JP2725818B2 - ヒトインターフエロンベーター２、その精製法及びその用途 - Google Patents
ヒトインターフエロンベーター２、その精製法及びその用途Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、ヒトインターフエロン−β２（IFN−β
２）、モノクローナル抗体，該モノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマセルライン及び該モノクローナル
抗体を用いたインターフエロン−β２の精製法に関す
る。更に本発明は、ヒトインターフエロン−β２を含有
する薬学的組成物に関する。
２）、モノクローナル抗体，該モノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマセルライン及び該モノクローナル
抗体を用いたインターフエロン−β２の精製法に関す
る。更に本発明は、ヒトインターフエロン−β２を含有
する薬学的組成物に関する。
発明の背景 ヒトインターフエロン−β２は、特願昭55−164482に
よつて初めて報告されたものであり、２本鎖RNAによつ
て誘導されたヒト線維芽細胞からβ−型インターフエロ
ン様活性を有するものとしてクローン化されている。CH
O細胞によつて発現されるその組換え蛋白については特
願昭61−258077に報告されている。
よつて初めて報告されたものであり、２本鎖RNAによつ
て誘導されたヒト線維芽細胞からβ−型インターフエロ
ン様活性を有するものとしてクローン化されている。CH
O細胞によつて発現されるその組換え蛋白については特
願昭61−258077に報告されている。
サイトカインの１つであるヒトインターフエロン−β
２は多数の機能及び活性を有しており、その後の文献に
記載され各種の生物学的活性を有するものとして同定さ
れているいくつかの蛋白と同一であることが明らかにさ
れている。即ち、インターロイキン−６（IL−６）（T.
Hirono et al.（1986）Nature324,pp.73−76）としても
命名されているＢ−細胞分化誘導もしくは促進因子（BC
DFもしくはBSF2）；ハイブリドーマ／プラズマサイトー
マ成長因子（HGFもしくはHPGF）（J.Van Damme et al.
（1987）J.Exp.Med.165,pp.914−919）；肝細胞促進因
子（HSF）（J.Gauldie et al.（1987）Proc.Natl.Acad.
Sci.U.S.A.84,pp.7251−7255）；ヒト線維芽細胞中で誘
導される26kPa蛋白（Haegeman et al.（1986）Eur.J.Bi
ochem.159,pp.625−632）；及びエプラスタインバール
ウイルス（EBV）で形質転換されたヒトＢ細胞の成長を
促進する単球由来ヒトＢ細胞成長因子（G.Tosato et a
l.（1988）Science239,pp.502−504）などの蛋白とイン
ターフエロン−β２とは同一であることが明らかにされ
ている。。本明細書においてはこのインターフエロン−
β２を以後IFN−β2/IL−２またはIFN−β２と略記す
る。
２は多数の機能及び活性を有しており、その後の文献に
記載され各種の生物学的活性を有するものとして同定さ
れているいくつかの蛋白と同一であることが明らかにさ
れている。即ち、インターロイキン−６（IL−６）（T.
Hirono et al.（1986）Nature324,pp.73−76）としても
命名されているＢ−細胞分化誘導もしくは促進因子（BC
DFもしくはBSF2）；ハイブリドーマ／プラズマサイトー
マ成長因子（HGFもしくはHPGF）（J.Van Damme et al.
（1987）J.Exp.Med.165,pp.914−919）；肝細胞促進因
子（HSF）（J.Gauldie et al.（1987）Proc.Natl.Acad.
Sci.U.S.A.84,pp.7251−7255）；ヒト線維芽細胞中で誘
導される26kPa蛋白（Haegeman et al.（1986）Eur.J.Bi
ochem.159,pp.625−632）；及びエプラスタインバール
ウイルス（EBV）で形質転換されたヒトＢ細胞の成長を
促進する単球由来ヒトＢ細胞成長因子（G.Tosato et a
l.（1988）Science239,pp.502−504）などの蛋白とイン
ターフエロン−β２とは同一であることが明らかにされ
ている。。本明細書においてはこのインターフエロン−
β２を以後IFN−β2/IL−２またはIFN−β２と略記す
る。
例えばチヤイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）など
の哺乳動物細胞によつて産生される天然IFN−β２及び
組換えIFN−β２には、グリコシル化及びホスホリス化
により各種のタイプが存在する（A.Zilberstein et al.
（1986）EMBO J.5,pp.2529−2537;L.T.May et al.（198
8）J.Biol.Chem.263,pp.7760−7768;L.T.May et al.（1
988）Biophys.Biochem.Res.Commun.152,pp.1144−114
8）。従つて、変性したゲル上でのイムノブロツト分析
によると、約23,26,45及び66Kdの各種のバンドが現れ
る。グルコシル化されたIFN−β２蛋白の糖鎖部分が除
去すると約20Kdの小さい蛋白が得られるが、この蛋白は
IFN−β２のほとんどのあるいはすべての生物学的活性
を保持している。
の哺乳動物細胞によつて産生される天然IFN−β２及び
組換えIFN−β２には、グリコシル化及びホスホリス化
により各種のタイプが存在する（A.Zilberstein et al.
（1986）EMBO J.5,pp.2529−2537;L.T.May et al.（198
8）J.Biol.Chem.263,pp.7760−7768;L.T.May et al.（1
988）Biophys.Biochem.Res.Commun.152,pp.1144−114
8）。従つて、変性したゲル上でのイムノブロツト分析
によると、約23,26,45及び66Kdの各種のバンドが現れ
る。グルコシル化されたIFN−β２蛋白の糖鎖部分が除
去すると約20Kdの小さい蛋白が得られるが、この蛋白は
IFN−β２のほとんどのあるいはすべての生物学的活性
を保持している。
発明の要旨 本発明によれば、ヒト天然IFN−β２及びCHOなどの哺
乳動物細胞あるいはE.coliなどのバクテリア中で発現さ
れた組換えIFN−β２等の由来の異なるIFN−β2/IL−６
と特異的に結合することの出来るモノクローナル抗体が
提供される。また本発明は、該モノクローナル抗体を産
生することの出来るハイブリドーマセルラインに関す
る。
乳動物細胞あるいはE.coliなどのバクテリア中で発現さ
れた組換えIFN−β２等の由来の異なるIFN−β2/IL−６
と特異的に結合することの出来るモノクローナル抗体が
提供される。また本発明は、該モノクローナル抗体を産
生することの出来るハイブリドーマセルラインに関す
る。
また本発明は、免疫学的精製工程を含むヒトIFN−β
２の精製法に関する。
２の精製法に関する。
更に本発明は、成熟型ヒトIFN−β２のアミノ酸配列
を含む非グリコシル化ポリペプチド，該ポリペプチドを
コードするDNA配列を含む組換えベクター、該ベクター
によつて形質転換された微生物，及び該微生物を培養し
てポリペプチドを回収することからなる該非グルコシル
化ポリペプチドの製造法に関する。
を含む非グリコシル化ポリペプチド，該ポリペプチドを
コードするDNA配列を含む組換えベクター、該ベクター
によつて形質転換された微生物，及び該微生物を培養し
てポリペプチドを回収することからなる該非グルコシル
化ポリペプチドの製造法に関する。
更に本発明は、乳癌、白血病、感染性疾患及び骨髄前
駆細胞障害の治療用IFN−β２含有薬学的組成物に関す
る。
駆細胞障害の治療用IFN−β２含有薬学的組成物に関す
る。
発明の詳細な記述 本発明の抗IFN−β２モノクローナル抗体は、IFN−β
２またはプロテインＡ−IFN−β２融合蛋白などのIFN−
β２を含む融合蛋白で免疫したマウスの脾細胞とムリン
ミエローマ細胞とを融合して得られるハイブリドーマセ
ルラインから得ることが出来る。
２またはプロテインＡ−IFN−β２融合蛋白などのIFN−
β２を含む融合蛋白で免疫したマウスの脾細胞とムリン
ミエローマ細胞とを融合して得られるハイブリドーマセ
ルラインから得ることが出来る。
本明細書においては、プロテインＡ−IFN−β２融合
蛋白をE.coli中で発現するためのプラスミドの構築、及
びモノクローナル抗体を得るためのその使用法が記載さ
れる。ヒトIFN−β２をコードする第１図のcDNAの翻訳
配列を、ブドウ球菌プロテインＡのアフイニテイーテイ
ルをコードする配列（Uhlen et al.（1984）J.Bio.Che
m.259,p.1695）の３′末端に結合する。得られるハイブ
リツト遺伝子をE.coli中にて効果的に発現させるため
に、強力ラムダPRプロモーターに連結する。
蛋白をE.coli中で発現するためのプラスミドの構築、及
びモノクローナル抗体を得るためのその使用法が記載さ
れる。ヒトIFN−β２をコードする第１図のcDNAの翻訳
配列を、ブドウ球菌プロテインＡのアフイニテイーテイ
ルをコードする配列（Uhlen et al.（1984）J.Bio.Che
m.259,p.1695）の３′末端に結合する。得られるハイブ
リツト遺伝子をE.coli中にて効果的に発現させるため
に、強力ラムダPRプロモーターに連結する。
かくして得られる融合蛋白プロテインＡ−IFN−β２
を精製してマウスを免疫するのに用いる。この精製融合
蛋白をマウスに６回注射後、ポジテイブ血清を得て、固
相ラジオイムノアツセイ法（SRIA）によりその結合力価
をテストし、ウエスタンブロツトによりその結合特異性
をテストする。最も高い結合力価を示すマウスから脾細
胞を得（1:25,000希釈）、これをマウスミエローマ細胞
に融合する。細胞の融合は、当業者に公知の適当な融合
プロモーターの存在下で行なう。次いで得られる融合細
胞をウエル中で培養する。次いで各ウエルの上清を採取
して、IFN−β２と特異的に結合するモノクローナル抗
体、好ましくはマウスの免疫化に用いたIFN−β２より
もむしろ異なつた由来のIFN−β２と特異的に結合する
モノクローナル抗体が存在するか否かをテストする。従
つて、E.coli中で発現された融合蛋白プロテインＡ−IF
N−β２を用いてマウスを免疫化した場合には、CHO細胞
中で産生されたIFN−β２を用いてモノクローナル抗体
のスクニーニングを行なう。このようにしてスクリーニ
ングすることによつて、プロテインＡとモノクローナル
抗体との交差反応及びマウスの免疫化に用いた抗原調製
物中に存在するE.coliからの混入物とモノクローナル抗
体との交差反応をさけることが出来る。SRIAの際には、
SV40初期プロモーターの支配下にIFN−β２遺伝子を含
むプラスミドを保持し且つこの遺伝子を高度に発現して
プロテインＡ及びバクテリア抗原は発現しないCHO細胞
を培養してその培養液の粗上清を固相支持体上に結合さ
せ、次いでハイブリドーマ培養液の上清及び〔125I〕ヤ
ギ抗マウス抗体と反応させる。
を精製してマウスを免疫するのに用いる。この精製融合
蛋白をマウスに６回注射後、ポジテイブ血清を得て、固
相ラジオイムノアツセイ法（SRIA）によりその結合力価
をテストし、ウエスタンブロツトによりその結合特異性
をテストする。最も高い結合力価を示すマウスから脾細
胞を得（1:25,000希釈）、これをマウスミエローマ細胞
に融合する。細胞の融合は、当業者に公知の適当な融合
プロモーターの存在下で行なう。次いで得られる融合細
胞をウエル中で培養する。次いで各ウエルの上清を採取
して、IFN−β２と特異的に結合するモノクローナル抗
体、好ましくはマウスの免疫化に用いたIFN−β２より
もむしろ異なつた由来のIFN−β２と特異的に結合する
モノクローナル抗体が存在するか否かをテストする。従
つて、E.coli中で発現された融合蛋白プロテインＡ−IF
N−β２を用いてマウスを免疫化した場合には、CHO細胞
中で産生されたIFN−β２を用いてモノクローナル抗体
のスクニーニングを行なう。このようにしてスクリーニ
ングすることによつて、プロテインＡとモノクローナル
抗体との交差反応及びマウスの免疫化に用いた抗原調製
物中に存在するE.coliからの混入物とモノクローナル抗
体との交差反応をさけることが出来る。SRIAの際には、
SV40初期プロモーターの支配下にIFN−β２遺伝子を含
むプラスミドを保持し且つこの遺伝子を高度に発現して
プロテインＡ及びバクテリア抗原は発現しないCHO細胞
を培養してその培養液の粗上清を固相支持体上に結合さ
せ、次いでハイブリドーマ培養液の上清及び〔125I〕ヤ
ギ抗マウス抗体と反応させる。
SRIAによつてハイブリドーマをスクリーニングし、い
くつかのポジテイブクローンを単離してその特性を調べ
る。目的とする抗体を産生するポジテイブクローンを選
択してサブクローンし、次いで、適当な生育培地中で培
養するかあるいはマウスに注入し、培養細胞の上清から
あるいは注入したマウスの腹水から目的とするモノクロ
ーナル抗体を回収する。
くつかのポジテイブクローンを単離してその特性を調べ
る。目的とする抗体を産生するポジテイブクローンを選
択してサブクローンし、次いで、適当な生育培地中で培
養するかあるいはマウスに注入し、培養細胞の上清から
あるいは注入したマウスの腹水から目的とするモノクロ
ーナル抗体を回収する。
かくして得られるモノクローナル抗体は、カラム内の
固相支持体上に結合させることが出来る。例えばアガロ
ースポリアクリルヒドラジドなどの公知のゲルマトリツ
クスであればいずれを用いてもモノクローナル抗体を固
定化することが出来る。ヒトIFN−β２の粗調製物をカ
ラムに付し、その後pHあるいはイオン強度を変化させて
カラム中のゲルから溶出させることが出来る。本発明の
好ましい態様においては、IFN−β２を含むフラクシヨ
ンをpH2のバツフアーで溶出させ、溶出直後にpH8.5のバ
ツフアーで中和する。
固相支持体上に結合させることが出来る。例えばアガロ
ースポリアクリルヒドラジドなどの公知のゲルマトリツ
クスであればいずれを用いてもモノクローナル抗体を固
定化することが出来る。ヒトIFN−β２の粗調製物をカ
ラムに付し、その後pHあるいはイオン強度を変化させて
カラム中のゲルから溶出させることが出来る。本発明の
好ましい態様においては、IFN−β２を含むフラクシヨ
ンをpH2のバツフアーで溶出させ、溶出直後にpH8.5のバ
ツフアーで中和する。
上記の本発明方法によつて精製される粗天然IFN−β
２は、誘導された線維芽細胞よりIFN−β２とともに得
ることが出来る。
２は、誘導された線維芽細胞よりIFN−β２とともに得
ることが出来る。
本発明によつて精製されるCHO細胞産生組換えIFN−β
２は、A.Zilberstein et al.（1986）EMBO J.5,pp.2529
−2537に記載された方法によつて得ることが出来る。
２は、A.Zilberstein et al.（1986）EMBO J.5,pp.2529
−2537に記載された方法によつて得ることが出来る。
本発明によれば、組換えDNA法によりIFN−β２アミノ
酸配列を含む非グルコシル化ポリペプチドが得られる。
ヒトDNA、特に、IFN−β２アミノ酸配列を含むポリペプ
チドをコードするcDNAを、ハイブリツドtryp−lacプロ
モーターなどの強力なバクテリアプロモーターに連結
し、得られる融合DNA分子を適当なプラスミドに挿入し
て、該ポリペプチドがバクテリア細胞中で発現されるよ
うな位置に該DNA配列と調節領域とを有する組換えベク
ターを構築する。このベクターでE.coliなどのバクテリ
ア細胞を形質転換し、得られる形質転換体を培養して目
的とするポリペプチドを発現せしめ、次いでポリペプチ
ドを回収して精製する。
酸配列を含む非グルコシル化ポリペプチドが得られる。
ヒトDNA、特に、IFN−β２アミノ酸配列を含むポリペプ
チドをコードするcDNAを、ハイブリツドtryp−lacプロ
モーターなどの強力なバクテリアプロモーターに連結
し、得られる融合DNA分子を適当なプラスミドに挿入し
て、該ポリペプチドがバクテリア細胞中で発現されるよ
うな位置に該DNA配列と調節領域とを有する組換えベク
ターを構築する。このベクターでE.coliなどのバクテリ
ア細胞を形質転換し、得られる形質転換体を培養して目
的とするポリペプチドを発現せしめ、次いでポリペプチ
ドを回収して精製する。
IFN−β２分子は212個のアミノ酸からなるポリペプチ
ドであり、そのＮ末端には、第１図で示すように、以下
の配列を有している。
ドであり、そのＮ末端には、第１図で示すように、以下
の配列を有している。
Ala28−Pro−Val−Pro−Pro−， −Pro29−Val−Pro−Pro, 又は−Val30−Pro−Pro−。
本発明の好ましい態様においては、IFN−β2 cDNAはP
ro29コドンの位置でMetイニシエータ−コドンとtrp−la
cプロモーターに連結している。しかしながら、得られ
るポリペプチドがIFN−β2/LL−６活性を有する限り、
いずれの配列も本発明に包含される。
ro29コドンの位置でMetイニシエータ−コドンとtrp−la
cプロモーターに連結している。しかしながら、得られ
るポリペプチドがIFN−β2/LL−６活性を有する限り、
いずれの配列も本発明に包含される。
本発明で用いるDNAベクターは標準的方法によつて構
築することが出来る。プラスミドDNAは、CsCl−エチジ
ウムブロマイドグラジエント中でバンド化することによ
つて精製することが出来る。アガロースゲルまたはポリ
アクリルアミドゲル上で電気泳動により分離されたDNA
制限酵素断片は、DE−52カラムによつて精製することが
出来る。制限酵素（Boehringer,New England Biolab
s）,T4 DNAリガーゼ（New England Biolabs）,E.coli D
NAポリメラーゼのラージ断片（Boehringer）及びT4ポリ
ヌクレオチドキナーゼ（Pharmacia）は、それらの供給
者の指針に従つて使用することが出来る。E.coli形質転
換は、菌株HB 101 ATCC33694,JM 101 ATCC 33876,N4830
−１（Gootesman et al.（1980）J.Mol.Biol.140,p.5
7）及びJM 105（Messing et al.（1981）Nucleic Acids
Res.9,pp.309−321）を用いて凍結コンピテントバクテ
リア法（D.A.Morrison（1979）Methods Enzymol.79,pp.
326−331）により実施することが出来る。
築することが出来る。プラスミドDNAは、CsCl−エチジ
ウムブロマイドグラジエント中でバンド化することによ
つて精製することが出来る。アガロースゲルまたはポリ
アクリルアミドゲル上で電気泳動により分離されたDNA
制限酵素断片は、DE−52カラムによつて精製することが
出来る。制限酵素（Boehringer,New England Biolab
s）,T4 DNAリガーゼ（New England Biolabs）,E.coli D
NAポリメラーゼのラージ断片（Boehringer）及びT4ポリ
ヌクレオチドキナーゼ（Pharmacia）は、それらの供給
者の指針に従つて使用することが出来る。E.coli形質転
換は、菌株HB 101 ATCC33694,JM 101 ATCC 33876,N4830
−１（Gootesman et al.（1980）J.Mol.Biol.140,p.5
7）及びJM 105（Messing et al.（1981）Nucleic Acids
Res.9,pp.309−321）を用いて凍結コンピテントバクテ
リア法（D.A.Morrison（1979）Methods Enzymol.79,pp.
326−331）により実施することが出来る。
本明細書においては、乳癌細胞の成長抑制，骨髄性白
血病細胞の成長抑制及び分化誘導，並びに線維芽細胞で
の補体因子Ｂの誘導及びその造血効果に用いるIFN−β
２の用途について記載される。かくしてヒトIFN−β２
は、乳癌、白血病、感染性疾患及び骨髄前駆細胞障害の
治療用薬学的組成物の活性成分として用いることが出来
る。
血病細胞の成長抑制及び分化誘導，並びに線維芽細胞で
の補体因子Ｂの誘導及びその造血効果に用いるIFN−β
２の用途について記載される。かくしてヒトIFN−β２
は、乳癌、白血病、感染性疾患及び骨髄前駆細胞障害の
治療用薬学的組成物の活性成分として用いることが出来
る。
以下に本発明を実施例により詳細に説明するが、本発
明はこれら実施例によつて何んら限定されるものではな
い。
明はこれら実施例によつて何んら限定されるものではな
い。
例１ 融合蛋白プロテインＡ−IFN−β２の調製 （Ａ）プラスミドpRIβ2802とpRIβ2604の構築 プラスミドpRIβ2HB（第２図）は、強力SV40初期プロ
モーターのコントロール下でCHO細胞中にてIFN−β２遺
伝子を発現するために用いたベクターの１つであり、標
準的クローニング法によりcDNAの５′及び３′非コード
領域の全てを除去することによつてプラスミドp8VCIFβ
2（A.Zilberstein et al.（1986）EMBO J.5,pp.2529−2
537）から誘導することが出来る。
モーターのコントロール下でCHO細胞中にてIFN−β２遺
伝子を発現するために用いたベクターの１つであり、標
準的クローニング法によりcDNAの５′及び３′非コード
領域の全てを除去することによつてプラスミドp8VCIFβ
2（A.Zilberstein et al.（1986）EMBO J.5,pp.2529−2
537）から誘導することが出来る。
IFN−β２をコードする661 bp cDNA挿入配列を、661
bp Hind III/Cla I断片としてプラスミドpSVβ2HBから
切り出し、EcoR IIで消化した。得られる５個の断片を
分離用アガロースゲルで分離した。シグナルペプチド配
列と成熟型蛋白の最初の３個のアミノ酸をコードする5
5,12及び37bpの小さな３個の断片を捨てて、239及び318
bpの２個の断片をゲルから回収した。最初の部分のアミ
ノ酸配列をコードするDNA配列を復元しプロテインＡフ
レームを維持するために、２本鎖合成オリゴヌクレオチ
ドを調製し（その配列を第３図に示した）、上記の239
及び318bp断片とともに、あらかじめEcoRI及びAccIで消
化したプラスミドpGEM−１に連結した。得られるプラス
ミドをｐβ2132（第３図）と命名した。このプラスミド
は、プラスミドpGEM−１のマルチプルコード部位内のア
スパラギンコドンとセリンコドンの後に全IFN−β２配
列を含んでいる。アスパラギンコドンとセリンコドン
は、プラスミドpRIT2T（Pharmacia）のユニークセパレ
ートEcoRI部位（プロテインＡ遺伝子の３′末端）にお
ける２つのコドンに相当する。このプラスミドpRIT2Tは
後に続くクローニング用に用いたものである。プラスミ
ドｐβ2132をEcoRIとHind IIIで消化し、IFN−β2cDNA
完全配列を単離し、EcoRIとPvu II又はEcoRIとSma Iで
消化したプラスミドpRIT2Tに導入した。EcoRIとPvu II
で消化したプラスミドpRIT2Tに導入してプラスミドpRI
β2802が得られ、EcoRIとSma Iで消化したプラスミドpR
IT2Tに導入してプラスミドpRIβ2604が得られた（第３
図）。
bp Hind III/Cla I断片としてプラスミドpSVβ2HBから
切り出し、EcoR IIで消化した。得られる５個の断片を
分離用アガロースゲルで分離した。シグナルペプチド配
列と成熟型蛋白の最初の３個のアミノ酸をコードする5
5,12及び37bpの小さな３個の断片を捨てて、239及び318
bpの２個の断片をゲルから回収した。最初の部分のアミ
ノ酸配列をコードするDNA配列を復元しプロテインＡフ
レームを維持するために、２本鎖合成オリゴヌクレオチ
ドを調製し（その配列を第３図に示した）、上記の239
及び318bp断片とともに、あらかじめEcoRI及びAccIで消
化したプラスミドpGEM−１に連結した。得られるプラス
ミドをｐβ2132（第３図）と命名した。このプラスミド
は、プラスミドpGEM−１のマルチプルコード部位内のア
スパラギンコドンとセリンコドンの後に全IFN−β２配
列を含んでいる。アスパラギンコドンとセリンコドン
は、プラスミドpRIT2T（Pharmacia）のユニークセパレ
ートEcoRI部位（プロテインＡ遺伝子の３′末端）にお
ける２つのコドンに相当する。このプラスミドpRIT2Tは
後に続くクローニング用に用いたものである。プラスミ
ドｐβ2132をEcoRIとHind IIIで消化し、IFN−β2cDNA
完全配列を単離し、EcoRIとPvu II又はEcoRIとSma Iで
消化したプラスミドpRIT2Tに導入した。EcoRIとPvu II
で消化したプラスミドpRIT2Tに導入してプラスミドpRI
β2802が得られ、EcoRIとSma Iで消化したプラスミドpR
IT2Tに導入してプラスミドpRIβ2604が得られた（第３
図）。
（Ｂ）融合蛋白プロテインＡ−IFN−β２の製造及びそ
の精製 E.coli株N4830−１（Gootesman et al.（1980）J.Mo
l.Biol.140,p.57）を組換えプラスミドpRIβ2802あるい
はpRIβ2604で形質転換して、新たな微生物E.coli N−4
830−1/pRβ2802及びE.coli N4830−1/pRβ2602をそれ
ぞれ得た。
の精製 E.coli株N4830−１（Gootesman et al.（1980）J.Mo
l.Biol.140,p.57）を組換えプラスミドpRIβ2802あるい
はpRIβ2604で形質転換して、新たな微生物E.coli N−4
830−1/pRβ2802及びE.coli N4830−1/pRβ2602をそれ
ぞれ得た。
これら微生物の希釈培養細胞を、アンピシリンを含む
M9培地中で30℃で１晩生育せしめて初期定常期まで生育
させ、次いで42℃で90分間インキュベートし、冷却して
遠心により採取した。再懸濁と遠心をくり返した後、20
％SDSを１％の終濃度となるまで、また10M尿素を8Mの終
濃度となるまで加えて、発現した融合蛋白プロテインＡ
−IFN−β２を含む抽出物をTST（50mM Tris pH7.6,150m
M Nacl及び0.05％Tween20）に対して透析した。透析後
の透明な上清を、IgGセフアロース6 Fast Flow（FF）平
衡化カラムに付した。カラムに付した後、ゲルを洗浄
し、結合した融合蛋白を0.5M NH4COOH（pH3.4）で溶出
し、透析することなく直接凍結乾燥した。
M9培地中で30℃で１晩生育せしめて初期定常期まで生育
させ、次いで42℃で90分間インキュベートし、冷却して
遠心により採取した。再懸濁と遠心をくり返した後、20
％SDSを１％の終濃度となるまで、また10M尿素を8Mの終
濃度となるまで加えて、発現した融合蛋白プロテインＡ
−IFN−β２を含む抽出物をTST（50mM Tris pH7.6,150m
M Nacl及び0.05％Tween20）に対して透析した。透析後
の透明な上清を、IgGセフアロース6 Fast Flow（FF）平
衡化カラムに付した。カラムに付した後、ゲルを洗浄
し、結合した融合蛋白を0.5M NH4COOH（pH3.4）で溶出
し、透析することなく直接凍結乾燥した。
例２ 抗IFN−β２モノクローナル抗体の調製 （Ａ）マウスの免疫化及び細胞融合 ３月令の雌性Balb/cに、最初は例１で得られる部分精
製融合蛋白プロテインＡ−IFN−β２を注射した（10μg
/マウス，完全フロイントのアジュバントに乳化したも
の）。３週間後に、上記の融合蛋白溶液をマウスに皮下
投与した。更に、10日毎に４回注射した。最も高い結合
力価を示し（表１）且つウエスタンブロツト分析え最も
強いシグナルを示したマウスに、上記融合蛋白を腹膜内
投与し、３日後にマウスから得た脾臓リンパ球（150×1
06細胞）とミエローマセルライン（30×106NSO/l）とを
融合した。得られる融合細胞をマイクロカルチヤープレ
ートに分散し（３×104細胞／ウエル）、ハイブリドー
マの成長に基づいて融合細胞を選択した。抗IFN−β２
抗体を分泌するハイブリドーマを選んでこれをクローン
化し、更に限界希釈法によつて再クローン化した。
製融合蛋白プロテインＡ−IFN−β２を注射した（10μg
/マウス，完全フロイントのアジュバントに乳化したも
の）。３週間後に、上記の融合蛋白溶液をマウスに皮下
投与した。更に、10日毎に４回注射した。最も高い結合
力価を示し（表１）且つウエスタンブロツト分析え最も
強いシグナルを示したマウスに、上記融合蛋白を腹膜内
投与し、３日後にマウスから得た脾臓リンパ球（150×1
06細胞）とミエローマセルライン（30×106NSO/l）とを
融合した。得られる融合細胞をマイクロカルチヤープレ
ートに分散し（３×104細胞／ウエル）、ハイブリドー
マの成長に基づいて融合細胞を選択した。抗IFN−β２
抗体を分泌するハイブリドーマを選んでこれをクローン
化し、更に限界希釈法によつて再クローン化した。
（Ｂ）抗IFN−β２モノクローナル抗体を産生する特異
的ハイブリドーマのスクリーニング ハイブリドーマ培養上清について、固相ラジオイムノ
アツセイ法（SRIA）により抗IFN−β２抗体の存在をテ
ストした。PVCマイクロプレート（Dynatech Laboratori
es,Alexandria,VA）を、IFN−β２を分泌するCHO細胞の
血清フリー培養粗上清でコートした（80μg/ウエル）。
37℃で２時間又は４℃で16時間インキュベーシヨン後、
BSA（0.5％）及びTween20（0.05％）を含むPBSでプレー
トを２回洗浄し、次いで37℃で２時間洗浄溶液でプレー
トをブロツクした。ハイブリドーマ培養上清を加えて
（50μg/ウエル）、プレートを37℃で４時間インキユベ
ートした。次いで、洗浄溶液でプレートを３回洗浄し、
125I−ヤギ抗マウス（Fab′）2（50μl,105cpm）を加え
て４℃で16時間インキユベートした。プレートを４回洗
浄し、個々のウエルを切り出し、ガンマカウンターで計
測した。ネガテイブコントロールよりも少なくとも４倍
高いカウント数を与えるサンプルをポジテイブとした
（表１）。
的ハイブリドーマのスクリーニング ハイブリドーマ培養上清について、固相ラジオイムノ
アツセイ法（SRIA）により抗IFN−β２抗体の存在をテ
ストした。PVCマイクロプレート（Dynatech Laboratori
es,Alexandria,VA）を、IFN−β２を分泌するCHO細胞の
血清フリー培養粗上清でコートした（80μg/ウエル）。
37℃で２時間又は４℃で16時間インキュベーシヨン後、
BSA（0.5％）及びTween20（0.05％）を含むPBSでプレー
トを２回洗浄し、次いで37℃で２時間洗浄溶液でプレー
トをブロツクした。ハイブリドーマ培養上清を加えて
（50μg/ウエル）、プレートを37℃で４時間インキユベ
ートした。次いで、洗浄溶液でプレートを３回洗浄し、
125I−ヤギ抗マウス（Fab′）2（50μl,105cpm）を加え
て４℃で16時間インキユベートした。プレートを４回洗
浄し、個々のウエルを切り出し、ガンマカウンターで計
測した。ネガテイブコントロールよりも少なくとも４倍
高いカウント数を与えるサンプルをポジテイブとした
（表１）。
表１から明らかなように、14個の抗IFN−β２モノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマがSRIAにより選択され
た。ハイブリドーマ34からサブクローン化されたハイブ
リドーマ34−１の特性を更に調べた所、IgG 1クラスに
属することが明らかになつた。ハイブリドーマ34−１を
Collection Nationale des Cultures de Mickroorganis
mes−CNCM,Institute Pasteur（Paris）に1988年11月14
日にブタペスト条約に基づく国際寄託をし、受託番号と
してCNCM I−813が付与された。
ローナル抗体産生ハイブリドーマがSRIAにより選択され
た。ハイブリドーマ34からサブクローン化されたハイブ
リドーマ34−１の特性を更に調べた所、IgG 1クラスに
属することが明らかになつた。ハイブリドーマ34−１を
Collection Nationale des Cultures de Mickroorganis
mes−CNCM,Institute Pasteur（Paris）に1988年11月14
日にブタペスト条約に基づく国際寄託をし、受託番号と
してCNCM I−813が付与された。
ハイブリドーマ34−１はウエスタンブロツテイングに
敵しており、また天然IFN−β２及びE.coliあるいはCHO
細胞で発現される組換えIFN−β２のアフイニテイー精
製にも適していることが明らかになつた。このハイブリ
ドーマを以下の実験に用いた。
敵しており、また天然IFN−β２及びE.coliあるいはCHO
細胞で発現される組換えIFN−β２のアフイニテイー精
製にも適していることが明らかになつた。このハイブリ
ドーマを以下の実験に用いた。
例３ 抗IFN−β２モノクローナル抗体の適用 （Ａ）ウエスタンブロツテイング 天然IFN−β２の粗調製物サンプル、あるいはCHO細胞
もしくはE.coliで発現される組換えIFN−β２粗調製物
サンプルを還元条件下でSDSPAGEで分析し、ニトロセル
ロースシート（BA85,SchleicherとBhuell）上にエレク
トロブロツトした。エレクトロブロツテイング後、ブロ
ツキングバツフアー（0.05％Tween20及び0.02％ナトリ
ウムアジドを含むPBSに非脂肪ミルク５％を加えたも
の）とともにシートを１晩インキユベートした。次い
で、抗IFN−β２抗体No.34−１とともに室温で２時間イ
ンキユベートした。0.05％Tween20のPBS溶液で洗浄後、
ニトロセルロースを125I−ヤギ抗マウス血清（ブロツキ
ングバツフアー中に0.7×106cpm/ml）とともに室温で３
時間インキユベートした。次いでシートを洗浄し、乾燥
して、オートラジオグラフイーに付した。得られる結果
４を第４図に示した。レーンA:天然IFN−β2;レーンB:C
HO細胞で発現された組換えIFN−β2;レーンC:E.coliで
発現された組換えIFN−β2;レーンD:CHO細胞で発現され
た組換えIFN−β１（比較用）。
もしくはE.coliで発現される組換えIFN−β２粗調製物
サンプルを還元条件下でSDSPAGEで分析し、ニトロセル
ロースシート（BA85,SchleicherとBhuell）上にエレク
トロブロツトした。エレクトロブロツテイング後、ブロ
ツキングバツフアー（0.05％Tween20及び0.02％ナトリ
ウムアジドを含むPBSに非脂肪ミルク５％を加えたも
の）とともにシートを１晩インキユベートした。次い
で、抗IFN−β２抗体No.34−１とともに室温で２時間イ
ンキユベートした。0.05％Tween20のPBS溶液で洗浄後、
ニトロセルロースを125I−ヤギ抗マウス血清（ブロツキ
ングバツフアー中に0.7×106cpm/ml）とともに室温で３
時間インキユベートした。次いでシートを洗浄し、乾燥
して、オートラジオグラフイーに付した。得られる結果
４を第４図に示した。レーンA:天然IFN−β2;レーンB:C
HO細胞で発現された組換えIFN−β2;レーンC:E.coliで
発現された組換えIFN−β2;レーンD:CHO細胞で発現され
た組換えIFN−β１（比較用）。
（Ｂ）IFN−β２調製物のアフイニテイークロマトグラ
フイー ハイブリドーマ34−１によつて分泌されるモノクロー
ナル抗体を含むマウスの腹水を硫酸アンモニウム（50％
飽和濃度）４℃で16時間処理して沈殿させた。沈殿物を
遠心によつて集め、水に再溶解し、食塩水に対して透析
した。免疫グロブリン約10mgを、WilcheckとMironの方
法（（1974）Methods Enzym.34,p.72）によつてアガロ
ース−ポリアクリル−ヒドラジド1mlに結合させた。天
然IFN−β２（線維芽細胞由来）又は組換えIFN−β２
（E.coli又はCHO細胞にて発現）の粗調製物（0.5M NaCl
を含む）を、４℃で流速0.25ml/minでカラムに付した。
カラムを、カラムの30倍容量の0.5M NaClのPBS溶液で洗
浄した。50mMクエン酸バツフア−（pH2）（８×１倍容
量フラクシヨン）でIFN−β２を溶出させ、0.1M Hepes
バツフアー（pH8.5）で直ぐに中和した。
フイー ハイブリドーマ34−１によつて分泌されるモノクロー
ナル抗体を含むマウスの腹水を硫酸アンモニウム（50％
飽和濃度）４℃で16時間処理して沈殿させた。沈殿物を
遠心によつて集め、水に再溶解し、食塩水に対して透析
した。免疫グロブリン約10mgを、WilcheckとMironの方
法（（1974）Methods Enzym.34,p.72）によつてアガロ
ース−ポリアクリル−ヒドラジド1mlに結合させた。天
然IFN−β２（線維芽細胞由来）又は組換えIFN−β２
（E.coli又はCHO細胞にて発現）の粗調製物（0.5M NaCl
を含む）を、４℃で流速0.25ml/minでカラムに付した。
カラムを、カラムの30倍容量の0.5M NaClのPBS溶液で洗
浄した。50mMクエン酸バツフア−（pH2）（８×１倍容
量フラクシヨン）でIFN−β２を溶出させ、0.1M Hepes
バツフアー（pH8.5）で直ぐに中和した。
粗組換えIFN−β２（DNAを除いたE.coli抽出物）を抗
IFN−β２モノクローナル抗体カラム1mlに付した。ワン
ステツプで1000倍に精製され、IFN−β２が100％回収さ
れた（表２）。8mlアフイニテイーカラムを用いてスケ
ールアツプした。カラムの精製能は、カラム1ml当り純
粋IFN−β2 400μｇが得られた。溶出フラクシヨンをSD
S−PAGEに付し銀染色した所、分子量21,000の主要バン
ドとより高い分子量の混入物のバンドが現われた（第５
図）。粗組換えIFN−β２（CHO細胞）をアフイニテイー
カラム1mlに付した所、ワンステツプで精製され100％で
回収された。溶出フラクシヨンをSDS−PAGEに付し銀染
色した所、23KD及び28KDaのグリコシル化IFN−β２の２
つの主要バンドが現われた（第５図）。天然IFN−β２
（包皮線維芽細胞由来）をイムノアフイニテイー精製に
付した場合にも同様のバンドが得られた。
IFN−β２モノクローナル抗体カラム1mlに付した。ワン
ステツプで1000倍に精製され、IFN−β２が100％回収さ
れた（表２）。8mlアフイニテイーカラムを用いてスケ
ールアツプした。カラムの精製能は、カラム1ml当り純
粋IFN−β2 400μｇが得られた。溶出フラクシヨンをSD
S−PAGEに付し銀染色した所、分子量21,000の主要バン
ドとより高い分子量の混入物のバンドが現われた（第５
図）。粗組換えIFN−β２（CHO細胞）をアフイニテイー
カラム1mlに付した所、ワンステツプで精製され100％で
回収された。溶出フラクシヨンをSDS−PAGEに付し銀染
色した所、23KD及び28KDaのグリコシル化IFN−β２の２
つの主要バンドが現われた（第５図）。天然IFN−β２
（包皮線維芽細胞由来）をイムノアフイニテイー精製に
付した場合にも同様のバンドが得られた。
例４ CHO細胞によつて産生されるIFN−β２のモニタリング SHO細胞によつて１培養培地中に分泌されるIFN−β
２を、イムノアフイニテイー精製に用いたモノクローナ
ル抗体34−１を用いて定量した。
２を、イムノアフイニテイー精製に用いたモノクローナ
ル抗体34−１を用いて定量した。
クローンA2−５−10は、CHO細胞をプラスミドpSVβ22
9（第６図）でトランスフエクトし、50nMメトトレキセ
ート（MTX）で選択することにより得られるCHOクローン
である。
9（第６図）でトランスフエクトし、50nMメトトレキセ
ート（MTX）で選択することにより得られるCHOクローン
である。
プラスミドpSVβ229は以下のようにして得ることが出
来る。即ち、SV40初期プロモーター及びSV40ポリアデニ
ル化部位に融合したIFN−β２コード配列を含むDNA断片
を、2.5kb BamHI断片としてプラスミドpSVc15から切り
出した。プラスミドpSVc15は、CHO細胞にて強力SV40初
期プロモーターのコントロール下にIFN−β２を発現す
るのに用いたベクターの１つであつて、IFN−β2cDNAの
５′末端からXho I部位までの全ての配列を取り出すこ
とによつてプラスミドpSVCIFβ2（A.Zilberstein et a
l.（1986）EMBO J.5,pp.2529−2537）から誘導すること
が出来る。上記のBamHI断片を、SV40初期モーターに融
合したマウスDHFRとIgGガンマ−2aのスプライシング領
域とを含むpDHERプラスミドのBamHI部位にクローン化し
た。
来る。即ち、SV40初期プロモーター及びSV40ポリアデニ
ル化部位に融合したIFN−β２コード配列を含むDNA断片
を、2.5kb BamHI断片としてプラスミドpSVc15から切り
出した。プラスミドpSVc15は、CHO細胞にて強力SV40初
期プロモーターのコントロール下にIFN−β２を発現す
るのに用いたベクターの１つであつて、IFN−β2cDNAの
５′末端からXho I部位までの全ての配列を取り出すこ
とによつてプラスミドpSVCIFβ2（A.Zilberstein et a
l.（1986）EMBO J.5,pp.2529−2537）から誘導すること
が出来る。上記のBamHI断片を、SV40初期モーターに融
合したマウスDHFRとIgGガンマ−2aのスプライシング領
域とを含むpDHERプラスミドのBamHI部位にクローン化し
た。
クローンA2−５−10をローラーボトル中でコンフルエ
ントになるまで生育させた。培養培地を、低（２％）胎
児ウシ血清培地に変え、その後24時間目に採取した。培
養液１を45mlに濃縮し、例3Bで調製したモノクローナ
ル抗体アフイニテイーカラムに付した。カラムを十分に
洗浄し、結合IFN−β２を50mMクエン酸（pH2）を用いて
それぞれ1mlで４つのフラクシヨンに溶出させた。この
ようにして精製したIFN−β２は、SDS−PAGEに付して銀
染色して分析した所、均質に純粋であることが示された
（第５図）。１培養液から回収されたIFN−β２蛋白
の量は469μｇであつた。
ントになるまで生育させた。培養培地を、低（２％）胎
児ウシ血清培地に変え、その後24時間目に採取した。培
養液１を45mlに濃縮し、例3Bで調製したモノクローナ
ル抗体アフイニテイーカラムに付した。カラムを十分に
洗浄し、結合IFN−β２を50mMクエン酸（pH2）を用いて
それぞれ1mlで４つのフラクシヨンに溶出させた。この
ようにして精製したIFN−β２は、SDS−PAGEに付して銀
染色して分析した所、均質に純粋であることが示された
（第５図）。１培養液から回収されたIFN−β２蛋白
の量は469μｇであつた。
各フラクシヨン中のIFN−β２の量を、粗調製物中の
該蛋白のハイブリドーマ成長因子（HGF）活性及びアフ
イニテイーカラムから得られる各フラクシヨン中のHGF
活性を測定することによつて評価した。カラムに付した
IFN−β２の約40％が非結合フラクシヨン中に回収され
（第７図）、他方、残りの活性は、pH2で溶出されたフ
ラクシヨンであつて溶出液２にピークを有するフラクシ
ヨン中に回収された（第８図）。これらの結果から、上
記した条件下ではクローンA2−５−10により約800μg/l
のIFN−β２が産生されることが判る。
該蛋白のハイブリドーマ成長因子（HGF）活性及びアフ
イニテイーカラムから得られる各フラクシヨン中のHGF
活性を測定することによつて評価した。カラムに付した
IFN−β２の約40％が非結合フラクシヨン中に回収され
（第７図）、他方、残りの活性は、pH2で溶出されたフ
ラクシヨンであつて溶出液２にピークを有するフラクシ
ヨン中に回収された（第８図）。これらの結果から、上
記した条件下ではクローンA2−５−10により約800μg/l
のIFN−β２が産生されることが判る。
CHOクローンA2−５−10によつて産生分泌されるIFN−
β２の比活性を、イムノアフイニテイーカラムにより得
られる各精製フラクシヨン中のHGF活性及び蛋白濃度を
測定することによつて求めた。HGF1ユニツトを、アツセ
イにおいて最大値効果の50％を与える蛋白量として定義
した。HGF活性は、Nordan R.P.とPotter M.（1986）Sci
ence233,pp.566−568に記載された方法と同様にして24
時間処理し〔3H〕チミジンで16時間パルスしたムリンプ
ラズマ細胞腫T1165細胞の1ml培養液中でアツセイした。
表３に分析結果をまとめて示した。アフイニテイークロ
マトグラフイーカラムから溶出した３つのフラクシヨン
中のIFN−β２のHGF比活性は1.18×106から2.1×106の
範囲であつて1.47×106の平均値を有していた。
β２の比活性を、イムノアフイニテイーカラムにより得
られる各精製フラクシヨン中のHGF活性及び蛋白濃度を
測定することによつて求めた。HGF1ユニツトを、アツセ
イにおいて最大値効果の50％を与える蛋白量として定義
した。HGF活性は、Nordan R.P.とPotter M.（1986）Sci
ence233,pp.566−568に記載された方法と同様にして24
時間処理し〔3H〕チミジンで16時間パルスしたムリンプ
ラズマ細胞腫T1165細胞の1ml培養液中でアツセイした。
表３に分析結果をまとめて示した。アフイニテイークロ
マトグラフイーカラムから溶出した３つのフラクシヨン
中のIFN−β２のHGF比活性は1.18×106から2.1×106の
範囲であつて1.47×106の平均値を有していた。
アフイニテイークロマトグラフイーカラムからの溶出
フラクシヨンを進めて、10mM酢酸バツフアー（pH5）に
対して透析し、Mono Sカチオン交換カラム（Pharmaci
a）に付した。カラムを10mM酢酸バツフアー（pH5）で洗
浄し、次いで０−600mM塩化ナトリウムリニアーグラジ
エントを用いて溶出した。それぞれのフラクシヨンのHG
F活性を測定した。活性は蛋白のメインピークと一致し
た。
フラクシヨンを進めて、10mM酢酸バツフアー（pH5）に
対して透析し、Mono Sカチオン交換カラム（Pharmaci
a）に付した。カラムを10mM酢酸バツフアー（pH5）で洗
浄し、次いで０−600mM塩化ナトリウムリニアーグラジ
エントを用いて溶出した。それぞれのフラクシヨンのHG
F活性を測定した。活性は蛋白のメインピークと一致し
た。
例５ E.coliにより産生される組換えIFN−β２の調製及び
精製 （Ａ）プラスミドpTLβ2501とpKKβ2７の構築 プラスミドpGEM−１のマルチプルコード部位内のATG
コドンの後にIFN−β２全配列を含むプラスミドｐβ232
4を、異なる合成オリゴヌクレオチド（第９図）を用い
る以外は、例1A及び第３図でプラスミドｐβ2132を調製
した方法と同様にして調製した。プラスミドｐβ2324を
EcoRI及びHind IIIで消化し、IFN−β2 cDNA完全配列を
単離し、EcoRI及びHind IIIで消化したプラスミドpTLα
2143−４（Y.Chernajovsky et al.,（1983）Ann.N.Y.Ac
ad.Sci.413,pp.88−96）もしくはpKK223−３（Pharmaci
a）に導入して、プラスミドpTLβ2501及びpKKβ2７（第
９図）を得た。
精製 （Ａ）プラスミドpTLβ2501とpKKβ2７の構築 プラスミドpGEM−１のマルチプルコード部位内のATG
コドンの後にIFN−β２全配列を含むプラスミドｐβ232
4を、異なる合成オリゴヌクレオチド（第９図）を用い
る以外は、例1A及び第３図でプラスミドｐβ2132を調製
した方法と同様にして調製した。プラスミドｐβ2324を
EcoRI及びHind IIIで消化し、IFN−β2 cDNA完全配列を
単離し、EcoRI及びHind IIIで消化したプラスミドpTLα
2143−４（Y.Chernajovsky et al.,（1983）Ann.N.Y.Ac
ad.Sci.413,pp.88−96）もしくはpKK223−３（Pharmaci
a）に導入して、プラスミドpTLβ2501及びpKKβ2７（第
９図）を得た。
（Ｂ）E.coliでの生物学的に活性なIFN−β２ポリペプ
チドの発現 E.coli株JM105（J.Messing et al.,（1981）Nucleic
Acids Res.9,pp.309−321）を組換えプラスミドpKKβ2
７で形質転換して、新たな微生物E.coli JM 105（pKKβ
2７を得、これを1987年12月17日にブタペスト条約に基
づきATCCへ寄託し、受託番号ATCC67583が付与された。
E.coli株JM 101（ATCC33876）を組換えプラスミドpTLβ
2501で形質転換し、新たな微生物E.coli JM 101/pTLβ2
501を得、これを1987年12月17日にブタペスト条約に基
づきATCCへ寄託し、受託番号ATCC67584が付与された。
これらの微生物を培養し、次いで溶解して、IFN−β２
を含む抽出物を精製した。
チドの発現 E.coli株JM105（J.Messing et al.,（1981）Nucleic
Acids Res.9,pp.309−321）を組換えプラスミドpKKβ2
７で形質転換して、新たな微生物E.coli JM 105（pKKβ
2７を得、これを1987年12月17日にブタペスト条約に基
づきATCCへ寄託し、受託番号ATCC67583が付与された。
E.coli株JM 101（ATCC33876）を組換えプラスミドpTLβ
2501で形質転換し、新たな微生物E.coli JM 101/pTLβ2
501を得、これを1987年12月17日にブタペスト条約に基
づきATCCへ寄託し、受託番号ATCC67584が付与された。
これらの微生物を培養し、次いで溶解して、IFN−β２
を含む抽出物を精製した。
（ｃ）クロマトグラフイーによるE.coli IFN−β２の精
製 ポリエチレンイミンによる沈殿次いでDEAEセルロース
に通すことによつて、核酸フリーのバクテリア抽出物を
得た。流出フラクシヨンを、10mM Naアセテートバツフ
アー（pH5）（バツフアーＡ）中のＳ−セフアロースに
吸着させ、０−0.03M NaClグラジエントで溶出させた。
活性フラクシヨンを集め、バツフアーＡに対して透析
し、次いでMono−S FPLLカラムに付し０−0.03M NaClグ
ラジエントで溶出した。精製期間中HGF活性をモニター
した所、IFN−β２のＮ末端ペプチドに対するポリクロ
ーナル抗体を用いたイムノブロツトによつて検出される
IFN−β２蛋白と一致した。最終的に得られる調製物をS
DS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した所、約20
kPaの一本のバンドが現われた。
製 ポリエチレンイミンによる沈殿次いでDEAEセルロース
に通すことによつて、核酸フリーのバクテリア抽出物を
得た。流出フラクシヨンを、10mM Naアセテートバツフ
アー（pH5）（バツフアーＡ）中のＳ−セフアロースに
吸着させ、０−0.03M NaClグラジエントで溶出させた。
活性フラクシヨンを集め、バツフアーＡに対して透析
し、次いでMono−S FPLLカラムに付し０−0.03M NaClグ
ラジエントで溶出した。精製期間中HGF活性をモニター
した所、IFN−β２のＮ末端ペプチドに対するポリクロ
ーナル抗体を用いたイムノブロツトによつて検出される
IFN−β２蛋白と一致した。最終的に得られる調製物をS
DS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した所、約20
kPaの一本のバンドが現われた。
（Ｄ）E.coli IFN−β２の免疫学的精製 発酵槽培養液３−6lから得られるDynomill抽出物１−
1.5lをポリエチレンイミンで沈殿させ、得られる溶液を
100ml（A4）又は500ml（A8）に濃縮し、0.5M NaCl（pH
7.0）（A4の場合）あるいは1M NaCl（A8の場合）を加え
たリン酸緩衝化食塩水（PBS）中のモノクローナル抗体3
4−１（腹水から得たIg）吸着カラム8ml（8mgIg/mlカラ
ム）に付した。同じバツフアーでカラムを洗浄後、50mM
クエン酸バツフアー（pH2）（A4の場合）あるいは同様
のクエン酸バツフアーとプロピレングリコール25％（A8
の場合）で溶出し、得られるサンプルに直ぐに0.1M Hep
esバツフアー（pH8.5）を加えて中和した。得られる結
果は次の通りである。
1.5lをポリエチレンイミンで沈殿させ、得られる溶液を
100ml（A4）又は500ml（A8）に濃縮し、0.5M NaCl（pH
7.0）（A4の場合）あるいは1M NaCl（A8の場合）を加え
たリン酸緩衝化食塩水（PBS）中のモノクローナル抗体3
4−１（腹水から得たIg）吸着カラム8ml（8mgIg/mlカラ
ム）に付した。同じバツフアーでカラムを洗浄後、50mM
クエン酸バツフアー（pH2）（A4の場合）あるいは同様
のクエン酸バツフアーとプロピレングリコール25％（A8
の場合）で溶出し、得られるサンプルに直ぐに0.1M Hep
esバツフアー（pH8.5）を加えて中和した。得られる結
果は次の通りである。
イムノアフイニイテイー後、Ｓ−セフアロースカラム
を用いて最終的に精製した。典型的な実験（s12）で
は、A4フラクシヨンを集めて更に10mM酢酸バツフアー
（pH5）に対して透析して、これをカラムに付し、0.1−
0.4M NaClグラジエントで溶出した。0.3M NaClの時に活
性ピークが溶出した。得られる結果は以下の通りであ
る。
を用いて最終的に精製した。典型的な実験（s12）で
は、A4フラクシヨンを集めて更に10mM酢酸バツフアー
（pH5）に対して透析して、これをカラムに付し、0.1−
0.4M NaClグラジエントで溶出した。0.3M NaClの時に活
性ピークが溶出した。得られる結果は以下の通りであ
る。
この工程での収量は64％であつた。得られる生成物
を、還元条件下及び非還元条件下でSDS−ポリアクリル
アミドゲルに付した所、21Kdに１本のバンドが現われ
た。
を、還元条件下及び非還元条件下でSDS−ポリアクリル
アミドゲルに付した所、21Kdに１本のバンドが現われ
た。
例６ 乳癌細胞の成長抑制 IFN−β2/IL−６はプラズマ細胞腫／ハイブリドーマ
細胞の成長を促進する（HGF活性）が、他の細胞の成長
を抑制する。本発明者は、ヒトBreast Ductalカルシノ
ーマ細胞のT47Dライン（ATCC HTB133）のコロニー形成
について調べた。コロニー形成はIFN−β１によつてわ
ずかに抑制されるだけであるが、IFN−β２による抑制
に対しては感受性を示した。第11図には、純粋なE.coli
rIFN−β2/IL−６による培養皿中のT47Dコロニー形成
の抑制効果が示されている。10−20HGF U/mlで50％抑制
効果が観察された。100U/mlの量では、生存したコロニ
ーは極めて小さく、成長が抑制された細胞がほとんどで
あつた。E.coli rIFN−β2/IL−６又はCHO細胞rIFN−β
2/IL6によるセミコンフルエントT47細胞の3H−チミジン
取込み抑制は、抗IFN−β２モノクローナル抗体によつ
て中和された。
細胞の成長を促進する（HGF活性）が、他の細胞の成長
を抑制する。本発明者は、ヒトBreast Ductalカルシノ
ーマ細胞のT47Dライン（ATCC HTB133）のコロニー形成
について調べた。コロニー形成はIFN−β１によつてわ
ずかに抑制されるだけであるが、IFN−β２による抑制
に対しては感受性を示した。第11図には、純粋なE.coli
rIFN−β2/IL−６による培養皿中のT47Dコロニー形成
の抑制効果が示されている。10−20HGF U/mlで50％抑制
効果が観察された。100U/mlの量では、生存したコロニ
ーは極めて小さく、成長が抑制された細胞がほとんどで
あつた。E.coli rIFN−β2/IL−６又はCHO細胞rIFN−β
2/IL6によるセミコンフルエントT47細胞の3H−チミジン
取込み抑制は、抗IFN−β２モノクローナル抗体によつ
て中和された。
T47D細胞の3H−チミジン取込み抑制が真実の成長抑制
を示しているかどうかを調べるために、15日間クローン
原性アツセイを実施した（第12図）。E.coli IFN−β２
の2BSF−2U/mlによつT47D細胞のコロニー数が50％減少
し、50U/mlでほとんど完全に成長が抑制された。擬似調
製物では成長抑制活性を示さなかつた（第12図）。同様
の実験糸で、IFN−β1 500抗ウイルスU/mlではT47D細胞
の成長抑制は観察されなかつた。他の乳癌カルシノーマ
セルラインMCF−７（ATCC HTB 22）についても同様にIF
N−β２によるコロニー形成抑制が観察された（第12図
ｂ）。3Hチミジンの取込みについては、T47D細胞よりも
MCF−７の方がわずかに感受性が低くかつた。
を示しているかどうかを調べるために、15日間クローン
原性アツセイを実施した（第12図）。E.coli IFN−β２
の2BSF−2U/mlによつT47D細胞のコロニー数が50％減少
し、50U/mlでほとんど完全に成長が抑制された。擬似調
製物では成長抑制活性を示さなかつた（第12図）。同様
の実験糸で、IFN−β1 500抗ウイルスU/mlではT47D細胞
の成長抑制は観察されなかつた。他の乳癌カルシノーマ
セルラインMCF−７（ATCC HTB 22）についても同様にIF
N−β２によるコロニー形成抑制が観察された（第12図
ｂ）。3Hチミジンの取込みについては、T47D細胞よりも
MCF−７の方がわずかに感受性が低くかつた。
クローン原理アツセイを行なうために、６−ウエルCo
starプレートのウエルに、T47D細胞はウエル１個当り20
0個の割合いで、MCF−７はウエル１個当り1000個の割合
いで細胞を接種した。ウエル中には、10％胎児ウシ血清
（FCS）、インシユリン0.2U/ml、グルタミン2mM、ペニ
シリン100U/ml及びストレプトマイシン100μg/mlを含む
RPMI1640培地1mlを加えた。24時間後に、E.coli IFN−
β２あるいは擬似E.coli調製物の同じ蛋白濃度の一連の
５倍希釈液を加えた。15日後にコロニーにクリスタルバ
イオレツトを加えて染色し、倒立顕微鏡で計測した。DN
A合成を測定するために、96−ウエルプレートに、１ウ
エル当り 15−25×103個の細胞を接種し、３日後にFCSを取出して
24時間放置し、E.coli IFN−β２あるいは擬似調製物の
一連の５倍希釈液を加えた新たな培地に加えた。16−24
時間後に、15μCi/ml3Hチミジン（25Ci/mmol,Amersha
m）で１時間細胞をラベル化し、PBSで２回洗浄し、４℃
で30分間５％トリクロロ酢酸（TCA）で処理し、５％TCA
で３回洗浄した。得られる沈殿を37℃で30分間0.2M NaO
H0.1ml中に溶解し、2M HCl0.01mlで中和し、次いで、ト
ルエンシンチレーター及びLumax（3:2v/v）を用いてTri
carbカウンターで計測した。血清を与えない場合にも同
様の効果が得られた。3Hチミジン取込みは低いが、抑制
は同じであつた。
starプレートのウエルに、T47D細胞はウエル１個当り20
0個の割合いで、MCF−７はウエル１個当り1000個の割合
いで細胞を接種した。ウエル中には、10％胎児ウシ血清
（FCS）、インシユリン0.2U/ml、グルタミン2mM、ペニ
シリン100U/ml及びストレプトマイシン100μg/mlを含む
RPMI1640培地1mlを加えた。24時間後に、E.coli IFN−
β２あるいは擬似E.coli調製物の同じ蛋白濃度の一連の
５倍希釈液を加えた。15日後にコロニーにクリスタルバ
イオレツトを加えて染色し、倒立顕微鏡で計測した。DN
A合成を測定するために、96−ウエルプレートに、１ウ
エル当り 15−25×103個の細胞を接種し、３日後にFCSを取出して
24時間放置し、E.coli IFN−β２あるいは擬似調製物の
一連の５倍希釈液を加えた新たな培地に加えた。16−24
時間後に、15μCi/ml3Hチミジン（25Ci/mmol,Amersha
m）で１時間細胞をラベル化し、PBSで２回洗浄し、４℃
で30分間５％トリクロロ酢酸（TCA）で処理し、５％TCA
で３回洗浄した。得られる沈殿を37℃で30分間0.2M NaO
H0.1ml中に溶解し、2M HCl0.01mlで中和し、次いで、ト
ルエンシンチレーター及びLumax（3:2v/v）を用いてTri
carbカウンターで計測した。血清を与えない場合にも同
様の効果が得られた。3Hチミジン取込みは低いが、抑制
は同じであつた。
IFN−β２を含む抽出物についてBSF−２活性をアツセ
イした。即ち、該抽出物処理に対して応答するCESS細胞
によるIgG分泌促進に基づいてBSF活性を測定した（A.Mu
ragvchi et al.,（1981）J.Immunol.128,pp.1296−130
1;T.Hirano et al.,（1985）Prokc.Natl.Acad.Sci.USA8
2,pp.5490−5494）。また、プラズマ細胞腫セルラインT
1165（R.P.NordanとM.Potter,（1986）Science233,pp.5
66−569）の成長を補助する能力を測定することによつ
て、HGF活性もアツセイした。T1165細胞での3Hチミジン
の取込み促進及びCESS細胞によるIgG分泌促進は、1:12,
500希釈液の時に最大値の半分の効果を示した。従つて
この値をBSF−2/HGF活性の１ユニツトと定義した。この
単位量を本実験で用いた。
イした。即ち、該抽出物処理に対して応答するCESS細胞
によるIgG分泌促進に基づいてBSF活性を測定した（A.Mu
ragvchi et al.,（1981）J.Immunol.128,pp.1296−130
1;T.Hirano et al.,（1985）Prokc.Natl.Acad.Sci.USA8
2,pp.5490−5494）。また、プラズマ細胞腫セルラインT
1165（R.P.NordanとM.Potter,（1986）Science233,pp.5
66−569）の成長を補助する能力を測定することによつ
て、HGF活性もアツセイした。T1165細胞での3Hチミジン
の取込み促進及びCESS細胞によるIgG分泌促進は、1:12,
500希釈液の時に最大値の半分の効果を示した。従つて
この値をBSF−2/HGF活性の１ユニツトと定義した。この
単位量を本実験で用いた。
例７ 骨髄性白血病細胞の成長抑制及び分化誘導 IFN−β２は骨髄性白血病細胞の成長を抑制し分化誘
導する作用を有している。ムリン骨髄性M1細胞及びヒト
組織球リンパ腫U937細胞を、10％胎児ウシ血清（FCS）
を加えたRPMI 1640培地中で生育せしめた。12−ウエルC
ostarプレートに、１ウエル当り105個の割合いで、細胞
を接種した。純粋なE.coli IFN−β２を0.1−75mg/ml加
えて、４−６日間培養細胞を観察した。細胞数を計測
し、Sigma社（St.Louis,MO）のα−ナフチルアセテート
エステラーゼキツト91−Ａを用いて、Giemsa及び非特異
的エステラーゼ用に染色した。0.5％Triton−X100細胞
抽出物中のリソチーム活性を、Micrococcue lysodeikti
cus（Sigma Co.）の溶解を濁度測定によりアツセイする
ことによつて測定した。卵白リソチームを用いてキヤリ
ブレーシヨンを行なつた（Wcisinger,GとSachs,L.（198
3）EMBO J.3,pp.2103−2107）。Nonidet p40細胞抽出物
中の（２′−５′）オリゴ−Ａシンセターゼ活性をアツ
セイした（Reshitzky et al.,（1986）Cell,46,pp.31−
40）。
導する作用を有している。ムリン骨髄性M1細胞及びヒト
組織球リンパ腫U937細胞を、10％胎児ウシ血清（FCS）
を加えたRPMI 1640培地中で生育せしめた。12−ウエルC
ostarプレートに、１ウエル当り105個の割合いで、細胞
を接種した。純粋なE.coli IFN−β２を0.1−75mg/ml加
えて、４−６日間培養細胞を観察した。細胞数を計測
し、Sigma社（St.Louis,MO）のα−ナフチルアセテート
エステラーゼキツト91−Ａを用いて、Giemsa及び非特異
的エステラーゼ用に染色した。0.5％Triton−X100細胞
抽出物中のリソチーム活性を、Micrococcue lysodeikti
cus（Sigma Co.）の溶解を濁度測定によりアツセイする
ことによつて測定した。卵白リソチームを用いてキヤリ
ブレーシヨンを行なつた（Wcisinger,GとSachs,L.（198
3）EMBO J.3,pp.2103−2107）。Nonidet p40細胞抽出物
中の（２′−５′）オリゴ−Ａシンセターゼ活性をアツ
セイした（Reshitzky et al.,（1986）Cell,46,pp.31−
40）。
IFN−β２を加えない場合には、M1細胞は培養皿に付
着することなく生育し、典型的な骨髄芽球形態を示し
た。これに対して、IFN−β２を加えて培養した場合に
は４日後に、細胞は培養皿に付着し、著しい形態の変化
を示した（第13図）。細胞の約60％はマクロフアージ様
の形態となり、残りの細胞は各種の成熟度を有する形態
となつた。細胞質は大きくなり、液胞を有し、典型的な
泡状態を示した。核は中心から離れ、丸さがなくなり、
著しい変化を示し、隆起した核小体が少なくなつた。生
存細胞数を計測した所、コントロール培養細胞は６日間
生育し、他方、IFN−β2 50U/mlで処理したM1細胞は２
−３分の１になり、成長が抑制された（表４）。接種４
日後にM1細胞数を50％減少させるには、IFN−β２を1U/
ml（プラズマ細胞腫成長ユニツトで表わした値）以下与
えれば十分であつた。成長抑制効果はIFN−β２約30U/m
l（15ng/ml）最大値を示した。化学的に精製されたrIFN
−β２の場合でも、この濃度はLPS2.5pg/ml以下に相当
する。尚、LPS2.5pg/ml細胞に対して何んらの効果も示
さない。IFN−β２をポリミキシンB5μg/mlとともに加
えて更にトレース量のLPSの作用を除いた場合でもM1細
胞の成長抑制及び分化誘導が観察された。分化誘導の生
化学的マーカーとして、IFN−β2 30U/mlで４日間培養
したM1細胞５×106個の抽出物のリソチーム活性を測定
した。コントロールM1培養細胞ではリソチームは検出さ
れなかつた。IFN−β２で処理した場合には、５×106個
の細胞当りリソチーム0.85μｇに相当するレベルでリソ
チームが誘導された。ラテツクスビーズ上の食作用活性
も、分化誘導されたM1細胞について観察された。
着することなく生育し、典型的な骨髄芽球形態を示し
た。これに対して、IFN−β２を加えて培養した場合に
は４日後に、細胞は培養皿に付着し、著しい形態の変化
を示した（第13図）。細胞の約60％はマクロフアージ様
の形態となり、残りの細胞は各種の成熟度を有する形態
となつた。細胞質は大きくなり、液胞を有し、典型的な
泡状態を示した。核は中心から離れ、丸さがなくなり、
著しい変化を示し、隆起した核小体が少なくなつた。生
存細胞数を計測した所、コントロール培養細胞は６日間
生育し、他方、IFN−β2 50U/mlで処理したM1細胞は２
−３分の１になり、成長が抑制された（表４）。接種４
日後にM1細胞数を50％減少させるには、IFN−β２を1U/
ml（プラズマ細胞腫成長ユニツトで表わした値）以下与
えれば十分であつた。成長抑制効果はIFN−β２約30U/m
l（15ng/ml）最大値を示した。化学的に精製されたrIFN
−β２の場合でも、この濃度はLPS2.5pg/ml以下に相当
する。尚、LPS2.5pg/ml細胞に対して何んらの効果も示
さない。IFN−β２をポリミキシンB5μg/mlとともに加
えて更にトレース量のLPSの作用を除いた場合でもM1細
胞の成長抑制及び分化誘導が観察された。分化誘導の生
化学的マーカーとして、IFN−β2 30U/mlで４日間培養
したM1細胞５×106個の抽出物のリソチーム活性を測定
した。コントロールM1培養細胞ではリソチームは検出さ
れなかつた。IFN−β２で処理した場合には、５×106個
の細胞当りリソチーム0.85μｇに相当するレベルでリソ
チームが誘導された。ラテツクスビーズ上の食作用活性
も、分化誘導されたM1細胞について観察された。
他の実験系では、M1培養細胞にIFN−β2/IL6を添加す
ることによつて24時間後に細胞の成長が抑制され（第14
図）、マクロフアージへの分化誘導が起こる。24時間後
には、細胞の細胞質が大きくなつて動原体のない核とな
り、３−４日後に典型的なマクロフアージの形態を示し
た。これは、リソチーム食作用活性の上昇及びMac1抗原
の上昇によつて証明された。rIFN−β２約0.5ng/mlでM1
細胞の50％成長抑制が観察され、この値は、プラズマ細
胞腫T1165細胞の促進に必要な量よりも少ない。IFN−β
2/IL−６の効果の発現は、IL−１（10U/ml）とTNF（102
U/ml）とを組合わせた場合よりも早い。この組合わせの
場合には48時間後に初めて成長の抑制効果が現われる。
これらのサイトカインもM1細胞の分化誘導を引き起こ
し、IFN−β2/IL−６のインデユーサーとして知られて
いる。IFN−β2/IL−６による成長抑制はモノクローナ
ル抗体34によつて十分に中和される。
ることによつて24時間後に細胞の成長が抑制され（第14
図）、マクロフアージへの分化誘導が起こる。24時間後
には、細胞の細胞質が大きくなつて動原体のない核とな
り、３−４日後に典型的なマクロフアージの形態を示し
た。これは、リソチーム食作用活性の上昇及びMac1抗原
の上昇によつて証明された。rIFN−β２約0.5ng/mlでM1
細胞の50％成長抑制が観察され、この値は、プラズマ細
胞腫T1165細胞の促進に必要な量よりも少ない。IFN−β
2/IL−６の効果の発現は、IL−１（10U/ml）とTNF（102
U/ml）とを組合わせた場合よりも早い。この組合わせの
場合には48時間後に初めて成長の抑制効果が現われる。
これらのサイトカインもM1細胞の分化誘導を引き起こ
し、IFN−β2/IL−６のインデユーサーとして知られて
いる。IFN−β2/IL−６による成長抑制はモノクローナ
ル抗体34によつて十分に中和される。
Mono−S FPLCで精製したrIFN−β２（例5C）で５日間処
理した細胞及び未処理細胞を用いた。
理した細胞及び未処理細胞を用いた。
ヒト組織球リンパ腫U937細胞は、ホルボールエステ
ル、ビタミンD3によつて分化誘導することが出来、また
IFN−ガンマによつても部分的に分化誘導することが出
来、更に他の未だ同定されていないサイトカインによつ
ても分化誘導することが出来る。本発明者らは、U937培
養細胞にIFN−β2 100HGF U/mlを加えた時の効果を調べ
た。４−５日後に、約25％の細胞が単球／マクロフアー
ジ様形態を示し、30％の細胞が成長抑制された（表
５）。分化誘導の生化学的マーカーとしてのα−ナフチ
ルアセテートエステラーゼ用に細胞を染色した。IFN−
ガンマによつては分化誘導は起らない。IFN−β２で処
理した培養細胞の約1/4が非特異的エステラーゼについ
て強いポジテイブ特性を示し、他方、未処理培養細胞
（表５）ではポジテイブ細胞はほとんど観察されず、ま
た擬似調製物処理した場合もほとんど観察されなかつた
（結果は示されていない）。純粋なrIFN−β２の調製物
の添加量が多くなれば、それにつれて、成長抑制（表
５）、及び細胞質の拡大あるいは核のくぼみなどの部分
的形態変化が促進される。しかしながら、本発明者は、
IFN−ガンマとともにIFN−β２を加えた場合には、IFN
−β２の低ドーズでの効果が有意に増加することを見出
した（表６）。この条件下では、細胞の成長が抑制さ
れ、ほとんどの細胞が、細胞質の拡大、核の型の変化及
び核小体の減少を示した。但し、単球の分化誘導は不完
全であつた。本発明者は、IFN−ガンマ100U/mlとIFN−
β２（１−10HGF U/ml）とを組合わせることによつて、
相乗効果を発揮し、成長抑制及び分化誘導の作用が増強
されることを見出した。最適条件下では、IFN−ガンマ
単独で10％の成長抑制が起こり（６日後）、IFN−β２
単独で25％の抑制が起こるが、IFN−ガンマとIFN−β２
とを組合わせると90％の抑制を示す。
ル、ビタミンD3によつて分化誘導することが出来、また
IFN−ガンマによつても部分的に分化誘導することが出
来、更に他の未だ同定されていないサイトカインによつ
ても分化誘導することが出来る。本発明者らは、U937培
養細胞にIFN−β2 100HGF U/mlを加えた時の効果を調べ
た。４−５日後に、約25％の細胞が単球／マクロフアー
ジ様形態を示し、30％の細胞が成長抑制された（表
５）。分化誘導の生化学的マーカーとしてのα−ナフチ
ルアセテートエステラーゼ用に細胞を染色した。IFN−
ガンマによつては分化誘導は起らない。IFN−β２で処
理した培養細胞の約1/4が非特異的エステラーゼについ
て強いポジテイブ特性を示し、他方、未処理培養細胞
（表５）ではポジテイブ細胞はほとんど観察されず、ま
た擬似調製物処理した場合もほとんど観察されなかつた
（結果は示されていない）。純粋なrIFN−β２の調製物
の添加量が多くなれば、それにつれて、成長抑制（表
５）、及び細胞質の拡大あるいは核のくぼみなどの部分
的形態変化が促進される。しかしながら、本発明者は、
IFN−ガンマとともにIFN−β２を加えた場合には、IFN
−β２の低ドーズでの効果が有意に増加することを見出
した（表６）。この条件下では、細胞の成長が抑制さ
れ、ほとんどの細胞が、細胞質の拡大、核の型の変化及
び核小体の減少を示した。但し、単球の分化誘導は不完
全であつた。本発明者は、IFN−ガンマ100U/mlとIFN−
β２（１−10HGF U/ml）とを組合わせることによつて、
相乗効果を発揮し、成長抑制及び分化誘導の作用が増強
されることを見出した。最適条件下では、IFN−ガンマ
単独で10％の成長抑制が起こり（６日後）、IFN−β２
単独で25％の抑制が起こるが、IFN−ガンマとIFN−β２
とを組合わせると90％の抑制を示す。
イムノアフイニテイーカラムで精製したrIFN−β２で
６日間処理した細胞及び未処理細胞を用いた。
６日間処理した細胞及び未処理細胞を用いた。
IFN−ガンマを加えることによつて、IFN−β２による
（２′−５′）オリゴＡシンセターゼの誘導も強く促進
され（表６）、この事実から、M1細胞の場合のような完
全な分化誘導を起こすには更に他の成分を加える必要が
あるかもしれないが、この２つのサイトカインは協力し
て分化誘導工程を進行させていることが判る。
（２′−５′）オリゴＡシンセターゼの誘導も強く促進
され（表６）、この事実から、M1細胞の場合のような完
全な分化誘導を起こすには更に他の成分を加える必要が
あるかもしれないが、この２つのサイトカインは協力し
て分化誘導工程を進行させていることが判る。
急性骨髄生白血病（AML）の新鮮な白血病細胞に対す
るIFN−β２活性についても調べた。AML患者の末梢血単
核細胞をrIFN−β2/IL−６と共に５日間インキユベート
した所、芽球の割合いが減少し（コントロール培養細胞
で20−30％、IFN−β2/IL−６処理細胞で６−12％）、
多種の分化段階における骨髄球型が上昇し且つ芽球に対
する骨髄単球の割合いが上昇した。２人のAML患者につ
いて調べた結果は表７に示した。GM−CSFについてもテ
ストした（比較用）。IFN−β2/IL−６は新鮮な白血病
細胞に対しても作用するため、このようなテストは、AM
Lに対するサイトカインの治療効果を予想するのに有用
である。
るIFN−β２活性についても調べた。AML患者の末梢血単
核細胞をrIFN−β2/IL−６と共に５日間インキユベート
した所、芽球の割合いが減少し（コントロール培養細胞
で20−30％、IFN−β2/IL−６処理細胞で６−12％）、
多種の分化段階における骨髄球型が上昇し且つ芽球に対
する骨髄単球の割合いが上昇した。２人のAML患者につ
いて調べた結果は表７に示した。GM−CSFについてもテ
ストした（比較用）。IFN−β2/IL−６は新鮮な白血病
細胞に対しても作用するため、このようなテストは、AM
Lに対するサイトカインの治療効果を予想するのに有用
である。
例８ 正常骨髄培養細胞に対する造血効果 CFU−mix（コロニー形成ユニツト−顆粒球、単球、赤
芽球、巨核球）、CFU−GM（コロニー形成ユニツト−顆
粒球、単球）及びBFU−Ｅ（バースト形成ユニツト−赤
芽球）コロニーのプロジエニターを除去するために４−
ヒドロキシシクロホスフアミド（４−HC）（100μg/ml,
30分）で処理した単球及びＴ細胞を含まないヒト骨髄細
胞を用いて、造血分化の初期の段階に与えるrIFN−β2/
IL−６の効果を調べた。細胞をメチルセルロース上にプ
レート（105）/ml）した時にIFN−β２を加えた所、IFN
−β２によつてはコロニーの成長は促進されなかつたこ
とから、IFN−β２は成長促進CSF（コロニー促進因子）
としては機能しないことが判つた（第15図）。しかしな
がら、顆粒球単球（CGU−GM）表現型並びに混合型（CFU
−GEMM）及び赤芽球（BFU−Ｅ）についてのコロニー形
成をIL−３が誘導する能力をIFN−β2/IL−６が著しく
増強せしめた。この作用に関しては、IFN−β2/IL−６
はIL−１よりも強力である（第15図）。細胞を十分なCS
Fとともにメチルセルロースにプレートする１週間前にI
FN−β2/IL−６を培養液に加える２工程アツセイ系で
は、IFN−β2/IL−６単独によつて、CSFに応答する前駆
細胞の数が上昇した（第15図右側）。この上昇度はIL−
３によるそれよりもほんとわずかに低いだけであり、２
つの因子はこの最初のアツセイ工程では独立に作用して
いると考えられる。第15図では、15日後にコロニーを計
測し、CFU−mix、CFU−GM、BFU−Ｅとして分類した。左
側半分は、何も加えないで培養０日目（10％胎児ウシ血
清及びエリスロポイエチン）、及び10HGF U/ml rIFN−
β2/IL−６、2U/ml rIL−１、10U/ml rIL−３、IFN−β
2/IL−６＋IL−３又はIL−１＋IL−３を加えた培養０日
目を示す。右側半分は、何も加えないであるいはrIFN−
β2/IL−６、rIL−１、rIL−３、IFN−β2/IL−６＋IL
−３又はIL−１＋IL−３を加えて細胞を培養液中で１週
間インキユベートした場合である。次いで、PHA−誘導
白血球ならし培地（全てCSFを含む）とともに細胞を15
日間メチルセルロースにプレートし、コロニー数を計測
した。正常な骨髄前駆細胞からの混合型コロニーの形成
促進効果は有意に高く、骨髄移植にrIFN−β2/IL−６を
使用できることを十分に保証するものである。
芽球、巨核球）、CFU−GM（コロニー形成ユニツト−顆
粒球、単球）及びBFU−Ｅ（バースト形成ユニツト−赤
芽球）コロニーのプロジエニターを除去するために４−
ヒドロキシシクロホスフアミド（４−HC）（100μg/ml,
30分）で処理した単球及びＴ細胞を含まないヒト骨髄細
胞を用いて、造血分化の初期の段階に与えるrIFN−β2/
IL−６の効果を調べた。細胞をメチルセルロース上にプ
レート（105）/ml）した時にIFN−β２を加えた所、IFN
−β２によつてはコロニーの成長は促進されなかつたこ
とから、IFN−β２は成長促進CSF（コロニー促進因子）
としては機能しないことが判つた（第15図）。しかしな
がら、顆粒球単球（CGU−GM）表現型並びに混合型（CFU
−GEMM）及び赤芽球（BFU−Ｅ）についてのコロニー形
成をIL−３が誘導する能力をIFN−β2/IL−６が著しく
増強せしめた。この作用に関しては、IFN−β2/IL−６
はIL−１よりも強力である（第15図）。細胞を十分なCS
Fとともにメチルセルロースにプレートする１週間前にI
FN−β2/IL−６を培養液に加える２工程アツセイ系で
は、IFN−β2/IL−６単独によつて、CSFに応答する前駆
細胞の数が上昇した（第15図右側）。この上昇度はIL−
３によるそれよりもほんとわずかに低いだけであり、２
つの因子はこの最初のアツセイ工程では独立に作用して
いると考えられる。第15図では、15日後にコロニーを計
測し、CFU−mix、CFU−GM、BFU−Ｅとして分類した。左
側半分は、何も加えないで培養０日目（10％胎児ウシ血
清及びエリスロポイエチン）、及び10HGF U/ml rIFN−
β2/IL−６、2U/ml rIL−１、10U/ml rIL−３、IFN−β
2/IL−６＋IL−３又はIL−１＋IL−３を加えた培養０日
目を示す。右側半分は、何も加えないであるいはrIFN−
β2/IL−６、rIL−１、rIL−３、IFN−β2/IL−６＋IL
−３又はIL−１＋IL−３を加えて細胞を培養液中で１週
間インキユベートした場合である。次いで、PHA−誘導
白血球ならし培地（全てCSFを含む）とともに細胞を15
日間メチルセルロースにプレートし、コロニー数を計測
した。正常な骨髄前駆細胞からの混合型コロニーの形成
促進効果は有意に高く、骨髄移植にrIFN−β2/IL−６を
使用できることを十分に保証するものである。
例９ 線維芽細胞におけ補体因子Ｂの誘導 ヒト二倍体皮膚線維芽細胞GM8399でのIFN−β２によ
る補体因子Ｂの誘導を調べた。イムノアフイニテイーカ
ラムによつて精製したIFN−β２を単独で用いた時にも
補体因子Ｂの分泌が誘導されたが、この効果についても
IFN−ガンマによつてその効果が増強された。補体因子
Ｂは、抗体なしにバクテリアあるいは寄生虫を殺すこと
のできる補体の他の経路に必須の成分であり、従つてIF
N−β２のこの効果は極めて重要である。このような感
染性病原体に対する局所での抵抗性は、IFN−β２とIFN
−ガンマとを組合わせて用いることによつて増強される
と考えられる。補体因子Ｂ活性が上昇したことが示され
た。IFN−ガンマとIFN−β２との相乗効果により、この
組合わせが極めて重要なことが判る。
る補体因子Ｂの誘導を調べた。イムノアフイニテイーカ
ラムによつて精製したIFN−β２を単独で用いた時にも
補体因子Ｂの分泌が誘導されたが、この効果についても
IFN−ガンマによつてその効果が増強された。補体因子
Ｂは、抗体なしにバクテリアあるいは寄生虫を殺すこと
のできる補体の他の経路に必須の成分であり、従つてIF
N−β２のこの効果は極めて重要である。このような感
染性病原体に対する局所での抵抗性は、IFN−β２とIFN
−ガンマとを組合わせて用いることによつて増強される
と考えられる。補体因子Ｂ活性が上昇したことが示され
た。IFN−ガンマとIFN−β２との相乗効果により、この
組合わせが極めて重要なことが判る。
薬学的組成物 本発明によれば、ヒトIFN−β２を、乳癌、急性骨髄
性白血病などの白血病、バクテリア又は寄生虫によつて
引き起される感染性疾患などの治療用に用いることが出
来、また骨髄移植の際に使用することも出来る。ヒトIF
N−β２は、感染性疾患あるいはある種の白血病の治療
用には、他のサイトカイン、特にIFN−ガンマと組合わ
せて用いることも出来る。もちろんIFN−β２単独で用
いることも出来る。IFN−β２は、治療が必要とされる
患者によつて適当であればいずれのルートによつて投与
することが出来る。IFN−β２は、１つもしくはそれ以
上の薬学的に許容し得る担体とともに製剤化することが
出来、非経口、静脈又は皮下投与によつて、あるいは錠
剤、カプセル剤の形態で経腸投与によつて、全身的に投
与することが出来る。
性白血病などの白血病、バクテリア又は寄生虫によつて
引き起される感染性疾患などの治療用に用いることが出
来、また骨髄移植の際に使用することも出来る。ヒトIF
N−β２は、感染性疾患あるいはある種の白血病の治療
用には、他のサイトカイン、特にIFN−ガンマと組合わ
せて用いることも出来る。もちろんIFN−β２単独で用
いることも出来る。IFN−β２は、治療が必要とされる
患者によつて適当であればいずれのルートによつて投与
することが出来る。IFN−β２は、１つもしくはそれ以
上の薬学的に許容し得る担体とともに製剤化することが
出来、非経口、静脈又は皮下投与によつて、あるいは錠
剤、カプセル剤の形態で経腸投与によつて、全身的に投
与することが出来る。
投与する活性成分の量は医者によつて決定され、それ
は、症状、患者の体重、年令、患者の一般的な状態、投
与ルート、IFN−β２の比活性などに応じて変動する。
１日の投与量は、約５μｇ−約800μｇ、好ましくは10
−100μｇの範囲である。
は、症状、患者の体重、年令、患者の一般的な状態、投
与ルート、IFN−β２の比活性などに応じて変動する。
１日の投与量は、約５μｇ−約800μｇ、好ましくは10
−100μｇの範囲である。
本発明の薬学的組成物は、単位投与形態にあるのが便
宜的であり、当業者に公知の方法によつて単位投与形態
に成型することが出来る。
宜的であり、当業者に公知の方法によつて単位投与形態
に成型することが出来る。
第１図は、IFN−β２のヌクレオチド配列及びアミノ酸
配列を示す。 第２図は、プラスミドpSVβ2HBの構築を示す。 第３図は、プラスミドpRIβ2802及びpRIβ2604の構築を
示す。 第４図は、ウエスタンブロツテイングによるIFN−β２
調製物の分析結果を示す写真である。 第５図は、IFN−β２の溶出フラクシヨンをSDS−PAGEに
付して銀染色した結果を示す写真である。 第６図は、プラスミドpSVβ229の構築を示す。 第７図は、モノクローナル抗体34−１を用いたアフイニ
テイ−クロマトグラフイー後の、CHOクローンA2−５−1
0により産生されるIFN−β２を含む非結合フラクシヨン
のHGF活性を示す。 第８図は、モノクローナル抗体34−１を用いたアフイニ
テイクロマトグラフイー後の、CHOクローンA2−５−10
により産生されるIFN−β２を含む溶出フラクシヨンのH
GF活性を示す。 第９図は、プラスミドpTLβ2501及びpKKβ2７の構築を
示す。 第10図は、イムノアフイニテイーカラム及びＳ−セフア
ロースによる精製後の、E.coli IFN−β２をSDS−PAGE
に付して銀染色した結果を示す写真である。 第11図は、乳癌セルラインT47Dコロニー形成のE.coli I
FN−β２による抑制を示す。 第12図は、乳癌セルラインT47D及びMCF−７細胞のE.col
i IFN−β２を用いたクローン原性アツセイの結果を示
す。 第13図は、生物の形態を示す写真であつて、E.coli IFN
−β２によつて誘導される骨髄性白血病M1細胞の分化誘
導を示す。 第14図は、IFN−β２（HGFユニツト/ml）により処理し
た骨髄性白血病M1細胞の成長及び（２′−５′）オリゴ
Ａシンセターゼ誘導を示す。 第15図は、正常ヒト骨髄から得られる造血コロニーの成
長に及ぼすIFN−β２の効果を示す。
配列を示す。 第２図は、プラスミドpSVβ2HBの構築を示す。 第３図は、プラスミドpRIβ2802及びpRIβ2604の構築を
示す。 第４図は、ウエスタンブロツテイングによるIFN−β２
調製物の分析結果を示す写真である。 第５図は、IFN−β２の溶出フラクシヨンをSDS−PAGEに
付して銀染色した結果を示す写真である。 第６図は、プラスミドpSVβ229の構築を示す。 第７図は、モノクローナル抗体34−１を用いたアフイニ
テイ−クロマトグラフイー後の、CHOクローンA2−５−1
0により産生されるIFN−β２を含む非結合フラクシヨン
のHGF活性を示す。 第８図は、モノクローナル抗体34−１を用いたアフイニ
テイクロマトグラフイー後の、CHOクローンA2−５−10
により産生されるIFN−β２を含む溶出フラクシヨンのH
GF活性を示す。 第９図は、プラスミドpTLβ2501及びpKKβ2７の構築を
示す。 第10図は、イムノアフイニテイーカラム及びＳ−セフア
ロースによる精製後の、E.coli IFN−β２をSDS−PAGE
に付して銀染色した結果を示す写真である。 第11図は、乳癌セルラインT47Dコロニー形成のE.coli I
FN−β２による抑制を示す。 第12図は、乳癌セルラインT47D及びMCF−７細胞のE.col
i IFN−β２を用いたクローン原性アツセイの結果を示
す。 第13図は、生物の形態を示す写真であつて、E.coli IFN
−β２によつて誘導される骨髄性白血病M1細胞の分化誘
導を示す。 第14図は、IFN−β２（HGFユニツト/ml）により処理し
た骨髄性白血病M1細胞の成長及び（２′−５′）オリゴ
Ａシンセターゼ誘導を示す。 第15図は、正常ヒト骨髄から得られる造血コロニーの成
長に及ぼすIFN−β２の効果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き 微生物の受託番号 ＣＮＣＭ Ｉ−８１３ 前置審査 (72)発明者 イブズ モリィ イスラエル国 レホボト エス．ベン ジオン ストリート 46／13 (72)発明者 ルイーズ チェン イスラエル国 ラマット アビブ，タゴ ー ストリート 52 (72)発明者 ダニエラ ノビック イスラエル国 レホボト，ハナシ ハリ シヨン ストリート 40 (72)発明者 リタ ミカレビグズ イスラエル国 ペタ ティクバ，アンデ ルセン ストリート 10／26 (56)参考文献 特開 昭61−115024（ＪＰ，Ａ) Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，18 （1988）Ｐ．951−956 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ．，82（1985）Ｐ．5490− 5494 Ｎａｔｕｒｅ，276（1978）Ｐ．269− 270 ＥＭＢＯ Ｊ．５（1986）Ｐ．2529− 2537 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，259 （1984）Ｐ．1695−1702
Claims (5)
- 【請求項１】以下に示す特性ａ）〜ｄ）を有するモノク
ローナル抗体： ａ）ヒト天然インターフェロン−β２（IFN−β２）、
哺乳動物細胞によって発現されるヒト組換えIFN−β
２、及びバクテリア細胞によって発現されるヒト組換え
IFN−β２に特異的に結合することができる； ｂ）ヒトIFN−β２に結合した時にその生物学的活性を
抑制することができる； ｃ）当該モノクローナル抗体に結合したIFN−β２は50m
Mクエン酸によって遊離させることができる； 及び ｄ）ハイブリドーマセルラインCNCM I−813によって発
現される。 - 【請求項２】請求項１に記載のモノクローナル抗体を発
現することができるハイブリドーマセルラインCNCM I−
813。 - 【請求項３】請求項１に記載のモノクローナル抗体を調
製する方法であって、 ハイブリドーマセルラインCNCM I−813を適当な生育培
地で培養し、次いで該培地の上清から回収する、 ことからなるモノクローナル抗体を調製方法。 - 【請求項４】請求項１に記載のモノクローナル抗体を調
製する方法であって、 ハイブリドーマセルラインCNCM I−813をマウスに注入
し、そのマウスの腹水から回収する、 ことからなるモノクローナル抗体を調製方法。 - 【請求項５】生物学的に活性なヒトIFN−β２の免疫学
的精製法であって、 固相支持体に結合した請求項１に記載のモノクローナル
抗体を含む免疫吸着カラムに、ヒトIFN−β２を含むサ
ンプルを通し、カラムを洗浄し、次いでカラムからIFN
−β２を溶出させる、 ことからなる生物学的に活性なヒトIFN−β２の免疫学
的精製法。
Applications Claiming Priority (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IL85204 | 1988-01-26 | ||
| IL85204A IL85204A0 (en) | 1988-01-26 | 1988-01-26 | Recombinant human interferon beta2,its preparation and pharmaceutical compositions comprising it |
| US19358088A | 1988-05-13 | 1988-05-13 | |
| US193580 | 1988-05-13 | ||
| IL88375 | 1988-11-14 | ||
| IL193580 | 1988-11-14 | ||
| IL88376A IL88376A0 (en) | 1988-11-14 | 1988-11-14 | Pharmaceutical compositions containing interferon-beta 2 |
| IL8837588A IL88375A (en) | 1988-11-14 | 1988-11-14 | Monoclonal antibodies that specifically bind interferon-bia 2 natural and recombinant and a natural and recombinant interferon-beta 2 purification method and method |
| IL88376 | 1988-11-14 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH029394A JPH029394A (ja) | 1990-01-12 |
| JP2725818B2 true JP2725818B2 (ja) | 1998-03-11 |
Family
ID=27452320
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1016080A Expired - Lifetime JP2725818B2 (ja) | 1988-01-26 | 1989-01-25 | ヒトインターフエロンベーター２、その精製法及びその用途 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0326120B1 (ja) |
| JP (1) | JP2725818B2 (ja) |
| AT (1) | ATE165010T1 (ja) |
| AU (1) | AU621852B2 (ja) |
| CA (1) | CA1341588C (ja) |
| DE (1) | DE68928641T2 (ja) |
| ES (1) | ES2119735T3 (ja) |
Families Citing this family (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PT92479A (pt) * | 1988-12-01 | 1990-06-29 | Univ North Carolina | Processo de preparacao de genes recombinantes e suas proteinas de codificacao |
| JPH0331215A (ja) * | 1989-06-27 | 1991-02-12 | Ajinomoto Co Inc | 制癌療法支持剤 |
| DE3939706C1 (ja) * | 1989-12-01 | 1991-03-21 | Centre Regional De Transfusion Sanguine, Besancon, Fr | |
| ES2062762T3 (es) * | 1989-12-04 | 1994-12-16 | Schering Corp | Metodo para tratar el choque septico. |
| IT1247484B (it) * | 1991-03-22 | 1994-12-17 | Ceinge Societa Consortile A R | Metodo per la preparazione di interleuchina 6 |
| US5902576A (en) * | 1992-10-22 | 1999-05-11 | Yeda Research And Development Co. Ltd. At Weizmann Institute Of Science | Antitumor pharmaceutical composition comprising IL-6 transfected cells |
| WO1996025433A1 (en) * | 1995-02-15 | 1996-08-22 | Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | B cell differentiation and proliferation factors and methods for obtaining and using the same |
| WO1997016202A1 (en) * | 1995-10-27 | 1997-05-09 | Amrad Operations Pty. Ltd. | Cytokines and their use in treatment and/or prophylaxis of breast cancer |
| CA2312188C (en) | 1997-12-08 | 2010-06-29 | Lexigen Pharmaceuticals Corp. | Heterodimeric fusion proteins useful for targeted immune therapy and general immune stimulation |
| SK782002A3 (en) | 1999-07-21 | 2003-08-05 | Lexigen Pharm Corp | FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens |
| DK1200479T3 (da) | 1999-08-09 | 2006-05-15 | Emd Lexigen Res Ct Corp | Multiple cytokin-antistof-komplekser |
| WO2001058957A2 (en) | 2000-02-11 | 2001-08-16 | Lexigen Pharmaceuticals Corp. | Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins |
| KR100900176B1 (ko) | 2001-03-07 | 2009-06-02 | 메르크 파텐트 게엠베하 | 하이브리드 이소타입 항체 부분구조를 포함하는 단백질을위한 발현 기술 |
| US6992174B2 (en) | 2001-03-30 | 2006-01-31 | Emd Lexigen Research Center Corp. | Reducing the immunogenicity of fusion proteins |
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