JP6920363B2 - 多機能未成熟歯髄幹細胞および療法適用 - Google Patents
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Description
本文書は、2013年3月15日に出願された、Kerkisに対する「ロバストな長期培養系によって得られた多機能未成熟歯髄幹細胞」と題される米国仮特許出願61/7
91,594の恩典、およびまた2013年3月15日に出願された、Kerkisに対する「多機能未成熟歯髄幹細胞の療法適用」と題される米国仮特許出願61/800,2
45の恩典を請求し、各出願の全内容は、すべての目的のため、本明細書に援用される。
本明細書にその全体が援用されるのは、本明細書と同時に提出され、そして2014年3月14日に生成された「Seq_List」と称される1つの10,865バイトASCII(テキスト)ファイルとして同定される、コンピュータ読み取り可能ヌクレオチド/アミノ酸配列表である。
本発明は、多機能未成熟歯髄幹細胞(IDPSC)の組成物、こうして得られた幹細胞を幹細胞療法において使用するため、その「幹細胞性」を失うリスクが最小限である早期継代時に、患者または単一のドナーの歯髄(DP)から、臨床的に有用な量のIDPSCを生成するための方法、ならびに変性疾患、および医学的および審美的症状を防止し、そして治療するための、IDPSC多系譜志向療法組成物の臨床的および審美的使用に関する。本明細書に提示する方法によって、神経上皮マーカーが特に濃縮された、多機能IDPSCの混合集団を得る。これらの細胞は、主に(優先的に)非血管周囲ニッチから生じ、そして酵素的に処理されていないDP外植片を長期培養するだけで得られる。
しても知られる(Caplan AI(2009)MSCはなぜ療法性か? 新規データ:新規洞察。J. Pathol. 217:318−324)。
しかし、これは実行が困難である可能性もあり、そしてその後の産生能力を制限する可能性もある。同様に、スケールアッププロセスの望ましい終点が、マイクロキャリアー上で細胞を培養することである場合、早期研究で用いる産物は、やはり、懸濁培養を用いて産生されている必要がある。そうでなければ、最終産物細胞は、おそらく、臨床において後に用いられるものと匹敵しないであろう。
にもかかわらず、これらの方法は、分化能が限定されたMSCの単離を生じ、限定された多様性の細胞タイプしか生じさせない。さらに、組織中のASCの数は、非常に少ないため、これらの方法は、不均質な培養を生じ、幹細胞ではない多数の細胞を含有する。
響を有する。PLos One 4:e5846)。
vitro拡大の影響を示した。これらは、最小限の拡大を伴うプロトコルであってさえ、MSCの迅速な加齢を誘導し、喪失は総複製寿命の約半分と同等であることを示した(Baxter MAら(2004)テロメア長の研究は、in vitro拡大後のヒト骨髄間質細胞の迅速な加齢を明らかにする。Stem Cells 22,675−682)。
vitroおよびin vivoで証明される。多系譜志向のin vitro証明は、多機能マーカー発現および多様な細胞系譜に向かう多機能性によって証明され、そしてin vivoで証明される多系譜性は、多様な組織へのIDPSCのin vivo生着潜在能力に基づき、そして組織特異的機能性によって特徴付けられる。in vivo多機能性の強い証明は、腫瘍原性および免疫原性を伴わない、多数の組織内へのIDPSC子宮内移植に基づく。非腫瘍原性のさらなる証明は、腫瘍抑制遺伝子であるp53がLP−IDPSCにおいて発現していることであり、そしてLP採取後、継代数が少ない必要があるため、これが核型突然変異を防止し、そしてしたがってまた腫瘍原性リスクを減少させる。IDPSC組成物による治療の開示する方法のさらなる利点は、免疫原性潜在能力が減少していることであり、これは前記IDPSCがHLA−ABCおよびHLA−DR主要組織適合性(MHC)抗原に関して陰性であり、したがって同種移植が可能になるためである。
ない項目が排除されないことを意味する。さらに、不定詞「a」または「an」による要素への言及は、1つの、そして1つのみの要素が存在することを、文脈が明らかに必要としない限り、要素の1より多くが存在する可能性を排除しない。不定詞「a」または「an」は、通常、「少なくとも1つ」を意味する。
細胞培養容器へのDPのトランスファー、その後の保存(例えば凍結保存)および/またはIDPSCのアウトグロース物の継代培養を構成する。
(i)最大約0.5%〜1%、または最大約0.5%〜15%の間の酸素(O2);
(ii)約0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%または2%または5%の酸素(O2);
(iii)約0.1%〜2%の間の酸素(O2);あるいは
5〜7%のCO2を含む(i)、(ii)または(iii)のいずれか
を含むかまたはこれらに同等の培養条件下で、細胞を培養することを含む。
び「成長」は、細胞数の増加を伴う、細胞または細胞集団の連続した生存を指す。
用;情報の特定;問題解決に関連する動物またはヒト被験体の精神機能、ならびにアイディアおよび/または情報の学習、知覚、および/または認知などの精神機能を指す。認知機能は、認知機能に関する1またはそれより多い試験またはアッセイ、例えば妥当な診断試験および/またはコンピュータ化認知試験を通じて定義されうる。
とも90%、または少なくとも95%がp75神経上皮マーカーを発現する。
(a)IDPSCの少なくとも80%が、ネスチン、p75、ATP結合カセットサブファミリーGメンバー2(ABCG2)、p63、脳由来神経栄養因子(BDNF)、グリア細胞株由来神経栄養因子(GNDF)、神経成長因子−ベータ(ベータ−NGF)、ニューロトロフィン−3(NT3)、NT4、およびNT5より選択されるマーカーを発現する、神経上皮幹細胞プロファイルIDPSC;ならびに
(b)IDPSCの20%未満が、STRO−1およびCD146より選択されるマーカーを発現する、周皮細胞プロファイルIDPSC;
(c)集団の少なくとも80%が、CD105、CD73、CD90、CD29、CD44、CD117、ビメンチン、フィブロネクチン、アルカリホスファターゼ(ALP)、アルファ−フェトプロテイン(AFP)、テネシン−C、マトリックスメタロプロテイナーゼ−1(MMP−1)、MMP−2、MMP−9、シンデカン1(SDC1)、SDC2、SDC3、SDC4、p53、および1型コラーゲンより選択されるマーカーを発現する、間葉系幹細胞プロファイルIDPSC;
(d)IDPSCの2%〜30%が、Oct3/4、SOX2、Nanog、TRA1−60、TRA1−81、およびSSEA4より選択される少なくとも1つのマーカーを発現する、多能性幹細胞プロファイルIDPSC;ならびに
(e)IDPSCがHLA−ABCおよびHLA−DR主要組織適合性(MHC)抗原に関して陰性である、間葉系幹細胞プロファイルIDPSC
の多機能分子プロファイルによって特徴付けられる。
、ポリリジン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン、またはその組み合わせを含む細胞外マトリックス(ECM)基質と、IDPSCを培養する。ECM基質はMatrigelであってもよい。
(a)歯からDPを摘出し;
(b)無菌容器中にDPを入れ、そして抗生物質を含む無菌溶液でDPを洗浄し;
(c)場合によって、抗生物質を含む無菌溶液を取り除き、そしてDPを基本培地中で細かく刻み;
(d)DPを、培地を含む別の容器内に、機械的にトランスファーし;
(e)IDPSCのアウトグロースおよび接着が観察されるまでDPを培養し;そして
(f)DP内の多数ニッチからIDPSCのアウトグロースおよび接着を可能にするように、少なくとも5回、工程(d)および(e)を反復する
工程を含むIDPSCの単離集団を産生する方法を提供する。
4日間、少なくとも5日間、少なくとも10日間または少なくとも15日間続けてもよい。工程(d)および(e)を少なくとも10回、少なくとも15回、少なくとも20回、少なくとも25回、少なくとも30回、少なくとも35回、少なくとも40回、少なくとも45回、少なくとも50回、少なくとも55回または少なくとも60回反復してもよい。
IDPSC、少なくとも7x105 IDPSC、少なくとも8x105 IDPSC、少なくとも9x105 IDPSC、または少なくとも1x106 IDPSCの単離集団を生じる。
用可能性は高い。
チャー・フィンガープリントは、多能性細胞タイプ特性の典型である。
CSは、本明細書において初めて、長期培養法を用いて得られる。
012)PLoS ONE 7:e39885。本開示において、本発明者らは、乳歯由来のDSCの新規系譜(hIDPSC)が、歯髄における異なる(非血管周囲)特徴的なニッチから、あるいはDP外植片の虚血/血管栄養/酸素枯渇内部組織から、単離可能であり、したがって、推定上、腫瘍形成リスクを最小限にすることを開示する。
3/4およびSTRO−1に対する免疫組織化学染色を行った。
いる。
毛包は、成長する際、3つの相:成長相(成長期)、後退相(退行期)、および休止相(休止期)を通過する。毛成長は連続したプロセスであり、生物の生涯を通じて続く。したがって毛包は幹細胞ニッチを有しているはずであり、これは常に活性であり、そして特に、毛包再生時に活性である。現在の知識によれば、神経冠から生じる毛包幹細胞は、皮脂腺の近くの毛包の膨らんだ領域に常在する。これらの細胞は、未分化状態でネスチンを発現し、これは神経および毛包幹細胞のマーカーである。毛包の膨らんだ領域に見られるこうしたネスチン発現幹細胞は、成長期中に、毛包の外部および内部経路外筒を形成することになっていた。これらの幹細胞は、毛包を産生可能であるだけでなく、表皮中の創傷を再生するかまたは少なくとも治癒させることが可能であることが示されてきている。さらに、毛包幹細胞は、ニューロンに変換可能である。これらはニューロスフェアを形成し、これが次に、ニューロン、グリア細胞、角化細胞、平滑筋細胞、および他の細胞タイプを形成した。毛包幹細胞をマウスに皮下注射すると、これらはニューロンを形成した。マウスに移植した後、毛包の膨らんだ領域において、これらは血管を生じさせ、毛包幹細胞が内皮細胞を形成する潜在能力を有することが示された。毛包幹細胞はまた、神経再生および神経機能回復の速度を非常に増進させることも可能である。これらの結果は、毛包幹細胞の多能性、および再生医学におけるその潜在的な使用を示す。これらの幹細胞は、胚性および成体幹細胞のいくつかの利点を組み合わせる特性を有する。胚性幹細胞と同様に、これらは高い度合いの可塑性を有し、高レベルの純度で単離可能であり、そして培養中で拡大可能である。
幹細胞に基づく療法は、傷害および疾患後の皮膚再生に新たな道を開く。皮膚にはいくつかの機能性幹細胞ニッチがあり、これらは集合的に、物理的および化学的微小環境の合図の原因であることが知られており、これらが、すべての層のヒト皮膚再生潜在能力を可能にする。前臨床研究によって、傷害部位に局所送達された後、幹細胞によって分泌されるパラクリン因子が、慢性創傷治癒を改善可能であり、そしてこれが幹細胞が修復を増進可能な主要な機構であることが立証されてきている。間葉系幹細胞(MSC)由来の馴化培地でさえ、宿主細胞の活性化を通じて創傷治癒を促進することが示されてきている。
1. 創傷治癒、例えば糖尿病から生じる難治性皮膚潰瘍、虚血およびコラーゲン疾患は、ほとんど解決策がない重大な問題に相当する。
繁殖性マウス由来の精原幹細胞を不妊レシピエントマウスの精巣に移植すると、ドナー由来精子形成が生じ、そしてまた、ドナーから子孫レシピエント動物への遺伝物質の伝達が生じることが示されてきている。生殖細胞移植は、雄性生殖細胞発生系の生物学を研究するバイオアッセイを提供し、精子形成における欠陥を調べ、そして雄性不妊を治療する、精原幹細胞の単離および培養の系を発展させる。生殖細胞の移植は、齧歯類において最も広く研究されているが、より大きな哺乳動物に適用された。ブタ、ヤギおよびウシを含む家畜動物、ならびに霊長類において、精巣中の超音波カニューレ挿入によって導かれ、生殖細胞をレシピエント精巣内に移植可能である。生殖細胞移植は、関連のない種(ブタおよびヤギ)間で成功し、そして免疫抑制プロトコルを用いる必要がない一方、齧歯類における移植は、同系または免疫適合性パートナーである動物を使用する必要がある。
唆した。対照的に、以前の研究は、霊長類(ヒヒ(baboon))の生殖系列幹細胞が、少なくとも6ヶ月間、免疫不全マウスの精巣で、コロニー形成可能であることを立証してきている。これらの細胞は、精子形成によってのみ分化したが、この結果は、霊長類の幹細胞がマウスの精巣において生存するだけでなく、増殖可能であることも示した。
腎不全(RF)(腎不全または腎臓機能不全とも)は、腎臓が血液から廃棄産物を適切に濾過することに失敗する医学的状態である。高レベルの外胚葉性マーカー発現が、ネコRF獣医学的患者に対するIDPSC療法を可能にするかどうかを試験するため(RF代表的症例は、獣医学的専門家の書面の治療/症状分析に基づいて記載され、何匹かのペットにおいては、飼い主によるリクエスト/通知された懸念(informed concern)を通じて、本明細書に記載しない他の例がRF疾患を治療するために適用された)。
本開示の他の側面は、歯髄機械的トランスファーおよび神経分化の誘導の15、30および45サイクル後、神経前駆体およびニューロンを用いた、hIDPSCの後期集団の濃縮に関する。CNSは、外胚葉から生じ、より正確には、多分化能神経上皮幹細胞(NSC)のプールから生じる。この細胞集団は、神経前駆体の2つの異なる群によって少なくとも構成され:第一の群は、単層培養で成長することが可能であり;第二の群は、一般的にニューロスフェアを形成する(すなわち懸濁培養中で増殖する)。この相違にもかかわらず、どちらの細胞タイプも同じ分化潜在能力を示す(Nobleら、2011、Kempermann、2011)。
組織の取り込みが含まれる。こうして取り込まれた細胞は、ニューロン、グリアまたは他の細胞に分化するかまたは発展する潜在能力を有し、損傷を受けたか、外傷を受けたかまたは変性した組織を置換するかまたはその修復を促進して、それによって変性、急性傷害、外傷性、神経学的状態のより永続的な治療を生じる。
SOX1(性決定領域Y−ボックス1を示す)タンパク質は、初期中枢神経系発生に関与する転写因子である。SOX1は、発達中の中枢神経系に特徴的な既知のマーカー特性である。神経板および神経管におけるSOX1の発現は、まだ最終段階に拘束されていない有糸分裂的に活性である前駆体と相関するようである。SOX1は、胚性CNSの分裂中の神経前駆体を定義し、そして特に腹側線条体で発現する(Pevnyら、1998;Kempermannら、2003)。
Moleroおよび同僚ら(2009)は、HDモデルを概説した。このモデルにおい
て、9ヶ月齢で進行性認知障害が発展し、ありうる海馬機能不全が示唆される(Kandasamyら、2010)。彼らは、後期胚性段階で、NSC自己再生、多系譜潜在能力、および神経形成を仲介する因子である高レベルのSOX2とともに、NSC自己再生の増進を観察した。他のグループは、ハンチントン病のトランスジェニックラットモデルの海馬神経幹細胞ニッチにおいて、疾患に関連する海馬前駆細胞増殖の進行性の減少に、トランスジェニック動物における5−ブロモ−2−デオキシウリジン標識保持SOX2陽性休止幹細胞プールの拡大が付随することを示した。
に最終的に分化する神経芽細胞;(iii)患者に投与することによって、CNS疾患を治療する細胞療法のための薬学的に許容されうるキャリアー/ビヒクル中での薬学的組成物としての使用;および/または(iv)神経芽細胞腫および網膜芽細胞腫を治療するが、これらの腫瘍タイプに限定されない腫瘍を治療するための遺伝子療法を含む、抗癌療法のための薬学的に許容されうるキャリアー/ビヒクル中の薬学的組成物としての使用によって提示される。
IDPSCを、集密(confluence)の前まで培養したが、これは基本培地中、25cm2に2x106に等しい。次に、細胞をPBS中で2回洗浄し、そして基本培地を、2% B27を補った神経基本培地(NB+B27)に交換した。培地を3〜4日で交換しなければならない。1週間後、0.25%トリプシン/EDTAで2〜3分処理した後に、細胞を採取し、そして同じ培地で中和した。800xgで5分間遠心分離した後、細胞ペレットを得て、そして上清を取り除いた。次に、NB+B27中で、IDPSCを穏やかに脱凝集させ、そして6つのペトリ皿9.6cm2上に植え付けた。レチノイン酸を0.1μMの最終濃度で24時間添加し、その後、成熟ニューロンを得た。
さらに、ニューロン形態を研究するため、ヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)染色を用いた(図4)。分化中の細胞およびニューロン表現型を獲得するプロセスのものの形態を示す細胞によって形成されるネットワークの両方が観察可能であった(図4A〜4C)。神経中のニッスル顆粒の染色のためにニュートラルレッドを用い(図4D〜4F)、これは、遊離リボソームのロゼットを含む粗面小胞体であり、そしてタンパク質合成部位である。
神経分化のプロセス中、いくつかの細胞は、二核(または多核)であることが見出された。この事実は、細胞融合が分化中のIDPSCにおいて起こる指標であろう。図4Eにおいて、多数の核を持つニューロンが観察可能である。これらの細胞学的データは、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)で確認された(図5)。
的プローブLSI21(Vysis)を用いた。以下に簡潔に記載するように、製造者の指示(Vysis−Abbott)にしたがってFISHプロトコルを用いた。
IDPSC由来ニューロンにおける、ニューロン分化の初期マーカー、ネスチンに対する抗体(図7A〜7B);神経細胞のマーカー、ベータ−チューブリンに対する抗体(図7C〜7E);グリアタンパク質、グリア線維酸性タンパク質(GFAP)に対する抗体(図7F);および成熟神経細胞のマーカー、NeuNに対する抗体(図7J〜7H)を用いた免疫蛍光を用いて、神経分化の特異的タンパク質の発現を実行した。これらのマーカーのすべてが、IDPSCニューロン様細胞において発現された。
先に、Marquesおよび同僚ら(2009)によって記載されるように、成体雌マウス6〜8週齢をケタミンおよびキシラジン(それぞれ、100および15mg/kg)で麻酔し、そして30g血管クリップ(Kent Scientific社、コネチカット州トリングトン)によって、T9レベルで1分間圧迫傷害に供した。術後、温パッド上で動物を回復させ、そして1mLの生理食塩水溶液を投与して、脱水および血液の喪失を補償し、そしてエンロバイトリル(enrobaytril)(2.5mg/kg/日SC)を注射した。自発的な尿機能が戻るまで、膀胱を1日2回、手動で絞った(expressed)。
養因子染色は低い免疫反応性を示すが、群間の染色パターンの相違が観察可能であった(データ未提示)。一般的に、IDPSC処置群は、特に、分析した栄養因子すべてのより高いレベルを示した亜急性群において、DMEM処置群に比較して、領域あたり、増加した免疫反応を示した。慢性群に関して、本発明者らは、BDNFおよびNGF定量化に関して、IDPSC処置群およびDMEM処置群間の相違を観察したのみであった。DMEM処置動物に比較した際、すべての分析した栄養因子に関して、特に亜急性および慢性群両方において、有意により高い免疫標識領域を示したBDNFおよびNGFに関して、IDPSC処置動物において、より強い染色が観察された(図13A〜13D)。
る、Marquesおよび同僚らによって記載される広域移動試験(2009)を用いた。その後、1分間の期間中に動物が到達する速度(cm/秒)を、ImageJソフトウェアを用いて測定した。Bassoマウススケール(BMS)試験もまた行い(Bassoら、2006)、これは、かかとの動き、足の位置、体重支持、足底ステップ、後肢および前肢の協調、および体幹安定性などの自発運動能力および自発運動特徴を示す、9ポイントスケールである。統計分析のため、左および右後肢(HL)から得られるスコアの平均を用いて、動物あたり単一のスコアを確立した。事後比較のための一方向ANOVAおよびチューキー試験を決定した。
イヌ・ジステンパーは、イヌのウイルス性疾患であり、そしてこのウイルスは、パラミクソウイルス群に属する。ヒトにおいて、麻疹ウイルスもまたこの群のメンバーである。症例のおよそ半分は致死性である。イヌ・ジステンパーは、治癒が不可能であり、あらゆる面でイヌの体を攻撃する深刻なウイルス性疾患である。該ウイルスは、イヌの中枢神経系の持続性感染を引き起こし、進行性の多病巣性脱ミエリン化疾患を生じる。動物がひとたび、該疾患の神経学的症状、例えば発作または麻痺を発展させたら、生存の可能性は低く、そして生活の質は、次第に悪くなっていく運命である。したがって、これらの動物は、通常、安楽死となる。
動物の飼い主によってサインされたインフォームドコンセントを得た後、そして国際動物飼育指針にしたがって、動物を実験処置に登録した。また、飼い主にはいかなる費用も負担させずに治療を実現し、そして動物は治療後、長期追跡調査を受けた。
これらはいかなる臨床的寛解も提供しなかった。イヌ自身がウイルスの影響をかわす能力にしたがって、イヌは、この疾患の神経型の症状、例えば後足の麻痺または後足および前足両方の麻痺を得た。
さらに、心筋細胞(CM)様細胞へのIDPSCの分化を観察した(図19)。IDPSCは、融合(図19A)または分化(図19B〜19C1)後、in vitroでCM様表現型および形態を採用しうる。
グ心臓再生療法の新規アプローチを提供する(Yangら、2012)。IDPSCはまた、in vitroで立証されうる天然の自発的な融合能のため、心不全において使用する優れたオプションである可能性もある(図20)。初代ヒト皮膚線維芽細胞(PHSF)、マウス骨髄細胞(MBMC)およびIDPSCを単離し、そしてカルシウムおよびマグネシウム不含ダルベッコのリン酸緩衝溶液(DPBS、Invitrogen)で2回洗浄し、そして0.25%トリプシン/EDTA溶液(Invitrogen)で解離させた。懸濁物を遠心分離し、そして緑色(Dio)蛍光色素(Vybrant CM−Dio細胞標識溶液;Molecular Probes、Invitrogen)を含有する10%ウシ胎児血清(FBS)(Invitrogen)を含むDMEM(Invitrogen)中に細胞ペレットを再懸濁し、一方、赤色(Dil)蛍光色素を含有する同じ溶液中に、IDPSC懸濁物を再懸濁した。細胞を37℃で15分間インキュベーションし、DPBS中で2回洗浄し、そして混合細胞IDPSC:PHSFおよびIDPSC:MBMCを1:1比で植え付けた。どちらの実験でも、効率的で自発的な細胞融合が観察された(図20)。
各試験株(n=4)106細胞でBALB/cヌードマウス(n=15)の腹腔内注射後、生着する能力によって、IDPSCをさらに性質決定した。IDPSC注射の2週間後にマウスを屠殺した際、これらの細胞の高密度の生着がマウス骨髄において観察された(図23)。
IDPSCが未分化である際、セルトリ細胞の重要なマーカー、例えばデスミン、ビメンチンおよびサイトケラチン−18およびCD29(インテグリン・ベータ1)を発現するのは興味深いことであった(図24)。このデータから、これらの細胞は、セルトリ細胞および精原細胞の他のタイプに分化する能力を試験することを正当化する、すべての利
点を有する可能性が高いようであった。パイロット実験において、図25に概略するように、ヒトIDPSC(hIDPSC)の2つの培養を、繁殖性および不妊(放射線照射による)マウス精巣内に移植した。
雄のペルシャ猫、年齢11歳が、中程度の脱水、多尿、多飲、食欲喪失、無感情、および体重喪失の症状を提示したことによって、臨床ケアのため、動物病院を訪れた。バイタルパラメータの身体検査によって、水和の度合いの変化が示され、これはほぼ7%であった。腎機能の評価を行い、尿素>250mg/dl、クレアチニン11.1mg/dl、尿比重1012と測定され、そして腎臓の超音波評価によって、どちらも皮髄境界部の部分的喪失、小さいサイズ、皮質エコー輝度増進を示した。腎臓の測定値は、それぞれ左および右で、幅1.7cm、長さ2.0cm、および幅2.0cm、長さ2.5cmであった。組織学的変化は観察されなかった。
最初のヒトIDPSC療法は、療法支持開始の27日後に行い、第二および第三は41日後および50日後であった。最初の細胞療法中、動物には、1mLの無菌リン酸溶液中で希釈した未分化LP IDPSCの2x106を投与し;0.6mLは腎内(右腎臓のみ)に適用し、そして0.4mLは皮下適用した。この方法のため、動物に5mg/kgモルヒネの鎮痛剤を投与し、そして水槽中、吸入麻酔剤、イソフルランで誘導した。
。静脈内リンゲル乳酸、0.3mLのPlasil、およびカリウム補充液3mL(19.1% KCl溶液)で、0.5mEq/kg/時間の速度を超えずに、液体療法を開始した。4時間後、動物は、発作を起こし、そして死亡した。動物が到着した際に検査を行い、カリウム4.1mg/dl、尿素156mg/dlおよびクレアチニン4.4mg/dlが示され、全処置中に値を維持する処置を取ったため、死亡のありうる原因は腎不全ではないことが示された。
LP増進緑色蛍光タンパク質(EGFP)タグ化IDPSC(EGFP−IDPSC)を記載されるように培養した(Lizierら(2012)PLoS ONE 7:e39885)。Swissマウス(8週齢;雌;体重20〜23g)を用いた。動物をランダムに3つの群に分け、そして切除創傷副子固定モデルを生成した。簡潔には、12匹のマウスにおいて、腹部表面から毛を除去し、そして麻酔した後、2つの5mmの完全な厚さの切開皮膚創傷を、正中線の各側に生成した。各創傷に、100μLのPBS中に希釈した105細胞(LP EGFP−IDPSC)を投与し、そして細胞を4つの注射部位で、創傷周囲に皮内注射した。対照群はPBSのみを投与された。免疫抑制プロトコルは適用されなかった。切開をナイロン(4−0)で縫合した(saturated)。動物を個々に飼育した。本発明者らは、本実験前に、マウスの皮膚に対して接着剤を試験し、そしていかなる皮膚刺激またはアレルギー反応も観察されなかった。動物を7日後に安楽死させた。
による染色は、皮膚におけるコラーゲンの存在を立証し、これは、傷害を受けた部位にEGFP−IDPSCを局所送達することによってリモデリングされた。対照的に、対照群は、皮膚リモデリングを示さなかった(図40)。
神経網膜は、外胚葉細胞、ならびにDPおよびDP由来IDPSCと同じ起源のものからなるため、これらの細胞、網膜およびIDPSCのどちらも、IDPSCを中枢神経系(CNS)のニューロンだけでなく、網膜幹細胞および網膜ニューロン様細胞に生じさせることを可能にしうる、共通の胚性「記憶」を保持しうる。
LP IDPSCを維持し、そしてLizierら、2012に記載されるようにin
vitro拡大した。LP IDPSCからニューロスフェアを得て、これを25cm2の培養フラスコ中、70%の半集密に到達するまで増殖させた。次いで、細胞をトリプシン処理し、そして2つの35mmペトリ皿に分け、1%アガロース(Sigma)であらかじめ処理し、これはプレートの底に薄層を形成した。3%B27を補った神経基本培地(どちらもGibco)を用いた。プレートを、5%CO2インキュベーター中、加湿大気中、37℃で3日間、インキュベーションした。ひとたび形成されたら、ニューロスフェアを他のプレートに移し、そしてIDPSC基礎培地中で接着させるため、カバースリップ上にプレーティングし、翌日、NB+B27に交換した。接着したニューロスフェアを、ニューロスフェアから細胞がアウトグロースを開始するまで、NB+B27+0.5μMレチノイン酸培地に5日間、維持した。次に、0.25%トリプシンを用いて、酵素消化を行い、そして細胞を35mmの新規ペトリ皿に植え付け、同じ培地であるが5μMレチノイン酸添加を伴わずにさらに10日間維持し、そして培地を3日ごとに交換した。細胞培養をさらに5日間維持し、そして次いで、4%ホルムアルデヒド中で固定した。
要約したプロトコルを図44A〜44Fに示し、そして分化のタイムラインを図44Gに示す。
ドプシンの発現を促進する。発生中、中枢神経および末梢系全体で発現されるが、成体期には、新皮質および網膜ニューロンに制限される。網膜細胞で発現される次のマーカーはカルビンディンであり、これは、カルシウム結合ビタミンD依存性タンパク質としても知られ、そして神経組織および水平網膜細胞において発現される。リカバリンは、カルシウムリガンド光受容体タンパク質であり、そして発光適応に必要な酵素であるロドプシンキナーゼ活性の制御に関与する。本発明者らは、このタンパク質を発現するいくつかの細胞を見出した。カルビンディンおよびリカバリンはどちらも、細胞質に局在する(図58〜59)。
外胚葉起源である膵臓β細胞は、外胚葉、神経冠起源であるニューロンと共通の特徴を共有することが、以前示されてきている(Yangら、1999;TeitelmanおよびLee、1987;Baekkeskovら、1990;De Vroedeら、1990)。これらのデータによって、歯科組織は、インスリン産生細胞の生成のための幹細胞のありうる供給源でありうることが示唆される。したがって、酵素消化を用いて得られた乳歯由来のDPSCが、膵臓様β細胞に分化可能であることが報告された(Govindasamyら、2011)。したがって、この研究は、いくつかの疑問を生じた。ランゲルハンス島は、内分泌(すなわちホルモン産生)細胞を含有する膵臓領域であり、膵臓質量のおよそ1%〜2%を構成する。これらの島は、ホルモンを産生する5つの異なる細胞タイプで構成される。
IDPSCにおけるこれらのマーカーの発現パターンの間の重複が明らかである。これは、LP IDPSCが、幹細胞の潜在的に限定されない供給源であり、インスリン産生内分泌細胞ならびに外分泌細胞(導管/小導管)および膵臓ニューロンへの拘束を示すことを示す。
実施例14. 子宮内幹IDPSC移植(IUSCT)
本発明者らは、本明細書において、ひとたびIDPSCを子宮中の胎児内に移植すると、胎児全体に分布しながら、未分化型および分化型で生存し続けることを示し、そして他の実施例において、多組織特異的分子マーカーおよびロバストな分化潜在能力で特徴付けられる、ユニークな多系譜志向のため、多数の細胞タイプに発展することを示す。
胎盤組織に分布する。1つの態様において、本開示は、外因性遺伝物質をIDPSCに形質導入する工程を含む、遺伝子修飾されたIDPSCを得る方法、および遺伝した遺伝子障害および/または獲得障害の治療のため、外因性遺伝子によってコードされる療法タンパク質のための送達系としての、修飾hIDPSC送達系の使用に関する。
・IDPSCはRex1を決して発現しない。
顕著なことに、本発明者らは、子宮中の実験中、分化および未分化LP IDPSCの分布および生着を検出した。これらが分化する際、これらはこれを適切に行い、例えば心臓組織において、これらは適切なマーカーを発現するが、上皮のマーカーであるCK18を発現しない。これらは、CD45を発現するヒトリンパ球に分化することが示された。本明細書に開示するのは、ロバストな多臓器生着および組織にマッチした分化である。比較すると、MAPCは、分化する、より限定された能力を示す:
・MAPCのIUTトランスファーは、上皮細胞タイプへの分化を生じなかった。
孫を、単回または組み合わせた生物学的治療(すなわち、これらは他の再生または療法剤と混合してもよい)として、薬学的キャリアー中で投与して、好ましい細胞タイプへの分化を促進する、ロバストな方法である。これはまた、生着または遺伝子送達が、胎児における臓器系の発生進行にしたがって望ましい場合に好適でありうる。
2004)。
に適用した。ドナー細胞は、動物骨において見られ、そして細胞外構造タンパク質、骨オステオポンチンを産生する骨芽細胞系譜の遺伝子を発現する。治療後、骨折および骨格異常の顕著な減少が観察された(GUILLOTら、2008)。
%パラホルムアルデヒド中で固定するかまたは凍結保存した。
本発明者らは、イヌモデル(イヌ(Canis lupus familiar))、SRD(雑種)、雌、3〜4歳、妊娠ほぼ43日の妊娠動物を用いた。
外科処置の3日、2日、および1日前に、トランスデューサー:7.5MHzリニア、コンベックス5.0MHzおよび別の腔内装置(endocavitary)を備えた、ハンドセットGE(登録商標)ブランド、モデルLogic 100MP超音波検査を行った。画像をデジタル文書化した。
スキーム1は、実験モデルの子宮角を例示する:治療群胎児1、3、4および5の右の子宮角(Cud)は、GFPタグ化IDPSCを投与された。胎児対照群は左の子宮角(Cue)の2および7中にあり;これらを実験対照のために収集した(図61)。
本発明者らは、3つの異なる回で、この研究において使用する外科処置を分けた:
初回は外科処置1の3日前に始まる
1−妊娠した雌の臨床的評価
2−年齢および胎児生存性を決定する腹部超音波(US)
3−CBCのための血液収集
4−術前12時間絶食および4時間水分遮断(fluid deprivation)
5−両方の外科処置における麻酔技術
メペリジン(Cristalia Chemicals and Pharmaceuticals、イタピラ)5mg/kg IM(筋内)とともに、0.1mg/kgの用量のアセプロマジン(Univet、サンパウロ、SP)の前麻酔を15分間行い、その後、ジアゼパム5mg/kgとともに、7.5mg/kg用量のケタミンで麻酔の誘導に進み、次いで、腰仙を通じて、皮下注射針40x8で、血管収縮剤を伴わない2%リドカイン(Cristalia Chemicals and Pharmaceuticals、イタピラ)とともに、1.0mg/3kgの用量のモルヒネでの硬膜外麻酔を用いた。手術中には、4.4mg/kg IV(静脈内を通じる)の用量のフェンタニル(疼痛緩和剤)(Hipolabor、サバラ)およびアンピシリンナトリウム(抗生物質)20mg/kg IVを用いた。
2−子宮胎児を計数するためのマッピング、および胎盤近傍(paraplacentary)右子宮角(CUD)の胎児の同定
3−US−腔内プローブに導かれた、胎児の腹腔の同定
4−腹腔内胎児1、3、4および5 Cudへの、1.0ml無菌生理食塩水中に再懸濁された子宮内IDPSC 1x106細胞の移植
5−毎日のケア:ATB(抗生物質療法)療法、5.0mg/kg SC(皮下)BID(12時間ごと)の用量のエンロフロキサシン10%、ならびに第1日に0.2mg/kg、そして2日目および3日目に0.1mg/kgの用量のSC後、SID(24時間ごと)の抗炎症(Anti−flamatorio)メロキシカム0.2%、ならびに液体ヨウ素およびDakimポルビジン(polvidine)での領域のドレッシング。
1−胎児生存性を決定するための腹部超音波(心拍−HR、蠕動胎児運動)
2−CBCのための母親血液収集
3−術前12時間絶食および4時間水分遮断
外科処置II−3日以内に卵巣卵管子宮摘出術(ovariosalpingohisterectomy)を行い、続いて:
1−臨床評価のため、術後1日目、2日目、および3日目の腹部超音波
2−先に記載するものと同様の毎日の術後ケア(ATB、治癒および抗炎症部位)
3−動物に自由に食物および水を与え、そしてエリザベスカラーをつけて、3日間犬小屋で飼育した。
子宮除去を行った直後の3回目
胎児剖検−胎児1、3、4および5(治療群−CUD)、ならびに胎児2および7対照群−CUE+2 CUD胎児の臓器および組織を、後の異種移植の分析のために収集した。
試料1−1/3の臓器を10%パラホルムアルデヒドに先に入れ、そしてパラフィンに
浸した。
試料3−1/3の臓器を、凍結試験管中、−80℃の冷凍庫で凍結保存した。
トリプシン処理によって細胞を採取し、そしてウシ胎児血清でトリプシンを不活性化し、細胞を15ml試験管に入れた。次いで、材料を1500rpmで10分間遠心分離して、細胞ペレットを形成した。遠心分離後、上清を廃棄し、そして5mlの0.9%生理食塩水溶液中に再懸濁して、1500RPMで10分間洗浄遠心分離し、そして再び上清を廃棄し、そしてFACS緩衝液フローを添加して、懸濁物をサイトメトリー用の試験管に移し、そしてすべての特異的抗ヒト抗体、例えば抗HuNu、抗IDPSC、CD45、CK18、CD146、OCT3/4、β1インテグリン、カルジオチン、MyoD1およびミオゲニン、ヒトを添加し、4℃で15分間インキュベーションした。FACS Caliburフローサイトメーター上で、10,000事象に関して、発現分析を行い、そして獲得プログラムMdi Win 2.8によって分析した。FITC非特異的蛍光色素で標識したアイソタイプ対照と比較することによって、マーカー発現を決定した。
多様な臓器から細胞を単離した後、これらを注意深く、1mlの70%エタノールRNアーゼに再懸濁し、微量遠心管に移し、そして−20℃の温度で保存した。固定した試料をあらかじめ2000rpmで5分間遠心分離し、そして保存した。上清を廃棄し、細胞を1mlサイトメトリー緩衝液中に再懸濁し、そして再び遠心分離した。遠心分離後、上清を廃棄し、そして細胞をPI溶液中に再懸濁し、5mlのPBSから調製して、これに5μl Triton 100(0.01% v/v)、50mLのRNアーゼA(2mg/ml)および20μlのヨウ化プロピジウム(5mg/ml)を添加した。次いで、フローサイトメーターFACS Caliburでデータフローを10,000事象に関して獲得し、そして分析プログラム、Mdi Win 2.8を用いた。
ヨウ化プロピジウム(PI)は、DNAの二本鎖に散在する(intersperses)化学量論蛍光色素である。蛍光はFL−2で捕捉され、そしてこれは細胞中のDNA含量に比例する。複製していない(細胞周期のG0/G1期)二倍体細胞は、2n細胞含量を有し、DNA含量の増加がある間のS期に位置する細胞よりも、より低い強度のシグナルを放出する。S期の細胞は、続いて、4nへのDNA含量の完全な複製が完了するまで、G2/Mに位置するものより低い強度のシグナルを生成し、これは、G2期から減数分裂まで、このままであり、減数分裂時で各母細胞は、2つの娘細胞を生じる。
免疫組織化学分析には、スライド上にマウントされたパラフィン切片を用いた。この方法のため、材料をあらかじめ4%のパラホルムアルデヒドに入れ、パラフィン包埋し、そして5.4μm(Microtome、LEICA)に切断した。
三胚葉由来の多様な組織において、EGFP LP IDPSCの移植に関して多くの証拠を提供した後、本発明者らは、レシピエント組織内のありうる増殖および分化を評価した。
肺組織は、赤色免疫陽性染色によって測定されるように(図X A、B)、高率のEGFP LP IDPSC移植を示した。ローダミン二次抗体の選択は、緑色EGFP LP IDPSCによって放出される蛍光シグナルの干渉を回避するためであった。移植率は、抗IDPSCの発現によって観察した際は52.8%、そして抗HuNu抗体では50.2%であった(図62A〜62B)。次いで、フローサイトメトリーによって、EGFP LP IDPSCに関して、増殖を分析し(図62C〜62D)、そして53.17%のEGFP LP IDPSCがDNA断片化を有し、29.88%がG0/G1期にあり(静止細胞そしてDNA合成の準備中)、8.53%がDNA合成のS期で見られ、そして8.65%が細胞分裂のG2期にあった。
中胚葉中のEGFP LP IDPSCの定量化を、骨格筋組織(大腿二頭筋)(図6
3A〜63D)および腎組織(図64A〜64D)を用いて行った。抗IDPSCおよび抗HuNuの発現によって測定されるような移植率は、それぞれ、34.29%および36.86%であった。大腿二頭筋に移植されたEGFP LP IDPSCの細胞周期の分析によって、22.28%が断片化DNAを有し、8.82%がG0/G1期(静止細胞そしてDNA合成の準備中)にあり、そして2.64%がDNA合成のS期であり、そして31.70%が細胞分裂のG2期にあることが明らかになった(図63C〜63D)。
腎組織において、EGFP LP IDPSC移植率は、42.3%(抗IDPSC)および31.3%(抗HuNu)(図64A〜64B)であった。大腿二頭筋におけるEGFP LP IDPSCの細胞周期の分析によって、50.07%が断片化DNAを有し、15.92%がG0/G1期にあり、8.97%がS期にあり、そして25.25%がG2期にあることが明らかになった(図64C〜64D)。
脳組織試料において、EGFP LP IDPSC移植率は13.1%(抗IDPSC)および13.4%(抗HuNu)と観察された(図65A〜65B)。脳におけるEGFP LP IDPSCの細胞周期分析によって、8.52%の細胞が断片化DNAを有し、3.24%がG0/G1期にあり、29.1%がS期にあり、そしてG2期が66.59%にあることが明らかになった(図65C〜65D)。
本発明者らは、胎盤材料および胎盤血腫におけるEGFP LP IDPSCの移植を検出した。本発明者らは、胎盤ベルトにおけるEGFP LP IDPSC移植のみ定量化し、そしてこの移植が64.8%(抗IDPSC)および65.6%(抗HuNu)であることを見出した(図66A〜66B)。次いで、本発明者らは、胎盤ベルト、胎盤血腫におけるEGFP LP IDPSC生存度および増殖を別個に分析し、これは胎児構造とは異なっていた。本発明者らのデータは、胎盤組織の環境および機能が、EGFP LP IDPSCの生存度および増殖に対する影響を有しうることを示唆する。胎盤中央ベルトにおける細胞周期の分析によって、21.96%のEGFP LP IDPSCが断片化DNAを有し、10.83%がG0/G1期にあり、3.59%がS期にあり、そして38.64%がG2期にあることが明らかになった(図66C〜66D)。中央胎盤ベルトに関して、挫傷周辺部または側部ポケットにおいて、より高率の断片化DNA31.82%、そしてより低いG1/G2期、S期およびG2期の、それぞれ、7.40%、1.63%および13.13%が示された。
筋組織におけるOct3/4およびMSCマーカーの発現
Oct3/4を発現しながら分化していないEGFP LP IDPSCが知られる(Kerkisら、2006)。本研究により、EGFP LP IDPSCがイヌ胎児心筋において、高い移植を示すため、本発明者らは、この組織においてこのマーカーの発現を分析した。免疫蛍光分析によって、EGFP LP IDPSCにおいて、このタンパク質の発現が示され、そして核内に位置することが示された(図67A1〜67A3)。これらの細胞のサイズは5μm未満であり、これによって、これらが、サテライト細胞とも呼ばれる筋細胞の特性および局在を示すことが示唆される。フローサイトメトリーによって、EGFP LP IDPSC率の定量化が可能であり、これは抗Oct3/4抗体を発現し、これは21.3%に等しかった(図68A〜68B)。同時に、MSCマーカーの発現率に関しては:同じ組織中のCD146(周皮細胞)およびβ1−インテグリンは非常に低く、そしてそれぞれ、0.1%および0.5%であった。
本発明者らは、EGFP LP IDPSCが心筋の筋組織において、分化プロセスを経るかどうかを評価した。ミオゲニンおよびカルジオチン(cardiotin)タンパク質は、それぞれ29.7%および49.1%の率で、これらの細胞において発現され(図69)、一方、上皮細胞マーカーであるCK18の発現は、予期されるとおり、筋組織において4.7%と低かった。異なるタイプの造血細胞のマーカーであるタンパク質CD45は、移植心臓組織中のEFGP LP IDPSCにおいて発現された。この結果を検証するため、本発明者らは、心筋および異なると予期される動脈において、このマーカーの発現を比較した。予期されるように、心筋上のCD45の発現は、9.6%であり、それに対して動脈では19.5%であった(図69)。大腿二頭筋の横紋筋における分化した筋細胞のマーカーの発現研究によって、分析細胞のそれぞれ33.87%および7.5%でのMyoD1およびミオゲニンの存在が明らかになった(図69)。CK18は細胞の7.7%で陽性であり、一方、CD45は分析細胞の12%で陽性であった。
心臓組織中の分化したIDPSCのマーカー発現は、心臓タンパク質ミオゲニンおよびカルジオチンの陽性発現、ならびにCK−18に関する陰性を示した。本発明者らは、CD45+の陽性発現を観察し、その量は、心筋および動脈弓で多様である(図70)。
EGFP LP IDPSCは、Oct3/4に関する陽性の免疫染色を示し、これは核および核周囲局在を示す(図72)。EGFP LP IDPSC Oct3/4の率もまたフローサイトメトリーによって評価し、そしてこれは12.6%であった。MSCマーカー、例えばCD146(周皮細胞)およびβ1−インテグリンは、それぞれ、2.5%および18.3%であった(図73)。
ヒト歯髄(DP)は、Kerkisら(Kerkisら(2006)OCT−4および他の胚性幹細胞マーカーを発現している未成熟歯髄幹細胞集団の単離および性質決定。Cells Tissues Organs 184:105−116)に以前記載されるように、メスを用いて、歯の尖端部分の除去を通じて、10人の健康な被験体(6〜9歳の範囲)の10の乳歯から摘出された。
ン、2mM L−グルタミン、および2mM非必須アミノ酸(すべてInvitrogen)を補充したダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)/HamのF12(DMEM/F12、Invitrogen社−米国カリフォルニア州カールスバッド)中で、DP組織外植片を培養した。
新鮮に抽出された歯髄(DP)は、歯冠および歯根歯髄の中央領域に大きな神経幹および血管を含有する(図76A)。線維芽細胞様細胞の最初のアウトグロースは、DPプレーティング3〜4日後の間に現れた(図76B)。酵素処理の使用を伴わずに、新規培養プレート内にDPを機械的にトランスファーすることによって、長期培養を行った。各トランスファー後、DPは、3または4日ごとに、多数のアウトグロースする(outgrowing)細胞を産生し、したがって継代ゼロ(P0)で幹細胞(SC)の一定の産生が可能であった(図74および75を参照されたい)。本発明者らは、少なくとも6ヶ月の間、各3〜5日間のDPの多数回の機械的トランスファーを行った。本発明者らは、乳歯のすべての試料(n=10)での単離に成功した。
透過型電子顕微鏡検査(TEM)用に、IDPSCのEPおよびLPを2.5%グルタルアルデヒド(Sigma)中で48時間固定し、1%リン酸緩衝四酸化オスミウム溶液(pH7.4)(Sigma)中で4℃で2時間、後固定し、そしてSpurrの樹脂(Sigma)中に包埋した。自動ウルトラマイクロトーム(Ultracut R、Leica Microsystems、ドイツ)を用いて、超薄層切片を得た。切片を、酢酸ウラニル(Sigma)およびクエン酸鉛(Sigma)(それぞれ、2%および0.5%)で二重染色し、そしてTEM(Morgagni 268D、FEI社、オランダ;Mega)を用いて分析した。
後の機械的トランスファー中の細胞アウトグロースから単離したIDPSC)両方の形態が保持された(図76Cを参照されたい)。TEMは、2つのタイプのIDPSC形態を明らかにした:
1. 低い細胞質対核比、低い細胞質密度、および少ない細胞内小器官を持つES様細胞(図76D);ならびに
2. ES様IDPSCに比較して、より多い細胞質および細胞内小器官を持ち、基盤探査で作用する伸張した仮足を多数有するMSC様細胞IDPSC(図76E)。
DMEM/F12培地(Invitrogen)中で培養するIDPSCの集密未満のEPおよびLPの核型決定を継代3で行った。採取前、最終濃度0.1mg/mlのデメコルシン(Sigma)を1時間添加した。細胞を採取し、PBS中で洗浄し、そして0.5mlの培地中に再懸濁し、そして0.075M KCl(Sigma)と10mlの体積まで混合した。室温で20分間インキュベーションした後、細胞を400gで5分間遠心分離して、そしてペレットを5ml中で3倍(3:1)の冷メタノール/酢酸(Sigma)中で固定した。スライドあたり細胞懸濁物3滴を固定した。染色体計数のため、ギムザ中でスライドを15分間染色し、そして;細胞株あたり>200細胞を分析し、そしてヒト細胞遺伝学命名のための国際的システムにしたがって、Zeiss II顕微鏡(Zeiss、ドイツ・イエナ)上で報告した。
in vitro培養中のDPにおけるBrdU陽性細胞を調べるため、歯髄をPBSで穏やかにリンスし、そしてスライスした。各スライスを異なる培養プレートに入れた。次に、5−ブロモ−29−デオキシウリジン(BrdU、Sigma)を基本培地内に直接添加した。最初の歯髄スライスを固定し、そしてBrdUで6時間処理した後にプロセシングした。歯髄スライスを含む第二の培養プレートにおいて、BrdUを42時間後に添加し、そして第三のプレートにおいて、66時間後に添加した。
KO、デンマーク・グロストラップ)で30分間インキュベーションした。試料をPBST(0.1%Tween20を含むPBS)で洗浄し、そしてStrepABComplex/HRP(DAKO)と1:100希釈で30分間インキュベーションした。さらに1回PBSTで洗浄した後、色素原3(3−ジアミノベンジジンDABキット、Zymed Laboratories, Inc.)で5分間、発色させ、その後、PBST洗浄し、Harrisヘマトキシリンで45秒間、核対比染色し、脱水し、そしてPermount中でマウントした。Carl Zeiss Axioplan蛍光顕微鏡(Zeiss)を用いて、切片の観察を行った。一次抗体をPBSによって置換した以外は、陰性対照切片を同様に処理した。
に近い尖端部分のDP周辺でもまた見られた(図77C)。
組織特異的幹細胞単離には少なくとも2つの方法:酵素処理および外植片培養が使用可能である。幹細胞単離のため、柔組織を小片に切り、そして組織脱凝集後、酵素で処理した。
IDPSC免疫表現型決定は、免疫蛍光に基づき、そして抗ヒト特異的抗体:ビメンチン、ネスチン、フィブロネクチン、およびOct3/4(すべてSanta Cruz Biotechnology、米国カリフォルニア州サンタクルーズより);ならびにCD105/SH−2およびCD73/SH−3(どちらも、Case Western Reserve University、米国オハイオ州より)を用いることによって、フローサイトメトリー分析を行った。FITCコンジュゲート化二次抗体(Chemicon、米国カリフォルニア州テメキュラ)を用いて、そしてそれぞれのアイソタイプマッチ対照を用いた。PBS中の4%パラホルムアルデヒド(Sigma)中で細胞固定し、そしてPBS中の0.1% Triton X−100(Sigma)中で透過処理した後、前述の抗体を用いて、免疫蛍光を分析した。IDPSCを5%ウシ血清アルブミン(BSA、Sigma)とインキュベーションし、PBS中で30分間希釈し、そしてPBS(Invitrogen)中、1:500の最終希釈で、FITCコンジュゲート化ヤギ抗マウスまたは抗ウサギ免疫グロブリン(Chemicon)と、室温で1時間、さらにインキュベーションした。
kon Eclipse E1000(Nikon、日本・神奈川)を用いて、免疫蛍光を検出した。CCDカメラ(Applied Imagingmodel ER 339)でデジタル画像を獲得し、そして用いたドキュメンテーションシステムは、Cytovision v.2.8(Applied Imaging社−米国カリフォルニア州サンタクララ)であった。
SH2/CD105、SH3/CD73(MSCマーカー)およびOct3/4(ES細胞マーカー)を含むいくつかのマーカーを用いて、初期集団(EP)および後期集団(LP)幹細胞を性質決定した。さらに、MSCマーカー、例えばビメンチン、ネスチン、フィブロネクチンの発現をEPおよびLPの両方で評価した。代表的な図79(A1〜E
1、A2〜E2)は、すべてのMSCマーカーが両方の集団(EPおよびLP)で発現され、そして多数回のDPトランスファーサイクル6ヶ月後、Oct3/4を例外として、LP SCでわずかに減少したことを示す(図79A2〜79E2)。
細胞増殖に対する異なる培地の影響を評価するため、新鮮に単離し、そして同じIDPSC凍結融解物を3つの群(DMEM/F12)、DMEM低グルコース(1000mg/ml;DMEM−LG)、および最小必須培地(MEM)アルファ培地(MEM−アルファ)に等しく分けた。すべての培地(Invitrogen)に15%FBS(Hyclone)、100単位/mlペニシリン、100mg/mlストレプトマイシン、2mM L−グルタミン、および2mM非必須アミノ酸(すべてInvitrogen)を補った。細胞を105/cm2の密度で植え付け、そして少なくとも連続15日間カウントして、増殖率および凍結保存の影響を評価した。DP組織外植片が凍結保存および融解の連続周期後にIDPSCを産生する能力もまた検証した。すべての実験を3つ組で行った。
アルファ培地中で培養したEPおよびLPの増殖率を評価し、そして凍結保存前のものと比較した際、類似の増殖潜在能力を示した(図81B、表5)。DMEM−LG中で培養したIDPSCの非凍結保存EPおよびLPは、骨原性系譜への自発的な分化を示し(データ未提示)、そして増殖潜在能力の迅速な減少を示した(図81A、表5)。興味深いことに、融解後、DMEM−LG中で培養したIDPSCのEPおよびLPは、増殖状態を維持した(図81B、表6)。DMEM/F12およびMEM−アルファ培地は、IDPSCの非凍結保存および凍結保存EPおよびLPにおいて、いかなる自発的な分化も誘導しなかった。
IDPSCのEPおよびLPを、3つの異なる培地(DMEM/F12、MEM−アルファ、およびDMEM−LG)中、7回の継代中で培養した。遺伝子発現に対するこれらの異なる培地の影響を評価するため、Trizol(Invitrogen)を用いて、総RNAを抽出した:IDPSCをPBS中で洗浄し、そしてRNA抽出を製造者の支持にしたがって行った。1μgの総RNAから、RevertAid M−MuLV逆転写
酵素およびオリゴ(dT)(Fermentas Life Science、米国ニューヨーク州アムハースト)を用いて、製造者の指示にしたがって逆転写して、cDNAを合成した。試薬の最終濃度は以下の通りであった:20μlのPCR反応物を、2μl cDNA、0.2μMの各プライマー、1単位のTaq DNAポリメラーゼ、0.2μMのdNTP、1.5mMの塩化マグネシウムおよびTaq DNAポリメラーゼ緩衝液(Fermentas Life Science)で調製した。プライマー配列(順方向および逆方向)、および増幅産物の長さを要約する:ネスチンFW 5’−CTCTGACCTGTCAGAAGAAT−3’(配列番号l)およびRV 5’−GACGCTGACACTTACAGAAT−3’(配列番号2)(302bp/54℃);ビメンチンFW 5’−AAGCAGGAGTCCACTGAGTACC−3’(配列番号3)、およびRV 5’−GAAGGTGACGAGCCATTTCC−3’(配列番号4)(205bp/55℃);フィブロネクチンFW 5’−GGATCACTTACGGAGAAACAG−3’(配列番号5)およびRV 5’−GATTGCATGCATTGTGTCCT−3’(配列番号6)(386bp/56℃); OCT3/4 FW 5’−ACCACAGTCCATGCCATCAC−3’(配列番号7);およびRV 5’−TCCACCACCCTGTTGCTGTA−3’(配列番号8)(120bp/61℃); SH2/CD105 FW 5’−TCTGGACCACTGGAGAATAC−3’(配列番号9)、およびRV 5’−GAGGCATGAAGTGAGACAAT−3’(配列番号10)(171bp/56℃); SH3/CD73 FW 5’−ACACGGCATTAGCTGTTATT−3’(配列番号11)、およびRV 5’−AGTATTTGTTCTTTGGGCA−3’(配列番号12)(391bp/56℃)。軟骨原性および筋原性分化に関しては、以下のプライマー配列を用いた: COMP
FW 5’−CCGACAGCAACGTGGTCTT−3’(配列番号13)、およびRV 5’−CAGGTTGGCCCAGATGATG−3’(配列番号14)(91bp/53℃); ACTB FW 5’−TGGCACCACACCTTCTACAATGAGC−3’(配列番号15)、およびRV 5’GCACAGCTTCTCCTTAATGTCACGC−3’(配列番号16)(395bp/59℃); MYOD1 FW 5’−GCCGCCTGAGCAAAGTAAATGAGG−3’(配列番号17)、およびRV 5’−TAGTCCATCATGCCGTCGGAGC−3’(配列番号18)(280bp/53℃)。GADPH遺伝子FW 5’ACCACAGTCCATGCCATCAC−3’(配列番号19)、およびRV 5’−TCCACCACCCTGTTGCTGTA−3’(配列番号20)(463bp/61℃)を対照として用いた。未分化IDPSCを陰性対照として、分化特異的プライマーに関して調べた。以下の条件下で、PCR反応を行った:94℃5分間の1周期、その後、94℃1分間、1分間のアニーリング温度、および72℃1分間の35周期。1.5%アガロースゲル(Sigma)上の電気泳動によって、増幅産物を分離し、そしてエチジウムブロミド(Sigma)染色を用いて視覚化した。
フローサイトメトリー分析のため、細胞表面分子に対する以下の抗体およびそのそれぞれのアイソタイプ対照を用いた:モノクローナル抗ヒトCD45、CD13(Sigma
)、CD43、およびCD34(BD−PharMingen、米国カリフォルニア州サンディエゴ)およびCD105(Serotec、英国オックスフォード)。SH−2、SH−3、およびSH−4は、Case Western Reserve University(米国オハイオ州クリーブランド)から、マウス抗ヒトHLA−ABCおよびHLA−DR(Chemicon)、CD90、CD146(BD PharmingenTM)、CD29(Serotec)、CD117/c−kit、CD44/Hcam(米国カリフォルニア州サンタクルーズ)。約106細胞を一次抗体と氷上で30分間、インキュベーションし、PBS+2%FBSおよび1Mアジ化ナトリウム(緩衝剤)中で洗浄し、その後、二次FITCまたはフィコエリトリン・コンジュゲート化抗体を添加した。細胞内抗原を染色するため、細胞を固定し、そして透過処理プロトコルにしたがった。ペレットを1mlのTween−20溶液(PBS中、0.2%)に室温で再懸濁し、そして混合物を37℃の水槽で15分間インキュベーションした。CELL Questプログラム(Becton, Dickinson)を用いて、蛍光活性化細胞ソーター(FACS、Becton, Dickinson、米国カリフォルニア州サンノゼ)上でフローサイトメトリー分析を行った。
i)CD44は、80〜250kDa I型(細胞外N末端)膜貫通糖タンパク質であり、そして該ヒアルロナン受容体は、MSC遊走において重要な役割を果たし、そして組織再生の課題のため、MSCの創傷部位への補充に非常に重要であるようである(Zhuら、2006);
ii)幹細胞因子/c−kit(チロシンプロテインキナーゼKit)またはCD117;
iii)CD90またはThy−1は、多様な幹細胞および成熟ニューロンの軸索突起のマーカーとして、使用可能である;
iv)CD29−表面抗原発現は、神経冠様および間葉系免疫表現型を明らかにした(Pruszakら、2009);
v)ネスチンは、多分化能神経幹細胞のマーカーであり、そしてまた、毛包芽幹細胞においても発現される;そして
vi)ビメンチンは、神経幹細胞マーカーであり、これはまた、のちにより特殊化されたネットワークで置き換えられる前に、未成熟細胞において発現される(Langaら、2000)。
LP IDPSCにおいて、BDNF、NGF、NT−3およびNT−4に関してフローサイトメトリーを行った。上述の同じプロトコルにしたがい、そして用いた一次抗体は:ウサギ抗ヒトBDNF(Preprotech、1:100)、ウサギ抗ヒトNGF(Preprotech、1:100)、ヤギ抗マウスNT−3(Preprotech、1:100)、ヤギ抗マウスNT−4(Preprotech、1:100)であった。p75タンパク質の発現を、Ab3125マウス・モノクローナル抗体(Abcam、英国ケンブリッジ)またはアイソタイプ対照を用いて、FACS分析によって監視した。一次インキュベーション後、スライドを洗浄し、そして適切な抗体、Alexa 488ヤギ抗ウサギ(Sigma、1:600)またはAlexa 488ウサギ抗ヤギ(Sigma、1:600)と、室温で2時間インキュベーションした後、3回洗浄し、そしてFluoromount(Sigma)でカバースリップ処理した。
GAG CAT C−3’)(配列番号22); GDNF−F(5’−CAC CAG ATA AAC AAA TGG CAG TGC−3’)(配列番号23)、GDNF−R(5’−CGA CAG GTC ATC ATC AAA GGC G−3’)(配列番号24); NGF−β−F(5’−ATA CAG GCG GAA CCA CAC TCA G−3’)(配列番号25)、NGF−β−R(5’−GTC CAC AGT AAT GTT GCG GGT C−3’)(配列番号26); NT−3−F(5’−TGG GGG AGA CTT TGA ATG AC−3’)(配列番号27)、NT−3−R(5’−CTG GCA AAC TCC TTT GAT
CC−3’)(配列番号28); NT−4/5−F(5’−AGG AGG CAC
TGG GTA TCT GA−3’)(配列番号29)、NT−4/5−R(5’−ATC CCT GAG GTC TCT CAG CA−3’)(配列番号30)。それぞれ、ゲノムDNAからの増幅の非存在および混入の非存在に関して、逆転写酵素を含まず、そしてテンプレートを含まない反応を、陰性対照として行った。アンプリコンは、147bp(脳由来神経栄養因子、ヒト−BDNF)、335bp(グリア細胞由来神経栄養因子、ヒト−GDNF)、174bp(神経成長因子、ベータポリペプチド、ヒト−NGF−β)、201bp(ニューロトロフィン3、ヒト−NT−3)、198bp(ニューロトロフィン4/5、ヒト−NT−4/5)を有した。
CSC)から生じる可能性があり、そしてNCSC特徴を持つこれらの歯髄幹細胞は、成人期まで持続し、環境に応じて、非常に多様な細胞を生成可能である。本発明者らは、初めて、LP IDPSCが、感覚および運動軸索成長を促進することが知られる、高レベルの神経栄養因子、例えばBNDF(脳由来神経栄養因子)、GNDF(グリア細胞株由来神経栄養因子)、NGF−β(神経成長因子)、NT−3(ニューロトロフィン−3)、NT−4/5(ニューロトロフィン−4/5)(図84A〜84Eおよび84G)、ならびにp75(ニューロトロフィン受容体およびNCSCのマーカー)(図84Fおよび84H)を天然に、恒常性に発現することを示した。蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)分析(図84A〜F)は、LP IDPSC集団において、BDNF(100%)、GNDF(99%)、NGF−β(99%)、NT−3(70%)、NT−4/5(80%)およびp75(90%)の比率を示した。
LP IDPSCはまた、上皮細胞運命に、そして特に目の表面の上皮に重要であるマーカーサブセットを発現することも示された。免疫組織化学分析を用いて、いくつかの角膜縁幹細胞および上皮タンパク質の存在を、未分化LP IDPSCにおいて評価した。以下の抗体を用いた:マウス抗ヒトモノクローナル抗体:抗インテグリンベータ1(インテグリンβ1)(Santa Cruz Biotechnology、米国カリフォルニア州サンタクルーズ)、コネキシン43(Chemicon)、ABCG2(Chemicon)およびビメンチン(NeoMarkers、米国カリフォルニア州フレモント)、ならびに細胞質/核モノクローナル抗体:マウス抗サイトケラチン3/12(K3/12)(RDI、米国ニュージャージー州フランダース)はヒトおよびウサギと反応、ならびにマウス抗ヒト抗p63(Chemicon)。細胞をガラスカバースリップ上、最大70%集密まで増殖させ、PBS(Gibco)中で洗浄し、そして4%パラホルムアルデヒド(Sigma)で一晩固定した。カバースリップを、20mm Tris−HCl pH7.4(Vetec、ブラジル・リオデジャネイロ州ドゥケ・デ・カシアス)、0.15M NaCl(Dinamica Reagent、ブラジル・サンパウロ州サンパウロ)、および0.05%Tween−20(Sigma)を含有するTris緩衝生理食塩水(TBS)中で3回洗浄した。0.1%Triton X−100を用いて、透過処理を15分間行った(Santa Cruz Biotechnology)。細胞を3回洗浄し、そしてPBS pH7.4(Gibco)中、5%ウシ血清アルブミン(Sigma)中で30分間インキュベーションした。一次抗体を、異なる希釈で(コネキシン43、ABCG2、ビメンチン、インテグリンβ1およびK3/12(1:100)、p63(1:200)および抗hIDPSC(1:1000))、各スライド上に1時間添加し、これを室温でインキュベーションした。TBS中で洗浄した後(3回)、細胞を暗所で1時間、二次抗マウス抗体コンジュゲート化イソチオシアン酸フルオレセイン(FITC)と1:500希釈でインキュベーションした。顕微鏡スライドを褪色防止溶液(Vectashieldマウンティング媒体、Vector Laboratories、米国カリフォルニア州ハーキュルス)中、4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAPI)中でマウンティングし、そして共焦点顕微鏡を用いて分析した。対照反応を、一次抗体の代わりにPBSとインキュベーションし、その後、洗浄し、そしてそれぞれの二次抗体とインキュベーションした。
CTGCTGTAG(配列番号37)58℃;K12(150bp)ACATGAAGAAGAACCACGAGGATGTCTGCTCAGCGATGGTTTCA(配列番号38)58℃;β−アクチン(208bp)GGCCACGGCTGCTTC(配列番号39);GTTGGCGTACAGGTCTTTGC(配列番号40)55℃。ヒト角膜縁および角膜上皮の試料は、インフォームドコンセントの後、サンパウロの連邦大学眼科学科の患者によって供与され、そして本研究において対照として用いられた。これらのヒト角膜縁、角膜上皮、およびLP IDPSC由来の総mRNAは、製造者のプロトコルにしたがって、TRIZOL試薬(Invitrogen)を用いて抽出された。SuperScript第一鎖合成系およびオリゴdT20プライマー(どちらもInvitrogen)を用いて、総mRNAをcDNAに逆転写した。反応あたり約2μlのmRNAを用いた。試薬の最終濃度は、1xPCR緩衝液、0.2mM dNTP混合物、各0.2μmのプライマー(上記);1.5mmのMgCl2、および2単位の白金Taq DNAポリメラーゼ(Invitrogen)であり、最終濃度は50μlであった。MiniCycler(MJ Research、米国カリフォルニア州サンディエゴ)を用いて、PCRを行った。以下の条件下でPCRを行った:1周期の94℃5分間、その後、35周期の94℃1分間、アニーリング温度の1分間、および72℃1分間。PCR産物を2%アガロースゲル電気泳動によってサイズ分画し、そして2%エチジウムブロミド(Sigma、米国ミズーリ州セントルイス)を用いて染色した。ヒトβ−アクチン遺伝子を対照として用いた。
一次抗体Oct3/4およびNanog(Chemicon、米国カリフォルニア州テメキュラ)を1:40で希釈した。適切なFITC二次抗体を1:100希釈で、室温で40分間添加した。顕微鏡スライドを、4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAPI;Vector Laboratories、米国カリフォルニア州バーリンゲーム)を含みまたは含まず、Vectashieldマウンティング媒体(Invitrogen)中でマウンティングした。冷却CCDカメラ(PCO、VC44)で獲得し、そしてISISソフトウェア(MetaSystem、米国マサチューセッツ州ベルモント)でプロセシングしたデジタル画像を用いて、視覚化を達成した。総RNAをTrizol試薬(Invitrogen)で精製し、そしてTurbo DNA不含キット(Ambion、米国テキサス州オースティン)で処理して、ゲノムDNA混入を取り除いた。ヒトES細胞を対照として用いた。製造者の指示にしたがって、ReverTra Ace−αおよびdT20プライマーでの逆転写反応に、1マイクログラムの総RNAを用いた。PCRをExTaqで行った。RT−PCRプライマー配列は以下の通りである:(5’から3’) Oct3/4(End−S) GAC AGG GGG AGG GGA GGA GCT AGG、(配列番号41);(End−AS) CTT CCC TCC AAC CAG TTG CCC CAA AC(配列番号 42); SOX2(End−S) GGG AAA TGG GAG GGG TGC AAA A
GA GG(配列番号43)、(End−AS) TTG CGT GAG TGT GGA TGG GAT TGG TG(配列番号44); Nanog(S) CAG CCC CGA TTC TTC CAC CAG TCC C(配列番号45)、(AS) CGG AAG ATT CCC AGT CGG GTT CAC C(配列番号46); GAPDH(S) GCA CCG TCA AGG CTG AGA AC(配列番号47)、(AS) TGG TGA AGA CGC CAG TGG A(配列番号48)。
プライマー:5’−AATGAAGGGACACAGAGGTTTC−3’(配列番号49)および
5’−CCAGTAGCACCATCATTTCCAC−3’(配列番号50)
産物サイズ:198bp
アニーリング温度:61℃
定量的PCRを用いて、ヒト上皮幹細胞(hESC)に対する発現パーセントを決定した。
製造者の指示にしたがって、RNeasyミニキット(Qiagen、ドイツ・デュッセルドルフ)で、乳歯(DL−1およびDL−4)から、そして第三大臼歯(DL−2)から単離したLP IDPSCの細胞試料から、総RNAを調製した。QIAGEN OneStep RT−PCRキット(Qiagen)を用いることによって、〜800ngの総RNAに対して、相補的DNA合成を実行し、そして以下に示す遺伝子特異的プライマーを用いて、生じたcDNA産物を増幅した。
プライマー:5’−AATGAAGGGACACAGAGGTTTC−3’および
5’−CCAGTAGCACCATCATTTCCAC−3’
産物サイズ:198bp
アニーリング温度:61℃
フィブロネクチンIIIA
プライマー:5’−GGTCAGTCCTACAAGATTGGTG−3’(配列番号51)および
5’−CTTCTCCCAGGCAAGTACAATC−3’(配列番号52)
産物サイズ:223bp
アニーリング温度:61℃
テネシン−C
プライマー:5’−AGAAGAGGTGTCCTGCTGACTG−3’(配列番号53)および
5’−TCATGTCACTGCAGTCATAGCC−3’(配列番号54)
産物サイズ:285bp
アニーリング温度:61℃
ビメンチン
プライマー:5’−AATCCAAGTTTGCTGACCTCTC−3’(配列番号55)および
5’−TGTAGGTGGCAATCTCAATGTC−3’(配列番号56)
産物サイズ:327bp
アニーリング温度:61℃
Primer3ソフトウェアv.0.4.0を用いることによって、プライマーを設計した。産物を1.5%アガロースゲル上で電気泳動し、エチジウムブロミドで染色し、そしてソフトウェアKodak 1D v.3.6.5K2(Kodak)を用いて、トランスルミノメーターGel Logic 100画像化系(Kodak、コネティカット州ニューヘブン)で視覚化した。ソフトウェアAdobe Photochop CS2で、バンドの比較密度測定を得た。
IDPSCの3つの集団は、ビメンチン、テネシン、およびフィブロネクチン遺伝子の類似の発現を示した。密度測定分析は、DL−2細胞におけるI型コラーゲンに関して、総RNAが、他のhIDPSCにおいて観察されてきているものより有意により少ないことを示した(p<0.05)。
実施例30. SOX2発現細胞が濃縮された未分化IDPSC集団
IDPSCは、若い生物から単離される神経冠幹細胞である。したがって、本発明者らは、低酸素環境を考慮して、in vitroで、そして機械的DPトランスファー後に、複数回の継代のこれらの細胞におけるSOX2の発現を検証した。15サイクルのDPトランスファー後に得た未分化EP IDPSCは、継代2のSOX2タンパク質のロバストな発現を示し(図90a、A〜A1)、一方、in vitro培養後、SOX2発現は次第に減少した。継代5で、SOX2発現は、いくつかのEP IDPSCでしか観察されなかった(図90a、B〜B1)。
IDPSCは、遊走神経冠幹細胞であり、ニューロスフェアに凝集可能である。発生中、SOX2は、神経になる運命の細胞によってのみ、再獲得されることが知られる。SOX2不含のままである神経冠幹細胞は、他の細胞タイプに分化し、ニューロンには決してならない。
在を示す。より具体的には、図91aは、ニューロン由来のhIDPSCの後期集団(LP)中、Sox1およびβ−チューブリンタンパク質の発現を示す。以下もまた、図91aで示される:A.DAPI染色されたニューロンの核(白い矢印);A1.ニューロンの核(白い矢印)で観察されたSOX1に関する陽性免疫染色;A2.β−チューブリンに関する陽性免疫染色;A3.A〜A2の合併画像;およびA4.A3の挿入図の高倍率は、ニューロンの核におけるDAPIおよびSOX1の重ね合わせ(白い矢印)を示す。図91b〜eは、歯髄機械的トランスファーおよび神経分化誘導の15、30および45サイクル後に、神経前駆体およびニューロンのhIDPSCのLPの濃縮を示す。図91b−Aにおいて、SOX1陰性細胞、核がDAPI(青色)でしか染色されない核の割合を示す;SOX1陽性細胞は緑色を提示する。図91d−Bにおいて、核がDAPI(青色)でしか染色されないβ−チューブリン陰性細胞の割合;β−チューブリン陽性細胞を赤色で示す。
IDPSC由来神経芽細胞は、in vitro神経成熟にしたがって、神経の重要なマーカーを発現し始める:
1. ニューロンの遊走およびシグナル伝達、アウトグロースおよび維持ならびに軸索内輸送に関与、例えばダイニン、Lis1、Ndel1;
2. ミエリン鞘の生成に関与:ミエリンP2、O4;
3. 神経特定および分化に関与:RAR−アルファ
4. 神経伝達因子放出の制御に関与:シナプシンIa/b
ダイニンはマイナス端定方向モータータンパク質であり、細胞において、ATPに含有される化学エネルギーを運動の機械エネルギーに変換する。逆行性軸索内輸送を通じて、ダイニンは、細胞体に向かってニューロンの軸索に沿って、細胞内小器官、小胞、およびおそらく微小管断片を運ぶ。
Sakakibara A, Ando R, Sapir T, Tanaka T. 神経形態形成における、微小管動力学。 Open Biol. 2013 Jul
17;3(7):130061. doi: 10.1098/rsob.130061.
ミエリンP2タンパク質およびミエリン塩基性タンパク質は、ともに、末梢神経系ミエリンタンパク質の主要な部分を構成する。これらは、ミエリン鞘の生成に親密に関与する。これらはまた、いくつかの神経学的疾患にも関与し、これには、中枢および末梢神経系両方の自己免疫疾患が含まれる。
DMEM/F12培地(Invitrogen)中で培養したIDPSCの集密以下のLPの核型決定を継代3および10で行った。採取前に、0.1μg/mlの最終濃度のデメコルシン(Sigma)を1時間添加した。細胞を採取し、PBS中で洗浄し、そして0.5mlの培地中に再懸濁し、そして0.075M KCl(Sigma)と10mlの体積に混合した。室温で20分間インキュベーションした後、細胞を400gで5分間遠心分離し、そしてペレットを5mlの3倍(3:1)の冷メタノール/酢酸(Sigma)中で固定した。スライドあたり、細胞懸濁物3滴を固定した。染色体計数のため、スライドをギムザで15分間染色し、そして;細胞株あたり>200細胞を分析し、そしてヒト細胞遺伝学命名に関する国際システムにしたがって、Zeiss II顕微鏡(Zeiss、ドイツ・イエナ)上で報告した。
一般体性求心性(感覚)神経である頤神経の再生の評価を行った。この神経は、顎および下唇の前方局面ならびに下顎前歯および小臼歯の頬側歯肉への感覚を提供する。これは、下歯槽神経の後幹の枝であり、該神経はこれ自体、三叉神経(CNV)下顎分枝の枝である。
奇形腫形成は、任意の多能性細胞、例えば胚性または人工多能性幹細胞(ESおよびi
PS細胞)の多能性を決定する際に必須のツールである。細胞の奇形腫形成能の評価のための一定のプロトコルが確立され、そして次いで、研究に用いられた。いくつかの近年公開された本発明者の方法は、定義される数の未分化IDPSCおよびMatrigelの免疫不全マウス内への皮下同時移植に基づく。方法は、マウスおよびヒトの多能性細胞の106細胞を用いた際に、非常に再現性であり、そして効率的であることが示された。症例の100%で、本発明者らは、多数の動物において、そして長期追跡調査(最長6ヶ月)で、奇形腫形成を観察した。この方法は、他の成体/間葉系幹細胞(MSC)、例えば乳歯の歯髄、臍帯および脂肪組織およびその他に由来するものなどの生物安全性分析のためのものである。
A. 最終的な細胞数および単細胞懸濁物産生;多能性細胞マーカー発現および核型に関する研究細胞の免疫表現型決定;Matrigelを伴う研究細胞の同時移植;奇形腫発展の単純な監視を可能にする皮下(s.c.)細胞移植;細胞をNOD/SCIDマウス内に移植した。
A. 初期(n=10)および後期継代(n=10)での、3つの異なるLP IDPSC培養
B. ヒト初代線維芽細胞(陰性対照)
IDPSCは、多能性マーカーを発現する多様な数の幹細胞(細胞の1〜25%)を含む集団によって構成される(Kerkisら、2006;Lizierら、2012)。これらの細胞をNOD/SCIDマウス(n=20)に移植し、そして腫瘍の発展を4ヶ月から監視した(およそ16週)。細胞注入部位における正常組織完全性に関する任意のタイプの変化を考慮した。
MSCは、パラクリン機構を通じて補助し、そして抗炎症および免疫調節機構を通じて再生環境を調節する。病原性が異なるMtbおよびウシ結核菌にi.t.感染させたC5
7Bl/6マウスの肺細胞によるサイトカイン産生に対するIDPSC i.p.接種の効果を観察した。BIOPLEX試験データを図97に提供する。IDPSC接種によって、感染肺細胞によるサイトカイン産生が減少した。炎症促進性(TNF−a、IL−1b、MIP−2、IL−17)および抗炎症性(IL−10)サイトカインの強い減少が、非常に悪性のMtb株に感染した肺で観察された。IFN−gおよびKC産生の減少はより顕著でなかった。IL−4産生の誘導は、IDPSCを接種されたマウスにおいてのみ観察された。
図104は、摘出された第三大臼歯、智歯を示す。CD105は、MSCの主なマーカーである。MSCの分布を検証し、そして歯髄におけるそのニッチを同定するために、該マーカーを用いた。本発明者らは、このマーカーを発現するMSCが、血管周囲の多数のニッチ、血管または神経のネットワーク中の血管叢および神経叢に位置することを立証する(図98)。血管叢および神経叢は、非常に似た構造であるが、この定義は、より小さいネットワーク(血管叢)と大きいもの(神経叢)を区別するために含まれた。本発明者らが観察するように、CD105+細胞は、血管周囲ニッチ(図98B、C、F、黒い矢印)、血管叢(図98B、C、G、オレンジの矢印)、および神経叢(図98H、星)に位置する。
IDPSCの催奇潜在性を評価するため、1x106細胞を15匹の免疫抑制マウスの背中に皮下注射した。40日後、細胞塊および/または奇形腫の形成が巨視的に観察された(図104)。
図105は、多数回の患者投薬のための臨床的に適切な量を得るため、LP法によるhIDPSCの産業的スケールアップのためのバッチ放出プロセスのための例示的フローチャートを示す。いくつかの側面にしたがって、乳歯由来の歯髄を、細胞培養フラスコ上にプレーティングする。歯髄(DP)由来の細胞を、各採取サイクル(H)で、継代1(P1)〜継代3(P3)まで、酵素解離試薬によって継代する。各採取(h1〜H35)で、DPを非酵素的方法によってトランスファーする。
歯髄単離。試料採取直前の歯の調製に関して、異なる方法がある。ヒト歯髄から単離される幹細胞は、神経冠によって産生される間葉系細胞に由来する。ヒト歯髄から幹細胞を単離するため、歯が健康であり、そして歯髄および口腔の間にいかなる連絡もないことが必要である。
補充することも可能である。抗細菌剤は、限定されることなく、ペニシリンおよびストレプトマイシン、好ましくはゲンタマイシン(微量での、ペニシリンアレルギー性集団への移植のリスクを減少させるため)から選択されることも可能である。
ref 2006;およびLieserら 2012)を発現することが以前示されてきている。したがって、OCTファミリーおよびSOXファミリーマーカーの両方の共存は、hIDPSCの高い幹細胞性および多能性を示す。しかし、SOXおよびベータ−チューブリンマーカーの濃縮は、神経運命への強いアフィニティを示す。
細胞へのSCの定方向分化を支持する培養系は、当該技術分野に周知である。
および分散物である。注射可能配合物のキャリアーは、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、または他の適切なビヒクル、およびその適切な混合物を含有する溶媒または分散媒体であることも可能である。技術を持つ薬学専門家は、本発明の方法において投与されるべき組成物中の細胞、ならびに場合によるキャリアーおよび添加剤を決定することも可能である。典型的には、hIDPSC細胞に対する任意の添加剤/賦形剤または活性化合物は、リン酸緩衝生理食塩水中、0.001〜50重量%の量で存在する。
[態様1]
神経変性疾患、脱ミエリン化疾患、または両方を治療する方法であって、その必要がある被験体に、未成熟歯髄幹細胞(IDPSC)の未分化集団、IDPSC由来の神経幹細胞、または両方を含む組成物を、神経変性疾患および/または脱ミエリン化疾患を治療するために十分な量で、投与する工程を含む、前記方法。
[態様2]
脱ミエリン化疾患が、多発性硬化症:特発性炎症性脱ミエリン化疾患;ビタミンB12不全;橋中央ミエリン溶解;脊髄ろう;横断性脊髄炎;デビック病;進行性多巣性白質脳症;視神経炎;白質ジストロフィーからなる群より選択される中枢神経系の脱ミエリン化疾患、または:ギランバレー症候群、慢性炎症性脱ミエリン化ポリニューロパシー;抗MAG末梢ニューロパシー;シャルコー−マリー・トゥース病;および銅欠乏からなる群より選択される末梢神経系の脱ミエリン化疾患である、態様1の方法。
[態様3]
神経変性疾患が:アルツハイマー病、パーキンソン病、プリオン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、ハンチントン病、前頭側頭型認知症(ピック病)および筋萎縮性側索硬化症(ALSまたはルー・ゲーリック病)からなる群より選択される、態様1の方法。
[態様4]
神経変性疾患が、である、態様1の方法。
[態様5]
網膜神経節細胞(RGC)死、視神経変性、または両方を阻害する方法であって、その必要がある被験体に、未成熟歯髄幹細胞(IDPSC)の未分化集団、IDPSC由来の神経幹細胞、または両方を含む組成物を、RGC死、視神経変性、または両方を阻害するのに十分な量で投与する工程を含む、前記方法。
[態様6]
腎不全を治療する方法であって、その必要がある被験体に、未成熟歯髄幹細胞(IDPSC)の未分化集団を含む組成物を、腎機能を増加させるか、または腎臓損傷を減少させるのに十分な量で投与する工程を含む、前記方法。
[態様7]
組成物を、kg体重あたり、およそ0.01−1x106細胞の用量で腎内投与を通じて局所投与する、態様6の方法。
[態様8]
IDPSCを投与する工程を1〜3週間の間隔で、腎機能が回復するまで、続いて反復する、ここで、IDPSCの投与間隔を1〜6ヶ月に増加させる、態様6の方法。
[態様9]
禿頭を治療するかまたは白髪を治療する方法であって、その必要がある被験体に、未成熟歯髄幹細胞(IDPSC)の未分化集団を含む組成物を、毛髪増殖を増加させ、そして/または被験体の全体の白髪の割合を減少させるのに十分な量で投与する工程を含む、前記方法。
[態様10]
組成物を、皮下、局所で、またはシャワー法によって、投与して、毛包幹細胞ニッチを回復させる、態様9の方法。
[態様11]
組成物が細胞シートを生じる、態様9の方法。
[態様12]
細胞シートが移植され、そして移植前に予め除去された毛髪皮膚によって覆われている、態様11の方法。
[態様13]
他の毛髪回復または白髪減少幹細胞因子または薬剤と組み合わせて組成物を投与する工程をさらに含む、態様9の方法。
[態様14]
皮膚創傷および/または皮膚美容的特徴を治療するための皮膚治療法であって、その必要がある被験体に、未成熟歯髄幹細胞(IDPSC)の未分化集団を含む組成物を、皮膚創傷治癒を増加させそして/または皮膚美容的特徴を改善するのに十分な量で投与する工程を含む、前記治療法。
[態様15]
皮膚創傷が、糖尿病、虚血およびコラーゲン疾患または火傷傷害から生じる難治性皮膚潰瘍である、態様14の皮膚治療法。
[態様16]
組成物を、皮膚の硬さを増加させ、しわを減少させ、皮膚加齢プロセスを遅延させ、新規血管形成を増加させ、免疫学的反応を誘導せずにコラーゲン再生を増加させるのに十分な量で投与する、態様14の皮膚治療法。
[態様17]
脊髄傷害を治療する方法であって、その必要がある被験体に、未成熟歯髄幹細胞(IDPSC)の未分化集団、IDPSC由来の神経幹細胞、または両方を含む組成物を、脊髄傷害を治療するのに十分な量で投与する工程を含む、前記方法。
[態様18]
心臓疾患を治療する方法であって、その必要がある被験体に、未成熟歯髄幹細胞(IDPSC)の未分化集団、IDPSC由来の幹細胞、または両方を含む組成物を、心臓疾患を治療するのに十分な量で投与する工程を含む、前記方法。
[態様19]
精子形成を増加させる方法であって、、その必要がある被験体に、未成熟歯髄幹細胞(IDPSC)の未分化集団を含む組成物を被験体における精子形成を誘導するのに十分な量で投与する工程を含む、前記方法。
[態様20]
心臓疾患が心筋梗塞である、態様19の方法。
[態様21]
治療が、心筋細胞アポトーシスを阻害し、そして/または組成物を動脈注射を通じて投与する、態様19の方法。
[態様22]
IDPSCの少なくとも50%が、p75神経上皮マーカー、p53腫瘍抑制因子マーカー、または両方を発現する、態様1〜21のいずれか一項の方法。
[態様23]
組成物が、IDPSCおよび/またはIDPSC由来の幹細胞を、少なくとも1x106 IDPSC、少なくとも1x107 IDPSC、少なくとも1x108 IDPSC、少なくとも1x109 IDPSC、または少なくとも1x1010 IDPSCで含む、態様1〜21のいずれか一項の方法。
[態様24]
IDPSCの少なくとも75%が、p75神経上皮マーカーまたはp53腫瘍抑制因子マーカーを発現する、態様1〜21のいずれか一項の方法。
[態様25]
IDPSCの50%未満が、CD13マーカー、CD31マーカー、または両方を発現する、態様1〜21のいずれか一項の方法。
[態様26]
IDPSCの50%未満が、CD34、CD43、およびCD45マーカーに関して陰性である、態様1〜21のいずれか一項の方法。
[態様27]
IDPSCの少なくとも50%が、脳由来神経栄養因子(BDNF)、グリア細胞株由来神経栄養因子(GNDF)、神経成長因子−ベータ(ベータ−NGF)、ニューロトロフィン−3(NT3)、ニューロトロフィン−4(NT4)、およびニューロトロフィン−5(NT5)より選択される神経栄養因子を生じる、態様1〜21のいずれか一項の方法。
[態様28]
IDPSCの少なくとも75%が、BDNF、GNDF、ベータ−NGF、NT3、NT4、およびNT5より選択される神経栄養因子を生じる、態様27の方法。
[態様29]
IDPSCの少なくとも75%がネスチンを発現する、態様1〜21のいずれか一項の方法。
[態様30]
IDPSCの少なくとも95%がネスチンを発現する、態様29の方法。
[態様31]
IDPSCの20%未満がOct3/4を発現する、態様1〜21のいずれか一項の方法。
[態様32]
IDPSCが、以下の多機能分子プロファイル:
(a)IDPSCの少なくとも80%が、ネスチン、p75、ATP結合カセットサブファミリーGメンバー2(ABCG2)、p63、脳由来神経栄養因子(BDNF)、グリア細胞株由来神経栄養因子(GNDF)、神経成長因子−ベータ(ベータ−NGF)、ニューロトロフィン−3(NT3)、NT4、およびNT5より選択されるマーカーを発現する、神経上皮幹細胞プロファイルIDPSC;
(b)IDPSCの20%未満がSTRO−1およびCD146より選択されるマーカーを発現する、周皮細胞プロファイルIDPSC;
(c)集団の少なくとも80%が、CD105、CD73、CD90、CD29、CD44、CD117、ビメンチン、フィブロネクチン、アルカリホスファターゼ(ALP)、アルファ−フェトプロテイン(AFP)、テネシン−C、マトリックスメタロプロテイナーゼ−1(MMP−1)、MMP−2、MMP−9、シンデカン1(SDC1)、SDC2、SDC3、SDC4、p53、および1型コラーゲンより選択されるマーカーを発現する、間葉系幹細胞プロファイルIDPSC;
(d)IDPSCの2%〜30%が、Oct3/4、SOX2、Nanog、TRA1−60、TRA1−81、およびSSEA4より選択される少なくとも1つのマーカーを発現する、多能性幹細胞プロファイルIDPSC;ならびに
(e)IDPSCがHLA−ABCおよびHLA−DR主要組織適合性(MHC)抗原に関して陰性である、間葉系幹細胞プロファイルIDPSC;
によって特徴付けられる、単離されたヒト出生後IDPSCの表現型的に均質な多系譜集団を含む、態様1〜21のいずれか一項の方法。
[態様33]
IDPSCの集団が、単離されたヒト出生後IDPSCの表現型的に均質な多系譜集団を含み、ヒト出生後IDPSCの前記集団が、低酸素条件下で少なくとも10採取サイクルに関して培養されたDPのアウトグロース(outgrowth)として得られる、態様1〜21のいずれか一項の方法。
[態様34]
低酸素条件が:
(i)約0.5%〜1%の間の最大値、または約0.5%〜15%酸素(O2)の間の最大値;
(ii)約0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%または2%または5%の酸素(O2);
(iii)約0.1〜2%酸素(O2)の間;あるいは
5〜7%CO2を伴う、(i)、(ii)または(iii)のいずれか
を含むかまたはこれらと同等である培養条件下で細胞を培養する工程を含む、態様33の方法。
[態様35]
ヒト出生後IDPSCの前記集団の採取工程が、酵素処理を伴わず、DPを保持し、そしてIDPSCの低酸素誘導性多系譜志向を可能にする、機械的トランスファーによって起こる、態様33の方法。
[態様36]
ヒト出生後IDPSC集団が、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ビトロネクチン、ポリリジン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン、またはその組み合わせを含む、細胞外マトリックス(ECM)基質とともに培養される、態様33の方法。
[態様37]
ECM基質がMatrigelである、態様36の方法。
[態様38]
ヒト出生後IDPSC集団が、少なくとも20採取サイクル、少なくとも30採取サイクル、少なくとも40採取サイクル、少なくとも50採取サイクル、または少なくとも60採取サイクルで培養されるDPからのアウトグロースとして単離される、態様33の方法。
[態様39]
IDPSCの単離集団を産生する方法であって:
(a)歯からDPを摘出し;
(b)DPを無菌容器中に入れ、そして抗生物質を含む無菌溶液でDPを洗浄し;
(c)場合によって、抗生物質を含む無菌溶液を取り除き、そしてDPを基本培地中で細かく刻み;
(d)DPを、培地を含有する別の容器内に、機械的にトランスファーするか、または容器内の培地を交換し;
(e)IDPSCのアウトグロースおよび接着が観察されるまでDPを培養し;そして
(f)DP内の多数ニッチからIDPSCのアウトグロースおよび接着を可能にするように、少なくとも5回、工程(d)および(e)を反復する
工程を含む、前記方法。
[態様40]
DP培養を少なくとも3日間進める、態様39の方法。
[態様41]
DP培養を少なくとも5日間、少なくとも10日間または少なくとも15日間進める、態様40の方法。
[態様42]
歯が、乳歯、永久歯、および第三大臼歯より選択される、態様39の方法。
[態様43]
工程(d)および(e)が、少なくとも10回、少なくとも20回、少なくとも30回、少なくとも40回、少なくとも50回、または少なくとも60回反復される、態様39の方法。
[態様44]
DP内の多数のニッチの完全性が、DP外植片の機械的トランスファーによって保持される、態様39の方法。
[態様45]
DP外植片を培地を含む別の容器内に機械的にトランスファーする前に、DPを凍結保存し、そして融解する、態様39の方法。
[態様46]
(g)IDPSCを継代培養に継代する
工程をさらに含む、態様39の方法。
[態様47]
IDPSCを継代中にプロテアーゼで処理しない、態様46の方法。
[態様48]
IDPSCを継代中にプロテアーゼで処理する、態様46の方法。
[態様49]
IDPSCの継代培養への継代を最大5回反復する、態様46の方法。
[態様50]
IDPSCの継代培養への継代を最大4回、3回、2回、または1回反復する、態様49の方法。
[態様51]
DPを約3日間培養すると、少なくとも1x105 IDPSCの単離集団を生じる、態様39の方法。
[態様52]
DPを約3日間培養すると、少なくとも2x105 IDPSC、少なくとも3x105 IDPSC、少なくとも4x105 IDPSC、少なくとも5x105 IDPSC、少なくとも6x105 IDPSC、少なくとも7x105 IDPSC、または少なくとも8x105 IDPSCの単離集団を生じる、態様51の方法。
[態様53]
培地がDMEM/F12培地またはMEM−アルファ培地である、態様39の方法。
[態様54]
培地に、約5%〜約20%のウシ胎児血清、約1%の非必須アミノ酸、約1%のL−グルタミンまたはL−グルタミン置換物、および約1%の抗生物質が補充されている、態様53の方法。
[態様55]
神経幹細胞および/または分化した神経細胞をin vitroで生じさせる方法であって:
歯髄(DP)の少なくとも10サイクルの機械的トランスファーによって維持されたDP外植片培養から、未成熟歯髄幹細胞(IDPSC)を単離し;
細胞の集密に到達することなくIDPSCを培養し、ここで、これらの細胞を培地中で1週間、追加培養し、
酵素的消化を用いて、これらの細胞を採取し、そして
レチノイン酸の存在下で、さらなる拡大のため、ペトリ皿上に植え付ける
工程を含む、前記方法。
[態様56]
集密が、25cm2の培地中、2x106 IDPSCに等しい、態様55の方法。
[態様57]
DP外植片培養が、少なくとも15サイクル、少なくとも20サイクル、少なくとも25サイクル、または少なくとも30サイクルのDPの機械的トランスファーによって維持される、態様56の方法。
[態様58]
サイクルが、DPの機械的トランスファー前の、約2日間、約3日間、約4日間、または約5日間の外植片培養である、態様55の方法。
[態様59]
集密前の未分化LP IDPSCの前記培養が、この段階で、ニューロスフェアまたは一次スフェアまたはスフェア様構造形成を回避する、態様55の方法。
[態様60]
集密前が、IDPSCの基本培地中に維持される、25cm2中、2x106 IDPSCに等しい、態様59の方法。
[態様61]
IDPSC基本培地の前記置換が、いかなる他の成長因子も含まず、2%のB27を補充した神経基本培地(NB+B27)への置換である、態様60の方法。
[態様62]
IDPSCの前記インキュベーションが、酵素消化または細胞再植え付けを伴わず、1週間の間、NB+B27中でインキュベーションすることである、態様61の方法。
[態様63]
NB+B27培地の前記交換が、各3〜4日間である、態様62の方法。
[態様64]
態様55記載の方法によって生じる、単離された神経幹細胞。
[態様65]
前記の1週間後、0.25%トリプシン/EDTAでの2〜3分間の処理後に、細胞を採取し、NB+B27で中和する、態様62の方法。
[態様66]
800g、5分間の遠心分離後、細胞ペレットを得て、そして上清を廃棄する、態様62の方法。
[態様67]
IDPSCペレットをNB+B27中で穏やかに脱凝集し、そして拡大のため、各々、平方9.6cm2を有する6枚のペトリ皿上に植え付ける、態様66の方法。
[態様68]
前記レチノイン酸を、0.1μMを超えない最終濃度で24時間で添加しなければならず、そして48時間後、神経分化細胞を産生するニューロスフェアを得ることが可能である、態様67の方法。
[態様69]
IDPSCの前記分化が、同じ培養プレート中、同時に、ニューロンおよびグリア細胞に分化するものである、態様1の方法。
[態様70]
態様1にしたがった方法によって生じる、脱ミエリン化疾患を治療し、そして治癒させることが可能な、IDPSC。
[態様71]
網膜幹細胞および/または分化した網膜細胞をin vivoで生成する方法であって:
歯髄(DP)の少なくとも10サイクルの機械的トランスファーによって、維持されたDP外植片培養から、未成熟歯髄幹細胞(IDPSC)を単離し;
半集密に到達するまで、IDPSCを培養し;
酵素的消化を用いて、これらの細胞を採取し;そして
さらなる拡大のため、ペトリ皿上に植え付ける
工程を含む、前記方法。
[態様72]
分化した網膜細胞が、桿体細胞、錐体細胞、および/または神経節細胞である、態様71の方法。
[態様73]
増加した多系譜潜在力を所持するLP IDPSCを含む組成物であって、前記IDPSCをロバストな神経上皮マーカーの発現を可能にする条件下で培養し、前記発現が、前記LP IDPSCの多機能再生潜在力を生じる、前記組成物。
[態様74]
DPの長期培養後、遠位ニッチにアクセスさせることを通じて、IDPSCを誘導することによって、そして/または採取したIDPSCを低継代数で培養して、核型突然変異を防止し、そしてそれによって腫瘍原性のリスクを防止する低酸素非酵素的採取条件下で、特に、神経外胚葉系譜へのIDPSCの潜在力を増加させ、そして腫瘍原性潜在力を減少させる方法。
[態様75]
未成熟歯髄幹細胞(IDPSC)の単離集団を含む組成物であって、IDPSCの少なくとも50%がp75神経上皮マーカーを発現する、前記組成物。
[態様76]
IDPSCの少なくとも75%がp75神経上皮マーカーを発現する、態様75の組成物。
[態様77]
IDPSCの少なくとも50%がp53腫瘍抑制因子マーカーを発現する、IDPSCの単離集団を含む組成物。
[態様78]
IDPSCの少なくとも75%がp53腫瘍抑制因子マーカーを発現する、態様3の組成物。
[態様79]
IDPSCの50%未満がCD13マーカーを発現する、態様75〜78のいずれか一項の組成物。
[態様80]
IDPSCの50%未満がCD31マーカーを発現する、態様75〜78のいずれか一項の組成物。
[態様81]
IDPSCの50%未満が、CD13およびCD31より選択されるマーカーを発現し、そしてIDPSCがCD34、CD43、およびCD45マーカーに関して陰性であるる、態様75〜78のいずれか一項の組成物。
[態様82]
IDPSCの少なくとも50%が、脳由来神経栄養因子(BDNF)、グリア細胞株由来神経栄養因子(GNDF)、神経成長因子−ベータ(ベータ−NGF)、ニューロトロフィン−3(NT3)、ニューロトロフィン−4(NT4)、およびニューロトロフィン−5(NT5)より選択される神経栄養因子を産生する、態様75〜78のいずれか一項の組成物。
[態様83]
IDPSCの少なくとも75%が、BDNF、GNDF、ベータ−NGF、NT3、NT4、およびNT5より選択される神経栄養因子を産生する、態様82の組成物。
[態様84]
IDPSCの少なくとも75%がネスチンを発現する、態様75〜78のいずれか一項の組成物。
[態様85]
IDPSCの少なくとも95%がネスチンを発現する、態様84の組成物。
[態様86]
IDPSCの20%未満がOct3/4を発現する、態様75〜78のいずれか一項の組成物。
[態様87]
(a)IDPSCの少なくとも80%が、ネスチン、p75、ATP結合カセットサブファミリーGメンバー2(ABCG2)、p63、脳由来神経栄養因子(BDNF)、グリア細胞株由来神経栄養因子(GNDF)、神経成長因子−ベータ(ベータ−NGF)、ニューロトロフィン−3(NT−3)、NT4、およびNT5より選択されるマーカーを発現する、神経上皮幹細胞プロファイルIDPSC;
(b)IDPSCの20%未満がSTRO−1およびCD146より選択されるマーカーを発現する、周皮細胞プロファイルIDPSC;
(c)集団の少なくとも80%が、CD105、CD73、CD90、CD29、CD44、CD117、ビメンチン、フィブロネクチン、アルカリホスファターゼ(ALP)、アルファ−フェトプロテイン(AFP)、テネシン−C、マトリックスメタロプロテイナーゼ−1(MMP−1)、MMP−2、MMP−9、シンデカン1(SDC1)、SDC2、SDC3、SDC4、p53、および1型コラーゲンより選択されるマーカーを発現する、間葉系幹細胞プロファイルIDPSC;
(d)IDPSCの2%〜30%が、Oct3/4、SOX2、Nanog、TRA1−60、TRA1−81、およびSSEA4より選択される少なくとも1つのマーカーを発現する、多能性幹細胞プロファイルIDPSC;ならびに
(e)IDPSCがHLA−ABCおよびHLA−DR主要組織適合性(MHC)抗原に関して陰性である、間葉系幹細胞プロファイルIDPSC;
の多機能分子プロファイルによって特徴付けられる、単離されたヒト出生後IDPSCの表現型的に均質な多系譜集団を含む、組成物。
[態様88]
ヒト出生後IDPSCの集団が、低酸素条件下で少なくとも10採取サイクルに渡って培養されたDPのアウトグロースとして得られる、単離されたヒト出生後IDPSCの表現型的に均質な多系譜集団を含む組成物。
[態様89]
低酸素条件が:
(i)約0.5%〜1%の間の最大値、または約0.5%〜15%酸素(O2)の間の最大値;
(ii)約0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%または2%または5%の酸素(O2);
(iii)約0.1%〜2%酸素(O2)の間;あるいは
5〜7%CO2を伴う、(i)、(ii)または(iii)のいずれか
を含むかまたはこれらと同等である培養条件下で細胞を培養する工程を含む、態様88の組成物。
態様89
ヒト出生後IDPSCの集団の採取工程が、DPを保持し、そしてIDPSCの低酸素誘導性多系譜志向を可能にする、酵素処理を伴わない機械的トランスファーによって起こる、態様88の組成物。
[態様90]
ヒト出生後IDPSC集団が、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ビトロネクチン、ポリリジン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン、またはその組み合わせを含む、細胞外マトリックス(ECM)基質とともに培養される、態様88の組成物。
[態様91]
ECM基質がMatrigelである、態様90の組成物。
[態様92]
ヒト出生後IDPSC集団が、少なくとも20採取サイクル、少なくとも30採取サイクル、少なくとも40採取サイクル、少なくとも50採取サイクル、または少なくとも60採取サイクルに渡って培養されるDPからのアウトグロースとして単離される、態様88〜91のいずれか一項の組成物。
[態様93]
IDPSCが歯由来の歯髄(DP)から単離される、態様75〜92のいずれか一項の組成物。
[態様94]
歯が、乳歯、永久歯、および第三大臼歯より選択される、態様93の組成物。
[態様95]
SOX−1およびSOX−2を同時発現し、そして神経冠幹細胞である、ヒト未成熟歯髄幹細胞(hIDPSC)を含む細胞培養組成物。
[態様96]
長期(LT)細胞培養から得られ、そして転写因子の濃縮が、LP培養に向かって増加し、それによって、神経分化への高い潜在能力を保持し、そして正常核型を有する、態様95の細胞培養組成物。
[態様97]
ヒト未成熟歯髄幹細胞(hIDPSC)の均質な集団を得るための方法であって:
少なくとも25サイクルの長期(LT)機械的/非酵素的採取サイクルを通じて、均質な集団を得て;
採取された細胞を培養して細胞培養を形成し、そして
細胞培養からプラスチック接着細胞を継代し、ここでプラスチック接着細胞は、(i)自己再生し、(ii)内胚葉、中胚葉、または外胚葉系譜の細胞に分化し、(iii)マーカー、Sox−1、Sox−2および3−ベータ−チューブリンを発現する
工程を含む、前記方法。
[態様98]
最終段階にまだ拘束されていない、Sox−1、Sox−2およびベータ−3−チューブリンなどのマーカーを含む(同時発現する)、有糸分裂的に活性である均質な神経前駆組成物。
[態様99]
分化前未成熟歯髄幹細胞(IDPSC)の実質的に均質な集団を得るための方法であって:
非接着性懸濁条件でIDPSCを培養し、その後、プラスチックプレートに接着させて神経ロゼットを形成することによって、IDPCS由来ニューロスフェアを得る、ここで、ロゼット内の細胞は、IDPSCよりわずかにより分化した、Sox−1、Sox−2およびBrdUおよびベータ−3−チューブリンに関して陽性である神経芽細胞の細胞集団を移行(transit)増幅させることによって提示され、神経芽細胞は、外部in vitroまたはin vivo誘導性微小環境に際して、神経前駆体、星状細胞、オリゴデンドロサイト、および神経節細胞を含む、中枢神経系および末梢神経系のニューロン系譜に最終的に分化することが可能である
工程を含む、前記方法。
[態様100]
態様116の方法によって得られる分化前IDPSC、およびCNS疾患を治療する細胞療法に適した薬学的に許容されうるキャリアーを含む、薬学的組成物。
[態様101]
癌を治療するための、態様100の薬学的組成物の使用。
[態様102]
癌が神経芽細胞腫および網膜芽細胞腫より選択される、態様101の使用。
[態様103]
IDPSCの実質的に均質なLPが、Sox−1;Sox−2;およびベータ−3−チューブリンを含む群より選択される、少なくとも2つのマーカーを同時発現する、態様99の方法。
Claims (14)
- 未成熟歯髄幹細胞(IDPSC)の単離集団を産生する方法であって:
(a)0.5%〜15%の間の酸素(O2)を含む低酸素条件下で培地中で歯髄(DP)を培養し、それによりDPからのIDPSCのアウトグロースおよびIDPSCの接着を可能にし;
(b)培地を交換するか、または酵素処理を伴わずにDPを別の容器内に機械的に移し;
(c)少なくとも15回、工程(a)および(b)を反復し;そして
(d)接着したIDPSCを継代し、ここで接着した細胞はレチノイン酸を含む培地で処理され、IDPSCの単離集団を得る、ここでIDPSCの単離集団は、Sox1、Sox2、およびベータ−3−チューブリンを発現する、
工程を含む、前記方法。 - 工程(a)および(b)が、少なくとも20回反復される、請求項1の方法。
- 工程(a)および(b)が、少なくとも25回反復される、請求項2の方法。
- 工程(a)および(b)が、少なくとも30回反復される、請求項3の方法。
- 工程(a)が、DPを少なくとも2日間、少なくとも3日間、少なくとも4日間、少なくとも5日間、少なくとも10日間、または少なくとも15日間培養することを含む、請求項1〜4のいずれか一項の方法。
- 工程(a)が、DPを約2日間、約3日間、約4日間、または約5日間培養することを含む、請求項5の方法。
- 未成熟歯髄幹細胞(IDPSC)の単離集団から分化した網膜細胞を生成する方法であって、
(a)0.5%〜15%の間の酸素(O2)を含む低酸素条件下で培地中で歯髄(DP)を培養し、それによりDPからのIDPSCのアウトグロースおよびIDPSCの接着を可能にし;
(b)培地を交換するか、または酵素処理を伴わずにDPを別の容器内に機械的に移し;
(c)少なくとも15回、工程(a)および(b)を反復し;
(d)接着したIDPSCが半集密に達した時に、接着したIDPSCを継代し、ここで接着した細胞はレチノイン酸を含む培地で処理され、Sox1、Sox2、およびベータ−3−チューブリンを発現するIDPSCの単離集団を得る;そして
(e)IDPSCの単離集団をレチノイン酸培地中で培養し、分化した網膜細胞へと発達するニューロスフェアを生成させる、
工程を含む、前記方法。 - 分化した網膜細胞が、桿体細胞、錐体細胞、神経節細胞、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項7の方法。
- 未成熟歯髄幹細胞(IDPSC)の単離集団を含む組成物であって、
IDPSCの単離集団は、Sox1、Sox2、およびベータ−3−チューブリンを発現する、前記組成物。 - IDPSCの単離集団が、HLA−ABCおよびHLA−DR主要組織適合性(MHC)抗原に関して陰性である、請求項9の組成物。
- IDPSCの単離集団が、ヒトIDPSCである、請求項9または10の組成物。
- 脱ミエリン化疾患、神経変性疾患、脊髄傷害の治療のための、視神経変性、網膜神経節細胞(RGC)死を阻害するための、またはそれらの組み合わせのための医薬の製造における、請求項9〜11のいずれか一項の組成物の使用。
- 脱ミエリン化疾患、神経変性疾患、脊髄傷害の治療における使用のための、視神経変性、網膜神経節細胞(RGC)死を阻害するための、またはそれらの組み合わせのための、請求項9〜11のいずれか一項の組成物。
- 脱ミエリン化疾患が、抗MAG末梢ニューロパシー、橋中央ミエリン溶解、シャルコー−マリー・トゥース病、慢性炎症性脱ミエリン化ポリニューロパシー、銅欠乏、末梢神経系の脱ミエリン化疾患、デビック病、ギランバレー症候群、特発性炎症性脱ミエリン化疾患、白質ジストロフィー、多発性硬化症、視神経炎、進行性多巣性白質脳症、脊髄ろう、横断性脊髄炎、およびビタミンB12不全からなる群より選択され;そして
神経変性疾患が、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症(ALSまたはルー・ゲーリック病)、ミエリンを攻撃する自己免疫疾患、クロイツフェルト・ヤコブ病、前頭側頭型認知症(ピック病)、ハンチントン病、パーキンソン病、およびプリオン病からなる群より選択される、
請求項12の使用。
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