CN100513418C - 促进细胞粘附和扩散的肽、其片段和衍生物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种可促进细胞的粘附性和扩散性的肽,以及其片段和衍生物,更具体来说,涉及可介导整合素α3β1的结合以及细胞的粘附和扩散、并在人层粘蛋白-5α3链LG3结构域中的整合素-α3β1-依赖性肽,以及其片段和衍生物。本发明的肽、以及其片段和衍生物可有效地用在有关通过各种胞外基质蛋白,包括层粘连蛋白,介导的有关细胞粘附活性、损伤治疗、组织再生、抑制癌症转移等的研究中。
Description
技术领域
本发明涉及可介导细胞粘附和扩散的人层粘连蛋白-5 α3链LG3结构域中的整合素-α3β1-依赖性肽,其片段和衍生物。
背景技术
层粘连蛋白是一个胞外基质蛋白家族,其主要位于基底膜中,可通过与细胞表面上的特异性整合素或其它受体的相互作用来调控多种细胞功能,如粘附、移动、生长、分化、损伤愈合、以及肿瘤入侵(Timpl,R.,Curr.Opin.Cell Biol.8:618,1996;Howe,A.等,Curr.Opin.Cell Biol.,10:220,1998;Colognato,H.和Yurchenco,P.D.,Dev.Dyn.,218:213,2000)。层粘连蛋白由三种不同的亚单元构成(α、β和γ链),它们通过二硫键形成交叉型结构(Ekblom,M.等,Ann.N.Y.Acad.Sci.,857:194,1998)。迄今为止,已经鉴别出5α、3β和3γ链,通过这些亚单元的各种组合形成了至少15种同种型(层粘连蛋白1-15)(Colognato,H.和Yurchenco,P.D.,Dev.Dyn.,218:213,2000;Burgeson,R.E.等,Matrix Biol.,14:209,1994;Miner,J.H.等.,J.Cell Biol.,137:685,1997)。在这些层粘连蛋白的同种型中,由α3、β3和γ2链构成的同种型——层粘连蛋白-5具有独特的结构和生物学活性。层粘连蛋白-5最初被鉴定为一种角化细胞衍生的基质蛋白(Carter,W.G.等.,Cell,65:599,1991),但不像其它的同种型,它缺乏存在于三个亚单元的N-末端区域的一些结构域(Aumailley,M.和Rousselle,P.,Matrix Biol.,18:19,1999)。层粘连蛋白-5前体(460kDa)在角化细胞中进行加工。分泌该前体,之后通过蛋白水解将α3链(200kDa)和γ2链(155kDa)分别转化成165和105kDa(Marinkovich,M.P.等.,J.Biol.Chem.,267:17900,1992;Rousselle,P.等,J.Cell Biol.,114:567,1991)。
层粘连蛋白-5可调控上皮细胞与下面的结缔组织的稳定粘附性(Marinkovich,M.P.等,J.Biol.Chem.,267:17900,1992;Rousselle,P.等,J.Cell Biol.,114:567,1991;Niessen,C.M.等,Exp.Cell.Res.,211:360,1994),并通过与细胞表面受体,如整合素α3β1和α6β4的相互作用而影响细胞的行为(Carter,W.G.等,Cell,65:599,1991;Rousselle,P.等,J.Cell Biol.,114:567,1991;Niessen,C.M.等,Exp.Cell.Res.,211:360,1994;Rousselle,P.和Aumailley,M.,J.Cell Biol.,125:205,1994)。在正常人的角化细胞中表达的整合素当中,整合素α3β1参与了焦点粘连的形成,其与含肌动蛋白的紧张纤维以及角化细胞移动性的介导有关(DiPersio,C.M.等,J.CellSci.,108:2321,1995;Zhang,K.和Kramer,R.H.,Exp.Cell.Res.,227:309,1996)。整合素α6β4构成了上皮细胞的半桥粒结构,可介导上皮细胞的粘附、移动、和损伤愈合,并且参与了癌细胞的入侵(Niessen,C.M.等,Exp.Cell,Res.,211:360,1994;Mercurio,A.M.等,Curr.Opin.Cell Biol.,13:541,2001)。层粘连蛋白-5或整合素α6β4的突变可造成Herlitz型交界性大疱性表皮松解症,其特征是表皮/真皮交界的分裂(Aberdam,D.等,Nat.Genet.,6:299,1994;Korge,B.P.和Krieg,T.,J.Mol.Med.,74:59,1996)。
除了层粘连蛋白-5之外,层粘连蛋白α3链还发现存在于层粘连蛋白-6(α3β1γ1),层粘连蛋白-7(α3β2γ1)以及层粘连蛋白-13(α3β2γ3)中,然而层粘连蛋白β3和γ2链仅发现存在于层粘连蛋白-5中。层粘连蛋白α3链含有由五个球形模块LG1-LG5构成的C末端球形结构域,每个长度上约有200个氨基酸残基(Talts,J.F.等,FEBS Lett.,426:71,1998;Timple,R.等,Matrix Biol.,19:309,2000)。利用了各种层粘连蛋白同种型的图谱研究已经绘制出了对层粘连蛋白α链的球形结构域的整合素依赖性细胞粘附位点的位置图谱(Baker,S.E.等,J.Cell Sci.,109:2509,1996;Hirosaki,T.等,J.Biol.Chem.,275:22495,2000)。α3链中的C末端LG3结构域对于层粘连蛋白-5的独特活性来说是必要的。鼠类中的重组型LG3(rLG3)结构域和人类严重缺失LG结构域的重组层粘连蛋白-5的蛋白质通过与整合素α3β1的相互作用促进了细胞的粘附性和移动性(Hirosaki,T.等,J.Biol.Chem.,275:22495,2000;Shang,M.等,J.Biol.Chem.,276:33045,2000)。有关人层粘连蛋白α3链的rLG蛋白的研究表明,LG2结构域含有整合素α3β1结合位点,而LG4和LG5结构域与肝素硫酸糖蛋白有微弱的相互作用(Mizushima,H.等,Cell Growth Differ.,8:979,1997)。此外,尽管层粘连蛋白α3链的LG4-LG5片段本身不表现出活性,但其在成熟层粘连蛋白-5存在的情况下刺激了细胞的移动性,这表明其在细胞移动中起着调控的作用(Tsubota,Y.等,Biochem.Biophys.Res.Commun.,278:614,2000)。然而,利用rLG结构域片段并没有重现上述整合素依赖性细胞粘附在人层粘连蛋白α3链LG3结构域中的直接证明,这可能是由于难以表达可溶性LG蛋白的缘故。
同时人们已知,层粘连蛋白的主要粘附位点位于层粘连蛋白α链的C末端LG结构域区域。层粘连蛋白α链的多个LG结构域已被证明介导了细胞的粘附和移动,并与肝素、α-肌萎缩蛋白聚糖、连接素、以及整合素相结合(Howe,A.等,Curr.Opin.Cell Biol.,10:220,1998)。尽管已经证明人层粘连蛋白-5的α3链的LG3结构域对于通过层粘连蛋白-5来促进细胞粘附性和移动性来说是必须的(Hirosaki,T.等,J.Biol.Chem.,275:22495,2000),但还没有进一步关于LG3结构域中生物学功能和整合素结合的活性位点的报道。
因此,为了弄清人层粘连蛋白-5的α3链LG结构域的功能并进一步确定生物学活性中心的序列,本发明者制备了以单体可溶性融合蛋白和层粘连蛋白-5的α3链LG3结构域内的合成肽形式表达的重组人层粘连蛋白-5的α3链LG结构域,并检测了其细胞粘附和扩散活性。结果,本发明者证实,人层粘连蛋白-5的α3链LG3结构域通过用作整合素α3β1的配体而促进了细胞的粘附和扩散活性,并且LG3结构域内SEQ ID:1的基序PPFLMLLKGSTR(1312-1323残基)、其片段和衍生物作为整合素α3β1结合的活性位点对于细胞粘附和扩散活性来说很重要,并且表现出对Beschitin W微纤维有极佳的粘附活性,因此可用于损伤治疗或组织再生中,从而完成本发明。
发明公开内容
本发明的一个主要目的在于鉴别介导细胞粘附和扩散以及整合素结合的人层粘连蛋白-5的α3链中的活性结构域,并提供一种通过特异性地结合该结构域中的整合素而起到促进细胞粘附和扩散活性的必要基序功能的肽、其片段和衍生物,以及其应用。
为实现上述目标,本发明提供了一种具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的肽,及其片段或衍生物,其可介导细胞粘附和扩散并起到细胞粘附和扩散的必要基序的作用。
此外,本发明提供了一种具有氨基酸序列SEQ ID NO:13的肽(rLG-His6),其可促进细胞的粘附和扩散,或其衍生物。
在本发明中,制备了五个单独表达的重组LG蛋白(rLG1到rLG5)来识别介导细胞粘附和扩散以及整合素结合的人层粘连蛋白-5的α3链中的活性结构域。
根据本发明制备的rLG蛋白当中,rLG1含有SEQ ID NO:2的人层粘连蛋白α3链氨基酸序列中的782-978个残基,而rLG2、rLG3、rLG4和rLG5分别含有959-1148个残基、1128-1364个残基、1352-1555个残基和1522-1713个残基。此外,rLG蛋白表达成为C末端连接有六个组氨酸标签作为检测探针的融合蛋白的形式,从而有助于其纯化(图1A和1B)。
制备含有编码各LG结构域的DNA序列和编码各检测探针的DNA序列的cDNA片段,然后制备插入该cDNA片段的表达载体。将该表达载体转化到E.coli中以获得转化体和表达在获得的转化体中的蛋白质重组体,接着利用检测探针从表达蛋白中纯化rLG1到rLG5(图1C)。
由从E.coli转化体中分离/纯化的rLG1到rLG5的细胞粘附和扩散活性的测定结果,在五种rLG蛋白当中只有rLG3蛋白表现出细胞粘附活性(图2A-2C),而HOK-16B细胞对rLG3的粘附是计量依赖性的,在25μg/ml的涂覆浓度下出现最大的粘附量。在涂覆rLG3的板中,47%的HOK-16B细胞表现出扩散形态;也就是说,它们呈现出扁平、多边形形状,具有类似丝状伪足和板状伪足的延伸部分(图2D)。这些结果说明rLG3蛋白表现出类似于其亲代分子层粘连蛋白-5的功能特性,这是因为其支持细胞的粘附和扩散。此外,LG3结构域介导的细胞粘附和扩散通过整合素α3β1介导,这表明整合素α3β1是人角化细胞中层粘连蛋白的主要受体,并且层粘连蛋白是角化细胞粘附和扩散活性的重要配体。
为了识别赋予层粘连蛋白α3链LG3结构域的细胞粘附活性必需的氨基酸残基,可合成覆盖了来自合成的LG3结构域的1293-1332氨基酸残基的五个重叠的12肽(P1-P5)(图3)。在上述这些合成肽当中,P1含有氨基酸序列SEQ ID NO:2中的1293-1304残基,P2含有相应于1297-1308残基的氨基酸序列,P3含有相应于1305-1316残基的氨基酸序列,P4含有相应于1312-1323残基的氨基酸序列,以及P5含有相应于1321-1332残基的氨基酸序列。由合成肽的细胞粘附和扩散活性的检测结果,具有SEQ ID NO:1中PPFLMLLKGSTR序列的肽P4表现出类似于rLG3的强计量依赖性细胞粘附性和扩散活性(图4A-4C)。
本发明者发现肽P4的细胞扩散活性类似于rLG3,并检测了肽P4与LG3结构域竞争细胞粘附活性的能力。结果,肽P4抑制了rLG3的大约51%的细胞粘附活性,但是其它的肽在HOK-16B细胞与100μg/ml肽预培养30min时没有表现出粘附活性的降低(图4D)。这些结果表明肽P4序列起着在完整的层粘连蛋白-5α3链LG结构域中的细胞结合位点的作用。
此外,发现的表现出细胞粘附和扩散性的rLG3蛋白和肽P4可被α3和β1亚单元的抗体特异性抑制(图5B和5C),这表明整合素α3β1同时是HOK-16B细胞中rLG3蛋白和肽P4的特异性功能受体。
为了确定出具有SEQ ID NO:1的肽P4中的生物学活性中心序列,其已被识别能促进强细胞粘附和扩散活性以及与整合素α3β1的结合,可制备五种从肽P4上截去了C末端的合成肽(P4D-I到D-V),以及六种从肽P4上截去了N末端的合成肽(P4D-N1,到P4D-N6)(图6A)。对C末端截短肽和N末端截短肽的细胞粘附和扩散活性进行检测的结果是,去掉肽P4中C末端Arg残基的肽P4D-I表现出比肽P4对照品显著降低的细胞粘附和扩散活性(图6B-6D),而去掉肽P4中N末端两个Pro残基的肽P4D-N2表现出比肽P4对照品显著降低的细胞粘附和扩散活性(图6C-6D)。
因此,证明去除肽P4中C末端Arg残基和去除N末端两个Pro残基都显著降低了细胞的粘附和扩散活性。然而,去掉肽P4中N末端两个Pro残基之一的肽P4D-N1在细胞粘附和扩散活性上并没有表现出很大的改变。这表明肽P4中去掉了两个N末端Pro残基之一的肽P4片段也可用作促进细胞粘附和扩散性的肽。
因此,为了证实两个基本氨基酸残基Arg和Lys在SEQ ID NO:1的肽P4序列中的作用,通过Ala同时/分别取代肽P4序列(P4-S1和P4-S3,图7A)中的Lys1319和Arg1323,本发明者测定了其细胞粘附和扩散活性。结果,与肽P4对照品相比,Ala取代Arg时细胞粘附和扩散性被肽P4-S2显著地抑制,Ala取代Lys和Arg时其被肽P4-S3显著地抑制。然而当Ala取代Lys时这些活性并未受到肽P4-S1的影响(图7B和7C)。因此,肽P4中的基本残基Arg对于细胞粘附活性来说很重要。这些结果表明,层粘连蛋白-5α3链LG3结构域内PPFLMLLKGSTR序列(残基1312-1323)是负责细胞粘附和扩散性以及整合素α3β1结合的活性基序。
同时,为了测定由LG3结构域或肽P4介导的信号通道,可检测位于rLG3或肽P4板上的HOK-16B细胞中的FAK磷酸化水平。结果,在涂覆有层粘连蛋白板上的HOK-16B细胞中FAK磷酸化程度明显高于位于未涂覆有层粘连蛋白的板上或者保持在悬液中的HOK-16B细胞中的程度(图8A)。此外,检测在涂覆有层粘连蛋白、rLG3或肽P1-P5的板上培养的HOK-16B细胞中,Tyr-397、-407、-576、-577和-861处的FAK磷酸化程度。结果,在涂覆有层粘连蛋白或rLG3的板上培养的HOK-16B细胞中,Tyr-397处FAK磷酸化程度与未处理的对照品相比增加了16.2和8.2倍(图8B)。
同样,通过肽P4,正常人表皮角化细胞(NHEK)和正常人表皮成纤维细胞(NHEF)通过细胞增殖形成的数目增量很明显,尤其在NHEK中(图9A和9B中),细胞粘附和扩散活性的检测结果是,涂覆有肽P4的不滑几丁质(beschitin W)微纤维中粘附细胞和扩散细胞数目多于其它对照品中的数目(图10A-10C)。
通过这些结果证实了,不同于人层粘连蛋白-5α3链的LG1、LG2、LG4和LG5结构域,LG3结构域对于层粘连蛋白-5以整合素α3β1依赖性的方式促进细胞粘附和扩散来说是必需的。而且,层粘连蛋白-5α3链的人LG3结构域内PPFLMLLKGSTR序列(SEQ ID NO:2的残基1312-1323)是能够支持整合素α3β1依赖性细胞扩散的活性基序。
同样,作为粘附到rLG3蛋白和SEQ ID NO:1的PPFLMLLKGSTR序列的结果,Tyr-397和-577处的FAK磷酸化水平增加,这成为首先证明LG3结构域内SEQ ID NO:1的PPFLMLLKGSTR是能够支持整合素α3β1依赖性细胞扩散的新型基序的报道。
因此,根据本发明的人层粘连蛋白-5α3重组LG3结构域和SEQ IDNO:1的肽、其片段或衍生物可以取代层粘连蛋白-5,用于有关细胞粘附活性、损伤治疗、组织再生、抑制癌症转移、组织工程以及其它治疗应用的研究中。
因此,本发明提供了用于损伤治疗、烧伤治疗、组织再生或抑制癌细胞转移的药物组合物,其中含有在人层粘连蛋白-5α3重组LG3结构域具有SEQ ID NO:1序列的肽、其片段或衍生物以作为有效成分。
在本发明中,所述衍生物在第12位具有保守的Arg或者在第一或第二位具有保守的Pro。
在本发明中,衍生物为P4-S1,其中SEQ ID NO:1的第八位Lys由A1a取代,所述片段为P4D-N1,其中缺失了第一个Pro或第二个Pro中的任意一个。
在本发明中,“片段”指从具有有效活性的肽上去除了一个或多个氨基酸,但具有与所述肽相同或相似的活性的那些肽。
在本发明中,“衍生物”指在具有有效活性的肽上取代了一个或多个氨基酸,但具有与所述肽相同或相似的活性的那些肽。
在临床给药时,本发明药物组合物的有效成分可以通过肠外注射给药,并且可以以常见药物制剂的形式使用。也就是说,本发明的肽、其片段或衍生物可以通过各种肠外注射配方来给药。在药物制剂的情况下,可利用通用的稀释剂,如填料、添加剂、粘合剂、润湿剂、崩散剂和表面活性剂或赋形剂来制备。用于肠外注射给药的药物制剂包括蒸馏水、非水溶性溶剂、悬液、乳化剂、冻干剂。植物油,例如丙二醇、聚乙二醇、橄榄油和油酸乙酯可用作非水溶性溶剂和悬液。
此外,肽、其片段或衍生物可通过与载体,如可用作药物的生理盐溶液或有机溶剂相混合来使用。为提高肽的稳定性或吸收性,碳水化合物如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖,抗氧化剂如抗坏血酸或谷胱甘肽,螯和剂,低分子蛋白或者其它可用作药物的稳定剂。
在本发明的药物组合物中,给患者的总有效剂量的用药可通过丸剂型单剂量或在较短时间内注射,也可以通过分次治疗的方法长时间地多次剂量地给药。为达到有效剂量,肽的浓度通过考虑各种因子素而确定,例如给药的涂径、治疗频率、以及患者的年龄和健康状况。因此,本领域技术人员能够根据作为肽药物组合物的特定应用来确定适当的有效肽剂量。
本发明还提供了伤口覆盖材料和用于组织工程的支架,包括在人层粘连蛋白-5α3重组LG3结构域具有SEQ ID NO:1氨基酸序列的肽、其片段或衍生物。
皮肤是一种重要的组织,其具有保护身体不受外界刺激并防止水从体内散失的功能。当皮肤受到由于烧伤或各种外部损伤造成的伤害时,就丧失了保护功能,这就引起了疾病,并且由于副作用和来自外界的细菌感染的缘故很难进行治疗,而且还会引起其它的副作用,如次级功能障碍或损伤。因此,为了快速治疗损伤并减小各种次级副作用,损伤治疗必须采用适当的覆盖材料来实施。
伤口覆盖材料可保护由于皮肤损伤造成的伤口并且促进皮肤组织的再生,它是越来越多的皮肤损伤患者的重要医疗物品之一。当治疗大面积烧伤时,将损伤组织从烧伤区域去除,留下的烧伤区域在最终的自体移植之前用临时性烧伤覆盖材料覆盖。临时性烧伤覆盖材料应当具有一些治疗功能。首先,它们具有防止外界微生物入侵造成的感染以及体内水、盐份和蛋白质损失的遮挡物作用。其次,它们通过促进伤口愈合而帮助伤口的净化和再生。第三,它们可减轻疼痛。
因此,理想的伤口覆盖材料甚至能够帮助损伤皮肤细胞的再生以及具有这些功能的损伤治疗。
根据本发明用于组织工程的支架包括所有可用于组织工程领域的支架,用以通过活体组织替代物移植来保持、提高或恢复身体功能。这些用于组织工程支架包括通过合成可生物降解的高分子化合物制成的多孔支架,所述高分子化合物例如聚氨基酸、聚酸酐、聚-ε己内酯、聚原酸酯、聚羟基酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、其共聚物,如聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA),以及天然可生物降解的高分子化合物,如海藻酸、壳聚糖、highalginic acid以及胶原蛋白。用于组织工程的支架可包括遮蔽物,如多孔聚乳酸遮蔽物、由甲壳素或壳聚糖纳米纤维制成的再生膜、或者由甲壳素或壳聚糖制成的膜形遮蔽物,但不仅限于此。
在层粘连蛋白-5α3重组LG3结构域含有SEQ ID NO:1氨基酸序列的本发明的肽、其片段或衍生物具有极佳的细胞粘附和扩散活性。预计含有所述肽、其片段和衍生物的损伤覆盖材料具有极佳的功能。涂覆有本发明的肽P4的不滑几丁质(Beschitin W)微纤维,是一种市场上可买到的人工皮肤材料,由于表现出极佳的细胞粘附活性而证实了这些功能。
通过以下的详细说明和所附权利要求,本发明的上述以及其它的特征和实施例将更加完整清楚。
附图简要说明
图1A表示层粘连蛋白-5α3链结构域及其重组蛋白的示意图;
图1B表示层粘连蛋白-5α3链结构域中的重组LG蛋白(rLG1-rLG5)的示意图,以His6-标签融合蛋白的形式表达;
图1C是通过SDS-PAGE纯化层粘连蛋白-5α3链结构域中重组LG蛋白的结果;
图2A是表示人层粘连蛋白-5α3链结构域中重组LG蛋白的细胞粘附活性与人胎盘层粘连蛋白(LN)的细胞粘附活性之间的比较图;
图2B是表示对重组LG蛋白的浓度对细胞粘附活性的影响的检测结果图表。
图2C表示了对重组LG蛋白的细胞粘附活性以及HOK-16B细胞中粘附细胞数目的测量结果;
图2D表示了HOK-16B细胞中重组LG蛋白的细胞扩散活性的测量结果;
图3表示了人、大鼠、小鼠和狗的层粘连蛋白α3LG3结构域部分的氨基酸序列之间的比较,箭头表示合成肽的位点;
图4A表示根据浓度变化对来自于人层粘连蛋白-5α3的LG3结构域的合成肽(P1-P5)细胞粘附活性的测定结果;
图4B表示对合成肽的细胞粘附活性以及HOK-16B细胞中粘附细胞数目的测定结果;
图4C表示HOK-16细胞中合成肽的细胞扩散活性测定结果;
图4D是表示预培养的HOK-16B细胞与合成肽对HOK-16B细胞粘附人层粘连蛋白-5α3链结构域中重组LG的抑制效果检测结果图;
图5A表示了对HOK-16B细胞上的整合素亚单元流式细胞计数的结果;
图5B表示了通过整合素α3β1的抗体对人层粘连蛋白-5α3链中的重组LG3蛋白的细胞粘附活性抑制;
图5C表示了通过整合素α3β1的抗体对来自人层粘连蛋白-5α3链LG3结构域的合成肽P4的细胞粘附活性抑制;
图6A表示了来自人层粘连蛋白-5α3链LG3结构域的合成肽P4的C末端截短肽(P4 D-1—P4 D-5)和N末端截短肽(P4 D-N1—P4 D-N6)的氨基酸序列;
图6B是表示BSA(牛血清白蛋白)对照品和C末端截短肽(P4 D-I,P4 D-III和P4 D-V)的细胞粘附活性图;
图6C是表示粘附到BSA(牛血清白蛋白)对照品、C末端截短肽(P4D-I,P4 D-III和P4 D-V)以及N末端截短肽(P4 D-N2、P4 D-N2和P4D-N6)的细胞数目图;
图6D是表示BSA(牛血清白蛋白)对照品、C末端截短肽(P4 D-I,P4 D-III和P4 D-V)以及N末端截短肽(P4 D-N2、P4 D-N2和P4 D-N6)的细胞扩散活性图;
图7A表示了肽P4的A1a取代肽(P4-S1—P4-S-3)的氨基酸序列;
图7B和7C是表示A1a取代肽的细胞粘附活性和扩散活性的图表;
图8A表示了通过免疫印记分析得到的层粘连蛋白在酪氨酸-397处FAK磷酸化的效果;
图8B表示了通过免疫印记分析得到的人层粘连蛋白-5α3重组LG3蛋白在各种酪氨酸位点处FAK磷酸化的效果;
图8C表示了通过免疫印记分析得到的来自人层粘连蛋白-5α3LG3结构域的合成肽在各种酪氨酸位点处FAK磷酸化的效果;
图8D表示了通过免疫印记分析得到的肽P4的A1a取代肽(P4-S1—P4-S3)在酪氨酸-397、577处FAK磷酸化的效果;
图9A是表示根据NHEK细胞在涂附有聚苯乙烯(PS)、BSA(牛血清白蛋白)和合成肽P4的24孔板上增殖得到的NHEK数目增加图;
图9B是表示根据NHEF细胞在涂附有聚苯乙烯(PS)、BSA(牛血清白蛋白)和合成肽P4的24孔板上增殖得到的NHEF数目的增加图;
图10A-10C表示了NHEK和NHEF与其它对照品的细胞粘附活性、粘附细胞的数目和的扩散细胞速率分别相比较的结果;
PS:聚苯乙烯
只有不滑几丁质(Beschitin W):不滑几丁质(Beschitin W)微纤维
BSA:用牛血清白蛋白处理过的不滑几丁质(beschitin W)微纤维
P4:用功能性肽P4处理过的不滑几丁质(beschitin W)微纤维
图11表示了用以鉴定肽P4的体内功能的动物实验结果,其是表示大鼠皮肤损伤愈合过程在第三天和第七天时的显微照片(FIG.11A:H&E,100X;FIG.11B:H&E,200X)。
发明详细说明
在下文中,本发明将通过以下实施例来进行更加详细的描述。
但是,给出的这些实施例仅出于说明的目的,本发明的范围并非限于此。
试验实施例1:细胞培养
将HOK-16B细胞系,即通过克隆的HPV-16基因组转染细胞形成的人口腔角化细胞(Park,N.H.等,Carcinogenesis,12:1627,1991),保持在含有0.15mM钙的角化细胞生长介质和增补生长因子弹头试剂盒中(KGM;Clonetics)。制备正常人口腔角化细胞(NHOK)并像其它文献中所述的那样保持(Min,B.M.等,Exp.Cell.Res.,249:377,1999)。特别的是,利用牙科外科手段,通过胰蛋白酶处理将口腔角化细胞从牙科健康申请者(18到30岁)的齿龈上皮组织中分离出来,然后先将其在KGM中培养。将最初表现为约70%的融合性的NHOK以每60mm 1 x 105个细胞的密度涂在皮氏培养皿上,然后进行培养直到达到80%的融合性。将该具有80%融合性的NHOK进行传代培养,在下述实验中使用该传代培养的NHOK。
试验实施例2:细胞粘附和扩散活性测定
根据Okazaki等人报道的方法(Okazaki,I.等,J.Biol.Chem.,277:37070,2002)进行细胞粘附测定。具体来说,在24孔培养板(Nunc,Roskilde,Denmark)上涂附各种量的rLG蛋白,4℃下过夜。将肽也涂附在板上干燥过夜。在37℃下,通过在PBS中加入1%的热惰性牛血清白蛋白(BSA),板上的涂覆底物被阻塞1小时,并用PBS洗涤两遍。将试验实施例1中的细胞,在PBS中用0.05%胰蛋白酶和0.53mM的EDTA分离并重悬于培养基中,加到(1 x 105个细胞/500μl)每个板上,在37℃下温育1小时。温育之后,通过用PBS冲洗两遍去除未附着的细胞。将附着的细胞在PBS中用10%的福尔马林固定15min,用PBS冲洗两遍,并用0.5%的结晶紫染色1h。用DDW轻柔地洗板三遍并用2%的SDS溶解5min。在Bio-Rad550型微孔板读数仪(BioRad)中,在570nm处测定吸光度。
为了识别扩散细胞,在PBS中用10%的福尔马林固定附着细胞15min,用PBS冲洗两遍,并用0.005%的结晶紫染色1h。然后用DDW轻柔地洗板。为确保计数的代表性,将板划分为四等分,每等分两个视野用Olympus BX51显微镜在100X放大率下照相。呈扁平、多边形并具有类似丝状伪足和板状伪足延伸的细胞被认为是扩散细胞。相反,耐洗涤并保持束缚于板表面的细胞被认为是非扩散细胞。
试验实施例3:流式细胞计数
利用Rodeck等人的方法(Rodeck,U.et al.,J.Cell Sci.,110:113,1997)进行流式细胞计数检测细胞表面整合素的表达水平。特别是,将HOK-16B细胞用含有0.05%胰蛋白酶和0.53mM EDTA的PBS温和处理来分离,并进行洗涤。然后,将细胞与抗整合素mAbs(抗-α2、α3、α5、α6、αv、β1和β4)在4℃下培养45min。洗涤之后,将细胞与FITC标记的二抗在4℃下培养45min,并用FACS(流式细胞仪)(Calibur flow cytometer,Becton-Dickinson,San Jose,CA)分析。
试验实施例4:粘附活性抑制测定
为鉴别HOK-16B细胞对rLG3蛋白和肽P4的受体,在37℃下将5μg/ml不同类型的mAbs(抗整合素)或者5mM EDTA分别与HOK-16B细胞在0.5ml培养溶液(2 x 105个细胞/ml)中预培养30min。然后将预培养的细胞转移到预先涂附有25μg/ml rLG3蛋白或者10μg/孔肽P4的板上,并在37℃下培养1h。然后通过上述试验实施例2中的细胞粘附测定试验定量附着的细胞,并测定细胞粘附活性抑制率。
试验实施例5:FAK磷酸化测定
根据Shang等人的方法(Shang,M.et al.,J.Biol.Chem.,276:33045,2001)进行FAK磷酸化测定。具体来说,将HOK-16B细胞进行胰蛋白酶处理,洗涤,并在37℃下在具有0.1% BSA的无血清KGM悬液中保持1h。将60-mm的培养皿用层粘连蛋白(5μg/ml)或rLG3蛋白(25μg/ml)涂覆,在4℃下过夜。同样将肽(50μg/60-mm培养皿)涂覆在培养皿上,干燥过夜。用于粘附FAK测定,将1 x 106个细胞涂板于未涂覆有涂覆层粘连蛋白、涂覆rLG3蛋白、或涂覆各种肽的培养皿上,并使之在37℃、5% CO2的气氛下附着15、30、或60min。温育之后,用冰凉的PBS洗涤细胞并在RIPA缓冲液(50mM Tris[pH 7.4],150mM NaCl,1% NonidetP-40,0.5% Na-脱氧胆酸,1mM EDTA,0.1% SDS,2mM Na3VO4,1mM磷酸甘油,1mM PMSF,以及蛋白酶抑制剂混合物)中裂解。12,000Xg 4℃下离心10min澄清裂解物以分离胞质提取物。
用SDS样品缓冲液(50mM Tris-HCl[pH 6.8],2% SDS,10%甘油,0.1%溴酚蓝,100mM β-巯基乙醇)使胞质提取物变性,并在8%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离。将SDS-PAGE凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上,接着用多克隆的抗-FAK抗体进行免疫印记以测定总FAK水平,或者用多克隆的抗-FAK[pY397],[pY407],[pY576],[pY577]or[pY861]抗体进行免疫印记以测定酪氨酸磷酸化的程度。引起FAK磷酸化的相对倍数,定义为样品相对于其相应的本底水平(即在塑料上涂板的细胞)的FAK磷酸化增量,测定如下:首先,用LAS-1000plus(Fuji photo film,Japan)测定Western印记的磷酸化FAK(p-FAK)的密度测定强度和总FAK(t-FAK)信号数。然后计算每个样品的p-FAK与t-FAK之比(p-FAK/t-FAK)以便修正蛋白质加载量的差异。该比例标准化为阴性对照的p-FAK/t-FAK比例以便获得引起FAK磷酸化的相对倍数。
实施例1:人层粘连蛋白-5 α3链的rLG结构域表达
为鉴别人层粘连蛋白-5的整合素结合粘性结构域,在E.coli中以单体水溶性重组蛋白的形式分别表达人层粘连蛋白-5α3链的五个LG结构域。
详细来说,利用逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)来克隆人层粘连蛋白-5α3链的cDNA,其中利用了从NHOK中分离的mRNA,根据制造商的说明使用Super-script II逆转录酶(GibcoBRL,Grand Island,NY)。通过聚合酶链式反应扩增层粘连蛋白-5α3链的五个C末端LG cDNA片段(LG1-LG5),其中采用克隆的层粘连蛋白-5α3链的cDNA作为膜板,并将LG1到LG3片段克隆到pGEM-T Easy载体(Promega,Madison,WI)中,LG4和LG5片段克隆到pEZ-T载体(RNA,首尔,韩国)中。使用的聚合酶链式反应引物如下:LG1,SEQ ID NO:3(有义)和SEQ ID NO:4(反义);LG2,SEQ ID NO:5(有义)和SEQ ID NO:6(反义);LG3,SEQ ID NO:7(有义)和SEQ ID NO:8(反义);LG4,SEQ ID NO:9(有义)和SEQ ID NO:10(反义);LG5,SEQ ID NO:11(有义)和SEQ ID NO:12(反义)。所有质粒构造的核苷酸序列通过序列分析证实。含有LG cDNA片段的pGEM-TEasy载体和pEZ-T载体用适当的限制酶切割。随后将这些cDNA片段克隆到哺乳动物表达质粒载体pET-32a(+)(Novagen,Madison,WI)的EcoR I位点(LG1)或Nco I-Sal I位点(LG2),或者克隆到哺乳动物表达质粒载体pRSET(Invitrogen,Carlsbad,CA)的EcoR I位点(LG3)或Nco I位点(LG4和LG5)。通过序列分析证实插入子的正确方位。
为了有助于重组蛋白的纯化,在加工过程中将重组蛋白的C末端连接上六个His6-标签。选择在正确方位插入了DNA片段的克隆,并通过序列分析证实该过程中的突变或缺失。在37℃下将用各个表达载体转化的大肠杆菌(E.coli)菌株BL21在LB介质中培养,直到595nm处的OD值为0.5-0.6,加入1mM异丙基-β-D-半乳糖苷(Promega)以引起重组LG结构域的蛋白质表达。在37℃下诱导蛋白质5h后,以6000rpm的转速离心10min获取细胞。将细胞团存放于-80℃下备用。
为了纯化蛋白质,将细胞团重悬于含有1mM苯甲基磺醯化氟(Sigma)的冰凉裂解缓冲液(100mM NaH2PO4,10mM Tris-HCl,8M尿素,pH8.0)中。将细胞悬液通过10ml的移液管来进行细胞裂解,小心避免起泡。将净化的细胞裂解物加到Ni2+-次氮基三乙酸琼脂糖柱(Qiagen,Valencia,CA)中。在裂解缓冲液中用10mM的咪唑洗涤该柱,然后在裂解缓冲液中用250mM的咪唑洗脱连接到柱上的蛋白。
将洗脱的重组蛋白顺序在含有10mM Tris-HCl,100mM NaH2PO4,1mM苯甲基磺醯化氟,和3、2、1、或0.5M尿素,pH 3.0的溶液中进行渗析,最后,用含1mM苯甲基磺醯化氟(pH 3.0)的PBS对蛋白质进行渗析。用Centricon YM-10过滤仪(Millipore,Bedford,MA)将渗析的rLG蛋白质浓缩到0.5μg/μl,并储存在-80℃下备用。用Bio-Rad蛋白质检测试剂盒(BioRad,Hercules,CA)测定该蛋白质浓缩物。
在整个α3链分子中的重组蛋白质的对应氨基酸位置如图1所示,层粘连蛋白-5α3链(开放柱)的结构域结构标为IIIa、I/II、和LG1-LG5。阴影部分表示信号肽。闭合柱表示根据本发明的重组LG蛋白质的位置,括号中的数字表示在整个α3链分子中重组LG蛋白的对应氨基酸位置。在所制备的rLG蛋白当中,rLG1包含在SEQ ID NO:2的人层粘连蛋白α3链的氨基酸序列中的782~978个残基,rLG2包含959~1148个残基,rLG3包含1128~1364个残基,rLG4包含1352~1555个残基,rLG5包含1522~1713个残基。
本发明中所制备的重组LG蛋白通过3到25个氨基酸延伸到邻近结构域中,以帮助蛋白质折叠,并以N末端His6-标签融合蛋白的形式表达以便于蛋白质纯化和鉴定试验(图1C)的处理。将根据本发明在E.coli中以单体水溶性融合蛋白形式表达的rLG1、rLG2、rLG3、rLG4和rLG5蛋白进行SES-PAGE分析,并通过Coomassie染色进行可视化处理,从而测得各重组蛋白质的分子量分别为43、39、32、30和29kDa。在变性条件下用Ni2+-次氮基三乙酸琼脂糖纯化rLG蛋白质以达到接近均一,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶的Coomassie染色进行测定(图1C)。五种rLG结构域都表现出近似的表达水平。平均起来,每0.5升细菌培养物可获得大约0.5mg纯化的rLG蛋白。
实施例2:人层粘连蛋白-5 α3链rLG蛋白的细胞粘附和扩散活性
为检测实施例1中制备的人层粘连蛋白-5α3重组LG蛋白对细胞粘附和扩散的效果,根据试验实施例2中的方法分析细胞粘附和扩散活性。
结果,五种rLG蛋白中只有rLG3蛋白表现出粘附活性(图2A-2C)。在rLG3蛋白上HOK-16B细胞粘附性是计量依赖性的,最大粘附量出现在25-μg/ml的涂覆浓度下(图2B)。在图2B中,BSA和层粘连蛋白用作阴性和阳性对照。在相同或更大的涂覆浓度下,rLG1、rLG2、rLG4和rLG5蛋白的粘附活性相对于BSA表现出边缘粘附活性(图2B和2C)。发现采用50μg/mlrLG3蛋白的细胞粘附水平与涂附5μg/ml层粘连蛋白的对照品相比大约有45%的降低。
为了进一步估算层粘连蛋白-5α3链rLG蛋白的细胞粘附活性,本发明者检测了粘附细胞是被束缚在底层上还是在底层上扩散。在粘附测定中,将附着到rLG蛋白上的HOK-16B细胞进行洗涤、固定、和结晶紫染色之后成像。通过在细胞粘性测定中对细胞计数测定的rLG蛋白粘附活性图与通过分光光度法测得的rLG蛋白粘附活性图非常相似(图2C)。
用试验实施例2中所述的方法对HOK-16B细胞在rLG上的扩散活性的检测结果是,47%的HOK-16B细胞表现出扩散形态;也就是说它们呈扁平、多边形、具有类似丝状伪足和板状伪足样延伸(图2D)。余下的在rLG3蛋白上的非扩散细胞可耐洗涤并保持束缚于板表面上。与rLG3相比,在涂覆rLG1-、rLG2-、rLG4-和rLG5-的板上观察到很少量的细胞扩散。这些结果表明,重组LG3结构域表现出类似于其亲代分子—层粘连蛋白-5的功能特性,这是因为其支持细胞的粘附和扩散。
实施例3:鉴定人层粘连蛋白-5 α3链LG对细胞粘附和扩散的序列活性
在实施例2中,已经鉴明人层粘连蛋白-5α3链rLG3结构域介导了细胞的粘附和扩散。此外,先前已证明C末端的28个氨基酸(1297-1324残基)和LG3结构域内的83个氨基酸(1214-1296)分别支持细胞的粘附性和细胞的移动性(Kariya,Y.等,J.Cell Biochem.,88:506,2003)。因此,为了鉴定赋予层粘连蛋白α3链LG结构域细胞粘附活性的必须氨基酸残基,可通过Fmoc(9-芴甲氧羰基)为基础的固相方法,用C末端氨基化合物在韩国基础科学研究院(Korea Basic Science Institute)的先锋肽合成仪(Applied Biosystem,Forster City,CA)上合成覆盖了来自LG3结构域的1293-1332氨基酸残基的五个重叠的12肽(P1-P5)(图3)。图3中的箭头表示合成肽的位置。预测的β-链结构为灰色框,而肽P4的基本氨基酸Lys和Arg在白色框(http://www.bmm.icnet.uk/~3diigsaw/dom fish)。通过反相高效液相色谱法纯化该合成肽。通过高效液相色谱法和质谱法分析其特征。在合成的肽当中,P1含有SEQ ID NO:1氨基酸序列的1293-1304个残基,P2含有相应于1297-1308残基的氨基酸序列,P3含有相应于1305-1316残基的氨基酸序列,P4含有相应于1312-1323残基的氨基酸序列,以及P5含有相应于1321-1332残基的氨基酸序列。
通过与试验实施例2相同的方法用HOK-16B细胞来检测涂覆肽的板上的细胞粘附和扩散活性。将24孔板上分别涂覆10、20、30、40和50μg/孔的肽P1到P5。将HOK-16B细胞加到涂覆了肽的板上,在无血清的介质中培养1hr。洗涤去掉未粘附的细胞之后,将粘附细胞固定并用结晶紫染色,然后分析染色的细胞。在微孔板读数仪中测定在570nm处的吸光度。分别用BSA和rLG3作为阴性对照和阳性对照。
结果,肽P4(PPFLMLLKGSTR)表现出强烈的剂量依赖性细胞粘附活性。当涂板上的肽P4浓度≥10/孔时可获得最大细胞粘附性。然而,甚至在高涂覆浓度下,P1、P2和P3也没有表现出粘附活性,而P5在浓度≥25/孔时表现出非常弱的剂量依赖性粘附活性(图4A)。
此外,通过细胞粘性测定中的细胞计数测得的在10μg/孔涂敷浓度下的肽粘附活性图像,除肽4外,所有的肽都相同(图4B)。肽P4的细胞粘附活性与rLG3的细胞粘附活性类似。
为了详细测定肽P4的粘附活性,本发明者测定了该粘附细胞是被束缚在底板上,还是在底板上扩散。分别用BSA和rLG3作为阴性对照和阳性对照,用扩散细胞的数目除以被粘附细胞的总数目来表示扩散形态的细胞百分数。结果,在肽P4上,35%的HOK-16B细胞表现出了扩散形态,然而,其它的肽却没有表现出扩散(图4C)。
已知肽P4的细胞扩散活性与rLG3蛋白的细胞扩散活性类似。因此,发明者通过试验实施例4中的方法检测了P4与rLG3结构域细胞粘附活性能力的对比。首先,将纯化的rLG3蛋白(25μg/孔)涂覆到24孔板上。将HOK-16B细胞与各种肽(100μg/ml)一起或者在没有肽的情况下在37℃预培养30min。然后将预培养的细胞加到涂覆了rLG3的板上并在无血清的介质中培养1h。将未粘附的细胞洗去并固定粘附细胞,用结晶紫染色。将对照培养物(在没有肽的情况下预培养的HOK-16B细胞)的平均粘附活性看作100%,结果表示为平均值±四个独立试验的SD。因此,合成肽P4抑制了大约51%的细胞对rLG3的粘性,但其它的肽都没有在与100μg/ml肽预培养了30min的HOK-16B细胞中表现出降低了细胞粘附活性。总之,这些结果说明肽P4序列(PPFLMLLKGSTR)在完整层粘连蛋白-5α3链的LG3结构域中起着细胞连接位点的功能。
实施例4:rLG3蛋白和肽P4的细胞粘附依赖于整合素α3β1
为了鉴定重组LG3结构域和肽P4的细胞中参与粘附和扩散活性的细胞表面受体,本发明者通过FACS利用对整合素亚单元的功能阻断性单克隆mAb(Chemicon Temecula,CA)测定了HOK-16B细胞表面上表达的整合素种类。如在试验实施例3中,将HOK-16B细胞与对α2、α3、α5、α6、αv、β1或β4整合素亚单元特异性的mAb一起培养,以便通过FITC结合的二抗进行着色来实现流式细胞计数。此时,将阴性对照只和二抗一起培养。绘制细胞数目(y坐标)与荧光强度(x坐标)的函数。结果,证实了HOK-16B细胞可表达几种整合素,包括α3β1、α6β1和α6β4(FIG.5A)。
同时,已知配体-整合素的相互作用需要二价阳离子。为了测定阳离子在该相互作用中的作用,本发明者测定了金属螯合物试剂EDTA对粘附到涂覆了rLG3和肽P4的板上HOK-16B细胞的作用。将HOK-16B细胞与5mM EDTA或5μg/ml对整合素α3(P1B5)、β1(6S6)、α6(NK I-GoH3)亚单元起功能阻断性的mAbs一起在37℃下预培养30min,并涂在预涂覆25μg/ml rLG3的板上,然后培养1hr。洗去未粘附的细胞之后,将粘附细胞固定并用结晶紫染色,分析染色的细胞。将对照培养物(在没有EDTA或整合素抗体的情况下预培养的HOK-16B细胞)的平均粘附活性视为100%。结果,粘附到rLG3上的细胞几乎被5mM的EDTA完全抑制(图5B)。类似地,在存在5mM EDTA的情况下,涂覆了10μg/孔肽P4的板上观察到细胞粘性的降低,虽然该EDTA的抑制效果低于其在rLG3蛋白上的效果。这表明rLG3蛋白和肽P4的细胞表面受体可能是需要二价阳离子用于其与配体之间相互作用的整合素之一。
同样,本发明者检测了对整合素亚单元起功能阻断性的mAbs对涂覆有rLG3蛋白和肽P4的表面上的HOK-16B细胞粘附活性的作用效果。结果,涂覆有rLG3蛋白和肽P4的表面的粘性被α3和β1亚单元的抗体特异性地抑制了(图5B和5C)。用抗整合素α3对HOK-16B细胞的抗体处理分别抑制了71%和49%的rLG3和肽P4的细胞粘附活性,而用抗整合素β1的抗体处理分别抑制了71%和54%的rLG3和肽P4的细胞粘附活性。该结果表明,整合素α3β1同时是HOK-16B细胞中rLG3和肽P4的特定功能性受体,并且肽P4相比于rLG3蛋白对HOK-16B细胞的细胞粘附活性通过与整合素α3β1稍微弱些的相互作用来介导。
实施例5:肽P4的C末端截短型和Ala取代型肽的细胞粘附活性
在实施例4中已经观察到肽P4可促进强烈的细胞粘附和扩散活性并与整合素α3β1结合。因而,为了测定肽P4中的生物学活性中心序列,可制备来自肽P4的C末端截短肽的五种合成肽(P4 D-I到P4 D-V),以及来自肽P4的N末端截短肽的六种合成肽(P4 D-N1,到P4 D-N6)(图6A),并由本发明者检测在涂覆了肽的板上的HOK-16B细胞粘附和扩散活性。在24孔板上以10μg/孔涂覆C末端截短的肽或N末端截短的肽,将HOK-16B细胞加到该板上,然后在无血清的介质中培养1hr。洗去未粘附的细胞之后,将粘附的细胞固定以用结晶紫染色,分析该染色的细胞。在微孔板读数仪中测定570nm处的吸光度。分别用肽P4和BSA作为阳性和阴性对照。
结果,肽P4中缺失了C末端Arg残基的肽P4 D-I,表现出明显低于肽P4对照品的细胞粘附活性(图6B和6C)。然而,在肽P4中进一步缺失C末端氨基酸残基表现出的细胞粘附活性与P4 D-I的类似或者稍微有所降低。同样,使用了五个C末端截短肽的细胞扩散活性也明显低于肽P4对照品(图6D),而细胞扩散形态与细胞粘附图像基本上相同。
可以观察到肽P4中缺失C末端Arg残基明显降低了细胞的粘附活性。
同样,肽P4中缺失了两个N末端Pro残基之一的肽P4 D-N1并没有表现出明显低于肽P4对照品的细胞粘附和扩散活性,而肽P4中缺失了两个N末端Pro残基的肽P4 D-N2表现出了明显低于肽P4对照品的细胞粘附和扩散活性(图6C和6D)。然而,在肽P4中进一步缺失N末端氨基酸残基表现出的细胞粘附和扩散活性与缺失了C末端氨基酸的P4的类似或者显著降低。
为了证实肽P4序列中这两个基本氨基酸Arg和Lys对细胞粘附活性的作用,本发明者通过Ala同时/分别取代肽P4序列中的Lys1319和Arg1323,而制备出合成肽(P4-S1到P4-S3)(图7A),并用HOK-16B细胞在涂覆肽的板上测定其细胞粘附和扩散活性(图7B和7C)。
在24孔板上以10μg/孔涂覆肽,并将HOK-16B细胞加到该板上,然后在无血清的介质中培养1hr。洗去未结粘附的细胞之后,将粘附的细胞固定以用结晶紫染色,分析该染色的细胞。分别用肽P4和BSA作为阳性和阴性对照。结果表示成平均值±四个独立试验的SD的形式。
结果,与肽P4对照品相比,Ala取代Arg时细胞和扩散性被肽P4-S2显著地抑制,Ala取代Lys和Arg时其被肽P4-S3显著地抑制。然而,当Ala仅取代Lys时这些活性并未受到肽P4-S1的影响(图7B和7C)。通过这些结果可知,基本残基Arg对于肽P4的细胞粘附活性来说很重要。这些结果表明,层粘连蛋白-5α3链LG3结构域内PPFLMLLKGSTR序列(残基1312-1323)是负责细胞粘附和扩散性以及整合素α3β1结合的活性基序。
实施例6:rLG3或肽P4对Tyr-397和-577处的FAK磷酸化效果
已经证实整合素不仅起着粘附受体的作用,还起着信号转换器的作用(Schwartz,M.A.等,Ann.Rev.Cell.Dev.Biol.,11:549,1995;Shoenwaelder,S.M.和Burridge,K.,J.Biol.Chem.,274:14359,1999)。在细胞粘附到胞外基质蛋白的基础上对整合素的活化可导致FAK(焦点粘连激酶)磷酸化水平的增加,它是在细胞粘附到胞外基质蛋白成分之后的主要酪氨酸磷酸化蛋白(Clark,E.A.和Brugge,J.S.,Science,268:233,1995;Guan,J.L.,Int.J.Biochem.Cell Biol.,29:1085,1997;Giancotti,F.G.和Ruoslahti,E.,Science,285:1028,1999)。已鉴明Tyr-397、-407、-576、-577、-861和-925处的FAK是磷酸受体位点。在它们当中,据报道Tyr-397是FAK自磷酸化中的主要位点(Schlaepfer,D.D.等,Nature,372:786,1994)。
为了检测由LG3结构域或者肽P4介导的信号通道,可检测位于rLG3或肽P4板上的HOK-16B细胞中的FAK磷酸化水平。包括层粘连蛋白作为连接到α3β1整合素上的对照配体(Lampe,P.D.等,J.Cell Biol.,143:1735,1998)。首先,通过试验实施例5中所述的方法利用HOK-16B细胞15、30或60min分析涂覆和未涂覆有层粘连蛋白的板上在Tyr-397处的FAK磷酸化水平。
将通过胰蛋白酶作用分离的HOK-16B细胞悬浮1hr,并保持在悬液(Sus)中,或者再次涂板在涂覆有或没有层粘连蛋白(5μg/ml)的60-mm的培养皿中。使细胞保持15、30、或60min以便附着在板上,然后通过免疫印记分析法利用抗FAK p-Y397抗体(Biosource,Camariollo,CA)来分析裂解物。结果,层粘连蛋白上的HOK-16B细胞FAK磷酸化程度明显高于位于在塑料板上或者保持在悬液中的HOK-16B细胞中的程度。在暴露于涂覆有层粘连蛋白的板之后,可在15min内观察到该结果,并且峰值位于15min处。
因此,检测在涂覆有层粘连蛋白(5μg/ml)、rLG3(25μg/ml)或肽P1-P5(50μg/60-mm培养皿)的板上培养了15min的HOK-16B细胞中,Tyr-397、-407、-576、-577和-861处的FAK磷酸化程度。用多克隆抗-FAK、p-Y397、p-Y407、p-Y576、pY-577或p-Y861抗体(Biosouece,Camariollo,CA)免疫印记该裂解物,并用抗-FAK抗体(Upsate Biotechnology,LakePlacid,NY)检测总FAK水平。然后计算每个样品的p-FAK与t-FAK之比(p-FAK/t-FAK)以便修正蛋白质加载量的差异。该比例标准化为阴性对照(板上细胞)的p-FAK/t-FAK比例以便获得引起FAK磷酸化的相对倍数。结果,在涂覆有层粘连蛋白或涂覆有rLG3蛋白的板上培养的细胞的Tyr-397处FAK磷酸化程度与未处理的对照品相比增加了16.2和8.2倍(图8B)。该结果证实了层粘连蛋白在Tyr处引起了FAK磷酸化(Clark,E.A.和Brugge,J.S.,Science,268:233,1995;Guan,J.L.,Int.J.Biochem.CellBiol.,29:1085,1997;Giancotti,F.G.和Ruoslahti,E.,Science,285:1028,1999)。
尽管在粘附到肽P4的细胞中Tyr-397处的FAK磷酸化水平低于层粘连蛋白的,但在肽P4上引起细胞粘性的水平大大高于其它的肽(图8C)。此外,涂板在肽P4上的细胞中的Tyr-577处FAK磷酸化水平高于在其它肽上扩散的细胞的水平,但低于在层粘连蛋白上扩散的细胞的水平。然而,在Tyr-407、-576和-861处的FAK磷酸化水平的这些改变并没有在类似条件下的层粘连蛋白、rLG3和其它肽中观察到。这表明层粘连蛋白、rLG3和肽P4活化了不同的整合素α3β1-介导的信号通道。
由于用A1a取代了Arg的肽P4-S2以及用A1a同时取代了Arg和Lys的肽P4-S3与肽P4对照相比明显抑制了细胞的粘性,因此本发明者检测了粘附到肽P4-S1到P4-S3上的HOK-16B细胞中Tyr-397和-577处的FAK磷酸化水平以证实在肽P4序列中这两个基本氨基酸残基在FAK的Tyr磷酸化上的作用。在涂板于用A1a取代了Lys的肽P4-S1上的细胞中,Tyr-397处的FAK磷酸化水平与在肽P4上的类似。相反,在涂板于肽P4-S2和P4-S3上的细胞中,Tyr-397处的FAK磷酸化水平与肽P4对照品(图8D的上板)相比明显降低。在类似条件下,FAK Tyr-577处同样观察到了肽P4-S2到P4-S3上的这种变化(图8D的下板)。这些结果表明,对于FAK的Tyr磷酸化来说,需要与细胞粘附性水平密切相关的肽P4中的基本残基Arg1323。
实施例7:通过肽P4测定NHEK和NHEF的细胞粘附活性
7-1:NHEK制备
从1至3岁健康人的包皮组织中取样并制备正常人表皮角化细胞(NHEK)组织样品。用含有3X抗体,无钙和镁的Hanks平衡盐溶液(CMF-HBSS;GibcoBRL)洗涤该组织样品三次,加入含有胶原酶(II型胶原酶,1.0mg/ml;sigma Chemical Co.)和分散酶(II级分散酶,2.4mg/ml;Boeringer-Mannheim)的CMF-HBSS以将上皮层从该上皮组织中分离,然后在37℃下在95%空气和5% CO2中培养90min。从分离的上皮组织中制备NHEKs,并在含有0.15mM钙的上皮细胞介质和生长因子弹头形试剂盒(KGM;Clonetics Corp.)中培养。当细胞密度大约为70%时,将NHEKs分成每60-mm皮氏培养皿1 x 105个细胞,并进行培养直到细胞密度达到大约70%。将NHEKs如上所述进行传代培养两次,使用传代培养了2次的传代培养物。
7-2:NHEF制备
从1至3岁健康人的包皮组织中取得正常人表皮成纤维细胞(NHEF),并用含有3X抗体,无钙和镁的Hanks平衡盐溶液(CMF-HBSS;GibcoBRL)洗涤三次,通过外植培养制备。当细胞密度大约为80%时,将NHEF以1:3的比例划分,并进行培养直到细胞密度达到大约80%。将NHEF如上所述进行传代培养,使用传代培养了4次的传代培养物。
7-3:鉴定上皮细胞和表皮成纤维细胞的增殖促进程度
将聚苯乙烯(PS)、BSA(牛血清白蛋白)和合成肽P4涂覆在24孔板上。向该涂覆有聚苯乙烯(PS)、BSA(1%)和合成肽P4(20μg/12孔板)的24孔板加入NHEK(PD13.0;2 x 104个细胞/12孔板)和NHEF(通道数目4)培养物,培养1、2、3或4天。通过血细胞计数器中的锥虫蓝以排除法计数活细胞。数据表示为平均值±SD(n=4)的形式。
参见测定结果,图9A和9B分别表示了NHEKs和NHEFs根据细胞增殖的增量。如图所示,涂覆BSA的板上的NHEK和NHEF数目最少,而在涂覆PS和肽P4的板上根据细胞增殖的细胞数目增量相近似。在NHEKs的情况下,在涂覆肽P4的板上的NHEKs数目比在涂覆PS板上的增加得多。这证实了肽P4对于NHEK细胞增殖来说尤其有作用。
7-4:测定细胞粘附活性
将直径为14-mm的不滑几丁质(Beschitin W)微纤维(UNITIKA Co.,Japan)放在24孔培养皿中,加入0.4ml牛血清白蛋白(1mg/ml),对照肽P1(10μg/孔)或功能肽(P4,10μg/孔),将该培养皿在室温下进行干燥涂覆12hr。在仅测试不滑几丁质(Beschitin W)微纤维的情况下,加入0.4ml磷酸盐缓冲液(PBS),并将培养皿进行相同处理。为了阻断未涂覆肽的位点,加入0.4ml/孔牛血清白蛋白(1mg/ml),并在37℃下培养30min。然后,去除牛血清白蛋白,并用PBS仔细洗涤。扩散1 x 105个细胞/孔(0.5ml),在37℃下,95%的空气和5%CO2中培养60min。该步骤中使用含有0.15mM钙的上皮细胞培养液和生长因子弹头形试剂盒(KGM;Clonetics Corp.)。去除培养液,将板用PBS仔细清洗一遍,然后加入含0.4ml 10%的福尔马林的PBS。细胞在室温下静置15min以便固定。去除固定溶液,并用PBS洗板两遍,然后将粘附到不滑几丁质(Beschitin W)微纤维上的细胞用苏木精-曙红溶液染色。去除染色液,然后将板用DDW仔细清洗3遍,之后使粘附到不滑几丁质(Beschitin W)微纤维上的细胞成像。为确保取值具有代表性,可将不滑几丁质(BeschitinW)微纤维分成四等分,每等分两个视野用Olympus BX51显微镜在100X放大率下照相。由四个独立的试验计算平均百分比和标准偏差。图10A至10C表示了照片和细胞粘附活性和扩散活性的计算结果。
如图10A至10c所示,当市场上可购得的人工皮肤材料不滑几丁质(Beschitin W)微纤维上涂覆有本发明的肽P4时,可表现出极佳的细胞粘附活性和扩散活性。通过该结果证实了根据本发明的肽P4对于损伤愈合或组织再生十分有用。
实施例8:通过动物实验鉴定肽P4的细胞粘附活性和扩散活性
8-1:动物实验条件
该实验使用重240±10g的Sprague-Dawley鼠。麻醉之后,在每个鼠的背部制备两个1cm x 1cm平行于脊柱的全层矩形伤口。然后将涂覆有肽P4的不滑几丁质(Beschitin W)微纤维运用到每个鼠的伤口上。同样的伤口只用不滑几丁质(Beschitin W)微纤维处理作为对照。在处理的第3或第7天之后,取下各伤口用于上皮化和肉芽化的组织检查。
8-2:伤口愈合和组织学检查
对于组织学检测来说,通过显微镜检查第3和第7天的涂覆有肽P4的不滑几丁质(Beschitin W)微纤维组和对照组的结果。图11A和11B分别表示了100X和200X的显微图像。
在第3和第7天的对照组中,伤口表面覆盖有纤维蛋白组织碎片,并且在该层下方观察到了多形核白细胞的致密渗入物和成纤维细胞增殖。然而,在第3和第7天的涂覆有肽P4的不滑几丁质(Beschitin W)微纤维组中,表面组织碎片消失,并且有明显的新毛细血管和成纤维细胞增殖。
两组中,伤口的上皮化过程都在4周后完成。此外,炎症细胞消失并且形成了致密的结缔组织。然而,在第7天的涂覆有肽P4的不滑几丁质(Beschitin W)微纤维组中,表面组织碎片消失,并且有明显的新毛细血管和成纤维细胞增殖。
该动物实验结果证明,在涂覆有肽P4的不滑几丁质(Beschitin W)微纤维组中,早期愈合阶段比只用Beschitin W微纤维的对照组中要快。
尽管本发明是参考特定特征进行详细说明的,但对于本领域技术人员来说显然该说明仅针对了优选的实施例,而并非限制了本发明的范围。因此,本发明的实质范围将由所附的权利要求及其等价物来限定。
工业实用性
正如上面所详细描述的,含有氨基酸序列SEQ ID NO:1的本发明的肽,其片段和衍生物,通过特异性地结合整合素α3β1可促进细胞的粘附性和扩散性,因此对于通过各种胞外基质蛋白,包括层粘连蛋白,介导的有关细胞粘附活性、损伤治疗、组织再生、抑制癌症转移等的研究来说很有用处。
FP06KR091.ST25
SEQUENCE LISTING
<110>闵(MIN),炳武(Byung-Moo)
金(KIM),镇万(Jin-Man)
<120>促进细胞粘附和扩散的肽、其片段和衍生物
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<400>13
Claims (7)
1.一种可促进细胞的粘附性和扩散性肽,其特征是所述肽由氨基酸序列SEQ ID NO:1,如附图6A所示的P4-D-N1,P4-D-N2,P4-D-I,P4-D-II,P4-D-III,P4-D-IV或P4-D-V,如附图7A所示的P4-S1,P4-S2或P4-S3组成。
2.根据权利要求1所述的肽,其特征在于,其中所述肽具有第12位保守的Arg。
3.根据权利要求1所述的肽,其特征在于,其中所述肽具有第1或第2位保守的Pro。
4.根据权利要求1所述的肽,其特征在于,所述肽通过整合素α3β1来介导细胞的粘附和扩散。
5.一种用于损伤治疗、烧伤治疗、组织再生或抑制癌细胞转移的药物组合物,其特征在于,含有权利要求1至4中任意一种肽作为有效成分。
6.一种伤口覆盖材料,其特征在于,含有权利要求1至4中任意一种肽。
7.一种用于组织工程的支架,其特征在于,含有权利要求1至4中任意一种肽。
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The LG3 Module of Laminin-5 Harbors a Binding Site forIntegrin α3β1 That Promotes Cell Adhesion, Spreading, andMigration. Meiling Shang 等.The Journal of Biological Chemistry,Vol.276 No.35. 2001 * |
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