KR101658163B1 - 만능 줄기세포-유래의 테라토마 형성 억제방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미분화 만능 줄기세포(undifferentiated pluripotent stem cells)로부터의 테라토마(teratoma) 형성 억제방법에 관한 것이다. 종래 테라토마 형성 억제방법 중 미분화 PSC에서 선별적 세포 사멸을 나타내는 화합물의 이용은 높은 효율에도 불구하고 예상치 못한 독성 또는 부작용이 있었으나, 본 발명의 방법은 미분화 PSC의 선택적 사멸을 위하여 어떠한 추가 화합물도 사용하지 않고 간단한 가시광선 조사(visual light exposure)만으로 미분화 PSC를 완전히 제거할 수 있다. 또한 종래 방법으로는 테라토마의 형성을 억제할 수 있는데 그쳤으나, 본 발명의 방법은 미분화 줄기세포를 100%의 효율로서 제거할 수 있어, 종래 해결하지 못한 미분화 줄기세포로부터의 테라토마 형성 및 종양형성의 가능성을 완전히 배제시킬 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 줄기세포는 테라토마 형성 및 종양형성의 가능성이 100% 배제된 바, 광범위한 임상 적용이 가능하고, 줄기세포 치료제로서의 빠른 시일 내의 상업화 및 임상 적용이 가능할 것이다.

Description

만능 줄기세포-유래의 테라토마 형성 억제방법{A Method for Inhibition of Pluripotent stem cell-derived Teratoma Formation}

본 발명은 만능 줄기세포-유래의 테라토마 형성 억제방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 광감작제(photosensitizer)의 선택적 광독성(Selective phototoxicity)을 이용한 만능 줄기세포(pluripotent stem cells)로부터의 테라토마 형성 억제방법에 관한 것이다.

테라토마 형성은 만능 줄기세포[PSCs (pluripotent stem cells): 배아줄기세포(embryonic stem cells, ESCs) 및 유도전분화성 줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPSCs)]의 특징 중 하나이며, 이는 줄기세포의 전분화능(pluripotency) 및 무제한 증식능력에 기인한다(1). 이러한 특징들로 인하여 이론상으로 인간의 신체에서 260여 가지 타입 이상의 세포가 만들어질 수 있으며, PSC는 퇴행성 또는 손상된 세포 타입을 대체하는 것을 목표로 하는 재생의학(regenerative medicine)을 위한 유망한 세포 소스(source)가 될 수 있다(2). 그러나, PSC로부터의 테라토마 형성은 PSC 기반 세포치료의 임상 적용을 지연시키는 심각한 기술적 장애로 남아있다(3, 4). 망막아종 단백질 (Rb protein)의 지속적 억제와 텔로머라아제의 높은 활성에 의해 야기되는 암세포의 증식능력과 PSC의 무제한 증식능력이 비슷한 양상을 보이고(6), 결국 분화과정 후 엄격한 분별과정을 통과하지 않은 미분화 PSC 또는 불완전 분화세포는 무종양(tumor-free) 세포치료에서의 고위험 요소가 될 수 있다.

그러나, 인간 PSC (hPSCs)의 동물모델(예컨대, 설치류)로의 이종이식(xenograft) 이후, 몇몇 예외가 있었지만(9, 10) 거의 테라토마 또는 종양 형성이 나타났다(7, 8). 최근 Doi 박사 연구팀에서는 영장류 모델에서 hPSCs의 지속된(extended) 분화가 테라토마 형성 위험을 감소시킨다는 것을 증명하였다(11). 이로써, 유세포분석에 의한 분화세포의 엄격한 선별(9, 10)이나 지속된 분화 방법(9, 14)을 통해 종양형성 위험을 충분히 피할 수 있다고 판단했다. 그럼에도, ESCs의 숙주(host) 의존성 종양형성 (hPSC의 동물모델로의 이종이식의 경우)을 고려하면(15), hPSC의 종양형성 위험성은 풀어야 할 과제로 남아 있고, 특히 많은 hPSCs 기반 세포 치료의 임상 실험이 여전히 진행되고 있다(16). 마우스 ESCs로부터 유도된 마우스 배아체(mouse embryonic body, mEB) 뿐만 아니라 분화를 유도한 기능성 세포들이 설치류 모델에 이식되었을 때 테라토마를 형성하였다는 보고가 있다(17-19).

따라서, 미분화 PSC로부터의 테라토마 형성 위험성을 감소시키기 위하여 항체 기반 선별적 제거(20, 21), 소분자 (22-24), 및 티미딘 키나아제(Thymidine kinase, TK) 자살 유전자와 소분자인 간사이클로비르(ganciclovir)의 적용(25)과 같은 많은 연구들이 이루어져 왔다. 이들 연구 중 미분화 PSC에서 선별적 세포 사멸을 유도하는 소분자의 이용은 높은 효율에도 불구하고 예상치 못하는 위험을 갖고 있다(23). 따라서 본 발명자들은 미분화 PSC의 선택적 사멸을 위하여 어떠한 소분자도 사용하지 않고 미분화 PSC의 완전한 제거를 시도하였다. 본 발명에서 제시하는 킬러레드(KillerRed)가 도입된 PSCs에 가시광선을 조사하여 선택적으로 광독성을 유도하는 방법은 PSCs 기반 세포 치료의 종양 형성 위험을 낮추는 효과적인 전략이 될 것이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 줄기세포 치료제로서 이용되는 만능(pluripotent) 줄기세포의 테라토마 형성 위험을 감소시킬 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 최초로 광감작제 단백질(photosensitizer protein)인 킬러레드(KillerRed)의 선택적 광독성(Selective phototoxicity)을 이용한 테라토마 형성 억제방법을 개발하였다. 본 발명의 방법으로써 PSC 기반 세포치료의 임상 적용의 심각한 기술적 장애인 테라토마 형성 또는 종양 형성에 대한 문제점을 해결할 수 있으며, 종래의 전형적인 자살유전자(예컨대, 티미딘 키나아제)의 도입과는 달리 추가적인 화합물을 사용하지 않고 간단한 광 조사(light exposure)만으로 미분화 줄기세포를 선택적으로 제거할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 만능 줄기세포(undifferentiated pluripotent stem cells)의 분화 유도 후 잔존하는 미분화 세포에 의해 야기되는 테라토마(teratoma) 형성 억제방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 만능 줄기세포를 이용한 허혈성 질환(ischemic disease) 치료를 위한 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 미분화 만능 줄기세포(undifferentiated pluripotent stem cells)로부터의 테라토마(teratoma) 형성 억제방법을 제공한다:

(a) (ⅰ) 광 조사(light exposure)에 의해 광독성(phototoxicity)을 나타내는 광감작 단백질(photosensitizer protein)을 코딩하는 핵산분자; 및 (ⅱ) 상기 핵산 분자에 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있고 미분화 줄기세포-특이적(undifferentiated stem cell-specific) 활성화되는 프로모터;를 포함하는 유전자 전달체를 만능 줄기세포에 도입시키는 단계;

(b) 상기 단계 (a)의 줄기세포의 분화를 유도하는 단계; 및

(c) 상기 단계 (b)의 줄기세포에 광 조사하여 미분화 줄기세포를 선별적으로(selectively) 제거하는 단계.

본 발명자들은 줄기세포 치료제로서 이용되는 만능(pluripotent) 줄기세포의 테라토마 형성 위험을 감소시킬 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 최초로 광감작제 단백질(photosensitizer protein)인 킬러레드(KillerRed)의 선택적 광독성(Selective phototoxicity)을 이용한 테라토마 형성 억제방법을 개발하였다. 본 발명의 방법으로써 PSC 기반 세포치료의 임상 적용의 심각한 기술적 장애인 테라토마 형성 또는 종양 형성에 대한 문제점을 해결할 수 있으며, 종래의 전형적인 자살유전자(예컨대, 티미딘 키나아제)의 도입과는 달리 추가적인 화합물(소분자)을 사용하지 않고 간단한 광 조사(light exposure)만으로 미분화 줄기세포를 선택적으로 제거할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

특정 기능적 세포로의 분화 유도 후 잔류된 미분화 만능 줄기세포(PSCs)로부터의 테라토마 형성 위험성은 PSCs 기반 세포 치료에 있어서 가장 중요한 기술적 장벽으로 생각되어 왔다. 특히, 미분화 PSCs를 선별적으로 제거하기 위하여 시도된 줄기세포-독성 소분자의 사용은 테라토마 형성을 감소시켰다. 그러나, 이러한 방법은 미분화 PSCs에 대하여 높은 효과를 나타내었음에도 불구하고 분화된 세포에 대하여 예상치 못한 독성 또는 부작용을 나타내었다. 본 발명자들은 가시광선 조사에 의해 광독성을 나타내는 인공 광감작 단백질인 킬러레드(KillerRed, KR)의 특성에 착안하여 본 발명의 테라토마 형성 억제방법을 고안하였다. 이로써, 전분화능이 유지되는 동안에만 조절가능하도록 KR을 발현하는 마우스 PSCs (KR-mPSCs)를 디자인하였다. 상기 KR-mPSCs는 분화를 유도한 경우 가시광선 조사에 의해 선별적 광독성을 나타내지 않는다. KR-mPSCs에서 높은 광독성 선별성으로 인하여, 가시광선 조사 후의 테라토마 형성이 성공적으로 억제되었다. 특히, KR-mPSCs에서 유래한 내피세포(ECs)는 인 비트로 및 인 비보에서 여전히 기능을 유지하였으며, 이는 KR 발현을 엄격히 조절하는 유전적 접근이 향후 안전한 PSCs 기반 치료에 있어 잔존한 미분화 PSCs에서 선택적으로 광독성을 유도하여 테라토마 형성을 억제하는 방법이 될 수 있음을 의미한다.

본 발명의 미분화 만능 줄기세포(undifferentiated pluripotent stem cells)로부터의 테라토마(teratoma) 형성 억제방법은 궁극적으로 세포치료시 테라토마(teratoma) 형성을 막을 수 있는 줄기세포를 제조하기 위한 방법으로써, 미분화 만능 줄기세포(undifferentiated pluripotent stem cells) 및 분화된 세포(differentiated cells)를 포함하는 세포 시료에서 미분화 줄기세포만을 특이적으로 제거하는 방법과 동일한 의미로 사용될 수 있다.

본 발명의 가장 큰 특징 중 하나는, 전분화능(pluripotent)이 유지되는 동안만 조절가능한 미분화 줄기세포-특이적(undifferentiated stem cell-specific) 또는 만능 줄기세포-특이적(pluripotent stem cells) 작동가능한(operable) 프로모터를 사용한다는 것이다. 상기 프로모터는 광감작 단백질을 발현하는 유전자 전달체가 미분화 만능 줄기세포에서만 발현되도록 디자인된 것이다.

본 발명이 적용되는 줄기세포는 줄기세포의 특성, 즉 미분화, 무한정 증식 및 특정세포로의 분화능을 갖는 줄기세포로서, 만능 줄기세포(pluripotent stem cells)이며, 예컨대 배아줄기세포, 유도만능줄기세포, 배아생식세포, 배아종양세포 및 성체줄기세포를 포함한다. 본 발명에 따르면, 상기 만능 줄기세포는 배아줄기세포 또는 유도만능줄기세포이다. 한편, 만능 줄기세포는 개개 형태의 단일 세포일 수 있지만, 만능 줄기세포의 응집체인 배아유사체 또는 배아체(embryonic body) 형태일 수 있다. 배아줄기세포는 배반포의 내부세포괴(ICM)로부터 유래되고, 배아생식세포는 5-10 주령의 생식융기(gonadal ridge)의 원시생식세포로부터 유래된다. 한편, 만능 줄기세포는 인 비트로에서 무한정 증식되며, 3종류의 모든 배아층(외배엽, 중배엽과 내배엽)으로부터 유래되는 다양한 세포로 분화될 수 있는 능력을 갖는다. 유도만능줄기세포는 비-전분화능 세포(예를 들면, 체세포)로부터 특정 유전자를 삽입하여 인공적으로 유래된 전분화능 줄기세포의 하나이다. 유도만능중기세포는 줄기세포 유전자 및 단백질 발현, 염색체 메틸화, 배가시간(doubling time), 배아체 형성, 테라토마 형성, 생존성 키메라 형성, 교잡성 및 분화성을 가지는 면에서 전분화능 줄기세포(예를 들면, 배아줄기세포)와 동일하다고 여겨진다.

본 발명의 테라토마 형성 억제방법에 대하여 상세히 설명하면 다음과 같다:

단계 (a): 유전자 전달체의 미분화 만능 줄기세포로의 도입

우선, (ⅰ) 광감작 단백질(photosensitizer protein)을 코딩하는 핵산분자 및 (ⅱ) 상기 핵산 분자에 작동적으로 결합(operatively linked)된 프로모터를 포함하는 유전자 전달체를 미분화 만능 줄기세포에 도입시킨다.

본 발명의 광감작 단백질은 광 조사(light exposure)에 의해 광독성(phototoxicity)을 나타내는 단백질로서, 상기 광 조사에 의해 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)을 생성함으로써 미분화 줄기세포의 사멸(apoptosis)을 유도한다. 예컨대, 상기 광감작 단백질은 킬러레드(KillerRed)(서열목록 제 1 서열)이다.

본 발명자들은 킬러레드(KillerRed, KR), 즉 560 nm의 가시광선 조사 시 활성 산소종(ROS)을 생성하는(27) 히드로충 색소단백질에서 유래한 인공 광감작 단백질(photosensitizer protein)을 미분화 PSC에서만 발현되도록 디자인한 만능(pluripotent) 특이 프로모터와 조합하여 PSCs에 도입하였다. 본 발명의 미분화 줄기세포 제거방법은 ROS 의존 방법으로서, 간단한 가시광선 조사만으로 KR을 발현하는 PSC만을 제거하고, KR-mESCs으로부터 분화된 내피세포(differentiated endothelial cells ECs)를 생존케 하고 기능도 유지하도록 하여 인 비트로 뿐 아니라 인 비보 상에서 기능할 수 있도록 할 수 있다. 중요한 것은, KR을 발현하는 마우스 PSCs를 가시광선 조사 후 동물에 적용하였을 때 가시광선을 조사하지 않은 동물군과는 달리 테라토마가 형성되지 않았으며, 특히 허혈성 마우스 모델에서는 KR-mPSC로부터 분화한 EC가 가시광선 조사 후에도 가시광선을 조사하지 않은 대조군과 유사하게 혈관재생에 효과적인 것으로 나타났다. 이러한 결과는 ‘숙주-의존적 종양형성 성향’을 극복하기 위하여 인간에 적용될 수 있음을 의미한다. 본 발명에서 제시하는 KR이 도입된 PSCs에 가시광선을 조사하여 선택적으로 광독성을 유도하는 방법은 PSCs 기반 세포 치료의 종양 형성 위험을 낮추는 효과적인 전략이 될 수 있다.

본 발명의 유전자 전달체에 포함되는 상기 광감작 단백질 코딩 뉴클레오타이드 서열은 상기 서열목록 제 1 서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함한다. 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.

한편, 상기 광감작 단백질은 미토콘드리아 타겟팅 서열(mitochondria targeting sequence, MTS) 또는 미토콘드리아 위치 서열(mitochondria localization sequence, MLS)인 서열목록 제 2 서열, 서열목록 제 3 서열, 또는 서열목록 제 2 서열 및 서열목록 제 3 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 미토콘드리아 내로 타겟팅(targeting)된다.

본 발명에서 사용되는 프로모터는 미분화 줄기세포-특이적(undifferentiated stem cell-specific)으로 활성화되는 프로모터로서, 줄기세포의 전분화능(pluripotent)이 유지되는 동안에만 활성화되도록 디자인되었다. 예컨대, 상기 프로모터는 EOS-C(3+) 프로모터 또는 EOS-C(4+) 프로모터이다. 본 발명에 따르면, 상기 프로모터는 EOS-C(3+) 프로모터(서열목록 제 4 서열)이다.

본 발명에 따르면, 만능 줄기세포에 도입되는 유전자 전달체는 (ⅰ) 서열목록 제 2 서열, 서열목록 제 3 서열, 또는 서열목록 제 2 서열 및 서열목록 제 3 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 미토콘드리아 내로 타겟팅(targeting)되는 서열목록 제 1 서열의 핵산 분자; 및 (ⅱ) 상기 핵산 분자에 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있고 동물세포에서 RNA 분자를 형성시키며, 미분화(undifferentiated) 줄기세포에서 활성화되는 서열목록 제 4 서열의 프로모터를 포함한다.

본 발명의 광감작 단백질을 효율적으로 발현시키기 위하여 상기 광감작 단백질의 코딩 뉴클레오타이드 서열 및 프로모터 서열은 적합한 발현 컨스트럭트(expression construct) 내에 존재하는 것이 바람직하다. 상기 발현 컨스트럭트에서, 상기 광감작 단백질의 코딩 뉴클레오타이드 서열과 프로모터 서열은 작동적으로 연결되는 것이 바람직하다.

실질적으로 상기 유전자 전달체는 (ⅰ) 광감작 단백질(photosensitizer protein)을 코딩하는 핵산분자, (ⅱ) 상기 핵산 분자에 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있고 동물 세포에서 RNA 분자를 형성시키는 프로모터, 및 (ⅲ) 동물세포에서 작용하여 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열을 포함하는 동물발현용 재조합 벡터이다(서열목록 제 5 서열).

본 발명에 있어서, 재조합 벡터에 결합된 프로모터는, 바람직하게는 동물세포, 보다 바람직하게는 포유동물 세포에서 작동하여 광감작 단백질 유전자의 전사를 조절할 수 있는 것으로서, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대, CMV (cytomegalo virus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터, 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터, 암세포 특이적 프로모터 (예컨대, TERT 프로모터, PSA 프로모터, PSMA 프로모터, CEA 프로모터, E2F 프로모터 및 AFP 프로모터) 및 조직 특이적 프로모터 (예컨대, 알부민 프로모터)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 용어 “작동적으로 결합된”은 핵산 발현 조절 서열 (예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 트랜스레이션을 조절하게 된다.

본 발명에서 상기 재조합 벡터는 적합한 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열(3’-비-해독화 부위)은 소성장 호르몬 터미네이터 또는 SV40 유래 폴리 아데닐화 서열를 포함하며 이에 한정되는 것은 아니다.

선택적으로, 상기 재조합 벡터는 리포터 분자 (예: 루시퍼라아제 및 β-글루쿠로니다아제)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 운반할 수 있다. 또한, 본 발명의 재조합 벡터는 선택 표지로서 항생제 (예: 네오마이신, 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신 등) 내성 유전자 (예: 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 (nptⅡ), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 (hpt), 등)를 포함할 수 있다.

본 발명의 발현 컨스트럭트 또는 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 유전자 전달체, 즉 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19, pET 등), 파지(예: λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명의 유전자 전달체를 줄기세포 내로 운반하는 방법은, CaCl₂ 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl . Acac . Sci . USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al., Proc . Natl . Acac. Sci . USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol . Biol ., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic . Acids Res ., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다.

단계 (b): 줄기세포의 분화 유도

이어, 상기 단계 (a)의 줄기세포의 분화를 유도한다.

상기 줄기세포는 ‘분화 자극’에 의해 특정세포(예컨대, 내피 세포)로 분화하게 되며, 이는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 무혈청 배지(Tropepe V et al., Direct neural fate specification from embryonic stem cells: A primitive mammalian neural stem cell stage acquired through a default mechanism. Neuron. 30:6578(2001)), VEGF, FGFs(fibroblast growth factors), Wnt 및 RA(retinoic acid)와 같은 모르포겐(morphogens)의 처리(Ying QL et al. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat Biotechnol. 21:183186(2003))에 의해 분화 할 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

줄기세포가 여러 종류의 세포로 분화할 수 있다는 것은 잘 알려져 있다. 예를 들면, 상기 만능 줄기세포는 세포 분화를 위한 조건하에서 내피 세포, 조혈 세포, 신경 세포, 베타 세포 (beta cell), 근육 세포, 간세포, 연골 세포, 상피 세포, 요로 세포 및 유사 세포로 분화하도록 유도된다. 줄기세포가 분화하기 위한 배지 조건 및 방법은 Palacios, et al., PNAS. USA, 92:7530-7537(1995), Pedersen, J. Reprod. Fertil. Dev., 6;543-552(1994), 및 Bain et al., Dev. Biol, 168:342-357(1995)에 개시되어 있다.

본 발명에 따르면, 부유 배양 조건에서 만능 줄기세포에서 내피세포로의 분화를 유도할 수 있다. 단계 (b)에서 사용되는 배지는 혈청을 포함하는 DMEM에 기초한다. 배지 및 배양에 대한 일반적인 설명은 R. Ian Freshney, Culture of Animal Cells, Alan R. Liss, Inc., New York (1984)에 기재되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

단계 (b)의 분화과정 동안 줄기세포는 Nanog 또는 Oct-4의 발현이 감소한다. 한편, 분화가 진행되는 동안 세 가지 생식층(germ layer)에서 전형적인 마커 유전자, 즉 외배엽의 fgf5, 중배엽의 brachyury, 및 내배엽의 sox17의 발현이 점진적으로 증가한다.

본 발명에 따르면, 상기 만능 줄기세포를 혈관 형성을 위한 내피 세포로 분화시키는 경우, 테라토마(teratoma)가 형성되지 않는 혈관 치료용 세포치료제로 사용할 수 있다.

단계 (c): 미분화 줄기세포의 선별적 제거

최종적으로 상기 단계 (b)의 줄기세포에 광 조사하여 미분화 줄기세포를 선별적으로(selectively) 제거한다.

본 발명에서 이용되는 광 조사 파장은 540 nm - 580 nm 파장 영역의 가시광선이다.

본 발명의 방법은 상기 미분화 줄기세포의 제거과정 이후, 분화된 세포(differentiated cells), 즉 살아있는 세포만을 분리하는 세포분리(cell sorting) 과정을 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 테라토마(teratoma) 형성이 억제된 줄기세포의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 허혈성 질환(ischemic disease) 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용된 용어 “허혈성 질환(ischemic disease)”은 조직손상, 허혈성 심장질환, 허혈성 심근경색, 허혈성 심부전, 허혈성 장염, 허혈성 혈관질환, 허혈성 폐질환, 허혈성 안질환, 허혈성 망막증, 허혈성 녹내장, 허혈성 신부전, 허혈성 뇌졸중 및 허혈성 하지질환, 신경 손상 질환 또는 조직손상 및 감염증과 관련된 허혈성 질환을 모두 포함하는 의미로서, 혈관 및 기타 조직이 손상되어 재생(regeneration)에 의한 혈관 및 조직의 회복이 필요한 질환을 포함한다.

신경 손상 질환은 운동 및 감각에 관여하는 신경이 손상되어 운동 및 감각을 포함하는 행동기능에 이상이 있는 질환을 의미하며, 이러한 질환은 뇌졸중(stroke), 알츠하이머병, 파킨슨병, 척추 손상 질환(spinal cord injury disease), 치매, 탈수초질환, 헌팅톤병 및 근위축성 척수측색경화증을 포함한다.

허혈성 혈관질환은 환경적 요인과 유전적 요인, 고혈압, 이상지혈증 과 같은 여러 요인이 복잡하게 관련되나, 직접적인 병인은 혈소판의 활성화와 이로 인한 혈전 생성에 따른 혈액 흐름의 방해 및 이에 의한 경색, 허혈이다.

또한, 본 발명에서 사용된 용어 "치료"는 1) 아직 허혈성 질환을 보유하고 있다고 진단되지 않았으나, 이러한 경향이 있는 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간에서 질병 또는 장애가 발생되는 것의 예방, 2) 허혈성 질환의 억제, 즉 발전의 억제, 및 3) 허혈성 질환의 경감을 의미한다. 구체적으로, 상기 약제학적 조성물을 치료학적으로 유효한 양으로 허혈성 질환의 치료가 필요한 대상(subject)의 손상부위에 투여할 경우, 주변 조직의 줄기세포를 혈관 내피 세포 또는 근육 세포로 분화시켜 손상된 혈관 및 근육 기능을 회복시키고 허혈성 질환을 치료할 수 있다. 한편, 상기 투여 대상은 인간을 포함하는 포유동물일 수 있다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

또한, 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 바람직하게는 진피 또는 피하 주입을 위한 주사제 형태로 제조된다.

본 발명의 약제학적 조성물은, 획기적으로 조직 또는 혈관 결함을 경감시키나 혹은 치료할 수 있는 세포치료제로서, 더욱이 자가 줄기세포를 이용하는 경우에는 면역학적으로도 매우 안전하다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 예컨대 0.001-1000 ㎎/㎏이다. 그러나, 유효 성분의 실제 투여량은 분화 및 증식하고자 하는 대상조직 세포의 양, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등 여러 관련 인자를 고려하여 결정할 수 있으며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 형태로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 미분화 만능 줄기세포(undifferentiated pluripotent stem cells)로부터의 테라토마(teratoma) 형성 억제방법에 관한 것이다.

(b) 종래 테라토마 형성 억제방법 중 미분화 PSC에서 선별적 세포 사멸을 나타내는 화합물(소분자)의 이용은 높은 효율에도 불구하고 예상치 못한 독성 또는 부작용이 있었으나, 본 발명의 방법은 미분화 PSC의 선택적 사멸을 위하여 어떠한 추가 화합물도 사용하지 않고 간단한 가시광선 조사(visual light exposure)만으로 미분화 PSC를 완전히 제거할 수 있다.

(c) 종래 방법으로는 테라토마의 형성을 억제할 수 있는데 그쳤으나, 본 발명의 방법은 미분화 줄기세포를 100%의 효율로서 제거할 수 있어, 종래 해결하지 못한 미분화 줄기세포로부터의 테라토마 형성 및 종양형성의 가능성을 완전히 배제시킬 수 있다.

(d) 본 발명의 방법에 의해 제조된 줄기세포는 테라토마 형성 및 종양형성의 가능성이 100% 배제된 바, 광범위한 임상 적용이 가능하고, 줄기세포 치료제로서의 빠른 시일 내의 상업화 및 임상 적용이 가능할 것이다.

도 1: KR을 발현하는 PS 세포 클론 구축. 도 1a는 EOS-C(3+) 프로모터 조절 하에 KR을 발현하는 마우스 PS 세포의 형질도입을 위한 벡터의 모식도이다. MLS : mitochondria localization sequence.
도 1b는 KR-mESCs를 mitotracker(200 μM)에서 45분간 처리한 후의 결과이다. DAPI 염색으로 인해 KR 발현(적색) 및 미토콘드리아(녹색)의 co-localization이 나타났다(스케일 바, 10 ).
도 1c는 KR-mESCs의 위상차(phase contrast) 이미지 및 적색 형광을 나타낸다.
도 1d는 EOS-C(3+)-KR 플라스미드가 도입된 리프로그래밍 가능한(reprogrammable) MEFs의 리프로그래밍 과정을 위상차(phase contrast) 형광 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 1e는 KR-miPSCs는 위상차(phase contrast) 이미지 및 적색 형광을 나타낸다.
도 1f 및 도 1g는 mPSCs (Mock 및 KR) 세포주에서 줄기세포성 마커의 발현을 비교한 것이다(스케일 바, 200 ) (***p<0.001)
도 2: KR의 전분화능 특이적 발현. 도 2a는 만능-특이적 KR 발현을 확인하기 위하여 KR-mESCs의 자발적 분화과정을 위상차 형광 현미경을 이용하여 관찰한 결과이다.
도 2b는 KR-mESCs의 자발적 분화과정 동안, 줄기세포성(stemness) 마커인 Oct-4와 Nanog 및 KR의 유전자 발현을 정량적 PCR을 이용하여 분석한 결과(위쪽) 및 분화과정 동안 3 가지 생식층(germ layer)에서의 전형적인 유전자 발현, 즉 fgf5(외배엽), brachyury (중배엽) 및 sox17 (내배엽)의 발현을 분석한 결과이다(아래쪽).
도 2c는 KR-mESCs의 자발적 분화를 부분적으로 유도 후, 형광현미경을 이용하여 KR 및 Oct-4의 발현 구역을 비교한 결과이다(흰색 점선)(스케일 바, 50 ).
도 3: 광 조사 후 KR-mESCs의 광독성에 따른 mESCs (Mock 및 KR)의 세포 사멸을 위상차 형광 현미경(도 3a), 아넥신 V 염색 및 유세포분석(도 3b), cleaved 카스파제-3 및 cleaved PARP의 이뮤노블로팅(도 3c) 및 카스파제-3 효소 활성 분석(도 3d)으로 관찰한 결과이다. 도 3e는 광 조사 후 mESCs (Mock 및 KR)의 형태적 변화를 JuLI Smart 형광 세포 분석기 현미경으로 관찰한 결과이다. 정량 데이터는 평균±표준오차(SEM)로 나타내었다. (***p<0.001)
도 4: 광 조사 후 KR-mPSCs에서의 ROS 생성을 산화제-민감성 프로브 디클로로플로레신(DCF-DA) 분석법으로 측정하였다. KR-mESCs을24-웰 플레이트에 분주하고 540 nm 의 가시광선으로 조사하였다. 세포를 1시간동안 배양한 후, DCF-DA으로 30분간 염색하였다. ROS 레벨은 형광현미경(도 4a) 및 유세포분석기(도 4b)를 이용하여 측정하였다.
mPSCs (Mock 및 KR)는 광 조사 전 5 mM NAC를 1시간동안 전처리하였다. 상기 세포에 광 조사 후 24시간 후 mPSCs (Mock 및 KR)의 세포 사멸을 아넥신 V (도 4c) 및 cleaved 카스파제-3 항체를 이용한 면역 형광(도 4d 내지 도 4f)으로 측정하였다. 2회 실시한 후 세포 사멸 비율을 평균±표준오차로 나타내었다(**p<0.01 및 ***p<0.001)(스케일 바, 100 ).
도 5: KR-mPSCs의 만능 특이 세포 사멸 및 테라토마 형성. 도 5a의 분화된 KR-mPSCs의 광 조사 후 IFC 이미지에서, 각각 KR 또는 SSEA-1 (적색), cleaved 카스파제-3 (녹색), 및 DAPI (청색)을 나타낸다(자발적 분화 7일)(스케일 바, 100 ).
도 5b는 KR-mPSCs에서 광 조사 후, cleaved 카스파제-3 및 KR (또는 SSEA-1)의 FACS 분석 결과를 나타낸다. KR (또는 SSEA-1)-양성 및 -음성군에서의 cleaved 카스파제-3- 양성 및 -음성 군의 정량적 데이터를 그래프로 나타낸 것이다.
도 5c는 광 조사 24시간 후, FITC-SSEA-1로 염색한 혼합된 세포 집단(자발적 분화 7일)을 FACS 분석한 결과이다.
도 5d는 광 조사 또는 광 조사하지 않은 KR-miPSCs를 피하주사로 주입하였다. KR-miPSCs를 피하주사한 부위에서 형성된 테라토마 이미지를 나타낸다.
도 5e는 테라토마를 절단(section)하여 H&E, Masson’s 트리크롬(trichrome), 및 Alcian 블루(스케일 바, 50 ) 염색한 결과이다. 정량 데이터는 평균±표준오차이다.
도 6: 인 비트로에서 KR-mPSCs에서 분화된 내피 세포의 광 조사 후 기능 유지(functionally intact). 도 6a는 내피세포로 분화-유도된 세포의 FACS 분석 및 CD31-양성 세포 선별, 형태학적 특징 및 vWF (스케일 바, 20 )의 면역염색 결과를 나타낸다.
도 6b는 내피 관 형성 분석 및 아세틸화(acetylated) 저밀도 리포단백(low-density lipoprotein, ac-LDL, Red) 흡수 분석 (스케일 바, 1000 (상단) 및 100 (하단))으로 선별된 세포을 나타낸다.
도 6c 및 도 6d는 CD-31-선별된 세포의 관 형성 및 ac-LDL 흡수 실험에서 광 조사의 영향을 나타낸다(스케일 바, 200 (C) 및 100 (D)), n/s: 유의성 없음.
도 6e는 ECs의 세포 사멸에 있어 광 조사의 영향을 cleaved 카스파제-3 및 DAPI 핵 염색의 IFC 이미지로 나타낸 것이다(스케일 바, 100 ).
도 7: KR-mESCs로부터 분화된 내피세포의 광 조사 후 혈관 생성(vasculorigenesis)에 대한 기능. 도 7a는 연속적인 레이저 도플러 관류 영상을 나타낸다(적색에서 노란색)(상단). 도 7b는 비허혈성(nonischemic) 군에 대한 허혈성군의 뒷다리 혈류 비율을 정량적으로 나타낸 것이다. 데이터는 평균±표준오차로 나타내었다
도 7c는 다리 손상(Limb salvage), 발 괴사(Foot necrosis) 및 다리 손실(Limb loss)의 이미지를 나타낸다. 세포를 이식 또는 이식하지 않은 마우스의 상태에 대하여 표에 정리하였다.
도 7d는 처치 후 24일에 정상 및 허혈성군 뒷다리의 조직학적 분석결과를 나타낸다. 각 이미지는 H&E 및 masson’s 트리크롬(MT) 염색 결과를 나타낸다.(스케일 바, 500 ).
도 7e는 KR-mESCs 및 EC-KR-mESCs의 (1:1) 혼합 세포시료를 주입한 대조군(상단) 및 혼합 세포시료에 광 조사 후 주입한 시험군(하단)의 테라토마-유사 종양괴(teratoma-like tumor mass) 이미지를 나타낸다.
도 8은 KR-mESCs (도 8a) 및 KR-miPSCs (도 8b)에 의해 생성된 테라토마의 조직 절편을 H&E, Masson’s 트리크롬, 및 Alcian 블루 염색하여 나타낸 것이다. 각각은 내배엽인 소화관의 지표인 지방 조직, 연골 및 근육섬유, 중배엽인 연결조직, 외배엽인 신경 로제트(rosette), 케라틴 펄(keratin pearl) 및 편평상피조직(squamous tissue)에서 형성된 테라토마를 나타낸다스케일 바, 50 ).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험 방법

형질전환 PSC 클론 구축

미토콘드리아에서 발현되도록 디자인된 KR 백본 벡터는 Evrogen에서 상업적으로 구입가능하다(Moscow, Russia)(26). EOS-C(3+) 프로모터의 코딩 서열(28)을 포함하고 있는 벡터는 김광수 박사(Harvard medical school, Boston, MA)로부터 제공받았다. EOS-C(3+) 프로모터 코딩 서열을 PCR로 증폭한 후, 벡터에서 CMV 프로모터를 제거하고 선형화된 KR 백본에 서브 클로닝하였다. 최종 유전자 카세트에서는 EOS-C(3+) 프로모터가 KR 발현을 유도한다. 리프로그램가능한(reprogrammable) 마우스(Gt(ROSA)26Sor^{tm1(rtTA*M2)Jae} Col1a1^{tm3(tetO-Pou5f1,-Sox2,-Klf4,-Myc)Jae}/J)로부터 마우스 배아 섬유아세포(Mouse embryonic fibroblasts, MEFs)를 분리하였다(29). J1 마우스 ES 세포 및 리프로그램가능한 MEFs를 세포 선별이 가능하도록 네오마이신 유전자를 포함한 EOS-C(3+)-KR 플라스미드로 형질변환 시켰다. 세포 형질변환은 Neon Transfection System (Life Technologies)의 프로토콜에 따라 수행하였다. 200 μg/ml의 네오마이신을 사용하여, KR을 발현하고 적색 형광을 띄는 mESC를 양성 콜로니로서 선별하였다. EOS-C(3+)-KR로 형질변환된 리프로프래밍가능한 MEFs의 경우, 2 μg/ml 독시사이클린(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)가 첨가된 마우스 ESC 배지를 2일마다 교체해주었다.

분화 및 세포 선별

내피세포를 유도하기 위하여 부유 배양 조건에서 KR-mESCs가 mEB를 형성하도록 하였다. 배양 배지는 기본적인 배양 구성물에 5% FBS (Hyclone) 및 20 ng/ml 마우스 재조합 혈관 내피 성장인자(VEGF)(R&D system Inc., Minneapolis, MN)를 첨가한 DMEM (Gibco)을 사용하여 10일간 배양하였다. EB 배지는 10일 동안 2일 간격으로 교체하였다. 이후, mEB를 0.2% 젤라틴 코팅된 플레이트에 분주하고, 5% FBS가 포함된 DMEM에서 7일간 배양하였다. 분화된 mEBs로부터 ECs를 분리하기 위하여, APC-컨쥬게이트 항-마우스 CD31 항체(BD Biosciences)를 사용하는 FACS Aria 3 세포 선별기(BD Biosciences)를 이용하였다. CD31 양성 세포는 0.2% 젤라틴 코팅된 플레이트에서 5% FBS 및 20 ng/ml VEGF가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여, 2차 계대배양(passage)까지 배양하였다.

내피 혈관 형성 및 ac-LDL 흡수 분석

내피 혈관 형성 분석을 위하여, 분리된 ECs-KR-mESCs를 4-웰 매트리젤-코팅된 플레이트 상에 분주하고(5 x 10⁴ 세포), 37℃에서 12 시간동안 배양하였다. ac-LDL 흡수 분석을 위하여 ECs-KR-mESCs에 10 mg/ml DiI-labeled ac-LDL (Biomedical Technologies, Stoughton, MA)를 처리한 후 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 이후 상기 세포들을 각각 PBS로 3번 세척한 다음, 형광 현미경(Nikon)을 이용하여 이미지를 분석하였다.

테라토마 형성

인 비보에서 KR-mESCs의 전분화능을 실험하기 위하여, 2가지 방법을 이용한 테라토마 형성 분석을 수행하였다: 알긴산 캡슐의 등 부위 이식 및 직접 정소 주입. 우선, 미분화 KR-mESCs을 ECs-KR-mESCs와 혼합하여 CaCl₂ 존재 하 알길산(alginate)(Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO)과 1 x 10⁵개 세포의 응집체를 형성하였고, 이어 세포 이동을 방지하기 위하여 성장인자 감소된 50 matrigel (BD Biosciences)와 재-캡슐화(re-encapsulated) 하였다(30). 캡슐화된 세포를 balb/c-누드마우스의 등 부위에 피하주사로서 이식하였다. 캡슐화된 세포 타입은 MEF (n=1), KR-mESCs + ECs-KR-mESCs (n=6), 및 KR-mESCs + ECs-KR-mESCs (light, n=6)이다. 직접 정소 주입을 위하여, 미분화 KR-mESCs와 ECs-KR-mESCs를 총 세포 수 5 x 10⁶ 개가 되도록 혼합하였다. 세포타입은 KR-mESCs + ECs-KR-mESCs (n=5), 및 KR-mESCs + ECs-KR-mESCs (light, n=5)이고, 이러한 과정을 두 번 수행하였다. 정소 주입한 모든 그룹에 있어서 테라토마가 형성되지 않았다. 모든 동물의 보호 및 실험 과정은 건국 대학교의 동물 보호 위원회(IACUC No. KU 13125-1)의 승인 하에 수행되었다.

뒷다리 허혈성 모델 및 세포 이식

6-주령 자성 누드마우스(몸무게 25-30 g) (Orient bio)를 럼푼(20 mg/kg) 및 케타민(100 mg/kg)을 사용하여 마취시켰다. 대퇴 동맥 및 분지 혈관은 6-0 silk (Ethicon, Somerville, NJ)의 피부 절개를 통하여 접합하였다. 외부 장골 동맥 및 상기 모든 동맥들을 접합하였다. 복재(saphenous) 및 슬와(popliteal) 동맥으로 나누어지는 원위부로의 외부 장골 동맥의 지맥(branch)으로서, 대퇴 동맥을 근위부로부터 제거하였다. 이식 전, 인 비보 상에서 생존 및 접종(engraftment) 여부를 확인할 수 있도록 세포를 CM-DiI (DiI, Molecular probes)로 레이블링 하였다. 1×10⁵개 mES-ECs 세포를 200 PBS에 현탁시킨 후, 29-게이지 인슐린 시린지를 이용하여 의학적 대퇴부에 있는 박근(gracilis muscle)의 4 부위에 근육내 주사 하였다.

통계 분석

그래프 데이터는 평균±표준오차로 나타내었다. 각 그룹 및 그룹간의 통계적 유의성은 각각 Bonferroni post-test 및 Student t test 후, one-way 또는 two-way 분산분석(ANOVA)을 이용하여 결정하였다. p<0.05(*), p<0.01 (**), 및 p<0.001 (***).

마우스 ES 세포 배양

마우스 J1 세포주는 American Tissue Culture Collection (ATCC, VA, USA)로부터 구입하였다. 배아 상태의 세포를 유지하기 위하여, 첨가물 없는 mESC 배지[DMEM (Gibco, Life technologies, NY, USA), 15% 소태아혈청(FBS) (Gibco), 1% 비필수 아미노산(Gibco), 0.1 mM β-머캅토에탄올(Gibco), 0.1% 젠타마이신(Gibco) 및 1,000 U/ml 마우스 루케미아 저해 인자(mLIF) (Millipore, Merck, Germany]에서 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다. 매일 배지를 교체하였으며, 2-3일 단위로 계대배양하였다.

세포 사멸 및 아넥신 V 분석

mESCs (Mock 및 KR) 및 miPSCs (Mock 및 KR) 세포를 젤라틴 코팅된 24-웰 플레이트에 2×10⁵ 세포/웰로 분주한 후, 24시간 동안 표준 ES 세포 배지에서 배양하였다. 세포를 540 nm - 580 nm의 빛으로 적정시간 조사한 후, 24시간 동안 배양하고, 상기 세포를 PE Annexin V 세포사멸 검출 키트 I(BD Pharmingen)로 염색하였다. 한편, 광 조사 후 mESCs(Mock 및 KR)의 세포 사멸 동역학은 JuLI Smart 형광 세포 분석 현미경(Montreal Biotechnologies Inc. (MBI), Dorval, PQ, Canada)을 이용하여 약 24시간 동안 관찰하였다.

이뮤노블로팅( Immunoblotting )

세포를 10 uM 소듐 바나데이트 및 1 mM 프로테아제 억제 칵테일(Roche, Basel, Switzerland)이 첨가된 TLB 버퍼(20 mM Tris-HCl (pH7.4), 137 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% 트리톤 X-100, 및 10% glycerol)에서 용해시킨 후, SDS-PAGE을 실시하였으며, 이어 1 차 항체로서 cleaved-카스파제-3 (Cell signaling, Danvers, MA), PARP, 및 ERK2 (Santa Cruz Biotech Inc., Dallas, TX), 2차 항체로서 horseradish 퍼옥시다아제 (HRP)-컨쥬게이트(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)를 사용하여 이뮤노블로팅을 실시하였다.

카스파제 ( caspase )-3 활성 분석

The Ac-DEVD-AMC 카스파제-3 형광발생(fluorogenic) 기질(BD Pharmingen, CA, USA)을 사용하여 제조자 설명서에 따라 분석을 실시하였다.

전체 RNA 추출 및 정량적 실시간( real - time ) PCR

전체 RNA는 easy-BLUETM Total RNA 추출키트 (Intron, Seongnam, South Korea)를 사용하여 제조자 설명서에 따라 추출하였다. 추출된 RNA로부터 PrimeScriptTM RT Master Mix (Takara Bio Inc., Shiga, Japan)를 사용하여 cDNA를 수득하였다. 유전자-특이 프라이머는 다음과 같다:

mOct4 (forward: 5’-GAGAAAGCGAACTAGCATTGAGAAC-3’, reverse: 5’-TGTAGCCTCATACTCTTCTCGTTG-3’); mNanog (forward: 5’-GTGCACTCAAGGACAGGTTTCAG-3’, reverse: 5’-CTGCAATGGATGCTGGGATACTC-3’); mSox2 (forward: 5’-ATGGGCTCTGTGGTCAAGTC-3’, reverse: 5’-CCCTCCCAATTCCCTTGTAT-3’); KillerRed (forward: 5’-CAACGAGACCCACATGTTCC-3’, reverse: 5’-CTGGTGTCCCTCATCTGCTT-3’); mBrachyury(T) (forward: 5’-CATCTGCTTGTCTGTCCATGCTG-3’, reverse: 5’-GAGAACCAGAAGACGAGGACGTG-3’); mFgf5 (forward: 5’-CATCGGTTTCCATCTGCAGATCTAC-3’, reverse: 5’-GTTCTGTGGATCGCGGACGCATAG-3’); mSox17 (forward: 5’-ACCCAGATCTGCACAACGCAGAG-3’, reverse: 5’-GCTTCATGCGCTTCACCTGCTTG-3’); and mGAPDH (forward: 5’-TCTGGAAAGCTGTGGCGTGATGG-3’, reverse: 5’-CAGATGCCTGCTTCACCACCTTC-3’). 증폭된 주형 DNA는 SYBRPremix Ex TaqTM (Takara Bio Inc.)을 이용하여 실시간 PCR(LightCycler480; Roche, Basel, Switzerland)로 검출하였다. PCR은 10 μl SYBR green mix (Applied Biosystems, Foster, CA), 각 0.1 μM의 프라이머 및 2 μl cDNA를 포함하는 총 20 μl 부피에서 수행하였으며, PCR 조건은 다음과 같다: 95℃/30초 (변성과정); 95℃/5초, 58℃/15초, 및 72℃/20초(40 사이클).

ROS 검출

세포내 하이드로페록사이드 및 과산화물(superoxide) 음이온 생성은 DCF-DA 형광 프로브를 이용하는 유세포 분석으로 분석하였다. KR-mESCs를 540 nm - 580 nm의 빛으로 조사한 후, 2시간 동안 배양하였다. 상기 세포에 HBSS (Gibco) 존재 하 프로브(10 uM)를 처리하고 37℃에서 30분간 배양한 후, 세포를 세척하고 형광현미경(Olympus Corporation, Tokyo, Japan) 및 FACS Caliber (BD Biosciences, Bedford, MA)를 이용하여 형광 강도를 측정하였다.

면역조직화학( Immunocytochemistry )

KR-mESCs 및 KR-mESCs 유래 내피 세포(ECs-KR-mESCs)를 4% PFA (paraformaldehyde)로 20분간 고정시킨 후, PBS하 0.1% 트리톤 X-100으로 10분간 permeabilized 하였다. 이후, 블로킹 용액으로서 5% 염소 혈청을 30분간 처리하고, 1차 항체로서 블로킹 용액 하 Oct-4 (Santa Cruz Biotech Inc., Dallas, TX), SSEA-1 (Novus Biologicals, Littleton, CO), cleaved 카스파제-3 (Cell signaling, Danvers, MA), 및 vWF (Abcam, Cambridge, MA)를 4℃에서 하루동안(overnight) 처리하였다. 상기 세포를 PBS로 3회 세척한 후, Cy2 (Jackson ImmunoResearch Laboratories), Alexa 488, 및 Alexa 594 (Molecular probe Inc., Eugene, OR) 컨쥬게이트된 2차 항체를 1시간 동안 처리하였다. 이미지는 형광 현미경(Olympus and Nikon, Eclipse Ti, Japan)을 이용하여 관찰하였다.(Olympus and Nikon, Eclipse Ti, Japan).

도플러 분석( Doppler analysis )

레이저 도플러 이미지 분석은 선행문헌에 따라 실시하였다(18). 레이저 도플러 관류(perfusion) 이미저(Moor Instruments, Devon, UK)는 세포 치료 0일, 3일, 7일, 14일 및 28일 째에 뒷다리의 혈류를 측정하는데 사용하였다. 디지털 칼라-코드 이미지를 분석하여 무릎 관절에서 발끝부분까지의 혈류를 정량화하고, 평균 관류 수치를 계산하였다.

허혈성 조직의 조직학

조직 염색을 위하여, 조직 샘플(specimen)을 4% 파라포름알데하이드에서 4주간 고정하였다. 상기 샘플을 에탄올로 탈수시켜, 파라핀에 고정시킨 후 5 μm의 두께로 잘라 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)으로 염색하였다. 허혈성 조직에서 섬유증의 범위를 확인하기 위하여 Masson의 트리크롬 콜라겐 염색을 수행하였다. 모세혀관 발현을 검출하기 위하여, 상기 5 조직 절편을 PECAM (Millipore) 1차 항체로 염색하였다. PECAM 염색 시그널은 어비딘 비오틴 복합체 면역퍼옥시다아제(Vectastain ABC kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA) 및 3,30-디아미노벤지딘 기질 용액 키트(Vector Laboratories)를 이용하여 관찰하였다.

실험결과

킬러레드(KillerRed)를 발현하는 마우스 만능 줄기세포의 구축

본 발명의 목표는 정상 세포에 유해하지 않은 가시광선에 의한 미분화 PSCs의 선별적 세포사멸을 입증하는 것이다. 이에, PSC가 오직 전분화능을 유지할 때에만 특이적으로 발현하도록 광감작 단백질인 KR을 디자인 하였다. 이를 위하여 만능-특이 프로모터인 EOS-C(3+) (28)와 같은 EOS (Early transposon promoter and Oct-4 and Sox2 enhancers) 벡터 시스템을 이용하였다. EOS-C(3+)는 multimerized Oct-4 코어 인핸서 요소 CR4 (conserved region 4) (31)로 구성된다. ROS 생성을 통해 세포 사멸을 유도하는 KR의 효과를 극대화하기 위하여, KR은 미토콘드리아 타겟팅 서열(MTS)에 의해 미토콘드리아에서 발현되도록 디자인되었다(도 1a)(32). 예상한 바와 같이, 미토트레이커(mitotracker)(33)를 이용하여 분석한 결과 KR 발현이 미토콘드리아에서 발현되었다(도 1b).

구축된 플라스미드(EOS-C(3+)-KR)를 전기천공법(electroporation)을 이용하여 J1 mESCs로 운반였으며, KR 발현 mESCs는 KR로부터의 적색 형광에 의해 분류되었다(도 1b). EOS-C(3+)-KR 발현 mESCs (KR-mESCs)는 여전히 외배엽(ectodermal), 중배엽(mesodermal) 및 내배엽(endodermal) 조직의 배아 생식층(embryonic germ layers)으로 구성된 테라토마를 형성하였으며, 이는 mESC로의 KR 도입이 전능성을 막지 못했음을 의미한다(도 8a). 이와 유사하게, 리프로그래밍 가능한 MEFs (29)도 EOS-C(3+)-KR가 도입된 경우 독시사이클린에 의해 세포 리프로그래밍이 유도되었다(도 1d). 독시사이클린 처리에 의해 리프로그래밍된 세포는 전분화능을 획득한 것과 같이 EOS 프로모터의 활성으로 적색 형광이 쉽게 관찰되었다(도 1c). EOS-C(3+)-KR를 발현하는 마우스 유도 만능 줄기세포(KR-miPSCs) 또한 KR-mESCs의 경우와 유사하게 테라토마를 형성할 수 있다(도 8b). 많은 전분화능 마커 유전자들이 모세포(parent cell)와 비교하여 KR-mESCs 및 KR-miPSCs에서 동일하게 발현되었다(도 1f 및 도 1g). 이러한 결과들은 KR 도입이 PSC의 줄기세포성(stemness)을 손상시킬 수 없음을 나타낸다.

전분화성 특이 KR 발현

EOS-C(3+) 프로모터 활성에 의한 KR 발현으로 나타나는 적색 형광은 세포의 리프로그래밍 과정동안 구별되기 때문에(도 1c), 본 발명자들은 분화가 진행되면서 KR-mESCs에서 KR 발현이 감소하는지 관찰하였다. 배아체(embryonic body, EB) 형성을 통하여 KR-mESCs의 자발적인 분화가 유도되었다(34). EB에서 KR의 적색 형광이 나타났으며, 시간 의존적으로 형광이 점진적으로 감소하였다(도 2a). 그리고 자발적인 분화과정 동안의 Nanog 및 Oct-4 발현과 유사하게, KR 발현이 동시에 감소하였다(도 2b). 본 발명자들은 분화가 진행되는 동안 세 가지 생식층(germ layer)에서 전형적인 마커 유전자, 즉 외배엽의 fgf5, 중배엽의 brachyury, 및 내배엽의 sox17의 발현이 점진적으로 증가됨을 확인하였다(도 2b).

KR의 전분화성 특이 발현을 확인하기 위하여, mESCs의 배양 배지로부터 자발적인 분화를 유도하기 위하여 LIF를 제거하고 배아체 형성을 거쳐서 분화가 진행 되었다. 부분적인 분화과정 이후(LIF 제거 조건 하 7일), KR의 적색 형광은 Oct-4 양성 집단에서만 관찰되고 음성 집단에서는 관찰되지 않았고, 이는 진정한 만능성 특이 KR 발현을 의미한다(도 2c, 흰 점선 부분).

가시광선에 의한 PSCs 에서의 세포사멸 유도

KR 발현은 만능 특이적으로 조절되기 때문에(도 2), KR 발현 PSCs (KR-mPSCs: KR-mESCs 및 KR-miPSCs)에서 녹색의 540 nm - 580 nm 광조사로 인한 광독성은 만능 특이적으로만 나타날 것이다. 이를 증명하기 위하여, 우선, 녹색광(1.3 W/cm², 540 nm)을 조사할 경우 광독성이 유도되어 KR- mESCs가 제거되는지 실험하였다. 예상한 바와 같이 KR- mESCs의 적색 형광은 광 조사 후 6 시간 이내에 완전히 제거되었으나, 반면, 다른 KR 발현 음성 mESC는 여전히 생존하였다(도 3a). 광독성의 정량화를 위하여 아넥신 V/7-AAD 이중 염색법에 의해 KR- mPSCs에서의 광독성 효과를 평가하였다. 그 결과, 광 조사 후 KR-mPSCs에서만 세포 사멸이 유도되었다(도 3b). 광 조사에 의한 KR-mPSCs의 선택적 세포 사멸은 이뮤노블로팅(도 3c) 및 카스파제 활성 분석(도 3d)으로 확인하였다. 광 조사 후, KR-mESCs의 시간 의존적 형태 변화에 따라, 대조군(Mock-mESCs)과 달리 광 조사 후 9-10 시간 이내에 세포 사멸이 나타났나(560분 - 660분)(도 3e).

광 조사 후 KR - mPSCs 에서의 광독성에 의한 ROS 생성

광감작제인 KR의 광독성은 ROS 생성을 유도한다(26). 따라서, KR-mPSCs의 세포 사멸 유도(도 3)는 KR 활성에 의한 ROS 생성 때문인 것으로 추측된다. PSCs의 산화적 손상의 높은 감응성(susceptibility)을 고려하면(35), 광 조사 후 KR 활성에 의한 ROS 생성은 KR-mPSCs에서의 세포 사멸유도와 매우 밀접하게 관련되어 있을 것이다. 이러한 이유로 광 조사 후 KR-mPSCs에서의 ROS 생성을 모니터링 하였다. KR-mPSCs에서의 ROS 레벨은 형광 현미경(도 4a) 및 형광프로브로서 DCF-DA를 사용하는 유세포분석기(도 4b 및 도 4c)를 사용하여 측정하였다. 일관되게, 광 조사 후 KR-mESCs 및 KR-miPSCs에서 명백히 ROS가 생성되었으며, 이러한 현상은 Mock-mESCs 및 Mock-miPSCs에서는 나타나지 않았다. 이는 ROS의 형성이 KR-mPSCs의 광독성에 기인한 것임을 나타낸다. 이러한 가설을 증명하기 위하여, 광감작 중인 KR-mPSCs에서 ROS 의존 세포 사멸을 방지하기 위하여 미리 산화방지제인 N-아세틸 시스테인(NAC)을 처리하였다. NAC를 처리 또는 비처리한 세포에 광 조사 후 사멸된 KR-mPSCs를 FACs로 분석한 결과, 광감작 후 KR의 ROS 생성은 KR-mPSCs에서의 세포 사멸 유도와 관련됨을 확인할 수 있었다(도 4c). 반면, NAC 처리한 KR-mPSCs는 광 조사 후 세포 사멸이 나타나지 않았다(도 4d).

KR - mPSCs 의 전분화성 특이 세포 사멸

본 발명자들은 KR 발현이 전분화능 의존적으로 조절되고(도 2), KR의 ROS 생성은 KR-mPSCs에서 유도된 광독성 때문임(도 4a 및 도 4b)을 증명하였다. 따라서 미분화 KR-mPSCs에서와 달리, KR-mPSCs로부터 분화된 세포, 즉 KR 발현이 강하게 억제된 세포에서는 광 조사에 따른 광독성 효과가 나타나지 않을 것이다. 이러한 차이점은 PSC의 선별적 세포 사멸을 유도하는데 있어서 중요하며, 분화 후 간단한 광 조사만으로도 잔류 미분화 세포에서의 테라토마 형성 위험성을 감소시킬 수 있을 것이다. 이를 입증하기 위하여, KR-mPSCs의 분화세포 및 미분화 세포의 광감작도(photosensitivity)를 비교하였다. KR-mPSCs를 7일간 부분적으로 분화시킨 후, 여전히 미분화된 그룹을 KR 적색형광 또는 SSEA-1 양성 염색으로서 나타내었다(도 5a, 하부 패널).

광 조사 이후, KR 양성 또는 SSEA-1 집단에서만 분명한 세포 사멸이 나타났으며, 이는 cleaved 카스파제-3 염색으로 확인하였다(도 5a). 이러한 결과는 KR-mPSCs의 광감작성이 미분화된 KR-mPSCs에 매우 특이적으로 나타남을 의미한다. 이어, KR-mPSCs의 분화 또는 미분화 세포 간 광독성 정량을 위하여, 미분화된 KR-mPSCs을 식별할 수 있는 SSEA-1 또는 KR 적색 형광을 이용하는 FACs 분석을 이용하여 분화 및 미분화된 KR-mPSCs을 모두 포함하고 있는 부분적으로 분화된 세포를 분석하였다. 도 5b에서 볼 수 있는 바와 같이, 광 조사 후 KR 발현에 의한 적색 형광이 관찰되거나 SSEA-1 (stage-specific embryonic antigen-1) 양성인 집단에서의 세포 사멸이 유도되었으나, KR 음성 또는 SSEA-1 음성 집단에서는 세포 사멸이 관찰되지 않았다. 미분화 PSCs에서의 테라토마 형성 위험을 감소시키기 위하여, 잔류 미분화 세포는 제거되어야 한다(23). 광 조사 24시간 후, SSEA-1 양성 집단에서만 현저하게 제거 되었다(도 5c).

마우스 이식 모델에서 테라토마 형성을 위해 적어도 1 X 10⁵개의 세포가 필요한 hESCs와 달리(36), mESCs는 500개 정도의 세포를 이식한 경우에도 테라토마 형성이 가능하다(15). 따라서, mPSCs가 광 조사에 의한 미분화 PSCs 제거가 테라토마 형성을 완전히 배제시킬 수 있는지에 대한 실험에 보다 적합할 것이다. 이러한 이유로, 보다 공격적으로 테라토마를 형성한다고 보고된 iPSC를 이용하여 실험하였다. 광 조사 또는 광 조사하지 않은 1 X 10⁶ 개의 KR-miPSCs를 마우스에 피하주사한 후 테라토마 형성을 관찰하였다. 32일 이후, 광 조사 하지 않은 KR-miPSCs를 주입한 6 마리 중 5 마리에서 테라토마-유사 덩어리(mass)가 나타났으며, 반면 광 조사한 세포를 이식한 군에서는 테라토마가 발생하지 않았다(도 5d). 예상한 바와 같이, KR-miPSCs의 테라토마는 세 가지 생식층으로부터의 다양한 조직 타입이 나타났다(도 5e).

인 비트로에서 KR - mPSCs 으로부터 분화된 내피 세포는 광 조사에 의한 기능적 손상이 없다

만능 특이 KR 발현으로 인한 미분화 mPSCs에 대한 선택적 광독성으로 인하여 테라토마 형성을 억제할 수 있을지라도(도 5), 분화된 세포의 ‘기능적 안정성(functional safty)'이 ‘개념입증(proof of concept)’을 위하여 보증되어야 한다. 미분화 KR-mPSCs에서 선택적 세포사멸을 유도하는 광 조사가 분화된 세포를 안전하게 선별하는데 적합함을 증명하기 위하여, KR-mPSCs을 내피 세포(ECs)로 분화시켰다(38). KR-mPSCs 유래의 내피 세포를 내피세포 마커인 CD31로 선별하였으며, 선별된 세포의 세포질 대형 과립구에서 von Willebrand factor (vWF) 발현이 관찰되었다(도 6a). KR-mPSCs로부터 선별된 ECs는 아세틸화된 저-밀도 리포단백질(acetylated low-density lipoprotein, Ac-LDL)의 흡수 또는 관 형성(tubule formation)의 인 비트로 실험을 통하여 기능적으로 특정되었다(도 6b). 따라서, 본 발명자들은 KR-mESCs에서 유래된 ECs (ECs-pKR-mESCs)의 기능적 특성이 여전히 광 조사 후에도 손상되지 않고 남아있을 것으로 예상하였다. 상기 예측과 같이, ECs-pKR-mESCs는 미분화 KR-mPSCs의 선택적 세포 사멸을 유도시키는데 충분한 광 조사 이후에도 세포 사멸의 유도 없이(도 6e) 기능적이었으며, 이는 관 형성 분석(도 6c) 또는 ac-LDL 흡수(도 6d)에 의해 증명되었다.

광 조사 후 테라토마가 형성되지 않는 KR - mESCs 유래 내피세포의 혈관생성

ECs-KR-mESCs가 미분화 KR-mPSCs을 제거할 뿐 아니라(도 5c) 테라토마 형성을 억제하는(도 5d 및 도 5e) 광 조사 이후에도 기능을 온전히 유지하는 것을 고려하면(도 6), ECs-KR-mESCs는 테라토마 형성 위험 없이 허혈성 손상을 회복시킬 수있는 최적의 세포 소스가 될 것이다.

ECs-KR-mESCs의 치료적 효과를 증명하기 위하여, 광 조사 또는 광 조사하지 않은 세포를 뒷다리 허혈성 모델에 주입하였다. 허혈성 뒷다리에서의 혈류 변화는 레이저 도플러 관류 이미징 분석을 통하여 특정 시간에 측정하였다(40). 광 조사에 관계없이 EC-KR-mESCs가 주입된 허혈성 다리에서 혈액 관류는 대조군과 비교하여 현저히 증가되었다(도 7a). 세포 이식 24일 후, 혈류의 상대적 비율(정상대조군에 대한 허혈성 실험군의 비율)은 각각 광 조사한 EC-KR-mESCs 군에서 12.8±3.7%, PBS 군에서 7.6 ± 2.3% (n=5) 및 1± 0.8%로 나타났다(도 7b). 이러한 차이점은 외형적으로 더욱 분명히 나타났다. 광 조사 한 EC-KR-mESCs를 주입한 마우스는 다리 구조(n=2/5) 및 발 괴사(n=3/5)에 있어서 분명히 호전되었다. 한편, PBS 대조군에서는 심각한 괴사 및 자가절단(autoamputation)에 의한 다리 절단이 나타났다(n=4/5)(도 7c).

PBS (도 7d, PBS), 광 조사 또는 광 조사하지 않은 ECs-KR-mESCs(도 7d, Cont 또는 Light exposure)를 이식하고 24일 후, 정상 다리 조직(도 7d, Normal)과 허혈성 다리의 근육조직에서 근육 퇴화 및 섬유증의 조직학적 실험을 수행하였다.

PBS 군의 근육 조직에서는 심각한 근육 손상이 관찰되었으며, 비정상적인 구조 및 섬유증이 관찰되었다. 그러나, ECs-KR-mESCs 이식한 근육에서는 상기 PBS 그룹과 비교하여 광 조사와 관계없이 근육 손상 및 섬유증 부위가 적었다(도 7d). 이와 유사하게, 허혈성 부위에서 모세혈관 형성을 관찰하기 위한 PECAM 염색에서는 PBS 대조군과 비교하여 ECs-KR-mESCs 이식군에서 PECAM-양성 모세혈관이 현저히 증가된 것을 알 수 있었다(도 7d, 흰 화살표).

최종적으로, 혼재된 세포 집단(50% ECs-KR-mESCs 및 50% 미분화 KR-mESCs로 구성된 총 1×10⁶개 세포)을 마우스에 이식 전 광조사한 경우, 이식 8 주 후 테라토마 유사 덩어리 형성이 성공적으로 억제되었다(도 7e).

논의

잔류 미분화 hPSCs에서 발생되는 테라토마 또는 종양 형성은 PSCs 기반 세포 치료의 임상 적용에 있어 주요 난관 중의 하나이다(4, 41). 이러한 심각한 기술적 장벽을 극복하기 위하여 오직 분화된 PSCs만을 선별하기 위한 많은 시도들이 있어왔다. 예컨대, 바람직한 세포 타입의 엄격한 선별(12), 미분화 hPSCs의 면역제거법(immunodepletion)(21), 세포독성 항체의 도입(20) 또는 줄기세포 독성 화합물(22-24, 42, 43) 등이 이종이식 모델에서 테라토마 형성을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 특히, 현재 본 발명자들에 의해 연구되고 있는 2 가지 분자를 포함하는 많은 소분자 타입(23)은 미분화 hPSCs에 대하여 선별적인 세포 사멸을 유도할 수 있으며, 이를 ‘줄기세포-독성 소분자”로 제시하고 있다. 그러나, hPSCs 특이 유전자를 타겟팅하는 소분자는 높은 가능성 및 효율성에도 불구하고, 적어도 소분자가 도파민작동성(dopaminergic) 뉴런 및 평활근(smooth muscle) 세포(23)에서는 기능적으로 안전함이 입증되었지만, 특정 분화된 세포에서 동일한 타겟 단백질[예컨대, 조혈모세포의 BIRC5 유전자(44)]의 발현 때문에 다른 분화된 세포에 예상치 못한 부작용을 가져오는 것을 피하기 어렵다. 이러한 가능성은 다른 줄기세포-독성 화합물에서도 신중히 고려되어야 한다.

따라서, 분화 세포의 높은 선별성 및 안정성에 중요한, 미분화 hPSCs에서의 높은 선별성을 입증하기 위하여, hPSCs 특이적 유전자 발현 뿐만 아니라 미분화 hPSCs 자체의 특성을 고려한 다른 전략이 필요하다. 이러한 이유로, 본 발명자들은 광(green, 540 nm - 580 nm) 조사에 의해 ROS를 생성하도록 디자인 된 광감작 단백질인 킬러레드(KillerRed, KR)(26)를 이용하였다. 미분화 ESCs는 산화적 스트레스에 극도로 민감하며(35, 45), 또한 미토콘드리아 세포 사멸 경로에 매우 민감하다(23, 46). 따라서, 미토콘드리아에서 발현되고(도 1a), EOS-C(3+)(31)에 의해 발현 조절되는 KR로부터 ROS의 생산은 오직 미분화 세포에서 높은 선택적 세포 사멸을 나타낼 뿐만 아니라(도 5) 동종 동물 모델에서 테라토마 형성을 방지할 수 있다(도 5d, 도 5e 및 도 7d). 보다 중요하게는, KR-mESCs 유래 ECs는 인 비트로(도 6) 및 인 비보(도 7)에서 광 조사 이후에도 온전한 기능을 유지하였다.

본 발명에서의 자살 유전자 도입은 티미딘 키나아제 및 간사이클로비르(ganciclovir)(25, 47)를 사용하는 전형적인 자살유전자의 도입과는 달리, 추가적인 화합물을 사용하지 않는다.

설치류 모델에 hPSCs로부터 분화된 세포를 이종이식하여 테라토마 형성을 억제한다는 수 많은 연구에도 불구하고(7, 13), hPSCs 기반 세포 치료에서 테라토마 또는 종양형성의 위험성은 지속적으로 제기되어 왔다(4, 41).

마우스 모델에서 mPSCs 유래 마우스 세포의 이식은 명백히 종양 형성이 잘 되는 경향이 있으며(17, 18, 48), 이러한 결과들은 숙주-의존적 성향과 일치되는 것이다. 따라서, mPSCs 및 마우스 모델을 이용한 PSCs의 종양 위험성을 낮추기 위한 전략의 효율성을 실험해 보는 것이 적절할 것이다. 이러한 전략은 테라토마의 위험성을 낮추는데 유효하며, 나아가 hPSCs은 그 다음 적용이 될 것이다. 본 발명에서 전기천공법을 이용한 EOS-C(3+)-KR의 유전적 삽입으로서 유전자로의 삽입(integration)을 조절할 수는 없다. 그러나, 바람직하지 않은 무작위적인 EOS-C(3+)-KR의 삽입을 피하기 위하여, 최근 RNA-Guided 엔도뉴클레아제 (RGEN)(49)를 이용한 유전자 편집 기술이 개발되었다. 이러한 기술은 특정 유전자가 유전적으로 안전한 구역(genomic safe harbor, GSH)에 삽입되도록 하며(50), 이는 향후 연구를 위한 최적의 접근법이 될 것이다. 테라토마가 없는 iPSCs을 생성하고, EOS-C(3+)-KR를 모세포의 GSH 구역에 유전적 삽입한 때, 오직 세포의 리프로그래밍이 완료된 때 유도되어 적색 형광을 방출할 수 있는데(28), 이는 마우스 모델에서와 같이(도 1d) iPSC 콜로니를 결정하는데 유용할 것이다.

요약하면, 본 발명자들은 PSCs에서 EOS-C(3+)-KR의 발현은 가시광선 하에서 오직 미분화 PSCs에 대한 선별적 광독성을 유도할 수 있으며, 다른 화학적 처리없이 테라토마 형성을 억제할 수 있다. KR-mESCs에서 유래한 분화된 ECs는 광조사 후 인 비트로 및 인 비보에서 여전히 기능하였고, 이러한 자살유전자를 이용한 접근법은 hPSCs를 적용하였을 때 테라토마 또는 종양 형성의 위험이 없는 안전한 세포 소스를 생성할 수 있다는 개념증명(proof of concept)을 나타낸다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

참조문헌

1. Gruen L & Grabel L (2006) Concise review: scientific and ethical roadblocks to human embryonic stem cell therapy. Stem Cells 24(10):2162-2169.

2. Robinton DA & Daley GQ (2012) The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature 481(7381):295-305.

3. Ben-David U & Benvenisty N (2011) The tumorigenicity of human embryonic and induced pluripotent stem cells. Nat Rev Cancer 11(4):268-277.

4. Lee AS, Tang C, Rao MS, Weissman IL, & Wu JC (2013) Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies. Nat Med 19(8):998-1004.

5. Thomson JA, et al. (1998) Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 282(5391):1145-1147.

6. Burdon T, Smith A, & Savatier P (2002) Signalling, cell cycle and pluripotency in embryonic stem cells. Trends Cell Biol 12(9):432-438.

7. Kriks S, et al. (2011) Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature 480(7378):547-551.

8. Laflamme MA, et al. (2007) Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nat Biotechnol 25(9):1015-1024.

9. Brederlau A, et al. (2006) Transplantation of human embryonic stem cell-derived cells to a rat model of Parkinson's disease: effect of in vitro differentiation on graft survival and teratoma formation. Stem Cells 24(6):1433-1440.

10. Seminatore C, et al. (2010) The postischemic environment differentially impacts teratoma or tumor formation after transplantation of human embryonic stem cell-derived neural progenitors. Stroke 41(1):153-159.

11. Doi D, et al. (2012) Prolonged maturation culture favors a reduction in the tumorigenicity and the dopaminergic function of human ESC-derived neural cells in a primate model of Parkinson's disease. Stem Cells 30(5):935-945.

12. Chung S, et al. (2006) Genetic selection of sox1GFP-expressing neural precursors removes residual tumorigenic pluripotent stem cells and attenuates tumor formation after transplantation. J Neurochem 97(5):1467-1480.

13. Cho SW, et al. (2007) Improvement of postnatal neovascularization by human embryonic stem cell derived endothelial-like cell transplantation in a mouse model of hindlimb ischemia. Circulation 116(21):2409-2419.

14. Zhang SC, Wernig M, Duncan ID, Brustle O, & Thomson JA (2001) In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol 19(12):1129-1133.

15. Erdo F, et al. (2003) Host-dependent tumorigenesis of embryonic stem cell transplantation in experimental stroke. J Cereb Blood Flow Metab 23(7):780-785.

16. Cyranoski D (2013) Stem cells cruise to clinic. Nature 494(7438):413.

17. Arnhold S, Klein H, Semkova I, Addicks K, & Schraermeyer U (2004) Neurally selected embryonic stem cells induce tumor formation after long-term survival following engraftment into the subretinal space. Invest Ophthalmol Vis Sci 45(12):4251-4255.

18. Moon J, et al. (2013) Stem cell grafting improves both motor and cognitive impairments in a genetic model of Parkinson's disease, the aphakia (ak) mouse. Cell Transplant 22(7):1263-1279.

19. Fujikawa T, et al. (2005) Teratoma formation leads to failure of treatment for type I diabetes using embryonic stem cell-derived insulin-producing cells. Am J Pathol 166(6):1781-1791.

20. Choo AB, et al. (2008) Selection against undifferentiated human embryonic stem cells by a cytotoxic antibody recognizing podocalyxin-like protein-1. Stem Cells 26(6):1454-1463.

21. Tang C, et al. (2011) An antibody against SSEA-5 glycan on human pluripotent stem cells enables removal of teratoma-forming cells. Nat Biotechnol 29(9):829-834.

22. Ben-David U, et al. (2013) Selective Elimination of Human Pluripotent Stem Cells by an Oleate Synthesis Inhibitor Discovered in a High-Throughput Screen. Cell Stem Cell.

23. Lee MO, et al. (2013) Inhibition of pluripotent stem cell-derived teratoma formation by small molecules. Proc Natl Acad Sci U S A.

24. Kuo TF, et al. (2014) Selective elimination of human pluripotent stem cells by a marine natural product derivative. Journal of the American Chemical Society 136(28):9798-9801.

25. Rong Z, Fu X, Wang M, & Xu Y (2012) A scalable approach to prevent teratoma formation of human embryonic stem cells. J Biol Chem 287(39):32338-32345.

26. Bulina ME, et al. (2006) A genetically encoded photosensitizer. Nat Biotechnol 24(1):95-99.

27. Wang Y, Nartiss Y, Steipe B, McQuibban GA, & Kim PK (2012) ROS-induced mitochondrial depolarization initiates PARK2/PARKIN-dependent mitochondrial degradation by autophagy. Autophagy 8(10):1462-1476.

28. Hotta A, et al. (2009) Isolation of human iPS cells using EOS lentiviral vectors to select for pluripotency. Nat Methods 6(5):370-376.

29. Carey BW, Markoulaki S, Beard C, Hanna J, & Jaenisch R (2010) Single-gene transgenic mouse strains for reprogramming adult somatic cells. Nat Methods 7(1):56-59.

30. Moon SH, et al. (2011) A system for treating ischemic disease using human embryonic stem cell-derived endothelial cells without direct incorporation. Biomaterials 32(27):6445-6455.

31. Okumura-Nakanishi S, Saito M, Niwa H, & Ishikawa F (2005) Oct-3/4 and Sox2 regulate Oct-3/4 gene in embryonic stem cells. J Biol Chem 280(7):5307-5317.

32. Rizzuto R, Brini M, Pizzo P, Murgia M, & Pozzan T (1995) Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells. Curr Biol 5(6):635-642.

33. Lee JS, et al. (2009) Senescent growth arrest in mesenchymal stem cells is bypassed by Wip1-mediated downregulation of intrinsic stress signaling pathways. Stem Cells 27(8):1963-1975.

34. Cha Y, et al. (2010) Zap70 functions to maintain stemness of mouse embryonic stem cells by negatively regulating Jak1/Stat3/c-Myc signaling. Stem Cells 28(9):1476-1486.

35. Han MK, et al. (2008) SIRT1 regulates apoptosis and Nanog expression in mouse embryonic stem cells by controlling p53 subcellular localization. Cell Stem Cell 2(3):241-251.

36. Lee AS, et al. (2009) Effects of cell number on teratoma formation by human embryonic stem cells. Cell Cycle 8(16):2608-2612.

37. Gutierrez-Aranda I, et al. (2010) Human induced pluripotent stem cells develop teratoma more efficiently and faster than human embryonic stem cells regardless the site of injection. Stem Cells 28(9):1568-1570.

38. Kim GD, et al. (2008) Differentiation of endothelial cells derived from mouse embryoid bodies: a possible in vitro vasculogenesis model. Toxicol Lett 180(3):166-173.

39. Vecchi A, et al. (1994) Monoclonal antibodies specific for endothelial cells of mouse blood vessels. Their application in the identification of adult and embryonic endothelium. Eur J Cell Biol 63(2):247-254.

40. Lee MO, et al. (2012) Effect of ionizing radiation induced damage of endothelial progenitor cells in vascular regeneration. Arterioscler Thromb Vasc Biol 32(2):343-352.

41. Cunningham JJ, Ulbright TM, Pera MF, & Looijenga LH (2012) Lessons from human teratomas to guide development of safe stem cell therapies. Nat Biotechnol 30(9):849-857.

42. Vazquez-Martin A, et al. (2012) Metformin limits the tumourigenicity of iPS cells without affecting their pluripotency. Scientific reports 2:964.

43. Ben-David U, Nudel N, & Benvenisty N (2013) Immunologic and chemical targeting of the tight-junction protein Claudin-6 eliminates tumorigenic human pluripotent stem cells. Nature communications 4:1992.

44. Leung CG, et al. (2007) Requirements for survivin in terminal differentiation of erythroid cells and maintenance of hematopoietic stem and progenitor cells. J Exp Med 204(7):1603-1611.

45. Ou X, Lee MR, Huang X, Messina-Graham S, & Broxmeyer HE (2014) SIRT1 positively regulates autophagy and mitochondria function in embryonic stem cells under oxidative stress. Stem Cells 32(5):1183-1194.

46. Dumitru R, et al. (2012) Human Embryonic Stem Cells Have Constitutively Active Bax at the Golgi and Are Primed to Undergo Rapid Apoptosis. Mol Cell.

47. Schuldiner M, Itskovitz-Eldor J, & Benvenisty N (2003) Selective ablation of human embryonic stem cells expressing a "suicide" gene. Stem Cells 21(3):257-265.

48. Cui L, et al. (2013) WNT signaling determines tumorigenicity and function of ESC-derived retinal progenitors. J Clin Invest 123(4):1647-1661.

49. Gaj T, Gersbach CA, & Barbas CF, 3rd (2013) ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol 31(7):397-405.

50. Papapetrou EP, et al. (2011) Genomic safe harbors permit high beta-globin transgene expression in thalassemia induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol 29(1):73-78.

<110> Industry-University Cooperation Foundation Sogang University <120> A Method for Inhibition of Pluripotent stem cell-derived Teratoma Formation <130> PN140298 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 718 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KillerRed <400> 1 atgggttcag agggcggccc cgccctgttc cagagcgaca tgaccttcaa aatcttcatc 60 gacggcgagg tgaacggcca gaagttcacc atcgtggccg acggcagcag caagttcccc 120 cacggcgact tcaacgtgca cgccgtgtgc gagaccggca agctgcccat gagctggaag 180 cccatctgcc acctgatcca gtacggcgag cccttcttcg cccgctaccc cgacggcatc 240 agccatttcg cccaggagtg cttccccgag ggcctgagca tcgaccgcac cgtgcgcttc 300 gagaacgacg gcaccatgac cagccaccac acctacgagc tggacgacac ctgcgtggtg 360 agccgcatca ccgtgaactg cgacggcttc cagcccgacg gccccatcat gcgcgaccag 420 ctggtggaca tcctgcccaa cgagacccac atgttccccc acggccccaa cgccgtgcgc 480 cagctggcct tcatcggctt caccaccgcc gacggcggcc tgatgatggg ccacttcgac 540 agcaagatga ccttcaacgg cagccgcgcc atcgagatcc ccggcccaca cttcgtgacc 600 atcatcacca agcagatgag 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Claims (12)

1. 다음의 단계를 포함하는 미분화 만능 줄기세포(undifferentiated pluripotent stem cells)로부터의 테라토마(teratoma) 형성 억제방법:
   (a) (ⅰ) 광 조사(light exposure)에 의해 광독성(phototoxicity)을 나타내는 광감작 단백질(photosensitizer protein)을 코딩하는 핵산분자; 및 (ⅱ) 상기 핵산 분자에 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있고 미분화 줄기세포-특이적(undifferentiated stem cell-specific) 활성화되는 서열목록 제 4 서열의 프로모터;를 포함하는 유전자 전달체를 만능 줄기세포에 도입시키는 단계;
   (b) 상기 단계 (a)의 줄기세포의 분화를 유도하는 단계; 및
   (c) 상기 단계 (b)의 줄기세포에 광 조사하여 미분화 줄기세포를 선별적으로(selectively) 제거하는 단계.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 광감작 단백질은 광 조사에 의해 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)을 생성함으로써 미분화 줄기세포의 사멸(apoptosis)을 유도하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
3. 제 1 항에 있어서, 상기 광감작 단백질은 킬러레드(KillerRed)인 것을 특징으로 하는 방법.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 광감작 단백질을 코딩하는 핵산분자는 서열목록 제 2 서열, 서열목록 제 3 서열, 또는 서열목록 제 2 서열 및 서열목록 제 3 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 미토콘드리아 내로 타겟팅(targeting)되는 것을 특징으로 하는 방법.
   
5. 제 1 항에 있어서, 상기 유전자 전달체는 (ⅰ) 서열목록 제 1 서열의 핵산 분자; 및 (ⅱ) 상기 핵산 분자에 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있고 동물세포에서 RNA 분자를 형성시키며, 미분화(undifferentiated) 줄기세포에서 활성화되는 서열목록 제 4 서열의 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
6. 삭제
7. 제 1 항에 있어서, 상기 만능 줄기세포는 배아줄기세포, 유도만능줄기세포, 배아생식세포, 배아종양세포 또는 성체줄기세포인 것을 특징으로 하는 방법.
   
8. 제 1 항에 있어서, 상기 광 조사 파장은 540 nm - 580 nm인 것을 특징으로 하는 방법.
   
9. 제 1 항에 있어서, 상기 줄기세포는 상기 단계 (b)의 분화과정 동안 Nanog 또는 Oct-4의 발현이 감소하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
10. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 상기 만능 줄기세포를 내피 세포(endothelial cells)로 분화시키는 것을 특징으로 하는 방법.
    
11. (a) 제 1 항 내지 제 5 항 및 제 7 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 테라토마(teratoma) 형성이 억제된 줄기세포의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 허혈성 질환(ischemic disease) 치료용 약제학적 조성물.
    
12. 제 11 항에 있어서, 상기 허혈성 질환은 조직손상, 허혈성 뇌혈관장애, 허혈성 신장질환, 허혈성 폐질환, 허혈성 심질환, 신경 손상 질환 또는 조직손상 또는 감염증과 관련된 허혈성 질환인 것을 특징으로 하는 조성물.

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