CN113613727A - 多特异性前趋化因子治疗蛋白（park）及其制备和使用方法 - Google Patents

多特异性前趋化因子治疗蛋白（park）及其制备和使用方法 Download PDF

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Abstract

蛋白酶释放的趋化因子蛋白(PARK)包括前趋化因子部分，前趋化因子部分包括与趋化因子部分融合的前肽部分，其中趋化因子部分包括N端和C端；和与前趋化因子部分连接的靶向部分，其中靶向部分对肿瘤、纤维化或阿尔茨海默氏病相关抗原或受体具有结合特异性。

Description

多特异性前趋化因子治疗蛋白（PARK）及其制备和使用方法
相关申请案的交叉引用
本申请要求于2019年1月11日根据35U.S.C.119(e)提交的美国临时申请序列 62/791,667号的申请日的权益，其全部公开内容通过引用并入本文。
技术领域
本申请总体涉及重组蛋白和抗体的技术领域，更具体地涉及治疗癌症、纤维化和神经退行性疾病的治疗性蛋白和抗体。
背景技术
许多研究表明，低水平的肿瘤淋巴细胞浸润与不良预后相关(Jung 2014，Zhang2003， Naito 1998)。增强肿瘤淋巴细胞浸润增加抗肿瘤免疫应答，减少肿瘤生长。例如，用趋化因子治疗可导致肿瘤完全消退或无肿瘤生长，表明单独施用趋化因子或与细胞因子组合施用趋化因子可为治疗性的(Homey 2002)。CCL21是C-C趋化因子配体，也称为次级淋巴组织趋化因子(SLC)，并且可以通过与趋化因子受体CCR7结合而引起其作用。 CCL21由成纤维细胞网状细胞表达并从成纤维细胞网状细胞分泌，作为化学引诱物以将幼稚的表达CCR7的T细胞引导至人淋巴结内的T细胞区。已经证明，将SLC趋化因子注射到肝细胞癌(HCC)模型中增加了肿瘤部位处的CD8和CD4阳性T细胞群(Chen 2013)。SLC诱导树突细胞的成熟，增加IL-12和IFN的水平，并抑制HCC生长和侵袭。其他研究显示，逆转TH1趋化因子、CXCL9和CXCL10(两者均为CXC趋化因子) 的肿瘤表观遗传沉默增加肿瘤淋巴细胞浸润，减缓肿瘤进展，并且提高PD-L1阻断的疗效(Peng 2015)。
在许多癌症患者中，存在抗肿瘤免疫应答不足的证据，并且肿瘤中浸润的低水平免疫细胞指示不良预后。潜在机制可能与刺激和/或抑制肿瘤细胞引发的免疫应答不良有关。这些观察结果提供了通过增加肿瘤部位的免疫细胞来改善癌症治疗疗效的机会。
发明内容
以下概述仅是说明性的并且不旨在以任何方式进行限制。除了上述说明性方面、实施例和特征之外，通过参考附图和以下详细描述，其它方面、实施例和特征将变得显而易见。
本公开总体上提供了治疗性蛋白、编码此类蛋白或其片段的核酸序列或表达载体(vector)、用于表达此类蛋白或其片段的细胞、制造此类蛋白的方法以及使用此类蛋白治疗疾病的方法。
在一个方面，本公开提供治疗性蛋白。蛋白可用于治疗疾病，包括癌症、纤维化或阿尔茨海默氏病。在一个实施方案中，蛋白包括前趋化因子部分和与前趋化因子部分连接的靶向部分。
前趋化因子部分包括与趋化因子部分融合的前肽部分，并且趋化因子部分包括N端和C端。在一个实施方案中，前肽部分与趋化因子部分的N端或C端融合。在一个实施方案中，前肽部分与趋化因子部分的N端融合。在一个实施方案中，前肽部分包括约5 个至约20个氨基酸。在一个实施方案中，前肽部分包括约8个氨基酸。
靶向部分对肿瘤、纤维化或阿尔茨海默氏病相关抗原或受体具有结合特异性。
在一个实施方案中，前趋化因子部分进一步包括前导序列，并且前肽部分在一端与前导序列融合，在另一端与趋化因子部分融合。在一个实施方案中，前导序列包括具有约10个至约50个氨基酸的氨基酸序列。在一个实施方案中，前导序列包括具有约15个至约25个氨基酸的氨基酸序列。
在一个实施方案中，蛋白含有单个前趋化因子部分。在一个实施方案中，蛋白含有两个或更多个前趋化因子部分。在一个实施方案中，蛋白包括至少两个前趋化因子部分。在一个实施方案中，两个前趋化因子部分通过间隔区串联连接。在一个实施方案中，间隔区包括至少一个氨基酸残基。在一个实施方案中，氨基酸残基包括甘氨酸残基。在一个实施方案中，间隔区包括至少两个甘氨酸残基。在一个实施方案中，间隔区包括2至 8个甘氨酸残基。
在一个实施方案中，蛋白还包括融合在趋化因子部分C端的氨基酸序列，其中氨基酸序列包括fractalkine的粘蛋白区域。
在一个实施方案中，趋化因子部分包括与CC、CXC、CX3C、OR C家族趋化因子具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相似性的趋化因子氨基酸序列。在一个实施方案中，相似性为90％。在一个实施方案中，相似性为98％。在一个实施方案中，相似性为99％。
在一个实施方案中，趋化因子部分包括与CCL1、CCL3、CCL5、CCL7、CCL14、 CCL16、CCL19、CCL20、CCL21、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL12、CXCL16、 XCL1或CX3CL1具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％，97％，98％，99％或100％相似性的趋化因子氨基酸序列。在一个实施方案中，相似性为90％。在一个实施方案中，相似性为98％。在一个实施方案中，相似性为99％。
在一个实施方案中，趋化因子部分包括与能够募集具有抗肿瘤、抗纤维化或抗阿尔茨海默氏病活性的细胞的趋化因子具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相似性的趋化因子氨基酸序列。在一个实施方案中，相似性为90％。在一个实施方案中，相似性为98％。在一个实施方案中，相似性为99％。
在一个实施方案中，靶向部分包括对肿瘤、纤维化或阿尔茨海默氏病相关抗原或受体具有结合亲和力的抗体、单链Fv(scFv)结构域、单一可变结构域或天然配体结构域。
在一个实施方案中，结合的Kd不超过1、5、10、15、20、25、30、50、60、80、90、100、150nM。在一个实施方案中，靶向部分配置成结合肿瘤细胞，肿瘤基质抗原，肌成纤维细胞抗原，淀粉样蛋白或τ蛋白。
在一个实施方案中，蛋白进一步包括蛋白标签。在一个实施方案中，蛋白标签与蛋白之一共价连接。在一个实施方案中，蛋白标签包括与包括约6至约10个组氨酸残基、streptag-2或免疫球蛋白Fc的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％，90％，95％，97％，98％，99％或100％相似性的氨基酸序列。在一个实施方案中，相似性为90％。在一个实施方案中，相似性为98％。在一个实施方案中，相似性为99％。
在一个实施方案中，蛋白还包括免疫球蛋白(IgG)Fc结构域。在一个实施方案中，前趋化因子部分和靶向部分都与IgG Fc结构域融合。在一个实施方案中，靶向部分融合到前趋化因子部分的一端，IgG Fc融合到前趋化因子结构域的相对端。在一个实施方案中，IgG Fc结构域包括两个免疫球蛋白CH2-CH3结构域。在一个实施方案中，免疫球蛋白CH2-CH3结构域中的一个与靶向部分融合，而另一个免疫球蛋白CH2-CH3结构域与前趋化因子部分融合。在一个实施方案中，蛋白包括至少两个前趋化因子部分。
在一个实施方案中，靶向部分包括scFv结构域。在一个实施方案中，蛋白包括一个scFv结构域和一个前趋化因子部分。在一个实施方案中，蛋白包括至少两个scFv结构域。
在一个实施方案中，蛋白是抗体。在一个实施方案中，抗体是双特异性抗体。
在第二方面，本公开提供了编码本文公开的治疗性蛋白质或其片段的分离的核酸序列。在一个实施方案中，本公开提供了分离的核酸，其编码前导序列、前趋化因子部分和肿瘤、纤维化或阿尔茨海默氏病靶向部分。
在另一方面，本公开提供了包括其公开的分离的核酸的表达载体(vector)。在一个实施方案中，载体(vector)可在细胞中表达。
在另一方面，本公开提供宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞包括本文公开的核酸。在一个实施方案中，宿主细胞包括本文公开的表达载体(vector)。在一个实施方案中，宿主细胞是原核细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞、酵母或细菌。
在另一方面，本公开提供产生本文公开的蛋白或其片段的方法。在一个实施方案中，方法包括培养宿主细胞以产生期望的蛋白。
在另一方面，本公开提供药物组合物。在一个实施方案中，组合物可用于治疗癌症、纤维化或阿尔茨海默氏病。在一个实施方案中，药物组合物包括本文公开的蛋白和药学上可接受的载体(carrier)。在一个实施方案中，组合物还包括放射性同位素、放射性核素、毒素、治疗剂、化疗药物或其组合。
在另一方面，本申请提供用于治疗患有癌症、纤维化或阿尔茨海默氏病的受试对象的方法。在一个实施方案中，该方法包括给予受试对象有效量的本文公开的蛋白。
在一个实施方案中，癌症包括实体瘤或血液肿瘤。在一个实施方案中，癌症选自乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌、头颈癌、肝癌、黑色素瘤、卵巢癌、前列腺癌、肺细胞癌、白血病、淋巴瘤或多发性骨髓瘤组成的组。
在一个实施方案中，肿瘤能够表达一种或多种肿瘤相关蛋白酶，其中肿瘤相关蛋白酶能够将前趋化因子部分从蛋白上切割下来并释放活性趋化因子。在一个实施方案中，从蛋白释放的活性趋化因子能够募集免疫细胞以在肿瘤、纤维化或阿尔茨海默氏病病变内的免疫或其它细胞类型中刺激治疗活性。
在一个实施方案中，纤维化包括肾、肝、肺或心肌纤维化。
在一个实施方案中，治疗方法还包括共同施用有效量的治疗剂。在一个实施方案中，治疗剂包括抗体、化疗药物、酶或其组合。在一个实施方案中，治疗剂包括抗雌激素药、受体酪氨酸抑制剂、抗纤维化药物、抗阿尔茨海默氏病药物或其组合。在一个实施方案中，治疗剂包括卡培他滨、顺铂、曲妥单抗、氟维司群、他莫昔芬、来曲唑、依西美坦、阿那曲唑、氨鲁米特、睾内酯、伏氯唑、福美司坦、法曲唑、来曲唑、埃罗替尼、阿法替尼(lafatinib)、达沙替尼、吉非替尼、伊马替尼、帕唑替尼(pazopinib)、拉帕替尼、舒尼替尼、尼洛替尼、索拉非尼、nab-紫杉醇(nab-palitaxel)。
在一个实施方案中，受试对象是人。
在另一方面，本公开提供了包括有效浓度的本文公开的蛋白的溶液。在一个实施方案中，溶液是受试对象的血浆。
附图说明
结合附图，通过下面的描述和所附权利要求，本公开的前述和其它特征将变得更加清楚。应当理解，这些附图仅描述了根据本公开安排的若干实施例，因此不应被认为是对其范围的限制，将通过使用附图以附加的特性和细节来描述本公开，其中：
图1显示了(A)通过将CCL14的前导序列与RANTES的前肽和活性部分的序列融合，将趋化因子RANTES转化为新的前趋化因子ProRANTES的实例；和(B) Pro-CCL21-XCL1中的前趋化因子的实例的序列；
图2显示用于鉴定由疾病相关蛋白酶(例如肿瘤相关蛋白酶)特异性切割的前趋化因子的测定；
图3显示前趋化因子修饰的抗体(PARK)和蛋白酶切割位点的实例；
图4显示共表达含有Fc的PARK蛋白的PARK表达载体(vector)的实例；
图5显示了分别用于治疗癌症、纤维化和阿尔茨海默氏病(AD)的PARK蛋白的实例；以及
图6阐明了PARK平台可用作治疗剂以募集针对肿瘤的不同细胞毒性细胞并激活先天性、获得性和/或工程化的抗肿瘤应答。
具体实施方式
在以下详细描述中，参考了参考文献(其通过引用整体并入本文)和附图(其形成本文的一部分)。在附图中，类似的符号通常标识类似的组分，除非上下文另外指示。在详细描述、附图和权利要求中描述的说明性实施例并不意味着是限制性的。可以利用其他实施例，并且可以进行其他改变，而不偏离本文呈现的主题的精神或范围。将容易理解的是，如本文一般描述的以及在附图中示出的本公开的这些方面可以被排列、替代、组合、分离以及设计成多种不同的构型，本文明确地考虑了所有这些构型。
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员、通常理解的相同的含义。尽管在本公开的实践或测试中可使用与本文所述的那些类似或等同的任何方法和材料，但还是描述了优选方法和材料。为了本公开的目的，以下术语定义如下。
冠词“一(a)”和“一(an)”在本文中用于指一个或多于一个(即至少一个)该冠词的语法对象。例如，“一元素”意指一个元素或多于一个元素。
“约”是指相对于参考量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化多达30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、 2％或1％的水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、数量、重量或长度。
“编码序列”是指有助于编码基因的多肽产物的任何核酸序列。相反，术语“非编码序列”是指无助于基因的多肽产物的编码的任何核酸序列。
在整个说明书中，除非上下文另外要求，否则词语“包括(comprise)”、包括(comprises) 和“包括(comprising)”将被理解为意指包括所陈述的步骤或元素或步骤或元素的组，但不排除任何其它步骤或元素或步骤或元素的组。
“由…组成(consisting of)”意指包括且限于短语“由…组成”之间的任何内容。因此，短语“由…组成”表示所列元素是必需的或强制性的，并且可以不存在其它元素。
“基本上由…组成”意指包括短语后列出的任何元素，并且限于不干扰或有助于本公开中对所列出元素指定的活性或作用的其它元素。因此，短语“基本上由…组成”表示所列元素是必需的或强制性的，但是其它元素是任选的并且可以存在或可以不存在，这取决于它们是否影响所列元素的活性或作用。
术语“互补的”和“互补性”是指通过碱基配对规则相关的多核苷酸(即，核苷酸序列)。例如，序列“A-G-T”与序列“T-C-A”互补。互补性可以是“部分的”，其中只有一些核酸的碱基根据碱基配对规则匹配。或者，核酸之间可以存在“完全”或“全部”互补性。核酸链之间的互补性程度对核酸链之间杂交的效率和强度有显著影响。
“对应于(corresponds to)”或“对应于(corresponding to)”意指(a)具有与参考多核苷酸序列的全部或部分基本上相同或互补的核苷酸序列或编码与肽或蛋白中的氨基酸序列相同的氨基酸序列的多核苷酸；或(b)具有与参照肽或蛋白中的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的肽或多肽。
如本文所用，术语“功能”和“功能的”等是指生物学，结合或治疗功能。
“基因”是指占据染色体上的特定基因座并且由转录和/或翻译调节序列和/或编码区和/或非翻译序列(即内含子，5'和3'非翻译序列)组成的遗传单位。
“同源性”指相同或构成保守取代的氨基酸的百分数。同源性可以使用序列比较程序来确定，例如GAP(Deveraux等人，1984，《核酸研究》(Nucleic Acids Research)12， 387-395)，其通过引用并入本文。以这种方式，可以通过在比对中插入缺口来比较与本文引用的那些序列长度相似或基本上不同的序列，这样的缺口例如通过GAP使用的比较算法来确定。
术语“宿主细胞”包括单个细胞或细胞培养物，其可以是或已经是本公开的任何重组载体(vector)或分离的多核苷酸的受体。宿主细胞包括单一宿主细胞的子代，并且由于天然的、意外的或故意的突变和/或改变，后代可能不必与原始亲代细胞(在形态学或总DNA互补方面)完全相同。宿主细胞包括体内或体外用本公开的重组载体(vector) 或多核苷酸转染或感染的细胞。包括本发明的重组载体(vector)的宿主细胞是重组宿主细胞。
“分离的”抗体是已经从其天然环境的组分中鉴定和分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染物成分是将干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可以包括酶、激素和其它蛋白质性或非蛋白质性溶质。
“分离的”核酸分子是从至少一种污染物核酸分子中鉴定和分离的核酸分子，该污染物核酸分子通常与抗体核酸的天然来源中的污染物核酸分子结合。分离的核酸分子不同于其天然存在的形式或天然环境种发现的。因此，分离的核酸分子区别于存在于天然细胞中的核酸分子。然而，分离的核酸分子包括包含在通常表达抗体的细胞中的核酸分子，其中例如核酸分子位于不同于天然细胞的染色体位置。
表述“控制序列”是指在特定宿主生物体中表达可操作地连接的编码序列所必需的 DNA序列。适合于原核生物的控制序列例如包括启动子，任选地操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。
当核酸与另一核酸序列处于功能关系时，它是“可操作连接的”。例如，如果前序列或分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则其与多肽的DNA可操作连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则其可操作地连接至编码序列；或者如果核糖体结合位点被定位以便于翻译，则其可操作地连接至编码序列。通常，“可操作地连接”是指被连接的DNA序列是连续的，并且在分泌前导序列的情况下，是连续的并且处于读取阶段。然而，增强子不必是连续的。通过在方便的限制性位点连接完成连接。如果不存在这样的位点，根据常规实践使用合成的寡核苷酸接合体或接头。
如本文所用，表述“多核苷酸”或“核酸”是指mRNA、RNA、cRNA、rRNA、cDNA 或DNA。该术语通常是指长度为至少10个碱基的核苷酸的聚合形式，核糖核苷酸或脱氧核苷酸，或任一类型的核苷酸的修饰形式。该术语包括单链和双链形式的DNA和RNA。
术语“多核苷酸变体”和“变体”等是指与参考多核苷酸序列显示基本上序列同一性的多核苷酸或在下文定义的严格条件下与参考序列杂交的多核苷酸。这些术语还涵盖通过添加、缺失或取代至少一个核苷酸而不同于参考多核苷酸的多核苷酸。因此，术语“多核苷酸变体”和“变体”包括其中一个或多个核苷酸已被添加或缺失或用不同核苷酸替换的多核苷酸。在这方面，本领域熟知可以对参照多核苷酸进行包括突变、添加、缺失和取代在内的某些改变，由此改变的多核苷酸保留参照多核苷酸的生物功能或活性，或者相对于参照多核苷酸(即，优化的)具有增加的活性。多核苷酸变体包括，例如，与本文描述的参考多核苷酸序列具有至少50％(以及至少51％至至少99％以及在其间的所有整数百分比，例如，90％，95％，或98％)序列同一性的多核苷酸。术语“多核苷酸变体”和“变体”还包括编码这些酶的天然存在的等位基因变体和直系同源基因。
“多肽”、“多肽片段”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物及其变体和合成类似物。因此，这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸的氨基酸聚合物，例如相应的天然存在的氨基酸的化学类似物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。在某些方面，多肽可以包括酶多肽，或通常催化(即，提高速率)各种化学反应的“酶”。
列举多肽“变体”是指通过添加、缺失或取代至少一个氨基酸残基而与参照多肽序列相区别的多肽。在某些实施方案中，多肽变体通过一个或多个取代与参照多肽不同，取代可以是保守的或非保守的。在某些实施方案中，该多肽变体包括保守取代，并且在这方面，本领域熟知一些氨基酸可以改变为具有广泛相似性质的其它氨基酸，而不改变多肽活性的性质。多肽变体还包括其中一个或多个氨基酸已被添加或缺失或用不同氨基酸残基替换的多肽。
术语“参考序列”通常是指与另一序列进行比较的核酸编码序列或氨基酸序列。本文所述的所有多肽和多核苷酸序列都包括在内作为参考序列。
如本文所用，表述“序列同一性”或例如包括“序列50％同一性”是指在比较窗口内序列在逐个核苷酸基础或逐个氨基酸基础上是相同的程度。因此，“序列同一性百分比”可以通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列来计算，确定在两个序列中出现相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、 Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的数目，以产生匹配的位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口(即，窗口大小)，并且将结果乘以100以产生序列同一性的百分比。包括的核苷酸和多肽与本文所述的任何参考序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、 97％、98％、99％或100％的序列同一性(参见，例如，序列表)，通常其中多肽变体保持参考多肽的至少一种生物活性。
“统计学上显著的”是指结果不太可能偶然发生。统计显著性可以通过本领域已知的任何方法来确定。通常使用的显著性度量包括p值，p值是在零假设为真时观察到的事件发生的频率或概率。如果得到的p值小于显著性水平，则拒绝零假设。在简单情况下，显著性水平定义为p值为0.05或更低。
“基本上”或“本质上”意指一些给定量的几乎全部或完全，例如95％、96％、97％、98％、99％或更高。
“治疗”或“处理”或“缓解”是指治疗性处理和预防性或防止性措施，其中目的是预防或减缓(减轻)目标病理状况或病症。例如，对于癌症，癌细胞数目减少或癌细胞不存在；肿瘤大小缩小；肿瘤转移的抑制(即，在一定程度上减慢并且最好是停止)；一定程度上抑制肿瘤生长；延长缓解时间，和/或在一定程度上缓解与特定癌症相关的一个或多个症状；降低发病率和死亡率，改善生活质量问题。患者也可能感觉到疾病体征或症状的减少。治疗可以达到完全缓解，定义为癌症的所有体征消失，或部分缓解，即肿瘤大小缩小，优选缩小50％以上，最优选缩小75％。如果患者经历稳定的疾病，则也认为患者接受了治疗。在优选实施方案中，癌症患者在一年后，优选在15个月后癌症仍然无进展。这些用于评估疾病的成功治疗和改善的参数很容易通过本领域具有适当技能的医生熟悉的常规程序来测量。
术语“调节”和“改变”包括相对于对照通常在统计学上显著的或生理学上显著的量或程度上“增加”和“增强”以及“减少”或“降低”。在具体的实施方案中，与血液代用品移植相关的免疫排斥相对于未修饰或不同修饰的干细胞减少至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％、或至少1000％。
“增加的”或“增强的”量通常是“统计学显著的”量，并且可以包括增加1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6 1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、 20、30、40或50或更多倍(例如，100、500、1000倍)(包括在1之间和以上的所有整数和小数点，例如1.5、1.6、1.7、1.8等等)本文描述的量或水平。
“减少的”或“降低的”或“更少的”量通常是“统计学显著的”量，并且可以包括减少约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6 1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、 8、9、10、15、20、30、40或50或更多倍(例如，100、500、1000倍)(包括在1之间和以上的所有整数和小数点，例如1.5、1.6、1.7、1.8等等)本文描述的量或水平。
“获得自”意指样本例如多核苷酸或多肽分离自或衍生自特定来源，例如所需生物体或所需生物体内的特定组织。“获得自”还可以指多核苷酸或多肽序列从生物体内的特定生物体或组织中分离或衍生的情况。例如，编码本文参考多肽的多核苷酸序列可分离自多种原核或真核生物，或分离自特定真核生物内的特定组织或细胞。“治疗有效量”是指有效“治疗”受试对象的疾病或病症的抗体或药物的量。就癌症而言，治疗有效剂量的药物可减少癌细胞数量；缩小肿瘤大小；抑制(即在一定程度上减缓并最好停止)癌细胞向外周器官的渗透；抑制(即在一定程度上减缓并最好停止)肿瘤转移；在某种程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上缓解与癌症相关的一个或多个症状。参见前面的“治疗”的定义。
“长期”施用是指以与急性模式相反的连续模式施用药剂，以便在延长的时间段内维持初始治疗效果(活性)。“间歇”施用是不中断地连续进行，而是本质上是循环的治疗。
“载体(vector)”包括穿梭和表达载体(vector)。通常，质粒构建体还将包括复制起点(例如，ColE1复制起点)和可选择标志物(例如，氨苄西林或四环素抗性)，分别用于复制和选择细菌中的质粒。“表达载体(vector)”是指含有用于在细菌或真核细胞中表达抗体(包括本公开的抗体片段)所必需的控制序列或调节元件的载体(vector)。下面公开了合适的载体(vector)。
术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且具体涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的生物学活性或功能。
“抗体片段”包括全长抗体的一部分，通常是抗体的抗原结合区或可变结构域。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab’)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子和由抗体片段形成的单链抗体分子。
“Fv”是含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域以紧密，非共价缔合的二聚体组成。这两个结构域的折叠产生6个高变环(H链和L链各有3个环)，它们为抗原结合提供氨基酸残基，并赋予抗体抗原结合的特异性。然而，即使是单个可变结构域(或仅包括三个抗原特异性互补决定区(CDR)的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于整个结合位点。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群获得的抗体，即构成群的各个抗体是相同的，除了可能以少量存在的可能的天然存在的突变。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原位点。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”表示抗体的特性是从基本上均质的抗体群获得的，并且不应被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本公开使用的单克隆抗体可以通过由Kohler等人在《自然》(Nature)256：495(1975)中首先描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方法制备(参见，例如，美国专利4,816,567号)。“单克隆抗体”也可以使用例如Clackson等人在《自然》(Nature)352：624-628(1991)和Marks等人在《自然》 (Nature)222：581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库分离。
术语“可变的”是指抗体中可变结构域(V结构域)的某些片段在序列上广泛不同的事实。V结构域介导抗原结合并限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性并不均匀分布在可变结构域的10-氨基酸跨度上。相反，V区由15-30个氨基酸组成的称为骨架区(FR)的相对不变的一段组成，中间隔着9-12个氨基酸的称为“高变区”的极端变异性较短的区。天然重链和轻链的可变结构域各自包括四个框架区(FR)，主要采用β-片层构型，由三个高变区连接，形成连接β-片层结构的环，并且在一些情况下形成β -片层结构的一部分。FR将每条链上的高变区紧密地结合在一起，并与另一链上的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成。(见Kabat等人，具有免疫学重要性的蛋白质序列(Sequence of Proteins ofImmunology Interest)，第5版，公共卫生署，美国国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达，(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，而是表现出各种效应子功能，例如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
当用于本文时，术语“高变区”是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区通常包括来自CDR的氨基酸残基(例如，在VL中约24-34(L1)、50-56(L2)和89-97 (L3)残基，在VH中约31-35B(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)残基，Kabat等人，具有免疫学重要性的蛋白质序列(Sequence of Proteins of Immunology Interest)，第5版，公共卫生署，美国国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达，(1991))和/或来自“高变环”的残基(例如，VL中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)，以及VH中的残基26-32(H1)、52A-55(H2)和96-101(H3)(Chothia和Lesk《分子生物学杂志》(J.Mol. Biol.)196:901-917(1987))。
“嵌合”抗体(免疫球蛋白)的重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分则与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列，以及这些抗体的片段中的相应序列相同或同源，只要它们表现出所需的生物学活性(美国专利4,816,567号；和Morrison 等人，《美国科学学院学报》(Proc.Natl Acad.Sci.USA)81：6851-6855(1984))。如本文所用，人源化抗体是嵌合抗体的亚类。
非人(例如，鼠)抗体的“人源化”形式是包括衍生自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在一些实施方案中，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体或受体抗体)，其中受体的高变区残基被来自非人类物种(供体抗体)的高变区残基取代，非人类物种(供体抗体)例如小鼠、大鼠、兔子或具有所需的特异性、亲和力和能力的非人灵长类动物。在一些实施方案中，人源化抗体是衍生自人细胞或衍生自具有表达人抗体基因的转基因动物(通常是小鼠)的抗体。
本公开涉及治疗性蛋白，及其制备和使用方法，用于通过增加肿瘤部位，特别是通常由低水平淋巴细胞浸润组成的那些肿瘤处的免疫细胞的募集和激活来诱导或增强先天性、获得性或工程化的(嵌合抗原受体介导的)抗肿瘤免疫应答。
在一个方面，本公开提供治疗性蛋白。蛋白可以是抗体。蛋白可以配置为在治疗部位释放趋化因子，其将免疫细胞吸引到治疗部位。
在一个实施方案中，本公开提供对肿瘤细胞或肿瘤基质具有结合亲和力的多功能重组蛋白，其中生物活性趋化因子被释放以将不同种类的淋巴细胞、单核细胞、树突细胞、NK细胞或嵌合抗原受体(CAR)表达细胞吸引至肿瘤。具体地，重组蛋白可以被制备为治疗产品，其包括至少一种前趋化因子部分和至少一种肿瘤靶向部分，用于结合肿瘤或肿瘤基质相关蛋白或抗原。肿瘤靶向部分可以是特异性结合肿瘤相关抗原或受体的抗体、单链可变片段(scFv)、可变重单结构域(即纳米抗体)或天然配体结构域。当重组蛋白施用于癌症患者时，重组蛋白识别并结合到肿瘤细胞或肿瘤微环境内。如在实体瘤的许多情况下，肿瘤或肿瘤基质相关的蛋白酶活性可在肿瘤部位切割重组蛋白的前趋化因子以释放趋化因子。游离的生物活性趋化因子能将免疫细胞募集到肿瘤部位。生物活性趋化因子还可以刺激免疫细胞，导致抗肿瘤应答。这种重组蛋白是名为“PARK”的蛋白酶释放趋化因子的治疗性蛋白。
在一个实施方案中，本公开提供对与纤维化或阿尔茨海默氏病相关的细胞或蛋白具有结合亲和力的多功能PARK蛋白。在一个实施方案中，PARK可以靶向成纤维细胞激活蛋白α(FAPα)，其在纤维化中的肌成纤维细胞上表达或在阿尔茨海默氏病中的β淀粉样蛋白(Aβ)上表达。在这些位点有活性的蛋白酶如uPA可以释放具有适当蛋白酶底物序列的生物活性趋化因子。释放的趋化因子可以显示治疗活性。例如，CXCL9和 CXCL10可以减少肝纤维化中肝星状细胞胶原的产生(Liang 2012)。CXCL12可降低Aβ所诱导的神经元凋亡(Zuena2019)。
在一个实施方案中，提供了用于筛选和鉴定由至少一种肿瘤相关蛋白酶特异性切割的前肽的测定。本公开的目的和优点可以从以下结合附图对其实例中优选实施方案的详细描述中变得清楚。
实施例
实施例1：将趋化因子转化为新的前趋化因子。
趋化因子CCL14(a.k.a.Hemofiltrate CC趋化因子，如Detheux 2000，Vakili2001， Blain 2007中描述的，)通常存在于血液中。8个氨基酸的前肽被蛋白水解地从CCL14的 N端切割以激活CCL14结合其受体(SEQ ID NO：1-4)。前肽切割激活与趋化因子受体CCR1、CCR3和CCR5的有效结合，并随后激活T细胞和单核细胞趋化性(Detheux 2000，Vakili 2001，Blain 2007)。基于CCL14的此生物化学特征，将其它趋化因子转化成前趋化因子，从而能够构建具有一系列特定细胞激活和向肿瘤募集的PARK蛋白。如图1所示，RANTES(SEQ ID NO：5-7)，也称为CCL5，对于T细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞是趋化性的，并且在将白细胞募集到炎性位点以及在抑制HIV感染中起积极作用。如图1所示，通过将CCL14(SEQ ID NO：2-3)的前导序列和前肽序列与RANTES(SEQ ID NO：7，图1A)的生物活性部分融合，RANTES被转化为ProRANTES(SEQ ID NO： 8)。通过将CCL14的前导序列和前肽序列融合至单独的生物活性趋化因子序列(SEQ ID NO：11-20)产生额外的PARK，这导致与其SEQ ID NO：111-201形成相应的前趋化因子。通过将另外的前肽插入每个另外的生物活性趋化因子序列，例如图1B所示的 CCL21-XCL1前趋化因子(SEQ ID NO：211)的实例，产生串联的前趋化因子。可以将 1至4个甘氨酸的间隔区序列插入前肽的N端以提高蛋白水解切割的效率。用某些趋化因子，可将单个甘氨酸插入前肽的C端以增加蛋白水解切割。趋化因子也通过在其前导肽的C端和趋化因子的成熟活性形式的N端之间插入前肽而转化成前趋化因子。各种前导序列和前肽序列可用于产生新的前趋化因子(表1)。前肽可以选自前肽数据库 (http://www.cbs.dtu.dk/databases/propeptides/)。蛋白酶底物序列可以选自切割位点的数据库(http://pmap.burnham.org/proteases)。
实施例2.肿瘤相关蛋白酶和PARK前趋化因子的鉴定
某些趋化因子作为单体是稳定和活性的，例如CCL21(SLC)或CCL7(MCP3)。其它趋化因子可形成能够结合糖基氨基聚糖并支持趋化性的二聚体(Kufareva等人2015， Imunocell Biol，93(4)372)。然而，通过单一氨基酸替代使趋化因子成为寡聚缺陷的趋化因子，维持了野生型趋化刺激水平。例如，许多CC趋化因子在位置8具有脯氨酸，其在被取代为丙氨酸时消除二聚化而不损失趋化活性(Paavola等人1998，JBC，V273； 33157)。为了破坏PARK前趋化因子形成二聚体的潜力并促进它们的制备，选择PARK 前趋化因子用于具有稳定和活性单体形式或造成二聚化缺陷的那些。这将有利于前趋化因子串联阵列形式的制造。或者，使用从第一单体的C端至第二单体的N端的接头(类似于在scFv中使用的接头)将趋化因子制造为同源二聚体。
肿瘤显示肿瘤相关蛋白酶活性。已经显示几种肿瘤具有肿瘤相关蛋白酶活性(Sudhan 2015，Choi 2012)(表1)。肿瘤相关蛋白酶包括组织蛋白酶，纤溶酶原激活剂，纤溶酶，基质金属蛋白酶和激肽释放酶(Choi 2012)。一些肿瘤相关蛋白酶被描述为预后因素。例如，已经报道了当与健康供体相比时，肺癌、胰腺癌和卵巢癌患者中组织蛋白酶L的血清水平升高(Chen等人，2011；Leto等人，1997；Nishida等人，1995；Siewinski等人， 2004；Tumminello等人，1996；Zhang等人，2011)。肿瘤相关蛋白酶可能参与转移。肿瘤相关蛋白酶活性是设计某些癌症治疗剂的基础(Choi 2012)。此外，组织蛋白酶E的表达在胃癌和胰腺癌中特别高，这在本文中是相关的。一种或多种肿瘤相关蛋白酶的前肽切割最接近肿瘤部位。肿瘤相关蛋白酶显示在肿瘤部位前肽切割增加。例如，需要用于荧光的前肽切割的荧光探针被注射到小鼠肿瘤模型中(Hisiao 2006)。生物发光在肿瘤部位达到峰值(结肠腺癌；HT-29和纤维肉瘤；HT-1080)显示探针主要在肿瘤部位被肿瘤相关蛋白酶活性切割。
当用于治疗肿瘤时，PARK被切割，导致最大浓度的活性趋化因子释放定位于肿瘤部位。在另一个实施方案中，PARK包括由与肾、肝、肺或心脏纤维化或阿尔茨海默氏病相关的活性蛋白酶释放的前趋化因子。这种局部释放可以导致用生物活性趋化因子的有效治疗。
在一个实施方案中，本文公开的PARK可以在CAR载体(vector)中编码并在CAR-T或CAR-NK细胞中表达。在一个实施方案中，可以在哺乳动物细胞中产生PARK，如果需要，当哺乳动物细胞表达切割PARK的特异性蛋白酶时，哺乳动物细胞具有被破坏的蛋白酶基因。
实施例3.含有PARK的治疗性蛋白
如图1和表1所示，使用重组DNA技术通过将前肽融合到趋化因子的N端产生新的前趋化因子。转化为前趋化因子的趋化因子可以是CC、CXC、CX3C或C族趋化因子，包括但不限于CCL1、CCL3、CCL5、CCL7、CCL14、CCL16、CCL19、CCL20、CCL21、 CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL12、CXCL16、XCL1、CX3CL1和PROK2。各种前肽可用于限制对特异性肿瘤相关蛋白酶的切割(表1)。PARK可包括多于一种类型的前肽，其需要多于一种肿瘤相关蛋白酶切割并释放一种或多种功能性趋化因子。例如，不同的蛋白酶切割位点可以位于前趋化因子的N端和C端。这可以实现趋化因子激活对肿瘤部位的更大限制。
实施例4.用于鉴定由肿瘤相关蛋白酶特异性切割的前肽的测定。
前肽可选自前肽数据库(例如http://www.cbs.dtu.dk/databases/propeptides/)，从已知的底物切割序列合成，基于共有蛋白酶切割位点合成或在由肿瘤相关蛋白酶选择性切割的肽的筛选中鉴定。鉴定由肿瘤相关蛋白酶特异性切割的前肽的筛选测定可以使用PARK，其包括具有表位标签(标签1)，例如flag、HA和His)的报告基因scFv。如图2所示， PARK可以含有通过间隔区连接的两种趋化因子和蛋白酶底物位点的几种变体之一。 PARK可以与肿瘤抗原结合，可以是固定化的重组抗原，也可以是表达在肿瘤细胞表面的抗原。通过ELISA测定报告基因scFv的释放，测试肿瘤蛋白酶或纯化的蛋白酶随时间切割PARK的能力。在ELISA中，通过将释放的报告基因scFv与固定化抗原结合并用例如与HRP偶联的抗标签抗体检测来证明切割。通过使用对标签2具有特异性的抗体来确定在ELISA中或在肿瘤表面上(通过流式细胞荧光测定法)肿瘤结合部分的存在。底物序列的文库可以通过使用PARK的噬菌体展示和从变异体中测序DNA来筛选蛋白酶切割，如Ratnikov等人，2009年所述。虽然可以如图2所示固定切割位点，但是可以修改该测定以证明PARK被存在于纤维化或阿尔茨海默氏病中的蛋白酶切割。例如，通过将 PARK报告基因底物与FAPα或Aβ结合。该测定可用于产生氨基酸取代的蛋白酶底物位点以改变切割速率。
实施例5.含有PARK的蛋白的构型
通过在单一肽的单一开放阅读框中具有编码前导序列、一种或多种前趋化因子和肿瘤、纤维化或AD靶向蛋白的序列来构建PARK表达载体(vector)。为了具有可以增加治疗效果的另外的结合活性，例如在涉及抗体的免疫治疗中，可以将PARK添加到治疗性抗体上。例如，图3显示了含有PARK的抗体蛋白(即，PARK蛋白)的几种构型。
虽然PARK蛋白的整体设计可以变化，但PARK蛋白可以具有单个前趋化因子或串联的几个前趋化因子，如图3A所示。短间隔区序列，例如两个或多个甘氨酸，可以插入到串联前趋化因子之间。fractalkine的粘蛋白区可掺入PARK前趋化因子的C端。
PARK蛋白可以是两种肽的复合物，例如具有一条重链和一条轻链的抗体结构，如图3F-3H所示。PARK构建体也可以编码免疫球蛋白Fc。Fc可以包括两个免疫球蛋白CH2-CH3结构域，其选择性地彼此缔合，例如在杵臼结构抗体(knob-in hole-antibody) 中，以产生双功能臂，如图3B-3E所示。列出了三种不同的杵臼结构PARK的序列(SEQ ID NO：241、251、261和271)。例如，一个CH2-CH3是靶向疾病相关抗原的部分，例如肿瘤相关抗原(TAA)和具有前趋化因子的第二CH2-CH3，如图3B所示。PARK蛋白Fc结构域可以是不同的同种型，因此支持ADCC或补体结合。
PARK蛋白可以具有一种或多种前趋化因子和一种或多种靶向抗体、抗体片段或配体。例如，图3A显示PARK前趋化因子以串联阵列存在，串联阵列系链于一种或多种 scFv以靶向一种或多种肿瘤或肿瘤基质抗原。PARK可具有两种不同的Ig CH2-CH3结构域，其选择性地彼此结合(杵臼结构Fc)。如图3B所示，一个CH2-CH3可以在其N端与svFv片段融合以将PARK靶向疾病相关抗原，例如肿瘤细胞或基质相关抗原。其它 CH2-CH3可具有与其N端融合的一种或多种前趋化因子。图3C中的构型显示PARK蛋白的相对对称结构，其中两种不同IgCH2-CH3中的每一种在其N端与多个前趋化因子结构域连接，并且在其C端与一个scFv结构域连接，并且两个scFv结构域可以具有两种不同的结合特异性。
其它变体可以在N端或C端具有一个或多个前趋化因子和肿瘤靶向部分。图3D-3E显示PARK可能具有在N端或C端具有一个或多个前趋化因子或肿瘤靶向部分的免疫球蛋白Fc。例如，图3E中的靶向部分可以是抑制免疫检查点的一种或多种天然配体，例如PD-1或TIM3。图3F-3H显示PARK可能具有在N端或C端具有一个或多个前趋化因子的完整抗体。PARKS可以是双特异性的并结合两种肿瘤抗原。箭头表示肿瘤蛋白酶切割位点。在一个实施方案中，前趋化因子侧接两个不同的蛋白酶切割位点，以增加活性趋化因子在肿瘤上的特异性释放。在某些情况下，蛋白酶切割位点可以在PARK内变化，使得通过氨基酸取代修饰更多的C端前趋化因子切割位点以降低切割速率，从而促进趋化因子梯度的产生。
实施例6.构建PARK表达载体(vector)
可以设计表达构建体从哺乳动物细胞分泌PARK，如图4所示。含有被破坏的蛋白酶基因的哺乳动物细胞可能有利于表达完整的PARK或PARK蛋白。蛋白酶基因，例如表1中鉴定的那些，可以通过几种方法之一例如CRISPR破坏。PARK也可由不表达蛋白酶但仍切割工程化PARK蛋白酶位点的昆虫细胞或酵母产生。PARK构建体可以表达一种或多种前趋化因子和靶向一种或多种肿瘤、纤维化或AD相关抗原的配体。TAA-scFv 是肿瘤相关抗原特异性scFv。
实施例7.修饰蛋白酶切割位点
PARK可以具有前趋化因子，其在如图3所示的不同位置具有修饰的蛋白酶切割位点序列，如箭头所示。修饰的位点可以降低切割速率并且在释放活性趋化因子之前使 PARK能够定位至肿瘤的时间更长。修饰的位点可出现在接近靶向部分的前趋化因子中，使得这些趋化因子将是最后释放的，从而允许更连续的释放和梯度。已经报道了uPA和 tPA的非最佳蛋白酶底物(Lui等人2001，JBC 276 17976)。
实施例8.用于治疗疾病，包括癌症、纤维化和阿尔茨海默氏病的PARK蛋白的实例。
现在普遍接受的是，抗CD3部分将T细胞杀伤重定向至肿瘤靶标或癌症相关成纤维细胞(CAF)，并且抗CD11b可以支持肿瘤细胞的吞噬作用。类似地，抗PAI-1部分可以增加uPA和纤溶酶的活性以增加PARK趋化因子的释放和纤维化细胞外基质的降解，并且抗清除剂受体可以刺激Aβ的摄取。为了将这些功能配置进PARK蛋白，选择图3C中的结构用于产生PARK治疗性蛋白。如图5A-5C所示，3种PARK蛋白均包括在N端与杵臼结构Fc串联的前趋化因子和在C端与Fc串联的两个scFv结合结构域。对于治疗胃癌，两个scFv结构域对T细胞的CD3和胃癌细胞的CDH17具有结合特异性，而前趋化因子具有CXCL10、CCL21和XCL1的成熟活性(图5A，SEQ ID NO：221-222)。对于治疗纤维化，两个scFv结构域对组织成纤维细胞的FAP和PAI-1具有结合特异性，而前趋化因子具有CXCL9和CXCL10的成熟活性(图5B，SEQ ID NO：231-232)。对于治疗AD，两个scFv结构域对β-淀粉样蛋白和清道夫受体具有结合特异性，而前趋化因子具有CXCL12的成熟活性(图5C)。
在图3C或图5的每种构型中，靶向部分可以是结合图6所示病变特异性抗原的scFv、纳米抗体或内源配体结构域。示例性趋化因子是能够募集将支持抗肿瘤应答的细胞而不是能够减弱抗肿瘤应答的细胞类型的那些趋化因子，例如Tregs。示例性趋化因子包括显示出抗肿瘤活性，特别是当注射到肿瘤中时消退的趋化因子(Homey，2002)。靶向肿瘤抗原的PARK构建体也可以与细胞毒药物缀合以增强抗肿瘤活性。
可以使用合适的表达载体(vector)优化编码PARK的密码子以在人、细菌或酵母细胞中表达和生产。PARK蛋白可以具有蛋白标签，例如，包括约8至约10个组氨酸， streptag-2或免疫球蛋白Fc的氨基酸序列，其可以用于通过标准技术进行纯化。
可以通过不同的施用途径(包括静脉内、腹膜内、皮下、脑室内、玻璃体内、鞘内或瘤内)向癌症、纤维化或阿尔茨海默氏病(AD)患者施用有效浓度的纯化的PARK蛋白。PARK蛋白可以单剂量或多剂量施用。PARK可以在一定浓度范围内施用。PARK可用作单一治疗剂或与其它免疫疗法、细胞疗法、化学疗法或药物疗法组合使用。例如， PARK可与CAR T或CARNK细胞组合以实现更好的肿瘤定位。
实施例9.PARK作为癌症免疫治疗的平台技术。
在PARK与肿瘤抗原包被的微量滴定孔结合并加入肿瘤相关蛋白酶后，将证明PARK趋化因子的体外释放。此外，在PARK与表达特异性蛋白酶的肿瘤细胞结合后，将证明趋化因子的释放。
初始PARK构建体可以含有作为uPA、组织蛋白酶和/或MMP的底物的前趋化因子。趋化因子释放可通过趋化因子ELISA和基于细胞的钙动员或趋化性测定随时间测量。阴性对照将包括没有蛋白酶和没有蛋白酶切割位点的PARK。PARK的Fc部分的释放也将通过ELISA进行测定，以证明PARK与肿瘤抗原的结合不会被蛋白酶改变。
作为体内实例，PARK将被施用于小鼠异种移植癌模型中，该模型通常表现为低水平的淋巴细胞浸润，并且其中肿瘤细胞或肿瘤基质已被确定为表达PARK特异性肿瘤抗原和趋化因子前肽的特异行蛋白酶。
通过免疫组织化学(IHC)或通过使用具有荧光标记的淋巴细胞的小鼠模型的生物发光测定随时间增加的肿瘤淋巴细胞浸润。或者，静脉注射人淋巴细胞，如果细胞被适当标记，经IHC用人特异性抗淋巴抗体或生物发光法测量肿瘤浸润。在后一种情况下，PARK 可以含有人趋化因子。
PARK可用于治疗任何癌症类型以诱导或增强抗肿瘤免疫应答。PARK可优选用于治疗显示低水平淋巴细胞浸润的实体瘤。PARK可用于治疗肺、结肠、肝、胃、胰腺、前列腺、乳腺、卵巢、脑或其它癌症类型。
许多肿瘤类型不产生足够的抗肿瘤免疫应答，并且一些显示低水平的淋巴细胞浸润。 PARK通过招募和/或激活一种或多种具有抗肿瘤活性的细胞类型(如树突状细胞、T细胞、NK细胞和巨噬细胞)来使癌症患者受益，如图6所示。PARK治疗可以抑制肿瘤介导的免疫抑制并促进更有效的抗肿瘤免疫应答。PARK可用于使CAR T或CAR NK细胞能够更好地归巢至肿瘤。这将通过将CAR细胞集中在肿瘤，特别是在不吸引淋巴细胞或其它免疫细胞类型的肿瘤中来增加CAR细胞的效率。这可能会减少需要施用以实现完全和持久的抗肿瘤应答的CAR细胞的数量。CAR细胞的更好的肿瘤定位和应答所需的CAR 细胞的减少可以使CAR介导的对正常组织的毒性降低。
或者，前趋化因子与靶向肿瘤相关抗原和T或NK细胞受体的双特异性抗体连接。这实现了附加的PARK功能；除了将免疫细胞定位于肿瘤部位之外，抗CD3将刺激T细胞介导的肿瘤杀伤。抗CD3可以用抗NK细胞受体代替以刺激NK介导的肿瘤杀伤。相反，双特异性PARK前趋化因子可在空间上阻碍与T或NK细胞的结合。前趋化因子可以与TCR或NK细胞靶向部分融合，使得它们的结合由于前趋化因子空间位阻而被阻断。双特异性抗体经由靶部分定位于肿瘤。在肿瘤部位，前趋化因子被肿瘤相关蛋白酶切割，允许抗TCR或抗NK受体结合并激活肿瘤局部杀伤。这可以实现低水平的不期望的肿瘤外毒性。
实施例10.PARK作为一个灵活的平台。
PARK是可以使用各种趋化因子的灵活平台，趋化因子能够募集先天和获得性免疫系统的不同细胞类型(表2)。可以将一种或多种趋化因子掺入PARK蛋白以最大限度地增强抗肿瘤应答。例如，可选择趋化因子，其募集抗原递呈细胞和肿瘤细胞毒性细胞，但不募集可减弱抗肿瘤免疫应答的Tregs。PARK可以募集细胞毒性T细胞和NK细胞。
可以设计PARK蛋白以靶向广泛的抗原以靶向不同的肿瘤、纤维化或AD(表3)。如图3所示，通过拥有两个具有不同特异性的scFv，单个PARK可以含有对一种或多种肿瘤相关抗原的特异性。PARK还可以通过阻断免疫检查点抑制剂的相互作用来增强抗肿瘤免疫应答。例如，PARK scFv可以结合PD-L1和/或PD-L2(表3)。
PARK蛋白可抑制肿瘤生长或具有肿瘤细胞毒性活性。在这种情况下，PARK靶向部分可以阻断生长因子受体(例如EGF或VEGF受体)的活性，刺激细胞凋亡应答，例如 Fas配体或通过ADCC、补体结合或作为药物缀合物介导细胞毒性。作为药物缀合物， PARK可以缀合到伊立替康、澳瑞他汀(auristatins)、PBD、美登素、鹅膏菌素、剪接体抑制剂和其它化学治疗剂。
PARK蛋白可以具有不同的前肽以限制对与某些肿瘤类型相关的特定蛋白酶的切割。因此，可以针对不同的癌症类型定制PARK活性。PARK可包括多于一种类型的前肽，其需要多于一种肿瘤相关蛋白酶切割并释放功能性趋化因子。这可以实现趋化因子激活对肿瘤部位的更大限制。
几种癌症治疗影响淋巴细胞向肿瘤中的浸润，包括免疫检查点抑制剂的特异性抗体、抗血管生成剂、耗竭Treg细胞的治疗和溶瘤病毒治疗(Oelkrug 2014)。这些治疗中没有一个直接控制肿瘤部位中特异性趋化因子的类型和浓度。这些治疗中的一些不预期在治疗之前对具有低水平淋巴细胞的肿瘤有效。
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Figure BDA0003151061860000185
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表1.可以切割和激活PARK前趋化因子的各种蛋白酶的实例
Figure BDA0003151061860000191
修改自Choi等人2012：X＝任何氨基酸；*可以从蛋白酶数据库例如PMAP (http://pmap.burnham.org/proteases)选择底物序列
表2.趋化因子，靶细胞和功能。
Figure BDA0003151061860000201
Figure BDA0003151061860000211
参考文献参见Oo 2012。
表3.PARK靶向特异性或配体的实例
scFv或其他抗体片段在PARK中的特异性 PARK中的天然配体
PD-L1 PD-1
PD-L2 TIM3
CDH17 EGF1,EGF2
TROP-2 VEGF
生长因子受体例如EGFR、HER2、VEGFR、IGF1R IGF
B7H3 细胞因子
EpCAM c-METErb3
PSMA Tigit
磷脂酰肌醇聚糖-3 趋化因子
CEA[例如]，CEACAM5 细胞因子
神经节苷脂例如，GD2、GM3、GM2
CD19+CD22
成纤维细胞激活蛋白-1(FAP)
β淀粉样蛋白
清道夫受体例如，SR-A1、SR-B1、SR-F、SR-L
吞噬细胞受体，例如CD11b/CD18、IgFc受体
整合蛋白例如αVβ3、α6β4
序列表
SEQ ID NO:1
天然CCL14是包括CCL14前导序列(SEQ ID NO：2)、CCL14前肽(SEQ ID NO：3)、生物 活性CCL14趋化因子(SEQ ID NO：4)序列的PRO-CCL14。
MKISVAAIPFFLLITIALGTKTESSSRGPYHPSECCFTYTTYKIPRQRIMDYYETNSQC
SEQ ID NO:2
CCL14前导序列
MKISVAAIPFFLLITIALG
SEQ ID NO:3
CCL14前肽序列
TKTESSSR
SEQ ID NO:4
CCL14成熟的活性趋化因子序列
MKISVAAIPFFLLITIALGTKTESSSRGPYHPSECCFTYTTYKIPRQRIMDYYETNSQC
SEQ ID NO:5
天然RANTES(也称为CCL5)包括CCL5前导序列(SEQ ID NO:6)和生物活性CCL5趋化 因子(SEQ ID NO:7)序列
MKVSAAALAVILIATALCAPASASPYSSDTTPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAVVFVTRKNRQVCANPEKKWVREYINSLEMS
SEQ ID NO:6
A CCL5前导序列
MKVSAAALAVILIATALCAPASA
SEQ ID NO:7
生物活性RANTES/CCL5趋化因子序列
SPYSSDTTPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAVVFVTRKNRQVCANPEKKWV REYINSLEMS
SEQ ID NO:8
PRO-RANTES(PRO-CCL5)是包括CCL14前导序列(SEQ ID NO:2)、CCL14前肽(SEQ ID NO:3)和生物活性RANTES/CCL5趋化因子(SEQ ID NO:7)序列的重组蛋白
MKISVAAIPFFLLITIALGTKTESSSRSPYSSDTTPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAVVFVTRKNR
QVCANPEKKWVREYINSLEMS
SEQ ID NO:11
生物活性CCL1趋化因子序列
KSMQVPFSRCCFSFAEQEIPLRAILCYRNTSSICSNEGLIFKLKRGKEACALDTVGWVQRHRKMLRHCPSKRK
SEQ ID NO:12
生物活性CCL2趋化因子序列
QPDAINAPVTCCYNFTNRKISVQRLASYRRITSSKCPKEAVIFKTIVAKEICADPKQKWVQDSMDHLDKQTQTPKT
SEQ ID NO:13
生物活性CCL3趋化因子序列
SLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIADYFETSSQCSKPGVIFLTKRSRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA
SEQ ID NO:14
生物活性CCL20趋化因子序列
ASNFDCCLGYTDRILHPKFIVGFTRQLANEGCDINAIIFHTKKKLSVCANPKQTWVKYIVRLLSKKVKNM
SEQ ID NO:15
生物活性CCL21趋化因子序列
SDGGAQDCCLKYSQRKIPAKVVRSYRKQEPSLGCSIPAILFLPRKRSQAELCADPKEL WVQQLMQHLDKTPSPQKPAQGCRKDRGASKTGKKGKGSKGCKRTERSQTPKGP
SEQ ID NO:16
生物活性CXCL9趋化因子序列
TPVVRKGRCSCISTNQGTIHLQSLKDLKQFAPSPSCEKIEIIATLKNGVQTCLNPDSADV KELIKKWEKQVSQKKKQKNGKKHQKKKVLKVRKSQRSRQKKTT
SEQ ID NO:17
生物活性CXCL10趋化因子序列
VPLSRTVRCTCISISNQPVNPRSLEKLEIIPASQFCPRVEIIATMKKKGEKRCLNPESKAIKNLLKAVSKERSKRSP
SEQ ID NO:18
生物活性CXCL16趋化因子序列
SVTGSCYCGKRISSDSPPSVQFMNRLRKHLRAYHRCLYYTRFQLLSWSVCGGNKDPWVQELMSCLDLKECGHAYS
SEQ ID NO:19
生物活性XCL1趋化因子序列
VGSEVSDKRTCVSLTTQRLPVSRIKTYTITEGSLRAVIFITKRGLKVCADPQATWVRDV VRSMDRKSNTRNNMIQTKPTGTQQSTNTAVTLTG
SEQ ID NO:20
生物活性CX3CL1趋化因子序列
QHHGVTKCNITCSKMTSKIPVALLIHYQQNQASCGKRAIILETRQHRLFCADPKEQWVKDAMQHLDRQAAALTRNG
SEQ ID NO:111
PRO-CCL1是包括CCL14前导序列(SEQ ID NO:2)、CCL14前肽(SEQ ID NO:3)和生物 活性CCL1趋化因子(SEQ ID NO:11)序列的重组蛋白
MKISVAAIPFFLLITIALGTKTESSSRKSMQVPFSRCCFSFAEQEIPLRAILCYRNTSSICSNEGLIFKLKRGK
EACALDTVGWVQRHRKMLRHCPSKRK
SEQ ID NO:121
PRO-CCL2是包括CCL14前导序列(SEQ ID NO:2)、CCL14前肽(SEQ ID NO:3)和生物 活性CCL2趋化因子(SEQ ID NO:12)序列的重组蛋白
MKISVAAIPFFLLITIALGTKTESSSRQPDAINAPVTCCYNFTNRKISVQRLASYRRITSSKCPKEAVIFKTIV
AKEICADPKQKWVQDSMDHLDKQTQTPKT
SEQ ID NO:131
PRO-CCL3是包括CCL14前导序列(SEQ ID NO:2)、CCL14前肽(SEQ ID NO:3)和生物 活性CCL3趋化因子(SEQ ID NO:13)序列的重组蛋白
MKISVAAIPFFLLITIALGTKTESSSRSLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIADYFETSSQCSKPGVIFLTKRSR
QVCADPSEEWVQKYVSDLELSA
SEQ ID NO:141
PRO-CCL20是包括CCL14前导序列(SEQ ID NO:2)、CCL14前肽(SEQ ID NO:3)和生 物活性CCL20趋化因子(SEQ ID NO:14)序列的重组蛋白
MKISVAAIPFFLLITIALGTKTESSSRASNFDCCLGYTDRILHPKFIVGFTRQLANEGCDINAIIFHTKKK
LSVCANPKQTWVKYIVRLLSKKVKNM
SEQ ID NO:151
PRO-CCL21是包括CCL14前导序列(SEQ ID NO:2)、CCL14前肽(SEQ ID NO:3)和生 物活性CCL21趋化因子(SEQ ID NO:15)序列的重组蛋白
MKISVAAIPFFLLITIALGTKTESSSRSDGGAQDCCLKYSQRKIPAKVVRSYRKQEPSLGCSIPAILFLPRKRS
QAELCADPKELWVQQLMQHLDKTPSPQKPAQGCRKDRGASKTGKKGKGSKGCKRTE RSQTPKGP
SEQ ID NO:161
PRO-CXCL9是包括CCL14前导序列(SEQ ID NO:2)、CCL14前肽(SEQ ID NO:3)和生 物活性CXCL9趋化因子(SEQ ID NO:16)序列的重组蛋白
MKISVAAIPFFLLITIALGTKTESSSRTPVVRKGRCSCISTNQGTIHLQSLKDLKQFAPSP SCEKIEIIATLKNGVQTCLNPDSADVKELIKKWEKQVSQKKKQKNGKKHQKKKVLKVRKS QRSRQKKTT
SEQ ID NO:171
PRO-CXCL10是包括CCL14前导序列(SEQ ID NO:2)、CCL14前肽(SEQ ID NO:3)和生 物活性CXCL10趋化因子(SEQ ID NO:17)序列的重组蛋白
MKISVAAIPFFLLITIALGTKTESSSRVPLSRTVRCTCISISNQPVNPRSLEKLEIIPASQFC PRVEIIATMKKKGEKRCLNPESKAIKNLLKAVSKERSKRSP
SEQ ID NO:181
PRO-CXCL16是包括CCL14前导序列(SEQ ID NO:2)、CCL14前肽(SEQ ID NO:3)和生 物活性CXCL16趋化因子(SEQ ID NO:18)序列的重组蛋白
MKISVAAIPFFLLITIALGTKTESSSRSVTGSCYCGKRISSDSPPSVQFMNRLRKHLRAY HRCLYYTRFQLLSWSVCGGNKDPWVQELMSCLDLKECGHAYS
SEQ ID NO:191
PRO-XCL1是包括CCL14前导序列(SEQ ID NO:2)、CCL14前肽(SEQ ID NO:3)和生物 活性XCL1趋化因子(SEQ ID NO:19)序列的重组蛋白
MKISVAAIPFFLLITIALGTKTESSSRVGSEVSDKRTCVSLTTQRLPVSRIKTYTITEGSLR AVIFITKRGLKVCADPQATWVRDVVRSMDRKSNTRNNMIQTKPTGTQQSTNTAVTLTG
SEQ ID NO:201
PRO-CX3CL1是包括CCL14前导序列(SEQ ID NO:2)、CCL14前肽(SEQ ID NO:3)和生 物活性CX3CL1趋化因子(SEQ ID NO:20)序列的重组蛋白
MKISVAAIPFFLLITIALGTKTESSSRQHHGVTKCNITCSKMTSKIPVALLIHYQQNQAS CGKRAIILETRQHRLFCADPKEQWVKDAMQHLDRQAAALTRNG
SEQ ID NO:211
前趋化因子串联：PRO-CCL21-XCL1的序列
MKISVAAIPFFLLITIALGTKTESSSRGSDGGAQDCCLKYSQRKIPAKVVRSYRKQEPSL GCSIPAILFLPRKRSQAELCADPKELWVQQLMQHLDKTPSPQKPAQGCRKDRGASKTGKKG KGSKGCKRTERSQTPKGPGGGTKTESSSRGVGSEVSDKRTCVSLTTQRLPVSRIKTYTITEGS LRAVIFITKRGLKVCADPQATWVRDVVRSMDRKSNTRNNMIQTKPTGTQQSTNTAVTLTG SEQ ID NO:221
如图5A所示，PARK蛋白CCL21-XCL1-FC杵-αCD3是包括PRO-CXCL10-CCL21和抗CD3 SCFV结构域序列的重组蛋白。
MKISVAAIPFFLLITIALGTKTESSSRGVPLSRTVRCTCISISNQPVNPRSLEKLEIIPASQF CPRVEIIATMKKKGEKRCLNPESKAIKNLLKAVSKERSKRSPGGGTKTESSSRSDGGAQDC CLKYSQRKIPAKVVRSYRKQEPSLGCSIPAILFLPRKRSQAELCADPKELWVQQLMQHLDK TPSPQKPAQGCRKDRGASKTGKKGKGSKGCKRTERSQTPKGPGGGTKTESSSRSDGGAQD CCLKYSQRKIPAKVVRSYRKQEPSLGCSIPAILFLPRKRSQAELCADPKELWVQQLMQHLD KTPSPQKPAQGCRKDRGASKTGKKGKGSKGCKRTERSQTPKGPGGGTKTESSSRVGSEVSDKRTCVSLTTQRLPVSRIKTYTITEGSLRAVIFITKRGLKVCADPQATWVRDVVRSMDRKSN TRNNMIQTKPTGTQQSTNTAVTLTGGAPGGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCPEEMTKNQVSLWC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSLGKPAGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTM NWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVY YCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVG DRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQ PEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIK*
SEQ ID NO:222
如图5A所示，PARK蛋白CCL21-XCL1-FC臼-αCDH17是包括PRO-CXCL10-CCL21和抗 CDH17 SCFV结构域序列的重组蛋白。
MKISVAAIPFFLLITIALGTKTESSSRGVPLSRTVRCTCISISNQPVNPRSLEKLEIIPASQF CPRVEIIATMKKKGEKRCLNPESKAIKNLLKAVSKERSKRSPGGGTKTESSSRSDGGAQDC CLKYSQRKIPAKVVRSYRKQEPSLGCSIPAILFLPRKRSQAELCADPKELWVQQLMQHLDK TPSPQKPAQGCRKDRGASKTGKKGKGSKGCKRTERSQTPKGPGGGTKTESSSRSDGGAQD CCLKYSQRKIPAKVVRSYRKQEPSLGCSIPAILFLPRKRSQAELCADPKELWVQQLMQHLD KTPSPQKPAQGCRKDRGASKTGKKGKGSKGCKRTERSQTPKGPGGGTKTESSSRVGSEVSDKRTCVSLTTQRLPVSRIKTYTITEGSLRAVIFITKRGLKVCADPQATWVRDVVRSMDRKSN TRNNMIQTKPTGTQQSTNTAVTLTGGAPGGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSPEEMTKNQVSLSCA VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSLGKPAGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSW VRQTPGKGLEWVAVIDSNGGSTYYPDTVKDRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCS SYTNLGAYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAS QDISGYLNWLQQKPGGAIKRLIYTTSTLDSGVPKRFSGSGSGTDFTLTISSLQSEDFATYYCL QYASSPFTFGGGTKVEIK*
SEQ ID NO:231
如图5B所示，PARK蛋白CXCL9-CXCL9-CXCL10-CXCL10-FC杵-MAFAP是包括PRO- CXCL9-CXCL9-CXCL10-CXCL10-FC杵-MAFAP序列的重组蛋白。
MKISVAAIPFFLLITIALGTKTESSSRTPVVRKGRCSCISTNQGTIHLQSLKDLKQFAPSP SCEKIEIIATLKNGVQTCLNPDSADVKELIKKWEKQVSQKKKQKNGKKHQKKKVLKVRKS QRSRQKKTTGGGTKTESSSRTPVVRKGRCSCISTNQGTIHLQSLKDLKQFAPSPSCEKIEIIA TLKNGVQTCLNPDSADVKELIKKWEKQVSQKKKQKNGKKHQKKKVLKVRKSQRSRQKK TTGGGTKTESSSRVPLSRTVRCTCISISNQPVNPRSLEKLEIIPASQFCPRVEIIATMKKKGEK RCLNPESKAIKNLLKAVSKERSKRSPGGGTKTESSSRVPLSRTVRCTCISISNQPVNPRSLEK LEIIPASQFCPRVEIIATMKKKGEKRCLNPESKAIKNLLKAVSKERSKRSPGAPGGEPKSSDKT HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPCPEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKPAGGGGSQVQLKQSGAELV KPGASVKLSCKTSGYTFTENIIHWVKQRSGQGLEWIGWFHPGSGSIKYNEKKDKATLTAD KSSSTVYMELSRLTSEDSAVYFCARHGGTGRGAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSG GGGSDILMTQSPASSVVSLSGQRATISCRASKSVSTSAYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLAS NLESGVPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPYTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO:232
如图5B所示，PARK蛋白CXCL9-CXCL9-CXCL10-CXCL10-FC臼-αPAI-1是包括PRO- CXCL9-CXCL9-CXCL10-CXCL10-FC臼-αPAI-1序列的重组蛋白。
MKISVAAIPFFLLITIALGTKTESSSRTPVVRKGRCSCISTNQGTIHLQSLKDLKQFAPSP SCEKIEIIATLKNGVQTCLNPDSADVKELIKKWEKQVSQKKKQKNGKKHQKKKVLKVRKS QRSRQKKTTGGGTKTESSSRTPVVRKGRCSCISTNQGTIHLQSLKDLKQFAPSPSCEKIEIIA TLKNGVQTCLNPDSADVKELIKKWEKQVSQKKKQKNGKKHQKKKVLKVRKSQRSRQKK TTGGGTKTESSSRVPLSRTVRCTCISISNQPVNPRSLEKLEIIPASQFCPRVEIIATMKKKGEK RCLNPESKAIKNLLKAVSKERSKRSPGGGTKTESSSRVPLSRTVRCTCISISNQPVNPRSLEK LEIIPASQFCPRVEIIATMKKKGEKRCLNPESKAIKNLLKAVSKERSKRSPGAPGGEPKSSDKT HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPRE PQVCTLPPSPEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLV SRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKPAGGGGSQVQLVQSGAEVK KPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYTDDFKGRFTM TLDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAKDVSGFVFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGG GGSDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNIIKQKNCLAWYQQKPGQPPKLLIYWAST RESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPYTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO:241
FAPSCFV-FCBS1:杵
MKWVTFISLLFLFSSAYSQVQLKQSGAELVKPGASVKLSCKTSGYTFTENIIHWVKQR SGQGLEWIGWFHPGSGSIKYNEKKDKATLTADKSSSTVYMELSRLTSEDSAVYFCARHG GTGRGAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDILMTQSPASSVVSLSGQRATISC RASKSVSTSAYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEE EDAATYYCQHSRELPYTFGGGTKLEIKGAPGGGSGEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSPEEMTKN QVSLYCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK**
SEQ ID NO:251
CCL14(X3)-FCBS2:臼
MKISVAAIPFFLLITIALGTKTESSSRGPYHPSECCFTYTTYKIPRQRIMDYYETNSQCSK PGIVFITKRGHSVCTNPSDKWVQDYIKDMKENGGGTKTESSSRGPYHPSECCFTYTTYKIPR QRIMDYYETNSQCSKPGIVFITKRGHSVCTNPSDKWVQDYIKDMKENGGGTKTESSSRGPY HPSECCFTYTTYKIPRQRIMDYYETNSQCSKPGIVFITKRGHSVCTNPSDKWVQDYIKDMK ENGAPGGGSGEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS QEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSPEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLTSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK* *
SEQ ID NO:261
CCL14-CCL5-XCL1-FCBS2:臼
MKISVAAIPFFLLITIALGTKTESSSRGPYHPSECCFTYTTYKIPRQRIMDYYETNSQCS KPGIVFITKRGHSVCTNPSDKWVQDYIKDMKENGGGTKTESSSRSPYSSDTTPCCFAYIAR PLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAVVFVTRKNRQVCANPEKKWVREYINSLEMSGGGTKTESS SRVGSEVSDKRTCVSLTTQRLPVSRIKTYTITEGSLRAVIFITKRGLKVCADPQATWVRDVV RSMDRKSNTRNNMIQTKPTGTQQSTNTAVTLTGGAPGGGSGEPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ FNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSPE EMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLTSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK**
SEQ ID NO:271
CCL14-CCL5-CCL21-CXCL10-FCBS2:臼
MKISVAAIPFFLLITIALGTKTESSSRGPYHPSECCFTYTTYKIPRQRIMDYYETNSQCSK PGIVFITKRGHSVCTNPSDKWVQDYIKDMKENGGGTKTESSSRSPYSSDTTPCCFAYIARPL PRAHIKEYFYTSGKCSNPAVVFVTRKNRQVCANPEKKWVREYINSLEMSGGGTKTESSSR SDGGAQDCCLKYSQRKIPAKVVRSYRKQEPSLGCSIPAILFLPRKRSQAELCADPKELWVQQ LMQHLDKTPSPQKPAQGCRKDRGASKTGKKGKGSKGCKRTERSQTPKGPGGGTKTESSS RVPLSRTVRCTCISISNQPVNPRSLEKLEIIPASQFCPRVEIIATMKKKGEKRCLNPESKAIKNL LKAVSKERSKRSPGAPGGGSGEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSPEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLTSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSLGK**。
序列表
<110> ARBELE Limited
<120> 多特异性前趋化因子治疗蛋白（PARK）及其制备和使用方法
<130> ARTI902PCT_SEQ LISTING
<141> 2020-01-11
<150> US 62/791,677
<151> 2019-01-11
<160> 33
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<220>
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Ile Met Asp Tyr Tyr Glu Thr Asn Ser Gln Cys
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Met Lys Ile Ser Val Ala Ala Ile Pro Phe Phe Leu Leu Ile Thr Ile
1 5 10 15
Ala Leu Gly
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<223> Synthesized
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<220>
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Met Lys Ile Ser Val Ala Ala Ile Pro Phe Phe Leu Leu Ile Thr Ile
1 5 10 15
Ala Leu Gly Thr Lys Thr Glu Ser Ser Ser Arg Gly Pro Tyr His Pro
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Ser Glu Cys Cys Phe Thr Tyr Thr Thr Tyr Lys Ile Pro Arg Gln Arg
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Ile Met Asp Tyr Tyr Glu Thr Asn Ser Gln Cys
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<213> Artificial Sequence
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Met Lys Val Ser Ala Ala Ala Leu Ala Val Ile Leu Ile Ala Thr Ala
1 5 10 15
Leu Cys Ala Pro Ala Ser Ala Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro
20 25 30
Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala Arg Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys
35 40 45
Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe
50 55 60
Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp
65 70 75 80
Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser Leu Glu Met Ser
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Met Lys Val Ser Ala Ala Ala Leu Ala Val Ile Leu Ile Ala Thr Ala
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Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala
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Arg Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly
20 25 30
Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln
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Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser
50 55 60
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<223> Synthesized
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Met Lys Ile Ser Val Ala Ala Ile Pro Phe Phe Leu Leu Ile Thr Ile
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Ala Leu Gly Thr Lys Thr Glu Ser Ser Ser Arg Ser Pro Tyr Ser Ser
20 25 30
Asp Thr Thr Pro Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala Arg Pro Leu Pro Arg
35 40 45
Ala His Ile Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys Ser Asn Pro
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Ala Val Val Phe Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln Val Cys Ala Asn Pro
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Lys Ser Met Gln Val Pro Phe Ser Arg Cys Cys Phe Ser Phe Ala Glu
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Gln Glu Ile Pro Leu Arg Ala Ile Leu Cys Tyr Arg Asn Thr Ser Ser
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Ile Cys Ser Asn Glu Gly Leu Ile Phe Lys Leu Lys Arg Gly Lys Glu
35 40 45
Ala Cys Ala Leu Asp Thr Val Gly Trp Val Gln Arg His Arg Lys Met
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Leu Arg His Cys Pro Ser Lys Arg Lys
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Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe Thr
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Asn Arg Lys Ile Ser Val Gln Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile Thr
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Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Val Ala
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Arg Gln Ile Pro Gln Asn Phe Ile Ala Asp Tyr Phe Glu Thr Ser Ser
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Gln Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys Arg Ser Arg Gln
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Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Glu Trp Val Gln Lys Tyr Val Ser Asp
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Ala Ser Asn Phe Asp Cys Cys Leu Gly Tyr Thr Asp Arg Ile Leu His
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Asp Ile Asn Ala Ile Ile Phe His Thr Lys Lys Lys Leu Ser Val Cys
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Ser Asp Gly Gly Ala Gln Asp Cys Cys Leu Lys Tyr Ser Gln Arg Lys
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Ile Pro Ala Lys Val Val Arg Ser Tyr Arg Lys Gln Glu Pro Ser Leu
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Gly Cys Ser Ile Pro Ala Ile Leu Phe Leu Pro Arg Lys Arg Ser Gln
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Thr Pro Val Val Arg Lys Gly Arg Cys Ser Cys Ile Ser Thr Asn Gln
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Ser Val Thr Gly Ser Cys Tyr Cys Gly Lys Arg Ile Ser Ser Asp Ser
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Tyr His Arg Cys Leu Tyr Tyr Thr Arg Phe Gln Leu Leu Ser Trp Ser
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Val Cys Gly Gly Asn Lys Asp Pro Trp Val Gln Glu Leu Met Ser Cys
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Leu Asp Leu Lys Glu Cys Gly His Ala Tyr Ser
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Gln Arg Leu Pro Val Ser Arg Ile Lys Thr Tyr Thr Ile Thr Glu Gly
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Ser Leu Arg Ala Val Ile Phe Ile Thr Lys Arg Gly Leu Lys Val Cys
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Pro Phe Ser Arg Cys Cys Phe Ser Phe Ala Glu Gln Glu Ile Pro Leu
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Arg Ala Ile Leu Cys Tyr Arg Asn Thr Ser Ser Ile Cys Ser Asn Glu
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Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe Thr Asn Arg Lys Ile Ser
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35 40 45
Gln Ser Leu Lys Asp Leu Lys Gln Phe Ala Pro Ser Pro Ser Cys Glu
50 55 60
Lys Ile Glu Ile Ile Ala Thr Leu Lys Asn Gly Val Gln Thr Cys Leu
65 70 75 80
Asn Pro Asp Ser Ala Asp Val Lys Glu Leu Ile Lys Lys Trp Glu Lys
85 90 95
Gln Val Ser Gln Lys Lys Lys Gln Lys Asn Gly Lys Lys His Gln Lys
100 105 110
Lys Lys Val Leu Lys Val Arg Lys Ser Gln Arg Ser Arg Gln Lys Lys
115 120 125
Thr Thr Gly Gly Gly Thr Lys Thr Glu Ser Ser Ser Arg Thr Pro Val
130 135 140
Val Arg Lys Gly Arg Cys Ser Cys Ile Ser Thr Asn Gln Gly Thr Ile
145 150 155 160
His Leu Gln Ser Leu Lys Asp Leu Lys Gln Phe Ala Pro Ser Pro Ser
165 170 175
Cys Glu Lys Ile Glu Ile Ile Ala Thr Leu Lys Asn Gly Val Gln Thr
180 185 190
Cys Leu Asn Pro Asp Ser Ala Asp Val Lys Glu Leu Ile Lys Lys Trp
195 200 205
Glu Lys Gln Val Ser Gln Lys Lys Lys Gln Lys Asn Gly Lys Lys His
210 215 220
Gln Lys Lys Lys Val Leu Lys Val Arg Lys Ser Gln Arg Ser Arg Gln
225 230 235 240
Lys Lys Thr Thr Gly Gly Gly Thr Lys Thr Glu Ser Ser Ser Arg Val
245 250 255
Pro Leu Ser Arg Thr Val Arg Cys Thr Cys Ile Ser Ile Ser Asn Gln
260 265 270
Pro Val Asn Pro Arg Ser Leu Glu Lys Leu Glu Ile Ile Pro Ala Ser
275 280 285
Gln Phe Cys Pro Arg Val Glu Ile Ile Ala Thr Met Lys Lys Lys Gly
290 295 300
Glu Lys Arg Cys Leu Asn Pro Glu Ser Lys Ala Ile Lys Asn Leu Leu
305 310 315 320
Lys Ala Val Ser Lys Glu Arg Ser Lys Arg Ser Pro Gly Gly Gly Thr
325 330 335
Lys Thr Glu Ser Ser Ser Arg Val Pro Leu Ser Arg Thr Val Arg Cys
340 345 350
Thr Cys Ile Ser Ile Ser Asn Gln Pro Val Asn Pro Arg Ser Leu Glu
355 360 365
Lys Leu Glu Ile Ile Pro Ala Ser Gln Phe Cys Pro Arg Val Glu Ile
370 375 380
Ile Ala Thr Met Lys Lys Lys Gly Glu Lys Arg Cys Leu Asn Pro Glu
385 390 395 400
Ser Lys Ala Ile Lys Asn Leu Leu Lys Ala Val Ser Lys Glu Arg Ser
405 410 415
Lys Arg Ser Pro Gly Ala Pro Gly Gly Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys
420 425 430
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
435 440 445
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
450 455 460
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp
465 470 475 480
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
485 490 495
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val
500 505 510
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
515 520 525
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys
530 535 540
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr
545 550 555 560
Leu Pro Pro Ser Pro Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser
565 570 575
Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
580 585 590
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
595 600 605
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys
610 615 620
Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
625 630 635 640
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
645 650 655
Lys Pro Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly
660 665 670
Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala
675 680 685
Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala
690 695 700
Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly
705 710 715 720
Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Thr Met Thr Leu
725 730 735
Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser
740 745 750
Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Val Ser Gly Phe Val
755 760 765
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
770 775 780
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val
785 790 795 800
Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala
805 810 815
Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ile Ile Lys Gln
820 825 830
Lys Asn Cys Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys
835 840 845
Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg
850 855 860
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
865 870 875 880
Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser
885 890 895
Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
900 905 910

Claims (33)

1.一种蛋白，其包括：
前趋化因子部分，其包括与趋化因子部分融合的前肽部分，其中所述趋化因子部分包括N端和C端，并且其中所述前肽部分与所述趋化因子部分的N端或C端融合；以及
与所述前趋化因子部分连接的靶向部分，其中，所述靶向部分对肿瘤、纤维化或阿尔茨海默氏病相关抗原或受体具有结合特异性。
2.根据权利要求1所述的蛋白，其中，所述前趋化因子部分还包括在一端与所述前肽部分融合和在相对端与趋化因子部分融合的前导序列。
3.根据权利要求1所述的蛋白，其中，所述蛋白含有单一前趋化因子部分。
4.根据权利要求1所述的蛋白，其中，所述蛋白包括至少两个前趋化因子部分。
5.根据权利要求1所述的蛋白，其中，至少两个前趋化因子部分通过间隔区串联连接。
6.根据权利要求5所述的蛋白，其中，所述间隔区包括至少一个甘氨酸残基。
7.根据权利要求5所述的蛋白，其中，所述间隔区包括至少两个甘氨酸残基。
8.根据权利要求1所述的蛋白，其中，进一步包括融合在所述趋化因子部分的所述C端的氨基酸序列，其中，所述氨基酸序列包括fractalkine的粘蛋白区。
9.根据权利要求1所述的蛋白，其中，所述趋化因子部分包括与CC、CXC、CX3C或C家族趋化因子具有至少90％相似性的趋化因子氨基酸序列。
10.根据权利要求9所述的蛋白，其中，所述趋化因子部分包括与CCL1、CCL3、CCL5、CCL7、CCL14、CCL16、CCL19、CCL20、CCL21、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL12、CXCL16、XCL1或CX3CL1具有至少90％相似性的趋化因子氨基酸序列。
11.根据权利要求1所述的蛋白，其中，所述趋化因子部分包括趋化因子氨基酸序列，所述趋化因子氨基酸序列与能够募集具有抗肿瘤、抗纤维化或抗阿尔茨海默氏病活性的细胞的趋化因子具有至少90％的相似性。
12.根据权利要求1所述的蛋白，其中，所述靶向部分包括抗体、单链Fv(scFv)结构域、单一可变结构域或天然配体结构域，其对肿瘤、纤维化或阿尔茨海默氏病相关抗原或受体具有结合特异性。
13.根据权利要求1所述的蛋白，其中，所述靶向部分对肿瘤细胞、肿瘤基质抗原、肌成纤维细胞抗原、淀粉样蛋白或τ蛋白具有结合亲和力。
14.根据权利要求1所述的蛋白，进一步包括共价连接到所述蛋白的至少一个末端的蛋白标签。
15.根据权利要求14所述的蛋白，其中，所述蛋白标签包括与8-10个组氨酸、streptag-2或免疫球蛋白Fc具有至少90％相似性的氨基酸序列。
16.根据权利要求1所述的蛋白，进一步包括免疫球蛋白(IgG)Fc结构域。
17.根据权利要求16所述的蛋白，其中，所述靶向结构域包括scFv结构域。
18.根据权利要求16所述的蛋白，其包括一个scFv结构域和一个前趋化因子部分。
19.根据权利要求16所述的蛋白，其包括至少两个scFv结构域。
20.根据权利要求16所述的蛋白，其包括至少两个前趋化因子部分。
21.根据权利要求16所述的蛋白，其中所述前趋化因子部分和所述靶向部分都与所述IgG Fc结构域融合。
22.根据权利要求16所述的蛋白，其中，所述靶向部分融合到所述前趋化因子部分的一端，并且所述IgG Fc融合到所述前趋化因子部分的所述相对端。
23.根据权利要求16所述的蛋白，其中，所述IgG Fc结构域包括两个免疫球蛋白CH2-CH3结构域。
24.根据权利要求23所述的蛋白，其中，所述免疫球蛋白CH2-CH3结构域中的一个与所述靶向部分融合，而另一个所述免疫球蛋白CH2-CH3结构域与所述前趋化因子部分融合。
25.根据权利要求1所述的蛋白，其中，所述蛋白是抗体。
26.编码根据权利要求1所述蛋白的分离的核酸。
27.一种表达载体，其包括根据权利要求30所述的分离的核酸。
28.一种宿主细胞，其包括根据权利要求30所述的分离的核酸或根据权利要求31所述的表达载体。
29.一种药物组合物，其包括根据权利要求1所述的蛋白和药学上可接受的载体。
30.根据权利要求29所述的药物组合物，进一步包括放射性同位素、放射性核素、毒素、治疗剂、化疗药物或其组合。
31.一种治疗患有癌症、纤维化或阿尔茨海默氏病的受试对象的方法，其包括对所述受试对象施用有效量的根据权利要求1所述的蛋白。
32.根据权利要求31所述的方法，其中，所述癌症能够表达一种或多种肿瘤相关蛋白酶，其中所述肿瘤相关蛋白酶能够从所述蛋白切割所述前趋化因子结构域并释放活性趋化因子，并且其中所述活性趋化因子能够募集免疫细胞以在肿瘤、纤维化或阿尔茨海默氏病病变内的免疫或其它细胞类型中刺激治疗活性。
33.根据权利要求31所述的方法，进一步包括共同施用有效量的治疗剂，其中所述治疗剂包括抗体、化疗剂、酶、抗雌激素剂、受体酪氨酸抑制剂、抗纤维化药物、抗阿尔茨海默氏病药物或其组合。
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