CN1265148A - 锚定于细胞膜的抗凝血融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明是关于对血液凝结作用的抑制,尤其是在器官排异作用的过程中,并且特别是对延迟性血管排异作用的抑制。本发明提供了可锚定于细胞膜的抗凝血蛋白。其抗凝血功能优选地是由肝素,抗凝血酶,水蛭素,TFPI,蜱抗凝血肽或蛇毒液因子所提供。优选地,这些抗凝血蛋白可被阻止在细胞表面组成型表达。特别是,在细胞表面的表达是由细胞的激活调节的,例如通过使该蛋白质定向进入合适的分泌颗粒。这些蛋白质的表达,可使细胞,组织和器官在移植之后(例如在异种移值之后)较少受排异作用的损害。

Description

锚定于细胞膜的抗凝血融合蛋白
发明领域
本发明是关于对血液凝结作用的抑制，特别是在器官排异作用过程中。
发明背景
器官移植外科技术到现在已被成功地实施了几十年，并且由于它的成功，这种做法己普遍了，并可论证地成了常规程序。但是，适当移植器官的供应不能满足日益增长的需要。
由于缺乏适当的人体(即同种异体)器官，近年来，对于在人体移植手术中使用动物(即异种的)器官(异种移植)的可能性已日益受到重视(例如自然1997；385：285)。认为猪供体器官是适合的选择，因为猪在解剖学和生理学方面都类似于人类，并且供应充足。
但是在目前，严重充分确证的排异作用问题阻止了异种移植。这种排异过程可分为明显不同的阶段，其中第一步发生在移植后数分钟时间内。这一步骤被称为超急性反应，是由于接受者存在抗体而引起，这种抗体能识别异种移植物内皮细胞(ECs)上的外来抗原并与之反应。此识另过程可激发补体级联过程(Complement Cascade)，并进而导致移植物ECs的溶胞和死亡。
然后，这种初始的超急性排异作用，将被迟发性血管反应(也被称为急性血管排异作用或异种移植迟发性排异作用)进一步强化。在超急性反应过程中，EC细胞裂解、死亡，同时伴随有水肿和外膜细胞的暴露，这些细胞在其表面组成型表达组织因子(TF)。据认为，组织因子对引发体内凝血级联过程具有决定性作用，它暴露于血浆可能引发凝血反应。凝血酶和TNF-α集中在受损组织的周围，这可进一步诱发ESs合成和表达TF。
静止ECs周围环境不利于凝结作用。几种天然的凝血抑制剂可与EC细胞外蛋白多糖相结合，例如组织因子途径抑制剂，抗凝血酶III和凝血调节蛋白。但是，天然的异种反应性抗体(XNAs)对外来组织的识别，可导致这些分子丧失。组织因子的暴露和诱导合在一起，使EC周围的抗凝血环境变成为前凝血环境。
异种移植物的血管形成区因此将成为血液凝结的部位，这是受损害组织的特征。血流减少，移植的器官将发生局部缺血。可在Bach等(1996)的文献中找到对迟发性血管排异作用的可详细的叙述。
因此，在移植中使用异种器官受到如下排异作用的阻碍：开始是超急性排异作用，随后是长时间的血管排异作用，可能随后还有T-细胞介导的排异作用。抑制引起这些排异作用的机制可能有助于异种移植的使用。
但是，单纯地给予适当的抑制剂不是特别适合的措施。对受体动物完全抑制补体相当于免疫抑制，将使受试动物增加被感染的机会。类似地，对受体动物抑制其凝血级联过程，将导致该动物对手术后失控性出血敏感。因此，抑制剂按需要应该局限于受试者的异种移植物部位。
防止超急性排异作用是欧洲专利0495852(Imutran)的研究主题。此专利揭示，为了使组织更适合于异种移植，应该使它们与同源的补体限制因子结合，此种限制因子可防止对异种器官的接受者补体的完全激活。
已经发展和应用了这种方法，以便产生转基因动物，设计使此动物具有能在超急性排异作用下生存的器官。已产生了可在心脏ECs上表达人的一种补体调节剂CD59的转基因小鼠(Diamond，1995)。当以人血浆灌注此转基因心脏时，人CD59可保持生物活性，而补体被抑制了。
还报导了表达人DAF和/或CD59的转基因猪(McCurry，1996)。与对照相比较，用转基因移植物时，经历了二倍长的时间才出现心脏排异作用。
对于抑制迟发性血管排异作用没有受到同样的关注。尽管本领域已熟知一些凝结级联过程的抑制剂，并对其中很多已进行了充分地鉴定。
例如已知组织因子途径抑制剂(TEPI)可抑制通常是组织因子，因子VIIa，以及因子Xa之间形成的活性复合物的功能。TFPI是一种276个残基的可溶性多肽，它带正电荷的C-端连接了EC蛋白多糖层中的肝素硫酸盐。理论上已将它分为三个“Kunitz”功能区：Kunitz功能区I负责结合组织因子和因子VIIa；功能区II结合因子Xa；但对区域III的功能尚不了解(Hamamotom 1993)。
蜱抗凝血肽(TAP)是因子Xa的特异性有效抑制剂。已从软蜱Ornithodoros moubata纯化得到了这种60个氨基酸的多肽。
许多蛇毒液也含有抗凝血多肽。例如已从蛇Agkistrodon contoetrixcontortrix的毒液中纯化得到一种231个氨基酸的蛋白质C激活物(McMullen，1989；Kisiel，1987)。
水蛭素是水蛭Hirudo medicinelis在从受害者吸血时使用的抗凝血蛋白。它非常有效，可按1∶1的比例与凝血酶结合，具有飞摩尔数量级的离解常数。凝血酶的活性位点被掩盖在此稳定的复合物中，因此水蛭素可阻止血纤维蛋白原分解而抑制血凝结块形成。
用于使抗凝血剂局限于排异作用部位的一种可能的方法是，将水蛭素连接于抗E-选择素抗体，在细胞激活过程中，其表达在ECs表面。在体外试验中已表明这种方法对抑制血凝块形成是有效的(Kiely，1995)。最近Bach等(1996)对另一些可能的方案进行了评述。
P-选择素(也称为CD62)也是在细胞激活过程中表达在ECs表面。在合成过程中，由存在于胞质区域内的序列使它定向进入血小板和内皮细胞中的分泌性贮存颗粒(Disdier，1992)。在对细胞激活物如凝血酶反应时，这些颗粒迅速地重新分布，P-选择素表达于细胞表面(Green，1994)。
本发明的一个目标是提供膜结合的抗凝血蛋白。这些蛋白质适合于在ECs表面抑制血凝结级联过程，因此适合于在体内抑制引起器官排异作用的机制。
本发明的另一个目标是，提供在ECs表面对这些分子的调节性表达，因此使凝血抑制过程局部地在器官排异状态下发生。这种排异作用可能是异种的或同种异体的。
本发明还有另一个目标是，提供适合于移植的，特别是适合于异种移植的生物组织。
发明详述
本发明的第一方面是提供一种蛋白质，它包含一个具有抗凝血剂活性的区域和一个可使此蛋白质锚定于细胞膜的区域。优选地这是一种嵌合蛋白质，也就是说，其锚定区和抗凝区是来自不同的蛋白质。
此抗凝血区可以包括任何一种抗凝血多肽的序列。这种抗凝血多肽的例子包括肝素，TAPs，抗凝血酶，水蛭素和TFPIs，以及它们的功能衍生物，如保持有抗凝血剂活性的片断和衍生物。还报导了一些凝血酶的抗凝血剂衍生物，通常是前凝血剂(Dang，1997)。
优选地此抗凝血区含有水蛭素序列。水蛭素类包括水蛭素，水蛭素衍生物，类似物(“hirulogs”)和变异体(如hirudisins)。例如，己报导在Tyr-64硫酸化可增加水蛭素的抗凝血剂活性，以及hirudisin-2比水蛭素本身，是凝血酶活性的更有效的抑制剂(如Knapp，1992；Skern 1990)。
另一种选择是，此抗凝血区可含有组织因子途径抑制剂(TFPI)序列。TFPI类包括TFPI本身及其保持有抑制活性的衍生物或类似物。优选的TFPI序列包含TFPI本身的Kunitz功能区I和功能区II。
还有另一种选择是，此抗凝血区可含有蜱抗凝血肽(TAP)序列。TAP类包括TAP本身及其保持有抑制活性的衍生物或类似物。例如通过位点定向诱变，提高了TAP对FXa的抑制效果(如Mao.1995)。
还有一些选择是，抗凝血区可含有例如从蛇毒液中分离出的蛋白C激活物序列(例如McMullen，1989；Kisiel，1987)，或者从不是通过蛋白C激活而起作用的蛇毒液中分离出的抗凝血序列，或者是它们的保持有抗凝血活性的衍生物或类似物。
锚定区可以是能使该蛋白质附着于细胞膜的任何一种序列。适合的例子包括来自膜蛋白的跨膜序列和GPI锚定体。优选的锚定区是能够使该蛋白质附着于脂质双层的序列，如HLA I类蛋白或CD4蛋白的跨膜区。还可以要求该蛋白质包含通常是与所述跨膜区结合的细胞质功能区，如CD4细胞质功能区，以及/或者包含与细胞膜紧邻接的细胞外功能区，如CD4功能区3和4。另一种选择是，此锚定区可以是一个使该蛋白质能够在细胞外与膜蛋白结合，而不需要该蛋白质本身插入细胞膜的序列。
本发明的第二方面是提供一种根据第一方面的蛋白质，并且另外还包含一个使该蛋白质不致在细胞表面组成型表达的定向序列。
优选地此向定序列是一种可以使新生的多肽定向进入分泌颗粒的多肽序列，更优选地是，此分泌颗粒是一种直至细胞受到适合的刺激才能与细胞质膜融合的分泌颗粒。例如，Weibel-Palade小体只有在内皮细胞表面受促分泌素如凝血酶或血纤维蛋白刺激时才能与质膜融合(Wagner，1993)。优选的情况是，在器官排异过程中发生EC激活时，此分泌颗粒与质膜融合。
因此，此定向序列优选地是一个可使新生的多肽定向进入Weibel-Palade小体的序列，例如来自P-选择素的相关序列。更优选地是，根据本发明第二方面的蛋白质包含抗凝血序列，以及P-选择素的跨膜功能区和细胞质功能区。因此，来自P-选择素的这些功能区既提供锚定序列，又提供定向序列。
本发明的第三方面是提供了一种编码本发明蛋白质的多核苷酸。优选地此多核苷酸是DNA。
此多核苷酸优选地含有适合于调节本发明蛋白质表达的序列。这种表达优选地可被控制，如细胞特异性控制，可诱导性控制，或时序控制。例如，表达可能对EC是特异性的，或者可能是在对细胞激活反应时受到调节。
本发明的第四方面是提供一种包含根据第三方面的多核苷酸的载体。
此名词“载体”意指一种能够将多核苷酸转移至宿主细胞的分子。优选地此载体是DNA载体，而更优选地是它能够表达编码本发明蛋白质的RNA。本领域已知许多适合的载体。
此载体优选地是适合于产生转基因动物的。例如，在Heckl-Ostreicher(1995)，McMurry(1996)，White(1995)，Yannoutsos(1995)，和Langford(1996)的文献中论述了适合用于产生转基因猪的载体。Diamond(1995)论述了适合用于产生转基因小鼠的小基因载体。
本发明的第五方面，提供了一个包括本发明第一，第二，第三或第四方面分子的传递系统，以及传递这些分子至靶细胞的方法。
本发明第四方面的某些载体还可能作为适合的传递系统而起作用。同样，本发明第五方面的某些传递系统也可能本来就是载体，但这不是经常的情况。例如，病毒载体也可以起传递系统的作用，而脂质体传递系统不是载体。
该传递系统可以是病毒或非病毒系统。非病毒系统如脂质体，可避免一些与病毒为基础系统有关的困难，如批量生产的费用，表达稳定性差和对安全的担心。优选地此传递系统是适合用于基因治疗的。本领域已知道许多适合的传递系统。
优选地此传递系统将被定向，以致使适合于移植的细胞，或已被移植的细胞可吸收本发明的分子。更优选地，此传递系统是对这些细胞特异的。例如，可使此传递系统定向对准特定的器官如心脏或肾脏，或者对准特定的细胞类型如上皮细胞。
为达到这个目的，例如，此传递系统可能是一个受体介导的传递系统，已被定向对准了靶细胞上所发现的受体。例如，可使此传递系统定向对准心脏细胞上所发现的受体，优选地是对准仅在心脏细胞上发现的受体，或者可使之定向对准内皮细胞上所发现的受体，优选地是对准仅见于内皮细胞上的变体，或者对准被激活内皮细胞上所发现的受体，如E-选择素或P-选择素。
此传递系统优选地是适合于产生转基因动物的。例如，可使此传递系统定向对准配子，受精卵，或胚胎干细胞。
本发明的第六方面是提供了一种用本发明的载体转染细胞的方法。在此可能包括使用本发明的传递系统。
细胞类型不受限制，可以是原核细胞或真核细胞。转染过程可以在体内或体外进行。
当细胞是用于移植时，此细胞优选地是真核细胞，更优选地是内皮细胞。例如Heckl-Ostreicher(1995)描述了对猪内皮细胞的稳定转染过程。
优选地此细胞是适合于产生转基因动物的。更优选地，此细胞是配子细胞，受精卵或胚胎干细胞。例如，Diamond(1995)描述通过微注射法转染鼠卵细胞产生了转基因小鼠，而Yannoutsos(1995)，Langford(1996)，和White(1995)描述通过微注射猪受精卵产生了转基因猪。
本发明的第七方面是提供一种按照本发明第六方面转染的细胞。
为了增加对凝血级联过程的抑制效果，此细胞优选地能够表达本发明的二种或两种以上不同的蛋白质，每种蛋白质在不同的阶段抑制凝血级联过程。例如，在一个蛋白质中的抗凝血区可能含有TFPI，而在另一个蛋白质中，它可能含有水蛭素序列。
本发明的第八方面提供了包含本发明细胞的生物组织。在此所应用的名词生物组织包括细胞，组织和器官标本。因此，该定义包括例如成纤维细胞，角膜，神经组织，心脏，肝脏，或肾脏。
本发明的第九方面提供了一种包含有本发明的细胞和/或生物组织的动物。优选地此动物适合于产生用于对人移植的器官。优选地此动物是哺乳动物，更优选地是转基因猪或转基因羊。
可在活着时对此动物进行处理，以使它包含转基因生物组织(即作基因治疗处理)。为了产生转基因动物，优选地是用本发明的载体对活动物进行转染。例如，可特异性地将本发明的载体传递给猪的内皮细胞，而产生适合用于异种移植的转基因器官。
另一种选择是，此动物可作为转基因动物被生虫，本领域已知道多种适合用于产生这种转基因动物的方法(例如Bradley &Liu.1996；Clarke，1996；Wheeler，1994)。例如，已熟知通过微注射DNA直接操作受精卵或早期胚胎，通常是体外操作多能性细胞如胚胎干细胞。已证明对早期胚胎的反转病毒感染在种范围内是成功的，对无带卵的腺病毒感染已有报导。通过核转移对羊的转基因和克隆也有论述(例如WO97/07668)。
本发明的第十方面是提供了一种使生物组织适合用于移植的方法，包括在此生物组织内，优选地是在其内皮细胞内表达一种或几种本发明的蛋白质。可在体内或体外使此生物织织进行这种过程。例如，可在体内用本发明的载体转染动物的一种器官，或者可以移植前在体外或移植后在体内转染某一器官。
本发明的第十一方面是提供了一种移植方法，包括将本发明的生物组织从供体动物移植进入受体动物。优选地此方法是用于异种移植，相对于受体动物，此供体生物组织是异种的。
附图简要说明
图1显示本发明的水蛭素-CD4嵌合蛋白和构建物的结构图。(A)具有甘氨酸接头的HLA-水蛭素-CD4构建物。(B)具有人P-选择素C-末端的HLA-水蛭素-CD4构建物，特异性定向序列被加底线。标明了CD4的跨膜区(TM)，转移终止区(ST)，和细胞质区(C)。
图2显示对于在DAP3成纤维细胞中表达的HLA-水蛭素-CD4构建物的FACS分布图。
图3显示对于在CHO-K1中表达的HLA-水蛭素-CD4-P-选择素cDNA构建物的FACS分布图。
图4显示表达水蛭素-CD4的成纤维细胞对凝血酶的结合。
图5显示凝血酶对表达水蛭素-CD4的细胞结合的特异性。
图6显示凝血酶对以HLA-水蛭素构建物转染的CHO-K1细胞的结合。
图7显示使凝血酶失活可消除凝血酶在细胞表面对水蛭素-CD4的结合。将表达水蛭素-G2-CD4的细胞同凝血酶或失活的凝血酶共温育，并用抗凝血酶原抗体或抗-凝血酶-水蛭素抗体染色显示凝血酶的结合。
图8显示本发明的TFPI-CD4嵌合蛋白和构建物的结构图。
图9显示表达束缚于细胞表面的TFPI如DAP.3细胞的流式细胞术测定分布图。
图10显示FXa对结合了TFPI1-276-CD4和TFPI1-183-CD4的细胞表面的特异性结合。
图11显示抗-TFPI多克隆免疫球蛋白组分对FXa结合的阻断。
图12显示针对Kunitz功能区I和II的单克隆抗体对FXa结合的阻断。
图13显示表达TFPI1-276-CD4和TFPI1-183-CD4的细胞对FXa的抑制作用。显示了对于同FXa共温育的已转染DAP.3细胞，FXa-特异性生色底物达到OD405＝1的平均时间。扣除了对于对照细胞的数值，误差标志表示标准差。
图14显示，为了最大地结合了TFPI-CD4嵌合蛋白需要活性的TF1-219/FVII复合物。
图15显示凝血酶对表达水蛭素-CD4的永生化猪上皮细胞(IPEC)结合的特异性，并且还显示了细胞表面水蛭素-CD4的表达对凝血时间的作用。
图16显示D16/16细胞中ACTH和水蛭素的分布，是通过荧光显示的。
图17显示PMA刺激之后水蛭素-CD4-P-选择素在细胞内分布的改变。
图18显示在IPEC上表达的TFPI-CD4保持有其结合特性。
图19显示猪组织因子和人组织因子的竞争性结合。
图20显示当在IPEC表面表达时，TFPI-CD4可延长凝血时间。
图21显示共表达TFPI-CD4和水蛭素-CD4的抗凝血作用。
对实施方案的描述1.将与HLA I类信号肽融合的并连接于人CD4功能区3和4的水蛭素束缚在细胞膜上
为了在哺乳动物的细胞中表达异种的水蛭素构建物，应用重叠延伸的PCR技术，使来自人HLA I类A2.1，氨基酸-1至-24(Holmes.1987)的膜定向性信号肽前导序列与水蛭素变异体1(Dodr，1984)融合(图1)。用如下引物扩增了此HLA A2.1前导序列：
5′-cagtgtcgacggatccatggccgtcatggcgccccga-3′[hla-1]<SEQ ID 1>(导入SalI和BamHI限制性位点)和：
5′-gtcagtgtaaacaaccgcccaggtctgggtcagg-3′          <SEQ ID 2>用如下引物扩增hirudin序列：
5′-acccagacctgggcggttgtttacactgactgcacc-3′及      <SEQ ID 3>
5′-gacgctgcagaattcttgcaggtattcnccgggatt-3′[hir-3] <SEQ ID 4>(导入末端EcoRI和PstI位点)。借助于琼脂糖凝胶电泳纯化所得到的PCR产物(108和228bp)，然后用于第三次PCR，使用侧翼引物hla-1和hir-3。对形成的PCR产物(300 bp)用SaII和BamHI消化，并亚克隆进入pBluescript  SK(+)(Stratagene)。
将由编码CD4功能区3和4(Maddon，1985)的cDNA组成的锚定体，连同转移终止序列(ST)，CD4(CD4166-435)的跨膜功能区和细胞质功能区一起，加入到HLA-水蛭素盒中。
但是，为确保当以其C-末端连接于此CD4锚定体时，水蛭素能保持可移动性并有活性，制备了如下3段不同的甘氨酸接头(称为G1、G2、G3-图1A)：
-甘氨酸接头1(G1：GGSGG)，此寡核甘酸对是由5′-aattaggaggttctggaggctgca-3′<SEQ ID 5>(含有突变的EcoRI识别序列和PstI位点)和5′-gcctccagaacctcct-3′<SEQ ID 6>组成；
-甘氨酸接头2(G2)和接头3(G3)是分别由重复2次或3次的核心序列(GGSGG)组成。将这3段接头导入HLA-水蛭素片断的3′末端。
在插入CD4锚定体之前将这些甘氨酸接头寡核苷酸退火，并分别连接进入包含HLA-水蛭素盒的质粒EcoRI/PstI位点中。
用如下引物扩增了CD4166-435：
5′-tgtctgcaggaaccagaagaaggtggaattca-3′      <SEQ ID 7>(导入PstI和EcoRI位点)和：
5′-gtgggatccgcctggcctcgtgcctcaa-3′          <SEQ ID 8>(含有一个末端BamHI)。
将形成的PCR产物克隆进入pBluescript并测序。在CD4166-435中，发现V328突变成A328。将PstI/BamHI CD4片断亚克隆进入HLA-水蛭素-Gl，-G2，和-G3质粒，并且通过DNA序列分析核实这些构建物。
将此3个cDNA构建物的每一个亚克隆进入哺乳动物表达载体pHβActpr-l gpt(Gunning，1987)的BamHI位点，此载体包含有人β-肌动蛋白增强子和启动子区，以及驱动gpt抗性基因的SV40增强子成分，使之可在霉酚酸存在下对克隆进行选择(图1C和1D)。通过限制性内切酶基因定位测定核实了最终构建物的取向。
按照标准的程序，以磷酸钙将包含有单独HLA-水蛭素-G1/2/3-CD4构建物的载体转移进入小鼠成纤维细胞DAP.3品系(Merguelies.1983)。在以5％胎牛血清，氨苄青霉素，链霉素和谷氨酰胺补充的DMEM培养基(Gibco)中培养生长18小时之后，用甘油处理细胞30分钟。然后用磷酸缓冲盐水(PBS)洗细胞2次。再加入含有黄嘌呤，次黄嘌呤和霉酚酸达最后浓12μg/ml的新鲜培养基。
对于阴性对照，是使以表达HLA-DR的人II类构建物转染的DAP.3细胞(细胞品系513)(Lechler，1988)，培养生长在含有霉酚酸的相同培养基内。
分别用鼠单克隆抗体4185-81-7(Schlaeppi，1991)和OKT-4(Reinherz，1979)，借助于FACS(荧光激活细胞分类法)检测了存活的克隆对水蛭素和CD4的表达。在冰浴上用鼠抗体对105个细胞染色30分钟，并加入FITC-结合标记的羊抗小鼠多克隆抗体作为第二抗体。
如在图2中所显示，在DAP.3细胞表面，这些水蛭素-CD4构建物很好地被表达了。在具有3个不同长度甘氨酸接头的水蛭素-CD4之间，未检测出表达水平有任何显著性差异。
因此，抗凝血多肽可在细胞表面稳定地被表达。2.在CHO-K1细胞表面表达具有来自P-选择素C-末端的定向序列的水蛭素-CD4。
除HLA-水蛭素-G1/2/3-CD4构建物之外，还构建了具有来自人P-选择素的定向序列的另外二个构建物(图1B)。来自CD4的跨膜区被用于这些构建物，同时用来自P-选择素的相应序列(Johnston，1989)代替了转移终止序列和C-末端。
为了将CD4功能区3和4加跨膜区(CD4166-395)融合于人P-选择素(P-sel754-789)的转移终止序列和细胞质1区和2区(McEver，1989)，实施了重叠延伸的PCR反应。为了扩增此分子的CD4部分，使用了如下引物：
5′-tgtctgcaggaaccagaagaaggtggaattca-3′[CD4-5]              <SEQ ID 7>(导入PstI和EcoRI限制性位点)和：
5′-gtctgaaacgctttctgaagaagatgcctagcccaatgaaaagcaggaggccg-3′<SEQ ID 9>平行地，为了扩增P-选择素的C-末端区，使用了如下引物(导入一个末端BamHI位点)：
5′-tgggctaggcatcttcttcagaaagcgtttcagacaaaaaga-3′and        <SEQ ID 10>
5′-gaccaggatccggacaggtctctta-3′[P-selN3]                   <SEQ ID 11>
以琼脂糖凝胶纯化所形成的PCR产物之后，用侧翼引物CD4-5和P-selN3实施了第三次PCR。用PstI和BamHI消化所形成的PCR产物(832bp)，亚克隆进入pBluescript并进行测序。然后，用PstI/BamHI切割此CD4-P-sel片断(CD4166-395-P-sel754-789)，并亚克隆进入含有HLA-水蛭素G1或G2的质粒。
将最后的HLA-水蛭素-G1/G2-CD4-P-选择素构建物亚克隆进入pHβActpr-lgpt的BamHI位点，并被转染进入CHO-K1细胞(ATCC CCL 61)，在以5％胎牛血清，氨苄青霉素，链霉素和谷氨酰胺补充的RPMI 1640培养基(Gibco)中培养此细胞。
通过电穿孔法，按照标准的程序进行了转染。简单地说，将5×106个细胞再悬浮于350ml无血清培养基中，并转移至1ml的电穿孔小杯中，电极(Bio-Rad)间的距离为0.4cm。在150ml内加入10μl质粒DNA之后，将样品缓慢地搅拌并保持在冰浴中。在基因脉冲发生仅(Bio-Rad)中以无穷大电阻，960μF和350V使细胞经受电穿孔作用。电穿孔后的次日，用PBS洗细胞，并加入包含有霉酚酸，黄嘌呤和次黄嘌呤的新鲜培养基。
最近发现，当用P-选择素cDNA转染CHO-K1细胞时，细胞内没有聚积P-选择素蛋白，而是被表达在细胞表面(Disdier，1992)。如通过用OKT-4和4158-81-7单克隆染色可断定(图3)，对于上述产生的CHO-K1转染子，水蛭素-G1-CD4-P-选择素和水蛭素-G2-CD4-P-选择素都在其表面表达了，使用的阴性对照是CHO-K1细胞系，它表达融合CD4功能区3和4的TFPI(TFPI-CD4166-435)，培养在含有霉酚酸的相同培养基内。
用完整长度的人P-选择素转染CHO-K1细胞(Johnston，1989)作为阳性对照，此P-选择素是作为3142bp的SalI片断被亚克隆进入包含有SV40-驱动的新霉素(G418)抗性基因的pHβActpr-lneo中。用400μg/ml的G418处理这些细胞，2周后用棉拭子挑出单独的克隆，转移至12孔培养板内。用10μg/ml的4158-81-7和未稀释的OKT-4杂交瘤上清液，分析了存活克隆对水蛭素和CD4的表达。
用抗-CD62 mAb(Becton Dickinson)按照制造商的建议，对人P-选择素进行了检测。对于这些CD62-标记的细胞，观察到与使用水蛭素-CD4-P-选择素相类似的FACS分布图(图3E)，证实CHO-K1细胞在质膜可表达P-选择素。
因此，当在细胞表面表达时，含有P-选择素定向序列的嵌合蛋白质仍然具有功能作用。3.如以特异性抗体所检测的，锚定在细胞表面的水蛭素可结合凝血酶
为了测定以这种方式束缚于细胞表面的水蛭素是否仍保持其凝血酶结合活性，采用了如下的结合试验。
每次实验之前，将稳定转染的细胞在T75培养摇瓶中培养36小时。用细胞剥离器脱离下DAP.3细胞，而通过用PBS，5mM EDTA在37℃处理10分钟，使CHO-K1细胞与塑料瓶分离。细胞用含有0.1％BSA(w/v)的PBS洗4次之后，将150μl 2.5×105个细胞在37℃同递增浓度的凝血酶共温育1小时。用含有0.1％ BSA的PBS洗此细胞4次，并在冰浴上同兔抗-人凝血酶原免疫球蛋白(100μl中10μg/ml)(Dakopatts)再孵育30分钟。再洗2次之后，将细胞同FITC-标记的猪抗-兔免疫球蛋白(Dakopatts)共温育30分钟。最后，将转染子洗3次，并用流式细胞仅进行分析。
如图4所显示，在细胞表面表达的水蛭素保持了结合凝血酶的能力，甘氨酸接头长度不影响对凝血酶的结合。
为了测定饱和水蛭素-CD4表达细胞所需的凝血酶量，将2个克隆同最高达82U/ml的凝血酶共温育。当分析阳性细胞百分数时，可见转染子在41U/ml凝血酶含量下被饱和(图4C)。但是，根据平均荧光强度(mfi)，即使在82U/ml细胞也未被饱和(图4D)。在这些实验性高凝血酶浓度下，对表达HLA-DR的对照细胞的背景结合也显著增加了。
为了进一步阐明凝血酶对水蛭素-CD4结合的特异性，进行了如下阻断实验。将DAP.3 HLA-水蛭素-G3-CD4转染子同10μg/ml的抗-水蛭素mAb或适当的对照(小鼠IgG1和IgG2a，Dakopats)，在冰浴中共同预孵育30分钟，在含有0.1％ BSA的PBS中洗2次后，如上述同凝血酶在37℃共温育1小时。同上述对凝血酶的结合进行了分析。
同4158-81-7的预温育抑制了凝血酶对水蛭素-CD4的特异性结合(图5A)。通过同凝血酶共温育，以及以mAb 4107-76-1(Schlaeppi，1991)和抗-凝血酶原免疫球蛋白的标记比较，证明了水蛭素-CD4对凝血酶的结合。4107-76-1定向针对水蛭素-凝血酶复合物，检测到未结合凝血酶的水蛭素和凝血酶都不与内源性凝血酶受体结合。如图5B所示，以4107-76-1检测的凝血酶结合类似于以抗-凝血酶原免疫球蛋白组分所观察到的结合。
因此，在DAP.3细胞表面表达的水蛭素保持了对凝血酶的特异性结合。
按同样的方式以水蛭素-CD4转染猪的永生化上皮细胞(IPEC)。如图15A所示，只有转染的细胞结合凝血酶，并且这种结合可被4158-81-7以剂量依赖性方式所阻断(图15B)。应用人血浆再钙化试验系统进一步研究了在IPEC上表达，表面束缚的水蛭素的功能作用。如图15C所示，与不存在细胞的对照血凝结时间370秒相比较，未转染的IPEC使再钙化血浆的凝结时间缩短至大约170秒。同诱导TF表达的IL-1预温育进一步使凝血时间减少至100秒以下。与之相反，转染的IPEC使凝血时间延长，即使是同诱导TF表达的IL-1预温育之后也是如此。同4158-81-7共温育则以剂量依赖性方式降低了这种抗凝血作用，表明此作用是由于存在细胞表面水蛭素(图15D)。
因此，在IPEC表面表达的水蛭素可结合凝血酶，并且也能抑制人血浆凝结。4.CHO-K1细胞表达的水蛭素-CD4-P-选择素对凝血酶的结合
为了探查水蛭素-CD4-P-选择素当被表达在CHO-K1细胞表面时是否也能结合凝血酶，将这些细胞同凝血酶在37℃共温育1小时。用抗-凝血酶原免疫球蛋白染色，并加上FiTC-标记的第二抗体层之后，借助于流式细胞仪对细胞进行分析。
检测出完全不同的结合曲线，如图6A所示。以抗-凝血酶原免疫球蛋白，在同相当低浓度的凝血酶共温育之后，可检测出凝血酶对表达与CD4连接的不相干蛋白质的CHO-K1细胞的本底结合。但是，通过以特异性抗-水蛭素/凝血酶mAb 4107-76-1染色，证实了凝血酶对水蛭素的特异性结合(图6B)。以这种抗体，未能测定出对照CHO-K1细胞的本底结合。图6还表明，表达水蛭素的克隆显示有对凝血酶不同程度的非特异性结合，意味着它们对内源性凝血酶受体具有不同的表达水平。用其它几个克隆证实了这种非特异性结合的变化。
为了比较，将来自表达水蛭素-G1-CD4和水蛭素-G2-CD4(即无P-选择素序列)的二个CHO-K1转染子的结果显示在图6C和6D中。与表达连接于CD4-P-选择素锚定器的水蛭素的转染子相比较，除了由于对嵌合蛋白质较好的表达，凝血酶的结合稍有增加(较高的mfi)之外，未检测出结合曲线有任何大的差异。5.水蛭素-CD4-P-选择素被贮存在分泌颗粒中，激活时可被释放出。
为了测定水蛭素在细胞内的积蓄和它从分泌颗粒到细胞表面的路径，以编码水蛭素-CD4-P-选择素或水蛭素-CD4的cDNA瞬时地转染了分泌性鼠垂体细胞系(D16/16)。出于二个理由选择了这个细胞系。第一，已知这些细胞在特殊的贮存颗粒内表达ACTH，用佛波醇酯激活时，在细胞表面释放出ACTH。第二，在体外培养过程中内皮细胞(这种细胞对于研究P-选择素构建物的细胞内定向似乎是理想的细胞类型)会迅速地丧失其Weibel-Palede贮存颗粒。
转染后48小时，以抗水蛭素和抗ACTH抗体对D16/16细胞染色。在以水蛭素-CD4-P-选择素转染的细胞内，发现水蛭素在颗粒内均匀地分布在细胞质中(图16A)。以ACTH-特异染色时，观察到同样的颗粒分布形式，表明了与水蛭素的共-定位(图16B)。用二种抗体同时染色时证实了这点(图16C)。
相比之下，以水蛭素-CD4转染的D16/16细胞不将水蛭素积蓄在细胞内的颗粒中，而是在细胞表面表达了高水平的水蛭素(图16D)。双重染色(图16F)仅显示有水蛭素和ACTH的少量共-定位。
用佛波醇酯PMA激活表达水蛭素-CD4-P-选择素的细胞，并借助于流式细胞术进行了分析。对于未受刺激的细胞4158-81-7不能在细胞表面检测出水蛭素(图17A)。但是在PMA刺激30分钟之后，在细胞表面检测出了水蛭素(图17B)。而且，激活的D16/16细胞可特异性地与凝血酶结合，不同于未激活细胞(图17C-以4107-76-1染色的)。
因此，通过应用含有颗粒的垂体细胞系D16/16，清楚地证明，水蛭素-CD4-P-选择素可被定位于特定的细胞内贮存颗粒中，并且激活时在细胞表面可释放和暴露出功能性嵌合分子。6.当使凝血酶催化位点失活时可消除凝血酶和水蛭素-CD4之间的相互作用。
已明了凝血酶对带有和不带有P-选择素定向序列的水蛭素-CD4的特异性结合(图4和6)。为了进一步增强凝血酶-水蛭素相互作用的特异性，将凝血酶(210nmol，在50μl Tris-缓冲盐水(TBS)中，含0.1％ BSA，pH7.4)同如下成分在37℃预温育1小时：
-天然的全长水蛭素(Biopharm)，以10倍摩尔过量：
-D-Phe-Pro-Arg氯甲基酮二盐酸化物(“PPACK-HCl”)(Calbiochem)，以100倍摩尔过量；或者
-合成的含有水蛭素残基53-64的C-端水蛭素十二肽类似物，带有硫酸根合-Try64(Amertican Diagnostica)，以100倍摩尔过量。
用一个小的生色寡肽底物(H-D-Phe-Pip-Arg-pNA·2HCl(“S-2238”)(Quadratech)分析凝血酶依赖性催化活性。
为了确定凝血酶是否已被PPACK-HCl和水蛭素失活，将5μl每种反应混合物用95ml TBS，0.1％BSA稀释，同50μl 4mM S-2238在37℃共温育10分钟。
如所预料的，与不加抑制剂温育的凝血酶相比较，对于同PPACK-HCl或水蛭素共温育的凝血酶未观察到任何颜色改变，另一方面，如通过S-2238的断裂作用所测定的，此十二肽不影响凝血酶依赖性催化活性。
将这三种不同的制备物加到表达束缚于细胞表面的水蛭素的转染子中。应用上述的程序，用抗-凝血酶抗体或抗-水蛭素-凝血酶抗体，对凝血酶的结合进行了检测。如从图7A可见，以水蛭素或PPACK-HCl失活的凝血酶，没有被在DAP.3细胞表面所表达的水蛭素结合。此外，只观察到凝血酶-十二肽复合物的部分结合。与DAP.3转染子不同，CHO-K1细胞显示了相对较高的凝血酶-PPACK-HCl结合(图7B)。发现这种相互作用是非特异性的，如用抗-水蛭素-凝血酶mAb4107-76-1所显示的。未检测到凝血酶-PPACK-HCl-水蛭素的特异性结合。
这证实水蛭素已特异性地束缚在细胞表面，并且在凝血酶的催化位点与它强烈地结合。7.在细胞表面表达锚定于CD4功能区的全长和截短的TFPI。
为了使TFPI束缚在细胞膜上，将由人CD4166-435组成的融合蛋白连接于包含所有3个Kunitz功能区的全长TFPI(TFPI1-276)，或者连接于缺少了Kunitz功能区III和C-末端的TFPI截短形式(TFPI1-183)(Wun，1988)(图8)。按类似于上述用于水蛭素的路径，通过应用盒式克隆方案将TFPI和CD4序列融合，进行了这些合成，但是不同于水蛭素，TFPI是哺乳动物蛋白质，因此含有内源性信号肽。
用如下引物扩增了编码TFPI的N-末端部分的DNA，此TFPI包含有Kunitz功能区I和II(675bp)：
5′-catcgtcgacggatcctagatgatttacacaatgaagaaagtacatgcactttgggc-3′    <SEQ ID 12>(导入SalI和BamHI限制性位点)；和
5′-ggacctgcagaattcaaaaaggctgg-3′                                   <SEQ ID 13>(包含EcoRI和PstI位点)
用如下引物扩增了编码Kunitz第III功能区连同TFPI C-末端(315bp)的DNA：
5′-agcctttttgaattccacggtccctcat-3′                                 <SEQ ID 14>(具有EcoRI位点)，和
5′-cattgctataacaactgcagatatttttaac-3′                              <SEQ ID 15>(含有PstI位点)。
如上所述扩增了CD4166-435。
通过将限制性位点导入TFPI183 cDNA的3′末端和TFPI184-276cDNA的5′末端，在重组体融合蛋白中H184和G185被突变成C184和R185(图8)。而且P186被突变成S186。通过导入PstI位点除去了TFPI的终止密码子，因此使M276突变成I276，并加入了氨基酸C277。在将PstI位点导入CD4功能区3 N-末端的过程中，L164和Q165被分别突变成C164和R165。发现TFPI184-276 cDNA中K265被突变成E265，CD4166-435中V328被突变成A328(如上所述)
将所有的PCR产物克隆进入pBluescrpt SK(+)。
将全部TFPI-CD4 cDNA连接进入pHβActpr-1gpt表达载体的BamHI位点。
如上面所述，借助于磷酸钙对保持在补充DMEM中的DAP.3进行了转染。通过FACS法，用10μg/ml的鼠抗-人TFPI mAb 4903或4904(American Diagnostica)以及未稀释的OKT-4杂交瘤上清液(Reinherz，1979)，分析了克隆对TFPI和CD4的表达。4903是针对Kunitz功能区I的，而4904针对Kunitz功能区II。如上所述，每个样品用105个细胞进行分析，用细胞系531作为对照。
如图9所示，细胞表面既能表达TFPI1-276-CD4也能表达TFPI1- 183-CD4。8.束缚在细胞表面的TFPI1-183-CD4和TFPI1-276-CD4能与FXa结合
为了测定以此方法束缚于细胞表面的TFPI是否保持其FXa结合活性，采用了如下的结合试验：
通过以PBS，5mM EDTA在37℃处理10分钟，分离出被稳定转染的DAP.3细胞。以过量PBS，0.1％ BSA(w/v)洗细胞之后，将100μl中的2.5×105个细胞同递增浓度的FXa在37℃共温育1小时。
然后洗细胞2次，在冰浴上用100μl 10μg/ml的兔抗-人FXa免疫球蛋白(RAFX-IG，Enzyme Research Laboratories)再共温育30分钟。再洗2次之后，将细胞同FITC-标记的猪抗兔多克隆免疫球蛋白共温育30分钟，并借助于流式细胞仪分析。
如图10中所示，在细胞表面表达TFPI1-276-CD4和TFPI1-183-CD4的DAP.3细胞，以剂量-依赖性方式强烈地结合FXa(图10)，在0.02nM就可检测到显著的结合。在全长TFPI-CD4和截短的TFPI-CD4之间，未发现对FXa结合有任何差异。
还可能用多克隆抗-TFPI免疫球蛋白组分(4901)或者用单克隆4903和4904阻断对FXa的结合。
在冰浴上将细胞同递增浓度的4901，4903或4904共温育30分钟，用抗-血红蛋白抗血清(Dakopatts)作阴性对照。然后在PBS，0.1％ BSA中洗细胞2次，同5nM FXa 37℃共温育1小时。然后再洗细胞，如上述同RAFX-IG共温育，并通过FACS法分析FXa的结合。
与同无关的抗-血红蛋白多克隆对照共温育的细胞相比较，在10μg/ml和80μg/ml多克隆4901下FXa对TFPI1-276-CD4的结合分别降低了27％和55％(图11A)。还发现对于同4901预温育的TFPI1- 183-CD4细胞FXa的结合降低了(图11B)。
与同种型-匹配的小鼠免疫球蛋白相比较，当用4903或4904阻断TFPI1-276-CD4时，在40μg/ml mAb下观察到FXa结合降低了33％(图12)。在mAb4903和4904之间未发现其阻断活性的的差异。
这首次证明，当作为膜结合的融合蛋白被表达时，TFPI仍保持其Fxa结合活性。9.TFPI1-183-CD4和TFPI1-276-CD4都具有抗FXa功能活性
为了测定束缚于细胞表面的TFPI是否保持了其抑制FXa功能作用的能力，应用生色底物N-a-Z-D-Arg-Gly-Arg-PNA·2HCl(“S-2765”)(Quadratech)分析FXa的蛋白水解活性。
如前面所述分离出转染的DAP.3细胞，用过量的TBS，pH7.4，0.1％BSA洗4次。每孔加入0.5×106个细胞(在100μl)，与不同浓度的Fxa在37℃共温育1小时。加入50μl 4mM S-2765，在37℃再温育2小时。每30秒测定一次OD405值，确定达到OD405＝0.1所需的时间，表明仍具有FXa活性。
所表达的TFPI-CD4以剂量依赖性方式抑制了FXa活性，发现加入低浓度FXa(0.16nM)时具有最大的抑制作用(图13)。在一系列实验中，未观察到在表达TFPI1-183-CD4或TFPI1-276-CD4的细胞之间，FXa抑制作用的任何显著的差异。
因此，当束缚于细胞表面不论在TFPI1-183-CD4还是在TFPI1-276-CD4表达细胞表面，Kunitz功能区II仍保持有功能作用。10.TF1-129/FVIIa复合物的结合作用与Kunitz第III功能区的存在无关
组织因子和因子VIIa的结合可用于证实Kunitz功能区I是否也保持有功能作用。
分别在E.Coli和CHO-K1中产生了重组人TF1-129和FVIIa(O′Brien，1994)。以等摩尔浓度将它们混合，并在25℃温育15分钟，获得TF1-129/FVIIa复合物。
按标准方法制备了兔抗-人TF多克隆免疫球蛋白。
将表达TFPI1-276-CD4或TFPI1-183-CD4的DAP.3细胞同5nMFXa在37℃共温育1小时。洗细胞2次，并将TF1-219/FVIIa复合物加入到100μl的2.5×105个细胞中。在37℃温育1小时之后，洗转染子2次，并在冰浴上同50μl兔抗-TF多克隆免疫球蛋白(2.5μg/ml)共温育30分钟，随后洗2次，然后同FITC标记的猪抗兔免疫球蛋白共温育。借助于流式细胞术仅对阳性细胞进行分析。
TF1-219/FVIIa可同等有效地与TFPI1-276-CD4(图14A)和TFPI1 -183-CD4(图14B)结合，而完全没有检出有对对照细胞系531的结合。
为了证实TF1-219/FVIIa复合物对Kunitz功能区I的特异性结合，可通过用1.5-丹磺酰-Glu-Gly-Arg-氯甲基酮，二盐酸化物(“1，5-DNS-GGACK·HCl”)预温育使FVIIa失活。此抑制剂结合于FVIIa的活性位点，抑制它对TFPI的结合，而不影响形成TF1-219/FVIIa复合物(Bajaj，1992)。
首先将FVIIa用100倍摩尔过量的1，5-DNS-GGACK·HCl在20℃共温育18小时，并借助于离子交换层析再次纯化。将活性位点受抑制的FVIIa(FVIIai)同等摩尔浓度的TF1-219在25℃共温育15分钟，然后加到100μl的2.5×105个细胞中。随后的步骤同上所述。
如从图14可以看出，同具有结合“活性的”TF1-219/FVIIa相比较，TF1-219/FVIIai复合物对TFPI-CD4表达细胞的结合显著地减少了。在以TFPI1-276-CD4或TFPI1-183-CD4转染的DAP.3之间未见有任何差异。
因此，当在TFPI1-183-CD4和TFPI1-276-CD4中束缚于细胞表面时，Kunitz功能区I也保持其功能作用。所以显然，束缚在细胞表面的TFPI是作为一个整体发挥其功能活性。11.在IPEC上表达的TFPI-CD4可结合相关的人凝血因子和猪TF
如在图18中所示，可在IPEC上表达TFPI-CD4融合蛋白并保持有结合FXa和FVIIa的能力。为了证明TFPI可同猪TF发生物理性相互作用，采取了应用可溶性人TF的竞争性抑制法。如图19A中所示，与TF-阴性对照转染子(没有用IL-1α激活的)的结合相比较，存在饱和浓度的FXa和FVIIa时，可溶性人TF对TFPI-转染的IPEC(用IL-1α预处理的)的结合显著地降低了。这表明猪TF在同可溶性人TF竞争VIIa，并因此竞争对TFPI的结合。图19B显示的结果支持了这点，如果将这些转染子同递增浓度的抗猪TF抗体共温育，则可溶性人TF对TFPI-CD4转染的IPEC(用IL-1α预激活的)的结合增加了。这种抗体的作用可反映出对猪TF和FVIIa之间或者猪TF-VIIa复合物和TFPI-CD4之间相互作用的抑制。二种方法的结果都提示，在IPEC表面表达的TFPI-CD4融合蛋白可同猪TF-FVIIa发生物理性相互作用。12.在IPEC上表达的TFPI-CD4可抑制TF-依赖性血纤维蛋白的形成
图20A显示图解说明TFPI-CD4转染的IPEC前凝血剂表型的单个代表性实验的结果。与对照的IPEC相比较，在转染的细胞上存在融合蛋白质时，相应延长了凝血时间。但是，只有当使用TF-阴性IPEC时，在IL-1α激活-RFPI-CD4表达对凝血时间没有影响之后，才能观察到这种作用。因此，如所预料的，TFPI-CD4抑制了TF-依赖性血纤维蛋白的形成，但不抑制TF-无关的血纤维蛋白形成。在预温育步骤中以递增浓度使用抗TFPI抗体，能够使凝血时间正常化返回到用未转染的IL-1α激活的对照IPEC所看到的时间(图20B)，表明存在转染细胞时凝血时间的延长，完全是由于TFPI的特异性抑制作用。13.在细胞膜表达蛋白C激活物
为了表达含有从Agkistrodon Contortrix Contortrix毒液中分离出的蛋白C激活物的异源性构建物(McMullen，1989；Kisiel，1987)，合成了编码此蛋白质的cDNA。该蛋白质的序列是如下<SEQID 16>：
V I G G D E C N I N E H R F L A L V Y A N G S L C G
G T L I N Q E W V L T A R H C D R G N M R I Y L G M
H N L K V L N K D A L R R F P K E K Y F C L N T R N
D T I W D K D I M L I R L N R P V R N S A H I A P L
S L P S N P P S V G S V C R I M G W G T I T S P N A
T L P D V P H C A N I N I L D Y A V C Q A A Y K G L
A A T T L C A G I L E G G K D T C K G D S G G P L I
C N G Q F Q G I L S V G G N P C A Q P R K P G I Y T
K V F D Y T D W I Q S I I S G N T D A T C P P
根据猪密码子的应用倾向性(它至少适合于绝大多数哺乳动物细胞)，合成了如下单健DNA<SEQ ID 17>：
GTG ATC GGC GGC GAC GAG TGC AAC ATC AAC GAG CAC CGC
TTC CTG GCC CTG GTG TAC GCC AAC GGC AGC CTG TGC GGC
GGC ACC CTG ATC AAC CAG GAG TGG GTG CTG ACC GCC CGC
CAC TGC GAC CGC GGC AAC ATG CGC ATC TAC CTG GGC ATG
CAC AAC CTG AAG GTG CTG AAC AAG GAC GCC CTG CGC CGC
TTC CCC AAG GAG AAG TAC TTC TGC CTG AAC ACC CGC AAC
GAC ACC ATC TGG GAC AAG GAC ATC ATG CTG ATC CGC CTG
AAC CGC CCC GTG CGC AAC AGC GCC CAC ATC GCC CCC CTG
AGC CTG CCC AGC AAC CCC CCC AGC GTG GGC AGC GTG TGC
CGC ATC ATG GGC TGG GGC ACC ATC ACC AGC CCC AAC GCC
ACC CTG CCC GAC GTG CCC CAC TGC GCC AAC ATC AAC ATC
CTG GAC TAC GCC GTG TGC CAG GCC GCC TAC AAG GGC CTG
GCC GCC ACC ACC CTG TGC GCC GGC ATC CTG GAG GGC GGC
AAG GAC ACC TGC AAG GGC GAC AGC GGC GGC CCC CTG ATC
TGC AAC GGC CAG TTC CAG GGC ATC CTG AGC GTG GGC GGC
AAC CCC TGC GCC CAG CCC CGC AAG CCC GGC ATC TAC ACC
AAG GTG TTC GAC TAC ACC GAC TGG ATC CAG AGC ATC ATC
AGC GGC AAC ACC GAC GCC ACC TGC CCC CCC
使此单链DNA对互补的寡核苷酸退火，得到双链分子。在此双链DNA的二端包括有限制性位点，CD4锚定器和P-选择素信号序列以类似于前面所述的方式与这些位点相连接。如前面所述，将所形成的分子连接进入pHβActpr-1gpt载体。
作为DNA的另一种来源，可基于已知的蛋白质序列，对蛇cDNA文库进行筛选。14.TFPI-CD4和水蛭素-CD5的共表达可导致对TF-依赖性凝血和TF-无关的凝血的抑制
产生了表达TFPI-CD4和水蛭素-CD4的稳定转染子。如图21A中所示，此初级转染子表达了不同水平的水蛭素和低水平的TFPI。但是，尽管大多数转染子进行这种适度的表达，与对照相比较，这些细胞的前凝血剂表型显著地减少了(图21B)。在IL-1α激活的IPEC的细胞表面存在二种抗凝血分子，明显地延长了血浆凝结的时间至大约300秒钟，接近于被认为是再钙化人血浆自发凝结的时间。以抗-水蛭素和抗-TFPI抗体进行的阻断研究证实，这些双转染子的表型改变是由于所表达的水蛭素和TFPI对凝血的特异性抑制作用。
应该理解的是，上面仅以实施例的方式对本发明进行了描述，并且可能对其进行修改，而仍属于本发明的范围。参考文献(其内容在此被引用了)Bach.FH等，迟发性异种移植排异作用。今日免疫学1996；17(8)；379-384Bajaj SP等，钙结合和酶原激活时人因子IX蛋白酶功能区中抗体检测的
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进展1995；27：324-25。序列表(1)一般信息
(i)申请人：
   (A)名称：RPMS Technology Limited
   (B)街道：Commonwealth Building
   (C)城市：Du Cane Road
   (D)州：伦敦
   (E)国家：英国
   (F)邮编(ZTP)：W12 0NN
(ii)发明名称：凝血抑制作用
(iii)序列数：17
(iv)计算机可读形式
   (A)存储媒体类型：软盘720K
   (B)计算机：IBM PC兼容机
   (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
   (D)软件：PatentIn Ver 2.0/Microsoft Word 97
(v)目前申请数据：
   申请号：PCT/GB98/(2)SEQ ID NO：1信息
(i)序列特征：
   (A)长度：38个核苷酸
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述SEQ ID NO.1：cagtgtcgac ggatccatgg ccgtcatggc gccccga    37(2)SEQ ID NO：2信息
(i)序列特征：
   (A)长度：34个核苷酸
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述SEQ ID NO.2：gtcagtgtaa acaaccgccc aggtctgggt cagg            34(2)SEQ ID NO：3信息
(i)序列特征：
   (A)长度：36个核苷酸
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述SEQ ID NO.3：acccagacct gggcggttgt ttacactgac tgcacc          36(2)SEQ ID NO：4信息
(i)序列特征：
   (A)长度：37个核苷酸
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述SEQ ID NO.4：gacgctgcag aattcttgca ggtattcttc cgggatt         37(2)SEQ ID NO：5信息
(i)序列特征：
   (A)长度：24个核苷酸
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述SEQ ID NO.5：aattaggagg ttctggaggc tgca                       24(2)SEQ ID NO：6信息
(i)序列特征：
   (A)长度：16个核苷酸
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述SEQ ID NO.6：gcctccagaa cctcct                                16(2)SEQ ID NO：7信息
(i)序列特征：
   (A)长度：32个核苷酸
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述SEQ ID NO.7：tgtctgcagg aaccagaaga aggtggaatt ca              32(2)SEQ ID NO：8信息
(i)序列特征：
   (A)长度：28个核苷酸
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述SEQ ID NO.8：gtgggatccg cctggcctcg tgcctcaa                                    28(2)SEQ ID NO：9信息
(i)序列特征：
   (A)长度：53个核苷酸
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述SEQ ID NO.9：gtctgaaacg ctttctgaag aagatgccta gcccaatgaa aagcaggagg ccg        53(2)SEQ ID NO：10信息
(i)序列特征：
   (A)长度：42个核苷酸
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述SEQ ID NO.10：tgggctaggc atcttcttca gaaagcgttt cagacaaaaa ga                    42(2)SEQ ID NO：11信息
(i)序列特征：
   (A)长度：25个核苷酸
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述SEQ ID NO.11：gaccaggatc cggacaggtc tctta                                       25(2)SEQ ID NO：12信息
(i)序列特征：
   (A)长度：57个核苷酸
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述SEQ ID NO.12：catcgtcgac ggatcctaga tgatttacac aatgaagaaa gtacatgcac tttgggc    57(2)SEQ ID NO：13信息
(i)序列特征：
   (A)长度：26个核苷酸
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述SEQ ID NO.13：ggacctgcag aattcaaaaa ggctgg                                      26(2)SEQ ID NO：14信息
(i)序列特征：
   (A)长度：28个核苷酸
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述SEQ ID NO.14：agcctttttg aattccacgg tccctcat                             28(2)SEQ ID NO：15信息
(i)序列特征：
   (A)长度：31个核苷酸
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述SEQ ID NO.15：cattgctata acaactgcag atatttttaa c                         31
(2)SEQ ID NO：16信息
(i)序列特征
   (A)长度：231个氨基酸
   (B)类型：蛋白质
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(vi)来源：
   (A)生物体：Agkistrodon contortrix contortrix
(xi)SEQ ID NO：16序列描述Val Ile Gly Gly Asp Glu Cys Asn Ile Asn Glu His Arg Phe Leu Ala1               5                  10                  15Leu Val Tyr Ala Asn Gly Ser Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Gln
         20                  25                  30Glu Trp Val Leu Thr Ala Arg His Cys Asp Arg Gly Asn Met Arg Ile
     35                  40                  45Tyr Leu Gly Met His Asn Leu Lys Val Leu Asn Lys Asp Ala Leu Arg
 50                  55                  60Arg Phe Pro Lys Glu Lys Tyr Phe Cys Leu Asn Thr Arg Asn Asp Thr65                  70                  75                  80Ile Trp Asp Lys Asp Ile Met Leu Ile Arg Leu Asn Arg Pro Val Arg
             85                  90                  95Asn Ser Ala His Ile Ala Pro Leu Ser Leu Pro Ser Asn Pro Pro Ser
        100                 105                 110Val Gly Ser Val Cys Arg Ile Met Gly Trp Gly Thr Ile Thr Ser Pro
    115                 120                 125Asn Ala Thr Leu Pro Asp Val Pro His Cys Ala Asn Ile Asn Ile Leu
130                 135                 140Asp Tyr Ala Val Cys Gln Ala Ala Tyr Lys Gly Leu Ala Ala Thr Thr145                 150                 155                 160Leu Cys Ala Gly Ile Leu Glu Gly Gly Lys Asp Thr Cys Lys Gly Asp
            165                 170                 175Ser Gly Gly Pro Leu Ile Cys Asn Gly Gln Phe Gln Gly Ile Leu Ser
        180                 185                 190Val Gly Gly Asn Pro Cys Ala Gln Pro Arg Lys Pro Gly Ile Tyr Thr
    195                 200                 205Lys Val Phe Asp Tyr Thr Asp Trp Ile Gln Ser Ile Ile Ser Gly Asn
210                 215                 220Thr Asp Ala Thr Cys Pro Pro225                 230(2)SEQ ID NO：17信息
(i)序列特征：
   (A)长度：693个核苷酸
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述SEQ ID NO.17：gtgatcggcg gcgacgagtg caacatcaac gagcaccgct tcctggccct ggtgtacgcc 60aacggcagcc tgtgcggcgg caccctgatc aaccaggagt gggtgctgac cgcccgccac 120tgcgaccgcg gcaacatgcg catctacctg ggcatgcaca acctgaaggt gctgaacaag 180gacgccctgc gccgcttccc caaggagaag tacttctgcc tgaacacccg caacgacacc 240atctgggaca aggacatcat gctgatccgc ctgaaccgcc ccgtgcgcaa cagcgcccac 300atcgcccccc tgagcctgcc cagcaacccc cccagcgtgg gcagcgtgtg ccgcatcatg 360ggctggggca ccatcaccag ccccaacgcc accctgcccg acgtgcccca ctgcgccaac 420atcaacatcc tggactacgc cgtgtgccag gccgcctaca agggcctggc cgccaccacc 480ctgtgcgccg gcatcctgga gggcggcaag gacacctgca agggcgacag cggcggcccc 540ctgatctgca acggccagtt ccagggcatc ctgagcgtgg gcggcaaccc ctgcgcccag 600ccccgcaagc ccggcatcta caccaaggtg ttcgactaca ccgactggat ccagagcatc 660atcagcggca acaccgacgc cacctgcccc ccc                              693

Claims (20)

1.一种蛋白质，它包含一个具有抗凝血活性的区域，以及一个可以将此蛋白质锚定于细胞膜的区域。
2.权利要求1的蛋白质，另外还含有一个使此蛋白质不致在细胞表面组成型表达的定向序列。
3.权利要求1或2的蛋白质，其中的抗凝血区包括水蛭素序列，组织因子途径的抑制剂序列，蜱抗凝血肽序列，或蛋白C激活物序列。
4.权利要求1或2的蛋白质，其中的锚定区是一个能将此蛋白质附着于脂质双层的序列。
5.权利要求4的蛋白质，其中的锚定区包括来自膜蛋白的跨膜序列。
6.权利要求2的蛋白质，其中的定向序列是一种可以使新生的多肽定向进入分泌颗粒的序列。
7.权利要求6的蛋白质，其中所述的分泌颗粒直到细胞受到适合的刺激才能与细胞质膜融合。
8.权利要求7的蛋白质，其中的分泌颗粒是Weibel-Palade小体。
9.权利要求6的蛋白质，其中的定向序列是P-选择素的细胞质功能区。
10.上述权利要求中任何之一的蛋白质，其中的锚定序列是P-选择素的序列。
11.一种多核苷酸，它编码根据上述权利要求中任何之一的蛋白质。
12.一种载体，包含有权利要求11的多核苷酸。
13.一种传递系统，包括权利要求1-10中任何之一的蛋白质，权利要求11的多核苷酸，或权利要求12的载体。
14.一种以权利要求12的载体转染细胞的方法。
15.一种根据权利要求14转染的细胞。
16.包含有权利要求15的细胞的生物组织。
17.一种动物，包含有权利要求16的生物组织和/或权利要求15的细胞。
18.权利要求17的动物，其中该动物是转基因的猪或绵羊。
19.一种使组织或器官适合于移植的方法，包括在该组织或器官中的内皮细胞表面，表达权利要求1-10中任何之一的蛋白质。
20.一种移植方法，包括将权利要求16的生物组织从供体动物移植到受体动物体内。
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