JP2003523207A - Ｌｉｖ−１関連タンパク質、それをコードするポリヌクレオチド、及び癌の治療へのその利用 - Google Patents

Ｌｉｖ−１関連タンパク質、それをコードするポリヌクレオチド、及び癌の治療へのその利用

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＬＩＶ-１の過剰発現によって特徴付けられる疾患の治療のための組成物及び方法に関する。更に具体的には、この組成物は、ＬＩＶ-１のＤＮＡ及びアミノ酸配列、ＬＩＶ-１に対する抗体、並びにＬＩＶ-１が過剰発現する、癌に罹りやすく、又は癌と診断された哺乳動物の治療のための方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、腫瘍でのＬＩＶ-１遺伝子産物の過剰発現によって特徴付けられる
疾患の治療のための組成物と方法に関する。この組成物には、核酸、この核酸に
よってコードされているポリペプチド、及び化合物、好ましくはポリペプチド好
ましくはＬＩＶ-１ポリペプチドの細胞外ドメインと結合する抗体又はその断片
が含まれる。
【０００２】 （発明の背景） 乳癌は、世界中で毎年数百万人もの女性を冒す、広範で破壊的な癌の形態であ
る。多くの乳癌はエストロゲンに対して感受性あり、エストロゲンの乳癌組織上
に発現するエストロゲンレセプター（ＥＲｓ）との結合を妨害する化合物によっ
てしばしば治療が可能である。ＥＲ発現及びエストロゲン刺激に対する感受性の
レベルを検出することは、抗ホルモン型化学療法が特定の患者において有効があ
り得ることを確定するのに有用である。 エストロゲン誘導遺伝子、ｐＬＩＶ-１及びｐＬＩＶ２（ｐＳ２とも命名され
ている）の過剰発現は、エストロゲンレセプターをも発現する幾つかの乳癌にお
いて起こる（Manning, D.L., ら., European J. Cancer 29A(10): 1462-1468(19
93)；Manning, D.L., ら., European J. Cancer 30A(5): 675-678(1994)；Manni
ng, D.L., ら., Oncologica 34(5):641-646(1995)；Manning, D.L., ら., 米国
特許第5,693, 465号)。ｐＳ２ではなく、ｐＬＩＶ-１の発現は、乳癌細胞の領域
リンパ節への転移と関連している（Manningら., 米国特許第5,692, 465号)。 更には、乳癌を含む、種々のヒト悪性腫瘍の病因は、成長因子及び成長因子レ
セプターをコードするプロトオンコジーンの影響を受ける。上皮細胞成長因子（
ＥＧＦＲ）に関連する１８５-ｋｄ膜貫通糖タンパク質レセプター（ＥｒｂＢ２
、ＨＥＲ２又はｐ１８５ＨＥＲ２としても知られている）をコードするヒトＥｒ
ｂ２遺伝子（ｅｒｂＢ２、ｈｅｒ２としても知られている、又はｃ-ｅｒｂＢ-２
）は、ヒト乳癌の約２５％から３０％で過剰発現している（Slamonら., Science
235: 177-182[1987]；Slamonら., Science 244: 707-712[1989]）。
【０００３】 幾つかの証拠は、ＥｒｂＢ２を過剰発現する腫瘍の病原性及び臨床的病原力に
おけるＥｒｂＢ２の直接的な役割を支持している。非新生物細胞へＥｒｂＢ２を
導入すると、その悪性形質転換を引き起こすことが示されている(Hudziakら, Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7159-7163[1987]；DiFioreら, Science 237:78-1
82[1897])。ＥｒｂＢ２を発現するトランスジェニックマウスは、乳腫瘍を発症
する（Guy ら., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10578-10582[1992]）。Ｅｒ
ｂＢ２過剰発現は、特に腋窩リンパ節に関与する原疾患を有する患者における、
乏しい予後の予測指標であると一般的に考えられている(Slamonら, [1987]及び[
1989], 前掲；Ravdin及びChamness, Gene 159:19-27[1995]；及びHynesとStern,
Biochim Biophys Acta 1198:165-184[1994])。 ｅｒｂＢ２タンパク質産物（抗-ＥｒｂＢ２抗体）に対して、そしてｅｒｂＢ
２遺伝子（ｎｅｕ）のラット同等物（抗-ｎｅｕタンパク質抗体）によってコー
ドされているタンパク質に対して向けられている抗体は、Ｂ１０４-１-１細胞上
でのｐ１８５の細胞表層発現（ｎｅｕプロトオンコジーンで形質移入されたＮＩ
Ｈ-３Ｔ３細胞）を下方制御し、この細胞のコロニー形成を阻害する。Drebinら.
, Cell 41: 695-706(1985)。抗-ｎｅｕ抗体の生物学的効果は、Myersら., Meth.
Enzym. 198: 277-290(1991)にてレビューされている。１９９４年１０月１３日
に発行のＷＯ９４／２２４７８も参照のこと。
【０００４】 抗-ＥｒｂＢ２抗体である４Ｄ５は、ＳＫＤＲ３ヒト乳癌腫瘍細胞株に対して
抗増殖作用を示し、およそ細胞増殖の５６％を阻害し、ＴＮＦ-αの細胞障害性
作用に対してｐ１８５ｅｒｂＢ２過剰発現乳腫瘍細胞株を感作させた。また、１
９８９年７月２７日に公開された国際公開８９／０６６９２号を参照のこと。Hu
dziakらにより検討された抗ＥｒｂＢ２抗体は、Fendlyら,Cancer Research 50:1
550-1558(1990)；Kottsら,In Vitro 26(3):59A(1990)；Sraupら,Growth Regulat
ion 1:72-82(1991)；Shepardら,J. Clin. Immunol. 11(3):117-127(1991)；Kuma
rら, Mol. Cell. Biol. 11(2):979-986(1991)；Lewisら, Cancer. Immunol. Imm
unother. 37:255-263(1993)；Pietrasら, Oncogene 9:1829-1838(1994)；Vitett
aら, Cancer Research 54:5301-5309(1994)；Sliwkowskiら, J. Biol. Chem. 26
9(20):14661-14665(1994)；Scottら, J. Biol. Chem. 266:14300-5(1991)；及び
D'souzaら, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:7202-7206(1994)においてもさらに特徴
付けられている。
【０００５】 ＥｒｂＢ２過剰発現はまた、ＣＭＦ(シクロホスファミド、メトトレキセート
及びフルオロウラシル)及びアントラサイクリン(Baselgaら, Oncology 11(3 Sup
pl 1):43-48[1997])を含む、ホルモン治療法及び化学療法に対する感受性及び／
又は耐性に関連している。ＥｒｂＢ２過剰発現が乏しい予後に関連しているにも
かかわらず、タキサンでの治療に臨床的に反応するＨＥＲ２ポジティブ患者の見
込みは、ＨＥＲ２ネガティブ患者の３倍を越えていた(同上)。ｒｈｕＭａｂ Ｈ
ＥＲ２は、高レベルのＨＥＲ２を発現するＢＴ-４７４ヒト乳腺癌細胞を注射し
たヌードマウスにおける乳癌異種移植片に対するパクリタキセル(タキソール(登
録商標））とドキソルビシンの活性を高めることが示されている(Baselgaら, Br
east Cancer, Proceeding of ASCO, vol.13, Abstract 53[1994])。 乳及び他の癌が健康へ絶えず脅威を突きつけることから、同時に多くの否癌牲
細胞を害さずに癌細胞を標的にし、典型的な癌化学療法につきまとっている逆副
作用を制限する方法を用いることによる癌の治療法を開発する継続的な必要性が
存在している。
【０００６】 （発明の要約） 本発明は、前立腺、結腸、肺、乳房のような幾つかの腫瘍細胞において過剰発
現される独特のタンパク質ＬＩＶ-１-１６４６４７、並びに ＬＩＶ-１-１６４
６４７を過剰発現するがＥｒｂＢ２を過剰発現しない乳腫瘍の集団の発見に関す
る。本発明は、更に、ここにで開示されたＬＩＶ-１遺伝子配列（ＤＮＡ１６４
６４７と命名）に対して相同性を有する核酸配列及びアミノ酸配列、並びにＤＮ
Ａ１６４６４７によってコードされているＬＩＶ-１タンパク質のアミノ酸配列
に関する。腫瘍細胞においてＬＩＶ-１-１６４６４７が過剰発現しているという
出願者の発見は、腫瘍細胞の検出と治療ための組成物のさらなる発見、並びにそ
のような検出と治療を実行する方法につながった。
【０００７】 一側面では、本発明は、ＤＮＡ１６４６４７（配列番号：３（コード化配列）
）の核酸配列、或いはその一部分に対して相同性を有する核酸配列に関する。好
ましくは、この相同性とは、少なくとも約８０％相同性、より好ましくは少なく
とも約９０％、さらにより好ましくは少なくと約９５％、及び最も好ましくは少
なくとも９７％の相同性である。好ましくは、本発明の核酸は、ＤＮＡ１６４６
４７（配列番号：３）の約核酸７３から約１０６０に対して、少なくとも８０％
相同的である水溶性細胞外ドメイン（ＥＣＤ）をコードする。好ましくは、本発
明の相同的な核酸は、緊縮性の条件下で、ＤＮＡ１６４６４７（配列番号：３）
の核酸配列の３０核酸又はより長い部分、或いはその相補的な配列とハイブリダ
イズし、好ましくは、緊縮性の条件下で、配列番号：３のヌクレオチド４４０か
らヌクレオチド４７０を含有するまでの３０ヌクレオチド領域、又はその相補的
な配列とハイブリダイズする。関連する実施態様では、本発明の相同的核酸には
、配列番号：３のヌクレオチド４４６からヌクレオチド４６３を含有する配列、
又は配列番号：３のヌクレオチド２２９７から２３３７を含有する配列、或いは
両方の配列に対して、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも８０％、より好
ましくは少なくとも９０％相同的である配列を含んでなる核酸配列が含まれる。
最も好ましくは、単離された核酸は、ヌクレオチド４４６からヌクレオチド４６
４を含有するまで、及び／又はヌクレオチド２２９７から２３３７を含有するま
での配列を含む。現在開示されている発明によると、本発明の単離された核酸は
、配列番号：３の約ヌクレオチド４１２からヌクレオチド４７７を含有するまで
の配列、或いはその相補的な配列に対して、少なくとも６５％、好ましくは少な
くとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なく
とも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９６％の相同性を有する配列を含
む。好ましくは、この配列は、抗原性ポリペプチドのヒスチジンリッチ領域、好
ましくはＥＣＤをコードする。
【０００８】 その他の側面では、本発明は、アミノ酸配列（配列番号：４）、或いはここで
ＬＩＶ-１-１６４６４７と命名されたＤＮＡ１６４６４７によって、又はその中
のものによってコードされているアミノ酸配列（配列番号：４）に対して相同性
を有するアミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチドに関する。好ましく
は、その相同性とは、少なくとも約８０％相同性、より好ましくは少なくとも約
９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、そして最も好ましくは少なく
とも約９７％の相同性である。好ましくは、本発明のＬＩＶ-１-１６４６４７ア
ミノ酸配列は、アミノ酸１から約アミノ酸３２７、又は少なくとも１０のアミノ
酸を含んでなるその断片に対して、水溶性のＥＣＤ相同体である。このＥＣＤの
領域は、標準的なハイドロパシープロットによって容易に決定でき、疎水性膜貫
通領域の比較的により親水性領域のＮ末端を示す。関連する実施態様では、本発
明の相同的アミノ酸配列には、配列番号：４のアミノ酸１２６からアミノ酸１３
２を含有するまでの配列（具体的には、アミノ酸配列HDHHSHH（配列番号：１７
）、又は配列番号：４のアミノ酸７４３からアミノ酸７５５を含有する配列（具
体的には、アミノ酸配列SIFEHKIVFRINF（配列番号：１８）、或いは両方の配列
が含まれる。本発明は、更に、配列番号：１７に対して、少なくとも５０％、好
ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の相同性を有する
アミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチドを含む。本発明は、より更に
は、配列番号：１８に対して、少なくとも２０％、より少なくとも５０％、好ま
しくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の相同性を有するア
ミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチドを含む。更なるその他の実施態
様では、本発明は、配列番号：３の単離された核酸、並びに配列番号：４の単離
されたポリペプチドを含む。本発明は、更には、配列番号：４のアミノ酸１１４
からアミノ酸１３５を含有する配列に対して、少なくとも６５％、好ましくは少
なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少な
くとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９６％を有するアミノ酸配列を
含んでなる単離されたポリペプチドを含む。アミノ酸１１４から１３５のこのア
ミノ酸配列は、配列番号：１９と命名されている。よりさらなる実施態様は、配
列番号：１７及び／又は配列番号：１８を含んでなる単離されたポリペプチドを
含む。
【０００９】 さらにその他の実施態様では、本発明は、配列番号：４のアミノ酸１からアミ
ノ酸３２７を含有する配列に対して少なくとも９８％の相同性があるアミノ酸、
より好ましくはＬＩＶ-１-１６４６４７のＥＣＤを含んでなる単離されたポリペ
プチドを含む。最も好ましくは、この配列は、配列番号：１７を含み、細胞外ド
メイン（ＥＣＤ）の一部分、好ましくはＬＩＶ-１-１６４６４７のＥＣＤを形成
する。ここで使用される「一部分」という用語は、配列番号：４のアミノ酸１か
らアミノ酸３２７を含有する、ＬＩＶ-１-１６４６４７のＥＣＤの７つのアミノ
酸を含む配列に相当する。
【００１０】 その他の実施態様では、本発明は、ＬＩＶ-１-ポリペプチドと特異的に結合す
る抗体に関する。好ましくは、この抗体はモノクローナル抗体である。より好ま
しくは、この抗体はヒト抗体、又はヒト化抗体である。一実施態様では、この抗
体は、細胞での過剰発現ＬＩＶ-１ポリペプチドの活性を減じる。その他の側面
では、この抗体は、好ましくは、非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基、及び
フレームワーク領域（ＦＲ）の残基を有するモノクローナル抗体である。この抗
体を標識して、固体支持体上に固定化してもよい。更なる側面では、この抗体は
、抗体断片、一本鎖抗体、又は抗-イディオタイプ抗体である。好ましくは、本
発明のＬＩＶ-結合抗体は、ＬＩＶ-１ＥＣＤ核酸配列、又はＤＮＡ１６４６４７
（配列番号：３）のＥＣＤコード化領域（ヌクレオチド１−１０００）内によっ
てコードされているその断片に対して、少なくとも約８０％の相同性、より好ま
しくは少なくとも約９０％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも約９５％
の相同性、そして最も好ましくは少なくとも９７％の相同性を有するポリペプチ
ドと特異的に結合する。より好ましくは、本発明のＬＩＶ-１-結合抗体は、ＬＩ
Ｖ-１ＥＣＤ（配列番号：４のアミノ酸１−３２７）のアミノ酸配列に対して、
少なくとも８０％の相同性、より好ましくは少なくとも約９０％の相同性、さら
により好ましくは少なくとも約９５％の相同性、そして最も好ましくは少なくと
も約９７％の相同性を有するポリペプチドと特異的に結合する。好ましい実施態
様では、本発明は、配列番号：３のヌクレオチド４４６からヌクレオチド４６３
を含有する配列、或いは配列番号：３の２２９７から２３３７を含有する核酸配
列、又は両方の核酸配列に対して、少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７
５％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０
％、そして最も好ましくは少なくとも９６％の相同性を有する核酸配列を含んで
なる核酸配列によってコードされているＬＩＶ-１ポリペプチドと特異的に結合
する単離された抗体に関する。その他の好ましい実施態様では、本発明は、配列
番号：４のアミノ酸１２６からアミノ酸１３２を含有する配列、或いは配列番号
：４のアミノ酸７４３からアミノ酸７５５を含有するアミノ酸配列、又は両方の
アミノ酸配列に対して、少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７５％、より
好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、そして
最も好ましくは少なくとも９６％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるＬ
ＩＶ-１ポリペプチドと特異的に結合する単離された抗体に関する。
【００１１】 さらにその他の実施態様では、本発明は、抗体、好ましくは、ＬＩＶ-１の同
じエピトープと特異的に結合するモノクローナル抗体、好ましくは、ここで開示
されているアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）へ寄託し
たハイブリドーマ細胞株によって生産されるモノクローナル抗体のいずれか一つ
と結合するＬＩＶ-１-１１６４６４７に関する。 更なる実施態様では、本発明には、配列番号：４のアミノ酸１からアミノ酸１
４７を含有する配列を含んでなるポリペプチドと結合する抗体が含まれる。その
他の実施態様では、抗体は、配列番号：４のアミノ酸１４８からアミノ酸２９８
を含有する配列を含んでなるポリペプチドと結合する。好ましくは、この抗体は
モノクローナル抗体である。より好ましくは、このモノクロナール抗体は、ヒト
抗体又はヒト化抗体である。
【００１２】 その他の側面では、本発明は、製薬的に許容可能な担体との混合であるＬＩＶ
-１ポリペプチドと結合する抗体を含んでなる組成物に関する。一側面では、こ
の組成物には、抗体の治療的有効量が含まれる。その他の側面では、この組成物
には、例えば、さらに抗体、又は細胞障害性、或いは化学療法剤でもよいさらな
る活性成分が含まれる。好ましくは、この組成物は無菌である。 更なる実施態様では、本発明は、本発明に記載の抗-ＬＩＶ-抗体をコードする
核酸、並びにそのような核酸を含んでなるベクター及び組み換え宿主細胞に関す
る。 さらに更なる実施態様では、本発明は、抗体が発現する条件下で抗体をコード
する核酸で形質転換した宿主細胞を培養し、その細胞培養から抗体を回収するこ
とによって抗-ＬＩＶ-抗体を生産する方法に関する。
【００１３】 本発明は、更に、ＬＩＶ-１ポリペプチドのアンタゴニスト及びアゴニストに
関し、そのアゴニストはＬＩＶ-１ポリペプチドの機能又は活性の一つ以上を阻
害し、アゴニストはＬＩＶ-１ポリペプチドの機能又は活性の一つ以上を模倣す
る。好ましくは、ＬＩＶ-１ポリペプチドは、機能又は活性がアンタゴナイズ又
はアゴナイズしているＬＩＶ-１-１６４６４７ポリペプチドである。 その他の実施態様では、本発明は、ＬＩＶ-１ポリペプチドを含有すると思わ
れる細胞を本発明の抗-ＬＩＶ-１抗体へ曝露し、抗体の細胞との結合を測定する
ことを含んでなる、ＬＩＶ-１ポリペプチド、又はその断片の存在を測定する方
法に関する。 更に他の実施態様では、本発明は、哺乳動物から得られた組織細胞の被験試料
、並びに同じ細胞型の既知の正常な組織細胞のコントロール試料中でのＬＩＶ-
１ポリペプチドをコードする遺伝子の発現のレベルを検出することを含んでなる
、哺乳動物における腫瘍の診断方法に関し、ここで、被験試料での高い発現レベ
ルは、被験組織細胞が得られた哺乳動物中に腫瘍が存在することを示す。
【００１４】 他の実施態様では、本発明は、哺乳動物から得られた組織細胞の被験試料に抗
-ＬＩＶ-１抗体を接触させ、被験試料中における抗-ＬＩＶ-１抗体とＬＩＶ-１
ポリペプチドの間の複合体の生成を検出することを含んでなる、哺乳動物におけ
る腫瘍の診断方法に関する。この検出は定量的又は定性的でもよく、同じ細胞型
の既知の正常な組織細胞のコントロール試料における複合体の生成をモニターし
て比較しながら行われてもよい。被験試料中に生成された多量の複合体は、被験
組織細胞が得られた哺乳動物中に腫瘍が存在することを示す。抗体は、好ましく
は検出可能な標識を担持する。複合体生成は、光学顕微鏡、フローサイトメトリ
ー、蛍光定量法、あるいは他の当該分野で知られている方法によりモニターする
ことができる。 診断方法のために、被験試料は、通常は腫瘍細成長又は増殖(例えばガン細胞)
を有すると思われる個人から得られる。
【００１５】 その他の実施態様では、本発明には、ＬＩＶ-１タンパク質を過剰発現し、正
常なレベルのＥｒｂＢ２を発現する組織としての乳腫瘍組織の診断方法が含まれ
る。この方法には、コントロールがポジティブコントロール、ネガティブコント
ロール、或いは両方である場合に、癌牲であると思われる組織の被験試料を提供
すること、被験試料をＬＩＶ-１遺伝子産物の天然発生形態に対する抗体と接触
させること、同じ又は控えの被験試料と抗-ＥｒｂＢ２抗体と接触させること、
コントロール試料と比較して被験試料に対する抗体の相対結合を検出することが
含まれる。ＬＩＶ-１遺伝子産物（正常組織に対して）を過剰発現し、ＥｒｂＢ
２タンパク質（正常組織に対して）を過剰発現しない被験試料は、本発明の組成
物及び方法によって治療される乳腫瘍の集団の一部として診断される。本発明の
診断アッセイ方法において有用なのは、ＥｒｂＢ２レセプターの細胞外ドメイン
と結合し、好ましくはＥｒｂＢ２細胞外ドメイン配列内のエピトープ４Ｄ５又は
３Ｈ４と結合する抗-ＥｒｂＢ２抗体である。より好ましくは、この抗体は抗体
４Ｄ５である。限定されるものではないが、他の好ましいＥｒｂＢ２結合抗体に
は、抗体７Ｃ２、７Ｆ３、及び２Ｃ４が含まれる。抗-ＥｒｂＢ２抗体に関する
情報は、例えば、そのすべてが参考文献としてここに取り入れられているHudzia
k, R.M.ら., 米国特許第５，７７２，９９７号に見出せる。
【００１６】 その他の側面では、本発明は、抗-ＬＩＶ-１-１６４６４７抗体と担体(例えば
バッファー)を適当な包装中に含んでなる癌診断キットに関する。このキットは
、好ましくはＬＩＶ-１ポリペプチドを検出するために抗体を使用ことに関する
指示を含む。 更なるその他の側面では、本発明は、ＬＩＶ-１ポリペプチドを過剰発現する
細胞を、ＬＩＶ-１ポリペプチドの発現及び／又は活性を阻害する有効量の薬剤
に暴露することを含んでなる、腫瘍細胞の成長を阻止する方法に関する。この薬
剤は、好ましくは抗-ＬＩＶ-１-１６４６４７抗体、小さい無機及び有機分子、
ペプチド、リンペプチド、アンチセンス又はリボザイム分子、あるいは三重らせ
ん体分子である。特定の側面では、この薬剤、例えば抗-ＬＩＶ-１-１６４６４
７抗体は細胞死を誘導するか、或いは少なくとも他の癌療法を施すことを可能に
するのに十分に細胞の成長を遅らせる。更なる側面では、腫瘍細胞をさらに放射
線治療及び／又は細胞障害性又は化学療法剤へ曝露する。
【００１７】 さらにその他の側面では、本発明は、ＥｒｂＢ２レセプターの過剰発現をとも
なわないＬＩＶ-１遺伝子産物の過剰発現によって特徴付けられる疾患の診断を
下されるか、又はそれに罹りやすいヒト患者の治療方法に関する。実施態様では
、この方法には、抗-ＬＩＶ-１ポリペプチド抗体の治療的有効量を投与すること
が含まれ、投与とは、静脈注射、皮下投与、又は抗体送達の他の製薬的に許容可
能な方法であってよい。好ましくは、抗体は、ＬＩＶ-１-１６４６４７ポリペプ
チドの天然発生形態と特異的に結合し、この結合は、好ましくは細胞外ドメイン
又はその断片に対するものである。好ましくは、初期の一服投与（又は複数投与
）と並んでその後の継続の一服投与又は複数投与は、皮下投与される。選択的に
は、患者の抗-ＬＩＶ-１抗体に耐える力が未知である場合、初期投与は静脈内注
射によって行われ、患者の抗体に対する耐性が許容可能ならば、皮下投与の継続
投与がその後に続く。本発明の実施態様によると、初期投与又は複数投与には、
有効な標的レベル又はそれ以上に抗体の底値血清濃度を維持するのに極めて十分
な間隔での、等量又は少量の抗体の事後投与が後に続く。好ましくは、初期投与
又は個々の事後投与は、１００ｍｇ／ｋｇを超えず、各事後投与は、少なくとも
１μｇ／ｋｇである。初期及び維持投与に関する送達方法の選択は、動物又はヒ
ト患者の体への抗体の導入に耐える能力に従って行われる。抗体が上手く耐えら
れるものであるならば、注入の時間を減じてもよい。この実施態様で開示された
送達方法の選択は、本発明に従って考えられたすべての薬剤送達方式へ適用され
る。
【００１８】 更なる側面では、本発明は、抗-ＬＩＶ-１抗体（抗体が、好ましくはＬＩＶ-
１遺伝子産物の細胞外ドメインと結合する）、及び化学療法剤の有効量を患者へ
投与することを含んでなる、ヒト患者のＬＩＶ-１遺伝子産物過剰発現する癌（
ＥｒｂＢ２の過剰発現を欠く）の治療法を提供する。本発明の一つの実施態様で
は、限定されるものではないが、化学療法剤は、パクリタキセル及びドキシタキ
セルを含むタキソイドである。その他の実施態様では、化学療法剤は、限定され
るものではないが、ドキソルビシン及びエピルビシンを含むアントラサイクリン
誘導体である。更なるその他の実施態様では、化学療法剤は、抗-ＬＩＶ-１抗体
とともに同時に患者へ投与されない。また、一つ又は複数の付加的な化学療法剤
を患者へ投与してもよい。
【００１９】 本発明の方法によってなるべく治療されるべき疾患とは、ＬＩＶ-１遺伝子産
物の過剰発現によって特徴付けられる良性又は悪性腫瘍である。好ましくは、腫
瘍の悪性細胞は、同じ型の非癌牲細胞のように、およそ同じレベルのＥｒｂＢ２
（又はより低い）を発現する。例えば、治療されるべき疾患は、癌、例えば乳癌
、肺癌、及び前立腺癌である。 従って、本発明の一側面には、ＬＩＶ-１タンパク質と結合し、その活性を阻
害する化合物が含まれる。好ましくは、この化合物は、ＬＩＶ-タンパク質の細
胞外領域と結合し、その活性を阻害する。本発明の実施態様では、阻害性の化合
物は、ＬＩＶ-１遺伝子産物又はその断片に対して特異的な抗体である。好まし
くは、本発明の阻害性の化合物は、ＬＩＶ-１タンパク質の細胞外領域と特異的
に結合する。 その他の側面では、本発明には、ＬＩＶ-１タンパク質の活性化リガンドの結
合をブロックする化合物が含まれる。そのようなリガンド阻止化合物には、ポリ
ペプチドに限定されるものではないが、タンパク質、抗体及びその類似物が含ま
れる。好ましくは、このリガンド阻止化合物は、ＬＩＶ-１活性化リガンドの活
性をブロックする。より好ましくは、本発明のリガンド阻止化合物は、ＬＩＶ-
１-発現細胞の成長を阻害する。
【００２０】 その他の側面では、本発明は、被験化合物とポリペプチドとの相互作用が可能
となる条件の下、並びに十分な時間にわたって、候補化合物とＬＩＶ-１ポリペ
プチドを接触させ、ＬＩＶ-１ポリペプチドの発現及び／又は活性を阻害するこ
との可能な化合物を同定する方法を提供する。特別な側面では、候補化合物又は
ＬＩＶ-１ポリペプチドのいずれかが、固体支持体上に固定されている。その他
の側面では、非固定化成分は検出可能な標識を担持する。 更なるその他の側面では、本発明は、容器；ＬＩＶ-１タンパク質（好ましく
は、細胞外ドメイン、又はその断片と結合する）、或いはＬＩＶ-１タンパク質
の活性化リガンドと結合する抗-ＬＩＶ-１抗体を含んでなる容器内の組成物；並
びに随意的には、組成物が、ＥｒｂＢ２の過剰発現をともなわないＬＩＶ-１の
過剰発現によって特徴付けられる症状を治療することに使用することができるこ
とを示す容器上の、又はその容器と関連しているラベルを含んでなる製造品に関
する。本発明のその他の実施態様によると、製造品には、更に、少なくとも一回
の投与に関する、好ましくは初期投与に続くすべての事後投与、最も好ましくは
全ての投与に関する、抗-ＬＩＶ-１抗体を皮下的に投与するための指示書を含ん
でなる添付文書が含まれる。
【００２１】 本発明の方法及び組成物は、抗-ＬＩＶ-１抗体を含み、その抗体は、ＬＩＶ-
１遺伝子産物の細胞外ドメイン、或いは細胞外ドメインの断片と特異的に、そし
て好んで結合する。本発明の組成物には、好ましくはヒト化ＬＩＶ-１抗体が含
まれる。従って、本発明は、ＬＩＶ-１遺伝子産物の細胞外ドメインと特異的に
、そして好んで結合する抗体を含んでなる組成物に関し、並びに、例えば高レベ
ルのＥｒｂＢ２を同時発現しないＬＩＶ-１過剰発現性癌のような、ヒトにおけ
るＬＩＶ-１＋／ＥｒｂＢ２発現性癌の治療のための抗体の使用に関する。好ま
しくは、この抗体は、モノクローナル抗体、例えば、ＬＩＶ-１の細胞外ドメイ
ン（又は細胞外ドメインの一部分）と結合するヒト化抗-ＬＩＶ-１モノクローナ
ル抗体（以下において抗-ＬＩＶ-１）である。この抗体は、無傷の抗体（例えば
、無傷のＩｇＧ抗体）、又は抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（Ａｂ）２ダイアボ
ディ、及びその類似物）である。ヒト化抗-ＬＩＶ-１抗体の可変軽鎖及び可変重
鎖領域。 本発明のこれら及び他の利点と特徴は、下記により完全に記載した本発明と添
付した請求項の詳細な内容を読むことによって、当該分野に熟練した者にとって
明らかになる。
【００２２】 （好適な実施態様の詳細な説明） Ｉ．定義 ここで使用されているように、「ＬＩＶ-１」という用語は、遺伝子又はそれ
がコードしているタンパク質に相当し、その遺伝子転写物は、幾つかの癌細胞に
おいて上記の標準的なレベルで検出される。より具体的には、本発明の遺伝子又
はタンパク質は、ＤＮＡ１６４６４７（配列番号：３）によってコードされてい
るものであり、配列番号：４の推定アミノ酸配列を有する。ここで使用されてい
るように、ＬＩＶ-１という用語は、ＬＩＶ-１６４６４７に相当し、その開示は
少なくとも配列番号：３のヌクレオチドを含んでなるか、或いはその開示は少な
くとも、ここで開示されているような配列番号：４の７のアミノ酸を含んでなる
アミノ酸配列に相当する。本発明によれば、ＥｒｂＢ２レセプターをコードする
遺伝子は、標準量より高くは発現しないが、ＬＩＶ-１-１６４６４７は、細胞で
標準量よりも高く発現する。標準の発現よりもより高いそのような発現は、遺伝
子又はタンパク質の「過剰発現」と称されている。「ＬＩＶ-１」又は「ＬＩＶ-
１-１-１６４６４７」という用語は、ＬＩＶ-１遺伝子又はそれによってコード
されているタンパク質を称するために使用され得る。一般的には、タンパク質又
はペプチドを考慮する場合には、「ＬＩＶ-１タンパク質」という用語が使用さ
れる。
【００２３】 「ＬＩＶ-１遺伝子産物」又は「ＬＩＶ-１タンパク質」という用語は、その遺
伝子の発現タンパク質産物、好ましくは、その遺伝子産物のポリペプチド又はタ
ンパク質形態に相当する。本発明によると、ＬＩＶ-１遺伝子産物のポリペプチ
ド又はタンパク質形態には、その遺伝子産物の可溶性形態（すなわち、ＬＩＶ-
１遺伝子産物の細胞外ドメイン（ＥＣＤ））が含まれ、その可溶性形態は、完全
長ＬＩＶ-１遺伝子産物の細胞外ドメインと結合し、その活性化を阻害する抗-Ｌ
ＩＶ-１遺伝子産物を産生する抗原として有用である。また、ＬＩＶ-１遺伝子産
物がメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）遺伝子産物に相当し得ることは理解され
、これが適切な場合には、タンパク質とｍＲＮＡの区別がなされる。本発明に記
載のＬＩＶ-１タンパク質は、ＤＮＡ１６４６４７（配列番号：３、又はその相
補体；Ｆｉｇ２Ａ）に対して少なくとも８０％の相同性、配列番号：３又はその
相補体、或いはその一部分に対して、好ましくは少なくとも約９０％の相同性、
より好ましくは少なくとも約９５％、そして最も好ましくは少なくとも約９７％
の相同性がある配列を含んでなる本発明の核酸によってコードされている。本発
明のＬＩＶ-１核酸は、緊縮性の条件下で、配列番号：３又はその相補体、或い
はその一部分とハイブリダイズする。本発明のＬＩＶ-１タンパク質は、ＤＮＡ
１６４６４７（ＬＩＶ-１ポリペプチド、配列番号：４；Ｆｉｇ２Ｂ）によって
コードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％の相同性、配列番号：４
、又はその断片に対して、好ましくは少なくとも約９０％の相同性、より好まし
くは少なくとも約９５％、そして最も好ましくは少なくとも約９７％の相同性が
ある。
【００２４】 「抗-ＬＩＶ-１抗体」、「ＬＩＶ-１抗体」という用語、並びに文法的に類似
の用語は、少なくとも、配列番号：４の予想されたアミノ酸配列（ＬＩＶ-１-１
６４６４７遺伝子の予想された完全長アミノ酸配列）を有するＬＩＶ-１-１-１
６４６４７タンパク質の細胞外ドメインの一部分と特異的に結合する抗体に相当
する。好ましくは、この抗体は、ＬＩＶ-１遺伝子産物の細胞外ドメインと結合
し、より好ましくは、ここで開示のモノクローナル抗体が結合するエピトープＡ
、Ｂ、又はＣと同じようなエピトープと結合する。さらにより好ましくは、抗-
ＬＩＶ-１-１６４６４７抗体は、配列番号：４のアミノ酸１１４からアミノ酸１
３５を含有する配列に対して、少なくとも６５％の相同性を有するポリペプチド
と結合する。好ましくは、本発明の抗-ＬＩＶ-１抗体は、この抗体がヒト患者を
治療するために使用される場合には、ヒト又はヒト化のものである。
【００２５】 本発明の抗体は、好ましくは、ヒトＬＩＶ-１-１６４６４７と特異的に結合す
るものであり、このことは、それが他のタンパク質と顕著に交差反応しないこと
を意味する。そのような実施態様では、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）分
析又は放射性免疫沈降法（ＲＩＡ）による測定では、ＬＩＶ-１遺伝子産物以外
のタンパク質との抗体の結合の程度は、約１０％より低い。 「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、例えば、単一の抗-Ｌ
ＩＶ-１モノクローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体を含む
)、多エピトープ特異性を持つ抗-ＬＩＶ-１抗体組成物、一本鎖抗-ＬＩＶ-１抗
体を包含している。ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実
質的に均一な抗体の集団、すなわち、少量存在し得る自然に生じる可能性のある
突然変異を除いて、構成する個々の抗体が同一である集団から得られる抗体を称
する。
【００２６】 「抗体」（Ａｂｓ）及び「免疫グロブリン」（Ｉｇｓ）は同じ構造的特徴を持
つ糖タンパク質である。抗体は特定の抗原に対する結合特異性を示すが、免疫グ
ロブリンは抗体及び抗原特異性を持たない他の抗体様分子の両方を含む。後者の
種類のポリペプチドは、例えば、リンパ系では低レベルで産生され、ミエローマ
において産生レベルが増加する。「抗体」という用語は最も広い意味で使用され
、限定されることなく、無傷のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少な
くとも２つの無傷の抗体から形成される多重特異的抗体（例えば二重特異的抗体
）、及びそれらが所望の生物学的活性を有している限り抗体断片を包含する。
【００２７】 「天然抗体」及び「天然免疫グロブリン」は、通常、２つの同一の軽(Ｌ)鎖及
び２つの同一の重(Ｈ)鎖からなる、約１５０,０００ダルトンの異種四量体糖タ
ンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合してお
り、異なる免疫グロブリンアイソタイプ重鎖中のジスルフィド結合の数は相違す
る。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した部位との間で鎖内ジスルフィド架橋
を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインに続いて可変ドメイン(ＶＨ)を一
端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(ＶＬ)を、他端に定常ドメインを有
し；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメイ
ンは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖
可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。
【００２８】 「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲
に異なるという事を意味し、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合及び特
異性に利用される。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様
には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の高頻度可変領域又は
相補性決定領域(ＣＤＲｓ)と呼ばれる３つのセグメントに濃縮される。可変ドメ
インのより高度に保存された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然
の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、ループ結合を形成し、そしてある場合にはそ
の一部を形成する-シート構造を形成する、３つのＣＤＲにより連結された-シー
ト配置を主にとる４つのＦＲ領域をそれぞれ含んでいる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ
領域により近接して結合せしめられ、他の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部
位の形成に寄与している(Kabat等, NIH Publ. No.91-3242, Vol.I, 647-669頁(1
991)を参照のこと)。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連している
ものではないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞毒性における
抗体の関与を示す。
【００２９】 ここで使用される場合、「高頻度可変領域」なる用語は、抗原結合において重
要な抗体のアミノ酸残基を意味する。高頻度可変領域は、「相補性決定領域」か
ら「ＣＤＲ」のアミノ酸残基(すなわち、軽鎖可変ドメインの残基、及び重鎖可
変ドメインの残基；Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Intere
st,５版, Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda,
MD.[1991])及び／又は「高頻度可変ループ」からの残基(すなわち、軽鎖可変ド
メインの残基、及び重鎖可変ドメインの残基；Chothia及びLesk J.Mol.Biol. 19
6:901-917 [1987])を含む。「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基はここに定義
した高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００３０】 「抗体断片」は、未変性の抗体の一部、好ましくは未変性の抗体の抗原結合又
は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ')２、及びＦ
ｖ断片；ダイアボディ(diabody)；直鎖状抗体（Zapata等, Protein Eng., 8(10)
: 1057-1062 [1995]）；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成される多重特異
的抗体を含む。 抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれ、各々単一の抗原結合部位を
持つ２つの同一な抗原結合断片、及び、その名称が容易に結晶化する能力を反映
している残りの「Ｆｃ」断片を生成する。ペプシン処理により、２つの抗原結合
部位を有するが、交差結合抗原であり得るＦ(ａｂ')２断片が生成される。
【００３１】 「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小抗体断片である。この領
域は、緊密に非共有的に結合した１つの重鎖と１つの軽鎖の可変ドメインの二量
体からなる。この配置では、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面における抗原結合部位を決
定するために各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用する。正確には、６つの
ＣＤＲが抗体に抗原結合特異性を与える。しかし、単一の可変ドメイン（又は抗
原特異的な３つのＣＤＲしか含まないＦｖの半分）でさえも抗原を認識し結合す
る能力を持つが、結合部位全体よりは親和性が低い。 また、Ｆａｂ断片は軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ
１）も含む。Ｆａｂ断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ又は複数のシステインを
含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端における数個の残基の付加によりＦ
ａｂ断片と相違する。Ｆａｂ'-ＳＨは、ここにおいて、定常ドメインのシステイ
ン残基が遊離のチオール基を持つＦａｂ'の記号である。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は
、元々、それらの間にヒンジシステインを持つＦａｂ'断片の対として生成され
た。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
【００３２】 任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常
ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる
２つの明らかに異なる型の１つに分類できる。 重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、免疫グロブリンは異なるクラ
スに分けられる。免疫グロブリンには５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、Ｉ
ｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらの幾つかは、更にサブクラス（アイソ
タイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ
２に分けられる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは
、各々α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサ
ブユニット構造及び三次元配置は良く知られている。
【００３３】 ここで用いられる「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均一な抗体の
集団、即ち、集団を構成する個々の抗体が少量存在する起こりうる自然発生突然
変異体以外は同一であるような集団から得られる抗体を意味する。モノクローナ
ル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に向けられている。さらに、通常
は、異なる決定基（エピトープ）に対して作られた様々な抗体を含む従来の（ポ
リクローナル）抗体調製物とは違い、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決
定基に対して向けられている。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は
、ハイブリドーマ培養によって合成され、他の免疫グロブリンに汚染されていな
い点において有利である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な
抗体集団から得られという抗体の特徴を示すものであって、ある特定の方法によ
る抗体の生産を必要とすることを意味するためのものではない。例えば、本発明
に従って使用されるモノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256: 495 [1975
]によって最初に記載されたハイブリドーマ法により作成してもよいし、組換え
ＤＮＡ法（例えば、米国特許第4,816,567号参照）により作成してもよい。また
「モノクローナル抗体」はファージ抗体ライブラリから、例えば、Clackson等,
Nature, 352: 624-628 [1991]及び Marks等, J. Mol. Biol., 222: 581-597 (19
91)に記載された技術を用いて単離してもよい。
【００３４】 ここで、モノクローナル抗体は特に、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含
み、それは、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種から誘導された又は特定の抗
体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同であるが、
鎖の残りの部分は他の種から誘導された又は他の抗体クラス又はサブクラスに属
する抗体、並びにそれらが所望の生物学的活性を示す限りにおいてそれらの抗体
の断片の対応する配列と同一又は相同である（米国特許第4,816,567号；Morriso
n等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 [1984]）。ここで対象であ
るキメラ抗体には、げっ歯類（例えば、マウスの）起源の抗原結合領域をともな
うヒト定常領域配列、又は非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、サル、マカク等
）から誘導した可変領域抗原結合配列を含んでなる「霊長類化」抗体、或いは対
象の抗原で免疫化した他の非ヒト類で生成した抗体から誘導した抗原結合領域が
含まれる。
【００３５】 非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンから誘
導された最小配列を含有する特定のキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又
はそれらの断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２あるいは抗体の
他の抗原結合性配列）である。大部分において、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリ
ン（レシピエント抗体）であって、そのレシピエントＣＤＲ由来の残基が、マウ
ス、ラット又はウサギなどのヒト以外の種のＣＤＲ（ドナー抗体）に由来する所
望の特異性、親和性及び容量を持つ残基で置換されている。ある場合は、ヒト免
疫グロブリンのＦｖＦＲ残基が対応する非ヒト残基で置換される。さらに、ヒト
化抗体は、レシピエント抗体にも、移植されるＣＤＲ又は枠配列にも見られない
残基を含んでもよい。これらの修飾は、抗体の性能をさらに精密かつ最適化する
ために施される。一般にヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全て又は実質上全てが非ヒ
ト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全て又は実質上全てがヒト免疫グ
ロブリン配列のものである少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実
質的に全部を含有するであろう。また、最適なヒト化抗体は、免疫グロブリン定
常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含有
するであろう。さらなる詳細については、Jones等, Nature 321: 522-525 (1986
)；Reichmann等, Nature 332: 323-329 (1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct
. Biol. 2: 593-596 (1992)を参照のこと。
【００３６】 「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含
み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、Ｆｖポ
リペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それ
はｓＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓＦｖの概説に
ついては、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg
及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを
参照のこと。
【００３７】 「ダイアボディ」なる用語は、二つの抗原結合部位を持つ小さい抗体断片を指
し、その断片は同一のポリペプチド鎖(ＶＨ−ＶＬ)内で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)
に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)が結合している。非常に短いために同一鎖上で二つの
ドメインの対形成を不可能にするリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補
ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を形成する。ダイアボディ
ーは、例えば、ＥＰ４０４０９７；ＷＯ９３／１１１６１；及びHollingerら, P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)に更に詳細に記載されている
。
【００３８】 「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又
は回収されたものを意味する。その自然環境の狭雑成分とは、抗体の診断又は治
療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は
非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、抗体は、(１)ロー
リー(Lowry)法によって決定した場合９５重量％以上の、最も好ましくは９９重
量％の抗体まで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用することによ
り、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分な
程度まで、あるいは（３）非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥを行
い、クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色によって、均一になるまで精製
されうる。単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれるが
、これは抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないからである。しか
しながら、通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により調製され
る。
【００３９】 ここで使用される「過剰発現」という用語は、遺伝子及び／又はそれによって
コードされている癌細胞のような細胞のタンパク質に相当する。タンパク質を「
過剰発現」する癌細胞とは、同じ組織型の非癌細胞と比較して、顕著により高い
レベルのそのタンパク質を有する癌細胞である。例えば、本発明によれば、ＬＩ
Ｖ-１タンパク質の過剰発現は、遺伝子増幅、或いは増大した転写又は翻訳によ
って起こり得る。
【００４０】 ＬＩＶ-１タンパク質の過剰発現は、細胞又は組織でのＬＩＶ-１ｍＲＮＡのレ
ベルの増加を評価することによる（例えば、定量ＰＣＲ法によって）、或いは細
胞の表層に存在するＬＩＶ-１タンパク質を検出するによる（例えば、免疫組織
化学アッセイ）、診断又は予後アッセイで測定してもよい。あるいは、又は付加
的には、例えば、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ；１９９８
年１０月に発行のＷＯ９８／４５４７９）、サザンブロット、或いはリアルタイ
ム定量ＰＣＲ（ＲＴ-ＰＣＲ）などのポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）技術に
よって、細胞の中のＬＩＶ-１コード化核酸のレベルを測定してもよい。また、
ＬＩＶ-１タンパク質又はその断片と結合する抗体と体液又は他の試料を接触さ
せることで、血清などの生物体液中の流出抗原（例えば、ＬＩＶ-１細胞外ドメ
イン）を測定によって、ＬＩＶ-１の過剰発現を研究し得る。種々のインビトロ
及びインビボアッセイが、熟練した技術者にとって入手可能である。例えば、Ｌ
ＩＶ-１タンパク質又はその断片、或いは患者の体内の細胞を含んでなる組織又
は体液を、例えば放射活性アイソトープで随意的に標識された抗体へ曝露しても
よく、そして例えば放射活性の外部走査によって、或いは事前に抗体へ曝露した
患者から取り出した生検用組織を分析することによって、試料又は患者の細胞へ
の抗体の結合を評価することができる。
【００４１】 ＬＩＶ-１を「過剰発現する」細胞は、同じ組織型の非癌牲細胞と比較して、
正常なＬＩＶ-１核酸レベルよりも著しく高い。典型的には、この細胞は、癌細
胞、例えば乳房、卵巣、前立腺、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、結腸、甲状
腺、膵臓又は気泡細胞である。また、この細胞は、細胞株、例えばＳＫＢＲ３、
ＢＴ４７４、Ｃａｌｕ３、ＭＤＡ-ＭＢ-４５３、ＭＤＡ-ＭＢ-３６１又はＳＫＯ
Ｖ３である。 逆に、ＬＩＶ-１タンパク質又はＬＩＶ-１遺伝子の過剰発現によって特徴付け
られない癌は、診断アッセイにおいて、同じ組織型の非癌細胞と比較して、ＬＩ
Ｖ-１タンパク質又はＬＩＶ-１遺伝子の正常なレベルよりもより高い発現をしな
い。
【００４２】 「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴と
する、哺乳動物における生理学的状態を指すか又は表す。癌の例には、これらに
限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含
まれる。このような癌のより特定な例としては、乳癌、前立腺癌、大腸癌、扁平
上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子
宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液
腺癌、腎臓癌、肝臓癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝癌及び様々な種類の頭部及び頸
部の癌が含まれる。
【００４３】 「遺伝子増幅」及び「遺伝子重複」なる語句は交換可能に用いられ、遺伝子又
は遺伝子断片の複数のコピーが特定の細胞又は細胞系で生成されるプロセスを意
味する。重複された領域（増幅されたＤＮＡの伸展）は、しばしば「単位複製配
列」と呼ばれる。通常は、生成されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の量、
即ち遺伝子発現レベルも、発現された特定遺伝子の作成されたコピー数に比例し
て増加する。 ここで用いられる「腫瘍」は、悪性又は良性に関わらず、全ての腫瘍形成細胞
成長及び増殖、及び全ての前癌性及び癌性細胞及び組織を意味する。
【００４４】 「治療」とは、疾患の進行を阻害する、もしくは病理を変化させることを意図
して、行う処置のことである。従って、「治療」は治療的処置及び予防的又は保
護的手段の両方を指す。治療が必要なものは、既に疾患に罹っているもの並びに
疾患が防止されるべきものを含む。腫瘍（例えば、癌）治療では、治療薬は直接
的に腫瘍細胞の病理を低下させてもよいし、又は腫瘍細胞を他の治療媒介物、例
えば放射線及び／又は化学治療に対してより敏感にしてもよい。 癌の「病理」は、患者の良好な生存を損なう全ての現象を含む。これは、限定
されるものではないが、異常又は制御不能な細胞成長、転移、隣接細胞の正常機
能の阻害、サイトカイン又は他の分泌生成物の異常レベルでの放出、炎症又は免
疫反応の抑制又は悪化などを含む。 治療の目的とされる「哺乳動物」は、哺乳類に分類される任意の動物を意味し
、ヒト、家畜用及び農場用動物、動物園、スポーツ用、又はペット動物、例えば
イヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジなどを含む。好ましくは、哺乳動物はヒ
トである。
【００４５】 ここで用いられる「担体」は製薬的に許容される担体、賦形剤、又は安定化剤
を含み、それらは、用いられる用量及び濃度でそれに曝露される細胞又は哺乳動
物に対して非毒性である。生理学的に許容される担体は、ｐＨ緩衝水溶液である
ことが多い。生理学的に許容される担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他
の有機酸；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）のポ
リペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブ
リン；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アス
パラギン、アルギニン又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデ
キストラン等の単糖類、二糖類及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート化剤；
マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオ
ン；及び／又はTWEEN(商品名)、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びPLURO
NICS(商品名)等の非イオン性界面活性剤を含む。
【００４６】 一又は複数のさらなる治療薬「と組み合わせて」の投与は、同時（一時）及び
任意の順序での連続投与を含む。 ここで用いられる「細胞障害性薬」なる用語は、細胞の機能を阻害又は抑制す
る及び／又は細胞破壊を生ずる物質を意味する。この用語は、放射性同位体（例
えば、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０及びＲｅ１８６）、化学治療薬、及び細菌、
真菌、植物又は動物由来の酵素的活性毒素といった毒素、又はその断片を含むと
される。
【００４７】 「化学治療薬」は、癌の治療に有用な化合物である。化学治療薬の例は、アド
リアマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、５-フルオロウラシル、シトシ
ンアラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルフ
ァン、サイトキシン、タキソイド、例えばパクリタキセル（Taxol(商品名), Bri
stol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ）及びドキセタキセル（Taxotere,
Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）、トキソテール、メトトレキセート、
シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、
イフォスファミド、マイトマイシンＣ、マイトキサントロン、ビンクリスチン、
ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシ
ン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラマイシン（
米国特許第4,675,187号）、５-ＦＵ、６-チオグアニン、６-メルカプトプリン、
アクチノマイシンＤ、ＶＰ-１６、クロランブシル、メルファラン、及び他の関
連するナイトロジェンマスタードを含む。また、この定義に含まれるのは、タモ
キシフェン及びオナプリストンなどの腫瘍へのホルモン作用を調節又は阻害する
ように作用するホルモン様薬剤である。
【００４８】 ここで用いられる際の「成長阻害剤」は、細胞、特にここで同定される任意の
遺伝子を過剰発現する癌細胞の成長を、インビトロ又はインビボで阻害する化合
物又は組成物を意味する。即ち、成長阻害剤は、Ｓ期でそのような遺伝子を過剰
発現する細胞の割合を有意に減少させるものである。成長阻害剤の例は、細胞周
期の進行を（Ｓ期以外の位置で）阻害する薬剤、例えばＧ１停止又はＭ期停止を
誘発する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス（ビンクリスチン及
びビンブラスチン）、タキソール、及びトポＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン
、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。ま
たＧ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、ＤＮＡアルキ
ル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミ
ン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びａｒａ-Ｃで
ある。さらなる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrae
l, 編, Chapter 1, 表題「Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplas
tic drugs」, Murakami等, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特にp13に見
出すことができる。
【００４９】 「ドキソルビシン」はアントラサイクリン抗生物質である。ドキソルビシンの
完全な化学名は、(８Ｓ-シス)-１０-[(３-アミノ-２，３，６-トリデオキシ-α-
Ｌ-リキソ-ヘキサピラノシル)オキシ]-７，８，９，１０-テトラヒドロ-６，８
，１１-トリヒドロキシ-８-(ヒドロキシアセチル)-１-メトキシ-５，１２-ナフ
タセンジオンである。
【００５０】 「サイトカイン」なる用語は、１つの細胞集団から放出され、他の細胞に細胞
間メディエータとして作用するタンパク質の一般用語である。このようなサイト
カインの例は、リンホカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモン
である。サイトカインに含まれるのは、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン
、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン
；チロキシン；インシュリン；プロインシュリン；レラキシン；プロレラキシン
；糖タンパク質ホルモン、例えば濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホル
モン（ＴＳＨ）、及び黄体化ホルモン（ＬＨ）；肝臓成長因子；線維芽成長因子
；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子-α及び-β；ミューラー阻害因
子；マウス生殖腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内
皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ-β等の神経
成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ-α及びＴＧＦ-β等のトランスフォーミング
成長因子（ＴＧＦｓ）；インシュリン様成長因子-Ｉ及びＩＩ；エリスロポエチ
ン（ＥＰＯ）；骨誘発因子；インターフェロン-α、-β、及び-γ等のインター
フェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）、例えばマクロファージ-ＣＳＦ（Ｍ-
ＣＳＦ）；顆粒球-マクロファージ-ＣＳＦ（ＧＭ-ＣＳＦ）；及び顆粒球-ＣＳＦ
（Ｇ-ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬｓ）、例えばＩＬ-１、ＩＬ-１ａ、Ｉ
Ｌ-２、ＩＬ-３、ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、ＩＬ-８、ＩＬ-９、Ｉ
Ｌ-１１、ＩＬ-１２；腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ-α及びＴＮＦ-β；及びＬＩ
Ｆ及びキットリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子である。ここで用い
られる際、用語サイトカインは、天然供給源から、又は組換え細胞培養からのタ
ンパク質、及び天然配列サイトカインの生物学的な活性等価物を含む。
【００５１】 この出願で用いられる用語「プロドラッグ」は、親薬剤に比較して腫瘍細胞に
対する細胞障害性が低く、酵素的に活性化又はより活性な親形態に変換される製
薬的活性物質の前駆体又は誘導体形態を意味する。例えば、Wilman, 「Prodrugs
in Cancer Chemotherapy」, Biochemical Society Transactions, 14, : 375-3
82, 615th Meeting, Belfast (1986),及びStella 等, 「Prodrugs: A Chemical
Approach to Targeted Drug Delivery」、Directed Drug Delivery, Borchardt
等（編）, pp.247-267, Humana Press (1985)参照。本発明のプロドラッグは、
これらに限られないが、ホスファート含有プロドラッグ、チオホスファート含有
プロドラッグ、スルファート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ
-アミノ酸変性プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β-ラクタム含有プロ
ドラッグ、任意に置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ又は任意
に置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、より活性のある細胞毒の
ない薬剤に転換可能な５-フルオロシトシン及び他の５-フルオロウリジンプロド
ラッグを含む。限定するものではないが、本発明で使用されるプロドラッグ形態
に誘導体化可能な細胞障害性薬の例には、前記の化学療法剤が含まれる。
【００５２】 ここに開示されるポリペプチドの「有効量」とは、腫瘍性細胞成長、腫瘍又は
癌細胞成長の阻害に関しては、標的細胞の成長をある程度阻害できる量である。
この用語には、標的細胞の成長阻害、細胞分裂停止及び／又は細胞障害性効果及
び／又はアポトーシスを誘起することのできる量が含まれる。腫瘍性細胞成長、
腫瘍又は癌細胞成長の阻害に関するＬＩＶ-１ポリペプチドアンタゴニストの「
有効量」は、経験的に、そして常套手段によって決定することができる。 「治療的有効量」は、腫瘍の治療に関しては、次の効果：（１）遅延化及び完
全な成長停止を含む、腫瘍成長の或る程度の阻害；（２）腫瘍細胞数の減少；（
３）腫瘍サイズの縮小；（４）腫瘍細胞の末梢器官への浸潤の阻害（即ち、減少
、遅延化又は完全な停止）；（５）転移の阻害（即ち、減少、遅延化又は完全な
停止）；（６）抗腫瘍免疫反応の促進、これは、腫瘍の退行又は拒絶をもたらし
てもよいが、必ずしも必要ではない；及び／又は（７）疾患に伴う徴候の１つ又
は複数の或る程度の軽減の１つ又は複数を誘起することのできる量を意味する。
腫瘍の治療を目的とした、ＬＩＶ-１ポリペプチドアンタゴニストの「治療的有
効量」は、経験的に、そして常套手段によって決定することができる。
【００５３】 ＬＩＶ-１アンタゴニストの「成長阻害量」は、細胞、特に腫瘍、例えば癌細
胞の成長をインビトロ又はインビボで阻害できる量である。腫瘍性細胞成長の阻
害の目的のためのＬＩＶ-１アンタゴニストの「成長阻害量」は、経験的に、そ
して日常的手法で決定できる。 ＬＩＶ-１アンタゴニストの「細胞障害性量」は、細胞、特に腫瘍、例えば癌
細胞をインビトロ又はインビボで破壊できる量である。腫瘍性細胞成長の阻害の
目的のためのＬＩＶ-１アンタゴニストの「細胞障害性量」は、経験的に日常的
手法で決定できる。
【００５４】 ここに同定されるＬＩＶ-１ポリペプチド配列に対する「パーセント(％)アミ
ノ酸配列相同性又は同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性
を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部
と考えないとした、ＬＩＶ-１配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のア
ミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決
定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、
例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのよ
うな公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能で
ある。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを
達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するた
めの適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のために
は、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータープログラムALIGN-2を
使用することによって下記に記載のように得られる。ALIGN-2プログラム用の完
全なソースコードがジェネンテック社によって公認され、そしてＦｉｇ２０Ａ-
Ｑに示すソースコードは、米国著作権事務所, ワシントンD.C., 20559に使用者
用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087で登録されていて、表
１に提供されている。ALIGN-2プログラムはジェネンテック社、サウス サン フ
ランシスコ, カリフォルニアから公的に入手可能である。ALIGN-2プログラムは
、UNIX（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX V4.0D
での使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プ
ログラムによって設定され変動しない。
【００５５】 ここでの目的のためには、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸
配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたア
ミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は
含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される： 分率Ｘ／Ｙの１００倍 ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＡ及びＢのアラインメン
トによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全
アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる
場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列
同一性とは異なることは理解されるであろう。
【００５６】 特に断らない限りは、ここでの全ての％アミノ酸配列相同性又は同一性値は上
記のようにALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかし
ながら、％アミノ酸配列同一性は、配列比較プログラムNCBI-BLAST2（Altschul
ら, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)）を用いて決定してもよい。NCB
I-BLAST2配列比較プログラムは、http://www.ncbi.nlm.nih.govからダウンロー
ドでる。NCBI-BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメー
タの全ては初期値に設定され、例えば、unmask＝可、鎖＝全て、予測される発生
＝１０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ-値＝０．０１、マルチパスの
定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリ
ングマトリクス＝BLOSUM62を含む。
【００５７】 アミノ酸配列比較にNCBI-BLAST2が用いられる状況では、与えられたアミノ酸
配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同
一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対してある程度の％
アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともでき
る）は次のように計算される： 分率Ｘ／Ｙの１００倍 ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2のＡ及びＢのアライン
メントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢ
の全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異
なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸
配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
【００５８】 さらに、％アミノ酸配列同一性値も、WU-BLAST-2コンピュータプログラム（Al
tschulら, Methods in Enzymology 266: 460-480(1996)）を用いて決定してもよ
い。さらに、殆どのWU-BLAST-2検索パラメータは初期値に設定される。初期値に
設定されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する：オーバーラッ
プスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝
１１、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62。ここでの目的のためには、％ア
ミノ酸配列同一性値は、（ａ）WU-BLAST-2によって決定した、ＤＮＡ１６４６４
７によってコードされた天然ＬＩＶ-１ポリペプチドから誘導された配列を有す
る対象であるＬＩＶ-１ポリペプチドのアミノ酸配列と対象である比較アミノ酸
配列（即ち、ＬＩＶ-１ポリペプチド変異体であってもよい、対象であるＬＩＶ-
１ポリペプチドが比較される配列）の間で一致する同一アミノ酸残基の数を、（
ｂ）対象であるＬＩＶ-１ポリペプチドの残基の総数で除した商によって決定さ
れる。例えば、「アミノ酸配列Ｂに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一
性を有する又は有しているアミノ酸配列Ａを含んでなるポリペプチド」という記
載では、アミノ酸配列Ａが対象である比較アミノ酸配列であり、アミノ酸配列Ｂ
が対象であるＬＩＶ-１ポリペプチドのアミノ酸配列である。
【００５９】 ここに同定されるＬＩＶ-１ポリペプチド-コード化核酸配列にする「パーセン
ト(％)核酸配列相同性又は同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列
同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、ＬＩＶ-１ポリペプチド-コード化
核酸配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントと
して定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメ
ントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN、A
LIGN-2又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュー
タソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較さ
れる配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のア
ルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定す
ることができる。しかし、ここでの目的のためには、％核酸配列同一性値は、配
列比較コンピュータープログラムALIGN-2を使用することによって下記に記載の
ように得られる。ALIGN-2プログラム用の完全なソースコードは、米国著作権事
務所, ワシントンD.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登
録番号TXU510087で登録されていて、表１に提供されている。このALIGN-2プログ
ラムは、ジェネンテック社、サウス サン フランシスコ, カリフォルニアから公
的に入手可能である。ALIGN-2プログラムは、UNIXオペレーティングシステム、
好ましくはデジタルUNIX V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列
比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
【００６０】
【００６１】
【００６２】
【００６３】
【００６４】
【００６５】
【００６６】
【００６７】
【００６８】
【００６９】
【００７０】
【００７１】
【００７２】
【００７３】
【００７４】
【００７５】
【００７６】
【００７７】 ここでの目的では、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又
はそれに対する％核酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｄと、又
はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列
Ｃと言うこともできる）は次のように計算される： 分率Ｗ／Ｚの１００倍 ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＣ及びＤのアラインメン
トによって同一であると一致したスコアのヌクレオチドの数であり、ＺはＤのヌ
クレオチド数である。核酸配列Ｃの長さがアミノ酸配列Ｄの長さと異なる場合、
ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異な
ることは理解されるであろう。
【００７８】 特に断らない限りは、ここでの全ての％核酸配列同一性値は上記のようにALIG
N-2配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、％核酸
配列同一性は、配列比較プログラムNCBI-BLAST2（Altschul等, Nucleic Acids R
es. 25: 3389-3402 (1997)）を用いて決定してもよい。NCBI-BLAST2配列比較プ
ログラムは、http://ww.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードできる。NCBI-BLAST
2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に
設定され、例えば、unmask＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合
長＝１５／５、マルチパスｅ-値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギ
ャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリクス＝BL
OSUM62を含む。
【００７９】 配列比較にNCBI-BLAST2が用いれれる状況では、与えられた核酸配列Ｃの、与
えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性（あるいは、与え
られた核酸配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は
含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される： 分率Ｗ／Ｚの１００倍 ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2のＣ及びＤのアライン
メントによって同一対であると記録されたのヌクレオチドの数であり、ＺはＤの
全ヌクレオチド数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、
ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異な
ることは理解されるであろう。
【００８０】 さらに、％核酸配列同一性値は、WU-BLAST-2コンピュータプログラム（Altsch
ul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて決定してもよい
。殆どのWU-BLAST-2検索パラメータは初期値に設定される。初期値に設定されな
い、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する：オーバーラップスパン＝
１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１、及び
スコアリングマトリクス＝BLOSUM62。ここでの目的のために、％核酸配列同一性
値は、（ａ）天然配列ＬＩＶ-１ポリペプチドコード化核酸から誘導された配列
を有する対象とするＬＩＶ-１ポリペプチドコード化配列の核酸配列と、対象と
する比較核酸分子（即ち、対象とするＬＩＶ-１ポリペプチドコード化核酸分子
の配列が比較される変異体ポリヌクレオチドであってもよい配列）との間の、WU
-BLAST-2によって決定した一致する同一ヌクレオチドの数を、（ｂ）対象とする
ＬＩＶ-１ポリペプチドコード化核酸のヌクレオチドの総数で除した商によって
決定される。例えば、「核酸配列Ｂに対して少なくとも８０％の核酸配列同一性
を持つ又は持っている核酸配列Ａを含んでなる単離された核酸分子」という表現
では、核酸配列Ａが対象とする比較核酸配列であり、核酸配列Ｂが対象とするＬ
ＩＶ-１ポリペプチドコード化核酸分子の核酸配列である。
【００８１】 上記のように実施されるアミノ酸配同一性列比較の内容において、「ポジティ
ブ」という用語には、比較された配列において、同一ではないが類似の特性を持
つアミノ残基が含まれる。対象のアミノ酸残基に対してポジティブ値をスコアす
るアミノ酸残基は、対象のアミノ酸残基と一致するか、或いは対象のアミノ酸残
基の好ましい置換（下の表２に定義）であるかいずれかのアミノ酸残基である。
【００８２】 表 ２ 元の残基 例示的置換 好ましい置換 Ala (A) val; leu; ile val Arg (R) lys; gln; asn lys Asn (N) gln; his; lys; arg gln Asp (D) glu glu Cys (C) ser ser Gln (Q) asn asn Glu (E) asp asp Gly (G) pro;ala ala His (H) asn; gln; lys; arg arg Ile (I) leu; val; met; ala; phe; ノルロイシン leu Leu (L) ノルロイシン; ile; val; met; ala; phe ile Lys (K) arg; gln; asn arg Met (M) leu; phe; ile leu Phe (F) leu; val; ile; ala; tyr leu Pro (P) ala ala Ser (S) thr thr Thr (T) ser ser Trp (W) tyr; phe tyr Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe Val (V) ile; leu; met; phe; ala; ノルロイシン leu
【００８３】 ポリペプチドの機能又は免疫学的同一性の置換的修飾は、（ａ）置換領域のポ
リペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位での分子の
電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持しながら、それらの効果において実
質的に異なる置換基を選択することにより達成される。天然発生残基は共通の側
鎖特性に基づいてグループに分けることができる： （１）疎水性：ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile; （２）中性の親水性：cys, ser, thr; （３）酸性：asp, glu; （４）塩基性：asn, gln, his, lys, arg; （５）鎖配向に影響する残基：gly, pro; 及び （６）芳香族：trp, tyr, phe。
【００８４】 非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを
必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、好
ましくは残された（非保存）部位に導入されうる。 変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキ
ャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発等の当該分野で知られた方法を使用して生
成できる。部位特異的突然変異誘発［Carterら, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (
1986); Zollerら, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)］、カセット突然変異誘
発［Wellsら, Gene, 34: 315 (1985)］、制限的選択突然変異誘発［Wellsら, Ph
ilos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)］又は他の既知の技術を
実施することができる。
【００８５】 この目的において、付与されたアミノ酸配列Ｂとの、又はＢに対する付与され
たアミノ酸配列Ａのポジティブ％値(あるいは、付与されたアミノ酸配列Ａが、
付与されたアミノ酸配列Ｂとの、又はＢに対する所定の％ポジティブを有するか
、又はこれを含むものとしても呼称することができる)は、次の式： 分率Ｘ／Ｙの１００倍 により算出され、ここで、Ｘは、Ａ及びＢのプログラムアライメントにおいて、
配列アライメントプログラムALIGN-2によりポジティブ値がスコアされたアミノ
酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基の数である。アミノ酸配列Ａの長さ
はアミノ酸配列Ｂの長さとは等しくなく、Ｂに対するＡの％ポジティブは、Ａに
対するＢの％ポジティブとは等しくないと認識されるであろう。
【００８６】 「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを表すために使用
するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたポ
リペプチドを意味する。好ましくは、単離されたポリペプチドは、自然に結合す
る全ての成分と結合していない。その自然環境の汚染成分とは、そのポリペプチ
ドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、
及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様に
おいて、ポリペプチドは、(１)スピニングカップシークエネーターを使用するこ
とにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充
分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた
非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。
単離されたポリペプチドには、ＬＩＶ-１の自然環境の少なくとも１つの成分が
存在しないため、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれる。しかしな
がら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程により調製
される。
【００８７】 ＬＩＶ-１ポリペプチドをコードする「単離された」核酸分子、又は抗-ＬＩＶ
-１抗体をコードする「単離された」核酸とは、同定され、ＬＩＶ-１コード化核
酸又は抗-ＬＩＶ-１コード化核酸の天然源に通常付随している少なくとも１つの
汚染核酸分子から分離された核酸分子である。好ましくは、単離された核酸分子
は、それが天然では付随しているすべての成分を含まないものである。単離され
たＬＩＶ-１コード化核酸分子、或いは抗-ＬＩＶ-１-コード化核酸分子は、天然
に見出される形態や設定と異なるものである。
【００８８】 「コントロール配列」という表現は、特定の宿主生物において作用可能に結合
したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好
適なコントロール配列には、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及
びリボソーム結合部位が含まれる。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデ
ニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
【００８９】 核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」てい
る。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に
参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡ
に作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影
響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合
部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用
可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤ
ＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズに
あることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない
。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位
が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプター
あるいはリンカーが使用される。
【００９０】 ハイブリダイゼーション反応の「緊縮性」は、当業者によって容易に決定され
、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。
一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングに必要な温度が高くなり、プ
ローブが短くなるとそれに必要な温度は低くなる。ハイブリダイゼーションは、
一般的に、相補鎖がその融点より低い環境に存在する場合に、変性ＤＮＡの再ア
ニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイゼーション配列の間で所望
される相同性の程度が高くなればなるほど、用いることができる相対温度が高く
なる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をより緊縮性にすることになり
、低い温度は緊縮性を低下させることになる。ハイブリダイゼーション反応の緊
縮性の更なる詳細及び説明については、Ausubelら, Current Protocols in Mole
cular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995）を参照のこと。
【００９１】 ここで定義される「緊縮性条件」又は「高度の緊縮性条件」は、（１）洗浄の
ために低イオン強度及び高温度、例えば、５０℃において０．０１５Ｍの塩化ナ
トリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナト
リウムを用いるもの；（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性
剤、例えば、４２℃において５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと０．１％ウシ血清
アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭ
のｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、と７５０ｍＭの塩化ナトリウム、
７５ｍＭクエン酸ナトリウムを用いるもの；又は（３）４２℃における５０％ホ
ルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナト
リウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸
ナトリウム、５ｘデンハード液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）
、０．１％ＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸と、４２℃における０．２ｘ
ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中の洗浄及び５５℃での５０％
ホルムアミド、次いで５５℃におけるＥＤＴＡを含む０．１ｘＳＳＣからなる高
緊縮性洗浄を用いるものによって同定される。
【００９２】 「中程度の緊縮性条件」は、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory
Manual New York: Cold Spring Harbor Press, 1989に記載されているように同
定され、上記の緊縮性より低い洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件（例え
ば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度の緊縮性条件は、２
０％ホルムアミド、５ｘSSC（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナ
トリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハード液、１
０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶
液中の３７℃での終夜インキュベーション、次いで１ｘＳＳＣ中３５−５０℃で
のフィルターの洗浄といった条件である。当業者であれば、プローブ長などの因
子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するか
を認識する。
【００９３】 ここで意図している「活性な」及び「活性」とは、天然又は天然発生ＬＩＶ-
１ポリペプチドの生物学的及び／又は免疫学的活性特性を保持するＬＩＶ-１ポ
リペプチドの形態を意味し、「生物学的」活性とは、天然又は天然発生ＬＩＶ-
１ポリペプチドによって生ずる（阻害性又は刺激性の）機能であって、天然又は
天然発生ＬＩＶ-１ポリペプチドが有する抗原性エピトープに対して抗体を生成
すを誘発する能力を除くものを意味し、「免疫学的」活性とは、天然又は天然発
生ＬＩＶ-１ポリペプチドが有する抗原性エピトープに対して抗体を生成を誘発
する能力を意味する。
【００９４】 この出願に開示したスクリーニングアッセイ(例えば有機又は無機小分子、ペ
プチド、など）による同定が可能な抗体やその他の分子という面においての「生
物活性」は、そのような分子のこの出願において同定された増幅遺伝子によって
コードされているポリペプチドと結合又は複合体を形成する、或いはコード化さ
れたポリペプチドと他の細胞タンパク質との相互作用を妨害する、又はＬＩＶ-
１ポリペプチドの転写又は翻訳を妨害する能力に言及するために使用される。好
ましい生物活性は、標的腫瘍細胞の成長阻害である。その他の好ましい生物活性
は、標的腫瘍細胞の死を招く細胞傷害性活性である。 ＬＩＶ-１ポリペプチドという文脈における「生物活性」という用語は、腫瘍
性細胞成長又は制御されていない細胞成長を誘導する、或いは特に転移性のある
腫瘍の特定の形態の指標として機能するＬＩＶ-１ポリペプチドの能力を意味す
る。
【００９５】 「免疫学的活性」という語は、ＬＩＶ-１ポリペプチドの少なくとも一つのエ
ピトープとの免疫学的交差反応性を意味する。 ここで用いられる「免疫学的交差反応性」とは、候補ポリペプチドが、この活
性を持つＬＩＶ-１ポリペプチドの定性的生物学的活性を、公知の活性ＬＩＶ-１
ポリペプチドに対して生じたポリクローナル抗血清と競合的に阻害できることを
意味する。そのような抗血清は、例えばヤギ又はウサギに、完全フロイントアジ
ュバント中の周知の活性類似物を皮下注射し、次いで不完全フロイント中で腹膜
内又は皮下に追加免疫することにより従来の方法で調製される。免疫学的交差反
応性は好ましくは「特異的」であり、これは同定される免疫学的交差反応性分子
（例えば抗体）の対応するＬＩＶ-１ポリペプチドに対する結合親和性が、その
分子の他の任意の知られた天然ポリペプチドに対する結合親和性より有意に高い
（好ましくは少なくとも約２倍、より好ましくは少なくとも約４倍、さらにより
好ましくは少なくとも約８倍、最も好ましくは少なくとも約１０倍高い）ことを
意味する。
【００９６】 「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然
ＬＩＶ-１ポリペプチドの生物学的活性を部分的に又は完全に阻止、阻害、又は
中和する任意の分子を指す。好適なアンタゴニスト分子は特に、アンタゴニスト
抗体又は抗体断片、断片、ペプチド、有機小分子、抗-センス核酸などを含む。
ＬＩＶ-１ポリペプチドのアンタゴニストを候補アンタゴニスト分子と同定する
方法、並びにＬＩＶ-１ポリペプチドと通常は関連している一つ又は複数の生物
学的活性の変化を測定することをが含まれる。
【００９７】 この出願で定義されている「小分子」は、約５００ダルトン未満の分子量を有
する。 「標識」という語は、この出願で用いられる場合、抗体に直接的又は間接的に
結合して「標識された」抗体を生成する、検出可能な化合物又は組成物を意味す
る。標識はそれ自身によって検出可能でもよく（例えば、放射性同位体標識又は
蛍光標識）、あるいは、酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物又は組成物
の化学的変換を触媒してもよい。検出可能な標識として機能する放射性各種には
、例えばＩ-１３１、Ｉ-１２３、Ｉ-１２５、Ｙ-９０、Ｒｅ-１８８、Ｒｅ-１８
６、Ａｔ-２１１、Ｃｕ-６７、Ｂｉ-２１２、及びＰｄ-１０９が含まれる。
【００９８】 「固相」とは、本発明の抗体が接着できる非水性マトリクスを意味する。ここ
に包含される固相の例は、部分的又は全体的にガラス（例えば、孔の制御された
ガラス）、ポリサッカリド（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリス
チレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンで形成されたものを含む。或る実
施態様では、前後関係に応じて、固相はアッセイ用プレートのウェル；その他で
は精製用カラム（例えばアフィニティクロマトグラフィーカラム）を含むことが
できる。また、この用語は、米国特許第4,275,149号に記載されたような別々の
粒子の不連続な固体相も含む。
【００９９】 「リポソーム」は、哺乳動物への薬物（例えば、ＬＩＶ-１ポリペプチド又は
それに加えて抗体、並びに任意の化学療法剤）の送達に有用な、種々の型の脂質
、リン脂質及び／又は界面活性剤を含む小さな小胞である。リポソームの成分は
、通常は生物学的メンバーの脂質配列に類似した２層構造に配列される。
【０１００】 この出願で用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質（「
アドヘシン」、例えばレセプター、リガンド、又は酵素）の結合特異性と免疫グ
ロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを結合した抗体様分子を指す。構造
的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結
合部位（抗原結合部位）以外である（即ち「異種の」）アミノ酸配列と、免疫グ
ロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシ
ン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接
アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、
ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３又はＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ-
１及びＩｇＡ-２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブ
リン、並びにその任意のサブクラス又はアイソタイプから得ることができる。
【０１０１】 「ＨＥＲ２」、「ＥｒｂＢ２」、「ｃ-Ｅｒｂ-Ｂ２」という用語には互換的に
使用される。特にそうでないことを示さない限り、ここで使用される「ＥｒｂＢ
２」、「ｃ-Ｅｒｂ-Ｂ２」及び「ＨＥＲ２」という用語はヒトタンパク質を指し
、「ｅｒｂＢ２」、「ｃ-ｅｒｂ-Ｂ２」及び「ｈｅｒ２」はヒト遺伝子を指す。
ヒトｅｒｂＢ２遺伝子及びＥｒｂＢ２タンパク質は、例えばSembaら, PNAS(USA)
82:6497-6501(1985)及びYamamotoら, Nature 319:230-234(1986)(ジーンバンク
受託番号 X03363)に記載されている。ＥｒｂＢ２は４つのドメインを有する(ド
メイン１-４)。
【０１０２】 「エピトープ４Ｄ５」は、抗体４Ｄ５(ATCC CRL 10463)が結合するＥｒｂＢ２
の細胞外ドメイン中の領域である。このエピトープはＥｒｂＢ２の膜貫通領域に
近接している。４Ｄ５エピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、
例えばAntibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,Ed
Harlow及びDavid Lane編(1988)に記載の通常の交差ブロッキングアッセイを行う
ことができる。あるいは、抗体がＥｒｂＢ２の４Ｄ５エピトープ(すなわち、約
残基５２９から、例えば約残基５６１から、約残基６２５までを含む領域におけ
る任意の一又は複数の残基)に結合するか否かを評価するために、エピトープマ
ッピングを行うこともできる。 「エピトープ３Ｈ４」は、抗体３Ｈ４が結合するＥｒｂＢ２の細胞外ドメイン
中の領域である。このエピトープは、ＥｒｂＢ２の細胞外ドメインのアミノ酸配
列の残基約５４１から約５９９までを含む。
【０１０３】 「エピトープ７Ｃ２／７Ｆ３」は、７Ｃ２及び／又は７Ｆ３抗体（各々、ＡＴ
ＣＣ ＨＢ-１２２１５及びＡＴＣＣ ＨＢ-１２２１６)が結合するＥｒｂＢ２の
細胞外ドメインのＮ末端領域である。７Ｃ２／７Ｆ３エピトープに結合する抗体
をスクリーニングするために、例えばAntibodies, A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow及びDavid Lane編(1988)に記載の通常の
交差ブロッキングアッセイを行うことができる。あるいは、抗体がＥｒｂＢ２の
７Ｃ２／７Ｆ３エピトープに結合するか否かを確認するために、エピトープマッ
ピングを行うこともできる。
【０１０４】 「細胞死を誘発」又は「細胞死を誘発可能な」という用語は、生存している細
胞を生存不能とさせる抗-ＬＩＶ-１遺伝子産物抗体の能力を意味する。ここでの
「細胞」とはＬＩＶ-１遺伝子産物を発現するもの、特にＬＩＶ-１遺伝子産物を
過剰発現する細胞のことである。ＬＩＶ-１を「過剰発現する」細胞は、同じ組
織型の非癌化細胞に比べて、正常よりも顕著に高いＬＩＶ-１ ｍＲＮＡ及び／又
はＬＩＶ-１タンパク質レベルを有する。また、本発明の方法によって処置され
る細胞は、ＥｒｂＢ２を過剰発現しない（すなわち、細胞は、同じ細胞又は組織
型の正常、非癌細胞とおよそ同じかより低いレベルのＥｒｂＢ２を発現する）。
好ましくは細胞は癌細胞、例えば乳房、肺、又は前立腺細胞である。インビトロ
では、細胞は、細胞表層でＬＩＶ-１を発現させるためにＬＩＶ-１ ＤＮＡ、好
ましくはＤＮＡ１６４６４７で形質転換した細胞株由来のものでよい。インビト
ロでの細胞死は、補体と免疫エフェクター細胞の非存在下で決定され、抗体依存
性細胞障害活性(ＡＤＣＣ)又は補体依存性細胞障害活性(ＣＤＣ)により誘発され
る細胞死と区別される。よって、細胞死に対するアッセイは、熱不活性化血清(
すなわち補体の不在下)を使用し、免疫エフェクター細胞の不在下で行うことが
できる。抗体が細胞死を誘発可能であるか否かを測定するために、ヨウ化プロピ
ジウム(ＰＩ)、トリパンブルー(Mooreら, Cytotechnology 17:1-11[1995]を参照
)又は７ＡＡＤの取込みにより評価される膜インテグリティの損失度合いが未処
理細胞と比較して評価される。好ましい細胞死誘発抗体は、「ＬＩＶ-１発現細
胞におけるＰＩ取込みアッセイ」において、ＰＩの取込みを誘発するものである
。
【０１０５】 「アポトーシスを誘発」又は「アポトーシスを誘発可能な」という用語は、ア
ネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞収縮、小胞体の拡張、細胞断片化、及
び／又は膜小胞の形成(アポトーシス体と呼ばれる)によって判定されるようなプ
ログラム細胞死を誘発する抗体の能力を意味する。細胞は、ＬＩＶ-１遺伝子産
物を過剰発現するものである。好ましくは「細胞」は、腫瘍細胞、例えば乳房、
肺、又は前立腺細胞である。インビトロでは、この細胞は、ＤＮＡ１６４６４７
のような、ＬＩＶ-１ ＤＮＡで形質転換した細胞株由来のものでよい。アポトー
シスに伴う細胞のイベントを評価するために種々の方法が利用できる。例えば、
ホスファチジルセリン(ＰＳ)転位置をアネキシン結合により測定することができ
；ＤＮＡ断片化は以下の実施例に開示されているようにＤＮＡラダーリングによ
り評価することができ；ＤＮＡ断片化に伴う細胞核／染色質凝結は低二倍体細胞
の何らかの増加により評価することができる。好ましくは、「アネキシン結合ア
ッセイ使用細胞」において、アポトーシスを誘発する抗体は、未処理細胞の約２
〜５０倍、好ましくは約５〜５０倍、最も好ましくは約１０〜５０倍のアネキシ
ン結合を誘発するという結果を生じるものである(以下参照)。 「サルベージレセプター結合エピトープ」という用語は、ここで使用されると
きは、ＩｇＧ分子のインビボでの血清半減期を増加させる原因となるＩｇ分子(
例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４)のＦｃ領域のエピトープを
意味する。
【０１０６】 ここで使用される「治療」とは、治癒的処置、予防的療法及び防止的療法の両
方を意味する。治療が必要なものとは、既に疾患に罹っているもの、並びに疾患
が防止されているものを含む。 「疾患」とは抗-ＬＩＶ-１遺伝子産物抗体による治療から恩恵を受けるであろ
う任意の症状である。これには、哺乳動物が問題とする疾患になる素因になる病
理的症状を含む慢性及び急性の疾患又は障害が含まれる。ここで治療される限定
されない疾患の例には、乳房、肺、及び前立腺組織の良性と悪性腫瘍が含まれる
。
【０１０７】 「パッケージ挿入物」という用語は効能、用法、用量、投与方法、禁忌及び／
又はかかる治療製品の使用に関する警告についての情報を含む、治療製品の市販
用パッケージに通常含まれるインストラクションを意味するために使用される。 「血清濃度」、「血清薬剤濃度」、又は「血清抗-ＬＩＶ-１抗体濃度」という
用語は、薬剤を用いて治療される動物又はヒト患者の血清中の薬剤の濃度を意味
する。抗体の血清濃度は、例えば好ましくはイムノアッセイにより決定される。
好ましくは、イムノアッセイはここに開示される方法に従うＥＬＩＳＡである。 「ピーク血清濃度」という用語は、動物又はヒト患者に薬剤を送達した後すぐ
の最高の血清薬剤濃度を意味し、血液システムを通して薬剤が分配された後であ
るが、有意な組織分配の前に、薬剤の代謝又は排泄が起こる。
【０１０８】 「血清中谷値濃度」という用語は、前の投薬の送達の後で、一連の投薬におい
て薬剤の次のその後の投薬の送達の直後の血清薬剤濃度を意味する。一般に血清
中谷値濃度は、一連の薬剤投与における最少の持続した有効薬剤濃度である。ま
た、血清中谷値濃度は、薬剤の他の投薬が治療投与計画の一部として投与される
ためである血清濃度を意味するので、効果的な最少血清濃度として良く目安とさ
れる。静脈内投与により薬が送達された場合、もっとも好ましくは血清中谷値濃
度は前注入初期薬剤送達の１日目の内に達成される。薬剤の送達が、皮下投与に
よる場合には、ピーク血清脳度は好ましくは３日以下で達成される。本発明によ
れば、好ましくは血清中谷値濃度は、ここで開示される薬剤送達方法の何れかを
用いて、４週間以下、好ましくは３週間以下、より好ましくは２週間以下、好ま
しくはもっとも好ましくは一日以下を含む１週間以下で達成される。
【０１０９】 「静脈内注射」は、約５分以上、好ましくは約３０〜９０分の間の時点で動物
又はヒト患者の血管中での薬剤の導入を意味するが、本発明に従うと、静脈内注
入はあるいは１０時間以下で投与される。 「静脈内ボーラス」又は「静脈内プッシュ」は、体が約１５分以下、好ましく
は５分以下で薬剤を受け入れるような動物又はヒトの血管中への薬剤投与を意味
する。 「皮下投与」は、比較的ゆっくりと、薬剤容器からの送達が維持されることに
よって、動物又はヒト患者の皮膚の下に、好ましくは皮膚及び皮下組織の間のポ
ケットに薬剤を投入することを意味する。ポケットは、皮膚を上につまんで引き
上げ皮下組織から離すことにより作成される。
【０１１０】 「皮下注射」は、比較的ゆっくりと、これに限らないが３０分以下又は９０分
以下を含む時間、薬剤容器からの送達が維持されることによって、動物又はヒト
患者の皮膚の下に、好ましくは皮膚と皮下組織の間に薬剤を導入することを意味
する。場合によっては、注入が、動物又はヒト患者の皮膚の下に差し込まれた薬
剤送達ポンプの皮下挿入によって成され、ポンプは決定された時間、例えば３０
分、９０分、又は治療投薬計画の時間、定められた量を送達する。 「皮下ボーラス」という用語は、動物又はヒト患者の皮膚の下への薬剤投入を
意味し、ボーラス薬剤送達は好ましくは約１５分以下、より好ましくは５分以下
、及び最も好ましくは６０秒以下である。投与は、例えば皮膚をつまんで引き上
げ、皮下組織から離すことによりポケットが形成される、皮膚と皮下組織の間の
ポケット内が好ましい。
【０１１１】 薬剤投与に関する場合の「前注入」という用語は、後の間隔をおいた同量また
はそれより少量のもの以前の、初期の高用量を示す。初期の高用量は、効果的な
標的血清濃度に対する動物又はヒト患者の血清薬剤濃度をより速やかに増加させ
ることを意味する。 ＬＩＶ-１遺伝子発現及び遺伝子産物に関する刊行物としては、次の公開特
許及び公開出願を含む：1997年12月2日に公開のManning, D.L.ら., 米国特許第5
,693, 465号；Manning, D.L.ら., European J. Cancer 29A(10): 1462-1468[199
3]；Manning, D.L.ら., European J. Cancer 30A(5): 675-678[1994]；Manning,
D.L.ら., Acta Oncologica 34(5): 641-646[1995]；McClelland, R.A.ら., Bre
ast Cancer Res. & Treatment 41(1): 31-41 [1996]；Knowlden, J.M.ら., Clin
. Cancer Res. 3(11): 2165-2172[1997]；及びMcClelland, R.A., ら., British
J. Cancer 77(10): 1653-1656[1998]。
【０１１２】 抗-ＥｒｂＢ２抗体に関する刊行物としては、次の公開特許及び公開出願を含
む：1989年１月5日公開のPCT/US89/00051；1990年5月18日公開のPCT/US/90/0269
7；1997年7月23日公開のEU0474727；1997年7月２３日公開のDE69031120；1997年
10月9日公開のPCT/US97/18385；1997年10月14日公開のSA97/9185；1997年10月14
日公開のUS5677171；1998年6月24日公開のUS5720937；1998年2月24日公開のUS57
20954；1998年3月10日公開のUS5725856；1998年6月23日公開のUS5770195；1998
年6月30日公開のUS5772997；1998年12月10日公開のPCT/US98/2626；及び1999年3
月26日公開のPCT/US/06673、特許及び出願のそれぞれは、出展明示によりその全
部を個々に取り込む。
【０１１３】 以下の実施例は例示目的のためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲
を決して限定することを意図するものではない。 本明細書で引用した全ての特許及び参考文献は、その全体を出典明示によりこ
こに取り入れる。
【０１１４】 （実施例） 実施例で言及されている全ての他の市販試薬は、特に示さない限りは製造者の
使用説明に従い使用した。ＡＴＣＣ登録番号により以下の実施例及び明細書全体
を通して特定されている細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション、マナッサス、バージニアである。特に記さない限り、本発明は上記及
び以下の教科書に記載されたもののような組換えＤＮＡ技術の標準的な手法を用
いた：Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Ha
rbor Press N.Y., 1989; Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology
, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989; Innis
等, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press,
Inc., N.Y.., 1990; Harlow等, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Sprin
g Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1988; Gait, M.J.Oligonucleotide Synt
hesis, IRL Press, Oxford, 1984; R.I. Freshney, Animal Cell Culture, 1987
; Coligan等, Current Protocols in Immunology, 1991。
【０１１５】 実施例１． マイクロアレイ分析で検討した腫瘍細胞でのＬＩＶ-１発現 細胞がＥｒｂＢ２を過剰発現しないが、ＬＩＶ-１遺伝子産物（例えばＬＩＶ-
１-１６４６４７ｍＲＮＡ）を過剰発現する乳癌の形態が見出され、ここで独自
に開示されている。腫瘍の型の検出を、マイクロアレイ技術を使用しておこなっ
た。核酸マイクロアレイを使用して、被験及びコントロール組織試料の被験及び
コントロールｍＲＮＡ試料を逆転写し、標識化してｃＤＮＡプローブを作成した
。次いで、このｃＤＮＡプローブを固体支持体上に固定化した核酸のアレイとハ
イブリダイズさせた。このアレイは、アレイの各構成物の配列及び位置がわかる
ように構成されている。標識されたプローブと特定のアレイの構成物とのハイブ
リダイゼーションは、プローブが誘導された試料においてその遺伝子を発現して
いることを示す。被験（疾患組織）試料由来のプローブのハイブリダイゼーショ
ンシグナルが、コントロール（正常組織）試料由来のプローブのハイブリダイゼ
ーションシグナルよりも高い場合には、疾患組織で過剰発現している遺伝子又は
遺伝子群が同定される。この結果の意味は、疾患組織でのタンパク質の過剰発現
が、疾患症状の存在に関する診断マーカーとしてだけでなく、疾患症状の治療に
関する治療標的としても有用だということである。
【０１１６】 腫瘍細胞は、乳房腫瘍において、周囲の非癌牲細胞から肉眼によって切断分離
された。細胞のヘマトキシリン-エオシン染色法によって、摘出細胞が腫瘍由来
であることが確かめられた。この腫瘍細胞のｍＲＮＡ（種々の遺伝子の細胞特異
的な発現を反映する）を、ＲＴ／ＰＣＲ方法、蛍光タッグによる標識によってｃ
ＤＮＡへ変換し、ガラススライド上に配列させてあるＥＳＴとハイブリッドさせ
た。画像化装置によって、スライド上の各試料の蛍光を検出して測定した。この
蛍光は、スライド上の既知の位置にある既知の核酸配列（ＥＳＴ）とのハイブリ
ダイゼーションによって同定可能である被験細胞の標識されたメッセンジャーを
示した。相対蛍光は遺伝子の相対活性を示し、その強い蛍光は、相対的に多量の
メッセンジャーを発現している活性遺伝子を示した。僅か蛍光又は蛍光が無いこ
とは、標識されたメッセンジャーがＥＳＴとはハイブリダイズしてないことを示
した。マイクロアレイスライド上の配列とハイブリダイズした蛍光標識されたプ
ローブの検出は、例えば、この出願では文献として取り入れられている米国特許
第5,143,854号に記載されている。
【０１１７】 ＥｒｂＢ２も過剰発現しなかった乳房腫瘍組織での過剰発現を示唆するパター
ンで、調整品のｃＤＮＡが公的に入手可能なＥＳＴ配列（寄託番号Ｈ２９３１５
（Washington University-Merck EST Project, 著者Hillier, L. ら., 配列番
号：５，Research Genetics(Alabama, USA)とハイブリダイズしたことが見出さ
れた。このｃＤＮＡを配列決定し、ＬＩＶ-１-ＤＮＡ１６４６４７としてここで
開示した。放射活性で標識したＬＩＶ-１-１６４６４７プローブの腫瘍組織の組
織マイクロアッセイとのインサイツハイブリダイゼーションは、更に乳房、肺、
前立腺、結腸、子宮内膜、卵巣の腫瘍、及び移行上皮癌でのＬＩＶ-１発現を示
した。 更に、同じ型の正常細胞と対比して、ＬＩＶ-１を過剰発現した乳房腫瘍は、
ＥｒｂＢ２を過剰発現しなかったことが見出された（正常細胞とは、癌牲ではな
く、ＬＩＶ-１が過剰発現し得る任意の他の疾患ではないものを意味する）。乳
房腫瘍細胞でのＬＩＶ-１の過剰発現と相対的な正常組織でのＬＩＶ-１の低レベ
ル発現は、ＬＩＶ-１を治療用抗体にとって望ましい標的にする。
【０１１８】 例えば、乳房腫瘍では、ＬＩＶ-１の強い蛍光検出は、ＥｒｂＢ２発現の低い
検出をとともに生じるか、或いはＥｒｂＢ２の強い蛍光検出は、ＬＩＶ-１ ｍＲ
ＮＡ発現が無い場合に観察された。１７の試料のうち、各々が可変性の腫瘍細胞
内容物の異なる乳房腫瘍からのもので、６つの試料が中程度から強いＬＩＶ-１
発現を示し、そして６つが中程度又は強いＥｒｂＢ２発現を示した。中程度のＥ
ｒｂＢ２及びＬＩＶ-１発現を示した一つの腫瘍に重複があった。その他の腫瘍
では、ＥｒｂＢ２発現の強い検出は、ＬＩＶ-１発現のかなり弱い検出をともな
った。ＥｒｂＢ２を過剰発現しないが、内因性又は外因性ＬＩＶ-１タンパク質
（好ましくはＬＩＶ-１-１６４６４７）を発現する細胞株は、従って、ＥｒｂＢ
２発現と比較して、検出又はＬＩＶ-１発現の試験にとって有用である。また、
そのような細胞は、ＬＩＶ-１-１６４６４７発現細胞との結合のための抗-ＬＩ
Ｖ-１抗体、並びに細胞成長への抗-ＬＩＶ-１抗体の効果を試験するために有用
である。
【０１１９】 ＥＣＤ及びＣ末端におけるＬＩＶ-１-１６４６４７の領域は、GreenらのＬＩ
Ｖ-１配列と比較して独特であることが見出された（配列番号：４及びGenBank寄
託番号AAA96258と比較してＦｉｇ４を参照のこと）。この領域は、配列番号：４
（配列番号：１７）のアミノ酸１２６からアミノ酸１３２を包含する配列番号：
４（配列番号：１７）、並びにアミノ酸７４３から７５５（配列番号：１８）に
渡る。また、アミノ酸１１４からアミノ酸１３５（配列番号：１９）を包含する
までのより大きなヒスチジンリッチ領域は、本発明に含まれる。従って、この開
示された発明によると、本発明の核酸は、配列番号：３の約ヌクレオチド４１２
から４７７を包含する配列、又はその相補的配列に対して、少なくとも６５％、
好ましくは７５％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少
なくとも９０％、そして最も好ましくは９６％の相同性を有する配列を含む。好
ましくは、本発明の核酸は、配列番号：３のヌクレオチド４４３から核酸４４６
を包含する配列を含む。本発明は更には、配列番号：４の約アミノ酸１１４から
アミノ酸１３５を包含する配列に対して、少なくとも６５％、好ましくは少なく
とも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくと
も９０％、そして最も好ましくは少なくとも９６％の相同性を有するアミノ酸配
列を含んでなる単離されたポリペプチドが含まれる。好ましくは、本発明の単離
されたポリペプチドは、配列番号：４のアミノ酸１２６からアミノ酸１３２を包
含するアミノ酸配列を含む。
【０１２０】 実施例２： ＬＩＶ-１ポリペプチドの調製 以前に知られていなかったＬＩＶ-１遺伝子及びそのコード化タンパク質が、
ここで開示されている。ＬＩＶ-１（ＤＮＡ１６４６４７；配列番号：３及びそ
の補体）の核酸配列、並びにそのＬＩＶ-１コード化のアミノ酸配列（配列番号
：４）は、ここで独自に開示されている。この実施例は、ＤＮＡ１６４６４７に
よってコードされたここで開示されたＬＩＶ-１タンパク質の調製及び単離を記
載する。後の実施例は、ＬＩＶ-１の組織発現プロフイールを示す。ＬＩＶ-１遺
伝子はここに開示され、乳房、肺、前立腺、及び結腸を含む種々の腫瘍組織で発
現する。この腫瘍関連タンパク質の細胞表層発現によって、癌の検出及び治療に
関して、ＬＩＶ-１を有用な標的となる。
【０１２１】 ＤＮＡ１６４６４７によって表されるＬＩＶ-１は、独特の核酸配列及び独特
のアミノ酸配列を有する。現在、開示されているＬＩＶ-１は、Greenら（Green,
C. ら., 直接投稿，GenBank 寄託番号U41060（核酸配列）及びAAA96258（アミ
ノ酸配列)）によって以前に記載されたＬＩＶ-１タンパク質のその他の形態とは
、核酸配列及びアミノ酸配列が異なる。ＡＡＡ９６２５８ＬＩＶ-１（コード化
配列）の核酸配列は、Ｆｉｇ１Ａに示されている。核酸配列Ｕ４１０６１（配列
番号：１）によってコードされる予想アミノ酸配列（AAA96258；配列番号：２）
は、Ｆｉｇ１Ｂに示されている。このＦｉｇに含まれるのは、シグナル配列、細
胞外ドメイン、並びに膜貫通ドメインをコードする配列の予想である。ここに開
示されたＬＩＶ-１（ＤＮＡ１６４６４７）は、予想細胞外ドメイン領域とはか
なり異なる。 本発明は、成長阻害化合物（例えば、腫瘍化合物）を同定するスクリーニング
方法の調製のためみならず、腫瘍性成長を阻害する化合物の生産のためのＬＩＶ
-１ポリペプチドをコードするＤＮＡ１６４６４７を使用するための方法を提供
する。特に、ｃＤＮＡは、特定のＬＩＶ-１ポリペプチドをコードする。単純性
のために、本明細書では、ＬＩＶ-１ポリペプチドの先の定義に含まれる更なる
天然相同体及び変異体のみならず、「ＤＮＡ１６４６４７」と呼ばれている核酸
によってコードされたタンパク質は、その起源又は発現の方式に関わらず、「Ｌ
ＩＶ-１」ポリペプチドと呼ばれる。
【０１２２】 ＤＮＡ１６４６４７ＬＩＶ-１核酸のクローニング： この方法の長い遺伝
子を単離する能力のためにインバース長距離ＰＣＲとも呼ばれる完全長インバー
スＰＣＲ（「ＦＬＩＰ」）を、ＤＮＡ１６４６４７ＬＩＶ-１核酸をクローンす
るために使用した。ＦＬＩＰ ＰＣＲ技術は、J.C. Grimaldiら（発明者）．ジェ
ネンテック・インコーポレーテッド（譲受人）の２０００年１月１０日に出願さ
れた係属中の米国特許出願０９／４８０．７８２．に記載されていて、この出願
は、特に遺伝子をクローニングする方法に関して、そのものが参考文献として取
り入れられている。完全長遺伝子をクローンするために標準的なクローニング技
術を使用でき得るが、ＦＬＩＰは、核酸ライブラリをメチル化する宿主細胞にお
いて増幅した任意の核酸ライブラリの特定の核酸分子の全クローン、挿入物のあ
るベクターを単離する非常に迅速で高性能な方法である。ＦＬＩＰクローニング
方法は標的遺伝子又はヌクレオチド配列を増幅し、標的遺伝子の高度に精製され
た集団を生成する。Ｆｉｇ５は、ＦＬＩＰクローニング工程のフローチャートで
ある。ＤＮＡ１６４６４７を、以下のプライマー及びプローブを使用してＦＬＩ
Ｐ法によって単離した。 正方向プライマー： ＬＩＶ１-ＩＮＶ５’5'-ATGTTGACTTGGCAATTTCCACACGGCA-3'（配列番号：６） 逆方向プライマー： ＬＩＶ１-ＩＮＶ３’5'-TAATGCCAGATTCCCAATTCGGACTAA-3'（配列番号：７） プローブ： ＬＩＶ-ｐ 5'-TTAGTTCATGAAGGGGATTTGTGACAGAGAGGGCAAAGGTCAGGAT-3' （配列番号：８）
【０１２３】 ヒトＬＩＶ-１遺伝子（Genbank 登録番号＃ U41060）は、C. Greenら.によっ
て配列が決定された（直接投稿、１９９５年１１月２１日）。この配列は３４６
１ｂｐ（配列番号：１；Ｆｉｇ１Ａ）で、オープンリーディングフレーム（ＯＲ
Ｆ）を含む。ＦＬＩＰ法、及び上記に開示のプライマーとプローブを使用して、
ｃＤＮＡクローンを種々の組織を代表するｃＤＮＡライブラリの５０のヒトｃＤ
ＮＡのプールから単離した（ジェネンテックｃＤＮＡライブラリ、ジェネンテッ
ク，インク．，So. San Francisco, CA）。この単離されたｃＤＮＡには、変異
体核酸配列（ＤＮＡ１６４６４７；配列番号：３（コード化配列）及びその相補
配列）及び変異体推定アミノ酸配列（配列番号：４）を含んでなるＬＩＶ-１遺
伝子が含まれる。単離されたＬＩＶ-１ ＤＮＡ１６４６４７核酸の全長は、２７
７６ｂｐである；使用されたベクターｐＲＫ５Ｄは５．１ｋｂであり、従ってＩ
ＰＣＲ及び単離物によって増幅されたＤＮＡ分子の全長７．９ｋｂへ加える。
【０１２４】 Greenら., 上掲によって提示されたＬＩＶ-１及びここで開示されたＤＮＡ１
６４６４７の核酸配列の比較は、Ｆｉｇ３に示されている。星印はヌクレオチド
間の同一性を示し、ダッシュは、同一性が生じないギャップを示す。１８ヌクレ
オチドの挿入は、ＤＮＡ１６４６４７（配列番号：３）の約ヌクレオチド４４６
から４６３に観察され、二つの単一のヌクレオチド挿入は、ヌクレオチド２２９
７から２３２３に生じ、その領域にフレームシフト及び異なる推定アミノ酸配列
を引き起こす。Ｆｉｇ４は、配列番号：２（Green ら., 上掲を参照）と配列番
号：４（ここで開示）のＬＩＶ-１ポリペプチドのアミノ酸配列の比較である。
六つのアミノ酸挿入が、ＥＣＤの約アミノ酸１２６から１３１に観察され、一方
では、単一のヌクレオチド挿入のために、異なるアミノ酸配列がポリペプチドの
Ｃ末端に観察される（配列番号：２のアミノ酸７３６、並びに配列番号：４のア
ミノ酸７４２よりより先のアミノ酸を参照のこと）。
【０１２５】 具体的には、ＤＮＡ１６４６４７の単離を、以下の方法に従っておこなった。
二つの近接５’リン酸化プライマーであるＬＩＶ１-ＩＮＶ５’及びＬＩＮ１-Ｉ
ＮＶ３’を反対側の鎖で消化した。これらのプライマー、配列番号：６及び配列
番号：７をインバースＰＣＲ反応に使用した。５０ｕｌ反応として、以下の試薬
を加えた：メチル化ポジティブ細菌で増殖させた、５０ｎｇの改良ｐＲＫ５Ｄに
含まれる骨髄ｃＤＮＡ；５０ピコモルの各ＰＣＲプライマー；１０ナノモルの各
デオキシヌクレオチド三リン酸；５ｕｌのＰｆｕ １０ｘバッファー（Stratagen
e, La Jolla, CA）、並びに１ｕｌのＰｆｕ Ｔｕｒｂｏ（Stratagene, La Jolla
, CA）。プラスミドベクターｐＲＫ５（４．６６１ｂｐ）が記載されている（１
９８９年３月１５日に発行のＥＰ ３０７，２４７）。改良ｐＲＫ５ベクター（
ｐＲＫ５．ｔｋ．ｎｅｏ）は、Ｇ４１８耐性クローンの選択を可能にするために
ネオマイシン耐性遺伝子が挿入されたｐＲＫ５の誘導体である。
【０１２６】 ＰＣＲサイクルの条件は、３分間に渡る９４℃を１サイクル、次いで６５℃を
３０秒間、１３分間に渡る７２℃を２０サイクルである。当然のことながら、Ｐ
ＣＲの条件を、増幅の特定の必要性を満たすために改良してもよい。このＰＣＲ
反応はＬＩＶ-ｃＤＮＡ挿入物とｐＲＫ５Ｄベクターを含む、直鎖状５’リン酸
化単位複製配列を生成する。 次に、１０ｕｌの完全ＰＣＲ反応を、以下の他の試薬を含む１００ｕｌ反応で
結合させた：１０ｕｌの１０ｘＴ４ ＤＮＡリガーゼバッファー（New England B
ioLabs, Beverly, MA）、４ｕｌ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼNew England BioLabs, Be
verly, MA）、７６ｕｌ Ｈ２Ｏ。このライゲーションは、実験台の上で１時間に
わたって室温でインキュベーションした。
【０１２７】 一時間のライゲーションの後、２ｕｌの制限酵素ＤｐｎＩ（New England BioL
abs, Beverly, MA)をライゲーション反応へ添加し、消化を３７℃で一時間にわ
たっておこなった。ＤｐｎＩは、メチル化ＤＮＡを特異的に消化するが非メチル
化ＤＮＡは消化しない；従って、テンプレートとして使用された最初のＤＮＡラ
イブラリが消化され、無傷のＬＩＶ-１／ベクター単位複製配列のみが遊離した
。この消化の完了後、試料を、QIAquickＰＣＲキット（Qiagen, Valencia. CA）
を使用して、３０ｕｌの溶出バッファー又はＨ２Ｏで溶出し、次いでエタノール
沈殿した。ペレットを２ｕｌのＨ２Ｏに再懸濁し、次いですべての試料を細菌を
形質転換するために使用した。 形質転換は、ＤＨ１０Ｂエレクトロマックスコンピテント細菌（Life Technol
ogies, Rockville, MD）へのエレクトロポレーションによっておこなった。形質
転換細胞をルリア培養液寒天プレートへプレートし、３７℃で一晩にわたってコ
ロニーを成長させた。 次の日には、このコロニーをナイロン膜上へ移し、変性させ、再生させ、３２ Ｐ-ＡＴＰキナーゼで標識したＬＩＶ-１特異的プローブでプローブした（配列番
号：８）。ポジティブコロニーのＤＮＡを、配列がＰＣＲ反応によって誘導され
た点変異を含まないことを確認するために、ポジティブコロニーのＤＮＡの配列
決定した。
【０１２８】 ＬＩＶ-１ポリペプチド生産： 下記の記述は、ＬＩＶ-１コード化核酸を含
有するベクターで形質転換又は形質移入した細胞を培養することによる、ＬＩＶ
-１ポリペプチドの生産を主に述べている。当然のことながら、ＬＩＶ-１ポリペ
プチドを調製するために、当該分野において良く知られた代替方法を用いてもよ
いことが考慮されている。例えば、ＬＩＶ-１ポリペプチド配列、或いはその一
部分を、固相技術を使用した直接ペプチド合成によって生産してもよい［例えば
、Solid-Phase Peptide Synthesis. W.H. Freeman Co. San Francisco. CA(1969
): Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154(1963)を参照］。インビトロ
でのタンパク質合成は、自動化による手動技術を使用することでおこなわれ得る
。例えば、製造者の指示書をによってApplied Biosystems Peptide Synthesizer
(Foster City, CA)を使用することで、自動化合成は完遂され得る。全長ＬＩＶ-
１を生産するための化学的又は酵素的方法を使用して、ＬＩＶ-１ポリペプチド
の種々の部分は、別々に化学的に合成し、結合され得る。
【０１２９】 ｉ．ＤＮＡをコードするＬＩＶ-１の合成又は単離のための代替方法 ここで開示されているのは、タンパク質を発現及び生産させるのみならず、Ｄ
ＮＡを単離又は合成するための方法の、種々の制限のない実施例である。これら
の方法は、ＬＩＶ-１-１６４６４７遺伝子、ｍＲＮＡ、及びタンパク質、又はそ
の断片の生産及び単離へ応用可能そして有用である。 ＬＩＶ-１-１６４６４７ポリペプチド、その相同体、変異体、又は一部分をコ
ードするＤＮＡは、標準的な核酸合成技術を使用して直接ＤＮＡ合成によって生
産し得る［例えば、Gait. M.J., Oligonucleotide Synthesis, IRL Press, Oxfo
rd. 1984］。インビトロでのＤＮＡ合成は、手動の技術を使用することで、或い
は自動化によっておこなうこなうことができる。自動化オリゴヌクレオチド合成
は、例えば、標準的な技術を使用して完遂し得る。全長ＬＩＶ-１を生産するた
めの化学的又は酵素的方法を使用して、ＬＩＶ-１コード化核酸配列の種々の部
分は、別々に化学的に合成し、結合され得る。 或いは、ＬＩＶ-１をコードするＤＮＡは、ＬＩＶ-１ ｍＲＮＡを有し、それ
を検出可能なレベルで発現すると考えられている組織より調製されたｃＤＮＡラ
イブラリから得ることができる。従って、ヒトＬＩＶ-１ＤＮＡは、例えば実施
例に記載されているヒト組織より調製したｃＤＮＡライブラリから簡便に得るこ
とが出来る。また、ＬＩＶ-１コード化遺伝子は、ゲノムライブラリから、或い
はオリゴヌクレオチド合成によって得ることができる。
【０１３０】 ライブラリを、対象となる遺伝子又はそれによってコードされているタンパク
質を同定するために設計されたプローブ（例えば、ＬＩＶ-１ポリペプチドに対
する抗体、或いは少なくとも約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド）でスクリ
ーニングすることができる。選択したプローブでｃＤＮＡ又はゲノムライブラリ
をスクリーニングすることは、Sambrookら., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）に記載され
ているような標準的な方法を使用しておこなうことが可能である。ＬＩＶ-１を
コードする遺伝子を単離する代替手法は、ＰＣＲ法を使用することである［Samb
rook ら., 上掲：Dieffenbachら., PCR Primer: A Laboratory Manual（Cold Sp
ring Harbor Laboratory Press. 1995)］。 下記の実施例は、ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするための技術を記載
している。プローブとして選択したオリゴヌクレオチドプローブは、十分な長さ
であり、偽陽性を最小化するほど十分に明瞭でであるべきである。このオリゴヌ
クレオチドは、好ましくは、スクリーニングされるライブラリのＤＮＡとのハイ
ブリダイゼーションで検出されるように標識されている。標識化の方法は、当該
分野において良く知られており、３２Ｐ標識ＡＴＰ、ビオチン化又は酵素標識の
ような放射標識の使用が含まれる。中程度の緊縮性及び高度の緊縮性を含むハイ
ブリダイゼーションの条件は、Sambrookら., 上掲にて提供されている。
【０１３１】 このようなライブラリスクリーニング法で同定された配列を、GenBankなどの公
的データベース又は私的配列データベースに寄託され利用可能な他の周知の配列
と比較し整列させることができる。分子の特定領域内又は完全長配列を横切る（
アミノ酸又はヌクレオチドレベルのいづれか）配列同一性は、相同性を測定する
ために種々のアルゴリズムを用いるＡＬＩＧＮ、ＤＮＡｓｔａｒ、及びＩＮＨＥ
ＲＩＴ等のコンピュータソフトウェアプログラムを用いた配列アラインメントに
よって決定することができる。 タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ
酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されなかったｍＲＮＡの生
成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrookらにより記述されている従来の
プライマー伸展法を使用し、選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリをスクリ
ーニングすることにより得られる。
【０１３２】 ｉｉ．宿主細胞の選択及び形質転換 宿主細胞は、ここに記載したＬＩＶ-１産生についての発現又はクローニング
ベクターでトランスフェクト又は形質転換し、プロモータ誘発、形質転換体の選
択、又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適するように修飾した従来の滋
養媒質中で培養する。培地、温度、ｐＨ等の培養条件は、当業者が過度の実験を
することなく選択できる。一般的に、細胞培養の生産性を最大にするための概念
、プロトコール、及び実務的技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practi
cal Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991)及びSambrook, 上掲に見いだ
すことができる。
【０１３３】 トランスフェクションの方法は当業者に知られており、例えば、ＣａＰＯ４及
びエレクトロポレーションである。用いられる宿主細胞に応じて、そのような細
胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等
により記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレー
ションが、原核生物又は実質的な細胞壁障壁を含む他の細胞に対して用いられる
。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shawほか, Gene, 23
:315 (1983)及び１９８９年６月２９日公開の国際特許出願第ＷＯ８９／０５８
５９号に記載されたように、ある種の植物細胞の形質転換に用いられる。このよ
うな細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology
, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈殿法を用いることができる。哺乳動
物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第４，３９９，２１６号に記
載されている。酵母中の形質転換は、典型的には、Van solingenほか, J. Bact.
, 130:946 (1977)及びHsiaoほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979
)の方法によって実施する。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法
、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞
、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロト
プラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種
々の技術については、Keownほか, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)
及び Mansourほか, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
【０１３４】 ここのベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細
胞は、原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞を含む。適切な原核生物は、限定
するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例え
ば大腸菌のような腸内菌科である。種々の大腸菌株が公的に利用可能であり、例
えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）；大腸菌Ｘ１７７６（
ＡＴＣＣ３１５３７）；大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）及びＫ５
７７２（ＡＴＣＣ５３６３５）である。 原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ＬＩＶ-１をコ
ードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミ
セス・セレヴィシアは通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。 ＬＩＶ-１の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動
物細胞の例としては、ショウジョウバエＳ２及びスポドプテラＳｆ９等の昆虫細
胞並びに植物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、チャイニー
ズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及びＣＯＳ細胞を含む。より特別の例は、ＳＶ４０
によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (COS-7, ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓
株（293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Grahamほ
か, J. Gen Virol., 36:59 (1977)）;チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨ
ＦＲ(CHO, Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));
マウスのセルトリ細胞（TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）;ヒ
ト肺細胞 (W138, ATCC CCL 75); ヒト肝細胞 (Hep G2, HB 8065); 及びマウス乳
房腫瘍細胞 (MMT 060562, ATTC CCL51)を含む。適当な宿主細胞を選択するのは
、当業者の技量の範囲内である。
【０１３５】 ｉｉｉ．複製可能なベクターの選択及び使用 ＬＩＶ-１をコードする核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)を、クロー
ニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入してよい。
様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コ
スミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配
列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で
周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター
成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、１つ又は複数のシ
グナル配列、複製開始点、１つ又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメ
ント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の１つ又は複数を
含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術
を用いる。
【０１３６】 ＬＩＶ-１ポリペプチドは直接的に組換え手法によって生産されるだけではな
く、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ-末端に特
異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプ
チドとしても生産される。一般的に、シグナル配列はベクターの成分であるか、
ベクターに挿入されるＰＲＯ-コード化ＤＮＡの一部である。シグナル配列は、
例えばアルカリフォスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定性エ
ンテロトキシンIIリーダーの群から選択された原核生物シグナル配列であってよ
い。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、ア
ルファ因子リーダー(サッカロミセス(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(K
luyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第５，０１０，１８２号
に記載されている)、又は酸ホスファターゼリーダー、カンジダアルビカンス（C
.albicans)グルコアミラーゼリーダー(１９９０年４月４日発行のＥＰ３６２１
７９)、又は１９９０年１１月１５日に公開されたＷＯ９０／１３６４６に記載
されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグ
ナル配列は、同一あるいは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並
びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
【０１３７】 発現及びクローニングベクターは共に１つ又は複数の選択された宿主細胞にお
いてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌
、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来
する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点
は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウ
イルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有
用である。 発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される
選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、
メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素
に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバシリに対する遺伝子
コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素
を供給するタンパク質をコードする。
【０１３８】 哺乳動物細胞に適切な選べるマーカーの例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナ
ーゼのようにＰＲＯ-コード化核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定する
ことのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Ur
laubらにより Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されている
ようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞である
。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔ
ｒｐ１遺伝子である［Stinchcombら, Nature, 282：39(1979)；Kingsmanら, Gen
e, 7：141(1979)；Tschemperら, Gene, 10：157(1980)］。ｔｒｐ１遺伝子は、
例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン
内で成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する［
Jones, Genetics, 85:12 (1977)］。 発現及びクローニングベクターは、通常、ＬＩＶ-１-コード化核酸配列に作用
可能に結合し、ｍＲＮＡ合成を制御するプロモーターを含む。種々の可能な宿主
細胞により認識される好適なプロモーターが知られている。原核生物宿主での使
用に好適なプロモーターはβ-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Cha
ngら, Nature, 275:615 (1978)； Goeddelら, Nature, 281:544 (1979)］、アル
カリフォスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系［Goeddel, Nuclei
c Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776］、及びハイブリッドプロモーター、
例えばｔａｃプロモーター［deBoer ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-2
5 (1983)］を含む。細菌系で使用するプロモータもまたＰＲＯポリペプチドをコ
ードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン-ダルガーノ(S.D.)配列を有する
。
【０１３９】 酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリ
セラートキナーゼ［Hitzeman ら, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)］又は他の
糖分解酵素［Hess ら, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Biochem
istry, 17：4900(1987)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸
デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフ
ルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレート
ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコー
スイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。 他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効
果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチ
トクロムＣ、酸フォスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオ
ネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及び
ガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現
に好適に用いられるベクターとプロモータはＥＰ ７３，６５７に更に記載され
ている。
【０１４０】 哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのＬＩＶ-１の転写は、例えば、ポ
リオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(１９８９年７月５日公開のＵＫ２，
２１１，５０４)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィ
ルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウ
ィルス及びサルウィルス４０(ＳＶ４０)のようなウィルスのゲノムから得られる
プロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は
免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモータ
ーによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される
。 より高等の真核生物による所望のＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡの転
写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エ
ンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその
転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエン
ハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フ
ェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィル
ス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側の
ＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロ
モーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノ
ウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ＰＲＯコード化配列の５’
又は３’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーター
から５’位に位置している。
【０１４１】 また真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細
胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡ
の安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮ
Ａ又はｃＤＮＡの通常は５’、時には３’の非翻訳領域から取得できる。これら
の領域は、ＰＲＯポリペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニ
ル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。 組換え脊椎動物細胞培養でのＰＲＯポリペプチドの合成に適応化するのに適切
な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gethingら, Nature, 293:620-625 (1981
); Manteiら, Nature, 281:40-46 (1979)；ＥＰ１１７，０６０；及びＥＰ１１
７，０５８に記載されている。
【０１４２】 ｉｖ．遺伝子増幅／発現の検出 遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識
されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写
を定量化するノーザンブロット法［Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:52
01-5205 (1980)］、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリダ
イゼーション法によって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、
ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-
タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いること
もできる。次いで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本
鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に
結合した抗体の存在を検出することができる。 あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な
方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のア
ッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又
はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意
の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列ＬＩＶ-１ポ
リペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプ
チドに対して、又はＬＩＶ-１ ＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードす
る外因性配列に対して調製され得る。
【０１４３】 ｖ．宿主細胞からのＬＩＶ-１ポリペプチドの生産と単離 哺乳動物細胞におけるＰＲＯの発現 この実施例は、哺乳動物細胞での組み換え発現によるＬＩＶ-１ポリペプチド
の潜在的なグリコシル化形態の調製を例証する。 発現ベクターとしては、ベクターｐＲＫ５（１９８９年３月１５日公開のＥＰ
３０７，２４７参照）を用いる。場合によっては、上記のSambrook等に記載のよ
うなライゲーション方法を用いて、選択した制限酵素でＬＩＶ-１ ＤＮＡ １６
４６４７をｐＲＫ５とライゲーションし、ＬＩＶ-１ ＤＮＡの挿入を可能にする
。この結果生じたベクターをｐＲＫ５-ＤＮＡ１６４６４７と呼ぶ。 一実施態様では、選択宿主細胞を２９３細胞にしてもよい。ヒト２９３細胞（
ATCC CCL 1573）を、ウシ胎児血清、そして場合によっては滋養成分及び／又は
抗生物質で補ったＤＭＥＭなどの培地中の組織培養プレートで、集密化するまで
成長させる。約１０μｇのｐＲＫ５-ＤＮＡ１６４６４７ＤＮＡを、約１μgのＶ
Ａ ＲＮＡ遺伝子コード化ＤＮＡ［Thimmappayaら, Cell, 31:543 (1982))］と混
合し、５００μｌの１ｍＭ トリス-ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２２７
Ｍ ＣａＣｌ２に溶解する。この混合物に、滴状の５００μｌの５０ｍＭ ＨＥＰ
ＥＳ（ｐＨ７．３５）、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＮａＰＯ４を添加し
、２５℃で１０分間にわたって、析出物を形成させる。この析出物を懸濁して２
９３細胞に加え、３７℃で約４時間にわたって定着させた。培地を吸引し、２ｍ
ｌの２０％グリセロールのＰＢＳを３０秒間で添加した。次いで、この２９３細
胞を無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加して細胞を約１−５日間にわたって
インキュベートした。
【０１４４】 形質移入後のの約２４時間には、培養培地を除去し、培養培地（のみ）或いは
２００μＣｉ／ｍｌ３５Ｓ−システイン及び２００μＣｉ／ｍｌ３５Ｓ−メチオ
ニンを含む培地で置換した。１２時間のインキュベーションの後には、培養上清
を回収し、スピンフィルターで濃縮し、１５％ＳＤＳゲルに負荷する。この処理
したゲルを乾燥し、ＬＩＶ-１ポリペプチドの存在を現す選択された時間にわた
ってフィルムにさらす。形質転換した細胞を含む培地に、更なるインキュベーシ
ョンを施してもよく（無血清培地で）、この培地を選択されたバイオアッセイで
試験する。 これに換わる技術としては、Somparyacら, Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575
(1981)に記載されたデキストラン硫酸法を用いて、ＬＩＶ-１ ＤＮＡ１６４６
４７を２９３細胞へ過度的に導入してもよい。２９３細胞を、スピナーフラスコ
内で最大密度まで成長させ、７００μｇのｐＲＫ５-ＤＮＡ １６４６４７ＤＮＡ
を添加する。この細胞を、まずは遠心分離によってスピナーフラスコから濃縮し
、ＰＢＳで洗浄する。ＤＮＡ-デキストラン沈殿物を、細胞ペレット上で４時間
にわたってインキュベートする。この細胞を２０％グリセロールで９０秒間処理
し、組織培養培地で洗浄し、組織培養培地、５μｇ／ｍｌウシインシュリン、及
び０．１μｇ／ｍｌウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコに再度導入し
た。約４日後に、培養上清を遠心分離し、濾過して細胞及び細胞片を除去した。
次いで、任意の透析及び／又はカラムクロマトグラフィー等の選択した方法によ
って、発現したＬＩＶ-１を含む試料を濃縮し、精製することができる。
【０１４５】 ＬＩＶ-１をＣＨＯ細胞で発現させることができる。ＰＣＲ増幅に続いて、Aus
ubelら, Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley an
d Sons (1997)に記載のような標準的技術を用いて、それぞれのＤＮＡをＣＨＯ
発現ベクターにサブクローニングする。ＣＨＯ発現ベクターを、対象とするＤＮ
Ａの５’及び３’に適合する制限部位を有し、ｃＤＮＡの簡便にシャトル化がで
きるように作成する。ＣＨＯ細胞での発現に利用されるベクターは、Lucasら, N
ucl. Acids Res. 24: 9, 1774-1779 (1996)に記載されたようなものであり、対
象とするｃＤＮＡ及びジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）の発現の制
御にＳＶ４０初期プロモーター／エンハンサーを用いる。ＤＨＦＲ発現は、形質
移入に続くプラスミドの安定な維持に関する選択を可能にする。 所望のプラスミドＤＮＡの１２マイクログラムを、市販の形質移入試薬Superf
ect(登録商標)(Quiagen), Dosper(登録商標)及びFugene(登録商標)（Boehringer
Mannheim）を使用して、約１千万のＣＨＯ細胞に導入する。この細胞を、上記
のLucas等に記載されているように成長させる。下記に記載のような更なる成長
及び生産のために、約３ｘ１０-７の細胞をアンプルで凍結する。
【０１４６】 このプラスミドＤＮＡを含むアンプルを水槽に配することで解凍し、ボルテッ
クスによって混合する。内容物を１０ｍＬの媒質を含む遠心管へピペットし、１
０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。その上清を吸引し、細胞を１０ｍＬの選択
培地（０．２μｍ濾過ＰＳ２０、５％の０．２μｍ透析濾過ウシ胎児血清を添加
）に懸濁する。次いで、この細胞を９０ｍＬの選択培地を含む１００ｍＬスピナ
ーに分ける。１−２日後、細胞を１５０ｍＬの選択培地で満たした２５０ｍＬス
ピナーに移し、３７℃でインキュベートする。２−３日後、２５０ｍＬ、５００
ｍＬ及び２０００ｍＬのスピナーを３ｘ１０５細胞／ｍＬで播種する。遠心分離
及び生産培地での再懸濁によって、細胞培地を新鮮な培地で交換する。任意の適
切なＣＨＯ培地を用いてもよいが、実際には１９９２年６月１６日に発行された
米国特許第５，１２２，４６９号に記載されている生産培地を使用してもよい。
３Ｌの生産スピナーを１．２ｘ１０６細胞／ｍＬで播種する。０日目に、細胞数
とｐＨを測定する。１日目に、スピナーから試料採取し、濾過空気での散布を実
施する。２日目に、スピナーから試料採取し、温度を３３℃に変え、３０ｍＬの
５００ｇ／Ｌのグルコース及び０．６ｍＬの１０％消泡剤（例えば３５％ポリジ
メチルシロキサンエマルション、Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion）を
使用する。生産を通して、７．２近傍に維持するために、必要ならばｐＨを調節
する。１０日後、或いは生存率が７０％を下回るまで、細胞培養を遠心分離で回
収して０．２２μｍフィルターで濾過する。濾過物は、４℃で貯蔵するか、即座
に精製用カラムへ負荷する。
【０１４７】 ポリ-Hisタグ作成物に関しては、タンパク質をＮｉ-ＮＴＡカラム（Qiagen）
を用いて精製した。精製の前に、イミダゾールを培養上清へ５ｍＭの濃度まで添
加した。この培養上清を、０．３Ｍ ＮａＣｌ及び５ｍＭイミダゾールを含む２
０ｍＭのHepes，ｐＨ７．４バッファーで平衡化した６ｍｌのＮｉ−ＮＴＡカラ
ムへ４−５ｍｌ／分の流速で４℃でポンプ供給した。負荷後、このカラムをさら
に平衡バッファーで洗浄し、０．２５Ｍイミダゾールを含む平衡バッファーでタ
ンパク質を溶離した。高度に精製されたタンパク質は、続いて２５ｍｌのG25 Su
perfine（Pharmacia）で、１０ｍＭ Hepes、０．１４Ｍ ＮａＣｌ及び４％マン
ニトール，ｐＨ６．８を含む貯蔵バッファーへ脱塩し、−８０℃で貯蔵した。 ＬＩＶ-１は、標準的な技術を使用して、ＣＯＳ細胞などの宿主細胞において
一過性又は安定な発現によって生産され得る。
【０１４８】 酵母菌でのＰＲＯの発現 以下の方法は、酵母菌中でのＬＩＶ-１の組換え発現を示す。 第１に、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターからのＬＩＶ-１の細胞内生産又
は分泌のために、酵母菌発現ベクターを作成する。ＬＩＶ-１をコードするＤＮ
Ａ１６４６４７及びプロモーターを、選択したプラスミドの適切な制限酵素部位
に挿入してＬＩＶ-１の細胞内発現を指示する。分泌のためには、ＬＩＶ-１をコ
ードするＤＮＡを、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーター、シグナルペプチド、例
えば哺乳動物のシグナルペプチド、或いは例えば酵母菌α因子又はインベルター
ゼ分泌シグナル／リーダー配列、並びに（必要ならば）リンカー配列とともに、
ＬＩＶ-１の発現のために選択したプラスミドへクローニングすることができる
。 酵母菌株ＡＢ１１０等の酵母菌を、次いで上記の発現プラスミドで形質転換し
、選択した発酵培地で培養できる。形質転換した酵母菌上清は、１０％トリクロ
ロ酢酸での沈降、並びにＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離に続くクマシーブルー染色
によるゲルの染色によって分析することができる。 続いて、遠心分離と続く選択したカートリッジフィルターを用いての培地の濃
縮によって、発酵培地から酵母菌細胞を取り除くことで、組換えＬＩＶ-１を単
離そして精製できる。選択したカラムクロマトグラフィー樹脂を用いて、ＬＩＶ
-１を含む濃縮物をさらに精製してもよい。
【０１４９】 バキュロウイルス感染昆虫細胞でのＬＩＶ-１の発現 以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞におけるＬＩＶ-１の組換え発
現を記載する。 ＬＩＶ-１のコード化配列を、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピ
トープタグの上流に融合させる。このようなエピトープタグには、ポリ-hisタグ
及び免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域など）が含まれる。ｐＶＬ１３９３
（Navagen）などの市販されているプラスミドから誘導されるプラスミドを含む
、種々のプラスミドを用いることができる。簡単には、ＬＩＶ-１又はＬＩＶ-１
のコード化配列の所定部分（例えば膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコード
する配列、或いはタンパク質が細胞外である場合の成熟タンパク質をコードする
配列など）が、５’及び３’領域に相補的なプライマーによるＰＣＲによって増
幅される。５’プライマーは、隣接する（選択された）制限酵素部位を包含して
いてもよい。生産物は、次いで、選択された制限酵素で消化され、発現ベクター
にサブクローニングされる。 組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びBaculoGold(商品名)ウイル
スＤＮＡ（Pharmingen）を、Spodoptera frugiperda（「Ｓｆ９」）細胞（ＡＴ
ＣＣ ＣＲＬ １７１１）中にリポフェクチン（GIBCO-BRLから市販）を用いて同
時トランスフェクションすることによって作成される。２８℃で４−５日インキ
ュベートした後、放出されたウイルスを回収し、更なる増幅に用いる。ウイルス
感染及びタンパク質発現は、O'Reilleyら, Baculovirus expression vectors: A
Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)に記載されてい
るように実施される。
【０１５０】 次に、発現されたポリ-hisタグＬＩＶ-１は、例えばＮｉ２＋-キレートアフィ
ニティクロマトグラフィーによって、次のようにして精製できる。抽出は、Rupe
rtら, Nature, 362:175-179 (1993)に記載のように、ウイルス感染した組み換え
Ｓｆ９細胞から調製する。簡単には、Ｓｆ９細胞を洗浄し、超音波処理用バッフ
ァー（２５ｍＬのHepes，ｐＨ７．９；１２．５ｍＭのＭｇＣｌ２；０．１ｍＭ
ＥＤＴＡ；１０％グリセロール；０．１％のＮＰ−４０；０．４ＭのＫＣｌ）で
再懸濁し、氷上で２回ずつ２０秒間超音波処理する。この超音波処理物は、遠心
分離によって透明にし、その上清を負荷バッファー（５０ｍＭリン酸塩、３００
ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ７．８）で５０倍希釈して０．４５
μｍフィルターで濾過する。Ｎｉ２＋-ＮＴＡアガロースカラム（Qiagenから市
販）を５ｍＬの総容積で調製し、２５ｍＬの水で洗浄して２５ｍＬの負荷バッフ
ァーで平衡化する。濾過した細胞抽出物を、毎分０．５ｍＬでこのカラムに負荷
する。カラムを、分画回収が始まる地点であるＡ２８０のベースラインまで負荷
バッファーで洗浄する。次に、このカラムを、非特異的に結合しているタンパク
質を溶離する二次洗浄バッファー（５０ｍＭリン酸塩；３００ｍＭのＮａＣｌ、
１０％グリセロール、ｐＨ６．０）で洗浄する。Ａ２８０のベースラインに再度
到達した後、このカラムを二次洗浄バッファーでの０から５００ｍＭイミダゾー
ルのグラジエントで展開する。１ｍＬの分画を回収し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ及び銀
染色又はアルカリホスファターゼ（Qiagen）に共役させたＮｉ２＋-ＮＴＡによ
るウェスタンブロットで分析する。溶離したＨｉｓ１０-タグＬＩＶ-１を含む分
画をプールして負荷バッファーで透析する。あるいは、ＩｇＧタグ（又はＦｃタ
グ）ＬＩＶ-１の精製は、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマ
トグラフィーを含む公知のクロマトグラフィー技術を用いて実施できる。
【０１５１】 発現は０．５−２Ｌのスケールでおこなったが、容易により大きな（例えば8L
）調製にスケールアップできる。タンパク質はＩｇＧ作成物（イムノアドヘシン
）として発現され、そこではタンパク質細胞外領域がヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３
ドメイン及び／又はポリ-Ｈｉｓタグ結合体を含むＩｇＧ１定常領域配列に融合
している。 ＰＣＲ増幅に続いて、対応するコード化配列をバキュロウイルス発現ベクター
（ＩｇＧ融合物に対するpb.PH.IgG及びポリＨｉｓタグタンパク質に対するpb.PH
.His.c）にサブクローニングし、そのベクター及びBaculogold(登録商標)バキュ
ロウイルスＤＮＡ（Pharmingen）を１０５スポドプテラグルヒペルダ（Spodopte
ra frugiperda）（「Ｓｆ９」）細胞（ATCC CRL 1711）にリポフェクチン（Gibc
o BRL）を用いて同時形質移入した。pb.PH.IgG及びPH.His.は、市販のバキュロ
ウイルス発現ベクターｐＶＬ１３９３（Pharmingen）の修飾物であり、Ｈｉｓ又
はＦｃタグ配列を含むように修飾されたポリリンカー領域を持つ。細胞を、１０
％のＦＢＳ（Hyclone）を添加したHinkのＴＮＭ-ＦＭ培地で成長させた。細胞は
、２８℃で５日間インキュベートした。上清を回収し、続いて上清を１０％ＦＢ
Ｓを添加したHinkのＴＮＭ-ＦＨ培地中、Ｓｆ９細胞に約１０の感染効率（ＭＯ
Ｉ）で感染させることにより、最初のウイルス増幅に用いた。細胞を２８℃で３
日間インキュベートした。上清を回収し、バキュロウイルス発現ベクターに対す
る構成物の発現を、１ｍｌの上清を２５ｍＬのヒスチジンタグタンパク質用のＮ
ｉ２＋-ＮＴＡビーズ（Qiagen）又はＩｇＧタグタンパク質用のプロテインＡセ
ファロースＣＬ-４Ｂビーズ（Pharmacia）へバッチ結合で結合させ、次いでクマ
シーブルー染色により周知の濃度のタンパク質標準と比較するＳＤＳ-ＰＡＧＥ
分析により測定した。
【０１５２】 第１の増幅ウイルス上清をＥＳＦ-９２１培地（Expression System LLC）中
、成長させたスピナー（５００ｍｌ）により培養させたＳｆ９細胞に、約０．１
のＭＯＩで感染させるのに使用した。細胞は２８℃で３日間インキュベートした
。上清を回収して濾過した。バッチ結合及びＳＤＳ−ＰＡＧＥを、スピナー培地
の発現が確認されるまで、必要に応じて繰り返した。 形質移入細胞からの培養上清（０．５〜３Ｌ）を、遠心分離により細胞を除去
し０．２２ミクロンフィルターを通して濾過することにより回収した。ポリ-Ｈ
ｉｓタグ構成物については、配列を含むタンパク質をＮｉ２＋-ＮＴＡカラム（Q
iagen）を用いて精製した。精製前に、イミダゾールを培養上清に５mMの濃度ま
で添加した。培養上清を、０．３ＭのＮａＣｌ及び５ｍＭイミダゾールを含む２
０ｍＭのＨｅｐｅｓ，ｐＨ７．４バッファーで平衡化した６ｍｌのＮｉ２＋-Ｎ
ＴＡカラムに４−５ｍｌ／分の流速で４℃においてポンプ供給した。添加後、カ
ラムをさらに平衡バッファーで洗浄し、タンパク質を０．２５Ｍイミダゾールを
含む平衡バッファーで溶出した。高度に精製されたタンパク質は、続いて１０ｍ
ＭのＨｅｐｅｓ、０．１４ＭのＮａＣｌ及び４％のマンニトールを含む貯蔵バッ
ファー, ｐＨ６．８中で２５ｍｌのG25 Superfine（Pharmacia）を用いて脱塩し
、−８０℃で貯蔵した。
【０１５３】 タンパク質のイムノアドヘシン（Ｆｃ含有）作成物を以下のようにして培養上
清から精製した。培養上清を、２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー， ｐＨ
６．８で平衡化した５ｍｌのプロテインＡカラム（Pharmacia）に添加した。添
加後、カラムを平衡バッファーでよく洗浄した後、１００ｍＭのクエン酸， ｐ
Ｈ３．５で溶出した。溶出したタンパク質は、１ｍｌの画分を２７５ｍＬの1Mト
リスバッファー, ｐＨ９を含む管に回収することにより即座に中和した。高度に
精製されたタンパク質は、引き続きポリ-Ｈｉｓタグタンパク質について上記し
た貯蔵バッファー中で脱塩した。ＰＲＯポリペプチドの均一性はＳＤＳポリアク
リルアミドゲル（ＰＥＧ）電気泳動及びエドマン(Edman)分解によるＮ-末端アミ
ノ酸配列決定により評価できる。
【０１５４】 ｖｉ．ポリペプチドの精製 ＬＩＶ-１ポリペプチドの形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収するこ
とができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-Ｘ１００)
又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。ＬＩＶ-１の発現に用い
られる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤な
どの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。 ＬＩＶ-１を、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが望ま
しい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イオン
交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換
樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；Ｓ
ＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いる
ゲル濾過;ＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラム；及び
ＬＩＶ-１ポリペプチドのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラ
ムである。この分野で知られ、例えば、Deutscher, Methodes in Enzymology, 1
82(1990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springe
r-Verlag, New York (1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用いるこ
とができる。選択される精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び特に生産
される特定のＬＩＶ-１ポリペプチドの性質に依存する。
【０１５５】 実施例３： 抗-ＬＩＶ-１抗体の調製及び効果 本発明で使用される 抗-ＬＩＶ-１抗体を生産するための例示的な技術を以下
に説明する。抗-ＥｒｂＢ２抗体の生産のための技術は、上掲及びここで参考文
献として取り入れられたＥｒｂＢ２の発行物に見出され得る。 抗体の生産にとって特に有用なＬＩＶ-１抗原は、例えば、所望の抗原性エピ
トープを含む ＬＩＶ-１-１６４６４７の細胞外ドメイン又はそれらの一部の可
溶形態のものであってよい。あるいは、抗体を産生するために、その細胞表面に
あるいは、抗体を産生するために、その細胞表面にＬＩＶ-１を発現する細胞(例
えばＬＩＶ-１を過剰発現するように形質転換されたＮＩＨ-３Ｔ３細胞)を使用
するができる。抗体の産生に有用な他の形態のＬＩＶ-１は当業者には明らかで
あろう。
【０１５６】 (ｉ) ポリクローナル抗体 ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原とアジュバントを複数回皮
下(ｓｃ)又は腹腔内(ｉｐ)注射することにより動物に産生される。免疫化される
種において免疫原性であるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニ
ン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビター
に関連抗原を、二官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホ
スクシンイミドエステル(システイン残基による抱合)、Ｎ-ヒドロキシスクシン
イミド(リジン残基による)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、
又はＲとＲ１が異なったアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲにより抱合させるこ
とが有用である。 動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート１００μｇ又は５μｇ(それぞ
れウサギ又はマウスの場合)を完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この
溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、
又は誘導体に対して免疫化する。１ヶ月後、該動物を、完全フロイントアジュバ
ントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のペプチド又はコンジュゲートを用
いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７ないし１４日後に動
物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達する
まで追加免疫する。好ましくは、動物は、同じ抗原のコンジュゲートであるが、
異なったタンパク質にコンジュゲートさせた、及び／又は異なった架橋剤によっ
てコンジュゲートさせたコンジュゲートで追加免疫する。コンジュゲートはまた
タンパク融合として組換え細胞培養中で調製することもできる。また、ミョウバ
ンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。
【０１５７】 (ｉｉ) モノクローナル抗体 モノクローナル抗体は実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する
、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能な
突然変異を除いて同一である。よって、「モノクローナル」との修飾詞は、別個
の抗体の混合物ではなく、抗体の特性を示すものである。 例えば、モノクローナル抗体は、Kohlerら, Nature, 256:495 (1975)により最
初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、又は組換えＤＮＡ法(米国
特許第４，８１６，５６７号)によって作製することができる。 ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハ
ムスターを上記したようにして免疫し、免疫化に用いられるタンパク質と特異的
に結合する抗体を生産するか又は生産することのできるリンパ球を導き出す。別
法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次に、リンパ球を、
ポリエチレングリコールのような適当な融剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハ
イブリドーマ細胞を形成する(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and
Practice,59-103頁[Academic Press, 1986])。
【０１５８】 このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫
細胞の増殖または生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地
に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニジン
ホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失するならば
、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を妨
げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有するであろ
う(ＨＡＴ培地)。 好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体
の安定な高レベルの生産を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性であ
る細胞である。これらの中でも、好ましい骨髄腫株化細胞は、マウス骨髄腫系、
例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センタ
ー、サンディエゴ、カリフォルニア、ＵＳＡから入手し得るＭＯＰＣ-２１及び
ＭＰＣ-１１マウス腫瘍、並びにアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ン、１０８０１ ユニバーシティー ブルバード, マナサス, バージニア, ２０
１１０−２２０９から入手し得るＳＰ-２又はＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞から誘
導されたものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫株化細胞もまた
ヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている(Kozbor, J.Immunol., 1
33:3001 (1984)；Brodeurら, Monoclonal Antibody Production Techniques and
Applications,51-63頁[Marcel Dekker, Inc., New York, 1987])。
【０１５９】 ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体
の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生され
るモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例え
ばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によっ
て測定する。 モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunsonほか, Anal. Biochem., 10
7:220 (1980)のスキャッチャード分析法によって測定することができる。 所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞
が確定された後、該クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な
方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principl
es and Practice, 59-103頁[Academic Press, 1986])。この目的に対して好適な
培地には、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地が包含される。加えて
、該ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖させる
ことができる。 サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ-
セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析
、又はアフィニティークロマトグラフィーのような常套的な免疫グロブリン精製
法により、培地、腹水、又は血清から好適に分離される。
【０１６０】 モノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは、常法を用いて(例えば、マウ
スの重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオ
チドプローブを用いることにより)即座に分離され配列決定される。ハイブリド
ーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび分離されたな
らば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、そうしないと免疫グロブ
リンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムス
ター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中にトランスフェクト
し、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を達成することができる。抗
体をコードするＤＮＡの細菌中での組換え発現に関する概説論文には、Skerraら
, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262(1993)及びPlueckthum, Immunol. Rev
s., 130:151-188(1992)がある。
【０１６１】 更なる実施態様では、抗体又は抗体フラグメントは、McCaffertyら, Nature,
348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブ
ラリから分離することができる。Clacksonら, Nature, 352:624-628 (1991)及び
Marksら, J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリを使用し
たマウス及びヒト抗体の分離を記述している。続く刊行物は、鎖混合による高親
和性(ｎＭ範囲)のヒト抗体の生産(Marksら, Bio/Technology, 10:779-783[1992]
)、並びに非常に大きなファージライブラリを構築するための方策としてコンビ
ナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouseら, Nuc.Acids.Res., 21:2265-226
6[1993])を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の分離に
対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別法で
ある。 ＤＮＡはまた、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード化配列を、相
同的マウス配列に代えて置換することにより(米国特許第４，８１６，５６７号
；Morrisonら, Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,81:6851[1984])、又は免疫グロブリン
コード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部又は一部を共有
結合させることで修飾できる。 典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメイ
ンに置換され、又は抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換されて、抗
原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と異なる抗原に対する特異性を有
するもう一つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。
【０１６２】 より具体的には、抗-ＬＩＶ-１モノクローナル抗体は、以下のようにして調製
される。抗-ＬＩＶ-１ ＩｇＧ１κマウスモノクローナル抗体、好ましくはＬＩ
Ｖ-１-１６４６４７タンパク質の細胞外ドメインに対して特異的なものを、Fend
lyら., Cancer Research 50: 1550-1558(1990)及びＷＯ８９／０６６９２に記載
の方法と組み合わせた当該分野における常套技術を使用して生産することができ
る。要約すると、ＬＩＶ-１発現細胞（好ましくはＤＮＡ１６４６４７でコード
されたＬＩＶ-１を発現する細胞）を、２５ｍＭ ＥＤＴＡを含有するリン酸緩衝
化生理的食塩水（ＰＢＳ）で収集し、ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化するのに使用
する。例えば、０、２、５及び７週目に、このマウスへ０．５ｍｌ ＰＢＳの１
０７細胞を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射をする。好ましくは細胞外ドメイン又は細胞
外断片によって３２Ｐ-標識ＬＩＶ-１タンパク質を免疫沈降する抗血清を有する
マウスへ、９及び１３週目に、小麦胚凝集素-セファロース（ＷＧＡ）精製ＬＩ
Ｖ-１膜抽出物の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射をする。０．１ｍｌのＬＩＶ-１調製物
の静脈内（ｉ．ｖ．）注射がこれに続き、そして脾細胞を、例えばマウスメラノ
ーマ株Ｘ６３-Ａｇ８．６５３と融合させる。ＥＬＩＳＡ及び放射性免疫沈降法
によって、ＬＩＶ-１結合に関してハイブリドーマの上清をスクリーニングする
。ＭＯＰＣ-２１（ＩｇＧ１）（Cappell, Durham, NC）を、アイソタイプマッチ
コントロールとして使用する。モノクローナル抗体を生産する他の方法が考慮さ
れているため、開示された抗-ＬＩＶ-１抗体を調製する方法を、例として提供す
る。
【０１６３】 治療は、マウス抗-ＬＩＶ-１抗体のヒト化種によっておこなった。このヒト化
抗体は、コンセンサスなヒトイムノグロブリンＩｇＧ１（ＩｇＧ１）のフレーム
ワークへマウス抗-ＬＩＶ-抗体の相補性決定領域を挿入することによって設計さ
れる（例として、Carterら., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285-4289(1992
)を参照）。この結果として生じた抗-ＬＩＶ-１モノクローナル抗体は、好まし
くはＬＩＶ-１タンパク質の細胞外ドメインに対して高い親和性を有し、インビ
トロ及びインビボ並びにヒト異種移植片において、乳癌細胞、肺癌細胞、前立腺
癌細胞又はＬＩＶ-１タンパク質を過剰発現する他の細胞の成長を阻害する。好
ましくは、本発明の抗-ＬＩＶ-１抗体は、インビトロにおいて、２０％を超える
、最も好ましくは５０％を超える腫瘍細胞成長を阻害する。また、本発明の好ま
しい抗-ＬＩＶ-１モノクローナル抗体は、単一の薬剤として、或いは細胞障害性
又は他の細胞成長阻害剤剤との組み合わせで、ＬＩＶ-１過剰発現転移性乳癌、
又は肺、前立腺又は他の癌を有する患者では臨床的に活性である。抗-ＬＩＶ-１
モノクローナル抗体は、大量に成長させた培養培地へ抗体を分泌する遺伝子操作
されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株によって生産される。この
抗体は、標準的なクロマトグラフイー及び濾過法を使用してＣＨＯ培養培地から
精製する。食品医薬品局の無菌性及び安全性に関する要件を満たすと同時に、同
一性、純度、及びり力価を確かめるために、抗体の各ロットをアッセイする。
【０１６４】 診断目的、或いは抗体のロットの力価を試験するためにインビトロでヒト癌細
胞を死滅させるために使用する場合には、一般的に、この抗体は、ＬＩＶ-１を
過剰発現している細胞の培養液、特にＥｒｂＢ２をも過剰発現しない癌細胞の培
養液へ添加される。コントロールとして、抗体はまた、ＬＩＶ-１を過剰発現し
ない細胞の培養液へ添加される。この抗体は、濃度が少なくとも約１０ｎＭの細
胞培養培地へ添加される。インビトロでの使用に関する製剤及び投与方法は重要
ではない。培養又は潅流培養培地と合う水溶性製剤が通常は使用される。癌の存
在又は程度を測定するために、従来の技術によって細胞障害性を測定してもよい
。 癌を治療するための細胞障害性放射性医薬品は、抗体へ放射活性アイソトープ
（例えば、Ｉ、Ｙ、Ｐｒ）を抱合させることによって作製され得る。ここで使用
される「細胞障害性成分」という用語は、そのようなアイソトープを包含するこ
とを意図している。 その他の実施態様では、リポソームは細胞障害性剤で満たされ、そのリポソー
ムは、成長因子のレセプターと特異的に結合する抗体でコーティングされている
。多くにレセプター部位があるために、この方法は、正しい細胞型への大量の薬
剤を送達することを可能にする。
【０１６５】 抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）は、ＬＩＶ-１タンパク質を過剰発現す
る癌牲細胞を細胞障害性作用の標的にする方法として考慮されている。本発明に
は、（ａ）ＬＩＶ-１タンパク質の細胞外ドメインに対する、並びに（ｂ）抗体
分子が結合する腫瘍細胞の溶解を媒介することができるサブクラス又はアイソタ
イプに属する抗体の使用に基づく方法が含まれる。より具体的には、これらの抗
体は、成長因子レセプターとの複合化によって、ナチュラルキラー細胞又はマク
ロマージのようなエフェクター細胞を活性化することにより血清の補体を活性化
し、及び／又は抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）を媒介するサブクラス又は
アイソタイプに属する。 また、本発明は、これら抗体の天然形態での、ＬＩＶ-１タンパク質を過剰発
現するヒト腫瘍の治療のための、これら抗体の一般的使用に関する。例えば腫瘍
に関連する細胞表層抗原と結合する多くのＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ３マウス抗体は
、インビボで腫瘍治療に使用できる。実際に、種々の腫瘍にＬＩＶ-１が存在す
るために、主題の抗体及びそれらの治療的利用には、普遍的な適用性がある。
【０１６６】 （ｉｉｉ）ヒト化及びヒト抗体 非ヒト抗体をヒト化する方法は従来からよく知られている。好ましくは、ヒト
化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これら非
ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる
「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、本質的には齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配
列でヒト抗体の該当する配列を置換することによりウィンターと共同研究者の方
法(Jonesほか, Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmannほか, Nature, 332:323
-327 (1988)、Verhoeyenほか, Science, 239:1534-1536[1988])を使用して実施
することができる。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメ
インより実質的に少ない分が非ヒト種由来の該当する配列で置換されたキメラ抗
体(米国特許第４，８１６，５６７号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的
にはいくらかのＣＤＲ残基及び場合によってはいくらかのＦＲ残基が齧歯類抗体
の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
【０１６７】 抗原性を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方の
可変ドメインの選択が非常に重要である。「ベストフィット法」では、齧歯動物
抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対
してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列をヒト化抗体
のヒトフレームワーク領域(ＦＲ)として受け入れる(Simsほか, J. Immunol., 15
1:2296 (1993)；Chothiaら, J. Mol. Biol., 196:901[1987])。他の方法では、
軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導さ
れる特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異
なるヒト化抗体に使用できる(Carterほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:42
85 (1992)；Prestaほか, J. Immunol., 151:2623[1993])。
【０１６８】 更に、抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持して
ヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親
及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物
の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的
に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリ
ン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは
購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能にお
ける残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合
能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原
に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ
残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般
的に、ＣＤＲ残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
【０１６９】 別法として、内因性の免疫グロブリン産生がなくともヒト抗体の全レパートリ
ーを免疫化することで産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、
マウス)を作ることが今は可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体
マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子の同型接合除去が内因性抗体産生
の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列突然変異体
マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の転移は、抗原投与時にヒ
ト抗体の産生をもたらす。Jakobovitsら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1
993)；Jakobovitsら, Nature 362:255-258 (1993); Bruggermanら, Year in Imm
uno., 7:33 (1993)を参照されたい。ヒト抗体は、ファージディスプレーライブ
ラリから取り出すこともできる(Hoogenboomら, J.Mol.Biol., 227:381(1991)；M
arksら, J.Mol.Biol. 222:581-597[1991])。
【０１７０】 (ｉｖ) 抗体フラグメント 抗体フラグメントを生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には
、これらのフラグメントは、無傷の抗体のタンパク分解性消化を介して誘導され
た(例えば、Morimotoら, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24
:107-117 (1992)及びBrennanら, Science, 229:81[1985]を参照されたい)。しか
し、これらのフラグメントは現在は組換え宿主細胞により直接生産することがで
きる。例えば、抗体フラグメントは上において検討した抗体ファージライブラリ
から分離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨフラグメントは大腸菌か
ら直接回収することができ、化学的に結合してＦ(ａｂ')２フラグメントを形成
することができる(Carterら, Bio/Technology 10:163-167[1992])。他のアプロ
ーチ法では、Ｆ(ａｂ')２フラグメントを組換え宿主細胞培養から直接分離する
ことができる。抗体フラグメントの生産のための他の方法は当業者には明らかで
あろう。他の実施態様では、選択抗体は単鎖Ｆｖフラグメント(ｓｃＦＶ)である
。ＷＯ９３／１６１８５を参照のこと。
【０１７１】 (ｖ) 二重特異性抗体 二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を
有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、ＬＩＶ-１タンパク質の２つの
異なるエピトープに結合し得る。例えば、一つのアームがＬＩＶ-１タンパク質
の細胞外ドメインの一番目のエピトープに結合し、その一方では、他方が異なる
ＬＩＶ-１エピトープと結合し得る。あるいは、ＬＩＶ-１アームは、ＥｒｂＢ２
発現細胞に細胞防御メカニズムを集中させるように、ＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)、Ｆ
ｃγＲＩＩ(ＣＤ３２)及びＦｃγＲＩＩＩ(ＣＤ１６)等のＩｇＧ(ＦｃγＲ)に対
するＦｃレセプター、又はＴ細胞レセプター分子(例えばＣＤ２又はＣＤ３)等の
白血球上のトリガー分子に結合するアームと結合し得る。また、二重特異性抗体
は、ＬＩＶ-１を発現する細胞に細胞障害剤を局在化するためにも使用され得る
。これらの抗体は、ＬＩＶ-１細胞外ドメイン結合アーム、並びに細胞障害剤(例
えば、サポリン(saporin)、抗インターフェロン-α、ビンカアルカロイド、リシ
ンＡ鎖、メトトレキセート又は放射性同位体ハプテン)と結合するアームを有す
る。二重特異性抗体は、完全長抗体、又は抗体フラグメント(例えばＦ(ａｂ')２ 二重特異性抗体)として調製できる。
【０１７２】 二重特異性抗体を作成する方法は当該分野において良く知られている。全長二
重特異性抗体の伝統的な産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に
基づき、ここで二つの鎖は異なる特異性を持っている(Millsteinら, Nature, 30
5:537-539[1983])。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられている
ため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性あ
る混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、
アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、か
なり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法がＷＯ９３／０８８２９及びTrau
neckerら、EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。
【０１７３】 異なったアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗
原−抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は
好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む免疫グロブ
リン重鎖定常ドメインとの融合である。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重
鎖定常領域(ＣＨ１)を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免
疫グロブリン重鎖の融合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしている
ＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時トランスフェ
クトする。これにより、組立に使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比
率が最適な収率をもたらす態様において、三つのポリペプチドフラグメントの相
互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペ
プチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が特に重
要性を持たないときは、２または３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配
列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【０１７４】 このアプローチ法の好適な実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異
性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハ
イブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)ことから
なる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が
提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グ
ロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このア
プローチ法は、ＷＯ９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体を産生
する更なる詳細については、例えばSureshら, Methods in Enzymology, 121:210
(1986)を参照されたい。 ＷＯ９６／２７０１１に記載された他のアプローチ法によれば、一対の抗体分
子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセン
トを最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメイン
の少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数
の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と
置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を
、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換え
ることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのよ
うな不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズム
が提供される。
【０１７５】 二特異性抗体とは架橋抗体や「ヘテロ抱合抗体」を含む。例えば、ヘテロ抱合
体の一方の抗体がアビジンと結合し、他方はビオチンと結合していても良い。こ
のような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせ
ること（米国特許第4,676,980号）及びＨＩＶ感染の治療（WO91/00360、WO92/20
0373及びEP03089）等の用途が提案されてる。ヘテロ抱合抗体は適当な架橋方法
によって生成できる。当技術分野においては、適切な架橋剤は周知であり、それ
らは複数の架橋法と共に米国特許第４，６７６，９８０号に記されている。
【０１７６】 抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例
えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennanら,
Science, 229:81 (1985) は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')
２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤
亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジス
ルヒド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアー
ト(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプ
トエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再転換し、他のＦａｂ'-ＴＮ
Ｂ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性
抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
【０１７７】 最近の進歩により、大腸菌からＦａｂ'-ＳＨ断片の直接の回収が容易になり、
これは科学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalabyら,J.
Exp.Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')
２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ'断片は大腸菌から別個に分泌され、イ
ンビトロで定方向化学共役させて二重特異性抗体を形成する。従って、形成され
た二重特異性抗体は、ヒト乳腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活
性を誘発すると同時に、ＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞及び正常ヒト
Ｔ細胞へ結合することが可能であった。同じような技術が、ＬＩＶ-１を過剰発
現するが、ＥｒｂＢ２を過剰発現しない細胞と結合することができる二重特異性
抗体を調製するために使用される。
【０１７８】 組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法
もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して
生産された。Kostelnyら, J.Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及び
Ｊｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異
なった抗体のＦａｂ'部分に結合させられた。抗体ホモダイマーはヒンジ領域で
還元されてモノマーを形成し、ついで再酸化させて抗体ヘテロダイマーを形成す
る。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Ho
llingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された
「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供し
た。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするのに十分に短い
リンカーにより軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を結合してな
る。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶ Ｈ ドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆ
ｖ(ｓＦｖ)ダイマーを使用する他の二重特異性抗体断片製造方策もまた報告され
ている。Gruberら, J.Immunol., 152:5368 (1994)を参照されたい。 二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することがで
きる。Tuttら J.Immunol. 147:60(1991)。
【０１７９】 (ｖｉ) 所望の特性を有する抗体のスクリーニング 抗体を生産するための技術は上述した。ここで記載されている特徴を有する抗体
が選択される。 細胞死を誘発する抗体を選択するために、例えばＰＩ、トリパンブルー又は７
ＡＡＤの取込みにより示される膜インテグリティの損失度合いを対照と比較して
求める。好ましいアッセイは「ＢＴ４７４細胞を使用するＰＩ取込みアッセイ」
である。このアッセイでは、ＢＴ４７４細胞(アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション[Rockville, MD])が、ダルベッコの変性イーグル培地(D-MEM)；１０
％の熱不活性化ＦＢＳ(Hyclone)と２ｍＭのＬ-グルタミンを補ったハムのＦ-１
２(５０：５０)で培養される。(従って、アッセイは補体及び免疫エフェクター
細胞の不在下で行われる)。ＢＴ４７４細胞を１００ｘ２０ｍｍ皿に、皿当たり
３ｘ１０６の密度で播種し、一晩付着させたままにする。ついで培地を除去し、
新しい培地を単独で、又は１０μｇ／ｍｌの適切なＭＡｂを含む培地と取り替え
る。細胞を３日間インキュベートする。各処理に続いて、単層をＰＢＳで洗浄し
、トリプシン処理により分離する。ついで、１２００ｒｐｍ、５分間、４℃で細
胞を遠心分離し、ペレットを３ｍｌのＣａ２＋結合氷冷バッファー(１０ｍＭの
Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１４０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＣａＣｌ２)に
再懸濁させ、細胞凝塊除去のために３５ｍｍのストレーナキャップ付き１２ｘ７
５チューブ(チューブ当たり１ｍｌ、処理グループ当り３チューブ)に等分する。
サンプルをＦＡＣＳＣＡＮ(商品名）フローサイトメータとＦＡＣＳＣＯＮＶＥ
ＲＴ(商品名）セルクエスト(CellQuest)ソフトウエア(Becton Dickinson)を使用
して分析する。ＰＩ取込みにより測定されるような、統計的に有意なレベルの細
胞死を誘発する抗体が選択される。
【０１８０】 アポトーシスを誘発する抗体を選択するためには、「ＢＴ４７４細胞を使用す
るアネキシン結合アッセイ」が利用できる。ＢＴ４７４細胞を培養し、先の段落
において記載したように皿に播種する。ついで培地を回収し、新しい培地を単独
で、又は１０μｇ／ｍｌの適切なＭＡｂを含む培地と取り替える。３日間インキ
ュベートした後、単層をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理により分離する。つい
で細胞を遠心分離し、Ｃａ２＋結合氷冷バッファーに再懸濁させ、細胞死アッセ
イに対して上述したようにチューブに等分する。ついでチューブに標識化アネキ
シン(例えばアネキシンＶ-ＦＴＩＣ)(１μｇ／ｍｌ)を入れる。サンプルをＦＡ
ＣＳＣＡＮ(商品名）フローサイトメータとＦＡＣＳＣＯＮＶＥＲＴ(商品名）セ
ルクエスト(CellQuest)ソフトウエア(Becton Dickinson)を使用して分析する。
対照に対して、統計的に有意なレベルのアネキシン結合を誘発する抗体がアポト
ーシス誘発抗体として選択される。 アネキシン結合アッセイに加えて、「ＢＴ４７４細胞を使用するＤＮＡ染色ア
ッセイ」が利用できる。このアッセイを行うために、先の２段落に記載したよう
に関心のある抗体で処理されたＢＴ４７４細胞を、３７℃で２時間、９μｇ／ｍ
ｌのＨＯＥＣＨＳＴ３３３４２(商品名）と共にインキュベートし、ついでＭＯ
ＤＦＩＴＬＴ(商品名）ソフトウエア(Verity Software House)を使用し、ＥＰＩ
ＣＳ ＥＬＩＴＥ(商品名）フローサイトメータ(Coulter Corporation)で分析す
る。このアッセイを使用し、未処理細胞(最大１００％のアポトーシス細胞)より
も２倍又はそれ以上(好ましくは３倍以上)のアポトーシス細胞のパーセンテージ
の変化を誘発する抗体が、プロアポトーシス抗体として選択される。
【０１８１】 関心のある抗体により結合したＬＩＶ-１６４６４７の細胞外ドメイン上のエ
ピトープに結合する抗体をスクリーニングするため、Antibodies, A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Harlow及びDavid Lane編(1988)に記
載されているような通常の交差ブロッキングアッセイを実施することができる。
別法として、従来から公知の方法により、エピトープマッピングを実施すること
もできる（例えば、切断変異分析及び部位特異的変異誘発（Nakamuraら., J. of
Virology 67(10): 6179-6191[１９９３年１０月]；Rentzら., J. Cell Biol. 1
25(6): 1395-1406[１９９４年６月]）によって決定されたような、ErbB2の細胞
外ドメインのエピトープマッピングに使用した方法を参照のこと）。更には、特
定のアミノ酸配列が、エピトープのすべて又は実質的な部分を形成すると思われ
ている場合には、その配列から成るポリペプチドは、抗体と接触せしめられ、そ
して標準的な技術を使用して、ＬＩＶ-１-１６４６４７、例えばＬＩＶ-１-１６
４６４７ＥＣＤとの結合について競合するその能力に関して試験することができ
る。 細胞培養においてＬＩＶ-１発現細胞の成長を５０-１００％阻害する抗ＬＩＶ
-１抗体を同定するために、アッセイを以下のように実施することができる：Ｌ
ＩＶ-１発現細胞を、１０％のウシ胎児血清、グルタミン及びペニシリンストレ
プトマイシンを補充したＤＭＥＭ及びＦ１２培地の１：１混合物で生育させる。
ＬＩＶ-１発現細胞を、３５ｍｍの細胞培養皿に２０，０００細胞でプレートす
る(２ｍｌ／３５ｍｍ皿)。１皿当り２．５μｇ／ｍｌの抗ＬＩＶ-１抗体を添加
する。６日後、未処理細胞と比べた細胞数を電子ＣＯＵＬＴＥＲ(登録商標)細胞
カウンタを使用してカウントする。ＬＩＶ-１発現細胞の成長を５０-１００％阻
害する抗体を、所望のようなアポトーシス抗体と組合せるために選択する。
【０１８２】 (ｖｉｉ) エフェクター機能の設計 本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば癌の治療における抗
体の効能を増強することが望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入
して、この領域における鎖間ジスルイド結合の形成を許容する。このようにして
産生されたホモダイマー抗体は改善されたインターナリゼーション能力及び／又
は増加した補体媒介細胞死滅及び抗体依存性細胞障害活性(ＡＤＣＣ)を有しうる
。Caronら, J.Exp.Med. 176:1191-1195 (1992)及びShopes,B. J.Immunol. 148:2
918-2922 (1992)を参照されたい。抗腫瘍活性が高められたホモダイマー抗体は
、Wolffら, Cancer Research 53:2560-2565(1993)に記載されているようなヘテ
ロ二官能性架橋剤を使用して調製することもできる。別法として、二重Ｆｃ領域
を有し、よって増強された補体溶解及びＡＤＣＣ能を有しうる抗体を設計するこ
とができる。Stevensonら, Anti-cancer Drug Design 3:219-230 (1989)を参照
。
【０１８３】 (ｖｉｉｉ) 免疫コンジュゲート また本発明はここで記載され、細胞障害剤、例えば化学療法剤、毒素(例えば
、細菌、真菌、植物または動物由来の酵素活性毒又はそれらのフラグメント)、
又は放射性アイソトープ(すなわち、放射性コンジュゲート)に抱合した抗体を含
有する免疫コンジュゲートに関する。 このような免疫コンジュゲートの生成に有用な化学療法剤は上述している。使
用可能な酵素活性毒及びそのフラグメントには、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒
素の非結合性活性フラグメント、外毒素Ａ鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(
Pseudomonas aeruginosa))、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン(modeccin)Ａ
鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites ford
ii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカー
ナ(Phytolaca americana)プロテイン(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ-Ｓ)、モ
モルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(cur
cin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロ
ニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)
、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれ
る。種々の放射性核種が放射性コンジュゲート抗ＥｒｂＢ２抗体の生成に利用で
きる。具体例には２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅを
含む。
【０１８４】 抗体と細胞障害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリン
グ剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオナート
(ＳＰＤＰ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例え
ばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスク
シンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビス-アジド化合
物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム
誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン)、ジイ
ソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素
化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製さ
れる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載
されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナ
トベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)が抗体に放
射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。ＷＯ９４
／１１０２６号を参照されたい。 他の実施態様では、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプタ
ー」(例えばストレプトアビジン)に抗体がコンジュゲートされ得、ここで、抗体
-レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いて清澄化(clearing)剤を使用
し、循環から未結合コンジュゲートを除去し、細胞障害剤(例えば放射性ヌクレ
オチド)にコンジュゲートする「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
【０１８５】 (ｉｘ) 免疫リポソーム ここで開示されている抗-ＬＩＶ-１抗体は、免疫リポソームとして処方するこ
ともできる。抗体を含有するリポソームは、例えばEpsteinら, Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 82:3688(1985)；Hwangら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030(1
980)；及び米国特許第４，４８５，０４５号及び同４，５４４，５４５号に記載
されているように、当該分野において既知の方法により調製される。循環時間が
増したリポソームは米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。 特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ
-誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ-ＰＥ)を含有する脂質組成物
を用いた逆相蒸発法により作製することができる。リポソームは孔径が定められ
たフィルターを通して押し出され、所望の直径を有するリポソームが得られる。
本発明の抗体のＦａｂ'フラグメントは、ジスルフィド交換反応を介して、Marti
nら, J. Biol. Chem. 257:286-288(1982)に記載されているようにしてリポソー
ムにコンジュゲートすることができる。場合によっては、化学療法剤はリポソー
ム内に包含される。Gabizonら, J. National Cancer Inst. 81(19)1484(1989)を
参照されたい。
【０１８６】 (ｘ) 抗体依存性酵素媒介性プロドラッグ治療法(ＡＤＥＰＴ) また、本発明の抗体は、プロドラッグ(例えばペプチジル化学療法剤、ＷＯ８
１／０１１４５を参照)を活性な抗癌剤に転化させるプロドラッグ活性化酵素に
抗体をコンジュゲートさせることにより、ＡＤＥＰＴにおいて使用することがで
きる。例えばＷＯ８８／０７３７８及び米国特許第４，９７５，２７８号を参照
されたい。 ＡＤＥＰＴに有用な免疫コンジュゲートの酵素成分には、より活性な細胞毒形
態に転化するように、プロドラッグに作用し得る任意の酵素が含まれる。
【０１８７】 限定するものではないが、この発明の方法に有用な酵素には、ホスファート含
有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアルカリ性ホスファターゼ；
スルファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアリールスル
ファターゼ；非毒性５-フルオロシトシンを抗癌剤５-フルオロウラシルに転化す
るのに有用なシトシンデアミナーゼ；プロテアーゼ、例えばセラチアプロテアー
ゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ及びカテプシン(例
えば、カテプシンＢ及びＬ)で、ペプチド含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化
するのに有用なもの；Ｄ-アミノ酸置換基を含有するプロドラッグの転化に有用
なＤ-アラニルカルボキシペプチダーゼ；炭水化物切断酵素、例えばグリコシル
化プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なノイラミニダーゼ及びβガラ
クトシダーゼ；βラクタムで誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に転化させるのに
有用なβラクタマーゼ；及びペニシリンアミダーゼ、例えばそれぞれフェノキシ
アセチル又はフェニルアセチル基で、それらのアミン性窒素において誘導体化さ
れた薬剤を遊離の薬剤に転化するのに有用なペニシリンＶアミダーゼ又はペニシ
リンＧアミダーゼが含まれる。あるいは、「アブザイム」としてもまた公知の酵
素活性を有する抗体を、遊離の活性薬剤に本発明のプロドラッグを転化させるた
めに使用することもできる(例えば、Massey, Nature 328:457-458[1987]を参照)
。抗体-アブザイムコンジュゲートは、ここで記載されているようにして、腫瘍
細胞個体群にアブザイムを送達するために調製することができる。
【０１８８】 この発明の酵素は、当該分野においてよく知られている技術、例えば上で検討
したヘテロ二官能性架橋試薬を使用することにより、抗-ＬＩＶ-１抗体に共有的
に結合させることができる。あるいは、本発明の抗体の少なくとも結合領域を本
発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部位に結合せしめてなる融合タンパク質
を、当該技術においてよく知られている組換えＤＮＡ技術を使用して作成するこ
とができる(Neubergerら, Nature 312:604-608[1984])。
【０１８９】 (ｘｉ) 抗体-サルベージレセプター結合エピトープ融合 本発明のある実施態様においては、例えば腫瘍浸透性を増大させるために無傷
の抗体よりも抗体フラグメントを使用することが望ましい。この場合、その血清
半減期を増大させるために抗体フラグメントを改変することが望ましい。これは
、例えば、抗体フラグメントにサルベージレセプター結合エピトープを導入する
ことにより(例えば、抗体フラグメント中の適当な領域の突然変異により、ある
いはついで抗体フラグメントの何れかの末端又は中央に、例えばＤＮＡ又はペプ
チド合成により融合されるペプチドタグ内にエピトープを導入することにより)
達成できる。
【０１９０】 インビボでの半減期が増加したこのような抗体変異体を調製するための組織的
方法は、いくつかの工程を含んでなる。第１にはＩｇＧ分子のＦｃ領域のサルベ
ージレセプター結合エピトープの配列及び高次構造を同定することが含まれる。
ひとたびこのエピトープが同定されると、同定された結合エピトープの配列及び
高次構造を含むように、関心のある抗体の配列を修飾する。配列を変異させた後
、抗体変異体を検査して元の抗体よりもインビボ半減期が長くなっているかどう
か調査する。検査では、抗体変異体がより長いインビボ半減期を有していなかっ
たら、その配列をさらに改変して、同定された結合エピトープの配列及び高次構
造が含まれるようにする。改変された抗体をインビボ半減期が長くなっているか
否かについて検査し、このプロセスを、より長いインビボ半減期を示す分子が得
られるまで続ける。
【０１９１】 関心のある抗体にこのようにして導入されているサルベージレセプター結合エ
ピトープは、上述したような任意の適切なエピトープであり、その性質は、例え
ば修飾されている抗体のタイプに依存する。転移は、関心のある抗体がここで記
載した生物学的活性を有するようになされる。 エピトープは、好ましくは、Ｆｃドメインの一又は二つのループからの一又は
複数のアミノ酸残基が抗体フラグメントの類似位置に移される領域を構成する。
更により好ましくは、Ｆｃドメインの一又は二つのループの３又はそれ以上の残
基が移される。更に好ましくは、エピトープはＦｃ領域(例えばＩｇＧの)のＣＨ
２ドメインから取上げられ、抗体のＣＨ１、ＣＨ３、又はＶＨ領域、あるいは一
以上のそのような領域に移される。別法として、エピトープをＦｃ領域のＣＨ２
ドメインから取上げ、抗体フラグメントのＣＬ領域又はＶＬ領域、又は両方に移
す。
【０１９２】 (ｘｉｉ) 抗-ＬＩＶ-１抗体の精製 組換え技術を使用する場合、抗体は、細胞膜周辺腔において細胞内生産するこ
とができ、又は培地に直接分泌させることができる。抗体が細胞内生産されると
きは、第一工程として、宿主細胞であれ溶解断片であれ、粒状細片を、例えば遠
心分離又は限外濾過により除去する。Carterら, Bio/Technology 10:163-167(19
92)には、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌される抗体を単離する手順が記載されて
いる。簡単には、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム(ｐＨ３．５)、ＥＤＴＡ、及
びフェニルメチルスルホニルフロリド(ＰＭＳＦ)の存在下で、約３０分以上かけ
て溶かす。細胞屑は遠心分離により除去可能である。抗体が培地に分泌される場
合、そのような発現系からの上清は、好ましくは、商業的に入手可能なタンパク
質濃縮フィルター、例えばアミコン又はミリポアペリコン限外濾過ユニットを使
用して最初に濃縮される。ＰＭＳＦのようなプロテアーゼインヒビターを、タン
パク分解を阻害するために先の工程の何れかで含めてもよく、また抗生物質を外
来性汚染物の成長を防ぐために含めてもよい。
【０１９３】 細胞から調製された抗体組成物は、例えばヒドロキシルアパタイトクロマトグ
ラフィー、ゲル電気泳動法、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを使
用して精製することができ、アフィニティークロマトグフィーが好適な精製法で
ある。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在
する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに依存する。プロ
テインＡはヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体を精製するために使用す
ることができる(Lindmarkら, J.Immunol.Meth.62:1-13[1983])。プロテインＧが
全てのマウスのアイソタイプ及びヒトγ３に対して推奨される(Gussら, EMBO J.
5:1567-1575[1986])。アフィニティーリガンドが結合するマトリックスは最も
頻繁にはアガロースであるが、他のマトリックスも利用することができる。調整
穴あきガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼンのように機械的に安定なマトリ
ックスを使用すれば、アガロースの場合よりも速い流速と短い処理時間が可能に
なる。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合は、ベイカーボンド(Bakerbond)ＡＢＸ
（商品名）樹脂(J．T．Baker, ニュージャージー州フィリップスバーグ)が精製
に有用である。イオン交換カラムによる分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、
シリカによるクロマトグラフィー、ヘパリンセファロース(ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ
（商品名）)によるクロマトグラフィー、陰イオン又は陽イオン交換樹脂(ポリア
スパラギン酸カラムなど)によるクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング
、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ及び硫酸アンモニウム沈殿のような他のタンパク質精製技術
も、回収しようとする抗体によっては利用できる。 前段階の精製工程に続いて、関心ある抗体と汚染物質を含有する混合物を、約
２．５-４．５のｐＨで溶離バッファーを使用し、好ましくは低い塩分濃度(例え
ば、約０-０．２５Ｍの塩)で低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーにかけて
もよい。
【０１９４】 実施例４： ＬＩＶ-１は、細胞表層に発現 ＬＩＶ-１の推定アミノ酸配列の分析は、タンパク質の一部分が細胞外ドメイ
ン（ＥＣＤ）として存在することを示した。この発見を確かなものにするために
、ＥＣＤを発現させ、精製し、そして抗-ＬＩＶ-１ ＥＣＤ抗体の発生のための
抗原として使用した。抗体を完全長ＬＩＶ-１タンパク質を発現している細胞へ
接触させた。この実施例は、抗-ＬＩＶ-１ ＥＣＤ抗体がＬＩＶ-１発現細胞と結
合したことを示し、ＬＩＶ-１が細胞外ドメインを含むことを明らかにする。
【０１９５】 大腸菌におけるＬＩＶ-１ ＥＣＤの発現 抗体を生成することができるＬＩＶ-１ ＥＣＤの試料を得るために、アミノ酸
リーダー配列と作用可能に連結したＬＩＶ-１細胞外ドメインをコードする核酸
ベクターを最初に構築した後に、ＬＩＶ-１の細胞外ドメインを含んでなるポリ
ペプチドを大腸菌で発現させた。核酸構成物を調製し、コードされたタンパク質
を発現するために、以下の手法が使用された。 成熟ＬＩＶ-１の細胞外ドメインをコードしするアミノ酸１−２９８をコード
するＤＮＡを、プライマー5'-CAACATCAAATGCATCAACTTCATGAACTAAAAGCAGCTGCT-3'
（配列番号：９）及び5'-GAGCTCGAGCGGCCGCTTAGGTCTTTGGAGGGATTTCAGCCTT-3'（
配列番号：１０）を使用して完全長ｃＤＮＡから標準ＰＣＲ技術によって調製し
た。ＰＣＲ反応を二つに分けた：最初の半分は、ＮｓｉＩ及びＳａｃＩで消化し
、他の半分をＳａｃＩ及びＮｏｔＩで消化した。アミノ酸１−１６６をコードす
るＮｓｉＩ-ＳａｃＩ ＤＮＡ断片、並びにアミノ酸１６７−２９８をコードする
ＳａｃＩ-ＮｏｔＩ断片を単離し、前もって消化した，ＮｓｉＩ制限部位である
Ｎ末端ｐｏｌｙｈｉｓリーダーの３’末端を含有するｐＢＲ３２２-誘導ベクタ
ーである発現ベクターｐＳＴ２３９ｈｅライゲーションした。この結果生じたＬ
ＩＶ-１ ＥＣＤ発現プラスミドをｐＥ１６４６４７と命名した。
【０１９６】 ＳＴ２３９ベクターにおける発現の転写及び翻訳制御は、以下の遺伝的特徴に
よって提供された。転写開始は、大腸菌のアルカリフォスファターゼプロモータ
ーによって制御された（Kikuchi Y. ら., Nucleic Acids Res. 9: 5671-5678(19
81)）。ｔｒｐオペロンのリボゾーム結合部位は、翻訳開始に使用された（Yanof
sky C. ら., Nucleic Acids Res. 9: 6647-6668 (1981)）。翻訳終結は、希コド
ンｔＲＮＡ遺伝子ｐｒｏ２、ａｒｇＵ、及びｇｌｙＴ（Komine Y., ら., J. Mol
. Biol. 212: 579-598(1990), Fournier M.J., ら., Microbiol. Rev. 49: 379-
397(1985)）が後に続く、翻訳終結コドン及び下流のλから転写終結因子によっ
て影響をされた（Scholtissek S. ら., Nucleic Acids Res. 15: 3185(1987)）
。
【０１９７】 発現を促進するために、ＬＩＶ-１の細胞外ドメインを、Ｎ末端poly-histidin
eリーダー配列をコードするＳＴ２３９発現ベクターによって大腸菌細胞質で発
現させた。このリーダーのアミノ酸配列は：MKHQHQHQHQHQHQMHQ（配列番号：１
１）である。このリーダー配列は、幾つかの利点を提供した。第一に、翻訳開始
が最適化された。更には、ニッケルキレートカラムでの吸着によって、精製が簡
略化された。最後に、リーダー配列は、ＴＡＧＺｙｍｅ（商品名）システムを使
用して、所望の通りに、容易に効率良く除かれた。 発現ベクター、ｐＥ１６４６４７の構築、並びにＤＮＡ配列の確認に続いて、
ＬＩＶ-１発現プラスミドを、大腸菌株５８Ｆ３（fhuAΔ（tonAΔ)lonΔ galE r
poHts(htpRts) ΔclpP lacIq ΔompTΔ(nmpc-fepE)ΔslyD）へ形質転換した。形
質転換体を最初にルリア培地で３０℃で終夜生育させ、次にリン酸制限培地で１
００倍に希釈してアルカリホスファターゼプロモーターを誘導した。２４時間後
に３０℃で振盪後、培地を遠心分離し、次に精製を開始するまで細胞ペレットを
凍結した。
【０１９８】 ＬＩＶ-１ ＥＣＤの精製 ＬＩＶ-１を発現する大腸菌形質転換体の０．５Ｌの発酵によって、約６−１
０ｇの細胞ペレットが生じた。このペーストを、７Ｍグアニジン、２０ｍＭトリ
ス、ｐＨ８バッファーの１０容量（ｗ／ｖ）で再懸濁した。固体硫酸ナトリウム
及びテトラチオン酸ナトリウムを、各々の最終濃度が０．１Ｍ及び０．０２Ｍと
なるように添加し、この溶液を４℃で終夜にわたって撹拌した。この亜硫酸分解
の工程によって、すべてのシステイン残基がブロックされた変性タンパク質が生
じた。この溶液をBeckman Ultracentrifuge中で４０，０００ｒｐｍで３０分間
濃縮した。その上清を金属キレートカラムバッファー（６Ｍのグアニジン、２０
ｍＭのトリス、ｐＨ７．４）の３−５容量で希釈し、０．２２ミクロンフィルタ
ーで濾過して透明にした。５０ｍｌの容量に相当するこの透明抽出物を、金属キ
レートカラムバッファーで平衡化した５ｍｌのQiagen Ｎｉ-ＮＴＡ（ニッケル-
ニトリロ三酢酸）金属キレートカラムに負荷した（QIAexpress（登録商標）タン
パク質精製システム、Qiagen, Valencia, CA USA）。このカラムを，５０ｍＭの
イミダゾール（Calbiochem, Utrol grade）を含む添加バッファー、ｐＨ７．４
で洗浄した。所望のタンパク質を含有する分画をプールし、４℃で保存する。タ
ンパク質濃度を、そのアミノ酸配列に基づいて計算した吸光係数を用いて、２８
０ｎｍにおけるその吸収によって見積もった。抗体生産のためのタンパク質は、
ジチオスレイトール（最終濃度５０ｍＭ）でＮｉ-ＮＴＡプールのアリコートを
還元した後に、１ｍＭ ＨＣｌに対する大規模な透析によって得られた。
【０１９９】 ＬＩＶ-１タンパク質に対するモノクローナル抗体の開発 以下の方法によって、ＬＩＶ-１の細胞外ドメインに対して特異的なモノクロ
ーナル抗体を開発した。 １０匹のＢａｌｂｃ／マウス（Charles River Laboratories, Wilmington, DE
）を、ここに開示したｐＥ１６４６４７形質転換大腸菌より単離した組み換えpo
lyhistidine-タッグヒトＬＩＶ-１で過免疫化した。Ｒｉｂｉアジュバンドに含
まれるタッグＬＩＶ-１タンパク質（Ribi Immunochem Research, Inc., Hamilto
n, MO）をマウスへ投与した。以前に記載した修正した類似のプロトコール（Koh
ler. G. 及びMilstein, C., Nature 256: 495-497(1975)；Hongo. J.S.ら., Hyb
ridoma 14: 253-260(1995)）を使用して、高い抗-ＬＩＶ-１抗体力価を示した５
匹のマウスのＢ細胞を、マウスメラノーマ細胞（Ｘ６３．Ａｇ８．６５３；アメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクション，ロックビル，メリーランド）と融合
させた。
【０２００】 ７−１４日後に、上清を収集し、直接酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳ
Ａ）を使用して標準技術によって抗体生産に関してスクリーニングした。限界希
釈による第二ラウンド目のサブクローニングの後に最も高い免疫結合親和性を示
す１６のポジティブクローンを、モノクローナル抗体のインビボ生産のために、
プリスタンで初回刺激したマウス（Freund, Y. R. 及びBlair, P.B., J. Immuno
l. 129: 2826-2830(1982)）へ注射した。これらのマウスの腹水をプールし、以
前に記載（Hongo. J.S. ら., Hybridoma, 上掲(1995)）のようにプロテインＡア
フィニティークロマトグラフィー（Pharmacia fast protein chromatography(FP
LC) Pharmacia, ウップラサ，スウェーデン）によって精製した。精製抗体調製
物を、無菌的に濾過し（０．２-μｍ粒子サイズ；Nalgene, ロチェスター，ニュ
ーヨーク）、そしてリン酸バッファー化生理的食塩水（ＰＢＳ）で４℃で貯蔵し
た。
【０２０１】 大腸菌におけるＬＩＶ-１ ＥＣＤ断片の発現 ＬＩＶ-１-１６４６４７ＥＣＤの断片を、完全長ＬＩＶ-１-１６４６４７のク
ローニングと発現に関して記載したのと同じ技術を使用して、大腸菌で発現させ
た。発現させたＥＣＤ断片は、Ｎ末端断片（配列番号：４のアミノ酸１からアミ
ノ酸１４７を含む）及びＣ末端断片（配列番号：４のアミノ酸１４８からアミノ
酸２９８を含む）であった。この断片は、上記のように精製した。 どちらのＮ末端又はＣ末端ＥＣＤ断片が上記のように単離したモノクローナル
抗体と結合するのかを決定するために、標準的なウエスタンブロット分析を使用
した。モノクローナル抗体２９４５、２９８２、２９８４、２９８５、２９８７
及び２９８８のみを試験した。モノクローナル抗体２９４５、２９８２、２９８
５，２９８７及び２９８８がＣ末端断片と結合する一方で、モノクローナル抗体
２９８４がＮ末端断片と結合することが見出された。この結果は、表３に列挙さ
れている。
【０２０２】 哺乳動物における外来性完全長ＬＩＶ-１の発現 表３に列挙した１６の抗体の各々について、ＬＩＶ-１-１６４６４７のＥＣＤ
との結合に関して調べ、特異的に結合したことが見出された。抗体は、表３に列
挙されている特性を有するものと特徴付けられた。ＡＴＣＣへ寄託されているハ
イブリドーマによって生産された抗体を含み、クロス-ブロッキング（例えば、
競合ＥＬＩＳＡアッセイ）を使用する、本発明の抗-ＬＩＶ-１-１６４６４７抗
体が結合したエピトープのように、被験抗体が同じエピトープとの結合に関して
競合できるか否かを決定することが包含されるエピトープのキャラクタリゼーシ
ョンをおこなうことができる。模範的な競合ＥＬＩＳＡアッセイでは、マイクロ
タイタープレートのウェルをコートするＬＩＶ-１-１６７６４７又はそのＥＣＤ
（又は他の断片）は、候補競合抗体とともに又は候補競合抗体無しでプレインキ
ュベートし、次いで本発明のビオチンで標識した抗-ＬＩＶ-１-１６４６４７抗
体を添加する。ウェル中のＬＩＶ-１抗原と結合した標識抗-ＬＩＶ-１-１６４６
４７抗体の総量を、アビジン-パルオキシダーゼコンジュゲート及び適切な基質
を使用して測定する。この抗体は、放射活性又は蛍光標識又はその他の検出可能
及び測定可能な標識で標識できる。抗原と結合した標識抗-ＬＩＶ-１抗体の総量
は、同じエピトープとの結合に関して競合する候補競合抗体（被験抗体）の能力
と間接的な関連を有する（すなわち、同じエピトープに対する被験抗体の親和性
が高ければ、抗原でコートされたウェルと結合する標識抗体はより少ない）。候
補競合抗体は、実質的には、同じエピトープと結合する、或いは候補抗体が、候
補競合抗体の非存在下で同時におこなわれたコントロールと比較して（しかし、
既知の非競合抗体の存在下でもおこなわれ得る）、少なくとも２０％、好ましく
は２０−５０％、さらにより好ましくは少なくとも５０％のＬＩＶ-抗体の結合
をブロックすることができる場合に、本発明の抗-ＬＩＶ抗体のように、同じエ
ピトープとの結合について競合する抗体だと考えられている。このアッセイの変
形は、同じ定量値を達成するようにおこなうことができる。表３の各抗体に関す
るエピトープ群の割り当ては、競合ＥＬＩＳＡによって決定された。各抗体は、
ビオチン化され、過度の各非標識抗-ＬＩＶ-１-１６４６４７の存在又は非存在
下において、プレートにコートしたＬＩＶ-１-１６４６４７ＥＣＤとの結合につ
いて試験した。次いで、ストレプトアビジン-ＨＲＰを、続いてパルオキシダー
ゼ基質をプレートへ添加した。少なくとも５０％の結合の減少、又はＬＩＶ-１-
１６４６４７ＥＣＤとのビオチン化モノクローナル抗体の結合の欠如は、非標識
及びビオチン化抗体の双方が、ＬＩＶ-１-１６４６４７の同じ（又は近接する）
エピトープと結合することを示した。
【０２０３】 哺乳動物細胞における完全長ＬＩＶ-１の発現は、結果として細胞の表層に細
胞外ドメインを露出することを引き起こす。このことを証明するために、３Ｔ３
細胞を、過度的に野生型完全長ＬＩＶ-１６４６４７１（ｐＲＫ５-ＬＩＶ-１６
４６４７）をコードする発現構成物で形質移入した。コントロール細胞を、ＬＩ
Ｖ-１挿入物を欠くｐＲＫ５ベクターで形質移入した。２４時間後、ここで開示
の抗-ＬＩＶ-１-１６４６４７ＥＣＤモノクローナル抗体をタッグとして使用し
、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）分析によって、細胞表層発現に関して細
胞を分析した。約１０６細胞を、氷上で、２％ヤギ血清及び５％ウサギ血清（Ｆ
ＡＣＳバッファー）を含有するＰＢＳで３０分間にわたってインキュベートし、
次いで、２時間にわたって、抗-ＬＩＶ-１６４６４７ＥＣＤモノクローナル抗体
２９８２（ハイブリドーマ２９８２．４Ａ１２．１Ｅ８．１Ｃ４から単離，ＡＴ
ＣＣ と命名）又は抗-ＬＩＶ-１-１６４６４７ＥＣＤモノクローナル抗体
２９８３（ハイブリドーマ２９８３．３Ｇ９．１Ｄ４．１Ｄ７から単離，ＡＴＣ
Ｃ ）の１μｇ／ｍｌを含有するＦＡＣＳバッファーでインキュベートした
。この細胞は、次いでアイスコールドＰＢＳで洗浄し、２０分間にわたって、４
℃でビオチン-コンジュゲートヤギ抗-ヒトＩｇＧ二次抗体（Jackson Immunoreag
ents；West Grove, PA）でインキュベートし、フィコエリトリンコンジュゲート
ストレプトアビジン（Jackson Immunoreagents；West Grove, PA）で４℃、２０
分に渡るインキュベートの前に洗浄した。細胞は、再び細胞蛍光測定法の前に洗
浄した。抗体２９８３を使用するＦＡＣＳ分析の結果は、Ｆｉｇ６にプロットし
てある。この結果は、ＬＩＶ-１-１６４６４７の細胞表層発現が、ｐＲＫ５-Ｌ
ＩＶ-１-１６４６４７で形質移入した３Ｔ３細胞で検出され、コントロール（ｐ
ＲＫ５ベクターのみ）細胞では検出されなかったことを示した。従って、ＬＩＶ
-１-１６４６４７タンパク質のアミノ酸１−２９８は、細胞外ドメインを構成す
る。
【０２０４】 乳房腫瘍細胞株における内因性ＬＩＶ-１の発現 ここで、内因性ＬＩＶ-１が、ＭＣＦ-７乳房腫瘍細胞株（例えば、ＡＴＣＣ
ＨＴＢ-２２）の表層で発現することが開示されている。抗-ＬＩＶ-１モノクロ
ーナル抗体２９４５（ハイブリドーマ２９４５．２Ｇ１．１Ｃ７．２Ｆ１０から
；ＡＴＣＣ ）を、ラクトパルオキシダーゼ法を使用して１２５Ｉで放射
線標識した。ＭＣＦ-７細胞を、１ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳで収集した。
３．４百万のＭＣＦ-７細胞の集団を、室温で１時間にわたって、過剰の非標識
抗体（０．２５μＭ）の存在（ＮＳＢ）又は非存在（Ｔｏｔ）下において、５０
０００ｃｐｍ（２３０ｐＭ）の１２５Ｉ-２９４５を含むＰＢＳＡ（ＰＢＳ＋０
．１％ＢＳＡ＋０．０２％アジド）でインキュベートした。次いで、氷ＰＢＳ中
の２０％シュークロースによる１ｍｌクッションで、５０００ｒｐｍ、５分間に
渡る遠心分離によって、結合放射活性を非結合放射活性から分離した。次いで、
細胞ペレットに結合している放射活性をガンマーカウンターで計測した。Ｆｉｇ
７に示してあるように、抗-ＬＩＶ-１-１６４６４７モノクローナル抗体２９４
５の特異的結合は、ＭＣＦ-７細胞の表層で検出され、このことは、乳房腫瘍細
胞株の細胞表層で内因性ＬＩＶ-１が発現することを示す。
【０２０５】 ＬＩＶ-１への抗体結合 本発明の選択されたモノクローナル抗体、並びにそれら各々のハイブリドーマ
を表３に列挙する。モノクローナル抗体のキャラクタリゼーションを、ここに開
示のエピトープ分析ための競合分析の標準的な技術、ＦＡＣＳ分析のためのセル
ソーティング、並びに抗体がＬＩＶ-１-１６４６４７ＥＣＤのＮ末端又はＣ末端
部分のどちらと結合するのかを決定するためのウェスタンブロットを使用してお
こなった。
【０２０６】 ａここに開示された抗体競合分析によって作製されたエピトープ群の割り当て。
ｂＮ末端断片が配列番号：４のアミノ酸１−１４７であり、Ｃ末端断片が配列番
号：４のアミノ酸１４８−２９８である場合に、「Ｎ又はＣ末端」という用語は
、ＬＩＶ-１-１６４６４７ＥＣＤのＮ末端又はＣ末端断片への被験抗体の結合を
意味する。 ブダペスト条約に基づく、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションへ
のこれらハイブリドーマの幾つかの寄託は、「寄託材料」という見出しの下に示
してある。
【０２０７】 実施例５： ＲＮＡインサイツハイブリダイゼーションによって調べられた腫瘍
組織におけるＬＩＶ-１発現 この実施例は、種々のヒト組織におけるＬＩＶ-１発現の定量のための組織ア
レイの調製に使用する方法を提供する（例えば、Kononen, J., ら. Nature Medi
cine 4: 844-847(1998)を参照のこと）。 組織マイクロアレイの調製 組織マイクロアレイ、又は組織アレイは、幾つかの個々の組織試料を含有する
パラフィンブロックである。典型的な組織マイクロアッセイは、１０００又はそ
れより多くの試料を含み得る。組織マイクロアレイは、技術者の時間、試薬、及
び価値ある組織リソースの効果的な利用を最大にしつつ、多数のシリーズの検体
の検査を可能にする。
【０２０８】 組織マイクロアレイを、最初に、組織アレイ機器（Beecher Instruments, Sil
ver Spring, MD, USA）を使用して、パラフィンブロックに埋め込まれた「ドナ
ー」組織生検試料から小さなコア（直径０．６ｍｍ，高さ３−４ｍｍ）を除くこ
とによって構築する。同じ機器を使用して、次いで、アレイを形成するために、
各コアを他の生検コアとともに単一の「受容体」へ再度埋め込む。好ましくは、
各組織を、３通りに試料採取する。受容体ブロックの薄いスライス（４−８μｍ
の厚さ）を、ガラススライド上に添え付けた。視覚化及びスクリーニングは、限
定されるものではないが、形態学的な分析のための標準的なヘマトキシリン及び
エオシン染色；タンパク質検出のための免疫組織化学（ＩＨＣ）；ｍＲＮＡ検出
のためのインサイツハイブリダイゼーション（ｍＲＮＡ ＩＳＨ）及びＲＴ-ＰＣ
Ｒ；ＤＮＡ検出のための蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）及
びインサイツＰＣＲ；アポトーシス性ＤＮＡ断片化を起こしている細胞の検出の
ための末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）-媒介ｄＵＴＰ
ニック末端ラベル化（ＴＵＮＥＬ）アッセイを含む組織学的な方法によっておこ
なわれ得る。 以下のｍＲＮＡ ＩＳＨ法は、ＬＩＶ-１のヒト組織発現プロファイルを決定す
るために使用された。
【０２０９】 インサイツハイブリダイゼーション インサイツハイブリダイゼーションは、細胞又は組織調製物内での核酸配列の
検出及び局在化のための強力で多用途の技術である。それは、例えば、遺伝子発
現部位の同定、転写物の組織分布の分析、ウイルス感染の同定及び局在化、特定
ｍＲＮＡ合成及び染色体マッピングにおける追跡に有用である。 インサイツハイブリダイゼーションは、Lu及びGillett, Cell Vision 1: 169-
176 (1994)のプロトコールの最適な変形に従って、ＰＣＲ生成３３Ｐ-標識リボ
プローブを用いて実施された。要約すると、ホルマリン固定、パラフィン包埋ヒ
ト組織を切片化し、脱パラフィンし、プロテイナーゼＫ（２０μｇ／ｍｌ）で１
５分間３７℃で脱タンパクし、さらに上掲のLu及びGillettに記載されたような
インサイツハイブリダイゼーションのために処理をおこなった。［３３Ｐ］ＵＴ
Ｐ-標識アンチセンスリボプローブをＰＣＲ産物から生成し、５５℃で終夜ハイ
ブリダイゼーションする。スライドをKodak NTB2核トラックエマルションに浸漬
して４週間露出した。
【０２１０】 ＤＮＡテンプレートの調製 ＬＩＶ-１特異的リボプローブの分析ために、ＬＩＶ-１の一部分に相当するテ
ンプレートＤＮＡが必要であった。その末端に対して、以下の配列を有するヌク
レオチド１６９０−ヌクレオチド２２４０（配列番号：３；Ｆｉｇ２Ａを参照）
のＤＮＡ１６４６４７（ＬＩＶ-１-１６４６４７）核酸配列の一部分を、テンプ
レートＤＮＡとしての使用のために増幅した：5'-TGCCATTCAC ATTTCCACGA TACAC
TCGGC CAGTCAGACG ATCTCATTCA CCACCATCAT GACTACCATC ATATTCTCCA TCATCACCAC
CACCAAAACC ACCATCCTCA CAGTCACAGC CAGCGCTACT CTCGGGAGGA GCTGAAAGAT GCCGGC
GTCG CCACTTTGGC CTGGATGGTG ATAATGGGTG ATGGCCTGCA CAATTTCAGC GATGGCCTAG C
AATTGGTGC TGCTTTTACT GAAGGCTTAT CAAGTGGTTT AAGTACTTCT GTTGCTGTGT TCTGTCA
TGA GTTGCCTCAT GAATTAGGTG ACTTTGCTGT TCTACTAAAG GCTGACATGA CCGTTAAGCA GG
CTGTCCTT TATAATGCAT TGTCAGCCAT GCTGGCGTAT CTTGGAATGG CAACAGGAATT TTCATTG
GT CATTATGCTG AAAATGTTTC TATGTGGATA TTTGCACTTA CTGCTGGCTT ATTCATGTAT GTT
GCTCTGG TTGATATGGT ACCTGAAATG CTGCACAATG ATGCTAGTGA CCATGGATGT AGCCGCTGG
G G-3'（配列番号：１２）。増幅したＤＮＡは、テンプレートとして利用され、
インサイツハイブリダイゼーションのためにそのテンプレートからリボプローブ
が合成された。
【０２１１】 テンプレートｎｔ１６９０−ｎｔ２２４０からのＬＩＶ-１のアンチセンスｃ
ＤＮＡ鎖を生成するためのプライマー： プライマーＦ-９９１０４： 5'-GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCTGCCATTCACATTTCCACGAT -3' （配列番号：１３） プライマーＦ-９９１０５： 5'-CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGACCCCAGCGCCTACATCC-3' （配列番号：１４）
【０２１２】 Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ（８４１７-１）の アドバンテージｃＤＮＡポリメラーゼ
ミックス（The Advantage cDNA polymerase mix）を、僅かな修正を加えて製造
者指示書に従って使用した。要約すると、３１６μｌ ＳＱ水（高精製、ＲＮａ
ｓｅフリー水）、４０μｌ １０ＸＰＣＲバッファー、１６μｌ １０ｍＭ ｄＮ
Ｔ、８μｌ プライマー配列番号：１３、８μｌ プライマー配列番号：１４を組
み合わせて、マスター混合物を形成した。このマスター混合物から、９７μｌを
ＰＣＲチューブへ等分し、その後で２μｌのテンプレートＤＮＡ及び１μｌのア
ドバンテージｃＤＮＡポリメラーゼ（Advantagre cDNA polymerase）の添加をお
こなった。パーキンエルマーシータス９６００サーモサイクラー（Perkin-Elmer
Cetus 9600 thermocycler)を使用し、サイクル条件を以下の通りとした： 開始： ８５℃ ５分 ６０℃ １．５分 １０サイクルの： ９４℃ ３０秒 ６８℃ ３０秒 ７２℃ １分 １５サイクルの： ９４℃ ３０秒 ５５℃ ３０秒 ７２℃ １分 続いて： ７２℃ ７分 ４℃ 保持 ＰＣＲサイクルの完了後、プライマー及び過剰なバッファーを除くために、Ｐ
ＣＲ産物をMicrocon-50（商品名）フィルターユニット（商品名）を通して濾過
した。
【０２１３】 ３３ Ｐ-リボプローブ合成 ６．０μｌ（125mCi）の３３Ｐ-ＵＴＰ（Amersham BF 1002, SA＜2000 Ci/mmo
l）をスピード真空乾燥させた。乾燥３３Ｐ-ＵＴＰを含む管に以下の成分を添加
した： ２．０μｌの５ｘ転写バッファー １．０μｌのＤＴＴ（100mM） ２．０μｌのＮＴＰ混合物（2.5mM: 10μl; 10mMのGTP, CTP & ATP+10μlのH2 O） １．０μｌのＲＮＡｓｉｎ リボヌクレアーゼインヒビター ３．０μｌのＨ２Ｏ中のＤＮＡテンプレート（1μg） １．０μｌのＲＮＡポメラーゼ（ＰＣＲ産物についてT3＝AS（アンチセンス）
, T7=S（センス）,通常）
【０２１４】 管を３７℃で１時間インキュベートし、１．０μｌのＲＱ１ＤＮａｓｅを添加
し、次いで３７℃で１５分間インキュベートした。９０μｌのＴＥ（10mMトリス
pH7.6／1mMのＥＤＴＡpH8.0）を添加し、１．０μｌアリコートの混合物をＤＥ
８１紙にピペットした。残りの溶液をMicrocon-50限外濾過ユニット（Amicon, 4
2416）に負荷し、Heraeus Centrifuge 28Sのプログラム１０を用いて6分間スピ
ンさせた。濾過ユニットを第２の管に反転させ、プログラム２を用いて3分間ス
ピンさせた。最終回収スピンの後、１００μｌのＴＥを添加した。１μｌの最終
生成物をＤＥ８１紙にピペットした。濾過の前後にＤＥ８１紙にドットされた試
料を、Beckman LS 5000TD シンチレーションカウンターの６ｍｌのBiofluor II
で数えた。 サイズを確かめるために、プローブをＴＢＥ／尿素ゲルの上に流した。１−３
μｌのプローブ又は５μｌのＲＮＡ 分子量マーカーIII（Molecular Weight Mar
ker III）（Boehringer Mannheim）を３μｌの負荷バッファーに添加した。３７
℃の加熱ブロック上で３分間加熱した後、そのプローブを即座に氷上に置いた。
ゲルのウェルをフラッシングし、試料を負荷し、１８０−２５０ボルトで４５分
間走らせた。そのゲルを，サランラップでラップし、補強スクリーンを有するBi
omax MS（商品名）フイルムKodack又はＸＡＲ-２（商品名）フィルムへ−７０℃
のフリーザー内で１時間から終夜にわたって曝露した。
【０２１５】 ３３ Ｐ-ハイブリダイゼーション パラフィン包埋切片の前処理： ガラススライド上に添え付けた受容体組織
アレイブロックの薄いスライスを脱パラフィンし、ＳＱ Ｈ２Ｏ中に配置し、２
ｘＳＳＣで室温において各々５分間２回リンスした。切片を２０μｇ／ｍｌのプ
ロテイナーゼＫ（２５０ｍｌのＲＮａｓｅ無しＲＮａｓｅバッファー中１０ｍｇ
／ｍｌを５００μｌ；３７℃、１５分間）中で除タンパクし、続いてスライドを
、０．５ｘＳＳＣでリンスし、２分間にわたって各グレードの等級エタノール（
７０％、９５％、及び１００％）で脱水して空気乾燥した。 プレハイブリッド化： スライドをＢｏｘバッファー（4ｘＳＳＣ、50%ホル
ムアミド）−飽和濾紙で列を作ったプラスチックボックスに並べた。組織を１０
０μｌのハイブリダイゼーションバッファー（１０％デキストラン硫酸、５０％
ホルムアルデヒド、１ＸＳＳＣ）で被覆し、４２℃で１−４時間インキュベート
した。 ハイブリダイゼーション： スライド当たり２．０ｘ１０６ｃｐｍのプロー
ブ及び２．０μｌのｔＲＮＡ（１００ｍｇ／ｍｌストック）を９５℃で３分間加
熱した。スライドを氷上で冷却し、スライド当たり最終容量が１００μｌとなる
ようにハイブリダイゼーションバッファーを添加した。ボルテックスの後、１０
０μｌの３３Ｐ混合物をスライド上のプレハイブリッド１００μｌに添加した。
スライドを５５℃で終夜インキュベートした。
【０２１６】 洗浄： 洗浄は、２ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡで２ｘ１０分間、室温で実施し（４００ｍｌの
２０ｘＳＳＣ＋１６ｍｌの０．２５Ｍ ＥＤＴＡ、Ｖｆ＝４Ｌ）、次いでＲＮａ
ｓｅＡ処理を３７℃で３０分間行った（前もって暖めた２５０ｍｌＲＮａｓｅバ
ッファー中１０ｍｇ／ｍｌを５００μｌ＝２０μｇ／ｍｌ）。スライドを２ｘＳ
ＳＣ、ＥＤＴＡで２ｘ１０分間、室温において洗浄した。緊縮性洗浄条件は次の
通り：５５℃で２時間、０．１ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡ（２０ｍｌの２０ｘＳＳＣ＋
１６ｍｌのＥＤＴＡ、Ｖｆ＝４Ｌ）。これに、ＲＴでの２ｘ１０分の洗浄が後に
続いた。次いで、０．３Ｍ酢酸アンモニアを含有する各５０％、７０％、９０％
エタノールで２分間にわたって脱水し、２時間にわたって空気乾燥した。この乾
燥スライドを１６時間にわたってBiomax MSフィルム（Kodak）、又は２日間にわ
たってHyperfilm β-Maxフィルム（Amersham)へ曝露した。
【０２１７】 ＥｒｂＢ２及びβ-アクチン３３Ｐリボプローブ合成 ＲＮＡインサイツハイブリダイゼーションによるＬＩＶ-１及びＥｒｂＢ２発
現の比較分析のために、ＥｒｂＢ２核酸配列に対して相補的なリボプローブを調
製した。コントロールとしては、その遺伝子のＲＮＡに対して相補的なリボプロ
ーブを使用して、β-アクチンの発現もモニターした。
【０２１８】 開示された手法を使用して、ＥｒｂＢ２及びβ-アクチンに対して特異的なリ
ボプローブも調製した。このＥｒｂＢ２リボプローブを、以下の配列を有するＤ
ＮＡテンプレートの転写によって合成した、5'-TGGTCGTGGTCTTGGGGGTGGTCTTTGGG
ATCCTCATCAA GCGACGGCAGCAGAAGATCCGGAAGTACACGATGCGGAGACTGCTGCAGG AAACGGAGC
TGGTGGAGCCGCTGACACCTAGCGGAGCGATGCCCAACCAG GCGCAGATGCGGATCCTGAAAGAGACGGAG
CTGAGGAAGGTGAAGGTGCT TGGATCTGGCGCTTTTGGCACAGTCTACAAGGGCATCTGGATCCCTGATG
GGGAGAATGTGAAAATTCCAGTGGCCATCAAAGTGTTGAGGGAAAACACA TCCCCCAAAGCCAACAAAGAA
ATCTTAGACGAAGCATACGTGATGGCTGG TGTGGGCTCCCCATATGTCTCCCGCCTTCTGGGCATCTGCCT
GACATCCA CGGTGCAGCTGGTGACACAGCTTATGCCCTATGGCTGCCTCTTAGACCAT GTCCGGGAAAAC
CGCGGACGCCTGGGCTCCCAGGACCTGCTGAACTGGTG TATGCAGATTGCCAAGGGGATGAGCTACCTGGA
GGATGTGCGGCTCGTAC ACAGGGACTTGGCCGCTCGGAACGTGCTGGTCAAGAGTCCCAACCATGTC AAA
ATTACAGACTTCGGGCTGGCTCGGCTG-3'（配列番号：１５）、及びその補体。また、こ
のテンプレートは、Ｔ７及びＴ３プロモーターを含んでいた。この結果によって
生じたＥｒｂＢ２特異的アンチセンスリボプローブを「４４２ＡＳ」と命名した
。
【０２１９】 β-アクチンリボプローブを、以下の配列を有するＤＮＡテンプレートの転写
よって合成した、5'-GCTGCCTGACGGCCAGGTCATCACCATTGGCAATGAGCGGTTCCGCTGCC CT
GAGGCACTCTTCCAGCCTTCCTTCCTGGGCATGGAGTCCTGTGGCATC CACGAAACTACCTTCAACTCCAT
CATGAAGTGTGACTGTGACATCCGCAA AGACCTGTACGCCAACACAGTGCTGTCTGGCGGCACCACCATGT
ACCCTG GCATTGCCGACAGGATGCAGAAGGAGATCACTGCCCTGGCACCCAGCACA ATGAAGATCAAGAT
CATTGCTCCTCTGAGCGCAAGTACTC-3'（配列番号：１６）、及びその補体。このテン
プレートには、Ｔ３プロモーターが含まれていた。この結果生じたβ-アクチン
特異的アンチセンスリボプロテインを、「１１７ＡＳ」と命名した。
【０２２０】 ＲＮＡインサイツハイブリダイゼーションによる組織におけるＬＩＶ-１
の検出 この実施例は、種々の組織におけるＬＩＶ-１の発現を検査した組織アレイ分
析の結果を提供する。要約すると、ＬＩＶ-１発現は、胎児腎上皮、腸筋神経叢
を含む発達中の胎児脊髄神経節、胎児脳、成人前立腺上皮、乳房腫瘍、乳房線維
腺腫、肺癌、扁平上皮肺、結腸癌、前立腺癌、子宮内膜癌、卵巣癌及びメラノー
マにおいて生じることが見出された。
【０２２１】 表４は、幾つかの組織マクロアレイＲＮＡインサイツハイブリダイゼーション
分析の結果を提供する。表にした結果及びコメントは、内部レファレンスのため
にポジション番号が与えられた組織マイクロアレイにおいて、ＩＳ２０００-０
６０及びＩＳ２０００-０８４と命名された研究で作成した。ＬＩＶ-１の相対発
現を、検出のレベルの増加に関して「＋」、「＋＋」、又は「＋＋＋」で示し、
その一方で、非検出発現を「−」で示した。ＲＮＡインサイツハイブリダイゼー
ションに使用されるＬＩＶ-１リボプローブを、センスプローブとして「７６４
Ｓ」と命名し、アンチセンスプローブとして「７６４ＡＳ」と命名した。また、
ＥｒｂＢ２（プローブ４４２ ＡＳ）及びβ-アクチン（コントロールとしてプロ
ーブ１１７ ＡＳ）転写物に対して特異的なアンチセンスリボプローブを、ＩＳ
２０００-０８４研究で使用した。ここで使用されているように、「ＴＭＡ」と
いう用語は、組織マイクロアレイを指す。「ＮＭＡ」という用語は、正常な組織
マイクロアレイに相当し、「正常」とは非癌牲組織を指す。
【０２２２】 ａリボプローブの調製及び番号命名は、この実施例に開示。ｂ アレイは、Clinomics Biosciences、Inc., Pittsfield、MAより購入。ｃ 表４にリストされた幾つかの切片は、種々の組織型を含んだ。例えば、切片
Misc.02は，正常な（すなわち非-癌牲）腎臓、膀胱、肺、及び末期段階の腎疾患
（非癌牲）を含んだ。腫瘍ブロック３（Ｈ２０００−１６５．２０）は、軟骨肉
腫、骨肉腫、腎細胞癌、脂肪肉腫、胃腺腫、扁平上皮癌、及び脳腫瘍を含んだ。
ヒトＮＭＡ（Ｈ２０００-２）は、膵臓、副腎、心臓、眼、小腸、腎臓，脾臓，
リンパ節、扁桃腺、皮膚、乳房、肺，脳、結腸，肝臓，大動脈，胎盤，胃、卵巣
、前立腺、乳房，及び皮膚の試料を含んだ。Ｈ２０００-２のすべてのリンパ節
標本は、アクチンネガティブであり、このことは、これら試料においてｍＲＮＡ
が分解したことを示唆し、その一方で、心臓の試料のみが弱いアクチンポジティ
ブであった。乳房ＴＭＡ（切片Ｈ２０００-９４Ｂ）は、異常な胆管胃の増殖の
試料（前の切片の嚢胞肉腫）、巨大細胞の活性変化を含む；ＤＣＩＳ（０の４の
リンパ節（ＬＮ）ポジティブ）；腺管癌、浸潤性；腺管癌、不完全に分化、浸潤
性（０の２４のＬＮポジティブ）；異常な過形成／ＣＩＳ；管及び小葉での癌は
、浸潤性リンパ節転移性；腺管癌、浸潤性、グレードIII／III；ＤＣＳＩ、低い
グレード；ＬＣＩＳ（０の２６のＬＮポジティブ）；良性乳房組織；線維腺腫；
腺癌、浸潤性（３１の３１のＬＮポジティブ）；腺疾患。多腫瘍ＴＭＡ（切片Ｈ
２０００-１３２）は、肺腫瘍（細気管支肺胞性癌，腺癌）；結腸腺癌；胃腺癌
；膵管腺癌；肝細胞癌；前立腺癌（Gleason グレード２-３）；膀胱移行上皮癌
；腎臓乳頭移行癌；前立腺移行上皮癌；腎明細胞癌；子宮内膜癌；卵巣乳頭癌；
卵巣明細胞癌；リンパ種；及びメラノーマの試料を含んでいた。 ｄ 正常な乳皮膚の異なる試料の細胞から抽出したｍＲＮＡの定量的マイクロア
レイ分析は、乳房腫瘍に比べて皮膚での低いＬＩＶ-１発現を示した。
【０２２３】 表４のＩＳ２０００-０６０の研究の結果が示すように、ＲＮＡインサイツハ
イブリダイゼーションは、正常な乳房に比べて、幾つかの乳癌での上昇したＬＩ
Ｖ-１の発現を確かなものにする：ＴＭＡの１３の乳癌のうち５つで発現が上昇
していた。また、高発現が良性の乳疾患、特に線維腺腫及び硬化性腺症にみられ
た。強い発現は、前立腺癌だけでなく、正常な前立腺上皮で観察された。発現は
、扁平上皮肺、転移性、子宮内膜、卵巣癌腫及びメラノーマを含む多くの他の腫
瘍型の上皮組織にみられた。正常組織での発現に関して、ＬＩＶ-１は、正常な
扁平上皮（例えば、チンパンジー及びヒト乳皮膚）において高く発現している。
強い発現は、正常な前立腺上皮において、病巣の低レベル発現は、正常な腎細管
において観察された。肝臓、肺、胆嚢、脾臓、心臓、及び膵臓のすべておいて、
ＬＩＶ-１ ＲＮＡ発現はネガティブであった。胎児では、発現は、腸筋神経叢及
び胎児脳を含む発達中の脊髄神経節のみならず、胎児腎臓上皮においてみられた
。
【０２２４】 ＩＳ２０００-０８４研究では、乳房腫瘍におけるβ-アクチン（コントロール
として）、ＥｒｂＢ２、及びＬＩＶ-１のＲＮＡの相対発現を比較した。その結
果は、表４に示されている。すべての試料は、β-アクチンＲＮＡの十分な発現
を示した。ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）ＲＮＡの弱から中程度の発現は、殆どのケー
スの良性及び悪性上皮細胞でみられた。特に、強い発現が四つのケース、浸潤腺
管癌の三つのケース、並びに腺管癌インサイツ（ＤＣＩＳ）の一つのケースにみ
られた。ＬＩＶ-１ ＲＮＡは、良性及び悪性哺乳動物上皮細胞においてみられ、
殆どのケースで強度が弱から強であり、その殆どのケースが中レベル発現を示し
た。この研究に関数する組織試料には、良性細胞と比べて悪性細胞ではＬＩＶ-
１が上方制御されていることを示すものは無かった。
【０２２５】 実施例６： 細胞でのＬＩＶ-１発現の検出 ＬＩＶ-１を過剰発現し、ＥｒｂＢ２を同時に発現しない型としての乳房腫瘍
組織の診断は、医者が患者の腫瘍治療を組み立てることを可能にするのに有用で
ある。 乳房腫瘍（又は任意の腫瘍又は他の細胞）におけるＬＩＶ-１-１６４６４７発
現及びＥｒｂＢ２発現の検出は、実施例１に記載のマイクロアレイ技術を関連し
たマイクロアレイ技術手法の通常の知識と組み合わせることによって容易におこ
なえる。 細胞でのＬＩＶ-１-１６４６４７発現の検出は、検出のためのプローブがＬＩ
Ｖ-１-１６４６４７のＥＣＤから誘導されたものであり、配列番号：３のヌクレ
オチド４１２から４７７を包含する配列、又はその補体と緊縮性の条件の下でハ
イブリダイズする配列を有するｃＤＮＡ又はＲＮＡである場合に、インサイツハ
イブリダイゼーションによっておこない得る。好ましくは、このプローブは、配
列番号：３のヌクレオチド４４６からヌクレオチド４６４を包含する配列、又は
その相補性配列とハイブリダイズする。この方法の検出のためのハイブリダイゼ
ーションプロトコールは、関連する文献では標準的なものである。ＬＩＶ-１-１
６４６４７発現を検出するために有用な非制限ＲＮＡインサイツハイブリダイゼ
ーション技術を、ここに開示する。
【０２２６】 あるいは、ＬＩＶ-１及びＥｒｂＢ２の相対発現は、過剰発現が非癌性組織の
細胞での発現と比べて、腫瘍組織の細胞での発現が少なくとも１．５倍大きい場
合に、ＬＩＶ-１-１６４６４７タンパク質の細胞外ドメインと特異的に結合する
本発明の抗-ＬＩＶ-１-１６４６４７抗体と、ＬＩＶ-１-１６４６４７タンパク
質を発現しないコントロール細胞；ＥｒｂＢ２を過剰発現するがＬＩＶ-１-１６
４６４７を過剰発現しない細胞（例えばＳＫＢＲ３細胞）；ＬＩＶ-１-１６４６
４７を過剰発現するがＥｒｂＢ２を過剰発現しない細胞（例えばＬＩＶ-１又は
ＤＮＡ１６４６４７を発現する細胞）を接触させ、そしてこれら接触での検出可
能な結合量を比較することによっておこなわれる。抗-ＬＩＶ-１抗体及び／又は
抗-ＥｒｂＢ２抗体結合に関する技術は、細胞表層タンパク質の分野に関する通
常技術とここで提供された開示の内容を組み合わせたものを基礎にして容易に決
定できる。好ましくは、ＬＩＶ-１-１６４６４７ポリペプチドの発現の検出に使
用される抗体は、ＬＩＶ-１-１６４６４７のＥＣＤと結合し、好ましくはＬＩＶ
-１ＥＣＤのエピトープＡ、エピトープＢ、又はエピトープＣと結合し、好まし
くはＬＩＶ-１-１６４６４７ＥＣＤと結合する。あるいは、ＬＩＶ-１ポリペプ
チドの発現を検出するために使用する抗体は、配列番号：４のアミノ酸１１４か
ら１３５を包含するアミノ酸配列、より好ましくは、配列番号：４のアミノ酸１
２６から１３２を含有する配列を含んでなるポリぺプチドと結合する。この方法
を実行するために有用な抗体は、ここで開示され、それらは限定することなく、
一つ以上のハイブリドーマＡＴＣＣ （ＬＩＶ-１．２９４５．２Ｇ１．
１Ｃ７．２Ｆ１０）；ＡＴＣＣ （ＬＩＶ-１．２９８２．４Ａ１２．１
Ｅ８．１Ｃ４）；ＡＴＣＣ （ＬＩＶ-１．２９８３．３Ｇ９．１Ｄ４．
１Ｄ７）；ＡＴＣＣ （ＬＩＶ-１．２９８４．６Ｄ６．１Ｈ１０．２Ｃ
１）；ＡＴＣＣ （ＬＩＶ-１．２９８５．４Ｆ３．２Ｄ６．１Ｄ７）；
ＡＴＣＣ （ＬＩＶ-１．２９８７．１Ｄ８．１Ｃ１１．２Ｂ７）；及び
ＡＴＣＣ （ＬＩＶ-１．２９８８．１Ａ７．１Ｆ２．１Ｈ７）によって
生産されるモノクローナル抗体が含まれる。抗体結合研究をおこなうための有用
な技術は、ここで開示され、関連する文献に見いだされる。
【０２２７】 実施例７： 製薬組成物 ここで開示したスクリーニングアッセイによって同定され得る本発明のＬＩＶ
-１ポリペプチド、又はＬＩＶ-１ポリペプチドの断片、例えばＥＣＤと特異的に
結合する抗体は、癌を含む腫瘍の治療のために、製薬組成物の形態で投与するこ
とができる。 抗体断片が用いられる場合には、標的タンパク質の結合ドメインと特異的に結
合する最小阻害断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的
タンパク質配列と結合する能力を保持したペプチド分子が設計できる。このよう
なペプチドは、化学的に合成でき及び／又は組換えＤＮＡ技術によって生成でき
る（例えば、Marasco等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 [1993]）
。ＬＩＶ-１タンパク質と結合する抗体が細胞内部分と結合し、すべての抗体又
は断片が阻害剤として利用される場合、抗体を内在化することが好ましい。リポ
フェクチン又はリポソームが、細胞へ抗体又は抗体断片を送達するために使用で
きる。
【０２２８】 本発明に基づく抗体の治療用製剤は、親油性製剤或いは水性溶液の形態で、所
望される程度の純度を持つ活性成分を任意の製薬的に許容される担体、賦形剤又
は安定化剤と混合することによって調製されて保存される（Remington's Pharma
ceutical Science 16th edition, Osol, A. Ed. [1980]）。許容される担体、賦
形剤、又は安定化剤は、用いられる服用量及び濃度では受容者にとって非毒性で
あり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸及
びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモ
ニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンズアルコニウムクロライ
ド；ベンズエトニウムクロライド；フェノール；ブチル又はベンジルアルコール
；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノ
ール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾールなど）；低分
子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グ
ロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン
、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン等のアミノ
酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他
の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロー
ス又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例
えば、Ｚｎ-タンパク質錯体）；及び／又はトゥイーン(TWEEN)（商品名）、プル
ロニクス(PLURONICS)（商品名）、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の
非イオン性界面活性剤を含む。
【０２２９】 ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に１以上の活性化合物、
好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。例え
ば、一つの製剤において、血管内皮細胞（ＶＥＧＦ）と結合する抗体をさらに提
供することは所望され得る。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、細胞障害
性薬、サイトカイン又は成長阻害剤を含んでもよい。これらの分子は、適切には
、意図する目的に有効な量での組み合わせで存在する。 また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術、或いは界面重合によって
調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼ
ラチン-マイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル中
、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマ
ルション、ナノ粒子及びナノカプセル）中、又はマイクロエマルション中に包括
されていてもよい。これらの技術は、Remington's Pharmaceutical Science 16t
h edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。 インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過
膜を通した濾過により容易に達成される。
【０２３０】 徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例には、抗体を含有する固
体疎水性ポリマーの半透性マトリクスが含まれ、このマトリクスは成形された物
品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。除放性マトリクスの
例には、ポリエステルヒドロゲル（例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタク
リレート)又はポリ(ビニルアルコール））、ポリアクチド（米国特許第3,773,91
9号）、Ｌ-グルタミン酸及びγ-エチル-Ｌ-グルタメート、非分解性エチレン-酢
酸ビニル、LUPRON DEPOT(商品名)（乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸リュー
プロリドの注射可能な小球）などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、ポリ-
(Ｄ)-３-ヒドロキシブチル酸が含まれる。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコ
ール酸などのポリマーは分子を１００日にわたって放出することができるが、あ
る種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプセル化され
た抗体が身体内に長時間残ると、それらは３７℃の水分に露出されることにより
変性又は凝集し、その結果、生物学的活性の低下、並びに起こり得る免疫原性の
変化をもたらす。関与している機構に依存する安定化に関して、合理的な方法を
工夫することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を通した分
子間Ｓ-Ｓ結合形成であると見出された場合には、安定化はスルフヒドリル残基
の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の付加、並
びに特異的ポリマーマトリクス組成物の開発によって達成され得る。
【０２３１】 実施例８： 製造品 本発明の他の実施態様では、上記の疾患の診断又は治療に有用な物質を含む製
造品が提供される。この製造品は容器とラベルとを具備する。好適な容器は、例
えば、ビン、バイアル、シリンジ、及び試験管を含む。容器は、ガラス又はプラ
スチックなどの材料から形成されてよい。容器は、状態を検出（例えば、診断す
ること）又は治療するのに有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し
得る（例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バ
ッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の活性剤は、通常、ここで同定され
た遺伝子産物の活性を妨害することができる抗-腫瘍剤、例えば抗体である。容
器上又は添付されるラベルは、組成物が選択した状態の診断又は治療のために使
用されることを示す。製造品はさらに、リン酸緩衝塩水、リンガー液及びデキス
トロース溶液などの製薬的に許容されるバッファーを含む第２の容器を具備して
もよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使
用上の指示を付けたパッケージ挿入物を含む商業的及び使用者の見地から望まし
い他の材料を含んでもよい。
【０２３２】 実施例９： 腫瘍の診断及び予後 或る種の腫瘍で過剰発現される成長レセプター等の細胞表面タンパク質は候補
薬剤又は腫瘍（例えば、癌）治療の格好の標的であるが、同じタンパク質は腫瘍
細胞で増幅された遺伝子にコードされる分泌タンパク質とともに腫瘍の診断及び
予後診断に用途が見出される。例えば、腫瘍細胞で増幅された遺伝子のタンパク
質産物に対する抗体は腫瘍診断又は予後診断要素として使用できる。 例えば、抗体断片を含む抗体は、増幅された遺伝子にコードされるタンパク質
（「マーカー遺伝子産物」）の発現の定性的又は定量的検出に用いることができ
る。抗体は、好ましくは検出可能な、例えば蛍光標識を備え、結合は光学顕微鏡
、フローサイトメトリー、フルオロメトリー、又はこの分野で知られた他の技術
によって観察できる。これらの技術は、増幅された遺伝子が細胞表面タンパク質
、例えば成長因子をコードする場合に特に好ましい。このような結合アッセイは
、上記５節に実質的に記載されたように実施される。 マーカー遺伝子産物に結合する抗体のインサイツ検出は、例えば、免疫蛍光又
は免疫電子顕微鏡によって実施できる。この目的のために、組織学的試料を患者
から取り出し、好ましくは生物学的試料に抗体を重層させることにより、標識抗
体をそれに適用する。この手法はまた、試験される組織におけるマーカー遺伝子
産物の分布も決定できるようにする。当業者には、インサイツ検出のために広範
な組織学的方法が容易に利用できることは明らかであろう。
【０２３３】 実施例１０． 組織又は体液におけるＬＩＶ-１の測定 ここに記載されるのは、哺乳動物、好ましくは潜在的にＬＩＶ-１を過剰発現
する細胞の増殖を被っているヒト患者の体液におけるＬＩＶ-１遺伝子産物（例
えば、ＬＩＶ-１-１６４６４７タンパク質又はその断片）の存在を測定するため
の血清学的方法である。この方法は、好ましくは、そのような患者の血清におけ
るＬＩＶ-１細胞外ドメイン又はその断片の存在を検出し、場合によってはその
量を定量化し、それにより、患者におけるＬＩＶ-１の過剰発現の検出のための
比較的非侵襲的な方法を提供する。 基本的に、本発明のこの実施態様のプロセスは、潜在的にＬＩＶ-１-１６４６
４７細胞外ドメイン又はその断片を含有する体液の試料を、抗-ＬＩＶ-１-１６
４６４７モノクローナル抗体とインキュベート又は他で曝露し、反応生成物の存
在を検出することを含む。当業者は、これらの基本的な手法に多くの変法がある
ことを認めるであろう。これらは、例えば、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、沈降、凝集、
補体固定、及び免疫蛍光法を含む。現在好ましい手法において、モノクローナル
抗体は、検出のために適当に標識される。本発明で有用な標識は、これらに限ら
れないが、酵素などの検出されるために反応又は誘導体化されるべき部分を含む
。酵素標識は、現在用いられている比色分析、分光光度、蛍光分光光度、又はガ
ス定量法の任意のものによって検出できる。酵素は、カルボジイミド、過ヨウ素
酸、ジイソシアネート、グルタルアルデヒドなどの架橋分子で抗体に結合させる
。これらの手法に使用できる多くの酵素が知られており利用可能である。例とし
ては、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-グルクロニダーゼ、β-
Ｄ-グルコシダーゼ、β-Ｄ-ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシ
ダーゼプラスペルオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼプラスペルオキシダ
ーゼ及び酸ホスファターゼである。使用しうる蛍光物質は、例えば、フルオレセ
イン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、オーラミン、ダンシル、ウン
ベリフェロン(umbelliferone)、ルシフェリア(luciferia)、２,３-ジヒドロフタ
ラジンジオン、ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リゾチーム
、及びグルコース-６-ホスフェートデヒドロゲナーゼを含む。抗体は、これらの
標識で周知の方法により修飾してよい。例えば、アルデヒド、カルボジイミド、
ジマレイミド、イミデート、スクシンイミド、ビド-ジアゾ化ベンザジン(bid-di
azotized benzadine)などのカップリング試薬は、上記の蛍光、化学発光、及び
酵素標識で抗体を修飾するのに使用できる。種々の標識化技術が、Morrison, Me
thods in Enzymology 32b: 103 [1974]; Syvanen等, J. Biol. Chem. 284: 3762
[1973]; 及び Bolton及びHunter, Biochem J. 133: 529 [1973]に記載されてい
る。さらに、放射性標識後退は、現在利用可能な任意のカウント法により検出で
きる。好ましい同位体標識は、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、３Ｈ、 ３２ Ｐ、及び３５Ｓである。 さらに、以下の非限定的なアッセイは、哺乳動物の体液における特定の（好ま
しくはＬＩＶ-１-１６４６４７遺伝子産物の細胞外ドメイン又は細胞外ドメイン
の一部に特異的な）抗-ＬＩＶ-１抗体の存在及びその量の決定に有用である。体
液は、限定されないが、血清、羊水、乳、臍帯血清、眼水及び硝子体液、及び眼
硝子体ゲルを含む。
【０２３４】 ヒト化抗-ＬＩＶ-１モノクローナル抗体を用いたプレート結合活性アッセイ ここに記載される抗-ＬＩＶ-１抗体を検定する方法は、この様な方法の例とし
て表され、限定する意味ではない。好ましくはＬＩＶ-１-１６７６４７遺伝子産
物の細胞外ドメインに特異的な抗-ＬＩＶ-１抗体の標準化製剤、コントロール及
び血清サンプルを、検定用希釈液（ＰＢＳ／０．５% ＢＳＡ／０．０５% ポリソ
ルベート２０／０．０１% チメロサール）で希釈した。標準曲線として使用でき
る濃度の範囲を測るために、標準化抗-ＬＩＶ-１抗体の希釈物を調製した。サン
プルは標準曲線内に入るように希釈した。 コーティングバッファーのコート抗原（０．０５Ｍの炭酸ナトリウムバッファ
ー中の抗-ＬＩＶ-１-１６４６４７抗体）のアリコートを、マイクロタイタープ
レートの各々のウェルに添加して２−８℃で１２−７２時間インキュベートした
。コーティング溶液を取り除き、各々のウェルを水で６回洗浄し、次いで余分な
水を取り除くためにブロットした。検定希釈液のアリコートを各々のウェルに加
え、撹拌しながら室温で１−２時間インキュベートした。ウェルを前記段階のよ
うにして洗浄した。希釈した標準物、コントロール及びサンプル溶液のアリコー
トをウェルに加え、コーティング抗原に抗体を結合させるために撹拌しながら１
時間室温でインキュベートした。ウェルは、前の段階のようにして水で再び洗浄
した。 ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（ＨＲＰ-コンジュゲート、ワサビペ
ルオキシダーゼとコンジュゲートしたヤギ抗-ヒトＩｇＧＦｃ；Organon Teknika
カタログ#55253又は等価物）を最高及び最低基準の間の適切な光密度範囲を有
するように検定希釈液で希釈した。ＨＲＰコンジュゲート溶液のアリコートを各
々のウェルに加え、撹拌しながら１時間室温でインキュベートした。ウェルを前
記の段階のようにして水で洗浄した。 基質溶液（ＰＢＳ中１２．５mlの４ｍＭ Ｈ２Ｏ２中ｏ-フェニレンジアミン（
ＯＰＤ）の５mgタブレット（シグマP6912又は等価物））のアリコートを各ウェ
ルに加え、着色するために十分な時間（約８−１０分）室温暗所でインキュベー
トした。反応を４．５Ｎ硫酸のアリコートで停止させた。光学密度は、検出吸光
度の４９０−４９２ｎｍ及び参照吸光度の４０５ｎｍで読取られた。標準曲線の
データがプロットされ、コントロール及びサンプルの結果は標準曲線から決定さ
れる。
【０２３５】 実施例１１． 治療方法 本発明に従って、抗-ＬＩＶ-１抗体又は他のＬＩＶ-１活性阻止分子が、健常
者で見られるＥｒｂＢ２発現を越えるＥｒｂＢ２の同時発現の有又は無において
ＬＩＶ-１遺伝子産物の過剰発現及び／又は活性化によって特徴づけられる種々
の状態を治療するのに使用されると考えられる。これらの抗体又はこれらに限ら
れないが小有機又は無機分子、ペプチド、アンチセンス分子などを含む他の化合
物によって治療される状態又は疾患の例は、良性又は悪性腫瘍（例えば、乳房、
前立腺、肺、及び大腸、並びに、肝臓、腎臓、膀胱、胃、卵巣、結腸直腸、膵臓
、子宮頚部、甲状腺、肝細胞の癌；肉腫；膠芽細胞腫；及び種々の頭部及び頸部
の腫瘍）；白血病及びリンパ悪性疾患；ニューロン、グリア、星状、視床下部及
び他の腺、マクロファージ、上皮、間質及び胞胚腔の疾患；及び炎症、脈管形成
及び免疫学的疾患を含む。ＬＩＶ-１過剰発現−関連疾患の治療に抗体が用いら
れる場合、抗体は、好ましくは抗-ＬＩＶ-１-１６４６４７抗体、より好ましく
は配列番号：４のアミノ酸１１４からアミノ酸１３５までを含むアミノ酸配列を
含むポリペプチドに結合するヒト化抗体である。 本発明の抗腫瘍剤、例えば抗体は、哺乳動物、好ましくはヒトに、周知の方法
、例えば、ボーラスとして又は所定時間に渡る連続注入による静脈内投与、筋肉
内、腹膜内、脳脊髄内、皮下、関節間、滑膜内、鞘内、経口、局所、又は吸入経
路などにより投与される。抗体の静脈内投与が好ましい。
【０２３６】 他の治療的養生法を本発明の抗癌剤、例えば抗体の投与に組み合わせてもよい
。例えば、このような抗癌剤で治療される患者は放射線治療を受けてもよい。あ
るいは、又はそれに加えて、患者に化学治療薬を投与してもよい。このような化
学治療薬の調製法及び用量スケジュールは、製造者の指示に従って使用されるか
、熟練した実務者により経験的に決定される。そのような化学治療に対する調製
法及び用量スケジュールはまたChemotherapy Service M.C. Perry編, Williams
and Wilkins, Baltimore, MD (1992)にも記載されている。化学治療薬は、抗腫
瘍剤、例えば抗体の投与に先立って又は続いて投与してもよく、あるいはそれら
と同時に投与してもよい。抗体は、タモキシフェンなどの抗-エストロゲン化合
物又はオナプリストンなどの抗-プロゲステロン（EP616812参照）の、これらの
分子について知られた用量と組み合わせてもよい。 また、他の腫瘍関連抗原に対する抗体、例えばＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、Ｅｒｂ
Ｂ３、ＥｒｂＢ４、又は血管内皮因子（ＶＥＧＦ）に結合する抗体を投与するこ
とも好ましい。あるいは、又はそれに加えて、同じものに結合する、或いは２又
はそれ以上の異なる抗原と結合する２又はそれ以上の抗体を患者に同時投与して
もよい。ときどきは、患者に１又はそれ以上のサイトカインを投与することも有
利である。好ましい実施態様では、ここの抗体は、成長阻害剤と同時投与される
。例えば、まず成長阻害剤を投与し、続いて本発明の抗体を投与する。しかしな
がら、同時投与、又は本発明の抗体を最初に投与することも考えられる。成長阻
害剤についての適切な用量は現在用いられている量であるが、成長阻害剤とこの
抗体との組み合わせ（相乗）効果により減少させ得る。
【０２３７】 化学治療薬の組合せ投与が望ましい場合、組合せ投与はいずれかの順序での同
時投与を含むが、好ましくは時間差をとり、両方（又は全て）の活性剤がそれら
の生物学的活性を同時に発揮する。このような化学治療薬の調製法及び用量スケ
ジュールは、製造者の指示に従って使用されるか、熟練した実務者により経験的
に決定される。そのような化学治療に対する調製法及び用量スケジュールはまた
Chemotherapy Service M.C. Perry編, Williams and Wilkins, Baltimore, MD (
1992)にも記載されている。化学治療薬は、抗腫瘍剤、例えば抗体の投与に先立
って又は続いて投与してもよく、あるいはそれらと同時に投与してもよい。抗体
は、タモキシフェンなどの抗-エストロゲン化合物又はオナプリストンなどの抗-
プロゲステロン（EP616812参照）の、これらの分子について知られた用量と組み
合わせてもよい。 また、他の腫瘍関連抗原に対する抗体、例えば血管内皮因子（ＶＥＧＦ）に結
合する抗体を投与することも好ましい。あるいは、又はそれに加えて、２又はそ
れ以上の抗-ＬＩＶ-１抗体を患者に同時投与してもよい。ときどきは、患者に１
又はそれ以上のサイトカインを投与することも有利である。抗-ＬＩＶ-１抗体は
、成長阻害剤と同時投与される。例えば、まず成長阻害剤を投与し、続いて抗-
ＬＩＶ-１抗体を投与する。しかしながら、同時投与、又は抗-ＬＩＶ-１抗体を
最初に投与することも考えられる。成長阻害剤についての適切な用量は現在用い
られている量であるが、成長阻害剤と抗-ＬＩＶ-１抗体との組み合わせ（相乗）
効果により減少させ得る。
【０２３８】 上記の治療的養生法に加えて、患者に癌細胞の外科的切除及び／又は放射線治
療を施してもよい。 例えば、疾患の型及び重篤さに応じて、約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（
例えば、０．１−２０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、例えば、１又はそれ以上の別々の
投与あるいは連続注入により患者に投与するための最初の候補用量である。典型
的な１日の用量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ
以上であろう。数日以上に渡る繰り返し投与のためには、状態に応じて、疾患の
徴候に所望の抑制が現れるまで治療が続けられる。しかしながら、他の用量計画
が有用であることもある。この治療の進行は、従来の技術及びアッセイによって
容易に監視される。
【０２３９】 実施例１２． 抗体結合実験 遺伝子増幅実験の結果は、腫瘍（癌）細胞に対するＬＩＶ-１ポリペプチドの
効果の存在を検出する又は阻害する抗-ＬＩＶ-１-１６４６４７抗体の能力が試
験される抗体結合実験によって更に確認できる。例示的な抗体は、ポリクローナ
ル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性、及びへテロ抱合体抗体を含み、それ
らの調製は以下に記載する。 抗体結合実験は、競合的結合アッセイ、直接及び間接サンドウィッチアッセイ
、及び免疫沈降アッセイなどの既知のアッセイ法で実施してよい。Zola, Monocl
onal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc., 19
87)。 競合的結合アッセイは、標識標準物の、限られた量の抗体との結合について被
験試料分析物と競合する能力による。被験試料中の（腫瘍細胞で増幅された遺伝
子にコードされる）標的タンパク質の量は、抗体に結合し始める標準物の量に逆
比例する。結合し始める標準物の量の測定を促進するために、抗体は好ましくは
競合の前又は後に固定化し、抗体に結合した標準物及び分析物が未結合で残って
いる標準物及び分析物から容易に分離できるようにする。
【０２４０】 サンドウィッチアッセイは２つの抗体の使用を含み、各々が検出すべきタンパ
ク質の異なる免疫原部分、又はエピトープに結合できる。サンドウィッチアッセ
イにおいて被験試料分析物は固体支持体上に固定化された第１の抗体に結合し、
その後第２の抗体が分析物に結合し、よって不溶性の３成分複合体が形成される
。例えば米国特許第4,376,110号参照。第２の抗体はそれ自体が検出可能部分で
標識され（直接サンドウィッチアッセイ）、あるいは検出可能部分で標識された
抗-免疫グロブリン抗体を用いて測定してもよい（間接サンドウィッチアッセイ
）。例えば、サンドウィッチアッセイの一形態はＥＬＩＳＡアッセイであり、こ
の場合の検出可能部分は酵素である。 免疫組織化学のために、腫瘍試料は新鮮でも凍結したものでもよく、パラフィ
ンに包埋して、例えばホルマリン等の保存剤で固定してもよい。
【０２４１】 実施例１３． 細胞ベースの腫瘍アッセイ 細胞ベースアッセイ及び腫瘍（例えば、癌）の動物モデルを用いて、遺伝子増
幅アッセイの知見を確認し、ここで同定される遺伝子と腫瘍形成細胞成長の進行
及び病理との関係をさらに理解することができる。ここで同定された遺伝子産物
の腫瘍又は癌の進行及び病理における役割は、ここで遺伝子を増幅すると同定さ
れた原発腫瘍細胞又は細胞系を用いて試験することができる。このような細胞は
、例えば、上記した乳房及び前立腺癌細胞及び細胞系を含む。 異なる方法では、特定の腫瘍に関連することが知られた細胞型の細胞をここの
ｃＤＮＡで形質移入し、これらのｃＤＮＡの過剰成長誘発能力を分析する。適当
な細胞は、例えば、Ｂ１０４-1-１細胞株（ｎｅｕプロトオンコジーンで形質移
入された安定なＮＩＨ-３Ｔ３細胞系）及びｒａｓ-形質移入ＮＩＨ-３Ｔ３細胞
等の安定な腫瘍細胞系を含み、これらは所望の遺伝子で形質移入し、そして腫瘍
形成的成長を観察できる。このような形質移入細胞系は、次いで、形質転換細胞
の成長に対する細胞分裂停止又は細胞障害性活性の発揮により、又は抗体依存性
細胞性細胞障害性（ＡＤＣＣ）の媒介により、ポリ−又はモノクローナル抗体又
は抗体組成物の腫瘍形成細胞成長を阻害する能力を試験するのに使用できる。こ
こに同定した遺伝子のコード化配列で形質移入した細胞は、さらに、癌治療用の
候補薬の同定に使用できる。 さらに、（下記のような）トランスジェニック動物の腫瘍に由来する初代培養
は、ここでの細胞ベースアッセイに使用できるが、安定な細胞系が好ましい。ト
ランスジェニック動物から連続細胞系を誘導する技術はこの分野で良く知られて
いる（例えば、Small等, Mol. Cell. Biol. 5: 642-648 [1985]参照）。
【０２４２】 実施例１４． 動物モデル 種々の良く知られた動物モデルが、腫瘍の進行及び病原に関しここで同定され
た遺伝子の役割を更に理解するために利用でき、さらに抗体、及び小分子アゴニ
ストを含む天然ポリペプチドの他のアゴニストを含む候補治療薬の有効性を試験
するために使用することができる。これらのモデルのインビボ性質により、特に
ヒト患者における反応を予測できる。腫瘍及び癌（例えば、乳癌、大腸癌、前立
腺癌、肺癌など）の動物モデルは、非組換え及び組換え（トランスジェニック）
動物の両方を含む。非組換え動物モデルは、例えば、齧歯類、例えばマウスモデ
ルを含む。このようなモデルは、標準的な技術、例えば、皮下注射、尾部静脈注
射、脾臓移植、腹膜内移植、腎被膜下移植、又はオルトピン(orthopin)移植、例
えば大腸組織に移植された大腸癌細胞により、腫瘍細胞を同系マウスに導入する
ことにより作成される。（例えば、1997年9月18日に発行されたＰＣＴ公報WO 97
/33551参照。） 癌遺伝子の研究におそらく最もしばしば用いられる動物種は、免疫不全マウス
、特にヌードマウスである。低下／形成不全を持つヌードマウスがヒト腫瘍異種
移植の宿主としての役割を演じるという観察は、この目的のための広い用途を導
いた。常染色体劣性ｎｕ遺伝子が、例えば、ＡＳＷ、Ａ／Ｈｅ、ＡＫＲ、ＢＡＬ
Ｂ／ｃ、Ｂ１０.ＬＰ、Ｃ１７、Ｃ３Ｈ、Ｃ５７ＢＬ、Ｃ５７、ＣＢＡ、ＤＢＡ
、ＤＤＤ、Ｉ／ｓｔ、ＮＣ、ＮＦＲ、ＮＦＳ、ＮＦＳ／Ｎ、ＮＺＢ、ＮＺＣ、Ｎ
ＺＷ、Ｐ、ＲＩＩＩ及びＳＪＬを含むヌードマウスの極めて多数の異なる共通遺
伝子系統に導入された。さらに、ヌードマウス以外の遺伝的な免疫不全を持つ広
範な他の動物が生育され、腫瘍異種移植のレシピエントとして用いられた。さら
なる詳細については、例えば、The Nude Mouse in Oncology Research, E. Bove
n 及び B. Winograd 編, CRC Press, Inc., 1991を参照。
【０２４３】 これらの動物に導入される細胞は、周知の腫瘍／癌細胞系、例えば上記列挙し
た腫瘍細胞系、及び、例えばＢ１０４-１-１細胞系（ｎｅｕプロトオンコジーン
で形質移入された安定ＮＩＨ-３Ｔ３細胞系）；ｒａｓ-形質移入ＮＩＨ-３Ｔ３
細胞：Ｃａｃｏ-２（ATCC HTB-37）、中程度に良く分化したグレードＩＩヒト大
腸腺癌細胞系、ＨＴ-２９（ATCC HTB-38）から、あるいは腫瘍及び癌から誘導す
ることができる。腫瘍又は癌細胞の試料は、手術を受けている患者から、液体窒
素中での凍結及び保存を含む標準的な条件を用いて得ることができる（Karmali
等, Br. J. Cancer 48, 689-696 [1983]）。腫瘍細胞は、ヌードマウスなどの動
物に、種々の手法によって導入できる。マウスの皮下（ｓ．ｃ．）空間は、腫瘍
移植に非常に好ましい。腫瘍は、固体ブロックとして、トロチャー(trochar)を
用いてニードル生検として、細胞懸濁物としてｓ．ｃ．移植できる。固体ブロッ
ク又はトロチャー移植のために、適切な大きさの腫瘍組織断片がｓ．ｃ．空間に
導入される。細胞懸濁物は、原発腫瘍又は安定な腫瘍細胞系から新たに調製され
、皮下注射される。また腫瘍細胞は、皮下移植として注射することもできる。こ
の位置において、移植細胞が皮膚結合組織の下層とｓ．ｃ．組織との間に着床さ
れる。Boven及びWinograd (1991), 上掲。 乳癌の動物モデルは、例えば、ラット神経芽腫細胞（それからｎｅｕ癌遺伝子
が最初に単離される）、又はｎｅｕ形質転換ＮＩＨ-３Ｔ３細胞をヌードマウス
に移植することにより、基本的にはDrebin等, PNAS USA 83, 9129-9133 (1986)
に記載されているように生成される。
【０２４４】 同様に、大腸癌の動物モデルは、大腸癌細胞を動物、例えばヌードマウスに継
代し、これらの動物における腫瘍の発現を導くことにより生成される。ヌードマ
ウスにおけるヒト大腸癌の同所性移植モデルは、例えば、Wang等, Cancer Resea
rch 54, 4726-4728 (1994)及びToo等, Cancer Research 55, 681-684 (1995)に
記載されている。このモデルは、いわゆるAntiCancer, Inc. (San Diego, Calif
ornia)から市販の「METAMOUSE（商品名）」に基づく。 動物に生じた腫瘍は、取り出してインビトロで培養することができる。インビ
トロ培地からの細胞は、次いで動物に継代することができる。これらの腫瘍は、
さらなる試験及び薬物スクリーニングの標的として提供され得る。あるいは、継
代から得られる腫瘍は単離でき、継代前細胞及び１又はそれ以上の継代後に単離
した細胞のＲＮＡを、対象とする遺伝子の識別可能な発現について分析する。こ
のような継代技術は、周知の腫瘍又は癌細胞系で実施することができる。 例えば、Ｍｅｔｈ Ａ、ＣＭＳ４、ＣＭＳ５、ＣＭＳ２１、及びＷＥＨＩ-１６
４がＢＡＬＢ／ｃ雌マウスの線維肉腫に化学的に導入され（DeLeo等, J. Exp. M
ed. 146, 720 [1977]）、それは、種々の薬剤の抗-腫瘍活性の研究のための高度
に制御可能なモデル系を提供する（Palladino等, J. Immunol. 138, 4023-4032
[1987]）。簡便には、腫瘍細胞は細胞培地中でインビトロで成長させる。動物に
注射する前に、細胞系は洗浄してバッファー中に約１０ｘ１０６から１０ｘ１０ ７ 細胞／ｍｌの細胞密度で懸濁する。次いで動物を１０から１００μｌの細胞懸
濁物で皮下感染し、腫瘍が現れるまで１から３週間放置する。
【０２４５】 さらに、最も完全に研究された実験的腫瘍の一つであるマウスのルイス肺（３
ＬＬ）癌腫は、研究用腫瘍モデルとして用いることができる。この腫瘍モデルに
おける有効性は、肺の小細胞癌腫（ＳＣＣＬ）と診断されたヒト患者の治療にお
ける有利な効果と相関していた。この腫瘍は、影響を受けたマウスからの腫瘍断
片又は培養により維持された細胞を注射することで正常マウスに導入でき（Zupi
等, Br. J. Cancer 41: suppl. 4: 309 [1980]）、証拠は、腫瘍が一つの細胞の
注射からでも開始され、極めて高い割合で感染した腫瘍細胞が生存することを示
している。この腫瘍モデルに関する更なる情報については、Zacharski, Haemost
asis 16, 300-320 [1986]を参照のこと。 移植された腫瘍の動物モデルにおける被験化合物の有効性を評価する一つの方
法は、治療前後での腫瘍の大きさを測定することである。伝統的に、移植した腫
瘍の大きさは、二又は三次元のスライドキャリパーで測定される。二次元に制限
された測定は、腫瘍の大きさを正確に反映せず、従って、通常は数式を用いて対
応する容積に換算される。しかしながら、腫瘍の大きさの測定は極めて不正確で
ある。候補薬の治療効果は、治療-誘発性の成長遅延及び特異的な成長遅延とし
てより良く記述できる。腫瘍成長の記述における他の重要な変数は、腫瘍容積倍
加時間である。Rygaard及びSpang-Thomsen, Proc. 6th Int. Workshop on Immun
e-Deficient Animals, Wu及びSheng編, Basel, 1989, 301によって報告されたプ
ログラムなどの、腫瘍成長の計算及び記述のためのコンピュータプログラムも利
用可能である。しかし、処置後の壊死及び炎症反応が実際には少なくとも初期に
腫瘍の大きさを増大させ得ることを注記しておく。従って、これらの変化は、形
態学的方法及びフローサイトメトリー分析を組み合わせて、注意深く観察する必
要がある。
【０２４６】 組換え（トランスジェニック）動物モデルは、ここに同定された遺伝子のコー
ド部分を、トランスジェニック動物作成のための標準的技術を用いて、対象とす
る動物のゲノムに導入することにより加工できる。トランスジェニック操作の標
的として提供できる動物は、限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモ
ット、ブタ、ヒツジ、ヤギ、及び非-ヒト霊長類、例えばヒヒ、チンパンジー及
びサルを含む。これらの動物に導入遺伝子を導入するのにこの分野で知られた技
術は、全核マイクロインジェクション（Hoppe及びWanger, 米国特許第4,873,191
号）；胚系列へのレトロウイルス媒介遺伝子転移（例えば、Van der Putten等,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148-615 [1985]）；胚性肝細胞での遺伝子標
的化（Thompson等, Cell 56, 313-321 [1989]）；胚のエレクトロポレーション
（Lo, Mol. Cel. Biol. 3, 1803-1814 [1983]）；精子媒介遺伝子転移（Lavitra
no等, Cell 57, 717-73 [1989]）を含む。概説のためには、例えば、米国特許第
4,736,866号を参照のこと。 本発明の目的のために、トランスジェニック動物は、その一部にのみ導入遺伝
子を有するもの（「モザイク動物」）を含む。導入遺伝子は、単一の導入遺伝子
として、又はコンカテマー、例えば頭部対頭部又は頭部対尾部の直列型として組
み込まれる。特定の細胞型への導入遺伝子の選択的導入も、例えば、Lasko等, P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6232-636 (1992)の技術に従って可能である。 トランスジェニック動物における導入遺伝子の発現は、標準的技術によって監
視できる。例えば、導入遺伝子の組み込みの確認にサザンブロット分析又はＰＣ
Ｒ増幅が用いられる。次いで、ｍＲＮＡ発現のレベルは、インサイツハイブリッ
ダイゼーション、ノーザンブロット分析、ＰＣＲ、又は免疫組織化学などの技術
を用いて分析できる。動物は、腫瘍又は癌発生の徴候についてさらに試験される
。
【０２４７】 あるいは、動物の胚性細胞に導入された同ポリペプチドをコードする変更ゲノ
ムＤＮＡと、そのポリペプチドをコードする内在性遺伝子との間の相同的組換え
によって、ここに同定するＬＩＶ-１-１６４６４７ポリペプチドをコードする欠
陥又は変更遺伝子を有する「ノックアウト」動物を作成することができる。例え
ば、特にＬＩＶ-１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従
って当該ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡのクローニングに使用できる。
特にＬＩＶ-１ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡの一部を欠失したり、組
み込みを確認するために使用する選択可能なマーカーをコードする遺伝子等の他
の遺伝子で置換することができる。典型的には、ベクターは変異の無いフランキ
ングＤＮＡ(５'と３'末端の両方)を数キロベース含む［例えば、相同的組換えベ
クターについてはThomas and Capecchi, Cell, 51: 503 (1987)を参照のこと］
。ベクターは胚性幹細胞系に(例えばエレクトロポレーションによって)導入し、
導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞を選択する［例え
ば、Li等, Cell,69:915 (1992)参照］。選択された細胞は次に動物(例えばマウ
ス又はラット)の胚盤胞内に注入され、キメラ集合体を形成する［例えば、Bradl
ey, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.
J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152参照］。その後、キメラ
性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、「ノックアウト」動物を作ると言われ
る。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は標準的な技術により同
定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動
物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、ＬＩＶ-１ポリペプチドが
存在しないことによるある種の病理的状態及び病理的状態の進行に対して防御す
る能力によって特徴付けられる。
【０２４８】 ここに同定されるポリペプチドに特異的に結合する抗体、及び他の候補薬の有
効性も、自然発生の動物腫瘍の治療において調べることができる。このような研
究のための適切な標的は、ネコ口腔扁平上皮癌（ＳＣＣ）である。ネコ口腔ＳＣ
Ｃは高度に浸潤性の悪性腫瘍で、ネコに最も普通に見られる口腔悪性腫瘍であり
、この種に報告される口腔腫瘍の６０％以上を占める。それは、離れた部位には
殆ど転移しないが、この転移の低い発生率は単にこの腫瘍を持つネコの短い生存
期間を反映しているにすぎない。これらの腫瘍は通常手術できないが、主にネコ
の口腔の解剖学的形状による。現在では、この腫瘍の有効な治療法は存在しない
。研究に入る前に、各々のネコに完全な臨床検査、生体組織検査を施し、コンピ
ュータ断層撮影（ＣＴ）によりスキャンした。舌下口腔扁平上皮細胞腫瘍を持つ
と診断されたネコは研究から排除した。舌はこの腫瘍のために麻痺し始め、治療
によりこの腫瘍が消滅した後でも、動物は自分で餌を取ることができないであろ
う。各々のネコを長期にわたって繰り返し治療する。治療期間中、毎日及び引き
続き行われる再チェックの時点で腫瘍の写真を撮影した。治療の後、各ネコに再
度ＣＴスキャンを施した。ＣＴスキャン及び胸部レントゲンは、その後８週間ご
とに評価した。データは、対照群と比較した生存数、反応性及び毒性における相
違について評価した。ポジティブ反応は、腫瘍の縮小、好ましくは生存の質の向
上又は生存期間の延長を必要とする。 さらに、他の自発的動物腫瘍、例えばイヌ、ネコ、及びヒヒの線維肉腫、腺癌
、リンパ腫、クロンドローマ(chrondroma)、平滑筋肉腫も試験できる。これらの
イヌ及びネコでの乳腺癌は、その発現及び挙動がヒトのものに極めて類似してい
るので、好ましいモデルである。しかし、このモデルの使用は動物におけるこの
型の腫瘍の発生率によって制限される。
【０２４９】 実施例１５： 候補薬についてのスクリーニングアッセイ 候補薬のスクリーニングアッセイは、ここで同定される遺伝子にコードされる
ポリペプチドと結合又は複合体を形成する化合物、あるいはコードされるポリペ
プチドと他の細胞性タンパク質との相互作用を阻害する化合物を同定するために
計画される。このようなスクリーニングアッセイは、化学的ライブラリの高スル
ープットスクリーニングに利用可能なアッセイ、特に小分子候補薬の同定に適し
たものにするアッセイを含む。小分子とは、合成有機又は無機化合物を含むと考
え、それらは、ペプチド、好ましくは可溶性ペプチド、（ポリ）ペプチド-免疫
グロブリン融合体、特に、限定されないが、ポリ-及びモノクローナル抗体及び
抗体断片、一本鎖抗体、抗-イディオタイプ抗体、及びそれらの抗体又は断片の
キメラ又はヒト化形、並びにヒト抗体及び抗体断片を含む抗体を含んでいる。ア
ッセイは、種々の形式で実施でき、この分野で良く特徴付けられたタンパク質-
タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ及
び細胞ベースのアッセイを含む。 全てのアッセイは、それらが候補薬をここで同定される核酸にコードされるポ
リペプチドと、それら２成分が相互作用するのに十分な時間接触させることで共
通している。
【０２５０】 結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離され
るか、又は反応混合物中で検出される。特別な実施態様では、ここに同定された
遺伝子にコードされるポリペプチドのレセプター即ち候補薬が、共有又は非共有
結合により固相、例えばマイクロタイタープレートに固定化される。非共有結合
は、一般的に固体表面をポリペプチドの溶液で被覆し乾燥させることにより達成
される。あるいは、固定化すべきペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノク
ローナル抗体を、そのペプチドを固体表面に固着させるために用いることができ
る。アッセイは、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面に、検出可能な標
識で標識されていてもよい非固定化成分を添加することにより実施される。反応
が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複
合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面
に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化
成分が標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特
異的に結合する標識抗体によって検出できる。
【０２５１】 候補化合物がここで同定される遺伝子にコードされる特定のＬＩＶ-１ポリペ
プチドと相互作用するが結合しない場合、その相互作用は、タンパク質−タンパ
ク質相互作用を検出するために良く知られた方法によってアッセイすることがで
きる。そのようなアッセイは、架橋、共免疫沈降、及び密度勾配遠心又はクロマ
トグラフィカラムを通す共精製などの伝統的な手法を含む。さらに、タンパク質
−タンパク質相互作用は、Fields及び共同研究者等［Fields及びSong, Nature 3
40, 245-246 (1989); Chien等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9578-9582 (1
991)］に記載された酵母菌ベースの遺伝子系を用いることにより、Chevray及びN
athans［Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5789-5793 (1991)］に開示されてい
るように観察することができる。酵母菌ＧＡＬ４などの多くの転写活性化因子は
、２つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はＤＮＡ結合ドメイ
ンとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。以前の文献に記載
された酵母菌発現系（一般に「２-ハイブリッド系」と呼ばれる）は、この特性
の長所を利用して、２つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパ
ク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合し、他方では、候補となる活性化タ
ンパク質が活性化ドメインに融合している。ＧＡＬ１-ｌａｃＺリポーター遺伝
子のＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質-タンパク質
相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構築に依存する。相互作用するポリペプチド
を含むコロニーは、β-ガラクトシダーゼに対する色素生産性物質で検出される
。２-ハイブリッド技術を用いた２つの特定なタンパク質間のタンパク質-タンパ
ク質相互作用を同定するための完全なキット（MATCHMAKER(商品名)）は、Clonte
chから商業的に入手可能である。この系は、特定のタンパク質相互作用に含まれ
るタンパク質ドメインのマッピング、並びにこの相互作用にとって重要なアミノ
酸残基の特定にも拡張することができる。
【０２５２】 ここで同定されるＬＩＶ-１-コード化遺伝子と他の細胞内又は細胞外成分との
相互作用を阻害する化合物は、次のように試験することができる：通常は、増幅
された遺伝子の生成物及び細胞内又は外成分を含む反応混合物を、条件下で２つ
の生成物が相互作用及び結合する時間にわたって調製する。被験化合物が結合を
阻害する能力を試験するために、反応は被験化合物有り又は無しで実施する。さ
らに、第３の反応混合物に偽薬を添加してポジティブ対照としてもよい。混合物
中に存在する被験化合物と細胞内又は外成分との結合（複合体形成）は上記のよ
うに観察する。対照反応において複合体が形成され、被験化合物を含む反応混合
物ではしないことは、被験化合物が被験化合物とその反応パートナーとの相互作
用を妨害することを示す。
【０２５３】 実施例１６： 腫瘍治療のための他の組成物及び方法 ここで同定した遺伝子の増幅を伴う腫瘍の治療に有用な組成物は、限定されな
いが、抗体、小有機及び無機分子、ペプチド、ホスホペプチド、アンチセンス及
びリボザイム分子、三重螺旋分子などを含み、標的遺伝子産物の発現又は活性を
阻害するものである。 例えば、アンチセンスＲＮＡ及びＲＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡにハイブリッド
形成してタンパク質翻訳を防止することによりｍＲＮＡの翻訳を直接阻止する。
アンチセンスＤＮＡが用いられる場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレ
オチド配列の−１０から＋１０位置の間から誘導されるオリゴデオキシリボヌク
レオチドが好ましい。
【０２５４】 リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒できる酵素的ＲＮＡ分子である。リ
ボザイムは、相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリッド形成、次いでヌクレ
オチド鎖切断的切断により作用する。潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切
断部位は、既知の技術で同定できる。更なる詳細は、例えば、Rossi, Current B
iology 4: 469-471 (1994)及びＰＣＴ公報、番号ＷＯ ９７／３３５５１（１９
９７年９月１８日発行）を参照。 転写阻害に用いられる三重螺旋形成における核酸分子は一本鎖でデオキシヌク
レオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フーグスチン塩
基対則を介する三重螺旋形成を促進するように設計され、それは一般に二重鎖の
一方の鎖上のプリン又はピリミジンのサイズ変更可能な伸展を必要とする。さら
なる詳細は、例えば、ＰＣＴ公報、番号ＷＯ ９７／３３５５１、上掲を参照。 これらの分子は上記のスクリーニングアッセイの任意のもの又は任意の組み合
わせにより、又は当業者に知られた他のスクリーニング技術により同定できる。
【０２５５】 材料の寄託 次の細胞系をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション, １０８０１
ユニバーシティ ブルバード マナッサス、バージニア、２０１１０−２２０９
米国(ＡＴＣＣ)に寄託した： 材料 ATCC寄託番号 寄託日 プラスミド： DNA164647 1803-1 PTA-1534 2000年3月21日 ハイブリドーマ： LIV-1.2945.2G1.1C7.2F10 PTA-2961 2001年1月23日 LIV-1.2982.4A12.1E8.1C4 PTA-2962 2001年1月23日 LIV-1.2983.3G9 1D4.1D7 PTA-2963 2001年1月23日 LIV-1.2984.6D6.1H102C1 PTA-2964 2001年1月23日 LIV-1.2985 4F3.2D6 1D7 PTA-2960 2001年1月23日 LIV-1.2987 1D8.1C11.2B7 PTA-2959 2001年1月23日 LIV-1.2988 1A7.1F2.1H7 PTA-2965 2001年1月23日
【０２５６】 これらの寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペス
ト条約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の
日付から３０年間、寄託の生存可能な培養が維持されることを保証するものであ
る。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とＡＴＣＣとの
間の合意に従い、ＡＴＣＣから入手することができ、これは、どれが最初であろ
うとも、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に
、寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特
許法第１２２条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号８８６ＯＧ６３８
の３７ＣＦＲ第１．１４条を含む)に従って権利を有すると米国特許庁長官が決
定した者に子孫を入手可能とすることを保証するものである。
【０２５７】 本出願の譲受人は、寄託した培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に
死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものと即座
に取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる
政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスである
とみなされるものではない。
【０２５８】 上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十
分であると考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として
意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため
、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの
物質の寄託は、ここに含まれる文書による説明が、そのベストモードを含む、本
発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものでは
ないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈される
ものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に改変す
ることは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の
範囲内に入るものである。
【図面の簡単な説明】
【Ｆｉｇ１】 Ｆｉｇ１Ａ-１Ｃは、ＬＩＶ-１タンパク質の核酸配列（配列番
号：１（コード化配列）、Ｆｉｇ１Ａ-１から１Ａ-２）、並びにアミノ酸配列（
配列番号：２、Ｆｉｇ１Ｂ）。破線で上線が引かれている部分は、シグナル配列
（約アミノ酸１から２０）であると予想される。ＬＩＶ-１タンパク質の予想さ
れる細胞外ドメインは、破線によって下線が引かれたＬＩＶ-１アミノ酸配列の
一部分（およそアミノ酸２４から３１２）である。予想される膜貫通ドメインは
、約アミノ酸３１８から約アミノ酸３６７まで伸張している。ドメインのおおよ
その位置は、標準的なハイドロパシー分析プログラムを使用して予想された。Ｌ
ＩＶ-１の一部分をコードし、マイクロアレイ分析で有用な核酸配列（配列番号
：５）は、Ｆｉｇ１Ｃに示されている。
【Ｆｉｇ２】 Ｆｉｇ２Ａ-２Ｂは、それぞれＤＮＡ１６４６４７に相当する
核酸配列とアミノ酸配列である。Ｆｉｇ２Ａ１-２Ａ５は、天然配列ＬＩＶ-１タ
ンパク質をコードするｃＤＮＡである、ＤＮＡ１６４６４７のヌクレオチド配列
である。配列番号：３は、ＤＮＡ１６４６４７のコード鎖である。Ｆｉｇ２Ｂは
、ＤＮＡ１６４６４７によってコードされている天然ＬＩＶ-１ポリペプチドの
誘導アミノ酸配列（配列番号：４）である。
【Ｆｉｇ３】 Ｆｉｇ３-１から３-１１は、配列番号：１及び配列番号：３の
核酸配列のアライメントである。
【Ｆｉｇ４】 Ｆｉｇ４-１から４-３は、配列番号：２及び配列番号：４のア
ミノ酸配列である。配列は、配列番号：４の約アミノ酸７４０を超える、ＥＣＤ
（配列番号：４のアミノ酸１３０付近）及びＣ末端領域において異なる。一つの
アミノ酸の違いが、配列番号：４のアミノ酸６５１に見出された。
【Ｆｉｇ５】 ここに開示されたような、制限酵素消化選択段階までのＦＬＩ
Ｐクローニング方法を例示するフローチャート。ベクター配列の側方にある陰付
き囲いは、標的遺伝子配列を示す。
【Ｆｉｇ６】 抗-ＬＩＶ-１６４６４７モノクローナル抗体が、最初にＤＮＡ
１６４６４７で形質移入された３Ｔ３細胞の表面と結合する、蛍光活性化セルソ
ーター（ＦＡＣＳ）分析のグラフ表示。「ｐＲＫ５」という用語は、ＬＩＶ-１-
１６４６４７挿入物を欠くベクターで形質移入された細胞に相当する。「ｐＲＫ
５-ＬＩＶ-１-１６４６４７」という用語は、完全長ＬＩＶ-１-１６４６４７を
発現するベクターで形質移入した細胞に相当する。
【Ｆｉｇ７】 完全長ＬＩＶ-１-１６４６４７タンパク質をコードするＤＮＡ
で形質移入した細胞の表層に、ＬＩＶ-１-１６４６４７細胞外ドメインが発現し
ていることを示す棒グラフ。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｐ 1/00 ４Ｃ０８４ Ａ６１Ｐ 1/00 1/04 ４Ｃ０８５ 1/04 11/00 ４Ｈ０４５ 11/00 13/08 13/08 13/12 13/12 15/00 15/00 35/00 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/82 Ｃ０７Ｋ 14/82 16/32 16/32 16/46 16/46 19/00 19/00 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 1/68 Ａ 15/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ 1/68 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/574 Ｚ 33/50 33/577 Ｂ 33/53 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/574 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/577 Ｂ // Ｃ１２Ｐ 21/08 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 スミス，ヴィクトリア アメリカ合衆国 カリフォルニア 94010， バーリンゲーム，ドゥワイト ロード 19 (72)発明者 ホンゴ， ジョーアン，エス． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94061， レッド ウッド シティ， ショウ コ ート (72)発明者 デ ソーバージュ， フレデリック アメリカ合衆国 カリフォルニア 94404， フォスター シティ， シューティング スター アイル 187 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA12 DA13 DA14 DA36 FB03 4B024 AA01 AA12 BA36 BA45 CA04 DA02 DA06 DA12 GA05 HA14 4B063 QA19 QQ03 QQ58 QR55 QS33 QS35 QX07 4B064 AG27 DA05 DA14 4B065 AA26 AA72 AA90 AB01 BA01 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA07 AA13 AA14 AA19 BA01 BA02 BA08 BA22 BA23 CA18 CA53 CA56 CA59 MA02 NA13 NA14 ZA592 ZA662 ZA812 ZB262 4C085 AA13 AA14 AA16 AA21 CC02 CC04 CC05 CC21 CC23 EE01 EE03 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 BA41 CA41 DA76 DA86 EA28 EA51

Claims (100)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号：３のヌクレオチド４１２からヌクレオチド４７７
    を包含する配列、又はその相補性配列に対して、少なくとも６５％の相同性を有
    する配列を含んで成る単離された核酸。
  2. 【請求項２】 相同性が少なくとも７５％である、請求項１の単離された核
    酸。
  3. 【請求項３】 相同性が少なくとも８５％である、請求項１の単離された核
    酸。
  4. 【請求項４】 相同性が少なくとも９０％である、請求項１の単離された核
    酸。
  5. 【請求項５】 相同性が少なくとも９６％である、請求項１の単離された核
    酸。
  6. 【請求項６】 配列番号：３のヌクレオチド４１２からヌクレオチド４７７
    を包含する配列、又はその相補性配列を含んでなる請求項１の単離された核酸。
  7. 【請求項７】 配列番号：３を含んでなる、請求項１の単離された核酸。
  8. 【請求項８】 配列番号：３のヌクレオチド４４６からヌクレオチド４６３
    を包含する配列、又はその相補性配列を含んでなる請求項１の単離された核酸。
  9. 【請求項９】 核酸が抗原性ポリペプチドをコードする、請求項１の単離さ
    れた核酸。
  10. 【請求項１０】 配列が細胞外ドメインである、請求項１の単離された核酸
    。
  11. 【請求項１１】 配列番号：１９に対して、少なくとも６５％の相同性を有
    する配列を含んでなる単離されたポリペプチド。
  12. 【請求項１２】 相同性が少なくとも７５％である、請求項１１の単離され
    たポリペプチド。
  13. 【請求項１３】 相同性が少なくとも８５％である、請求項１１の単離され
    たポリペプチド。
  14. 【請求項１４】 相同性が少なくとも９０％である、請求項１１の単離され
    たポリペプチド。
  15. 【請求項１５】 相同性が少なくとも９６％である、請求項１１の単離され
    たポリペプチド。
  16. 【請求項１６】 配列番号：１９を含んでなる請求項１１の単離された核酸
    。
  17. 【請求項１７】 配列番号：１７に対して、少なくとも５０％の相同性を有
    する配列を含んでなる請求項１１の単離されたポリペプチド。
  18. 【請求項１８】 配列番号：１７を含んでなる、請求項１１の単離されたポ
    リペプチド。
  19. 【請求項１９】 配列番号：１８に対して、少なくとも２０％の相同性を有
    する配列を含んでなる単離されたポリペプチド。
  20. 【請求項２０】 配列番号：４を含んでなる請求項１１の単離されたポリペ
    プチド。
  21. 【請求項２１】 ポリペプチドが抗原性である、請求項１１の単離されたポ
    リペプチド。
  22. 【請求項２２】 配列が細胞外ドメインの一部分を含む、請求項１１の単離
    されたポリペプチド。
  23. 【請求項２３】 ポリペプチドが水溶性である、請求項１１の単離されたポ
    リペプチド。
  24. 【請求項２４】 配列番号：４のアミノ酸１からアミノ酸３２７を包含する
    配列に対して、少なくとも９８％の相同性を有する単離されたポリペプチド。
  25. 【請求項２５】 ポリペプチドがモノクローナル抗体と結合し、その抗体が
    、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション 寄託番号 ＡＴＣＣ （ＬＩＶ-１．２９４５．２Ｇ１．１Ｃ７．２Ｆ１０）によって生産された抗
    体が結合するのと同じエピトープに結合する、単離されたポリペプチド。
  26. 【請求項２６】 ポリペプチドがモノクローナル抗体と結合し、その抗体が
    、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション 寄託番号 ＡＴＣＣ （ＬＩＶ-１．２９８２．４Ａ１２．１Ｅ８．１Ｃ４）によって生産された抗
    体が結合するのと同じエピトープに結合する、単離されたポリペプチド。
  27. 【請求項２７】 ポリペプチドがモノクローナル抗体と結合し、その抗体が
    、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション 寄託番号 ＡＴＣＣ （ＬＩＶ-１．２９８３．３Ｇ９．１Ｄ４．１Ｄ７）によって生産された抗体
    が結合するのと同じエピトープに結合する、単離されたポリペプチド。
  28. 【請求項２８】 ポリペプチドがモノクローナル抗体と結合し、その抗体が
    、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション 寄託番号 ＡＴＣＣ （ＬＩＶ-１．２９８４．６Ｄ６．１Ｈ１０．２Ｃ１）によって生産された抗
    体が結合するのと同じエピトープに結合する、単離されたポリペプチド。
  29. 【請求項２９】 ポリペプチドがモノクローナル抗体と結合し、その抗体が
    、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション 寄託番号 ＡＴＣＣ （ＬＩＶ-１．２９８５．４Ｆ３．２Ｄ６．１Ｄ７）によって生産された抗体
    が結合するのと同じエピトープに結合する、単離されたポリペプチド。
  30. 【請求項３０】 ポリペプチドがモノクローナル抗体と結合し、その抗体が
    、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション 寄託番号 ＡＴＣＣ （ＬＩＶ-１．２９８７．１Ｄ８．１Ｃ１１．２Ｂ７）によって生産された抗
    体が結合するのと同じエピトープに結合する、単離されたポリペプチド。
  31. 【請求項３１】 ポリペプチドがモノクローナル抗体と結合し、その抗体が
    、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション 寄託番号 ＡＴＣＣ （ＬＩＶ-１．２９８８．１Ａ７．１Ｆ２．１Ｈ７）によって生産された抗体
    が結合するのと同じエピトープに結合する、単離されたポリペプチド。
  32. 【請求項３２】 配列番号：４のアミノ酸１からアミノ酸３２７を包含する
    配列に対して、少なくとも８０％の相同的な配列を含むポリペプチドと結合する
    モノクローナル抗体。
  33. 【請求項３３】 相同性が少なくとも９８％である、請求項３２のモノクロ
    ーナル抗体。
  34. 【請求項３４】 配列番号：１９に対して、少なくとも６５％相同的である
    配列を含むポリペプチドと結合するモノクローナル抗体。
  35. 【請求項３５】 相同性が少なくとも７５％である、請求項３２のモノクロ
    ーナル抗体。
  36. 【請求項３６】 相同性が少なくとも８５％である、請求項３２のモノクロ
    ーナル抗体。
  37. 【請求項３７】 相同性が少なくとも９０％である、請求項３２のモノクロ
    ーナル抗体。
  38. 【請求項３８】 相同性が少なくとも９６％である、請求項３２のモノクロ
    ーナル抗体。
  39. 【請求項３９】 ポリペプチドが配列番号：１９を含む、請求項３２のモノ
    クローナル抗体。
  40. 【請求項４０】 ポリペプチドが配列番号：１７を含む、請求項３２のモノ
    クローナル抗体。
  41. 【請求項４１】 抗体がＬＩＶ-１-１６４６４７である、請求項３２のモノ
    クローナル抗体。
  42. 【請求項４２】 抗体が腫瘍細胞の増殖を阻害する、請求項３２のモノクロ
    ーナル抗体。
  43. 【請求項４３】 腫瘍細胞が、ＬＩＶ-１-１６４６４７タンパク質を発現す
    る、乳房、肺、前立腺、結腸、卵巣、子宮、腎臓、胃、及び唾液腺癌、或いはそ
    の他の細胞型から成る群から選択される、請求項４２のモノクローナル抗体。
  44. 【請求項４４】 抗体が、ＬＩＶ-１を過剰発現する腫瘍細胞のインビトロ
    での増殖を阻害する、請求項４２のモノクローナル抗体。
  45. 【請求項４５】 抗体がマウスモノクローナル抗体である、請求項３２のモ
    ノクローナル抗体。
  46. 【請求項４６】 抗体がマウス-ヒトハイブリッド抗体である、請求項３２
    のモノクローナル抗体。
  47. 【請求項４７】 抗体が、ＬＩＶ-１タンパク質のリガンドのリガンド結合
    部位との結合に関して競合する、請求項３２のモノクローナル抗体。
  48. 【請求項４８】 抗体がＬＩＶ-１の発現を減じる、請求項３２のモノクロ
    ーナル抗体。
  49. 【請求項４９】 抗体が補体を活性化する、請求項３２のモノクローナル抗
    体。
  50. 【請求項５０】 抗体が抗体依存性細胞性細胞障害を媒介する、請求項３２
    のモノクローナル抗体。
  51. 【請求項５１】 エピトープが、配列番号：１９に対して少なくとも６５％
    の相同性を有するアミノ酸配列を含むエピトープと結合するモノクローナル抗体
    。
  52. 【請求項５２】 エピトープが、配列番号：１７に対して少なくとも８０％
    の相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４９のモノクローナル抗体。
  53. 【請求項５３】 エピトープが配列番号：１７を含む、請求項５２のモノク
    ローナル抗体。
  54. 【請求項５４】 ハイブリドーマ細胞株が、アメリカン・タイプ・カルチャー
    ・コレクション寄託番号 ＡＴＣＣ （ＬＩＶ-１．２９４５．２Ｇ１．
    １Ｃ７．２Ｆ１０）；ＡＴＣＣ （ＬＩＶ-１．２９８２．４Ａ１２．
    １Ｅ８．１Ｃ４）；ＡＴＣＣ （ＬＩＶ-１．２９８３．３Ｇ９．１Ｄ
    ４．１Ｄ７）；ＡＴＣＣ （ＬＩＶ-１．２９８４．６Ｄ６．１Ｈ１０
    ．２Ｃ１）；ＡＴＣＣ （ＬＩＶ-１．２９８５．４Ｆ３．２Ｄ６．１
    Ｄ７）；ＡＴＣＣ （ＬＩＶ-１．２９８７．１Ｄ８．１Ｃ１１．２Ｂ
    ７）；ＡＴＣＣ （ＬＩＶ-１．２９８８．１Ａ７．１Ｆ２．１Ｈ７）
    へ寄託したハイブリドーマ細胞株から成る群から選択され、ハイブリドーマ細胞
    株によって生産されるモノクローナル抗体がエピトープと結合するように、同じ
    エピトープと結合するモノクローナル抗体。
  55. 【請求項５５】 細胞障害性成分と請求項３２のモノクローナル抗体のコン
    ジュゲートである免疫毒素。
  56. 【請求項５６】 請求項３２のモノクローナル抗体を生産するハイブリドー
    マ。
  57. 【請求項５７】 ＡＴＣＣ （ＬＩＶ-１．２９４５．２Ｇ１．１
    Ｃ７．２Ｆ１０）；ＡＴＣＣ （ＬＩＶ-１．２９８２．４Ａ１２．１
    Ｅ８．１Ｃ４）；ＡＴＣＣ （ＬＩＶ-１．２９８３．３Ｇ９．１Ｄ４
    ．１Ｄ７）；ＡＴＣＣ （ＬＩＶ-１．２９８４．６Ｄ６．１Ｈ１０．
    ２Ｃ１）；ＡＴＣＣ （ＬＩＶ-１．２９８５．４Ｆ３．２Ｄ６．１Ｄ
    ７）；ＡＴＣＣ （ＬＩＶ-１．２９８７．１Ｄ８．１Ｃ１１．２Ｂ７
    ）；ＡＴＣＣ （ＬＩＶ-１．２９８８．１Ａ７．１Ｆ２．１Ｈ７）か
    ら成る群から選択されたハイブリドーマ。
  58. 【請求項５８】 （ａ）哺乳動物からの試料を、配列番号：４のアミノ酸１
    からアミノ酸３２７を包含する配列に対して、少なくとも８０％の相同性を有す
    る配列を含んでなるポリペプチドと特異的に結合する抗体へ曝露すること；並び
    に （ｂ）試料中のポリペプチドへの結合の程度を測定することを含んでなる方法で
    ある、腫瘍を検出するためのアッセイ。
  59. 【請求項５９】 試料中のポリペプチドが哺乳動物からの細胞上にある、請
    求項５８のアッセイ。
  60. 【請求項６０】 試料は哺乳動物の体液であり、ポリペプチドは可溶性ポリ
    ペプチドである、請求項５８のアッセイ。
  61. 【請求項６１】 抗体がモノクローナル抗体である、請求項５８のアッセイ
    。
  62. 【請求項６２】 インビトロでおこなわれ、そしてアッセイがＥＬＩＳＡア
    ッセイである、請求項５８のアッセイ。
  63. 【請求項６３】 細胞が哺乳動物の体の中にとどまる複数個の細胞であり、
    抗体が放射活性アイソトープで標識され、そして哺乳動物へ投与され、抗体の細
    胞との結合の程度が放射活性に関する外部スキャンニングによって観察される、
    請求項５９の抗体。
  64. 【請求項６４】 更に二次放射活性アイソトープで標識され、そして哺乳動
    物へ投与された抗-ＥｒｂＢ２抗体を含み、標識抗-ＥｒｂＢ２抗体と細胞とによ
    る抗体の細胞との結合の程度が、放射活性に関する外部スキャンニングによって
    観察される、請求項５８のアッセイ。
  65. 【請求項６５】 配列番号：４のアミノ酸１からアミノ酸３２７を包含する
    配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列と結合することが
    でき、ＬＩＶ-１-１６４６４７発現細胞の増殖を阻害する抗体の治療的有効量を
    哺乳動物へ投与することを含んでなる方法である、腫瘍細胞の成長を阻害する方
    法。
  66. 【請求項６６】 抗体が補体を活性する、請求項６５の方法。
  67. 【請求項６７】 抗体が抗体依存性細胞性細胞障害を媒介する、請求項６５
    の方法。
  68. 【請求項６８】 抗体がモノクローナル抗体である、請求項６５の方法。
  69. 【請求項６９】 腫瘍細胞が、ＬＩＶ-１-１６４６４７タンパク質を発現す
    る、乳房、肺、前立腺、結腸、卵巣、子宮、腎臓、胃、及び唾液腺癌、或いはそ
    の他の細胞型から成る群から選択される癌を含む、請求項６５のモノクローナル
    抗体。
  70. 【請求項７０】 腫瘍細胞が乳房組織細胞である、請求項６９の方法。
  71. 【請求項７１】 哺乳動物がヒトである、請求項６９の方法。
  72. 【請求項７２】 細胞障害性因子の治療的有効量を投与することを更に含む
    方法である、請求項６５の方法。
  73. 【請求項７３】 抗体及び細胞障害性因子を同時に投与する、請求項７２の
    方法。
  74. 【請求項７４】 細胞障害剤の前に抗体を患者へ投与する、請求項７２の方
    法。
  75. 【請求項７５】 抗体の前に細胞傷害剤を投与する、請求項７２の方法。
  76. 【請求項７６】 細胞傷害剤を抗体とコンジュゲートさせた、請求項７２の
    方法。
  77. 【請求項７７】 配列番号：４のアミノ酸１からアミノ酸３２７を包含する
    配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列と特異的に結合す
    る抗体、並びに製薬的に許容される担体を含んでなる組成物。
  78. 【請求項７８】 抗体が、ＡＴＣＣ （ＬＩＶ-１．２９４５．２
    Ｇ１．１Ｃ７．２Ｆ１０）；ＡＴＣＣ （ＬＩＶ-１．２９８２．４Ａ
    １２．１Ｅ８．１Ｃ４）；ＡＴＣＣ （ＬＩＶ-１．２９８３．３Ｇ９
    ．１Ｄ４．１Ｄ７）；ＡＴＣＣ （ＬＩＶ-１．２９８４．６Ｄ６．１
    Ｈ１０．２Ｃ１）；ＡＴＣＣ （ＬＩＶ-１．２９８５．４Ｆ３．２Ｄ
    ６．１Ｄ７）；ＡＴＣＣ （ＬＩＶ-１．２９８７．１Ｄ８．１Ｃ１１
    ．２Ｂ７）；ＡＴＣＣ （ＬＩＶ-１．２９８８．１Ａ７．１Ｆ２．１
    Ｈ７）から成る群から選択されるハイブリドーマ細胞株によって生産されるモノ
    クローナル抗体である、抗体及び製薬的に許容される担体を含んでなる組成物。
  79. 【請求項７９】 細胞傷害性因子を更に含んでなる、請求項７７の組成物。
  80. 【請求項８０】 被験試料における高発現レベルが、被験試料が得られた哺
    乳動物における腫瘍の存在を示し、配列番号：３のヌクレオチド４１２からヌク
    レオチド４７７を包含する配列に対して少なくとも６５％の相同性を有する配列
    を含んでなる核酸配列、又はその相補性配列の発現のレベルを、哺乳動物から得
    た被験試料、及びコントロール試料で検出することを含んでなる、哺乳動物での
    腫瘍を診断する方法。
  81. 【請求項８１】 （ａ）抗体を被験試料哺乳動物から得た被験試料と接触さ
    せ；並びに（ｂ）配列番号：４のアミノ酸１からアミノ酸３２７を包含する配列
    に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプ
    チドであって、抗体がポリペプチドと結合し、抗体と被験試料のポリペプチドの
    間の複合体の形成を検出することを含んでなる、哺乳動物での腫瘍を診断する方
    法。
  82. 【請求項８２】 前記被験試料が、腫瘍性細胞の成長又は増殖を有すると思
    われる個体から得られる、請求項８０の方法。
  83. 【請求項８３】 前記被験試料が、腫瘍性細胞の成長又は増殖を有すると思
    われる個体から得られる、請求項８１の方法。
  84. 【請求項８４】 容器；及び 容器内に含有される請求項７７の組成物を含んでなる製造品。
  85. 【請求項８５】 容器；及び 容器に含有される請求項７８の組成物を含んでなる製造品。
  86. 【請求項８６】 容器； 容器上の標識；及び 組成物が腫瘍細胞の成長を阻害するための効果的であり、容器上の標識がＬＩＶ
    -１-１６４６４７ポリペプチドの過剰発現によって特徴付けられる症状を治療す
    るために組成物を使用することができることを示す、請求項７７の組成物を含ん
    でなる製造品。
  87. 【請求項８７】 容器； 容器上の標識；及び 組成物が腫瘍細胞の成長を阻害するために効果的であり、並びに容器上の標識が
    ＬＩＶ-１-１６４６４７ポリペプチドの過剰発現によって特徴付けられる症状を
    治療するために組成物を使用することができることを示す、請求項７８の組成物
    を含んでなる製造品。
  88. 【請求項８８】 候補化合物と配列番号：１９に対して少なくとも６５％の
    相同性を有する配列を含んでなるポリペプチドを接触せしめることを含んでなる
    、ＬＩＶ-１-１６４６４７ポリペプチドの発現又は活性を阻害することができる
    化合物を同定するための方法。
  89. 【請求項８９】 候補化合物又はポリペプチドが固体支持体へ固定されてい
    る、請求項８８の方法。
  90. 【請求項９０】 非固定化成分が検出可能な標識を保持する、請求項８９の
    方法。
  91. 【請求項９１】 配列番号：３のヌクレオチド４１２からヌクレオチド４７
    ７を包含する配列又はその相補配列に対して、少なくとも６５％の核酸配列相同
    性を有する核酸配列を含んでなる宿主細胞。
  92. 【請求項９２】 細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である
    、請求項９１の宿主細胞。
  93. 【請求項９３】 細胞が大腸菌である、請求項９１の宿主細胞。
  94. 【請求項９４】 細胞が酵母細胞である、請求項９１の宿主細胞。
  95. 【請求項９５】 細胞が昆虫細胞である、請求項９１の宿主細胞。
  96. 【請求項９６】 抗体がキメラ抗体である、請求項３２の抗体。
  97. 【請求項９７】 抗体がヒト化抗体である、請求項３２の抗体。
  98. 【請求項９８】 抗体がヒト抗体である、請求項３２の抗体。
  99. 【請求項９９】 抗体が、Ｆａｂ，Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、
    二重特異性抗体、単鎖抗体、及び多特異性抗体から成る群から選択された抗体断
    片である、請求項３２の抗体。
  100. 【請求項１００】 宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細
    胞、大腸菌、及び昆虫細胞から成る群から選択される、請求項３２の抗体を生産
    する宿主細胞。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005063301A1 (ja) * 2003-12-26 2005-07-14 Toshio Hirano Emt誘導剤
JP2008501308A (ja) * 2004-02-20 2008-01-24 ルドウィグ インスティテュート フォー キャンサー リサーチ Ｅｇｆレセプターエピトープペプチドおよびその使用

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040141983A1 (en) * 1999-03-15 2004-07-22 Protein Design Labs, Inc. Compositions against cancer antigen LIV-1 and uses thereof
US6762020B1 (en) 1999-03-15 2004-07-13 Protein Design Labs, Inc. Methods of diagnosing breast cancer
WO2003000012A2 (en) * 2001-06-21 2003-01-03 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of breast and ovarian cancer
EP2107113B1 (en) 2002-02-20 2012-04-18 Sysmex Corporation Primers for nucleic acid amplification in detecting housekeeping gene mRNA and test method using these primers
CA2514062A1 (en) * 2003-01-27 2004-08-12 Biogen Idec Ma Inc. Compositions and methods for treating cancer using igsf9 and liv-1
WO2004067564A2 (en) * 2003-01-29 2004-08-12 Protein Design Labs, Inc. Compositions against cancer antigen liv-1 and uses thereof
WO2005048938A2 (en) 2003-11-13 2005-06-02 California Pacific Medical Center Anti-pecam therapy for metastasis suppression
FR2863275B1 (fr) * 2003-12-09 2007-08-10 Biomerieux Sa Procede pour le diagnostic/pronostic du cancer du sein
JPWO2005095942A1 (ja) * 2004-03-30 2008-02-21 独立行政法人理化学研究所 レーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法およびその装置
ZA200704934B (en) 2004-12-22 2010-09-29 Genentech Inc Methods for producing soluble multi-membrane-spanning proteins
TW200813231A (en) * 2006-04-13 2008-03-16 Novartis Vaccines & Diagnostic Methods of treating, diagnosing or detecting cancer
US20090304590A1 (en) * 2007-05-29 2009-12-10 Wyeth Therapeutic compositions and methods
US20090258005A1 (en) * 2007-05-29 2009-10-15 Trubion Pharmaceuticals Inc. Therapeutic compositions and methods
US8097423B2 (en) * 2007-07-30 2012-01-17 Institute Of Virology MN/CA IX and breast cancer therapy
US20100092894A1 (en) * 2008-10-14 2010-04-15 Weihong Liu Bottom Antireflective Coating Compositions
US8361744B2 (en) 2009-11-05 2013-01-29 Genentech, Inc. Methods and composition for secretion of heterologous polypeptides
CA2808859A1 (en) * 2010-08-20 2012-02-23 Pangea Biosciences, Inc. Cancer diagnostic and cancer therapeutic
PT3461847T (pt) 2010-12-06 2020-12-24 Seagen Inc Anticorpos humanizados para liv-1 e uso dos mesmos para tratar cancro
WO2013112881A1 (en) 2012-01-27 2013-08-01 Thomas Jefferson University Mct protein inhibitor-related prognostic and therapeutic methods
WO2014172627A1 (en) 2013-04-19 2014-10-23 Thomas Jefferson University Caveolin-1 related methods for treating glioblastoma with temozolomide
HRP20211748T1 (hr) 2014-03-14 2022-02-18 F. Hoffmann - La Roche Ag Postupci i sastavi za sekreciju heterolognih polipeptida
MA45324A (fr) 2016-03-15 2019-01-23 Seattle Genetics Inc Polythérapie utilisant un adc-liv1 et un agent chimiothérapeutique

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5720937A (en) 1988-01-12 1998-02-24 Genentech, Inc. In vivo tumor detection assay
WO1989006692A1 (en) 1988-01-12 1989-07-27 Genentech, Inc. Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function
ATE155813T1 (de) 1989-05-19 1997-08-15 Genentech Inc Her2 extrazellulare domäne
CA2132500A1 (en) 1994-09-20 1996-03-21 David Lockwood Manning Methods for predicting the behaviour of breast tumours
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
EP1361210B1 (en) 1996-08-12 2008-12-24 Celgene Corporation Novel immunotherapeutic agents and their use in the reduction of cytokine levels
AU4982097A (en) 1996-10-18 1998-05-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Anti-erbb2 antibodies
US5860935A (en) 1996-10-29 1999-01-19 Novid Inc. Game apparatus and method for monitoring psycho-physiological responses to questions
KR20010012223A (ko) 1997-05-06 2001-02-15 벤슨 로버트 에이치. 엔테로코커스 패칼리스 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드
WO1999006673A1 (en) 1997-07-30 1999-02-11 Eg & G Sealol, Inc. Improved brush seal and method of making same
ZA9811162B (en) 1997-12-12 2000-06-07 Genentech Inc Treatment with anti-ERBB2 antibodies.
DE19813839A1 (de) 1998-03-20 1999-09-23 Metagen Gesellschaft Fuer Genomforschung Mbh Menschliche Nukleinsäuresequenzen aus Brusttumorgewebe
PT1064027E (pt) 1998-03-27 2008-09-29 Genentech Inc Sinergismo de ligando de apo-2 e anticorpo anti-her-2
JP2002527066A (ja) 1998-10-15 2002-08-27 カイロン コーポレイション 転移性乳癌および結腸癌調節遺伝子
US6579973B1 (en) 1998-12-28 2003-06-17 Corixa Corporation Compositions for the treatment and diagnosis of breast cancer and methods for their use
CA2296792A1 (en) 1999-02-26 2000-08-26 Genset S.A. Expressed sequence tags and encoded human proteins
AU3395900A (en) 1999-03-12 2000-10-04 Human Genome Sciences, Inc. Human lung cancer associated gene sequences and polypeptides
WO2000058336A1 (en) 1999-03-26 2000-10-05 Human Genome Sciences, Inc. 50 human secreted proteins
US6649342B1 (en) 1999-03-15 2003-11-18 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosing breast cancer, compositions, and methods of screening for breast cancer modulators
US20040141983A1 (en) 1999-03-15 2004-07-22 Protein Design Labs, Inc. Compositions against cancer antigen LIV-1 and uses thereof
US6762020B1 (en) * 1999-03-15 2004-07-13 Protein Design Labs, Inc. Methods of diagnosing breast cancer
EP1159619A2 (en) 1999-03-15 2001-12-05 EOS Biotechnology, Inc. Methods of diagnosing and treating breast cancer
EP1212343A4 (en) 1999-09-03 2004-11-03 Human Genome Sciences Inc 52 HUMAN SECRETED PROTEINS
US6780586B1 (en) 1999-11-29 2004-08-24 Protein Design Labs, Inc. Methods of diagnosing breast cancer
US6750013B2 (en) 1999-12-02 2004-06-15 Protein Design Labs, Inc. Methods for detection and diagnosing of breast cancer
WO2002016939A2 (en) * 2000-08-18 2002-02-28 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis of cancer and screening for cancer modulators
WO2002059377A2 (en) * 2001-01-24 2002-08-01 Protein Design Labs Methods of diagnosis of breast cancer, compositions and methods of screening for modulators of breast cancer
WO2004067564A2 (en) 2003-01-29 2004-08-12 Protein Design Labs, Inc. Compositions against cancer antigen liv-1 and uses thereof

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005063301A1 (ja) * 2003-12-26 2005-07-14 Toshio Hirano Emt誘導剤
JP2008501308A (ja) * 2004-02-20 2008-01-24 ルドウィグ インスティテュート フォー キャンサー リサーチ Ｅｇｆレセプターエピトープペプチドおよびその使用
JP2012102109A (ja) * 2004-02-20 2012-05-31 Ludwig Inst For Cancer Research Ｅｇｆレセプターエピトープペプチドおよびその使用

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