KR101219512B1 - 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장을 촉진하는 인간 라미닌 α２ 사슬의 ＬＧ３ 도메인 및 활성 펩티드 - Google Patents

세포 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장을 촉진하는 인간 라미닌 α２ 사슬의 ＬＧ３ 도메인 및 활성 펩티드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장을 촉진하는 인간 라미닌 α２ 사슬의 ＬＧ３ 도메인 및 활성 펩티드에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장을 촉진하는 인간 라미닌-2 α2 사슬의 LG3 도메인 및 상기 LG3 도메인 내 활성 펩티드를 이용하여 신경 세포를 배양하였을 때, 신경 세포의 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진이 촉진되며, 이러한 신경 세포의 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진은 인테그린이 매개되고, PKC-δ의 활성화 및 FAK 타이로신 인산화에 의해서 일어난다는 것을 밝힘으로써 라미닌을 포함하는 다양한 세포외기질단백질(extracellular matrix protein)에 의해 매개되는 신경세포를 중심으로 한 세포의 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 활성 연구, 인공 신경도관 제작, 화상 치료, 창상 치료 및 조직 재생 등에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

세포 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장을 촉진하는 인간 라미닌 α２ 사슬의 ＬＧ３ 도메인 및 활성 펩티드{Human Laminin α２ Chain LG３ Domain and Active Peptides Promoting Cell Adhesion， Spreading， Migration，and Neurite Outgrowth}
본 발명은 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장을 촉진하는 도메인 및 이의 활성 펩티드에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장을 촉진하는 인간 라미닌-2 α2 사슬의 LG3 도메인 및 상기 LG3 도메인 내 활성 펩티드에 관한 것이다.
인테그린(Integrins)은 막관통 부착성 수용체이며, 이는 세포-세포 및 세포-세포외 매트릭스(extracellular matrix, ECM)의 상호작용을 매개한다는 것이 알려진 바 있다(Hynes, R. O. Cell , 1992). 인테그린이 매개된 세포 부착은 증식, 분화, 생존 및 이동과 같은 다양한 세포 기능을 조율하는 세포 내 신호 전달 기작을 조절한다는 것이 알려져 있다(Clark, E. A., et al, Science , 1995). 세포 내의 신호들은 세포 부착 및 이동에 변화를 이끄는("inside-out" 신호전달), 인테그린의 친화성 및 이의 ECM 리간드(ligand)에 대한 결합활성을 조절할 수 있다(Schwartz, M. A., et al, Annu . Rev . Cell Dev . Biol ., 1995; Hynes, R. O. Cell, 1992). 반대로, ECM 단백질에 대한 인테그린의 결합은 국소 부착 키나아제(focal adhesion kinase, FAK), Src-패밀리 키나아제 및 빈쿨린(vinculin), 탈린(talin) 및 팍실린(paxillin)과 같은 세포골격(cytoskeleton)-관련 단백질과 연관된 세포막 도메인을 통해서 신호 전달 케스케이드(cascade)를 유발하며(Liu, S., et al., J. Cell Sci ., 2000), 이는 "outside-in" 신호전달이라고 불리운다(Schwartz, M. A., et al, Annu . Rev . Cell Dev . Biol ., 1995; Hynes, R. O. Cell , 1992). 리간드와 인테그린의 결합은 미토겐-활성화 단백질 키나아제(mitogen-activated protein kinases), 로 패밀리 GTPase(Rho family GTPases), PI3K(phosphatidylinositol 3-kinase) 및 PKC(protein kinase C)를 포함하는 다수의 세포 내 신호전달 기작의 활성화를 유도한다(Schlaepfer, D. D., et al., Trends Cell Biol ., 1998; Aplin, A. E., et al., Pharmacol . Rev ., 1998)
PKC는 인테그린(integrin)이 매개된 세포전달 및 세포 부착(adhesion), 퍼짐(spreading), 이동(migration) 및 국소 부착 형성(focal adhesion formation) 과 같은 세포 행동에 있어서 중요한 조절자이다(Woods, A., et al., J. Cell Sci ., 1992; Lewis, J. M., et al., J. Cell Biol ., 1996). 이러한 PKC 패밀리는 12개의 아이소폼(isoform)으로 구성되어 있으며, 이는 이들의 주요 구조에 기반하여 3개의 서브 패밀리로 분류될 수 있다(Ron, D., et al., FASEB J., 1999): 칼슘 채널 및 디아실글리세롤(diacylglycerol)에 의해서 활성화되는 일반적인 PKC 아이소폼인 PKCα, βⅠ, βⅡ 및 γ; 디아실글리세롤(diacylglycerol)에 의해서 활성화되나, 칼슘 채널에 의해서는 활성화되지 않는 신규한 PKC 아이소폼인 PKCδ, ε, η, θ 및 μ; 및 디아실글리세롤(diacylglycerol)과 칼슘 채널에 반응하지 않는 비정형적인 PKC 아이소폼인 PKCξ 및 ι/λ.
프로볼 미리스테이트 아세테이트(phorbol myristate acetate)에 의한 PKC 활성은 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진을 촉진시킨다는 것이 알려져 있다(Huang, X., et al., J. Cell Sci ., 1998). 또한, 약학적 시약에 의한 PKC의 억제가 세포 부착 및 퍼짐 뿐만 아니라, 국소 부착 형성 및 FAK 인산화를 억제시킨다는 것이 알려져있다(Woods, A., et al., J. Cell Sci ., 1992; Disatnik, M. H., et al., J. Cell Sci ., 2002). 다수의 PKC 아이소폼은 세포 행동을 조절한다는 것이 밝혀졌으며, 예를 들어, PKCε 활성은 피르로넥틴(fibronectin)으로 근유 세포의 부착을 유도하는데 관여하며, PKCα 및 δ는 세포 퍼짐을 매개한다(Disatnik, M. H., et al., J. Cell Sci ., 2002). PKCδ는 피브로넥틴(fibronectin)의 섬유아세포의 국소 부착에 관여하며, PKCα는 마우스 태아의 섬유아세포의 국소 부착에 존재한다( Barry, S. T., et al., J. Cell Sci ., 1994; Jaken, S., et al., J. Cell Biol ., 1989). 그러나, 인테그린 매개된 세포 내 부착, 이동, 퍼짐과 활동과 관련된 PKC 활성 기작은 잘 알려지지 않았다.
라미닌(Laminin)은 세포 부착, 퍼짐, 이동, 신경돌기 성장, 종양 전이, 혈관신생, 분화 및 상처 회복과 같은 다양한 생물학적 활성을 조절한다고 알려진, 기저막 당단백질(glycoprotein) 패밀리이다(Colognato, H., et al., Dev . Dyn , 2000). 라미닌은 α, β 및 γ 폴리펩티드 사슬(polypeptide chain)로 구성되어 있다. 라미닌-2(α2β1γ1), 라미닌-4(α2β2γ1) 및 라미닌 12(α2β1γ3)의 구성 성분인 라미닌 α2 사슬은 골격, 심장 근육, 말초 신경, 뇌 및 태반에서 발현된다(Leivo, I., et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA , 1988). 라미닌 α 체인은 C-말단에 커다란 구(Large globular, LG) 도메인을 가지고 있으며, 이는 LG1 내지 LG5의 5개 구 모듈(globular module)을 가지고 있다(Colognato, H., et al., Dev . Dyn, 2000). 이들은 인테그린, α-디스트로글리칸(dystroglycan) 및 신데칸(syndecans)과 결합하여 다양한 생물학적 기능에 관련된다는 것이 알려져 있으나, 인간 라미닌 α2 사슬 내 LG 도메인의 수용체와 결합하는 모티프(motif) 및 이의 생물학적 기능 및 하위 단계의 신호전달 기작에 대해서는 잘 알려지지 않았다.
이에, 본 발명지들은 인간 라미닌 α2 사슬 내에서, 세포의 부착, 퍼짐, 이동과 같은 활성에 관련되는 모티프(motif)를 규명하고자 연구한 결과, 인간 라미닌 α2 사슬을 구성하고 있는 5개의 도메인 중, LG3 도메인 단백질이 인테그린이 매개된 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진에 관련되는 것을 확인하였으며, 또한, LG3 도메인을 구성하는 아미노산을 합성하여 생물학적 활성을 측정한 결과, 인간 라미닌 α2 사슬의 2675 번째 내지 2686 번째 위치에 존재하는 RNIPPFEGCIWN(서열번호 1)의 모티프가 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진에 관련되며, 이러한 인테그린 매개된 세포 부착이 PKCδ의 세포막으로의 이동과 FAK 인산화(Tyr-397)를 통해서 일어난다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 신경 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장을 촉진하는 인간 라미닌 α2 사슬 내 LG3 도메인 및 상기 도메인 내 활성 펩티드를 규명하고, 상기 도메인 또는 펩티드를 포함하는 신경 재생용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인간 라미닌(laminin)-2 α2 사슬의 LG(large globular) 3 도메인 서열로 구성되는 폴리펩티드를 포함하는 신경 재생용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 인간 라미닌(laminin)-2 α2 사슬의 LG(large globular) 3 도메인 서열 내 활성 펩티드로서, 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 신경 재생용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 인간 라미닌(laminin)-2 α2 사슬의 LG(large globular) 3 도메인 서열 내 활성 펩티드로서, 서열번호 35 내지 서열번호 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 신경 재생용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 인간 라미닌(laminin)-2 α2 사슬의 LG(large globular) 3 도메인 또는 상기 도메인에 포함되어 있는 활성 펩티드를 포함하는 신경 세포 부착 촉진제를 제공한다.
또한, 본 발명은 인간 라미닌(laminin)-2 α2 사슬의 LG(large globular) 3 도메인 또는 상기 도메인에 포함되어 있는 활성 펩티드를 포함하는 신경세포 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진용 용기를 제공한다.
또한 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 신경 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진 방법을 제공한다:
1) 본 발명에 따른 인간 라미닌(laminin)-2 α2 사슬의 LG(large globular) 3 도메인 또는 상기 도메인에 포함되어 있는 활성 펩티드를 고체 지지대에 고정하는 단계; 및
2) 상기 고체 지지대에 신경세포의 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장을 촉진시키는 단계.
또한, 본 발명은 인간 라미닌(laminin)-2 α2 사슬의 LG(large globular) 3 도메인 또는 상기 도메인에 포함되어 있는 활성 펩티드를 포함하는 화상 또는 창상 치료제를 제공한다.
또한, 본 발명은 인간 라미닌(laminin)-2 α2 사슬의 LG(large globular) 3 도메인 또는 상기 도메인에 포함되어 있는 활성 펩티드를 포함하는 인공 신경도관 또는 그의 지지체(scaffolds)를 제공한다.
아울러, 본 발명은 인간 라미닌(laminin)-2 α2 사슬의 LG(large globular) 3 도메인 또는 상기 도메인에 포함되어 있는 활성 펩티드를 포함하는 조직공학용 지지체를 제공한다.
본 발명에 따른 인간 라미닌 α2 사슬 내 rLG 도메인(서열번호 2) 및 이의 활성 펩티드(서열번호 1, 서열번호 35 내지 서열번호 50)는 높은 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진 활성을 가지며, 이는 PKCδ의 세포막으로의 이동과 FAK 인산화(Tyr-397)를 통해, 본 발명에 따른 도메인과 펩티드가 결합하여 신경 세포의 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진 효과를 나타냄으로써, 이를 세포 부착 활성 연구, 화상 치료, 창상 치료 및 인공 신경도관 또는 그의 지지체를 이용한 조직 재생 등에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 정제된 인간 라미닌 α2 사슬 내 rLG 도메인 단백질의 세포 활성을 SDS-PAGE 및 원평광 이색성 분광법(circular dichroism)을 이용하여 분석한 결과를 나타낸 그림 및 그래프이다:
도 1의 A는 인간 라미닌 α2 LG 도메인의 도식 및 이의 재조합 단백질을 나타내는 그림이다;
도 1의 B는 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT)을 처리한 정제된 rLG 도메인 단백질의 젤 이동성(gel mobility)을 SDS-PAGE를 이용하여 비교한 그림이다;
도 1의 C는 LG1, LG2, LG3, LG4 및 LG5 도메인 단백질의 원평광 이색성 분광법(circular dichroism)을 이용하여 분석한 결과를 나타낸 그래프이다;
도 1의 D 내지 F는 라미닌(5 ㎍/㎖) 또는 rLG1 내지 rLG5(25 ㎍/㎖)로 코팅된 플레이트에서 PC12 세포의 세포 부착(D), 퍼짐(E) 및 이동(F)을 관찰한 결과를 나타낸 그래프이다;
*: p<0.01 (BSA 코팅에 대한 값).
도 2는 LG3 도메인 내의 Ln2-LG3-P2(서열번호 1: RNIPPFEGCIWN)이 세포 부착(adhesion), 퍼짐(spreading) 및 이동(migration)을 촉진시킨다는 것을 확인한 그래프이다:
도 2의 A는 인간, 랫트(rat), 마우스(mouse)의 라미닌 α2 LG3 도메인의 일부 아미노산 서열을 정렬시킨 그림이다;
도 2의 B는 합성 펩티드로 코팅된 플레이트에서 PC12 세포의 코팅량 의존적인 세포 부착을 나타낸 그래프이다;
■: Ln2-LG3-P1 펩티드를 이용하여 코팅한 군;
□: Ln2-LG3-P2 펩티드를 이용하여 코팅한 군;
▲: Ln2-LG3-P3 펩티드를 이용하여 코팅한 군;
△: Ln2-LG3-P4 펩티드를 이용하여 코팅한 군;
●: Ln2-LG3-P5 펩티드를 이용하여 코팅한 군;
○: BSA를 이용하여 코팅한 군;
도 2의 C 내지 E는 라미닌(5 ㎍/㎖), rLG3(25 ㎍/㎖), Ln2-LG3-P1(62.5 ㎍/㎖), Ln2-LG3-P2(62.5 ㎍/㎖), Ln2-LG3-P3(62.5 ㎍/㎖), Ln2-LG3-P4(62.5 ㎍/㎖), Ln2-LG3-P5(62.5 ㎍/㎖), SP(Scrambled peptide, 서열번호 20)(62.5 ㎍/㎖)를 이용하여 코팅한 플레이트에서 PC12 세포의 세포 부착(C), 퍼짐(D) 및 이동(E)을 관찰한 결과를 나타낸 그래프이다;
도 2의 F 내지 G는 라미닌(5 ㎍/㎖), rLG3(25 ㎍/㎖), Ln2-LG3-P1(62.5 ㎍/㎖), Ln2-LG3-P2(62.5 ㎍/㎖), Ln2-LG3-P3(62.5 ㎍/㎖), Ln2-LG3-P4(62.5 ㎍/㎖), Ln2-LG3-P5(62.5 ㎍/㎖), SP(Scrambled peptide, 서열번호 20)(62.5 ㎍/㎖)를 이용하여 코팅한 플레이트에서 슈반세포(Schwann cell)의 세포 부착(F) 및 이동(E) 을 관찰한 결과를 나타낸 그래프이다;
*: p<0.01 (BSA 코팅에 대한 값);
ND: 검출되지 않음(Not detected); 및
도 2의 H는 PC12, 사람 정상 피부각화세포(normal human epidermal keratinocytes, NHEK), 사람 정상 구강각화세포(normal human oral keratinocytes, NHOK), 사람 정상 피부섬유모세포(normal human dermal fibroblasts, NHDF), CV-1, NIH/3T3 세포의 Ln2-LG3-P2에 대한 세포 부착 활성을 관찰한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 Ln2-LG3-P2 펩티드 내 기본 아미노산 잔기 Arg가 Ln2-LG3-P2 펩티드의 기능적 활성에 중요함을 확인한 결과를 나타낸 그림이다:
도 3의 A는 라미닌 α2 LG3 도메인의 Ln2-LG3-P2 펩티드 내의 기본 잔기의 부위 특이적으로 변이를 나타낸 그림이다;
도 3의 B는 재조합 단백질 rLG3에서 P2 부위의 아르기닌을 알라닌으로 치환시켜 발현시킨, 돌연변이 rLG3 단백질(rLG3-M1)의 도식그림과 SDS-PAGE 분석을 나타낸 그림이다;
도 3의 C는 라미닌(5 ㎍/㎖), rLG3(25 ㎍/㎖) 또는 rLG3-M1(25 ㎍/㎖)으로 코팅된 플레이트에서 PC12 세포의 부착을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다;
*: p<0.01;
도 3의 D는 라미닌(5 ㎍/㎖), rLG3(25 ㎍/㎖) 또는 rLG3-M1(25 ㎍/㎖)으로 코팅된 플레이트에서 PC12 세포의 퍼짐(spreading)을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다;
*: p<0.01;
도 3의 E는 라미닌(5 ㎍/㎖), rLG3(25 ㎍/㎖) 또는 rLG3-M1(25 ㎍/㎖)으로 코팅된 플레이트에서 PC12 세포의 이동(migration)을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다;
*: p<0.01;
도 3의 F는 PC12 세포에 rLG3(250 또는 500 ㎍/㎖), rLG3-M1(250 ㎍/㎖), 또는 비히클(pH 3.0의 인산 완충용액)을 30분 동안 전처리한 후, 라미닌(5 ㎍/㎖)으로 코팅된 플레이트에서 세포 부착 억제를 관찰한 결과를 나타낸 그래프이다;
*: p<0.01;
도 3의 G는 다양한 종에서 라미닌-1과 라미닌-2 내의 Ln2-LG3-P2 서열을 정렬하여 비교한 그림이다;
도 3의 H는 Ln2-LG2-P2(500 ㎍/㎖)과 Ln2-LG3-P2A(500 ㎍/㎖)로 코팅된 플레이트에서 PC12 세포의 세포 부착이 억제되는 것을 확인한 그래프이다;
*: p<0.01;
도 3의 I는 PC12 세포에 Ln2-LG2-P2(500 ㎍/㎖)과 Ln2-LG3-P2A(500 ㎍/㎖)를 전처리한 후, rLG3(25 ㎍/㎖)으로 코팅된 플레이트에서 세포 부착을 관찰한 결과를 나타낸 그래프이다; 및
*: p<0.01.
도 4는 rLG3 및 Ln2-LG3-P2의 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진 활성이 인테그린 β1에 의해서 매개되는 것을 확인되는 결과를 나타낸다;
도 4의 A 내지 B는 1 mM MnCl2 또는 5 mM EDTA가 전처리된 PC12 세포의 라미닌, rLG3 및 Ln2-LG3-P2 펩티드에 대한 세포 부착(A) 및 퍼짐(B)을 나타낸 그래프이다;
■: 무처리된 PC12 세포;
Figure 112011018853720-pat00001
: 5 mM EDTA가 전처리된 PC12 세포;
Figure 112011018853720-pat00002
: 1 mM MnCl2가 전처리된 PC12 세포;
도 4의 C 내지 E는 5 mM EDTA, 10 ㎍/㎖ 인테그린 α3 및 β1 항체로 전처리된 PC12 세포의 라미닌, rLG3 및 Ln2-LG3-P2 펩티드에 대한 세포 부착(C), 퍼짐(D) 및 이동(E)의 억제 효과를 나타낸 그래프이다;
■: 무처리된 PC12 세포;
Figure 112011018853720-pat00003
: 5 mM EDTA가 전처리된 PC12 세포;
Figure 112011018853720-pat00004
: 10 ㎍/㎖ 인테그린 α1 항체가 전처리된 PC12 세포;
Figure 112011018853720-pat00005
: 10 ㎍/㎖ 인테그린 α3 항체가 전처리된 PC12 세포;
Figure 112011018853720-pat00006
: 10 ㎍/㎖ 인테그린 β1 항체가 전처리된 PC12 세포;
*: p<0.01; 및
**: p<0.05.
도 5는 Ln2-LG3-P2 펩티드의 N- 또는 C- 말단이 절단되거나, 혹은 C-말단이 첨가된 펩티드의 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진에 미치는 영향을 확인한 결과이다:
도 5의 A는 Ln2-LG3-P2 펩티드의 N- 또는 C- 말단이 절단되거나, 혹은 C-말단이 첨가된 펩티드의 서열을 나타내는 표이다;
도 5의 B는 라미닌(5 ㎍/㎖), rLG3(25 ㎍/㎖) 및 도 5의 A에 기재된 펩티드(62.5 ㎍/㎖)에 대한 PC12 세포의 부착을 확인한 그래프이다;
SP: 스크램블 펩티드(scrambled peptide, SP);
도 5의 C 내지 D는 라미닌(5 ㎍/㎖), rLG3(25 ㎍/㎖), 스크램블 펩티드(62.5 ㎍/㎖) 및 도 5의 A에 기재된 Ln2-LG3-P2-DN3(62.5 ㎍/㎖), Ln2-LG3-P2-DN4(62.5 ㎍/㎖)에 대한 PC12 세포의 퍼짐(C)과 이동(D)을 나타낸 결과이다; 및
*: p<0.01.
도 6은 rLG3 및 Ln2-LG3-P2 펩티드에 의해서 유도되는 스트레스 섬유 형성, 국소 부착 및 FAK 인산화(Tyr-397) 수준을 나타낸 결과이다:
도 6의 A는 면역염색 방법을 이용하여, BSA, Laminin, rLG3, SP(Scrambled peptide), 또는 Ln2-LG3-P2로 코팅된 유리 슬라이드 챔버에서 배양된 PC12 세포의 F-액틴을 관찰한 그림이다;
ND: 검출되지 않음을 의미함;
―: 50 ㎛;
도 6의 B는 면역염색 방법을 이용하여, Laminin, rLG3 또는 Ln2-LG3-P2로 코팅된 유리 슬라이드 챔버에서 배양된 PC12 세포의 F-액틴 및 빈쿨린(vinculin)을 관찰한 그림이다;
↙: 국소 부착을 나타냄:
―: 20 ㎛;
도 6의 C는 웨스턴 블랏 방법을 이용하여, Laminin, rLG3 또는 Ln2-LG3-P2로 코팅된 유리 슬라이드 챔버에서 배양된 PC12 세포의 FAK 인산화의 정도를 확인한 그림이다;
Susp: 상층액;
15분: PC12 세포를 Laminin, rLG3 또는 Ln2-LG3-P2로 코팅된 유리 슬라이드 챔버에서 15분 동안 배양한 군;
30분:PC12 세포를 Laminin, rLG3 또는 Ln2-LG3-P2로 코팅된 유리 슬라이드 챔버에서 30분 동안 배양한 군; 및
60분: PC12 세포를 Laminin, rLG3 또는 Ln2-LG3-P2로 코팅된 유리 슬라이드 챔버에서 60분 동안 배양한 군.
도 7은 rLG3 및 Ln2-LG3-P2 펩티드에 의한, PKCδ의 위치 및 타이로신 인산화 결과를 나타낸 그림 및 그래프이다:
도 7의 A는 칼포스틴 C 처리에 의한, PC12 세포의 라미닌, rLG3 또는 Ln2-LG3-P2 펩티드에 대한 세포 부착이 억제되는 것을 나타낸 그래프이다;
*: p<0.01;
**: p<0.05;
■: 비히클(디메틸설폭사이드(Dimethylsulfoxide, DMSO));
Figure 112011018853720-pat00007
: 0.05 uM 칼포스틴 C 처리;
Figure 112011018853720-pat00008
: 0.1 uM 칼포스틴 C 처리;
Figure 112011018853720-pat00009
: 0.5 uM 칼포스틴 C 처리;
도 7의 B는 라미닌 코팅된 유리 슬라이드 위의 PC12 세포를 항-PKCα 또는 δ 항체와 로다민-팔로이딘 항체를 이용하여 면역염색한 결과를 나타낸 그림이다;
↙: 스트레스 섬유(stress fiber)의 말단을 나타내는 표시;
―: 20 ㎛;
도 7의 C는 His6 태그된 rLG3과 PKCα, δ, FAK 및 인테그린 β1과의 상호작용을 확인한 그림이다;
Susp: 상층액;
도 7의 D는 인테그린 β1을 이용한 면역침전 방법을 통한, 라미닌, rLG3, 또는 Ln2-LG3-P2 펩티드 코팅된 디쉬에서 배양된 PC12 세포에서 인테그린 β1과 PKCα, δ, FAK 및 인테그린 β1과의 상호작용을 확인한 그림이다;
Susp: 상층액;
Laminin: 라미닌 코팅된 디쉬에서 배양된 PC12 세포;
rLG3: rLG3 코팅된 디쉬에서 배양된 PC12 세포;
Ln2-LG3-P2: Ln2-LG3-P2 펩티드 코팅된 디쉬에서 배양된 PC12 세포;
도 7의 E는 면역염색법을 통한, 라미닌, rLG3, 또는 Ln2-LG3-P2 펩티드 코팅된 디쉬에서 배양된 PC12 세포에서의 PKCδ와 인테그린 β1과의 공존(colocalization)을 확인한 그림이다;
도 7의 F는 PC12 세포의 세포 부착은 PKCδ의 타이로신 인산화를 증가를 나타낸 그림이다;
Susp: 상층액;
Laminin: 라미닌 코팅된 디쉬에서 배양된 PC12 세포;
rLG3: rLG3 코팅된 디쉬에서 배양된 PC12 세포; 및
Ln2-LG3-P2: Ln2-LG3-P2 펩티드 코팅된 디쉬에서 배양된 PC12 세포;
도 8은 본 발명에 따른 rLG3 및 Ln2-LG3-P2 펩티드에 의해서 유도되는 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 스트레스 섬유 형성 및 FAK 인산화(Tyr-397)에 있어서, PKCα 및 PKCδ의 기능을 나타낸 그래프 및 그림이다:
도 8의 A 내지 D는 라미닌, rLG3 또는 Ln2-LG3-P2 펩티드 코팅된 디쉬 위에서 Go6976 또는 로틀레린(rottlerin)을 전처리한 PC12 세포를 배양하였을 때 관찰된, 세포 부착(A), 퍼짐(B), 이동(C) 및 스트레스 섬유 형성(D)을 확인한 그래프이다;
*: p<0.01;
**: p<0.05;
■: 비히클(디메틸설폭사이드(Dimethylsulfoxide, DMSO));
Go6976 처리;
Figure 112011018853720-pat00010
: 2.5 nM Go6976 전처리 군;
Figure 112011018853720-pat00011
: 5.0 nM Go6976 전처리 군;
로틀레린(rottlerin) 처리;
Figure 112011018853720-pat00012
: 1 uM 로틀레린 전처리 군;
Figure 112011018853720-pat00013
: 5 uM 로틀레린 전처리 군; 및
도 8의 E는 라미닌, rLG3 또는 Ln2-LG3-P2 펩티드 코팅된 디쉬 위에서 Go6976 또는 로틀레린(rottlerin)을 15분 동안 전처리한 PC12 세포를 37℃에서 15분 동안 배양하였을 때 관찰되는 FAK 인산화 수준을 나타낸 그림이다.
도 9는 α3β1 인테그린(integrin)과 라미닌, Ln2-LG3-P2 펩티드 및 이러한 펩티드를 포함하고 있는 인간 라미닌 α2 사슬 내 LG3 도메인의 결합에 의해 촉진되는 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진을 위한 기작을 나타낸 그림이다.
도 10은 정제된 인간 라미닌 α2 사슬 내 rLG 도메인 단백질의 세포 활성을 SDS-PAGE 및 원평광 이색성 분광법(circular dichroism)을 이용하여 분석한 결과를 나타낸 그림 및 그래프이다:
도 10의 A는 다섯 개의 rLG 도메인 단백질의 도식과, 상기 rLG 도메인 단백질에 His6 태그된 융합 단백질의 발현을 SDS-PAGE를 이용하여 확인한 그림이다;
도 10의 B는 라미닌(5 ㎍/㎖), rLG3(25 ㎍/㎖), 또는 Ln2-LG2-P2(62.5 ㎍/㎖)을 이용하여 코팅된 12-웰 플레이트에서 PC12 세포의 신경돌기 성장을 확인한 그림이다;
―: 25 ㎛
도 10의 C는 rLG 도메인 단백질이 PC12 세포의 부착을 증가시키는 것을 나타내는 그래프이다;
■: rLG1(25 ㎍/㎖)으로 코팅한 군;
◆: rLG2(25 ㎍/㎖)으로 코팅한 군;
▲: rLG3(25 ㎍/㎖)으로 코팅한 군;
×: rLG4(25 ㎍/㎖)으로 코팅한 군;
｜: rLG5(25 ㎍/㎖)으로 코팅한 군; 및
●: BSA 로 코팅한 군.
도 11은 Ln2-LG3-P3 펩티드 전처리에 의한 rLG3에 대한 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진 억제 효과를 나타낸 그래프이다:
도 11의 A는 0 내지 1.2 ㎍/㎖ 농도의 Ln2-LG3-P3 펩티드를 PC12 세포에 전처리한 후, rLG3(25 ㎍/㎖)으로 코팅된 플레이트에 배양하며 세포 부착 억제 효과를 확인한 그래프이다;
○: 무처리군;
●: Ln2-LG3-P2 처리군;
도 11의 B는 500 ㎍/㎖ 농도의 Ln2-LG3-P3 펩티드를 PC12 세포에 전처리한 후, rLG3(25 ㎍/㎖)으로 코팅된 플레이트에서 배양하며 세포 부착 억제 효과를 확인한 그래프이다;
*: p<0.01;
도 11의 C는 500 ㎍/㎖ 농도의 Ln2-LG3-P3 펩티드를 PC12 세포에 전처리한 후, rLG3(25 ㎍/㎖)으로 코팅된 플레이트에서 1시간 또는 3시간 동안 배양한 후, 세포 퍼짐(spreading) 억제 효과를 확인한 그래프이다;
□: 1시간 배양한 군;
■: 3시간 배양한 군;
*: p<0.01;
도 11의 D는 500 ㎍/㎖ 농도의 Ln2-LG3-P1, Ln2-LG3-P2, Ln2-LG3-P3, Ln2-LG3-P4, Ln2-LG3-P5 펩티드 및 SP(scramble peptide, SP)(서열번호 20)를 PC12 세포에 전처리한 후, rLG3(25 ㎍/㎖)으로 코팅된 트랜스 웰 필터의 위쪽 챔버에서 배양하며 세포 이동 억제 효과를 확인한 그래프이다; 및
*: p<0.01;
도 12는 인간 라미닌 α 사슬 내 LG3 도메인의 표면에 위치하는 Ln2-LG3-P2를 나타내는 공간 충전 모형(space-filling model)(상단) 및 리본 다이어그램(ribbon diagram)(하단)을 나타내는 그림이다.
도 13은 PKCα와 인테그린 β1이 함께 위치하는 것을 나타낸 그림이다.
도 14는 Rho-카이네이즈(kinase) 억제제인 Y27632 처리에 의해서 PC12 세포의 rLG3 및 Ln2-LG3-P2 펩티드에 대한 스트레스 섬유(stress fiber)가 분해되는 것을 나타낸 그림 및 그래프이다:
도 14의 A는 rLG3 및 Ln2-LG3-P2 펩티드로 코팅된 유리 슬라이드 챔버에 PC12 세포를 1시간 동안 배양한 후, 10 uM의 Y27632를 2시간 동안 처리한 후, 로다민-팔로이딘을 이용하여 면역염색한 결과를 나타낸 그림이다;
도 14의 B는 rLG3 및 Ln2-LG3-P2 펩티드로 코팅된 유리 슬라이드 챔버에 PC12 세포를 2.5 시간 동안 배양한 후, 5 uM의 로틀레린(rottlerin)을 30분 동안 처리한 후, 로다민-팔로이딘을 이용하여 면역염색한 결과를 나타낸 그림이다;
■: 비히클(디메틸설폭사이드(Dimethylsulfoxide, DMSO)); 및
Figure 112011018853720-pat00014
: 5 uM 로틀레린(Rottlerin) 처리.
도 15는 PLC(phospholipase C) 억제제인 U73122 처리에 의해서 PC12 세포의 rLG3 및 Ln2-LG3-P2 펩티드에 대한 세포 부착 및 퍼짐(spreading)이 감소되는 것을 나타내는 그래프이다:
도 15의 A는 rLG3 및 Ln2-LG3-P2 펩티드로 코팅된 플레이트에 U73122를 선처리한 PC12 세포를 1시간 동안 배양하였을 때, U73122 농도 의존적으로 세포 부착이 감소하는 것을 나타낸 그래프이다;
■: 비히클(디메틸설폭사이드(Dimethylsulfoxide, DMSO));
Figure 112011018853720-pat00015
: 0.5 uM U73122 처리;
Figure 112011018853720-pat00016
: 1.0 uM U73122 처리;
도 15의 B는 rLG3 및 Ln2-LG3-P2 펩티드로 코팅된 플레이트에 U73122를 선처리한 PC12 세포를 3시간 동안 배양하였을 때, U73122 농도 의존적으로 세포 부착이 감소하는 것을 나타낸 그래프이다;
■: 비히클(디메틸설폭사이드(Dimethylsulfoxide, DMSO));
Figure 112011018853720-pat00017
: 0.5 uM U73122 처리; 및
Figure 112011018853720-pat00018
: U73122 처리.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 인간 라미닌(laminin)-2 α2 사슬의 LG(large globular) 3 도메인 서열로 구성되는 폴리펩티드를 포함하는 신경 재생용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 인간 라미닌(laminin)-2 α2 사슬의 LG(large globular) 3 도메인 서열은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 펩티드는 α3β1 인테그린(integrin)과 결합하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 폴리펩티드는 α3β1 인테그린(integrin)과 결합을 통한 프로테인 키나아제 δ(Protein kinase δ, PKC-δ)의 세포 내 위치를 조절하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 폴리펩티드는 PKC-δ와 FAK(focal adhesion kinase, FAK)의 티로신 인산화(tyrosine phosphorylation)를 유도하는 것이 바람직하며, 상기 FAK(focal adhesion kinase, FAK)의 티로신 인산화(tyrosine phosphorylation)는 FAK의 397번째 티로신의 인산화를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 인간 라미닌 α2 사슬 내에서 인테그린과 매개되어 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진에 관여하는 생물학적 활성을 갖는 모티프(motif)를 발견하고자, 인간 라미닌 α2 사슬 내의 5가지 종류의 도메인을 클로닝하고, 이를 발현시켜 각각의 도메인 단백질을 획득하였다(도 10 참조). 그 후, 본 발명자들은 상기 획득된 LG1 내지 LG5 도메인 단백질의 구조 및 생물학적 활성을 파악하였으며, rLG 도메인 단백질을 이용하여 코팅한 플레이트에 신경세포를 배양함으로써, rLG 도메인 단백질 중 rLG3 도메인 단백질이 신경 세포의 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진을 가장 잘 시킨다는 것을 확인할 수 있었다(도 1 및 도 10 참조).
또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 생물학적 활성이 가장 높게 나타난 LG3 도메인을 구성하고 있는 아미노산 단편을 합성하여, 활성이 나타나는 정확한 모티프(motif)를 확인한 결과, 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 Ln2-LG3-P2 서열을 이용하여 플레이트를 코팅한 후, 세포를 배양하였을 때, 세포의 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기의 성장이 가장 활발하게 일어나며, 이는 다양한 신경세포에서 관찰되었다(도 2 참조).
또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명에 따른 Ln2-LG3-P2 펩티드의 알라닌(Ala) 아미노산 잔기를 아르기닌(Arg)으로 치환한 돌연변이 rLG3 및 Ln2-LG2-P2 펩티드의 N 또는 C 말단을 절단하거나 또는 첨가한 서열을 이용하여 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진에 관여하는 주요한 잔기 및 서열을 확인하였다(도 3 및 5 참조). 또한, 이러한 세포 부착의 구체적인 기작을 확인한 결과, 인테그린이 매개된 Ln2-LG3-P2 단백질과 세포의 부착이 일어났을 때, α3β1 인테그린과 Ln2-LG3-P2 펩티드의 상호작용으로 인하여, FAK가 인산화되는 것이 관찰되었으며, 이는 구체적으로 397번째 타이로신에서 관찰되었다(도 6 참조). 아울러, PKCα 및 δ 아이소폼이 인테그린으로 이동되며, PKCδ의 활성화가 세포부착에 필수적이라는 것을 확인하였다(도 7 내지 도 8 참고).
즉, 본 발명에 따른 서열번호 2로 기재되는 인간 라미닌(laminin)-2 α2 사슬 내의 LG(large globular) 3 도메인은 다른 도메인에 비하여 신경 세포의 부착, 퍼짐, 이동 및 신경 돌기 성장을 더욱 잘 시키므로, 이를 유효성분으로 함유하는 조성물을 신경 재생용 약학적 조성물로서 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구 투여(예를 들어, 도포 또는 정맥 내, 피하, 복강 내 주사)할 수 있으나 경구 투여가 바람직하다.
비경구 투여를 위한 제제로는 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 멸균된 수용액, 액제, 비수성용제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 좌제, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사제제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용 약학적 조성물을 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다. 국소 투여의 조성물은 임상적 처방에 따라 무수형 또는 수성형일 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
경구 투여를 위한 고형제제에는 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 연질캅셀제, 환 등이 포함된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 에어로졸 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
상기 조성물은 투여를 위해서 인간 라미닌(laminin)-2 α2 사슬의 LG(large globular) 3 도메인 서열로 구성되는 폴리펩티드 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형 등으로 제제화할 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1~90 중량부 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 환자의 연령, 성별 및 비만의 정도에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 경구 투여제의 경우 일반적으로 성인에게 1일에 체중 1당 본 발명의 조성물을 1일 0.0001 내지 100 g/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 ㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 신경 재생용 약학적 조성물은 인간 라미닌(laminin)-2 α2 사슬의 LG(large globular) 3 도메인 서열로 구성되는 폴리펩티드에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
또한, 본 발명은 인간 라미닌(laminin)-2 α2 사슬의 LG(large globular) 3 도메인 서열 내 활성 펩티드로서, 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 신경 재생용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 인간 라미닌(laminin)-2 α2 사슬의 LG(large globular) 3 도메인 서열 내 활성 펩티드는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 이는 서열번호 2로 기재되는 인간 라미닌(laminin)-2 α2 사슬의 LG(large globular) 3 도메인 내에 위치하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 폴리펩티드는 α3β1 인테그린(integrin)과 결합하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 폴리펩티드는 α3β1 인테그린(integrin)과 결합을 통한 프로테인 키나아제 δ(Protein kinase δ, PKC-δ)의 세포 내 위치를 조절하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 폴리펩티드는 PKC-δ와 FAK(focal adhesion kinase, FAK)의 티로신 인산화(tyrosine phosphorylation)를 유도하는 것이 바람직하며, 상기 FAK(focal adhesion kinase, FAK)의 티로신 인산화(tyrosine phosphorylation)는 FAK의 397번째 티로신의 인산화를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 아울러, 상기 신경 세포는 PC12, CV-1, NIH/3T3, 슈반세포(Schwann cell), 사람 정상 피부각화세포(normal human epidermal keratinocytes), 사람 정상 구강각화세포(normal human oral keratinocytes) 및 사람 정상 피부섬유모세포(normal human dermal fibroblasts)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
즉, 본 발명에 따른 서열번호 1로 기재되는 Ln2-LG3-P2 펩티드와 이를 포함하고 있는 LG3 도메인 단백질은 인테그린을 매개하여 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진시키는 효과를 나타내며, 이는 구체적으로 인테그린으로 PKC 아이소폼인 α 및 δ가 이동되고, FAK의 타이로신 인산화(Tyr-397) 및 PKC δ 인산화에 의해서 일어난다는 것을 밝혔으므로, 본 발명에 따른 서열번호 1로 기재되는 펩티드를 신경 세포 재생용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 인간 라미닌(laminin)-2 α2 사슬의 LG(large globular) 3 도메인 서열 내 활성 펩티드로서, 서열번호 35 내지 서열번호 50으로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 신경 재생용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 서열번호 35 내지 서열번호 50으로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 펩티드는 서열번호 2로 기재되는 인간 라미닌(laminin)-2 α2 사슬의 LG(large globular) 3 도메인 서열 내에 존재하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1로 기재되는 활성 펩티드 내에 존재하는 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 신경 재생용 약학적 조성물은 서열번호 37, 서열번호 49 또는 서열번호 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 상기 서열번호 35 내지 서열번호 50의 펩티드는 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진 효과가 우수하므로 이들 가운데 선택되는 어느 하나의 펩티드를 포함하는 조성물을 신경 재생용 약학적 조성물에 유용하게 사용할 수 있다.
또한, 상기 폴리펩티드는 α3β1 인테그린(integrin)과 결합하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 폴리펩티드는 α3β1 인테그린(integrin)과 결합을 통한 프로테인 키나아제 δ(Protein kinase δ, PKC-δ)의 세포 내 위치를 조절하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 폴리펩티드는 PKC-δ와 FAK(focal adhesion kinase, FAK)의 티로신 인산화(tyrosine phosphorylation)를 유도하는 것이 바람직하며, 상기 FAK(focal adhesion kinase, FAK)의 티로신 인산화(tyrosine phosphorylation)는 FAK의 397번째 티로신의 인산화를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 아울러, 상기 신경 세포는 PC12, CV-1, NIH/3T3, 슈반세포(Schwann cell), 사람 정상 피부각화세포(normal human epidermal keratinocytes), 사람 정상 구강각화세포(normal human oral keratinocytes) 및 사람 정상 피부섬유모세포(normal human dermal fibroblasts)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 서열번호 1로 기재되는 인간 라미닌(laminin)-2 α2 사슬의 LG(large globular) 3 도메인 서열 내 활성 펩티드 내의 활성 코어 서열을 규명하기 위하여, Ln2-LG3-P2 펩티드의 N- 또는 C-말단을 제거 또는 C-말단을 첨가한 16개의 펩티드를 합성하여(표 1 및 도 5 참조), 이들의 생물학적 활성을 관찰하였으며, 그 결과 서열번호 35 내지 서열번호 50으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드의 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진 효과가 rLG3 도메인과 유사하거나 혹은 더욱 우수한 효과는 나타내는 것이 관찰되었다. 특히, 서열번호 37, 서열번호 49 또는 서열번호 50으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드의 활성이 현저하게 우수한 것이 관찰되었다.
따라서, 서열번호 35 내지 서열번호 50으로 기재되는 아미노산 서열은 인간 라미닌(laminin)-2 α2 사슬의 LG(large globular) 3 도메인 서열 내의 활성 펩티드 중, 코어 서열로서, 세포의 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진을 촉진시키는 효과가 있으므로, 이를 유효성분으로 포함하는 조성물을 신경 세포 재생을 위하여 유용하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 상기 인간 라미닌(laminin)-2 α2 사슬의 LG(large globular) 3 도메인 또는 상기 도메인에 포함되어 있는 활성 펩티드를 포함하는 신경 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진제를 제공한다.
상기 본 발명의 인간 라미닌(laminin)-2 α2 사슬의 LG(large globular) 3 도메인은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하며, 상기 도메인에 포함되어 있는 활성펩티드는 서열번호 1, 및 서열번호 35 내지 서열번호 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서 인간 라미닌(laminin)-2 α2 사슬 내의 5개 도메인 중 LG(large globular) 3 도메인이 신경 세포의 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진 효과를 나타냈으며, 상기 LG3 도메인 내에서 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드에서 이러한 활성이 가장 높았다. 또한, 서열번호 1로 기재되는 활성 펩티드의 N- 또는 C- 말단을 제거하거나 또는 C-말단을 첨가한 서열을 이용하여 이러한 생물학적 활성을 확인한 결과, 서열번호 35 내지 서열번호 50의 아미노산 서열을 갖는 펩티드의 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진 효과가 우수한 것이 관찰되었다.
따라서, 본 발명에 따른 인간 라미닌(laminin)-2 α2 사슬의 LG(large globular) 3 도메인 또는 상기 도메인에 포함되어 있는 활성 펩티드는 신경 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진제로서 유용하게 사용할 수 있다.
상기 본 발명의 신경 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진제의 유효성분은 임상 투여시에 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 신경 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진제는 실제로 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면 활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트 등이 사용될 수 있다.
상기 신경 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진제는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용되는 담체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 세포부착 촉진제의 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스(glucose), 수크로스(sucrose) 또는 덱스트란(dextran)과 같은 당류(carbohydrates), 아스코르브산(ascorbic acid) 또는 글루타치온(glutathione)과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이트화제(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.
상기 본 발명의 신경 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진제의 총 유효량은 거환(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 확산(infusion) 등에 의해 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수도 있다. 상기 신경 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진제의 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강 상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 신경 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진제의 약학적 조성물로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다.
또한, 본 발명은 인간 라미닌(laminin)-2 α2 사슬의 LG(large globular) 3 도메인 또는 상기 도메인에 포함되어 있는 활성 펩티드를 포함하는 신경세포 부착, 퍼짐, 이동 또는 신경돌기 성장 촉진용 용기를 제공한다.
상기 신경 세포는 PC12, CV-1, NIH/3T3, 슈반세포(Schwann cell), 사람 정상 피부각화세포(normal human epidermal keratinocytes), 사람 정상 구강각화세포(normal human oral keratinocytes) 및 사람 정상 피부섬유모세포(normal human dermal fibroblasts)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 신경세포 부착, 퍼짐, 이동 또는 신경돌기 성장 촉진용 용기는 세포배양용 디쉬, 페트리 디쉬, 조직배양용 플라스크, 플레이트, 용기, 슬라이드, 필터 챔버, 슬라이드 챔버, 롤러 바틀(roller bottle), 수집기(harvester) 및 튜브로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 신경 세포의 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진방법을 제공한다:
1) 본 발명에 따른 상기 인간 라미닌(laminin)-2 α2 사슬의 LG(large globular) 3 도메인 또는 상기 도메인에 포함되어 있는 활성 펩티드를 고체 지지대에 고정하는 단계; 및
2) 상기 고체 지지대에 신경세포의 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장을 촉진시키는 단계.
상기 신경 세포는 PC12, CV-1, NIH/3T3, 슈반세포(Schwann cell), 사람 정상 피부각화세포(normal human epidermal keratinocytes), 사람 정상 구강각화세포(normal human oral keratinocytes) 및 사람 정상 피부섬유모세포(normal human dermal fibroblasts)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 실시예에서, 인간 라미닌(laminin)-2 α2 사슬의 LG(large globular) 3 도메인(서열번호 2) 또는 상기 도메인에 포함되어 있는 활성 펩티드(서열번호 1, 서열번호 35 내지 서열번호 50)는 신경세포 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진을 촉진하는 효과를 나타내고 있으므로, 이를 신경 세포의 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장을 촉진하는데 유용하게 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 인간 라미닌(laminin)-2 α2 사슬의 LG(large globular) 3 도메인 또는 상기 도메인에 포함되어 있는 활성 펩티드를 함유하는 화상 또는 창상 치료제를 제공한다.
본 발명의 서열번호 2로 기재되는 폴리펩티드, 서열번호 1 또는 서열번호 35 내지 서열번호 50으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드는 세포의 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진을 촉진시키므로 화상 또는 창상 치료시 유용하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 인간 라미닌(laminin)-2 α2 사슬의 LG(large globular) 3 도메인 또는 상기 도메인에 포함되어 있는 활성 펩티드를 함유하는 인공 신경도관 또는 그의 지지체(scaffolds)를 제공한다.
본 발명의 서열번호 2로 기재되는 폴리펩티드, 서열번호 1 또는 서열번호 35 내지 서열번호 50으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드는 세포의 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진을 촉진시킨다. 따라서, 상기 폴리펩티드, 펩티드 또는 이들의 유도체는 인공 신경도관 제작시 코팅, 부착 또는 화학적으로 결합시켜 사용한다면, 신경세포의 부착을 촉진시키므로 인공 신경도관을 생체 내 삽입시켰을 때 신경재생을 일으킬 수 있다.
아울러, 본 발명은 인간 라미닌(laminin)-2 α2 사슬의 LG(large globular) 3 도메인 또는 상기 도메인에 포함되어 있는 활성 펩티드를 함유하는 조직공학용 지지체를 제공한다.
본 발명에 따른 조직공학용 지지체는 생체 조직의 대용품을 만들어 이식함으로써 신체의 기능을 유지, 향상 또는 복원하는 것을 목적으로 하는 조직 공학(tissue engineering) 분야에서 사용될 수 있는 모든 지지체를 포함한다. 이러한 조직공학용 지지체는 합성 생분해성 고분자인 폴리아미노산, 폴리안하이드라이드, 폴리 ε-카프로락톤, 폴리오르쏘에스테르, 폴리글리콜산(PGA), 폴리락틱산(PLA) 및이들의 공중합체인 폴리락틱-글리콜산(PLGA) 등과 천연 생분해성 고분자인 알긴산, 키토산, 하이알루닉산 및 콜라겐등으로 제조된 다공성 지지체를 포함한다. 상기조직공학용 지지체에는 차폐막이 포함될 수 있는데, 차폐막으로는 다공성 폴리락트산 차폐막, 키틴 또는 키토산 나노섬유로 제조된 재생막 또는 키틴 혹은 키토산의 필름 형태의 차폐막을 사용할 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 세포 배양
<1-1> PC12 세포 배양
이식 쥐 갈색세포종(pheochromocytoma)로부터 유래되는 PC12 세포주(CRT-1721TM, ATCC)를 항생제 및 10% 태아 혈청(FBS)로 보충된 RPMI 1640 배양액(BioWhittaker Cambrex, Walkersville, MD)에서 37℃에서 5% CO2의 습한 공기의 조건에서 배양하였다.
<1-2> NIH /3 T3 세포 배양
마우스 태아 섬유아세포(fibroblast) 세포는 American Type Cultuer Collection(Manassas, VA)로부터 구매하였으며, 10% 소태아 혈청(Fetal bovine serum, FBS)가 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지를 이용하여 배양하였다.
<1-3> CV -1 세포 배양
정상 아프리카 초록 원숭이 신장 섬유아세포주(African green monkey kidney fibroblast cell) CV-1 세포는 American Type Cultuer Collection(Manassas, VA)로부터 구매하였으며, 10% 소태아 혈청(Fetal bovine serum, FBS)가 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지를 이용하여 배양하였다.
<1-4> 슈반세포( Schwann cell )의 배양
본 발명에서 사용한 신경세포인 슈반 세포(Schwann cell)는 인간 피부 전구체를 슈반 세포 리니지로 2주 동안 분화시켜 획득하였으며, S100D와 GFAP(glial fibrillary acidic protein)와 같은 슈반 세포 특이적인 면역세포염색 마커를 이용하여 확인하였다(Biernaskie, J. A. et al., Nat . Protoc ., 2006).
<1-5> 사람 정상 피부각화세포의 배양
사람 정상 피부의 표피조직에서 분리한 사람 정상 피부각화세포(normal human epidermal keratinocytes, NHEK)를 KGM(keratinocyte growth medium)배지(Clonetics, San Diego, CA)를 이용하여 배양하였다. 하기 실험에 사용할 때에는 두 번째 계대(passage 2)된 세포를 이용하였다.
<1-6> 사람 정상 구강각화세포의 배양
사람 치은(잇몸)의 표피조직에서 분리한 사람 정상 구강각화세포(normal human oral keratinocytes, NHOK)를 KGM(keratinocyte growth medium)배지(Clonetics, San Diego, CA)를 이용하여 배양하였다. 하기 실험에 사용할 때에는 두 번째 계대(passage 2)된 세포를 이용하였다.
<1-7> 사람 정상 피부섬유모세포의 배양
사람 정상 피부의 진피조직에서 분리한 사람 정상 피부섬유모세포(normal human dermal fibroblasts, NHDF)를 항생제 및 10% 소태아 혈청(Fetal bovine serum, FBS)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지를 이용하여 배양하였다. 하기 실험에 사용할 때에는 네 번째 계대(passage 4)된 세포를 이용하였다.
< 실시예 2> 인간 라미닌 α2 사슬 LG 도메인을 발현시키는 벡터 제조
본 발명자들은 이전 연구에서, 인간 라미닌 α2 C-말단의 LG 도메인인 LG1 내지 LG3의 3개의 도메인이 세포 부착 활성을 촉진시킨다는 것을 밝힌 바 있다. 비록 이전 연구에서 밝힌 생물학적 활성 서열을 갖는 LG1 도메인은 세포 부착을 유발할 수 있으나, 세포 퍼짐(spreading), 이동 및 신경세포 성장과 같은 다른 기능을 수행하지 않는다는 것을 확인하였다(Jung, S. Y, et al., J. Biol . Chem ., 2009)
인간 라미닌 α2 사슬의 기능적 도메인을 동정하고, 인간 라미닌 α2 사슬 내의 다양한 기능적 활성을 주는 생물학적 활성 서열을 명확하게 하기 위하여, 인간 라미닌 α2 사슬의 C-말단의 다섯 개 도메인(LG1 내지 LG5)를 각각 인간 케라틴세포(keratinocyte) 및 섬유아세포로부터 역전사중합효소 연쇄반응(RT-PCR, reverse transcriptase-PCR)에 의해서 클로닝하였으며, 각각의 LG 도메인을 E. coli에서 발현시켰다.
<2-1> 인간 라미닌 α2 사슬 LG 도메인 클로닝
본 발명자들은 인간 라미닌 α2 사슬의 C-말단에 존재하는 5개의 도메인인, LG1 내지 LG5의 생물학적 활성을 갖는 서열을 규명하기 위하여, 인간 라미닌 α2 사슬 cDNA를 이용하여 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR, reverse transcriptase-PCR)을 수행하였다.
구체적으로, 인간 라미닌 α2 사슬 cDNA는 인간 케라틴세포 및 섬유아세포로부터 분리된 mRNA를 이용하여 제조자에 의해 추천되는 조건에서 Superscript Ⅱ 역전사 효소(Invitrogen, Carlsbad, CA)로 RT-PCR을 사용하여 클로닝하였다. 라미닌 α2 사슬의 C-말단에 존재하는 5개의 LG 도메인의 cDNA 단편들(LG1-LG5)은 라미닌 α2 사슬 cDNA를 주형으로 이용하여 PCR에 의해 증폭하였고 pGEM-T Easy 벡터(Promega, Madison, WI)로 연결하였다. PCR 반응에 사용된 프라이머는 하기와 같다:
LG1-1 정방향 프라이머: 5'-AAACAAGCCAATTCTATCAA-3'(서열번호 3);
LG1-1 역방향 프라이머: 5'-ATTTCCATTTCCCATCATT-3'(서열번호 4);
LG1 정방향 프라이머: 5'-GCCACTCGAGCAGGAGGTGACTG-3'(서열번호 5);
LG1 역방향 프라이머: 5'-GCCACCATGGTCAACTGACAGTGCATCC-3'(서열번호 6);
LG2 정방향 프라이머: 5'-GCCACTCGAGCAGTCCTCAGGTG-3'(서열번호 7);
LG2 역방향 프라이머: 5'-GCCACCATGGTCACTCCACAAAACCAGGCTTA-3'(서열번호 8);
LG3 정방향 프라이머: 5'-GCCACTCGAGTGTGGAGCTCTCCCCTGT-3'(서열번호 9);
LG3 역방향 프라이머: 5'-GCCACCATGGTCAAACTGGGGTGGGCGTAGGA-3'(서열번호 10);
LG4 정방향 프라이머: 5'-GCCACTCGAGTCTGACACATGGTCCTTGTG-3'(서열번호 11);
LG4 역방향 프라이머: 5'-GCCACCATGGTCATGCAAAACATGTCCCAA-3'(서열번호 12);
LG5 정방향 프라이머: 5'-GCCACTCGAGTGCAAATGCTCAGAGGGGA-3'(서열번호 13); 및
LG5 역방향 프라이머: 5'-GCCACCATGGTCACCTGGGGTTACACTTATTTTTATT-3'(서열번호 14).
LG1-1은 LG1-1 정방향 프라이머와 LG1-1 역방향 프라이머를 이용하여 증폭되었으며, 증폭된 산물은 LG1 정방향 및 역방향 프라이머를 이용하여 증폭되었다. 상기 모든 플라스미드 컨스트럭트의 튜클레오티드 서열은 서열 분석에 의해서 확인되었다. 이러한 cDNA 단편은 XhoI 및 NcoI 제한효소를 이용하여 절단하였으며, 포유류 발현 플라스미드 벡터 pRSET(Invitrogen)에 대응하는 위치에 삽입하였다. 상기 삽입의 올바른 방향은 서열 분석에 의해 확인하였다.
<2-2> 인간 라미닌 α2 사슬 LG 도메인의 발현 및 정제
상기 실시예 <2-1>에서 클로닝된 인간 라미닌 α2 사슬 LG 도메인 발현 벡터에를 이용하여, 재조합 LG(recombinant LG, rLG)를 발현 및 정제하였다.
rLG 도메인 단백질의 발현 및 정제의 방법은 이전에 보고된 바 있다(Kim, J. M. et.al., Exp . Cell Res ., 2005). 구체적으로, rLG 도메인 단백질들은 1 mM IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, Promega)를 이용하는 Luria-Bertani 배양액에서 MIDlog 단계에 자라는 대장균(Escherichia coli) BL21에서 발현을 유도하였다. 37℃에서 5시간 동안 단백질 발현을 유도한 후, 세포를 10분 동안 6,000 rpm에서 원심분리하여 회수하였다. 세포 침전물은 사용 전까지 -80℃에 보관하였다.
단백질 정제를 위하여, 상기 세포 침전물을 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(phenylmethylsulfonyl fluoride, Sigma)를 포함하는 용해 완충용액(lysis buffer, 100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-HCl, 8 M urea, pH 8.0)에서 용해시킨 후 현탁하였다. rLG 도메인 단백질들은 Ni2 +-니트릴로트리아세트산 아가로스(Ni2 +-nitrilotriacetic acid agarose)(Qiagen, Valencia, CA) 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 정제된 재조합 히스티딘 6(His6)로 태그된 LG 단백질들을 100 mM NaH2PO4 및 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드를 포함하는 10 mM Tris-HCl(pH 3.0) 완충용액에서 고농도부터 저농도(3 M, 2 M, 1 M 또는 0.5 M)까지의 우레아(urea)로 연속적으로 투석한 후, 마지막으로 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드를 포함하는 PBS(pH 3.0)로 투석하여 재생시켰다.
상기 투석된 rLG 도메인 단백질들을 센트리콘 기기(Centricon YM-10, Millipore, Bedford, MA)를 이용하여 0.5 ㎍/㎕ 농도로 농축한 후 사용하기 전까지 -80℃에서 보관하였다. 단백질 농도는 단백질 분석 킷트(Bio-Rad protein assay kit, BioRad, Hercules, CA)를 이용하여 측정하였다.
도 1의 A에 전체 인간 라미닌 α2 사슬 LG 내에서 rLG 도메인 단백질에 상응되는 위치를 나타냈다. 구체적으로, LG1은 전체 인간 라미닌 α2 사슬 LG의 2151 내지 2331번째 아미노산 서열을 갖으며, LG2는 2331 내지 2538번째 아미노산을, LG3은 2537 내지 2745번째 아미노산 서열을, LG4는 2746 내지 2936번째 아미노산 서열을, 그리고 LG5는 2936 내지 3122번째 아미노산 서열을 갖는다(도 1의 A). 예측되는 rLG1, rLG2, rLG3, rLG4 및 rLG5 단백질의 분자량은 각각 24, 27, 27, 25 및 25 kDa이며, 상기 BL21에서 발현된 단백질을 정제한 결과, 도 10에 나타난 바와 같이 각각의 정제된 rLG 도메인 단백질이 예측된 분자량을 나타내는 것을 확인할 수 있었다(도 10).
< 실험예 1> 정제된 rLG 도메인 단백질의 구조 분석
<1-1> rLG 도메인 단백질의 이황화결합 확인
본 발명자들은 상기 정제된 rLG 도메인 단백질에서 분자내 이황화 결합(disulfide bond)의 형성 여부를 확인하기 위하여, 상기 정제된 재조합 단백질을 환원(reducing) 또는 비환원(nonreducing) 조건 하에서 SDS-PAGE 분석을 수행하였으며, 이동 차이를 관찰하였다.
rLG 도메인 단백에 100 mM 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT)을 처리한 후, 10% SDS-PAGE를 수행하였으며, DTT를 처리하지 않은 단백질과의 젤 이동성(gel mobility)를 비교하였다.
그 결과, 도 1의 B에 나타난 바와 같이, rLG 도메인 단백질을 SDS-PAGE를 수행하기 전에 100 mM 디티오트레이톨(dithiothreitol)을 처리하였을 때, 젤 이동에서 미약하지만 재생가능한 환원을 유발하였으며, 이를 통하여 5개의 재조합 단백질에 분자 내 이황화 결합이 존재한다는 것을 확인할 수 있었다(도 1의 B).
<1-2> 원평광 이색성 분광법을 이용한 rLG 도메인 단백질의 구조 분석
상기 박테리아에서 발현된 rLG 도메인 단백질의 폴딩(folding) 여부를 측정하기 위하여, rLG 도메인 단백질의 2차 구조를 원평광 이색성 분광법(Circular Dichroism Spectroscopy, CD Spectroscopy)를 이용하여 분석하였다.
0.2 ㎎/㎖의 rLG 도메인 단백질을 PBS에 준비하였다. CD 스펙트라는 Jasco spectropolarimeter(model J-715; Jasco International Co., Japan)에 기록되었다. 단백질 샘플을 23℃에서 180 내지 300 nm로 2 mm 경로 길이 세포에서 분석하였다. 세 개의 반복적인 스캔은 평균화하였으며, 이항곡선(binomial curve)에 의해서 스무딩(smoothing)시켰다. 몰 타원율(molar ellipticity)(cm2 dmol-1 단위)은 단백질 농도 및 각각의 rLG 도메인 단백질의 분자량에 근거하여 계산하였다.
그 결과, 도 1의 C에 나타난 바와 같이, 재조합 히스티딘 6(His6)-LG1, -LG2, -LG3, -LG4 및 -LG5는 각각 215, 212, 211, 210 및 216 nm에서 최소 타원율(ellipticity minim)을 나타냈다(도 1의 C). 이러한 결과는 박테리아에서 발현된 인간 라미닌 α2 사슬의 LG 도메인이 강력한 세포 기능을 수행할 수 있도록, 잘 폴딩(folding)된다는 것을 의미한다.
< 실험예 2> rLG 도메인 단백질의 생물학적 활성 확인
인간 라미닌 α2 사슬 LG 도메인은 세포 부착, 헤파린(heparin) 결합 및 신경돌기 성장을 위한 다수의 활성 부위가 있다는 것일 알려져 있어, 본 발명자들은 재조합 인간 라미닌 α2 사슬 LG 도메인 단백질의 세포 결합 도메인을 규명하기 위하여 세포 활성을 측정하였다.
<2-1> 세포 부착 분석을 통한 rLG 도메인 단백질의 생물학적 활성 측정
세포 부착 분석은 본 발명자가 이전에 발표한 논문에 기재된 방법에 따라 수행하였다(Kim, J. M., et al, Exp . Cell Res , 2005)
구체적으로, 24 웰 컬쳐 플레이트(Nunc, Denmark)를 5 ㎍/㎖의 인간 태반 라미닌(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 또는 25 ㎍/㎖ rLG 도메인 단백질을 이용하여 4℃에서 12시간 동안 코팅하였다. 또한, 상기 펩티드는 상온에서 12시간 동안 플레이트(plate)에서 건조시켜 코팅시켰다. 상기 기질이 코팅된 플레이트는 PBS에 희석시킨 1% 열-불활성화된 소 혈청 알부민(bovine serum albuim, BSA)를 이용하여 37℃에서 1시간 동안 블로킹(blocking)한 후, PBS를 이용하여 세척하였다.
상기 세포는 트립신(trypsin)/EDTA를 이용하여 트립신처리한 후, 혈청이 첨가되지 않은 배양 배지를 이용하여 현탁하였다. 상기 세포를 2×105 세포/500㎕의 비율로 각각의 플레이트에 첨가한 후, 37℃에서 1시간 동안 혈청이 첨가되지 않은 배지를 이용하여 배양하였다. 배양한 후, 부착되지 않은 세포는 PBS로 2회 세척하여 제거하였다. 상기 부착된 세포는 10% 포르말린(formalin)을 이용하여 15분 동안 고정시킨 후, 0.5% 크리스탈 바이올렛(crystal violet)을 이용하여 1시간 동안 염색하였다. 플레이트는 조심스럽게 증류수로 3회 세척한 후, 2% SDS로 5분 동안 용해시켰다. 흡광도는 마이크로플레이트 리더(microplate reader)(BioRad)를 이용하여 570 nm 파장에서 측정하였다.
그 결과, 도 1의 D에서 인간 태반 라미닌은 세포의 부착을 촉진하는 것이 관찰되었다. 비록, rLG 도메인 단백질의 세포 부착의 수준은 라미닌에 비하여 낮았으나, PC12 세포는 rLG1, rLG3 및 rLG4에 처리량 의존적으로 부착되는 것이 관찰되었으나, rLG2 및 rLG5는 약하게 부착되었다.
또한, 0 내지 60 ㎍/㎖의 다양한 농도의 rLG 도메인 단백질로 코팅된 플레이트에서 혈청이 포함되지 않은 배지를 이요하여 PC12 세포를 1시간 동안 배양하였을 때, 도 11의 C에 나타난 바와 같이, rLG 도메인 단백질의 PC12 세포 부착이 25 ㎍/㎖의 농도에서 최고로 나타나는 것을 확인할 수 있었다(도 10의 C).
<2-2> 세포 퍼짐( spreading ) 분석을 통한 rLG 도메인 단백질의 생물학적 활성 측정
세포 퍼짐(spreading) 분석을 수행하기 위하여, 상기 실험예 <2-1>에서 각각의 rLG 도메인 단백질을 이용하여 코팅된 플레이트에서 1시간 또는 3시간 동안 배양된 세포를 10% 포르말린을 이용하여 고정하였다. 그 후 고정된 세포를 0.05% 크리스탈 바이올렛(crystal violet)을 이용하여 1시간 동안 염색하고, 플레이트를 조심스럽게 PBS를 이용하여 3회 세척하였다. 상기 세포의 표면 부분을 Image-Pro plus software(Version 4.5; Media Cybernetics, Silver Spring, MD)를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 도 1의 E에서 인간 태반 라미닌은 세포의 퍼짐(spreading)을 촉진시켰다(도 1의 E). rLG3, rLG4 및 rLG5 단백질은 BSA 대조군에 비하여 각각 세포 퍼짐(spreading)을 유발하였으나, rLG1 및 rLG2은 세포 퍼짐에 아무런 영향을 미치지 못하였다.
<2-3> 세포 이동 분석을 통한 rLG 도메인 단백질의 생물학적 활성 측정
세포 이동은 8 ㎛ 포어(pore) 사이즈의 트랜스웰 이동 챔버(transwell migration chambers)(Corning Inc., NY)를 이용하여 본 발명자가 이전에 발표한 논문에 기재된 방법에 따라 분석하였다(Kim, J. M., Min, S. K., Kim, H., Kang, H. K., Jung, S. Y., Lee, S. H., Choi, Y., Roh, S., Jeong, D., and Min, B. M.(2007) Int . J. Mol . Med.).
트랜스웰 필터의 밑면은 라미닌(5 ㎍/㎖) 또는 rLG 도메인 단백질(25 ㎍/㎖)을 각각 이용하여 4℃에서 12시간 동안 코팅되었다. 상기 트랜스웰 필터의 밑면은 PBS에 1%로 희석된 BSA를 이용하여 37℃에서 1시간 동안 블로킹하였다. 4×105 세포/㎖의 비율로 세포를 0.5% FBS와 0.1% BSA가 함유된 RPMI 1640 배지에서 현탁하였다. 이러한 현탁액 100 ㎕를 트랜스웰 필터의 상단 챔버(chamber)에 심었다. 세포는 37℃에서 24시간 동안 이동하도록 둔 뒤, 10% 포르말린(formalin)을 이용하여 15분 동안 고정시키고, 0.5% 크리스탈 바이올렛(crystal violet)을 이용하여 염색하였다. 상기 상단 챔버에서 이동하지 않은 세포는 면봉으로 제거하였으며 광학현미경 아래서 관찰한 후, 계수하였다.
그 결과, 도 1의 F에서 인간 태반 라미닌은 세포의 이동(migration)을 촉진시켰다(도 1의 F). 구체적으로, rLG1, rLG3 및 rLG4는 세포 이동을 현저하게 유도하는 것이 관찰되었지만, rLG2 및 rLG5는 세포 이동 효과를 나타내지 않았다.
<2-4> 신경돌기 성장 분석을 통한 rLG 도메인 단백질의 생물학적 활성 측정
라미닌과 rLG 도메인 단백질, 펩티드를 플레이트에 코팅한 후 혈청이 포함되지 않은 배지 상태에서 세포를 부착시키고 24시간 배양한 후 배지를 교환하였다. 그 후 다시 72시간 배양을 하여 신경돌기의 성장을 확인하였다.
그 결과, 도 10의 B에 나타난 바와 같이 신경돌기의 성장을 촉진하였다. 도 10의 B에 나타난 바와 같이 rLG 도메인 단백질은 PC12 세포에서 신경돌기 성장을 유도하는 것이 관찰되었다(도 10의 B).
이러한 rLG 도메인의 생물학적 활성 분석 결과, rLG3 도메인 단백질의 생물학적 활성이 세포 부착, 퍼짐(spreading), 이동 및 신경돌기 성장을 촉진한다는 측면에서 라미닌(laminin)과 유사하였다.
< 실험예 3> Ln2 - LG3 펩티드의 생물학적 활성 확인
본 발명자들은 상기 rLG 도메인 단백질의 생물학적 활성 분석 결과를 통하여, rLG3 도메인 단백질의 생물학적 활성이 다른 도메인에 비하여 우수하며, 라미닌과 유사하다는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 토대로, 본 발명자들은 206 잔기 길이의 폴리펩티드 사슬로 구성된, 인간 LG3 도메인 단백질의 생물학적 활성을 주는 필수적인 세포 결합 서열을 규명하고자 하였다.
<3-1> Ln2 - LG3 펩티드의 합성
우선, 본 발명자들은 도 2의 A에 나타난 바와 같이, LG3 도메으로부터 유래한 2669 ~ 2726 번째 위치의 아미노산으로부터, 6개의 오버래핑되는 12-머(mer)의 펩티드를 합성하여, 이들의 생물학적 활성을 분석하였다.
모든 펩티드는 Pioneer 펩티드 합성기(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 이용하여, C-말단 아미드(amide)를 가지고, Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl)-기반 고체상 방법을 통해, 펩트론(Peptron, Daejon, Korea)에서 정제되고 확인되었다.
합성된 12-머(mer)의 펩티드는 하기와 같다:
Ln2-LG3-P1: FQPSPLRNIPPF(서열번호 15);
Ln2-LG3-P2: RNIPPFEGCIWN(서열번호 1);
Ln2-LG3-P3: KNADIGRCAHQK(서열번호 16);
Ln2-LG3-P4: RCAHQKLREDED(서열번호 17);
Ln2-LG3-P5: LREDEDGAAPAE(서열번호 18); 및
Ln2-LG3-P6: EGCIWNLVINSV(서열번호 19).
상기 합성한 펩티드 중 Ln2-LG3-P1를 제외하고는 베타-시트(β-sheet) 사슬을 가지고 있었으며, 본 발명자들은 하기 실험예에서는 Ln2-LG3-P6(아미노산 2681-2692 위치)은 충분한 양의 정제량을 얻지 못하여 이용하지 않았다.
<3-2> Ln2 - LG3 펩티드의 세포 부착 활성 측정
본 발명자들은 상기 실험예 <3-1>에서 합성한 5가지 종류의 Ln2-LG3 펩티드를 이용하여, 이들의 세포 부착에 미치는 효과를 관찰하였다.
우선, 5가지 종류의 Ln2-PG3 펩티드의 양을 달리하여 코팅한 플레이트에 PC12 세포를 배양한 후, 세포 부착을 관찰하였다. 0 ~ 125 ㎍/㎖의 농도로 상기 펩티드를 플레이트에 12시간 동안 상온에서 건조과정을 거쳐 코팅하였다. 그 뒤, PC12 세포를 혈청이 포함되지 않은 배지를 이용하여 1시간 동안 상기 코팅된 플레이트에 부착시킨 후, 상기 실험예 <2-1>에 기재된 방법을 이용하여 세포 부착을 관찰하였다.
그 결과, 도 2의 B에 나타난 바와 같이 상기 Ln2-LG3-P2 펩티드의 세포 부착 활성은 PC12 세포에서 62.5 ㎍/㎖ 농도에서 최대화되었다. 반면, 다른 펩티드들은 세포 부착 활성을 나타내지 않았으며, 가장 높은 코팅 농도에서조차 나타내지 않는 것을 확인할 수 있었다(도 2의 B).
또한, 가장 세포 부착 활성이 높은 62.5 ㎍/㎖ 농도의 Ln2-PG3 펩티드를 이용하여 PC12 세포 부착 활성을 측정한 결과, 도 2의 C에 나타난 바와 같이, 5가지 종류의 Ln2-PG3 펩티드 중 Ln2-LG3-P2 펩티드가 PC12 세포의 부착을 촉진시켰으나, 다른 펩티드들은 세포 부착 활성을 나타내지 않았다(도 2의 C).
<3-3> Ln2 - LG3 펩티드의 세포 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진에 미치는 영향 측정
본 발명자들은 5가지 종류의 Ln-LG3 펩티드를 이용하여, 이들의 세포 퍼짐(spreading), 이동(migration) 및 신경돌기 성장에 미치는 효과를 관찰하였다.
본 발명자들은 세포 부착 활성이 가장 높게 나타났던, 62.5 ㎍/㎖ 농도에서 Ln2-LG3-P2 펩티드와 Ln2-LG3-P2 펩티드의 스크램블(scramble) 펩티드(서열번호 20: NWEIRCIPGNPF)의 세포 활성을 비교하였으며, Ln2-LG3-P1과 Ln2-LG3-P5 펩티드의 세포활성을 비교하였다. 구체적으로, 라미닌(5 ㎍/㎖), rLG3(25 ㎍/㎖), Ln2-LG3-P1(62.5 ㎍/㎖), Ln2-LG3-P2(62.5 ㎍/㎖), Ln2-LG3-P3(62.5 ㎍/㎖), Ln2-LG3-P4(62.5 ㎍/㎖), Ln2-LG3-P5(62.5 ㎍/㎖), SP(Scrambled peptide, 서열번호 20)(62.5 ㎍/㎖)를 이용하여 코팅한 플레이트에서 PC12 세포를 혈청이 포함되지 않은 배지를 이용하여, 1시간 동안 배양하여 세포 부착을 관찰하였으며, 3시간 동안 혈청이 포함되지 않은 배지로 배양하여 세포 퍼짐을 관찰하였다.
그 결과, 도 2의 D 및 E에 나타난 바와 같이, Ln2-LG3-P2 펩티드는 rLG3과 유사하게 세포 퍼짐과 세포 이동에 영향을 미쳤으나, 스크램블 펩티드(서열번호 20)를 포함한 그 외의 Ln2-LG3 펩티드는 세포 퍼짐과 세포 이동에 아무런 영향을 끼치지 못하였다(도 2의 D 및 E).
<3-4> Ln2 - LG3 펩티드의 슈반세포에서의 부착 활성, 퍼짐 및 신경돌기 성장에 미치는 영향 측정
본 발명의 Ln2-LG3-P2 펩티드는 상기 실험예 <3-1>에서 PC12 세포의 세포 부착 활성을 나타냈으며, 이에 본 발명자들은 본 발명의 Ln2-LG3-P2 펩티드가 다른 종류의 세포 종류의 부착을 매개할 수 있는지를 확인하기 위하여, 신경 재생에 있어서 중요한 역할을 하는 슈반세포(Schwann cell)를 이용하였다.
구체적으로, 라미닌(5 ㎍/㎖), rLG3(25 ㎍/㎖), Ln2-LG3-P1(62.5 ㎍/㎖), Ln2-LG3-P2(62.5 ㎍/㎖), Ln2-LG3-P3(62.5 ㎍/㎖), Ln2-LG3-P4(62.5 ㎍/㎖), Ln2-LG3-P5(62.5 ㎍/㎖), SP(Scrambled peptide, 서열번호 20)(62.5 ㎍/㎖)로 코팅한 플레이트에서 혈청이 포함되지 않은 배지를 이용하여, 1시간 동안 배양하여 슈반세포(Schwann cell)의 부착을 관찰하였으며, 3시간 동안 혈청이 포함되지 않은 배지로 배양하여 슈반세포의 퍼짐을 관찰하였다.
그 결과, 도 2의 F에 나타난 바와 같이, 본 발명의 Ln2-LG3-P2 펩티드는 BSA, 스크램블 펩티드 및 그외의 다른 Ln2-LG3 펩티드에 비하여 상대적으로 슈반 세포에 강한 세포 부착 활성을 나타내는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 이러한 본 발명의 Ln2-LG3-P2 펩티드의 세포 부착 활성은 라미닌과 유사하였다(도 2의 F).
또한, 도 2의 G에 나타난 바와 같이, 비록 Ln2-LG3-P2 펩티드에서 슈반 세포의 퍼짐은 라미닌에 비하여 약 50% 감소하였으나, Ln2-LG3-P2 펩티드는 BSA 또는 스크램블 펩테드에 비하여 상대적으로 높은 세포 퍼짐 효과를 나타냄으로써, Ln2-LG3-P2 펩티드가 슈반 세포의 부착 및 퍼짐을 촉진하는 기능적으로 활성화된다는 것을 알 수 있었다(도 2의 G).
<3-5> Ln2 - LG3 펩티드의 다양한 세포에서의 부착 활성, 퍼짐 및 신경돌기 성장 비교
또한, 본 발명자들은 본 발명의 Ln2-LG3-P2 펩티드의 다양한 세포에서의 세포 부착 활성, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진에 미치는 효과를 측정하고자, PC12, CV-1, NIH/3T3. 사람 정상 피부각화세포(normal human epidermal keratinocytes, NHEK), 사람 정상 구강각화세포(normal human oral keratinocytes) 및 사람 정상 피부섬유모세포(normal human dermal fibroblasts, NHOK)를 이용하였다.
본 발명에서 사용한 피부 유래 전구 세포로부터 유래되어, 분화된 슈반 세포는 본 발명에서 사용한 트랜스 웰 이동 챔버(transwell migration chamber) 분석 시스템에서 이동하지 않았으며, 이는 이미 상기 세포에 신경돌기 분기(branching) 및 성장이 확정되어 있기 때문이라고 추정되었다.
구체적으로, 상기 <실시예 1>에서 배양된 사람 정상 피부각화세포(normal human epidermal keratinocytes, NHEK), 사람 정상 구강각화세포(normal human oral keratinocytes, NHOK), 사람 정상 피부섬유모세포(normal human dermal fibroblasts, NHDF), CV-1, NIH/3T3 세포를 Ln2-LG3-P2(62.5 ㎍/㎖)로 코팅한 플레이트에서 1시간 동안 혈청이 포함되지 않은 배지를 이용하여 배양한 후, 각각의 세포 부착을 관찰하였다.
그 결과, 도 2의 H에 나타난 바와 같이, 62.5 ㎍/㎖ 농도의 Ln2-LG3-P2 펩티드는 사람 정상 피부각화세포에 비하여 강한 세포 부착 활성을 두 번째 계대(passage 2)에서 나타냈으며, 정상 인간 구강 케라틴세포에 비하여는 두 번째 계대(passage 2)에서, 사람 정상 피부섬유모세포(dermal fibroblasts)에 비하여는 네 번째 계대(passage 4)에서, 강한 세포 부착 활성이 관찰되었다. 또한, CV-1 세포와 NIH/3T3 세포에서도 Ln2-LG3-P2 펩티드(62.5 ㎍/㎖)는 강한 세포 부착 활성을 나타냈으며, 이러한 결과는 본 발명의 Ln2-LG3-P2 펩티드가 다양한 세포에 대하여 세포 부착 활성을 나타낸다는 것을 의미한다(도 2의 H).
<3-6> 세포 부착 억제 분석을 통한, Ln2 - LG3 - P2 펩티드 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장에 미치는 영향 확인
인간 라미닌 α2 체인의 LG3 도메인의 세포 활성에서 Ln2-LG3-P2 펩티드의 역할을 규명하기 위하여, rLG3 단백질의 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진에 대한, Ln2-LG3-P2 펩티드의 경쟁적인 능력을 측정하였다.
<3-6-1> Ln2 - LG3 - P2 펩티드 전처리에 의한 농도 의존적인 PC12 세포 부착 억제 효과 확인
구체적으로, PC12 세포에 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 또는 1.2 ㎍/㎖ 농도의 Ln2-LG3-P3 펩티드를 상온에서 10분 동안 전처리한 후, rLG3(25 ㎍/㎖)으로 코팅된 플레이트에 혈청이 포함되지 않은 배지를 이용하여 1시간 동안 배양하였다.
그 결과, 도 11의 A에 나타난 바와 같이, 무처리 군에 비하여 Ln2-LG3-P2 펩티드를 전처리군에서 처리 농도 의존적으로 세포 부착이 감소하는 것을 관찰할 수 있었다(도 11의 A). 도 11의 A에 나타난 수치는 펩티드를 처리하지 않은 무치리군에 대한 세포의 수치를 퍼센트로 나타냈으며, 이는 평균 ± S.D.(n=4)를 나타낸다.
<3-6-2> Ln2 - LG3 - P2 펩티드 전처리에 의한 PC12 세포의 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진 억제 효과 확인
PC12 세포에 500 ㎍/㎖ 농도의 Ln2-LG3-P1, Ln2-LG3-P2, Ln2-LG3-P3, Ln2-LG3-P4, Ln2-LG3-P5 및 SP(scramble peptide)(서열번호 20)을 상온에서 10분 동안 전처리한 후, rLG3(25 ㎍/㎖)으로 코팅된 플레이트에 혈청이 포함되지 않은 배지를 이용하여 배양하였다. 세포 부착을 관찰하기 위해서는 1시간 동안 PC12 세포를 상기 코팅된 플레이트에서 배양하였으며, 세포 퍼짐을 관찰하기 위해서는 3시간 동안 PC12 세포를 상기 코팅된 플레이트에서 배양하여 관찰하였다. 세포의 이동을 관찰하기 위해서는 rLG3(25 ㎍/㎖)로 코팅된 트랜스웰 필터(transwell filter)의 위쪽 챔버(chambeR)에 세포를 심은 뒤, 24시간 동안 배양하면서, 상기 필터를 통해서 이동된 세포의 수를 계수하여 수치화하였다.
그 결과, 도 11의 A 내지 D에 나타난 바와 같이, Ln2-LG3-P2 펩티드는 rLG3 단백질에 대한 세포 부착을 처리 농도 의존적인 방식으로 억제하였으며, 500 ㎍/㎖에서 약 40% 정도 세포 부착을 억제하는 것이 관찰되었다. 또한, Ln2-LG3-P2 펩티드는 rLG3 단백질에 대한 세포 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진을 억제하는 것을 확인할 수 있었다(도 11의 C 및 D). 이러한 결과를 종합하였을 때, 이러한 결과는 상기 LG3 도메인 내의 Ln2-LG3-P2 펩티드가 PC12 세포의 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장에 있어서 매우 중요하다는 것을 확인할 수 있었다.
아울러, 도 11의 B 내지 D에 나타난 데이타는 펩티드를 전처리하지 않은 세포에 대한 값을 기준으로 퍼센트로 나타내었으며, 이는 평균 ± S.D.(n=4)이다.
< 실험예 4> Ln2 - LG3 - P2 펩티드의 아르기닌( Arg ) 잔기의 세포 활성에 미치는 영향 확인
<4-1> 돌연변이 rLG1 단백질( rLG3 - M1 )의 제조
본 발명자와 다른 연구진들은 이전에 아르기닌(arginine, Arg) 잔기와 같이 전하를 띈 아미노산 잔기가 세포 부착에 있어서 필수적이라는 것을 밝힌바 있다(Kim, J. M., et al., Exp . Cell Res ., 2005; Hohenester, E., et al., Mol . Cell, 1999). 전하를 띈 아미노산 잔기는 몇몇의 라미닌 α 체인의 LG 도메인, 인테그린(integrin), 신데칸-1(syndecan-1), 또는 헤파린 유사 세포 표면 수용체(heparin-line cell surface recpetor) 사이의 상호작용을 위해 매우 중요하므로, Ln2-LG3-P2 위치의 양전하를 띈 아르기닌(Arg)을 알라닌(Ala)로 치환하여 돌연변이 rLG1 단백질(rLG3-M1)(서열번호 21: ANIPPFEGCIWN)을 발현시킨 후, 이를 수득하여 하기 실험에 사용하였다(도 3의 A).
<4-2> LG 도메인 내 Ln2 - LG3 - P2 펩티드의 위치 분석
공간 충전 모형(space-filling model) 및 리본 다이어그램(ribbon diagram)에서 Ln2-LG3-P2 펩티드는 LG 도메인의 표면에 있는 것이 알려져 있다(Carafoli, F., et al., J. Biol . Chem , 2009). 구체적으로 Ln2-LG3-P2 펩티드 내의 기본 아미노산 잔긴 아르기닌(Arg)은 루프(loop)에서 발견되었으며, 단백질의 표면에서 노출되어 있어, 라미닌과 세포 표면 수용체와 같은 단백질-단백질 상호작용에 참여할 수 있는 위치에 있다(도 12).
<4-3> 돌연변이 rLG3 단백질( rLG3 - M1 )의 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진에 미치는 영향 확인
상기 실험예 <4-1>에서 아르기닌을 알라닌으로 치환하여 발현시킨 돌연변이 rLG3-M1 펩티드는 약 27 kDa의 사이트를 나타냈다(도 3의 B).
본 발명자들은 부위 특이적 돌연변이를 통하여 제조한 돌연변이 rLG3-M1 단백질의 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진에 미치는 영향을 관찰하였다.
구체적으로, 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진을 관찰하기 위하여, 상기 실험예 <2-1> 내지 <2-3>에 기재된 방법을 이용하였으며, 라미닌(5 ㎍/㎖), rLG3(25 ㎍/㎖) 또는 rLG3-M1(25 ㎍/㎖)으로 코팅된 플레이트에서 PC12 세포를 배양한 후, 이를 관찰하였다. 세포 부착을 관찰하기 위해서 PC12 세포를 상기 코팅된 플레이트에 배양한 시간은 1시간이었으며, 세포 퍼짐을 관찰하기 위하여 PC12 세포를 상기 코팅된 플레이트에 배양한 시간은 3시간이었으며, 세포 이동을 관찰하기 위하여 1시간 동안 상기 코팅된 플레이트에서 배양한 후, 분석하였다.
그 결과, 도 3의 C, D 및 E에 나타난 바와 같이 PC12 세포에서 상기 돌연변이 rLG3-M1 펩티드는 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진을 rLG3 단백질(Ln2-LG3-P2 펩티드)에 비하여 현저하게 감소시키는 것을 관찰할 수 있었다(도 3의 C, D 및 E).
또한, PC12 세포에 rLG3(250 또는 500 ㎍/㎖), rLG3-M1(250 ㎍/㎖), 또는 비히클(pH 3.0의 인산 완충용액)을 30분 동안 전처리한 후, 라미닌(5 ㎍/㎖)으로 코팅된 플레이트에서 혈청이 제거된 배지를 이용하여 30분 동안 배양한 후, 세포 부착을 관찰하였다.
그 결과, 도 3의 F에 나타난 바와 같이, 돌연변이 rLG3-M1 펩티드를 PC12 세포에서 250 ㎍/㎖ 농도로 전처리하였을 때, 라미닌에 대한 세포 부착이 억제되지 못하는 것을 관찰할 수 있었다(도 3의 F). 반면, rLG3은 라미닌에 대한 세포 부착을 PC12 세포에서 250 ㎍/㎖ 농도로 처리하였을 때는 23% 까지 약하게 억제하는 효과를 나타냈으나, PC12 세포에서 500 ㎍/㎖ 농도로 처리하였을 때는 라미닌에 대한 세포 부착을 48%까지 억제하는 효과를 나타냈다.
이러한 결과는 다른 세포 표면 수용체가 라미닌에 대한 세포 부착을 유도할 수 있으며, 인테그린, α-디스트로글리칸(α-dystroglycan) 및 신데칸-1(syndecan-1)이 라미닌 α2 사슬 LG 도메인과 결합한다는 것을 의미하며, 이는 이전 연구 결과들과 일치한다(Suzuki, N., et al., Connect . Tissue Res ., 2005; Jung, S. Y, et al., J. Biol . Chem , 2009; Smirnov, S. P.,et al., J. Biol . Chem, 2002)
<4-4> 라미닌 -1 및 라미닌 -2의 종간 서열 비교
다른 종의 라미닌-1과 라미닌-2를 비교한 결과 Ln2-LG3-P2 펩티드 내의 아르기닌/라이신(Arg/Lys) 잔기를 포함한 기본 아미노산 잔기가 모두 보존되어 있는 것을 확인할 수 있었다(도 3의 G, 표 1).
다양한 종에서의 Ln-2 및 Ln-2 펩티드의 서열 비교
종 펩티드 종류 아미노산 서열 서열번호
인간 Ln-2 R N I P P F EGC I WN 서열번호 22
마우스 R N I P A F QGC VWN 서열번호 23
랫트 R N I P A F QGC VWN 서열번호 24
닭 R N I P P F EGC I WN 서열번호 25
복어 R V N V P F QGC I WN 서열번호 26
다니오(danio) R P S V P F EGC I WN 서열번호 27
인간 Ln-1 T MR R S F HGC I K N 서열번호 28
마우스 K M R T S F HGC I K N 서열번호 29
랫트 R M R T S F HGC I K N 서열번호 30
말 R M R G S F HGC I R N 서열번호 31
개 K MR K S F HGC I K N 서열번호 32
닭 KM T GS F YGC I SN 서열번호 33
다니오(danio) T L T P A F YGC I R N 서열번호 34
<4-5> 합성된 Ln2 - LG3 - P2A 펩티드의 세포 부착에 미치는 영향 확인
Ln2-LG3-P2 펩티드 내 아르기닌(Arg) 잔기의 역할을 조사하기 위하여, 재조합 단백질 rLG3의 P2 부위의 아르기닌을 알라닌으로 치환하여 Ln2-LG3-P2A 펩티드를 합성하였다. Ln2-LG3-P2 펩티드의 아르기닌(Arg)을 알라닌(Ala)으로 치환하여 합성된 Ln2-LG3-P2A 펩티드가 코팅된 플레이트 웰에 PC12 세포를 심은 후, 세포 부착 활성을 비교하였다.
구체적으로, PC12 세포에 Ln2-LG2-P2(500 ㎍/㎖)과 Ln2-LG3-P2A(500 ㎍/㎖)를 전처리한 후, rLG3(25 ㎍/㎖)으로 코팅된 플레이트에서 세포 부착을 관찰하였다.
그 결과, 도 3의 H에 나타난 바와 같이, 대조군 Ln2-LG3-P2에 비하여 돌연변이 Ln2-LG3-P2A 펩티드에 의하여 세포 부착이 현저하게 억제되는 것을 관찰할 수 있었다. 그리고, 도 3의 I에 나타난 바와 같이 Ln2-LG3-P2A 펩티드를 500 ㎍/㎖ 전처리한 PC12 세포는 rLG3에 대한 부착이 억제되지 않음을 관찰할 수 있었다.
이러한 결과를 종합해보면, Ln2-LG3-P2 펩티드는 인간 라미닌 α2 LG3 도메인 내 세포 결합 위치로서 기능을 하며, Ln2-LG3-P2 펩티드 내 전하를 띈 아미노산 잔기인 아르기닌(Arg)은 상기 펩티드의 생물학적 활성에 있어서 필수적이라는 것을 의미한다.
< 실험예 5> 인간 라미닌 α2 LG3 도메인의 수용체 규명
<5-1> 금속 킬레이트제 처리에 의한 LG3 도메인 및 Ln2 - LG3 - P2 펩티드의 세포 부착 및 퍼짐 에 미치는 영향 확인
인간 라미닌 α2 LG3 도메인에 대한 수용체 규명은 완전히 밝혀지지 않았으므로, 본 발명자들은 PC12 세포에서 부착을 매개할 수 있는 LG3 및 Ln2-LG3-P2에 대한 특이적 부착 수용체를 규명하기 위하여 실험을 계획하였다. 인테그린 및 α-디스트로글리칸(α-dystroglycan)의 이들의 리간드에 결합에는 Ca2 + 및 Mn2 +과 같은 2가양이온이 필요하다는 것이 알려져 있다(Hall, H., et al., Mol . Cell . Neurosci ., 2003). 2가양이온의 기능을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 금속킬레이트제(metal-chelating reagent)인 EDTA가 라미닌, LG3 도메인 및 Ln2-LG3-P2 펩티드의 세포 부착 및 퍼짐에 미치는 영향을 연구하였다.
PC12 세포에 5 mM EDTA 또는 1 mM MnCl2를 37℃에서 15분 동안 전처리한 후, rLG3 또는 Ln2-LG3-P2 펩티드를 이용하여 코팅된 플레이트에 배양하였다. 세포 부착을 측정하기 위해서 상기 코팅된 플레이트에서 1시간 동안 세포를 배양한 후, 흡광도를 측정하였다. 또한, 세포 퍼짐을 측정하기 위해서는 3시간 동안 상기 코팅된 플레이트에서 배양한 후, Image-Pro plus software를 이용하여 상대적인 영역을 측정하였다.
그 결과, 라미닌에 대한 세포 부착 및 퍼짐은 PC12 세포를 5 mM EDTA를전처리한 후 배양하였을 때, EDTA를 전처리하지 않은 대조군 PC12 세포에 비하여 완전히 억제되는 것을 관찰할 수 있었으나, rLG3 또는 Ln2-LG3-P2에 대한 세포 부착 및 퍼짐은 EDTA 처리에 의해서 부분적으로 억제되는 것을 관찰할 수 있었다(도 4의 A 내지 B). 반면, Mn2 + 전처리는 라미닌, rLG3 및 Ln2-LG3-P2에 대한 세포 부착 및 퍼짐을 현저하게 증가시키는 것을 관찰할 수 있었다(도 4의 A 및 B).
<5-2> 인테그린 항체 처리에 따른 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진에 미치는 영향 측정
이전 연구에 따르면, PC12 세포는 공간적으로 상이한 위치에서 라미닌과 상호작용하는 2개의 주요한 인테그린인 α1β1, α3β1을 발현한다는 것이 발표된 바 있다(Tomaselli, K. J., et al., Neuron , 1990). rLG3 및 Ln2-LG3-P2 펩티드와 인테그린 사이의 상호작용을 더욱 잘 이해하기 위하여, 본 발명자들은 인테그린 α1, α3 및 β1 서브유닛에 대한 단일클론 기능-억제 항체를 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진에 대한 경쟁자로서 그 효과를 관찰하였다.
구체적으로, PC12 세포를 5 mM EDTA, 10 ㎍/㎖의 인테그린 α1에 대한 기능-억제 항체(Ha31/8; BD Biosciences, San Jose, CA) 및 인테그린 α3에 대한 기능-억제 항체(Ralph 3.2; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) 및 β1에 대한 기능-억제 항체(Ha2/5; BD Biosciences) 서브유닛을 37℃에서 15분 동안 전처리한 후 배양하였다. 그리고, 상기 미리 배양된 세포를 라미닌(5 ㎍/㎖), rLG3 도메인 단백질(25 ㎍/㎖)을 500 ㎕를 웰 플레이트에 넣고 1시간 동안 코팅하였으며, Ln2-LG3-P2 펩티드(25 ㎍/well) 또한 웰 플레이트에서 1 시간 동안 코팅시켰다.
그 결과, 인테그린 α3 및 β1 항체는 아무것도 처리되지 않은 무처리 대조군(none)에 비하여 상대적으로 rLG3 및 Ln2-LG3-P2에 대한 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진을 부분적으로 억제하였으나, 인테그린 α1 항체는 이 실험에서 전체적으로 아무런 효과를 나타내지 못하였다(도 4의 C 내지 E). 도 4의 C 내지 E에 나타난 수치는 모두 평균 ± S.D.(n=3)으로 나타난 수치이다.
이러한 결과는 α3β1 인테그린이 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진 활성에 영향을 미치는 rLG3 및 Ln2-LG3-P2의 세포 수용체라는 것을 나타낸다.
< 실험예 6> Ln2 - LG3 - P2 펩티드의 생물학적 활성 코어 서열 규명
<6-1> Ln2 - LG3 - P2 펩티드의 N- 및 C- 말단이 제거 또는 첨가된 합성 펩티드의 제조
상기 실험예를 통하여, Ln2-LG3-P2 펩티드가 α3β1 인테그린에 결합하여, 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장을 촉진시킨다는 것을 확인할 수 있었다. Ln2-LG3-P2 펩티드의 생물학적으로 활성을 나타내는 코어(core) 서열을 밝히기 위하여, 상기 Ln2-LG3-P2 펩티드의 N- 및 C- 말단이 제거된 합성 펩티드를 제조하였다(도 5의 A).
Ln2-LG3-P2 펩티드의 N- 및 C- 말단이 제거 또는 C-말단이 첨가된 합성 펩티드
펩티드 명칭 아미노산 서열 서열번호
Ln2-LG3-P2 RNIPPFEGCIWN 서열번호 1
Ln2-LG3-P2-DN1 NIPPFEGCIWN 서열번호 35
Ln2-LG3-P2-DN2 IPPFEGCIWN 서열번호 36
Ln2-LG3-P2-DN3 PPFEGCIWN 서열번호 37
Ln2-LG3-P2-DN4 PFEGCIWN 서열번호 38
Ln2-LG3-P2-DN5 FEGCIWN 서열번호 39
Ln2-LG3-P2-DC1 RNIPPFEGCIW 서열번호 40
Ln2-LG3-P2-DC2 RNIPPFEGCI 서열번호 41
Ln2-LG3-P2-DC3 RNIPPFEGC 서열번호 42
Ln2-LG3-P2-DN3-DC1 PPFEGCIW 서열번호 43
Ln2-LG3-P2-DN3-DC2 PPFEGCI 서열번호 44
Ln2-LG3-P2-DN3-DC3 PPFEGC 서열번호 45
Ln2-LG3-P2-DN3-DC4 PPFEG 서열번호 46
Ln2-LG3-P2-DN3-DC5 PPFE 서열번호 47
Ln2-LG3-P2-DN3-DC6 PPF 서열번호 48
Ln2-LG3-P2-AC1 RNIPPFEGCIWNLVINSVPMDFAR 서열번호 49
Ln2-LG3-P2-AC2 RNIPPFEGCIWNLVINSVPMDFARPVSFKNADIGRC 서열번호 50
<6-2> N- 및 C- 말단이 제거 또는 첨가된 Ln2 - LG3 - P2 펩티드의 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진에 미치는 영향 측정
상기 제조된 Ln2-LG3-P2 펩티드의 N- 및 C- 말단이 제거된 합성 펩티드를 이용하여 PC12 세포의 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진 활성을 측정하기 위하여, 상기 표 1체 기재된 펩티드를 62.5 ㎍/㎖의 농도로 플레이트에 코팅한 후, 그 위에 PC12 세포를 심었다.
Ln2-LG3-P2 및 스크램블 펩티드는 각각 양성 및 음성 대조군으로 사용하였다. Ln2-LG3-P2-DN3, Ln2-LG3-P2-DN4 및 Ln2-LG3-P2-DC1을 제외한 모든 펩티드는 Ln2-LG3-P2 대조군에 비하여 세포 부착 활성을 현저히 낮췄다(도 5의 B). 이와 유사하게, Ln2-LG3-P2-DN3 및 Ln2-LG3-P2-DN4의 세포 퍼짐 활성은 Ln2-LG3-P2와 유사하였다(도 5의 C).
또한, Ln2-LG3-P2-DN3의 세포 이동 활성은 Ln2-LG3-P2와 유사하였으나, Ln2-LG3-P2-DN4는 세포 이동 활성을 나타내지 않았다(도 5의 D). 도 5의 C 내지 D에서 나타난 수치는 평균 ± S.D.(n=4)이며, P값은 BSA 또는 스크램블 펩티드(scaramble peptide, SP)를 이용하여 코팅된 플레이트에서 배양된 세포에서 측정된 수치를 기준으로 나타낸 값이다.
< 실험예 7> 인테그린이 매개된 Ln2 - LG3 - P2 펩티드의 세포 부착 유도 확인
인테그린 매개 세포 부착은 액틴 스트레스 섬유(actin stress fiber) 형성 및 국소 부착 어셈블리(focal adhesion assembly)를 유도한다는 것은 잘 알려져 있다(Clark, E. A., et al., Science, 1995; Schwartz, M. A.et al., Annu . Rev . Cell Dev . Biol ., 1995). 이에, 본 발명자들은 rLG3 및 Ln2-LG3-P2 펩티드 또한 인테그린 매개 세포 부착을 유도할 수 있는지 확인하기 위하여, PC12 세포의 액틴 스트레스 섬유의 구조 및 국소 부착의 위치를 면역염색에 의해서 확인하였다.
구체적으로, 면역 염색방법을 위해서 PC12 세포를 우선, 라미닌(5 ㎍/㎖), rLG 도메인 단백질(25 ㎍/㎖) 또는 스크램블 펩티드(Scrambled peptide, SP)(25 ㎍/well)로 코팅된 Lab-Tek 챔버 슬라이드(Nalge Nunc International, Rochester, NY)를 이용하여 37℃에서 3시간 동안 혈청이 포함되지 않은 배지를 이용하여 배양하였으며, 이에 대한 대조군으로 BSA를 이용하여 Lab-Tek 챔버 슬라이드를 코팅하였다. PBS를 이용하여 세척한 후, PC12 세포는 3.7% 포르말린(formalin)으로 20분 동안 고정시키고, 0.5% Triton X-100을 5분 동안 처리하여, PC12 세포를 투과성(permeabilization)이 있도록 만들었다. PC12 세포는 1차 항체를 이용하여 4℃에서 12시간 동안 배양하였다. 사용된 1차 항체로는 1:500 항-빈쿨린(vinculin)(Sigma-Aldrich 9131)과 F-actin을 염색하기 위한, 1:300 로다민-팔로이딘(rhodamine-phalloidin)(Invitrogen R154)을 이용하였다. PBS를 이용하여 세척한 후, PC12 세포는 FITC 결합된 항-마우스 IgG 항체(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) 또는 로다민(rhodamin) 결합된 항-마우스 IgG 항체(Santa Cruz Biotechnology)를 이용하여 상온에서 1시간 동안 면역염색되었다. PBS를 이용하여 3회 세척한 후, 상기 염색된 PC12 세포는 공초점 레이져 현미경(confocal laser scanning microscope)을 이용하여 사진을 찍었다(FV300; Olympus, Japan).
그 결과, 도 6의 A 및 B에 나타난 바와 같이 PC12 세포는 라미닌 코팅된 플레이트에서 매우 잘 퍼짐(spreading)되며, 액틴 스트레스 섬유(actin stress fiber)를 형성하고, 국소 부착(focal adhesion)을 형성하는 것을 관찰할 수 있었다. 유사하게, PC12 세포는 rLG3 및 Ln2-LG3-P2가 코팅된 플레이트에서 잘 퍼짐되며, 액틴 스트레스 섬유와 국소 부착을 형성하나, 상기 라미닌에 비하여 그 정도가 낮았다(도 6의 A 및 B).
반대로, 다른 rLG 도메인 단백질 및 스크램블 펩티드는 PC12 세포 퍼짐에 아무런 영향을 미치지 못하였으며, 액틴 스트레스 섬유(actin stress fiber)를 형성하지 못하였다(도 6의 A 및 B). 참고로, 도 6의 A의 면역 염색 사진에 나타난 바(bar)는 50 ㎛를 의미하며, 도 6의 B의 염색 사진에 나타난 바(bar)는 20 ㎛를 의미한다.
< 실험예 8> Ln -2 LG3 - P2 펩티드와 α3β1 인테그린의 상호작용에 의한 FAK 의 인산화 확인
기존 연구를 통하여, FAK는 인테그린 매개된 신호 유도 기작의 구성요소라는 것이 확인되었다(Clark, E. A., et al., Science , 1995; Schwartz, M. A., et al., Annu . Rev . Cell Dev . Biol ., 1995). FAK 활성의 전형적인 특징은 인테그린 매개된 세포 부착 및 퍼짐에 의한 Tyr-397의 급속한 인산화이다(Richardson, A., et al., Nature , 1996). 본 발명자들은 포스포-FAK-Tyr397(phospho-FAK-Tyr397) 항체를 이용하여, 라미닌, rLG3 및 Ln2-LG3-P2를 이용하여 코팅된 플레이트에서 배양되는 PC12 세포의 FAK 인산화를 측정하였다.
FAK의 인산화를 측정하기 위하여, 구체적으로 PC12 세포는 0.1% FBS가 함유된 RPMI 1640 배지로 교체하여 12시간 동안 굶겼다. 2×106의 PC12 세포는 라미닌(5 ㎍/㎖), rLG3(25 ㎍/㎖), 또는 Ln2-LG3-P2(25 ㎍/well)을 이용하여 60-mm 디쉬를 코팅한 후, 지정된 시간(15분, 30분 및 60분) 동안 부착되도록 두었다. 세포는 차가운 PBS를 이용하여 세척한 후, 프로테아즈(protease) 억제제 칵테일이 포함된 200 ㎕의 RIPA 버퍼[50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA 1% Triton X-100, 1 mM PMSF, 2 mM Na3VO4, 1 mM 글리세롤 포스페이트(glycerol phosphate)]을 이용하여 용해시켰다. RIPA 용해물은 SDS 샘플 버퍼[50 mM Tris/HCl, pH 6.8, 2% SDS, 10% 글리세롤(glycerol), 0.1% 브로모페놀 블루(bromophenol blue), 50 mM 디티오트레이톨(dithiothreitol)]를 이용하여 변성되고, SDS-PAGE에 의해서 분석되었다. 상기 분리된 단백질은 Immobilon-P 멤브레인(Millipore, Bedford, MA)으로 전기블랏팅(electroblotting)되었으며, FAK Tyr-397(Biosource, Camarillo, CA), FAK(Upstate Biotechnology Inc., Lake Placid, NY)에 대한 1차 항체로 프로브(probe)하였다. 그리고 모든 블랏은 HRP-결합된 2차 항체(Cell Signaling)를 이용하여 검출되었다. 신호는 ECL에 의해서 검출하였다(iNtRON Biotechnology, Korea).
그 결과, 도 6의 C에 나타난 바와 같이, Tyr-397 위치에서의 FAK 인산화 수준은 라미닌, rLG3 및 Ln-2LG3-P2로 코팅된 플레이트에서 15분 동안 배양된 PC12 세포에서 최고조로 높았으나, 라미닌, rLG3 및 Ln-2LG3-P2로 코팅된 플레이트에서 30분 또는 60분 동안 배양된 세포에서는 감소하였다. 전체적으로 이러한 결과는 α3β1 인테그린과 라미닌, LG3 도메인 펩티드 및 Ln-2LG3-P2 펩티드와의 결합이 스트레스 섬유 및 국소 부착 형성에 중요하다는 것을 의미한다. Ln-2LG3-P2 펩티드는 α3β1 인테그린과 상호 작용과, 인테그린이 매개된 FAK의 Tyr-397 위치의 인산화 자극에 충분하다는 것을 알 수 있다(도 6의 C).
< 실험예 9> Ln -2 LG3 - P2 펩티드와 α3β1 인테그린의 상호작용에 의한 PKC δ의 인 테그린 β 1으로의 이동 및 인산화 측정
<9-1> PKC 활성과 Ln2 - LG3 - P2 매개된 세포 부착과의 연관성 확인
세포 퍼짐 및 국소 부착 형성이 PKC(protein kinase C) 활성에 의해서 촉진된다는 것은 잘 알려져 있다(Lewis, J. M., et al., J. Cell Biol ., 1996; Ron, D., et al., FASEB J., 1999; Huang, X., et al., J. Cell Sci ., 1998). 이에, 본 발명자들은 PKC가 라미닌, rLG3 및 Ln2-LG3-P2 매개된 세포 부착에 관련되는지의 여부를 조사하였다.
PC12 세포에 0.05 uM, 0.1 uM 및 0.5 uM 농도의 칼포스틴 C(calphostin)을 37℃에서 15분 동안 전처리한 후, rLG3 또는 Ln2-LG3-P2 펩티드를 이용하여 1시간 동안 코팅된 플레이트에 배양하였다.
그 결과, 도 7의 A에 나타나 바와 같이, PKC 억제제인 칼포스틴 C(calphostin)을 전처리한 PC12 세포에서 라미닌, rLG3 및 Ln2-LG3-P2에 대한 PC12 세포의 부착 활성은 현저하게 처리농도 의존적으로 억제되었으며, 이는 PKC가 인테그린 매개된 PC12 세포의 부착에 필요하다는 것을 가리킨다(도 7의 A). 도 7의 A에 나타난 그래프는 칼포스틴 C를 처리하지 않은 세포에 대한 퍼센트로 나타냈으며, 평균 ± S.D. 값이며, 3회 반복한 결과이다.
더욱이, 칼포스틴 C(calphostin C)는 상기 처리된 농도 및 처리 동안 세포 성장에 영향을 미치지 않았으며, 이는 라미닌, rLG3 및 Ln2-LG3-P2 펩티드에 대한 세포 부착 억제는 세포 독성에 의해서 유발되지 않는다는 것을 의미한다(데이타 보이지 않음).
<9-2> 세포 부착시 PKC 아이소폼(isoform)의 세포내 분배 확인
0.2% 소 태아 혈청을 이용한 마우스 스위스 3T3 섬유아세포(Swiss 3T3 fibroblasts)의 자극은 국소 부착을 하는 PKCα의 재분배를 유도하기 때문에(Barry, S. T., et al.,J. Cell Sci ., 1994), 본 발명자들은 라미닌 코팅된 디쉬에서 배양된 PC12 세포에서 PKC의 아이소폼(isoform)의 세포내 분배(subcellular distribution)를 면역 염색방법을 이용하여 측정하였다.
PC12 세포를 라미닌으로 코팅된 유리 슬라이드 위에서 혈청이 포함되지 않은 배지를 이용하여 30분 동안 배양하였다. 그 후, 상기 세포를 항 PKCα 및 δ 항체와 로다민-팔로이딘(rhodamin-phalloidn) 항체를 이용하여 염색하였다.
그 결과, PKCα 및 δ는 상기 세포의 말단 주변 부위에 F-actin과 함께 존재하는 것을 관찰할 수 있었다(도 7의 B). 도 7의 B에 나타난 화살표는 스트레스 섬유의 말단을 나타내며, 바(bar)는 20 ㎛이다.
이러한 두 개의 PKC 아이소폼은 인테그린 매개된 세포 부착 및 퍼짐을 잘 조절할 수 있는 적합한 위치인, 액틴 스트레스 섬유의 말단에서 발견되었다.
<9-3> 세포 부착시 PKC α 및 δ가 인테그린 β 1으로 이동 확인
PKCα 및 δ가 인테그린 β1으로 이동 여부를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 항-His6-태그 항체, 항-인테그린 β1 항체 또는 PKCδ 항체를 이용하여 면역침전에 의해서 PKCα 및 δ가 라미닌, rLG3 및 Ln2-LG3-P2 펩티드가 코팅된 디쉬에서 배양되고 있는 PC12 세포에서 관련된 복합체로서 존재하는지를 검사하였다.
구체적으로 면역침전법을 수행하기 위하여, PC12 세포는 0.1% FBS가 첨가된 RPMI 1640 배지를 이용하여 12시간 동안 굶겼다. 세포는 0.1% BSA를 함유하는 혈청이 제거된 배지를 이용하여 세포 부착을 떼어내고, 현탁시켰다. PC12 세포는 100mm 디쉬당 4×106 세포의 비율로 라미닌(5 ㎍/㎖), rLG3(25 ㎍/㎖), 또는 Ln2-LG3-P2(25 ㎍/well) 코팅된 디쉬에서 배양하였으며, 37℃에서 30분 동안 부착되도록 두었다. 배양 후, 상기 세포는 차가운 PBS를 이용하여 세척되었으며, 프로테아즈(protease) 억제제 칵테일을 포함하는 RIPA 버퍼를 이용하여 용해시켰다. 상기 용해물은 원심분리시켰으며, 상층액은 비특이적 결합을 제거하기 위하여, 4℃에서 1시간 동안 50 ㎕의 고정된 단백질 G 비드(immobilized protein G bead)(Upstate Biotechnology Inc.)로 전배양시켰다. 상기 상층액은 항-His6(Roche, Mannheim, Germany), 항-인테그린 β1(Santa Cruz Biotechnology), 또는 항-PKCα(Santa Cruz Biotechnology) 항체로 4℃에서 2시간 동안 배양시켰다. 상기 면역복합체(immunocomplexes)는 고정된 단백질 G 비드(immobilized protein G bead)를 이용하여 4℃에서 12시간 동안 침전시켰다. 원심분리한 후, 상기 면역 복합체를 갖고 있는 비드를 RIPA 버퍼를 이용하여 4회 세척하였다. 면역침전물은 SDS 샘플 버퍼에서 현탁되고, 5분 동안 끓인 뒤, 웨스턴 블랏(western blot)에 의해서 분석하였다.
그 결과, 도 7의 C에 나타난 바와 같이, 항-His6 면역침전물에서는 PKCα, PKCδ 및 FAK는 rLG3(His-태그 융합 단백질) 코팅 디쉬에서 배양된 세포에서 관찰되었다(도 7의 C).
유사하게, 인테그린 β1 면역침전물에서는 PKCα, PKCδ 및 FAK가 라미닌, rLG3 및 Ln2-LG3-P2 코팅된 디쉬에서 배양된 세포에서 관찰되었다(도 7의 D).
<9-4> 인테그린 β1과 PKC α 및 PKC δ의 공존( colocalization ) 확인
PC12 세포를 라미닌, rLG3 또는 Ln2-LG3-P2 펩티드를 이용하여 코팅된 유리 슬라이드 챔버에 30분 동안 배양한 후, 항-인테그린 β1 항체 및 항-PKCδ 항체를 이용하여 면역염색을 수행하였다.
면역형광 분석을 통하여 관찰한 결과, PKCδ가 인테그린 β1과 함께 존재하는 것을 관찰할 수 있었다(도 7의 E).
또한, 라미닌, rLG3 또는 Ln2-LG3-P2 펩티드로 코팅된 유리 슬라이드 챔버에 PC12 세포를 30분 동안 배양한 후, 항-인테그린 β1 항체 및 항-PKCα 항체를 이용하여 면역 염색한 결과, PKCα는 인테그린 β1과 함께 존재하는 것을 관찰할 수 있었다(도 13).
<9-5> 세포 부착시 PKC δ의 타이로신 인산화 확인
Cos7 원숭이 섬유아세포(Cos7 monkey fibroblast)의 피프로넥틴(fibronectin)으로의 부착은 세포막과 연관된 PKCα의 인산화를 촉진한다는 것이 알려진 바 있다(Miranti, C. K., et al., J. Biol . Chem, 1999). 이에, 본 발명자들은 PKCδ의 타이로신 인산화가 PC12 세포에서 라미닌, rLG3 및 Ln2-LG3-P2 펩티드에 영향을 미칠 것인지 확인하고자 하였다.
라미닌, rLG3 또는 Ln2-LG3-P2 펩티드로 코팅된 디쉬에서 30분 동안 배양한 후, PKCδ와 포스포타이로신(phosphotyrosine)과의 상호결합을 면역침전 및 웨스턴 블랏을 이용하여 확인하였다.
그 결과, 도 7의 F에 나타난 바와 같이, 라미닌, rLG3 및 Ln2-LG3-P2 펩티드에 대한 PC12 세포의 세포 부착은 PKCδ의 타이로신 인산화를 증가시키는 것이 관찰되었다(도 7의 F).
이러한 결과를 종합하여 보면, 상기 결과들은 α3β1 인테그린과 라미닌, rLG3 및 Ln2-LG3-P2 펩티드 사이의 수용체-리간드 상호작용이 PKCδ를 인테그린 β1이 있는 복합체로 이동하게 하며, PKCδ의 인산화를 유도한다는 것을 확인할 수 있었다.
< 실험예 10> Ln2 - LG3 - P2 펩티드의 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 스트레스 섬유 형성 및 FAK 인산화( Tyr -397)에 있어서, PKC α 및 PKC δ의 기능
<10-1> PKC 억제제의 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 스트레스 섬유 형성에 미치는 영향 확인
본 발명자들은 특정한 약학적 억제제를 이용하여 PKCα와 PKCδ의 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 스트레스 섬유 형성에 있어서 기능적 역할을 확인하였다. PKCα/β 억제제인 Go6976(IC50 = 2.3 nM) 또는 PKCδ 억제제인 로틀레린(rottlerin)(IC50 = 3-6 uM)을 사용하였다.
PC12 세포에서 Go6976 또는 로틀레린(rottlerin)을 37℃에서 15분 동안 전처리 한 후, 라미닌, rLG3 또는 Ln2-LG3-P2 펩티드가 코팅된 플레이트에서 배양한 후, 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 스트레스 섬유 형성을 관찰하였다. 세포 부착을 확인하기 위하여, 전처리된 PC12 세포는 1시간 동안 배양되었으며, 퍼짐 및 스트레스 섬유 형성을 관찰하기 위해서 전처리된 세포를 코팅된 플레이트에서 3시간 동안 배양하였다. 아울러, 세포 이동을 관찰하기 위해서, 상기 전처리된 세포를 코팅된 플레이트에서 24시간 동안 배양하였다.
그 결과, 도 8의 A 내지 D에 나타난 바와 같이, PKCδ 억제제인 로틀레린(rottlerin)를 처리한 경우에는 PC12 세포의 라미닌, rLG3 및 Ln2-LG3-P2 펩티드에 대한 부착, 퍼짐, 이동 및 세포 섬유 형성이 현저하게 손상되는 것을 관찰할 수 있었으나, Go6976을 처리한 경우에는 아무런 영향을 미치지 않음을 관찰할 수 있었다(도 8의 A 내지 D). 또한, Go6976과 로틀레린(rottlerin)을 상기 PC12 세포에 처리한 농도 및 처리하는 동안 관찰하였을 때, 세포 생존능력에 아무런 영향을 미치지 않음을 확인할 수 있었다.
이러한 결과는 명백하게, PKCδ 신호전달이 라미닌, rLG3 및 Ln2-LG3-P2 펩티드가 매개된 PC12 세포의 부착, 퍼짐, 이동 및 세포 섬유 형성에 관여된다는 것을 나타낸다.
<10-2> Rho - 카이네이즈 ( kinase ) 억제제의 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 스트레스 섬유 형성에 미치는 영향 확인
스트레스 섬유 형성은 섬유아세포의 Rho-카이네이즈(kinase)의 활성에 의존한다는 것이 알려져 있다(Katoh, K., et al., Genes Cells , 2007). 이에, 본 발명자들은 Rho-카이네이즈(kinase) 억제제인 Y27632의 존재하에서 스트레스 섬유 형성을 조사하였다.
PC12 세포를 라미닌, rLG3, 또는 Ln2-LG3-P2를 이용하여 코팅된 유리 슬라이드 챔버(glass slide chamber)에 1시간 동안 배양한 후, 상기 세포에 10 uM의 Rho-카이네이즈(kinase) 억제제인 Y27632를 혈청이 포함되지 않은 배지에 혼합하여 2시간 동안 처리하였다. 그 후, 로다민-팔로이딘(rhodamine-phalloidin) 항체를 이용하여 면역염색하였다.
그 결과, 도 14의 A에 나타난 바와 같이, 10 uM Y27632을 처리하였을 때, PC12 세포의 라미닌, rLG3 및 Ln2-LG3-P2 펩티드에 대한 스트레스 섬유가 완전히 분해되는 것을 관찰할 수 있었다(도 14의 A).
또한, 본 발명자들이 PKCδ 억제제인 로틀레린(rottlerin)이 라미닌, rLG3 및 Ln2-LG3-P2 펩티드에 대한 세포의 스트레스 섬유 형성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, PC12 세포에 5 uM의 로틀레린을 처리한 후, 스트레스 섬유 형성을 관찰하였다.
PC12 세포를 라미닌, rLG3, 또는 Ln2-LG3-P2를 이용하여 코팅된 유리 슬라이드 챔버(glass slide chamber)에 2.5시간 동안 배양한 후, 상기 세포에 5 uM의 로틀레린(rottlerin)을 혈청이 포함되지 않은 배지에 혼합하여 30분 동안 처리하였다. 그 후, 로다민-팔로이딘(rhodamine-phalloidin) 항체를 이용하여 면역염색하였다.
그 결과, 도 14의 B에 나타난 바와 같이, 로틀레린은 PC12 세포의 라미닌, rLG3 및 Ln2-LG2-P2에 대하여 이미 형성되어 있는 스트레스 섬유 형성을 간섭하지 못한다는 것을 확인할 수 있었다(도 14의 B). 도 14의 A 내지 B에 나타난 그래프는 액틴 스트레스 섬유(actin stress fiber)를 갖는 세포의 퍼센트를 나타내며, 결과는 평균 ± S.D.(n=3)으로 나타냈다. 또한, 도 14의 A 내지 B의 그림에 나타난 바(bar)는 20 ㎛이다.
또한, 이러한 결과는 이전에 보고된 로틀레린(rottlerin)(1 - 3 uM)를 처리하였을 때, 피브로넥틴(fibronectin)에 이미 퍼짐(spreading)이된 섬유아세포의 스트레스 섬유 형성을 손상시키지 않는다는 결과와 일치하였다(Dovas, A., et al., J. Cell Sci , 2006)
<10-3> PKC 억제제의 FAK 인산화( Tyr -397)에 미치는 영향 확인
근육 세포의 피브로넥틴(fibronectin) 위에서의 퍼짐 및 FAK 인산화는 PKC 억제제에 의해서 억제된다는 것이 보고된바 있다(Disatnik, M. H., et al., J. Cell Sci ., 2002). 이에, 본 발명자들은 FAK 타이로신 인산화에 있어서, PKCα/β 억제제인 Go6976과 PKCδ 억제제인 로틀레린(rottlerin)의 영향을 확인하였다.
PC12 세포에 5 nM의 Go6976과 5 uM의 로틀레린(rottlerin)을 각각 37℃에서 15분 동안 처리한 후, 라미닌, rLG3 및 Ln2-LG3-P2 펩티드가 코팅된 플레이트에서 혈청이 포함되지 않은 배지를 이용하여 15분 동안 배양하였다.
그 결과, 도 8의 B에 나타나 바와 같이, 로틀레린(rottlerin)의 처리는 라미닌, rLG3 및 Ln2-LG3-P2 펩티드가 코팅된 플레이트에 배양된 PC12 세포에서 FAK의 Tyr-396 인산화의 수준을 감소시켰으나, Go6976 처리는 FAK의 Tyr-396 인산화의 수준에 아무런 영향을 미치지 않았다(도 8의 E).
이러한 결과를 종합하여 보면, PKCδ는 Rho-카이네이즈 의존적인 신호전달을 통해서, 라미닌, rLG3 및 Ln2-LG3-P2 펩티드 위에 배양된 PC12 세포의 초기 부착 및 퍼짐에 있어서 중요하며, PKCδ 활성은 라미닌, rLG3 및 Ln2-LG3-P2 펩티드 위에서 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 Tyr-397 위치의 인산화에 필요하다는 것을 알 수 있다.
<10-4> PLC 억제제의 세포 부착 및 퍼짐 에 미치는 영향 확인
PKC 활성은 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 국소 부착 어셈블리(focal adhesion assembly)와 같은 인테그린 매개된 다수의 과정의 신호전달에 관련된다는 것이 알려져있다(Lewis, J. M., et al., J. Cell Biol ., 1996; Ron, D., et al., FASEB J., 1999; Huang, X., et al., J. Cell Sci ., 1998). 또한, 상기 결과를 통해서 본 발명자들은 PKCδ 활성이 PC12 세포에서 LG3 및 Ln2-LG3-P2 매개된 세포 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진에 필요하다는 것을 확인하였다.
이러한 PKC 활성은 PLC(phospholipase C) 활성에 의해서 매개되는 세포 내 디아실글리세롤(diacylglycerol)의 증가로부터 유래되며, PLC 활성은 인테그린 β1과의 라이게이션(ligation)에 의해서 활성화된다. PLC 억제제인 U73122 처리는 α1β1 인테그린 매개된 PC12 세포의 부착을 억제한다는 것이 보고되었다(Vossmeyer, D., et al., J. Biol . Chem , 2002). 이에, 본 발명자들은 PLC 억제제인 U73122의 PC12 세포의 세포 부착 및 퍼짐에 미치는 영향을 확인하였다.
PC12 세포를 PLC 억제제인 U73122 0.5 uM 또는 1.0 uM의 농도로 미리 15분 동안 37℃ 처리하였다. 그 후, 라미닌(5 ㎍/㎖), rLG3(25 ㎍/㎖) 및 Ln2-LG3-P2(62.5 ㎍/㎖)으로 1시간 또는 3시간 동안 코팅한 플레이트에 혈청이 포함되지 않은 배지를 이용하여 배양하였다.
그 결과, 도 15에 나타난 바와 같이, PLC 억제제인 U73122 처리는 rLG3 및 Ln2-LG3-P2에 대한 세포 부착 및 퍼짐을 감소시키는 것을 관찰할 수 있었으며, 이는 PKC의 업스트림(upstream) 조절자인 PLC의 활성이 인테그린 매개된 세포 부착 및 퍼짐의 조절에 중요할 수 있음을 의미한다(도 15).
서열목록 전자파일 첨부

Claims (15)

  1. 서열번호 2로 구성되는 인간 라미닌(laminin)-2 α2 사슬의 LG(large globular) 3 도메인 폴리펩티드를 세포에 처리하는 단계를 포함하는 세포 부착, 퍼짐, 이동 또는 신경돌기 성장을 촉진시키는 방법.
  2. 인간 라미닌(laminin)-2 α2 사슬의 LG(large globular) 3 도메인 서열 내 활성 펩티드로서, 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 세포에 처리하는 단계를 포함하는 세포 부착, 퍼짐, 이동 또는 신경돌기 성장을 촉진시키는 방법.
  3. 삭제
  4. 인간 라미닌(laminin)-2 α2 사슬의 LG(large globular) 3 도메인 서열 내 활성 펩티드로서, 서열번호 35 내지 서열번호 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 세포에 처리하는 단계를 포함하는 세포 부착, 퍼짐, 이동 또는 신경돌기 성장을 촉진시키는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 신경 재생용 약학적 조성물은 서열번호 37, 서열번호 49 또는 서열번호 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 부착, 퍼짐, 이동 또는 신경돌기 성장을 촉진시키는 방법.
  6. 제 1항, 제 2항 또는 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드 또는 펩티드는 α3β1 인테그린(integrin)과 결합하는 것을 특징으로 하는 세포 부착, 퍼짐, 이동 또는 신경돌기 성장을 촉진시키는 방법.
  7. 제 1항, 제 2항 또는 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드 또는 펩티드는 α3β1 인테그린(integrin)과 결합을 통한 프로테인 키나아제 δ(Protein kinase δ, PKC-δ)의 세포 내 위치를 조절하는 것을 특징으로 하는 세포 부착, 퍼짐, 이동 또는 신경돌기 성장을 촉진시키는 방법.
  8. 제 1항, 제 2항 또는 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드 또는 펩티드는 PKC-δ와 FAK(focal adhesion kinase)의 티로신 인산화(tyrosine phosphorylation)를 유도하는 것을 특징으로 하는 세포 부착, 퍼짐, 이동 또는 신경돌기 성장을 촉진시키는 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 FAK(focal adhesion kinase, FAK)의 티로신 인산화(tyrosine phosphorylation)는 FAK의 397번째 티로신의 인산화를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 부착, 퍼짐, 이동 또는 신경돌기 성장을 촉진시키는 방법.
  10. 제 1항, 제 2항 또는 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경 세포는 PC12, CV-1, NIH/3T3, 슈반세포(Schwann cell), 사람 정상 피부각화세포(normal human epidermal keratinocytes), 사람 정상 구강각화세포(normal human oral keratinocytes) 및 사람 정상 피부섬유모세포(normal human dermal fibroblasts)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 부착, 퍼짐, 이동 또는 신경돌기 성장을 촉진시키는 방법.
  11. 제 1항의 폴리펩티드, 또는 제 2항 또는 제 4항의 펩티드를 포함하는 신경세포 부착, 퍼짐, 이동 및 신경돌기 성장 촉진용 용기.
  12. 1) 제 1항의 폴리펩티드, 또는 제 2항 또는 제 4항의 펩티드를 고체 지지대에 고정하는 단계; 및
    2) 상기 고체 지지대에 신경세포의 부착, 퍼짐, 이동 또는 신경돌기 성장시키는 단계를 포함하는 신경세포의 부착, 퍼짐, 이동 또는 신경돌기 성장의 촉진방법.
  13. 제 1항의 폴리펩티드, 또는 제 2항 또는 제 4항의 펩티드를 포함하는 화상 또는 창상 치료제.
  14. 제 1항의 폴리펩티드, 또는 제 2항 또는 제 4항의 펩티드를 포함하는 인공 신경도관 또는 그의 지지체(scaffolds).
  15. 제 1항의 폴리펩티드, 또는 제 2항 또는 제 4항의 펩티드를 포함하는 조직공학용 지지체.
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