CN116715761B - 一种治疗性单克隆抗体及应用 - Google Patents
一种治疗性单克隆抗体及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种治疗性单克隆抗体及应用，所述治疗性单克隆抗体识别CCN1蛋白，本发明采用以杂交瘤技术为主的方式进行单克隆抗体的制备和筛选，得到了具备稳定表达针对CCN1蛋白高亲和力抗体的杂交瘤细胞株及其相应单克隆抗体，本发明所得单克隆抗体对CCN1蛋白具有较高的结合能力和亲和能力。所述单克隆抗体在寻求治疗银屑病的新靶点上具有重要的应用价值，为银屑病的治疗开拓了新方向。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种治疗性单克隆抗体及应用，尤其涉及一种识别CCN1蛋白的单克隆抗体及其应用。
背景技术
银屑病（psoriasis）俗称牛皮癣，是一种由免疫介导的鳞屑性皮损为主要特征的慢性炎症性皮肤疾病，属于自体免疫性疾病，通常以上覆银白色鳞屑的红色丘疹和斑块为特征，但也可见其他临床表现，影响皮肤和关节。其严重程度因遗传和环境因素而不同，有些患者病情较轻，在肘部、膝盖或头皮上有孤立的鳞状红斑斑块，而有些患者的皮肤表面可受到100%的影响。银屑病的发病原因复杂，具体机制至今不甚清楚。
从遗传角度分析，银屑病的发生与多种易感基因有较强的关联性，如PSORS1、IL- 12B、IL-23R或TNFAIP3等。作为慢性皮肤病，其病情的发生发展与炎症的产生和维持也有密切的关联。当带有银屑病易感基因的个体遇到多种潜在的环境诱因，如创伤、感染、药物或紫外线照射等，会使机体的固有免疫和适应性免疫系统产生免疫反应。
目前银屑病的致病模型认为：银屑病的发病始于环境诱因和/或耐受丧失，导致浆细胞样树突状细胞（pDCs）和IL-23产生的皮肤树突状细胞（DC）的激活。一些促炎DC细胞群呈现银屑病自身抗原，并触发T17细胞极化和克隆扩增。活化的T17细胞产生关键的细胞因子，包括IL-17、IL-26、IL-29和TNF-α，它们作用于表皮角质形成细胞，促进皮肤的前馈炎症反应。IL-17单独或与TNF-α协同作用诱导角质形成细胞中银屑病相关基因的表达，导致表皮增生和抗菌肽的产生（如hBD2、S100s和LL37/cathelicidin）。角质形成细胞衍生的CCR20招募CCR6+细胞（产生IL-23的tip-dc和产生IL-17的T细胞）进一步促进炎症反应。CXCL1/2/3/5/8也由角质形成细胞产生，并将中性粒细胞和巨噬细胞招募到发炎的皮肤中。IL-23促进产生IL-22的T22细胞的克隆扩增和分化，IL-22与IL-19/IL-36g共同作用，改变角质形成细胞的终末分化和增殖。活化的树突状细胞和角质形成细胞来源的CXCL9/10/11产生的IL-12促进Th1细胞流入银屑病皮损。皮肤中的ILC3s也产生IL-17和IL-22，这进一步增加皮肤炎症的发展。这些因素导致在银屑病患者的皮肤中，角质形成细胞过度活化，角化不全且大量增殖，炎性细胞又被不断招募和迁移，使得炎症和皮肤损伤不断加剧，最终形成银屑病最显著的症状，即皮肤表皮增生及慢性炎症，鳞屑脱落，病情反复不愈。
在临床上，根据不同的病理特征和症状表现，银屑病主要分为：寻常型银屑病、脓疱型银屑病、红皮病型银屑和关节型银屑病。其中脓疱型银屑病又分为局限性和泛发性两种，但是都会在发病部位伴随无菌性脓疱，泛发性甚至会出现片状脓糊，全身分布，发生红皮病变，肿胀疼痛，甚至伴随寒战和高热的现象。
脓疱型银屑病是一种罕见疾病，亚洲人的患病率高于高加索人。脓疱型银屑病的遗传特征、临床表现和病理变化表明其发病机制与寻常型银屑病有显著不同。在脓疱型银屑病患者的皮肤损伤部位组织中，表皮组织的棘皮改变，同时伴随以中性粒细胞为主的炎性细胞大量浸润，导致脓疱形成。
与寻常型银屑病相似的是，脓疱型银屑病的发生也与某些基因的突变具有较强关联性，如IL36RN、IL1RN等。文献报道，约75%的脓疱型银屑病患者携带IL36RN基因的失活突变。在正常生理情况下，IL-36RN蛋白与IL-36竞争结合IL-36受体，抑制IL-36信号通路的活化，对IL-36通路的激活起到精细调控作用。而IL36RN基因的失活突变，使IL-36RN蛋白无法正常表达，造成IL-36通路的激活失控，促使皮肤中IL-8、CXCL1、CXCL2、IL-18等趋化因子和细胞因子大量分泌，招募大量以中性粒细胞为代表的炎性细胞迁移浸润，形成脓疱。
银屑病的治疗和用药：银屑病不仅仅是一种皮肤病，更是一种系统性疾病。目前的治疗主要是控制和稳定病情，减缓全身发展进程，消除或减轻红斑、鳞屑、斑块皮损等，减少不良反应，提高生活质量。虽然银屑病的特点是表皮增生，免疫系统在这一疾病的发展有突出的作用。银屑病的治疗包括外用皮质类固醇、焦油、蒽醌、维生素D类似物、他扎罗汀和水杨酸。用紫外线B光（UBV）、窄带UVB、补骨脂素、用紫外线A光（PUVA）、口服阿维甲酸、甲氨蝶呤和环孢素也是非常有效的。并且由于银屑病会反复发作，对患者的生活质量有实质性的负面影响，并有可能会对患者心理造成负担。在银屑病的治疗中，更是涉及到了身体和社会心理两个部分。
随着生物制剂的发展，截止至2021年，银屑病治疗生物制剂获批上市，已用于治疗银屑病的生物制剂包括肿瘤坏死因子α抑制剂、白细胞介素12/23抑制剂和白细胞介素17A抑制剂三大类7种制剂。其中英夫利昔单抗和依那西普两种药物曾被用于治疗克罗恩病、类风湿关节炎和银屑病关节炎。
对于银屑病中的脓疱型银屑病的治疗，以控制及稳定病情、减缓发展进程、减轻临床症状为主。尽可能避免诱发病情加重的因素，减少治疗的不良反应，提高患者的依从性和生活质量。与其他类型的银屑病一样，目前治疗只能控制病情，不能阻止复发，用药也是以激素类、光照等为主，没有提及生物制剂、抗体类药物的治疗。虽然目前上市了7种单抗药物，但这7种单抗药物在多个国家的用药指南中均没有提及其对脓疱型银屑病的治疗。虽然这7种药物有望成为治疗脓疱型银屑病的潜在药物，但是还有很长的一段路要走。所以，发现和开发出针对脓疱型银屑病的抗体药物势在必行。
Cyr61（cysteine-rich 61）是一种由381个氨基酸残基组成的细胞外基质蛋白，相对分子质量约为42 kDa；因其氨基酸序列富含半胱氨酸残基（约占10%）而被命名为富含半胱氨酸蛋白61。Cyr61属于结缔组织生长因子（Connective tissue growth factor/Cysteine-rich 61/Nephroblastoma overexpressed family，CCN）家族，是该家族中最早被发现的成员，编号为CCN1。Cyr61蛋白有一个信号肽和四个功能区，广泛参与机体生命活动的多种生理及病理过程。Cyr61分泌到细胞外基质后，可与细胞膜表面的多种整合素受体结合，激活下游的信号转导通路，发挥不同的生物学功能。
Cyr61在体内多种组织和器官都有不同水平的表达。在胚胎发育的过程中，Cyr61主要表达于外胚层和中胚层发育而来的组织，如软骨、血管平滑肌和胎盘等。在成年个体组织中，Cyr61在子宫、卵巢、睾丸、心血管、肺、肠、肾等多种组织均有表达。此外，Cyr61还在某些肿瘤细胞中高表达，如乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、胃癌细胞或黑色素瘤细胞等。Cyr61的表达受到多种因素调控，如生长因子、炎症因子、激素、低氧条件和机械张力刺激等。在功能上，Cyr61广泛参与调控细胞增殖粘附、迁移、分化以及凋亡等多种生物学过程。在胚胎时期，Cyr61与神经系统、肌肉、骨髓、软骨、骨以及血管的发生与形成有关。而在成年个体，Cyr61在创伤愈合、血管生成、骨折修复和肿瘤的发生转移等多种生理及病理过程中起重要作用。
自2009年以来，Cyr61在自身免疫病和炎症性疾病发生发展中的致病作用逐渐被揭示，并引发一定的关注。文献报道，在类风湿关节炎病人的滑膜局部，关节滑膜细胞在高水平的IL-17诱导下，分泌更多的Cyr61，一方面直接促进了滑膜细胞自身的增殖，造成软骨的侵蚀破坏；另一方面通过自分泌方式诱导滑膜细胞分泌IL-6，间接促进Th17细胞分化，加剧了关节局部炎症的发展。由此，IL-17/Cyr61/IL-6三者在关节滑膜局部形成了“炎症-组织损伤”的恶性循环。而Cyr61中和抗体能够阻断滑膜细胞与Th17细胞的交流，在胶原诱导的小鼠类风湿性关节炎模型中展示出非常显著的治疗效果。
除了类风湿关节炎患者的滑膜组织以外，Cyr61在银屑病病人皮肤损伤部位的表皮组织中也呈现很高的表达水平，而anti-Cyr61抗体在咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型中也都显示出较强的治疗效果。有多篇文章报道Cyr61蛋白通过影响角质形成细胞的活化状态，调控角质形成细胞中IL-1β、CCL20和IL-8等细胞因子和趋化因子的表达，从而促进皮肤表皮层异常增生、炎性细胞浸润和血管形成等病理过程的发生发展。
综上所述，Cyr61已被认为是一种促进炎症发生发展的早期炎症因子。Cyr61在类风湿关节炎和银屑病等炎症疾病中的研究，显示出其作为自身免疫病和炎性疾病治疗靶点的潜力。针对Cyr61的单克隆抗体，可能成为干预自身免疫病和炎性疾病的新思路和新手段。
目前，针对银屑病和脓疱型银屑病的治疗，靶向TNF-α、IL-17和IL-23的单克隆抗体等生物制剂开始应用于银屑病的临床治疗，但获批适应症仍集中于中重度寻常型银屑病患者，并且在临床应用中仍存在仅部分病人有效、容易引发感染、易复发、并发症及毒性等问题。而且对于脓疱型银屑病和红皮病型银屑病等其他银屑病分型，目前临床治疗方法仍局限于环孢霉素、甲氨蝶呤等非靶向药物、激素及光化学疗法等，且疗效有限。目前针对脓疱型银屑病开发的抗体药物品类更是少之又少，靶点以IL-36通路和IL-1通路为主。其中，IL-1通路靶点的药物，其主要适应症为肿瘤及川崎病等炎性疾病。IL-36通路靶点的药物，以AnaptysBio公司的ANB019/Imsidolimab和Boehringer Ingelheim公司的BI655130/Spesolimab为代表。二者均为anti-IL36R单克隆抗体，通过阻断IL-36受体与配体的结合，抑制IL-36通路的活化，降低趋化因子和细胞因子的分泌，使炎性细胞的浸润减少，从而缓解皮肤脓疱形成，减轻皮肤组织的损伤。
因此，发现和开发出针对脓疱型银屑病的抗体药物，提供更多的治疗脓疱型银屑病的潜在药物具有重要的意义。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种治疗性单克隆抗体及应用。本发明采用以杂交瘤技术为主的方式进行单克隆抗体的制备和筛选，得到了具备稳定表达针对CCN1蛋白高亲和力抗体的杂交瘤细胞株，本发明所得单克隆抗体对CCN1蛋白具有较高的结合、亲和能力，为治疗脓疱型银屑病增加新的抗体药物。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种识别CCN1蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3；所述轻链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3；
所述重链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；CDR2的氨基酸序列如SEQID NO:2所示；CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；
所述轻链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；CDR2的氨基酸序列如SEQID NO:5所示；CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；
或，所述重链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；
所述轻链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；
或，所述重链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示；CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示；CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；
所述轻链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示；CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示；CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示；
或，所述重链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示；CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示；CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示；
所述轻链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示；CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示；CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示。
本发明中所述单克隆抗体对CCN1蛋白具有较高的结合、亲和能力，所述单克隆抗体有潜力解决有效性、容易引发感染、易复发、并发症及毒性等问题，本发明所述单克隆抗体在寻求治疗银屑病的新靶点上具有重要的应用价值，为银屑病的治疗开拓了新方向，为治疗脓疱型银屑病增加新的可能。
优选地，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示；所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示；
或，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示；所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示；
或，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示；所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示；
或，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示；所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示。
本发明中包括四种单克隆抗体，分别为单克隆抗体-9、单克隆抗体-15、单克隆抗体-41和单克隆抗体-47。
单克隆抗体-9：
SEQ ID NO:1重链可变区CDR1：TSGMGIG。
SEQ ID NO:2重链可变区CDR2：HIWWDDDKYYNPSLKS。
SEQ ID NO:3重链可变区CDR3：VYGNFFAY。
SEQ ID NO:4轻链可变区CDR1：KSSQSLLNSGNQKNYLA。
SEQ ID NO:5轻链可变区CDR2：GASTRES。
SEQ ID NO:6轻链可变区CDR3：QNDHSYPLT。
SEQ ID NO:25重链可变区：
QVTLKESGPGILKPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGIGWIRQPSGKGLEWLAHIWWDDDKYYNPSLKSQLTISKDTSRNQVFLKITSVDTADTATYYCARVYGNFFAYWGQGTRSPSRA。
SEQ ID NO:26轻链可变区：
DIVMTQSPSSLSVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDHSYPLTFGAGTKLELKRA。
单克隆抗体-15：
SEQ ID NO:7重链可变区CDR1：SYDIN。
SEQ ID NO:8重链可变区CDR2：WIFPGDGSTKYNEKFKG。
SEQ ID NO:9重链可变区CDR3：DGFDY。
SEQ ID NO:10轻链可变区CDR1：RASQSISDYLH。
SEQ ID NO:11轻链可变区CDR2：YASQSIS。
SEQ ID NO:12轻链可变区CDR3：QNGHSFPLT。
SEQ ID NO:27重链可变区：
DVQLVESGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYDINWVRQRPEQGLEWIGWIFPGDGSTKYNEKFKGKATLTTDKSSSTAYMQLSRLTSEDSAVYFCARDGFDYWGQGTTLTVSS。
SEQ ID NO:28轻链可变区：
ENVLTQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQSISDYLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGSDFTLSINSVEPEDVGVYYCQNGHSFPLTFGAGTKLEIK。
单克隆抗体-41：
SEQ ID NO:13重链可变区CDR1：SFGVH。
SEQ ID NO:14重链可变区CDR2：VKWSGGNTNYNSALMS。
SEQ ID NO:15重链可变区CDR3：EGYGNWFAY。
SEQ ID NO:16轻链可变区CDR1：RSSQSILHSNGNTYLE。
SEQ ID NO:17轻链可变区CDR2：KVSKRFS。
SEQ ID NO:18轻链可变区CDR3：FQGSHVPPT。
SEQ ID NO:29重链可变区：
QSLSITCTVSGFSLTSFGVHWVRQSPGKGLEWLGVKWSGGNTNYNSALMSRLSISKDNSKSQVFLEMNSLQIDDSAIYYCVREGYGNWFAYWGQGTLVTVSS。
SEQ ID NO:30轻链可变区：
DVLMTQIPLSLPVSLGDQASISCRSSQSILHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPPTFGGGTKLEIKRA。
单克隆抗体-47：
SEQ ID NO:19重链可变区CDR1：DYYIN。
SEQ ID NO:20重链可变区CDR2：EIYPGSGDTYYNEKFRG。
SEQ ID NO:21重链可变区CDR3：GLPH。
SEQ ID NO:22轻链可变区CDR1：RSSKSLLHSNGNTYLY。
SEQ ID NO:23轻链可变区CDR2：RMSNLAS。
SEQ ID NO:24轻链可变区CDR3：MQHLEDPYS。
SEQ ID NO:31重链可变区：
QVQLQQSGAELARPGASVQLSCKASGYTFTDYYINWVKQKTGQGLEWIGEIYPGSGDTYYNEKFRGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARGLPHWGQGTLVTVSA。
SEQ ID NO:32轻链可变区：
DIVMTQAVPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLISRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEDPYSFGGGTKLELKRA。
第二方面，本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码第一方面所述的识别CCN1蛋白的单克隆抗体。
第三方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括第二方面所述的核酸分子。
第四方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有第三方面所述的表达载体，或所述宿主细胞的基因组中整合了第二方面所述的核酸分子。
第五方面，本发明提供了一种结合物，所述结合物为包含与化学标记或生物标记共价连接的第一方面所述的识别CCN1蛋白的单克隆抗体。
第六方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括第一方面所述的识别CCN1蛋白的单克隆抗体，或者第五方面中所述的结合物。
第七方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物中包括第一方面所述的识别CCN1蛋白的单克隆抗体。
优选地，所述药物组合物中还包括药学上可接受的辅料。
第八方面，本发明提供了第一方面所述的识别CCN1蛋白的单克隆抗体、第二方面所述的核酸分子，第三方面所述的表达载体、第四方面所述的宿主细胞、第五方面所述的结合物或第七方面所述的药物组合物中任意一种或至少两种的组合在制备治疗银屑病的药物中的应用。
优选地，所述银屑病的类型为脓疱型银屑病。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明所得单克隆抗体对CCN1蛋白具有较高的结合、亲和能力，为治疗脓疱型银屑病增加新的抗体药物。
附图说明
图1是蛋白免疫小鼠血清效价检测结果（HSA非完全、HSA完全）；
图2是流式检测CCN1抗体与过表达human CCN1的CHO-K1细胞系上的CCN1蛋白的结合能力验证结果（对照）；
图3是流式检测CCN1抗体与过表达human CCN1的CHO-K1细胞系上的CCN1蛋白的结合能力验证结果（样本组）；
图4是杂交瘤纯化后的抗体的电泳胶图；
图5是抑制增殖实验的检测结果。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
发明详述：
抗体药物具有靶向性强、副作用小和疗效显著的优点，还可以靶向于非保守的位点区域。本发明将CCN1的蛋白打入小鼠体内，生成天然的抗体。除此之外抗体在体内的清除率更低，作用时间更长，相应的给药频率更低；并且在给定剂量下，抗体的血浆浓度的个体差异更小，并且还能通过抗体依赖的细胞毒性，补体依赖的细胞毒性以及抗体依赖的细胞吞噬作用而杀死细胞。基于以上单抗药物的优点，伴随着单抗类药物开发技术的进步，以及靶点生物学功能基础研究的推进，发现并开发靶向CCN1的抗体药物变得尤其的重要。
本发明以杂交瘤技术进行单克隆抗体的制备和筛选，通过Single B cellsequencing（单个B细胞测序）、phage display（噬菌体展示）等方式辅助筛选，增加单克隆抗体的多样性。杂交瘤技术在抗体药物研发领域中已作为经典技术广泛使用多年；SingleB cell sequencing（单个B细胞测序）、phage display（噬菌体展示）等方式也已逐步应用于各类抗体药物筛选，处于技术积累和发展阶段。
杂交瘤抗体筛选技术为具有靶点特异性且高亲和力的单克隆抗体提供了筛选平台。该技术主要将能分泌抗体但不能无限增殖的浆B细胞与能在体外增殖且长期培养的骨髓瘤细胞相融合，筛选得到既能分泌特异性抗体且能长期培养无限增殖的杂交瘤细胞。并通过杂交瘤的扩大培养实现单克隆抗体的生产制备，还可以通过液氮冷冻保存杂交瘤细胞为后期抗体生产提供了便利。
实施例1 单克隆抗体的制备
（1）免疫小鼠以及血清学效价测定
为了获得更高的小鼠免疫效价，使用弗氏佐剂作为免疫佐剂，同时免疫中尝试了采用不同标签的蛋白，不同的乳化方式。设置了2个组别：CCN1-HSA非完全乳化组、CCN1-HSA完全乳化组。弗式佐剂采用多点皮下注射的方式，在初次免疫以后，每两周进行一次加强免疫，共进行三次免疫后，用蛋白ELISA检测小鼠血清中抗体效价。所述免疫方式操作简单，用蛋白ELISA的方式检测小鼠血清中CCN1抗体与CCN1蛋白的结合能力，蛋白免疫小鼠血清效价检测结果如图1所示，图1展示了不同血清稀释倍数下抗体的结合能力，大部分小鼠均得到了较好的效价。
（2）细胞融合
在最后一针加强免疫后3天，挑选出小鼠血清中抗体效价最高的一只老鼠，取出脾脏并在基础培养基中研磨后获得富含淋巴细胞的悬液。为了能够得到可供筛选的杂交瘤细胞，首先建立了（a）传统的PEG融合方法；在此基础上，为了提升融合效率，又建立了（b）高效的电转的方式，将其与小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）融合。将融合细胞在含有HAT的RPMI-1640完全培养基中37℃孵育1个小时后，进行铺板。为了后期更高效的获取杂交瘤阳性细胞，且为后期亚克隆提供便利，尝试了5000/孔、104/孔、2×104/孔及105/孔的细胞浓度进行铺板筛选；且对换液时间及亚克隆方式都进行了多种尝试及优化。具体的方法如下所述：
1）PEG融合方法：将用不完全培养基清洗过的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞按照5：1的比例混合，离心弃上清后，慢慢往细胞中滴入1 mL 50%的PEG溶液，短暂静置后往混合细胞内加入不完全培养基终止促融作用。再次离心后将培养基换成含有HAT的筛选培养基，按105/孔铺入96孔板中，37℃培养箱培养4-7天后换成HT培养基进行后期筛选实验。
2）电融合方法：将小鼠脾细胞悬液，与SP2/0细胞分别用不完全培养基清洗3遍后。将两种细胞按照1:1比例（例如5×107脾细胞与5×107骨髓瘤细胞）混合，并用电融合液离心清洗3遍后，按照107/mL细胞密度加入9 mL融合池中，参照融合条件进行电融合。融合完成后将细胞加入含HAT的筛选培养基中，37℃静置1小时，并按2×104/孔铺入96孔板。HAT筛选至第四天换成HT培养基继续培养至第七天，取上清用进行抗体亲和力检测。
（3）杂交瘤亚克隆
将通过ELISA筛选出的杂交瘤阳性孔按3倍梯度稀释加入A1孔，并纵向每个孔3倍稀释4个梯度（A1-D1），再用排枪向横向3倍梯度稀释（A1至A2，A2至A3以此类推）。每个杂交瘤克隆亚克隆得到半块96孔板，待7天以后取杂交瘤上清进行ELISA检测（检测时抗原为1 μg/mL，每孔100 μL）。共进行三轮亚克隆，确保获得的杂交瘤克隆为抗体稳定表达的单克隆株。
在该项目验证中，本实施例通过上述方法在53块HAT筛选板中，通过细胞膜表面蛋白检测（ELISA），筛选出多株可以结合CCN1蛋白的抗体表达克隆株，并进行三轮亚克隆后，筛选到185个具备稳定表达针对CCN1蛋白高亲和力抗体的细胞株。
（4）杂交瘤克隆株抗体的功能检测
本实施例对这185株杂交瘤单克隆进行了抗体表达功能性的检测，用流式检测杂交瘤抗体与CHO-K1过表达细胞系上human CCN1的结合能力。将过表达human CCN1的CHO-K1细胞系消化下来，铺于96孔板中，1w个/孔，离心，PBS洗三次。弃上清，加入杂交瘤上清，室温孵育1小时后，以PBS洗脱3次，加入anti-mouse-IgG-APC，室温孵育1小时后，以PBS洗脱3次，将细胞重悬于PBS中，流式细胞分析仪检测。结果如图2和图3所示，流式检测CCN1抗体与过表达human CCN1的CHO-K1细胞系上的CCN1蛋白的结合能力验证结果（对照）如图2，阴性对照为CHO-K1-hCCN1细胞（APC 0.19%），未加一抗；阳性对照为CHO-K1-hCCN1细胞与anti-CCN1 reference抗体的结合（APC 99.44%）。流式检测CCN1抗体与过表达human CCN1的CHO-K1细胞系上的CCN1蛋白的结合能力验证结果如图3（样本组），样本组为加入50 μL/孔杂交瘤上清的样本。
实施例2 抗体纯化
杂交瘤（包括杂交瘤4、9、10、11、15、41、47）于6孔板中培养，对表达出的抗体进行纯化。杂交瘤单克隆培养于6孔板中，2.5 mL/孔。D7，收集上清。取培养基上清100 µL至1.5mL EP管中，接着加入900 µL Binding/Washing buffer（结合/洗脱缓冲液），充分混匀。将抗体纯化磁珠漩涡振荡30 s，使磁珠充分重悬；取200 µL 10%（v/v）磁珠悬液置于另一新的1.5 mL EP管中。对磁珠悬液进行磁性分离，弃上清液，用1 mL Binding/Washing buffer（结合/洗脱缓冲液）洗涤2次，磁性分离，管中磁珠可直接用于抗体分离。将磁珠加入稀释过的培养基，置于翻转混合仪翻转约15 min。进行磁性分离，移弃上清液。向EP管中加入1 mL结合/洗脱缓冲液，振荡重悬磁珠后进行磁性分离，移弃上清液，洗3次。向磁珠洗涤的EP管中加入0.5 mL Elution buffer（洗脱缓冲液），用移液器吹打或者涡旋震荡。室温下置于翻转混合仪翻转10 min后进行磁性分离，收集上清液至新的EP管。向抗体洗脱液中加入Neutrilization buffer（中和缓冲液），一般为抗体洗脱体积的1/10，最终使洗脱的抗体pH值保持中性。收集的抗体，用过滤柱更换缓冲液。HTRF测定抗体浓度。取5 µg蛋白上样。8%的PAGE胶，140 V，30 min电泳。杂交瘤纯化后的抗体的电泳胶图如图4所示，泳道M为蛋白标准品Marker；泳道4为杂交瘤上清4；泳道9为杂交瘤上清9；泳道10为杂交瘤上清10；泳道11为杂交瘤上清11；泳道15为杂交瘤上清15；泳道41为杂交瘤上清41；泳道47为杂交瘤上清47。
实施例3 功能性实验-细胞增值抑制
CCN1蛋白在NIH/3T3增殖实验中，可以有效促进其增殖。所以添加anti-CCN1抗体，验证其是否可以抑制其增殖的作用。
D0，96孔板中，铺NIH/3T3细胞，1w细胞/孔。37℃，5% CO2，过夜。D1，对照孔中：10 µg/mL CCN1+对应体积PBS。样本孔：10 µg/mL CCN1+10 µg/mL anti-CCN1 Ab。D3，预先将用于细胞计数的发光细胞活力测定液和接种了细胞的96孔板平衡至室温，酶标板读数。
抑制增殖实验的检测结果如图5所示，结果表明，加入47、41号克隆的分泌的抗体后，细胞数量显著降低，表明47、41号anti-CCN1抗体具有抑制NIH/3T3细胞增殖的作用。
实施例4 杂交瘤克隆株抗体可变区序列的获得
考虑到某些杂交瘤克隆株不稳定的情况，因此，通过PCR获得抗体可变区来保存所需的杂交瘤可变区序列，并通过其他高表达抗体的细胞（如Expi CHO细胞）来进行抗体生产。
获得抗体轻重链可变区序列具体操作如下：用Trizol裂解候选的杂交瘤克隆株并提取总RNA，以此为模板合成第一链cDNA后，以第一链cDNA为模板用抗体可变区特异性引物进行后续PCR扩增，获得杂交瘤细胞所对应的抗体轻重链可变区的核酸，进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收TA克隆后，进行Sanger测序获得抗体可变区序列。抗体重链可变区和轻链可变区的序列如表1所示。
表1
9H（重链可变区）的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示：
QVTLKESGPGILKPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGIGWIRQPSGKGLEWLAHIWWDDDKYYNPSLKSQLTISKDTSRNQVFLKITSVDTADTATYYCARVYGNFFAYWGQGTRSPSRA。
9L（轻链可变区）的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示：
DIVMTQSPSSLSVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDHSYPLTFGAGTKLELKRA。
15H（重链可变区）的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示：
DVQLVESGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYDINWVRQRPEQGLEWIGWIFPGDGSTKYNEKFKGKATLTTDKSSSTAYMQLSRLTSEDSAVYFCARDGFDYWGQGTTLTVSS。
15L（轻链可变区）的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示：
ENVLTQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQSISDYLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGSDFTLSINSVEPEDVGVYYCQNGHSFPLTFGAGTKLEIK。
41H（重链可变区）的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示：
QSLSITCTVSGFSLTSFGVHWVRQSPGKGLEWLGVKWSGGNTNYNSALMSRLSISKDNSKSQVFLEMNSLQIDDSAIYYCVREGYGNWFAYWGQGTLVTVSS。
41L（轻链可变区）的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示：
DVLMTQIPLSLPVSLGDQASISCRSSQSILHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPPTFGGGTKLEIKRA。
47H（重链可变区）的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示：
QVQLQQSGAELARPGASVQLSCKASGYTFTDYYINWVKQKTGQGLEWIGEIYPGSGDTYYNEKFRGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARGLPHWGQGTLVTVSA。
47L（轻链可变区）的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示：
DIVMTQAVPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLISRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEDPYSFGGGTKLELKRA。
实施例5 杂交瘤克隆株的冻存
为了长期保存筛选所得有亲和力且有相应功能的杂交瘤单克隆株，筛选出的杂交瘤株进行扩大培养后（从96孔板，至24孔板，至6孔板，直到10 cm培养皿），用10% DMSO加血清进行冻存，并保存在液氮中来保证将来需要抗体时能直接复苏后进行抗体生产。
实施例6
本实施例将通过ELISA筛选出的杂交瘤阳性孔（细胞数2W/孔）按3倍梯度稀释加入A1孔，并纵向每个孔3倍稀释4个梯度（A1-D1），再用排枪向横向3倍梯度稀释（A1至A2，A2至A3以此类推）。每个杂交瘤克隆亚克隆得到半块96孔板，待7天以后取杂交瘤上清进行ELISA检测（检测时抗原为1 μg/mL，每孔100 μL）。共进行三轮亚克隆，确保获得的杂交瘤克隆为抗体稳定表达的单克隆株。结果如表2所示。
表2
注：实验中，阴性孔读值0.14
在ELISA验证中，通过上述方法在53块HAT筛选板中，通过细胞膜表面蛋白检测（ELISA），筛选出多株可以结合CCN1蛋白的抗体表达克隆株，并进行三轮亚克隆后，有若干个具备稳定表达针对CCN1蛋白高亲和力抗体的能力。
从表中的结果可知，所得的4个单克隆（9、15、41、47）均与抗原具有良好的结合活性。
综上，本发明开发出了新的针对银屑病的新抗体，有望解决银屑病治疗中的有效性、容易引发感染、易复发、并发症及毒性等问题，更是寻求治疗银屑病的新靶点，为银屑病的治疗开拓了新方向，更是为治疗脓疱型银屑病增加新的可能。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (7)
1.一种识别CCN1蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3；所述轻链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3；
所述重链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；CDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示；CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；
所述轻链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；CDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:5所示；CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；
或，所述重链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；CDR2的氨基酸序列如SEQID NO:8所示；CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；
所述轻链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；CDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:11所示；CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；
或，所述重链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示；CDR2的氨基酸序列如SEQID NO:14所示；CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；
所述轻链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示；CDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:17所示；CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示；
或，所述重链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示；CDR2的氨基酸序列如SEQID NO:20所示；CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示；
所述轻链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示；CDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:23所示；CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示。
2.根据权利要求1所述的识别CCN1蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示；所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示；
或，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示；所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示；
或，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示；所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示；
或，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示；所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示。
3.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1或2所述的识别CCN1蛋白的单克隆抗体。
4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括权利要求3所述的核酸分子。
5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求4所述的表达载体，或所述宿主细胞的基因组中整合了权利要求3所述的核酸分子。
6.一种结合物，其特征在于，所述结合物为与化学标记或生物标记共价连接的权利要求1或2所述的识别CCN1蛋白的单克隆抗体。
7.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括权利要求1或2所述的识别CCN1蛋白的单克隆抗体，或者权利要求6中所述的结合物。
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2023
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