JP2013506417A - 核内受容体及びその変異体、並びに細胞の再プログラミングにおけるその使用 - Google Patents
核内受容体及びその変異体、並びに細胞の再プログラミングにおけるその使用 Download PDFInfo
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Abstract
【選択図】図13
Description
[00023]本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、例えば、宿主において前記ポリヌクレオチドの発現を対象とすることができる調節配列に操作可能に結合した本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
[00043]通常核内受容体ポリペプチドをコードする、単離された核内受容体核酸分子を開示する。核酸分子は表1に挙げた機能的核内受容体ポリペプチドをコードすることができる任意の核酸を含む。好ましくは、核酸分子は、サブファミリー5の核内受容体をコードすることができる核酸、対立遺伝子変異型又は断片も含むそれらの類似体を含む。サブファミリー5の核内受容体は、Nr5a2、Nr5a1又は対立遺伝子変異型のいずれか1つ、又はDNA結合ドメイン(DBD)及び又は活性化ドメインを含む、断片を含むそれら類似体を含むことができる。具体的には、(a)配列番号:1、3、5、8で記載されたDNA分子又は配列番号10などのそれらの断片をコードするDNA分子、(b)(a)で定義したDNA分子とハイブリダイズするDNA分子又はそれらのハイブリダイズできる断片、及び(c)前記のDNA分子のいずれかによってコードされたアミノ酸配列の発現をコードするDNA分子からなる群から選択されるDNA分子を提供する。
[00056]本発明の完全長核内受容体ポリペプチドは、少なくとも87アミノ酸を有し、動物、特に、哺乳類の核内受容体をコードしており、対立遺伝子変異型、変異体又は相同体を含む。本発明の核内受容体ポリペプチドはまた、完全長核内受容体ポリペプチドの断片及び誘導体、特に実質的に同じ、又は増強された生物活性を有する断片又は誘導体を含む。核内受容体ポリペプチドには、配列番号2、4、6、7、9、10、11のアミノ酸配列、又は対立遺伝子変異型、変異体又は相同体を含むものが含まれ、配列番号10又は11などのそれらの断片も含まれる。特に好ましいポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸1から560、配列番号4のアミノ酸1から560、配列番号6のアミノ酸1から499、配列番号7のアミノ酸1から560若しくは配列番号9のアミノ酸1から462、又はそれらの対立遺伝子変異型、相同体又は配列番号10若しくは11などの断片からなる。
[00072]本発明によって生成したポリペプチドは、組成物の形態で再プログラミングする体細胞に投与することができる。
[00080]本発明の一実施形態は、多能性幹細胞治療の必要な患者を治療するための医薬品の製造において、インビトロで多能性幹細胞を誘導する方法であって、個体ドナーから細胞を単離するステップ、インビトロで細胞を培養するステップ、培養液中の細胞に転写因子をコードするポリヌクレオチドを導入するステップであり、前記転写因子をコードするポリヌクレオチドが、細胞を多能性細胞に誘導するために、核内受容体及び群Sox2、Klf4、c−Myc、Klf2、Klf5、Sox1、Sox5、N−myc及びL−mycから選択される1個以上の転写因子を含む、ステップ、多能性幹細胞治療の必要な患者に多能性細胞を導入するステップを含む方法である。
[00084]一実施形態では、多能性幹細胞株を作製する方法は、インビトロで細胞を培養するステップ、培養液中の細胞に転写因子をコードするポリヌクレオチドを導入するステップであり、細胞を多能性細胞に誘導するために、転写因子をコードするポリヌクレオチドが、核内受容体と、群Sox2、Klf4、c−Myc、Klf2、Klf5、Sox1、Sox5、N−myc及びL−mycから選択される1個以上の転写因子とを含む、ステップ、細胞株を維持するために多能性細胞を継代するステップを含む。
[00085]本明細書では「細胞」とは、体内の組織、又は体液から得られた生物学的試料を意味する。細胞は、穿刺生検試料などの患者から得られた試料である「臨床試料」であることが多い。「細胞」にはまた、血液、血清などの液体から単離された細胞が含まれてもよい。細胞試料は、肺、膀胱、脳、子宮、子宮頚部、結腸、直腸、食道、口腔、頭部、筋肉、心臓、皮膚、腎臓、乳房、卵巣、首部、膵臓、前立腺、精巣、肝臓、生殖腺、胃の組織又は当業者には公知の任意のその他の臓器若しくは組織から単離して得ることができる。
[00087]iPSCは、研究又は医学的処置用のインビトロで細胞を増殖させるための人工培地などの関連培養培地で、当業界で知られているように培養してもよい。細胞は、細胞の連続継代性を維持するために当業界で公知なように何世代か継代してもよい。培養培地は、細胞に栄養を与え、保持するために栄養素を含有してもよい。培養培地にはまた、細胞に所望する変化を起こさせるため、増殖因子を添加して含めてもよい。
[00088]再プログラミングの効率を高めることができる核内受容体を同定するため、18種の核内受容体(表1)のスクリーニングを実施した。内在性Pou5f1−GFPレポーターを含有するマウスの胚性線維芽細胞(MEF)をスクリーニングで使用した。再プログラミングされたMEFは、サイレンシングしたPou5f1−GFPレポーターの反応の結果として、GFPが発現することによって陽性に同定された。スクリーニングは、Oct4(O)、Sox2(S)、Klf4(K)及びc−Myc(M)ウイルスでレトロウイルスにより形質導入されたそれぞれの核内受容体について実施した。Pou5f1−GFP陽性コロニーの出現頻度は、感染させて14日後(dpi)に記録した。核内受容体構築物全ての転写発現も確認された(図5)。このスクリーニングによって、オーファン核内受容体Nr1i2(プレグナンX受容体、Pxrとしても知られている)及びNr5a2(肝臓受容体ホモログ−1、Lrh−1としても知られている)の両方が再プログラミングの効率を(OSKM対照と比較して)それぞれ2.7倍及び4.0倍増強することができることを発見した(図1a)。
[00092]Nr5a2で再プログラミングされた細胞のグローバル遺伝子発現プロファイルを実施して、これらのiPSCの遺伝子発現がESCと類似しているかどうかを調べた。Nr5a2で再プログラミングされた細胞株(N2SKM及びN2SK)並びにMEF(アクチン−GFP及びPou5f1−GFP)、ESC及びOSKM iPSC株のトランスクリプトームを特徴付けた。クラスター分析によって、Nr5a2で再プログラミングされた細胞はMEFよりもESC及びOSKM iPSCに類似していることが明らかになった(図2a)。さらに、発現プロファイリングによって、Nr5a2で再プログラミングされた細胞では、ESC関連遺伝子が付随して上方制御され、MEF関連遺伝子が下方制御されることが示された(図2b)。これらのことを考え合わせると、Nr5a2で再プログラミングされた細胞の発現プロファイルは、ESC及び従来のOSKM iPSCの両方と類似している。
[00096]ステロイド産生因子1(Sf1)としても知られているNr5a1は、Nr5a2と同じ核内受容体サブファミリー5に属する。したがって、Nr5a1が再プログラミングの効率を高め、Oct4と代替できるかどうかを調べることに関心を持った。Nr5a1は再プログラミング効率を高めるが(図9a)、Nr5a2よりは少なかった。次に、Nr5a1が中心的な再プログラミング因子(O、S及びK)のいずれかと代替できるかどうかを調べた。Nr5a2と同様に、Nr5a1はSox2及びKlf4と代替することはできなかった。興味深いことに、Nr5a1及びSKMウイルスで形質導入したMEFは、Pou5f1−GFP陽性iPSCコロニーを生成した(図9b〜d)。これらの再プログラミングされたMEFは、N1SKM iPSCと称する。これらのNr5a1で再プログラミングされた細胞はアルカリホスファターゼ(図9e)、Nanog(図9f〜g)及びSSEA−1(図9h〜i)を発現する。さらに、これらの核型が正常なN1SKM iPSC(図9j)は、インビトロで3種類の異なる胚葉の系列に分化することができた(図9k)。Nr5a1による再プログラミングを独立して示すことによって、Nr5aサブファミリーの両メンバーは本当に類似の再プログラミング特性を有することが示される。
[00098]その他の核内受容体のように、Nr5a2はリガンド結合ドメイン(LBD)及びDNA結合ドメイン(DBD)を有する。しかし、オーファン核内受容体は、Nr5a2の内在性リガンドが依然として知られていない。二量体で機能を果たすほとんどの核内受容体とは異なり、Nr5a2は単量体の状態でDNAに結合することができる。Oct4がない場合のMEFの再プログラミングにおいて、Nr5a2のLBD及びDBDの機能的重要性を調べた。推定リガンドの結合を阻止するために、Nr5a2 LBDの溝を埋めるように特定の残基を大きな残基(A368M)に変異させた。次に、Nr5a2 DNA結合活性の著しい減少を生じる、保存されたFtz−F1ドメインに2重変異(G190V、P191A)を有するDBD変異体を作製した。したがって、SKMウイルスで形質導入したPou5f1−GFP MEFをまた、野生型(WT)Nr5a2、A368M Nr5a2変異体又はG190V、P191A Nr5a2変異体のいずれかをコードするウイルスで形質導入することによって、再プログラミングアッセイを実施した。レトロウイルスベクターが同レベルのNr5a2タンパク質を発現することを確かめるために、ウェスタン分析を実施した(図11a)。我々の結果によって、Nr5a2 LBD変異体はWTと比較して、Pou5f1−GFP陽性コロニーの形成数を減少させないことが示された(図11b)。このことは、Nr5a2はリガンド結合とは独立した再プログラミング因子として機能することを示唆している。対照的に、Nr5a2 DBD変異体をSKMと共に導入すると、Pou5f1−GFP陽性コロニー数が劇的に減少した(図11b)。このことは、Nr5a2 DBDの完全性は、MEFにおいて再プロミングプロセスを開始するために核内受容体が標的遺伝子のプロモーター/エンハンサー領域に適切に結合するために重要であることを示している。考え合わせると、DBDはNr5a2の再プログラミング機能に必須であるが、リガンド結合はNr5a2の再プログラミングの役割に重要ではないことが示される。
[000101]細胞培養及びトランスフェクション。iPSCは、熱不活性化牛胎児血清(FBS、Gibco)15%又はノックアウト血清代替物(KSR、Gibco)15%、β−メルカプトエタノール(Gibco)0.055mM、L−グルタミン(Gibco)2mM、MEM非必須アミノ酸(Gibco)0.1mM、ゲンタマイシン(Gibco)20μgml−1及びLIF(手製)1000Uml−1を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Gibco)においてマイトマイシンCで処理したMEFフィーダーで培養し、2〜3日毎に継代した。MEFは、E13.5胚から単離し、以前に記載したように培養した7。10cmプレート上の293−T細胞を、リポフェクタミン2000(Invitrogen)を使用して製造元の指示に従って各PMXレトロウイルスベクター25μgをトランスフェクトした。
5’-ATGGGTTGAAATATTGGGTTTATTTA、
5’CCACCCTCTAACCTTAACCTCTAAC、及び
5’−GATTTTGTAGGTGGGATTAATTGTGAATTT、
5’−ACCAAAAAAACCCACACTCATATCAATATAである。
Nr5a2:5’−GACGCAATAGCTGTAAGTCCATG
Sox2:5’−GCTTCAGCTCCGTCTCCATCATGTT
Klf4:5’−GCCATGTCAGACTCGCCAGG
c−Myc:5’−TCGTCGCAGATGAAATAGGGCTG
Oct4:5’−CCAATACCTCTGAGCCTGGTCCGATである。
[000132]iPSCは、前述のようにマイトマイシンC処理したMEFフィーダー上で培養した(Fengら、2009a)。MEFは、E13.5胚から単離し、以前に記載されたように培養した(Fengら、2009a)。293−T細胞は、リポフェクタミン2000(Invitrogen)を使用して製造元の方法に従って、各pMXレトロウイルスベクターをトランスフェクトした。RNAi実験用に、pSUPER.puroベクターにクローニングしたshRNA構築物をリポフェクタミンでESCにトランスフェクトした。細胞は、トランスフェクション16時間後にピューロマイシン1μgml−1で選択した。shRNA配列はPou5f1:5’−GAAGGATGTGGTTCGAGTA−3’、ルシフェラーゼ:5’−GATGAAATGGGTAAGTACA−3’及びNr5a2:5’GCAAGTGTCTCAATTTAAA−3’である。
[000133]Nr5a2 ChIP−seqデータ(8,023 427特有にマップされたタグ)のピーク検出(peak calling)は、MACSを使用してp値カットオフ1e〜9を用いて実施し、3,346ピークを生成した。対照の抗HA ChIP−seqライブラリーは13,001,272の特有にマップされたタグを含有した。濃縮されたモチーフは、新規モチーフ発見ツールMEMEによって、ChIP−seqピークの中心の200−bp配列を使用して同定した。Nr5a2結合部位とその他の重要な転写因子の結合部位との重複を研究するために同時出現分析をNr5a2 ChIP−seqデータ及び我々の以前の研究で作製したデータセットで実施した(Chenら、2008)。
[000134]マウスESC、iPSC(OSKM、N2SKM #A5、N2SK #B3及び#B11)及びMEF(アクチン−GFP及びPou5f1−GFP)から収集したmRNAの逆転写を実施した。各細胞株について、2つの生物学的な2連のマイクロアレイデータが得られた。OSKM+Nr5a2及びOSKM試料のマイクロアレイでは、生物を3連で使用した。製造元の指示に従って処理したアレイ(セントリックス(Sentrix)マウス−6発現ビーズチップ バージョン1.1)をイルミナ(Illumina)マイクロアレイプラットホームで読み取った。個別に発現した遺伝子をマイクロアレイの有意性分析基準に基づいて選択した:倍率変化((FC)<0.6は下方制御、FC>1.5は上方制御、q値<0.02及び全試料の検出可能性は0.95超。
[000135]マイクロアレイ及びChIP−seqデータは、GEOデータベースでそれぞれ登録番号GSE19023及びGSE19019で入手できる。
[000136]MEFはPou5f1−GFPトランスジェニックマウス及びアクチン−GFPトランスジェニックマウス(JAX研究室、ストック番号004654及び003516)から単離した。Pou5f1−GFPは、Pou5f1−GFP雄マウスと野生型129S2/SV雌の交配から得られたE13.5胚から収集し、アクチン−GFP MEFはアクチン−GFPマウスと野生型CD1雌マウスの交配から得られたE13.5胚から収集した。8〜12個のiPSCを、8細胞期で得られたC57BL/6J及びB6(Cg)−Tyrc−2J/J胚にマイクロインジェクションした。マイクロインジェクションした胚をE0.5偽妊娠雌F1(CBA×C57BL/6J)の卵管に移植した。キメラ胚は、E13.5で収集し、蛍光顕微鏡で生殖腺におけるGFP発現を測定した。キメラマウスは、生殖系列関与を測定するためにアルビノB6(Cg)−Tyrc−2J/Jマウスと交配した。動物実験は全てIACUC指針に従って実施した。
[000137]Nr5a2及びその他の因子のcDNA配列は、マウスESC cDNA又は市販のプラスミド(Open Biosystems)のいずれかからPCR増幅した。Nr5a2 SUMO変異体(2KR:K173R、K289R及び5KR:K173R、K213R、K289R、K329R、K389R)のcDNA配列は恵与された構築物(Yangら、2009)から増幅した。Nr5a2リガンド及びDNA結合変異体は、適切なプライマーでPCR増幅した。増幅したコーディング配列は配列決定によって確認し、MMLVをベースにしたpMXレトロウイルスベクターにクローニングした。それぞれのプロモーター領域でshRNAノックダウンした構築物は、pSUPER.puroベクターからpMXベクターに移した。レトロウイルスは、既に記載されたように作製した(Takahashi及びYamanaka、2006)。3T3細胞はGFP遺伝子を有するpMXレトロウイルスで感染させた。48時間感染させた後、GFP陽性細胞の割合を定量するためにFACsを実施した。形質導入する単位の数は、既に記載されたように計算した(Tiscorniaら、2006)。形質導入する単位の数は、感染効率(MOI)5を実現するために必要なウイルスの量を計算するために使用した(Parkら、2008)。iPSC作製のために、それぞれMOIが5の異なる因子をコードするウイルスを、FBS15%及びポリブレン6ngml−1を含有するDMEM中で、70%コンフルエンスでMEFに導入した。1dpiで培地を新鮮なMEF培地に交換した。2dpiで、細胞をMEFフィーダーに移し、FBSを含有する培養培地で6日間培養し、その後さらに5〜15日間KSRを含有する培養培地で培養した。
[000138]方法は前述の通りである(Fengら、2009)。
[000139]ゲノムDNAは、Imprint(商標)DNA修飾キット(Sigma)によって製造元の指示に従って重亜硫酸塩処理した。Pou5f1及びNanogのプロモーター領域は、PCRによって増幅し、pCR2.1−TOPOベクター(Invitrogen)にクローニングし、M13フォワード及びM13リバースプライマーで配列確認した。Pou5f1及びNanogプロモーター領域のPCR増幅で使用したプライマー配列はそれぞれ、
5’−ATGGGTTGAAATATTGGGTTTATTTA−3’、5’−CCACCCTCTAACCTTAACCTCTAAC−3’及び
5’−GATTTTGTAGGTGGGATTAATTGTGAATTT−3’、5’−ACCAAAAAAACCCACACTCATATCAATATA−3’である。
[000140]iPSCをコルセミド(Invitrogen)で処理し、標準低浸透圧処理によって収集し、メタノール:酢酸(3:1)で固定した。スライドは、Gバンド核型分析の前に空気乾燥した。
[000141]各PCR増幅反応は、iPSC、ESC、MEF又は胚のいずれかから収集したゲノムDNA300ngで実施した。
センスプライマー配列:5’−GACGGCATCGCAGCTTGGATACAC−3’。
アンチセンスプライマー配列は、
Nr5a2:5’−GACGCAATAGCTGTAAGTCCATG−3’、
Sox2:5’−GCTTCAGCTCCGTCTCCATCATGTT−3’、
Klf4:5’−GCCATGTCAGACTCGCCAGG−3’
c−Myc:5’−TCGTCGCAGATGAAATAGGGCTG−3’
Pou5f1:5’−CCAATACCTCTGAGCCTGGTCCGAT−3’である。
[000142]EB形成のため、iPSCをトリプシン処理し、ペトリ皿でLIF及びβ−メルカプトエタノールを含まないiPSC培養培地で4〜5日培養した。ゼラチンをコートしたプレートにEBを移し、レチノイン酸(Sigma)1μMを添加して5〜6日培養した。試料は4%パラホルムアルデヒドで固定し、1%トリトンX−100で透過処理し、8%FBSでブロックし、抗Gata−4(1:100、sc−25310、Santa Cruz)、抗ネスチン(1:100、sc−58813、Santa Cruz)又は抗α−平滑筋アクチン(1:100、ab18460、Abcam)で染色した。次に試料は、2次抗体、Alexa Fluor546結合抗マウス(1:1000、Invitrogen)で染色し、次いでヘキスト(1:4000、Invitrogen)で核を染色した。
[000143]iPSCは、トリプシン処理によって収集し、0.9%生理食塩水に1×107細胞ml−1で再懸濁した。細胞懸濁液100μlをアベルチンで麻酔したSCIDマウスの各背側部に皮下注射した。奇形腫を3〜4週間後に切除し、重量を量り、パラフィルムに包埋する前にブアン固定液で固定した。パラフィン包埋組織を切除し、既に記載されたようにマロリーテトラクロームで染色した(Wang及びLufkin、2000)。
[000144]ゼラチンコーティングしたカバーガラス上で培養したiPSCを4%パラホルムアルデヒドで固定し、1%tritonX−100で透過処理し、8%FBSでブロックした。ブロック後、試料を抗Nanog(1:50、RCAB0002PF、CosmoBio)又は抗SSEA−1(1:200、MAB4301、Chemicon)で染色し、その後Alexa Fluor568結合抗ウサギ(1:300、Invitrogen)又はAlexa Fluor546結合抗マウスIgM(1:2000、Invitrogen)それぞれで染色した。次に、核はヘキスト(Invitrogen)で対比染色した。市販のESC特徴付けキット(Chemicon)を使用して、製造元の方法にしたがってアルカリホスファターゼ検出を実施した。
[000145]プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche)を補給したRIPA緩衝液(Pierce)で細胞を可溶化した。タンパク質濃度は、ブラッドフォードアッセイキット(Bio−Rad)で測定した。細胞溶解物50μgを10%SDS−ポリアクリルアミドゲルで分離し、ポリビニリジンジフルオライド膜(Millipore)に移した。この膜は5%スキムミルクでブロックした。ブロックした後、ブロットを抗HA(1:2000、sc−7392、Santa Cruz)、抗Nr5a2(1:2000、ab18293、Abcam)又は抗アクチン(1:2000、sc−1616、Santa−Cruz)1次抗体のいずれかで1時間インキュベートし、PBSTで洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合抗マウスIgG(1:5000、1858413、Pierce)、HRP結合ウサギIgG(1:5000、sc−2004、Santa Cruz)又はHRP結合抗ヤギIgG(1:5000、sc−2768、Santa Cruz)のいずれかでそれぞれインキュベートした。PBSTで洗浄後、シグナルはウェスタンブロッティングルミノール試薬(Santa Cruz)を使用して検出した。
[000146]MEFに各ウイルスを感染させ、感染培地は24時間後に新鮮なMEF培地と交換した。感染して78時間後、タネルアッセイのために細胞を収集した。陽性対照のために、感染してないMEFを細胞標識する前にDNアーゼ1(Ambion)で処理した。市販のキットを使用して、製造元(Roche)の方法にしたがってタネル標識を実施した。標識後、細胞はFACS分析を行った。
[000147]ChIPアッセイは、以前に記載されたように実施した(Lohら、2006)。一般的に、細胞は室温で10分間1%ホルムアルデヒドと架橋結合させ、ホルムアルデヒドはグリシン125mMで反応停止させた。細胞溶解物を超音波処理し、クロマチン抽出物を抗H3K4me3(ab8580、Abcam)、抗H3K27me3(07−449、Millipore)抗体又は抗HA(sc−7392、Santa Cruz)抗体で免疫沈降させた。定量PCR分析は、以前に記載したように実施した(Fengら、2009)。
[0001]本出願は、いずれの内容も本明細書に参考として組み込んだ、2009年9月30日出願のシンガポール特許出願第200906546−7号及び2010年1月9日出願の第201000140−2号の利益及び優先権を主張する。
Claims (26)
- インビトロで多能性幹細胞を誘導する方法であって、
a)インビトロで細胞を培養するステップ、
b)培養液中の細胞に転写因子をコードするポリヌクレオチドを導入するステップであり、細胞を多能性細胞に誘導するために、転写因子をコードするポリヌクレオチドが、核内受容体と、Sox遺伝子、クルッペル様因子遺伝子又はmycファミリーの遺伝子から選択される1個以上の転写因子とを含む、ステップ
を含む方法。 - ポリヌクレオチドが、表1に挙げた核内受容体の1つをコードする、請求項1に記載の方法。
- 核内受容体をコードするポリヌクレオチドが、サブファミリー5の核内受容体又はそのSUMO化変異体を含む、請求項1に記載の方法。
- サブファミリー5の核内受容体が配列番号10を含む、請求項3に記載の方法。
- サブファミリー5の核内受容体が、配列番号1、配列番号3、配列番号5又は配列番号8を含む、請求項3に記載の方法。
- サブファミリー5の核内受容体が、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号7、配列番号9、配列番号10又は配列番号11から選択されるポリペプチドをコードする、請求項3に記載の方法。
- 宿主細胞内でポリヌクレオチドの発現を導くことができる調節配列に操作可能に結合した、核内受容体と、Sox遺伝子、クルッペル様因子遺伝子、又はmycファミリーの遺伝子から選択される1個以上の転写因子とのポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- ポリヌクレオチドが、表1に挙げた核内受容体の1つをコードする、請求項7に記載の発現ベクター。
- 核内受容体をコードするポリヌクレオチドが、サブファミリー5の核内受容体又はそのSUMO化変異体を含む、請求項7に記載の発現ベクター。
- サブファミリー5の核内受容体が配列番号10を含む、請求項9に記載の発現ベクター。
- サブファミリー5の核内受容体が、配列番号1、配列番号3、配列番号5又は配列番号8を含む、請求項9に記載の発現ベクター。
- サブファミリー5の核内受容体が、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号7、配列番号9、配列番号10又は配列番号11から選択されるポリペプチドをコードする、請求項9に記載の発現ベクター。
- 変性疾患の治療において使用するための、請求項7〜12のいずれか一項に記載の発現ベクター。
- ポリヌクレオチドが、請求項7〜12のいずれか一項に記載のベクターによって培養液中の細胞に導入される、請求項1に記載の方法。
- 多能性幹細胞治療の必要な患者を治療するために多能性幹細胞を誘導する方法であって、
a)個体ドナーから細胞を単離するステップ、
b)インビトロで細胞を培養するステップ、
c)培養液中の細胞に転写因子をコードするポリヌクレオチドを導入するステップであり、細胞を多能性細胞に誘導するために、転写因子をコードするポリヌクレオチドが、核内受容体と、Sox遺伝子、クルッペル様因子遺伝子又はmycファミリーの遺伝子から選択される1個以上の転写因子とを含む、ステップ、
d)多能性幹細胞治療の必要な患者に多能性細胞を誘導するステップ
を含む方法。 - ポリヌクレオチドが、表1に挙げた核内受容体の1つをコードする、請求項15に記載の方法。
- 核内受容体をコードするポリヌクレオチドが、サブファミリー5の核内受容体をコードするポリヌクレオチド又はそのSUMO化変異体を含む、請求項15に記載の方法。
- サブファミリー5の核内受容体が、配列番号10を発現するポリヌクレオチドを含む、請求項17に記載の方法。
- サブファミリー5の核内受容体が、配列番号1、配列番号3、配列番号5又は配列番号8のポリヌクレオチドを含む、請求項17に記載の方法。
- サブファミリー5の核内受容体が、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号7、配列番号9、配列番号10又は配列番号11から選択されるポリペプチドをコードする、請求項17に記載の方法。
- 変性疾患の治療のための医薬品を調製するための、請求項7〜12のいずれか一項に記載のベクターの使用。
- 多能性幹細胞株の作製方法であって、
a)インビトロで細胞を培養するステップ、
b)培養液中の細胞に転写因子をコードするポリヌクレオチドを導入するステップであり、細胞を多能性細胞に誘導するために、ポリヌクレオチドが、核内受容体と、Sox遺伝子、クルッペル様因子遺伝子又はmycファミリーの遺伝子から選択される1個以上の転写因子とを含む転写因子をコードする、ステップ、
c)多能性細胞を継代して細胞株を維持するステップ
を含む方法。 - 核内受容体ポリペプチドと、Soxポリペプチド、クルッペル様因子ポリペプチド又はmycファミリーのポリペプチドから選択される1個以上の転写因子ポリペプチドとを含む、体細胞を再プログラミングするための組成物。
- 核内受容体ポリペプチドが、表1に挙げた核内受容体の1つである、請求項23に記載の組成物。
- 核内受容体ポリペプチドが、サブファミリー5の核内受容体又はそのSUMO化変異体を含む、請求項23に記載の組成物。
- サブファミリー5の核内受容体ポリペプチドが、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号7、配列番号9、配列番号10又は配列番号11から選択される、請求項25に記載の組成物。
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