WO2002097088A1

WO2002097088A1 - Testicular carnitine transporter and its gene

Info

Publication number: WO2002097088A1
Application number: PCT/JP2002/005095
Authority: WO
Inventors: Hitoshi Endou; Yoshikatsu Kanai; Atsushi Enomoto
Original assignee: Human Cell Systems, Inc.
Priority date: 2001-05-29
Filing date: 2002-05-27
Publication date: 2002-12-05
Also published as: CN1549857A; US7582447B2; EP1403368B1; JPWO2002097088A1; JP4231778B2; EP1403368A1; CN100463967C; DE60237518D1; EP1403368A4; US20080050811A1; US7244556B2; US20050054035A1; ATE479748T1

Description

明細書精巣型カルニチントランスポーターとその遺伝子技術分野

本発明は精巣及び精巣上体におけるカルニチン及びその類似物質のナトリウム依存的な輸送に関与する遺伝子と、その遺伝子がコードするポリべプチドに関する。背景技術

カルニチンは、生体のあらゆる臓器における脂肪酸のベータ酸化において重要な役割を果たしている。あらゆる臓器の細胞はそのエネルギー源である AT P

(アデノシン三リン酸）を脂肪酸のベ一夕酸化によりミトコンドリア内で産生している。脂肪酸のァシル基はカルニチンの作用によりミトコンドリァ内に輸送され、ァシル C θ— Aに変換された後、ベータ酸化を受け、 AT Pを産生する。力ルニチンは多くは食物由来であり、一部は肝臓、脳で生合成されるが、多くの細胞はカルニチンを細胞外より取り込む必要があり、カルニチン特異的な輸送体が細胞膜に存在することがこれまでの生理学的な研究から予測されてきた。

各種細胞のカルニチンの取り込みについては、これまで摘出臓器灌流法や単離細胞膜小胞系などを用いた実験系により研究されてきた。しかし従来の手法では、細胞膜を介したカルニチン輸送系について詳細に解析することは困難であり、トランスポーターそのものを単離して解析することが望まれてきた。

カルニチントランスポー夕一として、ラット CT1 (Sekine, T et al. , Biochem. Biophis. Res. Commun. , 第 251巻、 586- 591頁、 1998年）が単離されている。 CT 1のヒトにおける相同遺伝子として hOCTN2 (Tamai, I. et al. , J. Biol. Chem. , 第 273巻、 20378-20382頁、 1998年）が報告されている。これらは全身の臓器に広く分布し、各種細胞のカルニチン取り込みに寄与している。また腎臓にも発現し、カルニチンを尿細管腔より再吸収する機能をはたしている。

これまでの研究で、精巣及び精巣上体のカルニチンの濃度は生体内で最も高く、種によっては血中濃度の 2 0 0 0倍にも達することが明らかにされた。精巣上体管腔は精子の栄養及び成熟を司る器官であることから、カルニチンと精子機能の関連が注目されてきた。

精巣で産生された精子は、その段階では未成熟であり、運動性もきわめて低く、そのままでは受精能力を有さないことが明らかになつている。精巣を離れた精子は精巣上体に移行し、様々な修飾をうけ、成熟する。また精子の受精能にはその鞭毛運動が不可欠であり、そのために膨大なエネルギーを要する。このエネルギ一源となる AT P産生のためにカルニチンが大量に要求されると考えるのは合目的的である。

実際にヒトの精液中カルニチン濃度と精子の数及び運動能の正の相関を示す研究も報告されている。また臨床医学において、特発性不妊症患者にカルニチンを投与したところ、妊娠の確率が上昇したとの報告もされている。

このように、精巣及び精巣上体に特異的なカルニチン輸送は、精子の成熟及び受精能力に関して重要な役割を担っていると考えられ、摘出臓器灌流法や単離細胞膜小胞系などを用いた実験系により研究されてきた。これらの研究により能動的カルニチン輸送系が存在することは示されていたが、その分子的実体は不明であった。

本発明者の一部らは、以前に腎臓、肝臓、脳、胎盤などにおける薬物輸送において中心的な役割を果たしている有機ァニオントランスポーター 0 AT 1 (orga ni c anion t ranspor ter 1 ) ( Seki ne, T. e t a 1. , J . Biol. Chera. , 第 272卷， 1 8526-18529頁、 1997年）、 O A T 2 (Sekine, T.， FEBS letter, 第 429卷、 179- 182頁、 1998年）、 O A T 3 (Kusu ara, H. et al. , J. Biol. Chem. , 第 274卷、 13675- 13680頁、 1999年）、及び O A T 4 (Cha, S. H. et al. , J. Biol. Chem. , 第 275巻、 4507- 4512頁、 2000年）を単離し報告してきた。 O A Tファミリ一に属するこれらのトランスポーターは化学構造の異なる多くの有機ァニオンを輸送することの出来るトランスポー夕一であり、種々のァニオン性薬物の輸送も行っている。

更に近年、有機カチオンを認識する OCT ( o r g a n i c c a t i o n t r a n s p o r t e r ) ファミリ一も同定されている。カルニチンは正電荷及び負電荷の両者を併せ持つ有機イオンであり、カルニチントランスポーターは分子進化の観点から OATファミリーと OCTファミリ一の中間に位置することが予想される。

これらの事実から、本発明者らは、精巣及び精巣上体に特異的なカルニチントランスポーターが有機イオントランスポー夕一フアミリーに属するものであることを予測した。発明の開示

本発明の目的は、精巣及び精巣上体におけるカルニチン輸送に関与する新規なカルニチントランスポーター遺伝子及びその遺伝子がコードするポリペプチドであるカルニチントランスポーターを同定し、提供することにある。図面の簡単な説明

第 1図は、ヒト CT 2遺伝子の c RN Aを注入した卵母細胞によるカルニチン取り込み実験の結果（A) と時間依存性（B) を示す図である。

第 2図は、ヒト CT 2遺伝子の c RNAを注入した卵母細胞によるカルニチン取り込みのミカエリス一メンテン動力学試験の結果（A) と CT 2による L一力ルニチン輸送において D—カルニチンの阻害効果を調べた結果（B) を示す図である。

第 3図は、ヒト CT 2遺伝子の c RNAを注入した卵母細胞によるカルニチン取り込み実験において、添加する塩の影響を調べた結果（A) と pHの影響を調ベた結果（B) を示す図である。

第 4図は、ヒト C T 2遺伝子の c RNAを注入した卵母細胞によるカルニチン取り込み実験において、系へのカルニチン類似物質添加の影響を調べた結果を示す図である。

第 5図は、ヒ卜の各臓器組織における C T 2遺伝子 mRNAの発現をノーザンブロッテイングにより解析した結果を示す図面に代わる写真である。

第 6図は、精巣及び精巣上体における C T 2タンパク質の発現を免疫組織学的に解析した結果を示す図面に代わる写真である。第 7図は、 CT 2遺伝子のヒトゲノムにおける構造を解析した結果を示す図である。発明を実施するための最良の形態

本発明は、（ 1 ) 配列番号： 1に記載されたアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、カルニチン及びその類似物質を輸送する能力を有するタンパク質に関する。

また、本発明は、（ 2 ) 上記タンパク質をコードする遺伝子に関する。

更に、本発明は、（ 3) 配列番号： 1に記載された塩基配列からなる D N A、又は該 D N Aとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、ナトリゥム依存的にカルニチン及びその類似物質を輸送する能力を有するタンパク質をコードする DNA、からなる遺伝子に関する。

更にまた、本発明は、（4) 上記遺伝子若しくは該遺伝子の中のタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターに関する。

また、本発明は、（ 5) 上記発現ベクターで形質転換された宿主細胞に関する, 更に、本発明は、（ 6) 配列番号： 1に記載された塩基配列の中の連続する 1 4塩基以上の部分配列若しくはその相補的な配列を含むヌクレオチドに関する。更にまた、本発明は、（ 7 ) 上記ヌクレオチドを含んでなる、ナトリウム依存的にカルニチン及びその類似物質を輸送する能力を有するタンパク質をコードする遺伝子を検出するためのプローブに関する。

また、本発明は、（ 8) 上記ヌクレオチドを用いて、ナトリウム依存的にカル二チン及びその類似物質を輸送する能力を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現を変調させる方法に関する。

更に、本発明は、（ 9 ) 上記（ 1 ) に記載のタンパク質に対する抗体に関する, 更にまた、本発明は、（ 1 0 ) 上記（ 1 ) に記載のタンパク質を用いて、該夕ンパク質の有するナトリウム依存的にカルニチン及びその類似物質を輸送する能力に対する被検物質の基質としての作用を検出する方法に関する。

また、本発明は、（ 1 1 ) 上記（ 1 ) に記載のタンパク質、その特異抗体、その機能促進物質或いは機能抑制物質を用いて、該タンパク質の有するカルニチン及びその類似物質を輸送する能力を変調させることにより、該タンパク質によつて輸送されるカルニチン及びその類似物質の精巣及び精巣上体での動態を調整する方法に関する。

更に、本発明は、（ 1 2 ) 上記（ 1 ) に記載のタンパク質、その特異抗体、その機能促進物質或いは機能抑制物質を用いて、該タンパク質の有するカルニチン及びその類似物質を輸送する能力を変調させることにより、該タンパク質によつて輸送されるカルニチン及びその類似物質の精子細胞に与える影響を調整する方法に関する。

更にまた、本発明は、（ 1 3) 上記（ 1 ) に記載のタンパク質、その特異抗体. その機能促進物質或いは機能抑制物質を用いて、該タンパク質の有するカルニチン及びその類似物質を輸送する能力を変調させることにより、該タンパク質によつて輸送されるカルニチン及びその類似物質の精子細胞の受精能力に与える影響を調整する方法に関する。

また、本発明は、（ 1 4) 上記（ 1 ) に記載のタンパク質、その特異抗体、その機能促進物質或いは機能抑制物質を用いて、該タンパク質を特定の細胞に過剰発現させるか、或いはすでに細胞に存在する該タンパク質の有するカルニチン及びその類似物質を輸送する能力を変調させることにより、該タンパク質によって輸送されるカルニチン及びその類似物質の精子細胞の受精能力、或いは個体の受精能力に与える影響を検出及び調整する方法に関する。

即ち、本発明者らは既に述べたように、 4つの有機ァニオントランスポーター ΟΑΤ 1、 OAT 2、 OAT 3及び OAT 4を先に単離した。これらは相互に 4 0 %前後のアミノ酸配列の相同性を有している。これらの配列をもとに、 E S T (e x p r e s s e d s e q u e n c e t a g) —夕ベース検索し、 OAT 1 , 2， 3及び 4と相同性を有する新規 c D N A断片を同定し、この c D NA断片を用いて、ヒト精巣 c DNAライブラリーよりこれまでに報告のない新規クロ一ン（CT 2 ) を同定し本発明を完成するに到った。

本発明のカルニチントランスポー夕一 CT 2は、 L—カルニチン及びその類似物質を細胞膜を介して一方より他方に輸送する能力を有し、他の OATや O C T ファミリーに属する薬物トランスポー夕一と比較して、狭い範囲の基質選択性を有するトランスポー夕一である。

本発明のタンパク質としては、配列番号： 1に記載されたアミノ酸配列を有するもののほか、例えば、配列番号： 1に記載されたアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するものが挙げられるが、アミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、有機ァニオン輸送活性が失われない程度であればよく、その数としては、通常 1〜約 1 1 0個、好ましくは 1〜約 5 5個である。このようなタンパク質は、配列番号 1で示されたアミノ酸配列と通常、〜 7 5 %、好ましくは〜 9 0 %のアミノ酸配列の相同性を有する。

本発明の遺伝子としては、配列番号： 1に記載された塩基配列を有する D N A からなるもののほか、例えば、配列番号： 1に記載された塩基配列を有する D N Aとストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズし、ナトリゥム依存的にカルニチン及びその類似物質を輸送する能力を有するタンパク質をコ一ドする D N Aからなる遺伝子が挙げられる。

本発明において、ストリンジェン卜な条件下でのハイブリダィゼ一シヨンは、通常、ハイプリダイゼーシヨンを、 5 X S S C ( s t a n d a r d s a l i n e c i t r a t e ) 又はこれと同等の塩濃度のハイプリダイゼーション溶液中, 3 7〜 4 2 °Cの温度条件下、約 1 2時間行い、 5 X S S Cまたはこれと同等の塩濃度の溶液等で予備洗浄を行った後に、 1 X S S C又はこれと同等の塩濃度で洗浄を行うことにより実施できる。また、より高いストリンジエンシーを得るためには、洗浄を 0. 1 X S S C又はこれと同等の塩濃度の溶液中で洗诤を行うことにより実施できる。

本発明のカルニチントランスポーター遺伝子、並びに本発明のタンパク質は、適当な哺乳動物の臓器、組織、若しくは培養細胞を遺伝子源として用いてスクリ —ニングを行うことにより単離取得できる。哺乳動物としては、ィヌ、ゥシ、ゥマ、ャギ、ヒッジ、サル、ブ夕、ゥサギ、ラット、マウスなどの非ヒト動物のほか、ヒ卜が挙げられる。

遺伝子のスクリーニング及び単離は、ホモロジ一スクリーニング及び P C Rスクリーニングなどにより好適に実施できる。

得られた c D N Aについては、常法により塩基配列を決定し、翻訳領域を解析して、これにコードされるタンパク質、即ち C T 2のアミノ酸配列を決定することができる。

得られた c D NAがカルニチントランスポーターの c D NAであること、即ち c D NAにコードされた遺伝子産物がカルニチントランスポーターであることは，例えば次のようにして検証することができる。

得られた C T 2 c D NAから調製した c R N Aを卵母細胞に導入して発現させ，カルニチンを細胞内に輸送する（取り込む）能力を、カルニチンを基質とする通常の取り込み実験（Sekine，T et aし， Biochem. Biophis. Res. Commun.，第 251卷、 5 86-591頁、 1998年）により、細胞内への基質取り込みを測定することにより確認できる。

また、発現細胞に同様の取り込み実験を応用して、 C T 2の輸送特性や基質特異性などを調べることができる。

また、発現細胞について、同様の取り込み実験を応用して、 C T 2の特性、例えば、 C T 2が時間依存性の輸送を行っているという特性や、 C T 2のナトリウム依存性、基質選択性、 p H依存性などを調べることができる。

得られた C T 2遺伝子の c D NAを用いて、異なる遺伝子源で作製された適当な c D NAライブラリ一又はゲノミック D NAライブラリーをスクリーニングすることにより、異なる組織、異なる生物由来の相同遺伝子や染色体遺伝子等を単離することができる。

また、開示された本発明の遺伝子の塩基配列（配列番号： 1 ) に示された塩基配列、若しくはその一部）の情報に基づいて設計された合成プライマーを用い、通常の P C R法により c D NAライブラリ一から遺伝子を単離することが出来る < c D NAライブラリー及びゲノミック D NAライブラリ一等の D NAライブラリーは、例えば、（"Molecular C 1 on i ng； Sarabrook, J ·， Fr i t sh, E. F.及び Man i a t i s , T.著、 Cold Spring Harbor Laboratory Pressより 1989年に発刊」に記載の方法により調製することができる。或いは、市販のライブラリーがある場合にはこれを用いてもよい。 CT 2遺伝子のヒトゲノム上における構造を得るには、得られた CT 2遺伝子の c DNAを用いて、ゲノミック DNAライブラリーをスクリーニングし、得られたクローンを解析する。或いは公開されているヒトゲノム解析結果の情報をもとにホモロジ一検索プログラムを用いてこれを探索してもよい。

本発明のカルニチントランスポーター（C T 2 ) は、例えば、カルニチントランスポーターをコードする c DNAを用い、遺伝子組み換え技術により生産することができる。例えば、カルニチントランスポーターをコードする DN A ( c D NA等）を適当な発現べクタ一、例えばプラスミドベクタ一、ファージベクター. ウィルスベクタ一等に組み込み、得られた組み換え DNAを適当な宿主細胞に導入することができる。ポリペプチドを生産するための発現系（宿主べクタ一系）としては、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞及び哺乳動物細胞の発現系等が挙げられる。このうち、機能タンパクを得るためには、昆虫細胞及び哺乳動物細胞を用いることが望ましい。

例えば、ポリペプチドを哺乳動物で発現させる場合には、カルニチントランスポーターをコードする DNAを、適当な発現ベクター（例えば、プラスミドべクター、レトロウイルス系ベクター、パピローマウィルスベクタ一、ワクチニァゥィルスべクタ一、 S V 4 0系べクタ一等）中の適当なプロモーター（例えば S V 40プロモー夕一、 L T Rプロモー夕一、ェロンゲ一シヨン 1 αプロモーター等）の下流に挿入して発現ベクターを構築する。次に、得られた発現べクタ一で適当な動物細胞を形質転換して、形質転換体を適当な培地で培養することによつて、目的とするポリペプチドが生産される。宿主とする哺乳動物細胞としては、サル CO S— 7細胞、チヤィニーズハムス夕一 CHO細胞、ヒト H e l a細胞または、腎臓組織由来の初代培養細胞やブタ腎由来 L L C— P K 1細胞、フクロネズミ腎由来 OK細胞、マウス由来近位尿細管 S 1、同 S 2、同 S 3細胞等の細胞株が挙げられる。

カルニチントランスポーター CT 2をコードする c DNAとしては、例えば、配列番号： 1に記載された塩基配列を有する c D N Aを用いることが出来るほか. 前記の c D N Aに限定されることなく、アミノ酸配列に対応する D N Aを設計し. ポリペプチドをコードする D N Aを用いることもできる。この場合、一つのアミノ酸をコードするコドンは各々 1〜 6種類知られており、用いるコドンの選択は任意でよいが、例えば発現に利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現の高い配列を設計することが望ましい。設計した塩基配列をもつ D N Aは D N Aの化学合成、前記 c D N Aの断片化と結合、塩基配列の一部改変等によって取得できる。人為的な塩基配列の一部改変、変異導入は、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用して部位変異導入法（s i t e s pe c i f i c mu t agene s i s ) 「Mar k，D. F . ら、 P r oc Na t 1 Ac ad Sc i USA 第 1 8巻、 5662-5 666頁、 1 984年」等により実施できる。

本発明のカルニチントランスポーター遺伝子にストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズするヌクレオチド（オリゴヌクレオチド若しくはポリヌクレオチド）は、カルニチントランスポーター遺伝子を検出するためのプローブとして使用できるほか、カルニチントランスポーターの発現を変調させるために、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、やリボザィム、デコイとして使用することもできる。このようなヌクレオチドとしては、例えば、配列番号： 1 に記載された塩基配列の中の通常、連続する 1 4塩基以上の部分配列若しくはその相補的な配列を含むヌクレオチドを用いることができ、ハイプリダイズをより特異的とするためには、部分配列としてより長い配列、例えば 2 0塩基以上或いは 3 0塩基以上の配列を用いても良い。

また、本発明のカルニチントランスポーターまたは、これと免疫学的同等性を有するポリペプチドを用いて、その抗体を取得することが出来、抗体は、カルニチントランスポー夕一検出や精製などに利用できる。抗体は、本発明のカルニチントランスポー夕一、その断片、またはその部分配列を有する合成ペプチド等を抗原として用いて製造できる。ポリクロナ一ル抗体は、宿主動物（たとえば、ラットゃゥサギ）に抗原を接種し、免疫血清を回収する通常の方法により製造することができ、モノクロナ一ル抗体は、通常のハイプリドーマ法などの技術により製造できる。

本発明のタンパク質を用いることにより、該タンパク質の有するナトリウム依存的にカルニチン及びその類似物質を輸送する能力に対する被検物質の基質としての作用を検出することが出来る。また、本発明のタンパク質、その特異抗体、その機能促進物質（例えば、アンドロゲン等のホルモン）或いは機能抑制物質（例えば、アンチセンスヌクレオチド等）を用いて、該タンパク質の有するカルニチン及びその類似物質を輸送する能力を変調させることにより、該タンパク質によって輸送されるカルニチン及びその類似物質の精巣及び精巣上体での動態を調整することが出来る。

更に、本発明のタンパク質、その特異抗体、その機能促進物質（例えば、アンドロゲン等のホルモン等）或いは機能抑制物質（例えば、アンチセンスヌクレオチド等）を用いて、該タンパク質の有するカルニチン及びその類似物質を輸送する能力を変調させることにより、該タンパク質によって輸送されるカルニチン及びその類似物質の精子細胞に与える影響を調整することが出来る。

更にまた、本発明のタンパク質、その特異抗体、その機能促進物質（例えば、アンドロゲン等のホルモン等）或いは機能抑制物質（例えば、アンチセンスヌクレオチド等）を用いて、該タンパク質の有するカルニチン及びその類似物質を輸送する能力を変調させることにより、該タンパク質によって輸送されるカルニチン及びその類似物質の精子細胞の受精能力に与える影響を調整することが出来る。また、本発明のタンパク質、その特異抗体、その機能促進物質（例えば、アンドロゲン等のホルモン等）或いは機能抑制物質（例えば、アンチセンスヌクレオチド等）を用いて、該タンパク質を特定の細胞に過剰発現させるか、或いは既に細胞に存在する該夕ンパク質の有するカルニチン及びその類似物質を輸送する能力を変調させることにより、該タンパク質によって輸送されるカルニチン及びその類似物質の精子細胞の受精能力、或いは個体の受精能力に与える影響を検出又は調整することが出来る。実施例

以下、実施例により本説明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。

なお、下記実施例において、各操作は特に断りがない限り、「Molecular Clon ing： Sambrook, J . , Fr i t sh, E. F.及び Man ia t i s， T.著、 Cold Spring Harbor Labora tory Pressより 1989年に発刊」に記載の方法により行うか、又は市販のキットを用いる場合には市販品の指示書に従ってこれを使用した。実施例 1 精巣及び精巣上体特異的カルニチントランスポー夕一（C T 2 ) c D

N Aの単離とその解析

先に本発明者の一部らが単離した OAT l、〇AT 2、 OAT 3、 OAT 4、及び C T 1の塩基配列情報をもとに、公開されている E S Tデ一夕ベースを探索した。この結果、 0AT 1、〇AT 2、〇AT 3、 OAT 4、及び CT 1 と相同性を有する新規 c DNA断片 AA 7 7 8 5 9 8を得た。

A A 7 7 8 5 9 8を³² Pでラベルしたプローブを用いて、既に構築してあったヒト精巣 c D N Aライブラリ一をスクリーニングした。ハイブリダィゼ一シヨンは、 5 0 °Cのハイブリダィゼ一シヨン用溶液中で一昼夜行い、その後フィルター膜は、 5 0 °Cで 0. 1 X S S C (standard saline citrate) / 0 - 1 % S D S (ドデシル硫酸ナトリウム）で洗浄した。ハイブリダィゼ一シヨン溶液としては， 5 0 %ホルムアミド、 5 X S S C、 3 Xデンハード液、 0. 2 % S D S、 1 0 % 硫酸デキストラン、 0. 2 m g Zm 1変性サーモン精子 D N A、 2. 5mMピロリン酸ナトリウム、 2 5mM ME S、 0. 0 1 % A n t i f o am B (シグマ社製、発泡防止剤）を含む p H 6. 5の緩衝液を用いた。 λ Ζ i p L o x中に単離されたクロ一ンは i n v i t r o e x c i s i o n 法によりプラスミドベクター p Z L 1に更にサブクローン化した。この結果、カルニチン輸送活性を持つ新規 c DNA (C T 2 c D N A) が得られた。

上記により得られた c D N A (C T 2 c DN A) の塩基配列の決定は、特異的プライマ一を用いて、自動シークェンサ一（アプライドバイオシステム社製）によりおこなった（配列番号： 1に記載）。

次いで、 C T 2 C DNAを含むプラスミドから、 T 7 RNAポリメラーゼを用いて、 i n v i t r o で c RNA (c DNAに相補的な RNA) を調製した (Sekine, T. , et aし， J. Biol . Chem.，第 272巻、 18526- 18529頁、 1997年参照) 。得られた c RNAを、既に報告されている方法（Sekine, Τ·， et al. , J. Biol. C em.,第 272卷、 18526- 18529頁、 1997年）に従い、アフリカッメガエルの卵母細胞に注入し、この卵母細胞について放射能標識された L一カルニチンによる取り込み実験を行った。この結果、第 1図 Aに示すように C T 2を発現させた卵母細胞は³ H— L—カルニチンの取り込みを示すことが判明した。これに対して代表的な有機ァニオンである '⁴ C— PAH (パラアミノ馬尿酸）及び有機カチオンである ¹⁴C一 TEA (テトラェチルアンモニゥム）の取り込みは認められなかった。以下に、本発明の C T 2について、輸送機能解析、基質選択性の検討、遺伝子発現の解析、遺伝子がコードするタンパク質の精巣及び精巣上体における免疫組織学的検討、並びに CT 2遺伝子のヒトゲノムにおける構造解析を行った結果を順を追って記す。

( 1 ) C T 2のカルニチン輸送の時間依存性試験をおこなった。

この結果、第 1図 Bに示すように C T 2を発現させた卵母細胞は³ H _ L—カル二チンの取り込みの時間依存性を示した。このことから、 CT 2は単にカルニチンと結合するだけではなく、細胞内に輸送するトランスポ一夕一であることが示された。

(2 ) CT 2のカルニチン輸送のミカエリス一メンテン動力学試験をおこなった。種々の濃度のカルニチンの C T 2による取り込み量の変化を調べることにより、カルニチンの C T 2による輸送の濃度依存性を検討した。放射能標識されたカル二チンの取り込み実験は、 C T 2 c RN Aを注入した卵母細胞を用い、前記記載方法に準じて実施した。この結果（第 2図 A) 、 L一カルニチンの取り込みの K m値は約 2 0 . 3 Mであった。

( 3 ) L—カルニチンの異性体である D—カルニチンが CT 2による L—カルニチン輸送に与える影響を検討した。

第 2図 Bに示すように、 D—カルニチンは濃度依存的に C T 2による L一カル二チン輸送を阻害した。 K i値は約 3 0. I Mであった。

(4) C T 2のカルニチン輸送におけるナトリウム依存性を検討した。

細胞外ナトリウムをリチウム及び N—メチル— D—グルカミンに置換した場合、 CT 2を介したカルニチンの輸送は減少し、 C T 2が細胞外ナトリゥム依存性のカルニチントランスポーターであることが明らかになった（第 3図 A ) 。ただし細胞外ナトリウムをリチウム及び N—メチルー D—グルカミンに置換した場合でも取り込みは完全には減少せず、部分的細胞外ナトリゥムに依存することが明らかになった。

( 5) CT 2のカルニチン輸送における pH依存性を検討した。

第 3図 Bに示すように、細胞外の p Hをより酸性にしたところ、 C T 2のカル二チン輸送は減少した。

( 6 ) C T 2の基質選択性をさらに検討するために、 C T 2 c RNAを注入した卵母細胞による ³ H—カルニチンの取り込み実験系において、系へ各種カルニチン類似物質を添加し、その影響を調べた（阻害実験）。

³H—カルニチンの取り込み実験は、 CT 2 c RNAを注入した卵母細胞を用い前記記載方法に準じて実施した。 5 tM、及び 5 0 Mの各種化合物（非標識）の存在下及び非存在下で、 5 0 nM ³H—カルニチンの取り込みを測定した。その結果、種々のカルニチン類似物質（D—カルニチン、ァセチル L—カルニチン、ァセチル D L—カルニチン、ォクタノィル L—カルニチン、ベタインなど）は C T 2による³ H—カルニチンの輸送を有意に阻害した（第 4図）。一方、パラアミノ馬尿酸ゃテトラェチルアンモニゥムのようなァニオン性物質及びカチオン性物質は阻害作用を示さなかった（第 4図）。以上の結果から、 CT 2はカルニチン及びカルニチン類似物質の特異的なトランスポーターであることが判明した。

( 7 ) ヒトの各組織における C T 2遺伝子の発現（ノーザンブロッテイング）の解析を行った。

CT 2 c DNAの全長を³² P— d C T Pでラベルし、これをプローブとして用いて、ヒ卜の種々の組織から抽出した RNAをブロッティングしたフィルター

(クロンテック社製）のハイブリダィゼ一シヨンをおこなった。 CT 2 c DNA 全長を含んだハイプリダイゼ一ション液で一晩ハイプリダイセーションを行い、フィル夕一を 6 5でにて、 0 . 1 % S D Sを含む 0 . 1 X S S Cで洗浄した。ノ一ザンブロットの結果（第 5図）、精巣のみにおいて、強いバンドが検出された <

( 8 ) C T 2の遺伝子がコ一ドするタンパク質の精巣及び精巣上体における免疫組織学的検討を行った。

C T 2タンパク質のカルボキシル末端の 1 4アミノ酸残基からなるポリべプチドを合成し、これをゥサギに免疫することにより、抗血清を得た。ヒト精巣のパラフィン切片を脱パラフィン化したのち、 3 %過酸化水素水で処理することにより内因性のペルォキシダーゼを不活性化した。切片をァフィ二ティー精製したポリクローナル抗 C T 2抗体（ 1次抗体）で 2 4時間インキュベートし、次にペルォキシダーゼで標識した抗ゥサギ I g G抗体で反応させた。最後にペルォキシダ —ゼの基質であるジァミノべンジジンを加えることにより、茶褐色の沈殿の得られた場所を光学顕微鏡で観察した。第 6図に示す通り、精巣ではセルトリ細胞の細胞質内に、精巣上体では上皮細胞の管腔側に有意な染色がみられた（第 6図中, 矢頭は C T 2発現部位を示す。）。従って、 C T 2は精巣においてセルトリ細胞内にカルニチンを供給し、また精巣上体管腔内に血中よりカルニチンを輸送するトランスポーターである。

( 9 ) C T 2遺伝子のヒトゲノムにおける構造を解析した。

ホモロジ一検索プログラムを利用して公開されているヒトゲノム解析結果の情報を探索したところ、 C T 2遺伝子のェクソン · イントロン構造が明らかになつた。第 7図に示すように、 C T 2遺伝子は 1 0のェクソンからなり、開始コドンは第 2ェクソンに存在した。産業上の利用可能性

本発明のカルニチンを選択的に輸送する精巣及び精巣上体特異的カルニチン卜ランスポーター及びその遺伝子は当該トランスポーターの発現箇所でのカルニチン及びカルニチン類似物質の輸送のィンビトロでの検討や、それを基にしたそれら化合物の生殖器官内の動態の予測を可能とする。カルニチンは精子の運動能及び受精能に必須なエネルギー産生に必須の因子であり、当該トランスポーターの発明は将来特発性男性不妊症の病因解明に寄与するものと考えられる。さらに、当該トランスポーターの発現を変調する制御因子を解明することにより、カルニチン輸送能を変調させる方法、精子受精能を変調させる方法の開発に利用できる,

Claims

請求の範囲

1 . 配列番号： 1 に記載されたアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、カルニチン及びその類似物質を輸送する能力を有する夕ンパク質。

2 . ヒト由来である請求の範囲第 1項記載のタンパク質。

3 . 臓器、組織、若しくは培養細胞由来である請求の範囲第 1項又は第 2項に記載のタンパク質。

4 . 請求の範囲第 1項に記載のタンパク質をコードする遺伝子。

5 . 配列番号： 1 に記載された塩基配列からなる D N A、又は該 D N Aとストリンジェン卜な条件下でハイプリダイズし、ナトリゥム依存的にカルニチン及びその類似物質を輸送する能力を有するタンパク質をコードする D N A、からなる遺伝子。

6 . ヒト由来である請求の範囲第 5項に記載の遺伝子。

7 . 臓器、組織、若しくは培養細胞由来である請求の範囲第 5項又は第 6項に記載の遺伝子。

8 . 請求の範囲第 4項〜第 7項の何れかに記載の遺伝子若しくは該遺伝子の中のタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクター。

9 . 発現べクタ一がプラスミドである請求の範囲第 8項に記載の発現ベクター <

1 0 . 請求の範囲第 8項に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。

1 1 . 配列番号： 1 に記載された塩基配列の中の連続する 1 4塩基以上の部分配列若しくはその相補的な配列を含むヌクレオチド。

1 2 . 請求の範囲第 1 1項に記載のヌクレオチドを含んでなる、ナトリウム依存的にカルニチン及びその類似物質を輸送する能力を有するタンパク質をコードする遺伝子を検出するためのプローブ。

1 3 . 請求の範囲第 1 1項に記載のヌクレオチドを用いて、ナトリウム依存的にカルニチン及びその類似物質を輸送する能力を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現を変調させる方法。

1 4 . 請求の範囲第 1項〜第 3項の何れかに記載のタンパク質に対する抗体。

1 5 . 請求の範囲第 1項〜第 3項の何れかに記載のタンパク質を用いて、該夕ンパク質の有するナトリウム依存的にカルニチン及びその類似物質を輸送する能力に対する被検物質の基質としての作用を検出する方法。

1 6 . 請求の範囲第 1項〜第 3項の何れかに記載のタンパク質、その特異抗体その機能促進物質或いは機能抑制物質を用いて、該タンパク質の有するカルニチン及びその類似物質を輸送する能力を変調させることにより、該タンパク質によつて輸送されるカルニチン及びその類似物質の精巣及び精巣上体での動態を調整する方法。

1 7 . 請求の範囲第 1項〜第 3項の何れかに記載のタンパク質、その特異抗体その機能促進物質或いは機能抑制物質を用いて、該タンパク質の有するカルニチン及びその類似物質を輸送する能力を変調させることにより、該タンパク質によつて輸送されるカルニチン及びその類似物質の精子細胞に与える影響を調整する方法。

1 8 . 請求の範囲第 1項〜第 3項の何れかに記載のタンパク質、その特異抗体その機能促進物質或いは機能抑制物質を用いて、該タンパク質の有するカルニチン及びその類似物質を輸送する能力を変調させることにより、該タンパク質によつて輸送されるカルニチン及びその類似物質の精子細胞の受精能力に与える影響を調整する方法。

1 9 . 請求の範囲第 1項〜第 3項の何れかに記載のタンパク質、その特異抗体その機能促進物質或いは機能抑制物質を用いて、該タンパク質を特定の細胞に過剰発現させるか、或いはすでに細胞に存在する該タンパク質の有するカルニチン及びその類似物質を輸送する能力を変調させることにより、該タンパク質によつて輸送されるカルニチン及びその類似物質の精子細胞の受精能力、或いは個体の受精能力に与える影響を検出又は調整する方法。