SI21373A - Metoda za moduliranje biološke aktivnosti proteinov - Google Patents

Abstract

Izum se nanaša na novo metodo za moduliranje biološke aktivnosti faktorja tumorske nekroze alfa (TNF-alfa), njegovih analogov in drugih proteinov, ki omogoča spremembo specifičnosti biološke aktivnosti teh proteinov na tak način, da se modulira interakcije proteina z matriksom ali s komponentami, ki se nahajajo na površini celic.ŕ

Description

Metoda za moduliranje biološke aktivnosti proteinov

Področje tehnike

Predloženi izum se nanaša na novo metodo za moduliranje biološke aktivnosti faktorja tumorske nekroze alfa (TNF-alfa), njegovih analogov in drugih proteinov. Ta metoda omogoča, da se spremeni specifičnost biološke aktivnosti proteina, kar lahko uporabimo v medicini in v veterini z namenom moduliranja sistemske toksičnosti in povečevanja ciljane toksičnosti npr. za tumorske celice.

Humani TNF-alfa je neglikoziliran protein, ki ga uvrščamo v družino citokinov. Primarno ga proizvajajo monociti in makrofagi kot odgovor na stimulacijo z endotoksinom ali drugimi stimuli. Topni TNF-alfa lahko proizvajajo tudi druge celice. Je kijučen element v kaskadi dejavnikov, ki so udeleženi v celičnem imunskem odzivu in je vpleten v patogenezo različnih akutnih infekcijskih ter kroničnih inflamatornih bolezni. V splošnem ima veliko pleiotropnost delovanja tako v zdravem kot v bolnem organizmu.

Ena najpomembnejših funkcij je njegova protitumorska aktivnost, ki se pa trenutno v medicini uporablja le za lokalno zdravljenje. To poteka s kombinacijo TNFalfa in kemoterapevtika ob uporabi tehnike izolirane perfuzije okončin. Poskusi sistemskega zdravljenja s TNF-alfa so bili do sedaj zaradi visoke toksičnosti in prevelikih stranskih učinkov neuspešni.

Bistvo predloženega izuma

Bistvo predloženega izuma je nova metoda za moduliranje biološke aktivnosti TNF-alfa, njegovih analogov in drugih proteinov, ki omogoča spremembo specifičnosti biološke aktivnosti teh proteinov na tak način, da se modulira interakcije proteina z matriksom ali s komponentami, ki se nahajajo na površini celic. Tako moduliranje omogočajo spremembe v strukturi proteina, ki se nanašajo na regijo (Arg/Lys)XYZ(Arg/Lys). Sekvenco ΧΥΖ lahko sestavljajo predvsem kombinacije majhnih, fleksibilnih, polarnih ali nabitih aminokislin, npr.: Ser, Gfy, Ala, Thr, His, Lys, Arg, Gin, Asn in druge. Z odstranitvijo navedene regije rz proteinske strukture ali z vključevanjem te regije v proteinske strukture lahko moduliramo interakcije z matriksom ali s komponentami, ki se vključujejo na površini celic. S tem pa lahko moduliramo biološko aktivnost TNF-alfa, njegovih analogov in/ali drugih proteinov.

Stanje tehnike

TNF-alfa so odkrili leta 1975 v serumu miši, ki so bife inficirane z mikobakterijo Calmett-Guerin (BCG) in tretirane z endotoksinom (Carsvvell EA et al Proč Natl Acad Sci U S A 1975 Sep;72(9):3666-70).

Zaradi izrazitih protitumorskih učinkov je TNF-alfa izredno zanimiv kot potencialno zdravilo proti raku. Vendar je zaradi visoke toksičnosti in posledično hudih stranskih učinkov pri sistemski terapiji uporaben le za lokalno terapijo (Taguchi in Sohmura Biotherapy 1991 ;3(2):177-86; Lejeune et al Curr Opin Immunol 1998 Oct;10(5):573-80: Eggermont et al., Ann Surg. 1996 Dec;224(6):756-64; discussion 764-5.; Eggermont et ak, J Ciin Oncol. 1996 Oct; 14(10):2653-65).

Idealna rešitev bi bilo odkritje oziroma kreiranje TNF-alfa analogov z ohranjeno ali celo povišano citotoksično aktivnostjo, ki pa bi bili specifično spremenjeni tako, da bi povzročali manj toksičnih učinkov.

Spremembe jn vitro citotoksičnostl kot posledice spreminjanja aminokislinskega zaporedja na N-koncu molekule TNF-alfa so opisane v Nakamura S et al Agric. Biol. Chem. 55: 53-57, 1991; WO8602381, 1986; Creasey A.A et al. Cancer Res. 47: 145-149, 1987; Carlino J.A et al. J. Biol.Chem 262:958-961, 1987; Shikama H. et al., J Interferon Cytokine Res. 1995 Aug;15(8):677-84.; Kuroda K. et al., Int J Cancer 1995 Sep 27;63(1 ):152-7; Atarashi Y. Et al., Hepatology. 1998 Jul;28(1 ):57-67,: Nakamura S et ai Int. J. Cancer 48,744-748, 1991. Predvsem so preučevali vpliv delecije N-terminalnih aminokislin oz. njihove zamenjave z bazičnimi in/ali hidrofobnimi aminokislinami na spremembe v in vitro in in vivo citotoksičnostl, pri čemer je podatkov o in vivo citotoksičnostl malo.

Spremembe citotoksičnostl kot posledice spreminjanja aminokislinskega zaporedja na C- koncu molekule TNF-alfa so opisane v Masegi et al., Jpn J Cancer

Res. 1993 Apr;84(4):451-4. in Guo D. Et al., Biochem Biophys Res Commun. 1995 Feb 27;207(3):927-32.

Uvajanje mutacij, ki povzročajo spremembo v specifičnosti vezave na receptorje za TNF-alfa, so opisali v Barbara JA et al, EMBO J. 1994 Feb 15; 13(4):843-50, EP0486908, 1992; van Ostade X. et al Nature. 1993 Jan 21 ;361(6409):266-9, Atarashi V et al, Hepatology. 1998 Jul;28(1 ):57-67

Pri mišjem TNF-alfa so dokazali vpliv mutacij v konici trimerne molekule na spremembo specifičnosti vezave na določene oligosaharide (Lucas R. et ak, Science. 1994 Feb 11 ;263(5148):814-7; US5891679, 1999). Trojna alaninska mutanta v tem delu naj bi imela zmanjšano sistemsko toksičnost (Lucas R. et al., Infect Immun. 1997 Jun;65(6):2006-10). Pri humanem TNF-alfa so z dodatkom aminokislinskega zaporedja RGD v N-terminalnem delu molekule dobili mutein z ohranjeno protitumorsko aktivnostjo, vendar z manjšim vplivom na nastanek metastaz (Miyata k. Et al., J Interferon Cytokine Res. 1995 Feb;15(2):161-9; US5519119, 1996). Novakovič S. et al., Cytokine. 1997 Aug;9(8):597-604 pa poročajo o analogu humanega TNF-alfa s povišano citotoksično aktivnostjo in vitro ter z izboljšanimi lastnostmi za terapijo na mišjih modelih z implantiranimr tumorji.

Zmanjšano toksičnost opisujejo pri analogih z bazičnimi aminokislinami na Nterminalnem delu molekule (Soma G. Et al., J Biol Response Mod. 1988 Dec;7(6):587-95; Nakamoto T et al. Anticancer Res 2000 Nov-Dec;20(6A):4087-96; de Wilt JH et al, Anticancer Res 2000 Sep- Oct;20(5B):3491-6).

Čeprav so bile opisane številne mutacije aminokislinskega zaporedja TNFalfa, pa je resnično uspešnih muteinov oziroma analogov pravzaprav malo.

Interakcija TNF-alfa s fibronektinom in lamininom je opisana v Alon R, Cahalon L. Et al., J. Immunol. 152:1304-1313,1994 in s heparinom v Lantz M, etal J. Ciin. Invest. 88:2026-2031,1991.

Znano je, da s heparinom interagirajo številni proteini. Za vezavo na heparin so pri teh proteinih odgovorne predvsem bazične aminokisline (Fromm JR et al Arch Biochem Biophys 1995 Nov 10;323(2):279-87), Cardin AD et al Arteriosclerosis 1989 Jan-Feb;9(1 ):21-32, Rastegar-Lari G et al. Biochemistry. 2002 May 28;41(21 ):666878; Soncin F, et al. J Biol Chem. 1997 Apr 11;272(15):9818-24); Zhao M et al J Biol Chem 1998 Nov 20;273(47):31153-9; Chen VC et al J Biol Chem. 2001 Jan

12;276(2): 1276-84; VVhinna HC et al J Biol Chem. 1991 May 5;266(13):8129-35). V splošnem se vezavna mesta za heparin pri različnih proteinih precej razlikujejo in ni možno predvideti vezavnega mesta.

Ne v patentni ne v strokovni lineraturi ne zasledimo podatkov o vezavnem mestu za heparin na TNF-alfa.

Opis izuma

V smislu izuma smo presenetljivo ugotovili, da je aminokislinska zaporedje s strukturo (Arg/Lys)XYZ(Arg/Lys) ključno za interakcijo TNF-alfa, TNF-alfa analogov in drugih proteinov, ki to zaporedje vsebujejo, z matriksom ali s komponentami, ki se nahajajo na površini celic. Arg/Lys pomeni, da Arg lahko zamenja Lys ali obratno pri vseh možnih kombinacijah. Sekvenco ΧΥΖ pa sestavljajo predvsem kombinacije majhnih, fleksibilnih, polarnih ali nabitih aminokislin, izbranih iz skupine, ki zajema vsaj: Ser, Giy, Ala, Thr, His, Lys, Arg, Gin, Asn. Primer takega zaporedja je ArgSerSerSerArg. Z odstranitvijo navedenega zaporedja ali z njegovim vključevanjem ali z vključevanjem več takih zaporedij v različnih kombinacijah na različna mesta v proteinsko strukturo lahko moduliramo interakcije proteina z matriksom ali komponentami, ki se nahajajo na celični površini. S tem pa lahko moduliramo biološko aktivnost TNF-alfa, TNF-alfa analogov in drugih proteinov, ki to zaporedje vsebujejo. Ta ugotovitev je bistvo metode za moduliranje biološke aktivnosti, ki je predmet izuma.

Aminokislinska zaporedja s strukturo (Arg/Lys)XYZ(Arg/Lys), ki se nanašajo na predmet izuma, se iahko nahajajo na različnih mestih v proteinski strukturi. Ta so izbrana iz skupine, ki zajema: fleksibilne terminuse (N- in C-), zunanjost proteinskih struktur, popolnoma fleksibilne aminokislinske verige in delno fleksibilne aminokislinske verige.

Matriks ali komponente na površini celice, ki se nanašajo na predloženi izum, so izbrani iz skupine, ki zajema proteoglikane, med drugim glikozaminoglikane, kot sta; heparin in heparan sulfate, kot tudi druge glikozaminoglikane, ki so prisotni na površini mnogih celic (npr. endotelijskih, tumorskih, jetrnih itd.) in komponente ekstracelulamega matriksa, kot sta npr. laminin in fibronektin.

Bistveno je tudi, da z večjim številom dodanih ali vključenih aminokislinskih zaporedij s strukturo (Arg/Lys)XYZ(Arg/Lys) lahko povečamo jakost vezave na matriks oz. komponente celične stene.

Z izrazom ‘TNF-aifa’ je mišljen poiipeptid TNF-alfa z naravnim humanim aminokislinskim zaporedjem.

Z izrazom ‘TNF-alfa analog' je mišljen poiipeptid z določenimi mutacijami, delecijami oz. na splošno manjšimi spremembami v naravnem aminokislinskem zaporedju humanega TNF-alfa.

Z izrazom 'LK-805' je mišljen TNF-alfa analog, ki ima uvedeno mutacijo Glu107Lys.

Z izrazom ‘άΝδ-ίΚ-δΟδ’ je mišljen LK-805, ki ima delecijo N-terminalne peptidne sekvence v dolžini šestih aminokislin, tj. sekvence ValArgSerSerSerArg.

Z izrazom ‘dN6-LK-802’ je mišljen TNF-alfa analog, ki ima delecijo Nterminalne peptidne sekvence v dolžini šestih aminokislin - ValArgSerSerSerArg,, poleg tega ima uvedeni dve mutaciji: Ser95Cys in Gly148Cys.

Z izrazom ‘dN6-LK-805/LK-802 ‘ je mišljen TNF alfa analog, ki ima delecijo Nterminalne peptidne sekvence v dolžini šestih aminokislin - ValArgSerSerSerArg,, poleg tega ima uvedene tri mutacije: Ser95Cys, Gly148Cys in Glu107Lys.

Metoda za moduliranje biološke aktivnosti, ki je predmet izuma, predstavlja nov način modulacije targetinga na tumorske celice in hkrati zmanjšanja sistemske toksičnosti. Glavne ovire za sistemsko aplikacijo TNF-alfa, ki so znane iz literature,, so visoka sistemska toksičnost, kratek razpolovni čas v plazmi, naliven TNF-aifa ne kaže sposobnosti targetinga na tumor in rezistenca nekaterih vrst tumorjev. Metoda za moduliranje biološke aktivnosti, ki je predmet izuma, pa omogoča modificiranje biološke aktivnosti TNF-alfa, TNF-alfa analogov in drugih proteinov na ta način, da se zgoraj naštete ovire vsaj delno zmanjšajo.

Odstranitev aminokislinskega zaporedja s strukturo (Arg/Lys)XYZ(Arg/Lys) v primeru TNF-alfa in njegovih analogov torej vodi do spremenjene specifičnosti biološke aktivnosti teh proteinov. Na primer odstranitev sekvence ValArgSerSerSerArg iz TNF-alfa (dN6-TNF-alfa) lahko vodi do zmanjšanje interakcije dN6-TNF-alfa s komponentami ekstracelularnega matriksa, kar ima za posledico tudi znižano lokalno vezavo leukocitov, in lahko pomeni, da imajo analogi z odstranjeno sekvenco ValArgSerSerSerArg zmanjšan proinflamatorni potencial in so zato bolj varni za terapijo. Po drugi strani je možna tudi drugačna ali dopolnjena interpretacija za spremenjeno sistemsko toksičnost teh analogov zaradi spremenjene interakcije na nekaterih ključnih celicah aii organih, točno mesto pa zaenkrat še ni znano. Potencialno je izboljšana tudi razpolovna doba v plazmi zaradi manjše afinitete do alfa2 makroglobuiina, ki je eden od pomembnejših naravnih lovilcev in odstranjevalcev biološko aktivnega TNF-alfa iz krvnega obtoka.

Odstranitev sekvence ValArgSerSerSerArg ima torej raziične fiziološke posledice, sumarno pa pomeni, da so analogi z dodatno deiecijo dN6 protitumorsko bolj aktivni od nativnega TNF-alfa in zato primernejši za terapijo raka.

Analogom TNF-alfa, ki že imajo uvedeno eno ali več mutacij za izboljšanje terapevtskega indeksa lahko dodatno moduliramo biološko aktivnost z deiecijo ali dodatkom navedene sekvence, ki jo prepoznavamo kot ključno za interakcijo z (mobiliziranim heparinom ali drugimi glikozaminoglikani. Navedeni analogi imajo potencialno uporabnost pri razvoju novih pristopov in farmacevtskih formulacij pri zdravljenju raka.

Primer takega analoga je LK-805, pri katerem je že bila izboljšana terapevtska vrednost. Z odstranitvijo regije ValArgSerSerSerArg iz N-terminusa tega analoga pridobimo dN6-LK-805 in tako še nadalje modificiramo biološko aktivnost.

Primer je tudi analog LK802, pri katerem mutaciji omogočata spontano tvorbo disulfidnih vezi med sosednjima podenotama. Z odstranitvijo ValArgSerSerSerArg iz N-terminusa tega analoga nastane TNF-alfa analog dN6-LK-802, ki je tudi predmet izuma. Tako nastane nedisociabilna TNF trimera, ki ima tudi bistveno izboljšano termično stabilnost in je zato primerna za pripravo bolj stabilnih farmacevtskih formulacij.

Primer je tudi analog dN6-LK805 /LK802, ki je tudi predmet izuma in kjer kombiniramo tri lastnosti: zmanjšano interakcijo s heparinom (delecija sekvence ValArgSerSerSerArg); zmanjšano sistemsko toksičnost zaradi mutacije Glu107Lys; povečano termostabilnost zaradi mutacij Ser95Cys in Gly148Cys.

Opis slik

Slika 1: Kromatografsko obnašanje različnih proteinov TNF-alfa in TNF-alfa analogov na afinitetnem nosifcu Heparin-Sepharose 6 fast flow (Amersham Bioscience).

Kromatogram prikazuje spreminjanje absorbance pri 280nm (_) in deleža pufra P2 (____) v odvisnosti od časa.

Pik A: ‘flow through' frakcija - proteini, ki se ne vežejo na kolono (dN6-TNFalfa in dN6-LK-805)

Pik B: elucija TNF-alfa in LK-805.

Slika 2: Izoelektrično fokusiranje ekvimolarne zmesi LK805 in dN6-LK805 na poliakrilamidnem gelu v področju pH vrednosti 3,5 do 9,0.

Legenda;

1. standard za izoelektrično fokusiranje (Bio-Rad).

2. dN6-LK-805

3. LK-805

4. ekvimolarna mešanica dN6-LK-805 in LK-805 v času 0.

5. ekvimolarna mešanica dN6LK-805 in LK-805 po 4 dneh pri temperaturi +4 °C.

Slika 3: Kromatografska ločba ekvimolarne zmesi LK-805 in dN6-LK-805 po 4dnevnem stanju pri temperaturi +4 °C, na afinitetni koloni Heparin-Sepharose 6 fast flow (Amersham Bioscience).

Kromatogram prikazuje spreminjanje absorbance pri 280nm (_) in deleža pufra

P2 (____) v odvisnosti od časa.

Pik A: elucija dN6-LK-805

Pik B; elucija mešanih trimerov in LK-805

Slika 4: Analiza frakcij pika B s kromatograma na Sliki 3 z izoelektričnim fokusiranjem na poliakrilamidnem gelu v področju pH vrednosti 3,5 do 9,0..

Legenda:

1: Standard za izoelektrično fokusiranje (Bio-Rad).

2: Ekvimolarna zmes LK-805 in dN6-LK-805, po 4-dnevnem stanju pri temperaturi +4 °C (pred separacijo na afinitetni koloni Heparin-Sepharose).

3-7: Zaporedne frakcije pika B s kromatograma na Sliki 3.

Izum pojasnjujejo, vendar z ničemer ne omejujejo naslednji izvedbeni primeri:

Primeri

Primer 1: Priprava TNF analogov

Osnova za pripravo vseh opisanih analogov je bil komercialno dosegljiv sintetski gen za TNF-alfa s kodoni za visoko ekspresijo v bakteriji Escherichia coli (E. cofi). Sintetski gen za TNF-aJfa je bil iz nosilnega plazmida BBG4 (British Biotechnofogy) izrezan z ustreznimi encimi in usmerjeno subkloniran v izbrane ekspresijske plazmide. TNF-alfa in njegovi analogi s kompletnim N-terminusom so bili eksprimirani s plazmidom pCYTEXP1 (Medac), ki je bil z delecijo dela represorskega gena c!857 spremenjen iz termoinducibiinega plazmida v konstitutivni plazmid pCydcl. To je omogočilo bistveno višjo akumulacijo nemodificiranega TNFalfa kot tudi vseh opisanih analogov. Optimalna akumulacija (10-25 %) je bila dosežena pri gojenju okoli 30 °C v znanih sevih E. coli kot so npr. NM522, DHSalfa, BL21 itd. Po razbijanju celic v homogeni2atorju EmulsiFlex C-5 (Avestin), je biia glavnina sproščenih nukleinskih kislin oborjena z dodatkom polietilenimina (PEI) v končni koncentraciji 0,1 %. Jz bistrega supernatanta pa so bili proteini izsoljeni z dodatkom trdnega amonijevega sulfata (AS) do končne koncentracije 65 % nasičenja. Ob dodatkih AS je bil sproti korigiran padec pH, tako da je bil končni pH vedno med 6.5 in 7.5. V amonsulfatni oborini je vsebnost TNF-alfa ali njegovih analogov še narasla in je bila od 35 - 50 % od celotnih proteinov. Čisti proteini so bili pridobljeni z raztapljanjem AS oborine v ustreznih pufrih, čemur je sledila kromatografska izolacija. Čisti proteini so bili raztopljeni v 30 - 50 mM fosfatnem pufru pH okoli 7,3 z dodatkom 0,5 M NaCI in shranjeni stabilno pri - 80 °C.

dN6-TNF-alfa in TNF-alfa analogi z delecijo dN6 na N-terminusu (dN6-LK-802, dN6-LK-805, dN6-LK-802/LK-805) so bili eksprimirani kot fuzijski proteini z oligohistidinskim podaljškom na N-koncu s komercialnim plazmidom TAGZyme pGE2 (Qiagen) v sevu E. cofi BL21 (DE3). To je omogočilo izolacijo čistih proteinov z uporabo kelatne kovinske afinitetne kromatografije po protokolu proizvajalca (Qiagen). Afinitetni podaljšek je brl odstranjen z encimom DAPazo, ustreznost cepitve pa je bila dokazana z analizo N-terminalne sekvence.

Mutacije so bile uvedene na plazmidu pCYTEXP1 z uporabo oligonukleotidne usmerjene mutageneze po Kunklu (Kunkel et al. 1987, Methods in Enzymology, Recombinant DNA, Part, Eds. R Wu in L. Grossman; Academic Press Inc., 367-382).

Primer 2: Kromatografija na Heparin-Sepharose - primerjava TNF-alfa analogov dN6LK-805 in LK-805

Afiniteto celih in dN6-proteinov do Heparin-Sepharose smo testirali na koloni HR 5/5 (Amersham Pharmacia Biotech, volumen kolone: 0,8 mL), napolnjeni s kromatografskim nosilcem Heparin-Sepharose 6 Fast Flovv (Amersham Pharmacia Biotech). Raztopine proteinov smo dializirali proti pufru P1 in jih nanesli na kolono, ekvilibrirano z istim pufrom. Nanos proteinov je bil -100 μρ. Kolono smo 10 minut spirati s pufrom P1, nato smo eluiraii vezane proteine z 20 minutnim linearnim gradientom od 0 do 500 mM NaCI. Pred vsakim naslednjim nanosom smo kolono 5 minut spirali s pufrom P2 in jo ponovno ekvilibrirali s pufrom P1. Pretok je bil 1 mL/min, celoten kromatografski postopek je bil izveden pri sobni temperaturi.

Pufri:

P1:50 mM TRIS/HCI, pH 7,4

P2: 50 mM TRIS/HCi, pH 7,4, 1 M NaCI

TNF-alfa in LK-805 se vežeta na Heparin-Sepharose in se eluirata s 150 mM NaCI. dN6-TNF-alfa in dN6-LK-805 pa se ne vežeta na kolono. (Slika 1)

Kromatogram, ki ga dobimo, je kompozitni kromatogram, v katerem pik A prikazuje obnašanje proteinov TNF-alfa, ki imajo N-konec skrajšan za 6 aminokislin in torej ne vsebujejo aminokislinskega zaporedja ValArgSerSerSerArg. Ti proteini se ne vežejo na afinitetno kolono s heparinom in se pojavljajo v »flovv through« frakcijah. Pik B pa prikazuje kromatografsko obnašanje proteinov TNF-alfa, ki imajo neokrnjen N-konec in se zaradi aminokislinskega zaporedja ArgSerSerSerArg vežejo na afinitetno kolono s heparinom. N-terminalna sekvenca ValArgSerSerSerArg je torej ključna za vezavo TNF-alfa afi TNF-alfa analogov (če imajo neokrnjene N-konce) na imobiliziran heparin (kot je npr. na koloni Heparin-Sepharose).

-1010

Primer 3: Priprava hibridnih (mešanih) trimerov in ločevanje na Heparin-Sepharose

S tem primerom želimo pokazati, da za vezavo na Heparin-Sepharose zadošča že ena sama sekvenca ValArgSerSerSerArg. Upoštevati namreč moramo, da je biološko aktiven TNF-alfa kompakten trimer, ki ima tri ekvivalentne Nterminalne sekvence ValArgSerSerSerArg.

Z inkubacijo ekvimolarnih količin dveh izhodnih čistih proteinov LK-805 (ima tri ekvivalentne sekvence ValArgSerSerSerArg, kar pomeni, da ima v trimerni molekuli 3 neokrnjene N-konce.) in dN6-LK-805 (vse tri N-terminalne sekvence ValArgSerSerSerArg so odstranjene, kar pomeni, da ima zaradi skrajšanega Nkonca in s tem odsotnosti 2 argininskih ostankov v vsaki podenoti nižjo izoelektrično točko) po principu, ki je že bil opisan (Menart V et al. 1996, Eur. Cytokine Network,Vol 7, No 2, p. 172) nastane ravnotežna zmes trimerov, kjer se poleg izhodnih zvrsti nahajata še dve novi, hibridni (mešani) obliki trimerov.

Priprava hibridnih (mešanih) trimerov:

Pomešali smo 300 pg LK-805 (600 pL, C = 0,5 mg/mL) in 300 pg dN6-LK-805 (600 pL, C = 0,5 mg/mL). Oba proteina sta bila raztopljena v pufru PBS z 0,5 M NaCI. Mešanica je stala 4 dni pri temperaturi 4 °C. Nastanek mešanih trimerov smo dokazali z izoelektričnim fokusiranjem. Po končanem fokusiranju smo proteinske lise obarvali z barvilom Coomassie R250 (Slika 2).

Iz slike 2 je razvidno, da pride pri stanju na temperaturi +4 °C v ekvimolami mešanici obeh analogov TNF-alfa do izmenjave podenot in nastanka mešanih trimer z vmesnima pl vrednostima. Po določenem času so torej v zmesi prisotne trimerne molekule TNF-alfa, katerih podenote se razlikujejo v številu neokrnjenih N-koncev. Kromatografija na Heparin-Sepharose:

Vzorec (raztopino mešanih trimerov) smo pred nanosom na kolono razsolili na koloni PD-10 (Amersham Pharmacia Biotech). 1,2 mL raztopine smo redčili na 2,5 mL s pufrom P3 (10 mM TRIS/HCI, pH 8,0), nanesli na kolono PD-10 in ulovili 3,5 mL razsoljenega eluata, končni pufer je bil pufer P3, koncentracija proteinov pa 0,17 mg/mL.

-1111

Kolono KR 5/5 (Amersham Pharmacia Biotech, volumen kolone: 0,8 mL) (kromatografski nosilec: Heparin-Sepharose 6 Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech)) smo ekvilibrirali s pufrom P3. Na kolono smo nanesnli - 100 pg proteinov (590 pL, C = 0,17 mg/mL). Vezane proteine smo eluirali z gradientom NaCI, dolžina linearnega gradienta od 0 do 0,5 M NaCI je bila 20 volumnov kolone. Pretok je bil 0,5 mL/min, zbirali smo frakcije po 0,5 mL. Celoten kromatografski postopek je bif izveden pri sobni temperaturi. Pri kromatografiji zmesi mešanih trimerov smo dobili dva pika (Slika 3).

Pik A na Sliki 3 predstavlja nevezano frakcijo in vsebuje samo dN6-LK-805, ki se zaradi odsotnosti aminokislinskega zaporedja ValArgSerSerSerArg (na vseh 3 N-. koncih) ne veže na afinitetno kolono.

V piku B, ki se je eluiral v območju od 100 do 150 mM NaCI, pa so prisotne tri oblike trimerov, ki vsebujejo en, dva ali tri neokrnjene N-konce. Posamezne frakcije pika B so bile analizirane z izoelektričnim fokusiranjem (Slika 4). Po končanem fokusiranju so bile proteinske lise obarvane z barvilom Coomassie R250. Analiza posameznih frakcij jasno kaže, da se pri afinitetni kromatografiji na HeparinSepharose v piku B najprej eluirajo trimeri z nižjimi pl vrednostmi, nato pa se povečuje delež trimerov z višjimi pi vrednostmi. Kasnejše frakcije vsebujejo torej vedno več trimerov z neokrnjenimi N-konci.

Teoretično je razmerje vseh možnih trimerov 1:2:2:1. Razmerje površin pikov A in B na kromatogramu je 1 : 5,1 in je zelo blizu teoretičnemu razmerju, kar pomeni, da je v nevezani frakciji samo trimer, sestavljen iz dN6 podenot, vsi drugi tipi trimerov (z enim, dvema ali tremi neokrnjenimi N-konci) pa se nahajajo v piku B. Za vezavo na Heparin-Sepharose je torej dovolj eno samo zaporedje ArgSerSerSerArg, več takih zaporedij na isti molekuli pa povzroči močnejšo vezavo, kar je razvidno tudi iz analize kromatografskih frakcij na Sliki 4.

Primer 4: Določanje specifične aktivnosti in vitro

Metoda za pritrjene celične linije

Specifično citotoksično aktivnost smo merili na celicah L929 (mišji fibroblasti) po nekoliko spremenjeni metodi Flicka and Gifforda (Flick, D.A., Glfford, G.E. 1984

-1212

68: 167-175). V vsako jamico na mikrotitrskih ploščah smo nasadili 2x10⁴ celic v 100 μΙ gojitvenega medija. Plošče s celicami smo inkubirali 24 ur (37 °C, 5 % CO₂). Po inkubaciji smo jamice dodali serijske redčitve standarda TNF-alfa (NIBSC TNF-alfa standard 87/650) in derivatov TNF ter 2 gg/ml actinomycina D. Plošče smo ponovno inkubirali 18-20 ur na 37 °C, v atmosferi s 5 % CO₂. Sledilo je fiksiranje (2,5 % glutaraldehid) in barvanje (0,5 % kristal vijolično barvilo v 20 % metanolu) viabilnih celic. Plošče smo nato posušili in v vsako jamico dodali 100μΙ 1 % SDS. Po 10 minutnem stresanju na stresalniku pri sobni temperaturi smo spektrofotometrično določili optično gostoto pri 570 nm. iz izmerjene optične gostote smo dobili naravni logaritem celične koncentracije. Specifično citotoksično aktivnost TNF-alfa in njegovih analogov smo določili s primerjavo redčitve standarda in vzorca, pri kateri smo dobili 50 % maksimalne citotoksičnosti, torej kjer je preživelo 50% celic glede na število celic v kontrolnih jamicah brez proteina (negativna kontrola).

Metoda za suspenzijske celične linije

Specifično citotoksično aktivnost smo merili na celični liniji KYM-1D4 (celice izolirane iz humanega rabdomiosarkoma) po metodi opisani v: Meager, A. 1991. J Immunol Meth 144: 141-143. Na mikrotitrskih ploščah smo pripravili serijske redčitve standarda TNF-alfa (NIBSC TNF-alfa standard 87/650) in analogov. Nato smo v vsako jamico dodali 2x10⁴ celic v 50 μΙ gojitvenega medija. Po 18 -19 urni inkubaciji celic z vzorci in standardom na 37 °C, v atmosferi z 5 % CO₂ smo nanesli 20 μΙ MTT barvila na jamico in plošče ponovno za 1 uro prenesli v inkubator. Netopne kristale formazana, ki so nastali v metabolno aktivnih celicah, smo raztopili z 10 % SDS in 0,02 M HCI. Optično gostoto smo izmerili pri 590 nm. Citotoksično aktivnost proteinov TNF-alfa smo določili enako, kot je opisano zgoraj.

-1313

ANALOG	SPECIFIČNA CITOTOKSIČNA AKTIVNOST [IU/mg]
	L929 (mišja linija)	KYM-1D4 (humana linija)
TNF-alfa	3x10'	3 x10z(ocena)
dN6-TNF-alfa	6x10'	6 χ 107 (ocena)
LK-805	8x 10'	5,7x10'
dN6-LK-805	1,2x10“	-
LK802	3,8x10“	6,2 x 10'
dN6-LK-802	8 x 10e (ocena)	1,2 x 10a (ocena)
dN6-LK-805/LK-802	1,5 x 107 (ocena)	2-3 χ 108 (ocena)

Tabela 1: Specifična citotoksična aktivnost merjena na mišji in humani celični liniji v odvisnosti od različnih TNF-alfa analogov.

Rezultati v Tabeli 1 kažejo, da je z delecijo šestih aminokislin ValArgSerSerSerArg na N-terminusu vsaj na eni celični liniji možno dobiti bistveno povečano in vitro citotoksičnost, zato lahko pričakujemo tudi ustrezne učinke oziroma modulacijo biološke aktivnosti in vivo.

Lek farmacevtska družba d.d.

Claims (14)

1. Postopek za pripravo proteinov, označen s tem, da vključuje spremembo v proteinski strukturi, ki se nanaša na aminokislinsko zaporedje (Arg/Lys)XYZ(Arg/Lys), pri čemer so X, Y, in Z aminokisline, ki so izbrane iz skupine, ki obsega: Ser, Gly, Ala, Thr, His, Lys, Arg, Gin, Asn,

2. Postopek po zahtevku 1, označen s tem, da aminokislinsko zaporedje (Arg/Lys)XYZ(Arg/Lys) zajema kombinacije: ArgXYZArg, ArgXYZLys, LysXYZLys, LysXYZArg in vse možne kombinacije X, Y in Z.

3. Postopek po zahtevkih 1 in 2, označen s tem, da vključuje odstranitev in/ali vključevanje aminokislinskega zaporedja (Arg/Lys)XYZ(Arg/Lys) in/ali vključevanje več takih zaporedij v različnih kombinacijah na različna mesta v proteinsko strukturo.

4. Postopek po kateremkoli predhodnem zahtevku, označen s tem, da so proteini izbrani iz skupine TNF alfa in TNF alfa analogov.

5. TNF alfa in TNF alfa analogi po zahtevku 4, označeni s tem, da imajo spremenjeno biološko aktivnost.

6. TNF alfa in TNF alfa analogi po zahtevku 5, označeni s tem, da je spremenjena biološka aktivnost posledica interakcije med aminokislinskim zaporedjem (Arg/Lys)XYZ(Arg/Lys) in proteoglikanom.

7. TNF alfa in TNF alfa analogi po zahtevku 6, označeni s tem, da so proteoglikani izbrani iz skupine glikozaminoglikanov.

8. TNF alfa in TNF alfa analogi po zahtevku 7, označeni s tem, da je izbrani glikozaminoglikan heparin ali heparansulfat.

9. TNF in TNF alfa analogi po zahtevkih 6-8, označeni s tem, da se proteoglikani nahajajo na celični površini.

10. Uporaba TNFalfa in TNF alfa analogov po kateremkoli predhodnem zahtevku za pripravo zdravil za modulacijo targentinga na tumorske celice in/ali moduliranja sistemske toksičnosti.

11. Uporaba TNF alfa in TNF alfa analogov po kateremkoli predhodnem zahtevku za pripravo zdravil za zdravljenje rakavih obolenj.

-1545

12. TNF-alfa analog, označen s tem, da ima deiecijo prvih šestih N-terminalnih aminokislin ValArgSerSerSerArg in uvedeno mutacijo Glu107Lys

13. TNF-alfa analog, označen s tem, da ima deiecijo prvih šestih N-terminalnih aminokislin ValArgSerSerSerArg in uvedeni mutaciji Ser95Cys in Gly148Cys.

14. TNF-alfa analog, označen s tem, da ima deiecijo prvih šestih N-terminalnih aminokislin ValArgSerSerSerArg in uvedene mutacije Ser95Cys, Gly148Cys in