ES2631727T3 - Anticuerpos contra el ErbB3 y usos de los mismos - Google Patents

Anticuerpos contra el ErbB3 y usos de los mismos Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo monoclonal aislado o porción de unión a antígeno del mismo que se une a ErbB3 y comprende regiones variables de cadena pesada y ligera, en el que: la región variable de cadena pesada CDR1 comprende la SEQ ID NO: 7; la región variable de cadena pesada CDR2 comprende la SEQ ID NO: 8; la región variable de cadena pesada CDR3 comprende la SEQ ID NO: 9; la región variable de cadena ligera CDR1 comprende la SEQ ID NO: 10; la región variable de cadena ligera CDR2 comprende la SEQ ID NO: 11; y la región variable de cadena ligera CDR3 comprende la SEQ ID NO: 12.

Description

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DESCRIPCION
Anticuerpos contra la ErbB3 y usos de los mismos Antecedentes de la invencion
La subfamilia de receptores de factores de crecimiento polipeptidicos ErbB/HER incluye el receptor del factor de crecimiento epidermico (EGF) (EGFR, ErbB1/HER1), el producto del oncogen neu (ErbB2/HER2) y las mas recientemente identificadas protefnas de los receptores ErbB3/HER3 y ErbB4/HER4 (vease, por ejemplo, Hynes y col. (1994) Biochim. Biophys. Acta Rev. Cancer 1198, 165 - 184). Se ha predicho que cada uno de estos receptores consiste en un dominio extracelular de union a ligando, un dominio que abarca la membrana, un dominio citosolico de tirosina cinasa de protefna (PTK) y un dominio de fosforilacion C-terminal (vease, por ejemplo, Kim y col., (1998) Biochem. J. 334, 189 - 195).
Se describen anticuerpos que se unen a HER-3 y composiciones farmaceuticas que comprenden anticuerpos anti- HER3 en, por ejemplo, los documentos EP 1283053, WO 97/35885 y WO 2007/077028. Se describen metodos para disenar anticuerpos y para fabricar anticuerpos biespecfficos en, por ejemplo, los documentos WO 2005/117973; WO 2006/091209; Balint et al. (1993) Gene. 137, 109-118 y Brown et al. (1996) J. Immunol. 156, 3285-3291.
Algunos experimentos in vitro han indicado que la actividad tirosina cinasa de protefna de la protefna ErbB3 esta significativamente atenuada en comparacion con la de otros miembros de la familia ErbB/HER, y esta atenuacion se ha atribuido en parte a la aparicion de sustituciones no conservativas de aminoacidos en el dominio catalftico predicho de la ErbB3 (vease, por ejemplo, Guy y col. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 91, 8132 - 8136; Sierke y col. (1997) Biochem. J. 322, 757 - 763). Sin embargo, se ha demostrado que la protefna ErbB3 esta fosforilada en varios contextos celulares. Por ejemplo, la ErbB3 esta fosforilada de forma constitutiva en los residuos de tirosina de un subconjunto de lfneas celulares de cancer de mama humano que sobreexpresan esta protefna (vease, por ejemplo, Kraus y col. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90, 2900 - 2904; y Kim y col. Supra; vease tambien, Schaefer y col. (2006) Neoplasia 8 (7): 613 - 22 y Schaefer y col. Cancer Res (2004) 64 (10): 3395 - 405).
Aunque se ha explorado el papel de la ErbB3 en el cancer (vease, por ejemplo, Horst y col. (2005) 115, 519 - 527; Xue y col. (2006) Cancer Res. 66, 1418 - 1426, Lee et al. (1998) Oncogene 16, 3243-3252), la ErbB3 sigue estando poco valorada como objetivo de intervencion clfnica. Las inmunoterapias actuales se centran principalmente en inhibir la accion de la ErbB2 y, en particular, la heterodimerizacion de los complejos de ErbB2/ErbB3 (vease, por ejemplo, Sliwkowski y col. (1994) J. Biol. Chem. 269 (20): 14661 - 14665 (1994)). Consecuentemente, es un objeto de la presente invencion proporcionar inmunoterapias mejoradas que inhiban de forma eficaz la senalizacion de la ErbB3, y que pueden usarse para tratar y diagnosticar varios canceres.
Resumen de la Invencion
La presente invencion proporciona un anticuerpo monoclonal aislado o porcion de union a antfgeno del mismo que se une a ErbB3 y comprende regiones variables de cadena pesada y ligera, en el que:
la region variable de cadena pesada CDR1 comprende la SEQ ID NO: 7; la region variable de cadena pesada CDR2 comprende la SEQ ID NO: 8; la region variable de cadena pesada CDR3 comprende la SEQ ID NO: 9; la region variable de cadena ligera CDR2 comprende la SEQ ID NO: 10; la region variable de cadena ligera CDR2 comprende la SEQ ID NO: 11; y la region variable de cadena ligera CDR3 comprende la SEQ ID NO: 12.
La presente divulgacion se refiere a una nueva clase de anticuerpos monoclonales que se unen al receptor de la ErbB3 e inhiben varias funciones de la ErbB3. Por ejemplo, los anticuerpos descritos en el presente documento son capaces de unirse a ErbB3 e inhibir la fosforilacion mediada por ligando de tipo EGF del receptor. Segun se describe en este documento, los ligandos de tipo EGF incluyen EGF, TGF-a, betacelulina, factor de crecimiento epidermico de union a la heparina, birregulina y anfirregulina, que se unen al EGFR e inducen la dimerizacion del EGFR con la ErbB3. Esta dimerizacion, a su vez, provoca la fosforilacion de la ErbB3, y activa la senalizacion a traves del receptor. Los anticuerpos monoclonales de la presente divulgacion, son por lo tanto utiles para el tratamiento y el diagnostico de varios canceres asociados con la senalizacion celular mediada por la ErbB3. Por consiguiente, en una realizacion, la presente invencion proporciona anticuerpos monoclonales (y porciones de union a antfgeno de los mismos) que se unen a ErbB3 e inhiben la fosforilacion mediada por ligando de tipo EGF de ErbB3.
Los anticuerpos se caracterizan adicionalmente por una o mas de las siguientes propiedades: (i) inhibicion de la senalizacion mediada por ligando de la ErbB3, incluyendo la senalizacion mediada por la union de ligandos de la ErbB3, tales como herregulina, epiregulina, epigenina y BIR, a la ErbB3 ; (ii) inhibicion de la proliferacion de celulas que expresan la ErbB3 ; (iii) capacidad para disminuir los niveles de la ErbB3 en la superficie de las celulas (por ejemplo, induciendo la internalizacion de la ErbB3 ); (iv) inhibicion de la secrecion del VEGF en las celulas que expresan la ErbB3 ; (v) inhibicion de la migracion de las celulas que expresan la ErbB3; (vi) inhibicion del crecimiento
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esferoidal de las celulas que expresan la ErbB3 ; y/o (vii) union a un epftopo ubicado en el dominio I (residuos 20 - 209) de la ErbB3, por ejemplo, un epftopo que implica o abarca los residuos 20 - 202 de la secuencia de aminoacidos de la ErbB3 .
Los anticuerpos monoclonales y las porciones de union al antfgeno de los mismos en particular de la presente divulgacion muestran una Kd de 50 nM o menos, medida mediante un ensayo de resonancia de plasmon superficial o un ensayo de union celular.
Los anticuerpos monoclonales y las porciones de union al antfgeno de los mismos en particular de la presente divulgacion incluyen una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que es identica en al menos el 90% (por ejemplo, el 85%, el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99%) a la region variable de la cadena pesada secuencia de aminoacidos establecida en la SEC ID N°: 1, en la SEC ID N°: 3, en la SEC ID N°: 5, en la sEc ID N°: 35 o en la SEC ID N°: 37. Otros anticuerpos monoclonales y porciones de union al antfgeno de los mismos en particular de la presente divulgacion incluyen una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que es identica en al menos el 80% (por ejemplo, el 85%, el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, 98% o el 99%) a la region variable de la cadena ligera secuencia de aminoacidos establecida en la SEC ID N°: 2, en la SEC ID N°: 4, en la SEC ID N°: 6, en la SEC ID N°: 36 o en la SEC ID N°: 38. Los anticuerpos tambien pueden incluir ambas de las anteriormente mencionadas regiones variables de la cadena pesada y de la cadena ligera.
Las regiones variables de cadena pesada y ligera de los anticuerpos o porciones de union a antfgeno de los mismos incluyen tfpicamente una o mas regiones determinantes de complementariedad (CDR). Estas incluyen una o mas regiones CDR1, CDR2 y CDR3. Por consiguiente, otros anticuerpos particulares y porciones de union a antfgeno de los mismos de la presente divulgacion incluyen una o mas secuencias CDR seleccionadas de entre una region variable de cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO:7; una region variable de cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO:8; una region variable de cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO:9; una region variable de cadena ligera CDR1 que comprende la SEQ ID NO:10; una region variable de cadena ligera CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 11; una region variable de cadena ligera CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 12; y combinaciones de las mismas.
Todavfa otros anticuerpos particulares y porciones de union al antfgeno de los mismos de la presente divulgacion incluyen o una o mas secuencias cDr elegidas de entre una region variable de cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 13; una region variable de cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO:14; una region variable de cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO:15; una region variable de cadena ligera CDR1 que comprende la sEq ID NO:16; una region variable de cadena ligera CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 17; una region variable de cadena ligera CDR3 que comprende la SEQ ID NO:18; y combinaciones de las mismas.
Todavfa otros anticuerpos particulares y porciones de union al antfgeno de los mismos de la presente divulgacion incluyen; o una o mas secuencias de CDR elegidas de entre una region variable de la cadena pesada CDR1 que comprende la SEC ID N°: 19; una region variable de la cadena pesada CDR2 que comprende la SEC ID N°: 20; una region variable de la cadena pesada CDR3 que comprende la SEC ID N°: 21; una region variable de la cadena ligera CDR1 que comprende la SEC ID N°: 22; una region variable de la cadena ligera CDR2 que comprende la SEC ID N°: 23; una region variable de la cadena ligera CDR3 que comprende la SEC ID N°: 24; y combinaciones de las mismas.
Todavfa otros anticuerpos particulares y porciones de union al antfgeno de los mismos de la presente divulgacion incluyen; o una o mas secuencias de CDR elegidas de entre una region variable de la cadena pesada CDR1 que comprende la SEC ID N°: 39; una region variable de la cadena pesada CDR2 que comprende la SEC ID N°: 40; una region variable de la cadena pesada CDR3 que comprende la SEC ID N°: 41; una region variable de la cadena ligera CDR1 que comprende la SEC ID N°: 42; una region variable de la cadena ligera CDR2 que comprende la SEC ID N°: 43; una region variable de la cadena ligera CDR3 que comprende la SEC ID N°: 44; y combinaciones de las mismas.
Todavfa otros anticuerpos particulares y porciones de union al antfgeno de los mismos de la presente divulgacion incluyen; o una o mas secuencias de CDR elegidas de entre una region variable de la cadena pesada CDR1 que comprende la SEC ID N°: 45; una region variable de la cadena pesada CDR2 que comprende la SEC ID N°: 46; una region variable de la cadena pesada CDR3 que comprende la SEC ID N°: 47; una region variable de la cadena ligera CDR1 que comprende la SEC ID N°: 48; una region variable de la cadena ligera CDR2 que comprende la SEC ID N°: 49; una region variable de la cadena ligera CDR3 que comprende la SEC ID N°: 50; y combinaciones de las mismas.
Los anticuerpos y porciones de union a antfgeno de los mismos tambien pueden comprender una o mas CDR que son al menos el 80 % (por ejemplo, el 85%, el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99%) identicas a cualquiera de las CDR mencionadas anteriormente, o combinaciones de CDR.
En una forma de realizacion, los anticuerpos y las porciones de union al antfgeno de los mismos son completamente
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humanos (es decir, contienen secuencias de CDR y en marco humanas). Algunos anticuerpos humanos en particular de la presente divulgacion incluyen aquellos con una region variable de la cadena pesada que proceden de un gen de la lfnea germinal humana VH3 y/o una region variable de la cadena ligera que procede de un gen de la lfnea germinal humana VL2.
Tambien estan englobados por la presente divulgacion los anticuerpos monoclonales y las porciones de los mismos que se unen a los mismos o epftopos superpuestos unidos por cualquiera de los anticuerpos o porciones de los mismos descritos en este documento (por ejemplo, un epftopo ubicado en el dominio I de la ErbB3, tal como un epftopo que implica o abarca los residuos 20 - 202 de la secuencia de aminoacidos de la ErbB3). Los anticuerpos que tienen la misma actividad que los anticuerpos descritos en este documento, por ejemplo, los anticuerpos con la misma secuencia que el Ab #6, tambien estan englobados por la presente divulgacion.
Los anticuerpos de la presente divulgacion incluyen todas las formas conocidas de anticuerpos y otros esqueletos proteicos con propiedades de tipo anticuerpo. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo biespecffico, un anticuerpo quimerico o un esqueleto proteico con propiedades de tipo anticuerpo, tal como fibronectina o repeticiones de anquirina. El anticuerpo tambien puede ser un Fab, un Fab'2, un ScFv, SMIP, aficuerpo, nanocuerpo, o un un anticuerpo de dominio. El anticuerpo tambien puede tener cualquiera de los siguientes isotipos: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD e IgE.
En otra forma de realizacion mas, la presente divulgacion tambien proporciona composiciones que comprenden combinaciones de anticuerpos o de porciones de union al antfgeno descritos en este documento, formulados con un portador y/o coadyuvante aceptable. En una forma de realizacion en particular, la composicion comprende dos o mas anticuerpos que se unen a epftopos diferentes de la ErbB3 o los anticuerpos descritos en este documento combinados con anticuerpos antineoplasicos que no se unen a la ErbB3.
Todavfa en otra realizacion, la presente divulgacion proporciona acidos nucleicos aislados que codifican los anticuerpos y porciones de union a antfgeno de los mismos descritos en el presente documento. En realizaciones particulares, el acido nucleico codifica una region variable de cadena pesada que comprende una secuencia nucleotfdica que es al menos un 80% (por ejemplo, un 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o un 99%) identica a, o que hibrida en condiciones de alta rigurosidad, con la SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:35, o SEQ ID NO:37; o una region variable de cadena ligera que comprende una secuencia nucleotfdica que es al menos un 80% (por ejemplo, un 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o un 99%) identica a, o que hibrida en condiciones de alta rigurosidad, con la SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:36, o SEQ ID NO:38; o combinaciones de dichas regiones variables de cadena pesada y ligera.
La presente divulgacion tambien proporciona mamfferos no humanos transgenicos, hibridomas y plantas transgenicas que expresan y/o producen los anticuerpos y las porciones de union al antfgeno descritos en este documento.
La divulgacion tambien proporciona kits que comprenden uno o mas anticuerpos monoclonales aislados o porciones de union al antfgeno de los mismos descritos en este documento, y opcionalmente, instrucciones para su uso en el tratamiento o el diagnostico de una enfermedad asociada con la senalizacion dependiente de la ErbB3, tales como los canceres.
Los anticuerpos y las porciones de union al antfgeno de los mismos de la presente divulgacion pueden usarse en una amplia variedad de aplicaciones terapeuticas y diagnosticas, particularmente aplicaciones oncologicas. Consecuentemente, en otro aspecto, la invencion proporciona un procedimiento para inhibir la fosforilacion mediada por ligando de tipo EGF de la ErbB3 en un sujeto administrando uno o mas anticuerpos o porciones de union a antfgeno de los mismos descritos en el presente documento en una cantidad suficiente para inhibir la fosforilacion mediada por ligando de tipo EGF de ErbB3. La invencion proporciona ademas los anticuerpos de la invencion para su uso en metodos para tratar una diversidad de canceres en un sujeto, incluyendo, pero sin limitacion, melanoma, cancer de mama, cancer de ovario, carcinoma renal, cancer gastrointestinal/de colon, cancer de pulmon, sarcoma de celulas claras, y cancer de prostata, administrando uno o mas anticuerpos o porciones de union a antfgeno de los mismos descritos en el presente documento en una cantidad suficiente para tratar el cancer. Los anticuerpos o porciones de union a antfgeno de los mismos pueden administrarse en solitario o en combinacion con otros agentes terapeuticos, tales como agentes anticancerosos, por ejemplo, otros anticuerpos, agentes quimioterapeuticos y/o radiacion.
Aun en otras realizaciones, la divulgacion proporciona metodos para diagnosticar y pronosticar enfermedades (por ejemplo, canceres) asociadas a ErbB3. En una realizacion, esto se consigue poniendo en contacto anticuerpos o porciones de union a antfgeno de la divulgacion (por ejemplo, ex vivo o in vivo) con celulas del sujeto, y midiendo el nivel de union a ErbB3 en las celulas, donde los niveles anormalmente altos de union a ErbB3 indican que el sujeto tiene un cancer asociado a ErbB3.
Otras caracterfsticas y ventajas de la invencion seran apreciables a partir de la siguiente descripcion detallada, y a partir de las reivindicaciones.
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Breve descripcion de los dibujos
Las Figuras 1A y 1B son graficos de barras que representan la union de varios candidatos a anticuerpo anti- ErbB3 (Fabs, denominados en este documento Abs) a la ErbB3 expresada en celulas de melanoma MALME-3M usando un anticuerpo secundario de cabra anti-Alexa 647 humana.
Las Figuras 2A - 2D son graficos que representan los valores de la Kd de varios candidatos a anticuerpo anti- ErbB3. Las Figuras 2A y 2B son graficos que representan el valor de la Kd del Anticuerpo # 6 (denominado Ab #6) y del Anticuerpo # 3 (denominado Ab #3), respectivamente, medidos mediante el uso de tecnologfa de resonancia de plasmon superficial (SPR). Las Figuras 2C y 2D son graficos que representan los valores de la Kd de Ab #6 y Ab #3, respectivamente, medidos mediante el uso de un ensayo de union celular usando celulas de melanoma MALME-3M.
La Figura 3 es un grafico que representa la especificidad de union de un anticuerpo anti-ErbB3 (Ab #6) a la ErbB3 usando ELISA. Como controles se usaron EGFR, BSA y TGF-a.
La Figura 4 es un grafico que representa la capacidad de un anticuerpo anti-ErbB3 (Ab #6) para disminuir los niveles totales de ErbB3 en celulas de melanoma MALME-3M in vitro, medido mediante el uso de un ELISA.
Las Figuras 5A y 5B son graficos que representan la capacidad de un anticuerpo anti-ErbB3 (Ab #6) para regular por disminucion los receptores de la ErbB3 en celulas MALME-3M, medido mediante el uso de un analisis por FACS. La Figura 5A muestra los resultados usando un isotipo IgG1 del anticuerpo la Figura 5B muestra los resultados usando un isotipo IgG2 del anticuerpo.
Las Figuras 6A - 6D son graficos que representan la evolucion temporal de la regulacion por disminucion de la ErbB3 mediada por anticuerpo (Ab #6), medida mediante el uso de un analisis por FACS.
La Figura 7 es un grafico de barras que representa la capacidad de varios anticuerpos anti-ErbB3 para regular por disminucion la ErbB3 en celulas de melanoma in vivo.
La Figura 8 es un grafico de barras que representa la capacidad de un anticuerpo anti-ErbB3 (Ab #6) para regular por disminucion la ErbB3 en xenoinjertos de ADRr in vivo.
La Figura 9 es un grafico de barras que representa la capacidad de un anticuerpo anti-ErbB3 (Ab #6) para inhibir la proliferacion de celulas MALME-3M en un ensayo de Cell Titer Glow.
La Figura 10 es un grafico de barras que representa la capacidad de un anticuerpo anti-ErbB3 (Ab #6) para inhibir la proliferacion celular en una lfnea celular de ovario, ADRr.
La Figura 11 es un grafico de barras que representa la capacidad de un anticuerpo anti-ErbB3 (Ab #6) para inhibir la proliferacion de celulas ACHN.
La Figura 12 es un grafico de barras que representa la capacidad de un anticuerpo anti-ErbB3 (Ab #6) para inhibir la fosforilacion de la ErbB3 en xenoinjertos de ADRr in vivo.
Las Figuras 13A - 13C son graficos que representan la capacidad de un anticuerpo anti-ErbB3 (Ab #6) para inhibir la fosforilacion mediada por betacelulina y herregulina de la ErbB3 en celulas ADRr.
Las Figuras 14A - 14B son graficos que representan la capacidad de un anticuerpo anti-ErbB3 (isotipo IgG2 del Ab #6) para inhibir la fosforilacion de la ErbB3 en las lfneas celulares de tumor de ovario OVCAR 5 y OVCAR 8. Las Figuras 15A - 15C son graficos que representan la capacidad de la betacelulina (BTC) para unirse a la ErbB1 segun se muestra por una ausencia de union a celulas la MALME-3M negativas en ErbB1 (Figura 17A); la union a celulas ADRr positivas en ErbB1 a unas concentraciones de 10 nM (Figura 17B) y 200 nM (Figura 17B), respectivamente, y la inhibicion de dicha union por Erbitux.
Las Figuras 16A - 16B son graficos que representan la capacidad de un anticuerpo anti-ErbB3 (isotipo IgG2 del Ab #6)) para inhibir la senalizacion mediada por herregulina en celulas MALME-3M.
La Figura 16A representa la capacidad del Ab #6 para inhibir la fosforilacion mediada por herregulina de la ErbB3 en celulas MALME-3M y la 16b representa la capacidad del Ab #6 para inhibir la fosforilacion de la AKT en celulas MALME-3M.
Las Figuras 17 A - D son graficos que representan la capacidad de un anticuerpo anti-ErbB3 (Ab #6) para inhibir el crecimiento celular en (A) ovario (celulas ADRr), (B) prostata (celulas Du145), (C) ovario (celulas OvCAR8) y (D) pancreas (celulas Colo357) a traves de estudios con xenoinjertos.
Las Figuras 18A y 18B son graficos que representan la capacidad del Ab #6 (Figura 18A) y del Fab para el Ab #3 (Figura 18B) de inhibir la union de la herregulina a la ErbB3 en celulas MALME-3M, medido mediante el uso de un analisis por FACS.
Las Figuras 19A y 19B son graficos que representan la capacidad del Ab #6 para inhibir la union de la epirregulina a la ErbB3 en celulas ADRr.
La Figura 19A representa la union de la epirregulina a celulas ADRr, y la Figura 19B representa la capacidad de Erbitux y de Ab #6 de inhibir la union de la epirregulina a celulas ADRr.
Las Figuras 20A y 20B son graficos que representan la capacidad del factor de crecimiento epidermico de union a heparina (HB-EGF) para unirse a la ErbB en celulas ADRr (Figura 20A) y la incapacidad de un anticuerpo anti- ErbB3 (Ab #6) para inhibir dicha union (Figura 20B).
Las Figuras 21A - 21C muestra las secuencias de aminoacidos de las regiones de la cadena variable pesada y ligera de los anticuerpos: Ab #6, Ab #3, Ab #14, Ab #17 y Ab #19.
Las Figuras 22A - 22B muestran las secuencias de nucleotidos de las regiones de la cadena variable pesada y ligera de los anticuerpos: Ab #6, Ab #3, y Ab #14.
La Figura 23 muestra las secuencias de aminoacidos de las regiones de la cadena ligera variable de los anticuerpos: Ab #6, Ab #17, y Ab #19, que han sido revertidas a la correspondiente secuencia de aminoacidos de
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la linea germinal. Los cambios en los residuos de aminoacidos estan subrayados.
Las Figuras 24A - 24C son graficos que representan la capacidad del Ab #6 para inhibir la secrecion del VEGF en celulas tumorales.
La Figura 25 es un grafico que muestran el efecto del Ab #6 sobre la migracion celular.
Las Figuras 26 A - C son graficos que muestran (A) la inhibicion del crecimiento esferoidal en celulas AdrR, (B) la inhibicion del crecimiento esferoidal inducido por HRG en AdrR, y (C) la inhibicion del crecimiento esferoidal inducido por HRG en celulas Du145.
Las Figuras 27 A y B son graficos que muestran el efecto del Ab #6 en (A) HRG y (B) la union de la BTC a celulas AdrR.
La Figura 28 es un grafico que muestra el efecto del Ab #6 sobre la fosforilacion de la ErbB3 inducida por el HGF.
Las Figuras 29 A y B muestran el efecto del Ab #6 sobre la fosforilacion de (A) la pErbBI y la pErbB3 y (B) la formacion del complejo ErbB2/3 inducida por HRG.
La Figura 30 es un grafico que muestra la union del Ab #6 a los residuos de aminoacidos 20 - 202 de la ErbB3. Descripcion detallada de la invencion
Con objeto de que la presente invencion pueda ser comprendida con mayor facilidad, en primer lugar se definen ciertos terminos. Se establecen definiciones adicionales a lo largo de la descripcion detallada.
I. Definiciones
Los terminos "ErbB3," "HER3," "receptor ErbB3" y "receptor HER3", segun se usan de forma intercambiable en este documento, se refieren a la protefna ErbB3 humana, segun se describe en la patente de EE.UU. N° 5.480.968 y en Plowman y col., Proc. Natl. Acad Sci. EE.UU., 87: 4905 - 4909 (1990); vease tambien, Kani y col., Biochemistry 44: 15842 - 857 (2005), Cho y Leahy, Science 297: 1330 - 1333 (2002)).
El termino "ligando de tipo EGF", segun se usa en este documento, se refiere a ligandos del receptor del factor de crecimiento epidermico (EGFR), incluyendo el factor de crecimiento epidermico (EGF) y protefnas estrechamente relacionadas, tales como el factor de crecimiento transformante a (TGF-a), betacelulina (BTC), factor de crecimiento epidermico de union a heparina (HB-EGF), birregulina (BIR) y anfirregulina (AR), que se unen al EGFR de la superficie de las celulas y estimulan la actividad cianasa de tirosina de protefnas intrfnseca del receptor. Especfficamente, los ligandos de tipo EGF inducen la formacion del complejo entre el EGFR (tambien denominado ErbB1) y la protefna ErbB3 (vease, por ejemplo, Kim y col., (1998) Biochem J., 334: 189-195), que da como resultado la fosforilacion de residuos de tirosina en el complejo.
Los anticuerpos y las porciones de union al antfgeno de los mismos de la presente invencion inhiben la fosforilacion mediada por ligando de tipo EGF de la ErbB3 y, en ciertas formas de realizacion, muestran una o mas de las siguientes propiedades adicionales: (i) inhibicion de una o mas de la senalizacion mediada por herregulina, epirregulina, epigenina y birregulina (BIR) hasta la ErbB3; (ii) inhibicion de la proliferacion de las celulas que expresan la ErbB3; (iii) capacidad para disminuir los niveles de la ErbB3 en la superficie de las celulas; (iv) inhibicion de la secrecion del VEGF de las celulas que expresan la ErbB3; (v) inhibicion de la migracion de las celulas que expresan la ErbB3; (vi) inhibicion del crecimiento esferoidal de las celulas que expresan la ErbB3; y/o (vii) union a un epftopo ubicado en el dominio I de la ErbB3, por ejemplo, un epftopo que implica o abarca los residuos 20 - 202 de la secuencia de aminoacidos de la ErbB3.
El termino "inhibicion", segun se usa en este documento, se refiere a cualquier disminucion estadfsticamente significativa de la actividad biologica, incluyendo el bloqueo completo de la actividad. Por ejemplo, "inhibicion" puede referirse a una disminucion de aproximadamente el 10%, el 20%, el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 90% o el 100% en la actividad biologica.
Consecuentemente, la frase "inhibicion de la fosforilacion mediada por ligando de tipo EGF de la ErbB3", segun se usa en este documento, se refiere a la capacidad de un anticuerpo o de una porcion de union al antfgeno del mismo de disminuir estadfsticamente significativamente la fosforilacion de la ErbB3 inducida por un ligando de tipo EGF, con respecto a la fosforilacion en una celula no tratada (control). La celula que expresa la ErbB3 puede ser una celula o una linea celular natural, o puede estar producida recombinantemente mediante la introduccion de un acido nucleico que codifica para la ErbB3 en una celula hospedadora. En una forma de realizacion, el anticuerpo o una porcion de union al antfgeno del mismo inhibe la fosforilacion mediada por ligando de tipo EGF de la ErbB3 en al menos el 10%, o en al menos el 20%, o en al menos el 30%, o en al menos el 40%, o en al menos el 50%, o en al menos el 60%, o en al menos el 70%, o en al menos el 80%, o en al menos el 90%, o 100%, segun se determina, por ejemplo, mediante una inmunotransferencia Western seguido de un sondeo con un anticuerpo anti-fosfotirosina segun se describe en Kim y col., (1998) Biochem J., 334: 189 - 195 y en los Ejemplos, infra.
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La expresion "inhibicion de la senalizacion mediada por herregulina, epirregulina, epigenina o birregulina hasta la ErbB3", segun se usa en este documento, se refiere a la capacidad de un anticuerpo o de una porcion de union al antfgeno del mismo de disminuir estadfsticamente significativamente la senalizacion mediada por un ligando de la ErbB3 (por ejemplo, herregulina, epirregulina, epigenina y birregulina) hasta la ErbB3, con respecto a la senalizacion en ausencia del anticuerpo (control). Los ligandos de la ErbB3 tambien se denominan este documento "ligandos de tipo herregulina". Esto significa que, en presencia del anticuerpo o de una porcion de union al antfgeno del mismo, una senal mediada en una celula que expresa la ErbB3 por una o mas de herregulina, epirregulina, epigenina y birregulina, con respecto a un control (sin anticuerpo), esta estadfsticamente significativamente disminuida. Una senal mediada por un ligando de la ErbB3 puede ser medida mediante el ensayo del nivel o de la actividad de un sustrato de la ErbB3, y/o de una protefna que este presente en una cascada celular que implique la ErbB3. En una forma de realizacion, el anticuerpo o una porcion de union al antfgeno del mismo disminuye el nivel o la actividad de un sustrato de la ErbB3 y/o los de una protefna en una cascada celular que implica la ErbB3, en al menos el 10%, o en al menos el 20%, o en al menos el 30%, o en al menos el 40%, o en al menos el 50%, o en al menos el 60%, o en al menos el 70%, o en al menos el 80%, o en al menos el 90% o el 100% relativo al nivel o a la actividad en ausencia de dicho anticuerpo o de una porcion de union al antfgeno del mismo (control). Dicha senalizacion mediada por un ligando de la ErbB3 puede medirse mediante el uso de tecnicas reconocidas en la tecnica que miden el nivel o la actividad de un sustrato de la ErbB3 (por ejemplo, SHC o PI3K) o de una protefna en una cascada celular que implica la ErbB3 (por ejemplo, AKT) usando ensayos de cinasa para dichas protefnas (vease, por ejemplo, Horst y col. supra, Sudo y col. (2000) Methods Enzymol, 322: 388 - 92; y Morgan y col. (1990) Eur. J. Biochem., 191: 761 - 767).
En una forma de realizacion en particular, el anticuerpo o una porcion de union al antfgeno del mismo inhibe la senalizacion mediada por ligando de la ErbB3 (por ejemplo, herregulina, epirregulina, epigenina o birregulina) hasta la ErbB3 mediante la inhibicion de la union del ligando de la ErbB3 (por ejemplo, uno o mas de herregulina, epirregulina, epigenina o birregulina) a la ErbB3. Algunos ligandos (por ejemplo, birregulina o BIR) funcionan tanto como ligandos de tipo EGF (es decir, se unen a EGFR/ErbB1) como ligandos de tipo ErbB3 (es decir, se unen a la ErbB3).
La expresion "inhibicion de la union de herregulina, epirregulina, epigenina o birregulina a la ErbB3", segun se usa en este documento, se refiere a la capacidad de un anticuerpo o de una porcion de union al antfgeno del mismo para disminuir estadfsticamente significativamente la union de un ligando de la ErbB3 (por ejemplo, uno o mas de herregulina, epirregulina, epigenina o birregulina) a la ErbB3, con respecto a la union en ausencia del anticuerpo (control). Esto significa que, en presencia del anticuerpo o de una porcion de union al antfgeno del mismo, la cantidad de ligando de la ErbB3 (por ejemplo, herregulina, epirregulina, epigenina o birregulina) que se une a la ErbB3 con respecto a un control (sin anticuerpo), esta estadfsticamente significativamente disminuida. La cantidad de un ligando de la ErbB3 que se une a la ErbB3 puede estar disminuida en presencia de un anticuerpo o de una porcion de union al antfgeno del mismo de la divulgacion en al menos el 10%, o en al menos el 20%, o en al menos el 30%, o en al menos el 40%, o en al menos el 50%, o en al menos el 60%, o en al menos el 70%, o en al menos el 80%, o en al menos el 90% o el 100% con respecto a la cantidad en ausencia del anticuerpo o de una porcion de union al antfgeno del mismo (control). Una disminucion en la union del ligando a la ErbB3 puede medirse usando tecnicas reconocidas en la tecnica que miden el nivel de union del ligando marcado a la ErbB3 (por ejemplo, herregulina, epirregulina, epigenina o birregulina radiomarcadas) a celulas que expresan la ErbB3 en presencia o ausencia (control) del anticuerpo o de una porcion de union al antfgeno del mismo.
La expresion "inhibicion de la proliferacion de una celula que expresa la ErbB3", segun se usa en este documento, se refiere a la capacidad de un anticuerpo o de una porcion de union al antfgeno del mismo de disminuir estadfsticamente significativamente la proliferacion de una celula que expresa la ErbB3 con respecto a la proliferacion en ausencia del anticuerpo. En una forma de realizacion, la proliferacion de una celula que expresa la ErbB3 (por ejemplo, una celula cancerosa) puede estar disminuida en al menos el 10%, o en al menos el 20%, o en al menos el 30%, o en al menos el 40%, o en al menos el 50%, o en al menos el 60%, o en al menos el 70%, o en al menos el 80%, o en al menos el 90% o el 100% cuando las celulas se ponen en contacto con el anticuerpo o con una porcion de union al antfgeno del mismo de la presente divulgacion, con respecto a la proliferacion medida en ausencia del anticuerpo o de una porcion de union al antfgeno del mismo (control). La proliferacion celular puede ser ensayada usando tecnicas reconocidas en la tecnica que miden la tasa de division celular, la fraccion de celulas dentro de una poblacion celular que experimentan division celular y/o la tasa de perdida de celulas en una poblacion celular debida a la diferenciacion terminal o la muerte celular (por ejemplo, usando un ensayo de cell titer glow o de incorporacion de timidina).
La expresion "la capacidad para disminuir los niveles de la ErbB3 en la superficie de las celulas", segun se usa en este documento, se refiere a la capacidad de un anticuerpo o de una porcion de union al antfgeno del mismo de reducir estadfsticamente significativamente la cantidad de ErbB3 encontrada en la superficie de una celula que ha sido expuesta al anticuerpo con respecto a una celula no tratada (control). Por ejemplo, una disminucion en los niveles de la ErbB3 en la superficie de las celulas puede ser el resultado de un aumento en la internalizacion de la ErbB3 (o un aumento en la endocitosis de la ErbB3). En una forma de realizacion, el anticuerpo o una porcion de union al antfgeno del mismo disminuye la expresion en la superficie celular de la ErbB3 en al menos el 10%, o en al menos el 20%, o en al menos el 30%, o en al menos el 40%, o en al menos el 50%, o en al menos el 60%, o en al
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menos el 70%, o en al menos el 80%, o en al menos el 90% o el 100% y/o aumenta la internalizacion del receptor de la ErbB3 en al menos el 10%, o en al menos el 20%, o en al menos el 30%, o en al menos el 40%, o en al menos el 50%, o en al menos el 60%, o en al menos el 70%, o en al menos el 80%, o en al menos el 90% o el 100% con respecto a la expresion en la superficie celular o a la internalizacion en ausencia del anticuerpo o de una porcion de union al antfgeno del mismo (control). Los niveles de la ErbB3 en la superficie de las celulas y/o la internalizacion del receptor de la ErbB3 en ausencia y en presencia de un anticuerpo o de una porcion de union al antfgeno del mismo puede medirse facilmente usando tecnicas reconocidas en la tecnica, tales como las descritas en Horst y col., supra y en los ejemplos de este documento.
La expresion "inhibicion de la secrecion de VEGF en celulas que expresan ErbB3", segun se usa en este documento, se refiere a la capacidad de un anticuerpo o de una porcion de union al antfgeno del mismo de reducir estadfsticamente significativamente la secrecion de VEGF de una celula que expresa la ErbB3 con respecto a la secrecion de VEGF en ausencia del anticuerpo. En una forma de realizacion, la secrecion de VEGF de una celula que expresa la ErbB3 (por ejemplo, una celula cancerosa) puede estar disminuida en al menos el 10%, o en al menos el 20%, o en al menos el 30%, o en al menos el 40%, o en al menos el 50%, o en al menos el 60%, o en al menos el 70%, o en al menos el 80%, o en al menos el 90% o el 100% cuando las celulas se ponen en contacto con el anticuerpo o con una porcion de union al antfgeno del mismo de la presente divulgacion, con respecto a la secrecion de VEGF medida en ausencia del anticuerpo o de una porcion de union al antfgeno del mismo (control). La secrecion de VEGF puede ensayarse usando tecnicas reconocidas en la tecnica, tales como las descritas en este documento.
La expresion "inhibicion de la migracion de celulas que expresan la ErbB3", segun se usa en este documento, se refiere a la capacidad de un anticuerpo o de una porcion de union al antfgeno del mismo de reducir estadfsticamente significativamente la migracion de una celula que expresa la ErbB3 con respecto a la migracion de la celula en ausencia del anticuerpo. En una forma de realizacion, la migracion de una celula que expresa la ErbB3 (por ejemplo, una celula cancerosa) puede estar disminuida en al menos el 10%, o en al menos el 20%, o en al menos el 30%, o
en al menos el 40%, o en al menos el 50%, o en al menos el 60%, o en al menos el 70%, o en al menos el 80%, o
en al menos el 90% o el 100% cuando las celulas se ponen en contacto con el anticuerpo o con una porcion de union al antfgeno del mismo de la presente divulgacion, con respecto a la migracion medida en ausencia del anticuerpo o de una porcion de union al antfgeno del mismo (control). La migracion celular puede ensayarse usando tecnicas reconocidas en la tecnica, tales como las descritas en este documento.
La expresion "inhibicion del crecimiento esferoidal de celulas que expresan la ErbB3", segun se usa en este documento, se refiere a la capacidad de un anticuerpo o de una porcion de union al antfgeno del mismo de reducir estadfsticamente significativamente la migracion de una celula que expresa la ErbB3 con respecto a la migracion de la celula en ausencia del anticuerpo. En una forma de realizacion, la migracion de una celula que expresa la ErbB3 (por ejemplo, una celula cancerosa) puede estar disminuida en al menos el 10%, o en al menos el 20%, o en al menos el 30%, o en al menos el 40%, o en al menos el 50%, o en al menos el 60%, o en al menos el 70%, o en al
menos el 80%, o en al menos el 90% o el 100% cuando las celulas se ponen en contacto con el anticuerpo o con
una porcion de union al antfgeno del mismo de la presente divulgacion, con respecto a la migracion medida en ausencia del anticuerpo o de una porcion de union al antfgeno del mismo (control). La migracion celular puede ensayarse usando tecnicas reconocidas en la tecnica, tales como las descritas en este documento. El termino "anticuerpo" o "inmunoglobulina," segun se usa de forma intercambiable en este documento, incluye anticuerpos completos y cualquier fragmento de union al antfgeno (es decir, "porcion de union al antfgeno") o cadenas individuales de los mismos. Un "anticuerpo" comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por puentes de disulfuro. Cada cadena pesada esta formada por una region variable de la cadena pesada (abreviada en este documento como Vh) y una region constante de la cadena pesada. La region constante de la cadena pesada esta formada por tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera esta formada por una region variable de la cadena ligera (abreviado en este documento como Vl) y una region constante de la cadena ligera. La region constante de la cadena ligera esta formada por un dominio, CL. Las regiones Vh y Vl puede subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinates de la complementariedad (CDR), intercaladas entre las regiones que estan mas conservadas, denominada regiones en marco (FR). Cada Vh y Vl esta formada por tres CDRs y cuatro FRs, dispuestas desde el amino terminal hacia el carboxi terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de union que interactua con un antfgeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la union de la inmunoglobulina a los tejidos o los factores del hospedador, incluyendo varias celulas del sistema inmunitario (por ejemplo, celulas efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema componente clasico. Algunos ejemplos de anticuerpos de la divulgacion incluyen los anticuerpos #1, 3 y 14, y las porciones de union al antfgeno de los mismos.
El termino "porcion de union al antfgeno" de un anticuerpo (o simplemente "porcion de anticuerpo"), segun se usa en este documento, se refiere a uno o mas fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse especfficamente a un antfgeno (por ejemplo, a la ErbB3). Se ha demostrado que la funcion de union al antfgeno de un anticuerpo puede ser realizada por fragmentos de un anticuerpo completo. Algunos ejemplos de fragmentos de union englobados en el termino "porcion de union al antfgeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, a un fragmento monovalente que consiste en los dominios Vl, Vh, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento
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bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente de disulfuro en la region de bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios Vh y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios Vl y Vh de un unico brazo de un anticuerpo, (v) un dAb que incluye los dominios VH y VL; (vi) un fragmento dAb (Ward y col. (1989) Nature 341, 544 - 546), que consiste en un dominio Vh; (vii) un dAb que consiste en un dominio VH o VL; y (viii) una region determinante de complementariedad aislada (CDR) o (ix) una combinacion de dos o mas CDRs aisladas que opcionalmente pueden estar unidas mediante un conector sintetico. Adicionalmente, aunque los dos dominios del fragmento Fv, Vl y Vh, estan codificados por genes individuales, pueden unirse usando procedimientos recombinantes, mediante un conector sintetico que les permite ser creados como una unica cadena proteica en la que las regiones Vl y Vh se aparean para formar moleculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena individual (scFv); vease, por ejemplo, Bird y col. (1988) Science 242, 423 - 426; y Huston y col. (1988) Proc. Natl. Acad Sci. EE.UU. 85, 5879 - 5883). Tambien se pretende que dichos anticuerpos de cadena individual estan englobados en el termino "porcion de union al antfgeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen usando tecnicas convencionales conocidas por los expertos en la tecnica, y los fragmentos son cribados para comprobar su utilidad de la misma forma que lo son los anticuerpos intactos. Las porciones de union al antfgeno pueden ser producidas mediante tecnicas de ADN recombinante, o mediante la escision enzimatica o qufmica de inmunoglobulinas intactas.
El termino "anticuerpo monoclonal", segun se usa en este documento, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogenea, es decir, los anticuerpos individuales que forman la poblacion son identicos excepto por posibles mutaciones naturales que puedan estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente especfficos, siendo dirigidos contra un unico sitio antigenico. Adicionalmente, al contrario que las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) que incluyen tfpicamente anticuerpos diferentes dirigidos contra determinantes (epftopos) diferentes, cada anticuerpo monoclonal esta dirigido contra un unico determinante del antfgeno. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse usando cualquier tecnica reconocida la tecnica y aquellas descritos en este documento, tales como, por ejemplo, un procedimiento con hibridoma, segun describen Kohler y col. (1975) Nature, 256: 495, con un animal transgenico, segun se describe, por ejemplo, en (vease, por ejemplo, Lonberg, y col. (1994) Nature 368 (6474): 856 - 859), procedimientos con ADN recombinante (vease, por ejemplo, la patente de EE.UU. N° 4.816.567), o usando genotecas de anticuerpos de fagos usando las tecnicas descritas, por ejemplo, en Clackson y col., Nature, 352: 624 - 628 (1991) y en Marks y col., J. Mol. Biol., 222: 581 - 597 (1991). Los anticuerpos monoclonales incluyen anticuerpos quimericos, anticuerpos humanos y anticuerpos humanizados, y pueden aparecer de forma natural o producirse recombinantemente.
El termino "anticuerpo recombinante" se refiere a anticuerpos que son preparados, expresados, creados o aislados mediante medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados a partir de un animal (por ejemplo, un raton) que es transgenico o transcromosomico para genes de inmunoglobulina (por ejemplo, genes de inmunoglobulina humana) o un hibridoma preparado a partir de los mismos, (b) anticuerpos aislados a partir de una celula hospedadora transformada para que exprese el anticuerpo, por ejemplo, a partir de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados a partir de una genoteca combinatoria de anticuerpos recombinantes (por ejemplo, que contienen secuencias de anticuerpos humanos) usando expresion de fagos, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados mediante cualquier otro medio que implique el corte y empalme de secuencias genicas de inmunoglobulina (por ejemplo, genes de inmunoglobulina humana) en otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos recombinantes pueden tener regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulinas de lfneas germinales humanas. En ciertas formas de realizacion, sin embargo, dichos anticuerpos humanos recombinantes pueden ser sometidos a una mutagenesis in vitro y por lo tanto, las secuencias recombinantes de aminoacidos de las regiones Vh y Vl de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque derivan y estan relacionadas con las secuencias de Vh y Vl de la lfnea germinal humana, pueden no existir de forma natural en el repertorio de una lfnea germinal humana de anticuerpos in vivo.
El termino "inmunoglobulina quimerica" o anticuerpo se refiere a una inmunoglobulina o a un anticuerpo cuyas regiones variables derivan de una primera especie y cuyas regiones constantes derivan de una segunda especie. Las inmunoglobulinas o los anticuerpos quimericos pueden construirse, por ejemplo, mediante ingenierfa genetica, a partir de segmentos de genes de inmunoglobulinas pertenecientes a especies diferentes.
El termino "anticuerpo humano", segun se usa en este documento, pretende incluir anticuerpos con regiones variables en las que tanto las regiones en marco como la CDR derivan de secuencias de inmunoglobulinas de lfneas germinales humanas segun describen, por ejemplo, Kabat y col. (vease Kabat, y col. (1991) Sequences of proteins of Immunological Interest, quinta edicion, U.S. Department of Health and Human Services, Publicacion NIH N° 913242). Adicionalmente, si el anticuerpo contiene una region constante, la region constante tambien deriva de secuencias de inmunoglobulinas de lfneas germinales humanas. Los anticuerpos humanos pueden incluir residuos de aminoacidos no codificados por las secuencias de inmunoglobulinas de lfneas germinales humanas (por ejemplo, mutaciones producidas mediante mutagenesis aleatoria o especffica in vitro o mediante mutacion somatica in vivo). Sin embargo, el termino "anticuerpo humano", segun se usa en este documento, no pretende incluir anticuerpos en los que las secuencias de las CDR que derivan de la lfnea germinal de otra especie de mamffero, tal como un raton, ha sido injertadas en secuencias en marco humanas.
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El anticuerpo humano puede tener al menos uno o mas aminoacidos sustituidos por un residuo de aminoacido, por ejemplo, un residuo de aminoacido que mejore la actividad que no este codificado por la secuencia de inmunoglobulina de la lfnea germinal humana. Tfpicamente, el anticuerpo humano puede tener hasta veinte posiciones sustituidas con residuos de aminoacidos que no son parte de la secuencia de inmunoglobulina de la lfnea germinal humana. En una forma de realizacion en particular, estas sustituciones estan dentro de las regiones CDR segun se describe con detalle a continuacion.
El termino "inmunoglobulina humanizada" o "anticuerpo humanizado" se refiere a una inmunoglobulina o a un anticuerpo que incluye al menos una cadena de una inmunoglobulina o de un anticuerpo humanizado (es decir, al menos una cadena pesada o ligera humanizada). El termino "cadena de inmunoglobulina humanizada" o "cadena de anticuerpo humanizado" (es decir, una "cadena ligera de una inmunoglobulina humanizada" o una "cadena pesada de una inmunoglobulina humanizada") se refiere a una cadena de una inmunoglobulina o de un anticuerpo (es decir, una cadena ligera o pesada, respectivamente) con una region variable que incluye una region en marco variable sustancialmente procedente de una inmunoglobulina o de un anticuerpo humano, y regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) (por ejemplo, al menos una CDR, preferiblemente dos CDRs, mas preferiblemente tres CDRs) sustancialmente procedentes de una inmunoglobulina o de un anticuerpo no humano, y adicionalmente incluye regiones constantes (por ejemplo, al menos una region constante o una porcion de la misma, en el caso de una cadena ligera, y preferiblemente tres regiones constantes el caso de una cadena pesada). El termino "region variable humanizada" (por ejemplo, "region variable humanizada de la cadena ligera" o "region variable humanizada de la cadena pesada") se refiere a una region variable que incluye una region en marco variable sustancialmente procedente de una inmunoglobulina o un anticuerpo humano y regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) sustancialmente procedentes de una inmunoglobulina o de un anticuerpo no humano.
Un "anticuerpo biespecffico" o "bifuncional" es un anticuerpo hfbrido artificial con dos pares diferentes de cadena pesada/ligera y dos sitios de union diferentes. Los anticuerpos biespecfficos pueden producirse mediante varios procedimientos que incluyen la fusion de hibridomas o la union de fragmentos Fab'. Vease, por ejemplo, Songsivilai & Lachmann, (1990) Clin. Exp. Immunol. 79, 315 - 321; Kostelny y col. (1992) J. Immunol. 148, 1547 - 1553. En una forma de realizacion en particular, un anticuerpo biespecffico segun la presente divulgacion incluye sitios de union para la ErbB3 y para el IGF1-R (es decir, el receptor del factor de crecimiento insulinoide de tipo 1). En otra forma de realizacion, un anticuerpo biespecffico segun la presente divulgacion incluye sitios de union para la ErbB3 y para la C-MET. En otras formas de realizacion, un anticuerpo biespecffico incluye un sitio de union para la ErbB3 y un sitio de union para ErbB2, ERbB3, ErbB4, EGFR, Lewis Y, MUC-1, EpCAM, CA125, antfgeno de membrana especffico prostatico, PDGFR-a, PDGFR-p, C-KIT o cualquiera de los receptores del FGF.
Segun se usa en este documento, un "anticuerpo heterologo" se define en relacion con el organismo o el vegetal transgenico no humano que produce dicho anticuerpo.
Un "anticuerpo aislado", segun se usa en este documento, pretende referirse a un anticuerpo que esta sustancialmente exento de otros anticuerpos con unas especificidades antigenicas diferentes (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une especfficamente a la ErbB3 esta sustancialmente exento de anticuerpos que se unen especfficamente a otros antfgenos distintos a la ErbB3). Ademas, un anticuerpo aislado esta tfpicamente sustancialmente exento de otros materiales celulares y/o sustancias qufmicas. En una forma de realizacion de la divulgacion una combinacion de monoclonal anticuerpos "aislados" con diferentes especificidades de union a la ErbB3 se combinan en una composicion bien definida.
Segun se usa en este documento, "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM o IgG1) que es codificada por los genes de la region constante de la cadena pesada. En una forma de realizacion, un anticuerpo o una porcion de union al antfgeno del mismo es de un isotipo elegido de entre un isotipo de un anticuerpo de una IgG1, de una IgG2, de una IgG3, de una IgG4, de una IgM, de una IgA1 de una IgA2, de una IgAsec, de una IgD o de una IgE. En algunas formas de realizacion, un anticuerpo monoclonal de la invencion es del isotipo IgG1. En otras formas de realizacion, un anticuerpo monoclonal de la invencion es del isotipo IgG2.
Segun se usa en este documento, "intercambio de isotipos" se refiere al fenomeno por el cual la clase, o el isotipo, de un anticuerpo, cambia desde una clase de Ig a una de las otras clases de Ig.
Segun se usa en este documento, "isotipo no intercambiado" se refiere a la clase isotfpica de cadena pesada que se produce cuando no ha tenido lugar ningun intercambio de isotipo; el gen CH que codifica para el isotipo no intercambiado es tfpicamente el primer gen CH inmediatamente secuencia abajo del gen VDJ reordenado funcionalmente. El intercambio de isotipos se ha clasificado como intercambio de isotipo clasico o no clasico. El intercambio de isotipo clasico se produce mediante episodios de recombinacion que implican al menos un intercambio en regiones de secuencias en un gen que codifica para un anticuerpo. El intercambio de isotipo no clasico puede producirse, por ejemplo, mediante recombinacion homologa entre ou humana y Zu humana (delecion asociada a 8). Pueden producirse otros mecanismos de intercambio no clasico alternativos, tales como recombinacion intertransgenica y/o intercromosomica, entre otros, y efectuar el intercambio de isotipo.
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Segun se usa en este documento, el termino "secuencia de cambio" se refiere a aquellas secuencias de ADN responsables de la recombinacion de cambio. Una secuencia "donante de cambio", tfpicamente junto con una region de cambio p, estara en 5' (es decir, secuencia arriba) de la region del constructo que se va a eliminar durante la recombinacion de cambio. La region "aceptora de cambio" estara entre la region del constructo que se va a eliminar y la region constante de sustitucion (por ejemplo, y, e, etc.). Como no hay que un sitio especffico donde se produzca siempre la recombinacion, la secuencia genica final tfpicamente no sera predecible a partir del constructo.
Un "antfgeno" es una entidad (por ejemplo, una entidad proteica o un peptido) a la que se une un anticuerpo o una porcion de union al antfgeno del mismo. En varias formas de realizacion de la presente divulgacion, un antfgeno es una molecula de ErbB3 o una molecula de tipo ErbB3. En una forma de realizacion en particular segun la invencion, un antfgeno es una ErbB3 humana.
El termino "epftopo" o "determinante antigenico" se refiere al sitio de un antfgeno al que se une especfficamente una inmunoglobulina o un anticuerpo. Los epftopos pueden estar formados a partir tanto de aminoacidos contiguos como de aminoacidos no contiguos yuxtapuestos por el plegamiento terciario de una protefna. Los epftopos formados a partir de aminoacidos contiguos tfpicamente son conservados tras la exposicion a disolventes desnaturalizantes, mientras que los epftopos formados por el plegamiento terciario tfpicamente se pierden tras el tratamiento con disolventes desnaturalizantes. Un epftopo incluye tfpicamente al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoacidos en una unica conformacion espacial. Los procedimientos para determinar la conformacion espacial de los epftopos incluyen tecnicas de la tecnica y aquellas descritas en este documento, por ejemplo, cristalograffa de rayos X y resonancia magnetica nuclear bidimensional. Vease, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996).
La presente divulgacion tambien engloba anticuerpos que se unen al mismo epftopo, o a uno solapantte, que los anticuerpos de la presente divulgacion, es decir, anticuerpos que compiten por la union a la ErbB3, o que se unen a epftopos que se superponen con epftopos unidos por los anticuerpos descritos en este documento, es decir, un epftopo ubicado en el dominio I de la ErbB3. Los anticuerpos que reconocen el mismo epftopo pueden ser identificados mediante el uso de tecnicas rutinarias tales como un inmunoensayo, por ejemplo, demostrando la capacidad de un anticuerpo de bloquear la union de otro anticuerpo a un antfgeno objetivo, es decir, un ensayo de union competitiva. La union competitiva se determina en un ensayo en el que en la inmunoglobulina de prueba inhibe especfficamente la union de un anticuerpo de referencia a un antfgeno comun, tal como la ErbB3. Se conocen numerosos tipos de ensayos de union competitiva, por ejemplo: ensayo directo en fase solida o radioinmunoensayo indirecto (RlA), ensayo directo en fase solida o inmunoensayo enzimatico indirecto (EIA), ensayo de competicion en sandwich (vease Stahli y col., (1983) Methods in Enzymology 9: 242); ensayo directo de ElA en fase solida con biotina-avidina (vease Kirkland y col., (1986) J. Immunol. 137: 3614); ensayo directo fase solida marcado, ensayo directo en fase solida en sandwich marcado (vease Harlow y Lane, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); RlA directo en fase solida marcando usando un marcaje de I-125 (vease Morel y col., (1988) Mol. Immunol. 25 (1): 7); EIA directo en fase solida con biotina-avidina (Cheung y col., (1990) Virology 176: 546); y RIA directo marcado (Moldenhauer y col., (1990) Scand. J. Immunol. 32: 77). Tfpicamente, dichos ensayo implica el uso del antfgeno purificado (por ejemplo, ErbB3) unido a la superficie de un solido o de celulas portadoras de cualquiera de ellos, una inmunoglobulina de ensayo sin marcar y una inmunoglobulina de referencia marcada. La inhibicion competitiva se mide mediante la determinacion de la cantidad de marcador unida a la superficie solida o a las celulas en presencia de la inmunoglobulina de ensayo. Habitualmente la inmunoglobulina de ensayo esta presente en exceso. Habitualmente, cuando hay presente un exceso de un anticuerpo competidor, inhibira la union especffica de un anticuerpo de referencia a un antfgeno comun en al menos el 50 - 55%, el 55 - 60%, el 60 - 65%, el 65 - 70% el 70 - 75% o mas.
Segun se usa en este documento, los terminos "union especffica", "se une especfficamente" y "se une selectivamente" significan que un anticuerpo o una porcion de union al antfgeno del mismo, muestra una afinidad apreciable por un antfgeno o un epftopo en particular, y generalmente, no muestra una reactividad cruzada significativa con otros antfgenos y epftopos. Union "apreciable" o preferida incluye la union con una afinidad de al menos 106, 107, 108, 109 M-1 o 1010 M-1. Son mas preferidas las afinidades mayores de 107 M-1, preferiblemente mayores de 108 M-1. Los valores intermedios de los establecidos en este documento tambien pretenden estar en el ambito de la presente divulgacion y una afinidad de union preferida puede indicarse como un intervalo de afinidades, por ejemplo, de 106 a 1010 M-1, preferiblemente de 107 a 1010 M-1, mas preferiblemente de 108 a 1010 M-1. Un anticuerpo que "no muestra una reactividad cruzada significativa" es aquel que no se unira apreciablemente a una entidad indeseable (por ejemplo, una entidad proteica indeseable). Por ejemplo, en una forma de realizacion, un anticuerpo o una porcion de union al antfgeno del mismo que se une especfficamente a la ErbB3 se unira apreciablemente a esa molecula de ErbB3 pero no reaccionara significativamente con otras moleculas de ErbB ni con otras protefnas o peptidos no ErbB. La union especffica selectiva puede determinarse segun cualquier medio reconocido en la tecnica para la determinacion de dicha union, incluyendo, por ejemplo, mediante un analisis de Scatchard y/o ensayos de union competitiva.
El termino "Kd,", segun se usa en este documento, pretende referirse a la constante de disociacion en equilibrio de una interaccion is anticuerpo-antfgeno en particular o a la afinidad de un anticuerpo por un antfgeno. En una forma de realizacion, el anticuerpo o una porcion de union al antfgeno del mismo segun la presente divulgacion se une a
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un antfgeno (por ejemplo, ErbB3) con una afinidad (Kd) de 50 nM o mejor (es decir, o menos) (por ejemplo, de 40 nM o de 30 nM o de 20 nM o de 10 nM o menos), medida mediante el uso de un ensayo de resonancia de plasmon superficial o un ensayo de union celular. En una forma de realizacion en particular, un anticuerpo o una porcion de union al antfgeno del mismo segun la presente invencion se une a la ErbB3 con una afinidad (Kd) de 8 nM o mejor (por ejemplo, de 7 nM, de 6 nM, de 5 nM, de 4 nM, de 2 nM, de 1,5 nM, de 1,4 nM, de 1,3 nM, de 1 nM o menos), medida mediante el uso de un ensayo de resonancia de plasmon superficial o un ensayo de union celular. En otras formas de realizacion, un anticuerpo o una porcion de union al antfgeno del mismo se une a un antfgeno (por ejemplo, ErbB3) con una afinidad (Kd) de aproximadamente menos de 10-7 M, tal como aproximadamente menos de 10-8 M, de 10-9 M o de 10-10 M o incluso menor cuando se determina mediante tecnologfa de resonancia de plasmon superficial (SPR) con un instrumento BIACORE 3000 usando ErbB3 recombinante como analito y el anticuerpo como ligando, y se une al antfgeno predeterminado con una afinidad que es al menos dos veces mayor que su afinidad por la union a un antfgeno no especffico (por ejemplo, BSA, casefna) distinto a la tijera predeterminado o a un antfgeno estrechamente relacionado.
El termino "Koff", segun se usa en este documento, pretende referirse a la constante de disociacion para la disociacion de un anticuerpo del complejo anticuerpo/antfgeno.
El termino "CE50", segun se usa en este documento, se refiere a la concentracion de un anticuerpo o de una porcion de union al antfgeno del mismo que induce una respuesta, tanto en un ensayo in vitro como in vivo, que es el 50% de la respuesta maxima, es decir, a mitad de camino entre la respuesta maxima y la lfnea basal.
Segun se usa en este documento, "patron de glucosilacion" se define como el patron de unidades de carbohidratos que estan unidas covalentemente a una protefna, mas especfficamente a una protefna inmunoglobulina.
El termino "natural" segun se usa en este documento aplicado a un objeto se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de un polipeptido o de un polinucleotido que esta presente en un organismo (incluyendo virus), que puede ser aislada partir de una fuente natural y que no ha sido modificada intencionalmente por el hombre en el laboratorio, es natural.
El termino "reordenado", segun se usa en este documento, se refiere a una configuracion del locus de una cadena pesada o de una cadena ligera de una inmunoglobulina en la que hay posicionado un segmento V inmediatamente adyacente a un segmento D-J o J en una conformacion que codifica esencialmente para un dominio completo de Vh o de Vl, respectivamente. El locus de un gen reordenado de una inmunoglobulina puede ser identificado mediante comparacion con el ADN de la lfnea germinal; un locus reordenado tendra al menos un elemento recombinado de homologfa heptamero/nonamero.
El termino "no reordenado" o "configuracion de la lfnea germinal", segun se usa en este documento en referencia a un segmento V, se refiere la configuracion en la que el segmento V no esta reordenado, por lo que esta inmediatamente adyacente a un segmento D o J.
El termino "molecula de acido nucleico", segun se usa en este documento, pretende incluir moleculas de ADN y moleculas de ARN. Una molecula de acido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferiblemente es ADN bicatenario.
El termino "molecula de acido nucleico aislada", segun se usa en este documento en referencia a acidos nucleicos que codifican para anticuerpos o porciones de anticuerpos (por ejemplo, Vh, Vl, CDR3) que se unen a la ErbB3, pretende referirse a una molecula de acido nucleico en la que las secuencias de nucleotidos que codifican para el anticuerpo o para una porcion de anticuerpo estan exentas de otras secuencias de nucleotidos que codifican para anticuerpos que se unan a antfgenos distintos a la ErbB3, otras secuencias que pueden flanquear de forma natural el acido nucleico en el ADN genomico humano.
El termino "modificar" o "modificacion", segun se usa en este documento, pretende referirse a la modificacion de uno o mas aminoacidos en los anticuerpos o en las porciones de union al antfgeno de los mismos. El cambio puede producirse mediante la adicion, sustitucion o delecion de un aminoacido en una o mas posiciones. El cambio puede producirse usando tecnicas conocidas, tales como mutagenesis mediante PCR. Por ejemplo, en algunas formas de realizacion, puede modificarse un anticuerpo o una porcion de union al antfgeno del mismo identificado usando los procedimientos de la divulgacion, para modificar asf la afinidad de union del anticuerpo o la funcion de union al antfgeno del mismo por la ErbB3.
La presente divulgacion tambien incluye "sustituciones conservativas de aminoacidos" en las secuencias de los anticuerpos de la divulgacion, es decir, modificaciones en las secuencias de nucleotidos y de aminoacidos que no anulan la union del anticuerpo codificado por la secuencia de nucleotidos o que contiene la secuencia de aminoacidos, al antfgeno, es decir, a la ErbB3. Las sustituciones conservativas de aminoacidos incluyen la sustitucion de un aminoacido de una clase por un aminoacido de la misma clase, donde una clase esta definida por las propiedades fisicoqufmicas comunes de la cadena lateral del aminoacido y por las elevadas frecuencias de sustitucion en protefnas homologas encontradas en la naturaleza, determinadas, por ejemplo, mediante una matriz
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de intercambio de frecuencias estandar de Dayhoff o matriz BLOSUM. Se han clasificado seis clases generales de cadenas laterales de aminoacidos, e incluyen: Clase I (Cys); Clase II (Ser, Thr, Pro, Ala, Gly); Clase III (Asn, Asp, Gln, Glu); Clase IV (His, Arg, Lys); Clase V (Ile, Leu, Val, Met); y Clase VI (Phe, Tyr, Trp). Por ejemplo, la sustitucion de un Asp por otro residuo de la clase III tal como Asn, Gln o Glu, es una sustitucion conservativa. Por lo tanto, preferiblemente se sustituye un residuo de aminoacido predicho no esencial en un anticuerpo anti-ErbB3 por otro residuo de aminoacido de la misma clase. Los procedimientos de identificacion de sustituciones conservativas de nucleotidos y de aminoacidos que no eliminan la union al antfgeno son bien conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Brummell y col., Biochem. 32: 1180 - 1187 (1993); Kobayashi y col. Protein Eng. 12(10): 879 - 884 (1999); y Burks y col. Proc. Natl. Acad Sci. EE.UU. 94: 412 - 417 (1997)).
El termino "sustitucion no conservativa de aminoacidos" se refiere a la sustitucion de un aminoacido de una clase por un aminoacido de otra clase; por ejemplo, la sustitucion de una Ala, un residuo de clase II residuo, por un residuo de clase III tal como Asp, Asn, Glu o Gln.
Alternativamente, en otra forma de realizacion, pueden introducirse mutaciones (conservativas o no conservativas) aleatoriamente a lo largo de toda o de parte de la secuencia codificante del anticuerpo anti-ErbB3, tal como mediante una mutagenesis por saturacion, y los anticuerpos anti-ErbB3 modificados resultantes pueden ser cribados para comprobar su afinidad de union.
Una "secuencia consenso" es una secuencia formada a partir de los aminoacidos (o nucleotidos) que aparecen con mas frecuencia en una familia de secuencias relacionadas (vease, por ejemplo, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania 1987). En una familia de protefnas, cada posicion en la secuencia consenso esta ocupada por el aminoacido que aparece con mas frecuencia en esa posicion en la familia. Si dos aminoacidos aparecen con la misma frecuencia, cualquiera puede ser incluido en la secuencia consenso. Un "marco consenso" de una inmunoglobulina se refiere a una region en marco en la secuencia consenso de la inmunoglobulina.
De forma analoga, la secuencia consenso de las CDRs puede ser derivada mediante la alineacion optima de las secuencias de aminoacidos de las CDR de los anticuerpos ErbB3 de la presente divulgacion.
Para los acidos nucleicos, el termino "homologfa sustancial" indica que dos acidos nucleicos, o secuencias designadas de los mismos, cuando se alinean y comparan de forma optima, son identicos, con las apropiadas inserciones o deleciones de nucleotidos, en al menos aproximadamente el 80% de los nucleotidos, habitualmente al menos aproximadamente del 90% al 95%, y mas preferiblemente al menos aproximadamente del 98% al 99,5% de los nucleotidos. Alternativamente, existe una homologfa sustancial cuando los segmentos hibridan en unas condiciones de hibridacion selectivas con la hebra complementaria.
El porcentaje de identidad entre dos secuencias es funcion del numero de posiciones identicas compartidas por las secuencias (es decir, % de homologfa = n° de posiciones identicas / n° total de posiciones x 100), teniendo en cuenta el numero de huecos, y la longitud de cada hueco, que necesitan ser introducidos para una alineacion optima de las dos secuencias. La comparacion de las secuencias y la determinacion del porcentaje de identidad entre dos secuencias pueden realizarse usando un algoritmo matematico, segun se describe en los siguientes ejemplos no limitantes.
El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleotidos puede determinarse usando el programa GAP del paquete informatico GCG, usando un NWSgapdna. Una matriz cMp y un peso del hueco de 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso de la longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleotidos o de aminoacidos tambien puede determinarse usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (CABIOS, 4: 11 - 17 (1989)) que ha sido incorporado en el programa ALIGN (version 2.0), usando una tabla de pesos de los residuos PAM120, una penalizacion por longitud del hueco de 12 y una penalizacion por hueco de 4. Ademas, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoacidos puede determinarse usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444 - 453 (1970)) que ha sido incorporado en el programa GAP del paquete informatico GCG, usando bien una matriz Blossum 62 o bien una matriz PAM250, y un peso del hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de la longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6.
Las secuencias de acidos nucleicos y de protefnas de la presente divulgacion pueden usarse adicionalmente como "secuencias interrogates" para realizar una busqueda en bases de datos publicas para identificar, por ejemplo, secuencias relacionadas. Dichas busquedas pueden realizarse usando los programas NBLAST y XBLAST (version 2.0) de Altschul, y col. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 - 10. Las busquedas de nucleotidos con BLAST pueden realizarse con el programa NBLAST, puntuacion = 100, longitud de la palabra = 12, para obtener secuencias de nucleotidos homologas de las moleculas de acidos nucleicos de la divulgacion. Las busquedas de protefnas con BLAST pueden realizarse con el programa XBLAST, puntuacion= 50, longitud de la palabra = 3, para obtener secuencias de aminoacidos homologas de las moleculas proteicas de la divulgacion. Para obtener alineaciones con huecos con fines comparativos, puede utilizarse Gapped BLAST segun se describe en Altschul y col., (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17): 3389 - 3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, pueden usarse los parametros por defecto de los respectivos programas (por ejemplo, XBLAST y NBLAST).
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Los acidos nucleicos pueden estar presentes en celulas completas, en un lisado celular o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. Un acido nucleico esta "aislado" o "se ha hecho sustancialmente puro" cuando se purifica lejos de otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otros acidos nucleicos o protefnas celulares, mediante tecnicas convencionales, incluyendo un tratamiento o alcalino/SDS, bandeo con CsCl, cromatograffa en columna, electroforesis en gel de agarosa y otros bien conocidos en la tecnica. Vease F. Ausubel, y col., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, Nueva York (1987).
Las composiciones de acidos nucleicos de la presente divulgacion, aunque a menudo estan en una secuencia natural (excepto para los sitios de restriccion modificados y similares), procedente de ADNc, genomico o mezclas de los mismos, pueden mutarse segun tecnicas convencionales para proporcionar secuencias genicas. Para las secuencias codificantes, estas mutaciones pueden afectar segun se desee a la secuencia de aminoacidos. En particular, se contemplan secuencias de ADN sustancialmente homologas de, o derivadas de, una V, D, J natural, constante, cambios y otras secuencias descritas en este documento (donde "derivada" indica que una secuencia es identica a, o esta modificada a partir de, otra secuencia).
El termino "unido operativamente" se refiere a una secuencia de acidos nucleicos ubicada en una relacion funcional con otra secuencia de acidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o lfder de secrecion esta unido operativamente al ADN de un polipeptido si se expresa como una preprotefna que participa en la secrecion de polipeptido; un promotor o un potenciador esta unido operativamente a una secuencia codificante si afecta a la transcripcion de la secuencia; o un sitio de union de ribosoma esta unido operativamente a una secuencia codificante si esta ubicado de forma que facilite la traduccion. Generalmente, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que estan unidas son contiguas, y en el caso de un lfder de secrecion, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen por que ser contiguos. La union se consigue mediante la ligacion en los sitios de restriccion convenientes. Si dichos sitios un existen, se usan los adaptadores o conectores de oligonucleotidos sinteticos segun la practica convencional. Un acido nucleico esta "unido operativamente" cuando esta ubicado en relacion funcional con otra secuencia de acidos nucleicos. Por ejemplo, un promotor o un potenciador esta unido operativamente a una secuencia codificante si afecta a la transcripcion de la secuencia. Con respecto a la transcripcion de secuencias reguladoras, unido operativamente significa que las secuencias de ADN que estan unidas son contiguas, y, donde sea necesario unir las dos regiones codificantes de protefnas, contiguas y en marco de lectura. Para las secuencias de intercambio, unidas operativamente indica que las secuencias son capaces de efectuar la recombinacion por intercambio.
El termino "vector", segun se usa en este documento, pretende referirse a una molecula de acido nucleico capaz de transportar otro acido nucleico al que ha sido unida. Un tipo de vector es un "plasmido", que se refiere a un bucle circular de ADN bicatenario en el que pueden estar ligados segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector vfrico, en el que pueden estar ligados segmentos de ADN adicionales en el genoma vfrico. Ciertos vectores son capaces de una replicacion autonoma en una celula hospedadora en la que son introducidos (por ejemplo, vectores bacterianos con un origen bacteriano de replicacion y vectores episomales de mamfferos). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episomales de mamfferos) pueden ser integrados en el genoma de una celula hospedadora tras su introduccion en la celula hospedadora, y por lo tanto son replicados junto con el genoma del hospedador. Ademas, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresion de los genes a los que estan unidos operativamente. Dichos vectores se denominan en este documento "vectores de expresion recombinantes" (o simplemente, "vectores de expresion"). En general, los vectores de expresion utiles en las tecnicas de ADN recombinante estan a menudo en forma de plasmidos. Los terminos "plasmido" y "vector" pueden usarse de forma intercambiable. Sin embargo, la divulgacion pretende incluir esas otras formas de vectores de expresion, tales como vectores vfricos (por ejemplo, retrovirus de replicacion defectuosa, adenovirus y virus adenoasociados), que tienen funciones equivalentes.
El termino "celula hospedadora recombinante" (o simplemente "celula hospedadora"), segun se usa en este documento, pretende referirse a una celula en la que se ha introducido un vector de expresion recombinante. Deberfa entenderse que dichos terminos pretenden referirse no solo a la celula en cuestion en particular, sino tambien a la progenie de dicha celula. Dado que pueden producirse ciertas modificaciones en las generaciones sucesivas debido a mutaciones o a influencias medioambientales, dicha progenie puede no ser, de hecho, identica a la celula parental, pero todavfa esta incluida en el ambito del termino "celula hospedadora" segun se usa en este documento.
Los terminos "tratar", "tratando" y "tratamiento", segun se usan en este documento, se refieren a las medidas terapeuticas o preventivas descritas en este documento. Los procedimientos de "tratamiento" emplean la administracion a un sujeto de un anticuerpo o de una porcion de union al antfgeno de la presente divulgacion, por ejemplo, a un sujeto con una enfermedad o una alteracion asociada con la senalizacion dependiente de la ErbB3 o predispuesto a padecer dicha enfermedad o alteracion, con objeto de prevenir, curar, retrasar, reducir la gravedad de, o mejorar, uno o mas sfntomas de, la enfermedad o la alteracion, o la enfermedad o la alteracion recurrente, o con objeto de prolongar la supervivencia de un sujeto mas alla de la esperada en ausencia de dicho tratamiento.
El termino "enfermedad asociada con la senalizacion dependiente de la ErbB3" o "alteracion asociada con la senalizacion dependiente de la ErbB3", segun se usa en este documento, incluye estados patologicos y/o sfntomas
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asociados con un estado patologico, donde se encuentra un aumento en los niveles de la ErbB3 y/o de la activacion de las escamas celulares que implican la ErbB3. Se entiende que la ErbB3 heterodimeriza con otras protemas ErbB tales como EGFR y ErbB2 cuando se encuentran unos niveles elevados de la ErbB3. Consecuentemente, el termino "enfermedad asociada con la senalizacion dependiente de la ErbB3" tambien incluye estados patologicos y/o smtomas asociados con estados patologicos en los que se encuentran unos niveles elevados de heterodfmeros EGFR/ErbB3 y/o de ErbB2/ErbB3. En general, el termino "enfermedad asociada con la senalizacion dependiente de la ErbB3" se refiere a cualquier alteracion cuyo inicio, progresion o persistencia de los smtomas requiere la participacion de la ErbB3. Algunos ejemplos de alteraciones mediadas por la ErbB3 incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, cancer.
Los terminos "cancer" y "canceroso" se refieren a, o describen, el estado fisiologico en mairnferos que esta caracterizado tfpicamente por un crecimiento celular desregulado. Algunos ejemplos de cancer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Algunos ejemplos mas particulares de dichos canceres incluyen carcinoma escamoso, cancer pulmonar microdtrico, cancer pulmonar no microdtrico, cancer gastrico, cancer de pancreas, tumores de las celulas gliales tales como glioblastoma y neurofibromatosis, cancer cervical, cancer de ovario, cancer de tugado, cancer de vejiga, hepatoma, cancer de mama, cancer de colon, melanoma, cancer colorrectal, carcinoma endometrial, carcinoma de las glandulas salivales, cancer de rinon, cancer renal, cancer de prostata, cancer de la vulva, cancer de tiroides, carcinoma hepatico y varios tipos de canceres de cabeza y cuello. En una forma de realizacion en particular, un cancer tratado o diagnosticado mediante el uso de los procedimientos de la presente divulgacion se elige de entre melanoma, cancer de mama, cancer de ovario, carcinoma renal, cancer gastrointestinal/de colon, cancer de pulmon y cancer de prostata.
El termino "cantidad eficaz", segun se usa en este documento, se refiere a la cantidad de un anticuerpo o de una porcion de union al antfgeno del mismo que se une a la ErbB3, que es suficiente para efectuar el tratamiento, el pronostico o el diagnostico de una enfermedad asociada con la senalizacion dependiente de la ErbB3, segun se describe en este documento, cuando se administra a un sujeto. Una cantidad terapeuticamente eficaz variara dependiendo del sujeto y del estado patologico que se va a tratar, del peso y de la edad del sujeto, de la gravedad del estado patologico, de la via de administracion y similares, que puede ser facilmente determinada por el experto habitual en la tecnica. Las dosis de administracion pueden variar desde, por ejemplo, aproximadamente 1 ng hasta aproximadamente 10.000 mg, desde aproximadamente 5 ng hasta aproximadamente 9.500 mg, desde aproximadamente 10 ng hasta aproximadamente 9.000 mg, desde aproximadamente 20 ng hasta aproximadamente 8.500 mg, desde aproximadamente 30 ng hasta aproximadamente 7.500 mg, desde aproximadamente 40 ng hasta aproximadamente 7.000 mg, desde aproximadamente 50 ng hasta aproximadamente 6,500 mg, desde
aproximadamente 100 ng hasta aproximadamente 6.000 mg, desde aproximadamente 200 ng hasta aproximadamente 5.500 mg, desde aproximadamente 300 ng hasta aproximadamente 5.000 mg, desde
aproximadamente 400 ng hasta aproximadamente 4.500 mg, desde aproximadamente 500 ng hasta aproximadamente 4.000 mg, desde aproximadamente 1 pg hasta aproximadamente 3.500 mg, desde aproximadamente 5 pg hasta aproximadamente 3.000 mg, desde aproximadamente 10 pg hasta aproximadamente 2.600 mg, desde aproximadamente 20 pg hasta aproximadamente 2.575 mg, desde aproximadamente 30 pg hasta aproximadamente 2.550 mg, desde aproximadamente 40 pg hasta aproximadamente 2.500 mg, desde
aproximadamente 50 pg hasta aproximadamente 2.475 mg, desde aproximadamente 100 pg hasta
aproximadamente 2.450 mg, desde aproximadamente 200 pg hasta aproximadamente 2.425 mg, desde
aproximadamente 300 pg hasta aproximadamente 2.000, desde aproximadamente 400 pg hasta aproximadamente 1.175 mg, desde aproximadamente 500 pg hasta aproximadamente 1.150 mg, desde aproximadamente 0,5 mg hasta aproximadamente 1.125 mg, desde aproximadamente 1 mg hasta aproximadamente 1.100 mg, desde aproximadamente 1,25 mg hasta aproximadamente 1.075 mg, desde aproximadamente 1,5 mg hasta
aproximadamente 1.050 mg, desde aproximadamente 2,0 mg hasta aproximadamente 1.025 mg, desde
aproximadamente 2,5 mg hasta aproximadamente 1.000 mg, desde aproximadamente 3,0 mg hasta aproximadamente 975 mg, desde aproximadamente 3,5 mg hasta aproximadamente 950 mg, desde
aproximadamente 4,0 mg hasta aproximadamente 925 mg, desde aproximadamente 4,5 mg hasta aproximadamente 900 mg, desde aproximadamente 5 mg hasta aproximadamente 875 mg, desde aproximadamente 10 mg hasta aproximadamente 850 mg, desde aproximadamente 20 mg hasta aproximadamente 825 mg, desde
aproximadamente 30 mg hasta aproximadamente 800 mg, desde aproximadamente 40 mg hasta aproximadamente 775 mg, desde aproximadamente 50 mg hasta aproximadamente 750 mg, desde aproximadamente 100 mg hasta aproximadamente 725 mg, desde aproximadamente 200 mg hasta aproximadamente 700 mg, desde
aproximadamente 300 mg hasta aproximadamente 675 mg, desde aproximadamente 400 mg hasta
aproximadamente 650 mg, desde aproximadamente 500 mg, o desde aproximadamente 525 mg hasta
aproximadamente 625 mg, de un anticuerpo o de una porcion de union al antfgeno del mismo, segun la divulgacion. Los regfmenes de dosificacion pueden ajustarse para proporcionar la respuesta terapeutica optima. Una cantidad eficaz es tambien aquella en la que cualquier efecto toxico o perjudicial (es decir, efectos secundarios) de un anticuerpo o de una porcion de union al antfgeno del mismo estan minimizados y/o sopesados por los efectos beneficiosos.
El termino "paciente" incluye sujetos humanos y otros mamfferos que reciben un tratamiento profilactico o terapeutico.
Segun se usa en este documento, el termino "sujeto" incluye cualquier animal humano o no humano. Por ejemplo, los procedimientos y las composiciones de la presente divulgacion pueden usarse para tratar un sujeto con cancer. En una forma de realizacion en particular, el sujeto es un ser humano. El termino "animal no humano" incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mamfferos y no mamfferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, vacas, 5 pollos, anfibios, reptiles, etc.
El termino "muestra" se refiere a tejidos, fluidos corporales o a una celula procedente de un paciente o de un sujeto. Normalmente, el tejido o la celula seran extrafdos del paciente, pero tambien se contempla un diagnostico in vivo. En el caso de un tumor solido puede tomarse una muestra de tejido de un tumor extrafdo quirurgicamente y prepararse 10 para su ensayo mediante tecnicas convencionales. En el caso de linfomas y leucemias, pueden obtenerse linfocitos, celulas leucemicas o tejidos linfaticos y prepararse. Otras muestras del paciente, incluyendo orina, lagrimas, suero, lfquido cefalorraqufdeo, heces, esputo, extractos celulares etc. tambien pueden ser utiles para algunos tumores en particular.
15 Los terminos "agente anticanceroso" y "agente antineoplasico" se refieren a farmacos usados para tratar neoplasias, tales como crecimientos cancerosos. La terapia farmacologica puede usarse sola o junto con otros tratamientos tales como cirugfa o radioterapia. Pueden usarse muchas clases de farmacos en el tratamiento del cancer, dependiendo de la naturaleza del organo implicado. Por ejemplo, los canceres de mama son habitualmente estimulados por los estrogenos, y pueden tratarse con farmacos que inactiven las hormonas sexuales. De forma similar, el cancer de 20 prostata puede tratarse con farmacos que inactiven los androgenos, la hormona sexual masculina. Los agentes antineoplasicos de la presente divulgacion incluyen, entre otros, los siguientes agentes:
Agente antineoplasico Comentarios
Anticuerpos
(a) anticuerpos distintos Anticuerpos que se unen al IGF-1R (receptor del
a los anticuerpos anti- factor de crecimiento insulinoide de tipo 1), que ErbB3; y es expresado en la superficie celular de la
mayorfa de los canceres humanos
(b) anticuerpos anti- ErbB3 que se unen a epftopos diferentes
Ejemplos
A12 (mAb completamente humanizado)
19D12 (mAb completamente humanizado)
CP751-871 (mAb completamente humanizado)
H7C10 (mAb humanizado) alfaIR3 (raton)
scFV/FC (quimera raton/humano) EM/164 (raton)
Anticuerpos que se unen al EGFR (receptor del factor de crecimiento epidermico); las mutaciones que afectan a la expresion o a la actividad del EGFR podrfan dar como resultado cancer
Matuzumab (EMD72000)
Erbitux® / Cetuximab (Imclone) Vectibix® / Panitumumab (Amgen) mAb 806
Nimotuzumab (TheraCIM)
Anticuerpos que se unen al cMET (factor de transicion mesenquimo-epitelial); un miembro de la familia MET de receptores cinasas de tirosina)
AVEO (AV299) (AVEO) AMG102 (Amgen)
5D5 (OA-5D5) (Genentech)
Moleculas pequenas dirigidas al IGF1R
NVP-AEW541-A
BMS-536.924 (1H-bencimidazol-
2-il)-1H-piridin-2-ona)
BMS-554.417
Cicloligan
TAE226
PQ401
Anticuerpos anti-ErbB3 que se unen a epftopos diferentes del IGF-1R (receptor del factor de crecimiento insulinoide de tipo 1), que es expresado en la superficie celular de la mayorfa de los canceres humanos
Ab # 14 (MM 121-14), descrito en este documento Herceptin® (Trastuzumab; Genentech)
1B4C3; 2D1D12 (U3 Pharma AG)
Agente antineoplasico
Moleculas pequenas dirigidas al EGFR
Moleculas pequenas dirigidas al cMET
Antimetabolitos
Comentarios
EGFR (receptor del factor de crecimiento epidermico); las mutaciones que afectan a la expresion o a la actividad del EGFR podrfan dar como resultado cancer
cMET (o factor de transicion mesenquimo- epitelial); un miembro de la familia MET de receptores cinasas de tirosina)
Un antimetabolito es una sustancia qufmica con una estructura similar a una sustancia (un metabolito) requerida para las reacciones bioqufmicas normales, pero lo suficientemente diferente como para interferir en las funciones normales de las celulas, incluyendo la division celular
Ejemplos
Iressa® / Gefitinib (AstraZeneca) CI-1033 (PD 183805) (Pfizer) Lapatinib (GW-572016) (GlaxoSmithKline)
Tykerb® / Lapatinib Ditosilato (SmithKline Beecham) Tarceva®/ Erlotinib hCl (OSI- 774) (OSI Pharma)
PKI-166 (Novartis)
PD-158780 EKB-569 Tyrphostin AG 1478 (4-(3- cloroanillino)-6,7- dimetoxiquinazolina)
PHA665752 ARQ 197
Flourouracilo (5-FU)
Capecitabina / XELODA® (HLR Roche)
5-Trifluorometil-2'-deoxiuridina Metotrexato sodico (Trexall) (Barr) Raltitrexed / Tomudex® (AstraZaneca) Pemetrexed / Alimta® (Lilly)
Tegafur
Arabinosido de citosina (Cytarabine, Ara-C) / Tioguanine® (GlaxoSmithKline)
5- azacitidina
6- mercaptopurina (Mercaptopurina, 6-MP) Azatioprina / Azasan® (AAIPHARMA LLC) 6-tioguanina (6-TG) / Purinethol® (TEVA) Pentostatin / Nipent® (Hospira Inc.)
Fosfato de fludarabina / Fludara® (Bayer Health Care)
Cladribina (2-CdA, 2- clorodesoxiadenosina) / Leustatin® (Ortho Biotech)
Agente antineoplasico
Agentes alquilantes
Inhibidores de la topoisomerasa
Comentarios
Un agente antineoplasico alquilante es un agente alquilante que une un grupo alquilo al ADN. Dado que las celulas cancerosas generalmente proliferan sin restriccion mas que las celulas sanas, son mas sensibles a las lesiones en el ADN, y los agentes alquilantes se usan clfnicamente para tratar diversos tumores
Los inhibidores de la topoisomerasa son agentes quimioterapeuticos disenados para interferir en la accion de las enzimas topoisomerasas (topoisomerasa I y II), que son enzimas que controlan los cambios en la estructura del ADN catalizando la ruptura y la union de nuevo del esqueleto de fosfodiester de las hebras de ADN durante el ciclo celular normal.
Ejemplos
Inhibidor de la Reductasa de Ribonucleotidos (RNR) Ciclofosfamida / Cytoxan (BMS) Neosar (TEVA)
Ifosfamida /Mitoxana® (ASTA Medica)
Tiotepa (Bedford, Abraxis, Teva) BCNU^ 1,3-bis(2-cloroetil)-1- nitosourea
CCNU^ 1,-(2-cloroetil)-3- ciclohexil-1-nitrosourea (metil CCNU)
Hexametilmelamina (Altretamina, HMM) / Hexalen® (MGI Pharma Inc.)
Busulfan / Myleran (GlaxoSmithKline) Procarbazina HCL /
Procarbazina HCL /
Matulane (Sigma Tau Pharmaceuticals, Inc.) Dacarbazina (DTIC)
Clorambucilo / Leukaran® (SmithKline Beecham)
Melfalano / Alkeran® (GlaxoSmithKline) Cisplatino (Cisplatino, CDDP) /
Platinol (Bristol Myers) Carboplatino / Paraplatino (BMS) Oxaliplatino / Eloxitan® (Sanofi- Aventis US)
Doxorrubicina HCL / Doxil® (Alza) Citrato de daunorrubicina / Daunoxome®
(Gilead)
Mitoxantrona HCL/Novantrona (EMD Serono)
Actinomicina D Etoposido / Vepesid® (BMS)/ Etopophos® (Hospira, Bedford, Teva Parenteral, Etc.)
Topotecan HCL / Hycamtin® (GtaxoSmithKline)
Teniposido (VM-26) / Vumon® (BMS)
Irinotecan HCL(CPT-11) / Camptosar® (Pharmacia & Upjohn)
Agente antineoplasico
Agentes dirigidos a los microtubulos
Inhibidores de cinasas
Inhibidores de la sfntesis de protefnas
Agentes
inmunoterapeuticos
Comentarios
Los microtubulos son uno de los componentes del citoesqueleto. Tienen un diametro de ~24 nm y la longitud varfa desde varios micrometros hasta posiblemente mm en los axones de las neuronas nerviosas. Los microtubulos sirven como componentes estructurales dentro de la celula y estan implicados en muchos procesos celulares incluyendo la mitosis, la citocinesis y el transporte vesicular.
Las cinasas de tirosina son enzimas internas de la celula que funcionan uniendo grupos fosfato al aminoacido tirosina. Bloqueando la capacidad de funcionamiento de las cinasas de tirosina, estos compuestos proporcionan una herramienta para controlar el crecimiento celular canceroso.
Inducen la apoptosis celular
Ejemplos
Vincristina / Oncovin® (Lilly) Sulfato de vinblastina /Velban®) (suspendido) (Lilly)
Tartrato de vinorelbina / Navelbine®
(PierreFabre)
Sulfato de vindesina / Eldisine® (Lilly)
Paclitaxel / Taxol® (BMS) Docetaxel / Taxotere® (Sanofi Aventis US)
Paclitaxel nanoparticulado (ABI- 007) /
Abraxane® (Abraxis BioScience, Inc.)
Ixabepilona / IXEMPRA™ (BMS) Mesilato de imatinib / Gleevec (Novartis)
Malato de sunitinib / Sutent® (Pfizer)
Tosilato de sorafenib / Nexavar® (Bayer)
Clorhidrato de Nilotinib monohidratado / Tasigna® (Novartis)
L-asparraginasa / Elspar® (Merck & Co.)
Permiten que los pacientes con cancer muestren Interferon alfa
una respuesta inmunitaria Inhibidor de la angiogenesis /
Avastin®
(Genentech)
IL-2 — Interleucina 2 (Aldesleukin) /
Proleukin ® (Chiron)
IL-12—^ Interleucina 12
Agente antineoplasico
Hormonas
Exemestano / Aromasin® (Pharmacia & Upjohn)
Acetato de leuprolida / Eligard®
(QTL
EE.UU.)
Lupron® (TAP Pharm.)
Acetato de goserrelina / Zoladex® (AstraZeneca)
Pamoato de triptorrelina / Trelstar®
(Watson Labs)
Buserelin / Suprefact® (Sanofi Aventis)
Nafarrelina
Cetrorelix / Cetrotide® (EMD Serono)
Bicalutamida / Casodex® (AstraZeneca)
Nilutamida / Nilandron® (Aventis Pharm.)
Acetato de megestrol / Megace® (BMS)
Analogos de somatostatina (acetato de octreotida / Sandostatin® (Novartis))
Comentarios
Las terapias hormonales asociadas con la menopausia y el envejecimiento buscan incrementar la cantidad de ciertas hormonas en el cuerpo para compensar la terapia hormonal relacionada con la edad o con una enfermedad, ya que el tratamiento del cancer reduce el nivel de algunas hormonas especfficas o altera la capacidad del cancer de usar estas hormonas para crecer y diseminarse
Ejemplos
Citrato de toremifeno / Fareston® (GTX, Inc.)
Fulvestrant / Faslodex® (AstraZeneca)
Raloxifeno HCL / Evista® (Lilly) Anastrazol / Arimidex® (AstraZeneca)
Letrozol / Femara® (Novartis) Fadrozol (CGS16949A)
Glucocorticoides
Farmacos antinflamatorios usados para reducir la Predinsolona tumefaccion que provoca el dolor canceroso. Dexametasona / Decadron®
(Wyeth)
Inhibidores de la aromatasa
Inhibidores de la mTOR
Incluye imidazoles
Ketoconazol
La via de senalizacion de la mTOR fue descubierta originalmente durante los estudios del agente inmunosupresor rapamicina. Esta via altamente conservada regula la proliferacion celular y el metabolismo en respuesta a factores medioambientales, la senalizacion tras la union al receptor del factor de crecimiento celular a traves de la fosfoinosftido-3-cinasa (PI-3K) para el crecimiento y la proliferacion celulares, y la angiogenesis.
Sirolimus (Rapamycin) / Rapamune® (Wyeth) Temsirolimus (CCI-779) / Torisel® (Wyeth)
Deforolimus (AP23573) (Ariad Pharm.)
Everolimus (RAD001) / Certican® (Novartis)
Agentes
quimioterapeuticos
Adriamicina, 5-Fluorouracilo, Citoxina, Bleomicina, Mitomicina C, Daunomicina, Carminomicina, Aminopterina, Dactinomicina, Mitomicinas, Esperamicinas
Pueden administrarse uno o mas agentes antineoplasicos, bien simultaneamente o bien antes o despues de la administracion de un anticuerpo o de una porcion de union al antfgeno del mismo de la presente invencion.
5 En las siguientes subsecciones se describen con mas detalle varios aspectos de la invencion.
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II. Procedimientos para producir los anticuerpos
(i) Anticuerpos monoclonales
Los anticuerpos monoclonales de la invencion pueden producirse mediante el uso de varias tecnicas conocidas, tales como la tecnica de hibridacion celular somatica estandar descrita por Kohler y Milstein (1975) Nature 256: 495, la transformacion vfrica u oncogenica de linfocitos B o tecnicas de expresion de fagos usando genotecas de genes de anticuerpos humanos. En algunas formas de realizacion en particular, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales completamente humanos.
Consecuentemente, en una forma de realizacion, se usa un procedimiento con hibridoma para producir un anticuerpo que se une a la ErbB3. En este procedimiento, puede inmunizarse un raton u otro animal hospedador apropiado con un antfgeno adecuado con objeto de estimular los linfocitos para que produzcan, o sean capaces de producir, anticuerpos que se uniran especfficamente al antfgeno usado para la inmunizacion. Alternativamente, los linfocitos pueden ser inmunizados in vitro. Despues los linfocitos pueden fusionarse a celulas de mieloma usando un agente de fusion adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una celula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pags. 59 - 103 (Academic Press, 1986)). El medio de cultivo en el que estan creciendo las celulas del hibridoma se ensaya para comprobar la produccion de los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antfgeno. Una vez identificadas las celulas de hibridoma que producen los anticuerpos con la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones pueden ser subclonados mediante procedimientos de dilucion limitante y crecidos mediante procedimientos estandar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pags. 59 - 103 (Academic Press, 1986)). Algunos medios de cultivo adecuados para este proposito incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Ademas, las celulas de hibridoma pueden crecer in vivo como tumores de ascitis en un animal. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones pueden ser separados del medio de cultivo, del fluido de ascitis o del suero mediante procedimientos de purificacion de inmunoglobulinas convencionales tales como, por ejemplo, protefna A-Sepharose, cromatograffa de hidroxilapatito, electroforesis en gel, dialisis o cromatograffa de afinidad.
En otra forma de realizacion, los anticuerpos y las porciones de anticuerpo que se unen a la ErbB3 pueden ser aislados a partir de genotecas de fagos de anticuerpos generadas usando las tecnicas descritas, por ejemplo, en McCafferty y col., Nature, 348: 552 - 554 (1990). Clackson y col., Nature, 352: 624 - 628 (1991), Marks y col., J. Mol. Biol., 222: 581 - 597 (1991) y Hoet y col (2005) Nature Biotechnology 23, 344 - 348; en las patentes de EE.UU. Nos 5.223.409; 5.403.484; y 5.571.698 a favor de Ladner y col.; en las patentes de EE.UU. Nos 5.427.908 y 5.580.717 a favor de Dower y col.; en las patentes de EE.UU. Nos 5.969.108 y 6.172.197 a favor de McCafferty y col.; y en las patentes de EE.UU. Nos 5.885.793; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915 y 6.593.081 a favor de Griffiths y col. Adicionalmente, tambien pueden usarse para la produccion de anticuerpos humanos de elevada afinidad (intervalo nM) las transposiciones de cadena (Marks y col., Bio/Technology, 10: 779 - 783 (1992)), asf como la infeccion combinatoria y la recombinacion in vivo como una estrategia para la construccion de genotecas de fagos muy grandes (Waterhouse y col., Nuc. Acids. Res., 21: 2265 - 2266 (1993)).
En una forma de realizacion en particular, el anticuerpo monoclonal o una porcion de union al antfgeno del mismo que se une a la ErbB3 se produce mediante el uso de la tecnica de expresion de fagos descrita por Hoet y col., supra. Esta tecnica implica la generacion de una genoteca de Fab humanos con una unica combinacion de secuencias de inmunoglobulinas aisladas a partir de donantes humanos y que genera una diversidad sintetica en las CDRs de la cadena pesada. Despues, la genoteca se criba para comprobar los Fabs que se unen a la ErbB3.
En otra forma de realizacion mas, pueden generarse anticuerpos monoclonales dirigidos contra la ErbB3 mediante el uso de ratones transgenicos o transcromosomicos portadores de partes de un sistema inmunitario humano en lugar del sistema inmunitario del raton (vease, por ejemplo, Lonberg, y col. (1994) Nature 368 (6474): 856 - 859; Lonberg, N. y col. (1994), supra; revisado en Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49 - 101; Lonberg, N. y Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65 - 93, y Harding, F. y Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad Sci. 764: 536 - 546. Veanse adicionalmente, las patentes de EE.UU. Nos 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; y 5.770.429; todas a favor de Lonberg y Kay; y la patente de EE.UU. N° 5.545.807 a favor de Surani y col.; Las publicaciones PCT Nos WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 y WO 99/45962, todas a favor de Lonberg y Kay; y la publicacion PCT N° WO 01/14424 a favor de Korman y col.).
En otra forma de realizacion, los anticuerpos humanos de la divulgacion pueden crearse usando un raton que porte secuencias de inmunoglobulinas humanas en transgenes y transcromosomas, tal como un raton que porta un transgen de una cadena pesada humana y un transcromosoma de una cadena ligera humana (vease, por ejemplo, la publicacion PCT WO 02/43478 a favor de Ishida y col.).
Aun ademas, en la tecnica hay disponibles sistemas animales transgenicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulinas humanas y que pueden usarse para generar anticuerpos anti-ErbB3 de la divulgacion. Por ejemplo, puede usarse un sistema transgenico alternativo denominado Xenomouse (Abgenix, Inc.); dichos ratones se describen, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. Nos 5.939.598; 6.075.181; 6.114.598; 6.150.584 y 6.162.963 a
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favor de Kucherlapati y col.
Ademas, en la tecnica hay disponibles sistemas animales transcromosomicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulinas humanas, y que pueden usarse para crear anticuerpos anti-ErbB3 de la divulgacion. Por ejemplo, pueden usarse ratones portadores tanto de un transcromosoma de una cadena pesada humana como un transcromosoma de una cadena ligera humana; segun describen Tomizuka y col. (2000) Proc. Natl. Acad Sci. EE.UU. 97: 722 - 727. Adicionalmente, en la tecnica se han descrito vacas portadoras de transcromosomas con la cadena pesada y ligera (Kuroiwa y col. (2002) Nature Biotechnology 20: 889 - 894) y pueden usarse para generar los anticuerpos anti-ErbB3 de la divulgacion.
En otra forma de realizacion mas, los anticuerpos de la presente divulgacion pueden prepararse usando un vegetal transgenico y/o celulas vegetales cultivadas (tales como, por ejemplo, tabaco, mafz y lentejas de agua) que producen dichos anticuerpos. Por ejemplo, pueden usarse las hojas de tabaco transgenico que expresan los anticuerpos o las porciones de union al antfgeno de los mismos para producir dichos anticuerpos, por ejemplo, mediante el uso de un promotor inducible (vease, por ejemplo, Cramer y col., Curr. Top. Microbol. Immunol. 240: 95 118 (1999)). Tambien puede usarse mafz transgenico para expresar dichos anticuerpos y porciones de union al antfgeno de los mismos (vease, por ejemplo, Hood y col., Adv. Exp. Med Biol. 464: 127 147 (1999)). Los anticuerpos tambien pueden ser producidos en grandes cantidades a partir de semillas de plantas transgenicas que incluyen porciones del anticuerpo, tales como anticuerpos de cadena individual (scFv's), por ejemplo, mediante el uso de semillas de tabaco y tuberculos de patata (vease, por ejemplo, Conrad y col., Plant Mol. Biol. 38: 101 109 (1998)). Los procedimientos para la produccion de anticuerpos o de porciones de union al antfgeno en plantas tambien pueden encontrarse, por ejemplo, en Fischer y col., Biotechnol. Appl. Biochem. 30: 99 108 (1999), Ma y col., Trends Biotechnol. 13: 522 7 (1995); Ma y col., Plant Physiol. 109: 341 6 (1995); Whitelam y col., Biochem. Soc. Trans. 22: 940 944 (1994) y en las patentes de EE.UU. Nos 6.040.498 y 6.815.184.
La especificidad de union de los anticuerpos monoclonales o de las porciones de los mismos que se unen a la ErbB3 preparados mediante el uso de cualquier tecnica, incluyendo las desveladas en este documento, puede ser determinada mediante inmunoprecipitacion o mediante un ensayo de union in vitro, tal como un radioinmunoensayo (RIA) o un ensayo de enzimoinmunoadsorcion (ELISA). La afinidad de union de un anticuerpo monoclonal o de una porcion del mismo tambien puede ser determinada mediante el analisis de Scatchard de Munson y col., Anal. Biochem., 107: 220 (1980).
En ciertas formas de realizacion, un anticuerpo ErbB3 o una porcion del mismo producido mediante el uso de cualquiera de los procedimientos analizados anteriormente, puede ser adicionalmente alterado u optimizado para conseguir una especificidad y/o una afinidad de union deseadas usando tecnicas reconocidas en la tecnica, tales como las descritas en este documento.
En una forma de realizacion, pueden usarse secuencias parciales de anticuerpo derivadas de un antfgeno ErbB3 para producir anticuerpos relacionados estructural y funcionalmente. Por ejemplo, los anticuerpos que interactuan con los antfgenos objetivo predominantemente a traves de los residuos de aminoacidos que estan ubicados en las seis regiones determinantes de complementariedad (CRs) de la cadena pesada y ligera. Por esta razon, las secuencias de aminoacidos de las CDRs son mas diversas entre los anticuerpos individuales que en las secuencias externas de las CDRs. Debido a que las secuencias de las CDR son responsables de la mayorfa de las interacciones anticuerpo-antfgeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que simulen las propiedades de anticuerpos especfficos naturales mediante la construccion de vectores de expresion que incluyan las secuencias de las CDR a partir de anticuerpos naturales especfficos injertadas en las secuencias en marco procedentes de un anticuerpo diferente con propiedades diferentes (vease, por ejemplo, Riechmann, L. y col., 1998, Nature 332: 323 - 327; Jones, P. y col., 1986, Nature 321: 522 - 525; y Queen, C. y col., 1989, Proc. Natl. Acad See. EE.UU. 86: 10029 - 10033). Dichas secuencias en marco pueden obtenerse a partir de bases de datos de ADN publicas que incluyen las secuencias genicas del anticuerpo de la lfnea germinal.
Por lo tanto, pueden usarse una o mas caracterfsticas estructurales de un anticuerpo anti-ErbB3 de la divulgacion, tales como las CDRs, para crear anticuerpos anti-ErbB3 estructuralmente relacionados que conserven al menos una propiedad funcional de los anticuerpos de la divulgacion, por ejemplo, inhibir la fosforilacion mediada por ligando de tipo EGF de la ErbB3; inhibir una o mas de la senalizacion mediada por herregulina, epirregulina, epigenina o birregulina hasta la ErbB3; inhibir la proliferacion o las celulas que expresan la ErbB3; y/o disminuir los niveles de la ErbB3 en las superficies celulares.
En una forma de realizacion en particular, se combinan recombinantemente una o mas regiones CDR elegidas de entre las ID SEC Nos 7 - 12, las ID SEC Nos: 13 - 18, las ID SEC Nos: 19 - 24, las ID SEC Nos: 39 - 44, y las ID SEC Nos: 45 - 50 con regiones en marco y CDRs humanas conocidas para crear mediante ingenierfa genetica anticuerpos adicionales anti-ErbB3 de la divulgacion. Las regiones en marco variables de la cadena pesada y ligera pueden derivar de la misma o de diferentes secuencias de anticuerpos.
Es bien conocido en la tecnica que los dominios de las CDR3 en las cadenas pesada y ligera del anticuerpo juegan un papel particularmente importante en la especificidad/afinidad de union de un anticuerpo por un antfgeno (vease,
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Hall y col., J. Imunol., 149: 1605 - 1612 (1992); Polymenis y col., J. Immunol., 152: 5318 - 5329 (1994); Jahn y col., Immunobiol., 193: 400 - 419 (1995); Klimka y col., Brit. J. Cancer, 83: 252 - 260 (2000); Beiboer y col., J. Mol. Biol, 296: 833 - 849 (2000); Rader y col., Proc. Natl. Acad Sci. EE.UU., 95: 8910 - 8915 (1998); Barbas y col., J. Am. Chem. Soc., 116: 2161 - 2162 (1994); Ditzel y col., J. Immunol., 157: 739 - 749 (1996)). Consecuentemente, en ciertas formas de realizacion, se generan anticuerpos que incluyen las CDR3s de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos en particular descritos en este documento (por ejemplo, las ID SEC Nos: 9, 15, 21, 41, 47 y/o las ID SEC Nos: 12, 18, 24, 44, 50). Los anticuerpos pueden incluir adicionalmente las CDR1 y/o las CDR2s de las cadenas pesada y/o ligera de los anticuerpos de la presente divulgacion (por ejemplo, las ID SEC Nos: 7 - 8 y/o las ID SEC Nos: 10 - 11; las ID SEC Nos: 13 - 14 y/o las ID SEC Nos: 16 - 17; las ID SEC Nos: 20 - 21 y/o las ID SEC Nos: 22 - 23; las ID SEC Nos: 39 - 40 y/o las ID SEC Nos: 42 - 43; o las ID SEC Nos: 45 - 46 y/o las ID SEC Nos: 48 - 49).
Las regiones CDR1, 2 y/o 3 de los anticuerpos modificados geneticamente descritos anteriormente pueden comprender la(s) secuencia(s) de aminoacido(s) exacta(s) tales como las desveladas en este documento (por ejemplo, las CDRs del Ab #6, del Ab #3, del Ab #14, del Ab #17 o del Ab #19, establecidas en las ID SEC Nos: 7 - 12, 13 - 18, 19 - 24, 39 - 44 y 45 - 50, respectivamente). Sin embargo, el artesano con la pericia habitual apreciara que puede ser posible alguna desviacion de las secuencias exactas de las CDR conservando aun la capacidad del anticuerpo de unirse eficazmente a la ErbB3 (por ejemplo, sustituciones conservativas de aminoacidos). Consecuentemente, en otra forma de realizacion, el anticuerpo modificado geneticamente puede estar formado por una o mas CDRs que son, por ejemplo, identicas en el 90%, el 95%, el 98%, el 99% o el 99,5% a una o mas CDRs del Ab #6, del Ab #3 o del Ab #14.
En otra forma de realizacion, pueden alterarse uno o mas residuos de una CDR para modificar la union para conseguir una tasa de union mas favorable. Usando esta estrategia puede conseguirse un anticuerpo con una afinidad de union ultra alta de, por ejemplo, 1010 M-1 o mas. Las tecnicas de maduracion por afinidad, bien conocidas en la tecnica, y las descritas en este documento, pueden usarse para alterar la (s) region(es) de la(s) CDR seguido del cribado para comprobar que las moleculas resultantes tienen el cambio deseado en la afinidad de union. Consecuentemente, dado que las CDR(s) estan alteradas, los cambios en la afinidad de union asf como en la inmunogenicidad, pueden ser monitorizados y puntuados, de forma que se consiguen anticuerpos optimizados para la mejor combinacion de union y baja inmunogenicidad.
Ademas, o en lugar, de las modificaciones en las CDRs, tambien pueden realizarse modificaciones en una o mas de las regiones en marco, FR1, FR2, FR3 y FR4, de las regiones variables de la cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo, siempre que estas modificaciones no eliminen la afinidad de union del anticuerpo.
En otra forma de realizacion, el anticuerpo es adicionalmente modificado con respecto a la funcion efectora, de forma que se potencia la eficacia del anticuerpo en el tratamiento del cancer, por ejemplo. Por ejemplo, puede(n) introducirse un(os) residuo(s) de cistefna en la region Fc, permitiendo asf la formacion de puentes de disulfuro entre cadenas en esta region. El anticuerpo homodimerico asf generado puede tener una capacidad de internalizacion mejorada y/o una destruccion celular mediada por el complemento aumentada y una citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo aumentada (ADCC). Veanse Caron y col., J. Exp Med. 176: 1191 - 1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol. 148: 2918 - 2922 (1992). Tambien pueden prepararse anticuerpos homodimericos con una actividad antitumoral mejorada usando reticuladores heterobifuncionales segun se describe en Wolff y col. Cancer Research 53: 2560 - 2565 (1993). Alternativamente, un anticuerpo puede ser modificado geneticamente para que tenga regiones Fc dobles y pueda tener por lo tanto unas capacidades mejoradas de lisis del complemento y de ADCC. Vease Stevenson y col. Anti-Cancer Drug Design 3: 219 - 230 (1989).
La presente divulgacion tambien engloba anticuerpos biespecfficos e inmunoconjugados, segun se analiza a continuacion.
(ii) Anticuerpos biespecfficos
Los anticuerpos biespecfficos de la presente divulgacion incluyen al menos una especificidad de union para la ErbB3 y al menos una especificidad de union para otro antfgeno, tal como el producto de un oncogen. Los anticuerpos biespecfficos pueden prepararse como anticuerpos completos o como fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos F(ab')2 biespecfficos).
Los procedimientos para la elaboracion de anticuerpos biespecfficos son bien conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, el documento WO 05117973 y el documento WO 06091209). Por ejemplo, la produccion de anticuerpos biespecfficos completos puede basarse en la coexpresion de dos pares de cadenas pesada - ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas tienen diferentes especificidades (vease, por ejemplo, Millstein y col., Nature, 305: 537 - 539 (1983)). Los detalles adicionales sobre la generacion de anticuerpos biespecfficos pueden encontrarse, por ejemplo, en Suresh y col., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986) y en Brennan y col., Science, 229: 81 (1985), que describe un proceso de union qufmica para la elaboracion de anticuerpos biespecfficos. Tambien se han descrito varias tecnicas para la elaboracion y el aislamiento de fragmentos de anticuerpos biespecfficos directamente a partir de cultivos celulares recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos
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biespecfficos usando cremalleras de leucina (vease, por ejemplo, Kostelny y col., J. Immunol., 148 (5): 1547 - 1553 (1992)). Tambien se ha informado de otra estrategia para la elaboracion de fragmentos de anticuerpos biespecfficos mediante el uso de dfmeros de Fv de cadena individual (sFv) (vease, por ejemplo, Gruber y col., J. Immunol., 152: 5368 (1994)).
En una forma de realizacion en particular, el anticuerpo biespecffico comprende un primer anticuerpo o porcion de union del mismo que se une a la ErbB3 y un segundo anticuerpo o porcion de union del mismo que se une a la ErbB2, ERbB3, ErbB4, EGFR, IGF1-R, C-MET, Lewis Y, MUC-1, EpCAM, CA125, antfgeno prostatico especffico de membrana, PDGFR-a, PDGFR-p, C-KIT o cualquiera de los receptores del FGF.
(iii) Inmunoconjugados
Los inmunoconjugados de la presente divulgacion pueden formarse mediante la conjugacion de los anticuerpos o de las porciones de union al antfgeno de los mismos descritos en este documento con otro agente terapeutico. Algunos agentes adecuados incluyen, por ejemplo, un agente citotoxico (por ejemplo, un agente quimioterapeutico), una toxina (por ejemplo, una toxina activa enzimaticamente de origen bacteriano, fungico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma) y/o un isotopo radiactivo (es decir, un radioconjugado). Los agentes quimioterapeuticos utiles en la generacion de dichos inmunoconjugados se han descrito anteriormente. Las toxinas activas enzimaticamente y los fragmentos de la misma que pueden usarse incluyen la cadena A de la difteria, fragmentos activos de no union de la toxina difterica, la cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de la ricina, la cadena A de la abrina, la cadena A de la modeccina, alfa-sarcina, protefnas de Aleurites fordii, protefnas de diantina, protefnas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Hay disponible una variedad de radionuclidos para la produccion de anticuerpos anti-ErbB3 radioconjugados. Algunos ejemplos incluyen 212 Bi, 131 I, 131 In, 90Y y 186 Re.
Los inmunoconjugados de la divulgacion pueden elaborarse usando una variedad de agentes de acoplamiento de protefnas bifuncionales tales como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoesteres (tales como adipimidato de dimetilo, HCL), esteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehfdos (tales como glutareldehfdo), compuestos de bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoilo) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de tolieno) y compuestos de fluor biactivo (tal como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, puede prepararse una inmunotoxina de ricino segun se describe en Vitetta y col., Science 238: 1098 (1987). El acido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminapentaacetico marcado con Carbono-14 (MX-DTPA) es un ejemplo de un agente quelante para la conjugacion de un radionucleotido al anticuerpo (vease, por ejemplo, el documento WO94/11026)
III. Procedimientos para el cribado de los anticuerpos
Subsiguientemente a la produccion de los anticuerpos o de las porciones de union al antfgeno que se unen a la ErbB3, dichos anticuerpos, o las porciones de los mismos, pueden ser cribados para comprobar sus diversas propiedades, tales como las descritas en este documento, usando una variedad ensayos que son bien conocidos en la tecnica.
En una forma de realizacion, los anticuerpos o las porciones de union al antfgeno de los mismos son cribados para comprobar su capacidad para inhibir la fosforilacion mediada por ligando de tipo EGF de la ErbB3. Esto puede realizarse tratando las celulas que expresan la ErbB3 con un ligando de tipo eGf en presencia y en ausencia del anticuerpo o de una porcion de union al antfgeno del mismo. Despues las celulas pueden ser lisadas y los lisados en bruto pueden centrifugarse para eliminar el material insoluble. La fosforilacion de la ErbB3 puede medirse, por ejemplo, mediante inmunotransferencia Western seguida de un sondeado con un anticuerpo anti-fosfotirosina segun se describe en Kim y col., supra, y en los siguientes Ejemplos.
En otras formas de realizacion, los anticuerpos y las porciones de union al antfgeno de los mismos son cribados para comprobar una o mas de las siguientes propiedades: (1) la inhibicion de la senalizacion mediada por ligando de la ErbB3 (por ejemplo, herregulina, epirregulina, epigenina o birregulina) hasta la ErbB3; (2) la inhibicion de la proliferacion de las celulas que expresan la ErbB3; (3) la capacidad para disminuir los niveles de la ErbB3 en la superficie celular (por ejemplo, induciendo la internalizacion de la ErbB3), (4) la inhibicion de la secrecion del VEGF por las celulas que expresan la ErbB3; (5) la inhibicion de la migracion de las celulas que expresan la ErbB3; (6) la inhibicion del crecimiento esferoidal de las celulas que expresan la ErbB3; y/o (7) la union a un epftopo ubicado en el dominio I de la ErbB3, cada una de las cuales puede medirse facilmente usando tecnicas reconocidas en la tecnica y aquellas analizadas en este documento.
La inhibicion de una o mas de la senalizacion mediada por herregulina, epirregulina, epigenina o birregulina hasta la ErbB3 puede medirse facilmente usando ensayos rutinarios, tales como los descritos en Horst y col. supra. Por ejemplo, la capacidad de un anticuerpo o de una porcion de union al antfgeno del mismo para inhibir la senalizacion mediada por herregulina, epirregulina, epigenina o birregulina hasta la ErbB3 puede medirse mediante ensayos de
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cinasa para sustratos conocidos de la ErbB3 tales como, por ejemplo, SHC y PI3K, segun se describe, por ejemplo, en Horst y col. supra, Sudo y col., (2000) Methods Enzymol, 322: 388 - 92; y Morgan y col. (1990) Eur. J. Biochem., 191: 761 - 767, tras la estimulacion por una o mas de herregulina, epirregulina, epigenina o birregulina. Consecuentemente, las celulas que expresan la ErbB3 pueden ser estimuladas con una o mas de herregulina, epirregulina, epigenina o birregulina, E incubadas con candidato a anticuerpo o una porcion de union al antfgeno del mismo. Los lisados celulares preparados subsiguientemente a partir de dichas celulas pueden ser inmunoprecipitados con un anticuerpo para un sustrato de la ErbB3 (o una protefna en una via celular que implica la ErbB3) tal como, por ejemplo, un anticuerpo anti-JNK-1, y ensayarse para comprobar la actividad de cinasa (por ejemplo, la actividad de cinasa de JNK o la actividad de cinasa de PI3) usando tecnicas reconocidas en la tecnica. Una disminucion o una desaparicion completan en el nivel o en la actividad (por ejemplo, en la actividad de cinasa) de un sustrato una protefna de la ErbB3 en una via que implica la ErbB3 en presencia del anticuerpo o de una porcion de union al antfgeno del mismo, con respecto al nivel o la actividad en ausencia del anticuerpo o de una porcion de union al antfgeno del mismo, es indicativa de que un anticuerpo o una porcion de union al antfgeno inhibe una o mas de la senalizacion mediada por herregulina, epirregulina, epigenina o birregulina.
En ciertas formas de realizacion, el anticuerpo o una porcion de union al antfgeno del mismo inhibe la senalizacion mediada por ligando (por ejemplo, herregulina, epirregulina, epigenina o birregulina) de la ErbB3 disminuyendo la union de una o mas de herregulina, epirregulina, epigenina o birregulina a la ERbB3.
Con objeto de seleccionar aquellos anticuerpos o porciones de union al antfgeno de los mismos que inhiben la union de una o mas de herregulina, epirregulina, epigenina o birregulina a la ErbB3, pueden ponerse en contacto celulas que expresan la ErbB3 (por ejemplo, celulas MALME-3M, segun se describe en los Ejemplos, infra), con un ligando marcado de la ErbB3 (por ejemplo, herregulina, epirregulina, epigenina o birregulina radiomarcada) en ausencia (control) o en presencia del anticuerpo anti-ErbB3 o de una porcion de union al antfgeno del mismo. Si el anticuerpo o una porcion de union al antfgeno del mismo inhibe la union de herregulina, de epirregulina, de epigenina o de birregulina a la ErbB3, entonces se observara una disminucion estadfsticamente significativa en la cantidad de marcador recuperado (por ejemplo, de herregulina, epirregulina, epigenina o birregulina radiomarcada) con respecto a la cantidad en ausencia del anticuerpo o de una porcion de union al antfgeno del mismo.
El anticuerpo o una porcion de union al antfgeno del mismo puede inhibir la union del ligando de la ErbB3 (por ejemplo, herregulina, epirregulina, epigenina o birregulina) mediante cualquier mecanismo. Por ejemplo, el anticuerpo o una porcion de union al antfgeno del mismo puede inhibir la union del ligando de la ErbB3 (por ejemplo, una o mas de herregulina, epirregulina, epigenina o birregulina) a la ErbB3 uniendose al mismo sitio o a un sitio superpuesto en la ErbB3 como ligando de la ErbB3. Alternativamente, el anticuerpo o una porcion de union al antfgeno del mismo puede inhibir la union de un ligando de la ErbB3 alterando o distorsionando la conformacion de la ErbB3, de forma que sea incapaz de unirse al ligando de la ErbB3.
Los anticuerpos y las porciones de union al antfgeno de los mismos que disminuyen los niveles de la ErbB3 en la superficie de las celulas pueden identificarse por su capacidad para regular por disminucion la ErbB3 en las celulas tumorales. En ciertas formas de realizacion, los anticuerpos o las porciones de union al antfgeno de los mismos disminuyen la expresion en la superficie celular en la celula de la ErbB3 induciendo la internalizacion (o aumentando la endocitosis) de la Erbb3. Para comprobar esto puede biotinilarse la ErbB3 y determinarse facilmente el numero de moleculas de ErbB3 en la superficie celular, por ejemplo, midiendo la cantidad de biotina en una monocapa de celulas en cultivo en presencia o en ausencia de un anticuerpo o de una porcion de union al antfgeno del mismo, por ejemplo, segun se describe, por ejemplo, en Waterman y col., J. Biol. Chem. (1998), 273: 13819 - 27, seguido de la inmunoprecipitacion de la ErbB3 y el sondeo con estreptavidina. Una disminucion en la deteccion de ErbB3 biotinilada con el tiempo en presencia de un anticuerpo o de una porcion de union al antfgeno es indicativa de que el anticuerpo disminuye los niveles de la ErbB3 en la superficie celular.
Los anticuerpos o las porciones de union al antfgeno de los mismos de la presente divulgacion tambien pueden ensayarse para comprobar su capacidad para inhibir la proliferacion de celulas que expresan la ErbB3, por ejemplo, celulas tumorales, usando tecnicas reconocidas en la tecnica, tales como el ensayo Cell Titer Glow descrito en los siguientes Ejemplos (vease tambien, por ejemplo, Macallan y col., Proc. Natl. Acad Sci. (1998) 20; 95 (2): 708 - 13; Perez y col. (1995) Cancer Research 55, 392 - 398).
En otra forma de realizacion, los anticuerpos o las porciones de union al antfgeno de los mismos son cribados para comprobar su capacidad para inhibir la secrecion del VEGF en celulas que expresan la ErbB3. Esto puede realizarse mediante el uso de ensayos bien conocidos, tales como el kit de ELISA del VEGF disponible en R&D Systems (Minneapolis, MN, numero de catalogo DY293B). De forma analoga, los anticuerpos o las porciones de union al antfgeno de los mismos pueden ser cribados para comprobar su capacidad para inhibir la migracion de las celulas que expresan la ErbB3 (por ejemplo, celulas MCF-7) usando un ensayo transpocillo (Millipore Corp., Billerica, MA, numero de catalogo ECM552) segun se describe en este documento.
En otra forma de realizacion, los anticuerpos o las porciones de union al antfgeno de los mismos son cribados para comprobar su capacidad para inhibir el crecimiento esferoidal de las celulas que expresan la ErbB3. Esto puede realizarse mediante el uso de un ensayo que se aproxima a las condiciones de desarrollo de crecimiento tumoral
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(vease, por ejemplo, Herman y col. (2007) Journal of Biomolecular Screening Electronic publication) segun se describe en este documento.
Los anticuerpos o las porciones de union al antfgeno de los mismos que se unen al mismo epftopo o a uno solapante como uno o mas anticuerpos de la presente divulgacion tambien pueden identificarse usando tecnicas convencionales conocidas en la tecnica y descritas en este documento. Por ejemplo, con objeto de cribar los anticuerpos que se unen al mismo epftopo o a uno solapante en la ErbB3 unida a un anticuerpo de interes, puede realizarse un ensayo de bloqueo cruzado, tal como el descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lane (1988).
IV. Composiciones farmaceuticas
En otro aspecto, la presente invencion proporciona una composicion, por ejemplo, una composicion farmaceutica, que contiene uno, o una combinacion, de anticuerpos monoclonales, o de porciones de union al antfgeno de los mismos, de la presente invencion, formulados junto con un portador farmaceuticamente aceptable. En una forma de realizacion, las composiciones incluyen una combinacion de multiples (por ejemplo, dos o mas) anticuerpos aislados de la divulgacion, que se unen a diferentes epftopos de la ErbB3.
Segun se usa en este documento, "portador farmaceuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersion, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y retardadores de la absorcion, y similares, que sean fisiologicamente compatibles. Preferiblemente, el portador es adecuado para la administracion por via intravenosa, intramuscular, subcutanea, parenteral, espinal o epidermica (por ejemplo, mediante inyeccion o infusion). Dependiendo de la via de administracion, el compuesto activo, es decir, el anticuerpo, la molecula biespecffica y multiespecffica, puede esta recubierto con un material para proteger el compuesto del accion de los acidos y de otras condiciones naturales que puedan inactivar el compuesto.
Una "sal farmaceuticamente aceptable" se refiere a una sal que conserva la actividad biologica deseada del compuesto parental y no imparte ningun efecto toxicologico indeseado (vease, por ejemplo, Berge, S.M., y col. (1977) J. Pharm. Sci. 66: 1 - 19). Algunos ejemplos de dichas sales incluyen sales de adicion acida y sales de adicion basica. Algunas sales de adicion acida incluyen aquellas obtenidas a partir de acidos inorganicos no toxicos, tales como clorhfdrico, nftrico, fosforico, sulfurico, bromhfdrico, yodhfdrico, fosforoso y similares, asf como a partir de acidos organicos no toxicos tales como acidos alifaticos mono y dicarboxflicos, acidos alcanoicos fenilsustituidos, acidos hidroxialcanoicos, acidos aromaticos, acidos alifaticos y acidos aromaticos sulfonicos, y similares. Algunas sales de adicion basica que incluyen aquellas obtenidas a partir de metales alcalinoterreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio, y similares, asf como a partir de aminas organicas no toxicas, tales como N,N'- dibenciletilenodiamina, N-metilglucamina, cloroprocafna, colina, dietanolamina, etilenodiamina, procafna y similares.
Las composiciones farmaceuticas de la invencion pueden administrarse solas o en una terapia de combinacion, es decir, combinadas con otros agentes. Por ejemplo, la terapia de combinacion puede incluir una composicion de la presente invencion con al menos uno o mas agentes terapeuticos adicionales, tales como los agentes antineoplasicos descritos infra. Las composiciones farmaceuticas de la divulgacion tambien pueden administrarse junto con radioterapia y/o cirugfa.
Una composicion de la presente divulgacion puede administrarse mediante varios procedimientos conocidos en la tecnica. Como apreciara el artesano experto, la via y/o el modo de administracion variaran dependiendo de los resultados deseados. Los compuestos activos pueden prepararse con portadores que protegeran al compuesto frente a una liberacion rapida, tales como una formulacion de liberacion controlada, incluyendo implantes, parches transdermicos y sistemas de administracion microencapsulados. Pueden usarse polfmeros biodegradables y biocompatibles tales como acetato de etilenvinilo, polianhfdridos, acido poliglicolico, colageno, poliortoesteres y acido polilactico. Hay muchos procedimientos para la preparacion de dichas formulaciones que estan patentados o son generalmente conocidos por los expertos en la tecnica. Vease, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.
Para administrar un compuesto de la divulgacion a traves de ciertas vfas de administracion, puede ser necesario recubrir el compuesto, o coadministrar el compuesto, con un material para evitar su inactivacion. Por ejemplo, el compuesto puede administrarse a un sujeto en un portador apropiado, por ejemplo, en liposomas o en un diluyente. Algunos diluyentes farmaceuticamente aceptables incluyen disolucion salina y disoluciones acuosas tamponadas. Los liposomas incluyen emulsiones de agua en aceite CGF asf como los liposomas convencionales (Strejan y col. (1984) J. Neuroimmunol. 7: 27).
Algunos portadores farmaceuticamente aceptables incluyen disoluciones o dispersiones acuosas esteriles y polvos esteriles para la preparacion extemporanea de disoluciones o de dispersiones inyectables esteriles. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmaceuticamente activas es conocido en la tecnica. Excepto cuando cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso de los mismos en las composiciones farmaceuticas de la divulgacion. Tambien pueden incorporarse compuestos activos complementarios en la composicion.
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Las composiciones terapeuticas deben ser tfpicamente esteriles y estables en las condiciones de elaboracion y de almacenamiento. La composicion puede formularse como una disolucion, una microemulsion, un liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una elevada concentracion de farmaco. El portador puede ser un disolvente o un medio de dispersion que contenga, por ejemplo, agua, etanol, un poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol lfquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de partfcula requerido en el caso de una dispersion y mediante el uso de tensioactivos. En muchos casos sera preferible incluir agentes de isotonicidad, por ejemplo, azucares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro sodico en la composicion. La absorcion prolongada de las composiciones inyectables puede conseguirse incluyendo en la composicion un agente que retrase la absorcion, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.
Las disoluciones inyectables esteriles pueden prepararse incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinacion de los ingredientes enumerados anteriormente, segun se requiera, seguido de una esterilizacion por microfiltracion. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehfculo esteril que contiene un medio de dispersion basico y los otros ingredientes requeridos de entre los enumerados anteriormente. En el caso de polvos esteriles para la preparacion de disoluciones inyectables esteriles, los procedimientos de preparacion preferidos son secado a vacfo y liofilizacion, que producen un polvo del principio activo mas cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una disolucion previamente filtrada esteril de los mismos.
Los regfmenes de dosificacion se ajustan para proporcionar la respuesta deseada optima (por ejemplo, una respuesta terapeutica). Por ejemplo, puede administrarse un unico bolo, pueden administrarse varias dosis divididas en el tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente segun indiquen las exigencias de la situacion terapeutica. Por ejemplo, los anticuerpos humanos de la divulgacion pueden administrarse una o dos veces por semana mediante inyeccion subcutanea o una o dos veces al mes mediante inyeccion subcutanea.
Es especialmente ventajoso formular las composiciones parenterales en formas de dosificacion unitaria para facilitar la administracion y la uniformidad de la dosis. Una forma de dosificacion unitaria, segun se usa en este documento, se refiere a unidades ffsicamente individuales adecuadas como dosis unitarias para los sujetos que se van a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada del compuesto activo calculada para producir el efecto terapeutico deseado en asociacion con el portador farmaceutico requerido. La especificacion de las formas de dosificacion unitarias de la divulgacion vendra dictada por, y sera directamente dependiente, de (a) las caracterfsticas unicas del compuesto activo y el efecto terapeutico en particular que se va a conseguir, y (b) las limitaciones inherentes a la tecnica de combinar dicho compuesto activo para el tratamiento de individuos susceptibles.
Algunos ejemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, tales como acido ascorbico, clorhidrato de cistefna, bisulfato sodico, metabisulfito sodico, sulfito sodico, y similares; (2) antioxidantes liposolubles, tales como palmitato de ascorbilo, butilhidroxianisol (BHA), butilhidroxitolueno (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol, y similares; y (3) agentes quelantes de metales, tales como acido cftrico, acido etilendiaminotetraacetico (EDTA), sorbitol, acido tartarico, acido fosforico, y similares.
Para las composiciones terapeuticas, las formulaciones de la presente divulgacion incluyen aquellas adecuadas para su administracion por via oral, nasal, topica (incluyendo bucal y sublingual), rectal, vaginal y/o parenteral. Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en formas de dosificacion unitaria, y pueden prepararse mediante cualquier procedimiento conocido en la tecnica farmaceutica. La cantidad de principio activo que puede combinarse con un material portador para producir una forma de dosificacion individual variara dependiendo del sujeto que se va a tratar y del modo de administracion en particular. La cantidad de principio activo que puede combinarse con un material portador para producir una forma de dosificacion individual sera generalmente aquella cantidad de la composicion que produzca un efecto terapeutico. Generalmente, de un cien por ciento, esta cantidad variara entre aproximadamente el 0,001 por ciento hasta aproximadamente el noventa por ciento de principio activo, preferiblemente desde aproximadamente el 0,005 por ciento hasta aproximadamente el 70 por ciento, lo mas preferiblemente desde aproximadamente el 0,01 por ciento hasta aproximadamente el 30 por ciento.
Las formulaciones de la presente divulgacion que son adecuadas para su administracion por via vaginal tambien incluyen ovulos vaginales, tampones, cremas, geles, pastas, formulaciones en espuma o en aerosol que contienen portadores tales como los conocidos en la tecnica por ser apropiados. Las formas de dosificacion para la administracion topica o transdermica de las composiciones de esta divulgacion incluyen polvos, aerosoles, unguentos, pastas, cremas, lociones, geles, disoluciones, parches e inhalantes. El compuesto activo puede mezclarse en condiciones esteriles con un portador farmaceuticamente aceptable, y con cualquier conservante, tampon o propelente que pueda ser necesario.
Las frases "administracion parenteral" y "administrado por via parenteral", segun se usan en este documento, significan modos de administracion distintos a la administracion enteral y topica, habitualmente mediante inyeccion, e incluyen, sin limitacion, la inyeccion y la infusion intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradermica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutanea, subcuticular, intraarticular,
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subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal.
Algunos ejemplos de portadores acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmaceuticas de la divulgacion incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y esteres organicos inyectables, tales como oleato de etilo. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento tales como lecitina, manteniendo el tamano de partfcula requerido en el caso de las dispersiones, y mediante el uso de tensioactivos.
Estas composiciones tambien pueden contener coadyuvantes tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. Algunos ejemplos particulares de coadyuvantes que son bien conocidos en la tecnica incluyen, por ejemplo, coadyuvantes inorganicos (tales como sales de aluminio, por ejemplo, fosfato de aluminio e hidroxido de aluminio), coadyuvantes organicos (por ejemplo, escualeno), coadyuvantes de base oleosa, virosomas (por ejemplo, virosomas que contienen hemaglutinina unida a membrana y neuraminidasa derivada del virus de la gripe).
La prevencion de la presencia de microorganismos puede asegurarse tanto mediante procedimientos de esterilizacion, supra, como mediante la inclusion de varios agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, acido sorbico, y similares. Tambien puede ser deseable incluir en las composiciones agentes de isotonicidad, tales como azucares, cloruro sodico, y similares. Ademas, la absorcion prolongada de la forma farmaceutica inyectable puede conseguirse mediante la inclusion de agentes que retrasen la absorcion, tales como monoestearato de aluminio y gelatina.
Cuando los compuestos de la presente divulgacion se administran como productos farmaceuticos, a seres humanos y animales, pueden proporcionarse solos o como una composicion farmaceutica que contiene, por ejemplo, del 0,001 al 90% (mas preferiblemente, del 0,005 al 70%, tal como del 0,01 al 30%) de principio activo junto con un portador farmaceuticamente aceptable.
Independientemente de la via de administracion elegida, los compuestos de la presente divulgacion, que pueden usarse en una forma hidratada adecuada, y/o las composiciones farmaceuticas de la presente divulgacion, estan formulados en formas de dosificacion farmaceuticamente aceptables mediante procedimientos convencionales conocidos por los expertos en la tecnica.
Los niveles de dosis reales de los principios activos en las composiciones farmaceuticas de la presente divulgacion pueden variarse para obtener una cantidad de principio activo que sea eficaz para conseguir la respuesta terapeutica deseada para un paciente, una composicion y un modo de administracion en particular, sin que sea toxico para el paciente. El nivel de dosis elegido dependera de varios factores farmacocineticos que incluyen la actividad de las composiciones en particular de la presente divulgacion empleadas, o del ester, la sal o la amida de las mismas, de la via de administracion, del tiempo de administracion, de la tasa de excrecion del compuesto en particular que se esta empleando, de la duracion del tratamiento, de otros farmacos, compuestos y/o materiales usados junto con las composiciones empleadas en particular, de la edad, el sexo, el peso, el estado, la salud general y los antecedentes medicos del paciente que se esta tratando, y factores similares bien conocidos en la ciencia medica. Un medico o un veterinario experto habitual en la tecnica pueden determinar facilmente y prescribir la cantidad eficaz requerida de la composicion farmaceutica. Por ejemplo, el medico o el veterinario podrfan iniciar las dosis de los compuestos de la divulgacion empleados en la composicion farmaceutica a unos niveles menores de los requeridos con objeto de conseguir el efecto terapeutico deseado, y aumentar gradualmente la dosis hasta que se consigue el efecto deseado. En general, una dosis diaria adecuada de una composicion de la divulgacion sera aquella cantidad del compuesto que sea la menor dosis eficaz para producir un efecto terapeutico. Dicha dosis eficaz generalmente dependera de los factores descritos anteriormente. Se prefiere que la administracion sea intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutanea, administrandose preferiblemente en una zona proxima al sitio del objetivo. Si se desea, la dosis diaria eficaz de una composicion terapeutica puede administrarse como dos, tres, cuatro, cinco, seis o mas subdosis administradas por separado en los intervalos apropiados a lo largo del dfa, opcionalmente, en formas de dosificacion unitaria. Mientras sea posible administrar un compuesto de la presente divulgacion solo, es preferible administrar el compuesto como una formulacion (composicion) farmaceutica.
Las composiciones terapeuticas pueden administrarse con dispositivos medicos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, en una forma de realizacion preferida, una composicion terapeutica de la divulgacion puede administrarse con un dispositivo de inyeccion hipodermico sin aguja, tales como los dispositivos desvelados en las Patentes de EE.UU. Nos 5.399.163, 5.383.851, 5.312.335, 5.064.413, 4.941.880, 4.790.824 o 4.596.556. Algunos ejemplos de implantes y modulos conocidos utiles en la presente divulgacion incluyen: la Patente de EE.UU. N° 4.487.603, que desvela una bomba de microinfusion implantable para la dispensacion de medicacion a una velocidad controlada; la Patente de EE.UU. N° 4.486.194, que desvela un dispositivo terapeutico para la administracion de medicacion a traves de la piel; la Patente de EE.UU. N°. 4.447.233, que desvela una bomba de infusion de medicacion para la administracion de medicacion a una velocidad de infusion precisa; la Patente de EE.UU. N° 4.447.224, que desvela un aparato de infusion implantable de flujo variable para la administracion continua de un farmaco; la Patente de EE.UU. N° 4.439.196, que desvela un sistema osmotico de administracion de farmacos con varios compartimentos multicamara; y la Patente de EE.UU. N° 4.475.196, que desvela un sistema osmotico de administracion de farmacos.
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Los expertos en la tecnica conoceran otros muchos de dichos implantes, sistemas de administracion y modulos.
En ciertas formas de realizacion, los anticuerpos monoclonales de la divulgacion pueden formularse para asegurar su adecuada distribucion in vivo. Por ejemplo, la barrera hematoencefalica (BBB) excluye muchos compuestos altamente hidrofilos. Para asegurar que los compuestos terapeuticos de la divulgacion atraviesan la barrera hematoencefalica (si se desea), pueden formularse, por ejemplo, en liposomas. Para los procedimientos de elaboracion de liposomas, veanse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. 4.522.811; 5.374.548; y 5.399,331. Los liposomas pueden comprender una o varias fracciones que son transportadas selectivamente a celulas u organos especfficos, mejorando asf la administracion dirigida de farmacos (vease, por ejemplo, V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29: 685). Algunos ejemplos de fracciones dirigidas incluyen folato o biotina (vease, por ejemplo, la Patente de EE.UU. 5.416.016 a favor de Low y col.); manosidos (Umezawa y col., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038); anticuerpos (P. G. Bloeman y col. (1995) FEBS Lett. 357: 140; M. Owais y col. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180); el receptor de la protefna tensioactiva A (Briscoe y col. (1995) Am. J. Physiol. 1233: 134), diferentes especies de los cuales pueden comprender las formulaciones de la divulgacion, asf como componentes de las moleculas inventadas; pag. 120 (Schreier y col. (1994) J. Biol. Chem. 269: 9090); vease tambien K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FeBs Lett. 346: 123; J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4: 273.
V. Procedimientos de uso de los anticuerpos de la divulgacion
La presente divulgacion tambien proporciona procedimientos de uso de los anticuerpos y de las porciones de union al antfgeno de los mismos que se unen a la ErbB3, en una variedad de aplicaciones diagnosticas y terapeuticas ex vivo e in vivo. Por ejemplo, los anticuerpos de la divulgacion pueden usarse para tratar una enfermedad asociada con la senalizacion dependiente de la ErbB3, incluyendo varios tipos de cancer.
En una forma de realizacion, la presente divulgacion proporciona un procedimiento para tratar una enfermedad asociada con la senalizacion dependiente de la ErbB3 mediante la administracion a un sujeto de un anticuerpo o de una porcion de union al antfgeno del mismo de la divulgacion en una cantidad eficaz para tratar la enfermedad. Algunas enfermedades adecuadas incluyen, por ejemplo, varios tipos de canceres que incluyen, pero no se limitan a, melanoma, cancer de mama, cancer de ovario, carcinoma renal, cancer gastrointestinal, cancer de colon, cancer de pulmon y cancer de prostata.
El anticuerpo puede administrarse solo o con otro agente terapeutico que actua, junto o sinergicamente, con el anticuerpo para tratar la enfermedad asociada con la senalizacion mediada por la ErbB3. Dichos agentes terapeuticos incluyen, por ejemplo, los agentes antineoplasicos descritos infra (por ejemplo, citotoxinas, agentes quimioterapeuticos, moleculas pequenas y radiacion).
En otra forma de realizacion, la presente divulgacion proporciona un procedimiento para diagnosticar una enfermedad (por ejemplo, un cancer) asociada con la regulacion por incremento de la ErbB3 en un sujeto, poniendo en contacto los anticuerpos o las porciones de union al antfgeno de la divulgacion (por ejemplo, ex vivo o in vivo) con celulas procedentes del sujeto, y midiendo el nivel de union de la ErbB3 a las celulas. Unos niveles anormalmente elevados de union a la ErbB3 indican que el sujeto tiene una enfermedad relacionada con la regulacion por incremento de la ErbB3.
Tambien, en el ambito de la presente divulgacion hay kits que comprenden anticuerpos y porciones de union al antfgeno de los mismos de la divulgacion que opcionalmente incluyen instrucciones para su uso en el tratamiento o en el diagnostico de una enfermedad asociada con la regulacion por incremento de la ErbB3 y/o con la senalizacion dependiente de la ErbB3. Los kits pueden incluir una etiqueta que indique el uso previsto del contenido del kit. El termino etiqueta incluye cualquier inscripcion, material de publicidad o material registrado suministrado en o con el kit, o que acompane de otro modo al kit.
Otras formas de realizacion de la presente divulgacion se describen en los siguientes Ejemplos.
La presente invencion se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos.
Ejemplos
Materiales y procedimientos
A lo largo de los ejemplos se usaron los siguientes materiales y procedimientos salvo que se indique de otro modo.
En general, la practica de la presente divulgacion emplea, salvo que se indique de otro modo, tecnicas convencionales de qufmica, biologfa molecular, tecnologfa de ADN recombinante, inmunologfa (especialmente, por ejemplo, tecnologfa de anticuerpos) y tecnicas convencionales de preparacion de polipeptidos. Veanse, por ejemplo, Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y
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col., C.S.H.L. Press, Pub. (1999); y Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel y col., John Wiley & Sons (1992). Se describen sistemas modelo in vitro e in vivo para ensayar la biologfa del HCV, por ejemplo, en Cell culture models and animal models of viral hepatitis. Parte II: hepatitis C Lab. Anim. (NY); 34 (2): 39 - 47 (2005) y en The chimpanzee model of hepatitis C virus infections, ILAR J.; 42 (2): 117 - 26 (2001).
Lineas celulares
Todas las lineas celulares usadas en los experimented descritos a continuacion se obtuvieron en el National Cancer Institute o fueron proporcionadas por los investigadores, segun se indica.
Lineas celulares:
MCF7- ATCC numero de catalogo HTB-22 T47D- ATCC numero de catalogo HTB-133
Colo357- estas celulas se obtuvieron a partir de un investigador academico y son descritas por Kolb y col. (2006) Int. J. Cancer, 120: 514 - 523.
Du 145- ATCC numero de catalogo HTB-81
OVCAR8- la fuente ya se ha descrito en la solicitud provisional.
H1975 ATCC numero de catalogo CRL-5908
Pulverizacion de las celulas tumorales
Se uso un criopulverizador (Covaris Inc) para la pulverizacion de los tumores. Los tumores se almacenaron en bolsas especiales (pesadas previamente antes de la adicion del tumor) y se colocaron en nitrogeno lfquido durante su manipulacion. Para los tumores pequenos se anadieron en primer lugar 200 pl de tampon de lisis a la bolsa que contenfa el tumor, se congelo en nitrogeno lfquido y despues se pulverizo para mejorar la recuperacion del tumor a partir de la bolsa. Los tumores pulverizados se transfirieron a tubos de Eppendorf de 2 ml y se colocaron en nitrogeno lfquido hasta que estuvieron listos para su procesado adicional.
Lisis de las celulas tumorales
Los tumores fueron lisados en tampon de lisis complementado con inhibidores de la proteasa y de la fosfatasa. El tampon de lisis se anadio a las alfcuotas tumorales hasta una concentracion final de aproximadamente 62,5 mg/ml. Las muestras tumorales fueron homogeneizadas mediante agitacion con vortex durante 30 s y una incubacion en hielo durante aproximadamente 30 min. Los lisados fueron rotados durante aproximadamente 10 min en columnas Qiashredder de Qiagen para una homogeneizacion adicional de las muestras. Los lisados clarificados se colocaron en alfcuotas en tubos nuevos para su tratamiento adicional.
Ensayo de BCA
Se realizo un ensayo de BCA (Pierce) siguiendo el protocolo del fabricante en todas las muestras tumorales. La concentracion proteica total (en mg/ml) de cada muestra tumoral se uso posteriormente en la normalizacion de los resultados del ELISA.
Ensayo de ELISA
Todos los reactivos del ELISA para los ELISAs total y de fosfo-ErbB3 se adquirieron en R&D Systems como kits Duoset. Se recubrieron placas de 96 pocillos Nunc Maxisorb con 50 pl de un anticuerpo y se incubaron durante una noche a temperatura ambiente. A la manana siguiente las placas se lavaron 3 veces con 1000 pl/pocillo en el lavador de placas BioTek con PBST (0,05% de Tween-20). Las placas fueron subsiguientemente bloqueadas durante aproximadamente 1 h a temperatura ambiente con un 2% de BSA en PBS. Las placas se lavaron 3 veces con 1000 pl/pocillo en el lavador de placas BioTek con PBST (0,05% de Tween-20). Se diluyeron 50 pl de los lisados celulares y los estandares en un 50% de tampon de lisis y se uso un 1% de BSA en los duplicados para un tratamiento adicional. Las muestras se incubaron durante 2 h a 4°C en un agitador de placas y se lavaron 3 veces con 1000 pl/pocillo en el lavador de placas BioTek con PBST (0,05% de Tween-20). Se diluyeron aproximadamente 50 pl de un anticuerpo de deteccion en un 2% de BSA, se anadio PBST y se incubo durante aproximadamente 1 h a temperatura ambiente. Para la deteccion de la fosfor-ErbB3, el anticuerpo se conjugo directamente con peroxidasa de rabano picante (HRP) y se incubo durante 2 h a temperatura ambiente. La placa se lavo 3 veces con 1000 pl/pocillo en el lavador de placas BioTek con PBST (0,05% deTween-20). Se anadieron aproximadamente 50 pl de estreptavidina-HRP y se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente (excepto para la pErbB3). Las placas se lavaron 3 veces con 1000 pl/pocillo en el lavador de placas BioTek con PBST (0,05% de Tween-20). Se anadieron aproximadamente 50 pl de sustrato Supersignal Pico ELISA y la placa se leyo usando un lector de placas Fusion. Los datos fueron analizados mediante el uso de EXCEL. Las muestras por duplicado se promediaron y las barras de error se usaron para representar la desviacion estandar entre los dos replicados.
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Ejemplo 1: produccion de los anticuerpos usando expresion de faaos
Con objeto de obtener anticuerpos anti-ErbB3 humanos, denominados en este documento Ab #6, Ab #3, Ab #14, Ab #17 y Ab #19, inicialmente se cribo una genoteca de fagos Fab humana que inclufa una combinacion unica de secuencias de inmunoglobulinas obtenidas a partir de donantes humanos (Hoet y col. supra) para comprobar los ligandos de la ErbB3.
Usando una ErbB3 purificada y una linea de celulas de ovario de hamster chino que expresan la ErbB3 en la superficie celular, se identificaron 73 secuencias unicas de Fab a partir de la genoteca. Estos 73 clones se reformatearon despues como Fab solo, sin el fago. Usando procedimientos de alto rendimiento, estos Fabs fueron expresados a pequena escala y ensayados para comprobar su union mediante el uso de ELISA y el procedimiento Flexchip, que es una tecnologfa de resonancia de plasmon superficial (SPR) de alto rendimiento. Los 73 Fabs sin el fago se motearon en la superficie de un chip y se midio la cinetica de union y el bloqueo del epftopo a una protefna de fusion objetivo ErbB3-his o a una protefna ErbB3-Fc (R & D Systems). La constante de union en equilibrio y las velocidades de asociacion/disociacion para los Fabs se calcularon a partir de los datos obtenidos.
A continuacion se examino la union de varios Fabs a celulas MALME-3M usando aproximadamente 500 nM de los Fabs y una dilucion 1:750 de un anticuerpo secundario de cabra anti-humano Alexa 647. Segun se muestra en las Figuras 1A y 1B, muchos de los Fabs candidatos mostraron una tincion apreciable de las celulas MALME-3M.
Ejemplo 2: optimizacion de los Fabs anti-ErbB3
Subsiguientemente a la identificacion de los Fabs que bloqueaban la union del ligando de la ErbB3, la herregulina, a la ErbB3, se optimizaron los codones de las secuencias VH y VL de los Fabs como sigue.
Especfficamente, se reformatearon las regiones VH y VL usando constructos de expresion para la expresion como un isotipo de IgG1 o de IgG2. Los constructos inclufan un esqueleto de Selexis que tiene un casete disenado para la sustitucion de las apropiadas secuencias de la cadena pesada y ligera. Los vectores Selexis inclufan un promotor de CMV y una senal compatible de poli-A.
Las secuencias de acidos nucleicos para los codones optimizados de las VH y VL del Ab #6 se establecen en las ID SEC Nos: 25 y 26, respectivamente, y las del Ab #3 se establecen en las iD SEC Nos: 27 y 28, respectivamente, segun se muestra en la Figura 22.
Ejemplo 3: afinidad de union por la ErbB3
Las constantes de disociacion de los anticuerpos anti-ErbB3 se midieron usando dos tecnicas independientes, es decir, un ensayo de resonancia de plasmon superficial y un ensayo de union celular usando celulas MALME-3M.
Ensayo de resonancia de plasmon superficial
El ensayo de resonancia de plasma un superficial (tambien denominado ensayo Flexchip) se realizo segun se describe en Wassaf y col. (2006) Analytical Biochem., 351: 241 - 253. El valor de la Kd se calculo basandose en la formula Kd = Kd/Ka.
Los valores de la Kd de los Ab #6 y Ab #3, respectivamente, medidos mediante el uso del ensayo de resonancia de plasmon superficial, se representan en las Figuras 2A y 2B. El Ab #6 tenia un valor de la Kd de aproximadamente 4 nM y el Ab #3 tenia un valor de la Kd de aproximadamente 8 nM, segun se representa en las Figuras 2A y 2B, respectivamente.
Ensayo de union celular
El ensayo de union celular para la determinacion de los valores de la Kd de los Ab #6 y Ab #3 se realizo como sigue.
Se desprendieron celulas MALME-3M con 2 ml de tripsina-EDTA + 2 ml de RMPI + EDTA 5 mM a temperatura ambiente durante 5 minutos. Inmediatamente se anadio RPMI completo (10 ml) a las celulas tripsinizadas, se resuspendieron suavemente y se rotaron en una centrffuga de sobremesa Beckman a 1.100 rpm durante 5 minutos. Las celulas se resuspendieron en tampon de tincion BD (PBS + 2% de suero bovino fetal + 0,1% de azida sodica, Becton Dickinson) a una concentracion de 2 x 106 celulas por ml y se colocaron en placas alfcuotas de 50 pl (1 x 105 celulas) en una placa de titulacion de 96 pocillos.
Se preparo una disolucion de 150 pl de anticuerpo anti-ErbB3 200 nM (el Ab #6 o el Ab #3) en tampon de tincion BD en un tubo de eppendorf y se diluyo sucesivamente dos veces en 75 pl de tampon de tincion BD. Las concentraciones del anticuerpo diluido variaban entre 200 nM y 0,4 nM. Despues se anadieron directamente alfcuotas de 50 pl de las diferentes disoluciones de protefnas a los 50 pl de la suspension de celulas, dando unas concentraciones finales de 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12 nM, 6 nM, 3 nM, 1,5 nM, 0,8 nM, 0,4 nM y 0,2 nM del
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anticuerpo.
Las celulas alicuotadas en la placa de 96 pocillos se incubaron con las diluciones de protefnas durante 30 minutos a temperature ambiente en un agitador de plataforma y se lavaron 3 veces con 300 pl de tampon de tincion BD. Despues las celulas se incubaron con 100 pl de una dilucion 1:750 de IgG de cabra anti-humana marcada con Alexa 647 en tampon de tincion BD durante 45 minutos en un agitador de plataforma en la habitacion frfa. Finalmente, las celulas se lavaron dos veces, se sedimentaron y se resuspendieron en 250 pl de tampon de tincion BD + 0,5 pg/ ml de yoduro de propidio. El analisis de 10.000 celulas se realizo con un citometro de flujo FACScalibur usando el canal FL4. Los valores de MFI y las correspondientes concentraciones de los anticuerpos anti-ErbB3 se representaron en el eje y, y en el eje x, respectivamente. La Kd de la molecula se determino mediante GraphPad Prism usando el modelo de union de sitio unico para una curva de regresion no lineal.
El valor de la Kd se calculo basandose en la formula Y = Bmax* X / Kd + X (Bmax = fluorescencia en la saturacion. X = concentracion del anticuerpo. Y = grado de union). Segun se muestra en las Figuras 2C y 2D, los Ab # 6 y Ab #3 tenfan unos valores de Kd de aproximadamente 4 nM y 1,3 nM, respectivamente, en un ensayo de union celular usando celulas MALME-3M.
Ejemplo 4: especificidad de union / union del epitopo para la ErbB3
La especificidad de union de un isotipo de la IgG2 del Ab #6 a la ErbB3 se ensayo usando un ELISA como sigue. Tambien se analizo la identificacion del epitopo unido por el Ab #6.
Especificamente, se recubrieron placas de 96 pocillos Nunc Maxisorb con 50 pl de 5 pg/ml de proteina (ErbB3 humana recombinante, EGFR humano recombinante o una proteina no relacionada (BSA)) y se incubaron durante una noche a temperatura ambiente. A la manana siguiente las placas se lavaron 3 veces con 1000 pl/pocillo de PBST (0,05% de Tween-20) en el lavador de placas BioTek. Los pocillos se bloquearon durante 1 h a temperatura ambiente con un 2% de BSA en PBS. Las placas se lavaron 3 veces con 1000 pl/pocillo de PBST (0,05% de Tween- 20) en el lavador de placas BioTek. Se anadieron aproximadamente 50 pl de los lisados celulares y los estandares en un 50% de tampon de lisis y se uso un 1% de BSA en los duplicados para un tratamiento adicional. Las muestras se incubaron durante 2 h a 4°C en un agitador de placas y se lavaron 3 veces con 1000 pl/pocillo en el lavador de placas BioTek con PBST (0,05% de Tween-20). Se anadieron aproximadamente 50 pl de Ab #6 a varias diluciones (1 pM y diluciones seriadas dos veces) en un 2% de BSA, PBST. Todas las muestras se analizaron por duplicado y se incubaron durante 2 h a 4°C en un agitador de placas. Las placas se lavaron 3 veces con 1000 pl/pocillo de PBST (0,05% deTween-20) en el lavador de placas BioTek. Se anadieron 50 pl de anticuerpo de deteccion de IgG humana (conjugado de HRP (Bethyl Inc; dilucion de 1:75000 en un 2% de BSA, PBST)) y las placas se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. Las placas se lavaron 3 veces con 1000 pl/pocillo de PBST (0,05% de Tween-20) en el lavador de placas BioTek.
Segun se muestra en la Figura 3, el Ab #6 se unio a la ErbB3 recombinante en un ELISA, pero no mostro ninguna union apreciable a EGFR, BSA o TGF-a.
Se clono un fragmento (mutante de truncamiento) correspondiente a los residuos de aminoacidos 20 - 202 de la ErbB3 en el vector de expresion de levadura pYD2 (una version modificada de pYD1 (Invitrogen) con un codon de detencion disenado frente a la etiqueta de His) entre los sitios de restriccion Nhe y BsiWI. El plasmido se transformo en la cepa de levadura EBY100 (Invitrogen) y los clones que contenfan el plasmido se seleccionaron en medio selectivo de Trp-. El clon se hizo crecer en un medio que contenfa glucosa durante una noche a 30°C y se indujo la expresion del mutante de truncamiento de la ErbB3 mediante la transferencia a un medio que contiene galactosa durante 2 dfas a 18°C. Las levaduras que mostraban el mutante de truncamiento de ErbB3 se tineron 50 nM de Ab #6, seguido de un anticuerpo de cabra anti-humano marcado con colorante Alexa-647. Una muestra por separado se tino con el anticuerpo de cabra anti-humano unicamente para demostrar que no hay union no especffica a la levadura por parte del anticuerpo secundario. El analisis se realizo mediante citometrfa de flujo en el clasificador celular FACS Calibur (BD Biosciences).
Segun se muestra en la Figura 30, el Ab #6 se unio al mutante de truncamiento, es decir, a los residuos de aminoacidos 20 - 202 de la ErbB3.
Ejemplo 5: regulacion por disminucion de la ErbB3 total en celulas tumorales
Se ensayo la capacidad del Ab #6 para regular por disminucion la expresion de la ErbB3 tanto in vitro como in vivo en celulas tumorales, como sigue.
Las celulas MALME-3M se sembraron en placas de cultivo tisular de 96 pocillos y se hicieron crecer en medio RPMI- 1640 complementado con antibioticos, L-glutamina 2 mM y un 10% de suero bovino fetal (FBS) durante 24 horas a 37°C y con un 5% de dioxido de carbono. Despues el medio se cambio por MEDIO RPMI-1640 con antibioticos, L- glutamina 2 mM con y sin el anticuerpo a las concentraciones de 1 pM, 250 nM, 63 nM, 16 nM, 4,0 nM, 1,0 nM, 240
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pM, 61 pM y 15 pM. Las celulas se hicieron crecer durante 24 horas a 37°C y con un 5% de dioxido de carbono, se lavaron con PBS fno, despues se recogieron con tampon de lisis de extracto proteico de mairnfero (MPER) (Pierce, 78505) que contiene NaCl 150 mM, pirofosfato sodico 5 mM, bpV (fen) 10 pM, fenalarsina 50 pM, ortovanadato sodico 1 mM y un coctel inhibidor de proteasas (Sigma, P714). Los lisados celulares se diluyeron dos veces con un 4% de suero bovino fetal en disolucion salina tamponada con fosfato con un 0,1% de tween-20, despues se analizaron mediante un ELISA con anticuerpo de captura de raton anti-ErbB3 humana y un anticuerpo de deteccion secundario de raton anti-ErbB3 humana biotinilado. La senal se genero con estreptavidina conjugada con peroxidasa de rabano picante reaccionada con un sustrato quimioluminiscente (Pierce, 37070). Los ELISAs se visualizaron usando un luminometro.
Segun se muestra en la Figura 4, el Ab #6 disminuyo los niveles totales de la ErbB3 en aproximadamente un 46,9% en celulas MALME-3M in vitro, medido mediante un ELISA. Como control se uso medio que no contema suero ni anticuerpo.
En un experimento adicional se examino la regulacion por disminucion de los receptores de la ErbB3 en celulas MALME-3M usando los isotipos IgG1 e IgG2 del Ab #6 usando un analisis por FACS. Las celulas MALME-3M se tripsinizaron en una placa de 15 cm y se lavaron una vez con RPMI + 10% de suero bovino fetal. Los sedimentos celulares se resuspendieron a una densidad de 1 x 106 celulas por ml. Se anadieron dos alfcuotas de 2 x 105 celulas a una placa de cultivo tisular de 12 pocillos y se resuspendieron en un volumen final de 800 pl de RPMI + 10% de suero bovino fetal. En un pocillo se anadio el isotipo IgG1 de Ab #6 o IgG2 de Ab #6 a una concentracion final de 100 nM (muestra tratada) y en el otro pocillo se anadio un volumen equivalente de PBS (muestra no tratada).
Al dfa siguiente, las celulas tratadas y no tratadas fueron tripsinizadas, lavadas e incubadas con 100 nM del Ab #6 en tampon de tincion BD durante 30 minutos en hielo. Las celulas se lavaron dos veces con 1 ml de tampon de tincion BD y se incubaron con 100 pl de una dilucion 1:500 de Alexa 647 anti-humano de cabra marcado con Alexa 647 durante 45 minutos en hielo. Despues, las celulas se lavaron y se resuspendieron en 300 pl de tampon de tincion BD + 0,5 pg/ml de yoduro de propidio. El analisis de 10.000 celulas se realizo con un citometro de flujo FACScalibur usando el canal FL4.
Segun se muestra en las Figuras 5A y 5B, ambos isotipos IgG1 y IgG2 del Ab #6 regularon por disminucion la ErbB3 en celulas MALME-3M en aproximadamente el 62% y aproximadamente el 66%, respectivamente.
Con objeto de determinar si esta disminucion era debida a la internalizacion del receptor de la ErbB3 en la superficie de las celulas MALME-3M, se midio la expresion con el tiempo de la ErbB3 en presencia del anticuerpo. Espedficamente, las celulas MALME-3M se tripsinizaron en una placa de 15 cm y se lavaron una vez con RPMI + 10% de suero bovino fetal. Los sedimentos celulares se resuspendieron a una densidad de 1 x 106 celulas por ml. Se anadieron dos alfcuotas de 2 x 105 celulas a una placa de cultivo tisular de 12 pocillos y se resuspendieron en un volumen final de 800 pl de RPMI + 10% de suero bovino fetal. En un pocillo se anadio el anticuerpo anti-ErbB3 a una concentracion final de 100 nM (muestra tratada) y en el otro pocillo se anadio un volumen equivalente de PBS (muestra no tratada). Al dfa siguiente, las celulas tratadas y no tratadas fueron tripsinizadas, lavadas e incubadas con 100 nM de de anticuerpo anti-ErbB3 en tampon de tincion BD durante 30 minutos en hielo. Las celulas se lavaron dos veces con 1 ml de tampon de tincion BD y se incubaron con 100 pl de una dilucion 1:500 de Alexa 647 anti-humano de cabra marcado con Alexa 647 durante 45 minutos en hielo. Despues, las celulas se lavaron y se resuspendieron en 300 pl de tampon de tincion BD + 0,5 pg/ml de yoduro de propidio. El analisis de 10.000 celulas se realizo con un citometro de flujo FACScalibur usando el canal FL4
Segun se muestra en la Figura 6, la regulacion por disminucion de la ErbB3 en presencia del Ab #6 fue medida a las 0 horas (Figura 6A), a las 0,5 horas (la Figura 6B), a las 2 horas (Figura 6C) y a las 24 horas (Figura 6D). Segun se muestra en las Figuras 6A - 6D, aproximadamente el 50% de los receptores de la ErbB3 de la superficie celular fueron regulados por disminucion despues de aproximadamente 30 minutos, y aproximadamente a las 24 horas, aproximadamente el 93% de los receptores de la superficie celular estaban regulados por disminucion.
La capacidad del Ab #6 de provocar la regulacion por disminucion de la ErbB3 in vivo en celulas de melanoma tambien se examino como sigue.
En resumen, se adquirieron ratones nu/nu deficientes en linfocitos T (ratones hembra de 3 - 4 semanas de edad originados en NIH; no consangumeos; de fondo albino) en Charles River Labs (Wilmington, MA). Las celulas MALME-3M para la implantacion se hicieron crecer en cultivo (medio RPMI, 10% de FBS, L-glutamina y antibioticos, 37°C, 5% de CO2) hasta aproximadamente un 80% de confluencia antes de recogerlas. Las celulas se mantuvieron en hielo hasta su implantacion. A los ratones fueron se les implantaron mediante inyeccion subcutanea 100 pl de celulas MALME-3M en el costado derecho y se dejaron recuperar mientras eran monitorizados para controlar el crecimiento tumoral inicial.
Los tumores se midieron (longitud por ancho) con un calibre digital, y a los ratones se les inyecto por via intravenosa IgG2a (Sigma, M7769-5MG). A los ratones se les inyecto intraperitonealmente cada dos dfas con 15 pg o con 100
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pg del anticuerpo numero 6 y los tumores se midieron tres veces por semana y se registraron en una hoja de calculo de Microsoft EXCEL.
Se realizaron las mediciones finales de los tumores (L x W), los ratones fueron sacrificados mediante asfixia con CO2 y los tumores fueron extirpados, congelados al instante en nitrogeno lfquido, y almacenados a -80°C (para su analisis bioqufmico). Las mediciones finales de los tumores se analizaron y representaron graficamente por area tumoral y volumen tumoral segun se describe, por ejemplo, en Burtrum y col., (2003) Cancer Res., 63: 8912 - 8921. Los datos tambien se analizaron segun las medias "normalizadas" y "no normalizadas" tanto para el volumen tumoral como para el area tumoral. Para la "normalizacion" de los datos, en cada punto temporal de medicion, cada tumor de cada grupo fue dividido segun el tamano inicial del tumor determinado mediante una medicion con un calibre.
Segun se muestra en la Figura 7, de entre los diversos anticuerpos ensayados en este ensayo, el Ab #6 provoco la regulacion por disminucion total de la ErbB3 tan pronto como 24 horas tras la inyeccion en los tumores tratados con el isotipo IgG1 o IgG2 del Ab #6). Se uso PBS como control.
En un experimento adicional se examino la capacidad del Ab #6 para regular por disminucion la ErbB3 en xenoinjertos de ADRr in vivo.
En resumen, las muestras se pulverizaron con un criopulverizador (Covaris Inc). Los tumores se almacenaron en bolsas especiales (pesadas previamente antes de la adicion del tumor) y se colocaron en nitrogeno lfquido durante su manipulacion. Para los tumores pequenos se anadieron en primer lugar 200 pl de tampon de lisis a la bolsa con el tumor, se congelaron en nitrogeno lfquido y despues se pulverizaron para mejorar la recuperacion del tumor a partir de la bolsa. Los tumores pulverizados se transfirieron a tubos de Eppendorf de 2 ml y se colocaron en nitrogeno lfquido hasta que fueron lisados. Los tumores fueron lisados con tampon de lisis complementado con inhibidores de la proteasa y de la fosfatasa. El tampon de lisis se anadio a las alfcuotas tumorales a una concentracion final de 62,5 mg/ml. Las muestras tumorales fueron homogeneizadas mediante agitacion con vortex durante 30 segundos y se dejaron asentar en hielo durante 30 min. Los lisados fueron rotados durante 10 min en columnas Qiashredder de Qiagen para una homogeneizacion adicional de las muestras. Los lisados clarificados se colocaron en alfcuotas en tubos nuevos.
El ensayo de BCA se realizo segun se establece en la seccion de materiales y procedimientos, supra.
Los niveles totales de la ErbB3 se determinaron mediante ELISA. Los reactivos del ELISA fueron adquiridos en R&D Systems como kits Duoset. Se recubrieron placas de 96 pocillos Nunc Maxisorb con 50 pl del respectivo anticuerpo de captura y se incubaron durante una noche a temperatura ambiente. A la manana siguiente las placas se lavaron 3 veces con 1000 pl/pocillo en un lavador de placas BioTek con PBST (0,05% de Tween-20) y despues se bloquearon durante 1 h a temperatura ambiente con un 2% de BSA en PBS. Despues las placas se lavaron 3 veces con 1000 pl/pocillo en el lavador de placas BioTek con PBST (0,05% de Tween-20). Los lisados (50 pl) y los estandares se diluyeron en un 50% de tampon de lisis y en un 1% de BSA; todas las muestras se analizaron por duplicado. Las placas se incubaron durante 2 horas a 4°C en un agitador de placas y se lavaron tres veces con 1000 pl/pocillo en un lavador de placas BioTek con PBST (0,05% de Tween-20). Se diluyeron cincuenta microlitros de anticuerpo de deteccion en un 2% de BSA, se anadio PBST y las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron 3 veces con 1000 pl/pocillo en el lavador de placas BioTek con PBST (0,05% deTween-20). Se anadieron aproximadamente cincuenta microlitros de estreptavidina-HRP y las placas se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron de nuevo 3 veces con 1000 pl/pocillo en un lavador de placas BioTek con PBST (0,05% de Tween-20). Se anadieron cincuenta microlitros de sustrato Supersignal Pico ELISA y la lectura se realizo usando un lector de placas Fusion. Los datos fueron analizados mediante el uso de EXCEL. Las muestras por duplicado se promediaron y las barras de error representan la desviacion estandar entre los dos replicados.
Los resultados de este experimento se muestran en la Figura 8. Segun se muestra en la Figura 8, el Ab #6 regulo por disminucion la ErbB3 en xenoinjertos de ADRr in vivo.
Ejemplo 6: inhibicion de la proliferacion de las celulas tumorales
La capacidad del Ab #6 para inhibir la proliferacion celular de celulas que expresan la ErbB3 (por ejemplo, celulas cancerosas) se examino como sigue.
Se sembraron celulas MALME3M, ACHN y NCI/ADRr en placas de cultivo tisular de 96 pocillos y se hicieron crecer en medio RPMI-1640 complementado con antibioticos, L-glutamina 2 mM y un 10% de suero bovino fetal (FBS) durante 24 horas a 37 grados Celsius y con un 5% de dioxido de carbono. Despues el medio se cambio por medio RPMI-1640 con antibioticos, L-glutamina 2 mM y con y sin el anticuerpo a las concentraciones de 1 pM, 250 nM, 63 nM, 16 nM, 4,0 nM, 1,0 nM, 240 pM, 61 pM y 15 pM. Las celulas se hicieron crecer en durante 96 horas a 37°C y con un 5% de dioxido de carbono, despues se recogieron con el ensayo de viabilidad celular luminescente CellTiter-Glo®
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(Promega, G7573) y se analizaron con un luminometro. El medio que no contenfa suero ni anticuerpo se uso como control.
Segun se muestra en las Figuras 9, 10 y 11, el Ab #6 inhibio la proliferacion de las celulas MALME-3M (Figura 9), de las celulas de cancer de ovario ADRr (Figura 10) y de las celulas ACHN (Figura 11) que expresan la ErbB3. Especfficamente, el Ab # 6 inhibio la proliferacion de las celulas MALME-3M en aproximadamente el 19,6%, segun se midio mediante el uso del ensayo Cell Titer Glow, e inhibio la proliferacion de las celulas de cancer de ovario ADRr en aproximadamente el 30,5%. Tambien, segun se muestra en la Figura 11, el Ab # 6 inhibio la proliferacion de las celulas ACHN en aproximadamente el 25,4%.
Ejemplo 7: inhibicion de la fosforilacion de la ErbB3 en celulas tumorales
La capacidad del Ab #6 para inhibir la fosforilacion de la ErbB3 in vivo se examino como sigue.
Las muestras se pulverizaron usando la tecnica descrita en el Ejemplo 5 supra, con respecto a la Figura 8. Se realizo el ensayo de BCA segun se establece en la seccion de materiales y procedimientos, supra, y el ensayo de
ELISA se realizo segun se describio en el Ejemplo 5 supra, con respecto a la Figura 8.
Los resultados de este experimento se muestran en la Figura 12. Segun se muestra en la Figura 12, el Ab #6 inhibio
significativamente la fosforilacion de la mErbB3 en xenoinjertos ovaricos de ADRr in vivo, segun se midio por la
cantidad de ErbB3 fosforilada (pErbB3) en ng/mg de protefna total.
Tambien se examino la capacidad del Ab #6 para inhibir la fosforilacion de la ErbB3 inducida por betacelulina (BTC) o por herregulina (HRG), como sigue.
Las celulas ovaricas de ADRr se preincubaron con Ab #6 durante 30 minutos antes de su estimulacion con BTC 50 mM, HRG 10 mM o TGF-a 333 nM. Despues de la preincubacion, se elimino el medio y las celulas se estimularon durante 5 minutos a 37°C, y un 5% de Co2 con bTc 50 nM o TGF-a 333 nM (para PE498). Tambien se usaron controles de HRG (5 minutos, 5 nM), un 10% de suero y un 0% de suero. Las celulas se lavaron con 1 X de PBS frfo y se lisaron con 30 pl de tampon de lisis frfo (tampon M-PER mas vanadato sodico (NaVO4, Sigma), 2-glicerofosfato, oxido de fenilarsina, BpV e inhibidores de la proteasa) mediante su incubacion en hielo durante 30 minutos. Los lisados se almacenaron durante una noche a -80°C.
Segun se muestra en las Figuras 13A - 13C, el Ab #6 inhibio significativamente la fosforilacion mediada tanto por betacelulina como por herregulina de la ErbB3.
En un experimento adicional se examino la capacidad del Ab #6 para inhibir la fosforilacion de la ErbB3 en las lfneas celulares de tumor de ovario OVCAR 5 y OVCAR 8, como sigue.
Las lfneas celulares OVCAR 5 y OVCAR 8 se obtuvieron del National Cancer Institute, Division of Cancer Treatment and Diagnostics ("DCTD"). El ELISA se realizo segun se describio en la seccion de materiales y procedimientos, supra.
Los resultados de este experimento estan representados en las Figuras 14A y 14B. Segun se representa en las Figuras 14A y 14B, el Ab #6 inhibio la fosforilacion de la ErbB3 en ambas lfneas celulares de cancer de ovario OVCAR 5 y OVCAR 8.
Segun se analizo anteriormente, el Ab #6 inhibe la fosforilacion mediada por betacelulina de la ErbB3. Con objeto de investigar si la fosforilacion mediada por betacelulina de la ErbB3 se produce hasta la ErbB1 o la ErbB3, se realizo el siguiente experimento.
Se preincubaron celulas ADRr o celulas MALME-3M (1 x 105) con Ab # 6 anti-ErbB3 25 mM o Erbitux 25 mM (como control) en 50 ml de tampon de tincion BD durante 30 minutos en hielo. Despues de 30 minutos se anadieron 50 pl de BTC biotinilada 400 nM a las celulas y se incubaron durante otros 30 minutos en hielo. Esto dio una concentracion final de anticuerpos de 12,5 pM y de BTC 200 nM. Despues las celulas se lavaron dos veces con 500 pl de tampon de tincion BD y se incubaron con 100 pl de una dilucion 1:200 de estreptavidina-PE (PE = ficoeritrina) (Invitrogen) en tampon de tincion BD durante 45 minutos. Finalmente, las celulas se lavaron dos veces, se resuspendieron en 300 pl de tampon de tincion BD y se analizaron en un citometro de flujo FACScalibur. Como control positivo se incubaron 1 x 105 de celulas ADRr o MALME-3M con BTC 200 nM durante 30 minutos en hielo, se lavaron dos veces y se incubaron con una dilucion 1:200 de estreptavidina-PE durante 45 minutos. Para evaluar la tincion de fondo del conjugado de estreptavidina-PE, las celulas se incubaron con 100 pl de una dilucion 1:200 solo de estreptavidina-PE durante 45 minutos.
Los resultados de este experimento estan representados en las Figuras 15A - 15C. Segun se muestra en la Figura 15A, la betacelulina (BTC) no muestra ninguna union apreciable a las celulas MALME-3M negativas para ErbB1. Sin
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embargo, segun se representa en las Figuras 15B y 15C, la BTC si muestra una union a las celulas ADRr positivas para ErbB1.
Tambien, segun se muestra en las Figuras 15B y 15C, esta union fue bloqueada por Erbitux, que es un anticuerpo anti-EGFR que se une especfficamente al EGFR y que fue incluido como control para demostrar que los ligandos de tipo EGF se unen al EGFR, y que se describe, por ejemplo, en Adams y col. (2005), Nature Biotechnology 23, 1147 - 1157.
Ejemplo 8: inhibicion de la senalizacion mediada por herreaulina en celulas tumorales
La capacidad del Ab # 6 para inhibir la senalizacion mediada por herregulina en celulas tumorales se investigo como sigue.
Se sembraron celulas MALME-3M en placas de cultivo tisular de 96 pocillos y se hicieron crecer en medio RPMI- 1640 complementado con antibioticos, L-glutamina 2 mM y un 10% de suero bovino fetal (FBS) durante 24 horas a 37°C y con un 5% de dioxido de carbono. A las celulas se les privo de suero con medio RPMI-1640 con antibioticos y L-glutamina 2 mM durante 24 horas a 37°C y con un 5% de dioxido de carbono. Las celulas se pretrataron con y sin el anticuerpo anti-ErbB3 (isotipo IgG2 del Ab #6) a unas concentraciones de 1 pM, 250 nM, 63 nM, 16 nM, 4,0 nM, 1,0 nM, 240 pM y 61 pM durante 30 minutos, y despues se estimularon con HRG1-beta1-ECD durante 10 minutos a 37°C y con un 5% de dioxido de carbono. Las celulas se lavaron con PBS frfo y despues se recogieron con tampon de lisis de extracto proteico de mamffero (MPER) (Pierce, 78505) que contenfa NaCl 150 mM, pirofosfato sodico 5 mM, bpV 10 pM (fen), fenalarsina 50 mM, ortovanadato sodico 1 mM y un coctel inhibidor de proteasas (Sigma, P714). Los lisados celulares se diluyeron dos veces con un 4% de albumina serica bovina en disolucion salina tamponada con fosfato con un 0,1% de tween-20, y despues se analizaron mediante ELISA para comprobar la fosforilacion del AKT (un efector secuencia debajo de la ErbB3) y de la ErbB3.
Con objeto de ensayar la fosforilacion del AKT, los lisados se analizaron en una placa de ELISA con un anticuerpo de captura especffico para el anticuerpo AKT y una anticuerpo especffico de deteccion biotinilado contra el sitio de fosforilacion de la serina 473 del AKT. La senal se genero con estreptavidina conjugada con peroxidasa de rabano picante reaccionada con un sustrato quimioluminiscente (Pierce, 37070). Con objeto de ensayar la fosforilacion de la ErbB3, los lisados se analizaron en una placa de ELISA con un anticuerpo de captura especffico para la ErbB3 y un anticuerpo de deteccion anti-fosfotirosina conjugado con peroxidasa de rabano picante. Despues esto se hizo reaccionar con el sustrato quimioluminiscente (Pierce, 37070). Los ELISAs se visualizaron usando un luminometro.
Segun se muestra en las Figuras 16A y 16B, el Ab #6 era un potente inhibidor de la senalizacion mediada por herregulina en celulas MALME-3M, segun se midio mediante la disminucion en la fosforilacion de la ErbB3 (Figura 16A) y del AKT (Figura 16B). Notablemente, el Ab #6 inhibio la fosforilacion del AKT en practicamente el 100%.
Ejemplo 9: inhibicion del crecimiento tumoral ovarico, prostatico y pancreatico
Para evaluar la eficacia del Ab #6 in vivo, se establecieron varios modelos de xenoinjertos de canceres humanos en ratones lampinos y la inhibicion del crecimiento tumoral se evaluo con multiples dosis. Por ejemplo, se adquirieron ratones nu/nu deficientes en linfocitos T (ratones hembra de 3 - 4 semanas de edad originados en NIH; no consangufneos; de fondo albino) en Charles River Labs (Wilmington, MA) para los estudios con xenoinjertos. Las celulas ADRr para implantacion se hicieron crecer en cultivo (medio RPMI, 10% de FBS, L-glutamina y antibioticos, 37°C, 5% de CO2) hasta una confluencia de aproximadamente el 85% antes de recogerlas. Las celulas se mantuvieron en hielo hasta su implantacion. A los ratones fueron se les implantaron mediante inyeccion subcutanea 100 pl de celulas ADRr en el costado derecho y se dejaron recuperar mientras eran monitorizados para controlar el crecimiento tumoral inicial.
Los tumores se midieron (longitud por ancho) con un calibre digital, y a los ratones se les inyecto por via intravenosa IgG2a (Sigma, M7769-5MG). A los ratones se les inyecto intraperitonealmente cada tres dfas con 30 pg o con 300 pg de Ab #6 y los tumores se midieron tres veces por semana y se registraron en una hoja de calculo de Microsoft EXCEL.
Se realizaron las mediciones finales de los tumores (L x W), los ratones fueron sacrificados mediante asfixia con CO2 y los tumores fueron extirpados, congelados al instante en nitrogeno lfquido, y almacenados a -80°C (para su analisis bioqufmico). Las mediciones finales de los tumores se analizaron y representaron graficamente por area tumoral y volumen tumoral segun se describe en Burtrum y col., supra. Los datos tambien se analizaron segun las medias "normalizadas" y "no normalizadas" tanto para el volumen tumoral como para el area tumoral. Para la "normalizacion" de los datos, en cada punto temporal de medicion, cada tumor de cada grupo fue dividido segun el tamano inicial del tumor determinado mediante una medicion con un calibre.
Los datos procedentes de tres modelos diferentes derivados de lfneas celulares tumorales humanas, ADRr (de ovario), Du145 (de prostata) y OvCAR8 (de ovario) se muestran en las Figuras 17A-C y Colo357. El estudio con
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xenoinjertos se muestra en la Figura 17D. Los datos de estos tres estudios demostraron que una dosis de 300 pg del Ab #6 cada tres dfas (Q3d) da como resultado una inhibicion significativa del crecimiento tumoral (p < 0,05 para multiples puntos temporales durante los estudios). Ademas, este efecto inhibidor del Ab #6 se evaluo adicionalmente cuando se incremento la dosis hasta 600 pg, Q3d, en el modelo de cancer de prostata de Du145 asf como un modelo de xenoinjerto de carcinoma renal y pancreatico (ACHN y COLO357). Sin embargo, una elevacion adicional de la dosis hasta 1500 pg Q3d no dio como resultado un aumento en la eficacia (OvCAR8 - Figura 17; COLO357) lo que sugiere que los 600 pg son saturantes con respecto a la inhibicion del crecimiento tumoral. Los analisis farmacocineticos (PK) del suero procedente de los animales de estos estudios demostraron un aumento dependiente de la dosis en la retencion en suero del Ab #6. De forma analoga, los analisis bioqufmicos de los niveles intratumorales del Ab #6 de estos diferentes estudios mostraron un intervalo dependiente de la dosis desde 0 hasta ~6 pg de MM121/ug de lisado tumoral total (datos no mostrados).
Ejemplo 10: inhibicion de la union de los liaandos de la ErbB3 a la ErbB3 en celulas tumorales
En un experimento adicional se investigo la especificidad de los anticuerpos de la divulgacion para inhibir la union de los ligandos de la ErbB3 a la ErbB3, y no de los ligandos de tipo EGF al EGFR, como sigue.
En un experimento se investigo la especificidad del Ab #6 y de una version del Fab del Ab #3 (Ab/Fab #3) para inhibir la union de los ligandos de la ErbB3 (por ejemplo, herregulina y epirregulina) a la ErbB3.
Con objeto de investigar la capacidad del Ab #6 y del Ab/Fab #3 para inhibir la union de la herregulina a la ErbB3, se llevo a cabo el siguiente experimento.
Las celulas ADRr (1 x 105) se incubaron con 10 pM de un anticuerpo anti-ErbB3 (por ejemplo, de Ab #6 o de Ab/Fab # 3) en 50 pl de tampon de tincion BD durante 30 minutos en hielo. Despues de 30 minutos, se anadieron 50 pl de herregulina EGF 40 nM biotinilada a las celulas y se incubaron durante otros 10 minutos en hielo. Esto dio una concentracion final de 5 pM de anticuerpo y 20 nM de herregulina EGF. Las celulas se lavaron despues dos veces con 500 pl de tampon de tincion BD y se incubaron con 100 pl de una dilucion 1:200 de estreptavidina-PE (PE = ficoeritrina) (Invitrogen) en tampon de tincion BD durante 45 minutos. Finalmente, las celulas se lavaron dos veces, se resuspendieron en 300 pl de tampon de tincion BD y se analizaron en un citometro de flujo FACScalibur. Como control positivo se incubaron 1 x 105 celulas ADRr con herregulina EGF 20 nM durante 10 minutos en hielo, se lavaron dos veces y se incubaron con una dilucion 1:200 de estreptavidina-PE durante 45 minutos. Con objeto de evaluar la tincion de fondo del conjugado de estreptavidina-PE, se incubaron 1 x 105 celulas ADRr con 100 pl de una dilucion 1:200 de solo estreptavidina-PE durante 45 minutos.
Los resultados de este experimento se muestran en las Figuras 18A y 18B. Segun se representa en las Figuras 18A y 18B, tanto el Ab #6 como el Ab/Fab #3 eran capaces de inhibir la union de la herregulina a la ErbB3.
De forma analoga, se examino la capacidad del Ab #6 para inhibir la union de otro ligando de la ErbB3, la epirregulina, a la ErbB3, como sigue.
Las celulas ADRr (1 x 105) se preincubaron con 25 pM de Ab #6 o con 25 pM de Erbitux (como control) en 50 pl de tampon de tincion BD durante 30 minutos en hielo. Despues de 30 minutos, se anadieron a las celulas 50 pl de Epi 2 pM biotinilada y se incubaron durante otros 30 minutos en hielo. Esto dio una concentracion final de 12,5 pM de anticuerpos y 1 pM de Epi. Despues las celulas se lavaron veces con 500 pl de tampon de tincion BD y se incubaron con 100 pl de una dilucion 1:200 de estreptavidina-PE (PE = ficoeritrina) (Invitrogen) en tampon de tincion BD durante 45 minutos. Finalmente, las celulas se lavaron dos veces, se resuspendieron en 300 pl de tampon de tincion BD y se analizaron en un citometro de flujo FACScalibur. Como control positivo se incubaron 1 x 105 celulas ADRr con 1 pM de Epi durante 30 minutos en hielo, se lavaron dos veces y se incubaron con una dilucion 1:200 de estreptavidina-PE durante 45 minutos. Con objeto de evaluar la tincion de fondo del conjugado de estreptavidina-PE, se incubaron las celulas con 100 pl de una dilucion 1:200 de solo estreptavidina-PE durante 45 minutos.
Los resultados de este experimento se representan en las Figuras 19A y 19B. Segun se muestra en la Figura 19A, la epirregulina se une a las celulas ADRr positivas en ErbB3. Ademas, segun se muestra en la Figura 19B, es tambien es inhibida tanto por Erbitux como por el Ab #6, lo que sugiere que la que epirregulina puede unirse tanto al EGFR como al ErbB3.
Se realizo un experimento adicional para investigar si el Ab #6 es capaz de inhibir la union de un ligando de tipo EGF (por ejemplo, HB-EGF) a las celulas tumorales.
Las celulas ADRr (1 x 105) se preincubaron con 25 pM de Ab #6 o con 25 pM de Erbitux (como control) en 50 pl de tampon de tincion BD durante 30 minutos en hielo. Despues de 30 minutos, se anadieron a las celulas 50 pl de HB- EGF 400 nM biotinilado y se incubaron durante otros 30 minutos en hielo. Esto dio una concentracion final de 12,5 pM de anticuerpos y 200 nM de HB-EGF. Despues las celulas se lavaron veces con 500 pl de tampon de tincion BD
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y se incubaron con 100 pl de una dilucion 1:200 de estreptavidina-PE (PE = ficoeritrina) (Invitrogen) en tampon de tincion BD durante 45 minutos. Finalmente, las celulas se lavaron dos veces, se resuspendieron en 300 pl de tampon de tincion BD y se analizaron en un citometro de flujo FACScalibur. Como control positivo se incubaron 1 x 105 celulas ADRr con HB-EGF 200 nM durante 30 minutos en hielo, se lavaron dos veces y se incubaron con una dilucion 1:200 de estreptavidina-PE durante 45 minutos. Con objeto de evaluar la tincion de fondo del conjugado de estreptavidina-PE, se incubaron las celulas con 100 pl de una dilucion 1:200 de solo estreptavidina-PE durante 45 minutos.
Segun se muestra en las Figuras 20A y 20B, el HB-EGF se une a la ErbB de las celulas ADRr y el Ab #6 no inhibe esta union, lo que demuestra que el Ab #6 es especffico para inhibir la union de los ligandos de la ErbB3 (por ejemplo, herregulina y epirregulina) a la ErbB3.
Ejemplo 11: inhibicion de la secrecion del VEGF en celulas tumorales
Se examino la capacidad del Ab #6 para inhibir la secrecion del VEGF en celulas que expresan la ErbB3 (por ejemplo; celulas cancerosas) usando un ensayo de secrecion de VEGF (kit ELISA para el VEGf disponible en R&D Systems, Minneapolis, MN, numero de catalogo DY293B). En primer lugar se analizo la capacidad del Ab #6 para inhibir la secrecion del VEGF en las celulas MCF-7, T47D, y COLO-357 no tratadas y tratadas con HRG-beta1. Estos estudios revelaron que las COLO-357 secretaron una mayor cantidad de VEGF al medio. Como estas celulas tambien tenfan unos niveles muy elevados de HRG (datos no mostrados), la adicion de la HRG al medio no fue capaz de inducir la secrecion adicional de VEGF (Fig. 24A). Por el contrario, la HRG fue capaz de inducir la secrecion del VEGF en celulas MCF-7 y T47D.
El Ab #6 muestra un potente efecto inhibidor a elevados niveles en las tres lfneas celulares, siendo el mayor en COLO-357 (Fig. 24A). El Ab #6 tambien muestra un efecto similar in vivo inhibiendo la secrecion del VEGF en tres xenoinjertos diferentes, siendo el mayor en el xenoinjerto de COLO-357 (Fig. 24B). La inhibicion del VEGF se correlaciona con la inhibicion de la fosforilacion de la ErbB3 (Fig. 24 C). La inhibicion de la secrecion del VEGF tambien se correlaciona con la inhibicion de la angiogenesis en las celulas tumorales. En particular, se ha identificado que los factores secretados por las celulas de mieloma, tales como el VEGF y el bFGF, desencadenan la angiogenesis (vease, por ejemplo, Leung y col. (1989) Science 246 (4935): 1306 - 9; Yen y col. (2000) Oncogene 19 (31): 3460 - 9).
Ejemplo 12: inhibicion de la migracion celular
Se examino la capacidad del Ab #6 para inhibir la migracion de las celulas que expresan la ErbB3 (por ejemplo, celulas MCF-7) usando un ensayo transpocillo (Millipore Corp., Billerica, MA, numero de catalogo ECM552). En primer lugar, a las MCF-7 celulas se les privo de suero durante una noche y despues se incubaron en presencia o en ausencia de Ab #6 (concentracion final 8 pM) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Despues las celulas se transfirieron a una camara superior que esta separada de la camara inferior por una membrana recubierta de colageno de tipo I a traves de la cual pueden migrar las celulas. Se anadio FBS al 10% al medio de la camara inferior para que actuara como quimioatractivo en presencia o en ausencia del Ab #6. Las camaras se incubaron a 37°C durante 16 horas y despues las celulas que habfan migrado a traves de la membrana se eliminaron usando un tampon de desprendimiento, y se incubaron con un pigmento fluorescente de union a las celulas. La fluorescencia se cuantifico usando un lector de placas fluorescentes. La fluorescencia media + EEM (n = 2) se muestra en la Figura 25.
Segun se muestra en la Figura 25, el FBS al 10% estimula la migracion celular (carril 3) en comparacion con el control no tratado (carril 1) y el Ab #6 8 M inhibe la migracion celular inducida por el FBS (carril 4).
Ejemplo 13: inhibicion del crecimiento esferoidal
Se examino la capacidad del Ab #6 para inhibir el crecimiento esferoidal de celulas que expresan la ErbB3 usando un ensayo que simula las condiciones de desarrollo de un tumor en crecimiento (Herman y col. (2007) Journal of Biomolecular Screening Electronic publication). Los esferoides de AdrR y de DU145 se iniciaron a una frecuencia de 1 esferoide por pocillo en una placa de 96 pocillos usando el metodo de la gota colgante (Herrman y col., 2008). Entonces los esferoides individuales se trataron con Ab #6 (concentracion final 8 pM), dominio de Herregulina-p1 EGF (R&D Systems, Minneapolis, MN, numero de catalogo 396-HB, concentracion final de 3,4 nM), o una combinacion de ambos, segun se indique. Los diametros de los esferoides se midieron usando microscopfa optica (objetivo de 10X) en el dfa 1 y en el dfa 13.
El Ab #6 inhibe el crecimiento esferoidal en celulas AdrR (Fig. 26A). Ademas, la HRG 3,4 nM estimula el crecimiento esferoidal y el Ab #6 inhibe el efecto de la HRG (Fig. 26B). Los esferoides derivados de DU145 no aumentaron su tamano durante los 13 dfas del experimento, sin embargo, el crecimiento fue significativamente estimulado por la HRG1-beta 1. En estas celulas, el Ab #6 8 M inhibe el crecimiento esferoidal inducido por la HRG (Fig. 26C).
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Ejemplo 14: inhibicion de la senalizacion
Se examino la capacidad del Ab #6 para inhibir la senalizacion inducida por diferentes ligandos. Por ejemplo, se ensayo el efecto del Ab #6 sobre la union de la HRG y de la BTC a las celulas AdrR que expresan el receptor de la ErbB3. Segun se muestra en las Figuras 27A y B, usando un analisis mediante FACS, el Ab #6 compite con la HRG pero no con la BTC por la union a las celulas AdrR: consecuentemente, el bloqueo por parte del Ab #6 de la union de la HRG a la ErbB3 impedirfa la senalizacion inducida por la HRG.
Adicionalmente, se ensayaron varios ligandos para comprobar la induccion de la fosforilacion de la ErBb3. Tres ligandos, HRG, BTC y HGF, fueron capaces de estimular la fosforilacion inducida por la ErbB3 en celulas AdrR, mientras que el EGF no pudo. Segun se muestra en la Figura 28, el Ab #6 inhibe la fosforilacion de la pErbB3 inducida por el HGF en celulas AdrR (Fig. 28). Ademas, como se sabe en la tecnica (vease, por ejemplo, Wallenius y col. (2000) Am J Pathol. 156 (3): 821 - 9 10702398), se ha encontrado un aumento de la senalizacion por HGF en varios tumores epiteliales y no epiteliales.
Interaccion ErbB3/cMET y papel del Ab #6 en la modulacion de esta interaccion
Se ha demostrado que los canceres de pulmon de celulas no microcfticas portadores de mutaciones que activan el receptor del factor de crecimiento epidermico (EGFR) desarrollan resistencia a los inhibidores de las cinasas de tirosinas mediante el reclutamiento de las tirosinas MET y HER3 y activando asf la via de supervivencia celular PI3K- AKT (Engelmann y col. (2007) Science 316: 1039 - 1043; Gou (2007) PNAS: 105 (2): 692 - 697). La asociacion entre EGFR y c-MET en las lfneas celulares que portan mutaciones activadoras del EGFR ha sido bien establecida mediante co-inmunoprecipitacion (Engelmann y col. 2007; Gou 2007). Guo y col. demostraron recientemente que tambien existen c-MET y ErbB3 en un complejo en una lfnea celular gastrica MKN45 conocida por ser dependiente de la c-MET amplificada, usando co-inmunoprecipitacion.
Esta interaccion entre c-METy erbB3 tambien se produce en las celulas AdrR portadoras del EGFR natural y no es dependiente de la c-MET amplificada. El HGF (factor de crecimiento de hepatocitos) induce la fosforilacion de la ErbB3 en celulas AdrR de una forma dependiente de la dosis, segun se muestra en la Figura 28. Ademas, el Ab #6 inhibe la fosforilacion de la erbB3 inducida por el HGF.
Tambien se ha investigado el efecto de la HRG y de la BTC sobre la fosforilacion de la ErbB1 y de la ErbB3, y se ha averiguado que la HRG y la BTC inducen la fosforilacion de la ErbB1 y de la ErbB3. Se averiguo que la HRG era un inductor mas potente de la fosforilacion de la ErbB3, mientras que la BTC era un potente inductor de la fosforilacion de la ErbB1 (Fig. 29). Es probable que esta fosforilacion este dirigida por el complejo entre la ErbB1 y la ErbB3. En resumen, la union de la HRG a la ErbB3 induce la formacion de un complejo entre la ErbB1 y la ErbB3, dando lugar a la activacion de ambos receptores. Parece probable el mismo fenomeno para la BTC, donde la union de la BTC a la ErbB1 estimula la formacion de un complejo entre la ErbB1 y la ErbB3, dando lugar a la fosforilacion de la ErbB1 y de la ErbB3.
Inhibicion por anticuerpo de la fosforilacion estimulada por ligando (HRG, BTC, EGF y HGF) de la ErbB3.
Se examino la capacidad del Ab #6 para inhibir la fosforilacion inducida por ligando (HRG, BTC, EGF y HGF) de la ErbB3 basandose en el siguiente procedimiento: 1 2 3 4 5 6 7
1. Se colocaron celulas AdrR en placas de 96 pocillos a una densidad de 30.000 celulas/pocillo/100 pl en medio RPMI que contenfa un 10% de FBS y se dejaron crecer durante una noche;
2. Al dfa siguiente las celulas fueron privadas de suero cambiando el medio por medio sin FBS y se dejaron crecer durante una noche;
3. Las celulas se pretrataron con diferentes concentraciones de Ab #6 (desde 0,01 nM hasta 100 nM) o de tampon (control), durante 2 horas;
4. Despues las celulas fueron estimuladas con HRG y HGF 10 nM durante 10 minutos, o con BTC y EGF 10 nM durante 5 minutos;
5. La reaccion se detuvo extrayendo el medio de cultivo y lavando las celulas una vez con PBS enfriado en hielo;
6. Despues las celulas se lisaron con Tris 25 mM, pH +7,5, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 1,0% de Triton X-100, 1,0% de CHAPS, 10% v/v de glicerol, que contenfa 1X de inhibidor de la proteasa y 1X de inhibidor de la fosfatasa; y
7. Se midio la fosforilacion de la ErbB3 en los lisados celulares usando el kit ELISA de Human Phospho-ErbB3 (R&D Systems, Minneapolis, MN, numero de catalogo DYC1769) segun las instrucciones del fabricante.
Inhibicion por anticuerpo de la formacion del complejo de protefnas ErbB2-ErbB3.
Las celulas AdrR se preincubaron con tampon (control) o con Ab #6 250 nM durante 60 minutos a temperatura ambiente, despues se trataron con HRG 10 nM o con BTC 10 nM o con un tampon de control durante 10 minutos. Las celulas se lisaron con Tris 25 mM, pH +7,5, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 1,0% de Triton X-100, 1,0% de CHAPS,
10% v/v de glicerol, que contenfa PMSF 0,2 mM, 50 mTU/ml de aprotinina y leupeptina 100 pM, y el lisado en bruto se centrifugo brevemente para eliminar el material insoluble. El sobrenadante se transfirio a un nuevo tubo de eppendorf y se anadio el anticuerpo anti-ErbB3 (Santa Cruz sc-285) a una dilucion de 1:500. Los sobrenadantes se incubaron durante una noche con agitacion suave a 4°C. En primer lugar se lavaron 60 pl de microesferas de 5 protefna A/G inmovilizada sobre agarosa (Pierce, Rockford, IL, numero de catalogo 20421) con 1X de PBS. La mezcla de lisado celular-anticuerpo se anadio a las microesferas lavadas con PBS, y se incubo durante 2 horas con agitacion suave a 4°C. Entonces los inmunoprecipitados se lavaron 3 veces con tampon de lisis enfriado en hielo, se resuspendieron en 30 pl de 2X tampon de muestra en SDS, se desnaturalizaron por calor a 95°C durante 7 minutos y se analizaron en geles Bis-Tris de SDS-PAGE al 4 - 12% y se electrotransfirieron a una membrana de PVDF en
10 tampon de Tri-Glicina con un 10% de MeOH. La membrana se bloqueo durante 1 hora en 10 ml de tampon de bloqueo (Li-Cor Biosciences, Lincoln, NE, numero de catalogo 927-40000) y despues se incubo con al anticuerpo anti-ErbB2 a 1:1000 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, numero de catalogo 29D8) en 10 ml de tampon de bloqueo (Li-Cor Biosciences, numero de catalogo 927-40000). La senal se detecto usando IRDye800 anticonejo de cabra a 1 5000 (2 pl) en 10 ml de tampon de bloqueo (Li-Cor Biosciences, numero de catalogo 927-40000).
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Tambien se demostro que el Ab #6 inhibfa completamente la formacion del complejo ErbB2/3 estimulada por la HRG (Fig. 29B).

Claims (13)

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    65
    1. Un anticuerpo monoclonal aislado o porcion de union a antfgeno del mismo que se une a ErbB3 y comprende regiones variables de cadena pesada y ligera, en el que:
    la region variable de cadena pesada CDR1 comprende la SEQ ID NO: 7; la region variable de cadena pesada CDR2 comprende la SEQ ID NO: 8; la region variable de cadena pesada CDR3 comprende la SEQ ID NO: 9; la region variable de cadena ligera CDR1 comprende la SEQ ID NO: 10; la region variable de cadena ligera CDR2 comprende la SEQ ID NO: 11; y la region variable de cadena ligera CDR3 comprende la SEQ ID NO: 12.
  2. 2. El anticuerpo o porcion de union a antfgeno del mismo de la reivindicacion 1, en el que la region variable de cadena pesada comprende una secuencia aminoacfdica al menos un 80% identica a la secuencia aminoacfdica de la region variable de cadena pesada expuesta en la SEQ ID NO: 1.
  3. 3. El anticuerpo o porcion de union a antfgeno del mismo de la reivindicacion 1, en el que la region variable de cadena ligera comprende una secuencia aminoacfdica al menos un 80% identica a la secuencia aminoacfdica de la region variable de cadena ligera expuesta en la SEQ ID NO: 2
  4. 4. El anticuerpo o porcion de union a antfgeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la region variable de cadena pesada comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO: 1 y la region variable de cadena ligera comprende la secuencia aminoacfdica de la SEQ ID NO: 2.
  5. 5. El anticuerpo o porcion de union a antfgeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo o porcion de union a antfgeno del mismo muestra una o mas de las siguientes propiedades:
    (i) inhibe la fosforilacion mediada por ligando de tipo EGF de ErbB3;
    (ii) inhibicion de la senalizacion mediada por herregulina, epirregulina, betacelulina, epigenina o birregulina a traves de ErbB3;
    (iii) inhibicion de la proliferacion de celulas que expresan ErbB3;
    (iv) la capacidad para disminuir los niveles de ErbB3 en las superficies celulares;
    (v) inhibicion de la secrecion de VEGF de las celulas que expresan ErbB3;
    (vi) inhibicion de la migracion de las celulas que expresan ErbB3;
    (vii) inhibicion del crecimiento esferoidal de las celulas que expresan ErbB3;
    (viii) union a un epftopo situado en el dominio I de ErbB3; y/o
    (ix) union a ErbB3 con una Kd de al menos aproximadamente 8 nM o mejor, segun se mide por un ensayo de resonancia de plasmon superficial o un ensayo de union celular.
  6. 6. El anticuerpo o porcion de union a antfgeno de la reivindicacion 5, en el que el ligando de tipo EGF se selecciona del grupo que consiste en EGF, TGF-a, betacelulina, factor de crecimiento epidermico de union a heparina, anfirregulina y birregulina.
  7. 7. El anticuerpo o porcion de union a antfgeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que:
    (a) el anticuerpo se selecciona de un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo biespecffico y un anticuerpo quimerico;
    (b) la porcion de union a antfgeno del mismo es un Fab'2; o
    (c) el isotipo de anticuerpo se selecciona de un anticuerpo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD e IgE.
  8. 8. Una composicion que comprende el anticuerpo o porcion de union a antfgeno de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en un vehfculo farmaceuticamente aceptable.
  9. 9. Una celula huesped que produce el anticuerpo o porcion de union a antfgeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
  10. 10. Un anticuerpo monoclonal aislado o porcion de union a antfgeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o una composicion de la reivindicacion 8 para su uso en un metodo para tratar cancer, en el que el cancer se selecciona opcionalmente de entre melanoma, cancer de mama, cancer de ovario, carcinoma renal, cancer gastrointestinal/de colon, cancer de pulmon, sarcoma de celulas claras y cancer de prostata.
  11. 11. Un anticuerpo o porcion de union a antfgeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o una composicion de acuerdo con la reivindicacion 8 para su uso de acuerdo con la reivindicacion 10, en el que;
    10
    15
    20
    (a) el anticuerpo o porcion de union a antfgeno del mismo se administra por via intravenosa, intramuscular o subcutanea al sujeto; y/o
    (b) el anticuerpo o porcion de union a antfgeno del mismo se administra en combinacion con un segundo agente terapeutico, en el que el segundo agente terapeutico es un segundo anticuerpo o porcion de union a antfgeno del mismo y otro agente anticanceroso.
  12. 12. Un anticuerpo o porcion de union a antfgeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o una composicion de la reivindicacion 8 para su uso de acuerdo con la reivindicacion 11, en el que:
    (a) el segundo anticuerpo es un anticuerpo anti-IGF1R, un anticuerpo anti-EGFR, o un anticuerpo anti-cmet; o
    (b) el agente es un antimetabolito, un agente alquilante, un inhibidor de la topoisomerasa, un agente dirigido a los microtubulos, un inhibidor de la cinasa, un inhibidor de la sfntesis de protefnas, un inmunoterapeutico, una hormona o un analogo de la misma, un analogo de somatostatina, un glucocorticoide, un inhibidor de la aromatasa, un inhibidor de la mTOR, una molecula pequena dirigida al IGF1R o una molecula pequena dirigida al EGFR.
  13. 13. Uso de un anticuerpo o porcion de union a antfgeno del mismo que se une a ErbB3 en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de cancer, en el que la region variable de cadena pesada comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO: 1, y la region variable de cadena ligera comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO: 2.
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