KR101112713B1

KR101112713B1 - 인간 면역반응 조절인자(ｈＤＡＦ)와 인간 조직혈액응고 억제인자(ＴＦＰＩ) 기능부위와 ＣＤ4의 세포표면 부착부위와의 융합유전자(ｈＴＦＰＩ/ｈＣＤ4)를 조합 발현하는 단일 벡터 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR101112713B1
Application number: KR1020080055727A
Authority: KR
Inventors: 노현모; 이혜진; 백낙환
Original assignee: 인제대학교 산학협력단
Priority date: 2008-06-13
Filing date: 2008-06-13
Publication date: 2012-02-24
Also published as: KR20090129681A

Abstract

본 발명은 바이오 장기용 돼지 개발을 위한 조합 벡터에 대한 것으로, 더욱 상세하게는 돼지 조직이나 세포가 사람에게 이식되었을 경우 급성면역 거부반응을 효과적으로 억제하기 위해서 초기에 인간 면역반응 조절인자인 hDAF(human decay accelerating factor)를 다량 발현시키고, 인간 조직혈액응고 억제인자인 hTFPI(human tissue factor pathway inhibitor)의 전반부 작용부위와 hCD4(human cluster differentiation factor 4)의 후반부 세포표면 부착부위가 융합되어서 다량의 TFPI/CD4가 돼지세포에만 부착되도록 설계 제작되어서, 인간혈청에 의한 돼지조직 및 세포의 괴사가 억제되고 돼지조직 미세혈관의 혈액응고 현상을 억제하여, 돼지 장기를 사람에게 이종이식 하더라도 매우 유용하게 이용할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

인간 면역반응 조절인자(hDAF), 인간 조직혈액응고 억제인자(TFPI) 기능보유 전반부, CD4의 부착기능 후반부, 융합유전자(hTFPI/hCD4),돼지세포 표면 부착

Description

인간 면역반응 조절인자(ｈＤＡＦ)와 인간 조직혈액응고 억제인자(ＴＦＰＩ) 기능부위와 ＣＤ4의 세포표면 부착부위와의 융합유전자(ｈＴＦＰＩ/ｈＣＤ4)를 조합 발현하는 단일 벡터 및 그 제조방법{Single vector for the expression of human decay accelerating factor(DAF) and the fused protein of the fuctional domain of human tissue factor pathway inhibitor(TFPI) and the adhesive domain of cluster differentiation factor 4(CD4) and procass making there of}

본 발명은 돼지 세포에서 인간 면역반응 조절인자(hDAF)을 효율적으로 발현시키고, 조직혈액응고 억제인자(TFPI)를 세포표면에만 효과적으로 부착시키고자 제조한 조합 발현 벡터에 관한 것이다.

돼지의 장기를 사람에게 이식시키기 위해서는 돼지조직에 대한 거부반응을 억제하는 효율적인 면역억제제를 개발하거나, 급성면역반응에 관여하는 유전자를 조작한 돼지의 조직 및 장기를 이식하거나, 또는 조직혈액응고 경로를 효과적으로 차단하는 방법이 강구되어야만 한다. 지금까지 이와 같은 면역억제제 또는 급성면역을 억제하는 조직 또는 장기이식 기타 혈액응고차단방법에 있어서 만족스러운 결과를 얻지 못한 실정이다.

예컨대, 인체 장기와 기능적 구조적 유사성이 높은 돼지 장기의 이종이식 시 급성 면역거부반응을 제어하는 기술로는, 돼지 세포의 표면에 존재하는 Gal α (1,3) Gal 항원(일명 galactose 항원)을 인식하는 인간 항체의 반응을 제어하기 위해서 이러한 항원을 합성하는 α 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제(α 1,3-galactosyltransferase)가 넉아웃(knock-out)된 돼지를 생산하거나(Polejaeva I.A., et al., Nature, 407, p86, 2000; Lai L., et al., Science, 295, p1089, 2002; Phelps C.J. et al., Science, 299, p411, 2003) 또는, H-트랜스퍼라아제를 발현하여 돼지 세포 표면에 H 항원의 수준을 증가시켜 α 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제에 의한 효과를 약화시키거나(Sandrin M.S. et al., Nat. Med., 1, p1261, 1995), 이 밖에 돼지세포에 인간 보체 조절 단백질(hCRP)을 도입한 형질전환 돼지의 인간 혈청에 대한 세포용해를 억제하는 연구가 진행되어 왔을 뿐이다(Morgan B.P., Immunol. Today, 16, p257, 1995; Cozzi E., et al., Transplantation, 64, p1383, 1997; Diamond L.E., Transplantation, 71, p132, 2001; Fodor W.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 91, p11153, 1994; McCurry K.R. et al., Nat. Med., 1, p423, 1995).

최근에는 인간 보체 조절 단백질과 H-Transferase, 넉아웃 GGTA1 등이 조합된 상태의 돼지 세포 또는 조직을 통한 면역거부반응 억제 연구결과가 개시되었다(Zhou C.Y., et al., Xenotransplantation. 12, p142, 2005; Charreau B. et al., Transplantation. 58, p1222, 1994; Huang J. et al., FEMS. Immunol. Med. Microbiol., 31, p203, 2001; Costa C., et al., Xenotransplantation, 9, p45, 2002; Cowan P.J. et al., Transplantation, 69, p2504, 2000; van Denderen B.J., et al., Transplantation, 64, p882, 1997).

그러나, 상기 각각 하나의 인간 보체 조절 단백질들(hDAF, hMCP, hCD59)과 H-트랜스퍼라아제(H-Transferase)로 형질 전환된 돼지 세포의 급성 면역거부반응의 억제 효과는 큰 효과를 거두지 못하였고, 또 aGal double 넉아웃된 돼지의 심장을 배분원숭이에 이식하여 지속적으로 조사한 결과, 조직의 미세혈관에서 혈액응고 현상(microvascular thrombosis)이 일어나 결국 돼지 심장조직은 괴사하였는데, 이런 현상은 조직혈액응고경로 과정이 작동되어 일어난 것으로 추정되고, 아마도 TFPI가 이런 응고현상을 예방할 것으로 예측된 바 있다(Cooper D.K., et al.,Transplantation, 84, p1, 2007; Cowan P.J., Xenotransplantation, 14, p7, 2007).

본 발명은 상기와 같은 공지되고 개시된 선행기술을 감안하여 돼지 세포에서 인간 면역반응 조절인자(hDAF)을 효율적으로 다량 발현시킬 목적으로, 도 1에 도시한 바와 같이 상기 인간 면역반응 조절인자(hDAF)을 2개의 프로모터(promoter) 뒤에 배치시키고, hTFPI의 행동을 제한하기 위해 혈액응고 억제기능을 가진 인간 조직혈액응고 억제인자(hTFPI)의 전반부(K1 및 K2 도메인)와 hCD4의 세포표면 부착부위인 C-terminal 부위(D3 및 D4 도메인)가 융합된 융합유전자(TFPI/CD4)(Riesbeck K,. et al, Thromb Haemost. 78, p1488, 1997; Chen D., et al, Transplantation, 68, p832, 1999)를 제작하여서 돼지세포 표면에만 위치하도록 한 동일한 하나의 벡터를 제공하고, 이러한 벡터로 형질전환된 돼지세포는 인간혈청에 의한 괴사를 억제하고, 인간 조직혈액응고 억제인자(hTFPI)가 돼지세포 표면에만 발현되는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 면역반응의 첫 단계에 보체작용을 조절하는 인간 면역반응 조절인자(hDAF)을 돼지세포 표면에 다량으로 발현시켜 인간혈청에 의한 급성괴사를 예방하는데 있다. 본 발명의 다른 목적은 인간 조직혈액응고 억제인자(TFPI)의 행동반경을 제한하여 돼지세포 표면에만 위치시켜, 인간항체의 돼지세포 공격과 조직미세혈관 혈액응고현상을 예방하는 돼지세포를 제공하는데 있다.

본 발명은 돼지세포에서 효율적으로 인간 면역반응 조절인자(hDAF)과 조직혈액응고 억제인자(TFPI)를 발현시켜 돼지세포 표면에 위치시키는 동일한 벡터를 이용하여 조합 발현하는 벡터를 제공하는 효과가 있다.

또한, 본 발명의 벡터는 pLPC-pLTR/pCMVIE-hDAF-pSV40-GFP-pCMVIE-hTFPI/hCD4를 포함하며, 부족한 인체 장기 이식의 수요에 대처하기 위하여 돼지-인간간 이종이식에서 발생하는 인간 혈청에 의한 돼지 세포 또는 조직면역거부반응 및 조직혈액응고반응을 억제하기 위하여 다량의 인간 면역반응 조절인자(hDAF)과 인간 조직혈액응고 억제인자(hTFPI)가 돼지세포 표면에 동시에 발현되는 벡터로 형질 전환된 돼지세포는 인간혈청에 의한 돼지세포 괴사를 억제시키고, 돼지장기의 미세혈관에서 혈액응고현상을 예방하고, 급성 면역거부반응에 의한 돼지세포의 괴사를 억제하며, 나아가, 본 발명의 벡터로 형질 전환된 돼지장기를 인간에게 이종이식하더라도 인체 내에서 급성조직면역 거부반응과 조직미세혈관에서 혈액응고 현상이 억제되어 이종장기이식에 유용하게 이용할 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로 의료산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

삭제

이하, 본 발명의 구성을 설명한다.

본 발명의 상기 목적과 효과는, 돼지세포에서 인간항체와 면역반응과정의 초기 억제인자인 인간 면역반응 조절인자(hDAF)과, 조직혈액응고 과정을 억제시키는 인간 조직혈액응고 억제인자(hTFPI)를 돼지세포 표면에만 위치시키는 융합단백질(hTFPI/hCD4)을 조합하여 돼지항원과 인간항체의 급성면역반응을 억제시키고 이식된 돼지조직의 미세혈관조직의 혈액응고를 예방할 수 있는 조합발현 벡터를 제공함으로써 달성하였다.

이하에는 본 발명의 구체적인 구성을 실시예와 실험예를 들어 도면과 함께 상세히 설명한다.

이종이식의 경우, 보체 활성화 단백질들의 연쇄적인 반응에 의해 활성화된 보체는 숙주세포의 막에 결합하여 급성면역거부반응을 유도함으로써 이종이식의 결정적인 장애로 작용한다. 한편, 인간 혈액 속에는 상기한 보체의 활성화를 억제하는 단백질들(DAF, MCP, CD59)이 있는데, 이들은 모두 세포표면에 위치한다. 따라서, 본 발명자들은 이들 유전자를 돼지세포에 형질 전환하여 인간 면역반응 조절인자들을 발현시킴으로서 보체반응을 억제하는 연구를 진행하였다.

본 발명에서 이용하는 인간 면역반응 조절인자인 hDAF(human decay accelerating factor)는 보체반응경로에서 C2와 C4b의 결합을 방해함으로서 보체의 활성화를 억제하며, 면역반응의 조절에서 초기의 조절작용에 관여하는 것으로 알려져 있다. MCP(membrane cofactor protein)는 C4b 분해를 촉진하여 보체가 숙주세포에서 활성화되는 것을 억제하며, CD59 (human cluster differentiation factor 59)는 C7, C8과 C5b6의 결합을 방해함으로서 MAC의 형성을 억제한다. 또한 aGal double 넉아웃된 돼지 심장을 영장류인 배분 원숭이에 이식하였더니 돼지조직의 미세혈관에 혈액 응고현상이 일어나 돼지조직이 괴사함을 발견하였고, hTFPI가 돼지조직에 발현되면 희망이 보일 것이라 예측하였다. 이에 따라 본 발명자들은 인간의 혈액응고 인자(hTFPI)가 다량 발현되어 자유로이 떠돌아다니면 또 다른 문제를 유발시킬 수 있기 때문에 돼지세포 표면에만 위치하도록 하기 위해 CD4의 후반부가 세포표면에 부착하는 성격을 이용하여 혈액응고기능을 갖는 hTFPI의 전반부와 hCD4의 후반부로 구성된 hTFPI-hCD4 융합유전자를 구축하여 본 발명의 단일 벡터에 포함시켰다.

본 발명에서는 특히 인간 면역반응 조절인자인 hDAF를 2개의 프로모터 뒤에 위치시켜 돼지세포에서 다량발현을 유도했고, 인간 조직혈액응고 억제인자(hTFPI)의 기능인 응고억제 기능을 돼지세포표면에만 위치하도록 하는 hTFPI-hCD4 융합유전자를 동일 벡터에서 발현되도록 한 pLPC-pLTR/pCMVIE-hDAF-pSV40-GFP-pCMVIE-TFPI/CD4 벡터를 제작하였다(도 1).

본 발명의 인간 면역반응 조절인자(decay accelerating factor, hDAF), 조직혈액 응고억제인자(tissue factor pathway inhibitor, TFPI) 및 CD4(human cluster differentiation factor 4)는 인간혈액으로부터 추출한 RNA를 RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)하여 hDAF, hTFPI, hCD4의 cDNA(complementary DNA)를 합성하고, 이어서 primer design 방법으로 제한효소인지부위 및 적절한 프로모터 서열을 넣고, PCR로 dsDNA 유전자를 제작하였다. 먼저, 클로닝 벡터 pLPCX에서 virus package signal을 제거한 pLPC의 두 개의 프로모터, pLTR(long terminal repeat)/pCMVIE(cytomegalovirus immediate early 전사조절부위), 뒤에 hDAF 유전자를 삽입하여 돼지세포의 표면에 다량의 hDAF 단백질이 존재하도록 하였다. 그리고 시계방향으로 다음 위치에 pSV40-GFP(green fluorescence protein) 표지유전자를 삽입하였다. 그 다음에, hTFPI 유전자의 혈액 응고억제기능이 있는 hTFPI DNA의 전반부와 세포표면에 부착기능이 있는 hCD4의 후반부 hCD4 DNA를 Pst 1의 링커를 이용하여 두 DNA를 융합한 다음 pCMVIE 뒤에 삽입하였다.

본 발명의 상기 벡터를 이용하여 돼지세포를 형질전환시킬 경우, 본 발명의 벡터가 가진 조합된 인간 면역반응 조절인자(hDAF), 표지유전자(GFP) 및 세포표면에 부착된 조직혈액응고억제인자가 발현되었고(도 1 C), 인간혈청에 의해 형질전환된 돼지세포의 괴사가 억제되었으며(도 2), hTFPI가 세포표면에 위치함을 확인할 수 있었다(도 3 및 도 4).

본 발명의 바람직한 기술적 구성을 하기의 실시예 및 실험예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명의 바람직한 예시일 뿐, 당업자가 용이하게 변경하여 실시할 수 있다 할 것이므로 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에만 제한되지는 않음은 물론이다.

실시예 1: pLPC-pLTR/pCMVIE-hDAF-pSV40-GFP-pCMVIE-TFPI/CD4 발현 벡터 제작

1-1. 실험 재료

본 발명에서 사용한 제한효소(Age 1, Bam H1, BsiW1, Pst 1, Sfi 1, Spe 1)는 NEB, 일반시약은 SIGMA, 클로닝 벡터 pLPCX는 BD Biosciences Clontech, Lipofectamine은 Gibco-Invitrogene, MMLV 역전사 효소는 Promega, WST-1는 Roche, Chromogenic assay 는 Sigma에서 구입하여 사용하였다. 또 RNA는 Qiagen의 RNeasy mini kit를 사용하여 분리하였다.

1-2. 발현 벡터의 제작

본 발명 발현 벡터의 제작에 필요한 designed primers는 다음과 같다.

(1). pCMVIE-hDAF 클로닝에 사용한 프라이머(primer) 1:

Forward: 5'GGAACTAGTTATGGAGTTCCGCGTTACATAACT

Reverse: 5'GGACCGGTATGGCCTAACGAATTCCTTAAAGA

(2). pSV40-GFP 클로닝에 사용한 primer 2:

Forward: 5'ATCGTACGACGCGAATTTTAACAAAATATTAACG

Reverse:ATCGTACGCTTGCCCCAGCTGGTTCTTTCCGCCTC

(3). TFPI(K1-K2) region insert 준비에 사용한 primer 3:

Forward: 5'CCCAAGCTTCCAAGAACTTTCATCAGAGATTTTACTTAG

Reverse: 5'AACTGCAGTTCAAAAAGGCTGGGAACCTTGGTT

(4). CD4(D3-D4)region insert 준비에 사용한 primer 4:

Forward: 5'AACTGCAGAACCAGAAGAAGGTGGAGTTCAAA

Reverse: 5'CGGGATCCGTGGGATCTGCCTGGCCTCGTGCC

(5). TFPI/CD4 를 벡터에 클로닝에 사용한 primer 5:

Foward: 5'GGCCATTAAGGCCCCAAGAACTTTCATCAGAGATTTTACTTAG

Reverse: 5'GGCCGCCTCGGCCGTGGGATCTGCCTGGCCTCGTGCC

(6). hDAF 발현확인 primer 6:

Forward: 5'ATGACCGTCGCGCGGCCGAGCGTGC

Reverse: 5'CTAAGTCAGCAAGCCCATGGTTACT

(7). TFPI/CD4 발현확인 primer 7:

Forward: 5'ATGATTTACACAATGAAGAAAGTA

Reverse: 5'TCAAATGGGGCTACATGTCTTCTG

본 발명에서 hDAF, hTFPI, hCD4의 cDNA(complementary DNA)는 인간 혈액으로부터 추출한 RNA를 RT-PCR을 이용하여 합성하였다. RT(reverse transcription)는 Qiagen RNA extraction kit을 이용해 인간혈액에서 추출한 RNA를 이용하여: RNA 6 ul-5x Buffer 4 ul-dNTP 2 ul-RNasin 0.5 ul-Reverse transcriptase 1 ul-DDW 6.5 ul, 총 20 ul을 37℃에서 60분 배양하고, 이어서 95℃에서 5분간 배양하여서 반응을 중지시켰다.

PCR 조건: cDNA 3 ul-10x Buffer 2 ul-dNTP 1.6 ul-F/R primers 1 ul 각각의-Taq pol 0.5 ul-DDW 10.9 ul; 총 20 ul 반응 혼합물. PCR 조건: 95℃ 분, (95℃에서 30초 - 적절한 어닐링 온도에서 30초-72 extension 2분) x 30 사이클,이어서 마지막으로 7분동안 72℃.

본 발명에서 hDAF의 cDNA는 각각 클로닝 벡터 pLPC의 pCMVIE 프로모터 뒤에 위치한 Xho-EcoRⅠ 부위에 삽입하여 pLPC-hDAF를 제조하였다. pLPC-hDAF 벡터를 template로 하여 위에 기재한 primer 1 을 사용하여 pCMVIE-hDAF를 PCR한다.

이를 pLPC의 5' LTR (5' Long terminal repeat) 뒤의 SpeI-AgeI 부위에 삽입하여 pLPC-pLTR/pCMVIE-hDAF를 제조하였다. GFP로 형질 전환된 돼지세포주를 선별 하기 위해 pSV40-GFP를 pEGFP 벡터로부터 PCR(primer 2 사용) 한 후 pLPC-pLTR/pCM VIE-hDAF의 BsiWⅠ 부위에 클로닝하여 pLPC-pLTR/pCMV

IE-hDAF-pSV40-GFP 벡터를 제조 하였다. hTFPI 와 hCD4의 융합된 단백질 발현을 위해 primer 3, 4번을 사용하여 각각의 cDNA를 만들고 클로닝 벡터 pUC19의 HindⅢ- PstⅠ, PstⅠ-BamHⅠ 부위에 각각 삽입하여 pUC19-TFPI/CD4 벡터를 제조하였고 이 벡터를 template로 하여 primer 5 를 사용하여 pLPC-pLTR/pCMVIE

-hDAF-pSV40-GFP의 pCMVIE 와 3‘LTR 사이의 SfiⅠ부위에 삽입하여 최종적으로, 도1에 도시한 A지도를 가지는 pLPC-pLTR/pCMVIE-hDAF-pSV40-GFP-

pCMVIE-hTFPI/hCD4 벡터를 제조하였다.

한편, 본 발명 pLPC-pLTR/pCMVIE-hDAF-pSV40-GFP-pCMVIE-hTF

PI/hCD4 벡터의 확인을 위해 제한효소 SfiⅠ와 PstⅠ으로 벡터를 절단하여 도 1의 B와 같이 확인하였다. 상기 벡터를 가지고 돼지 세포를 형질 전환 시킨 다음 RNA를 추출하여 프라이머 6,7을 사용하여 발현여부를 도 1의 C와 같이 확인하였다.

[실험 1] pLPC-pLTR/pCMVIE-hDAF-pSV40-GFP-pCMVIE-hTFPI/hCD4 벡터로 형질 전환 된 돼지세포주의 인간 혈청에 대한 세포괴사 억제 효과조사

1-1. 숙주세포 및 인간 혈청의 준비

본 발명에서 숙주세포인 돼지 배아 섬유아세포는 임신 후 33일 된 Landrace 돼지의 태아로부터 분리하여 준비하였다. 머리와 내장을 제거한 태아를 항생제가 첨가된 PBS(phosphate buffer saline)로 3번 씻고 작은 조각으로 절편한 후 실온에서 30분 동안 0.05% 트립신-EDTA를 처리하였다. 그 후 10분 동안 3000 rpm에서 원심분리한 세포를 10% FBS를 함유한 DMEM에 풀어 준 후, 세포배양 디쉬에 플레이팅하고 37℃, 5% CO₂ 조직배양기에서 배양하였다. 또한 세포는 냉동배지(10% DMSO, 80% DMEM, 10% FBS)에 넣은 후 액체 질소에 냉동 보관하였다.

한편, 인간 혈청은 건강한 기증자로부터 분리 및 추출하였다. 채취한 혈액을 실온에서 2시간 동안 방치 후 3000rpm에서 10분 동안 원심분리한 후 상층액을 실험에 사용하였다.

1-2. 본 발명의 벡터로 형질 전환된 돼지세포주의 인간 혈청에 대한 세포괴사 억제 효과조사

본 발명에서 형질전환된 돼지 배아 섬유아세포를 수득하기 위하여, 상기 실시예 1에서 준비한 벡터들을 리포펙타민(lipofectamine, Gibco-Invitrogene)을 이용하여 상기 실험1-1에서 준비한 돼지 배아 섬유아세포에 형질전환하고 14일 후 FACS(fluorescence activated cell sorter)를 이용하여 GFP 표지색을 띠는 세포들만 선별하였다.

형질전환된 돼지 배아 섬유아세포(1-2 x 10⁵ cells/well)를 37℃ 에서 24시간 동안 상기 실험1-1에서 준비한 인간 혈청 0%, 10%, 20%, 30%, 40% 및 50%으로 각각 처리하고, WST-1(Roche)시약을 넣고 37℃에서 4시간 동안 더 처리한 후 파장 450 nm 에서 scanning multi-well spectrophotometer (Molecular Devices)을 이용하여 흡광도를 측정함으로서 세포의 생존율을 측정하였다.

상대적인 세포의 생존성은 50%의 인간 혈청으로 처리했을 때 0%로 간주하였다. 생존율은 (인간혈청을 처리한 것의 흡광도/인간 혈청을 처리하지 않은 것의 흡광도) × 100으로 측정하였다.

상기 실험은 여러 번 수행하여 얻은 결과로, 도 2 에서 확인되는 바와 같이 pLPC-pLTR/pCMVIE-hDAF-pSV40-GFP-pCMVIE-hTFPI/hCD4(도 2의 transformed pig cell)로 형질전환된 돼지세포는 50% 인간 혈청으로 처리한 경우에 대조군(control pig cell)과 비교하여 80% 정도가 살아있음을 확인할 수 있었다. 이는 이종이식시에 인간 혈청에 대해 효과적으로 급성 면역거부반응을 억제할 수 있다는 의미로서, 장기적으로 더 효율적인 이식용 장기의 생산에 기여할 수 있는 것으로 나타났다.

[실험 2] pLPC-pLTR/pCMVIE-hDAF-pSV40-GFP-pCMVIE-hTFPI/hCD4 벡터로 형질 전환된 돼지세포주의 TFPI(조직혈액 응고억제인자) 위치 확인

본 발명에서 TFPI 위치 측정은 Immunocytological stain 방법으로 실시하였다(J.Immunol. Methods 153:133-143 2001). 먼저 형질전환된 돼지 배아 섬유아세포(5 x 10⁴cells/well)를 6 well plate 내에 커버글라스를 깔고 배양 준비한다. CO₂ 인큐베이터에서 24 시간 배양하고, PBS로 세척하고, 고정액(PBS중 80% 메탄올)으로 30분간 상온에서 고정한다. 다시 PBS로 세척하고, 1% BSA-PBS를 넣고 1시간 놓아두었다가, Mouse Monoclonal Primary TFPI Ab(abcam)-1% BSA-PBS를 1시간 30분 처리하고, PBS로 다시 세척하고, TRIC 로 염색된 Goat secondary Ab against Mouse IgG 로 상온에서 1시간 반응시킨다. 다시 PBS로 세척하고, DAPI(300 ng/ml) 로 핵을 10 분동안 염색하고 다시 PBS로 세척하고 잠시 말린 다음 슬라이드에 올려 놓고 실링한 다음 현미경 관찰때까지 -20 ℃에 보관한다. 도 3은 대조군 세포의 경우이고, 도 4는 본 발명의 발현 벡터로 형질전환된 세포의 경우이다. TFPI가 형질전환된 세포면에 위치하고 있음이 확인되었다. Chromogenic assay method로 TFPI 활성을 측정하였는데 결과는 양성으로 나타났고, 그간의 여러 연구방법 및 결과들(Riesbeck K, et al, Thromb Haemost. 78, p1488,1997; Chen D., et al, Transplantation, 68, p832,1999)이 보편화되어 있어서 본 발명에서는 관련 도표를 특별히 적시하지 않고 생략하였다.

도 1은 본 발명의 발현 벡터의 맵(map)(A), 제한효소로 절단한 결과 (B), 및 발현을 확인한 결과를 보인 전기영동사진이다.

도 2는 본 발명의 벡터로 형질전환된 돼지 세포의 생존도를 대조군과 비교하여 나타낸 실험 결과이다.

도 3과 도 4는 각각, 대조군 세포와 본 발명 벡터로 형질전환된 돼지 세포에서 TFPI의 존재위치를 확인한 결과를 보인 그림이다.

Claims

인간 면역반응 조절인자(hDAF: human decay accelerating factor)가 pLPC 및 pLTR/pCMVIE 프로모터 뒤에 위치하고,

하기 프라이머(primer) 3, 4번 각각에 의해 제작된 인간 조직혈액응고 억제인자(hTFPI: human tissue factor pathway inhibitor)중 K1-K2 영역과 hCD4(human cluster differentiation factor 4)중 D3-D4 영역을 하기 프라이머 5번을 이용하여 클로닝시켜서 수득된 hTFPI중 K1-K2 영역과 hCD4중 D3-D4의 융합 유전자가 상기 hDAF보다 뒤에 위치하는 것을 특징으로 하는 pLPC-pLTR/pCMVIE-hDAF-pSV40-GFP-pCMVIE-hTFPI/hCD4 벡터:

프라이머 3:

Forward: 5'CCCAAGCTTCCAAGAACTTTCATCAGAGATTTTACTTAG

Reverse: 5'AACTGCAGTTCAAAAAGGCTGGGAACCTTGGTT;

프라이머 4:

Forward: 5'AACTGCAGAACCAGAAGAAGGTGGAGTTCAAA

Reverse: 5'CGGGATCCGTGGGATCTGCCTGGCCTCGTGCC;

프라이머 5:

Foward: 5'GGCCATTAAGGCCCCAAGAACTTTCATCAGAGATTTTACTTAG

Reverse: 5'GGCCGCCTCGGCCGTGGGATCTGCCTGGCCTCGTGCC.
삭제
삭제
청구항 1에 기재된 벡터로 형질전환된 돼지 세포.