KR20060053140A - 세포 부착 및 퍼짐을 촉진하는 펩티드, 그의 단편 및 그의유도체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포 부착(cell adhesion) 및 퍼짐(spreading)을 촉진하는 펩티드, 그의 단편 및 그의 유도체에 관한 것으로, 구체적으로 인테그린 α3β1 결합과 세포 부착 및 퍼짐을 매개하는 인간 라미닌-5 α3 사슬의 LG3 도메인의 확인 및 상기 LG3 도메인 내 인테그린-α3β1-의존성 세포 부착 및 퍼짐을 촉진하는 활성 모티프로 작용하는 서열번호 1 또는 서열번호 13으로 기재되는 펩티드, 그의 단편 및 그의 유도체에 관한 것이다. 본 발명의 펩티드, 그의 단편 및 그의 유도체는 라미닌을 포함하는 다양한 세포외 기질 단백질(extracellular matrix protein)에 의해 매개되는 세포 부착 활성 연구, 화상 치료, 창상 치료, 조직 재생 및 암전이 억제 등에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

세포 부착, 퍼짐, 펩티드, 화상 치료, 창상 치료

Description

세포 부착 및 퍼짐을 촉진하는 펩티드, 그의 단편 및 그의 유도체{PEPTIDES, FRAGMENTS AND DERIVATIVES THEREOF PROMOTING CELL ADHESION AND SPREADING}

도 1은 재조합 인간 라미닌-5 α3 LG 도메인들과 이들 중 LG 도메인 유래 합성 펩티드에 관한 것으로서, 도 1의 A는 라미닌-5 α3 사슬 도메인 및 이들의 재조합 단백질의 모식도를 나타낸 것이고, 도 1의 B는 His6-표지 융합 단백질로서 발현된 라미닌-5 α3 사슬 도메인의 재조합 LG 단백질들(rLG1 내지 rLG5)의 모식도를 나타낸 것이고, 도 1의 C는 SDS-PAGE로 인간 라미닌-5 α3 사슬 도메인의 재조합 LG 단백질들을 정제한 결과이다.

도 2는 재조합 LG 단백질들의 세포 활성 결과로서, 도 2의 A는 인간 라미닌-5 α3 사슬 도메인의 재조합 LG 단백질들의 세포 부착 활성을 인간 태반 라미닌(human placental laminin, LN)과 비교한 것이고, 도 2의 B는 상기 재조합 LG 단백질들의 농도가 세포 부착 활성에 미치는 영향을 조사한 것이고, 도 2의 C는 HOK-16B 세포에서 상기 재조합 LG 단백질들의 세포 부착 활성 및 부착된 세포의 수를 측정한 것이고, 도 2의 D는 HOK-16B 세포에서 상기 재조합 LG 단백질들의 세포 퍼짐 활성을 측정한 것이다.

도 3은 인간, 랫트(rat), 마우스(mouse) 및 개의 라미닌 α3 사슬 LG3 도메 인 일부의 아미노산 서열을 비교하고 합성 펩티드들의 아미노산 서열을 표시한 것이다.

도 4는 HOK-16B 세포에서 상기 합성 펩티드들의 세포 활성 결과로서, 도 4의 A는 인간 라미닌-5 α3 사슬 LG3 도메인 유래 합성 펩티드들(P1 내지 P5)의 농도 변화에 따른 세포 부착 활성을 측정한 것이고, 도 4의 B는 HOK-16B 세포에서 상기 합성 펩티드들의 세포 부착 활성 및 부착된 세포들의 수를 측정한 것이고, 도 4의 C는 HOK-16B 세포에서 상기 합성 펩티드들의 세포 퍼짐 활성을 측정한 것이고, 도 4의 D는 HOK-16B 세포에 상기 합성 펩티드들의 전처리가 인간 라미닌-5 α3 사슬의 재조합 LG3 단백질에 대한 HOK-16B 세포 부착 억제에 미치는 영향을 조사한 것이다.

도 5는 본 발명의 재조합 LG3 단백질과 인테그린과의 관계를 나타내는 것으로서, 도 5의 A는 HOK-16B 세포에 대한 인테그린 소단위들의 유세포 분석 결과를 나타낸 것이고, 도 5의 B는 인간 라미닌-5 α3 사슬의 재조합 LG3 단백질에 의한 세포 부착 활성이 인테그린 α3β1에 대한 항체들에 의해 억제됨을 나타낸 것이고, 도 5의 C는 인간 라미닌-5 α3 사슬 LG3 도메인 유래 합성 펩티드 P4에 의한 세포 부착 활성이 인테그린 α3β1에 대한 항체들에 의해 억제됨을 나타낸 것이다.

도 6은 본 발명의 합성 펩티드에 관한 것으로서, 도 6의 A는 인간 라미닌-5 α3 사슬 LG3 도메인 유래 합성 펩티드 P4의 C-말단 절단 펩티드들(C-terminal truncated peptides, P4 D-I 내지 P4 D-V) 및 N-말단 절단 펩티드들(N-terminal truncated peptides, P4 D-N1 내지 P4 D-N6)의 아미노산 서열을 나타낸 것이고, 도 6의 B는 대조군인 BSA(bovine serum albumin)와 상기 C-말단 절단 펩티드들(P4 D-I, P4 D-Ⅲ 및 P4 D-V)의 세포 부착 활성을 측정한 것이고, 도 6의 C는 대조군인 BSA와 상기 C-말단 절단 펩티드들(P4 D-I, P4 D-Ⅲ 및 P4 D-V) 및 N-말단 절단 펩티드들(P4 D-N2, P4 D-N4 및 P4 D-N6)에 부착된 세포의 수를 측정한 것이고, 도 6의 D는 대조군인 BSA와 상기 C-말단 절단 펩티드들(P4 D-I, P4 D-Ⅲ 및 P4 D-V) 및 N-말단 절단 펩티드들(P4 D-N2, P4 D-N4 및 P4 D-N6)의 세포 퍼짐 활성을 측정한 것이다.

도 7은 상기 합성 펩티드 중 펩티드 P4의 Ala-치환된 펩티드들(Ala-substituted peptides, P4-S1 내지 P4 S-3)에 관한 것으로서, 도 7의 A는 펩티드 P4의 Ala-치환된 펩티드들의 아미노산 서열을 나타낸 것이고, 도 7의 B는 상기 Ala-치환된 펩티드들의 세포 부착 활성을 측정한 것이다.

도 8은 본 발명의 재조합 LG3 단백질과 티로신 인산화와의 관계를 밝히는 것으로서, 도 8의 A는 라미닌이 FAK의 티로신-397 인산화에 미치는 영향을 면역블롯 분석으로 조사한 것이고, 도 8의 B는 인간 라미닌-5 α3 재조합 LG3 단백질이 FAK의 다양한 위치의 티로신 인산화에 미치는 영향을 면역블롯 분석으로 조사한 것이고, 도 8의 C는 인간 라미닌-5 α3 LG3 도메인 유래 합성 펩티드들이 FAK의 다양한 위치의 티로신 인산화에 미치는 영향을 면역블롯 분석으로 조사한 것이고, 도 8의 D는 펩티드 P4의 Ala-치환된 펩티드들(P4-S1 내지 P4-S3)이 FAK의 -397, -577 위치의 티로신 인산화에 미치는 영향을 면역블롯 분석으로 조사한 것이다.

도 9는 합성 펩티드 P4에 대한 피부 각화세포(NKEK) 및 피부 섬유모세포 (NHEF)의 세포 부착 활성도를 나타내는 결과로서, 도 9의 A는 트립판블루 시약을 이용하여 상기 각 세포들을 염색한 결과이고, 도 9의 B는 피부 각화세포(NKEK)의 세포 증식에 따른 세포수 증가를 나타낸 것이고, 도 9의 C는 피부 섬유모세포(NHEF)의 세포 증식에 따른 세포수 증가를 나타낸 것이다.

도 10은 각 세포에서 펩티드 P4에 의한 세포 부착 활성도, 부착된 세포들의 수 및 퍼진(spread) 세포들의 비율을 여러 대조군과 비교하여 나타낸 결과로서, 도 10의 A는 펩티드 P4에 의한 사람 정상 피부 각화세포의 세포 부착 활성도, 부착된 세포들의 수 및 퍼진(spread) 세포들의 비율을 여러 대조군과 비교하여 나타낸 결과이며, 도 10의 B는 피부 섬유모세포의 세포 부착 활성도, 부착된 세포들의 수 및 퍼진(spread) 세포들의 비율을 여러 대조군과 비교하여 나타낸 결과이다.

PS: 폴리스티렌;

Beschitin W only: 베스키틴 부직포;

BSA: 베스키틴 부직포에 소혈청 알부민 처리;

Control peptide: 베스키틴 W 부직포에 비기능성 펩티드 P1 처리;

P4: 베스키틴 W 부직포에 기능성 펩티드 P4 처리,

도 11은 펩티드 P4에 의한 사람 정상 피부 각화세포 및 피부 섬유모세포의 세포 부착 활성도, 부착된 세포들의 수 및 퍼진 세포들의 비율을 동물실험을 통하여 현미경으로 확인한 결과로서, 도 11의 A는 100배율로 관찰한 결과이며, 도 11의 B는 200배율로 관찰한 결과이다.

본 발명은 인간 라미닌-5 α3 사슬의 LG3 도메인이 인테그린 α3β1 결합과 세포 부착(cell adhesion) 및 퍼짐(spreading)을 매개함을 확인하고, 상기 LG3 도메인 내 인테그린-α3β1-의존성 세포 부착 및 퍼짐을 촉진하는 활성 모티프로 작용하는 서열번호 1 또는 서열번호 13으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 펩티드, 그의 단편 및 그의 유도체로 구성되는 군으로부터 선택되는 세포 부착 및 퍼짐 촉진 펩티드에 관한 것이다.

라미닌은 기저막에 주로 존재하는 세포외기질단백질의 일종으로 세포 표면의 특정 인테그린 또는 다른 수용체와의 상호작용을 통해 부착, 이동성, 성장, 분화, 상처 치유, 및 종양 침투와 같은 다양한 세포성 기능을 조절한다(Timpl, R., Curr . Opin. Cell Biol. 8, 618-624, 1996; Howe, A., et al, Curr. Opin. Cell Biol. 10, 220-231, 1998; Colognato, H., 및 Yurchenco, P. D., Dev. Dyn. 218, 213-2341, 2000). 라미닌은 α, β 및 γ 사슬의 세 개의 다른 소단위으로 구성되어 있는데, 이들은 이황화 결합에 의해 서로 연결되는 교차-모양 구조(cross-shaped structure)를 형성한다(Ekblom, M., et al., Ann. N. Y. Acad . Sci . 857, 194-211, 1998). 지금까지 5α, 3β 및 3γ 사슬이 밝혀졌는데, 이들 소단위들의 다양한 조 합에 의해 적어도 15개의 동형체(라미닌 1 내지 15)들이 형성됨이 보고되었다(Colognato, H., 및 Yurchenco, P. D., Dev . Dyn . 218, 213-2341, 2000; Burgeson, R. E., et al., Matrix Biol. 14, 209-211, 1994; Miner, J. H., et al., J. Cell Biol. 137, 685-7015, 1997). 이들 라미닌 동형체들 중에서, α3, β3 및 γ2 사슬로 구성된 라미닌-5는 독특한 구조와 생물학적 활성을 갖는다. 라미닌-5는 원래 각화세포-유래 기질 단백질(keratinocyte-derived matrix protein)로서 동정되었는데(Carter, W. G., et al., Cell 65, 599-610, 1991), 다른 라미닌 동형체들과는 달리 세 개 소단위의 N-말단 부위내에서 발견되는 몇몇 도메인들이 결실되어 있다 (Aumailley, M., 및 Rousselle, P., Matrix Biol . 18, 19-28, 1999). 라미닌-5 전구체(460 kDa)는 각화세포 내에서 프로세싱(processing)되는데, 상기 전구체는 분비되면서 α3 사슬(200 kDa) 및 γ2 사슬(155 kDa)이 분해되어 각각 165 kDa 및 105 kDa의 단백질로 전환된다(Marinkovich, M. P., et al., J. Biol . Chem . 267, 17900-17906, 1992; Rousselle, P., et al., J. Cell Biol. 114, 567-5769, 1991).

라미닌-5는 결합조직(connective tissue)에 대한 상피세포의 안정적인 부착을 조절하고(Marinkovich, M. P., et al., J. Biol . Chem . 267, 17900-17906, 1992; Rousselle, P., et al., J. Cell Biol. 114, 567-5769, 1991; Niessen, C. M., et al., Exp. Cell. Res. 211, 360-367, 1994), 인테그린 α3β1 및 α6β4와 같은 세포 표면 수용체들과 상호작용하여 세포 행동에 영향을 미친다(Carter, W. G., et al., Cell 65, 599-610, 1991; Rousselle, P., et al., J. Cell Biol. 114, 567-576, 1991; Niessen, C. M., et al., Exp. Cell. Res. 211, 360-367, 1994; Rousselle, P., 및 Aumailley, M., J. Cell Biol. 125, 205-214, 1994). 정상적인 인간 각화세포에서 발현된 인테그린 중에서, 인테그린 α3β1은 액틴-함유 스트레스 섬유(actin-containing stress fibers)와 관련되어 있는 병소 부착(focal adhesion)의 형성에 관여하고 각화세포의 이동성을 매개한다(DiPersio, C. M., et al., J. Cell Sci. 108, 2321-2336, 1995; Zhang, K., 및 Kramer, R. H., Exp. Cell. Res. 227, 309-322, 1996). 인테그린 α6β4는 상피세포의 반교소체 (hemidesmosome) 구조를 형성하고, 암종세포(carcinoma cell)의 침투뿐만 아니라 상피세포의 부착, 이동 및 상처 치유를 매개한다(Niessen, C. M., et al., Exp . Cell. Res. 211, 360-367, 1994; Mercurio, A. M., et al., Curr. Opin. Cell Biol. 13, 541-545, 2001). 라미닌-5 또는 인테그린 α6β4의 돌연변이는 상피/진피 연접(epidermal/dermo linkage)의 파열로 특정되는 전신 경계성 수포성 표피박리증(Herlitz-type junctional epidermolysis bullosa)을 야기한다(Aberdam, D., et al., Nat. Genet. 6, 299-304, 1994; Korge, B. P., 및 Krieg, T., J. Mol. Med. 74, 59-70, 1996).

라미닌-5 이외에, 라미닌 α3 사슬이 라미닌-6(α3β1γ1), 라미닌-7(α3β2γ1) 및 라미닌-13(α3β2γ3)에서 발견되지만, 라미닌 β3 및 γ2 사슬은 오직 라미닌-5에서만 발견된다. 라미닌 α3 사슬은 각각이 대략 200개의 아미노산 잔기로 이루어진 다섯 개의 구형 모듈 LG1 내지 LG5로 구성된 C-말단 구형 도메인을 포함한다(Talts, J. F., et al., FEBS Lett . 426, 71-76, 1998; Timple, R., et al., Matrix Biol. 19, 309-317, 2000). 다양한 라미닌 동형체를 이용한 유전자 지도 연구를 통해 라미닌 α 사슬들의 구형 도메인에 대한 인테그린-의존성 세포 부착 부위의 위치가 규명되었다(Baker, S. E., et al., J. Cell Sci . 109, 2509-2520, 1996; Hirosaki, T., et al., J. Biol. Chem. 275, 22495-22502, 2000). α3 사슬 내 C-말단 LG3 도메인은 라미닌-5의 독특한 활성에 필수적이다. 쥐(rat)에서 재조합 LG3(rLG3) 도메인 및 인간에서 LG 도메인들이 연속적으로 결실된 재조합 라미닌-5 단백질들은 인테그린 α3β1과의 상호작용에 의해 세포 부착 및 이동을 촉진하는데 기여한다(Hirosaki, T., et al., J. Biol . Chem . 275, 22495-22502, 2000; Shang, M., et al., J. Biol . Chem . 276, 33045-33053, 2000). 인간 라미닌 α3 사슬의 재조합 LG 단백질에 대한 연구를 통해 LG2 도메인이 인테그린 α3β1-결합 부위를 포함하고 있으며, LG4 및 LG5 도메인들은 헤파린 설페이트 프로테오글리칸(heparin sulfate proteoglycans)과 약하게 상호작용함이 밝혀졌다(Mizushima, H., et al., Cell Growth Differ. 8, 979-987, 1997). 또한, 라미닌 α3 사슬의 LG4-LG5 단편은 그 자체로는 활성을 나타내지 않지만, 성숙한 라미닌-5의 존재하에서는 세포 이동을 촉진시켰는데, 이는 이들 단편들이 세포 이동을 조절할 수 있음을 암시하는 것이다(Tsubota, Y., et al., Biochem . Biophys . Res. Commun . 278, 614-620, 2000). 그러나, 재조합 구형 도메인 단편들을 사용하여 인테그린-의존성 세포 부착에 직접적으로 관여하는 인간 라미닌 α3 사슬 LG 도메인을 규명한 보고는 아직까지 없었다.

한편, 라미닌의 일차적인 부착 부위는 라미닌 α 사슬의 C-말단 LG 도메인 지역 내에 위치하는 것으로 인식되고 있다. 라미닌 α 사슬의 다양한 LG 도메인들 은 세포 부착 및 이동을 매개하고, 헤파린(heparin), α-디스트로글리칸(α-dystroglycan), 신데칸(syndecans) 및 인테그린들에 결합하는 것으로 보인다 (Howe, A., et al., Curr. Opin. Cell Biol. 10, 220-231, 1998). 인간 라미닌-5 α3 사슬의 LG3 도메인이 라미닌-5에 의한 세포 부착 및 이동성의 강력한 촉진을 위해 필수적인 것으로 제시되었다고 하더라도(Hirosaki, T., et al., J. Biol . Chem. 275, 22495-22502, 2000), LG3 도메인 내 생물학적 기능들 및 인테그린 결합을 위한 활성부위 측면에서의 추가적인 보고는 없다.

이에, 본 발명자들은 인간 라미닌-5 α3 LG 도메인들의 기능을 규명하고 생물학적 활성에 있어서의 핵심 서열을 결정하기 위하여, 단량체의 수용성 융합 단백질 형태로 발현되는 재조합 인간 라미닌-5 α3 LG 도메인들과 이들 중 LG3 도메인 유래 합성 펩티드들을 제조하여 이들의 세포 부착 및 퍼짐 활성을 조사하였다. 그 결과, 본 발명자들은 인간 라미닌-5 α3 LG3 도메인이 인테그린 α3β1에 대한 리간드(ligand)로 작용하여 세포 부착 및 퍼짐 활성을 촉진시키고, 상기 LG3 도메인 내 서열번호 1로 기재되는 PPFLMLLKGSTR 모티프(1312-1323 잔기)가 인테그린 α3β1 결합의 활성 부위로서 세포 부착 및 퍼짐 활성에 중요하며, 베스키틴 W 부직포를 이용한 세포 부착능이 매우 우수하게 나타나 화상 치료, 창상 치료 및 조직 재생에 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 세포 부착 및 퍼짐과 인테그린 결합을 매개하는 인간 라미 닌-5 α3 사슬 내 활성 도메인을 규명하고 상기 도메인에서 인테그린에 특이적으로 결합하여 세포 부착 및 퍼짐 활성을 촉진시키는 필수적인 모티프로 작용하는 펩티드, 그의 단편 또는 그의 유도체를 포함하는 세포 부착 및 퍼짐 촉진 펩티드를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 세포 퍼짐 및 부착에 필수적인 모티프로 작용하는 서열번호 1 또는 세포 부착 및 퍼짐을 촉진하는 서열번호 13으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 펩티드, 그의 단편 및 그의 유도체로 구성되는 군으로부터 선택되는 세포 부착 및 퍼짐 촉진 펩티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 세포 부착 및 퍼짐 촉진 펩티드 서열을 포함하는 세포 부착 및 퍼짐 촉진 활성을 갖는 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 세포 부착 및 퍼짐 촉진 펩티드 또는 이의 단백질을 유효성분으로 함유하는 화상 치료, 창상 치료, 조직 재생 또는 암 전이 억제용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 세포 부착 및 퍼짐 촉진 펩티드 또는 이의 단백질을 유효성분으로 함유하는 화상 치료용 또는 창상 치료용 피복재를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 세포 부착 및 퍼짐 촉진 펩티드 또는 이의 단백질을 유효성분으로 함유하는 조직공학용 지지체를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 세포 퍼짐 및 부착에 필수적인 모티프로 작용하는 서열번호 1 또는 세포 부착 및 퍼짐을 촉진하는 서열번호 13으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 펩티드, 그의 단편 및 그의 유도체로 구성되는 군으로부터 선택되는 세포 부착 및 퍼짐 촉진 펩티드를 제공한다. 상기 유도체는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열에서 12번째 아르기닌(Arg) 잔기가 보존적으로 포함되는 것, 1번째 또는 2번째 프롤린(Pro) 잔기가 보존적으로 포함되는 것이 바람직하며, 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열에서 8번째 라이신(Lys)이 알라닌(Ala)으로 치환된 서열번호 15로 기재되는 P4-S1, 1번째 또는 2번째 프롤린(Pro) 잔기가 결실된 서열번호 14로 기재되는 P4-D-N1이 더욱 바람직하다. 더불어, 상기에서 인테그린 α3β1을 통하여 세포 부착 및 퍼짐을 촉진하는 것을 특징으로 하는 펩티드인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 세포 부착 및 퍼짐 촉진 펩티드 서열을 포함하는 세포 부착 및 퍼짐 촉진 활성을 갖는 단백질을 제공한다.

본 발명에서는 세포 부착 및 퍼짐과 인테그린 결합을 매개하는 인간 라미닌-5 α3 사슬 내 활성 도메인을 규명하기 위하여, 다섯 개의 독립적으로 발현되는 재조합 LG 단백질들(rLG1 내지 rLG5)을 제조하였다.

본 발명에 따라 제조된 재조합 LG 단백질들 중에서, rLG1은 서열번호 2의 인 간 라미닌 α3 사슬의 아미노산 서열에서 782-978 잔기를 포함하고, rLG2는 959-1148 잔기를, rLG3은 1128-1364 잔기를, rLG4는 1352-1555 잔기를, rLG5는 1522-1713 잔기를 포함한다. 또한, 상기 재조합 LG 단백질들은 정제를 용이하게 하기 위하여, 선별표지로 C-말단에 6개의 히스티딘 표지(histidine tag)가 결합된 융합 단백질 형태로 발현된다(도 1의 A 및 도 1의 B 참조).

각각의 LG 도메인을 코딩하는 염기서열 및 선별표지를 코딩하는 염기서열을 포함하는 cDNA 단편을 제조한 후, 상기 cDNA 단편이 삽입된 발현벡터를 제조하고, 이 발현벡터를 대장균에 형질전환시켜 얻은 형질전환체에서 재조합 단백질을 발현시킨 다음, 발현된 단백질들을 선별표지를 이용하여 rLG1 내지 rLG5를 정제하였다 (도 1의 C 참조). 상기 대장균 형질전환체로부터 분리·정제된 rLG1 내지 rLG5의 세포 부착 및 퍼짐 활성을 조사한 결과, 5개의 rLG 단백질들 중에서 서열번호 13의 아미노산 서열을 가지는 rLG3 만이 세포 부착 활성을 나타내었는데(도 2의 A 내지 도 2의 C 참조), rLG3에 의한 HOK-16B 세포의 부착은 25 ㎍/㎖ 코팅 농도에서 최대 부착 활성을 나타내었고 이는 농도-의존적 양상을 보였다. 또한, rLG3-코팅 플레이트에서 HOK-16B 세포들 중 47%가, 퍼짐되는 세포의 형태학적 특징인 필로포디아- 및 라멜리포디아-유사 팽창을 갖는 납작하고 다각형의 모양을 나타내었다(도 2의 D 참조). 이러한 결과들은 rLG3 단백질이 세포 부착 및 퍼짐을 촉진하여 그의 모분자인 라미닌-5와 유사한 기능적 특징을 나타냄을 제시하는 것이다. 또한, LG3 도메인 매개성 세포 부착 및 퍼짐은 인테그린 α3β1에 의해 매개되었는데, 이는 인테그린 α3β1이 인간 각화세포 내 라미닌에 대한 일차적인 수용체이고 라미닌이 각화세포의 부착 및 퍼짐 활성에 중요한 리간드임을 제시하는 것이다.

세포 부착 및 퍼짐을 매개하는 라미닌-5 α3 LG3 도메인에서 세포 부착 활성을 부여하는데 필수적인 아미노산 잔기들을 규명하기 위하여, LG3 도메인 유래 아미노산 잔기 1293-1332 부위 내에서 다섯 개의 중첩된 12-mer 펩티드들 (overlapping 12-mer peptides, P1 내지 P5)을 합성하였다(도 3 참조). 상기와 같이 합성된 펩티드들 중에서 P1은 서열번호 2의 아미노산 서열에서 1293-1304 잔기를, P2는 1297-1308 잔기를, P3은 1305-1316 잔기를, P4는 1312-1323 잔기를, P5는 1321-1332 잔기에 해당하는 아미노산 서열을 갖는다. 상기와 같이 합성된 펩티드들의 세포 부착 및 퍼짐 활성을 조사한 결과, 서열번호 1로 기재되는 PPFLMLLKGSTR 서열을 갖는 펩티드 P4가 rLG3와 유사하게 농도-의존적 양상으로 강한 세포 부착 및 퍼짐 활성을 나타내었다(도 4의 A 내지 도 4의 C 참조).

상기에서 펩티드 P4의 세포 퍼짐 활성이 rLG3와 거의 유사함을 확인한 본 발명자들은 LG3 도메인의 세포 부착 활성에 펩티드 P4가 경쟁적으로 작용하는지를 조사하였다. 그 결과, 펩티드 P4는 대략 51% 정도 rLG3에 대한 세포 부착을 억제하였으나, 다른 펩티드들은 모두 30분 동안 100 ㎍/㎖의 펩티드로 전배양된 HOK-16B 세포에서 세포 부착 활성을 감소시키지 않았다(도 4의 D 참조). 이는 펩티드 P4 서열이 천연 라미닌-5 α3 사슬 LG3 도메인의 세포 결합 부위로 작용함을 나타내는 것이다.

또한, 세포 부착 및 퍼짐 활성을 나타내는 본 발명의 rLG3 단백질 및 펩티드 P4는 인테그린 α3 및 β1 소단위들에 대한 항체에 의해 특이적으로 억제되었는데( 도 5의 B 및 도 5의 C 참조), 이는 인테그린 α3β1이 HOK-16B 세포에서 rLG3 및 펩티드 P4 모두의 특이적인 기능적 수용체로 작용함을 나타내는 것이다.

강력한 세포 부착 및 퍼짐 활성을 촉진시키고 인테그린 α3β1에 결합함이 확인된 서열번호 1의 펩티드 P4의 생물학적 활성 핵심 서열을 결정하기 위하여, 펩티드 P4로부터 C-말단이 순차적으로 절단된 다섯 개의 합성 펩티드(P4 D-I 내지 P4 D-V)를 제작하였다(도 6의 A 참조). 상기 C-말단 절단 펩티드들의 세포 부착 및 퍼짐 활성을 조사한 결과, 펩티드 P4에서 C-말단 Arg 잔기가 결실된 펩티드 P4 D-I가 펩티드 P4 대조군에 비하여 현저하게 낮은 세포 부착 및 퍼짐 활성을 보였다(도 6의 B 내지 도 6의 D 참조). 따라서, 펩티드 P4 내 C-말단 Arg 잔기의 결실이 세포 부착 활성을 현저하게 감소시킨다는 것이 확인되었다.

이에, 본 발명자들은 서열번호 1의 펩티드 P4 서열에서 염기성 아미노산 잔기인 Arg 및 Lys의 역할을 규명하기 위하여 1319 번째 Lys 및 1323 번째 Arg 잔기가 각각 또는 모두 Ala로 치환된 합성 펩티드들(P4-S1 내지 P4-S3)을 제조하고(도 7의 A 참조), 이들의 세포 부착 활성을 조사하였다. 그 결과, 세포 부착 활성은 펩티드 P4 대조군에 비하여 Arg이 Ala로 치환된 P4-S2 및 Lys 및 Arg이 모두 Ala로 치환된 P4-S3에 의해 현저하게 감소하였다. 그러나, Lys만이 Ala로 치환된 P4-S1은 세포 부착 활성에 별다른 영향을 미치지 않았다(도 7의 B 참조). 따라서, 펩티드 P4에서 염기성 잔기인 Arg가 세포부착 활성에 매우 중요함을 알 수 있다. 상기 결과들은 라미닌-5 α3 사슬 LG3 도메인 내 PPFLMLLKGSTR 서열(1312-1323 잔기)이 세포 퍼짐 및 부착과 인테그린 α3β1-결합을 담당하는 활성 모티프임을 나타내는 것이다.

한편, rLG3 또는 펩티드 P4에 의해 매개되는 신호 기작을 조사하기 위하여 rLG3 또는 펩티드 P4 상에 도말된 HOK-16B 세포에서 FAK의 인산화 정도를 조사한 결과, 라미닌-코팅된 플레이트에서의 FAK 인산화 정도가, 라미닌으로 코팅되지 않은 플레이트에 도말되거나 부유액 상태로 보관된 HOK-16B 세포에서의 FAK 인산화보다 현저하게 높았다(도 8의 A 참조). 또한, 라미닌, rLG3 또는 펩티드 P1 내지 P5로 코팅된 플레이트에서 Tyr-397, -407, -576, -577, 및 -861 위치의 FAK 인산화 정도를 조사한 결과, 라미닌- 또는 rLG3-코팅된 플레이트에서 배양된 세포의 Tyr-397 FAK 인산화 정도가 미처리 대조군과 비교하여 각각 16.2 및 8.2 배 증가하였다(도 8의 B 참조).

또한, 펩티드 P4에 의한 사람 정상 피부 각화세포(NHEK) 및 피부 섬유모세포 (NHEF)의 세포 부착능을 조사한 결과, P4 펩티드로 코팅된 베스키틴 W 부직포에서의 세포부착수가 여러 대조군에 비하여 증가한 결과를 나타내었다(도 9 참조).

상기 결과들로부터, 인간 라미닌-5 α3 사슬의 여러 도메인 중 LG3 도메인이 인테그린 α3β1과의 결합을 통해 세포 부착 및 퍼짐을 촉진하는데 필수적이고, 특히 상기 LG3 도메인 내 서열번호 1의 PPFLMLLKGSTR 펩티드(서열번호 2의 1312-1323 잔기)가 인테그린-α3β1-의존성 세포 부착 및 퍼짐을 촉진하는 활성 모티프임을 확인하였다.

또한, rLG3 및 서열번호 1의 펩티드에 의한 세포 부착은 Tyr-397 및 -577위치의 FAK 인산화를 증가시켰는데, 이는 재조합 단백질로서 발현된 인간 라미닌-5 LG3 도메인이 인테그린에 특이적으로 결합하여 결정적인 라미닌 기능들을 지지하고 서열번호 1의 펩티드가 인테그린 α3β1-결합을 위한 활성 모티프임을 입증하는 최초의 보고이다.

따라서, 본 발명의 서열번호 13으로 기재되는 인간 라미닌-5 α3 재조합 LG3 도메인 또는 서열번호 1로 기재되는 펩티드는 세포 부착 활성 연구, 화상 치료, 창상 치료, 조직 재생, 암전이 억제, 조직 공학 및 다른 치료학적 응용을 위해 라미닌-5의 대체물로서 사용될 수 있을 것이다.

이에, 본 발명은 상기 세포 부착 및 퍼짐 촉진 펩티드 또는 이의 단백질을 유효성분으로 함유하는 화상 치료, 창상 치료, 조직 재생 또는 암 전이 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 약학 조성물의 유효성분은 임상 투여시에 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 펩티드, 그의 단편 및 그의 유도체는 실제로 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면 활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propyleneglycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트 등이 사용될 수 있다.

또한, 상기 펩티드 또는 그의 유도체는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약 제로 허용되는 담체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 펩티드의 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스(glucose), 수크로스(sucrose) 또는 덱스트란(dextran)과 같은 당류(carbohydrates), 아스코르브산(ascorbic acid) 또는 글루타치온(glutathione)과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이트화제(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물에서 펩티드의 총 유효량은 거환(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 확산(infusion) 등에 의해 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수도 있다. 상기 펩티드의 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수 뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강 상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 펩티드의 약학적 조성물로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다.

상기와 같이 제조된 본 발명의 세포 부착 및 퍼짐 촉진 펩티드를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 비경구 제제이므로 독성 실험을 수행하지 않았다.

또한, 본 발명은 상기 세포 부착 및 퍼짐 촉진 펩티드 또는 이의 단백질을 유효성분으로 함유하는 화상 치료용 또는 창상 치료용 피복재를 제공한다.

피부란 인체를 외부의 자극으로부터 보호하며 수분의 손실을 막아주는 기능 을 수행하는 중요한 장치의 하나로서 피부가 화상이나 각종 외상에 의해 결손이 일어나게 되면 그 보호 작용이 상실되어 기능의 장애를 일으키게 된다. 또한 수분 손실에 따른 여러 가지 부작용과 외부로부터의 세균감염 등을 일으켜 환부의 치료를 어렵게 하거나 2차적인 기능 장애 또는 손상 등과 같은 추가적인 부작용을 초래하게 된다. 따라서 화상 또는 창상의 치유를 신속하게 하고 2차적인 각종 부작용을 최소화하기 위해서는 적절한 피복재를 이용한 치유가 수행되어야 한다.

화상 치료용 또는 창상 치료용 피복재는 피부 손상이 생긴 환부를 보호하고 피부 조직의 재생을 촉진시키는 것으로 급증하고 있는 피부 손상 환자에 필수적인 중요한 의료용품 중의 하나이다. 일반적으로 넓은 화상 부위를 치료할 때, 손상된 조직을 화상 부위로부터 제거하고 제거된 부분을 최종 자가 이식에 앞서 일시적인 화상 치료용 피복재로 덮는다. 일시적 화상 치료용 피복재는 몇 가지 치료 기능을 수행해야 한다. 먼저, 상기 피복재는 외부로부터의 미생물 침입에 의한 감염을 방지할 뿐 아니라 내부의 수분, 염, 단백질 손실을 방지하는 차단막으로의 역할을 수행한다. 둘째로 상기 피복재는 화상 또는 창상 폐쇄를 촉진시켜 정화 및 창상 부위의 재생을 용이하게 한다. 셋째로, 상기 피복재는 통증을 완화시킨다. 따라서, 이러한 기능에 덧붙여, 상기 피복재가 손상된 피부 세포의 재생과 상처 치유에도 기여할 수 있다면 이상적일 것이다.

본 발명의 라미닌-5 α3 재조합 LG3 도메인, 세포 퍼짐 및 부착에 필수적인 모티프로 작용하는 서열번호 1 또는 서열번호 13으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 펩티드, 그의 단편 및 그의 유도체로 구성되는 군으로부터 선택되는 세포 부착 및 퍼짐 촉진 펩티드는 세포 부착과 퍼짐 활성이 뛰어나 이를 포함하는 화상 또는 창상 피복재의 효과가 매우 클 것으로 기대되며, 본 발명에서도 기존의 시판되고 있는 인공피부 소재인 베스키틴 W 부직포에 본 발명의 펩티드 P4를 코팅하였을 때 세포 부착능이 매우 우수하게 나타나는 것을 확인함으로써 이를 입증하였다.

또한, 본 발명은 상기 세포 부착 및 퍼짐 촉진 펩티드 또는 이의 단백질을 유효성분으로 함유하는 조직공학용 지지체를 제공한다.

본 발명에 따른 조직공학용 지지체는 생체 조직의 대용품을 만들어 이식함으로써 신체의 기능을 유지, 향상 또는 복원하는 것을 목적으로 하는 조직 공학(tissue engineering) 분야에서 사용될 수 있는 모든 지지체를 포함한다. 이러한 조직공학용 지지체는 합성 생분해성 고분자인 폴리아미노산, 폴리안하이드라이드, 폴리 ε-카프로락톤, 폴리오르쏘에스테르, 폴리글리콜산(PGA), 폴리락틱산(PLA) 및이들의 공중합체인 폴리락틱-글리콜산(PLGA) 등과 천연 생분해성 고분자인 알긴산, 키토산, 하이알루닉산 및 콜라겐등으로 제조된 다공성 지지체를 포함한다. 상기조직공학용 지지체에는 차폐막이 포함될 수 있는데, 차폐막으로는 다공성 폴리락트산 차폐막, 키틴 또는 키토산 나노섬유로 제조된 재생막 또는 키틴 혹은 키토산의 필름 형태의 차폐막을 사용할 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실험예 1> 세포 및 배양 조건

클로닝된 HPV-16 게놈으로 형질전환되어 불멸화된 인간 구강 각화세포인 HOK-16B 세포주(Park, N. H., et al., Carcinogenesis 12, 1627-1631, 1991)를 0.15 mM 칼슘 및 보조적 성장인자 불릿 킷트(supplementary growth factor bullet kit, KGM; Clonetics, San Diego, CA)를 포함하는 각화세포 기저 배양액 (keratinocyte basal medium, KGM)에 배양하였다. 정상적인 인간 구강 각화세포 (NHOKs)는 이전에 보고된 바에 따라 준비하였다(Min, B. M., et al., Exp . Cell. Res. 249, 377-385, 1999). 구체적으로, 구강 수술을 받은 건강한 지원자 (18 내지 30세 연령 분포)의 잇몸 상피조직으로부터 트립신 처리에 의해 구강 각화세포를 분리한 후, 이를 KGM에 일차 배양하였다. 대략 70% 융합성(confluent)을 보인 일차 NHOKs를 60 ㎜ 페트리 디쉬 당 1×10⁵ 세포의 농도로 도말한 후 80% 융합성에 도달할 때까지 배양하였다. 80% 융합성에 도달한 세포를 계대배양(subculture)하였고, 이로부터 이차 배양된 NHOKs를 하기 실험에 사용하였다.

< 실험예 2> 세포 부착 및 퍼짐 활성 분석

세포 부착 활성 분석은 오카자키 등에 의해 보고된 방법에 따라 수행하였다 (Okazaki, I., et al., J. Biol. Chem. 277, 37070-37078, 2002). 구체적으로, 24-웰 배양 플레이트(Nunc, Roskilde, Denmark)를 다양한 농도의 rLG 단백질들로 4℃에서 밤새 코팅한 후 건조시켰다. 기질-코팅된 플레이트에 1% 열-비활성 소 혈청 알부민(heat-inactivated bovine serum albumin, BSA, Sigma)을 포함하는 PBS를 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 보관하여 차단한 후, PBS로 두 번 세척하였다. 상기 실험예 1에서 0.05% 트립신과 0.53 mM EDTA를 포함하는 PBS에 의해 상피조직으로부터 분리한 세포들을 배지에 재부유 시키고, 각 플레이트에 1×10⁵ 세포/500 ㎕ 농도로 첨가한 후 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후, 플레이트를 PBS로 두 번 세척하여 부착되지 않은 세포들을 제거하였다. 플레이트에 부착된 세포들을 10% 포르말린을 포함하는 PBS로 15분간 고정한 후, PBS로 두 번 세척하고 1시간 동안 0.5% 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 상기 플레이트를 DDW로 가볍게 세 번 세척한 후 2% SDS로 5분간 용혈시켰다. 흡광도는 Bio-Rad Model 550 마이크로플레이트 판독기 (Bio-Rad)를 이용하여 570 ㎚에서 측정하였다.

퍼진 세포를 확인하기 위하여, 플레이트에 부착된 세포들을 10% 포르말린을 포함하는 PBS로 15분간 고정한 후, PBS로 두 번 세척하고 1시간 동안 0.005% 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 상기 플레이트를 DDW로 가볍게 세척하였다. 대표수(representative count)를 정하기 위하여 각 플레이트를 4등분한 후, 각 등분의 두 지역을 ×100 배율로 현미경(Olympus BX51 microscope)을 이용하여 사진을 찍었다. 필로포디아- 및 라멜리포디아-유사 팽창을 갖는(filopodia- and lamellipodia-like extension) 납작하고 다각형 모양의 세포들을 퍼진 세포로 간주 하였다. 반대로, 씻겨지지 않고 플레이트 표면에 부착된 상태로 존재하는 세포들을 비-퍼짐 세포로 간주하였다.

<실험예 3> 유세포 분석(flow cytometry)

세포 표면 인테그린 발현 수준을 조사하기 위한 유세포 분석은 로덱 등의 방법에 따라 수행하였다(Rodeck, U., et al., J. Cell Sci . 110, 113-121, 1997). 구체적으로, HOK-16B 세포들을 0.05% 트립신 및 0.53 mM EDTA를 포함하는 PBS로 가볍게 처리하여 떼어낸 후 세척하고 항-인테그린 단일 클론 항체(anti-integrin mAbs; anti-α2, α3, α5, α6, αv, β1 및 β4)와 함께 4℃에서 45분 동안 배양하였다. 세척 후, 세포들을 FITC-표지 이차 항체(FITC-labeled secondary antibody)와 함께 4℃에서 45분 동안 배양한 다음, 유세포 분석기(FACS, Calibur flow cytometer, Becton-Dickinson, San Jose, CA)로 분석하였다.

< 실험예 4> 부착 활성 억제 분석

rLG3 단백질 및 펩티드 P4에 대한 HOK-16B 세포의 수용체를 동정하기 위하여, 서로 다른 형태의 인테그린에 대한 5 ㎍/㎖ mAbs 또는 5 mM EDTA를 각각 0.5 ㎖ 배양 용액 내 HOK-16B 세포(2×10⁵ cells/㎖)에 첨가한 후 37℃에서 30분 동안 전배양하였다. 전배양된 세포들을 25 ㎍/㎖ 농도의 rLG3 또는 10 ㎍/웰 농도의 펩티드 P4로 미리 코팅된 플레이트로 옮긴 후 37℃에서 1시간 동안 더 배양하였다. 부착된 세포들을 상기 실험예 2에서 기술한 방법에 따라 정량하여 세포 부착 활성 억제 정도를 측정하였다.

<실험예 5> FAK 인산화 분석

FAK 인산화 분석은 샹 등의 방법에 따라 수행하였다(Shang, M., et al., J. Biol. Chem. 276, 33045-33053, 2001). 구체적으로, HOK-16B 세포들을 트립신 처리한 후 세척하고 0.1% BSA를 포함하는 무혈청 KGM에 부유시켜 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 60 ㎜ 페트리 디쉬들을 라미닌(5 ㎍/㎖), rLG3(25 ㎍/㎖) 또는 P1 내지 P5 펩티드들(50 ㎍/디쉬)로 4℃에서 밤새 코팅한 후 건조시켰다. 부착성 FAK 분석을 위해, 1×10⁶ 세포들을 코팅되지 않거나, 라미닌, rLG3 또는 여러 펩티드들로 코팅된 페트리 디쉬에 첨가한 후 5% CO₂, 37℃에서 15분, 30분 또는 60분 동안 부착되도록 방치하였다. 배양 말기에, 세포들을 냉각 PBS로 세척한 후 RIPA 완충용액(50 mM Tris[pH 7.4], 150 mM NaCl, 1% 노니뎃(Nonidet) P-40, 0.5% Na-데옥시콜레이트(Na-deoxycholate), 1 mM EDTA, 0.1% SDS, 2 mM Na₃VO₄, 1 mM 글리세롤 포스페이트(glycerol phosphate), 1 mM PMSF, 및 프로테아제 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktail]))을 이용하여 용해시켰다. 용해물을 4℃에서 10분 동안 12,000 ×g로 원심분리하여 세포질 추출물(cytosolic extract)을 분리하였다.

상기 세포질 추출물에 SDS 시료 완충용액(50 mM Tris-HCl[pH 6.8], 2% SDS, 10% 글리세롤, 0.1% 브로모페놀 블루[bromophenol blue], 100 mM β-머캅토에탄올 [β-mercaptoethanol])을 첨가하여 단백질을 변성시킨 후 8% SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에 전개하였다. SDS-PAGE를 수행하여 단백질이 분리된 젤을 니트로셀룰로스 막으로 전기적 전달 후, 상기 막을 총 FAK 수준을 결정하기 위하여 다클론성 항-FAK 항체들(polyclonal anti-FAK antibodies)로 면역블랏팅하거나, 티로신 인산화 정도를 결정하기 위하여 다클론성 항-FAK [pY397], [pY407], [pY576], [pY577] 또는 [pY861] 항체들을 이용하여 면역블랏팅하였다. 이때, FAK 인산화의 상대적 배율 유도(relative-fold induction)는 플레이트 상에 도말된 대조군 세포들의 배경 수준에 대한 시료의 FAK 인산화의 증가로 정의되며 다음과 같이 결정되었다. 먼저, 웨스턴 블랏으로부터 인산화된 FAK(p-FAK) 및 총 FAK(t-FAK) 신호들의 농도계측기 강도(densitometry intensity)를 LAS-1000plus(Fuji photo film, Japan)로 측정하였다. 각 시료의 t-FAK에 대한 p-FAK의 비(p-FAK/t-FAK)를 단백질 전개에 있어서의 차이로 보정하였다. 상기 비는 FAK 인산화의 상대적 배율 유도를 얻기 위하여 음성 대조군의 p-FAK/t-FAK 비에 대해 표준화하였다.

<실시예 1> 인간 라미닌-5 α3 사슬의 재조합 LG 도메인들의 발현

인간 라미닌-5와 인테그린과의 결합을 규명하기 위하여, 인간 라미닌-5의 부착 도메인인 α3 사슬의 다섯 개 LG 도메인들을 각각 대장균에서 단량체의 수용성 재조합 단백질 형태로 발현시켰다.

구체적으로, 인간 라미닌-5 α3 사슬 DNA는 NHOKs로부터 분리된 mRNA를 사용하여 제조사의 지침에 따라 역전사효소(Superscript Ⅱ Reverse Transcriptase, GibcoBRL, Grand Island, NY)를 이용하는 역전사효소 연쇄중합반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction, RT-PCR)에 의해 클로닝하였다. 이와 같이 클로닝된 라미닌-5 α3 사슬 cDNA를 주형으로 하는 PCR에 의해 라미닌-5 α3 사슬의 다섯 개 C-말단 LG cDNA 절편들(LG1 내지 LG5)을 증폭한 후 LG1 내지 LG3 절편들은 각각 pGEM-T Easy 벡터(Promega, Madison, WI)에, LG4 및 LG5 절편들은 각각 pEZ-T 벡터(RNA, Seoul, Korea)에 클로닝하였다.

PCR에 사용된 프라이머는 하기와 같다;

LG1, 서열번호 3(센스) 및 서열번호 4(안티센스);

LG2, 서열번호 5(센스) 및 서열번호 6(안티센스);

LG3, 서열번호 7(센스) 및 서열번호 8(안티센스);

LG4, 서열번호 9(센스) 및 서열번호 10(안티센스);

LG5, 서열번호 11(센스) 및 서열번호 12(안티센스).

모든 플라스미드 컨스트럭트들은 염기서열을 분석하여 절편들이 올바르게 삽입되었는지 확인하였다. 상기 pGEM-T Easy 벡터 및 pEZ-T 벡터에 클로닝된 LG DNA 단편 중 LG1 절편은 포유동물 발현벡터인 pET-32a(+)(Novagen, Madison, WI)의 EcoRI 부위에, LG2 절편은 동일한 벡터의 NcoI-SalI 부위에 클로닝하였고, LG3 내지 LG5 절편들은 각각 포유동물 발현벡터 pRSET(Invitrogen, Carlsbad, CA)의 NcoI 부위에 클로닝하였다.

재조합 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여 이 과정에서 재조합 단백질의 C-말단에 6개의 히스티딘-표지(His6-tag)를 연결시켰다. 올바른 방향으로 DNA 절편이 삽입된 클론을 선택하고 클로닝 과정 동안 돌연변이나 결실이 일어났는지를 서열분석을 통해 확인하였다. 상기 발현벡터들로 각각 형질전환 시킨 대장균 E. coli BL21 균주를 595 ㎚에서의 광학농도(0D)가 0.5 내지 0.6이 될 때까지 37℃ LB 배지에서 배양한 후 1 mM IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, Promega)를 첨가하고 재조합 LG 도메인 단백질들의 발현을 유도하였다. 37℃에서 5시간 동안 단백질 발현을 유도한 후, 세포를 10분 동안 6,000 rpm에서 원심분리하여 회수하였다. 세포 침전물은 사용 전까지 -80℃에 보관하였다.

단백질 정제를 위하여, 상기 세포 침전물을 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(phenylmethylsulfonyl fluoride, Sigma)를 포함하는 차가운 용해 완충용액(lysis buffer, 100 mM NaH₂PO₄, 10 mM Tris-HCl, 8 M urea, pH 8.0)에 부유시켰다. 상기 세포 부유액을 거품이 생기지 않도록 조심하면서 10 ㎖ 피펫을 통과시켜 세포를 용해시켰다. 이로부터 얻은 세포 용해물을 Ni^{2 +}-니트릴로트리아세트산 아가로스(Ni²⁺-nitrilotriacetic acid agarose, Qiagen, Valencia, CA) 컬럼에 로딩하였다. 상기 컬럼을 10 mM 이미다졸(imidazole)을 포함하는 용해 완충용액으로 세척한 후, 25 mM 이미다졸을 포함하는 용해 완충용액을 이용하여 컬럼에 흡착된 단백질을 용출시켰다.

용출된 재조합 단백질들을 100 mM NaH₂PO₄ 및 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라 이드를 포함하는 10 mM Tris-HCl(pH 3.0) 완충용액에서 고농도부터 저농도(3 M, 2 M, 1 M 또는 0.5 M)까지의 우레아로 연속적으로 투석한 후, 마지막으로 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드를 포함하는 PBS(pH 3.0)로 투석하여 재생시켰다. 투석된 rLG 단백질들을 센트리콘 기기(Centricon YM-10, Millipore, Bedford, MA)를 이용하여 0.5 ㎍/㎕ 농도로 농축한 후 사용하기 전까지 -80℃에서 보관하였다. 단백질 농도는 단백질 분석 킷트(Bio-Rad protein assay kit, BioRad, Hercules, CA)를 이용하여 측정하였다.

전체 α3 사슬 분자 내 재조합 단백질들의 대응 아미노산 부위들을 도 1의 A에 나타내었다. 도 1의 A에서 라미닌-5 α3 사슬의 도메인 구조들(열린 컬럼)은 IIIa, I/II 및 LG1-LG5로 표시되었고, 음영 부위는 시그날 펩티드(signal peptide)를 나타낸다. 또한, 닫힌 막대들은 본 발명에 따라 제조된 재조합 LG 단백질들의 위치를 나타내고, 괄호안의 숫자들은 전체 α3 사슬 분자 내 재조합 LG 단백질들의 상응하는 아미노산 위치를 나타내는 것이다. 이와 같이 제조된 재조합 LG 단백질들 중에서, rLG1은 서열번호 2로 기재되는 인간 라미닌 α3 사슬의 아미노산 서열에서 782-978 잔기를 포함하고, rLG2는 959-1148 잔기를, rLG3은 1128-1364 잔기를, rLG4는 1352-1555 잔기를, rLG5는 1522-1713 잔기를 포함한다.

본 발명에서 제조된 재조합 LG 단백질들은 모두 단백질 접힘(protein folding)을 용이하게 하기 위하여 3 내지 25개 아미노산에 의해 이웃하는 도메인들까지 연장되었고, 단백질 정제 및 동정의 편의를 위하여 각각의 N-말단에 6개의 히스티딘 잔기 (His6)가 표지된 융합 단백질 형태로 발현되었다(도 1의 C 참조). 본 발명에 따라 대장균에서 단량체의 수용성 융합 단백질 형태로 발현된 rLG1, rLG2, rLG3, rLG4 및 rLG5 단백질들을 SDS-PAGE 겔에 걸어 전기영동을 수행한 후 쿠마시 블루로 염색하여 각 재조합 단백질들의 분자량이 각각 43, 39, 32, 30 및 29 kDa임을 확인하였다. SDS-PAGE 겔의 쿠마시 염색으로 확인된 rLG 단백질들을 변성 조건하에서 Ni^{2 +}-니트릴로트리아세트산-아가로스를 이용하여 거의 균질하게 분리하였다(도 1의 C 참조). 상기 다섯 종류의 rLGs 발현 수준은 서로 유사하였고, 평균적으로는 0.5 ℓ의 세균 배양으로부터 대략 0.5 ㎎의 정제된 rLG 단백질을 수득하였다.

< 실시예 2> 인간 라미닌 -5 α3 사슬 rLGs 의 세포 부착 및 퍼짐 활성

상기 실시예 1에서 제조된 인간 라미닌-5 α3 재조합 LG 단백질들이 각각 세포 부착 및 퍼짐에 어떠한 영향을 미치는지를 조사하기 위하여, 이들의 세포 부착 및 퍼짐 활성을 실험예 2에 기재된 방법에 따라 측정하였다.

그 결과, 5개의 rLG 단백질들 중에서 rLG3 만이 세포 부착 활성을 나타내었는데 (도 2의 A 내지 도 2의 C 참조), rLG3에 대한 HOK-16B 세포의 부착은 25 ㎍/㎖ 코팅 농도에서 최대 부착 활성을 나타내었고 이는 농도-의존적 양상을 보였다(도 2의 B 참조). 도 2의 B에서 BSA 및 라미닌은 각각 음성 및 양성 대조군으로 사용되었다. 25 ㎍/㎖ 또는 이보다 높은 코팅 농도에서 rLG1, rLG2, rLG4 및 rLG5는 BSA 대조군과 비교했을 때 동일한 조건하에서 거의 세포 부착 활성을 나타내지 않았다(도 2의 B 및 도 2의 C 참조). 50 ㎍/㎖ rLG3에서 세포 부착 활성은 5 ㎍/㎖ 라미닌-코팅된 대조군과 비교했을 때 약 45% 정도 감소하였다(도 2의 A 참조).

라미닌-5 α3 사슬 rLG3의 부착 활성을 좀더 분석하기 위하여, 부착된 세포들이 기저층(substratum)에 구속되어 있는지 아니면 기저층 위로 퍼지게 되는지를 조사하였다. 부착 분석에서 rLGs에 부착된 HOK-16B 세포들을 세척하고, 고정하고, 크리스탈 바이올렛으로 염색한 후 염색된 세포들을 분석하였다. 이로부터 결정된 rLGs의 세포 부착 활성 프로파일은 흡광 광도계(spectrophotometry)에 의해 결정된 rLGs의 프로파일과 매우 유사하였다(도 2의 C 참조).

또한, 실험예 2에 기술한 방법에 따라 rLGs의 HOK-16B 세포들에 대한 퍼짐 활성을 조사한 결과, rLG3-코팅 플레이트에서 47%의 HOK-16B 세포들이 퍼지는 세포의 형태학적 특징인 필로포디아- 및 라멜리포디아-유사 팽창을 갖는 납작하고 다각형의 모양을 나타내었다(도 2의 D 참조). rLG3에 대해 잔존하는 비퍼짐성 세포들은 씻겨나가지 않고 플레이트 표면에 부착된 상태로 존재하였다. 반면, rLG1-, rLG2-, rLG4- 또는 rLG5-코팅된 플레이트들에서 최소의 세포 퍼짐이 관찰되었다. 상기 결과들은 재조합 LG3 도메인이 세포 부착 및 퍼짐을 촉진하여 그의 모분자인 라미닌-5와 유사한 기능적 특징을 나타냄을 제시하는 것이다.

<실시예 3> 세포 부착 및 퍼짐에 유효한 인간 라미닌-5 α3 사슬 LG3 서열의 동정

상기 실시예 2에서 인간 라미닌-5 α3 재조합 LG3 도메인이 세포 부착 및 퍼짐을 매개한다는 사실을 확인하였다. 또한, LG3 도메인내 C-말단의 28개 아미노산 (1297-1324 잔기) 및 83개 아미노산(1214-1296 잔기) 부위들이 각각 세포 부착 및 세포 이동성을 촉진시키는 것으로 보고된 바 있다(Kariya, Y., et al., J. Cell Biochem. 88, 506-520, 2003). 이에, 본 발명자들은 라미닌-5 α3 LG3 도메인에서 세포 부착 활성을 부여하는 필수적인 아미노산 잔기들을 규명하기 위하여, LG3 도메인 유래 아미노산 잔기 1293-1332 부위 내에서 다섯 개의 중첩된 12-mer 펩티드들(overlapping 12-mer peptides)을 대한민국 기초과학연구소(Korea Basic Science Institute, Seoul, Korea)에서 파이오니아 펩티드 합성기(Pioneer peptide synthesizer, Applied Biosystems, Forster City, CA)로 C-말단 아미드를 이용한 Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl)-기초 고형상 방법(Fmoc-based solid-phase method)에 의해 합성하였다(도 3 참조). 도 3에서 화살표는 합성 펩티드들의 위치를 나타낸다. 추정된 β-가닥 구조들은 회색 상자에 넣었고, 펩티드 P4의 기본 아미노산 Lys 및 Arg는 흰색 상자에 넣었다(http://www.bmm.icnet.uk/~3djigsaw/ dom_fish). 합성된 펩티드들은 역상 고성능 액체 크로마토그래피(reverse-phase high performance liquid chromatography)에 의해 정제되었고, 고성능 액체 크로마토그래피와 질량 분광분석기(mass spectrophotometry)를 사용하여 특징을 분석하였다. 이와 같이 합성된 펩티드들 중에서 P1은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열에서 1293-1304 잔기를, P2는 1297-1308 잔기를, P3은 1305-1316 잔기를, P4는 1312-1323 잔기를, P5는 1321-1332 잔기에 해당하는 아미노산 서열을 갖는다.

상기와 같이 합성된 펩티드들을 실험예 2와 같은 방법에 의해 펩티드-코팅된 플레이트 상에서 세포 부착 및 퍼짐 활성을 HOK-16B 세포를 이용하여 조사하였다. 24-웰 플레이트를 각각 10, 20, 30, 40 및 50 ㎍/웰 농도의 펩티드 P1 내지 P5로 코팅하였다. HOK-16B 세포를 펩티드-코팅된 플레이트에 첨가하고 무혈청 배지에서 1시간 동안 반응시켰다. 미부착 세포들을 제거한 후 부착 세포들을 고정하고, 크리스탈 바이올렛으로 염색한 후 염색된 세포를 분석하였다. 흡광도는 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 570 ㎚에서 측정하였다. 이때, BSA 및 rLG3을 각각 음성 및 양성 대조군으로 사용하였다.

그 결과, 펩티드 P4(PPFLMLLKGSTR)는 강한 농도-의존적 세포 부착 활성을 나타내었고, 최대 세포 부착 활성은 펩티드 P4를 플레이트에 10 ㎍/웰 농도 이상으로 코팅하는 경우에 얻어졌다. 그러나, 매우 높은 코팅 농도에서조차도 펩티드 P1, P2 및 P3은 부착 활성을 나타내지 않았고, 펩티드 P5는 25 ㎍/웰 이상 농도에서 농도-의존적 양상으로 매우 약한 부착 활성을 나타내었다(도 4의 A 참조). 또한, 10 ㎍/웰 코팅 농도에서 펩티드들의 부착 활성 프로파일은 세포 부착 분석에서 세포 수의 측정에 의해 결정되었는데, 거의 모두 동일한 양상의 세포 부착이 관찰되었다(도 4의 B 참조). 펩티드 P4의 세포 부착 활성은 rLG3의 부착 활성과 유사하였다.

펩티드 P4의 부착 활성을 자세히 분석하기 위하여, 부착된 세포들이 기저층에 구속되어 있는지 아니면 기저층 위로 퍼짐되는지를 조사하였다. 이때, BSA 및 rLG3을 각각 음성 및 양성 대조군으로 사용하였고, 퍼짐 형태를 나타내는 세포의 비율은 총 부착 세포의 수를 퍼짐 세포의 수로 나누어 정량적으로 계산하였다. 그 결과, 펩티드 P4-코팅 플레이트에서 35%의 HOK-16B 세포가 퍼짐되는 세포의 형태학적 특징을 보였으나, P1, P2, P3 또는 P5-코팅된 플레이트에서는 어떠한 퍼짐 세포도 관찰되지 않았다(도 4의 C 참조). 상기에서 펩티드 P4의 세포 부착 및 퍼짐 활 성이 rLG3와 거의 유사함이 확인되었다.

이에, 본 발명자들은 LG3 도메인의 세포 부착 활성에 펩티드 P4가 경쟁적으로 작용하는지를 실험예 4에 기재된 방법에 따라 조사하였다(도 4의 D 참조). 먼저, 정제된 rLG3 단백질(25 ㎍/㎖)을 24-웰 플레이트에 코팅하였다. HOK-16B 세포를 펩티드가 첨가되지 않거나 다양한 펩티드들(100 ㎍/㎖)이 첨가된 배지에서 37℃에서 30분 동안 전배양하였다. 전배양된 세포를 rLG3-코팅된 플레이트에 첨가한 후 무혈청 배지 내에서 1시간 동안 반응시켰다. 미부착 세포들을 제거한 후 부착 세포들을 고정하고, 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 대조군 배양물(펩티드 없이 전배양된 HOK-16B 세포)의 평균 부착 활성을 100%로 간주하였으며, 결과는 네 번의 독립적인 실험의 평균 ± S.D.로 나타내었다. 그 결과, 합성 펩티드 P4는 대략 51% 정도 rLG3에 대한 세포 부착을 억제하였으나, 다른 펩티드들은 모두 30분 동안 100 ㎍/㎖의 펩티드로 전배양된 HOK-16B 세포에서 rLG3에 대한 세포 부착 활성을 감소시키지 않았다. 이는 펩티드 P4 서열(PPFLMLLKGSTR)이 천연 라미닌-5 α3 사슬 LG3 도메인의 세포 결합 부위로 작용함을 나타내는 것이다.

<실시예 4> 인테그린 α3β1 의존적인 rLG3 및 펩티드 P4에 대한 세포 부착

본 발명자들은 재조합 LG3 도메인 및 펩티드 P4의 세포 부착 및 퍼짐 활성에 관여하는 세포 표면 수용체를 규명하기 위해, rLG3 또는 펩티드 P4로 코팅된 표면에 부착하는 HOK-16B 세포의 표면에 발현되는 인테그린의 종류를 인테그린 소단위들에 대한 기능-차단 단클론성 항체들(function-blocking mAbs; Chemicon Temecula, CA)를 사용하는 FACS 분석에 의해 결정하였다. 실험예 3과 같이 HOK-16B 세포를 α2, α3, α5, α6, αv, β1 또는 β4 인테그린 소단위에 특이적인 mABs와 함께 배양한 후 유세포 분석을 위한 FITC-접합 이차 항체로 염색하여 유세포 분석을 수행하였다. 이때, 음성 대조군은 이차항체만으로 배양하였다. 결과는 형광 강도(florescence intensity)의 함수(×축)로서 플롯팅된 세포수(Y축)로 나타내었다. 그 결과, HOK-16B 세포가 α3β1, α6β1 및 α6β4 인테그린을 포함하는 다양한 인테그린을 발현함을 확인하였다(도 5의 A 참조).

한편, 리간드-인테그린 상호작용은 이가 양이온(divalent cation)을 요구하는 것으로 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 상기 상호작용에 있어 양이온의 역할을 결정하기 위하여, rLG3- 및 펩티드 P4-코팅된 플레이트에서의 HOK-16B 세포 부착에 금속-킬레이트화제(metal-chelating reagent)인 EDTA가 미치는 영향을 조사하였다. HOK-16B 세포를 5 mM EDTA 또는 인테그린 α3(P1B5), β1(6S6) 및 α6(NKI-GoH3) 소단위들에 대한 기능-차단 mAbs(Chemicon Temecula, CA) 5 ㎍/㎖과 함께 37℃에서 30분 동안 전배양한 후 25 ㎍/㎖ rLG3로 미리 코팅된 플레이트에 접종하고 1시간 동안 배양하였다. 미부착 세포들을 제거한 후 부착된 세포들을 고정하고 크리스탈 바이올렛으로 염색한 후 염색된 세포를 분석하였다. 대조군 배양물(EDTA 또는 인테그린 항체들 없이 전배양된 HOK-16B 세포)의 평균 부착 활성을 100%로 간주하였다. 그 결과, rLG3에 대한 세포 부착은 5 mM EDTA에 의해 거의 완벽하게 억제되었다(도 5의 B 참조). 이와 유사하게, rLG3-코팅된 플레이트에서보다는 낮았지만 5 mM EDTA 존재하에서 10 ㎍/웰의 농도로 펩티드 P4가 코팅된 플레이트에서 역시 세포 부착 활성의 감소가 관찰되었다(도 5의 C 참조). 이는 rLG3 및 펩티드 P4에 대한 세포 표면 수용체가 리간드와의 상호작용을 위해 이가 양이온을 필요로 하는 인테그린들 중의 하나임을 제시하는 것이다.

또한, 인테그린 소단위들에 대한 기능-차단 mAbs가 rLG3 또는 펩티드 P4로 코팅된 표면에 대한 HOK-16B 세포의 부착 활성에 미치는 효과를 조사하였다. 그 결과, rLG3- 또는 펩티드 P4-코팅된 표면에 대한 부착은 α3 및 β1 소단위들에 대한 항체에 의해 특이적으로 억제되었는데 (도 5의 B 및 도 5의 C 참조), HOK-16B 세포의 항-인테그린 α3 항체 처리는 rLG3 및 펩티드 P4의 부착 활성을 각각 71 및 49%씩 억제한 반면, 항-인테그린 β1 항체의 처리는 rLG3 및 펩티드 P4의 부착 활성을 각각 71 및 54%씩 억제하였다. 상기 결과들로부터 인테그린 α3β1이 HOK-16B 세포에서 rLG3 및 펩티드 P4 모두의 특이적인 기능적 수용체이고, HOK-16B 세포에 대한 펩티드 P4의 세포 부착 활성이 rLG3과 비교하여 인테그린 α3β1과의 조금 약한 상호작용에 의해 매개됨을 알 수 있다.

< 실시예 5> 펩티드 P4 의 C-말단 및 N-말단의 절단과 Ala-치환된 펩티드들의 세포 부착 활성

상기 실시예 4에서 펩티드 P4가 강력한 세포 부착 및 퍼짐 활성을 촉진시키고 인테그린 α3β1에 결합함이 확인되었다. 이에, 본 발명자들은 펩티드 P4에서 생물학적 활성 핵심 서열을 결정하기 위하여 펩티드 P4로부터 C-말단이 절단된 다섯 개의 합성 펩티드(P4 D-I 내지 P4 D-V)를 제작하였고(도 6의 A 참조), HOK-16B 세포를 이용한 펩티드-코팅된 플레이트 상에서 세포 부착 및 퍼짐 활성에 미치는 효과를 조사하였다. 24-웰 플레이트를 10 ㎍/웰 농도의 C-말단 절단된 펩티드들로 코팅한 후 HOK-16B 세포를 상기 플레이트에 첨가하고 무혈청 배지에서 1시간 동안 배양하였다. 미부착 세포들을 제거한 후 부착 세포들을 고정하고, 크리스탈 바이올렛으로 염색한 다음 염색된 세포를 분석하였다. 흡광도는 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 570 ㎚에서 측정하였다. BSA 및 펩티드 P4를 각각 음성 및 양성 대조군으로 사용하였고, 결과를 네번의 독립적인 실험의 평균 ±S.D.로 나타내었다.

그 결과, 펩티드 P4에서 C-말단 Arg 잔기가 결실된 펩티드 P4 D-I가 펩티드 P4 대조군에 비하여 현저하게 낮은 세포 부착 활성을 나타내었다(도 6의 B 및 도 6의 C). 또한, 펩티드 P4에서 N-말단 Pro 두개 중 하나만 결실된 펩티드 P4 D-N1의 경우, P4 대조군과 비교하여 부착 활성과 퍼짐 활성이 크게 떨어지지 않았으나, N-말단 Pro 두개 모두 결실된 P4 D-N2의 부착 활성과 퍼짐 활성은 현저히 낮아졌다(도 6의 C 및 도 6의 D 참조). 그러나, 펩티드 P4에서 C-말단 아미노산 잔기의 추가적인 결실은 P4와 유사하거나 또는 그보다 현저히 낮은 세포 부착 활성 및 퍼짐 활성을 나타내었다. 상기에서 펩티드 P4 내 C-말단 Arg 잔기의 결실이 세포 부착 활성을 현저하게 감소시킨다는 것이 확인되었다.

이에, 본 발명자들은 펩티드 P4 서열에서 염기성 아미노산 잔기인 Arg 및 Lys이 세포 부착 활성에 미치는 영향을 규명하기 위하여 Lys1319 및 Arg1323가 각각 또는 모두 Ala로 치환된 합성 펩티드들 (P4-S1 내지 P4-S3)을 제조하였고(도 7 의 A 참조), HOK-16B 세포를 이용한 펩티드-코팅된 플레이트상에서 이들의 세포 부착 활성을 조사하였다. 24-웰 플레이트를 10 ㎍/웰 농도의 펩티드들로 코팅한 후 HOK-16B 세포를 상기 플레이트에 첨가하고 무혈청 배지에서 1시간 동안 반응시켰다. 미부착 세포를 제거한 후 부착된 세포들을 고정하고, 크리스탈 바이올렛으로 염색한 후 염색된 세포를 분석하였다. BSA 및 펩티드 P4를 각각 음성 및 양성 대조군으로 사용하였고, 결과를 네 번의 독립적인 실험의 평균 ± S.D.로 나타내었다. 그 결과, 세포 부착 활성은 펩티드 P4 대조군에 비하여 Arg이 Ala로 치환된 P4-S2 및 Lys 및 Arg이 모두 Ala로 치환된 P4-S3에 의해 현저하게 감소하였다. 그러나, Lys만이 Ala로 치환된 P4-S1은 세포 부착 활성에 별다른 영향을 미치지 않았다(도 7의 B 참조). 이로부터 펩티드 P4에서 염기성 잔기인 Arg가 펩티드 P4의 세포 부착 활성에 필수적임을 확인하였다. 상기 결과들은 라미닌-5 α3 사슬 LG3 도메인 내 PPFLMLLKGSTR 서열(1312-1323 잔기)이 세포 퍼짐 및 부착과 인테그린 α3β1-결합을 담당하는 활성 모티프임을 나타내는 것이다.

<실시예 6> rLG3- 또는 펩티드 P4가 FAK의 Tyr-397 및 -577 위치의 인산화에 미치는 영향

인테그린은 부착 수용체(adhesion receptor) 뿐만 아니라 신호 전달체 (signal transducer)로도 작용함이 알려져 있다(Schwartz, M. A., et al., Ann. Rev. Cell. Dev. Biol. 11, 549-599, 1995; Shoenwaelder, S. M., 및 Burridge, K., J. Biol . Chem . 274, 14359-14367, 1999). 세포외기질 단백질에 대한 인테그 린의 활성은 세포외기질 단백질의 구성성분에 대한 세포 부착을 이끄는 주요 티로신 인산화 단백질인 병소 부착 키나제(foccal adhesion kinase, FAK)의 인산화를 증가시킨다(Clark, E. A., 및 Brugge, J. S., Science 268, 233-239, 1995; Guan, J. L., Int. J. Biochem. Cell Biol. 29, 1085-1096, 1997; Giancotti, F. G., 및 Ruoslahti, E., Science 285, 1028-1032, 1999). FAK Tyr-397, -407, -576, -577, -861, 및 -925가 인산-수용체 부위(phospho-acceptor site)로 동정되었는데, 이들 중 Tyr-397이 FAK 자가-인산화(auto-phosphorylation)의 주요 부위로 보고되었다 (Schlaepfer, D. D., et al., Nature 372, 786-791, 1994).

이에, 본 발명자들은 rLG3 또는 펩티드 P4에 의해 매개되는 신호 기작을 조사하기 위하여 FAK 인산화를 rLG3 또는 펩티드 P4상에 도말된 HOK-16B 세포에서 조사하였다. 라미닌은 α3β1 인테그린에 대한 대조군 리간드 결합으로 포함되었다 (Lampe, P. D., et al., J. Cell Biol . 143, 1735-1747, 1998). 우선, 라미닌-코팅된 또는 코팅되지 않은 플레이트상에서 Tyr-397 FAK 인산화 정도를 15분, 30분 또는 60분 동안 HOK-16B 세포를 이용하여 실험예 5에 기재된 방법에 따라 FAK 인산화 분석을 수행하였다(도 8의 A 참조). 트립신 처리(trypsinization)에 의해 분리한 HOK-16B 세포를 1시간 동안 부유시킨 후 퍼짐액 상태(Sus)로 보관하거나 라미닌(5 ㎍/㎖)으로 코팅되거나 코팅되지 않은 60 ㎜ 배양 접시에 재도말하였다. 세포가 플레이트에 부착되도록 15, 30 또는 60분 동안 방치한 후 세포 용해질(lysates)을 항-FAK p-Y397 항체(Biosource, Camarillo, CA)로 면역분석하였다. 그 결과, 라미닌-코팅된 플레이트에서의 FAK 인산화 정도가 라미닌으로 코팅되지 않은 플레 이트에 도말되거나 부유액 상태로 보관된 HOK-16B 세포의 FAK 인산화보다 현저하게 높았다. 이러한 효과는 15분 이내에 관찰되었고 라미닌-코팅된 플레이트에 노출된 후 15분에서 최고치를 나타내었다(도 8의 A 참조).

이에, Tyr-397, -407, -576, -577, 및 -861 위치에서의 FAK 인산화 정도를 라미닌(5 ㎍/㎖), rLG3(25 ㎍/㎖), 또는 펩티드 P1 내지 P5(50 ㎍/60 ㎜ 디쉬)로 코팅된 플레이트에서 15분 동안 배양된 HOK-16B 세포에서 조사하였다. 세포 용해질을 항-FAK p-Y397, p-Y407, p-Y576, p-Y577 또는 p-Y861 항체(Biosource, Camarillo, CA)로 면역분석하였고, 총 FAK 수준은 항-FAK 항체(Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY)를 사용하여 검출하였다. 각 시료에서 t-FAK에 대한 p-FAK(p-FAK/t-FAK)의 비율은 단백질 로딩(loading)에서의 차이를 보정하여 계산하였다. FAK 인산화의 상대적인-배율 유도를 얻기 위하여 상기 비율을 음성 대조군(즉, 플레이트 상에 도말된 세포)의 p-FAK/t-FAK 비율로 표준화시켰다. 그 결과, 라미닌- 또는 rLG3-코팅된 플레이트에서 배양된 세포의 Tyr-397 FAK 인산화 정도가 미처리 대조군과 비교하여 각각 16.2 및 8.2배 증가하였다(도 8의 B 참조). 이는 라미닌이 FAK의 Tyr 인산화를 유도한다는 사실과 일치하는 것이다(Clark, E. A., 및 Brugge, J. S., Science 268, 233-239, 1995; Guan, J. L., Int. J. Biochem. Cell Biol. 29, 1085-1096, 1997; Giancotti, F. G., 및 Ruoslahti, E., Science 285, 1028-1032, 1999).

펩티드 P4에 부착된 세포에서의 Tyr-397 FAK 인산화 수준이 라미닌에 부착된 세포에서보다 낮을지라도, 다른 펩티드들에 부착된 세포에서의 FAK 인산화보다는 훨씬 더 높았다(도 8의 C 참조). 또한, 펩티드 P4에 도말된 세포에서 티로신-577 FAK 인산화 수준이 다른 펩티드들에 도말된 세포에서보다는 조금 높았지만, 라미닌에 도말된 세포에서보다는 여전히 낮았다. 그러나, FAK 티로신-407, -576, 및 -861에서의 이러한 변화들은 유사한 조건에서 조사된 라미닌, rLG3, 또는 다른 펩티드들에서는 관찰되지 않았는데(도 8의 B 참조), 이는 라미닌, rLG3 및 펩티드 P4가 개별적인 인테그린 α3β1-매개 신호 기작들을 활성화시킴을 의미하는 것이다.

펩티드 P4에서 Arg가 Ala로 치환된 합성 펩티드 P4-S2 및 Lys 및 Arg가 모두 Ala로 치환된 합성 펩티드 P4-S3이 대조군인 펩티드 P4와 비교하여 현저하게 세포 부착을 억제하였기 때문에, 본 발명자들은 FAK의 Tyr 인산화에 있어서 펩티드 P4 서열 내 두 개의 염기성 아미노산 잔기의 역할을 규명하기 위하여, 펩티드 P4-S1 내지 P4-S3에 부착하는 HOK-16B 세포내 Tyr-397 및 -577 위치에서의 FAK 인산화 수준을 조사하였다. Lys이 Ala로 치환된 펩티드 P4-S1 상에 도말된 세포들에서 Tyr-397 위치의 FAK 인산화는 펩티드 P4의 경우에서와 유사하였다. 그러나, 펩티드 P4-S2 및 P4-S3 상에 도말된 세포에서의 FAK 인산화는 펩티드 P4에 비하여 현저하게 감소하였다(도 8의 D의 상부 패널). 이와 비슷하게, FAK Tyr-577에서의 이러한 변화가 유사한 조건하에서 펩티드 P4-S1 내지 P4-S3 상에서 관찰되었다(도 8의 D의 하부 패널). 상기 결과들은 세포 부착 활성과 밀접한 관련이 있는 펩티드 P4 내 염기성 잔기인 Arg-1323이 FAK의 Tyr 인산화에 요구됨을 나타내는 것이다.

< 실시예 7> P4 펩티드에 의한 사람 정상 피부 각화세포( NHEK ) 및 피부 섬유모세포 (NHEF)의 세포부착 활성도 측정

<7-1> 사람 정상 피부 각화세포의 준비

사람 정상 피부 각화세포(normal human epidermal keratinocytes, NHEK)는 조직표본을 1 내지 3세 사이 연령의 건강한 사람의 표피(foreskin)조직으로부터 채취하여 준비하였다. 상기 조직표본을 3X 항생제가 함유된 칼슘 및 마그네슘이 포함되지 않은 행크스 균질염 용액(calcium- and magnesium-free Hanks balanced salt solution, CMF-HBSS; GibcoBRL)으로 3회 세척하고, 표피 조직으로부터 상피층을 분리하기 위하여 콜라게나아제(collgenase type II, 1.0 mg/ml; sigma Chemical Co.) 및 디스파아제(dispase grade II, 2.4 mg/ml; Boeringer-Mannheim)를 함유한 CMF-HBSS를 첨가하여 95%의 공기와 5%의 이산화탄소 조건 하에서 37℃, 90분 동안 배양하였다. NHEK는 상기와 같이 분리된 표피 조직으로부터 준비하였으며, 0.15 mM 칼슘과 성장인자(growth factor) 블릿 키트를 포함한 상피세포 배양액(KGM; Clonetics Corp.)에서 세포배양을 시행하였다. 세포의 밀도가 대략 70%가 되었을 때 NHEK를 60-mm 페트리 디쉬 당 1 × 10⁵ 개의 세포수로 분주하였고, 세포 밀도가 대략 70%가 될 때까지 배양하였다. 이와 같이 계대배양(subculture)을 실시하였으며, 2회 계대배양한 NHEK를 사용하였다.

<7-2> 사람 정상 피부 섬유모세포의 준비

사람 정상 피부 섬유모세포(normal human epidermal fibroblasts, NHEF)는 사람 표피(foreskin)조직을 1 내지 3세 사이 연령의 건강한 사람에게서 채취하여 3× 항생제가 함유된 칼슘 및 마그네슘이 포함되지 않은 행크스 균질염 용액(calcium- and magnesium-free Hanks balanced salt solution, CMF-HBSS; GibcoBRL)으로 3회 세척한 다음 체외 배양(explant culture)을 시행하여 준비하였다. 세포의 밀도가 대략 80%가 되었을 때 NHEF를 1:3의 비율로 분주하여 세포밀도가 대략 80%가 될 때까지 배양을 시행하였다. 이와 같이 계대배양(subculture)을 실시하였으며, 4회 계대배양한 NHEF를 사용하였다.

<7-3> 상피 세포와 섬유모세포의 증식 촉진 확인

폴리스티렌(PS), BSA(Bovine serum albumin)(1 mg/ml), 합성 펩티드(P4)(10 μg/well)을 첨가하고 24-웰 플레이트에 12시간 동안 실온에서 건조 코팅(drying coating)시켰다. 펩티드로 코팅이 안된 부위를 차단하기 위하여 각 웰당 0.4 ml의 BSA(1 mg/ml)를 첨가하고 37℃에서 30분간 배양하였다. 피부 각화세포(NKEK)(PD 13.0; 2 × 10⁴ 세포/웰) 및 펩티드 P4(20μg/웰)-코팅된 플레이트에 각각 첨가한 다음 1일, 2일, 3일 또는 4일간 배양하였다. 생존 세포들은 트립판 블루 배제법에 의해 헤마토사이토미터에서 카운트하였다. 데이터는 평균 ±S.D.(n=4)로 나타내었다.

상기 측정 결과에 대하여, 피부 각화세포 및 피부 섬유모세포에 대한 세포 증식에 따른 세포수의 증가 경향을 도 9의 A 및 도 9의 B에 각각 나타내었다. 도 시된 바와 같이 BSA 코팅된 플레이트에서 피부 각화세포 및 피부 섬유모세포의 수가 가장 적었고, PS와 펩티드 P4 코팅된 플레이트에서 세포 증식에 따른 세포수 증가가 비슷하였으나, 피부 각화세포의 경우 PS 플레이트에 비해 펩티드 P4 플레이트에서 피부 각화세포의 세포수가 많이 증가되어 펩티드 P4가 특히 피부 각화 세포의 증식에 유용하다는 점을 확인할 수 있었다.

<7-4> 세포 부착능 측정

직경이 14 mm인 베스키틴 W 부직포(UNITIKA Co., Japan)를 24-웰 플레이트에 넣고, 0.4ml의 BSA(1mg/ml), 비기능성 펩티드(control peptide, P1)(10μg/well), 또는 기능성 펩티드(P4)(10μg/well)을 첨가하고 실온에서 12 시간 건조 코팅(drying coating)시켰다. 베스키틴 W 부직포만을 시험하는 경우에는, 0.4 ml의 인산화된 완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)를 첨가하고 동일하게 처리하였다. 펩티드로 코팅이 안된 부위를 차단시키기 위하여 각 웰당 0.4 ml의 BSA(1 mg/ml)을 첨가하고 37℃에서 30 분간 배양하였다. BSA를 제거하고, PBS로 조심스럽게 세척하였다. 각 웰 당 1 × 10⁵ 세포(0.5 ml)를 분주하고, 95 %의 공기와 5 %의 이산화탄소 조건 하에서 37℃, 60분 동안 배양하였다. 이 때 사용한 배양액은 0.15 mM 칼슘과 성장인자 불릿키트를 포함한 상피세포 배양액(KGM; Clonetics Corp.)이었다. 배양액을 제거하고 PBS로 1 회 조심스럽게 세척한 후 0.4 ml의 10% 포르말린 용액(10% formalin in PBS)을 가하여 실온에서 15 분간 방치시켜 세 포를 고정시켰다. 고정액을 제거하고, PBS로 2회 세척한 후 베스키틴 W 부직포에 부착된 세포를 헤마토실린-에오신 용액(hematoxylin-eosin solution)으로 염색하였다. 염색액을 제거하여 증류수로 3회 조심스럽게 세척한 다음 베스키틴 W 부직포에 부착된 세포의 사진을 촬영하였다. 대표값을 얻기 위하여 키틴 베스키틴 W 부직포를 4 등분하여 각 부위 당 2 부분 총 8 부분을 Olympus BX51 현미경으로 100배의 배율로 사진을 촬영하였다. 평균 백분율과 표준편차는 4번의 독립적인 실험으로부터 계산하였다.

그 결과 도 10에 나타난 바와 같이, 시판되고 있는 인공피부 소재인 베스키틴 W 부직포에 본 발명의 펩티드 P4를 코팅하였을 때 세포부착능이 매우 우수하게 나타나 본 발명의 펩티드 P4가 화상 치료, 창상 치료, 조직재생에 유용하게 이용될 수 있음이 판명되었다.

< 실시예 8> 동물 실험을 통한 펩티드 P4 의 세포 부착 및 퍼짐 활성도 확인

<8-1> 동물 실험

동물 실험을 위하여 무게가 240±10g 인 쥐(Sprague-Dawley Rat)를 이용하였다. 마취 후에, 각 쥐의 등에 척추 컬럼에 평행하도록 두 개의 1cm × 1cm 크기의 사각형으로 상처내었다. 그런 다음, 펩티드 P4-코팅된 베스키틴 W 마이크로 파이버를 각 쥐의 상처에 처리하였다. 동일한 상처에 베스키틴 W 부직포만 처리한 군은 대조군으로 이용되었다. 베스키틴 W 처리 후 3일 또는 7일째 되는 날에 표피화(epithelialization) 및 육아(granulation)의 조직학적 검사를 위해 각 상처를 제 거하였다.

<8-1> 상처의 치유 및 조직학적 검사

조직학적 검사를 위하여 3일째 또는 7일째의 대조군과 펩티드 P4-코팅된 베스키틴 W 마이크로 파이버 실험군의 결과를 현미경으로 확인하였고, 도 11의 A 및 도 11의 B와 같이 각각 ×100 및 ×200 배율의 현미경 사진을 도시하였다.

3일째 또는 7일째의 대조군에서 섬유성 조직 파편이 상처 표면을 덮었고, 그 층의 밑에서 다형핵(polymorphonuclear) 백혈구가 두텁게 침윤(infiltration)하고 섬유모세포(fibroblast)가 증식하는 것을 관찰할 수 있었다. 그러나, 3일째 또는 7일째의 펩티드 P4-코팅된 베스키틴 W 마이크로 파이버 실험군에서는 표면의 조직 파편이 사라졌고, 어린 모세혈관과 섬유모세포가 현저하게 증식하는 것을 확인할 수 있었다.

상기 두 군 모두에서 상처의 표피화는 4주 후에 완전하게 나타났다. 또한, 염증세포(inflammatory cells)가 사라졌고, 결합조직이 두텁게 형성되었다. 그러나, 7일째의 펩티드 P4-코팅된 베스키틴 W 마이크로 파이버 실험군에서 표면 조직 파편이 사라졌으며, 어린 모세관과 섬유모세포이 현저히 증식하였다.

상기와 같은 동물 실험 결과를 통해, 펩티드 P4-코팅된 베스키틴 W 마이크로 파이버 실험군의 초기 단계 치유가 베스키틴 W 마이크로 파이버만을 적용한 대조군보다 더 빠르다는 것을 확인할 수 있었다.

상기에서 전술한 바와 같이, 본 발명의 세포 퍼짐 및 부착에 필수적인 모티프로 작용하는 서열번호 1 또는 세포 부착 및 퍼짐을 촉진하는 서열번호 13으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 펩티드, 그의 단편 또는 그의 유도체를 포함하는 세포 부착 및 퍼짐 촉진 펩티드는 인테그린 α3β1과 특이적으로 결합하여 세포 부착 및 퍼짐을 촉진시킴으로써 라미닌을 포함하는 다양한 세포외기질 단백질(extracellular matrix protein)에 의해 매개되는 세포 부착 활성 연구, 화상 치료, 창상 치료, 조직 재생 및 암전이 억제 등에 유용하게 사용될 수 있다.

<110> MIN, BYUNG-MOO <120> Peptides, fragments and derivatives thereof promoting cell adhesion and spreading <130> 5p-07-12 <160> 15 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LG3 active motif <400> 1 Pro Pro Phe Leu Met Leu Leu Lys Gly Ser Thr Arg 1 5 10 <210> 2 <211> 1713 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Gly Trp Leu Trp Ile Phe Gly Ala Ala Leu Gly Gln Cys Leu Gly 1 5 10 15 Tyr Ser Ser Gln Gln Gln Arg Val Pro Phe Leu Gln Pro Pro Gly Gln 20 25 30 Ser Gln Leu Gln Ala Ser Tyr Val Glu Phe Arg Pro Ser Gln Gly Cys 35 40 45 Ser Pro Gly Tyr Tyr Arg Asp His Lys Gly Leu Tyr Thr Gly Arg Cys 50 55 60 Val Pro Cys Asn Cys Asn Gly His Ser Asn Gln Cys Gln Asp Gly Ser 65 70 75 80 Gly Ile Cys Val Asn Cys Gln His Asn Thr Ala Gly Glu His Cys Glu 85 90 95 Arg Cys Gln Glu Gly Tyr Tyr Gly Asn Ala Val His Gly Ser Cys Arg 100 105 110 Ala Cys Pro Cys Pro His Thr Asn Ser Phe Ala Thr Gly Cys Val Val 115 120 125 Asn Gly Gly Asp Val Arg Cys Ser Cys Lys Ala Gly Tyr Thr Gly Thr 130 135 140 Gln Cys Glu Arg Cys Ala Pro Gly Tyr Phe Gly Asn Pro Gln Lys Phe 145 150 155 160 Gly Gly Ser Cys Gln Pro Cys Ser Cys Asn Ser Asn Gly Gln Leu Gly 165 170 175 Ser Cys His Pro Leu Thr Gly Asp Cys Ile Asn Gln Glu Pro Lys Asp 180 185 190 Ser Ser Pro Ala Glu Glu Cys Asp Asp Cys Asp Ser Cys Val Met Thr 195 200 205 Leu Leu Asn Asp Leu Ala Thr Met Gly Glu Gln Leu Arg Leu Val Lys 210 215 220 Ser Gln Leu Gln Gly Leu Ser Ala Ser Ala Gly Leu Leu Glu Gln Met 225 230 235 240 Arg His Met Glu Thr Gln Ala Lys Asp Leu Arg Asn Gln Leu Leu Asn 245 250 255 Tyr Arg Ser Ala Ile Ser Asn His Gly Ser Lys Ile Glu Gly Leu Glu 260 265 270 Arg Glu Leu Thr Asp Leu Asn Gln Glu Phe Glu Thr Leu Gln Glu Lys 275 280 285 Ala Gln Val Asn Ser Arg Lys Ala Gln Thr Leu Asn Asn Asn Val Asn 290 295 300 Arg Ala Thr Gln Ser Ala Lys Glu Leu Asp Val Lys Ile Lys Asn Val 305 310 315 320 Ile Arg Asn Val His Ile Leu Leu Lys Gln Ile Ser Gly Thr Asp Gly 325 330 335 Glu Gly Asn Asn Val Pro Ser Gly Asp Phe Ser Arg Glu Trp Ala Glu 340 345 350 Ala Gln Arg Met Met Arg Glu Leu Arg Asn Arg Asn Phe Gly Lys His 355 360 365 Leu Arg Glu Ala Glu Ala Asp Lys Arg Glu Ser Gln Leu Leu Leu Asn 370 375 380 Arg Ile Arg Thr Trp Gln Lys Thr His Gln Gly Glu Asn Asn Gly Leu 385 390 395 400 Ala Asn Ser Ile Arg Asp Ser Leu Asn Glu Tyr Glu Ala Lys Leu Ser 405 410 415 Asp Leu Arg Ala Arg Leu Gln Glu Ala Ala Ala Gln Ala Lys Gln Ala 420 425 430 Asn Gly Leu Asn Gln Glu Asn Glu Arg Ala Leu Gly Ala Ile Gln Arg 435 440 445 Gln Val Lys Glu Ile Asn Ser Leu Gln Ser Asp Phe Thr Lys Tyr Leu 450 455 460 Thr Thr Ala Asp Ser Ser Leu Leu Gln Thr Asn Ile Ala Leu Gln Leu 465 470 475 480 Met Glu Lys Ser Gln Lys Glu Tyr Glu Lys Leu Ala Ala Ser Leu Asn 485 490 495 Glu Ala Arg Gln Glu Leu Ser Asp Lys Val Arg Glu Leu Ser Arg Ser 500 505 510 Ala Gly Lys Thr Ser Leu Val Glu Glu Ala Glu Lys His Ala Arg Ser 515 520 525 Leu Gln Glu Leu Ala Lys Gln Leu Glu Glu Ile Lys Arg Asn Ala Ser 530 535 540 Gly Asp Glu Leu Val Arg Cys Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Tyr Glu 545 550 555 560 Asn Ile Leu Asn Ala Ile Lys Ala Ala Glu Asp Ala Ala Asn Arg Ala 565 570 575 Ala Ser Ala Ser Glu Ser Ala Leu Gln Thr Val Ile Lys Glu Asp Leu 580 585 590 Pro Arg Lys Ala Lys Thr Leu Ser Ser Asn Ser Asp Lys Leu Leu Asn 595 600 605 Glu Ala Lys Met Thr Gln Lys Lys Leu Lys Gln Glu Val Ser Pro Ala 610 615 620 Leu Asn Asn Leu Gln Gln Thr Leu Asn Ile Val Thr Val Gln Lys Glu 625 630 635 640 Val Ile Asp Thr Asn Leu Thr Thr Leu Arg Asp Gly Leu His Gly Ile 645 650 655 Gln Arg Gly Asp Ile Asp Ala Met Ile Ser Ser Ala Lys Ser Met Val 660 665 670 Arg Lys Ala Asn Asp Ile Thr Asp Glu Val Leu Asp Gly Leu Asn Pro 675 680 685 Ile Gln Thr Asp Val Glu Arg Ile Lys Asp Thr Tyr Gly Arg Thr Gln 690 695 700 Asn Glu Asp Phe Lys Lys Ala Leu Thr Asp Ala Asp Asn Ser Val Asn 705 710 715 720 Lys Leu Thr Asn Lys Leu Pro Asp Leu Trp Arg Lys Ile Glu Ser Ile 725 730 735 Asn Gln Gln Leu Leu Pro Leu Gly Asn Ile Ser Asp Asn Met Asp Arg 740 745 750 Ile Arg Glu Leu Ile Gln Gln Ala Arg Asp Ala Ala Ser Lys Val Ala 755 760 765 Val Pro Met Arg Phe Asn Gly Lys Ser Gly Val Glu Val Arg Leu Pro 770 775 780 Asn Asp Leu Glu Asp Leu Lys Gly Tyr Thr Ser Leu Ser Leu Phe Leu 785 790 795 800 Gln Arg Pro Asn Ser Arg Glu Asn Gly Gly Thr Glu Asn Met Phe Val 805 810 815 Met Tyr Leu Gly Asn Lys Asp Ala Ser Arg Asp Tyr Ile Gly Met Ala 820 825 830 Val Val Asp Gly Gln Leu Thr Cys Val Tyr Asn Leu Gly Asp Arg Glu 835 840 845 Ala Glu Leu Gln Val Asp Gln Ile Leu Thr Lys Ser Glu Thr Lys Glu 850 855 860 Ala Val Met Asp Arg Val Lys Phe Gln Arg Ile Tyr Gln Phe Ala Arg 865 870 875 880 Leu Asn Tyr Thr Lys Gly Ala Thr Ser Ser Lys Pro Glu Thr Pro Gly 885 890 895 Val Tyr Asp Met Asp Gly Arg Asn Ser Asn Thr Leu Leu Asn Leu Asp 900 905 910 Pro Glu Asn Val Val Phe Tyr Val Gly Gly Tyr Pro Pro Asp Phe Lys 915 920 925 Leu Pro Ser Arg Leu Ser Phe Pro Pro Tyr Lys Gly Cys Ile Glu Leu 930 935 940 Asp Asp Leu Asn Glu Asn Val Leu Ser Leu Tyr Asn Phe Lys Lys Thr 945 950 955 960 Phe Asn Leu Asn Thr Thr Glu Val Glu Pro Cys Arg Arg Arg Lys Glu 965 970 975 Glu Ser Asp Lys Asn Tyr Phe Glu Gly Thr Gly Tyr Ala Arg Val Pro 980 985 990 Thr Gln Pro His Ala Pro Ile Pro Thr Phe Gly Gln Thr Ile Gln Thr 995 1000 1005 Thr Val Asp Arg Gly Leu Leu Phe Phe Ala Glu Asn Gly Asp Arg Phe 1010 1015 1020 Ile Ser Leu Asn Ile Glu Asp Gly Lys Leu Met Val Arg Tyr Lys Leu 1025 1030 1035 1040 Asn Ser Glu Leu Pro Lys Glu Arg Gly Val Gly Asp Ala Ile Asn Asn 1045 1050 1055 Gly Arg Asp His Ser Ile Gln Ile Lys Ile Gly Lys Leu Gln Lys Arg 1060 1065 1070 Met Trp Ile Asn Val Asp Val Gln Asn Thr Ile Ile Asp Gly Glu Val 1075 1080 1085 Phe Asp Phe Ser Thr Tyr Tyr Leu Gly Gly Ile Pro Ile Ala Ile Arg 1090 1095 1100 Glu Arg Phe Asn Ile Ser Thr Pro Ala Phe Arg Gly Cys Met Lys Asn 1105 1110 1115 1120 Leu Lys Lys Thr Ser Gly Val Val Arg Leu Asn Asp Thr Val Gly Val 1125 1130 1135 Thr Lys Lys Cys Ser Glu Asp Trp Lys Leu Val Arg Ser Ala Ser Phe 1140 1145 1150 Ser Arg Gly Gly Gln Leu Ser Phe Thr Asp Leu Gly Leu Pro Pro Thr 1155 1160 1165 Asp His Leu Gln Ala Ser Phe Gly Phe Gln Thr Phe Gln Pro Ser Gly 1170 1175 1180 Ile Leu Leu Asp His Gln Thr Trp Thr Arg Asn Leu Gln Val Thr Leu 1185 1190 1195 1200 Glu Asp Gly Tyr Ile Glu Leu Ser Thr Ser Asp Ser Gly Gly Pro Ile 1205 1210 1215 Phe Lys Ser Pro Gln Thr Tyr Met Asp Gly Leu Leu His Tyr Val Ser 1220 1225 1230 Val Ile Ser Asp Asn Ser Gly Leu Arg Leu Leu Ile Asp Asp Gln Leu 1235 1240 1245 Leu Arg Asn Ser Lys Arg Leu Lys His Ile Ser Ser Ser Arg Gln Ser 1250 1255 1260 Leu Arg Leu Gly Gly Ser Asn Phe Glu Gly Cys Ile Ser Asn Val Phe 1265 1270 1275 1280 Val Gln Arg Leu Ser Leu Ser Pro Glu Val Leu Asp Leu Thr Ser Asn 1285 1290 1295 Ser Leu Lys Arg Asp Val Ser Leu Gly Gly Cys Ser Leu Asn Lys Pro 1300 1305 1310 Pro Phe Leu Met Leu Leu Lys Gly Ser Thr Arg Phe Asn Lys Thr Lys 1315 1320 1325 Thr Phe Arg Ile Asn Gln Leu Leu Gln Asp Thr Pro Val Ala Ser Pro 1330 1335 1340 Arg Ser Val Lys Val Trp Gln Asp Ala Cys Ser Pro Leu Pro Lys Thr 1345 1350 1355 1360 Gln Ala Asn His Gly Ala Leu Gln Phe Gly Asp Ile Pro Thr Ser His 1365 1370 1375 Leu Leu Phe Lys Leu Pro Gln Glu Leu Leu Lys Pro Arg Ser Gln Phe 1380 1385 1390 Ala Val Asp Met Gln Thr Thr Ser Ser Arg Gly Leu Val Phe His Thr 1395 1400 1405 Gly Thr Lys Asn Ser Phe Met Ala Leu Tyr Leu Ser Lys Gly Arg Leu 1410 1415 1420 Val Phe Ala Leu Gly Thr Asp Gly Lys Lys Leu Arg Ile Lys Ser Lys 1425 1430 1435 1440 Glu Lys Cys Asn Asp Gly Lys Trp His Thr Val Val Phe Gly His Asp 1445 1450 1455 Gly Glu Lys Gly Arg Leu Val Val Asp Gly Leu Arg Ala Arg Glu Gly 1460 1465 1470 Ser Leu Pro Gly Asn Ser Thr Ile Ser Ile Arg Ala Pro Val Tyr Leu 1475 1480 1485 Gly Ser Pro Pro Ser Gly Lys Pro Lys Ser Leu Pro Thr Asn Ser Phe 1490 1495 1500 Val Gly Cys Leu Lys Asn Phe Gln Leu Asp Ser Lys Pro Leu Tyr Thr 1505 1510 1515 1520 Pro Ser Ser Ser Phe Gly Val Ser Ser Cys Leu Gly Gly Pro Leu Glu 1525 1530 1535 Lys Gly Ile Tyr Phe Ser Glu Glu Gly Gly His Val Val Leu Ala His 1540 1545 1550 Ser Val Leu Leu Gly Pro Glu Phe Lys Leu Val Phe Ser Ile Arg Pro 1555 1560 1565 Arg Ser Leu Thr Gly Ile Leu Ile His Ile Gly Ser Gln Pro Gly Lys 1570 1575 1580 His Leu Cys Val Tyr Leu Glu Ala Gly Lys Val Thr Ala Ser Met Asp 1585 1590 1595 1600 Ser Gly Ala Gly Gly Thr Ser Thr Ser Val Thr Pro Lys Gln Ser Leu 1605 1610 1615 Cys Asp Gly Gln Trp His Ser Val Ala Val Thr Ile Lys Gln His Ile 1620 1625 1630 Leu His Leu Glu Leu Asp Thr Asp Ser Ser Tyr Thr Ala Gly Gln Ile 1635 1640 1645 Pro Phe Pro Pro Ala Ser Thr Gln Glu Pro Leu His Leu Gly Gly Ala 1650 1655 1660 Pro Ala Asn Leu Thr Thr Leu Arg Ile Pro Val Trp Lys Ser Phe Phe 1665 1670 1675 1680 Gly Cys Leu Arg Asn Ile His Val Asn His Ile Pro Val Pro Val Thr 1685 1690 1695 Glu Ala Leu Glu Val Gln Gly Pro Val Ser Leu Asn Gly Cys Pro Asp 1700 1705 1710 Gln <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LG1s <400> 3 tccgactgcc aaatgacc 18 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LG1a <400> 4 ctgactcttc cttcctcctt ctac 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LG2s <400> 5 aaaaacattc aatctcaaca caac 24 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LG2a <400> 6 gatcgcacaa gcttccagtc t 21 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LG3s <400> 7 tcgttagatt gaatgatact gtgg 24 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LG3a <400> 8 catgattggc ctgggtctt 19 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LG4s <400> 9 agatgcttgc tcaccacttc c 21 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LG4a <400> 10 caatacagag tgagccaaga cgac 24 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LG5s <400> 11 ttcttcaagc ttcggggtgt c 21 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LG5a <400> 12 tgctgtgaaa taggcttggg ttac 24 <210> 13 <211> 311 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LG3-His6 <400> 13 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr 1 5 10 15 Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu Thr Asp Asp Asp Asp Lys Asp 20 25 30 Pro Ser Ser Arg Ser Ala Ala Gly Thr Met Glu Phe Asp Phe Val Arg 35 40 45 Leu Asn Asp Thr Val Gly Val Thr Lys Lys Cys Ser Glu Asp Trp Lys 50 55 60 Leu Val Arg Ser Ala Ser Phe Ser Arg Gly Gly Gln Leu Ser Phe Thr 65 70 75 80 Asp Leu Gly Leu Pro Pro Thr Asp His Leu Gln Ala Ser Phe Gly Phe 85 90 95 Gln Thr Phe Gln Pro Ser Gly Ile Leu Leu Asp His Gln Thr Trp Thr 100 105 110 Arg Asn Leu Gln Val Thr Leu Glu Asp Gly Tyr Ile Glu Leu Ser Thr 115 120 125 Ser Asp Ser Gly Gly Pro Ile Phe Lys Ser Pro Gln Thr Tyr Met Asp 130 135 140 Gly Leu Leu His Tyr Val Ser Val Ile Ser Asp Asn Ser Gly Leu Arg 145 150 155 160 Leu Leu Ile Asp Asp Gln Leu Leu Arg Asn Ser Lys Arg Leu Lys His 165 170 175 Ile Ser Ser Ser Arg Gln Ser Leu Arg Leu Gly Gly Ser Asn Phe Glu 180 185 190 Gly Cys Ile Ser Asn Val Phe Val Gln Arg Leu Ser Leu Ser Pro Glu 195 200 205 Val Leu Asp Leu Thr Ser Asn Ser Leu Lys Arg Asp Val Ser Leu Gly 210 215 220 Gly Cys Ser Leu Asn Lys Pro Pro Phe Leu Met Leu Leu Lys Gly Ser 225 230 235 240 Thr Arg Phe Asn Lys Thr Lys Thr Phe Arg Ile Asn Gln Leu Leu Gln 245 250 255 Asp Thr Pro Val Ala Ser Pro Arg Ser Val Lys Val Trp Gln Asp Ala 260 265 270 Cys Ser Pro Leu Pro Lys Thr Gln Ala Asn His Glu Ser Leu Val Asn 275 280 285 Ser Leu Leu Asp Pro Ala Ala Asn Lys Ala Arg Lys Val Ala Glu Leu 290 295 300 Ala Ala Ala Thr Ala Glu Gln 305 310 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> proline-deleted LG3 active motif <400> 14 Pro Phe Leu Met Leu Leu Lys Gly Ser Thr Arg 1 5 10 <210> 15 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lys-Ala substituted LG3 active motif <400> 15 Pro Pro Phe Leu Met Leu Leu Ala Gly Ser Thr Arg 1 5 10

Claims (11)

1. 세포 퍼짐 및 부착에 필수적인 모티프로 작용하는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 펩티드, 그의 단편 및 그의 유도체로 구성되는 군으로부터 선택되는 세포 부착 및 퍼짐 촉진 펩티드.
2. 제 1항에 있어서, 상기 유도체는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열에서 12번째 아르기닌(Arg) 잔기가 보존적으로 포함되는 것을 특징으로 하는 세포 부착 및 퍼짐 촉진 펩티드.
3. 제 1항에 있어서, 상기 유도체는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열에서 1번째 또는 2번째 프롤린(Pro) 잔기가 보존적으로 포함되는 것을 특징으로 하는 세포 부착 및 퍼짐 촉진 펩티드.
4. 제 1항에 있어서, 상기 유도체는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열에서 8번째 라이신(Lys)이 알라닌(Ala)으로 치환된 서열번호 15로 기재되는 P4-S1인 것을 특징으로 하는 세포 부착 및 퍼짐 촉진 펩티드.
5. 제 1항에 있어서, 상기 단편은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열에서 1번째 또는 2번째 프롤린(Pro) 잔기가 결실된 서열번호 14로 기재되는 P4-D-N1인 것을 특징으로 하는 세포 부착 및 퍼짐 촉진 펩티드.
6. 제 1항에 있어서, 인테그린 α3β1을 통하여 세포부착 및 퍼짐을 촉진하는 것을 특징으로 하는 펩티드.
7. 세포 부착 및 퍼짐을 촉진하는 서열번호 13으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 펩티드, 그의 단편 및 그의 유도체로 구성되는 군으로부터 선택되는 세포 부착 및 퍼짐 촉진 펩티드.
8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 세포 부착 및 퍼짐 촉진 펩티드 서열을 포함하는 세포 부착 및 퍼짐 촉진 활성을 갖는 단백질.
9. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 세포 부착 및 퍼짐 촉진 펩티드 또는 제 8항의 단백질을 유효성분으로 함유하는 화상 치료, 창상 치료, 조직 재생 또는 암 전이 억제용 조성물.
10. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 세포 부착 및 퍼짐 촉진 펩티드 또는 제 8항의 단백질을 유효성분으로 함유하는 화상 치료용 또는 창상 치료용 피복재.
11. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 세포 부착 및 퍼짐 촉진 펩티드 또는 제 8항의 단백질을 유효성분으로 함유하는 조직공학용 지지체.

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