JP5766598B2

JP5766598B2 - ヒトインターフェロン−αに対するヒト化抗体

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Description

本発明は、ヒトインターフェロンα（ＩＦＮ−α）に対するヒト化抗体、およびヒト患者の様々な疾患および障害の処置または防止におけるそれらの使用に関する。

様々な異なる観察に基づけば、インターフェロンα（ＩＦＮ−α）は多数の自己免疫性疾患に関与すると考えられるサイトカインである。全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者のＩＦＮ−αの血中濃度はしばしば測定可能ではないが、患者は明瞭なＩＦＮ−α遺伝子シグネチャーを有するように見える。さらに、ＳＬＥ患者の血清での樹状細胞（ＤＣ）の処理によるＤＣ成熟の誘導は、抗ＩＦＮ−α抗体によって阻害することができる。ＳＬＥ表現型を有するニュージーランド・ブラック（ＮＺＢ）マウスにおけるＩＦＮ−α／β受容体のノックアウトが、ほとんど正常な表現型をもたらすことも示されている（Santiago-Raber et al., J Exp Med. 2003;197(6):777-88）。

したがって、ＩＦＮ−αに対する抗体は、単独でまたは組み合わせで、かかる自己免疫性疾患の処置のためにこのサイトカインの活性を中和するツールとして示唆されている。広範囲の異なるＩＦＮ−αサブタイプを認識する特異的なマウス抗体（ＡＣＯ−１〜ＡＣＯ−６）は、ＷＯ２００６００８６５８６として公開済み国際特許出願中で記載されるように、生成および特性評価された。しかしながら、マウス抗体は免疫原性のためにヒトにおける使用には適切ではなく、したがってマウスＣＤＲがヒトスキャフォールド抗体上にグラフトされたヒト化抗体を生成することが望ましい。しかしながら、ヒト化抗体は、しばしば、マウス親抗体と比較して、例えば、より低い親和性および／または安定性および／または所望されない免疫原性などの機能的欠損が短所である。ヒト化抗体中のかかる欠損は、いくつかの事例では、１つまたは少数の復帰点変異を生じさせることによって補うことができる。あまりにも多くの復帰変異の存在は所望されない低い安定性および／または所望されない程度の免疫原性をもたらす傾向があるので、復帰点変異を全く行わないか、または非常に少数の復帰点変異のみを行なうことが通常望ましい。したがって、例えば、非常に多数のＩＦＮ−αサブタイプへのヒト化抗ＩＦＮ−α抗体の親和性および力価の保持などの望ましい生物学的特性を有する安全で安定性のあるヒト化抗ＩＦＮ−α抗体の供与が望ましい。

したがって、例えば、安定性、特異性、安全性、免疫原性などのような特色に関して望ましい特色を有するヒト化抗ＩＦＮ−α抗体が当技術分野において必要とされる。さらに、かかる抗体を産生する効率的な方法が当技術分野において必要である。

第１の態様において、本発明は、ヒトインターフェロン−α（ＩＦＮ−α）を特異的に結合するヒト化抗体またはその抗原結合断片であって、ヒト化抗体がＫａｂａｔに従うマウス相補性決定領域（ＣＤＲ）よりも少ないドナーアミノ酸残基を含む、マウス抗体のＡＣＯ−１もしくはＡＣＯ−２またはその組み合わせのヒト化バージョンである、ヒト化抗体またはその抗原結合断片に関する。

別の態様において、さらに本発明は、ＩＦＮ−αを特異的に結合するヒト化抗体またはその抗原結合断片であって、該抗体がＩＦＮ−αサブタイプのＡ、２、Ｂ２、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ２、Ｉ、Ｊ１、Ｋ、４ａ、４ｂおよびＷＡを結合することが可能であるが、サブタイプの１またはＤを結合することが可能ではなく、該抗体がＫａｂａｔに従う非ヒトＣＤＲよりも少ないドナーアミノ酸残基を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合断片に関する。

さらに本発明は、かかる抗体を得る方法に加えて、治療目的のためのかかる抗体の使用およびかかる抗体を含む組成物に関する。

本発明に従う抗体は様々な炎症性疾患の処置に適切でありえる。

ヒト化（ｈｚ＝ヒト化）のためのマウスＡＣＯ−１ＶＨ配列の解析を示した図であり、マスクは網掛け文字で示され、ＫａｂａｔＣＤＲは太字で示され、マウス配列とヒト生殖細胞系列配列との間の違いは下線を引いた文字で示され、可能な体細胞超変異残基は太字の下線を引いた文字で、および可能な復帰変異残基は網掛けの下線を引いた文字で示される。ＡＣＯ−１ＶＨ＝配列番号：１；ヒト生殖細胞系列のＶＨ１＿４６／ＪＨ４＝配列番号：２；ｈｚＡＣＯ−１ＶＨ＝配列番号：３。ヒト化（ｈｚ＝ヒト化）のためのマウスＡＣＯ−１ＶＬ配列の解析を示した図であり、マスクは網掛け文字で示され、ＫａｂａｔＣＤＲは太字で示され、マウス配列とヒト生殖細胞系列配列との間の違いは下線を引いた文字で示され、可能な体細胞超変異残基は太字の下線を引いた文字で、および可能な復帰変異残基は網掛けの下線を引いた文字で示される。ＡＣＯ−１ＶＬ＝配列番号：４；ヒト生殖細胞系列のＶＫＩＩＩ＿Ｌ６／ＪＫ２＝配列番号：５；ｈｚＡＣＯ−１ＶＬ＝配列番号：６。ＡＣＯ−１とＡＣＯ−２との間のＶＨ配列アライメントに加えて、対応するマウス生殖細胞系列配列を示した図である。ＡＣＯ−２ＶＨ＝配列番号：７；マウス生殖細胞系列Ｊ５５８．３３／Ｄ＿／ＪＨ３＿１＝配列番号：８。ＡＣＯ−１とＡＣＯ−２との間のＶＬ配列アライメントに加えて、対応するマウス生殖細胞系列配列を示した図である。ＡＣＯ−２ＶＬ＝配列番号：９；マウス生殖細胞系列ａｅ４／ＪＫ４＿１＝配列番号：１０。ｈｚＡＣＯ−１の中への導入のために選択されたＡＣＯ−２残基の位置を示した図である。ｈｚＡＣＯ−１の中への導入のために選択されたＡＣＯ−２残基の位置を示した図である。ＣＰＥ分析中のＩＦＮ−αＤおよびＩＦＮ−α１以外の試験されたすべてのインターフェロンサブタイプの保護的効果についてのｈｚＡＣＯ−１阻害を示した図である。レポーター遺伝子（ＲＧ）分析による１２個のＩＦＮ−α種のｈｚＡＣＯ−１阻害を示した図である。各々の抗体濃度の値を正規化し、４個の繰り返しの平均を計算した。データーは平均＋／−標準誤差として示される。最もフィットしたシグモイド応答曲線をプリズムソフトウェアを使用して計算した。Ｒ２値は０．９８を超えたすべてのデーターセットのためであった（曲線のフィッティングをしなかったＩＦＮ−αＤを除く）。ＩＦＮ−αＡを使用する、ＡＣＯ−２に由来する単一変異Ａ９３Ｖを有するｈｚＡＣＯ−１バリアントとｈｚＡＣＯ−１のＲＧ分析の比較を示した図である。図５について記載されるようにデーター計算を行なった。ＩＦＮ−αＦを使用する、ＡＣＯ−２に由来する単一変異Ａ９３Ｖを有するｈｚＡＣＯ−１バリアントとｈｚＡＣＯ−１のＲＧ分析の比較を示した図である。図５について記載されるようにデーター計算を行なった。添加剤なしの、ｐＨ３．５でのｈｚＡＣＯ−１およびバリアントの移行温度を示した図である。添加剤なしの、ｐＨ４．５でのｈｚＡＣＯ−１およびバリアントの移行温度を示した図である。添加剤なしの、ｐＨ５．５でのｈｚＡＣＯ−１およびバリアントの移行温度を示した図である。Ｘ線結晶解析によって決定された、ＩＦＮ−α８に結合したｈｚＡＣＯ−１のＦａｂ断片鎖（Ｈ、Ｌ）の構造を示した図である。ＩＦＮ−α８配列下の着色したボックスによって示されるように、ＩＦＮＡＲ１およびＩＦＮＡＲ２についてのＩＦＮ−α８の結合エピトープを示した図である（Quadt-Akabayov S.R. et al. Protein Sci. 15, 2656-2668, 2006 and Roisman L.C et al. J. Mol. Biol. 353, 271-281, 2005）。灰色のボックスによって示された残基はすべてのＩＦＮ−αサブタイプ間で部分的に保存されるが、黒のボックスによって示された残基は完全に保存される。４Åの距離カットオフを使用するＩＦＮ−α８の上のｈｚＡＣＯ−１結合エピトープは、ＩＦＮ−α８のアミノ酸配列の上に「＊」によって示される。ＲＧ分析において、ｈｚＡＣＯ−１に加えてその２つのバリアントに対してマウスＡＣＯ−１モノクローナル抗体を比較した図である。１つのバリアントは完全なＣＤＲＨ２を保有するヒト化ＡＣＯ−１（ｈｚＡＣＯ−１−ｋａｂａｔＣＤＲＨ２と表記される）であるが、ｈｚＡＣＯ−１は実施例２において記載されるように短いＣＤＲＨ２で構築された。さらに、図は、合理的デザインを介して、複数のＩＦＮ−αとの相互作用に最適化した別の変異ｈｚＡＣＯ−１（ｈｚＡＣＯ−１Ｙ３２Ｅ，Ｔ３０Ｒ）を示す。図示されるように、これらの４つの組換えモノクローナル抗体バリアントを５つの異なる代表的なＩＦＮ−αサブタイプの阻害に関して比較した。ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４のアイソタイプで発現されたｈｚＡＣＯ−１のタンパク質安定性の研究を示した図である。５週間のヒスチジンバッファー中のインキュベーション後に、ＨＰＬＣによって凝集を決定した。異なるエフェクター細胞：標的細胞比（Ｅ：Ｔ）での、ｈｚＡＣＯ−１ＩｇＧ４、ＩＦＮ−αおよびその異なる組み合わせによるＡＤＣＣの欠如を示す、⁵¹Ｃｒ放出分析を示した図である。ＩＦＮ−αｐｒｈｚＡＣＯ−１なしの細胞＋ＰＢＭＣ単独はバックグラウンド溶解を決定し、トリトン−Ｘ１００は最大の溶解を示す。リツキサンは陽性対照として含まれており、すべてのＥ：Ｔ比で検出可能な細胞溶解を誘導する。ＥＬＩＳＡによる補体結合の研究を示した図である。ＩＦＮ−αに結合された場合、ＩｇＧ４として発現されたｈｚＡＣＯ−１は補体を固定することができなかった。陽性対照として、ｈｚＡＣＯ−１は抗ＩｇＧ４ポリクローナル抗体と交差結合し、抗ＩｇＧ４に対するＣ４の明瞭な用量依存的結合が検出された。

本発明は、例えばＳＬＥなどの例えば狼瘡疾患または障害；移植片対宿主病；１型糖尿病、ＡＩＤＳ、自己免疫性甲状腺炎、乾癬、若年性皮膚筋炎およびシェーグレン症候群などのＩＦＮ−αに関連する症状または疾患を患うヒト患者の処置のために適切な特性を持つ抗ＩＦＮ−α抗体に部分的に基づく。抗体は、典型的にはマウスＡＣＯ−１抗体および／またはマウスＡＣＯ−２抗体のヒト化バージョンに基づく。

１３の組換えＩＦＮ−αサブタイプに加えてウイルス感染の際に産生される２つの複雑なＩＦＮの混合物の生物活性をブロックできるとしてＡＣＯ−１およびＡＣＯ−２が同定された（ＷＯ２００６０８６５８６を参照）。ＡＣＯ−１およびＡＣＯ−２は、マイクロアレイ解析によってＩＦＮ−αシグネチャーを示したＳＬＥ患者からの血清の生物活性も一貫してブロックした。ＡＣＯ−１およびＡＣＯ−２は、ＩＦＮ−αタンパク質サブタイプのＤおよび１の生物活性を有意に中和しなかったが、ＳＬＥ血清のＩＦＮ−α生物活性を中和した。理論で限定されるものではないが、したがって、サブタイプのＤおよび１がＳＬＥの病因に有意に関与しない可能性がある。

実施例において記載されるように、可変領域の構造的なモデル化は、ＫａｂａｔＣＤＲよりも少ないドナー（マウス）残基を使用してＡＣＯ−１およびＡＣＯ−２をヒト化し、したがってヒト患者における有害な免疫応答のリスクをさらに減少させることが可能であることを明らかにした。この解析は復帰変異に有利な部位も同定した。恐らくＡＣＯ−１可変領域とＡＣＯ−２可変領域との間の高い配列相同性（１３の部位でのみ異なる）のために、対応する位置のＡＣＯ−２残基によってヒト化ＡＣＯ−１（ｈｚＡＣＯ−１）配列中の特定のアミノ酸残基を置き換えることができることがさらに見出された。ＣＤＲ領域内では、通常、抗体配列をあまりヒトにはせずに変異を生じさせることができる。このヒト化手順は、ヒト化抗体の親和性、安定性、発現レベルおよびＩＦＮ−α阻害活性などの機能特性の改善をもたらした。

ヒト化ＡＣＯ−１抗体において、ｈｚＡＣＯ−１ＶＨ（配列番号：３）中の例示的な変異は、Ｋａｂａｔナンバリングを使用して、Ｖ５Ｑ、Ｔ２８Ｓ、Ｍ６９Ｌ、Ｒ７１Ｖ、Ｔ７３Ｋ、Ｓ７６Ｉ、Ｓ７６Ｎ、Ｔ７７Ｉ、Ｖ７８Ａ、Ｙ７９ＦおよびＡ９３Ｖに加えて、その任意の組み合わせを含む。ｈｚＡＣＯ−１ＶＬ（配列番号：６）中の例示的な変異は、Ｅ１Ｑ、Ｄ２９Ｇ、Ｌ３３Ｆ、Ｌ４７Ｗ、Ｓ５０Ｇ、Ｉ５８ＶおよびＦ７１Ｙに加えて、その任意の組み合わせを含む。１つの実施形態において、ｈｚＡＣＯ−１ＶＨ領域は、Ｔ２８Ｓ、Ｎ３１ＳおよびＡ９３Ｖから選択された変異を含む。別の実施形態において、ｈｚＡＣＯ−１ＶＨ領域は、Ｔ２８Ｓ、Ｎ３１ＳおよびＡ９３Ｖから選択された変異、ならびに例えばＴ２８ＳおよびＮ３１Ｓ、Ｔ２８ＳおよびＡ９３Ｖ、ならびにＮ３１ＳおよびＡ９３Ｖなどのその任意の組み合わせを含む。別の実施形態において、ｈｚＡＣＯ−１ＶＨ領域は、Ｔ２８Ｓ、Ｎ３１ＳおよびＡ９３Ｖから選択された変異、または例えばＴ２８ＳおよびＮ３１Ｓ、Ｔ２８ＳおよびＡ９３Ｖ、もしくはＮ３１ＳおよびＡ９３Ｖなどのその組み合わせ；ならびに少なくとも１つの追加の変異を含む。
定義

本発明の理解を促進するために、多数の用語を以下に定義する。

「ＡＣＯ−１抗体およびＡＣＯ−２抗体」はＷＯ２００６００８６５８６中で特徴づけられ記載される。ＡＣＯ−１はＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−６５５７（ＷＯ２００６０８６５８６）で寄託され、ＡＣＯ−２はＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−７７７８（ＷＯ２００８０２１９７６）として寄託される。本発明に記載の抗体はＡＣＯ−１およびＡＣＯ−２のヒト化バリアントである。しかしながら、本発明に記載のＡＣＯ−１およびＡＣＯ−２のヒト化バージョンは、全長マウスＫａｂａｔ配列を含まない。好ましい実施形態において、ＣＤＲ配列の少なくとも１つは、約３〜１０個のアミノ酸、好ましくは３〜８個、より好ましくは４〜７個のアミノ酸の短縮を含む。抗体は、好ましくはＣＤＲＨ２中に短縮を含み、好ましくは該ＣＤＲＨ２は、３〜１０個、好ましくは３〜８個、より好ましくは４〜７個、最も好ましくは６個のアミノ酸で短縮される。そしてさらに続いて１つまたは複数のＣＤＲ配列中に加えて、ヒトスキャフォールド抗体内に点変異をたまに導入することができる。しかしながら、用語「ＡＣＯ−１抗体およびＡＣＯ−２抗体」は、ＩＦＮ−αサブタイプのＡ、２、Ｂ２、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ２、Ｉ、Ｊ１、Ｋ、４ａ、４ｂおよびＷＡの結合が可能であるがサブタイプの１またはＤの結合が可能でない任意のＩＦＮ−α抗体をさらに包含することができる。しかしながらＣＤＲ配列中の差が少数のアミノ酸のみであるので、ＡＣＯ−１およびＡＣＯ−２それ自体がただ１つの抗体として認識できることが理解されるべきである。したがってＡＣＯ−１およびＡＣＯ−２が同じ抗体の生体内の体細胞超変異の２つの段階を表わすことはもっともらしいことである。本発明に記載のＡＣＯ−１抗体／ＡＣＯ−２抗体は、したがって、ＡＣＯ−１およびＡＣＯ−２のＣＤＲ配列と少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９２％、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するＣＤＲ配列を含むヒト化抗体である。

用語：「ＣＤＲ短縮」、「前進変異」および「ＣＤＲを短くすること」は、文献の全体にわたって同じ意味で使用することができる。かかる用語は、一般的には本発明と関連してＣＤＲ短縮が多数の連続した前進変異として認識できるという事実を指し、短くされたマウスＣＤＲ断片がヒトフレームワーク上にグラフトされうることを意味する。短いＣＤＲのグラフトが免疫原性の程度が減少した抗体をもたらす傾向があることは意外ではないが、例えば安定性、特異性などのようなヒト化抗体の他の有利な特色を保持することができるのは実際には意外である。「復帰変異」は、フレームワーク中の（すなわちＣＤＲ中ではない）変異を常に指し、典型的には、復帰変異は、例えば抗体構造を安定させるために選択された部位での１つまたは複数の「マウス」アミノ酸残基の導入である。

用語「インターフェロンα」（ＩＦＮ−α）は、本明細書において使用される時、先天免疫の主要なエフェクターのいくつかを含むタンパク質のファミリーを指す。ヒトＩＦＮ−αについて少なくとも１５の公知のサブタイプがある。ｌＦＮ−αタンパク質サブタイプおよび対応するコード遺伝子の名称は、表１中で以下にリストされる。
表１ＩＦＮ−αタンパク質サブタイプおよび遺伝子

Pestka et al. (1997)「Interferon Standardization and Designations」J Interferon Cytokine Res 17: Supplement 1, S9-S14を参照。ＩＦＮ−αＢ２は時にはＩＦＮ−αＢもと呼ばれ、ＩＦＮ−βと混同すべきではない。白血球からの天然のＩＦＮ−α（白血球ＩＦＮ−）に加えて、組換えヒトＩＦＮ−αタンパク質サブタイプは、ＰＢＬバイオメディカル・ラボラトリーズ（ＰＢＬＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＬａｂｓ）社、ピスカタウェイ、ニュージャージー（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ）から入手可能である。天然のＩＦＮ−αはＩＦＮ−αサブタイプの複雑な混合物である。ＥＬＩＳＡおよびＲＩＡなどのこれらのインターフェロンを検出および定量する方法は、当技術分野において公知である。

用語「抗体」は、最も広い意味で本明細書において使用され、全長モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ならびに特別の指示が無いかまたは文脈によって否定されない限り、所望の生物学的活性を示すならば、抗原結合断片、抗体バリアントおよびその多重特異性分子を具体的には含む。一般的には、全長抗体は、ジスルフィド結合によって相互に連結した少なくとも２個の重（Ｈ）鎖および２個の軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質、またはその抗原結合部分である。各々の重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨとして本明細書において略される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は３個のドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）を含む。各々の軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬとして本明細書において略される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は１個のドメイン（ＣＬ）を含む。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、より保存された領域（フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる）が散在する超可変性の領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる）へとさらに細分することができる。各々のＶＨおよびＶＬは３個のＣＤＲおよび４個のＦＲからなり、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序でアミノ末端からカルボキシ末端にアレンジされている。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。

抗体の「抗原結合断片」は、抗原に検出可能に結合できる全長抗体の一部を含む分子である。抗原結合断片は、１、２、３またはそれ以上の抗体の抗原結合部分を含む多価分子、ならびに合成リンカーによってまたは機能的な抗原結合分子を形成する組換え方法によってＶＬ領域およびＶＨ領域またはその選択された部分が連結される一本鎖コンストラクトを含む。

用語「抗体誘導体」および「免疫コンジュゲート」は、全長抗体またはその抗原結合断片を含み、例えば第２の分子に抗体を連結するための、例えばアルキル化、ＰＥＧ化、アシル化、エステル形成もしくはアミド形成または同種のものによって、１つまたは複数のアミノ酸が化学的に修飾される分子を示すように、本明細書において同じ意味で使用される。例示的な修飾は、ＰＥＧ化、システイン−ＰＥＧ化、ビオチン化、放射能標識、および検出可能薬剤または細胞傷害剤などの第２の薬剤とのコンジュゲーションを含む。

「多重特異性分子」は、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子に結合する分子を生成するために、少なくとも１つの他の機能分子（例えば別の抗体または受容体のリガンドなどの別のペプチドまたはタンパク質）と結合または連結される、抗体またはその抗原結合断片を含む。例示的な多重特異性分子は、二重特異性抗体、および可溶性受容体断片またはリガンドに連結された抗体を含む。

「ヒト化」抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列（ＣＤＲ領域）を含有するヒト／非ヒトキメラ抗体である。ヒト化抗体は、したがって所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域の残基によって、レシピエントの超可変領域の残基が置き換えられるヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの実例において、ヒト免疫グロブリンのＦＲ残基は対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体、またはドナー抗体において見出されない残基を含むことができる。これらの修飾は抗体性能をさらに改良するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、すべてまたは実質的にすべての超可変ループが非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、すべてまたは実質的にすべてのＦＲ残基がヒト免疫グロブリン配列のＦＲ残基である、少なくとも１つのおよび典型的には２つの可変ドメインを実質的にすべて含む。ヒト化抗体は、少なくとも免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（典型的にはヒト免疫グロブリンのＦｃ）の一部も随意に含むことができる。

本明細書において使用される場合、用語「超可変領域」は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般的には「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（軽鎖可変ドメイン中の２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）の残基；Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest、第５版、米国保健社会福祉省、ＮＩＨ公開番号９１−３２４２）および／または「超可変ループ」からのアミノ酸残基（軽鎖可変ドメイン中の２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）の残基；Chothia and Lesk, J. Mol. Biol 1987;196:901-917）を含む。典型的には、この領域中のアミノ酸残基のナンバリングは、Kabat et al.（前出）中で記載される方法によって行なわれる。「Ｋａｂａｔ位置」、「Ｋａｂａｔ残基」および「Ｋａｂａｔに従う」、などの語句は、本明細書において重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインのためのこのナンバリングシステムを指す。Ｋａｂａｔナンバリングシステムを使用して、ペプチドの実際の直線的アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＣＤＲの短縮またはその中への挿入に対応して、アミノ酸の減少またはアミノ酸の追加を含有することができる。例えば、重鎖可変ドメインはＣＤＲＨ２の残基の５２後のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔに従う残基５２ａ、５２ｂおよび５２ｃ）、および重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（例えばＫａｂａｔに従う残基８２ａ、８２ｂおよび８２ｃなど）を含むことができる。残基のＫａｂａｔナンバリングは、「スタンダード」のＫａｂａｔでナンバリングされた配列を持つ抗体の配列の相同領域でのアライメントによって、与えられた抗体について決定することができる。

「フレームワーク領域」残基または「ＦＲ」残基は、本明細書において定義されるようなＣＤＲ以外のＶＨ残基またはＶＬ残基である。

２つの実質的に同一のアミノ酸配列中の「対応する」アミノ酸位置は、典型的にはデフォルトパラメーターを使用して、本明細書において参照された任意のタンパク質分析ソフトウェアによってアライメントさせた位置である。

「単離された」分子は、それが属する分子のクラスに関して見出される組成物中で優勢種である分子である（すなわち、組成物中の分子のタイプのうちの少なくとも約５０％を占め、典型的には組成物中の分子種（例えばペプチド）の少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、またはそれ以上を占める）。一般に、抗体分子の組成物は、組成物中に存在するすべてのペプチド種状況における抗体分子について、または少なくとも提案された使用状況において実質的に活性のあるペプチド種に関して、９８％、９８％または９９％の均一性を示す。

用語、「選択的に中和する」および「選択的に中和すること」は、本明細書において使用される時、１つまたは複数のＩＦＮ−αタンパク質サブタイプの生物活性の少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％を選択的に中和するが別のＩＦＮ−αタンパク質サブタイプの少なくとも１つの生物活性を有意に中和しない、単離され精製された抗体（モノクローナル抗体などであるがこれらに限定されない）、またはその抗原結合断片を指し、ここで生物活性は例えばＭｘＡプロモーターの活性化および／または抗ウイルス活性でありえる。

本発明の文脈において、「処置」または「処置すること」は、文脈によって否定されない限り、１つまたは複数の病徴、または疾患もしくは障害の臨床的に関係のある兆候を防止、緩和、管理、治癒または減少させることを指す。例えば、病徴、または臨床的に関係のある疾患もしくは障害の兆候が同定されていない患者の「処置」は、防止的または予防的な治療法であるが、病徴、または臨床的に関係のある疾患もしくは障害の兆候が同定された患者の「処置」は、一般的には防止的または予防的な治療法ではない。

語句「ＩＦＮ−αに関連する症状または疾患」は、本明細書において使用される時、患者の血清中のＩＦＮ−αレベルの上昇と関連づけられる異常な症状、疾患または前臨床疾患の状態を指す。かかるものの実例は、ＳＬＥなどの狼瘡疾患または障害、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、１型糖尿病、ＡＩＤＳ（ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）によって引き起こされる）、自己免疫性甲状腺炎および乾癬を含むが、これらに限定されない。ｌＦＮ−αのレベルを決定する方法は、当技術分野において公知である。
ヒト化抗ＩＦＮ−α抗体

本発明の抗体は、抗ＩＦＮ−αマウス抗体のＡＣＯ−１またはＡＣＯ−２のヒト化バージョン、そのバリアント、および／または、特定の機能的および／または構造的な特色または特性によって特徴づけられるその抗原結合断片である。以下に記載されるように、組換え抗体は標準的技術によって適切な宿主細胞株において産生され、それらの機能的活性を評価する様々な分析によって特徴づけることができる。実際は、本発明に記載のＩＦＮ−α抗体が従来の方法のヒト化ＩＦＮ−α抗体と比較して、有意に改善された収率で産生されうることが判明する。

いわゆる「ベストフィット」法に従って、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列を、公知のヒト可変ドメイン配列またはヒト生殖細胞系列配列のライブラリーなどのライブラリーに対してスクリーニングする。次いで、げっ歯類の配列に最も近いヒト配列は、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク領域として認めることができる（Sims et al., J. Immunol. 1993;151:2296 et seq.; Chothia et al, Chothia and Lesk, J. Mol. Biol 1987;196:901-917）。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループのすべてのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークを複数の異なるヒト化抗体のために使用することができる。

本発明の抗体における使用のために好ましいフレームワーク配列は、ＡＣＯ−１またはＡＣＯ−２によって使用されるフレームワーク配列に構造的に類似したものである。したがって、１つの実施形態において、本発明は、ヒトＶＨ１＿４６遺伝子およびヒトＪＨ４遺伝子に由来するＶＨフレームワーク残基、およびヒトＶＫＩＩＩ＿Ｌ６遺伝子およびヒトＪＫ２遺伝子に由来するＶＬフレームワーク残基を含み、ヒトＩＦＮ−αを特異的に結合する、ヒト化ＡＣＯ−１抗体またはヒト化ＡＣＯ−２抗体を提供する。

下記の実施例１は、かかるフレームワーク配列を含む例示的なヒト化ＡＣＯ−１抗体（ｈｚＡＣＯ−１）のデザインを記載する。
機能特性

本発明のヒト化抗体は、特異的にＩＦＮ−αサブタイプのＡ、２、Ｂ２、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ２、Ｉ、Ｊ１、Ｋ、４ａ、４ｂおよびＷＡに結合する（表２）。１つの実施形態において、本発明のヒト化ＡＣＯ−１抗体またはヒト化ＡＣＯ−２抗体は、ＩＦＮ−αＡなどのＩＦＮ−αタンパク質サブタイプに高親和性、例えば約１０^-7Ｍ以下のＫＤ、約１０^-8Ｍ以下のＫＤ、約５×１０^-9Ｍ以下のＫＤ、または約２×１０^-9Ｍ以下のＫＤで結合する。１つの実施形態において、ヒト化抗体は、ｈｚＡＣＯ−１の親和性に同等かまたはそれよりも高い親和性で、ＩＦＮ−αＡ、ＩＦＮ−αＦ、および／または別のＩＦＮ−αタンパク質サブタイプに結合するｈｚＡＣＯ−１バリアントである。
表２。広範囲にわたるヒトＩＦＮ−αサブタイプについてのｈｚＡＣＯ−１の動力学的パラメーター

サンプル
結合なし

例えば、ＩＦＮ−αＡタンパク質サブタイプに対するｈｚＡＣＯ−１バリアントのＫＤとｈｚＡＣＯ−１のＫＤとの間の比は、約１．０、約０．８、約０．７、または約０．６でありえる。別の実施形態において、ヒト化抗体は、組換えにより産生されたＡＣＯ−１の親和性に同等かまたはそれよりも高い親和性で、ＩＦＮ−αＡ、ＩＦＮ−αＦ、および／または別のＩＦＮ−αタンパク質サブタイプに結合するｈｚＡＣＯ−１バリアントである。別の実施形態において、ヒト化抗体は、ハイブリドーマにより産生されたＡＣＯ−１の親和性に同等かまたはそれよりも高い親和性で、ＩＦＮ−αＡ、ＩＦＮ−αＦ、および／または別のＩＦＮ−αタンパク質サブタイプに結合するｈｚＡＣＯ−１バリアントである。

さらに、本発明のヒト化抗体は、１つまたは複数のＩＦＮ−αタンパク質サブタイプの生物活性を選択的に中和することができる。例えば、対照と比較して、ヒト化ＡＣＯ−１バリアントまたはヒト化ＡＣＯ−２バリアントは、ＩＦＮ−αタンパク質サブタイプのＡ、２、Ｂ２、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ２、Ｉ、Ｊ１、Ｋ、４ａ、４ｂまたはＷＡ、またはその任意の組み合わせの生物活性の少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％を選択的に中和することができる。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、ＩＦＮ−αサブタイプのＤおよび／または１の生物活性を有意に中和しない。例示的な生物活性は、ＭｘＡプロモーターもしくは抗ウイルス活性、または両者の活性化を含むが、これらに限定されない。ヒト化抗体がかかるＩＦＮ−α生物活性を中和する能力は、例えば、本明細書において記載されたレポーター遺伝子（ＲＧ）および細胞変性の阻害（ＣＰＥ）分析を使用して評価することができる。１つの実施形態において、ヒト化抗体は、ＲＧ分析においてｈｚＡＣＯ−１のＩＣ５０に同等かまたはそれよりも低いＩＣ５０を有するｈｚＡＣＯ−１バリアントである。特定の実施形態において、ｈｚＡＣＯ−１バリアントは、ＲＧ分析においてｈｚＡＣＯ−１よりも低いＩＣ５０を有する。

１つの実施形態において、本発明のヒト化抗体は、ＩＦＮ−αタンパク質サブタイプ上でＡＣＯ−１および／またはＡＣＯ−２と同じエピトープを競合および／または同じエピトープに結合する。かかる抗体は、本明細書において記載されるように標準的なＩＦＮ−α結合分析においてＡＣＯ−１および／またはＡＣＯ−２と交差競合する能力に基づいて同定することができる。ＡＣＯ−１またはＡＣＯ−２が１つまたは複数のＩＦＮ−αタンパク質サブタイプに結合することを試験ヒト化抗体が阻害する能力は、試験抗体がＡＣＯ−１またはＡＣＯ−２とＩＦＮ−αへの結合を競合し、したがってＩＦＮ−αタンパク質サブタイプ上でＡＣＯ−１および／またはＡＣＯ−２と同じエピトープに結合できることを実証する（ＷＯ０２０６６６４９およびＷＯ２００５０５９１０６）。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、マウスモノクローナル抗体の９Ｆ３、ＭＭＨＡ−１、ＭＭＨＡ−２、ＭＭＨＡ−３、ＭＭＨＡ−６、ＭＭＨＡ−８、ＭＭＨＡ−９、ＭＭＨＡ−１１、ＭＭＨＡ−１３およびＭＭＨＡ−１７（ＰＢＬバイオメディカル・ラボラトリーズ（ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社、ニュージャージー、アメリカ）、および／またはヒトモノクローナル抗体の１３Ｈ５、１３Ｈ７および７Ｈ９のいずれかと異なるヒトＩＦＮ−αエピトープに結合し、および／または１つまたは複数のリストされたマウスモノクローナル抗体およびヒトモノクローナル抗体以上にＡＣＯ−１またはＡＣＯ−２と交差競合する。

１つの実施形態において、本発明によって提供されるｈｚＡＣＯ−１、ｈｚＡＣＯ−２、ｈｚＡＣＯ−１バリアントまたはｈｚＡＣＯ−２バリアントは、Ｋａｂａｔに従うマウスＣＤＲ（ＫａｂａｔＡＣＯ−１）を含むヒト化ＡＣＯ−１抗体またはヒト化ＡＣＯ−２抗体と同等かまたはそれらよりも低い免疫原性を有する。ヒト化抗体の免疫原性はWadwha et al., Dev Biol (Basel) 2005;122:155-70中で記載される１つまたは複数の方法によって例えば評価することができ、その全体は参照することにより本明細書に組み入れられる。

さらなる態様において、本発明のヒト化抗体はヒト患者に投与のために適切な製剤中で安定である。１つの実施形態において、本発明に記載のヒト化ＡＣＯ−１抗体またはヒト化ＡＣＯ−２抗体は、全長マウスＫａｂａｔ配列を含む従来の方法におけるヒト化ＩＦＮ−α抗体と少なくとも同じくらいの安定性がある。抗体の安定性は、実施例１１で記載されるサーマフロウル（ｔｈｅｒｍａｆｌｏｕｒ）分析を含む当技術分野において公知の方法を使用して評価することができる。

本発明の好ましいヒト化抗体は、以下の特性のうちの少なくとも１、好ましくは、２、３、４、５、またはそれ以上のものを示す。（ａ）ＩＦＮ−αサブタイプのＡ、２、Ｂ２、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ２、Ｉ、Ｊ１、Ｋ、４ａ、４ｂおよびＷＡに特異的に結合する；（ｂ）ＩＦＮ−αタンパク質サブタイプのＡ、２、Ｂ２、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ２、Ｉ、Ｊ１、Ｋ、４ａ、４ｂもしくはＷＡ；その任意の組み合わせ、またはそのすべての１つまたは複数の生物活性を選択的に中和する；（ｃ）ＩＦＮ−α１またはＩＦＮ−αＤの生物活性を有意に中和しない；（ｄ）ＩＦＮ−αタンパク質サブタイプ上でＡＣＯ−１および／またはＡＣＯ−２と同じエピトープを競合および／または同じエピトープに結合する；（ｅ）９Ｆ３、１３Ｈ５、１３Ｈ７および７Ｈ９のいずれか以上にＡＣＯ−１またはＡＣＯ−２と競合する；（ｆ）Ｋａｂａｔに従うマウスＣＤＲを含むｈｚＡＣＯ−１抗体またはｈｚＡＣＯ−２抗体よりも免疫応答を誘発する可能性が低い；（ｇ）医薬用製剤中で安定である；（ｈ）１０^-8Ｍ以下のＫＤで、ＩＦＮ−αタンパク質サブタイプのＡ、２、Ｂ２、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ２、Ｉ、Ｊ１、Ｋ、４ａ、４ｂまたはＷＡの少なくとも１つに結合する。
構造特性

本発明の好ましい抗体はマウスモノクローナル抗体のＡＣＯ−１およびＡＣＯ−２のヒト化バージョンである。実施例中で記載されるように、かかる抗体は産生され、単離され、構造的および機能的に特徴づけることができる。ＡＣＯ−１およびｈｚＡＣＯ−１およびＡＣＯ−２の全長の可変領域およびＫａｂａｔＣＤＲ配列を、表３中で説明し、図１〜３中で記載する。
表３プライマー、タンパク質および抗体のための配列ナンバリング

ｈｚＡＣＯ−１ＣＤＲＨ１、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３の配列は、対応するＡＣＯ−１配列と同一である。ＡＣＯ−２ＣＤＲＨ３およびＬ３は対応するＡＣＯ−１ＣＤＲ配列と同一である。ｈｚＡＣＯ−１ＣＤＲ＿Ｈ２配列中のイタリック体で示されるアミノ酸は、ヒトフレームワーク配列に対応し、従来のヒト化抗体では全長Ｋａｂａｔ配列はＡＣＯ−１ＣＤＲ＿Ｈ２配列（アミノ酸はすべてマウス抗体に由来する）に対応する。

１つの態様において、本発明は、ＫａｂａｔＣＤＲよりも少ないドナー残基（すなわちｋａｂａｔＣＤＲのグラフトによって産生されたヒト化ＡＣＯ−１抗体またはヒト化ＡＣＯ−２抗体よりも少ないマウス残基）を持つマウスＡＣＯ−１抗体およびマウスＡＣＯ−２抗体のヒト化バージョンを提供する。

１つの実施形態において、ヒト化抗体はヒトＩＦＮ−αを特異的に結合し、Ｋａｂａｔに従うマウス相補性決定領域（ＣＤＲ）よりも少ないドナーアミノ酸残基を含むマウス抗体のＡＣＯ−１もしくはＡＣＯ−２またはその組み合わせのヒト化バージョンである。ＣＤＲＨ２配列は、例えば、Ｋａｂａｔ残基の５０〜６５、５０〜６４、５０〜６３、５０〜６２、５０〜６１または５０〜６０に対応する残基よりも少ないドナーアミノ酸残基を含みうる。ＣＤＲＨ２ドナー残基はＫａｂａｔ残基５０〜５９を含むことができる。さらにまたはあるいは、ＣＤＲＨ２ドナーアミノ酸残基はＫａｂａｔ残基５０〜５９からなることができる。Ｋａｂａｔ残基５０〜５９は、配列番号：１６、２１および２３の残基１〜１１に対応する。１つの実施形態において、残りのＶＨＣＤＲは、ＫａｂａｔＣＤＲ（図１〜３を参照）、すなわち、Ｋａｂａｔ残基３１〜３５に対応するドナーアミノ酸残基を含むＣＤＲＨ１配列、およびＫａｂａｔ残基９５〜１０２に対応するドナーアミノ酸残基を含むＣＤＲＨ３配列を含むかまたはそれらからなることができる。

１つの実施形態において、ヒト化ＡＣＯ−１抗体またはヒト化ＡＣＯ−２抗体は、ＡＣＯ−１軽鎖の可変（ＶＬ）領域のＫａｂａｔ残基２４〜３４に対応するドナーアミノ酸残基を含むＣＤＲＬ１、ＡＣＯ−１ＶＬ領域のＫａｂａｔ残基５０〜５６に対応するドナーアミノ酸残基を含むＣＤＲＬ２、およびＡＣＯ−１ＶＬ領域（配列番号：４）またはＡＣＯ−２ＶＬ領域（配列番号：９）のＫａｂａｔ残基８９〜９７に対応するドナーアミノ酸残基を含むＣＤＲＬ３を含むことができる。さらにまたはあるいは、抗体は、Ｋａｂａｔ残基２４〜３４からなるＣＤＲＬ１ドナーアミノ酸残基、Ｋａｂａｔ残基５０〜５６からなるＣＤＲＬ２ドナー残基、およびＫａｂａｔ残基８９〜９７からなるＣＤＲＬ３ドナーアミノ酸残基を含むことができる。対応するアミノ酸配列を表３中で示す。

１つの態様において、本発明は特異的なヒト化ＡＣＯ−１抗体を提供する。ヒト化ＡＣＯ−１抗体は、ヒトＩＦＮ−αを特異的に結合し、随意のＮ３１Ｓ変異を持つ、配列番号：３のＫａｂａｔ残基の３１〜３５、５０〜６５および９５〜１０２の配列に実質的に同一のＶＨＣＤＲ配列を含む。抗体は、例えば、配列番号：１５を含むＣＤＲＨ１配列；配列番号：２１を含むＣＤＲＨ２配列；および配列番号：１７を含むＣＤＲＨ３配列を含むことができる。さらにまたはあるいは、抗体は、配列番号：１５からなるＣＤＲＨ１配列；配列番号：２１からなるＣＤＲＨ２配列；および配列番号：１７からなるＣＤＲＨ３配列を含むことができる。１つの実施形態において、ヒト化ＡＣＯ−１は、ヒトＶＨ１＿４６遺伝子に由来するＶＨフレームワーク残基および／またはヒトＪＨ４遺伝子、好ましくは両方を含む。特定の実施形態において、ヒト化抗体は配列番号：３に対応するＶＨ配列を含む。

ヒト化ＡＣＯ−１抗体は配列番号：６のＫａｂａｔ残基の２４〜３４、５０〜５６および８９〜９７の配列に実質的に同一のＶＬＣＤＲ配列をさらに含むことができる。抗体は、例えば、配列番号：１８を含むＣＤＲ＿Ｌ１配列；配列番号：１９を含むＣＤＲ＿Ｌ２配列；および配列番号：２０を含むＣＤＲ＿Ｌ３配列を含むことができる。さらにまたはあるいは、配列番号：１８からなるＣＤＲ＿Ｌ１配列；配列番号：１９からなるＣＤＲ＿Ｌ２配列；および配列番号：２０からなるＣＤＲ＿Ｌ３配列を含むことができる。１つの実施形態において、ヒト化ＡＣＯ−１抗体は、ヒトＶＫＩＩＩ＿Ｌ６遺伝子に由来するＶＬフレームワーク残基および／またはヒトＪＫ２遺伝子、好ましくは両方を含む。特定の実施形態において、ヒト化抗体は配列番号：６に対応するＶＬ配列を含む。

１つの態様において、本発明は、ＡＣＯ−２のＣＤＲ配列を含む抗体を提供する。抗体は、ヒトＩＦＮ−αを特異的に結合することができ、配列番号：７のＫａｂａｔ残基の３１〜３５、５０〜５９および９５〜１０２の配列に実質的に同一のＶＨＣＤＲ配列を含む。１つの実施形態において、抗体は、配列番号：２２を含むＣＤＲ＿Ｈ１配列；配列番号：２３を含むＣＤＲ＿Ｈ２配列；および配列番号：１７を含むＣＤＲ＿Ｈ３配列を含む。追加または代替の実施形態において、抗体は、配列番号：２２からなるＣＤＲ＿Ｈ１配列；配列番号：２３からなるＣＤＲ＿Ｈ２配列；および配列番号：１７からなるＣＤＲ＿Ｈ３配列を含む。抗体は、配列番号：９の残基Ｋａｂａｔ残基の２４〜３４、５０〜５６および８９〜９７の配列に実質的に同一のＶＬＣＤＲ配列をさらに含むことができる。１つの実施形態において、抗体は、配列番号：２４を含むＣＤＲ＿Ｌ１配列；配列番号：２５を含むＣＤＲ＿Ｌ２配列；および配列番号：２０を含むＣＤＲ＿Ｌ３配列を含む。さらにまたはあるいは、抗体は、配列番号：２４からなるＣＤＲ＿Ｌ１配列；配列番号：２５からなるＣＤＲ＿Ｌ２配列；および配列番号：２０からなるＣＤＲ＿Ｌ３配列を含む。１つの態様において、抗体はヒト化ＡＣＯ−２抗体でありえる。

ヒト化ＡＣＯ−１抗体またはヒト化ＡＣＯ−２抗体は、少なくともヒトＦｃ領域の一部をさらに含むことができる（抗体が任意のＦｃ部分を含まない抗原結合断片でない限り）。典型的には、Ｆｃ領域のサイズは抗体の所望の薬物動態学的特性（Ｆｃ部分が大きいほどクリアランスは遅い）を達成するように選択される。１つの実施形態において、ヒト化抗体は、好ましくはＩｇＧ４アイソタイプＦｃ領域を含む全長抗体である。特定の実施形態において、ＩｇＧ４Ｆｃ領域はＫａｂａｔに従うナンバリングでＳ２４１Ｐ変異（ＥＵのナンバリングシステム（Edelman G.M. et AL., Proc. Natl. Acad. USA 63, 78-85 (1969)）で残基２２８に対応する）を含む。

ＡＣＯ−１およびＡＣＯ−２の両方がＩＦＮ−αに結合することができ、類似しているならば、ヒト化ＶＨ配列およびＶＬ配列は、本発明の他の抗ＩＦＮ−α結合分子を作成するために「ミックスおよびマッチ」させることができる。本明細書において記載された結合分析（例えばフローサイトメトリー、ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）、ＥＬＩＳＡ）を使用して、および／または本明細書において記載されるような１つまたは複数の機能分析を使用して、かかる「ミックスおよびマッチ」させた抗体のＩＦＮ−α結合を、検査することができる。好ましくは、ＶＨ鎖およびＶＬ鎖をミックスおよびマッチさせる場合、特定のＶＨ／ＶＬ対からのＶＨ配列は、構造的に類似したＶＨ配列により置換される。同様に、特定のＶＨ／ＶＬ対からのＶＬ配列は、構造的に類似したＶＬ配列により好ましくは置換される。

したがって、１つの態様において、本発明は、（ａ）ＡＣＯ−１またはＡＣＯ−２のＶＨＣＤＲを含むＶＨ領域および（ｂ）ＡＣＯ−１またはＡＣＯ−２のＶＬＣＤＲを含むＶＬ領域を含み；ＩＦＮ−αを特異的に結合する、ヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。好ましい重鎖および軽鎖の組み合わせは、（ａ）配列番号：１６の５個のＣ末端アミノ酸のいくつかまたはすべてを随意に省く、配列番号：１５〜１７を含むＶＨ領域および（ｂ）配列番号：１８〜２０を含む軽鎖可変領域；（ａ）配列番号：１６の５個のＣ末端アミノ酸のいくつかまたはすべてを随意に省く、配列番号：１５〜１７を含むＶＨ領域および（ｂ）配列番号：２４、２５および２０を含む軽鎖可変領域；（ａ）配列番号：２３の５個のＣ末端アミノ酸のいくつかまたはすべてを随意に省く、配列番号：２２、２３および１７を含むＶＨ領域および（ｂ）配列番号：１８〜２０を含む軽鎖可変領域；ならびに（ａ）配列番号：２３の５個のＣ末端アミノ酸のいくつかまたはすべてを随意に省く、配列番号：２２、２３および１７を含むＶＨ領域および（ｂ）配列番号：２４、２５および２０を含む軽鎖可変領域を含む。他の好ましい重鎖および軽鎖の組み合わせは、（ａ）配列番号：３の配列を含むＶＨ領域および（ｂ）配列番号：４のアミノ酸配列を含むＶＬ領域；（ａ）配列番号：１５、２１および１７を含むＶＨ、および（ｂ）配列番号：１８−２０を含むＶＬ；ならびに（ａ）配列番号：１５、２１および１７を含むＶＨ、および（ｂ）配列番号：２４および２５および２０を含むＶＬを含む。

別の態様において、本発明は、ＡＣＯ−１またはＡＣＯ−２の重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３を含む抗体、またはその組み合わせを提供する。これらの抗体の各々がＩＦＮ−αに結合することができ、その抗原結合特異性が主としてＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域によって提供されるならば、本発明の他の抗ＩＦＮ−α結合分子を作成するために、ＣＤＲＨ１配列、Ｈ２配列、およびＨ３配列ならびにＣＤＲＬ１配列、Ｌ２配列およびＬ３配列はミックスおよびマッチさせることができる（すなわち、各々の抗体はＣＤＲＨ１、Ｈ２およびＨ３ならびにＣＤＲＬ１、Ｌ２およびＬ３を含有できるが、異なる抗体からのＣＤＲをミックスおよびマッチさせることができる）。以下におよび実施例中に記載される結合分析を使用して、「ミックスおよびマッチ」させたかかる抗体のＩＦＮ−α結合を検査することができる（例えばフローサイトメトリー、ビアコアまたはＥＬＩＳＡ）。好ましくは、ＶＨＣＤＲ配列がミックスおよびマッチされる場合、特定のＶＨ配列からのＣＤＲＨ１配列、Ｈ２配列および／またはＨ３配列は、構造的に類似したＣＤＲ配列により置換される。同様に、ＶＬＣＤＲ配列がミックスおよびマッチさせる場合、特定のＶＬ配列からのＣＤＲＬ１配列、Ｌ２配列および／またはＬ３配列は、構造的に類似したＣＤＲ配列により好ましくは置換される。例えば、ＡＣＯ−１およびＡＣＯ−２のＣＤＲは実質的な構造類似性を共有し、したがってミックスおよびマッチを適用可能である。

したがって、別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号：１５および２２からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１；（ｂ）少なくとも配列番号：１６および２３の残基１〜１２からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、（ｃ）配列番号：１７を含むＣＤＲＨ３；（ｄ）配列番号：１８および２４からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１；（ｅ）配列番号：１９および２５からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２；ならびに（ｆ）配列番号：２０を含むＣＤＲＬ３を含み；ＩＦＮ−αを特異的に結合する、ヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。

好ましい実施形態において、抗体は、（ａ）配列番号：１５を含むＣＤＲＨ１；（ｂ）少なくとも配列番号：１６の残基１〜１２を含むＣＤＲＨ２；（ｃ）配列番号：１７を含むＣＤＲＨ３；（ｄ）配列番号：１８を含むＣＤＲＬ１；（ｅ）配列番号：１９を含むＣＤＲＬ２；および（ｆ）配列番号：２０を含むＣＤＲＬ３を含む。

別の好ましい実施形態において、抗体は、（ａ）配列番号：２２を含むＣＤＲＨ１；（ｂ）少なくとも配列番号：２３の残基１〜１２を含むＣＤＲＨ２；（ｃ）配列番号：１７を含むＣＤＲＨ３；（ｄ）配列番号：２４を含むＣＤＲＬ１；（ｅ）配列番号：２５を含むＣＤＲＬ２；および（ｆ）配列番号：２０を含むＣＤＲＬ３を含む。

好ましい実施形態において、抗体は、（ａ）配列番号：１５を含むＣＤＲＨ１；（ｂ）配列番号：２１を含むＣＤＲＨ２；（ｃ）配列番号：１７を含むＣＤＲＨ３；（ｄ）配列番号：１８を含むＣＤＲＬ１；（ｅ）配列番号：１９を含むＣＤＲＬ２；および（ｆ）配列番号：２０を含むＣＤＲＬ３を含む。

好ましい実施形態において、抗体は、（ａ）配列番号：２２を含むＣＤＲＨ１；（ｂ）少なくとも配列番号：１６の残基１〜１２を含むＣＤＲＨ２；（ｃ）配列番号：１７を含むＣＤＲＨ３；（ｄ）配列番号：１８を含むＣＤＲＬ１；（ｅ）配列番号：１９を含むＣＤＲＬ２；および（ｆ）配列番号：２０を含むＣＤＲＬ３を含む。

好ましい実施形態において、抗体は、（ａ）配列番号：１５を含むＣＤＲＨ１；（ｂ）少なくとも配列番号：１６の残基１〜１２を含むＣＤＲＨ２；（ｃ）配列番号：１７を含むＣＤＲＨ３；（ｄ）配列番号：２４を含むＣＤＲＬ１；（ｅ）配列番号：１９を含むＣＤＲＬ２；および（ｆ）配列番号：２０を含むＣＤＲＬ３を含む。

好ましい実施形態において、抗体は、（ａ）配列番号：１５を含むＣＤＲＨ１；（ｂ）少なくとも配列番号：１６の残基１〜１２を含むＣＤＲＨ２；（ｃ）配列番号：１７を含むＣＤＲＨ３；（ｄ）配列番号：１８を含むＣＤＲＬ１；（ｅ）配列番号：２５を含むＣＤＲＬ２；および（ｆ）配列番号：２０を含むＣＤＲＬ３を含む。
ヒト化抗ＩＦＮ−α抗体バリアント

典型的には抗体のバリアントまたは誘導体は、親抗体と比較して少なくとも１つの改変された特性を有するが、抗体のバリアントまたは誘導体は、以下のものを含むが、これらに限定されない本特許の抗ＩＦＮ−α抗体の機能特性の１つ、いくつか、大部分またはすべてを保持することができる。（ａ）ＩＦＮ−αサブタイプのＡ、２、Ｂ２、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ２、Ｉ、Ｊ１、Ｋ、４ａ、４ｂおよびＷＡに特異的に結合する；（ｂ）ＩＦＮ−αタンパク質サブタイプのＡ、２、Ｂ２、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ２、Ｉ、Ｊ１、Ｋ、４ａ、４ｂもしくはＷＡ；その任意の組み合わせ、またはそのすべての１つまたは複数の生物活性を選択的に中和する；（ｃ）ＩＦＮ−α１またはＩＦＮ−αＤの生物活性を有意に中和しない；（ｄ）ＩＦＮ−αタンパク質サブタイプ上でＡＣＯ−１および／またはＡＣＯ−２と同じエピトープを競合および／または同じエピトープに結合する；（ｅ）９Ｆ３、１３Ｈ５、１３Ｈ７および７Ｈ９のいずれか以上にＡＣＯ−１またはＡＣＯ−２と競合する；（ｆ）Ｋａｂａｔに従うマウスＣＤＲを含むｈｚＡＣＯ−１抗体またはｈｚＡＣＯ−２抗体よりも免疫応答を誘発する可能性が低い；（ｇ）医薬用製剤中で安定である；（ｈ）１０^-8Ｍ以下のＫＤで、ＩＦＮ−αタンパク質サブタイプのＡ、２、Ｂ２、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ２、Ｉ、Ｊ１、Ｋ、４ａ、４ｂまたはＷＡの少なくとも１つに結合する。上で記載された機能特色、および／または実施例中で記載されるような機能特色の任意の組み合わせは、本発明の抗体によって示されうる。

特定の実施形態において、本発明のヒト化抗体は、ＣＤＲＨ１〜Ｈ３配列を含むＶＨ領域およびＣＤＲＬ１〜Ｌ３配列を含むＶＬ領域を含み、１つまたは複数のこれらのＣＤＲ配列は、本明細書において記載された好ましい抗体（ＡＣＯ−１およびＡＣＯ−２またはその保存的修飾物）に基づいて指定されたアミノ酸配列を含み、当該抗体は、本発明の抗ＩＦＮ−α抗体の所望の機能特性を保持または改善する。したがって、本発明は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３配列を含む重鎖可変領域ならびにＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３配列を含む軽鎖可変領域を含み、それらが、（ａ）配列番号：１５および２２からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１ならびにその保存的修飾物；（ｂ）少なくとも配列番号：１６および２３の残基１〜１２からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２ならびにその保存的修飾物、（ｃ）配列番号：１７を含むＣＤＲＨ３およびその保存的修飾物；（ｄ）配列番号：１８および２４からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１ならびにその保存的修飾物；（ｅ）配列番号：１９および２５からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２ならびにその保存的修飾物；ならびに（ｆ）配列番号：２０を含むＣＤＲＬ３およびその保存的修飾物であり；ＩＦＮ−αを特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供する。

したがって、本発明の抗体のＣＤＲまたはＦＲの領域内の１つまたは複数のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基により置換することができ、本明細書において記載された機能分析を使用して、保持された機能（すなわち、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）中で説明された機能）について改変された抗体を検査することができる。

抗体バリアントの機能特性は、当技術分野において利用可能なおよび／または本明細書において記載された標準的な分析を使用して評価することができる。例えば、抗体がＩＦＮ−αを結合する能力は、実施例中で説明されたもの（例えばビアコア、またはＥＬＩＳＡ）などの、標準的な結合分析および生物学的効果（例えばレポーター遺伝子）分析を使用して決定することができる。
可変領域修飾

１つの態様において、本発明は、ＣＤＲまたはフレームワーク領域中に変異を持つヒト化ＡＣＯ−１抗体またはヒト化ＡＣＯ−２抗体を提供する。

ヒト化ＡＣＯ−１中の特定の例示的な変異およびそれらの同定は実施例２および３中に記載される（図１および３も参照）。これらは両方の復帰変異（ヒト化ＡＣＯ−１の中へのＡＣＯ−１残基の導入に加えて、ＡＣＯ−２に由来する残基をヒト化ＡＣＯ−１の中へ導入する変異）を含む。ｈｚＡＣＯ−１ＶＨ（配列番号：３）における例示的な復帰変異は、Ｋａｂａｔナンバリングを使用して、Ｖ５Ｑ、Ｍ６９Ｌ、Ｒ７１Ｖ、Ｔ７３Ｋ、Ｓ７６ＩおよびＶ７８Ａに加えて、その任意の組み合わせを含む。ｈｚＡＣＯ−１ＶＬ（配列番号：６）における例示的な復帰変異は、Ｅ１Ｑ、Ｌ４７Ｗ、Ｉ５８ＶおよびＦ７１Ｙに加えて、その任意の組み合わせを含む。ｈｚＡＣＯ−１ＶＨ（配列番号：３）における例示的なＡＣＯ−２由来変異は、Ｔ２８Ｓ、Ｎ３１Ｓ、Ｉ５８Ｓ、Ｓ７６Ｎ、Ｔ７７ＩおよびＡ９３Ｖに加えて、その任意の組み合わせを含む。ｈｚＡＣＯ−１ＶＬ（配列番号：６）における例示的なＡＣＯ−２由来変異は、Ｄ２９Ｇ、Ｌ３３ＦおよびＳ５０Ｇに加えて、その任意の組み合わせを含む。

さらに、様々なｈｚＡＣＯ−１ＶＨおよびＶＬのバリアント配列は、本発明のｈｚＡＣＯ−１バリアントのライブラリーを作成するために、バリアント配列または親配列と「ミックスおよびマッチ」させることができる。本明細書において記載された結合分析（例えばビアコア、ＥＬＩＳＡ）を使用して、および／または本明細書において記載されるような１つまたは複数の機能分析を使用して、「ミックスおよびマッチ」させたかかる抗体のＩＦＮ−α結合を検査することができる。

１つの実施形態において、本発明は、ヒトＩＦＮ−αを特異的に結合し、ヒトＩＦＮ−αを結合するドナー非ヒト抗体からヒト抗体可変ドメインの中へ取り込まれたアミノ酸を有する可変ドメインを含有し、重鎖可変ドメイン中の５、２８、３１、５８、６９、７１、７３、７６、７８、７９および９３からの選択された１つまたは複数の部位でドナー抗体アミノ酸残基を含む、ヒト化抗体を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、ヒトＩＦＮ−αを特異的に結合し、ヒトＩＦＮ−αを結合するドナー非ヒト抗体からヒト抗体可変ドメインの中へ取り込まれたアミノ酸を有する可変ドメインを含有し、軽鎖可変ドメイン中の１、２９、３３、４７、５０、５８および７１から選択された１つまたは複数の部位でドナー抗体アミノ酸残基を含む、ヒト化抗体を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、ヒトＩＦＮ−αを特異的に結合し、ヒトＩＦＮ−αを結合するＡＣＯ−１からヒト抗体可変ドメインの中へ取り込まれたＣＤＲ配列を有する可変ドメインを含有し、重鎖可変ドメイン中の２８、３１、５８、７６、７７、７８、７９および９３から選択された１つまたは複数の部位でＡＣＯ−２アミノ酸残基をさらに含む、ヒト化ＡＣＯ−１抗体を提供する。特定の実施形態において、ＡＣＯ−２アミノ酸残基は、２８、３１および９３から選択された１つまたは複数の部位である。

１つの実施形態において、本発明は、ヒトＩＦＮ−αを特異的に結合し、ヒトＩＦＮ−αを結合するＡＣＯ−１からヒト抗体可変ドメインの中へ取り込まれたＣＤＲ配列を有する可変ドメインを含有し、軽鎖可変ドメイン中の２９、３３および５０から選択された１つまたは複数の部位でＡＣＯ−２アミノ酸残基をさらに含む、ヒト化ＡＣＯ−１抗体を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、ヒトＩＦＮ−αを特異的に結合し、配列番号：３のＫａｂａｔ残基の３１〜３５、５０〜６５および９５〜１０２の配列に実質的に同一のＶＨＣＤＲ配列を含み、Ｎ３１Ｓ変異を持つ、ｈｚＡＣＯ−１バリアントを提供する。抗体は、例えば、Ｎ３１Ｓ変異を持つ配列番号：１５を含むＣＤＲＨ１配列；配列番号：２１を含むＣＤＲＨ２配列；および配列番号：１７を含むＣＤＲＨ３配列を含むことができる。さらにまたはあるいは、抗体は、Ｎ３１Ｓ変異を持つ配列番号：１５からなるＣＤＲＨ１配列；配列番号：２１からなるＣＤＲＨ２配列；および配列番号：１７からなるＣＤＲＨ３配列を含むことができる。１つの実施形態において、ヒト化ＡＣＯ−１は、ヒトＶＨ１＿４６遺伝子に由来するＶＨフレームワーク残基および／またはヒトＪＨ４遺伝子、好ましくは両方を含む。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、Ｋａｂａｔ位置３１でＮからＳの変異を持つ配列番号：３に対応するＶＨ配列を含む。実施例中で示されるように、ｈｚＡＣＯ−１中のＮ３１Ｓ変異は、ＡＣＯ−１と同等のレベルにＩＦＮ−αＡへの結合親和性を増加させ、ｐＨ３．５および４．５での安定性を増加させた。さらに、残基３１が「ドナー」ＣＤＲ残基中にあるので、さらなるマウス残基は変異によってｈｚＡＣＯ−１配列の中へ導入されず、したがってヒトに投与された場合に抗体に対する免疫応答のリスクを増加させない。同じ利点を持った他のＣＤＲ変異は、ｈｚＡＣＯ−１ＶＬ中にＤ２９ＧおよびＳ５０Ｇを含む。

１つの実施形態において、本発明はヒトＩＦＮ−αを特異的に結合し、Ｔ２８Ｓ変異を持つ配列番号：３のＫａｂａｔ残基の３１〜３５、５０〜６５および９５〜１０２の配列に実質的に同一のＶＨＣＤＲ配列を含むｈｚＡＣＯ−１バリアントを提供する。抗体は、例えば、配列番号：１５を含むＣＤＲＨ１配列；配列番号：２１を含むＣＤＲＨ２配列；および配列番号：１７を含むＣＤＲＨ３配列を含むことができる。さらにまたはあるいは、抗体は、配列番号：１５からなるＣＤＲＨ１配列；配列番号：２１からなるＣＤＲＨ２配列；および配列番号：１７からなるＣＤＲＨ３配列を含むことができる。１つの実施形態において、ヒト化ＡＣＯ−１は、Ｔ２８Ｓ変異をさらに含む、ヒトＶＨ１＿４６遺伝子に由来するＶＨフレームワーク残基を含む。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、Ｋａｂａｔ位置２８でＴからＳの変異を持つ配列番号：３に対応するＶＨ配列を含む。実施例中で示されるように、ｈｚＡＣＯ−１中のＴ２８Ｓ変異は、ＡＣＯ−１と同等のレベルにＩＦＮ−αＡへの結合親和性を増加させ、ｐＨ３．５および４．５での安定性を増加させた。

１つの実施形態において、本発明はヒトＩＦＮ−αを特異的に結合し、Ａ９３Ｖ変異を持つ配列番号：３のＫａｂａｔ残基３１〜３５、５０〜６５および９５〜１０２の配列に実質的に同一のＶＨＣＤＲ配列を含むｈｚＡＣＯ−１バリアントを提供する。抗体は、例えば、配列番号：１５を含むＣＤＲＨ１配列；配列番号：２１を含むＣＤＲＨ２配列；および配列番号：１７を含むＣＤＲＨ３配列を含むことができる。さらにまたはあるいは、抗体は、配列番号：１５からなるＣＤＲＨ１配列；配列番号：２１からなるＣＤＲＨ２配列；および配列番号：１７からなるＣＤＲＨ３配列を含むことができる。１つの実施形態において、ヒト化ＡＣＯ−１は、Ａ９３Ｖ変異をさらに含む、ヒトＶＨ１＿４６遺伝子に由来するＶＨフレームワーク残基およびヒトＪＨ４遺伝子を含む。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、Ｋａｂａｔ位置９３でＡからＶの変異を持つ配列番号：３に対応するＶＨ配列を含む。実施例中で示されるように、ｈｚＡＣＯ−１中のＡ９３Ｖ変異は、ＡＣＯ−１に同等のレベルにＩＦＮ−αＡに結合親和性を増加させ、ＲＧ分析において測定されるようにＩＦＮ効果の阻害の力価を増加させ、ｐＨ３．５および４．５で安定性を増加させた。

１つの実施形態において、本発明は、ヒトＩＦＮ−αを特異的に結合し、配列番号：３のＫａｂａｔ残基の３１〜３５、５０〜６５および９５〜１０２の配列に実質的に同一のＶＨＣＤＲ配列を含み、ＶＨＣＤＲ配列のうちの１つの中に変異をさらに含み、Ｋａｂａｔ残基５８には変異がないｈｚＡＣＯ−１バリアントを提供する。抗体は、例えば、配列番号：３のＫａｂａｔ残基の３１〜３５、５０〜６５および９５〜１０２からなるＶＨＣＤＲを含み、ＶＨＣＤＲ配列のうちの１つの中に変異をさらに含み、Ｋａｂａｔ残基５８はＩである。１つの実施形態において、ヒト化ＡＣＯ−１は、ヒトＶＨ１＿４６遺伝子に由来するＶＨフレームワーク残基およびヒトＪＨ４遺伝子を含む。実施例中で示されるように、ｈｚＡＣＯ−１中のＩ５８Ｓ変異は、ＩＦＮ−αＡへの結合親和性を実質的に低下させ、ＲＧ分析中に測定されたＩＦＮ効果の阻害の力価を低下させた。

別のタイプのフレームワーク修飾は、Ｔ細胞エピトープを除去し、それによって抗体の免疫原性の可能性を減少させるために、フレームワーク領域内の、またはさらに１つまたは複数のＣＤＲ領域内の、１つまたは複数の残基を変異させることを含む。このアプローチは「脱免疫化」とも呼ばれ、Carr et al.によって米国特許公報番号２００３０１５３０４３中にさらに詳細に記載される。
Ｆｃ修飾

さらにまたはフレームワークもしくはＣＤＲの領域内で行われた修飾の代替として、本発明の抗体は、Ｆｃ領域内に修飾を含むように、典型的には、血清半減期、補体固定、Ｆｃ受容体結合、タンパク質安定性、および／または抗原依存的細胞性細胞傷害などの抗体の１つまたは複数の機能特性を改変するか、またはそれらを欠如するように、操作することができる。さらに、本発明の抗体は、化学的に修飾することができる（例えば、１つまたは複数の化学的モイエティを抗体に付加することができる）か、または糖鎖付加を改変するために、さらに抗体の１つまたは複数の機能特性の改変するために修飾することができる。これらの実施形態の各々は、さらに詳細に以下に記載される。Ｆｃ領域中の残基はＫａｂａｔに従ってナンバリングされる。

所望されるならば、抗体のクラスは公知の技術によって「スイッチ」することができるかかる技術は、例えば，直接組換え技術（例えば米国特許４，８１６，３９７を参照）および細胞−細胞融合技術（例えば米国特許５，９１６，７７１を参照）の使用を含む。例えば、ＩｇＭ分子としてもともと産生された抗体は、ＩｇＧ抗体にクラススイッチすることができる。クラススイッチ技術も１つのＩｇＧサブクラスを別のサブクラスに変換するために（例えばＩｇＧ１からＩｇＧ２に）使用することができる。したがって、本発明の抗体のエフェクター機能は、例えば、様々な治療使用のためにＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、ＩｇＧ４抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＥ抗体またはＩｇＭ抗体にアイソタイプスイッチすることによって変化させることができる。定常領域のために例示的なｃＤＮＡ配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（その各々はその全体を参照することによって組み入れられる）によって利用可能であり、以下のとおりである。
ヒトＩｇＧ１定常重鎖領域：ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｊ００２２８；
ヒトＩｇＧ２定常重鎖領域：ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｊ００２３０；
ヒトＩｇＧ３定常重鎖領域：ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｘ０４６４６；
ヒトＩｇＧ４定常重鎖領域：ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｋ０１３１６；および
ヒトκ軽鎖定常領域：ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｊ００２４１。

１つの実施形態において、ＣＨ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域中のシステイン残基の数を改変（例えば、増加または減少）するように修飾される。このアプローチはBodmer et al.による米国特許第５，６７７，４２５号中でさらに説明される。ＣＨ１のヒンジ領域中のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖および重鎖の集合を促進するかまたは抗体の安定性を増加するかもしくは低下させるために改変される。

別の実施形態において、抗体のＦｃヒンジ領域は、抗体の生物学的半減期を低下させるために変異される。より具体的には、１つまたは複数のアミノ酸変異は、天然のＦｃヒンジドメインとブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）の結合と比較して、ＳｐＡ結合が減少するように、Ｆｃヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン境界領域の中へ導入される。このアプローチは、Ward et al.による米国特許第６，１６５，７４５号中でさらに詳細に記載される。別の実施形態において、抗体は生物学的半減期を増加するために修飾される。様々なアプローチが可能である。例えば、Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６ＦとしてWardによる米国特許第６，２７７，３７５号中で記載された１つまたは複数の以下の変異を導入することができる。あるいは、生物学的半減期を増加するために、抗体は、Presta et al.による米国特許第５，８６９，０４６号および第６，１２１，０２２号中で記載されるように、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから取ったサルベージ受容体結合エピトープを含有するようにＣＨ１領域またはＣＬ領域内で改変することができる。さらに他の実施形態において、Ｆｃ領域は、抗体の複数のエフェクター機能を改変するように、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換することによって改変される。例えば、アミノ酸残基の２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０および３２２から選択された１つまたは複数のアミノ酸は、異なるアミノ酸残基を持つ抗体がエフェクターリガンドについて改変された親和性を有するが、親抗体の抗原結合能力を保持するように、置換することができる。親和性が改変されたエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分でありえる。このアプローチは、どちらもWinter et al.による米国特許第５，６２４，８２１号および第５，６４８，２６０号中でさらに詳細に記載される。別の実施例において、アミノ酸残基３２９、３３１および３２２から選択された１つまたは複数のアミノ酸は、異なるアミノ酸残基を持つ抗体が改変されたＣ１ｑ結合を有するようにおよび／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を減少または消失させるように置換することができる。このアプローチは、Idusogie et al.による米国特許第６，１９４，５５１号中でさらに詳細に記載される。別の実施例において、アミノ酸位置２３１および２３９内の１つまたは複数のアミノ酸残基が改変され、その結果として抗体が補体を固定する能力を改変する。このアプローチは Bodmer et al.によるＰＣＴ公報ＷＯ９４／２９３５１中でさらに説明される。さらに別の実施例において、Ｆｃ領域は、２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８または４３９の位置で、１つまたは複数のアミノ酸を修飾することによって、抗体が抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を仲介する能力を増加するように、および／またはＦｃｙ受容体に対する抗体の親和性を増加するように、修飾される。このアプローチはPrestaによるＰＣＴ公報ＷＯ００／４２０７２中でさらに説明される。さらに、ＦｃｙＲｌ、ＦｃｙＲＩＩ、ＦｃｙＲＩＩＩおよびＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ１上の結合部位はマッピングされ、改善された結合を持つバリアントが記載されている（Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604を参照）。位置２５６、２９０、２９８、３３３、３３４および３３９での特異的変異は、ＦｃＲＩＩＩに対する結合を改善することが示された。さらに、Ｔ２５６Ａ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ２２４ＡおよびＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａの組み合わせの変異体はＦｃｙＲＩＩＩ結合を改善することが示された。

定常領域は、抗体を安定化させるように、例えば、二価抗体が２個の一価ＶＨ−ＶＬ断片へと分かれるリスクを減少させるように、さらに修飾することができる。例えば、ＩｇＧ４定常領域において、ヒンジでの完全なジスルフィド架橋形成を可能にするように、残基Ｓ２４１はプロリン（Ｐ）残基に変異させることができる（例えば、Angal et al., Mol Immunol. 1993;30:105-8を参照）。
糖鎖付加修飾

さらに別の実施形態において、抗体の糖鎖付加は修飾される。例えば、糖鎖付加されない抗体を作製することができる（すなわち糖鎖付加が欠如した抗体）。糖鎖付加は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を増加するように改変することができる。かかる炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内の糖鎖付加の１つまたは複数の部位の改変によって遂行することができる。
抗原結合断片

本発明の抗ＩＦＮ−α抗体は、全長抗体またはその抗原結合断片として調製することができる。抗原結合断片の実例は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ'断片、Ｆ（ａｂ）２断片、Ｆ（ａｂ'）２断片、Ｆ（ａｂ）３断片、Ｆｖ断片（典型的には抗体の単腕のＶＬドメインおよびＶＨドメイン）、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ；例えば、Bird et al., Science 1988;242:423-426;およびHuston et al. PNAS 1988;85:5879-5883を参照）、ｄｓＦｖ、Ｆｄ（典型的にはＶＨドメインおよびＣＨ１ドメイン）、およびｄＡｂ断片（典型的にはＶＨドメイン）；ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、ＶｈＨドメインおよびＶ−ＮＡＲドメイン；単一のＶＨ鎖および単一のＶＬ鎖を含む一価分子；ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディおよびκボディ（例えば、Ill et al., Protein Eng 1997;10:949-57を参照）；ラクダＩｇＧ；ＩｇＮＡＲ；これらに加えて単離ＣＤＲまたは抗原結合残基もしくは抗原結合ポリペプチドが、機能的抗体断片を形成するようにともに結合または連結される１つまたは複数の単離ＣＤＲまたは機能的パラトープを含む。様々なタイプの抗体断片は、例えば、Holliger and Hudson, Nat Biotechnol 2005;23:1126-1136；ＷＯ２００５０４０２１９、ならびに公開済み米国特許出願２００５０２３８６４６および２００２０１６１２０１中で記載または概説された。

抗体断片は従来の組換え技術またはタンパク質工学技術を使用して得ることができ、断片はインタクトな抗体と同じ方式で抗原結合機能または他の機能についてスクリーニングすることができる。

様々な技術は抗体断片の産生のために開発されている。従来、これらの断片は全長抗体のタンパク分解によって得られた（例えば、Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24:107-117 (1992)；およびBrennan et al., Science, 229:81 (1985)を参照）。しかしながら、今やこれらの断片は組換え宿主細胞によって直接生産することができる。あるいは、Ｆａｂ'−ＳＨ断片を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から直接回収し、Ｆ（ａｂ'）２断片を形成するために化学的にカップリングすることができる（Carter et al., Bio/Technology, 10:163-167 (1992)）。別のアプローチによれば、Ｆ（ａｂ'）２断片は組換え宿主細胞培養から直接単離することができる。他の実施形態において、選択した抗体は一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ１９９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号；および米国特許第５，５８７，４５８号を参照。例えば、抗体断片は、例えば米国特許第５，６４１，８７０号中で記載されるような「直鎖状抗体」でもありえる。かかる直鎖状抗体断片は単一特異性または二重特異性でありえる。
多重特異性分子

別の態様において、本発明は、本発明の抗ＩＦＮ−α抗体またはその抗原断片を含む多重特異性分子を特色とする。かかる多重特異性分子は、ＩＦＮ−αに対する少なくとも１つの第１の結合特異性および第２の標的エピトープに対する第２の結合特異性を含む二重特異性分子を含む。

１つのタイプの二重特異性分子は二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。二重特異性抗体を作製する方法は、当技術分野において公知であり、全長の二重特異性抗体の従来の産生は、２鎖が異なる特異性を有する２個の免疫グロブリン重鎖−軽鎖ペアの共発現に通常は基づく（Millstein et al., Nature, 305: 537-539 (1983)）。二重特異性抗体は、全長抗体もしくは抗体断片（例えばＦ（ａｂ'）２二重特異性抗体）または本明細書において記載される他の抗原結合断片として調製することができる。

他の多重特異性分子は、ＩＦＮ−α結合抗体モイエティを１つまたは複数の他の非抗体タンパクへ融合することから産生されたものを含む。かかる多重特異性タンパク質およびそれらの構築法は当技術分野において記載されている。例えば、Dreier et al.(Bioconjug. Chem. 9(4): 482-489 (1998)）；米国特許第６，０４６，３１０号；米国特許公開番号第２００３０１０３９８４号；ヨーロッパ特許出願第１４１３３１６号；米国特許公報番号第２００４００３８３３９号；von Strandmann et al., Blood (2006;107:1955-1962)、およびＷＯ２００４０５６８７３を参照。

２以上の価数を持つ多重特異性分子も意図される。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt et al., J. Immunol, 147:60 (1991)。

本発明の多重特異性分子は当技術分野において公知の方法を使用して、成分結合特異性をコンジュゲートすることによって調製することができる。例えば、多重特異性分子の結合特異性は各々個別に生成され、次いで互いへコンジュゲートすることができる。結合特異性がタンパク質またはペプチドである場合、様々なカップリングまたは架橋剤を共有結合性コンジュゲーションのために使用することができる。架橋剤の実例は、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオ酢酸（ＳＡＴＡ）、５，５'−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、およびスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（スルホ−ＳＭＣＣ）を含む（例えば、Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648を参照）。他の方法は、Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83、およびGlennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375中で記載されたものを含む。好ましいコンジュゲート剤はＳＡＴＡおよびスルホ−ＳＭＣＣであり、両方ともピアース・ケミカル（ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌ）社（ロックフォード、イリノイ）から利用可能である。

結合特異性が抗体である場合、それらは、２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルチドリル（ｓｕｌｔｈｙｄｒｙｌ）結合によってコンジュゲートすることができる。特に好ましい実施形態において、ヒンジ領域は、コンジュゲーションの前に奇数のスルフヒドリル残基（好ましくは１つ）を含有するように修飾される。

あるいは、両方の結合特異性を同じベクター中にコードし、同じ宿主細胞中で発現させ、集合させることができる。二重特異性分子が、モノクローナル抗体×モノクローナル抗体、モノクローナル抗体×Ｆａｂ、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ'）２、またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合、この方法は特に有用である。本発明の二重特異性分子は、１つの一本鎖抗体および結合決定基を含む一本鎖分子、または２つの結合決定基を含む一本鎖二重特異性分子でありえる。二重特異性分子は少なくとも２つの一本鎖分子を含むことができる。二重特異性分子を調製する方法は、例えば、米国特許第５，２６０，２０３号；米国特許第５，４５５，０３０号；米国特許第４，８８１，１７５号；米国特許第５，１３２，４０５号；米国特許第５，０９１，５１３号；米国特許第５，４７６，７８６号；米国特許第５，０１３，６５３号；米国特許第５，２５８，４９８号；米国特許第５，４８２，８５８号；米国特許出願公報第２００３００７８３８５号、Kontermann et al., (2005) Acta Pharmacological Sinica 26(1):1-9; Kostelny et al., (1992) J. Immunol. 148(5):1547-1553; Hollinger et al., (1993) PNAS (USA) 90:6444-6448；およびGruber et al. (1994) J. Immunol. 152: 5368。中で記載または概説される。
抗体誘導体

本発明の範囲内の抗体誘導体（または免疫コンジュゲート）は、第２の薬剤にコンジュゲートまたは共有結合された抗ＩＦＮ−α抗体を含む。

例えば、１つの態様において、本発明は、細胞傷害剤にコンジュゲートまたは共有結合された抗体を含む免疫コンジュゲートを提供し、当該細胞傷害剤は、治療用放射性同位体、毒性タンパク質、薬物などの毒性低分子、毒素、免疫修飾物質、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、酵素、オリゴヌクレオチド、酵素阻害剤、治療用放射性核種、血管新生阻害剤、化学療法薬、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、エピドフィロトキシン、タキサン、抗代謝物質、アルキル化剤、抗生物質、ＣＯＸ−２阻害剤、ＳＮ−３８、抗有糸分裂物質、抗血管新生剤およびアポトーシス剤、特にドキソルビシン、メトトレキサート、タキソール、ＣＰＴ−１１、カンプトテカン、ナイトロジェンマスタード、ゲムシタビン、アルキルスルホナート、ニトロソウレア、トリアゼン、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、プラチナ配位錯体、緑膿菌外毒素、リシン、アブリン、５−フルオロウリジン、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、ＤＮａｓｅＩ、ブドウ球菌腸毒素Ａ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素および緑膿菌内毒素ならびに他のものから選択することができる（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、第１９版（マック出版社（ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．）、１９９５）；Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics（マグロウヒル（ＭｃＧｒａｗＨｉｌｌ）社、２００１年）；Pastan et al. (1986) Cell 47:641;Goldenberg (1994) Cancer Journal for Clinicians 44:43；米国特許第６，０７７，４９９号を参照；その開示全体は参照することにより本明細書に組み入れられる）。毒素は、動物起源、植物起原、真菌起原もしくは微生物起源でありえるか、または化学合成によってデノボに作成できることが認識される。

別の実施形態において、抗体は、治療用放射性核種または検出目的に適切な放射性核種などの放射性同位体で誘導体化される。多数の適切な放射性同位体のいずれかは、Ｉ−１３１、インジウム−１１１、ルテチウム−１７１、ビスマス−２１２、ビスマス−２１３、アスタチン−２１１、銅−６２、銅−６４、銅−６７、イットリウム−９０、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１３１、リン−３２、リン−３３、スカンジウム−４７、銀−１１１、ガリウム−６７、プラセオジム−１４２、サマリウム−１５３、テルビウム−１６１、ジスプロシウム−１６６、ホルミウム−１６６、レニウム−１８６、レニウム−１８８、レニウム−１８９、鉛−２１２、ラジウム−２２３、アクチニウム−２２５、鉄５９、セレニウム−７５、ヒ素−７７、ストロンチウム−８９、モリブデン−９９、ロジウム−１０５、パラディウム−１０９、プラセオジム−１４３、プロメチウム−１４９、エルビウム−１６９、イリディアム−１９４、金−１９８、金−１９９および鉛−２１１を含むが、これらに限定されずに使用することができる。一般に、放射性核種は、好ましくはオージェ放射体については２０乃至６，０００ｋｅＶの範囲、好ましくは６０乃至２００ｋｅＶの範囲、β放射体については１００〜２，５００ｋｅＶ、およびα放射体については４，０００〜６，０００ｋｅＶの崩壊エネルギーを有する。さらに、α粒子を生成して実質的に崩壊する放射性核種が好ましい。

本発明の抗体コンジュゲートは既定の生物学的応答を修飾するために使用することができ、薬物モイエティは古典的な化学的治療剤に限定されると解釈されるべきでない。例えば、薬物モイエティは所望の生物学的活性を保持するタンパク質またはポリペプチドでありえる。かかるタンパク質は、例えば、アブリン、リシンＡ、緑膿菌外毒素もしくはジフテリア毒素などの酵素的に活性な毒素もしくはその活性断片；腫瘍壊死因子もしくはインターフェロン−ｙなどのタンパク質；または、例えば、リンホカイン、インターロイキン１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）もしくは他の増殖因子などの生物応答修飾因子を含むことができる。

第２の薬剤は、非常に多数の利用可能な方法のいずれかを使用して、抗体に対して直接または間接的に連結することができる。例えば、薬剤は、Ｎ−スクシニル３−（２−ピリジルジチオ）プロプリオネートなどの架橋剤を使用するジスルフィド結合形成を介して還元された抗体成分のヒンジ領域で、または抗体のＦｃ領域中の炭水化物モイエティを介して付加することができる（例えば、Yu et al. (1994) Int. J. Cancer 56: 244;Wong、Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking（ＣＲＣ出版（ＣＲＣＰｒｅｓｓ）社１９９１）；Monoclonal antibodies: principles and applications、Birch et al.（編）中のUpeslacis et al.、「Modification of Antibodies by Chemical Methods」、１８７〜２３０ページ（ワイリー−リス社（Ｗｉｌｅｙ−ＬｉｓｓＩｎｃ．）１９９５）；Monoclonal antibodies: Production, engineering and clinical application、Ritter et al.（編）中のPrice、「Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies」、６０〜８４ページ（ケンブリッジ大学出版（ＣａｍｂｒｉｄｇｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ）社１９９５）、Cattel et al. (1989) Chemistry today 7:51-58、Delprino et al. (1993) J. Pharm. Sci 82:699-704;Arpicco et al. (1997) Bioconjugate Chernistry 8:3;Reisfeld et al. (1989) Antihody, Immunicon. Radiopharrn. 2:217を参照；その各々の開示全体は参照することにより本明細書に組み入れられる）。例えば、Monoclonal Antibodies And Cancer TherapyReisfeld et al.（編）中のArnon et al.、「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」、２４３〜５６ページ（アランＲ．リス社（ＡｌａｎＲ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）1985;Controlled Drug Delivery（第２版）、Robinson et al.（編）中のHellstrom et al.、「Antibodies For Drug Delivery」、６２３〜５３ページ（マルセルデッカー社（ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）１９８７）；Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications、Pinchera et al.（編）中のThorpe、「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review」、４７５〜５０６ページ（１９８５）；Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy、Baldwin et al.（編）中の「Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」、３０３〜１６ページ（アカデミックプレス（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）社１９８５）、およびThorpe et al.、「The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates」、Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)も参照。

細胞毒素のタイプ、リンカー、および抗体への治療剤のコンジュゲート法のさらなる考察については、Saito, G. et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail, P.A. et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. and Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. and Springer, C.J. (2001)Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264も参照。

他の実施形態では、第２の薬剤は検出可能なモイエティであり、定量的にまたは定性的に観察または測定できる任意の分子でありえる。本発明のコンジュゲートされた抗体において有用な検出可能なマーカーの実例は、放射性同位体、蛍光色素、または抗原／抗体（ＩＦＮ−αに対する抗体以外）、レクチン／炭水化物；アビジン／ビオチン；受容体／リガンド；もしくは分子インプリントポリマー／プリント分子システムのうちの任意の１つのメンバーのような相補的結合ペアのメンバーである。

第２の薬剤は、さらにまたはあるいは、ポリマーでありえ、例えば抗体の血中循環半減期を増加するように意図される。例示的なポリマーおよびペプチドへのかかるポリマーを付加する方法は、例えば、米国特許第４，７６６，１０６号；第４，１７９，３３７号；第４，４９５，２８５号；および第４，６０９，５４６号中で示される。追加の例示的なポリマーは、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）モイエティを含む。本明細書において使用される時、用語「ポリエチレングリコール」は、他のタンパク質を誘導体化するために使用されるＰＥＧの任意の形態（モノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−ポリエチレングリコールもしくはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドなど）を包含することを意図する。例えば、全長抗体または抗体断片を、約１，０００乃至約４０，０００の間（約２０００乃至約２０，０００の間、例えば約３，０００〜１２，０００など）の分子量を持つ１つまたは複数のＰＥＧ分子にコンジュゲートすることができる。抗体またはその断片をＰＥＧ付加するために、典型的には、１つまたは複数のＰＥＧ基が抗体または抗体断片に対して付加されるようになる条件下で、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と抗体または断片を反応させる。好ましくは、ＰＥＧ付加は、反応性ＰＥＧ分子（または類似した反応性水溶性高分子）によるアシル化反応またはアルキル化反応を介して実行される。特定の実施形態において、ＰＥＧ付加された抗体は糖鎖付加されない抗体である。タンパク質をＰＥＧ付加する方法は、当技術分野において公知であり、本発明の抗体に適用することができる。例えば、Nishimura et al.によるＥＰ０１５４３１６およびIshikawa et al.によるＥＰ０４０１３８４を参照する。
抗体の特性評価

産生もしくは精製の後に、またはスクリーニング手順または選択手順の一部として、本発明の抗ＩＦＮ−α抗体の機能特性を調べることができる。

以下は抗体の特性評価のための例示的な分析の簡潔な説明である。いくつかは他のセクション中でさらに記載され、および／または実施例中で記載される。
結合分析

本発明は、ＩＦＮ−αを結合する抗体ならびに抗原結合断片およびその免疫コンジュゲートを提供する。ＩＦＮ−αへの抗体の結合を評価するために任意の様々な分析を使用することができる。ＥＬＩＳＡ、放射免疫分析、ウエスタンブロッティング、ビアコアおよび競合分析に基づいたプロトコールは、とりわけ使用に適切であり、当技術分野において周知である。

例えば、単純な結合分析を使用することができ、その分析において、標的タンパク質または標的エピトープ（例えば、Ａ、２、Ｂ２、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ２、Ｉ、Ｊ１、Ｋ、４ａ、４ｂ、ＷＡ、１およびＤから選択されたＩＦＮ−αタンパク質サブタイプ、その部分、またはその任意の組み合わせ）の存在下で、試験抗体をインキュベーションし、未結合抗体を洗浄し、結合抗体の存在を、例えばＲＩＡおよびＥＬＩＳＡなどを使用して評価する。かかる方法は当業者に周知である。対照の非特異的抗体で見られる量を上回る任意の結合量は、抗体が標的に特異的に結合することを示す。

かかる分析において、試験抗体がヒトＩＦＮ−αに結合する能力は、（陰性）対照タンパク質（例えば、構造的に無関係な抗原に対して作製された抗体、または非Ｉｇペプチドもしくはタンパク質）が、同じ標的に結合する能力と比較することができる。任意の適切な分析を使用して、対照タンパク質に比べて、２５％、５０％、１００％、２００％、１０００％、またはそれ以上増加した親和性能力を持つ、ＩＦＮ−αに結合する抗体または断片は、標的に「特異的に結合する」、または標的と「特異的に相互作用する」と考えられ、以下で記載される治療方法における使用に好ましい。試験抗体が、ＩＦＮ−αに対する（陽性）対照抗体（例えばヒト化ＡＣＯ−１抗体またはヒト化ＡＣＯ−２抗体）の結合を影響する能力も評価することができる。

１つの態様において、本発明は、ヒト化ＡＣＯ−１抗体またはヒト化ＡＣＯ−２抗体と、生物学的特徴および／または実質的なＶＨ配列および／またはＶＬ配列を共有する、ヒト化された抗ＩＦＮ−α抗体を提供する。１つの例示的な生物学的特徴は、ＡＣＯ−１エピトープまたはＡＣＯ−２エピトープ（すなわち、ＡＣＯ−１抗体およびＡＣＯ−２抗体が結合する特定のＩＦＮ−αタンパク質サブタイプの細胞外ドメイン中のそれぞれの領域）への結合である。ＡＣＯ−１エピトープまたはＡＣＯ−２エピトープに結合する抗体についてスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ed Harlow and David Lane(1988)中で記載されたものなどのルーチンの交差ブロック分析を行なうことができる。

例示的な交差ブロック分析または競合分析において、ＡＣＯ−１またはＡＣＯ−２の（対照）抗体、および試験抗体を混合（またはあらかじめ吸着）し、ＩＦＮ−αを含有するサンプルに適用する。特定の実施形態において、ＩＦＮ−α含有サンプルに適用する前の期間に、対照抗体を様々な量の試験抗体（例えば１：１０または１：１００）とあらかじめ混合する。他の実施形態において、対照抗体および様々な量の試験抗体を、抗原／標的サンプルへの曝露の間に単純に混合することができる。結合した抗体から遊離抗体を区別することができる限り（例えば未結合抗体を除去するために分離技術または洗浄技術を使用することによって）、および試験抗体から対照抗体を区別することができる限り（例えば、種特異的二次抗体もしくはアイソタイプ特異的二次抗体の使用によって、検出可能な標識で対照抗体を特異的に標識することによって、または異なる化合物間を区別する質量分析などの物理的方法の使用によって）、試験抗体が抗原に対する対照抗体の結合を減少させ、試験抗体が対照抗体と実質的に同じエピトープを認識することを示すかどうかを決定することができる。この分析において、完全に無関係な抗体の存在下における（標識）対照抗体の結合は、対照の高値である。対照の低値は、未標識対照抗体と共に標識（陽性）対照抗体をインキュベーションし、競合させて標識抗体の結合を減少させることによって得られる。

試験分析において、試験抗体の存在下における標識抗体反応性の有意な減少は、同じエピトープを認識する試験抗体（すなわち標識対照抗体と「交差反応する」抗体）を表す。抗原／標的に対する標識対照の結合を、約１：１０乃至約１：１００の間の対照：試験の抗体または化合物の任意の比で、少なくとも５０％、またはより好ましくは７０％まで減少させる任意の試験抗体または化合物は、対照と実質的に同じエピトープまたは決定基に対して結合する抗体または化合物であると見なされる。好ましくは、かかる試験抗体または化合物は、抗原／標的に対する対照の結合を少なくとも９０％まで減少させる。しかしながら、対照抗体または化合物の結合を測定可能な程度まで減少させる任意の化合物または抗体を、本発明において使用することができる。
生物学的活性

単球の分化。活性化されたＴリンパ球およびＢリンパ球の生成は、抗原提示細胞（「ＡＰＣ」）の動員および成熟を必要とする。これらのＡＰＣはＢ細胞、単球／マクロファージおよび樹状細胞を含む。ＳＬＥ患者の血清は、ＤＣを活性化することができるＩＦＮ−αを含有し、活性化された活性は、本発明に従うヒト化抗体調製物によりブロックすることができる。この活性を検出および定量する方法は科学文献および特許文献中に記載される（例えば特許公報第ＵＳ２００４００６７２３２Ａ１号のパラグラフ０１３６乃至０１５０を参照、その関係する部分は参照することにより本明細書に組み入れられる）。

ＭｘＡプロモーターの活性化。ＩＦＮ−αがＭｘＡプロモーターを活性化する能力、およびこの活性化をブロックする本発明の抗ＩＦＮ−αモノクローナル抗体の能力は、レポーター遺伝子（ＲＧ）分析（ＭｘＡプロモーターはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）またはルシフェラーゼ（ｌｕｃ）などのレポーター遺伝子、好ましくはルシフェラーゼに融合されている）を使用して、測定することができる。ＣＡＴおよびルシフェラーゼのための分析は当業者に公知である。好ましくは、ＭｘＡプロモーターの活性は、ＭｘＡプロモーター／レポーター遺伝子融合コンストラクトにより安定的に形質転換されたＡ５４９細胞において測定される。Ａ５４９細胞は、ＡＴＣＣ（製品番号ＣＣ１−１８５）を介して入手可能な肺癌細胞株である。ＭｘＡ（別名Ｍｘｌ）プロモーターはヒト、マウスまたはラットでありえる。ヒトＭｘＡプロモーターの配列および構造は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ５５６３９、Chang et al. (1991) Arch Virol. 117:1-15;およびRonni et al. (1998) J Interferon Cytokine Res. 18:773-781中で開示される。ヒトＭｘＡプロモーター／ルシフェラーゼ融合コンストラクトおよびルシフェラーゼ分析は、特許公報ＵＳ２００４０２０９８００およびRosmorduc et al. (1999) J of Gen Virol 80:1253-1262中で開示される。ヒトＭｘＡプロモーター／ＣＡＴ融合コンストラクトおよびＣＡＴアッセイは、Fernandez et al. (2003) J Gen Virol 84:2073-2082 and Fray et al. (2001) J Immunol Methods 249:235-244中で開示される。マウスＭｘＡ（Ｍｘｌ）プロモーターはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｍ２１１０４；Hug et al. (1988) Mol Cell Biol 8:3065-3079;およびLleonart et al. (1990) Biotechnology 8:1263-1267中で開示される。マウスＭｘＡプロモーター／ルシフェラーゼ融合コンストラクトおよびルシフェラーゼ分析は、Canosi et al. (1996) J Immunol Methods 199:69-67中で開示される。

細胞変性効果阻害（ＣＰＥ）分析。ＣＰＥ分析はインターフェロンの抗ウイルス活性に基づく。一般に、適切な細胞株をインターフェロンの存在下においてウイルスに感染させ、インターフェロンの阻害活性をウイルス増殖プロセスまたは複製プロセスで定量する。分析の計測値は、ウイルス収率の減少、ウイルスの細胞変性効果の減少、ＲＮＡ合成のウイルスタンパク質の減少、ウイルスプラーク形成の減少に基づく。細胞変性の分析は、インターフェロンの活性に対する抗体の中和効果を決定するために使用することができる。例示的なＣＰＥ分析は、Clemens, M.J., Morris, A.G., Gearing, A.J.H.（編）、Lymphokines and interferons: A Practical Approach中のMeager, A. 1987、Quantification of interferons by anti-viral assays and their standardization、ＩＲＬ出版（ＩＲＬＰｒｅｓｓ）社、オックスフォード、１２９ページおよびBilliau, A.（編）Interferon、１巻：General and Applied Aspects中のGrossberg and Sedmak、1984、Assays of interferons、エルゼビア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）社、アムステルダム、１８９ページ、ならびにＰＣＴ公開ＷＯ２００６０８６５８６の実施例６、パラグラフ１５７〜１６４および図１中で記載される。
医薬用製剤

本発明の別の目的は、１０〜５００ｍｇ／ｍｌ（例えば２０〜３００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは３０〜１００ｍｇ／ｍｌ、および最も好ましくは５０〜１００ｍｇ／ｍｌなど）の濃度で存在する［タンパク質］化合物を含み、２．０乃至１０．０のｐＨを有する医薬用製剤を提供することである。製剤は、バッファーシステム、防腐剤（複数可）、等張化剤（複数可）、キレート剤（複数可）、安定剤および界面活性剤をさらに含むことができる。本発明の１つの実施形態において、医薬用製剤は、水性製剤（すなわち水を含む製剤）である。かかる製剤は典型的には溶液または懸濁物である。本発明のさらなる実施形態において、医薬用製剤は水性溶液である。用語「水性製剤」は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む製剤として定義される。同様に、用語「水性溶液」は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む溶液として定義され、用語「水性懸濁物」は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む懸濁物として定義される。

別の実施形態において、医薬用製剤は凍結乾燥した製剤であり、医師または患者は、使用の前に溶媒および／または希釈剤をそれへ加える。

別の実施形態において、医薬用製剤は、事前の溶解を伴わない使用のための準備済みの乾燥した製剤（例えば、凍結乾燥または噴霧乾燥された）である。
診断適用

本発明のＩＦＮ−α抗体は非治療適用も有する。例えば、抗ＩＦＮ−α抗体は、ＩＦＮ−αタンパク質についての診断分析（例えば、特定の細胞、組織または血清中のＩＦＮ−αタンパク質の発現を検出する）においても有用でありえる。例えば、抗ＩＦＮ−α処置のために患者を選択する分析において抗ＩＦＮ−α抗体を使用することができる。かかる目的のために、血清または組織標本中のＩＦＮ−αの存在の分析に抗ＩＦＮ−α抗体を使用することができる。診断適用のために、抗体は典型的には検出可能なモイエティにより標識される。
治療適用

本明細書において記載されるようなヒト化抗ＩＦＮ−α抗体を使用して、患者を処置する方法も本発明によって提供される。１つの実施形態において、本発明は、ヒト患者への投与のための医薬組成物の調製物中での本明細書において記載されるようなヒト化抗体の使用を提供する。典型的には、患者は、サブタイプのＡ、２、Ｂ２、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ２、Ｉ、Ｊ１、Ｋ、４ａ、４ｂおよびＷＡからなる群から選択された少なくとも１つのＩＦＮ−αサブタイプの異常な発現と関連する自己免疫性または炎症性の疾患または障害を患うか、またはそれらに罹患するリスクがある。

本発明の抗体により処置される例示的な症状または障害は、狼瘡（例えば全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ））、関節リウマチ、若年性慢性関節炎、骨関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症（硬皮症）、特発性炎症性筋疾患（皮膚筋炎、多発性筋炎）、シェーグレン症候群、脈管炎、全身性血管炎、サーコイドーシス、自己免疫溶血性貧血（免疫性汎血球減少症、発作性夜間血色素尿症）、自己免疫性血小板減少症（特発性血小板減少性紫斑病、免疫介在性血小板減少症）、甲状腺炎（グレーヴス病、橋本甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）、糖尿病、免疫介在性腎臓疾患（糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎）、中枢神経系および末梢神経系の脱髄症（多発性硬化症、特発性脱髄性多発ニューロパシーまたはギラン‐バレー症候群、および慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチーなど）、伝染性肝炎などの肝胆道系疾患（Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎および他の非肝指向性ウイルス）、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎および硬化性胆管炎、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病）、セリアック病、グルテン過敏性腸疾患およびウィップル病、自己免疫性皮膚病または免疫介在性皮膚病（水疱性の皮膚病、多形性紅斑および接触性皮膚炎を含む）、乾癬、アレルギー性疾患（喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症および蕁麻疹など）、肺の免疫疾患（好酸球性肺炎、特発性肺線維症および過敏性肺炎など）、ならびに移植関連疾患（移植拒絶および移植片対宿主病を含む）を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態において、疾患、症状または障害は、狼瘡、シェーグレン症候群、乾癬、糖尿病、関節リウマチおよび若年性皮膚筋炎から選択される。別の特定の実施形態において、疾患、症状または障害はＳＬＥである。例えば、１つの態様において、抗ＩＦＮ−α抗体は、鎮痛剤、免疫抑制物質、コルチコステロイド、抗ＴＮＦα薬剤または他の抗サイトカイン剤もしくは抗サイトカイン受容体剤を含むが、これらに限定されない１つまたは複数の他の抗炎症剤ならびに抗血管新生剤と組み合わせて使用される。特定の実施例は、メトトレキサート、ＴＳＧ−６、リツキサン（登録商標）およびＣＴＬＡ４−Ｆｃ融合タンパク質を含む。組合せ療法のさらなる実例は以下で提供される。
製造品

本発明の別の実施形態において、上記の障害の処置のために有用な材料を含有する製造品が提供される。例えば、製造品は、ヒトにおける自己免疫性または炎症性の疾患または障害などの障害を効果のある量の抗体で処置するように使用者を導く説明書と共に、本明細書において記載されるようなヒト化抗ＩＦＮ−α抗体を含有する容器を含むことができる。製造品は、典型的には、容器、および容器上のまたは容器に付けられたラベルまたはパッケージ挿入物を含む。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジなどを含んでいる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成されうる。容器は、症状の処置のために効果的な組成物を保持し、滅菌済み接近ポート（例えば、容器は皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静注溶液バッグまたはバイアルでありえる）を有することができる。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は、本明細書のヒト化抗ＩＦＮ−α抗体、またはかかる抗体を含む抗原結合断片もしくは抗体誘導体（例えば免疫コンジュゲート）である。ラベルまたはパッケージ挿入物は、例えばＳＬＥなどの選択した症状の処置のために組成物が使用されることを示す。

さらに、製造品は、（ａ）本明細書のヒト抗体またはヒト化抗体を含み、容器中に含有される組成物を持つ第１の容器と、（ｂ）ヒト抗体またはヒト化抗体以外の治療剤を含み、容器中に含有される組成物を持つ第２の容器とを含むことができる。本発明のこの実施形態における製造品は、自己免疫性または炎症性の疾患または障害を処置するために第１の組成物および第２の組成物を併用して使用できることを示すパッケージ挿入物をさらに含むことができる。かかる治療剤は、前のセクション中で記載される任意の補助治療法でありえる。あるいはまたはさらに、製造品は、静菌注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液などの薬学的に許容されるバッファーを含む第２の（または第３の）容器をさらに含むことができる。製造品は、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針およびシリンジを含む、商業的見地および使用者の見地から望ましい他の材料をさらに含むことができる。

第１の態様において、したがって、本発明は、ヒトインターフェロン−α（ＩＦＮ−α）を特異的に結合するヒト化抗体またはその抗原結合断片であって、ヒト化抗体がＫａｂａｔに従うマウス相補性決定領域（ＣＤＲ）よりも少ないドナーアミノ酸残基を含むマウス抗体のＡＣＯ−１もしくはＡＣＯ−２またはその組み合わせのヒト化バージョンである、ヒト化抗体またはその抗原結合断片に関する。

第２の態様において、したがって、本発明は、ＩＦＮ−αを特異的に結合するヒト化抗体またはその抗原結合断片であって、該抗体がＩＦＮ−αサブタイプのＡ、２、Ｂ２、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ２、Ｉ、Ｊ１、Ｋ、４ａ、４ｂおよびＷＡを結合することが可能であるが、サブタイプの１またはＤを結合することが可能ではなく、該抗体がＫａｂａｔに従う非ヒトＣＤＲよりも少ないドナーアミノ酸残基を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合断片に関する。

１つの実施形態によれば、ＣＤＲＨ２ドナー残基はＫａｂａｔ残基５０〜５９を含む。別の実施形態において、該抗体は、ＩＦＮ−αサブタイプ上でＡＣＯ−１抗体および／またはＡＣＯ−２抗体と同じエピトープを競合および／または同じエピトープに結合する。好ましい実施形態によれば、抗体はＩｇＧ４サブタイプである。

好ましい実施形態において、抗体は配列番号：２１に従うＣＤＲＨ２配列を含む。

第３の態様において、本発明は本発明に従って抗体を生産する方法であって、適切な条件下で該抗体をコードする宿主細胞をインキュベーションすることおよび続いて該抗体を単離することを含む方法に関する。本発明は、かかる方法によって、得られる抗体または得ることが可能な抗体にさらに関する。

第３の態様において、本発明は、本発明に従う抗体を含む組成物に関する。本発明は、本発明に従う組成物の調製物のためのプロセスであって、該方法が抗体またはその断片を賦形剤と混合することを含むプロセスにさらに関する。本発明は、かかる方法によって、得られる組成物または得ることが可能な組成物にさらに関する。

第５の態様において、本発明は、ＩＦＮ−αに関連するＩＦＮｌａｍｍａｔｏｒｙ疾患（IFNlammatory disease）または障害を防止、管理、処置、または寛解する方法であって、それを必要とする被験者に予防的または治療的に効果のある量の本発明に従う抗体を投与することを含む方法に関する。

最後に、本発明は、炎症性疾患の処置のために適切な医薬品の調製のための本発明に従う抗体の使用に関する。

本発明のさらなる詳細は、以下の非限定的実施例によって示される。
実施例１−マウスＡＣＯ−１抗体およびマウスＡＣＯ−２抗体の配列決定

この実施例は、ＷＯ２００６００８６５８６中で記載される、マウス抗体ＡＣＯ−１およびＡＣＯ−２の配列決定および組換え発現に加えて、ＡＣＯ−２のＶＨ配列およびＶＬ配列のＢＬＡＳＴ検索を記載する。
抗体クローニングおよび配列決定

キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）社からのＲＮｅａｓｙ（＃６３４９１４）を使用して、ハイブリドーマ（ＡＣＯ−１．５．２およびＡＣＯ−２．２．１）から全ＲＮＡを抽出した。クロンテック（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）社からのＳＭＡＲＴ−ＲＡＣＥｃＤＮＡ増幅キットを使用して１μｇの全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。反応を４２℃で１．５時間実行し、７５μｌのトリシン−ＥＤＴＡ中でサンプルを希釈した。鋳型として５μｌのｃＤＮＡを使用して５０μｌの反応中で標的のＰＣＲ増幅を実行した。重鎖および軽鎖の両方のためのフォワードプライマーは、ＳＭＡＲＴＲＡＣＥキット中に含まれるユニバーサルプライマー混合物（ＵＰＭ）であった。ＡＣＯ−１重鎖（ＨＣ）のためのリバースプライマー配列は以下のようにデザインされた。
５'−ＣＴＧＧＧＣＣＡＧＧＴＧＣＴＧＧＡＧＧ（配列番号：１１）および、ＡＣＯ−１軽鎖（ＬＣ）のためのものは
５'−ＣＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣ（配列番号：１２）。
ＡＣＯ−２重鎖（ＨＣ）のためのリバースプライマー配列は以下のようにデザインされた。
５'−ＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＣＧＧＧＡＧＡＴＧＧ（配列番号：２６）および、ＡＣＯ−２軽鎖（ＬＣ）のためのものは、５'−ＧＣＴＣＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴＧ（配列番号：２７）。

クロンテック社からのアドバンテージＨＦＰＣＲキットを使用してＰＣＲ反応を実行し、ＰＣＲプログラムは、９４℃／２分の１回の変性工程、続いて９４℃／３０秒；５５℃／３０秒；７２℃／１．５分の２４サイクルで実行した。最終伸長工程は７２℃／１０分であった。エチジウムブロマイドを含有する１％のアガロースゲルでＰＣＲ産物を同定した。ＧＥヘルスケア（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）社からのＧＦＸ精製キットを使用してＰＣＲ産物をゲルから精製し、続いてゼロ・ブラントＴＯＰＯＰＣＲクローニングキット（＃Ｋ２８７５−４０）へとクローニングし、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社からのＴＯＰ１０大腸菌細胞の中に形質転換した。

キアゲン社からのミニプレップ・キット（＃２７１０６）を使用して大腸菌コロニーからＤＮＡを抽出した。プラスミドは、配列決定用プライマーのＭ１３ｒｅｖ（−２９）およびＭ１３ｕｎｉ（−２１）を使用して、ＭＷＧバイオテク（ＭＷＧＢｉｏｔｅｃｈ）社、マルティンスリート、ドイツで配列決定した。ベクターＮＴＩの使用によって、同定された配列からＨＣおよびＬＣを確認した。キットに基づくすべての手順は、製造業者の指示に従って行なわれた。

ＡＣＯ−１．５．２ハイブリドーマ細胞から、以下の核酸およびアミノ酸配列を有する、単一のκＬＣおよび単一のＩＧｇ２ａＨＣをクローン化した。

ＡＣＯ−１ＶＨ配列（配列番号：１３（シグナルペプチドを含む））：
ａｔｇｇｇａｔｇｇａｇｃｔａｔａｔｃａｔｇｃｔｃｔｔｔｔｔｇｇｔａｇｃａａｃａｇｃｔａｃａｇａｔｇｔｃｃａｃｔｃｃｃａｇｇｔｃｃａａｃｔｇｃａｇｃａｇｃｃｔｇｇｇｇｃｔｇａａｃｔｇｇｔｇａａｇｃｃｔｇｇｇｇｃｔｔｃａｇｔｇａａｇｃｔｇｔｃｃｔｇｔａａｇｇｃｔｔｃｔｇｇｃｔａｃａｃｃｔｔｃａｃｃａａｃｔａｃｔｇｇａｔｇｃａｃｔｇｇｇｔｇａａｇｃａｇａｇｇｃｃｔｇｇａｃａａｇｇｃｃｔｔｇａｇｔｇｇａｔｔｇｇａｇａｇａｔｔａａｔｃｃｔａｇｃｃａｃｇｇｔｃｇｔａｃｔａｔｃｔａｃａａｔｇａａａａｃｔｔｃａａｇａｇｃａａｇｇｃｃａｃａｃｔｇａｃｔｇｔａｇａｃａａａｔｃｃｔｃｃａｔｃａｃａｇｃｃｔｔｃａｔｇｃａａｃｔｃａｇｃａｇｃｃｔｇａｃａｔｃｔｇａｇｇａｃｔｃｔｇｃｇｇｔｃｔａｔｔｔｃｔｇｔｇｃａａｇａｇｇｇｇｇａｃｔｇｇｇａｃｃｃｇｃｃｔｇｇｔｔｔｇｃｔｔａｃｔｇｇｇｇｃｃａａｇｇｇａｃｔｃｔｇｇｔｃａｃｔｇｔｃｔｃｔｇｃａ

ＡＣＯ−１ＶＬ配列（配列番号：１４（シグナルペプチドを含む））：
ａｔｇｇａｔｔｔｔｃａａｇｔｇｃａｇａｔｔｔｔｃａｇｃｔｔｃｃｔｇｃｔａａｔｃａｇｔｇｔｃｔｃａｇｔｃａｔａａｔｇｔｃｃａｇａｇｇａｃａａａｔｔｇｔｔｃｔｃａｃｃｃａｇｔｃｔｃｃａｇｃａａｔｃａｔｇｔｃｔｇｃｔｔｃｔｃｃｔｇｇｇｇａｇａａｇｇｔｃａｃｃｔｔｇａｃｃｔｇｃａｇｔｇｃｃｇｇｃｔｃａａｇｔｇｔａｇａｔｔｃｃａｇｃｔａｔｔｔｇｔａｃｔｇｇｔａｃｃａｇｃａｇａａｇｃｃａｇｇａｔｃｃｔｃｃｃｃｃａａａｃｔｃｔｇｇａｔｔｔａｔａｇｃａｃａｔｃｃａａｃｃｔｇｇｃｔｔｃｔｇｇａｇｔｃｃｃｔｇｃｔｃｇｃｔｔｃａｇｔｇｇｃａｇｔｇｇｇｔｃｔｇｇｇａｃｃｔｃｔｔａｃｔｃｔｃｔｃａｃａａｔｃａｇｃａｇｃａｔｇｇａｇｇｃｔｇａａｇａｔｇｃｔｇｃｃｔｃｔｔａｔｔｔｃｔｇｃｃａｔｃａｇｔｇｇａｇｔａｇｔｔａｃｃｃａｔｔｃａｃｇｔｔｃｇｇｃｔｃｇｇｇｇａｃａａａａｔｔｇｇａａａｔａａａａｃｇｇ

ＡＣＯ−１ＶＨ（配列番号：１（シグナルペプチドは除外されている））
ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＷＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＥＩＮＰＳＨＧＲＴＩＹＮＥＮＦＫＳＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＩＴＡＦＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＧＧＬＧＰＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ

ＡＣＯ−１ＶＬ（配列番号：４（シグナルペプチドは除外されている））
ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＬＴＣＳＡＧＳＳＶＤＳＳＹＬＹＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＫＬＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＳＹＦＣＨＱＷＳＳＹＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫＲ

ＡＣＯ−２．２．１ハイブリドーマ細胞から、以下の核酸およびアミノ酸配列を持つ、単一のκタイプＡＣＯ−２軽鎖および単一のＩＧｇ２ｂＡＣＯ−２重鎖をクローン化した。

ＡＣＯ−２ＶＨ配列（配列番号２８（シグナルペプチドを含む））
ａｔｇｇｇａｔｇｇａｇｃｔａｔａｔｃａｔｃｃｔｃｔｔｔｔｔｇｇｔａｇｃａｇｃａｇｃｔａｃａｇａｔｇｔｃｃａｃｔｃｃｃａｇｇｔｃｃａａｃｔｇｃａｇｃａｇｃｃｔｇｇｇｇｃｔｇａａｃｔｇｇｔｇａａｇｃｃｔｇｇｇｇｃｔｔｃａｇｔｇａａｇｃｔｇｔｃｃｔｇｃａａｇｇｃｃｔｃｔｇｇｃｔａｃａｇｃｔｔｃａｃｃａｇｃｔａｃｔｇｇａｔｇｃａｃｔｇｇｇｔｇａａｇｃａｇａｇｇｃｃｔｇｇａｃａａｇｇｃｃｔｔｇａｇｔｇｇａｔｔｇｇａｇａｇａｔｔａａｔｃｃｔａｇｃｃａｃｇｇｔｃｇｔａｃｔａｇｃｔａｃａａｔｇａｇａａｃｔｔｃａａｇａｇｃａａｇｇｃｃａｃａｃｔｇａｃｔｇｔａｇａｃａａａｔｃｃｔｃｃａａｃａｔａｇｔｃｔａｃａｔｇｃａａｃｔｃａｇｃａｇｃｃｔｇａｃａｔｃｔｇａｇｇａｃｔｃｔｇｃｇｇｔｃｔａｔｔａｃｔｇｔｇｔａａｇａｇｇｇｇｇａｃｔｇｇｇａｃｃｃｇｃｃｔｇｇｔｔｔｇｃｔｔａｃｔｇｇｇｇｃｃａａｇｇｇａｃｔｃｔｇｇｔｃａｃｔｇｔｃｔｃｔｇｔａ

ＡＣＯ−２ＶＬ配列（配列番号：２９（シグナルペプチドを含む））
ａｔｇｇａｔｔｔｔｃａａｇｔｇｃａｇａｔｔｔｔｃａｇｃｔｔｃｃｔｇｃｔａａｔｃａｇｔｇｔｃｔｃａｇｔｃａｔａａｔｇｔｃｃａｇａｇｇａｃａａａｔｔｇｔｔｃｔｃａｃｃｃａｇｔｃｔｃｃａｇｃａａｔｃａｔｇｔｃｔｇｃａｔｃｔｃｃｔｇｇｇｇａｇａａｇｇｔｃａｃｃｔｔｇａｃｃｔｇｃａｇｔｇｃｃｇｇｃｔｃａａｇｔｇｔａｇｇｔｔｃｃａｇｃｔａｃｔｔｔｔａｃｔｇｇｔａｃｃａｇｃａｇａａｇｃｃａｇｇａｔｃｃｔｃｃｃｃｃａａａｃｔｃｔｇｇａｔｔｔａｔｇｇｃａｃａｔｃｃａａｃｃｔｇｇｃｔｔｃｔｇｇａｇｔｃｃｃｔｇｃｔｃｇｃｔｔｃａｇｔｇｇｃａｇｔｇｇｇｔｃｔｇｇｇａｃｃｔｃｔｔａｃｔｃｔｃｔｃａｃａａｔｃａｇｃａｇｃａｔｇｇａｇｇｃｔｇａａｇａｔｇｃｔｇｃｃｔｃｔｔａｔｔｔｃｔｇｃｃａｔｃａｇｔｇｇａｇｔａｇｔｔａｔｃｃａｔｔｃａｃｇｔｔｃｇｇｃｔｃｇｇｇｇａｃａａａａｔｔｇｇａａａｔａａａａｃｇｇ

ＡＣＯ−２ＶＨ配列（配列番号：７（シグナルペプチドは除外されている））：
ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＳＹＷＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＥＩＮＰＳＨＧＲＴＳＹＮＥＮＦＫＳＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＮＩＶＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＶＲＧＧＬＧＰＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＶ

ＡＣＯ−２ＶＬ配列（配列番号：９（シグナルペプチドは除外されている））：
ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＬＴＣＳＡＧＳＳＶＧＳＳＹＦＹＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＫＬＷＩＹＧＴＳＮＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＳＹＦＣＨＱＷＳＳＹＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫＲ

Ｋａｂａｔ定義に従うＡＣＯ−２ＣＤＲ配列は以下のとおりであることが見出された。
ＣＤＲ−Ｈ１：ＳＹＷＭＨ（配列番号：２２）
ＣＤＲ−Ｈ２：ＥＩＮＰＳＨＧＲＴＳＹＮＥＮＦＫＳ（配列番号：２３）
ＣＤＲ−Ｈ３：ＧＧＬＧＰＡＷＦＡＹ（配列番号：１７）
ＣＤＲ−Ｌ１：ＳＡＧＳＳＶＧＳＳＹＦＹ（配列番号：２４）
ＣＤＲ−Ｌ２：ＧＴＳＮＬＡＳ（配列番号：２５）
ＣＤＲ−Ｌ３：ＨＱＷＳＳＹＰＦＴ（配列番号：２０）
実施例２−ヒト化ＡＣＯ−１のデザインおよび可能な復帰変異残基の同定
マウスＡＣＯ−１ＣＤＲの同定および特性評価

Ｋａｂａｔ定義に従うＡＣＯ−１ＣＤＲ配列は以下のとおりであることが見出された。
ＣＤＲ−Ｈ１：ＮＹＷＭＨ（配列番号：１５）
ＣＤＲ−Ｈ２：ＥＩＮＰＳＨＧＲＴＩＹＮＥＮＦＫＳ（配列番号：１６）
ＣＤＲ−Ｈ３：ＧＧＬＧＰＡＷＦＡＹ（配列番号：１７）
ＣＤＲ−Ｌ１：ＳＡＧＳＳＶＤＳＳＹＬＹ（配列番号：１８）
ＣＤＲ−Ｌ２：ＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号：１９）
ＣＤＲ−Ｌ３：ＨＱＷＳＳＹＰＦＴ（配列番号：２０）
ヒト生殖細胞系列の同定

三次元タンパク質構造モデルは、タンパク質データーベースバンク（ＰＤＢ）：１Ｚ３Ｇからの構造テンプレートと共に、ＭＯＥ（モレキュラー・オペレイティング・エンバイロンメント（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＯｐｅｒａｔｉｎｇＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）；ｗｗｗ．ｃｈｅｍｃｏｍｐ．ｃｏｍで入手可能）を使用して確立された。ＰＤＢはBerman et al.（Nucl Acids Res 2000;28:235-242）中で記載され、www.rcsb.org/pdbで入手可能である。ＰＤＢデーターベース中の抗体−抗原複合体の解析に基づいて、パラトープの最も可能性の高い残基は、ＡＣＯ−１ＶＨの残基２３〜３５、４９〜５８、９３〜１０２、およびＡＣＯ−１ＶＬの残基２４〜３４、４９〜５６、８９〜９７であることが見出された。ＭＯＥを使用して、パラトープと相互作用する（疎水性相互作用、水素結合相互作用、電荷相互作用）残基を同定し、残基の組み合わせのセット（パラトープ＋相互作用する残基）は、図１中に示されるＡＣＯ−１のいわゆるマスクとされた。

ＡＣＯ−１ＶＨおよびＡＣＯ−１ＶＬを持つ生殖細胞系列Ｖデーターベースの検索から、以下の可能なフレームワーク鋳型を得た（Ｅ値はカッコ中に与えられる）。
ＶＨ：ＶＨ１＿４６（３ｅ−０３８）ＶＨ１＿ｆ（６ｅ−０３７）、ＶＨ１＿０２（６ｅ−０３７）、ＶＨ１＿０３（１ｅ−０３６）、ＶＨ１＿２４（２ｅ−０３４）、
ＶＬ：ＶＫＩＩＩ＿Ｌ６（９ｅ−０３５）、ＶＫＩＩＩ＿Ａ１１（４ｅ−０３４）、ＶＫＩＩＩ＿Ａ２７（８ｅ−０３４）、ＶＫＩＩＩ＿Ｌ２５（１ｅ−０３３）、ＶＫＩ＿Ｌ８（１ｅ−０３３）。

マスクによる生殖細胞系列データーベースの検索から以下の可能なフレームワーク鋳型を得た（Ｅ値はカッコ中に与えられる）。
ＶＨ：ＶＨ１＿４６（３ｅ−０１１）、ＶＨ１＿０２（６ｅ−０１１）、ＶＨ１＿ｆ（１ｅ−０１０）、ＶＨ５＿ａ（４ｅ−０１０）、ＶＨ１＿０３（４ｅ−０１０）、
ＶＬ：ＶＫＩＩＩ＿Ａ１１（５ｅ−００９）、ＶＫＩＩＩ＿Ｌ６（７ｅ−００９）、ＶＫＩＩＩ＿Ａ２７（９ｅ−００９）、ＶＫＩＩＩ＿Ｌ２５（３ｅ−００８）、ＶＫＩ＿Ｌ９（６ｅ−００８）。

アライメントおよびヒットの手作業の検査後に、ＶＨ１＿４６およびＶＫＩＩＩ＿Ｌ６をヒトスキャフォールドとして選択した。例えば、ヒト化抗体の物理化学的性質を改変または至適化するために他の鋳型を選択することができる。ＪＨ４およびＪＫ２を生殖細胞系列Ｊ−セグメントとして選択した（それぞれ配列番号：２および５）。
至適ヒト化ＡＣＯ−１のデザイン

ヒト化は以下のルールで行なわれた
−マスクの外側の残基はヒトとされた。
−マスクの内側かつＫａｂａｔＣＤＲの内側の残基はマウスとされた。
−マスクの内側かつマウス／生殖細胞系列コンセンサスを持つＫａｂａｔＣＤＲの外側の残基は、コンセンサス配列とされた。
−マスクの内側かつマウス／生殖細胞系列を持つＫａｂａｔＣＤＲの外側の残基は、生殖細胞系列配列とされたが、マウスで異なるものは可能な復帰変異が行なわれた。

得られた至適ｈｚＡＣＯ−１抗体のＣＤＲは次のとおりだった（Ｋａｂａｔ定義に従う）。
ＣＤＲ＿Ｈ１ＮＹＷＭＨ（配列番号：１５）
ＣＤＲ＿Ｈ２ＥＩＮＰＳＨＧＲＴＩＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号：２１）
ＣＤＲ＿Ｈ３ＧＧＬＧＰＡＷＦＡＹ（配列番号：１７）
ＣＤＲ＿Ｌ１ＳＡＧＳＳＶＤＳＳＹＬＹ（配列番号：１８）
ＣＤＲ＿Ｌ２ＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号：１９）
ＣＤＲ＿Ｌ３ＨＱＷＳＳＹＰＦＴ（配列番号：２０）

上記のヒト化方法（ｈｚＡＣＯ−１およびＩＦＮ−αＡの三次元モデルに基づいたパラトープを制定するために予測された残基のマスクのデザイン）を使用すると、Ｋａｂａｔ定義に従うＡＣＯ−１ＣＤＲＨ２配列中の対応するペプチドはマウス起原であったが、至適化されたｈｚＡＣＯ−１ＣＤＲＨ２配列（上記で太字で強調された）の５個のＣ末端アミノ酸を含むペプチドは対応するヒトフレームワーク配列と同一であったので、単純なＣＤＲグラフトとは対照的に、より少ないマウス残基を持つｈｚＡＣＯ−１抗体が得られた。さらに、本解析において同定されたヒト化ＡＣＯ−１抗体のためのＣＤＲＨ１配列はＷＯ２００６／０８６５８６中に記載されていたものよりも短かった。至適化されたｈｚＡＣＯ−１抗体、または少なくともｈｚＡＣＯ−１ＶＨ配列の一部を含む抗体もしくは抗原結合断片は、したがってヒト患者におけるヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答に対するリスクを減少させることができる。さらに、重鎖中の位置６０〜６２におけるＮＥＮの代わりに配列ＡＱＫを置換することは、脱アミド化の受けやすい２個のアスパラギン残基を避けるという長所を有する。
可能な復帰変異の同定。

ＡＣＯ−１ＶＨ配列およびＶＬ配列の解析を図１中に示す。図１において、結果として生じるヒト化ＡＣＯ−１（ｈｚＡＣＯ−１）のＶＨ配列（配列番号：３）およびＶＬ配列（配列番号：６）は、ヒトとして復帰変異の可能性のある残基（すなわち復帰変異なし）と共に示される。フレームワーク領域中の以下の復帰変異バリアントは、１つまたは複数の至適化されたｈｚＡＣＯ−１抗体を得るために同定され、これはしばしばもとのマウス抗体の親和性を保持するために必要とされる。
−ｈｚＡＣＯ−１ＶＨ：野生型（すなわち、復帰変異はない）、Ｖ５Ｑ、Ｍ６９Ｌ、Ｒ７１Ｖ、Ｔ７３Ｋ、Ｓ７６Ｉ、Ｖ７８Ａおよびその任意のものの任意の組み合わせ；
−ｈｚＡＣＯ−１ＶＬ：野生型、Ｅ１Ｑ、Ｌ４７Ｗ、Ｉ５８Ｖ、Ｆ７１Ｙおよびその任意のものの任意の組み合わせ；
−様々な重鎖−軽鎖の組み合わせで。
実施例３−ｈｚＡＣＯ−１の親和性成熟のためのＡＣＯ−２ベースのｈｚＡＣＯ−１バリアントのデザイン

図２中で示されるように、ＡＣＯ−１およびＡＣＯ−２のＶＨ配列およびＶＬ配列のアミノ酸配列アライメントは、それぞれの軽鎖および重鎖の間で高い配列同一性を示した。理論により限定されるものではないが、抗体が同じＶ−Ｄ−Ｊ再構成を有しており、生殖細胞系列配列と比較して３個の同一の変異を含有するので、同じ前駆細胞に抗体が由来する可能性がある。さらに、抗体は恐らく後続する体細胞超変異に起因して、１３個のアミノ酸残基で異なっていた。

ＡＣＯ−１およびＡＣＯ−２のＶＨドメインおよびＶＬドメイン中の１３個の同一でないアミノ酸残基のうちの９個の残基が、ヒト化ＡＣＯ−１抗体の親和性を改善するための変異解析に選択された（図３）。ＡＣＯ−２に由来する超変異の単一の追加により有害なアミノ酸残基および有利なアミノ酸残基を同定できる可能性があり、有利なアミノ酸のみの導入を許容することによって、もとのマウスＡＣＯ−１抗体およびＡＣＯ−２抗体を越えるように親和性を改善する。標的化された残基は、軽鎖または重鎖ＣＤＲの１つの内のそれらの位置（Ｋａｂａｔ定義に従う）に基づいて、または抗原−抗体三次元モデル化に基づく抗原と相互作用する可能性のある領域として述べられた領域内のそれらの位置に基づいて、選択された。

以下のバリアントは、１つまたは複数の至適化されたｈｚＡＣＯ−１抗体を得るために同定された。
−ｈｚＡＣＯ−１ＶＨ：野生型、Ｔ２８Ｓ、Ｎ３１Ｓ、Ｉ５８Ｓ、Ｓ７６Ｎ、Ｔ７７ＩおよびＡ９３Ｖ、ならびにＴ２８Ｓ、Ｎ３１Ｓ、Ｉ５８Ｓ、Ｓ７６Ｎ、Ｔ７７ＩおよびＡ９３Ｖから選択された少なくとも２つの変異の任意の組み合わせ；
−ｈｚＡＣＯ−１ＶＬ：野生型、Ｄ２９Ｇ、Ｌ３３Ｆ、Ｓ５０Ｇ、ならびにＤ２９Ｇ、Ｌ３３Ｆ、Ｓ５０Ｇから選択された少なくとも２つの変異の任意の組み合わせ、
−様々な重鎖−軽鎖の組み合わせで。

抗原結合に対する各々の残基の個々の寄与を評価するために、ｈｚＡＣＯ−１の軽鎖および重鎖のコンストラクト内のＡＣＯ−１配列からＡＣＯ−２配列へと、残基を個別に変異させた。１シリーズの組み合わせ変異体も生成された。
実施例４−ＡＣＯ−１、ＡＣＯ−２、ｈｚＡＣＯ−１のクローニングおよび部位特異的変異誘発
ＡＣＯ−１、ＡＣＯ−２およびｈｚＡＣＯ−１

ＶＨ配列およびＶＬ配列は、Durocher et al.（Nucleic Acids Res. 2002;30(2):E9）によって記載されたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ（ＨＥＫ２９３−６Ｅ）発現系における一過性発現のために、適切なＣＭＶプロモーターベースの発現ベクター（ｐＴＴベクター）に導入された。ベクターは、ＣＭＶプロモーターに加えて、ｐＭＢ１起点、ＥＢＶ起点およびＡｍｐＲ遺伝子を含有する。ＡＣＯ−１およびＡＣＯ−２のＶＨは、それぞれ、マウスのＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂのための定常領域を含有するＣＭＶベースのベクターの中へクローン化された。全長ＬＣは、ＡＣＯ−１およびＡＣＯ−２の両方のための空のＣＭＶベースのベクターに導入された。ｈｚＡＣＯ−１の可変領域についてのＤＮＡ配列は、ジェネアート（Ｇｅｎｅａｒｔ）社、レーゲンスブルク、ドイツに注文した。ｈｚＡＣＯ−１ＶＨについて提供された配列を、ヒトＩｇＧ４の定常領域（Ｓ２４１Ｐ）（ヒンジ領域中にＳ２４１Ｐ変異を含有する）を含有する発現ベクターに導入した。提供されたｈｚＡＣＯ−１ＶＬ配列を、ヒトκ軽鎖の定常領域を含有するベクターに導入した。
ｈｚＡＣＯ−１の復帰変異バリアントの生成

実施例２において同定された１０個の可能な復帰変異を、抗原結合に対する各々の残基の個々の寄与を測定するために、ｈｚＡＣＯ−１ＨＣコンストラクトおよびｈｚＡＣＯ−１ＬＣコンストラクトに別々に導入した。少数の組み合わせが同様に含まれていた。マウスＣＤＲＨ２（配列番号：１６）のＫａｂａｔ定義に相当する、延長されたＣＤＲＨ２（ｈｚＡＣＯ−１−ＫａｂａｔＣＤＲＨ２）を持つｈｚＡＣＯ−１のバリアントも、部位特異的変異誘発によって生成された。

部位特異的変異誘発は、ｈｚＡＣＯ−１ＬＣ発現ベクターおよびｈｚＡＣＯ−１ＨＣ発現ベクターで行なわれた。単一変異を生成するために、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社（カタログ番号２００５１８）からのクイックチェンジ（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ）（登録商標）部位特異的変異誘発キットを、製品プロトコールに従って使用した。所望の変異の導入は、各々の変異についてのプラスミドＤＮＡ調製物（ＭＷＧバイオテク社、マルティンスリート、ドイツ）の配列決定によって確認した。

変異させたＬＣコンストラクトは発現のためにｈｚＡＣＯ−１ＨＣと組み合わせ、変異させたＨＣコンストラクトは抗体発現のためにｈｚＡＣＯ−１ＬＣと組み合わせた。
復帰変異を持つ軽鎖バリアント：
ｈｚＡＣＯ−１−Ｅ１Ｑ
ｈｚＡＣＯ−１−Ｌ４７Ｗ
ｈｚＡＣＯ−１−Ｉ５８Ｖ
ｈｚＡＣＯ−１−Ｆ７１Ｙ
ｈｚＡＣＯ−１−Ｌ４７Ｗ、Ｉ５８Ｖ
復帰変異を持つ重鎖バリアント：
ｈｚＡＣＯ−１−Ｖ５Ｑ
ｈｚＡＣＯ−１−Ｍ６９Ｌ
ｈｚＡＣＯ−１−Ｒ７１Ｖ
ｈｚＡＣＯ−１−Ｔ７３Ｋ
ｈｚＡＣＯ−１−Ｓ７６Ｉ
ｈｚＡＣＯ−１−Ｖ７８Ａ
ｈｚＡＣＯ−１−Ｒ７１Ｖ、Ｔ７３Ｋ
ｈｚＡＣＯ−１−Ｍ６９Ｌ、Ｒ７１Ｖ、Ｔ７３Ｋ、Ｓ７６Ｉ、Ｖ７８Ａ
ｈｚＡＣＯ−１−ＫａｂａｔＣＤＲＨ２
ＡＣＯ−２ベースのｈｚＡＣＯ−１バリアントの生成

実施例３において記載されるように、親和性を改善するために、ｈｚＡＣＯ−１抗体の中へＡＣＯ−２の特定の残基を導入する部位特異的変異誘発を、ｈｚＡＣＯ−１ＬＣ発現ベクターおよびｈｚＡＣＯ−１ＨＣ発現ベクターで行なった。単一変異を生成するために、ストラタジーン社（カタログ番号２００５１８）からのクイックチェンジ（登録商標）部位特異的変異誘発キットを、製品プロトコールに従って使用した。組み合わせ変異は、製品プロトコール（カタログ番号２００５１３）に従って、クイックチェンジ（登録商標）部位特異的変異誘発およびクイックチェンジ（登録商標）多重部位特異的変異誘発キットの両方を使用して生成した。

所望の変異の導入は、各々の変異についてのプラスミドＤＮＡ調製物（ＭＷＧバイオテク社、マルティンスリート、ドイツ）の配列決定によって確認した。

変異させた軽鎖コンストラクトは発現のためにｈｚＡＣＯ−１重鎖と組み合わせ、変異させた重鎖コンストラクトは抗体発現のためにｈｚＡＣＯ−１軽鎖コンストラクトと組み合わせた。
ＡＣＯ−２に由来する変異を持つ軽鎖バリアント：
ｈｚＡＣＯ−１−Ｄ２９Ｇ
ｈｚＡＣＯ−１−Ｌ３３Ｆ
ｈｚＡＣＯ−１−Ｓ５０ＧｈｚＡＣＯ−１−Ｄ２９Ｇ、Ｌ３３Ｆ、Ｓ５０Ｇ
ＡＣＯ−２に由来する変異を持つ重鎖バリアント：
ｈｚＡＣＯ−１−Ｔ２８Ｓ
ｈｚＡＣＯ−１−Ｎ３１Ｓ
ｈｚＡＣＯ−１−Ｉ５８Ｓ
ｈｚＡＣＯ−１−Ｓ７６Ｎ
ｈｚＡＣＯ−１−Ｔ７７Ｉ
ｈｚＡＣＯ−１−Ａ９３Ｖ
ｈｚＡＣＯ−１−Ｎ３１Ｓ、Ｉ５８Ｓ
ｈｚＡＣＯ−１−Ｔ２８Ｓ、Ｎ３１Ｓ、Ｉ５８Ｓ、Ａ９３Ｖ
ｈｚＡＣＯ−１−Ｓ７６Ｎ、Ｔ７７Ｉ
ｈｚＡＣＯ−１−Ｔ２８Ｓ、Ｎ３１Ｓ、Ｉ５８Ｓ、Ｓ７６Ｎ、Ｔ７７Ｉ、Ａ９３Ｖ
ｈｚＡＣＯ−１−Ｔ２８Ｓ、Ａ９３Ｖ
ｈｚＡＣＯ−１−Ｎ３１Ｓ、Ａ９３Ｖ
ｈｚＡＣＯ−１−Ｔ２８Ｓ、Ｎ３１Ｓ、Ａ９３Ｖ
ｈｚＡＣＯ−１−Ｔ２８Ｓ、Ｎ３１Ｓ
実施例５−組換えＡＣＯに由来する抗体の発現

ＡＣＯ−１、ＡＣＯ−２、ｈｚＡＣＯ−１およびｈｚＡＣＯ−１のバリアントは、一般的な抗体発現プロトコールに従って、一過性にトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞で発現させた。以下は、懸濁に適合したＨＥＫ２９３細胞のためのトランスフェクションプロトコールを記載する。

細胞維持：懸濁に適合したＨＥＫ２９３細胞は、２５μｇ／ｍｌジェネティシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）（登録商標）（インビトロゲン社カタログ番号：１０１３１−０１９）、０．１％ｖ／ｖ、プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）（登録商標）Ｆ−６８（インビトロゲン社カタログ番号：１２３４７−０１９）界面活性剤および１％ｖ／ｖペニシリン−ストレプトマイシン（随意）（インビトロゲン社カタログ番号１５１４０−１２２）で補足した、ギブコ（ＧＩＢＣＯ）（登録商標）フリースタイル（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ）（商標）２９３発現培地（インビトロゲン社カタログ番号：１２３３８−０２６）中で増殖させた。細胞は、３７℃、８％ＣＯ₂および１２５ｒｐｍのインキュベーター振盪機において、０．２〜２×１０⁶細胞／ｍｌの間の細胞密度でエルレンマイアーの振盪フラスコ中で維持した。

ＤＮＡトランスフェクション：トランスフェクションのために使用した培養の細胞密度は０．８〜１．５×１０⁶細胞／ｍｌであった。１ｍｌ細胞培養あたり０．５μｇ軽鎖ベクターＤＮＡ＋０．５μｇ重鎖ベクターＤＮＡを使用した。２９３フェクチン（ｆｅｃｔｉｎ）（商標）（インビトロゲン社カタログ番号：１２３４７−０１９）を、トランスフェクションされたＤＮＡ１μｇあたり１μｌ試薬の濃度で、トランスフェクション試薬として使用した。２９３フェクチン（商標）を３０×体積のＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）（インビトロゲン社カタログ番号：５１９８５−０３４）で希釈し、混合し、室温（２３〜２５℃）で５分間放置した。ＤＮＡを全ＤＮＡ１μｇあたり３０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭの（登録商標）で希釈し、混合し、室温（２３〜２５℃）で５分間放置した。ＤＮＡおよびトランスフェクション試薬希釈物を１：１で混合し、室温（２３〜２５℃）で２５分間放置した。ＤＮＡ−２９３フェクチン（商標）混合物を細胞培養に直接加えた。トランスフェクション細胞培養を、３７℃、８％ＣＯ₂および１２５ｒｐｍのインキュベーター振盪機に移した。４〜７日後に、細胞培養上清を遠心分離によって採取し、続いて０．２２μｍのＰＥＳフィルター（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）社カタログ番号：４３１０９８）を介して濾過した。抗体は、上清として分析するか、または標準的なプロテインＡ精製技術を使用して精製した。
ｈｚＡＣＯ−１およびｈｚＡＣＯ−１−ＫａｂａｔＣＤＲＨ２の発現レベルの比較

細胞が２つの抗体バリアントのいずれかを発現する能力に対して、末端のＣＤＲＨ２残基が効果を有するかどうかを決定するために、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞におけるｈｚＡＣＯ−１およびｈｚＡＣＯ−１−ＫａｂａｔＣＤＲＨ２の一過性発現レベルを比較した。

ｈｚＡＣＯ−１軽鎖およびｈｚＡＣＯ−１重鎖またはｈｚＡＣＯ−１−ＫａｂａｔＣＤＲＨ２重鎖のためのｐＴＴベースの発現ベクターで、上記されるように、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞をトランスフェクションした。トランスフェクションは三重で行なった。各々の抗体バリアントについては、ピペッティングの不正確さからの影響を最小限にするためにＤＮＡ−２９３フェクチンのマスター混合物を使用して、３つの培養（２５ｍｌ）をトランスフェクションした。トランスフェクションした培養を、上記されるように、４日間振盪機インキュベーターでインキュベーションした。４日目に、細胞生存率および細胞密度の測定のために培養からサンプルを抽出し、残りの細胞培養上清を遠心分離によって採取した。抗体産生の定量化解析は、フォルテバイオ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）社オクテット・システムおよびプロテインＡバイオセンサーを使用して、清澄化した細胞培養上清に対するバイオレイヤー干渉法によって、直接行なわれた。細胞培養の密度および生存率は、セデックス（Ｃｅｄｅｘ）ＨｉＲｅｓ自動化細胞培養アナライザーを使用して測定した。結果を以下の表４中に示す。
表４。発現解析

表４中の結果は、ｈｚＡＣＯ−１−ＫａｂａｔＣＤＲＨ２（従来の手順を使用してヒト化されたヒト化ＩＦＮ−α抗体であり、従って全長Ｋａｂａｔ配列）と比較して、ｈｚＡＣＯ−１（本発明に従うヒト化ＩＦＮ−α抗体）の一過性発現レベルの有意な差を予想外に示す。細胞の生存率または密度の差は、２つのｈｚＡＣＯ−１バリアントのいずれかでトランスフェクションされた細胞培養について観察されなかった。ｈｚＡＣＯ−１−ＫａｂａｔＣＤＲＨ２抗体バリアントの発現レベルに比較して、ｈｚＡＣＯ−１の発現レベルは２倍高かった。

Ｋａｂａｔで定義されたＣＤＲＨ２と比較して、ＣＤＲＨ２のより短いバージョンをグラフトすることによって、抗体の発現レベルは意外にも有意に増加した。

理論により束縛されるものではないが、ｈｚＡＣＯ−１中のヒト生殖細胞系列に由来する残基は、ｈｚＡＣＯ−１−ＫａｂａｔＣＤＲＨ２抗体バリアント（ＨＣ折り畳みおよび可能性としてＬＣ−ＨＣ相互作用に影響する、延長されたＣＤＲＨ２（配列番号：１６）を保有する）と比較して、タンパク質安定性およびしたがって発現収率の改善をもたらすという仮説をたてることができる。

一過性発現レベルで観察された、改善されたタンパク質安定性から結果として生じるかかる改善されたレベルのタンパク質発現は、安定したＣＨＯベースの産生細胞株に反映されるだろう。したがって、ＣＤＲＨ２（配列番号：２１）の短いバージョンのグラフトによって、高産生の安定した産生細胞株の生成はこのように可能である。
ｈｚＡＣＯ−１のＩｇＧ４、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２のバリアントの発現レベルの比較

重鎖サブクラススイッチが抗体発現レベルに対して効果があるかどうかを決定するために、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞における一過性発現レベルは、ｈｚＡＣＯ−１のリードＩｇＧ４（Ｓ２４１Ｐ）バリアントおよびｈｚＡＣＯ−１（ＩｇＧ１）およびｈｚＡＣＯ−１（ＩｇＧ２）について比較された。

実験は、上記の発現分析と同様であるが、以下の変化で行なわれた。実験は５ｍｌの培養において二重で行なった。培養は、３７℃、８％ＣＯ₂および２５０ｒｐｍの振盪機インキュベーターにおいてフィルターキャップの５０ｍｌのファルコン（ｆａｌｃｏｎ）社チューブ中でインキュベーションした。

予測外に、ｈｚＡＣＯ−１（ＩｇＧ１）およびｈｚＡＣＯ−１（ＩｇＧ２）の平均発現レベルは、ｈｚＡＣＯ−１（ＩｇＧ４）の発現レベルの約６５％だった。タンパク質発現において観察された減少（〜３５％）に基づいて、ｈｚＡＣＯ−１可変ドメインおよびＩｇＧ４定常ドメインの組み合わせが他の鎖サブクラスを持つ組み合わせより優れており、この分子の開発が高産生の安定した産生細胞株の生成を大幅に促進する、と結論する。
実施例６：ｈｚＡＣＯ−１−Ｆａｂとの複合体におけるＩＦＮ−α８の結晶構造

ｈｚＡＣＯ−１のＦａｂ断片との複合体におけるＩＦＮ−α８の結晶構造は、Ｘ線結晶解析を使用して決定し、３．３Å分解能まで精密化した（図８）。
材料および方法

ＩＦＮ−α８（配列番号：３０のアミノ酸１〜１６６）およびｈｚＡＣＯ−１Ｆａｂ（配列番号：３２の軽鎖配列および配列番号：３１の残基１〜２２１の重鎖配列を持つ）を、ＩＦＮ−α８のわずかな過剰量で混合し、複合体をゲル濾過カラムで精製した。タンパク質複合体ｈｚＡＣＯ−１−Ｆａｂ／ＩＦＮ−α８を、２５ｍＭヘペスバッファー（ｐＨ７．５）＋２５ｍＭＮａＣｌのバッファー中に入れ、５ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。複合体は、１００ｍＭヘペスバッファー（ｐＨ７．５）、１５％ＰＥＧ１０，０００および１５％エチレングリコール（沈殿溶液）中で結晶化された。回折データー収集の前に、結晶を液体Ｎ₂中で急速凍結した。結晶を、凍結溶液（２５％ｖ／ｖの９９％グリセロールおよび７５％の沈殿溶液の混合物）へ最初に移した。回折データーは、ビームラインＢＬＩ９１１−３（ＭＡＸ研究所、ルンド、スウェーデン）で収集した。回折データーは、ＸＤＳプログラムパッケージ（Kabsch, J. Appl. Crystallogr. 1993;26:795-800）を使用して、インデックスを付け、統合した。

三次元構造は、ＣＣＰ４パッケージ（Baily, 1994, Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 50, 760-763）のＰＨＡＳＥＲプログラム（Read, 2001, Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 57, 1373-1382）を使用する分子置換（ＭＲ）法を使用して決定された。複合体化されていないｈｚＡＣＯ−１Ｆａｂの結晶構造は、１．５２Å分解能（ＲおよびＲフリーはそれぞれ０．１８および０．２１）まで以前に決定されていた（データー不掲載）。それらの三次元座標は、続いてｈｚＡＣＯ−１／ＩＦＮ−α８複合体のためのＭＲ計算において使用された。検索モデルは３部分へと分割された。１）ｈｚＡＣＯ−１Ｆａｂの可変ドメイン、２）ｈｚＡＣＯ−１Ｆａｂの定常ドメイン、および３）ＩＦＮ−α８（配列番号：３０）の配列を得るためにＣＯＯＴプログラムによって変異させた、ＰＤＢに寄託されたＩＦＮτモデル（タンパク質データーバンク（Berman et al., 2000,. Nucleic Acids Res. 28, 235-242）アクセッションコード１Ｂ５Ｌ（RADHAKRISHNAN et al, 1999, J.MOL.BIOL.v.286pp.151)）。最終的な空間群決定はＰＨＡＳＥＲプログラムによって行われた。最も高いスコアが、それぞれ１０．７、４．４および２．６σの回転関数ピーク（ＲＺの）、それぞれ２４．１、２６．４および８．０σの並進ピーク（ＴＺの）、それぞれ３８３、９１８および１１３４の対数尤度比（ＬＬＧの）により、ならびに対称関連分子に対するオーバーラップなしで、空間群Ｐ４₁について得られた。

分子置換に続いてＣＯＯＴ分子グラフィックスプログラムにおけるモデルに対するいくつかの調整をし、その後最大２０００Ｋまでのねじれのシミュレーテッドアニーリングを、個々の温度要因を精密化せずに、２回適用した。もとのＲ値およびＲフリー値はそれぞれ０．４１６および０．４３９であり、シミュレーテッドアニーリング後の最終的な値はそれぞれ０．３１４および０．４２７であった。次いで、モデルに、ＲＥＦＭＡＣ５プログラム（Murshudov et al., 1997, Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 53, 240-255）を使用して、ＣＯＯＴプログラムに従う精密化における手作業の介入を行ない、それぞれ０．２１６および０．３４８のＲ値およびＲフリー値を得た。モデルは残基１〜２１を含むが、残基２２〜２３は、Ａｌａ残基、ＩＦＮ−α８の、２８〜１０１および１１４〜１６４、ｈｚＡＣＯ−１軽鎖の１〜２１５ならびにｈｚＡＣＯ−１重鎖の１〜２１９として精密化された。

精密化においてＲとＲフリーとの間で見出される比較的大きな差は、データーの限定された分解能（３．３Å）のため、および電子密度地図の解釈が完全に欠けているＩＦＮ−α８のＸ線モデルの実質的な範囲があるためである。電子密度地図は、ｈｚＡＣＯ−１−Ｆａｂに対するＩＦＮ−α８の安定した接点における残基を明確に定義するが、抗体部位から離れたＩＦＮ−α８のＸ線構造モデルの詳細は、あまりよく定義されず、したがってあまり正確に決定されない。
結果

接触は、ＦａｂとＩＦＮ−α８分子との間の４．０Åのカットオフ距離を使用して、ＣＣＰ４スイートのＣＯＮＴＡＣＴコンピュータープログラムによって同定された。ヒトｈｚＡＣＯ−１について結果として生じるエピトープは、ＩＦＮ−α８（配列番号：３０）の以下の残基を含むことが見出された。Ｓｅｒ５５、Ｈｉｓ５８、Ｇｌｕ５９、Ｇｌｎ６２、Ｇｌｎ６３、Ａｓｎ６６、Ｇｌｕ９７、Ｌｅｕ１１８、Ａｒｇ１２１、Ｌｙｓ１２２、Ｐｈｅ１２４、Ｇｌｎ１２５、Ａｒｇ１２６、Ｔｈｒ１２８、Ｌｅｕ１２９、Ｔｈｒ１３２。ＩＦＮ−α８との相互作用に関与するｈｚＡＣＯ−１の残基（パラトープ）は、ｈｚＡＣＯ−１の軽（Ｌ）鎖のＳｅｒ３２、Ｔｙｒ３３、Ｔｙｒ３５、Ｔｙｒ５０、Ｓｅｒ５１、Ｔｒｐ９２、Ｓｅｒ９３、Ｔｙｒ９５およびＰｈｅ９７（Ｋａｂａｔではなく配列番号：３２に従うナンバリング）、ならびに重（Ｈ）鎖（表９）のＴｈｒ３０、Ａｓｎ３１、Ｔｙｒ３２、Ｔｒｐ３３、Ｈｉｓ３５、Ｇｌｕ５０、Ａｓｎ５２、Ｓｅｒ５４、Ｈｉｓ５５、Ａｒｇ５７、Ｌｅｕ１０１、Ｇｌｙ１０２、Ｔｒｐ１０５（Ｋａｂａｔではなく配列番号：３１に従うナンバリング）を含む。
配列番号：３０
＞ＩＦＮ＿ａ８
ＣＤＬＰＱＴＨＳＬＧＮＲＲＡＬＩＬＬＡＱＭＲＲＩＳＰＦＳＣＬＫＤＲＨＤＦＥＦＰＱＥＥＦＤＤＫＱＦＱＫＡＱＡＩＳＶＬＨＥＭ
ＩＱＱＴＦＮＬＦＳＴＫＤＳＳＡＡＬＤＥＴＬＬＤＥＦＹＩＥＬＤＱＱＬＮＤＬＥＳＣＶＭＱＥＶＧＶＩＥＳＰＬＭＹＥＤＳＩＬＡＶ
ＲＫＹＦＱＲＩＴＬＹＬＴＥＫＫＹＳＳＣＡＷＥＶＶＲＡＥＩＭＲＳＦＳＬＳＩＮＬＱＫＲＬＫＳＫＥ
配列番号：３２
ｈｚＡＣＯ−１ＬＣ
１ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＳＡＧＳＳＶＤＳＳＹＬＹＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹ
５１ＳＴＳＮＬＡＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＨＱＷＳＳＹＰＦＴＦＧ
１０１ＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫ
１５１ＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱ
２０１ＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号：３１
ｈｚＡＣＯ−１ＦａｂＨＣ
１ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＥ
５１ＩＮＰＳＨＧＲＴＩＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧ
１０１ＬＧＰＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤ
１５１ＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹ
２０１ＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫ

図９に示されるように、ＩＦＮＡＲ２結合エピトープはｈｚＣＡＯ−１結合エピトープから離れているが、ＩＦＮ−α８上のｈｚＡＣＯ−１相互作用エピトープはＩＦＮＡＲ１結合エピトープに部分的にオーバーラップする。そのことは、ｈｚＡＣＯ−１によるＩＦＮ−αの中和が、ＩＦＮＡＲ２ではなくＩＦＮＡＲ１へのＩＦＮ−αの結合を中和することによって起こることを示唆する。したがって、ｈｚＡＣＯ−１はＩＦＮ−α／ＩＦＮＡＲ２複合体を結合するが、細胞内シグナル伝達の原因である三成分受容体複合体ＩＦＮ−α／ＩＦＮＡＲ１／ＩＦＮＡＲ２の形成を阻害することを想定できる。
表５。ＩＦＮ−α８のパラメーター：構造決定のための使用されたｈｚＡＣＯ−１−Ｆａｂ複合体結晶

表６。ＸＤＳパッケージのプログラムＸＳＣＡＬＥからのＸ線データー統計

表７。ＲＥＦＭＡＣプログラムのＩＦＮ−α８：ｈｚＡＣＯ−１−Ｆａｂの最後の精密化サイクルからの統計。

表８。ＩＦＮ−α８−ｈｚＡＣＯ−１ＦａｂＬ鎖相互作用。
４．０Åのカットオフを使用した。接触はＣＣＰ４スイートのＣＯＮＴＡＣＴコンピュータープログラムによって同定された。最後のカラムにおいて、ＣＯＮＴＡＣＴによって計算されるように、「＊＊＊」は、この接触での水素結合についての高い可能性（距離＜３．３Å）を示し、「＊」は、弱い可能性（距離＞３．３Å）を示す。空白は、水素結合の可能性がないとプログラムが判断したことを示す。

表９。ＩＦＮ−α８−ｈｚＡＣＯ−１ＦａｂＨ鎖相互作用。
４．０Åのカットオフを使用した。接触はＣＣＰ４スイートのＣＯＮＴＡＣＴコンピュータープログラムによって同定された。最後のカラムにおいて、ＣＯＮＴＡＣＴによって計算されるように、「＊＊＊」は、この接触での水素結合についての高い可能性（距離＜３．３Å）を示し、「＊」は、弱い可能性（距離＞３．３Å）を示す。空白は、水素結合の可能性がないとプログラムが判断したことを示す。

実施例７：ｈｚＡＣＯ−１の親和性成熟のための構造に基づく変異のデザイン

抗体／抗原複合体のエピトープおよびパラトープが既知でないならば、非常に多数の可能なアミノ酸残基を抗体の親和性を改善するために変異させることができ、さらにそれらは特定の位置での至適残基を同定するために２０の残りのアミノ酸残基のいずれかに変換することができる。ＣＤＲ領域は変異のための利用可能な約５４の残基を保持する。したがって、相互作用の親和性を改善するために、５４×２０＝１０８０アナログをＣＤＲ内でのみ生成することができる。さらに、ＣＤＲの外側の変異を親和性を改善するために作製することができる。

しかしながら、抗体／抗原の構造が既知である場合、親和性を改善するにふさわしい、より限定された数の変異を、構造予測に基づいて予測および分析することができる。したがって、ｈｚＡＣＯ−１のＦａｂ断片との複合体におけるＩＦＮ−α８の結晶構造に基づいて、実施例６において記載されるように、すべてのＩＦＮ−αサブタイプに対するｈｚＡＣＯ−１の結合を改善する３つの変異が同定された。３つの変異は、ｈｚＡＣＯ−１ＨＣＴ３０Ｒ、ｈｚＡＣＯ−１ＬＣＹ３２Ｅ、および組み合わせのｈｚＡＣＯ−１Ｙ３２Ｅ，Ｔ３０Ｒである（Ｋａｂａｔに従う残基ナンバリング）。変異の同定は以下で記載される。

ＬＣＹ３２Ｅ：ＩＦＮ−α８の残基Ｌｙｓ１２２（ｈｚＡＣＯ−１に結合するエピトープの一部である）についての電子密度が、いくぶん高移動度を示すことが理解できる。さらに、ｈｚＡＣＯ−１軽鎖の残基Ｔｙｒ３２（Ｋａｂａｔ表記法）の原子Ｏηは、Ｌｙｓ１２２側鎖のＣβおよびＣγの原子へ向けられる。その相互作用は至適の残基−残基相互作用ではない。ＧｌｕまたはＡｓｐのような負に荷電した残基に軽鎖Ｔｙｒ３２を変異させることは、ＩＦＮ−α８の抗体軽鎖Ｔｙｒ３２残基と正に荷電したＬｙｓ１２２残基との間で強いイオン結合を形成する可能性を生じさせる。その理由のために、ｈｚＡＣＯ−１抗体の親和性を改善するために、ＹをＥと交換した。

ＨＣＴ３０Ｒ：Ｘ線構造におけるＩＦＮ−α８に近い各々のｈｚＡＣＯ−１残基について、コアの側鎖原子の数（ｃｏｒｅ）、周辺の側鎖原子の数（ｐｅｒｉ）、荷電した相互作用の数（ｃｈａｒ）、水素結合の数（ｈｙｂｏ）および疎水性相互作用の数（ｈｙｐｈ）の特性を計算し、表１０中で以下に示した。
表１０。ｈｚＡＣＯ−１モノクローナル抗体のアミノ酸の特性

コアおよび周辺の原子の数は、１０１×１０１×１０１ノードの格子上にＸ線の構造を重層することによって計算され、各々の格子点について、ノードから２．５Å未満の原子数（Ｎ_ex）および３．５Å未満の原子数（Ｎ_in）を計算した。コアのノードは０より多いＮ_exを有し、ｈｚＡＣＯ−１およびＩＦＮ−８の両方からの原子を包含する。周辺のノードはＮｅｘ＝０であり、０より多いＮ_inを有し、ｈｚＡＣＯ−１およびＩＦＮ−α８の両方からの原子を包含する。コアの側鎖原子はここで任意のノードから２．５Å未満の原子である。周辺の側鎖原子はここで任意のノードから３．５Å未満および２．５Å以上の原子である。

最終的に、周辺残基は周辺原子のみを持ち、相互作用のない残基として定義され、したがってこの残基は結合を生じるように修飾することができる。ＬＣＳ９２、ＨＣＴ２８、ＨＣＴ３０、ＨＣＰ５２、ＨＣＱ６４およびＨＣＰ９９が同定されている。重鎖のプロリンでないものに注目して、変異ＨＣＴ２８ＲがＤ９０との相互作用の可能性を有し、ＨＣＴ３０ＲがＤ９０およびＥ９７の両方との相互作用の可能性を有し、Ｑ６４ＲがＥ１１４との相互作用の可能性を有するであろうことは目視検査によって明らかであるが、他の類似した変異も適用することができる。Ｅ９７のみがすべてインターフェロンαにわたって保存されるので、ＨＣＴ３０ＲはｈｚＡＣＯ−１と類似したプロフィールで最も良く結合することが期待される。

特異的変異ＨＣＴ３０Ｒは、ｈｚＡＣＯ−１の親和性を改善するために結合部位の周辺における電荷−電荷相互作用を確立するようにデザインされた。

さらに、ＬＣＹ３２ＥおよびＨＣＴ３０Ｒの両方の変異を含有する二重変異（ｈｚＡＣＯ−１Ｙ３２Ｅ，Ｔ３０Ｒと呼ばれる）は、２つの変異が相加効果を有するかどうかを決定するために生成および分析された。
実施例８−ｈｚＡＣＯ−１、ｈｚＡＣＯ−１バリアントと組換えヒトＩＦＮ−αサブタイプとの間の相互作用のための動力学的パラメーターの決定。

タンパク質相互作用は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析を使用して、リアルタイムでモニタリングすることができる。この研究において、抗ＩＦＮαモノクローナル抗体ｈｚＡＣＯ−１およびそのバリアントの特性を評価するために、組換えヒトインターフェロンα（ＩＦＮ−α）の様々なサブタイプに対する親和性について、ビアコア３０００およびビアコアＴ１００の器機でＳＲＰ解析を行なった。

親和性研究は、センサーチップ表面上のカルボキシメチル化されたデキストラン膜（ＣＭ５）に遊離アミン基を介して共有結合でカップリングさせたそれぞれのモノクローナル抗体により、直接結合手順を使用して行なわれた。組換えＩＦＮ−αサブタイプ（ＰＢＬバイオメディカル・ラボラトリーズ社、ニュージャージー、アメリカ）を様々な濃度で注入し、続いてセンサーチップ表面を覆う一定のバッファーフローによる解離期間をとった。この実験計画法の使用、固定化されたモノクローナル抗体に対するＩＦＮ−αの結合は、１つの抗体結合部位に対して１つのＩＦＮ−α分子結合で、１：１の結合と見なすことができる。相互作用のための動力学的パラメーターは、１：１相互作用のラングミュアフィッティングモデルを使用して計算することができる。

精製されたモノクローナル抗体は、ＣＭ５タイプのセンサーチップ上の個々のフローセル中で固定化された。固定化は、１０００共鳴単位（ＲＵ）の固定化レベルを目指して、標準的なアミンカップリング手順を使用して行なわれた。

ＨＢＳ−ＥＰｐＨ７．４（１０ｍＭヘペス、１５０ｍＭＮａＣｌ、３ｍＭＥＤＴＡおよび０，００５％ポリソルベートＰ２０）を、ランニングバッファーおよび組換えＩＦＮ−αについての希釈剤として使用した。会合（注入）は４分であり、続いて１２乃至３０分の解離期間をとった。流速は５０μｌ／分であった。実験は２５℃で行なわれた。すべてフローセルの検出は同時に行なわれた。フローセル＃１は固定化された抗体を含有しておらず、バックグラウンドおよびバルクを引くために使用した。

動力学的パラメーターは、１：１ラングミュア結合モデルを使用して、与えられた抗体抗原組み合わせについてのデーターの全体的なフィッティングによって計算された。データーは動力学的パラメーターの計算の前に物質移動律速について検査された。

実験はビアコア３０００およびビアコアＴ１００の器機で行なわれた。データーは、Ｂｉａｅｖａｌ４．１およびビアコアＴ１００評価ソフトウェアを使用して評価した。

得られた動力学的パラメーターは、使用したバッファー中で、および組換え型の抗原でのみ妥当である。
結果

親和性を保持してヒト化ＡＣＯ−１抗体を生成するために、異なるストラテジーを使用して、実施例２、３および７中で記載されるように、多数のヒト化バリアントを生成した。組換えヒトＩＦＮ−αサブタイプとｈｚＡＣＯ−１のバリアントとの間の相互作用についての動力学的パラメーターは、ＳＰＲ解析によって得られた。表１１中で見られるように、たとえｈｚＡＣＯ−１（実施例２中で記載されるように生成された）が短縮したＣＤＲＨ２を含有し復帰変異がなくても、マウス抗体の２倍以内のｈｚＡＣＯ−１のＫＤによって示されるように、マウスＡＣＯ−１と比較して、ｈｚＡＣＯ−１の親和性は保持されていた。したがって、実施例２中で同定および記載されるように、フレームワーク領域中のヒトからマウスＡＣＯ−１へのそれ以上復帰変異は、ヒト化のために必要とされなかった。さらに、ｈｚＡＣＯ−１抗体のＩＦＮ−αサブタイププロフィールは、表２に示されるように保持された。
表１１。ＡＣＯ−１およびｈｚＡＣＯ−１バリアントと組換えＩＦＮ−αＡの相互作用についての動力学的パラメーター。
ＫＤは平衡解離定数であり、ｋａは会合速度定数であり、ｋｄは解離速度定数である。

従来のＣＤＲグラフトによって生成され、したがって大きなマウスＣＤＲＨ２を含有するヒト化ＡＣＯ−１分子（ｈｚＡＣＯ−１−ｋａｂａｔＣＤＲＨ２と表記される）と比較した、ｈｚＡＣＯ−１の、組換えヒトＩＦＮ−αＡとの相互作用についての動力学的パラメーターは、表１２にリストされる。示されるように、実施例２中で記載されるようにヒト化され、ｈｚＡＣＯ−１−ｋａｂａｔＣＤＲＨ２分子よりも短いＣＤＲＨ２を含有するｈｚＡＣＯ−１分子の親和性は等しく、実施例２中で記載されているヒト化プロセスは、単純なＣＤＲグラフトによって生成されたものと同じくらい優れているが、より多くのヒト配列を有するヒト化バリアントを生成することを示した。
表１２。ｈｚＡＣＯ−１およびｈｚＡＣＯ−１−ｋａｂａｔＣＤＲＨ２と組換えＩＦＮ−αＡの相互作用についての動力学的パラメーター。
ＫＤは平衡解離定数であり、ｋａは会合速度定数であり、ｋｄは解離速度定数である。

さらに、ｈｚＡＣＯ−１およびｈｚＡＣＯ−１−ｋａｂａｔＣＤＲＨ２が、ヒトＩＦＮ−αの様々なサブタイプに対する結合について同等の動力学的パラメーターを有するかどうかを調べるために、選択されたヒトＩＦＮ−αサブタイプに対して解離比較実験を行なった（表１３）。このことは、ｈｚＡＣＯ−１の親和性は、より短いマウスＣＤＲＨ２配列を有するにもかかわらず、ｈｚＡＣＯ−１−ｋａｂａｔＣＤＲＨ２と比較して、すべての試験したサブタイプに対して保持されるようであることを示す。
表１３。ｈｚＡＣＯ−１およびｈｚＡＣＯ−１−ｋａｂａｔＣＲＨ２と組換えヒトＩＦＮ−αＡの様々なサブタイプとの間の相互作用の解離速度定数（ｋｄ）のそれぞれの比較。

マウスＡＣＯ−１抗体の親和性を越えてｈｚＡＣＯ−１の親和性を改善することを試みるために、ＩＦＮ−αＡとＡＣＯ−２配列に基づく変異を含有する異なるｈｚＡＣＯ−１バリアントとの間のパラメーターの動力学が測定された（表１１）。行なわれた個別の実験において得られたパラメーターを相関させるために、個々の抗体のＫＤ値を同じ実験におけるｈｚＡＣＯ−１のＫＤ値に対して正規化し、同じ実験におけるｈｚＡＣＯ−１のＫＤに対する個々のモノクローナル抗体のＫＤ値の関係を、カラム「ＫＤモノクローナル抗体／ＫＤｈｚＡＣＯ−１」中で示す。

親和性決定は、ＡＣＯ２に由来するすべてのｈｚＡＣＯ−１抗体バリアント（ｈｚＡＣＯ−１−Ｉ５８Ｓ以外）のＫＤ値が低いｎＭ範囲であることをさらに実証した。ＫＤ値における小さな変化は、大部分はｋｄの差に関連する。ｈｚＡＣＯ−１における単一アミノ酸置換のＮ３１Ｓ、Ａ９３ＶまたはＴ２８Ｓおよびその組み合わせの導入は、ＡＣＯ−１の親和性に類似したレベルまで親和性をわずかに増加させた。ｈｚＡＣＯ−１−Ｉ５８Ｓ変異はｋｄ値に対して顕著な負の効果があり、ｈｚＡＣＯ−１／ＩＦＮα−Ａ複合体の安定性についてのこの特定のアミノ酸が重要であることを実証する。

ｈｚＡＣＯ−１Ｆａｂ／ＩＦＮ−α８結晶構造に基づいて、親和性をなおさらに増加させるために、多数のアミノ酸置換をｈｚＡＣＯ−１中に導入した（実施例７を参照）。これらのうちの、２つの単一置換（軽鎖のＹ３２Ｅおよび重鎖のＴ３０Ｒ）は親和性に有意な正の効果を有し（表１４）、ＩＦＮ−αＡに対する親和性をそれぞれ約２倍および約６倍増加させた。顕著なことに、２つの変異を組み合わせること（Ｙ３２ＥおよびＴ３０Ｒの両方を含有するｈｚＡＣＯ−１コンストラクト）によって、ＩＦＮ−αＡに対する親和性の約１０倍の増加が観察された（表１５）。
表１４。ｈｚＡＣＯ−１およびｈｚＡＣＯ−１バリアントと組換えＩＦＮ−αＡの相互作用についてのそれぞれの動力学的パラメーター。
ＫＤは平衡解離定数であり、ｋａは会合速度定数であり、ｋｄは解離速度定数である。

表１５。ｈｚＡＣＯ−１およびｈｚＡＣＯ−１Ｙ３２Ｅ，Ｔ３０Ｒと組換えＩＦＮ−αＡの相互作用についてのそれぞれの動力学的パラメーター。
ＫＤは平衡解離定数であり、ｋａは会合速度定数であり、ｋｄは解離速度定数である。

合理的デザインアプローチに基づいて生成されたｈｚＡＣＯ−１Ｙ３２Ｅ，Ｔ３０Ｒコンストラクトは、ＩＦＮ−α１に結合しないが試験された残りのサブタイプに結合するので、ＩＦＮ−αサブタイププロフィールを保持していることを、表１６中の動力学データーは例証する。Ｙ３２Ｅ、Ｔ３０Ｒ変異によって引き起こされた動力学的パラメーターに対する効果が、ヒトＩＦＮ−αの様々なサブタイプへの結合に反映されることを検証するために、選択されたヒトＩＦＮ−αサブタイプに対して解離比較実験を行なった（表１６）。二重変異ｈｚＡＣＯ−１コンストラクトの示唆された変異はＩＦＮ−α８の構造に基づいていたが、予測外に、すべての試験されたヒトＩＦＮ−αサブタイプについて、６〜６４倍の間で変動する解離速度の改善が観察された。
表１６。ｈｚＡＣＯ−１およびｈｚＡＣＯ−１Ｙ３２Ｅ，Ｔ３０Ｒと組換えヒトＩＦＮ−αの様々なサブタイプとの間で相互作用の解離速度定数（ｋｄ）のそれぞれの比較。

実施例９−ＣＰＥ分析におけるｈｚＡＣＯ−１コンストラクトの解析

この実施例は、ｈｚＡＣＯ−１が、ＩＦＮ−α１およびＩＦＮ−αＤ（ｈｚＡＣＯ−１によって影響されなかった）の保護的効果以外の、試験されたすべてＩＦＮ−αサブタイプの保護的効果を阻害できたことを示す。
材料および方法

使用されるこの抗ＩＦＮ−α中和分析は、Ａ５４９細胞に対するＥＣＭウイルスの細胞溶解効果に基づく。すべてのＩＦＮ−αサブタイプは、Ａ５４９細胞におけるＥＣＭウイルス複製を阻害することができ、細胞生存をもたらし、それは細胞内ＤＮＡ染色として測定することができる。異なるＩＦＮ−αサブタイプに対する抗ＩＦＮ−α抗体の中和効果は、細胞内ＤＮＡ染色の減少（細胞溶解の増加に対応する）によって測定することができる。

分析は９６ウェルを持つプレート（ヌンク（Ｎｕｎｃ）社、カタログ番号１６７００８）中で行ない、各々のウェルは２００μＬの最終体積を含有していた。すべてのＩＦＮ−α調製物はＰＢＬバイオメディカル・ラボラトリー社、ニュージャージー、アメリカからであった。

各々のウェルに、それぞれ体積５０μＬの４つの溶液（ＩＦＮ−α、ｈｚＡＣＯ−１、細胞およびウイルス）を加えた。すべての溶液は、１０％ＦＣＳ含有Ｆ１２Ｋａｉｇｈｎ培地（ギブコ社、カタログ番号２１１２７）中で調製した。各々のＩＦＮ−αサブタイプの特異的濃度（表１７に以下にリストされた）は、従来の研究に由来した。例えば、マウス抗体のＡＣＯ−１．５．２およびＡＣＯ−２．２．の使用から得られた既存のデーターに基づいて、分析において使用される抗体濃度は選択された。

各々のＩＦＮ−αサブタイプは、ｈｚＡＣＯ−１と共に、３７℃、５％ＣＯ₂で２時間プレインキュベーションした。抗インターフェロン抗体を表１７中で以下で示されるように希釈した。ＩＦＮ−αとの抗体のプレインキュベーション後に、５０μＬの細胞溶液（３０００００細胞／ｍＬ）を加えて１５０００細胞／ウェルを得た。３７℃、５％ＣＯ₂で４．５時間のインキュベーション後に、１０＾３．５ＴＣＩＤ₅₀の濃度で５０μＬのＥＣＭウイルスを加え、続いて３７℃、５％ＣＯ₂で４８時間インキュベーションを行なった。

続いて上清を注意深く除去し、５０μＬのクリスタルバイオレット溶液（０．５％クリスタルバイオレット、２５％メタノール）を加えた。室温で１５分のインキュベーション後に、ウェルを水で洗浄し、一晩で乾燥させた。

次いで、乾燥したプレートに、純粋なメタノールを２００μＬ／ウェルで１５分間加えて細胞からクリスタルバイオレットを抽出した。抽出後に、１００μＬの上清を、新しい９６ウェルのプレート（ヌンク社、カタログ番号２５６５１０）に注意深く移し、１００μＬのミリ−Ｑ水を各々のウェルに加えた。次いでプレートを５９０ｎｍでＥＬＩＳＡリーダーで測定した。

ＥＬＩＳＡリーダーから回収された生データーを、解析の前にメタノールおよびプレートバックグラウンドで補正した。
表１７。ＣＰＥ分析パラメーター。

結果および考察

分析において観察された細胞変性効果が、抗体および／またはＩＦＮ−αの細胞毒性によって引き起こされるのではなく、そしてウイルスに対する細胞のＩＦＮ−α保護の欠損が細胞変性効果を引き起こすのではないことを保証するために、異なる６つの対照（細胞、細胞＋抗体、細胞＋ＩＦＮ−α、細胞＋抗体＋ＩＦＮ−α、細胞＋ウイルス、および細胞＋ＩＦＮ−α＋ウイルス）を研究におけるすべてプレートで使用した。対照において、有意な細胞毒性効果は分析で観察されず、細胞変性効果の兆候はどんなインターフェロンのレベルでもなかった。

図４中で示されるように、このＣＰＥ分析は、ｈｚＡＣＯ−１によってほとんどすべてのインターフェロンサブタイプの保護的効果を阻害できることを示した。しかしながら、ＩＦＮ−αＤおよびＩＦＮ−α１の保護的効果は、５００００ｎｇ／ｍＬの抗体濃度のｈｚＡＣＯ−１によってでさえ阻害されなかった。したがって、マウスＡＣＯ−１の特異性はｈｚＡＣＯ−１コンストラクトにおいて保持されていた。
実施例１０−レポーター遺伝子（ＲＧ）生物検定におけるＡＣＯに由来する抗体の解析

ルシフェラーゼベースのレポーター遺伝子分析を、ｈｚＡＣＯ−１抗体バリアントが組換えＩＦＮαサブタイプの生物学的活性を中和する能力を評価するために利用した。
材料

「完全」ダルベッコ変法イーグル培地（フェノールレッド＋１０％ＦＣＳ＋２ｍＭＬ−グルタミン＋ペニシリン＋ストレプトマイシン＋２−メルカプトエタノールを含むＤＭＥＭ）、ヌンク社９６ウェルオプティカルボトムプレート（黒色、組織培養用処理）、１ｍＭＣａ²⁺および１ｍＭＭｇ²⁺を含むＰＢＳ、ステディー・グロー（Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ）ルシフェラーゼ分析システム（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社）。

９３Ｄ７細胞株は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を駆動するＭｘプロモーターを保有するＩＦＮ誘導可能コンストラクトによるＡ５４９細胞株（ＣＬＬ−１８５、ＡＴＣＣ）の安定したトランスフェクションに由来する。Ｍｘプロモーターは、ｐＳＰ６４−Ｍｘｐ（ＰｓｔＩ−ＰｖｕＩＩ）−ｒβｇｌｏから切り取られたマウスＭｘＡプロモーターおよびＩＦＮ応答エレメントを含有する１．６ｋｂのＢａｍＨＩ断片からなる（Lleonart et al. (1990) Biotechnology 8: 1263-1267）。

使用するＩＦＮ−αサブタイプ（すべて、ＰＢＬバイオメディカル・ラボラトリーズ社、ニュージャージー、アメリカから）を、図５中にリストする。
方法

ＲＧ分析は、不透明なヌンク社９６ウェルオプティカルボトムプレート中で、四重のウェルで行なった。すべての分析について、陽性対照のＩＦＮαに加えて、非刺激細胞を含有する陰性対照ウェル、およびＩＦＮα刺激の非存在下において抗体により処理された細胞が含まれていた。

具体的には、接着した９３Ｄ７細胞は、培養培地を除去し、ＰＢＳにより一回洗浄し、トリプシン処理することによって、フラスコから採取した。トリプシン処理は完全ＤＭＥＭを使用して停止した。細胞をカウントし、完全ＤＭＥＭ中で６００，０００／ｍｌに調整した。

精製された抗ＩＦＮ−αモノクローナル抗体を、３７℃＋５％のＣＯ₂で全体積１００μｌの完全ＤＭＥＭ中で１時間組換えＩＦＮサブタイプと共に、プレインキュベーションした。抗体−ＩＦＮのインキュベーションに続いて、５０μｌの９３Ｄ７細胞を加え、３７℃＋５％ＣＯ₂で５時間インキュベーションした。

組換えＩＦＮ亜種によるＭｘＡ駆動ルシフェラーゼ誘導について分析するために、ＩＦＮの濃度は、各々のウェル中に１００μｌで入れる量を含有するように調整された。１００μｌのＩＦＮを四重のウェル中に入れ、３７℃＋５％のＣＯ₂で１時間インキュベーションした。続いて、５０μｌの細胞を加え、インキュベーションをさらに５時間継続した。

精製されたモノクローナル抗体を使用して、組換えＩＦＮ亜種によるＭｘＡ駆動ルシフェラーゼ誘導の阻害について分析するために、５０μｌの組換えＩＦＮの所望の希釈物を１ウェルあたり加えた。次いで、完全ＤＭＥＭ中で希釈した５０μｌの抗体をウェルに加え、３７℃＋５％のＣＯ₂で１時間インキュベーションした。このインキュベーション後に、細胞を加え、インキュベーションをさらに５時間継続した。

５時間のインキュベーション後に、マルチチャンネルピペットを使用して、培地を細胞から注意深く除去した。次に、粘着性の黒いブロッカーを９６ウェルプレートのボトムに添付した。１００μｌのＣａ²⁺およびＭｇ²⁺イオン含有ＰＢＳを各々のウェルに追加した。１００μｌの再構成したステディー・グロー試薬は、各々のウェルに加え、各々のウェルにおける内容物が完全に混合されたことを確かめた。プレートを透明な粘着性のストリップにより密封した。暗所における室温での５分のインキュベーションに続いて、トップカウント（Ｔｏｐｃｏｕｎｔ）ルミネッセンス・カウンター（パーキン・エルマー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）社）で発光を読み取った。

抗体により発揮されたＩＦＮ誘導性（ＭｘＡ駆動性）ルシフェラーゼ活性に対する阻害の程度の計算のために、様々なＩＦＮ−αサブタイプの抗体阻害を比較する場合、抗体の非存在下における活性レベルに対してカウントを正規化し、この値を１００％に設定した。複数の単一のＩＦＮ−αの抗体のバリアント型の阻害の比較のために、データーは未加工のルシフェラーゼカウントとして示される。ＥＣ５０、および分析においてプラトーが達成されるＩＦＮ濃度を決定するために、ＩＦＮは、抗体の非存在下において最初にタイトレーションされた。抗体阻害のために試験する場合、ルシフェラーゼの堅実な誘導に加えて、分析における飽和未満レベルでの作動の両方を保証するために、一般的にはＩＦＮは最大刺激レベルの８０％で使用された。プリズム（グラフパッド・ソフトウェア社（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）、サンディエゴ）ソフトウェアを計算およびデーター表示のために使用した。
結果および考察

ヒト化されたＡＣＯ−１コンストラクトは、レポーター遺伝子分析において様々なヒトＩＦＮ−αサブタイプを阻害する能力について評価された。図５は、ｈｚＡＣＯ−１抗体によって１２のＩＦＮ−αサブタイプの阻害についての正規化されたデーターを示す。抗体の非存在下におけるＩＦＮ−α刺激を１００％に設定したが、モック処理した細胞（培地のみを与える）を０％に設定した。データーポイントを標準誤差と共に示す。曲線はプリズムソフトウェアを使用して、最もフィットしたシグモイド応答曲線として計算された。ｈｚＡＣＯ−１は、ＩＦＮ−αＤ以外の試験されたすべてのＩＦＮ−αの亜種を阻害することができ、したがってマウスＡＣＯ−１親抗体の特異性は、ヒト化の過程でｈｚＡＣＯ−１抗体に保持されていた。阻害は、高い抗体濃度でＩＦＮ−α活性がバックグラウンドレベルまで減少されたという点で完全であった。様々なＩＦＮ−αサブタイプの阻害についてのＩＣ５０は、この研究において２８ｎｇ／ｍｌ乃至３１４ｎｇ／ｍｌにわたった。より高いｈｚＡＣＯ−１濃度でさえＩＦＮ−αＤを阻害することができなかった。

図１０は、ＲＧ分析において、ヒト化されたＡＣＯ−１（ｈｚＡＣＯ−１）に加えて、２つの本明細書のバリアントに対するマウスＡＣＯ−１抗体の比較を示す。１つのバリアントは、完全なＣＤＲＨ２を保有するヒト化されたＡＣＯ−１（ｈｚＡＣＯ−１−ｋａｂａｔＣＤＲＨ２と表記される）であるが、ｈｚＡＣＯ−１は実施例２を記載されるように短いＣＤＲＨ２により構築された。さらに、図は、実施例７中で記載されるように、合理的デザインを介して複数のＩＦＮ−αとの相互作用について至適化された、別の変異ｈｚＡＣＯ−１（ｈｚＡＣＯ−１Ｙ３２Ｅ，Ｔ３０Ｒと表記される）を示す。これらの４つの組換えモノクローナル抗体バリアントを、ＲＧ分析において５つの異なる代表的なＩＦＮ−αサブタイプの阻害に関して比較した。

ｈｚＡＣＯ−１は、実施例８中で報告した観察されたＫＤによれば、５つのすべてのＩＦＮサブタイプについてマウスＡＣＯ−１とほとんど同等のＩＣ５０値（定量的に２倍未満のＩＣ５０）を示した（相対ＩＣ５０値についての表１８を参照）。ヒト化は、したがって、機能阻害についてはＡＣＯ−１親抗体の２倍未満の親和性減少で遂行された。結論としては、ＡＣＯ−１のモノクローナル抗体のヒト化は、複数のＩＦＮ−αに対して親和性を保持した抗体を産生した。したがって、親和性および力価の両方は、もとのマウスＡＣＯ−１と比較して、ｈｚＡＣＯ−１抗体で保持されたと判断され、それ以上の復帰変異は必要とされなかった。

実施例２中で記載されるように、一般的な単純なＣＤＲグラフトによるヒト化と比較して、ＡＣＯ−１のヒト化方法は、ＣＤＲＨ２中に比較的より多くのヒトアミノ酸を持つ抗体をもたらした。図１０および表１８中で示されるように、ＩＦＮ−αサブタイプの中和についてはヒト化されたＡＣＯ−１で力価の減少をもたらすことが予想できたが、意外にも、ｈｚＡＣＯ−１およびｈｚＡＣＯ−１−ｋａｂａｔＣＤＲＨ２は、試験したすべてのＩＦＮ−αサブタイプについて力価が等しいので、これはそうではない。これは、実施例８中で記載されるように、２つのＡＣＯ−１バリアントについて報告された親和性と一致している。
表１８。ｈｚＡＣＯ−１バリアントによるＩＦＮ−αサブタイプ阻害についてのＩＣ５０値。
正規化されたデーター。ＩＣ５０値は、ｈｚＡＣＯ−１のＩＣ５０値に対して正規化された各々のＩＦＮ−α種についてであった。したがって、１未満の値は、ＩＦＮ−α活性のｈｚＡＣＯ−１による阻害よりも高い力価で阻害する抗体を示すが、反対に１よりも高い値は阻害力価が低いことを示す。

ＡＣＯ−２に由来するｈｚＡＣＯ−１バリアントの力価を決定するために、実施例３中で記載されるように、これらをＲＧ分析を使用してｈｚＡＣＯ−１に比較した。２つのＩＦＮ−α亜種（ＩＦＮ−αＦおよびＩＦＮ−αＡ）を使用して比較を行なった。異なる単一の４つのアミノ酸置換（Ｔ２８Ｓ（すなわち位置２８（Ｋａｂａｔに従う）で、スレオニンをセリンで置換する）、Ｉ５８Ｓ、Ｎ３１ＳおよびＡ９３Ｖ）を試験した。

Ｉ５８Ｓバリアントは、減少した力価、および恐らくさらに減少した有効性でＩＦＮ作用を阻害したが（ＩＦＮ−αＡ）、Ｔ２８ＳおよびＮ３１Ｓのバリアントは両方ともｈｚＡＣＯ−１の力価に類似した力価を示した。しかしながら、Ａ９３Ｖ置換のバリアントは、ＲＧ分析において測定されるようにＩＦＮ効果の阻害については増加した力価を示した（図６）。異なるＩＦＮ−αサブタイプ間で置換の効果の差を検出することができたが、傾向はすべての４つの事例で２つの型について同じである。

実施例６中の結晶構造を使用する合理的デザインを介して、ＩＦＮ−αへの結合を改善するために、実施例７中で記載されるように、２つのアミノ酸を変化させて変異体ｈｚＡＣＯ−１のＨＣＴ３０Ｒ、ＬＣＹ３２Ｅ（ＡＣＯ−１Ｙ３２Ｅ，Ｔ３０Ｒと表記される）を構築した。変異はＩＦＮ−α８の構造に基づいていたが、図１０（Ａ〜Ｅ）から理解されるように、意外にも、この変異はすべての試験したＩＦＮ−αの阻害についての力価を増加させた。さらに、表１８は、力価の増加量は特異的サブタイプに依存するが、１６倍程度乃至最大５０倍の力価の改善があることを示す。

従って、実施例６中の結晶構造から得られたエピトープ情報は、このエピトープへの改善された結合親和性を持つ他の抗体バリアントをデザインするために使用することができる。さらに従って、本発明に従うかかるヒト化された抗体バリアントは、本発明の範囲によって包含される。
実施例１１−ヒト化されたＡＣＯに由来する抗体のタンパク質特性評価

この実施例は、ｈｚＡＣＯ−１および異なるバリアントの熱安定性に関する。
材料

抗体
ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４のアイソタイプとして発現されたｈｚＡＣＯ−１
ｈｚＡＣＯ−１−Ｔ２８Ｓ
ｈｚＡＣＯ−１−Ｎ３１Ｓ
ｈｚＡＣＯ−１−Ａ９３Ｖ
ｈｚＡＣＯ−１−Ｔ２８Ｓ−Ｎ３１Ｓ

以下は、研究中の使用されるバッファー（１００ｍＭ）およびそれらのｐＨ値のリストである。クエン酸／クエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０および３．５；酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０、４．５および５．０；ヒスチジン、ｐＨ６．０および６．５；イミダゾール、ｐＨ７．０；グリシン−グリシンｐＨ８．０、９．０、１０．０。

以下は、研究中の使用される添加剤のリストおよびそれらの濃度である。ＮａＣｌ、１００ｍＭ；ショ糖、０．２５Ｍ、０．５０Ｍ；フェノール、０．５％；ツイーン８０、０．０１％；グリセロール、１０％。
サーモフルオロ（ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ）安定性測定

１０μｌの４００×サイプロオレンジタンパク質ゲル染色剤５０００×濃縮のＤＭＳＯ中の溶液（インビトロゲン・モレキュラー・プローブス（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）社）、２５μｌバッファーおよび１０μｌタンパク質（１０μＭ）を、９６ウェルＰＣＲプレート（バイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ）社）のウェルに追加した。プレートを、マイクロシールＢアドヒージブ・シーラー（ＭｉｃｒｏｓｅａｌＢＡｄｈｅｓｉｖｅｓｅａｌｅｒ）ＭＳＢ−１００１（バイオラッド社）でシールし、０．５℃の増加量で２５℃から９５℃でＭｙｉＱ単色リアルタイムＰＣＲ検出システム（バイオラッド社）中で加熱した。プレートのウェル中の蛍光変化を電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラで同時にモニタリングした。励起および放射のための波長はそれぞれ４９０ｎｍおよび５７５ｎｍだった。タンパク質変性移行の中間点温度は、温度の関数の蛍光強度の一次微分最大値として決定された。

ｈｚＡＣＯ−１およびバリアントのサーモフルオログラフは、ＩｇＧタンパク質について、２つの主要なドメイン（ＦｃおよびＦａｂ）を反映する２つの予想される温度推移を示した。タンパク質は低いｐＨでの低いＴｍを示した。ｐＨ５．５より上では、移行中間点はむしろ一定であった。

添加剤の効果は異なる抗体について同じであった。一般的には、０．５Ｍのショ糖は最も安定効果を有していたが、ＮａＣｌ、フェノールおよびツイーン８０の添加は、不安定にする効果があるようであった。

より低いｐＨ（ｐＨ３．５）で、ｈｚＡＣＯ−１と異なるバリアントとの間で安定性における差が観察された（図７Ａ）。二重変異ｈｚＡＣＯ−１−Ｔ２８Ｓ−Ｎ３１Ｓおよび単一の変異ｈｚＡＣＯ−１−Ａ９３ＶはこのｐＨで最も高い安定性を示した。ウイルス不活化工程はｐＨ３．５〜４．０でしばしば実行されるので、これは治療抗体産物のための精製プロセスにおいて重要でありえる。より高いｐＨ（ｐＨ４．５、５．５；それぞれ図７Ｂおよび７Ｃ）で、この安定性の差は減少した。
溶液安定性の研究

１５ｍＭヒスチジン（ｐＨ６．５）、２０ｍｇ／ｍｌショ糖および０．０１％ツイーン８０中のｈｚＡＣＯ−１−ＩｇＧ４、ｈｚＡＣＯ−１−ＩｇＧ１およびｈｚＡＣＯ−１−ＩｇＧ２の溶液を４０℃でインキュベーションし、サンプルは、最初におよび５週間後に解析のために採取した。ｈｚＡＣＯ−１のインタクトなタンパク質、可溶性凝集物および／または断片の分布をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）を使用して決定した。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムモデルの１１００または１２００の液体クロマトグラフィーシステム（アジレント・テクノロジー（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社、パロアルト、カリフォルニア）を、０．８ｍＬ／分の流速で、ｐＨ７．２を使用して、移動相としてリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で、ＢＩＯＳＥＰＳＥＣ３０００（フェノメネクス（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）社）カラムと共に使用した。タンパク質は２１５ｎｍでＯＤをモニタリングすることによって検出された。全タンパク質領域における各々のピークのパーセンテージを計算した。

ｈｚＡＣＯ−１−アイソタイプの形成された高分子量型の量は、図１１中で示され、ＩｇＧ４コンストラクトはインキュベーションの間に凝集物形成を示さなかったが、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２の両方のアイソタイプは高分子量バリアントを形成したことを明白に示す。

さらに、ｈｚＡＣＯ−１−ＩｇＧ１バリアントはインキュベーション後に低分子量断片を示した。断片の量は１．３％だった。

したがって、安定性の観点から見て、ｈｚＡＣＯ−１ＩｇＧ４は、対応するＩｇＧ２抗体およびＩｇＧ１抗体よりも魅力的な治療用分子である。
実施例１２−ＡＤＣＣ解析。

実施例６において記載されるように、本明細書のＡＣＯ−１モノクローナル抗体およびヒト化されたバージョンは、Ｉ型インターフェロンα受容体サブユニット１（ＩＦＮＡＲ１）へのＩＦＮ−αの結合を阻害することによって、ＩＦＮ−αの活性をブロックすることができる。したがって、ヒト化された治療用ＡＣＯ−１モノクローナル抗体は、細胞表面に結合し、抗体、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮＡＲ２からなる複合体を作りうる。これは、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導するＡＣＯ−１のリスクを高める。

そのために、ＡＤＣＣ実験を行なって、ＩＦＮ−α２Ａの存在下においてＩｇＧ４サブタイプとして発現させたｈｚＡＣＯ−１抗体の能力を評価した。
材料および方法。

ラジ（Ｒａｊｉ）細胞（ヒトＢ細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−８６））を標的細胞として使用した。ラジ細胞を、１０％ウシ胎仔血清、１０ｍＭヘペス、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１ｍＭグルタミン、２．５ｇ／ｌグルコースおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンで補足されたＲＰＭＩ１６４０中で培養した。高精製したインターフェロン−α２Ａを分析のために使用した。タンパク質は、使用の前に生物学的活性についてレポーター遺伝子分析において試験された。ラジ細胞（Ｂ細胞表面抗原ＣＤ−２０を発現するＢ細胞株）を使用する場合、リツキサン（登録商標）（ノメコ社（ＮｏｍｅｃｏＡ／Ｓ）、デンマーク）を、ＡＤＣＣについての陽性対照として使用した。

標的細胞を採取し、血球計数器においてカウントした。１．５×１０⁶細胞を１５ｍＬチューブに移し、遠心分離した。上清を完全に除去し、細胞沈殿を１０⁶細胞あたり１００μＣｉの⁵¹Ｃｒ（クロム−５１）中で再懸濁した（崩壊表に従って体積を調整した）。ＩＦＮ−αによる３７℃での１時間のインキュベーション期間の間に、バイアルを１５分ごとにタッピングした。続いて細胞を培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＣＳ）中で２回洗浄し、分析培地の２ｍＬ培地中で再懸濁した。５０００の⁵¹Ｃｒ標識細胞を、９６ウェルプレート（平底）中に体積５０μＬでプレーティングした。すべてサンプルを三重で分析した。最大放出および最小放出はエフェクター細胞なしのウェル中で決定された。最大放出：５０００の標的細胞／ウェル＋１％のトリトンＸ−１００。最小放出：５０００の標的細胞／ウェル。エフェクター細胞は、標準的な技術を使用して、フィコール密度遠心分離によって「バフィーコート」から精製した。新たに単離したヒトＰＢＭＣを、段階的な数で各々のウェルに加えた。以下のエフェクター細胞対標的細胞（Ｅ：Ｔ）の比を使用した。１０、２０、４０および８０。すべて実験において、ｈｚＡＣＯ−１は１０μｇ／ｍＬ（６６ｎＭ）の飽和濃度で試験された。ＩＦＮ−α２Ａは、０．５、２．５、５および１０ｎＭで試験された。最終的な分析体積は２００μＬであった。３７℃での４時間のインキュベーション後に、３０μＬの上清をルマプレート（ＬｕｍａＰｌａｔｅ）（商標）に移し、一晩風乾させた。トップカウントＮＸＴ（パーキン・エルマー社、アメリカ）で放射能を決定した。データーをグラフプリズム（ＧｒａｐｈＰｒｉｓｍ）（登録商標）プログラムへと入力し、三重のデーターの平均の毎分放射能数および対応する標準偏差を計算した。
結果。

図１２中で見られるように、ＩＦＮ−αの存在下または非存在下において、ＩｇＧ４として発現されたｈｚＡＣＯ−１分子について、バックグラウンド（細胞、またはＩＦＮ−αと細胞）より上のＡＤＣＣの誘導がないことを観察できた。これとは対照的に、リツキスマブ（Ｒｉｔｕｘｕｍａｂ）（陽性対照として使用される）は、エフェクター細胞および標的細胞の比（Ｅ：Ｔ）の異なる比で細胞溶解を誘導した。
実施例１３−補体結合ＥＬＩＳＡ分析。

実施例６中で記載されるように本明細書のＡＣＯ−１モノクローナル抗体およびヒト化されたバージョンは、Ｉ型インターフェロンα受容体サブユニット１（ＩＦＮＡＲ１）へのＩＦＮ−αの結合を阻害することによって、ＩＦＮ−αの活性をブロックすることができる。したがって、ヒト化された治療用ＡＣＯ−１モノクローナル抗体は細胞表面に結合し、抗体、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮＡＲ２からなる複合体を作りうる。これは、補体系活性化および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の誘導のリスクを高める。

本補体結合研究の目的は、ヒトＩｇＧ４アイソタイプとして発現されたｈｚＡＣＯ−１が、ｈＩＦＮ−α上の対応するエピトープへ結合しそれと複合体を形成する場合、古典的補体経路が活性化されるかどうかを試験することだった。これは、Ｃ４へ抗体の結合を測定するＥＬＩＳＡの使用によって遂行される。Ｃ４の結合は、Ｃ１ｓが変化し、補体活性化経路が開始したことを示す。一旦Ｃ４が結合したならば、血漿からの他の補体成分は、次には、活性化され、結合し、カスケードの次の成分を酵素により切断する。
材料および方法。

ストレプトアビジンコートマイクロタイタープレート（２３６００１、ヌンク社）を、ＥＬＩＳＡプレートとして使用した。ビオチン化ｈＩＦＮ−α２Ａを抗原ソースとして使用し、プレートを、洗浄バッファー（１０ｍＭＮａ３ＰＯ４＋１４５ｍＭＮａＣｌ＋０．０５％ツイーン２０）中で希釈した０．２５μｇ／ｍｌタンパク質によって１００μｌ／ウェルでコートした。このｈＩＦＮ−α濃度は、ＥＬＩＳＡにおける至適のコート濃度であることが示された。プレートを室温で６０分間穏やかに振盪しながらインキュベーションし、次いで洗浄バッファー中で５回洗浄し、プレート中で最後の洗浄のバッファーを３０分間放置して、プレート上の可能な残りの結合部位をブロックした。バッファーをプレートから廃棄し、洗浄バッファー中で希釈した１００μｌのｈｚＡＣＯ−１モノクローナル抗体はを１μｇ／ｍｌでプレートに加えた。プレートを緩やかに振盪しながら室温で６０分間インキュベーションした。プレートを洗浄バッファー中で５回洗浄した。ポリクローナルの抗ＩｇＧ４ポリクローナル抗体を、ｈｚＡＣＯ−１ＩｇＧ４モノクローナル抗体の架橋によって陽性対照として使用した。抗ＩｇＧ４ポリクローナル抗体−モノクローナル抗体を洗浄バッファー中で希釈し、１００μｌ／ウェルで３２μｇ／ｍｌ乃至３２ｎｇ／ｍｌの階段希釈でプレートに加えた。抗ＩｇＧ４ポリクローナル抗体の異なる２つの精製を使用し、１つは親和性精製した抗体および１つはプロテインＡ精製した抗体であった。プレートを緩やかに振盪しながら室温で６０分間インキュベーションした。プレートを洗浄バッファー中で５回洗浄した。血漿バッファー（０．３ｍＭＣａ２＋、１ｍＭＭｇ２＋含有ＰＢＳ）中で１：２００に希釈したヒト血漿を１００μｌ／ウェルで加えた。プレートを緩やかに振盪しながら３７℃で６０分間インキュベーションした。プレートを５回洗浄し、洗浄バッファー中で１：２０００に希釈したマウス抗ヒトＣ４（ＨＹＢ１６２−０２＋ＨＹＢ１６２−０４、ＳＳＩ）の各々を１００μｌ／ウェルでプレートに追加した。プレートを緩やかに振盪しながら室温で６０分間インキュベーションした。プレートを洗浄バッファー中で５回洗浄し、その後洗浄バッファー中で１：１０００を希釈したＨＲＰウサギ抗マウスＩｇＧ（ダコ（ＤＡＫＯ）社Ｐ０２６０）を１００μｌ／ウェルで加えた。プレートを５回洗浄し、１００μｌのＴＭＢ基質をすべてウェルに加えた。インキュベーションの約６分後に、１００μｌの４ＭＨ３ＰＯ４をすべてウェルに加えて酵素反応を停止した。ヴィクター（Ｖｉｃｔｏｒ）プレートリーダー（ワラック（Ｗａｌｌａｃ）社）による分光測光法で色を測定した。
結果。

ヒトＩｇＧ４アイソタイプとして発現させたｈｚＡＣＯ−１は、ＩＦＮ−αでコートしたプレートを使用するＥＬＩＳＡによって、補体成分を結合する能力について試験された。これは、古典的補体活性化経路における成分の１つであるＣ４への結合の検出によって視覚化された。図１３中で示されるように、ｈｚＡＣＯ−１ＩｇＧ４は補体を固定することができなかった。陽性対照として、ポリクローナルの抗ＩｇＧ４ポリクローナル抗体はｈｚＡＣＯ−１ＩｇＧ４抗体の架橋によって結合を誘導するために使用された。ｈｚＡＣＯ−１が抗ＩｇＧ４のポリクローナル抗体と交差結合するならば、抗ＩｇＧ４へのＣ４の明らかな用量依存的結合が検出された。
実施例１４−抗体アイソタイプの選択。

ヒト化されたモノクローナル抗体を発現する場合、ヒト抗体アイソタイプを全長ヒト抗体の発現のために選択する必要がある。中和用抗ＩＦＮ−α抗体の作成のために、Ｆｃ仲介性エフェクター機能は必要とされない。

さらに、ＡＣＯ−１に由来する抗体はＩＦＮ−α活性を中和することができるが（実施例９および実施例１０）、ＡＣＯ−１抗体バリアントの結合するエピトープは、実施例６中で記載されるように、ＩＦＮＡＲ２受容体サブユニットおよびＩＦＮ−αの同時結合を両立することができる。したがって治療用ｈｚＡＣＯ−１モノクローナル抗体は可溶性ＩＦＮ−αサイトカインへ結合するが、実際はこのモノクローナル抗体はＩＦＮ−α／ＩＦＮＡＲ２複合体を介して細胞表面へ結合し、Ｆｃ仲介性エフェクター機能の動員によって細胞毒性を引き起こしうる。これに加えて、抗ＩＦＮのモノクローナル抗体のＦｃ部分は、実際は、以下に記載されるように、特定の細胞タイプにおいてＩＦＮの中和の代わりに増強をもたらす所望されない生物学的効果を引き起こしうることが記載されているので、Ｉ型ＩＦＮ（ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−β）に対する抗体について、抗体アイソタイプの選択は特に重要である（Moll HP. et al J Immunol 180, 1594-604, 2008）。

Ｉ型ＩＦＮの存在下においてヒトのＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βに対する抗体は通常は他の細胞タイプにおけるＩＦＮ活性を中和し、代わりにＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βの存在下においてヒト内皮細胞およびＰＭＢＣにおけるＩＦＮ活性を誘導する。これらの研究において使用される抗体はマウスＩｇＧ１アイソタイプであり、ヒトＦｃ受容体へ交差結合することが公知である。ＩＦＮ活性の誘導は同じ抗体のＦａｂまたはＦａｂ２断片ではなくインタクトな抗体でのみ見られ、抗体アイソタイプ対照モノクローナル抗体によるＦｃ受容体の遮断によって阻害されるように思われる。したがって、この現象の分子機構は公知ではないが、これらのモノクローナル抗体がＦｃ部分を介して細胞表面の受容体へ結合することを必要とするように思われる。さらに、この現象は、ＩＩ型ＩＦＮ（ＩＦＮ−γ）に対する抗体としてＩ型ＩＦＮに特異的であるようであり、類似した現象はＩ型ＩＦＮ受容体（ＩＦＮＡＲ）に対する抗体について観察されない。（Moll HP. et al J Immunol 180, 1594-604, 2008）。

要約すると、ＩＦＮ−αの中和のための治療用抗ＩＦＮモノクローナル抗体の開発のために、Ｆｃ仲介性エフェクター機能は必要とされず、実際は、抗ＩＦＮ−ａモノクローナル抗体で処置された患者の特定の細胞タイプにおいて細胞毒性を引き起こすことまたはＩＦＮ活性を増強することによって、所望されない生物学的効果を引き起こしうる。それゆえ、エフェクター機能を誘導することができないヒト化されたモノクローナル抗体の生成が重要である。

４つの異なるヒト抗体アイソタイプ、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ＩｇＧ３およびＩｇＧ４が存在する。これらのうち、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３はＦｃ受容体および補体への結合で最も効率的であり、それゆえ依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）などのＦｃ仲介性エフェクター機能の活性化を引き起こす（Salfeld JG. Biotechnol 25, 1369-1372, 2007）。様々なＦｃ受容体およびＣ１ｑの結合を停止する変異は文献において記載されている（Hezareh M. et al J Virol 75, 12161-12168, 2001.、Idusogie EE. Et al. J Immunol 164, 4178-4184, 2000.、Lund J. et al J Immunol.,147:2657-6, 1991.およびChappel et al 1991, Canfield MS et al J Exp Med. 173:1483-91, 1991）。しかしながら、例えばＩｇＧ１アイソタイプの選択および複数の変異の組入れは、かかる修飾されたＦｃ領域はヒトにおいて天然に存在しないので、免疫原性をもたらす可能性があり、ヒトにおいてＦｃ部分に対する免疫応答を引き起こしうる。

その理由のために、ｈｚＡＣＯ−１（抗ＩＦＮ−αモノクローナル抗体）は、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４のアイソタイプ（両方とも多数の治療用抗体において使用される）の両方で発現された（Salfeld JG. Biotechnol 25, 1369-1372, 2007）。予想外に、ＩｇＧ４コンストラクトの発現レベルは、産生収率をかなり改善するＩｇＧ２ｈｚＡＣＯ−１バリアント（実施例５）の発現レベルよりも有意に高かった。さらに、ＩｇＧ２ｈｚＡＣＯ−１分子は凝集する傾向があったが、ＩｇＧ４バリアントはその傾向はなかった（実施例１１）。凝集は、産生の間に収率を低下させて、保管期間を限定し、免疫原性の増加のために患者における力価減少をもたらしうるので、このことは薬物開発において深刻な問題と判断される。

したがって、実施例１２および１３においてそれぞれ記載されるように、ｈｚＡＣＯ−１ＩｇＧ４コンストラクトは、ＩＦＮ−αの存在下におけるＡＤＣＣ分析に加えて、補体固定ＥＬＩＳＡ分析でのさらなる特性評価のために選択された。これらのデーターは、ｈｚＡＣＯ−１ＩｇＧ４分子が所望されない細胞毒性を確かに引き起こすことができないことを確認する。ＩＦＮ−α活性の増強の予想される欠如は、Moll et al 2008において記載されるように、ＰＢＭＣおよびＥＣにおいても確認することができる。

要約すると、ｈｚＡＣＯ−１ＩｇＧ４分子は、ＩＦＮ活性の細胞毒性および増強を含むＦｃ仲介性エフェクター機能によって引き起こされる所望されない副作用の誘導なしにＩＦＮ−αを中和することができるので、および安定性がありよく発現される分子であり製造および患者への投与に適切であるので、ｈｚＡＣＯ−１ＩｇＧ４分子は特に適切な治療用分子であるように思われる。
実施例１５−Ｔ細胞エピトープの解析

免疫原性予測のための標準的な技術に基づいて（De Groot,A.S. and Moise,L. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 10, 332-340, 2007)、ProPred(Singh,H. & Raghava,G.P. ProPred. BioIFNormatics. 17, 1236-1237, 2001）によって拡張されたポケットプロフィール法（Sturniolo,T. et al. Nat. Biotechnol. 17, 555-561,1999）を使用して、５１のＨＬＡ−ＤＲＢ対立遺伝子の中で直線的Ｔ細胞エピトープを予測した。この方法は、評価されるタンパク質内の既定の９つの残基長ペプチドが結合することができる対立遺伝子の数を計算する。多くの対立遺伝子を結合する既定のペプチドが非ヒト起原であるならば、これは免疫原性の間接的な測定値として使用することができる。ペプチドがヒト起原であるならば、対応するＴ細胞の初期の負の選択のために免疫応答は期待されない。

ｈｚＡＣＯ−１のために適用された実際のヒト化手順に対して、全長ｈｚＡＣＯ−１−ｋａｂａｔＣＤＲＨ２を使用するヒト化手順の予測された免疫原性を比較することがこの実施例の目的である。

ＰｒｏＰｒｅｄアルゴリズムに対する入力配列として、ｈｚＡＣＯ−１−ｋａｂａｔＣＤＲＨ２の周囲に加えられた１０＋１０残基を持つ全長ＡＣＯ−１ＣＤＲ＿Ｈ２
ＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧ／ＥＩＮＰＳＨＧＲＴＩＹＮＥＮＦＫＳ／ＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴ（ＣＤＲ＿Ｈ２＿全長）を、
同じ領域中の同等のｈｚＡＣＯ−１配列
ＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧ／ＥＩＮＰＳＨＧＲＴＩＹＡＱＫＦＱＧ／ＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴ（ＣＤＲ＿Ｈ２＿ヒト）
と共に使用する。

ＣＤＲ＿Ｈ２＿全長を通して実行すると、Ｔ細胞エピトープ予測は以下の３つのエピトープを与える。ＷＭＧＥＩＮＰＳＨ（ＨＬＡ−ＤＲＢ対立遺伝子の４％に結合する）、ＩＮＰＳＨＧＲＴＩ（６％）およびＦＫＳＲＶＴＭＴＲ（２４％）。ＣＤＲ＿Ｈ２＿ヒトについては、最初のマイナーな２つのエピトープは同一であるが、最後の主なエピトープはＦＱＧＲＶＴＭＴＲ（２７％）に変換される。たとえそれがまだＴ細胞エピトープであっても、それは今や完全にヒト配列であり、推定から、自己反応性のＴ細胞は胸腺中で負の選択によって削除され、ＣＤＲ＿Ｈ２＿全長中のこの可能な主なエピトープはＣＤＲ＿Ｈ２＿ヒト配列によって除去されている。

したがって、ｈｚＡＣＯ−１は、従来のＣＤＲをグラフトしたヒト化ＡＣＯ−１よりも免疫原性がないことが予想される。
実施例１６−ＣＤＲ短縮

実施例２において記載されるように、マウスＡＣＯ−１抗体は従来の方法ではない方法によってヒト化された。これは、ｈｚＡＣＯ−１およびＩＦＮ−αＡの三次元モデルに基づいて、パラトープを含むことが予測される残基のマスクをデザインすることである。このヒト化方法の適用は、至適化されたｈｚＡＣＯ−１ＣＤＲＨ２配列の５個のＣ末端アミノ酸を含むペプチドが、対応するヒトフレームワーク配列と同一だったので、単純なＣＤＲグラフトによってヒト化された抗体よりも少ないマウス残基を持つｈｚＡＣＯ−１抗体をもたらした。これとは対照的に、従来のＣＤＲをグラフトしたヒト化抗体（ｈｚＡＣＯ−１−ｋａｂａｔＣＤＲＨ２）中の対応するペプチド配列は、マウス起原であった。したがって、このヒト化手順は、より多くのヒト配列を持ち、患者において免疫原性をあまり引き起さないヒト化された抗体をもたらした。ＣＤＲＨ２の配列の解析は、ｈｚＡＣＯ−１中のマウスアミノ酸残基を減少させることによって、マウスアミノ酸を含有するＭＨＣクラスＩＩＴ細胞エピトープが除去され、完全にヒトと置換されることを明らかにし、それに対して患者は寛容であると予想される。したがって、このことから、ｈｚＡＣＯ−１が従来のＣＤＲをグラフトしたヒト化ＡＣＯ−１抗体よりも免疫原性でないと予想されることが確認された。

ｈｚＡＣＯ−１抗体の親和性は、実施例８中で示されるように、マウスＡＣＯ−１抗体の２倍以内に保持された。したがって、それ以上のマウス復帰変異は必要とされなかった。さらに、実施例８、９および１０中で記載されるように、抗体のＩＦＮ−αサブタイププロフィール（ＩＦＮ−α１／Ｄ以外のすべてのＩＦＮ−αサブタイプを結合および中和する）は保持された。ＣＤＲＨ２中により少ないマウスアミノ酸を含有しているにもかかわらず、ｈｚＡＣＯ−１の親和性は、ｈｚＡＣＯ−１−ｋａｂａｔＣＤＲＨ２抗体（マウスＡＣＯ−１抗体からの全長マウスＣＤＲＨ２を含有する）の親和性および力価と同一であった（それぞれ、実施例８および９）。

さらに、記載されたヒト化方法の使用による重鎖中の位置６０〜６２におけるＮＥＮの代わりに配列ＡＱＫを置換することは、脱アミド化を受けやすい２個のアスパラギンを避けるという長所を有する。脱アミド化は、安定性および／または特異性に影響しうるタンパク質の正味電荷を変化させる。配列ＡＱＫの維持によって、ｈｚＡＣＯ−１の均一性はよりよく保存されるだろう。ｈｚＡＣＯ−１と従来のＣＤＲをグラフトしたｈｚＡＣＯ−１−ｋａｂａｔＣＤＲＨ２バージョンの比較は、ｈｚＡＣＯ−１は高安定性タンパク質であるが、ｈｚＡＣＯ−１−ｋａｂａｔＣＤＲＨ２抗体に予想外に凝集する傾向があることを明らかにした（実施例１１）。凝集は、産生の間の低収率、限定された保管期間および免疫原性の増加のために患者における力価減少をもたらしうるので、凝集は薬物開発において深刻な問題と判断される。さらに、ｈｚＡＣＯ−１コンストラクトの発現レベルは予想外にｈｚＡＣＯ−１−ｋａｂａｔＣＤＲＨ２バリアントの発現レベルの２倍であった（実施例５）。

要約すると、ｈｚＡＣＯ−１ＩｇＧ４抗体は、より少ないマウスアミノ酸を持ち、患者において免疫原性をあまり引き起さない治療用抗体をもたらす新規のアプローチによってヒト化された。もとのマウスモノクローナル抗体からのより少ないアミノ酸を含有しているにもかかわらず、このヒト化された抗体は、マウス抗体および従来のＣＤＲグラフトによって生成されたヒト化バージョンと、同等の親和性、力価、およびＩＦＮ−αサブタイププロフィールを有していた。さらに、ｈｚＡＣＯ−１抗体は脱アミド化を受けにくく、より高い発現レベルを有する。したがって、ｈｚＡＣＯ−１抗体は、製造および患者への投与に適切な、安定性がありよく発現される分子である。

本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕ヒトインターフェロン−α（ＩＦＮ−α）を特異的に結合するヒト化抗体またはその抗原結合断片であって、ヒト化抗体がＫａｂａｔに従うマウス相補性決定領域（ＣＤＲ）よりも少ないドナーアミノ酸残基を含む、マウス抗体のＡＣＯ−１もしくはＡＣＯ−２またはその組み合わせのヒト化バージョンである、ヒト化抗体またはその抗原結合断片。
〔２〕ＩＦＮ−αを特異的に結合するヒト化抗体またはその抗原結合断片であって、該抗体がＩＦＮ−αサブタイプのＡ、２、Ｂ２、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ２、Ｉ、Ｊ１、Ｋ、４ａ、４ｂおよびＷＡを結合することが可能であるが、サブタイプの１またはＤを結合することが可能ではなく、該抗体がＫａｂａｔに従う非ヒトＣＤＲよりも少ないドナーアミノ酸残基を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合断片。
〔３〕前記ＣＤＲＨ２ドナー残基がＫａｂａｔ残基５０〜５９を含む、前記〔１〕または〔２〕のいずれか一項に記載の抗体。
〔４〕前記〔１〕〜〔３〕のいずれか一項に記載の抗体であって、ＩＦＮ−αサブタイプ上でＡＣＯ−１抗体および／またはＡＣＯ−２抗体と同じエピトープを競合および／または同じエピトープに結合する抗体。
〔５〕前記抗体がＩｇＧ４サブタイプである、前記〔１〕〜〔４〕のいずれか一項に記載の抗体。
〔６〕前記抗体が配列番号：２１に記載のＣＤＲＨ２配列を含む、前記〔１〕〜〔５〕のいずれか一項に記載の抗体。
〔７〕前記〔１〕〜〔６〕のいずれか一項に従って抗体を生産する方法であって、適切な条件下で該抗体をコードする宿主細胞をインキュベーションすることおよび続いて該抗体を単離することを含む方法。
〔８〕前記〔７〕に記載の方法によって得られた抗体。
〔９〕前記〔１〕〜〔６〕および前記〔８〕のいずれか一項に記載の抗体を含む組成物。
〔１０〕賦形剤と抗体またはその断片を混合することを含む、前記〔９〕に記載の組成物の調製方法。
〔１１〕前記〔９〕に記載の方法によって得られる組成物。
〔１２〕ＩＦＮ−αに関連するＩＦＮｌａｍｍａｔｏｒｙ疾患または障害を防止、管理、処置または寛解する方法であって、それを必要とする被験者に予防的または治療的に効果のある量の前記〔１〕〜〔６〕および前記〔８〕のいずれか一項に記載の抗体を投与することを含む方法。
〔１３〕炎症性疾患の処置のために適切な医薬品の調製のための前記〔１〕〜〔６〕および前記〔８〕のいずれか一項に記載の抗体の使用。

Claims

ヒト化抗ＩＦＮ−α抗体又はその抗原結合断片であって、
該ヒト化抗体は、
マウス抗体ＡＣＯ−１のヒト化バージョンであり、
ヒトインターフェロン−α（ＩＦＮ−α）のサブタイプＡ、２、Ｂ２、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ２、Ｉ、Ｊ１、Ｋ、４ａ、４ｂおよびＷＡに特異的に結合し、かつ、該ヒト化抗体又はその抗原結合断片は、
以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）：
（ａ）配列番号１５を含むＣＤＲＨ１配列、
（ｂ）配列番号２１を含むＣＤＲＨ２配列、
（ｃ）配列番号１７を含むＣＤＲＨ３配列、
であるＶＨＣＤＲ配列を含み、
更に以下の（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）：
（ｄ）以下の（ｉ）又は（ii）：
（ｉ）配列番号１８、
（ii）変異Ｙ３２Ｅにより配列番号１８とは異なる配列(ＳＡＧＳＳＶＤＳＳＥＬＹ)、を含むＣＤＲＬ１配列、
（ｅ）配列番号１９を含むＣＤＲＬ２配列、
（ｆ）配列番号２０を含むＣＤＲＬ３配列
であるＶＬＣＤＲ配列を含む、
ヒト化抗体又はその抗原結合断片。
ＩＦＮ−αサブタイプ上でＡＣＯ−１抗体と同じエピトープを競合および／又は同じエピトープに結合する、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
前記抗体又はその抗原結合断片がＩｇＧ４サブタイプである、請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合断片。
配列番号３に対応するＶＨ配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
変異Ｔ３０Ｒ及びＡ９３Ｖのいずれか又は両方により配列番号３に示される配列とは異なるＶＨ配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
配列番号６に対応するＶＬ配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
変異Ｙ３２Ｅにより配列番号６に示される配列とは異なるＶＬ配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
配列番号３を含むＶＨドメイン及び配列番号６を含むＶＬドメインを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
ＣＤＲＬ１配列が、変異Ｙ３２Ｅにより配列番号１８とは異なる配列（ＳＡＧＳＳＶＤＳＳＥＬＹ）を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体を含む、治療組成物。
サブタイプのＡ、２、Ｂ２、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ２、Ｉ、Ｊ１、Ｋ、４ａ、４ｂ及びＷＡからなる群から選択された少なくとも１つのＩＦＮ−αサブタイプの異常な発現と関連する自己免疫性又は炎症性の疾患又は障害の治療に適した医薬を製造するための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体の使用。
疾患又は障害が、ＳＬＥ、関節リウマチ及び乾癬からなる群より選ばれる、請求項１１に記載の使用。
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片であって、
以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）：
（ａ）配列番号１５（ＮＹＷＭＨ）を含むＣＤＲＨ１配列、
（ｂ）配列番号２１を含むＣＤＲＨ２配列、
（ｃ）配列番号１７を含むＣＤＲＨ３配列
であるＶＨＣＤＲ配列を含み、
更に以下の（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）：
（ｄ）配列番号１８（ＳＡＧＳＳＶＤＳＳＹＬＹ）を含むＣＤＲＬ１配列、
（ｅ）配列番号１９（ＳＴＳＮＬＡＳ）を含むＣＤＲＬ２配列、
（ｆ）配列番号２０を含むＣＤＲＬ３配列
であるＶＬＣＤＲ配列を含む、抗体又はその抗原結合断片。