CN101747435A - 一种中和cyr61的单克隆抗体(杂交瘤)及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种能够中和CYR61的单克隆抗体及其应用和能产生单克隆抗体的杂交瘤。本发明采取的技术方案是：一种由小鼠抗人CYR61单克隆抗体杂交瘤CGMCC No.2766或CGMCC No.2767分泌的单克隆抗体。单克隆抗体在制备治疗风湿性疾病疾病药物中的应用，所述的风湿性疾病是类风湿性关节炎。本发明优点在于：1、用自制单抗既能够研究CYR61在类风关的发病机理，能够准确定位CYR61的表达和检测患者血清及病变部位(如关节)的CYR61水平。2、能够作为制备检测试剂盒以区别骨关节炎和类风关的临床诊断之用。3、又能够寻找能够中和类风关患者滑膜表面及滑液中的CYR61的结合表位，为下一步制备能够中和CYR61的人源化抗体提供筛选依据。

Description

一种中和CYR61的单克隆抗体(杂交瘤)及其应用

【技术领域】

本发明涉及一种单克隆抗体，尤其涉及一种能够中和CYR61的单克隆抗体及其应用和能产生单克隆抗体的杂交瘤。

【背景技术】

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是最常见的风湿性疾病之一。RA是一种最常见的自身免疫病。全球RA患病率平均为0.5-1％。在我国，RA患病率为0.45％，而且每年的新增患病总人约为400万左右。RA的发病多为青壮年，由于没有特异性治疗药物控制疾病发展，大部分患者在发病的6-10年左右即由于致残而失去劳动能力，未经治疗的患者，其2年和3年的致残率可达50％和70％。因此，RA严重影响人民生命健康，同时也给我国正在发展健全的医保事业带来沉重负担，在一定程度上阻碍我国和谐社会的建设进程。

RA的治疗没有特异性手段。目前的药物治疗及滑膜切除、关节置换等手术疗法只能缓解炎症和疼痛，而对软骨和骨的侵袭性破坏无效。因此深入研究RA的发病机制，寻找新的治疗靶点具有重要的理论和实际意义。虽然目前的抗TNF-a受体人源化抗体在抑制炎症病变的形成上有较好临床效果，但是该制剂对于中、晚期关节和滑膜已经有明显病变的患者效果不显著，而且只在部分患者中有效。因此，研究发现直接刺激滑膜和软骨病变的生物靶点、设计和发展针对这些生物靶点的干预手段极为重要。目前常用的干预手段有人源化单抗或者干扰SiRNA。但是，由于干扰SiRNA的长期转染技术至今不完善，目前仍不能用于体内。而人源化抗体的制备技术目前已经基本完善、国际上已经有多种人源化抗体上市并用于疾病治疗，均已获得良好效果，因此，选择有效生物靶点采用人源化抗体进行中和是特异性治疗的重要途径。

【发明内容】

本发明的目的是，提供一种单克隆抗体。

本发明的再一的目的是，提供一种单克隆抗体的用途。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种由小鼠抗人CYR61单克隆抗体杂交瘤CGMCC NO.2766或CGMCC NO.2767分泌的单克隆抗体。

所述分泌IgM的小鼠抗人CYR61单克隆抗体杂交瘤已保藏，保藏单位的名称中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位的地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。保藏日期：2008年11月25日。保藏编号CGMCC NO.2766。所述分泌IgG的小鼠抗人CYR61单克隆抗体杂交瘤已保藏，保藏单位的名称中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位的地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。保藏日期：2008年11月25日。保藏编号CGMCC NO.2767。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：单克隆抗体在制备治疗风湿性疾病疾病药物中的应用。所述的风湿性疾病是类风湿性关节炎。

依据上述技术方案，本发明的具体实施方法是：

1、在基因芯片筛查的基础上，运用实时定量PCR方法分析了CYR61在RA患者不同组织中的表达格局。发现CYR61主要表达在RA患者的滑膜组织中，其相对含量是RA患者外周血单个核细胞的8.7倍、是RA关节液单个核细胞的13.3倍、正常人的外周血单个核细胞的125倍。同时用免疫组化的方法比较了RA、OA、正常人的滑膜组织中CYR61的表达情况，发现CYR61在RA滑膜组织中表达明显高于OA患者和正常对照。进一步采用体外培养RA滑膜组织来源的FLS进行研究：用实时定量PCR发现CYR61在培养的FLS中表达高于滑膜组织；采用Western Blot方法比较了培养的RA、OA、正常人的FLS中CYR61蛋白的表达格局，明确了CYR61在RA患者的成纤维样滑膜细胞中的表达显著高于OA和正常对照，提示CYR61在RA滑膜组织病变中可能发挥着重要的作用。

2、采用原代细胞培养的方式研究RA FLS在局部炎症环境中的增殖与CYR61高表达的关系。用RA患者的SF刺激培养的FLS，发现RA患者的SF可以显著刺激FLS的增殖，同时可以刺激FLS中CYR61的表达。而后探讨SF中何种细胞因子能上调CYR61的表达，采用纯化的细胞因子分别刺激RA FLS，发现IFN-γ和TNF-a可以明显上调CYR61的表达。为了进一步研究CYR61的功能，我们制备并筛选了能够与天然CYR61蛋白相结合的单克隆抗体；并采用ELISA的方法检测RA滑膜液中CYR61的含量，发现RA滑膜液中存在高浓度的CYR61。为了明确CYR61蛋白对FLS增殖的作用，采用CYR61单克隆抗体阻断的方法研究CYR61对于FLS增殖的影响。结果显示，在中和了SF中CYR61蛋白后，SF刺激FLS增殖的能力明显下降，表明CYR61蛋白在SF刺激FLS增殖过程中发挥了重要作用。

3、用siRNA干扰的方法研究CYR61调控滑膜细胞增殖的机制。用筛选得到的CYR61特异性siRNA沉默FLS中CYR61基因的表达，发现干扰后FLS的增殖能力下降同时凋亡增加，证实CYR61可通过抑制其凋亡而发挥促进增殖的作用。为了探讨凋亡家族分子是否参与CYR61抑制FLS凋亡，采用实时定量PCR的方法检测了CYR61干扰后Bcl-2家族基因表达的变化，发现随着CYR61基因的抑制，凋亡抑制基因Bcl-2mRNA表达水平明显下调；而其它Bcl-2家族基因则没有明显变化，这一结果提示CYR61可通过上调抑凋亡基因Bcl-2而抑制FLS的凋亡，从而促进了FLS的增殖。

4、用基因工程方法人工表达人CYR61蛋白并免疫小鼠，常规方法融合并用CYR61蛋白筛选获得14株特异性单克隆抗体。采用无血清细胞培养上清进行免疫组化方法鉴定能与组织细胞中天然CYR61蛋白结合的活性抗体。由于已有报道293T细胞中高表达CYR61，因此本发明选用293T细胞作为阳性对照。结果表明：免疫组化鉴定发现其中有两株能够与293T细胞和滑膜细胞的CYR61结合。

本发明优点在于

1、该单抗能够用于研究CYR61在类风关的发病机理，能够准确定位CYR61的表达和检测患者血清及病变部位(如关节)的CYR61水平。

2、能够作为制备检测试剂盒以区别骨关节炎和类风关的临床诊断之用。

3、能够寻找能够中和类风关患者滑膜表面及滑液中的CYR61的结合表位，为下一步制备能够中和CYR61的人源化抗体提供筛选依据。

【附图说明】

图1：RA患者组织及细胞中CYR61基因的相对含量表达格局(P＜0.0001***P＝0.0054**)。

图2：滑膜组织切片HE染色和免疫组化结果，A：正常滑膜组织HE染色(20×)，B：OA滑膜组织HE染色(20×)，C：RA滑膜组织HE染色(20×)，D：正常滑膜组织CYR61组织化学染色(40×)，E：OA滑膜组织CYR61组织化学染色(40×)，F：RA滑膜组织CYR61组织化学染色(40×)。

图3A：FLS的体外培养和鉴定，第三代FLS(400×)。

图3B：FLS的体外培养和鉴定，FLS的鉴定(＜2％CD1Ib，＜2％CD14+，＜1％CD3+，and＜5％CD19+，流式细胞仪检测).CYR61在RA滑膜组织和体外培养的滑膜纤维母细胞中的表达。

图4A：体外培养的RA FLS中高表达CYR61，RA FLS中CYR61的表达明显高于RA滑膜组织。

图4B：体外培养的RA FLS中高表达CYR61，CYR61mRNA在RA FLS中的表达明显高于OA和正常人FLS。

图4C：体外培养的RA FLS中高表达CYR61，Western-blot：RA，OA和正常人FLS中CYR61蛋白的表达。

图5A：不同浓度滑膜液对FLS增殖的影响。

图5B：不同浓度滑液对FLS CYR61mRNA表达的影响。

图5C：不同浓度滑液对FLS CYR61蛋白水平表达的影响。

图6A：IFN-γ和TNF-α均可上调RA FLS中CYR61的表达，不同细胞因子刺激RA FLS后检测CYR61的表达，细胞因子浓度分别为：IL-100.1ng/ml，IL-120.5ng/ml，IFN-γ0.05ng/ml，TNF-α0.05ng/ml。

图6B：IFN-γ和TNF-α均可上调RA FLS中CYR61的表达，阻断抗体anti-IFN-γ(10μg/ml)和anti-TNF-α对IFN-γ，TNF-α和SF刺激作用的影响。

图7：ELISA检测RA和OA滑膜液以及RA外周血中CYR61蛋白的含量：RA SF中CYR61蛋白的含量明显高于对照OA SF、RA患者外周血。

图8：RA SF中的CYR61蛋白可以刺激FLS的增殖。特异性CYR61单克隆抗体与SF分别以1∶25、1∶50、1∶100、1∶200的比例混合后加入FLS中(见X轴下标注)，无关抗体加入在M+SF组中(黑色柱表示)；FLS的增殖用3H参入的方法检测。

图9A：筛选针对CYR61基因的特异性siRNA，光学显微镜观察转染荧光标记小RNA到细胞内的情况，以观察脂质体的转染效率。

图9B：筛选针对CYR61基因的特异性siRNA，荧光显微镜观察转染荧光标记小RNA到细胞内的情况，以观察脂质体的转染效率。

图9C：筛选针对CYR61基因的特异性siRNA，使用CYR61基因的特异性小RNA干扰人293T细胞株24小时，用realtimePCR检测CYR61基因的情况，其中以第三条(H-3)效率最高。

图9D：转染SiCYR61干扰Cyr61表达，进一步用Western Blot方法进行表达蛋白定量分析也表明经Cyr61干扰后，蛋白表达量明显降低。

图10：特异性siRNA干扰人CYR61基因的时相分析。使用CYR61基因的特异性小RNA干扰RA FLS24小时，用realtimePCR检测CYR61基因的情况。

图11A：CYR61干扰后RA FLS增殖减少。

图11B：CYR61干扰后RA FLS凋亡增加。

图12A：siRNA干扰后FLS后Bcl-2家族mRNA的表达。

图12B：siRNA干扰后FLS后Bcl-2蛋白的表达。

图13A：所制备2株中和抗体鉴定，3号单抗与293T细胞株中CYR61蛋白结合。

图13B：所制备2株中和抗体鉴定，3号单抗与FLS中CYR61蛋白结合。

图13C：所制备2株中和抗体鉴定，10号单抗染色FLS中CYR61蛋白。

图13D：所制备2株中和抗体鉴定，抗体型别检测表明所制备的中和抗体为IgG2型。图13E：用罗氏公司IsoStrip试剂检测抗体型别，表明071G12株单抗为IgG1型。

【具体实施方式】

下面结合附图对本发明提供的CYR61蛋白在制药中的应用的具体实施方式做详细说明。

实施例1：CYR61在类风湿关节炎滑膜组织中的表达格局

一、材料与方法

1实验材料

1.1临床样本：

研究中所有样本均来自于临床骨科行膝关节置换或滑膜切除术的RA病人和OA患者，所有病例的诊断符合国际诊断标准。正常对照2例来自与创伤患者。患者滑膜组织用于细胞的体外培养，部分组织4％多聚甲醛固定后留作免疫组化，血清和滑膜液(SF)高速离心后获得上清，-80℃储存。本研究中所用临床样本，均对患者进行知情告知。

2实验方法

2.1细胞制备

2.1.1外周血单个核细胞的制备：

肝素抗凝全血采用淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离单个核细胞，PBS洗涤2次，细胞备用。

2.1.2滑膜液单个核细胞的制备

肝素抗凝滑膜液采用淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离单个核细胞，PBS洗涤2次，细胞备用。

2.2FLS的制备及原代培养：

无菌获取滑膜组织，PBS清洗后用无菌手术剪刀剪切成约1mm*1mm*1mm的碎块；用2-3倍体积0.5mg/ml的胶原酶I或胶原酶II，37℃，消化2小时；经200目纱网过滤后，离心去上清后，将细胞重悬于DMEM培养液，置于培养皿中，37℃，5％CO₂培养。之后待FLS生长成片＞80％时，消化传代。并取传至第3代FLS进行表面标记染色(鼠抗人CD₃、CD₁₄、CD₁₉，CD_11b)鉴定。

2.3实时定量PCR

采用ABI公司提供的软件prism2.0设计CYR61和GADPH(作为内参)引物，序列如下：

表1.定量PCR检测基因及引物序列

按照QIAGEN试剂盒提供的说明抽提RNA并进行逆转录。按照ABI操作说明书进行实时定量PCR。

2.4滑膜样本组织病理性和免疫组织化学检查：

将获得的滑膜样本按照常规病理切片要求制备标本，经脱水、固定、包埋、切片、染色。进行HE染色和CYR61特异性组织化学染色。

2.5滑膜组织免疫组化图像分析：

将图像输入图像分析仪，经去除原图中各种噪声和畸变后进行图像二值化处理后将所获得的测量参数转换到Excel进行分析，获得蛋白表达的相对量。

2.6Westernblot检测FLS细胞CYR61蛋白表达：按照常规方法进行CYR61蛋白的电泳、转膜、抗体杂交与显色(采用ECL压片法)。

二、结果：

1.RA病人滑膜组织CYR61mRNA表达增高

本实验室前期运用基因芯片检测发现CYR61基因在RA滑膜组织中表达增高，为明确RA病人FLS中CYR61的表达情况，我们应用实时定量PCR分析了10例RA患者外周血、关节液和滑膜组织来源的单个核细胞，以及10例患者完整滑膜组织中CYR61mRNA的表达水平，图1中可见CYR61和内部参照GAPDH均得到了特异性S型扩增曲线，各复孔曲线一致，结果可靠。分析实时定量PCR结果，在RA患者的滑膜组织CYR61基因的相对含量比患者的外周血、关节液和滑膜组织来源的单个核细胞以及正常人的外周血单个核细胞分别高8.7倍、125倍及13.3倍(p＜0.05)，证实了基因芯片的结果。

2.RA病人滑膜组织中的CYR61表达增高

为了进一步验证上述用分子生物学手段检测的结果，我们进一步通过HE染色和免疫组化观察了CYR61在滑膜组织不同细胞中的分布及蛋白表达水平。结果发现，与OA及正常滑膜组织(图2A、B箭头指示血管周围无炎症细胞浸润)相比，可见RA患者滑膜衬里层和衬里下层巨噬细胞样滑膜细胞浸润，血管增生，大量淋巴细胞，浆细胞和单核细胞浸润，淋巴滤泡形成伴纤维素样坏死，FLS增生(图2C箭头指示炎性细胞浸润)。

在HE染色的基础上，应用免疫组织化学技术对RA患者手术切除的滑膜组织进行连续切片、ABC染色发现，类风湿关节炎的滑膜衬里层细胞及衬里下层血管内皮细胞、以及FLS中均有CYR61蛋白表达(图2F箭头指示棕褐色颗粒为CYR61蛋白)，主要分布于细胞浆，在滑膜绒毛的近关节腔端尤其多见。而OA患者和正常人的滑膜组织则极少见CYR61蛋白表达(图2D、E箭头指示棕褐色颗粒CYR61蛋白)。

3.RA患者滑膜成纤维细胞体外生长和鉴定

为了验证免疫组化的结果，我们建立了FLS的体外培养体系。将RA、OA和正常人手术得到的滑膜组织进行消化，37℃培养，待长成片状后进行传代，显微镜下观察，3-5代的RA FLS生长迅速，细胞形态趋向于长梭形，排列整齐，取向一致(图3A)。用特异性淋巴细胞分化抗原如CD3，CD14，CD19，CD11C等标记后用流式细胞仪检测发现上述分子表达为阴性(＜2％CD1Ib，＜2％CD14+，＜1％CD3+，and＜5％CD19+)，表明所培养的细胞为较为均一的FLS，极少有淋巴细胞污染(图3B)。

4.RA病人滑膜成纤维细胞CYR61表达增高

为明确RA病人FLS CYR61的表达情况，我们应用实时定量PCR分析了滑膜组织和体外培养的FLS中CYR61mRNA的表达格局。如图4A所示，在RA患者的FLS中CYR61基因的相对含量明显高于滑膜组织(p＜0.01)，说明CYR61主要在RA滑膜组织的成纤维样滑膜细胞中表达增高；同时我们还比较了RA、OA和正常人培养至第3代的FLS中CYR61mRNA的表达水平。如图4B所示，在RA患者的FLS中CYR61基因的相对表达量比OA患者和正常人的FLS分别高3.5倍、20倍(p＜0.05)，从mRNA水平上证实了CYR61在RA病人FLS表达增高。

进一步用Western-blot的方法对RA、OA和正常人的FLS进行CYR61蛋白表达水平检测。我们收集了体外培养的RA、OA、正常人的FLS，加入蛋白裂解液。12％SDS-PAGE电泳、转膜、5％脱脂奶粉封闭过夜、一抗CYR61多克隆抗体(1∶200稀释)杂交过夜、HRP标记二抗(1∶2000稀释)孵育2h，增强化学发光混合液中自显影。结果可见，RA FLS中CYR61表达水平明显高于OA和正常人FLS，从而验证免疫组化的结果，更加证明CYR61主要表达在滑膜的成纤维样细胞中。这样系统的建立为进一步分析CYR61在FLS生长和在RA的滑膜炎症中的生物学功能奠定了基础。

实施例2：类风湿关节炎滑液中CYR61促进FLS的增殖

一、材料与方法

1.1滑膜液刺激实验：将3-5份滑膜液混匀后加入呈对数生长期的FLS继续培养24h后检测CYR61的mRNA及蛋白表达水平，或者FLS增殖(详见下)。

1.2细胞增殖和抗体阻断实验：取对数生长期的FLS，经0.25％的胰蛋白酶消化后调整细胞浓度1×10⁴cells/ml，接种于96孔细胞培养板中，加入不同浓度的SF(SF与培养液的比例分别为1∶32、1∶16、1∶8、1∶4、1∶2)或细胞因子(IL-10，IL12，IFNγ，TNFa和IL-17)，或纯CYR61蛋白与FLS共同培养。在培养结束前16个小时加入1μCi的3H(每孔)，收集细胞，β液闪仪检测增殖。抗体阻断实验：即在上述SF、或者CYR61蛋白及细胞因子作用FLS之前，先用相应中和抗体进行孵育2小时(同时用无关单抗作为对照)，然后再加入FLS的培养中，其余操作同前。

1.3ELISA检测滑膜液和外周血中CYR61蛋白：收集RA、OA的SF(各30份)和正常人外周血(30份，作为对照)，-80℃保存。检测时在ELISA板中加入100μl上述待检样品后置37℃，120分钟包被。经充分洗涤后加入制备的抗CYR61抗体(用购买的标准抗CYR61多抗作为校正和阳性对照)，孵育后洗涤再加二抗和底物，中止反应后在ELISA读板机492nm处读取吸光度，根据检测样品和标准品吸光度值计算检测样品中各种细胞因子的含量。

2.8CYR61单克隆抗体制备：用基因以重组表达的CYR61蛋白按照常规方法与等体积的福氏完全佐剂混匀乳化后，皮下多点注射免疫小鼠。将免疫完成的小鼠脾脏细胞取出与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。然后进行有限稀释和筛选出能够特异性和CYR61基因工程蛋白结合的细胞克隆，获取上清用ELISA方法检测其特异性和效价。其中3号单抗为2006年6月22日制得，另一株为2007年12月7日制得。

2.9CYR61单克隆抗体腹水制备和纯化：

取CYR61杂交瘤细胞注射至6～8周龄的BALB/c雌性小鼠腹腔一侧，8～10d左右后，待小鼠腹腔明显胀大时，无菌下抽取腹水分装于一80℃保存。

二、结果

1.RA的滑膜液(SF)刺激FLS增殖与CYR61表达

为了观察局部炎症环境对于FLS的生物学效应和CYR61表达的影响，我们将RA患者的滑膜液(SF)加入培养的细胞中，利用H³-TdR掺入法，在DNA合成水平上，观察不同浓度滑液对于RA-FLS增殖的影响。如图5A所示，滑膜液呈剂量依赖性促进RA FLS的DNA合成，与对照组相比，各剂量组滑膜液均明显促进RA FLS的DNA合成(P＜0.01)。我们在体外培养中，用RA病人的滑液刺激RA病人的FLS。用不同浓度的RA-SF刺激FLS，随着浓度增高，其刺激CYR61表达的作用也增强。RA的SF的刺激作用呈剂量依赖性。RA-SF稀释到1∶32，刺激作用基本消失。本试验分别在mRNA水平和蛋白水平进行了real-time PCR检测(图5B)和western blot(图5C)分析。

2.RASF中IFN-γ和TNF-α可上调CYR61表达：

由于SF中含有高浓度的细胞因子，为了明确这些细胞因子是否与CYR61上调有关，本研究中用纯化的细胞因子分别刺激RA FLS，观察其CYR61的表达情况。为了模拟其在体内的作用，细胞因子的浓度选择为在SF中能够检测到的浓度。结果表明：IFN-γ和TNF-α能够上调CYR61的表达。为了明确该两种细胞因子的作用，进而采用阻断抗体anti-IFN-γ(10μg/ml)和anti-TNF-α(200ng/ml)分别与SF混匀，在刺激8小时后收集培养的细胞，使用real timePCR的方法检测其CYR61的表达水平。结果显示：细胞因子IFN-γ和TNF-α均有上调CYR61表达的作用，混合的细胞因子作用最强，与SF相似(图6A)。而用IFN-γ和TNF-α抗体阻断后，SF的刺激作用也明显下降，联合阻断的作用更明显(图6B)。

3.RA患者SF中含有高浓度CYR61：

由于CYR61是一种分泌性蛋白，具有明显的促有丝分裂活性，可诱导成纤维细胞增殖。而我们的实验也证实RA病人滑膜细胞中高表达CYR61蛋白，为此我们采用本室制备的具有结合天然CYR61蛋白的3号单克隆抗体(3号单克隆抗体制备方法：见上述2.8CYR61单克隆抗体制备)，检测RA SF(n＝30)中CYR61蛋白的含量，并与OA SF和RA患者外周血清相对比。结果显示：RA SF中CYR61蛋白明显高于对照OA SF，RA患者外周血(P＜0.0001，图7)。

4.RA SF中的CYR61蛋白可以刺激FLS的增殖

为了研究SF中的CYR61蛋白是否具有刺激滑膜细胞增殖的作用，我们上述3号单抗中和SF中的CYR61蛋白，观察对滑膜细胞增殖的影响。取对数生长期的FLS，接种至96孔培养板中，将抗人CYR61单抗与SF混合，按照1∶25、1∶50、1∶100、1∶200比例加入SF中，同时设无关单抗(1∶25)为对照。经与滑膜细胞培养24小时后Thymidine掺入检测FLS的增殖作用。结果发现：CYR61单克隆抗体能够中和RA-SF刺激滑膜细胞增殖的作用，并且呈剂量依赖性。当RA-SF稀释到1∶200，阻断作用基本消失(图8)。表明CYR61蛋白具有刺激滑膜细胞增殖作用。

实施例3：CYR61促进类风湿关节炎FLS增殖的机理研究

一、材料与方法

1、临床样本、CYR61基因和蛋白表达检测均同“实施例1：CYR61在类风湿关节炎滑膜组织中的表达格局”的材料与方法中所述。

2、FLS培养及增殖刺激实验，同“实施例2：类风湿关节炎滑液中CYR61促进FLS的增殖”的材料与方法中所述。

3、SiRNA干扰实验：

3.1：SiRNA序列与合成：根据siRNA设计原理合成3条SiRNA，序列如下：

S1：5’-CCA GAA AUG UAU UGU UCA ATT-3-

5’-UUG AAC AAU ACA UUU CUG GCC-3-

S2：5’-UCA AGG UAU CAA UGU UUA ATT-3-

5’-UUG CUC GCA ACA AAU CUG CTC-3-

S3：5’-CAA CGA GGA CUG CAG CAA ATT-3-

5’-UUU GCU GCA GUC CUC GUU GAG-3-

3.2siRNA转染：采用转染试剂脂质体(geneporter)和含抗生素的无血清成分DMEM溶液，转染体系(以24孔板为例)为250μl。将5×10⁴3-5代FLS种于24孔板中，于37℃，5％CO₂培养箱过夜培养；然后在12μl geneporter与113μl的DMEM混匀物中加入2μl siRNA并轻轻混匀，室温静置25min。将上述混匀的转染液体加到培养的细胞悬液中(同时设无关SiRNA作为对照)，置37℃，5％CO2培养箱中培养5-7小时后，加含等体积的20％FBS和含抗生素的DMEM营养液继续培养，24-48小时后，取培养的细胞做实时定量PCR和Western Blot，检测干扰的效果。

4.0CYR61抑制FLS凋亡机理研究：将上述经干扰CYR61的细胞分为三组，即转染100nM NC siRNA组；转染100nM S3siRNA组；正常细胞组。转染siRNA后24h收集细胞，检测细胞增殖，凋亡细胞比例已经凋亡相关基因Bcl-2、Bcl-xl、Bax、Bad、Bim的表达格局。

二、结果

1.CYR61基因的特异性小RNA筛选试验：

我们分别设计了3条针对人CYR61基因的双链小RNA(siRNA)(见材料方法)，同时用与哺乳动物无关的siRNA作为阴性对照(siRNA of Negativecontrol，siNC)。用脂质体(geneporter)将siRNA转染到细胞中，光学显微镜图(见图9A)和荧光显微镜和(见图9B)观察转染了荧光标记siRNA的细胞情况，显示转染率约为80-90％。用RealtimePCR检测干扰24小时后CYR61的表达水平，其中H-3是针对人CYR61的特异性siRNA，作用CYR61后使CYR61表达的抑制率达70-80％(见图9C)，CYR61蛋白表达也明显降低(图9D)。

2.siRNA干扰人CYR61基因表达的时相分析：

使用特异性siRNA干扰RA FLS中CYR61基因的表达，同时使用无关siRNA作为对照，使用Realtime PCR检测不同时间CYR61基因的表达变化情况：对于RA FLS干扰试验，24小时的细胞中CYR61基因的表达是对照的20-30％，48小时时抑制率略有下降，在40％左右(p＜0.05，图10)。

3.特异性siRNA干扰滑膜细胞CYR61表达后，滑膜细胞增殖减低，凋亡增加：

前面的试验发现SF可以刺激FLS的增殖，并且呈剂量依赖性；而用CYR61中和抗体可以明显阻断SF刺激FLS增殖的作用，说明CYR61与滑膜细胞的增殖密切相关。为了进一步验证两者间的关系，我们采用siRNA的方法，特异性干扰RA FLS中CYR61基因的表达，同时使用无关siRNA作为对照，使用³H参入的方法检测RA FLS的增殖能力：发现抑制CYR61基因后RA FLS的增殖能力下降(p＜0.0001，图11A)。为了深入研究CYR61与RA FLS增殖的关系，我们采用FACS的方法检测了RA FLS siRNA干扰后凋亡细胞的比率(Annexin-V+PI)：发现siRNA干扰后RA FLS凋亡细胞的比率增加(p＜0.0001，图11B)。

4.特异性siRNA干扰滑膜细胞CYR61表达后，细胞凋亡增加的机理：

前面的试验发现siRNA干扰后RA FLS凋亡增加，说明CYR61与滑膜细胞的凋亡密切相关。为了深入研究CYR61与凋亡相关基因表达的关系，我们采用siRNA干扰的方法，在体外干扰FLS CYR61基因的表达，抑制率大于60％，用实时定量PCR检测凋亡线粒体途径相关基因bcl-2，bcl-xl，bax，bim，bad；发现抑凋亡相关基因Bcl-2mRNA水平下调(p＜0.001，图12A)，促凋亡相关基因Bim略增加，而促凋亡基因Bad、Bax和抑凋亡基因Bcl-xl没有明显变化。提示CYR61促进滑膜细胞增殖可能与抑凋亡相关基因Bcl-2表达下调有关。为了验证mRNA水平的结果，我们采用FACS的方法检测Bcl-2的蛋白水平，发现抑制CYR61表达的同时FLS中Bcl-2蛋白表达水平也明显下降(p＜0.01，图12B)。从而证实CYR61是通过抑制线粒体途径的Bcl-2家族(主要通过下调Bcl-2蛋白)来发挥抑制FLS细胞凋亡作用的。

实施例4：杂交瘤的制备：

1.取6周龄雌性BALB/c小鼠，以重组表达的CYR61蛋白〔50pg/只)为抗原分别与等体积的福氏完全佐剂混匀乳化后，皮下多点注射免疫小鼠。间隔3周重复免疫3次。在免疫第三次后4周时取小鼠眼框血，用ELISA测效价达到1.6×10⁶时，冲击免疫(50ng/只)，3天后融合。

2.SP2/0细胞培养：融合前2周常规复苏冻存的小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0细胞，置于37℃，5％CO₂孵箱中培养。第一周用8-AG培养基培养，第二周改用完全培养基。融合前48-36小时改用含20％FBS的培养基扩大培养，融合当天收集重悬10ml RPMI 1640中，使细胞数达2×10⁷。

3.饲养层细胞的制备：融合前1天取8周龄以上的BALB/c小鼠，拉颈处死，无菌操作剪开腹部皮肤，暴露完整腹膜，用注射器向腹腔注入5ml RPMI 1640培养液，吸出腹腔中的液体后再用RPMI 1640培养液重复一次。收集腹腔巨噬细胞，加入HAT培养基，调整细胞浓度到2×10⁵/ml，每孔0.1ml加入96孔细胞培养板。

4免疫脾细胞的制备：取激发免疫后3天的BALB/c小鼠，无菌操作取脾，研磨得到脾脏细胞悬液，裂解红细胞后得到脾脏细胞，加入RPMI 1640培养液计数，调整细胞数至1×10⁸。置于培养箱中备用。

5细胞融合：免疫小鼠的脾脏细胞与SP2/0细胞比例10∶1，按常规方法进行融合。用HAT培养基培养2周后，改用HT培养基继续培养2周，再换成含10％FCS的RPMI 1640于CO₂培养箱中培养、观察，直至有克隆出现。

6.杂交瘤筛选：当细胞集落长至1/3孔大小时(融合后约7-10天)，用间接ELISA筛选分泌抗CYR61蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞集落。每块板均需用融合小鼠的血清(1∶200)作为阳性对照，用完全培养液、SP20细胞培养上清作为阴性对照。3日后再检测1次。

7.杂交瘤细胞的克隆化培养：取两次检测中全部为阳性的杂交瘤细胞，采用有限稀释法进行克隆化培养，以达到每个培养孔中只有一个起始杂交瘤细胞。同样当细胞集落长至1/3孔大小时再用间接ELISA法检测有无特异性抗CYR61单抗分泌，2日后再检测一次。选择两次ELISA检测均为阳性且倒置显微镜下观察为单个克隆的孔进行第二次克隆化。第二次克隆化的培养及检测方法均与第一次克隆化相同。选择mAb分泌阳性且于倒置显微镜下观察单个克隆的孔进行第三次及第四次克隆化培养。并收集上清用于检测单抗产生与效价。

实施例5：单克隆抗体的分离和滴度测定

1、用1ng CYR61蛋白包被ELISA检测板上(100ul/孔)，将板放置于4℃过夜，次日取出用3％BSA封闭，室温4小时，用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。

2、取经倍比稀释的100ul杂交瘤培养上清(一抗)加于上述已经包被有CYR61蛋白的孔中(同时设标准抗体作为制备标准曲线)，室温孵育4小时。用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。

3、在上述每孔中加入酶标抗体工作液(二抗)100μl，将板放置于室温2小时。用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。

4、每孔中加入底物工作液100μl，将板放置于室温20分钟，每孔加入1滴终止液使反应中止。在读扳机上混匀后，于492nm处测吸光度，根据检测样品和标准品吸光度值来计算检测上清中抗CYR61单抗及其滴度。本发明中所制备单抗效价(上清中)为：10^4-8。

5、单克隆抗体的类型鉴定

将单克隆阳性杂交瘤细胞培养上清进行稀释，采用小鼠单克隆抗体免疫球蛋白分型检测试剂盒进行快速测定。本次所制备的单抗分别为IgM型(轻链κ型，3号)(图13D)和IgG1型(轻链κ型，10号)(图13E)。

6、单克隆抗体的特异性鉴定：用免疫组化化学鉴定单克隆抗体，分别取杂交瘤细胞的无血清培养上清和小鼠腹水稀释后作为一抗，检测RA滑膜细胞和293T细胞中CYR61蛋白的表达。发现其中有两株(3号和10号)具有能够与天然CYR61结合的能力，免疫组化的方法也验证了同样结果。

实施例6：单克隆抗体的应用效果实验：

1、取对数生长期的FLS，经0.25％的胰蛋白酶消化后，反复吹吸使成单细胞悬液。调整细胞浓度1×10⁴cells/ml，接种于96孔细胞培养板中，每孔200μl，接种细胞量为2.0×10³cells/孔；将细胞置于37℃，5％CO₂培养箱贴壁生长24小时。

2、从RA患者关节中无菌抽取的滑膜液，经离心去除组织碎片之后，将3-5份滑膜液混匀；将不同稀释度的CYR61单克隆抗体加入混匀SF中(CYR61单克隆抗体与SF的比例分别为1∶25、1∶50、1∶100、1∶200)37℃孵育2h后，加入滑膜细胞中再培养24小时；然后每孔中加入1μCi的3H-TdR，再培养16小时。

3、用细胞收集仪收集上述细胞，加闪烁液检测其3H-TdR。根据加入抗CYR61单抗后FLS增殖受到抑制而判断其中和能力。如图8所示，所制备的抗CYR61单抗能够阻断FLS增殖。

用基因工程方法人工表达人CYR61蛋白并免疫小鼠，常规方法融合并用CYR61蛋白筛选获得14株特异性单克隆抗体。采用无血清细胞培养上清进行免疫组化方法鉴定能与组织细胞中天然CYR61蛋白结合的活性抗体。由于已有报道293T细胞中高表达CYR61，因此本实验选用293T细胞作为阳性对照。结果表明：免疫组化鉴定发现其中有两株(3号和10号)能够与293T细胞和滑膜细胞的CYR61结合(图13A，图13B图13C)。进一步扩增上述杂交瘤细胞株并按照常规方法制备小鼠腹水，采用罗氏公司IsoStrip试剂检测抗体型别，结果显示所制备的单抗为IgM型(图13D)IgG1型(图13E)，效价检测结果为10^4-8。为了检测上述抗体是否具有中和CYR61蛋白功能的作用，采用所制备抗体进行了SF中CYR61蛋白检测实验和抗体SF刺激滑膜细胞增殖实验，结果表明：所制备的抗体成功用于RA和OA滑液中CYR61蛋白检测，和SF刺激FLS的生长阻断实验。表明本实验室已经成功制备了能够中和CYR61作用的鼠源性抗体。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种由小鼠抗人CYR61单克隆抗体杂交瘤CGMCC NO.2766或CGMCCNO.2767分泌的单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体在制备治疗风湿性疾病疾病药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的风湿性疾病是类风湿性关节炎。

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