ES2549903T3 - Anticuerpos humanizados contra interferón alfa humano - Google Patents

Anticuerpos humanizados contra interferón alfa humano Download PDF

Info

Publication number
ES2549903T3
ES2549903T3 ES09742079.8T ES09742079T ES2549903T3 ES 2549903 T3 ES2549903 T3 ES 2549903T3 ES 09742079 T ES09742079 T ES 09742079T ES 2549903 T3 ES2549903 T3 ES 2549903T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
antibody
ifn
hzaco
cdr
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES09742079.8T
Other languages
English (en)
Inventor
Lars Anders Svensson
Søren PADKJÆR
Birgitte Friedrichsen
Berit Olsen Krogh
Inger Lund Pedersen
Jan Fleckner
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Merix Bioscience Inc
Original Assignee
Merix Bioscience Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merix Bioscience Inc filed Critical Merix Bioscience Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2549903T3 publication Critical patent/ES2549903T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/249—Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C07K16/464—Igs containing CDR-residues from one specie grafted between FR-residues from another
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues

Abstract

Un anticuerpo humanizado anti-IFN-α, o un fragmento del mismo de enlazamiento al antígeno, que comprende las siguientes secuencias de CDR del VH: (a) una secuencia de CDR H1 que consiste de la SEQ ID NO: 15; (b) una secuencia de CDR H2 que consiste de la SEQ ID NO: 21; y (c) una secuencia de CDR H3 que consiste de la SEQ ID NO: 17; y comprende además las siguientes secuencias de CDR de VH: (d) una secuencia de CDR L1 que consiste de la SEQ ID NO: 18; (e) una secuencia de CDR L2 que consiste de la SEQ ID NO: 19; y (f) una secuencia de CDR L3 que consiste de la SEQ ID NO: 20.

Description

Anticuerpos humanizados contra interferón alfa humano
Campo de la invención
La presente invención se refiere a anticuerpos humanizados contra interferón alfa (IFN-α) humano y su uso en el tratamiento o prevención de varias enfermedades y trastornos en pacientes humanos.
Antecedentes de la invención
Con base a una variedad de diferentes observaciones, el interferón alfa (IFN-α) es una citoquina que se cree que está involucrada en una variedad de enfermedades autoinmunes. Aunque los pacientes con lupus eritematoso sistémico (SLE) frecuentemente no tienen niveles medibles en suero de IFN-α, parecen tener la firma clara del gen del IFN-α. Además, la inducción de la maduración de células dendríticas (DC) mediante el tratamiento de las DC con suero de pacientes con SLE, se puede inhibir por un anticuerpo anti-IFN-α. También se ha demostrado que la inactivación del receptor de IFN-α/β en ratones New Zeeland Black (NZB) que tienen un fenotipo de SLE da por resultado un fenotipo casi normal (Santiago-Raber y colaboradores, J Exp. Med. 2003; 197(6): 777-88).
Por lo tanto, se han sugerido anticuerpos contra IFN-α como herramientas para neutralizar la actividad de esta citoquina para el tratamiento de estas enfermedades autoinmunes, solos o en combinación. Se generaron y caracterizaron anticuerpos murinos específicos (ACO-1 a ACO-6) que reconocen una amplia variedad de diferentes subtipos de IFN-α, como se describe en la solicitud de patente internacional, publicada como WO20060086586. Sin embargo, los anticuerpos murinos no son adecuados para el uso en humanos debido a su inmunogenicidad, y por lo tanto es deseable generar anticuerpos humanizados donde se injertan las CDR de murino en un anticuerpo humano de andamiaje. Sin embargo, los anticuerpos humanizados padecen frecuentemente de deficiencias funcionales en comparación con los progenitores murinos, tales como por ejemplo, una menor afinidad y/o estabilidad y/o inmunogenicidad indeseable. Estas deficiencias en los anticuerpos humanizados se pueden compensar, en algunos casos, mediante una o unas pocas retromutaciones puntuales. Usualmente, es deseable no realizar o solamente muy pocas retromutaciones puntuales ya que la presencia de muchas retromutaciones tiende a dar como resultado una baja estabilidad indeseable y/o un grado indeseable de inmunogenicidad. Por lo tanto, es deseable proporcionar un anticuerpo anti-IFN-α humanizado, seguro y estable, que tenga propiedades biológicas deseables tal como, por ejemplo, la retención de la afinidad y potencia del anticuerpo anti-IFN-α humanizado en un gran número de subtipos de IFN-α.
Existe por lo tanto la necesidad en la técnica de anticuerpos anti-IFN-α humanizados que tengan características deseables con respecto a características tales como, por ejemplo, estabilidad, especificidad, seguridad, inmunogenicidad, etc. Adicionalmente, existe la necesidad en la técnica de métodos eficientes para producir estos anticuerpos.
Resumen de la invención
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un anticuerpo humanizado que se enlaza de manera específica a interferón α (IFN-α) humano, o a un fragmento del mismo de enlazamiento al antígeno, que comprende las siguientes secuencias de CDR del VH.
(a)
una secuencia de la CDR H1 que consiste de la SEQ ID NO: 15;
(b)
una secuencia de la CDR H2 que consiste de la SEQ ID NO: 21; y
(c)
una secuencia de la CDR H3 que consiste de la SEQ ID NO: 17;
y además comprende las siguientes secuencias VL de la CDR:
(d)
una secuencia de la CDR L1 que consiste de la SEQ ID NO: 18;
(e)
una secuencia de la CDR L2 que consiste de la SEQ ID NO: 19; y
(f)
una secuencia de la CDR L3 que consiste de la SEQ ID NO: 20.
La presente divulgación se refiere además a un anticuerpo humanizado que se enlaza de manera específica a IFN-α,o un fragmento del mismo que se enlaza al antígeno, en donde dicho anticuerpo es capaz de enlazar a los subtipos de IFN-α A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b y WA, pero no a los subtipos 1 o D, y en donde dicho anticuerpo comprende menos residuos de aminoácido del donante que las CDR no humanas de acuerdo a Kabat.
La presente divulgación se refiere además a métodos para obtener estos anticuerpos. En otro aspecto, la presente invención gira alrededor del uso de tales anticuerpos para propósitos terapéuticos y de composiciones que comprenden estos anticuerpos.
Los anticuerpos de acuerdo a la presente invención pueden ser adecuados para el tratamiento de varias enfermedades inflamatorias.
Descripción de las figuras
La Figura 1 muestra el análisis de las secuencias de ACO-1 VH y VL (B) de murino para humanización (hz = humanizadas), donde la máscara se muestra en texto sombreado, las CDR de Kabat se muestran en negrita, las diferencias entre la secuencia de ratón y la secuencia de línea germinal humana se muestran en texto subrayado en negrita, y los residuos de retromutación potenciales, en texto subrayado, sombreado. ACO-1 VH = SEQ ID NO: 1; VH1_46/JH4 de línea germinal humana = SEQ ID NO:2; hzACO-1 VH = SEQ ID NO: 3; ACO-1 VL = SEQ ID NO: 4; VKIII_L6/JK2 de línea germinal humana = SEQ ID NO: 5; hzACO-1 VL = SEQ ID NO: 6.
La Figura 2 muestra una alineación entre las secuencias ACO-1 y ACO-2 VH (A) y VL (B), así cómo las correspondientes secuencias de línea germinal de ratón. ACO-2 VH = SEQ ID NO 7; J558.33/D_/JH3_1 de línea germinal de ratón = SEQ ID NO: 8; ACO-2 VL = SEQ ID NO: 9; ae4/ JK4_1 de línea germinal de ratón = SEQ ID NO: 10.
La Figura 3 muestra la ubicación de los residuos de ACO-2 seleccionados para la introducción en hzACO-1.
La Figura 4 muestra la inhibición de hzACO-1 del efecto protector de todos los subtipos de interferón probados excepto para IFN-αD y IFN-α1 en un ensayo de CPE.
La Figura 5 muestra la inhibición de hzACO-1 de 12 especies de IFN-α por un ensayo de gen reportero (RG). Los valores para cada concentración de anticuerpo se normalizaron y se calculó el promedio de cuatro repeticiones. Los datos se muestran como el promedio +/-los errores estándar. Se calcularon las curvas de respuesta sigmoidal de mejor ajuste usando el software Prism. Los valores de R2 estuvieron para todos los conjuntos de datos por arriba de 0.98 (excepto para IFN-αD para el cual no se hizo ajuste de la curva).
La Figura 6 muestra una comparación del ensayo de RG de hzACO-1 con variantes de hzACO-1 que tiene la única mutación A93V derivada de ACO-2, usando IFN-αA (A) o IFN-αF (B). Los cálculos de los datos se hicieron como se describe en la Figura 5.
La Figura 7 muestra las temperaturas de transición para hzACO-1 y sus variantes a pH 3.5 (A), 4.5 (B), y 5.5 (C), sin aditivos.
La Figura 8 muestra la estructura de las cadenas (H, L) del fragmento Fab hzACO-1, enlazadas a IFN-α8, determinada por cristalografía de rayos X.
La Figura 9 muestra los epítopos de enlace a IFN-α8 para IFNAR1 y IFNAR2 (Quadt-Akabayov S. R. y colaboradores, Protein Sci. 15, 2656-2668, 2006 y Roisman L.C y colaboradores, J. Mol. Biol. 353, 271-281, 2005), como se indica por los cajones coloreados por abajo de la secuencia de IFN-α8. Los residuos indicados por los cajones coloreados de gris están conservados parcialmente entre todos los subtipos de IFN-α en tanto que los residuos indicados por cajones coloreados de negro están completamente conservados. El epítopo enlazado a hzACO-1, usando un corte a una distancia de 4 A Å, en IFN-α8 se indica por medio de u “*” arriba de la secuencia de aminoácidos de IFN-α8.
La Figura 10 muestran la comparación del mAb de ACO-1 de ratón con hzACO-1 así como dos variantes del mismo en el ensayo de RG. Una variante es un ACO-1 humanizado que alberga la CDRH2 completa (denominado CDRH2 hzACO-1-kabat) mientras que el hzACO-1-se construyó con una CDRH2 más corta como se describe en el ejemplo 2. Además, la figura muestra otro hzACO-1 mutado que ha sido optimizado para interacción con IFN-αs (hzACO-1 Y32E, T30R) a través de un diseño racional. Estas cuatro variantes recombinantes de mAb se compararon con respecto a la inhibición de cinco subtipos diferentes representativos de IFN-α, como se indica.
La Figura 11 muestra un estudio de estabilidad de proteína de hzACO-1 expresado con los isotipos humanos IgG1, IgG2 e IgG4. Se determinó la agregación por HPLC después de la incubación en regulador de histidina durante 5 semanas.
La Figura 12 muestra un ensayo de liberación de 51Cr que ilustra la carencia de ADCC por hzACO-1 IgG4, IFN-α y diferentes combinaciones de los mismos, en diferentes proporciones de células efectoras:objetivo (E:T). Las células + PBMC solas sin IFN-α pr hzACO-1 determina la lisis de fondo y Triton-X 100 ilustra la lisis máxima. Se incluyó Rituxan como control positivo e induce lisis celular detectable en todas las proporciones de E:T.
La Figura 13 muestra un estudio de enlazamiento con el complemento por ELISA. El hzACO-1 expresado como una IgG4 fue incapaz de fijar el complemento cuando se enlazó a IFN-α. Como control positivo, se entrecruzó el hzACO-1 con un pAb anti-IgG4, y se detectó un claro enlazamiento dependiente a la dosis de C4 al anti-IgG4.
Descripción de la invención
La presente invención se basa, en parte, en anticuerpos anti-IFN-α con propiedades adecuadas para tratar pacientes humanos que padecen de una condición o enfermedad relacionada a IFN-α, tal como, por ejemplo, una enfermedad o trastorno por lupus tal como, por ejemplo, SLE; enfermedad injerto versus huésped; diabetes tipo 1, SIDA, tiroiditis autoinmune, psoriasis, dermatomiositis juvenil, y síndrome de Sjögren. Los anticuerpos se basan típicamente en versiones humanizadas de los anticuerpos murinos ACO-1 y/o ACO-2.
Se identificaron ACO-1 y ACO-2 como capaces de bloquear la bioactividad de trece subtipos recombinantes de IFN-α así como dos mezclas complejas de IFN producidas después de infección viral (véase WO2006086586). ACO-1 y ACO2 también bloquearon de manera consistente la bioactividad del suero de pacientes con SLE que exhibieron signos de IFN-α mediante análisis de microarreglos. ACO-1 y el ACO-2 no neutralizaron en forma significativa la bioactividad de los subtipos D y 1 de la proteína IFN-α, pero neutralizaron la bioactividad de IFN-α del suero de SLE. Aunque no está limitado a la teoría, e posible por lo tanto que los subtipos D y 1 no estén significativamente involucrados en la etiología de SLE.
Como se describe en los ejemplos, el modelado estructural de las regiones variables reveló que era posible humanizar ACO-1 y ACO-2, usando menos residuos del donante (murino) que las CDR de Kabat, reduciendo de esta manera adicionalmente el riesgo de una respuesta inmune adversa en un paciente humano. El análisis también identificó sitios ventajosos para retromutaciones. Adicionalmente se descubrió que, posiblemente debido a la alta similitud de secuencia entre las regiones variables de ACO-1 y ACO-2 (que difieren solo en 13 sitos), ciertos residuos de aminoácido en la secuencia humanizada de ACO-1 (hzACO-1) se pueden reemplazar por residuos de ACO-2 en la posición correspondiente. Dentro de las regiones CDR, normalmente se pueden producir mutaciones sin que vuelvan menos humana la secuencia del
anticuerpo. Este procedimiento de humanización da como resultado propiedades funcionales mejoradas tal como afinidad, estabilidad, nivel de expresión y actividad inhibitoria de IFN-α del anticuerpo humanizado.
En un anticuerpo ACO-1 humanizado, los ejemplos de mutaciones en la VH de hzACO-1 (SEQ ID NO: 3) incluyen V5Q, T28S, M69L, R71V, T73K, S76I, S76N, T77I, V78A, Y79F y A93V, así como cualquier combinación de las mismas, usando la numeración de Kabat. Los ejemplos de mutaciones en la VL de hzACO-1 (SEQ ID NO: 6) incluyen E1Q, D29G, L33F, L47W, S50G, I58V, y F71Y, así como cualquier combinación de las mismas. En una realización, la región VH de hzACO-1 comprende una mutación seleccionada de T28S, N315, y A93V. En otra realización, la región VH de hzACO-1 comprende una mutación seleccionada de T28S, N318, y A93V, y cualquier combinación de las mismas, tal como por ejemplo, T28S y N318, T28S y A93V, y N31S y A93V. En otra realización, la región VH de hzACO-1 comprende una mutación seleccionada de T28S, N31S, y A93V, o cualquier combinación de las mismas, tal como por ejemplo, T28S y N31S, T28S y A93V, o N31S y A93V; y al menos una mutación adicional.
Definiciones
Para facilitar la comprensión de esta invención, a continuación se definen varios términos.
Los “anticuerpos ACO-1 y ACO-2" se caracterizan y describen en la publicación internacional WO20060086586. ACO-1 está depositado con ATCC, número de acceso PTA-6557 (WO2006086586) y ACO-2 está depositado como ATCC número de acceso PTA-7778 (WO2008021976). Los anticuerpos de acuerdo con la presente invención son variantes humanizadas de ACO-1 y ACO-2. Sin embargo, las versiones humanizadas de ACO-1 v ACO-2 de acuerdo con la presente invención no comprenden las secuencias de Kabat de murino de longitud completa. En una realización preferida, al menos una de las secuencias de CDR comprende un truncamiento de aproximadamente 3-10 aminoácidos, preferiblemente 3-8, más preferiblemente 4-7 aminoácidos. El anticuerpo comprende preferiblemente un truncamiento en la CDR H2, dicha CDR H2 que está preferentemente truncada por 3-10, preferiblemente 3-8, más preferiblemente 47, y lo más preferible por 6 aminoácidos. Y, adicionalmente, se deduce que se pueden introducir mutaciones puntuales ocasionales en una o más secuencias de CDR así como dentro del anticuerpo humano de andamiaje. El término “anticuerpos ACO-1 y ACO-2” puede abarcar además sin embargo cualquier anticuerpo IFN-α capaz de enlazarse a los subtipos A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b y WA de IFN-α, pero no a los subtipos 1 o D. Sin embargo, se debe entender que ACO-1 y ACO-2 como tales se pueden percibir como solo un anticuerpo puesto que las diferencias en sus secuencias de CDR son solo de unos pocos aminoácidos. Es plausible que ACO-1 y ACO-2 representen por lo tanto dos etapas de hipermutación somática in vivo del mismo anticuerpo. Un anticuerpo ACO-1/ACO-2 de acuerdo con la presente invención es por lo tanto un anticuerpo humanizado que comprende secuencias de CDR que tienen al menos 90% de identidad con las secuencias de CDR de ACO-1 y ACO-2, más preferiblemente al menos 92%, y lo más preferible al menos 95%.
Los términos: “truncamiento de CDR”, “mutación directa", y “acortamiento de las CDR” se pueden usar indistintamente a todo lo largo del documento. Con respecto a la presente invención, estos términos generalmente se refieren al hecho que el truncamiento de CDR se puede percibir como una cantidad de mutaciones directas en fila, lo que significa que un fragmento acortado de CDR de murino, se puede injertar en el marco humano. Aunque puede no ser sorprendente que
5 el injerto de las CDR más cortas tienda a dar como resultado anticuerpos con un grado reducido de inmunogenicidad, realmente es sorprendente que se puedan retener otras características ventajosas del anticuerpo humanizado tales como por ejemplo, estabilidad, especificidad, etc. Las “retromutaciones” se refieren siempre a mutaciones en el marco (es decir, no en las CDR) y las retromutaciones son típicamente la introducción de uno o más residuos de aminoácido de “murino” en sitios seleccionados, por ejemplo con fin de estabilizar la estructura del anticuerpo.
10 El término “interferón alfa” (IFN-α), como se usa en la presente invención, se refiere a una familia de proteínas que incluye algunos de los efectores principales de la inmunidad innata. Hay al menos 15 subtipos conocidos de IFN-α humano. Los nombres de los subtipos de proteína de IFN-α y los genes codificantes correspondientes se enlistan a continuación en la Tabla 1.
Tabla 1. Subtipos y genes de la proteína de IFN-α
Subtipo de proteína de IFN-α
Gen correspondiente de IFN-α
A
2a
2
2b
B2
8
C
10
D (Val114)
1
F
21
G
5
H2
14
I
17
J1
7
K
6
4a
4a
4b
4b
WA
16
1 (Ala114)
1
15 Véase Pestka y colaboradores, (1997) “Interferon Standardization and Designations" J Interferon Cytokine Res 17: Supplement 1, S9-S14. El IFN-αB2 algunas veces se denomina también como IFN-αB, y no se debe confundir con IFNβ. El IFN-α natural de leucocitos (IFN-de leucocitos), así como los subtipos humanos recombinantes de proteína de IFN-α están disponibles a través de PBL Biomedical Labs, Piscataway, NJ (interferonsource.com). El IFN-α natural es
20 una mezcla compleja de subtipos de IFN-α. En la técnica se conocen métodos para detectar y cuantificar estos interferones, tales como ELISA y RIA.
El término “anticuerpo" se usa en la presente invención en el sentido más amplio e incluye de manera específica anticuerpos monoclonales de longitud completa, anticuerpos policlonales, y a menos que se establezca otra cosa o sea
25 contraindicado por el contexto, los fragmentos que se enlazan al antígeno, variantes de anticuerpo, y moléculas multiespecíficas de los mismos, con tal que exhiban la actividad biológica deseada. En general, un anticuerpo de longitud completa es una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y al menos dos cadenas
ligeras (L) interconectadas por enlaces de disulfuro, o una porción de la mismas que se enlazan al antígeno. Cada cadena pesada consta de una región variable de cadena pesada (abreviada aquí como VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada consta de tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera consta de una región variable de cadena ligera (abreviada aquí como VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera consta de un dominio, CL. Las regiones VH y VL se pueden subdividir adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, llamadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, llamadas regiones marco (FR). Cada VH y VL está compuesta de tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el término amino hasta el término carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de enlazamiento que interactúa con un antígeno.
Una “fragmento que se enlaza al antígeno” de un anticuerpo es una molécula que comprende una porción de un anticuerpo de longitud completa que es capaz de enlazarse de manera detectable al antígeno. Los fragmentos que se enlazan al antígeno incluyen moléculas multivalentes que comprenden una, dos, tres o más porciones que se enlazan al antígeno de un anticuerpo, y constructos monocatenarios en donde las regiones VL y VH, o porciones seleccionadas de las mismas, se unen mediante enlazadores sintéticos o por métodos recombinantes para formar una molécula funcional que se enlaza al antígeno.
Los términos “derivado de anticuerpo" e “inmunoconjugado” se usan de manera indistinta aquí para denotar moléculas que comprenden un anticuerpo de longitud completa o un fragmento del mismo que se enlaza al antígeno, en donde uno o más aminoácidos se modifican químicamente, por ejemplo, por alquilación, PEGilación, acilación, formación de éster o formación de amida, o similares, por ejemplo, para enlazamiento del anticuerpo a una segunda molécula. Los ejemplos de modificaciones, incluyen PEGilación, PEGilación de cisteína, biotinilación, marcación radioactiva, y conjugación con un segundo agente, tal como un agente detectable o citotóxico.
Una “molécula multiespecífica" comprende un anticuerpo, o un fragmento del mismo que se enlaza al antígeno, que está asociada con, o enlazada a al menos otra molécula funcional (por ejemplo, otra proteína o péptido tal como otro anticuerpo o ligando para un receptor) para generar una molécula que se enlaza a al menos dos sitios diferentes de enlazamiento o moléculas objetivo. Los ejemplos de moléculas multiespecíficas incluyen anticuerpos biespecíficos y anticuerpos enlazados a fragmentos o ligandos solubles del receptor.
Un anticuerpo “humanizado” es un anticuerpo quimérico humano/no humano que contiene una secuencia mínima (regiones CDR) derivada de inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados son por lo tanto inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las cuales se reemplazan residuos de una región hipervariable del receptor por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata, conejo, o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad, deseadas. En algunos casos, los residuos de FR de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los correspondientes residuos no humanos. Adicionalmente, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se hacen para refinar adicionalmente el desempeño del anticuerpo. En general, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los cuales todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todos o sustancialmente todos los residuos de FR son aquellos de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también puede comprender opcionalmente al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente aquella de una inmunoglobulina humana.
El término “región hipervariable” cuando se usa aquí se refiere a los residuos de aminoácido de un anticuerpo que son responsables del enlazamiento al antígeno. La región hipervariable comprende en general residuos de aminoácido de una “región determinante de complementariedad” o “CDR” (residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el domino variable de cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el domino variable de cadena pesada; (Kabat y colaboradores (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, Publicación de NIH No. 91-3242) y/o aquellos residuos de un “bucle hipervariable” (residuos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Chothia y Lesk, J. Mol. Biol 1987; 196: 901-917). Típicamente, la numeración de los residuos de aminoácido en esta región se realiza por el método descrito en Kabat y colaboradores, ver más arriba. Las frases tales como “posición de Kabat”, “residuo de Kabat”, y “de acuerdo con Kabat" se refieren aquí a este sistema de numeración para dominios variables de cadena pesada o para dominios variables de cadena ligera. Usando el sistema de numeración de Kabat, la secuencia lineal real de aminoácidos de un péptido puede contener menos o aminoácidos adicionales que corresponden a un acortamiento de, o a una inserción en, una FR o CDR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada puede incluir inserciones de aminoácido (residuos 52a, 52h y 52c de acuerdo con Kabat) después del residuo 52 de CDR H2 y de los residuos insertados (por ejemplo, los residuos 82a, 82b, y 82c, etc., de acuerdo con Kabat) después del residuo 82 de FR de cadena pesada. La numeración de Kabat de los residuos se puede determinar para un anticuerpo dado por alineación en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia “estándar" numerada de Kabat. Los residuos de la “región marco" o “FR” son aquellos residuos de VH o VL diferentes de las CDR como se define aquí. Las “correspondientes" posiciones de aminoácidos en dos secuencias sustancialmente idénticas de aminoácidos son aquellas alineadas por cualquier software de análisis de proteína mencionado aquí, típicamente usando parámetros
predeterminados.
Una molécula “aislada" es una molécula que es la especie predominante en la composición en donde se encuentra con respecto a la clase de moléculas a la cual pertenece (es decir, constituye al menos aproximadamente 50 % del tipo de molécula en la composición y típicamente constituirá al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, o más de la especie de molécula, por ejemplo, péptido, en la composición). Comúnmente, una composición de una molécula de anticuerpo exhibirá 97%, 98% o 99% de homogeneidad para moléculas de anticuerpo con el contexto de todas las especies presentes de péptidos en la composición o al menos con respecto a especies sustancialmente activas de péptidos en el contexto del uso propuesto.
Los términos “neutraliza de forma selectiva” y “que neutraliza de forma selectiva", como se usan aquí, se refieren a un anticuerpo aislado y purificado (tal como, pero no limitado a, un anticuerpo monoclonal), o un fragmento del mismo que se enlaza al antígeno, que neutraliza de forma selectiva al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, o al menos aproximadamente 60% de la bioactividad de uno o más subtipos de proteína de IFN-α, pero no neutraliza de forma significativa al menos la bioactividad de otro subtipo de proteína de IFN-α, en donde la bioactividad puede ser, por ejemplo, activación del promotor MxA y/o actividad antiviral.
En el contexto de la presente invención, “tratamiento" o “tratar” se refiere a prevenir, aliviar, manejar, curar o reducir uno
o más síntomas o manifestaciones clínicamente relevantes de una enfermedad o trastorno, a menos que se contradiga por el contexto; Por ejemplo, “tratamiento” de un paciente en quien no se han identificado los síntomas o manifestaciones clínicamente relevantes de una enfermedad o trastorno, es terapia preventiva o profiláctica, en tanto que “tratamiento” de un paciente en quien se han identificado los síntomas o manifestaciones clínicamente pertinentes de una enfermedad o trastorno, en general no constituye terapia preventiva o profiláctica.
La frase “condición o enfermedad relacionada con IFN-α”, como se usa aquí, se refiere a una condición anormal, enfermedad o estado preclínico de enfermedad que se ha relacionado con niveles elevados de IFN-α en el suero de un paciente. Los ejemplos de esto incluyen, pero no se limitan a, enfermedades o trastornos de lupus tales como SLE, enfermedad de injerto versus huésped (GVHD), diabetes tipo 1, SIDA (provocada por virus de inmunodeficiencia humana (VIH)), tiroiditis autoinmune, y psoriasis. En la técnica se conocen métodos para determinar el nivel de IFN-α. Anticuerpos anti-IFN-α humanizados.
Los anticuerpos de la invención son la versión humanizada de los anticuerpos ACO-1 o ACO-2 anti-IFN-α de ratón, variantes de los mismos, y/o fragmentos de los mismos que se enlazan al antígeno, caracterizados por propiedades o características estructurales y/o funcionales particulares. Los anticuerpos recombinantes se pueden producir en líneas adecuadas de células huésped mediante técnicas estándar y se caracterizan por diferentes ensayos para evaluar sus actividades funcionales, como se describe más adelante. En realidad, resulta que los anticuerpos de IFN-alfa de acuerdo con la presente invención se pueden producir con un rendimiento significativamente mejorado en comparación con los anticuerpos de IFN-alfa que se humanizaron de una forma tradicional.
De acuerdo el llamado método de “mejor ajuste”, se detecta la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor contra una biblioteca de tales secuencias humanas conocidas de dominio variable o bibliotecas de secuencias de línea germinal humanas. La secuencia humana que está más cercana a aquella del roedor puede ser luego aceptada como la región marco humana para el anticuerpo humanizado (Sims y colaboradores, J. Immunol. 1993; 151: 2296 y siguientes; Chothia y colaboradores, Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 1987; 196: 901-917). Otro método usa una región marco particular derivada de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. Se puede usar el mismo marco para varios anticuerpos humanizados diferentes.
Las secuencias marco preferidas para uso en los anticuerpos de la invención son aquellas que son estructuralmente similares a las secuencias marco usadas por ACO-1 o ACO-2. De esta forma, en una realización, la invención proporciona un anticuerpo ACO-1 o AGO-2 humanizado que comprende residuos del marco de VH derivados de un gen VH1_46 humano y un gen JH4 humano, y los residuos marco de VL derivados de un gen VKIII_L6 humano y un gen JK2 humano, y se enlazan específicamente a IFN-α humano.
El ejemplo 1 más adelante describe el diseño de un ejemplo de anticuerpo ACO-1 humanizado, hzACO-1, que comprende tales secuencias marco.
Propiedades funcionales
Los anticuerpos humanizados de la invención se enlazan específicamente a los subtipos A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b, y WA de IFN-α (Tabla 2). En una realización, un anticuerpo ACO-1 o ACO-2 humanizado de la invención se enlaza a un subtipo de proteína de IFN-α tal como IFN-αA con alta afinidad, por ejemplo con una KD de aproximadamente 10-7 M o menos, una KD de aproximadamente 10-8 M o menos, una KD de aproximadamente 5 x 10-9 M o menos, o una KD de aproximadamente 2x10-9 M o menos. En una realización, el anticuerpo humanizado es una
variante de hzACO-1 que se enlaza a IFN-αA, IFN-αF, y/o otros subtipos de proteína de IFN-α con una afinidad comparable a o mayor que aquella de hzACO-1.
Tabla 2. Parámetros cinéticos de hzACO-1 para una variedad de subtipos de IFN-α humano
Muestra
ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
hIFN-αA
2,97E+05 3,94E-04 1,93E-09
hIFN-α1
Sin enlazamiento - -
hIFN-α2
3.58E+05 3,51E-04 9,81E-10
hIFN-α4b
3.74E+05 6,22E-04 1,67E-09
hIFN-αG
4,63E-05 4,26E-04 9,20E-10
hIFN-αH2
3,78E+05 1,11E-03 3,21E-09
hIFN-αI
7,23E+05 2,03E-03 2,81E-09
hIFN-αJ1
6,81E+05 3,27E-03 4,81E-09
hIFN-αWA
7,09E+05 1,91E-03 4,10E-09
hIFN-α4a
3,33E+04 1,15E-04 3,45E-09
(continuación)
Muestra
ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
hIFN-αC
7,19E+05 7,53E-04 1,05E-09
hIFN-αK
5,74E+05 8,27E-04 1,44E-09
Por ejemplo, la relación entre la KD de la variante hzACO-1 y la KD de hzACO-1 con respecto a un subtipo de proteína
10 de lFN-αA puede ser aproximadamente de 1.0, aproximadamente 0.8, aproximadamente 0.7, o aproximadamente 0.6. En otra realización, el anticuerpo humanizado es una variante hzACO-1 que se enlaza a IFN-αA, IFN-αF, y/u otro subtipo de proteína de IFN-α con una afinidad comparable a, o mayor que aquella de un ACO-1 producido en forma recombinante. En otra realización, el anticuerpo humanizado es una variante hzACO-1 que se enlaza a IFN-αA, IFN-αF, y/u otros subtipos de proteína de IFN-α con una afinidad comparable a, o mayor que a aquella de ACO-1 producida por
15 hibridoma.
Adicionalmente, los anticuerpos humanizados de la invención son capaces de neutralizar de manera selectiva una bioactividad de uno o más subtipos de proteína de IFN-α. Por ejemplo, una variante humanizada de ACO-1 o ACO-2 puede ser capaz de neutralizar de forma selectiva al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, o al menos aproximadamente 60% de una bioactividad de los subtipos A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b, o WA de 20 proteína de IFN-α, o cualquier combinación de los mismos, en comparación con un control. En una realización particular, el anticuerpo humanizado no neutraliza en forma significativa la bioactividad de los subtipos D y/o 1 de IFN-α. Los ejemplos de bioactividades incluyen, pero no se limitan a, activación del promotor MxA, actividad antiviral o ambas. La capacidad de un anticuerpo humanizado para neutralizar tal bioactividad de IFN-α se puede evaluar usando, por ejemplo, ensayos de gen reportero (RG) y de inhibición citopática (CPE) descritos aquí. En una realización, el 25 anticuerpo humanizado es una variante hzACO-1 que tiene una IC50 comparable a o menor que la IC50 de hzACO-1 en
un ensayo de RG. En una realización específica, la variante hzACO-1 tiene una IC50 menor que hzACO-1 en un ensayo de RG.
En una realización, los anticuerpos humanizados de la invención compiten con y/o se enlazan al mismo epítopo en un subtipo de proteína de IFN-α como ACO-1 y/o ACO-2. Tales anticuerpos se pueden identificar con base en su capacidad para competir en forma cruzada con ACO-1 y/o ACO-2 en ensayos estándar de enlazamiento de IFN-α como se describe aquí. La capacidad de un anticuerpo humanizado de prueba para inhibir el enlazamiento de ACO-1 o ACO-2 con uno o más subtipos de proteína de IFN-α demuestra que el anticuerpo de prueba puede competir con ACO-1 o ACO-2 por el enlazamiento con IFN-α y de esta manera puede unirse al mismo epítopo en el subtipo de proteína de IFN-α como ACO-1 y/o ACO-2 (WO02066649 y WO2005059106). En una realización particular, el anticuerpo humanizado se une a un epítopo de IFN-α humano diferente que cualquiera de los anticuerpos monoclonales de murino 9F3, y MMHA-1, 2, 3, 6, 8, 9, 11, 13 y 17 (PBL Biomedical Laboratories, NJ, EE.UU.) y/o anticuerpos monoclonales humanos 13H5, 13H7, y 7H9, y/o compite de forma cruzada más con ACO-1 o ACO-2 que con uno o más de los anticuerpos monoclonales murinos y humanos enlistados.
En una realización, hzACO-1, hzACO-2, las variantes hzACO-1 o las variantes hzACO-2 proporcionadas por la invención tienen una inmunogenicidad comparable a o menor que aquella del anticuerpo ACO-1 o ACO-2 humanizado que comprende las CDR de murino de acuerdo con Kabat (ACO-1 de Kabat). Se puede evaluar la inmunogenicidad de un anticuerpo humanizado, por ejemplo, mediante uno o más de los métodos descritos en Wadwha y colaboradores, Dev Biol (Basilea). 2005; 122: 155-70), que se incorpora aquí por referencia en su totalidad.
En un aspecto adicional, los anticuerpos humanizados de la invención son estables en una formulación adecuada para administración a un paciente humano. En una realización, el anticuerpo humanizado ACO-1 o ACO-2 de acuerdo con la invención es al menos tan estable como los anticuerpos de IFN-alfa humanizados de una manera tradicional, que comprenden secuencias Kabat de murino de longitud completa. La estabilidad de un anticuerpo se puede evaluar usando métodos conocidos en el arte, que incluyen los análisis termoflúor descritos en el Ejemplo 11.
Los anticuerpos humanizados preferidos de la invención exhiben al menos uno, más preferiblemente dos, tres, cuatro, cinco o más de las siguientes propiedades: (a) enlazamiento específico con los subtipos A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b, y WA de IFN-α; (b) neutralizar de forma selectiva una o más bioactividades de los subtipos A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b, o WA de la proteína de IFN-α; cualquier combinación de los mismos, o todos estos; (c) no neutralizan de forma significativa una bioactividad de IFN-α1 o D; (d) compiten con y/o se unen al mismo epítopo en un subtipo de proteína de IFN-α como ACO-1 y/o ACO-2; (e) compiten más con ACO-1 o ACO-2 que con cualquiera de 9F3, 13H5, 13H7 y 7H9; (f) es menos probable que produzcan una respuesta inmunitaria que un anticuerpo hzACO-1 o hzACO-2 que comprende las CDR de murino de acuerdo con Kabat; (9) son estables en formulaciones farmacéuticas; y (h) se unen con al menos uno de los subtipos A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b, o WA de proteína de IFN-α con una KD de 10-8 M o menos.
Propiedades estructurales
Los anticuerpos preferidos de la invención son versiones humanizadas de los anticuerpos monoclonales de murino ACO-1 y ACO-2. Estos anticuerpos se pueden producir, aislar y caracterizar de manera estructural y funcional como se describe en los Ejemplos. La región variable de longitud completa y las secuencias de CDR de Kabat de ACO-1, hzACO-1 y ACO-2 se exponen en la Tabla 3 y se describen en las Figuras 1-3.
Tabla 3. Numeración de secuencias para cebadores, proteína y anticuerpos
Porción de anticuerpo
Composición de la secuencia Secuencia SEQ ID NO:
ACO-1 VH
Proteína 1
VH1_46/JH4
Proteína 2
hzACO-1 VH
Proteína 3
ACO-1 VL
Proteína 4
VKIII_L6/JK2
Proteína 5
hzACO-1 VL
Proteína 6
ACO-2 VH
Proteína 7
J558.33/D_/JH3_1
Proteína 8
ACO-2 VL
Proteína 9
ae4/ JK4_1
Proteína 10
Clonación de ACO-1 del cebador de PCR
ADN 11
Clonación de ACO-1 del cebador de PCR
ADN 12
ACO-1 VH
ADN 13
ACO-1 VL
ADN 14
ACO-1 CDR_H
Proteína NYWMH 15
ACO-1 CDR_H2
Proteína EINPSHGRTIYNENFKS 16
ACO-1 CDR_H3
Proteína GGLGPAWFAY 17
ACO-1 CDR_L
Proteína SAGSSVDSSYLY 18
ACO-1 CDR_L2
Proteína STSNLAS 19
ACO-1 CDR_L3
Proteína HQWSSYPFT 20
hzACO-1 CDR_H2
Proteína EINPSHGRTIYAQKFQG 21
ACO-2 CDR_H1
Proteína SYWMH 22
ACO-2 CDR H2
Proteína EINPSHGRTSYNENFKS 23
ACO-2 CDR_L1
Proteína SAGSSVGSSYFY 24
ACO-2 CDR_L2
Proteína GTSNLAS 25
Clonación de ACO-2 del cebador de PCR
ADN 26
Clonación de ACO-2 del cebador de PCR
ADN 27
ACO-2 VH
ADN 28
ACO-2 VL
ADN 29
hIFN-α8
Proteína 30
hzACO-1 Fab HC
Proteína 31
hzACO-1 LC
Proteína 32
Las secuencias de CDR H1, H3, L1, L2, y L3 de hzACO-1 son idénticas a las secuencias correspondientes de ACO-1. Las CDR H3 y L3 de ACO-2 son idénticas a las secuencias correspondientes de CDR de ACO-1. Los aminoácidos mostrados en cursiva en la secuencia de CDR_H2 de hzACO-1 corresponden a la secuencia marco humana -en
anticuerpos tradicionalmente humanizados, la secuencia Kabat de longitud completa corresponde a la secuencia de CDR_H2 de ACO-1, donde todos los aminoácidos se derivan del anticuerpo murino.
En un aspecto, la invención proporciona versiones humanizadas de anticuerpos murinos ACO-1 y ACO-2 con menos residuos del donante que las CDR de Kabat, es decir, menos residuos de murino que un anticuerpo humanizado ACO-1
o ACO-2 producido por injerto de las CDR de Kabat.
En una realización, el anticuerpo humanizado se une de manera específica a IFN-α humano y es una versión humanizada del anticuerpo murino ACO-1 o ACO-2, o de una combinación de los mismos, que comprende menos residuos de aminoácido del donante que las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de murino de acuerdo con Kabat. La secuencia de CDR H2 puede comprender, por ejemplo, menos residuos de aminoácido del donante que aquellos que corresponden a los residuos 50-65, 50-64, 50-63, 50-62, 50-61, o 50-60 de Kabat. Los residuos del donante de CDR H2 pueden comprender los residuos 50-59 de Kabat. De manera adicional o alternativamente, los residuos de aminoácido del donante de CDR H2 pueden consistir de los residuos 50-59 de Kabat. Los residuos 50-59 de Kabat corresponden a los residuos 1-11 de las SEQ ID NOS: 16, 21, y 23. En una realización, las CDR de VH restantes pueden comprender o consistir de las CDR de Kabat (véanse las Figuras 1-3), es decir, una secuencia de CDR H1 que comprende residuos de aminoácido del donante que corresponden a los residuos 31-35 de Kabat, y una secuencia de CDR H3 que comprende los residuos de aminoácido del donante que corresponden a los residuos 95-102 de Kabat.
En una realización, el anticuerpo humanizado ACO-1 o ACO-2 puede comprender una CDR L1 que comprende los residuos
de aminoácido del donante que corresponden a los residuos 24-34 de Kabat de la región variable de la cadena ligera (VL) de ACO-1, una CDR L2 que comprende los residuos de aminoácido del donante que corresponden a los residuos 50-56 de Kabat de la región VL de ACO-1, y una CDR L3 que comprende los residuos de aminoácido del donante que corresponden a los residuos 89-97 de Kabat de la región de VL de ACO-1 VL (SEQ ID NO: 4) o la región VL de ACO-2 (SEQ ID NO: 9). De manera adicional o alternativamente, el anticuerpo puede comprender residuos de aminoácido del donante de CDR L1 que consisten de los residuos 24-34 de Kabat, residuos del donante de CDR L2 que consisten de los residuos 50-56 de Kabat, y residuos de aminoácido del donante de CDR L3 que consisten de los residuos 89-97 de Kabat. Las secuencias correspondientes de aminoácidos se muestran en la Tabla 3.
En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos humanizados ACO-1 específicos. El anticuerpo humanizado ACO-1 se une de manera específica a IFN-α humano, y comprende secuencias de CDR de VH sustancialmente idénticas a las secuencias de los residuos 31-35, 50-65, y 95-102 de Kabat de la SEQ ID NO: 3, con una mutación N31S opcional. El anticuerpo puede comprender, por ejemplo, una secuencia de CDR H1 que comprende la SEQ ID NO: 15; una secuencia de CDR H2 que comprende la SEQ ID NO: 21 y una secuencia de CDR H3 que comprende la SEQ ID NO:
17. De manera adicional o alternativamente, el anticuerpo puede comprender una secuencia de CDR H1 que consiste de la SEQ ID NO: 15; una secuencia de CDR H2 que consiste de la SEQ ID NO: 21; y una secuencia de CDR H3 que consiste de la SEQ ID No: 17. En una realización, el ACO-1 humanizado comprende residuos marco de VH derivados de un gen VH1_46 humano y/o un gen JH4 humano, preferiblemente ambos. En una realización específica, el anticuerpo humanizado comprende una secuencia de VH que corresponde a la SEQ ID NO: 3.
El anticuerpo ACO-1 humanizado puede comprender además secuencias de CDR de VL sustancialmente idénticas a las secuencias de los residuos 24-34, 50-56, y 89-97 de Kabat de la SEQ ID NO: 26. El anticuerpo puede comprender, por ejemplo, una secuencia de CDR_L1 que comprende la SEQ ID INO: 18; una secuencia de CDR_L2 que comprende la SEQ ID NO: 19; y una secuencia de CDR_L3 que comprende la SEQ ID NO: 20. De manera adicional o alternativamente, puede comprender una secuencia de CDR_L1 que consiste de la SEQ ID NO: 18; una secuencia de CDR_L2 que consiste de la SEQ ID NO: 19; y una secuencia de CDR_L3 que consiste de la SEQ ID NO: 20. En una realización, el anticuerpo ACO-1 humanizado comprende residuos marco de VL derivados de un gen VKIII_L6 humano y/o un gen JK2 humano, preferiblemente ambos. En una realización específica, el anticuerpo humanizado comprende una secuencia de VL que corresponde a la SEQ ID NO: 6.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende las secuencias de CDR de ACO-2. El anticuerpo puede enlazarse de manera específica a IFN-α humano y comprende secuencias de CDR de VH sustancialmente idénticas a las secuencias de los residuos 31-35, 50-59, y 95-102 de Kabat de la SEQ ID NO: 7. En una realización, el anticuerpo comprende una secuencia de CDR_H1 que comprende la SEQ ID NO: 22; una secuencia de CDR_H2 que comprende la SEQ ID NO: 23; y una secuencia de CDR_H3 que comprende la SEQ ID NO: 17. En una realización alternativa o adicional, el anticuerpo comprende una secuencia de CDR_H1 que consiste de la SEQ ID NO: 22; una secuencia de CDR_H2 que consiste de la SEQ ID NO: 23 y una secuencia de CDR_H3 que consiste de la SEQ ID NO:
17. El anticuerpo puede comprender además secuencias de CDR de VL sustancialmente idénticas a las secuencias de los residuos 24-34, 50-56, y 89-97 de Kabat dela SEQ ID NO: 9. En una realización, el anticuerpo comprende una secuencia de CDR_L1 que comprende la SEQ ID NO: 24; una secuencia de CDR_L2 que comprende la SEQ ID NO: 25; y una secuencia de CDR_L31 que comprende la SEQ ID NO: 20. De manera adicional o alternativamente, el anticuerpo comprende una secuencia de CDR_L1 que consiste de la SEQ ID NO: 24; una secuencia de CDR_L2 que
consiste de la SEQ ID NO: 25; y una secuencia CDR_L3 que consiste de la SEQ ID NO: 20. En un aspecto, el anticuerpo puede ser un anticuerpo ACO-2 humanizado.
Un anticuerpo ACO-1 o ACO-2 humanizado puede comprender además al menos una porción de una región Fc humana (a menos que el anticuerpo sea un fragmento de enlazamiento al antígeno que no comprenda ninguna porción de Fc). Típicamente, el tamaño de la región Fc se selecciona para lograr las propiedades farmacocinéticas deseadas del anticuerpo; entre más grande la porción de Fc, más lenta la depuración. En una realización, el anticuerpo humanizado es un anticuerpo de longitud completa, preferiblemente que comprende una región Fc del isotipo IgG4. En una realización particular, la región Fc de IgG4 comprende una mutación S241 P, con la numeración de acuerdo a Kabat; que corresponde al residuo 228 según el sistema de numeración EU (Edelman G.M. y colaboradores, Proc. Natl. Acad. EE.UU. 63, 78-85 (1969)).
Dado que tanto ACO-1 como ACO-2 pueden enlazarse a IFN-α y son similares, las secuencias de VH y VL humanizadas se pueden “mezclar” y hacer corresponder” para crear otras moléculas de enlazamiento con anti-IFN-α de la invención. El enlazamiento con IFN-α de estos anticuerpos “mezclados y que se han hecho corresponder" se puede probar usando los ensayos de enlazamiento descritos aquí (por ejemplo, citometría de flujo, Biacore, ELISA) y/o usando uno o más ensayos funcionales como se describe aquí. Preferiblemente, cuando se mezclan y hacen corresponder cadenas de VH y VL, se reemplaza una secuencia de VH de un apareamiento particular de VH/VL con una secuencia de VH estructuralmente similar. Igualmente, se reemplaza preferiblemente una secuencia de VL de un apareamiento particular de VH/VL con una secuencia de VL estructuralmente similar.
Por consiguiente, en un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal humanizado, o una porción del mismo de enlazamiento con el antígeno, que comprende: (a) una región VH que comprende las CDR VH de ACO-1 o ACO-2 y (b) una región VL que comprende la CDR VL de ACO-1 o ACO-2; en donde el anticuerpo se enlaza de manera específica con IFN-α. Las combinaciones preferidas de cadena pesada y ligera incluyen: (a) una región VH que comprende las SEQ lD NOS: 15-17, omitiendo opcionalmente algunos o todos los 5 aminoácidos del terminal C de la SEQ ID NO: 16, y (b) una región variable de cadena ligera que comprende las SEQ ID NOS: 18-20; (a) una región VH que comprende las SEQ ID NOS: 15-17, omitiendo opcionalmente algunos o todos los 5 aminoácidos del terminal C de la SEQ ID NO: 16, y (b) una región variable de cadena ligera que comprende las SEQ ID NOS: 24, 25, y 20; (a) una región VH que comprende las SEQ ID NOS: 22, 23, y 17, omitiendo opcionalmente algunos o todos los 5 aminoácidos del terminal C de la SEQ ID No: 23, y (b) una región variable de cadena ligera que comprende las SEQ ID NOS: 18-20; y (a) una región VH que comprende las SEQ ID NOS: 22, 23, y 17, omitiendo opcionalmente algunos o todos los 5 aminoácidos del terminal C de la SEQ ID NO: 23, y (b) una región variable de cadena ligera que comprende las SEQ ID NOS: 24, 25, y 20. Otras combinaciones preferidas de cadenas pesadas y ligeras incluyen (a) una región VH que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 3 y (b) una región VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4; (a) una región VH que comprende las SEQ ID NOS: 15, 21, y 17, y (b) una región VL que comprende las SEQ ID NOS: 18-20; y (a) una región VH que comprende las SEQ ID NOS: 15, 21, y 17, y (b) una región VL que comprende las SEQ ID NOS: 24, 25, y 20.
En otro aspecto, la invención proporciona anticuerpos que comprenden las CDR1, CDR2 y/o CDR3 de cadena pesada y de cadena ligera de ACO-1 o ACO-2, o combinaciones de las mismas. Dado que cada uno de estos anticuerpos puede enlazarse a IFN-α y que la especificidad de enlazamiento al antígeno es proporcionada principalmente por las regiones CDR1, 2 y 3, las secuencias de CDR H1, H2 y H3 y las secuencias CDR L1, L2 y L3 se pueden “mezclar y hacer corresponder" (es decir, las CDR de diferentes anticuerpos se pueden mezclar y hacer corresponder, aunque cada anticuerpo puede contener una CDR H1, H2 y H3 y una CDR L1, L2 y L3) para crear otras moléculas de enlazamiento anti-IFN-α de la invención. El enlazamiento a IFN-α de estos anticuerpos “mezclados y que se han hecho corresponder" se puede probar usando los ensayos de enlazamiento descritos más adelante y en los Ejemplos (por ejemplo, citometría de flujo, Biacore, o ELISA). Preferiblemente, cuando las secuencias de CDR de VH se mezclan y hacen corresponder, la secuencia de CDR H1, H2 y/o H3 de una secuencia de VH particular se reemplaza con una secuencia(s) de CDR estructuralmente similar(es). Igualmente, cuando las secuencias de CDR de VL se mezclan y hacen corresponder, la secuencia de CDR L1, L2 y/o L3 de una secuencia de VL particular se reemplaza preferiblemente con una secuencia(s) de CDR estructuralmente similar(es). Por ejemplo, la(s) CDR de ACO-1 y ACO-2 comparten similitud estructural sustancial y por lo tanto se pueden someter a mezclado y correspondencia.
Por consiguiente, en otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal humanizado, o porción del mismo para enlazamiento con el antígeno que comprende: (a) una CDR H1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOS: 15 y 22; (b) una CDR H2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste al menos de los residuos 1-12 de las SEQ ID NOS: 16 y 23, (c) una CDR H3 que comprende la SEQ ID NO: 17; (d) una CDR L1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOS: 18 y 24; (e) una CDR L2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOS: 19 y 25; y (f) una CDR L3 que comprende la SEQ ID NO: 20; en donde el anticuerpo se enlaza de manera específica a IFN-α.
En una realización preferida, el anticuerpo comprende: (a) una CDR H1 que comprende la SEQ ID NO: 15; (b) una CDR H2 que comprende al menos los residuos 1-12 de la SEQ ID NO: 16; (c) una CDR H3 que comprende la SEQ ID NO:
17; (d) una CDR L1 que comprende la SEQ ID NO: 18; (e) una CDR L2 que comprende la SEQ ID NO: 19; y (5) una CDR L3 que comprende la SEQ ID No: 20.
En otra realización preferida, el anticuerpo comprende: (a) una CDR H1 que comprende la SEQ ID NO: 22; (b) una CDR H2 que comprende al menos los residuos 1-12 de la SEQ ID NO: 23; (c) una CDR H3 que comprende la SEQ ID NO: 17; (d) una CDR L1 que comprende la SEQ ID NO: 24; (e) una CDR L2 que comprende la SEQ ID NO: 25; y (f) una CDR L3 que comprende la SEQ ID NO: 20.
En una realización preferida, el anticuerpo comprende: (a) una CDR H1 que comprende la SEQ ID NO: 15; (b) una CDR H2 que comprende la SEQ ID NO: 21; (c) una CDR H3 que comprende la SEQ ID NO: 17; (d) una CDR L1que comprende la SEQ ID NO: 18; (e) una CDR L2 que comprende la SEQ ID NO: 19; y (f) una CDR L3 que comprende la SEQ ID NO: 20.
En una realización preferida, el anticuerpo comprende: (a) una CDR H1 que comprende la SEQ ID NO: 22; (b) una CDR H2 que comprende al menos los residuos 1-12 de la SEQ ID NO: 16; (c) una CDR H3 que comprende la SEQ ID NO: 17; (d) una CDR L1 que comprende la SEQ ID NO: 18; (e) una CDR L2 que comprende la SEQ ID NO: 19; y (f) una CDR L3 que comprende la SEQ ID NO: 20.
En una realización preferida, el anticuerpo comprende: (a) una CDR H1 que comprende la SEQ ID NO: 15; (b) una CDR H2 que comprende al menos los residuos 1-12 de la SEQ ID NO: 16; (c) una CDR H3 que comprende la SEQ ID NO: 17; (d) una CDR L1 que comprende la SEQ ID NO: 24, (e) una CDR L2 que comprende la SEQ ID NO: 19; y (f) una CDR L3 que comprende la SEQ ID NO: 20.
En una realización preferida, el anticuerpo comprende: (a) una CDR H1 que comprende la SEQ ID NO: 15, (b) una CDR H2 que comprende al menos los residuos 1-12 de la SEQ ID NO: 16; (c) una CDR H3 que comprende la SEQ ID NQ: 17; (d) una CDR L1 que comprende la SEQ ID NO: 18; (e) una CDR L2 que comprende la SEQ ID NO: 25; y (f) una CDR L3 que comprende la SEQ ID NO: 20.
Variantes del anticuerpo anti-IFN-α humanizado
Aunque una variante o derivado de anticuerpo tiene típicamente al menos una propiedad alterada en comparación con el anticuerpo progenitor, las variantes o derivados de anticuerpo pueden retener una, algunas, la mayoría, o toda las propiedades funcionales del anticuerpo anti-IFN-α progenitor, incluyendo, pero no limitado a: (a) el enlazamiento específico a los subtipos A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b, y WA de IFN-α; (b) neutralizar de manera selectiva una o más bioactividades de los subtipos A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b, o WA de proteína de IFN-α; cualquier combinación de los mismos, o todos éstos; (c) no neutralizar de forma significativa una bioactividad de IFN-α1 o D; (d) competir con y/o enlazarse al mismo epítopo en un subtipo de proteína de IFN-α como ACO-1 y/o ACO-2; (e) competir más con ACO-1 o ACO-2 que con cualquiera de 9F3, 13H5, 13H7 y 7H9; (f) es menos probable que produzca una respuesta inmune que un anticuerpo hzACO-1 o hzACO-2 que comprende las CDR de murino de acuerdo con Kabat;
(g) son estables en formulaciones farmacéuticas; y (b) se enlaza con al menos uno de los subtipos A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b, o WA de la proteína de IFN-α con una KD a la 10-8 M o menos. Cualquier combinación de las características funcionales descritas anteriormente, y/o las características funcionales como es describe en los Ejemplos, puede ser exhibida por un anticuerpo de la invención.
En ciertas realizaciones, un anticuerpo humanizado de la invención comprende una región VH que comprende las secuencias de CDR H1-H3 y una región VL que comprende las secuencias de CDR L1-L3, en donde una o más de estas secuencias de CDR comprenden secuencias especificadas de aminoácidos con base en los anticuerpos preferidos descritos aquí; ACO-1 y ACO-2, o modificaciones conservadoras de los mismos, y en donde los anticuerpos han retenido o mejorado las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-IFN-α de la invención. Por consiguiente, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o fragmento del mismo de enlazamiento con el antígeno, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias CDR H1, CDR H2 y CDR H3 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de CDR H1, CDR H2, y CDR H3: en donde (a) una CDR H1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOS: 15 y 22, y modificaciones conservadoras de las mismas; (b) una CDR H2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de al menos los residuos 1-12 de las SEQ ID NOS: 16 y 23, y modificaciones conservadoras de las mismas, (c) una CDR H3 que comprende la SEQ ID NO: 17, y modificaciones conservadoras de la misma; (d) una CDR L1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOS: 18 y 24, y modificaciones conservadoras de las mismas; (e) una CDR L2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOS: 19 y 25, y modificaciones conservadoras de las mismas, y (f) una CDR L3, que comprende la SEQ ID NO: 20, y modificaciones conservadoras de la misma, en donde el anticuerpo se enlaza de manera específica a IFN-α.
De esta manera, uno o más residuos aminoácido dentro de las regiones CDR o FR de un anticuerpo de la invención se pueden reemplazar con otros residuos de aminoácidos de la misma familia de cadena lateral y el anticuerpo alterado se
puede probar para la función retenida (es decir, las funciones expuestas en (c), (d) y (e) anteriores) usando los ensayos funcionales descritos aquí.
Las propiedades funcionales de las variantes de anticuerpo se pueden evaluar usando ensayos estándar disponibles en la técnica y/o descritos aquí. Por ejemplo, se puede determinar la capacidad del anticuerpo para enlazarse con el IFN-α usando ensayos de enlazamiento estándar y efectos biológicos (por ejemplo, un gen reportero), tal como aquellos expuestos en los Ejemplos (por ejemplo, Biacore, o ELISA).
Modificaciones de la región variable
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo humanizado ACO-1 o ACG-2 conmutaciones en las regiones CDR o regiones menos variables.
Los ejemplos de mutaciones específicas en ACO-1 humanizado y su identificación se describen en los Ejemplos 2 y 3 (ver, también las Figuras 1 y 3). Estos incluyen tanto retromutaciones; que introducen los residuos de ACO-1 en ACO-1 humanizado, así como mutaciones donde se introducen residuos derivados de ACO-2 en ACO-1 humanizado. Los ejemplos de retromutaciones en la VH de hzACO-1 (SEQ ID No: 3) incluyen V5Q, M69L, R71V, T73K, S76I, y V78A, así como cualquier combinación de las mismas, usando la numeración de Kabat. Los ejemplos de retromutaciones en la VL de hzACO-1 (SEQ ID NO: 6) incluyen E1Q, L47W, I58V, y F71Y, así como cualquier combinación de las mismas. Los ejemplos de mutaciones derivadas de ACO-2 en la VH de hzACO-1 (SEQ ID NO: 3) incluyen T28S, N31 S, I58S, S76N, T77I, y A93V, así como cualquier combinación de las mismas. Los ejemplos de mutaciones derivadas de ACO-2 en la VL de hzACO-1 (SEQ ID NO: 6) incluyen D29G, L33F, y S50G, así como cualquier combinación de las mismas.
Adicionalmente, diversas variantes de secuencias de VH y VL de hzACO-1 se pueden “mezclar y hacer corresponder” con variantes de secuencias o secuencias progenitoras para crear una biblioteca de variantes de hzACO-1 de la invención. El enlazamiento de IFN-α de estos anticuerpos “mezclados y que se han hecho corresponder" se puede probar usando los ensayos de enlazamiento descritos aquí (por ejemplo, Biacore, ELISA) y/o usando uno o más ensayos funcionales como se describe aquí.
En una realización, la invención proporciona un anticuerpo humanizado que se enlaza de manera específica a IFN-α humano y contiene un dominio variable que tiene, incorporado en un dominio variable de anticuerpo humano, aminoácidos de un anticuerpo no humano donante que se enlaza a IFN-α humano, que comprende un residuo de aminoácido de anticuerpo donante en uno o más sitios seleccionados de 5, 28, 31, 58, 69, 71, 73, 76, 78, 79, y 93 en el domino variable de cadena pesada.
En una realización, la invención proporciona un anticuerpo humanizado que se enlaza de manera específica a IFN-α humano y contiene un domino variable que tiene, incorporado en un dominio variable de anticuerpo humano, aminoácidos de un anticuerpo no humano donante que se enlaza a IFN-α, que comprende un residuo de aminoácido de anticuerpo donante en uno o más sitios seleccionados de 1, 29, 33, 47, 50, 58, y 71 en el dominio variable de cadena ligera.
En una realización, la invención proporciona un anticuerpo ACO-1 humanizado que se enlaza de manera específica a IFN-α y contiene un dominio variable que tiene, incorporado en un dominio variable de anticuerpo humano, secuencias de CDR de ÁCO-1 que se enlazan a IFN-α, y que comprenden además residuos de aminoácido de ACO-2 en uno o más sitios seleccionados de 28, 31, 58, 76, 77, 78, 79, y 93 en el dominio variable de cadena pesada. En una realización específica, los residuos de aminoácido de ACO-2 están en uno o más sitios seleccionados de 28, 31, y 93.
En una realización, la invención proporciona un anticuerpo humanizado ACO-1 que se enlaza de manera específica a IFN-α humano y contiene un dominio variable que tiene, incorporado en un dominio variable de anticuerpo humano, secuencias de CDR del ACO-1 que se enlazan a IFN-α humano, y que comprenden además residuos de aminoácido de ACO-2 en uno o más sitios seleccionados de 29, 33 y 50 en el dominio variable de cadena ligera.
En una realización, la invención proporciona una variante de hzACO-1 que se enlaza de manera específica a IFN-α humano, y comprende secuencias de CDR de VH sustancialmente idénticas a las secuencias de los residuos 31-35, 5065 y 95-102 de Kabat de la SEQ ID NO: 3, con una mutación N31S. El anticuerpo puede comprender, por ejemplo, una secuencia de CDR1 H1 que comprende la SEQ ID NO: 15 con una mutación N31S; una secuencia de CDR H2 que comprende la SEQ ID NO: 21; y una secuencia de CDR H3 que comprende la SEQ ID NO: 17. De manera adicional o alternativamente, el anticuerpo puede comprender una secuencia de CDR H1 que consiste de la SEQ ID NO: 15 con una mutación N31S; una secuencia de CDR H2 que consiste de la SEQ ID NO: 21; y una secuencia de CDR H3 que consiste de la SEQ ID NO: 17. En una realización, el ACO-1 humanizado comprende residuos de la región marco VH, derivados de un gen VH1_46 humano y/o un gen JH4 humano, preferentemente ambos. En una realización específica, el anticuerpo humanizado comprende una secuencia de VH que corresponde a la SEQ ID NO: 3, con una mutación N a S en la posición 31 de Kabat. Como se muestra en los Ejemplos, una mutación N31S en hzACO-1 incrementó la afinidad de enlazamiento a IFN-αA a niveles comparables con aquellos de ACO-1, e incrementó la estabilidad a pH 3.5
y 4.5. Además, puesto que el residuo 31 está en un residuo de CDR “donante”, la mutación no introduce un residuo de murino adicional en la secuencia de hzACO-1, no incrementando por lo tanto el riesgo de una respuesta inmune contra el anticuerpo cuando se administra a un humano. Otras mutaciones de CDR con la misma ventaja incluyen D29G y S50G en la VL de hzACO-1.
En una realización, la invención proporciona una variante de hzACO-1 que se enlaza de manera específica a IFN-α humano, y comprende secuencias de CDR de VH sustancialmente idénticas a las secuencias de los residuos 31-35, 5065 y 95-102 de Kabat de la SEQ ID NO: 3, con una mutación T28S. El anticuerpo puede comprender, por ejemplo, una secuencia de CDR1 H1 que comprende la SEQ ID NO: 15; una secuencia de CDR H2 que comprende la SEQ ID NO: 21; y una secuencia de CDR H3 que comprende la SEQ ID NO: 17. De manera adicional o alternativamente, el anticuerpo puede comprender una secuencia de CDR H1 que consiste de la SEQ ID NO: 15; una secuencia de CDR H2 que consiste de la SEQ ID NO: 21; y una secuencia de CDR H3 que consiste de la SEQ ID NO: 17. En una realización, el ACO-1 humanizado comprende residuos de la región marco VH, derivados de un gen VH1_46 humano, que comprende además una mutación T28S. En una realización específica, el anticuerpo humanizado comprende una secuencia de VH que corresponde a la SEQ ID NO: 3, con una mutación de T a S en la posición 28 de Kabat. Como se muestra en los Ejemplos, una mutación T28S en hzACO-1 incrementó la afinidad de enlazamiento a IFN-αA en niveles comparables a aquellos de ACO-1, e incrementó la estabilidad a pH 3.5 y 4.5.
En una realización, la invención proporciona una variante de hzACO-1 que se enlaza de manera específica a IFN-α humano, y comprende secuencias de CDR de VH sustancialmente idénticas a las secuencias de los residuos 31-35, 5065 y 95-102 de Kabat de la SEQ ID NO: 3, con una mutación A93V. El anticuerpo puede comprender, por ejemplo, una secuencia de CDR H1 que comprende la SEQ ID NO: 15; una secuencia de CDR H2 que consiste de la SEQ ID NO: 21; y una secuencia de CDR H3 que consiste de la SEQ ID NO: 17. De manera adicional o alternativamente, el anticuerpo puede comprender una secuencia de CDR H1 que consiste de la SEQ ID NO: 15; una secuencia de CDR H2 que consiste de la SEQ ID NO: 21; y una secuencia de CDR H3 que consiste de la SEQ ID NO: 17. En una realización, el ACO-1 humanizado comprende residuos de la región marco de VH, derivados de un gen VH1_46 humano y/o un gen JH4 humano, que comprende además una mutación A93V. En una realización específica, el anticuerpo humanizado comprende una secuencia de VH que corresponde a la SEQ ID NO: 3, con una mutación de A a V en la posición 93 de Kabat. Como se muestra en los Ejemplos, una mutación A93V en hzACO-1 incrementó la afinidad de enlazamiento con IFN-αA a niveles comparables con aquellos de ACO-1, incrementó la potencia para la inhibición de los efectos de IFN como se mide en el ensayo de RG, e incremento la estabilidad a pH 3.5 y 4.5.
En una realización, la invención proporciona una variante de hzACO-1 que se enlaza de manera específica a IFN-α humano, y comprende secuencias de CDR de VH sustancialmente idénticas a las secuencias de los residuos 31-35, 5065 y 95-102 de Kabat de la SEQ ID NO: 3, que comprende además una mutación en una de las secuencia de CDR de VH, en donde la mutación no está en el residuo 58 de Kabat. El anticuerpo puede comprender, por ejemplo, las CDR de VH que consisten de los residuos 31-35, 50-65 y 95-102 de Kabat de la SEQ ID NO: 3, que comprende además una mutación en una de las secuencias de CDR de VH, en donde el residuo 58 de Kabat es I. En una realización, el ACO-1 humanizado comprende residuos de la región marco de VH derivados de un gen VH1_46 humano y un gen JH4 humano. Como se muestra en los Ejemplos, una mutación I58S en hzACO-1 disminuyó sustancialmente la afinidad de enlazamiento a IFN-αA y disminuyó la potencia para la inhibición de los efectos de IFN-α como se mide en el ensayo de RG.
Otro tipo de modificación de la región marco involucra la mutación de uno o más residuos dentro de la región marco, o incluso dentro de una o más regiones CDR, para remover epítopos de células T para reducir de este modo la inmunogenicidad potencial del anticuerpo. Este enfoque también se denomina como “desinmunización” y se describe en forma más detallada en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos No. 20030153043 de Carr y colaboradores.
Modificaciones de Fc
Adicionalmente o como una alternativa a las modificaciones hechas dentro de las regiones marco o CDR, los anticuerpos de la invención se pueden modificar por ingeniería genética para incluir modificaciones dentro de la región Fc, típicamente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo, tal como la vida media en suero, la fijación al complemento, el enlazamiento al receptor de Fc, la estabilidad de la proteína y/o la citotoxicidad celular dependiente del antígeno, o carencia del mismo. Adicionalmente, un anticuerpo de la invención se puede modificar químicamente (por ejemplo, se pueden unir al anticuerpo una o más fracciones químicas) o se pueden modificar para alterar su glicosilación, nuevamente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo. Cada una de estas realizaciones se describen en forma más detallada más adelante. Los residuos en la región Fc se numeran de acuerdo a Kabat.
Si se desea, la clase de un anticuerpo se puede “cambiar” por técnicas conocidas. Estas técnicas incluyen, por ejemplo, el uso de técnicas recombinantes directas (véase por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 4.516.397) No. 4,816,397 y técnicas de fusión célula-célula (véase por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 5.916.771). Por ejemplo, un anticuerpo que fue originalmente producido como una molécula de IgM se puede cambiado de clase a un
anticuerpo de IgG. Las técnicas de cambio de clase también se pueden usar para convertir una subclase de IgG en otra, por ejemplo, de IgG1 a IgG2. De esta forma, la función efectora de los anticuerpos de la invención se puede modificar mediante el cambio del isotipo, por ejemplo, a un anticuerpo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, o IgM para diferentes usos terapéuticos. Los ejemplos de secuencias de ADNc para regiones constantes están disponibles, por ejemplo, a través del GenBank, cada una de las cuales se incorpora por referencia en su totalidad, de la siguiente forma:
Región de cadena pesada constante de IgG1 humana: GenBank número de Acceso: J00228;
Región de cadena pesada constante de IgG2 humana: GenBank número de Acceso: J00230;
Región de cadena pesada constante de IgG3 humana: GenBank número de Acceso: X04646;
Región de cadena pesada constante de IgG4 humana: GenBank número de Acceso: K01316; y
Región constante de cadena ligera kappa. humana: GenBank número de Acceso: J00241.
En una realización, se modifica la región bisagra de CH1 de tal forma que se altera, por ejemplo, se incrementa o disminuye el número de residuos de cisteína en la región bisagra. Este enfoque se describe adicionalmente en la patente de los Estados Unidos No. 5.677.425 de Bodmer y colaboradores. El número de residuos de cisteína en la región bisagra de CH1 se altera, por ejemplo, para facilitar el montaje de las cadenas ligeras y pesadas o para incrementar o disminuir la estabilidad del anticuerpo.
En otra realización, la región bisagra Fc de un anticuerpo se muta para disminuir la vida media biológica del anticuerpo. De manera más específica, se introducen una o más mutaciones de aminoácidos en la región de interfaz del dominio CH2-CH3 del fragmento de bisagra Fc de tal forma que el anticuerpo tiene un enlazamiento desmejorado con la proteína A de Estafilococo (SpA) con relación al enlazamiento de SpA del dominio bisagra de Fc. Este enfoque se describe adicionalmente en detalle en la patente de los Estados Unidos No. 6.165.745 de Ward y colaboradores. En otra realización, se modifica el anticuerpo para aumentar su vida biológica promedio. Son posibles varios enfoques. Por ejemplo, se pueden introducir una o más de las siguientes mutaciones: T252L, T254S, T256F, como se describe en la patente de los Estados Unidos No. 6.277.375 de Ward. De manera alternativa, para incrementar la vida biológica promedio, se puede alterar el anticuerpo dentro de la región CH1 o CL para que contenga un epítopo de enlazamiento con el receptor de salvamento, tomado de dos bucles de un dominio CH2 de una región Fc de una IgG, como se describe en las patentes de los Estados Unidos Nos. 5.869.046 y 6.121.022 por Presta y colaboradores. En aún otras realizaciones, se altera la región Fc mediante el reemplazo de al menos un residuo de aminoácido con un residuo de aminoácido diferente para altear la(s) función(es) efectoras del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden reemplazar uno más aminoácidos seleccionados de los residuos 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 y 322 de aminoácido con un residuo de aminoácido diferente de tal forma que el anticuerpo tenga una afinidad alterada para un ligando efector, pero retenga la capacidad de enlazamiento con el antígeno del anticuerpo progenitor. El ligando efector cuya afinidad se altera puede ser, por ejemplo, un receptor de Fc o el componente C1 del complemento. Este enfoque se describe con más detalle en las patentes de los Estados Unidos Nos. 5.624.821 y 5.648.260, ambas de Winter y colaboradores. En otro ejemplo, se pueden reemplazar uno o más aminoácidos seleccionados de los residuos 329, 331 y 322 de aminoácido con un residuo de aminoácido diferente de tal forma que el aminoácido tenga un enlazamiento alterado de C1q y/o citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) reducida o anulada. Este enfoque se describe en más detalle en la patente de los Estados Unidos No. 6.194.55 No. 6,194,551, por Idusogie y colaboradores. En otro ejemplo, se alteran uno o más residuos de aminoácido dentro de las posiciones 231 y 239 de aminoácido para alterar de este modo la capacidad del anticuerpo para fijar el complemento. Este enfoque se describe adicionalmente en la publicación PCT WO 94/29351 por Bodmer y colaboradores. En aún otro ejemplo, se modifica la región Fc para incrementar la capacidad del anticuerpo para mediar la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) y/o para incrementar la afinidad del anticuerpo por un receptor de Fcy mediante la modificación de uno o más aminoácidos en las siguientes posiciones: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 o 439. Este enfoque se describe adicionalmente en la publicación PCT WO 00/42072 por Presta. Además, los sitios de enlazamiento en IgG1 humana para FcyRI, FcyRII, FcyRIII y FcRn han sido mapeados y se han descrito las variantes con enlazamiento mejorado (Véase Shields, R.L. y colaboradores (2001) J. Bibl. Chem. 276: 6591-6604). Se mostró que las mutaciones específicas en las posiciones 256, 290, 298, 333, 334 y 339 mejoran el enlazamiento con FcRIII. Adicionalmente, se demostró que los siguientes mutantes de combinación mejoran el enlazamiento de FcyRIII: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A y S298A/E333A/K334A.
La región constante se puede modificar adicionalmente para estabilizar el anticuerpo, por ejemplo, para reducir el riesgo de un anticuerpo bivalente se separe en dos fragmentos VH-VL monovalentes. Por ejemplo, en una región constante de IgG4, se puede mutar el residuo S241 en un residuo de prolina (P) para permitir la formación de un puente completo de disulfuro en la bisagra (véase, por ejemplo Angal y colaboradores, Mol Immunol. 1993; 30: 105-8).
Modificaciones de la glicosilación
En aún otra realización, se modifica la glicosilación de un anticuerpo. Por ejemplo, se puede elaborar un anticuerpo no glicosilado (es decir, el anticuerpo que carece de glicosilación). La glicosilación se puede alterar, por ejemplo, para incrementar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Estas modificaciones del carbohidrato se pueden lograr, por ejemplo, mediante la alteración de uno o más sitios de glicosilación dentro de la secuencia del anticuerpo.
Fragmentos de enlazamiento con el antígeno
Los anticuerpos anti-IFN-α de la invención se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o como fragmentos de los mismos de enlazamiento con el antígeno. Los ejemplos de fragmentos de enlazamiento con el antígeno incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, F(ab)3, Fv (típicamente los dominios VL y VH de un brazo individual de un anticuerpo), Fv monocatenario (scFv; véase, por ejemplo, Bird y colaboradores, Science 1988; 242: 423-426; y Huston y colaboradores PNAS 1988; 85: 5879-5883), dsFv, Fd (típicamente el dominio VH y CH1), y dAb (típicamente un dominio VH); los dominios VH, VL, VhH, y V-NAR; moléculas monovalentes que comprenden una sola cadena VH y una sola cadena VL; minicuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, y cuerpos kappa (véase, por ejemplo, III y colaboradores, Protein Eng. 1997, 10: 949-57); IgG de camello; lgNAR; así como una o más CDR aisladas
o un paratopo funcional, donde las CDR aisladas o residuos de enlazamiento con el antígeno, o polipéptidos, se pueden asociar o enlazar entre sí para formar un fragmento funcional de anticuerpo. Se han descrito o revisado varios tipos de fragmentos de anticuerpo, por ejemplo, en Holliger y Hudson, Nat. Biotechnol 2005; 23: 1126-1136; WO2005040219, y las solicitudes publicadas de patente de los Estados Unidos Nos. 20050238646 y 20020161201.
Se pueden obtener fragmentos de anticuerpo usando técnicas recombinantes convencionales o de modificación de proteínas por ingeniería genética, y se pueden detectar los fragmentos para enlazamiento con el antígeno u otra función en la misma forma como con los anticuerpos intactos.
Se han desarrollado varias técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaron mediante digestión proteolítica de anticuerpos de longitud completa (véase, por ejemplo, Morimoto y colaboradores, Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24: 107-117 (1992); y Brennan y colaboradores, Science, 229: 81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos ahora pueden ser producidos directamente por células huésped recombinantes. De manera alternativa, se pueden recuperar directamente fragmentos Fab'-SH de E. coli y acoplarlos químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Carter y colaboradores, Bio/Technology, 10: 963-167 (1992)). De acuerdo a otro enfoque, se pueden aislar fragmentos F(ab’)2 directamente del cultivo de células huésped recombinantes. En otras realizaciones, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv monocatenario (scFv). Véase WO 1993/16185; patente de los Estados Unidos No. 5.571.894; y patente de los Estados Unidos No. 5.587.458. El fragmento de anticuerpo también puede ser un “anticuerpo lineal”, por ejemplo, como se describe en la patente de los Estados Unidos No. 5.641.870, por ejemplo. Estos fragmentos de anticuerpo lineales, pueden ser monoespecíficos o biespecíficos.
Moléculas multiespecíficas
En otro aspecto, la presente invención presenta moléculas multiespecíficas que comprenden un anticuerpo anti-IFN-α,o un fragmento de antígeno del mismo, de la invención. Estas moléculas multiespecíficas incluyen moléculas biespecíficas que comprenden al menos una primera especificidad de enlazamiento para IFN-α y una segunda especificidad de enlazamiento para un segundo epítopo objetivo.
Un tipo de moléculas biespecíficas son los anticuerpos biespecíficos. Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen especificidades de enlazamiento para al menos dos epítopos diferentes. Los métodos para elaborar anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica, y la producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa usualmente en la coexpresión de dos pares de cadenas de inmunoglobulina, de cadena pesada -de cadena ligera, donde las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Millstein y colaboradores, Nature, 305: 537-539 (1983)). Se pueden preparar anticuerpos biespecíficos como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab')2) o cualquier otro fragmento de enlazamiento con el antígeno, descrito aquí.
Otras moléculas multiespecíficas incluyen aquellas producidas a partir de la fusión de una fracción de anticuerpo que se enlaza con IFN-α a una o más proteínas diferentes que no son de anticuerpo. Estas proteínas multiespecíficas y como construirlas, ha sido descrito en la técnica. Véase, por ejemplo, Dreier y colaboradores (Bio-conjug. Chem. 9(4): 482-489 (l998)); patente de los Estados Unidos No. 6.046.310; publicación de la patente de los Estados Unidos No. 20030103984; solicitud de patente Europea 1 413 316; publicación de patente de los Estados Unidos No. 20040038339; von Strandmann y colaboradores, Blood (2006; 107: 1955-1962), y WO 2004056873.
También se contemplan moléculas multiespecíficas con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos. Tutt y colaboradores, J. Immunol, 147: 60 (1991).
Las moléculas multiespecíficas de la presente invención se pueden preparar mediante la conjugación de las especificidades de enlazamiento constituyentes, usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, cada especificidad de enlazamiento de la molécula multiespecífica se puede generar por separado y luego conjugarlas entre sí. Cuando las especificidades de enlazamiento son proteínas o péptidos, se pueden usar una variedad de agentes de acoplamiento o entrecruzamiento para la conjugación covalente. Los ejemplos de agentes de entrecruzamiento incluyen proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), 5,5'-ditiobis(ácido 2-nitróbenzoico) (DTNB), ofenilen-dimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), y sulfosuccinimidil 4-(Nmaleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC) (véase, por ejemplo, Karpovsky y colaboradores (1984) J. Exp. Med. 160: 1686; Liu, MA y colaboradores (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 82: 8648). Otros métodos incluyen aquellos descritos en Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132, Brennan y colaboradores (1985) Science 229: 81-83), y Glennie y colaboradores (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375). Los agentes de conjugación preferidos son SATA y sulfo-SMCC, ambos disponibles a través de Pierce Chemical. Co. (Rockford, IL).
Cuando las especificidades de enlazamiento son anticuerpos, se pueden conjugar mediante enlace de sulfhidrilo de las regiones bisagras del terminal C de las dos cadenas pesadas. En una realización particularmente preferida, la región bisagra se modifica para contener un número impar de residuos de sulfhidrilo, preferiblemente uno, antes de la conjugación.
De manera alternativa, ambas especificidades de enlazamiento se pueden codificar en el mismo vector y expresar y ensamblar en la misma célula huésped. Este método es particularmente útil cuando la molécula biespecífica es una proteína de fusión de mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 o ligando x Fab. Una molécula biespecífica de la invención puede ser una molécula monocatenaria que comprende un anticuerpo monocatenario y un determinante de enlazamiento, o una molécula biespecífica monocatenaria que comprende dos determinantes de enlazamiento. Las moléculas biespecíficas pueden comprender al menos dos moléculas monocatenarias. Los métodos para preparar moléculas biespecíficas se describen o revisan en, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos No. 5,260,203; la patente de los Estados Unidos No. 5.455.030; la patente de los Estados Unidos No. 4.881.175; la patente de los Estados Unidos No. 9.132.405 No. 5,132,405, la patente de los Estados Unidos No. 5.091.513; la patente de los Estados Unidos No. 5.476.786; la patente de los Estados Unidos No. 5.013.653; la patente de los Estados Unidos No. 5.258.498; la patente de los Estados Unidos No. 5.482.858, la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos No. 20030078385, Kontermann y colaboradores, (2005) Acta Pharmacological Sinica 26(1): 1-9; Kostelny y colaboradores, (1992) J. Immunol. l48(5): 1547-1553; Hollinger y colaboradores, (1993) PNAS (EE.UU.) 90: 6444-6448; y Gruber y colaboradores (1994) J. Immunol. 152: 5368.
Derivados de anticuerpo
Los derivados de anticuerpo (o inmunoconjugados) dentro del alcance de esta invención incluyen anticuerpos anti-IFN-α conjugados o enlazados covalentemente a un segundo agente.
Por ejemplo, en un aspecto, la invención proporciona inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado o enlazado covalentemente a un agente citotóxico, donde dicho agente citotóxico que se puede seleccionar de radioisótopos terapéuticos, proteínas tóxicas, moléculas pequeñas tóxicas, tales como fármacos, toxinas, inmunomoduladores, hormonas, antagonistas de hormonas, enzimas, oligonucleótidos, inhibidores enzimáticos, radionúclidos terapéuticos, inhibidores de angiogénesis, fármacos quimioterapéuticos, alcaloides de la vinca, antraciclinas, epidofilotoxinas, taxanos, antimetabolitos, agentes alquilantes, antibióticos, inhibidores de COX-2, SN-38, antimitóticos, agentes antiangiogénicos y apoptóticos, particularmente doxorrubicina, metotrexato, taxol, CPT-11, camptotecanos, mostazas de nitrógeno, gemcitabina, sulfonatos de alquilo, nitrosoureas, triazenos, análogos de ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina, complejos de coordinación de platino, endotoxina de Pseudomonas, ricino, abrina, 5-fluorouridina, ribonucleasa (ARNasa), ADNasa I, enterotoxina A Estafilocócica, proteína antiviral de hierba carmesí, gelonina, toxina de la difteria, exotoxina de Pseudomonas y endotoxina de Pseudomonas y otras (véase por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 19a Ed. (Mack Publishing Co. 1995); Goodman y Gilman's. The Pharmacological Basis of Therapeutics (McGraw Hill, 2001); Pastan y colaboradores (1986) Cell 47: 641; Goldenberg (1994) Cancer Journal for Clinicians 44: 43; patente de los Estados Unidos No. 6.077.499; cuyas descripciones completas se incorporan en la presente como referencia). Se apreciará que una toxina puede ser de origen animal, vegetal, por hongos o microbiano, o se puede crear de nueva procedencia por síntesis química.
En otra realización, el anticuerpo forma un derivado con un isótopo radioactivo, tal como un radionúclido terapéutico o un radionúclido adecuado para propósitos de detección. Se puede usar cualquiera entre una gran variedad de isótopos radioactivos adecuados, incluyendo, pero no limitado a, I 131, Indio 111, Lutecio 171, Bismuto 212, Bismuto 213, Astatino 211, Cobre 62, Cobre 64, Cobre 67, Itrio 90, Yodo 125, Yodo 131, Fósforo 32, Fósforo 33, Escandio 47, Plata 111, Galio 67, Praseodimio 142, Samario 153, Terbio 161, Disprosio 166, Holmio 166, Renio 186, Renio 188, Renio 189, Plomo 212, Radio 223, Actinio 225, Hierro 59, Selenio 75, Arsénico 77, Estroncio 89, Molibdeno 99, Rodio 105, Paladio 109, Praseodimio 143, Prometio 149, Erbio 169, Iridio 194, Oro 198, Oro 199, y Plomo 211. En general, el radionúclido tiene preferiblemente una energía de decaimiento en el intervalo de 20 a 6.000 keV, preferiblemente en los intervalos de 60 a 200 keV para un emisor Auger, 100 -2.500 keV para un emisor beta, y 4.000-6.000 keV para un emisor alfa. También se prefieren radionúclidos que decaigan sustancialmente con la generación de partículas alfa.
Los conjugados de anticuerpos de la invención se pueden usar para modificar una respuesta biológica dada, donde la porción farmacológica no se debe considerar como limitada a agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, la porción farmacológica puede ser una proteína o un polipéptido que posee una actividad biológica deseada. Estas proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa, o un fragmento activo de la misma, tal como abrina, ricina A, exotoxina de Pseudomonas, o toxina de difteria; una proteína tal como factor de necrosis tumoral o interferón y; o modificadores de la respuesta biológica tales como por ejemplo, linfoquinas, interleuquina l (“IL-1"), interleuquina 2 (“IL-2”), interleuquina 6 (“IL-6”), factor estimulador de colonias de macrófagos y granulocitos (“GM-CSF"), factor estimulador de colonias de granulocitos (“G-CSF”) u otros factores de crecimiento.
El segundo agente se puede enlazar directa o indirectamente al anticuerpo, usando cualquiera de un gran número de métodos disponibles. Por ejemplo, se puede unir un agente a la región bisagra del componente de anticuerpo reducido mediante la formación de enlaces disulfuro, usando reticuladores tales como N-succinil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), o mediante una fracción de carbohidrato en la región Fc del anticuerpo (véase, por ejemplo, Yu y colaboradores (1994) Int. J. Cancer 56: 244; Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking (CRC Press 1991); Upeslacis y colaboradores, "Modification of Antibodies by Chemical Methods", en Monoclonal antibodies: principles and applications, Birch y colaboradores (eds.), páginas 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995); Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies", en Monoclonal antibodies: Production, engineering and clinical application, Ritter y colaboradores (eds.), páginas 60-84 (Cambridge University Press 1995), Cattel y colaboradores (1989) Chemistry today 7: 51-58, Delprino y colaboradores (1993) J. Pharm. Sci 82: 699-704; Arpicco y colaboradores (1997) Bioconjugate Chemistry 8: 3; Reisfeld y colaboradores (1989) Anti-hody, Immunicon. Radiopharrn. 2: 217; cuyas descripciones completas de cada uno de los cuales se incorpora en la presente como referencia). Véase, también, por ejemplo, Arnon y colaboradores, "Monoclonal Antibodies For Immuno-targeting Of Drugs In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld y colaboradores (eds.), páginas 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom y colaboradores, "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2da Ed.), Robinson y colaboradores (eds.), páginas 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera y colaboradores (eds.), páginas 475-506 (1985); Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin y colaboradores (eds.), páginas 303-16 (Academic Press 1985) y Thorpe y colaboradores, "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev , 62: 119-58 (1982).
Para una discusión adicional de los tipos de citotoxinas, enlazadores y métodos para conjugar agentes terapéuticos con anticuerpos, véase también Saito, G. y colaboradores (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55: 199-215; Trail, P.A. y colaboradores (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52: 328-337; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3: 207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2: 750-763; Pastan, I., y Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3: 1089-1091; Senter, P.D. y Springer, C.J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53: 247-264.
En otras realizaciones, el segundo agente es una fracción detectable, que puede ser cualquier molécula que pueda ser observada o medida de manera cuantitativa o cualitativa. Los ejemplos de marcadores detectables útiles en los anticuerpos conjugados de esta invención, son radioisótopos, colorantes fluorescentes, o un miembro de un par de enlazamiento complementario, tal como un miembro de cualquiera de: sistemas de antígeno/anticuerpo (diferente de un anticuerpo con IFN-α), lectina/carbohidrato; avidina/biotina; receptor/ligando; o sistemas de polímero molecularmente impreso/molécula de impresión.
El segundo agente también puede ser alternativamente un polímero, propuesto para incrementar, por ejemplo, la vida media en circulación del anticuerpo. Los ejemplos de polímeros y métodos para unir estos polímeros a péptidos se ilustran, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos Nos. 4.766.106; 4.179.337; 4.495.285 y 4.609.546. Los polímeros ilustrativos adicionales incluyen polioles polioxietilados y fracciones de polietilenglicol (PEG). Como se usa aquí, el término “polietilenglicol” pretende abarcar cualquiera de las formas de PEG que se han usado para formar derivados de otras proteínas, tales como mono (C1-C10)alcoxi o ariloxi-polietilenglicol o polietilenglicol-maleimida. Por ejemplo, se puede conjugar un anticuerpo de longitud completa, o un fragmento de anticuerpo, con una o más moléculas de PEG con un peso molecular entre aproximadamente 1000 y aproximadamente 40000, tal como entre aproximadamente 2000 y aproximadamente 20000, por ejemplo, aproximadamente 3000-12000. Para pegilar un anticuerpo o un fragmento del mismo, el anticuerpo o fragmento se hace reaccionar típicamente con polietilenglicol (PEG), tal como un derivado reactivo de éster o aldehído de PEG, bajo condiciones en las cuales uno o más grupos PEG se llegan a unir al anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Preferiblemente, la pegilación se lleva a cabo mediante una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula reactiva de PEG (o un polímero reactivo análogo soluble en agua). En ciertas realizaciones, el anticuerpo que se va a pegilar es un anticuerpo no glicosilado. En la técnica se conocen los métodos para pegilar proteínas y se pueden aplicar a los anticuerpos de la invención. Véase, por ejemplo, la patente europea EP 0 154 316 por Nishimura y colaboradores, y la patente europea EP 0 401 384 por Ishikawa y colaboradores.
Caracterización de anticuerpo
Después de la producción o purificación, o como parte de un procedimiento de detección o de selección, se pueden investigar las características funcionales de un anticuerpo anti-IFN-α de la invención.
Lo siguiente son breves descripciones de ejemplos de ensayos para la caracterización de anticuerpos. Algunos se describen adicionalmente en otras secciones y/o se describen en los Ejemplos.
Ensayos de enlazamiento
La presente invención proporciona anticuerpos, y fragmentos de enlazamiento con el antígeno, e inmunoconjugados de los mismos, que se enlazan a IFN-α. Se puede usar cualquiera de una amplia variedad de ensayos para evaluar el enlazamiento de un anticuerpo con IFN-α. Los protocolos basados en ELISA, radioinmunoensayos, transferencias tipo Western, BIACORE, y ensayos de competición, entre otros, y son bien conocidos en la técnica.
Por ejemplo, se pueden usar ensayos de enlazamiento simple, en los cuales se incuba un anticuerpo de prueba en presencia de una proteína o epítopo objetivo (por ejemplo, un subtipo de proteína de IFN-α seleccionado de A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b, WA, 1 y D, y una porción de la misma, o una combinación de cualquiera de estos), se lavan los anticuerpos no enlazados, y se evalúa la presencia de los anticuerpos no enlazados, usando por ejemplo, RIA, ELISA, etc. Estos métodos son bien conocidos por aquellos normalmente capacitados en la técnica. Cualquier cantidad de enlazamiento por arriba de la cantidad observada con un anticuerpo no específico de control indica que el anticuerpo se une de manera específica con el objetivo.
En estos ensayos, se puede comparar la capacidad del anticuerpo de prueba para enlazarse a IFN-α humano con la capacidad de una proteína de control (negativo), por ejemplo un anticuerpo generado contra un antígeno estructuralmente no relacionado, o un péptido o proteína no de Ig, para enlazarse al mismo objetivo. Los anticuerpos o fragmentos que se enlazan a IFN-α usando cualquier ensayo adecuado con 25%, 50%, 100%, 200%, 1000% o mayor capacidad de afinidad incrementada con relación a la proteína de control, se dice que “se enlazan específicamente a” o “interactúan específicamente con" el objetivo, y se prefieren para uso en los métodos terapéuticos descritos más adelante. La capacidad de un anticuerpo de prueba para efectuar el enlazamiento de un anticuerpo de control (positivo) contra IFN-α, por ejemplo, un anticuerpo ACO-1 o ACO-2 humanizado, también se puede valorar.
En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos anti-IFN-α humanizados que comparten características biológicas y/o identidad sustancial de secuencia de VH y/o VL con los anticuerpos ACO-1 o ACO-2 humanizados. Un ejemplo de una característica biológica es el enlazamiento con el epítopo de ACO-1 o ACO-2, es decir, las regiones respectivas en el dominio extracelular de ciertos subtipos de proteína de IFN-α con las cuales se enlazan los anticuerpos ACO-1 y ACO-2. Para detectar los anticuerpos que se enlazan con el epítopo de ACO-1 o ACO-2, se puede realizar un ensayo de rutina de bloqueo cruzado, tal como aquel descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lane (1988).
En un ejemplo de ensayo de competición o bloqueo cruzado, se mezcla un anticuerpo ACO-1 o ACO-2 (de control) y un anticuerpo de prueba (o previamente adsorbido) y se aplican a una muestra que contiene IFN-α. En ciertas realizaciones, se mezclan previamente los anticuerpos de control con cantidades variables del anticuerpo de prueba (por ejemplo 1:10 o 1:100) durante un período de tiempo antes de realizar la aplicación a la nuestra que contiene IFN-α. En otras realizaciones, se pueden mezclar simplemente el control y cantidades variables del anticuerpo de prueba durante la exposición a la muestra de antígeno/objetivo. Mientras se puedan distinguir los anticuerpos enlazados de los libres (por ejemplo, mediante el uso de técnicas de separación o de lavado para eliminar los anticuerpos no enlazados) y el anticuerpo de control del anticuerpo de prueba (por ejemplo, mediante el uso de anticuerpos secundarios específicos de la especie o del isotipo, marcando específicamente el anticuerpo de control con una etiqueta detectable,
o mediante el uso de métodos físicos tales como espectrometría de masas para distinguir entre diferentes compuestos) se puede determinar si el anticuerpo de prueba reduce el enlazamiento del anticuerpo de control con el antígeno, lo que indica que el anticuerpo de prueba reconoce sustancialmente el mismo epítopo como el control. En este ensayo, el enlazamiento del anticuerpo de control (marcado) en presencia de un anticuerpo completamente irrelevante es el alto valor del control. El bajo valor del control se obtiene al incubar el anticuerpo de control marcado (positivo) con el anticuerpo de control no marcado, donde se presentará la competición y se reducirá el enlazamiento del anticuerpo marcado.
En un ensayo de prueba, una reducción significativa en la reactividad del anticuerpo marcado en presencia de un anticuerpo de prueba es indicativa de un anticuerpo de prueba que reconoce al mismo epítopo, es decir, uno que “reacciona de forma cruzada" con el anticuerpo de control marcado. Cualquier anticuerpo de prueba o compuesto que reduzca el enlazamiento del control marcado con el antígeno/objetivo en al menos 50% o más preferiblemente 70%, en cualquier relación de anticuerpo o compuesto de control : prueba entre aproximadamente 1:10 y aproximadamente 1:100, se considera que es un anticuerpo o compuesto que se enlaza sustancialmente al mismo epítopo o determinante como el control. Preferiblemente, este anticuerpo o compuesto de prueba reducirá el enlazamiento del control con el antígeno/objetivo en al menos un 90%. Sin embargo, cualquier compuesto o anticuerpo que reduzca el enlazamiento de un anticuerpo o compuesto de control en cualquier grado medible se puede usar en la presente invención.
Actividad biológica
Diferenciación de monocitos. La generación de linfocitos B y T activados requiere el reclutamiento y maduración de células que presentan antígeno (“APC”), Estas APC incluyen células B, monocitos/macrófagos y células dendríticas. El suero de pacientes con SLE contiene IFN-α que puede activar DC y la actividad activada puede bloquearse con preparaciones de anticuerpos humanizados de acuerdo a la invención. Los métodos para detectar y cuantificar esta actividad se describen en la literatura científica y de patentes (véase, por ejemplo, los párrafos 0136 hasta 0150 de la patente con número de publicación US20040067232A1, cuyas porciones pertinentes se incorporan aquí como referencia).
Activación del promotor MxA. La capacidad de IFN-α para activar al promotor MxA, y la capacidad de los anticuerpos monoclonales anti-IFN--α de la invención para bloquear esta activación se pueden medir utilizando ensayos con el gen reportero (RG) donde el promotor MxA se fusiona con un gen reportero, tal como cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) o luciferasa (luc), preferiblemente luciferasa. Los ensayos para CAT y luciferasa son conocidos por aquellos normalmente capacitados en la materia. Preferiblemente, la actividad del promotor MxA se mide en células A549 transformadas en forma estable con un constructo de fusión del gen reportero/promotor MxA. Las células A549 son una línea celular de carcinoma de pulmón disponible a través del ATCC (número de producto CC1-185). El promotor MxA (también conocido como Mxl) puede ser humano, de ratón o rata. La secuencia y la estructura del promotor MxA humano se divulga en el GenBank con el
número de acceso X55639, Chang y colaboradores (1991) Arch Virol. 117: 1-15; y Ronni y colaboradores (1998) J Interferon Cytokine Res. 18: 773-781. Los constructos de fusión de luciferasa/promotor MxA humanos y los ensayos de luciferasa se divulgan en la publicación de la patente US20040209800 y Rosmorduc y colaboradores (1999) J of Gen Virol 80: 1253-1262. Los constructos de fusión de CAT/promotor MxA humanos, y los ensayos CAT se divulgan en Fernandez y colaboradores (2003) J Gen Virol 84: 2073-2082 y Fray y colaboradores (2001) J Immunol Methods 249: 235-244. El promotor MxA (MxI) de ratón se divulga en el GenBank número de acceso M21104; Hug y colaboradores (1988) Mol Cell Biol 8: 3065-3079; y Lleonart y colaboradores (1990) Biotechnology 8: 1263-1267. Un constructo de fusión de luciferasa/promotor MxA de ratón y un ensayo de luciferasa se divulgan en Canosi y colaboradores (1996) J Immunol Methods 199: 69-67.
Ensayos de inhibición del efecto citopático (CPE). Los ensayos de CPE se basan en la actividad antiviral del interferón. En general, se infecta una línea celular adecuada con un virus en presencia de interferón, y se cuantifica la actividad inhibitoria del interferón en los procesos de replicación o de propagación viral. La lectura del ensayo se puede basar en la reducción de la producción del virus, en la reducción del efecto citopático viral, en la reducción de la proteína viral de la síntesis de ARN, en la reducción de la formación de placas virales. El ensayo citopático se puede usar para determinar el efecto neutralizante de los anticuerpos sobre la actividad del interferón. Los ejemplos de ensayos de CPE se describen en Meager, A. 1987. Quantification of interferons by anti-viral assays and their standardization. En: Clemens, M.J., Morris, A.G., Gearing, A.J.H. (Eds), Lymphokines and interferons: A Practical Approach. IRL, Press, Oxford, página 129 y Grossberg y Sedmak, 1984. Assays of interferons En: Billiau, A. (Ed) Interferon, vol. 1: General and Applied Aspects. Elsevier, Ámsterdam, página 189, y en el Ejemplo 6, párrafos 157-164, y la Figura 1 de la publicación PCT WO2006086586.
Formulaciones Farmacéuticas
Otro objetivo de la presente invención es proporcionar una formulación farmacéutica que comprende un compuesto [la proteína] que está presente en una concentración de 10-500 mg/ml, tal como por ejemplo 20-300 mg/ml, preferiblemente 30-100 mg/ml, y más preferiblemente 50-100 mg/ml, y en donde dicha formulación tiene un pH de 2.0 a
10.0. La formulación puede comprender además un sistema regulador del pH, preservante(s), un agente(s) de tonicidad, un agente(s) quelante(s), estabilizadores y surfactantes. En una realización de la invención, la formulación farmacéutica es una formulación acuosa, es decir, una formulación que comprende agua. Esta formulación es típicamente una solución o una suspensión. En una realización adicional de la invención, la formulación farmacéutica es una solución acuosa. El término “formulación acuosa” se define como una formulación que comprende al menos 50% p/p de agua. Igualmente, el término “solución acuosa" se define como una solución que comprende al menos 50% p/p de agua, y el término “suspensión acuosa” se define como una suspensión que comprende al menos 50% p/p de agua.
En otra realización la formulación farmacéutica es una formulación liofilizada, a la cual el médico o el paciente le adicionan solventes y/o diluyentes antes del uso.
En otra realización la formulación farmacéutica es una formulación seca (por ejemplo, liofilizada o secada por aspersión) lista para uso sin ninguna disolución anterior.
Aplicaciones de diagnóstico
Los anticuerpos de IFN-α de la invención también tienen aplicaciones no terapéuticas. Por ejemplo, los anticuerpos anti-IFN-α también pueden ser útiles en ensayos de diagnóstico para proteína de IFN-α, por ejemplo, para detectar su expresión en células, tejidos o sueros específicos. Por ejemplo, se pueden usar anticuerpos anti-IFN-α en ensayos que seleccionan pacientes para tratamiento anti-IFN-α. Para estos propósitos, los anticuerpos anti-IFN-α se pueden usar para analizar la presencia de IFN-α en especímenes de suero o de tejido. Para aplicaciones de diagnóstico, el anticuerpo se marcará típicamente con una fracción detectable.
Aplicaciones terapéuticas
Los métodos para tratar a un paciente usando un anticuerpo anti-IFN-α humanizado como se describe en la presente invención también son proporcionados por la presente invención. En una realización, la invención proporciona el uso de un anticuerpo humanizado como se describe en la presente invención en la preparación de una composición farmacéutica para la administración a un paciente humano. Típicamente, el paciente padece de, o está en riesgo de padecer una enfermedad o trastorno autoinmune o inflamatorio asociado con la expresión anormal de al menos un subtipo de IFN-α seleccionado del grupo que consiste de los subtipos A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b, y WA.
Los ejemplos de condiciones o trastornos que van a ser tratados con los anticuerpos de la invención incluyen, pero no se limitan a lupus (por ejemplo, lupus eritematoso sistémico (SLE)), artritis reumatoide, artritis crónica juvenil, osteoartritis, espondiloartropatías, esclerosis sistémica (escleroderma), miopatías inflamatorias idiopáticas (dermatomiositis, polimiositis), síndrome de Sjogren, vasculitis, vasculitis sistémica, sarcoidosis, anemia hemolítica autoinmune (pancitopenia inmune, hemoglobinuria nocturna paroxismal), trombocitopenia autoinmune (púrpura trombocitopénica idiopática, trombocitopenia mediada en forma inmune), tiroiditis (enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis linfocítica juvenil, tiroiditis atrófica), diabetes mellitus, enfermedad renal mediada en forma inmune (glomerulonefritis, nefritis túbulo intersticial), enfermedades desmielinizantes de los sistemas nerviosos central y periférico tales como esclerosis múltiple, polineuropatía desmielinizante idiopática o síndrome de Guillain-Barre, y polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, enfermedades hepatobiliares tales como hepatitis infecciosa (hepatitis A, B, C, D, E y otros virus no hepatotrópicos), hepatitis crónica activa autoinmune, cirrosis biliar primaria, hepatitis granulomatosa, y colangitis esclerosante, enfermedad inflamatoria del intestino (colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn), enfermedad celíaca, enteropatía sensible a gluten, y enfermedad de Whipple, enfermedades cutáneas autoinmunes o mediadas en forma inmune incluyendo enfermedades cutáneas bullosas, eritema multiforme y dermatitis por contacto, psoriasis, enfermedades alérgicas tales como asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, hipersensibilidad y urticaria por alimentos, enfermedades inmunológicas del pulmón tales como neumonías eosinofílicas, fibrosis pulmonar idiopática y neumonitis por hipersensibilidad, y enfermedades asociadas a trasplantes incluyendo rechazo de injerto y enfermedad del injerto versus huésped. En una realización específica, la enfermedad, condición o trastorno se selecciona de lupus, síndrome de Sjogren, psoriasis, diabetes mellitus, artritis reumatoide, y dermatomiositis juvenil. En otra realización específica, la enfermedad, condición o trastorno es SLE. Por ejemplo, en un aspecto, el anticuerpo anti-IFN-α se usa en combinación con uno o más agentes antiinflamatorios diferentes, incluyendo, pero no limitado a, agentes analgésicos, agentes inmunosupresores, corticosteroides, y agentes anti-TNFα u otros agentes anti-citoquina o receptores anti-citoquina, y agentes anti-angiogénicos. Los ejemplos específicos incluyen metotrexato, TSG-6, Rituxan® y proteínas de fusión CTLA4-Fc. Ejemplos adicionales de terapias de combinación se proporcionan a continuación.
Artículos de fabricación
En otra realización de la invención, se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento de los trastornos descritos anteriormente. Por ejemplo, el artículo de fabricación puede comprender un recipiente que contiene un anticuerpo anti-IFN-α humanizado como se describe en la presente invención, junto con instrucciones que instruyen a un usuario para tratar un trastorno tal como una enfermedad o trastorno autoinmune o inflamatorio en un humano con el anticuerpo en una cantidad efectiva. El artículo de fabricación comprende típicamente un recipiente y una etiqueta o inserto en el empaque en, o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, etcétera. Los recipientes se pueden elaborar de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que es efectiva para tratar la condición y puede tener un puerto estéril de acceso (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tenga un tapón que puede ser perforado por una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es el anticuerpo anti-IFN-α humanizado de la invención, o un fragmento que se enlaza al antígeno o un derivado del anticuerpo (por ejemplo, un inmunoconjugado) que comprende tal anticuerpo. La etiqueta o inserto del envase indica que la composición se usa para tratar la condición de elección, tal como, por ejemplo, SLE.
Además, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en donde la composición comprende el anticuerpo humano o humanizado en la misma, y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en donde la composición comprende un agente terapéutico diferente del anticuerpo humano o humanizado. El artículo de fabricación en esta realización de la invención puede comprender además un inserto en el envase que indica que la primera y segunda composiciones se pueden usar en combinación para tratar una enfermedad o trastorno inmune o inflamatorio. Estos agentes terapéuticos pueden ser cualquiera de las terapias adjuntas descritas en la sección anterior. De manera alternativa, o adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprende un regulador
farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina amortiguada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Adicionalmente, puede incluir otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros reguladores, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.
En un primer aspecto, la presente invención se refiere por lo tanto a un anticuerpo humanizado o a un fragmento del mismo de enlazamiento con el antígeno, que se enlaza de manera específica al interferón α humano (IFN-α), en donde el anticuerpo humanizado que es una versión humanizada del anticuerpo murino ACO-1 o ACO-2, o de una combinación de los mismos, que comprende menos residuos de aminoácido del donante que las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de murino de acuerdo a Kabat.
En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un anticuerpo humanizado que se enlaza de manera específica a IFN-α, o un fragmento del mismo que se enlaza con el antígeno, en donde dicho anticuerpo es capaz de enlazarse a los subtipos A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b y WA de IFN-α, pero no a los subtipos 1 o D, y en donde dicho anticuerpo comprende menos residuos de aminoácido del donante que las CDR no humanas de acuerdo a Kabat.
De acuerdo a una realización, los residuos del donante de CDR H2 comprenden los residuos 50-59 de Kabat. En otra realización, dicho anticuerpo compite con y/o se enlaza con el mismo epítopo en un subtipo de IFN-α como el anticuerpo ACO-1 y/o ACO-2.
De acuerdo con una realización preferida, el anticuerpo es un subtipo de IgG4. En una realización preferida, el anticuerpo comprende una secuencia de CDR H2 de acuerdo a la SEQ ID NO: 21.
En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a un método para producir un anticuerpo de acuerdo a la invención, en donde el método comprende incubar una célula huésped que codifica dicho anticuerpo bajo condiciones apropiadas y aislar posteriormente el anticuerpo. La invención se refiere además a anticuerpos obtenidos por, u obtenibles por dichos métodos.
En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a una composición que comprende un anticuerpo de acuerdo a la invención. La invención se refiere además a un proceso para la preparación de una composición de acuerdo a la invención, en donde el método comprende mezclar el anticuerpo o un fragmento del mismo con excipientes. La invención se refiere además a composiciones obtenidas por, u obtenibles por tales métodos.
En un quinto aspecto, la presente invención se refiere a un método para prevenir, manejar, tratar o mejorar una enfermedad o trastorno inflamatorio relacionado con IFN-α, comprendiendo dicho método administrar a un sujeto que requiera del mismo una cantidad profiláctica o terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de acuerdo a la invención.
Finalmente, la presente invención se refiere al uso de un anticuerpo de acuerdo a la invención para la preparación de un medicamento adecuado para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria.
Ejemplos
Los detalles adicionales de la invención se ilustran mediante los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplo 1 -Secuenciación de anticuerpos ACO-1 y ACO-2 de murino
Este ejemplo describe la secuenciación y expresión recombinante de los anticuerpos murinos ACO-1 y ACO-2, descritos en el documento WO20060086586, así como búsquedas por BLAST en las secuencias de VH y VL de ACO-2.
Clonación y secuenciación del anticuerpo
Se extrajo el ARN total de hibridomas (ACO-1.5.2 y ACO-2.2.1) usando RNeasy (#634914) de Qiagen. Se sintetizó ADNc a partir de 1 µg de ARN total usando el kit de amplificación de ADNc SMART-RACE de Clontech. La reacción se corrió a 42ºC durante 1,5 horas y se diluyeron las muestras en 75 µl de tricina-EDTA. Se llevó a cabo la amplificación por PCR del objetivo en reacciones de 50 µl usando 5 µl de ADNc como plantilla. El cebador directo tanto para la cadena pesada como ligera fue una mezcla universal de cebadores (UPM) que se incluyó en el kit SMART RACE. La secuencia del cebador inverso para la cadena pesada (HC) de ACO-1 se diseñó como sigue:
5'-CTGGGCCAGGTGCTGGAGG -(SEQ ID NO: 11) y, para la cadena ligera (LC) de ACO-1:
5'-CTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTC (SEQ ID NO: 12).
La secuencia del cebador inverso para la cadena pesada (HC) de ACO-2 se diseñó como sigue:
5'-CTAGCTAGCTCATTTACCCGGAÓACCGGGAGATGG (SEQ ID NO: 26) y, para la cadena ligera (LC) de ACO-2:
5'-GCTCTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTG (SEQ ID NO: 27).
Las reacciones PCR se llevaron a cabo usando el kit de PCR Advantage HF de Clontech y el programa de PCR se corrió con una sola etapa de desnaturalización a 94ºC/2 min seguido por los 24 ciclos siguientes: 94ºC/30 s; 55ºC/30 s;
5 72ºC/1,5 min. La etapa final de extensión fue a 72ºC/10 min. Los productos de PCR se identificaron en un gel de agarosa al 1% que contenía bromuro de etidio. Los productos de PCR se purificaron del gel usando el kit de purificación GFX de GE Healthcare seguido por la clonación en el kit de clonación de PCR Zero Blunt TOPO (#K2875-40) y se transformaron en células TOP10 E. coli de Invitrogen.
Se extrajo el ADN de las colonias de E. coli usando el kit miniprep (#27106) de Qiagen. Los plásmidos se secuenciaron
10 en MWG Biotech, Matinsried, Alemania usando los cebadores de secuenciación M13 rev (-29) y M13 uni (-21). Se verificaron HC y LC de las secuencias identificadas mediante el uso del VectorNT1. Todos los procedimientos basados en los kits se realizaron de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
A partir de las células de hibridoma ACO-1.5.2 se clonaron una sola LC kappa y una sola HC de IGg2a, que tienen las siguientes secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos.
15 Secuencia de VH de ACO-1 (SEQ ID NO: 13 (péptido señal incluido)):
Secuencia de VL de ACO-1 (SEQ ID NO: 14 (péptido señal incluido)):
VH de ACO-1 (SEQ ID NO: 1 (péptido señal excluido))
VL de ACO-1 (SEQ ID NO: 4 (péptido señal excluido))
A partir de las células de hibridoma ACO-2.2.1, se clonaron una sola cadena ligera de ACO-2 tipo kappa y una sola cadena pesada de ACO-2 de IGg2b, con las siguientes secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos.
25 Secuencia de VH de ACO-2 (SEQ ID NO: 28 (péptido señal incluido))
Secuencia de VL de ACO-2 (SEQ ID NO: 29 (péptido señal incluido))
Secuencia de VH de ACO-2 (SEQ ID NO: 7 (péptido señal excluido)):
Secuencia de VL de ACO-2 (SEQ ID NO: 9 (péptido señal excluido)):
Las secuencias de CDR de ACO-2 de acuerdo a las definiciones de Kabat se encontró que eran las siguientes. CDR-H1: SYWMH (SEQ ID NO: 22)
10 CDR-H2: EINPSHGRTSYNENFKS (SEQ ID NO: 23) CDR-H3: GGLGPANFAY (SEQ ID NO: 17) CDR-L1: SAGSSVGSSYFY (SEQ ID NO: 24) CDR-L2: GTSNLAS (SEQ ID NO: 25) CDR-L3: HQWSSYPFT (SEQ ID NO: 20)
15 Ejemplo 2.-Diseño de ACO-1 humanizado e identificación de potenciales residuos de retro-mutación Identificación y caracterización de CDR de ACO-1 de ratón Las secuencias de CDR de ACO-1 de acuerdo a las definiciones de Kabat se encontró que son como sigue. CDR-H1: NYWMH (SEQ ID NO: 15) CDR-H2: EINPSHGRTIYNENFKS (SEQ ID NO: 16)
20 CDR-H3: GGLGPAWFAY (SEQ ID NO: 17)
CDR-L1: SAGSSVDSSYLY (SEQ ID NO: 18) CDR-L2: STSNLAS (SEQ ID NO: 19) CDR-L3: HQWSSYPFT (SEQ ID NO: 20) Identificación de una línea germinal humana Se construyó un modelo de estructura tridimensional de proteína usando MOE (Molecular Operating Environment;
disponible en www.chemcomp.com) con una plantilla estructural del Protein Database Bank (PDB): 1Z3G. El PDB se describe en Berman y colaboradores (Nucl Acids Res 2000; 28: 235-242), y está disponible en www.rcsb.org/pdb. Con base en un análisis de los complejos de anticuerpo-antígeno en la base de datos de PDB, se encontró que los residuos más probables en el parátopo son los residuos 23-35, 49-58, 93-102 de la VH de ACO-1, y 24-34, 49-56, 89-97 de la VL de ACO-1. Usando MOE, se identificaron los residuos que interactúan (hidrófobos, de enlazamiento a hidrógeno, de interacción de carga) con el parátopo y se tomó el conjunto combinado de residuos (parátopo + residuos que interactúan) como la llamada máscara de ACO-1 mostrada en la Figura 1.
Buscando las bases de datos de la línea germinal V con la VH de ACO-1 y VL de ACO-1 se volvió a las siguientes plantillas potenciales marco (valor E dado entre paréntesis): VH: VH1_46 (3e-038) VH1_f (6e-037), VH1_02 (6e-037), VH1_03 (1e-036), VH1_24 (2e-034),
VL: VKIII_L6 (9e-035), VKIII_A11 (4e-034), VKIII_A27 (8e-034), VKIII_L25 (1e-033), VKI_L8 (1e-033). Buscado las bases de datos de líneas germinales con la máscara se volvió a las siguientes plantillas potenciales marco (valor E dado entre paréntesis):
VH: VH1_46 (3e-011) VH1_02 (6e-011), VH1_f (1e-01Q), VH5_a (4e-010), VH1_03 (4e-010), VL: VKIII_A11 (5e-009), VKIII_L6 (7e-009), VKIII_A27 (9e-009), VKIII_L25 (3e-008), VKI_L9 (6e-008). Después de inspecciones manuales de las alineaciones y los aciertos, se seleccionaron VH1_46 y VKIII_L6 como los
andamiajes humanos. Se pueden elegir otras plantillas para alterar u optimizar, por ejemplo, las propiedades fisicoquímicas del anticuerpo humanizado. Se seleccionaron JH4 y JK2 como los segmentos J de línea germinal (SEQ ID NO: 2 y 5, respectivamente).
Diseño de ACO-1 humanizado óptimo Se realizó la humanización con las siguientes reglas:
− Los residuos fuera de la máscara se tomaron como humanos.
− Los residuos dentro de la máscara y dentro de la CDR de Kabat se tomaron como murinos.
− Los residuos dentro de la máscara y fuera de la CDR de Rabat con consenso de ratón/línea germinal se tomaron como
la secuencia de consenso.
− Los residuos dentro de la máscara y fuera de la CDR de Kabat con ratón/línea germinal se tomaron como la secuencia de línea germinal, pero la diferencia de murinos se sometió a retromutaciones potenciales. Las CDR del anticuerpo hzACO-1 óptimo obtenidas fueron (de acuerdo a las definiciones de Kabat): CDR_H1 NYWMH (SEQ ID NO: 15) CDR_H2 EINPSHGRTIYAQKFQG (SEQ ID NO: 21)
CDR_H3 GGLGPAWFAY (SEQ ID NO: 17) CDR_L1 SAGSSVDSSYLY (SEQ ID NO: 18)
CDR_L2 STSNLAS (SEQ ID NO: 19)
CDR_L3 HQWSSYPFT (SEQ ID NO: 20)
Usando el método de humanización anterior, diseñando una máscara de residuos predicha para constituir el parátopo con base en un modelo tridimensional de hzACO-1 e IFN-αA, en contraste con el injerto simple de CDR, se obtuvo un anticuerpo hzACO-1 con menos residuos murinos, ya que el péptido que comprende los 5 aminoácidos del terminal C de la secuencia de CDR H2 de hzACO-1 optimizada (resaltada en negrita anteriormente) fue idéntica a la correspondiente secuencia humana marco, mientras que el correspondiente péptido en la secuencia de CDR H2 de ACO-1 de acuerdo con las definiciones de Kabat era de origen murino. Adicionalmente, la secuencia de CDR H1 para un anticuerpo ACO-1 humanizado identificado en el presente análisis, era más corta que aquella descrita en el documento WO2006/086586. El anticuerpo hzACO-1 optimizado, o un anticuerpo o fragmento de enlazamiento al antígeno que comprende al menos una porción de la secuencia de VH de hzACO-1, puede proporcionar por lo tanto un riesgo reducido para una respuesta de anticuerpo anti-ratón humano (HAMA) en un paciente humano.
Además, el reemplazo de la secuencia AQK en lugar de NEN en la posición 60-62 en la cadena pesada tiene la ventaja de evitar dos residuos de asparagina que pueden ser propensos a desamidación.
Identificación de retromutaciones potenciales
El análisis de las secuencias de VH y VL de ACO-1 se ilustra en la Figura 1. En la Figura 1, se muestran las secuencias de VH (SEQ ID NO: 3) y VL (SEQ ID No:6) de ACO-1 (hzACO-1) humanizado resultantes, con residuos de retromutación potenciales como humanos, es decir, sin ninguna retromutación. Se identificaron las siguientes variantes de retromutación en las regiones marco para obtener uno o más anticuerpos hzACO-1 optimizados, que frecuentemente se requieren con el fin de retener la afinidad del anticuerpo original de ratón:
− VH de hzACO-1: tipo silvestre (es decir, sin retromutación), V5Q, M69L, R71V, T73K, S76I, V78A y cualquier combinación de los mismos;
− VL-de hzACO-1: tipo silvestre, E1 Q, L47W, I58V, F71Y y cualquier combinación de los mismos;
− en diferentes combinaciones de cadena pesada-ligera.
Ejemplo 3 -Diseño de variantes con base en ACO-2 de hzACO-1 para maduración de afinidad de hzACO-1
Como se muestra en la Figura 2, las alineaciones de la secuencia de aminoácidos de las secuencias VH y VL de ACO-1 y ACO-2 relevaron una alta identidad de secuencia entre las respectivas cadenas ligeras y pesadas. Sin estar limitado a la teoría, es posible que los anticuerpos se derivaran de la misma célula precursora ya que tenían el mismo reordenamiento V-D-J y contenían 3 mutaciones idénticas comparado con la secuencia de línea germinal. Además, los anticuerpos diferían en 13 residuos de aminoácido, posiblemente debido a posteriores hipermutaciones somáticas.
Aparte de los 13 residuos de aminoácido no idénticos en los dominios VH y VL de ACO-1 y ACO-2, se seleccionaron 9 residuos para análisis mutacional con el fin de mejorar la afinidad del anticuerpo ACO-1 humanizado (Figura 3). Las adiciones individuales de hipermutaciones derivadas de ACO-2 podrían potencialmente identificar residuos de aminoácido nocivos y beneficiosos y al permitir la introducción únicamente de los aminoácidos beneficiosos se mejora la afinidad más allá de los anticuerpos ACO-1 y ACO-2 originales de ratón. Se escogieron los residuos objetivo con base en su posición dentro de una de las CDR de cadena ligera o pesada (de acuerdo con la definición de Kabat) o con base en su ubicación dentro de las regiones perfiladas como potenciales regiones que interactúan con el antígeno con base en el modelamiento tridimensional antígeno-anticuerpo.
Se identificaron las, siguientes variantes para obtener uno o más anticuerpos hzACO-1 optimizados:
− VH de hzACO-1: tipo silvestre, T28S, N31S, I58S, S76N, T77I y A93V, y cualquier combinación de al menos dos mutaciones seleccionadas de T28S, N31S, I58S, S76N, T77I y A93V;
− VL de hzACO-1: tipo silvestre, D29G, L33F, S50G y cualquier combinación de al menos dos mutaciones seleccionadas de D29G, L33F, y S50G,
− en diferentes combinaciones de cadena pesada-ligera.
Se mutaron los residuos separadamente de la secuencia de ACO-1 con la secuencia de ACO-2 dentro de los constructos de cadena ligera y pesada de hzACO-1, con el fin de evaluar la contribución individual de cada residuo al enlazamiento del antígeno. También se generaron una serie de mutantes de combinación.
Ejemplo 4-Clonación de ACO-1, ACO-2, hzACO-1 y mutagénesis dirigida al sitio ACO-1, ACO-2, X hzACO-1 Se transfirieron las secuencias de VH y VL a vectores de expresión basados en el promotor de CMV (vectores pTT)
adecuados para expresión transitoria en el sistema de expresión HEK293-EBNA (HEK293-6E) descrito por Durocher y colaboradores (Nucleic Acids Res. 2002; 30(2):E9). Además del promotor de CMV, los vectores contienen un origen pMB1, un origen EBV y el gen AmpR. Se clonaron las VH de ACC-1 y ACO-2 en el vector basado en CMV que contenía la región constante para IgG2a e IgG2b de ratón, respectivamente. Se transfirió LC de longitud completa al vector vacío basado en CMV tanto para ACO-1 como para ACO-2. Las secuencias de ADN para las regiones variables de hzACO-1 fueron ordenadas a través de Geneart, Regensburg, Alemania. La secuencia suministrada para la VH de hzACO-1 fue transferida al vector de expresión que contenía la región constante para IgG4 humana (S241P) (que contenía una mutación S241P en la región de bisagra). La secuencia suministrada de VL de hzACO-1 fue transferida al vector que contenía la región constante para una cadena ligera kappa, humana.
Generación de variantes de retromutación de hzACO-1 Se introdujeron las 10 retromutaciones potenciales identificadas en el Ejemplo 2 separadamente en constructos de HC y LC de hzACO-1 con el fin de medir la contribución individual de cada residuo para el enlazamiento al antígeno. También se incluyeron unas pocas combinaciones. También se generó una variante de hzACO-1 con una CDR H2 extendida
(hzACO-1-Kabat CDRH2), equivalente a la definición de Kabat de la CDR H2 de murino (SEQ ID NO: 16) mediante mutagénesis dirigida al sitio. Se realizó la mutagénesis dirigida al sitio en los vectores de expresión de LC y HC de hzACO-1. Para generar mutantes
individuales, se usó el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange® de Stratagene (cat. # 200518) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se verificó la introducción de las mutaciones deseadas mediante secuenciamiento de preparaciones de ADN de plásmido (MWG Biotech, Matinsried, Alemania) para cada mutante.
Se combinaron los constructos de LC mutados con la HC de hzACO-1 para expresión, y se combinaron las constructos de HC mutados con la LC de hzACO-1 para expresión del anticuerpo. Variantes de cadena ligera con retromutaciones: hzACO-1-E1Q hzACO-1-L47W hzACO-1-I58V hzACO-1-F71Y hzACO-1-L47W, I58V variantes de cadena pesada con retromutaciones: hzACO-1-V5Q hzACO-1-M69L. hzACO-1-R71V hzACO-1-T73K hzACO-1-S76I hzACO-1-V78A hZACO-1-R71V, T73K hzACO-1-M69L, R71V, T73K, S76I, V78A hzACO-1-Kabat CDRH2
Generación de variantes con base en ACO-2 de hzACO-1 La mutagénesis dirigida al sitio que introduce residuos específicos de ACO-2 en el anticuerpo hzACO-1 con el fin de mejorar la afinidad, como se describe en el Ejemplo 3, se realizó en los vectores de expresión de LC y HC de hzACO-1. Para generar mutantes individuales, se usó el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange® de Stratagene (cat. # 200518) de acuerdo al protocolo del fabricante. Se generaron mutantes de combinación utilizando tanto el kit de
mutagénesis dirigida al sitio de QuickChange® como el kit de mutagénesis dirigida a múltiples sitios de QuickChange® de acuerdo a los protocolos del fabricante (cat. # 200513). Se verificó la introducción de las mutaciones deseadas mediante secuenciación de las preparaciones de ADN del
plásmido (MWG Biotech, Matinsried, Alemania) para cada mutante. Las constructos mutados de cadena ligera se combinaron con la cadena pesada de hzACO-1 para expresión y se
combinaron las construcciones mutadas de cadena pesada con las construcciones de cadena ligera de hzACO-1 para la expresión del anticuerpo. Variantes de cadena ligera con mutaciones derivadas de ACO-2: hzACO-1-D29G hzACO-1-L33F hzACO-1-S50G hzACO-1-D29G, L33F, S50G Variantes de cadena pesada con mutaciones derivadas de ACO-2: hzACO-1-T28S hzACO-1-N31S hzACO-1-I58S hzACO-1-S76N hzACO-1-T77I hzACO-1-A93V hzACO-1-N31S, I58S hzACO-1-T28S, N3lS, I58S, A93V hzACO-1-S76N, T77l hzACO-1-T28S, N3lS, I58S, S76N, T77I, A93V hzACO-1-T28S, A93V hzACO-1-N3IS, A93V hzACO-1-T28S, N31S, A93V hzACO-1-T28S, N31S Ejemplo 5 -Expresión de anticuerpos recombinantes derivados de ACO Las variantes de ACO-1, ACO-2, hzACO-1, y hzACO-2 se expresaron en células HEK293 transfectadas en forma
transitoria siguiendo un protocolo genérico de expresión de anticuerpo. A continuación se describe el protocolo de
transfección para células HEK293 adaptadas en suspensión.
Mantenimiento de células: Se cultivaron células HEK293 adaptadas en suspensión en medio de expresión FreeStyleMR 293 de GIBCO® (Invitrogen cat. # 12338-026) complementado con 25 µg/mL de Geneticin® (Invitrogen cat. # 10131019), 0.1% v/v de surfactante Pluronic® F-68 (Invitrogen cat.#: 12347-019) y 1% v/v de Penicilina-Estreptomicina (opcional) (Invitrogen cat. # 15140-122). Las células se mantuvieron en matraces Erlenmeyer de agitación con densidades celulares entre 0,2 -2 x 106 células/mL en una incubadora con agitación a 37ºC, 8% de CO2 y 125 de rpm.
Transfección de ADN: La. densidad celular de los cultivos utilizados para transfección fue de 0,8 -1,5 x 106 células/mL. Se usaron 0,5 µg de ADN del vector de cadena ligera + 0,5 µg de ADN del vector de cadena pesada por mL de cultivo celular. Se usó 293fectinMR (lnvitrogen cat. # 12347-019) como reactivo de transfección a una concentración de 1 µL de reactivo por µg de ADN transfectado. Se diluyó el 293fectinMR 30 veces en un volumen de Opti-MEM® (Invitrogen cat. # 51985-034), se mezcló y se dejó a temperatura ambiente (23-25ºC) durante 5 minutos. El ADN se diluyó en 30 µL de Opti-MEM® por µg de ADN total, se mezcló y se dejó a temperatura ambiente (23-25ºC) durante 5 minutos. Las diluciones de ADN y reactivo de transfección se mezclaron 1:1 y se dejaron a temperatura ambiente (23 -25ºC) durante 25 minutos. Se añadió la mezcla ADN-293fectinMR directamente al cultivo celular. Se transfirió el cultivo de células de transfección a una incubadora con agitación a 37ºC, 8% de CO2 y 125 rpm. Después de 4-7 días, se recolectaron los sobrenadantes de cultivo celular mediante centrifugación seguido por filtración a través de un filtro PES de 0.22 µm (Corning cat.#: 431098). Los anticuerpos se analizaron como sobrenadantes o se purificaron usando técnicas estándar de purificación con proteína A.
Comparación del nivel de expresión de CDRH2 de hzACO-1 y hzACO-1-Kabat
Se compararon los niveles de expresión transitoria en células HEK293-6E para CDRH2 de hzACO-1 y hzACO-1-Kabat para determinar si los residuos distales de CDR H2 tenían algún efecto sobre la capacidad de las células para expresar cualquiera de las dos variantes de anticuerpo.
Se transfectaron las células HEK293-6E como se describió anteriormente con vectores de expresión basados en pTT para la cadena ligera de hzACO-1 y las cadenas pesadas de CDRH2 de hzACO-1 o hzACO-1-Kabat. Se realizaron las transfecciones por triplicado. Para cada variante de anticuerpo, se transfectaron tres cultivos (25 mL) usando una mezcla patrón de ADN-293Fectin para reducir al mínimo la influencia de la inexactitud del pipeteado. Se incubaron los cultivos transfectados en una incubadora con agitación durante 4 días como se describió anteriormente. En el día 4, se extrajeron las muestras de los cultivos para mediciones de la viabilidad celular y la densidad celular y los sobrenadantes restantes de cultivo celular se recolectaron por centrifugación. El análisis de cuantificación de la producción de anticuerpos se realizó por interferometría de biocapa directamente en sobrenadantes clarificados de cultivo celular usando el sistema Octet de FortéBio y biosensores de proteína A. Se midieron las viabilidades y densidades de cultivo celular usando un analizador automatizado de cultivo celular Cedex HiRes. Los resultados se muestran en la Tabla 4 a continuación.
Tabla 4. Análisis de expresión
Rendimiento de la expresión (mg/L)
Desviación estándar (rendimiento de la expresión) Densidad de células viables (x 105 células/mL) Desviación estándar (densidad de células viables) Viabilidad celular (%) Desviación estándar (viabilidad celular)
hzACO-1
41 0,9 19 0,2 65 2,1
hzACO-1-Kabat CDRH2
22 0,7 18 0,5 65 3,2
Los resultados en la Tabla 4, muestran inesperadamente una diferencia significativa en los niveles de expresión transitoria para hzACO-1 (anticuerpo humanizado IFN-α de acuerdo a la presente invención) comparado con CDRH2 de hzACO-1-Kabat (anticuerpo humanizado IFN-α, usando procedimientos tradicionales y por lo tanto secuencias Kabat de longitud completa). No se observó diferencia en la viabilidad o densidad celular para los cultivos celulares transfectados con cualquiera de las dos variantes de hzACO-1. El nivel de expresión para hzACO-1 fue aproximadamente 2 veces mayor en comparación con el nivel de expresión para la variante del anticuerpo de CDRH2 de hzACO-1-Kabat.
Al injertar una versión más corta de CDR H2 en comparación a la CDRH2 definida por Kabat, se incrementaron de manera sorprendentemente significativa los niveles de expresión del anticuerpo.
Sin estar limitado por la teoría, se puede tener como hipótesis que los residuos derivados de línea germinal humana en el hzACO-1 en comparación a la variante del anticuerpo de CDRH2 de hzACO-1-Kabat, que porta la CDR H2 extendida
(SEQ ID NO: 16) afectan el plegado de HC y potencialmente la interacción de LC -HC, dando por resultado una estabilidad mejorada de proteína y por lo tanto el rendimiento de expresión.
Este nivel mejorado de expresión de proteína que resulta de una estabilidad mejorada de proteína observada en los niveles de expresión transitoria se reflejará en líneas celulares estables de producción basadas en CHO. Por lo tanto, al injertar la versión corta de CDRH2 (SEQ ID No: 21) es posible por lo tanto la generación de una línea celular para la producción estable con alto rendimiento.
Comparación del nivel de expresión de IgG4, variantes 1 y 2 de hzACO-1
Se compararon los niveles de expresión transitoria en células HEK293-6E para la variante guía IgG4(S241P) de hzACO1 y hzACO-1 (IgG1) y hzACO-1 (IgG2) para determinar si el cambio de subclase de cadena pesada tenía algún efecto sobre los niveles de expresión del anticuerpo.
El experimento se realizó de manera similar al ensayo de expresión descrito anteriormente, pero con los siguientes cambios: El experimento se realizó por duplicado en cultivos de 5 mL. Los cultivos se incubaron en tubos Falcon de 50 mL tapados con filtro en una incubadora con agitación a 37ºC, 8% de CO2 y 250 rpm..
De manera impredecible, los niveles promedio de expresión para hzACO-1 (IgG1) y hzACO-1 (IgG2) fueron aproximadamente 65% del nivel de expresión para hzACO-1 (IgG4). Con base en la reducción observada en la expresión de proteína (~35%) se concluye que la combinación de los dominios variables de hzACO-1 y el dominio constante de IgG4 es superior a las combinaciones con cualquier otra de las subclases de cadena y el desarrollo de esta molécula facilita mucho la generación de una línea celular de producción estable de alta producción.
Ejemplo 6: Estructura cristalina de IFN-α8 en complejo con hzACO-1-Fab
Se determinó y refinó la estructura cristalina de IFN-α8 en el complejo con el fragmento Fab de hzACO-1 para una resolución de 3.3 Á usando cristalografía de rayos X (Figura 8).
Materiales y métodos
Se mezclaron IFN-α8 (aminoácidos 1-166 de la SEQ ID NO: 30), y Fab de hzACO-1 (con la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 32 y la secuencia de cadena pesada de los residuos 1-221 de la SEQ ID NO: 31), con un ligero exceso de IFN-α8, y se purificó el complejo en una columna de filtración por gel. Se colocó el complejo proteico hzACO1-Fab/IFN-α8 en un regulador HEPES 25 mM, pH 7,5, + NaCl 25 mM y se concentró hasta 5 mg/mL. Se cristalizó el complejo en regulador HEPES 100 mM, pH 7,5, 15% de PEG 10.000 y 15% de Etilenglicol, la solución precipitante. Antes de la recolección de los datos de difracción, se congeló instantáneamente el cristal en N2 líquido. Primero se transfirió el cristal a una criosolución que era una mezcla de 25% v/v de glicerol al 99% y 75% del la solución precipitante. Se recolectaron los datos de difracción del haz de luz de un BLI911-3, MAX-Lab, Lund, Suecia. Se indexaron e integraron los datos de difracción usando el paquete del programa XDS (Kabsch, J. Appl. Crystallogr. 1993;
26: 795-800).
Se determinó la estructura tridimensional usando el método de reemplazo molecular (MR) usando el programa PHASER (Read, 2001, Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 57, 1373-1382) del paquete CCP4 (Baily, 1994, Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 50, 760-763). La estructura cristalina del Fab de hzACO-1, no complejada, se había determinado antes a una resolución de 1,52 Á (R y libre de R 0,18 y 0,21, respectivamente), datos no mostrados. Estas coordenadas tridimensionales fueron utilizadas posteriormente en los cálculos de MR para el complejo hzACO-1/IFN-α8. Los modelos de búsqueda se dividieron en tres partes: 1) el dominio variable de Fab de hzACO-1, 2) el dominio constante del Fab de hzACO-1 y 3) el modelo IFN-tau depositado en PDB, Protein Data Bank (Berman y colaboradores, 2000, Nucleic Acids Res. 28, 235-242) código de acceso 1 B5L (RADHAKRISHNAN y colaboradores, 1999, J. MOL. BIOL. v. 286 p. 151), mutado por el programa COOT para obtener la secuencia de IFN-α8, SEQ ID. NO: 30. Se hizo la determinación del grupo espacial final mediante el programa PHASER. Los puntajes más altos se obtuvieron para el grupo espacial P41 con rotación de los picos de función, RZ de 10.7, 4.4 y 2.6 σ, respectivamente, los picos de traslación, TZ, de 24:1, 26.4 y 8.0 σ, respectivamente, ganancias de probabilidad logarítmica, LLG, de 383, 918 y 1134, respectivamente, y sin traslape con moléculas de simetría relacionada.
El reemplazo molecular fue seguido por algunos ajustes al modelo en el programa de gráficos moleculares COOT después de lo cual se aplicó dos veces un apareamiento torsional simulado hasta 2000 K sin refinamiento de los factores individuales de temperatura. Los valores originales de R y libre de R fueron 0.416 y 0.439, respectivamente, y los valores finales después del apareamiento simulado fueron 0.314 y 0.427, respectivamente. Se sometió luego el modelo a intervención manual en el programa COOT seguido por refinamientos usando el programa REFMAC5 (Murshudov y colaboradores, 1997, Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 53, 240-255) dando como resultado valores de R y libres de R de 0.216 y 0.348, respectivamente. El modelo comprendió los residuos 1-21, mientras que los
residuos 22-23 se refinaron como residuos de Ala, 28-101 y 114-164 de IFN-α8, 1-215 de la cadena ligera de hzACO-1 y 1-219 de la cadena pesada de hzACO-1.
La. diferencia relativamente grande observada entre R y libre de R en el refinamiento se debe a la limitada resolución de los datos; 3 Å, y que existen tramos sustanciales del modelo de rayos X de IFN-α8 que están completamente ausentes
5 en la interpretación del mapa de densidad electrónica. Los mapas de densidad electrónica definen claramente los residuos en la interfaz establecida de IFN-α8 para hzACO-1-Fab, mientras que los detalles del modelo de la estructura de rayos X del IFN-α8 lejos del sitio del anticuerpo están menos bien definidos y por lo tanto determinados con menos precisión.
Resultados
10 Los contactos se identificaron mediante el programa de ordenador CONTACT de la suite CCP4 usando una distancia de corte de 4.0 Å entre las moléculas de Fab e IFN-α8. Se encontró que el epítopo resultante para hzACO-1 humano se comprende los siguientes residuos de IFN-α8 (SEQ ID NO: 30): Ser 55, His 58, Glu 59, Gln 62, Gln 63, Asn 66, Glu 97, Leu 118, Arg 121, Lys 122, Phe 124, Gln 125, Arg 126, Thr 128, Leu 129, Thr 132. Los residuos de hzACO-1 comprendidos en las interacciones con IFN-α8, el parátopo, incluían Ser 32, Tyr 33, Tyr 35, Tyr 50, Ser 51, Trp 92, Ser
15 93, Tyr 95 y Phe 97 de la cadena ligera (L) de hzACO-1, (La numeración de acuerdo a la SEQ ID NO: 32, no Kabat, y Thr 30, Asn 31, Tyr 32, Trp 33, His 35, Glu 50, Asn 52, Ser 54, His 55, Arg 57, Leu 101, Gly 102, Trp 105 de la cadena pesada (H), Tabla 9 (numeración de acuerdo a la SEQ ID NO: 31, no Kabat).
SEQ ID NO: 30
>IFN_a8
SEQ ID NO: 32 hzACO-1 LC
SEQ ID NO: 31 25 hzACO-1 Fab HC
Como puede observarse en la figura 9, el epítopo de la interacción de hzACO-1 sobre IFN-α8 traslapa, parcialmente, el epítopo de enlazamiento de IFNAR1 mientras que el epítopo de enlazamiento de IFNAR2 está distante del epítopo de enlazamiento de hzACO-1. Esto sugiere que la neutralización de IFN-α por hzACO-1 se presenta por neutralización de
30 enlazamiento de IFN-α con IFNAR1, pero no con IFNAR2. Por consiguiente, se puede contemplar que hzACO-1 se enlaza con el complejo IFN-α/IFNAR2 pero inhibe la formación del complejo receptor ternario IFN-α/IFNAR1/IFNAR2 responsable de la señalización intracelular.
Tabla 5. Parámetros del IFN-α8: cristal del complejo hzACO-1-Fab utilizado para la determinación de la estructura
Grupo espacial:
P41
Parámetros de celda [Å]: 60.55
a 112.74 b 112.74 c
Complejos moleculares /unidad asimétrica:
1
Tabla 6. Datos estadísticos de rayos X del programa XSCALE del paquete XDS
Resoluci ón [Å]
Número de reflexiones Integrid ad Factor R Compara do I/Sigm a R Rmrg d S_nor m/ S_anor
observa da
únic a posibl e observa do espera do
10.00
984 353 453 77.9% 4.4% 4.9% 984 18.84 5.4% 5.4% -1%
6.00
4237 1461 1562 93.5% 6.8% 7.2% 4237 12.45 8.2% 8.2% 1%
5.00
3922 1343 1411 95.2% 9.7% 10.1% 3922 9.83 11.7 % 11.7 % 3%
4.00
8747 3063 3182 96.3% 11.6% 11.9% 8447 8.59 14.0 % 14.0 % 8%
3.50
8588 3106 3212 96.7% 24.8% 24.9% 8588 4.43 3.35 % 3.3% 9%
3.45
1102 397 410 96.8% 36.9% 37.8% 1102 3.17 45.0 % 45.0 % 7%
3.40
1198 448 464 96.6% 41.8% 41.3% 1198 2.82 52.3 % 52.3 % -12%
3.35
1271 468 495 94.5% 56.0% 51.5% 1271 2.33 69.9 % 69.9 % 1%
3.30
1317 486 502 96.8% 59.6% 51.2% 1317 2.14 74.9 % 74.9 % -8%
total
31366 1112 5 1169 1 95.2% 14.1% 14.2% 31366 7.44 17.2 % 17.2 % 6%
Tabla 7. Estadística del último ciclo de refinación de IFN-α8:hzACO-1-Fab del programa REFMAC.
Datos usados en el refinamiento
Rango de resolución alto (angstroms)
3.30
Rango de resolución bajo (angstroms)
20.23
Corte de datos (SIGMA(F))
Ninguno
Integridad para el rango (%)
95.66
Número de reflexiones
10571
Ajuste para los datos usados en el refinamiento
Método de validación cruzada
Sobre todo
Selección del grupo e prueba libre de valor R
Aleatorio
Valor R (grupo de prueba + trabajo)
0.22272
Valor R (grupo de trabajo)
0.21646
Valor libre de R
0.34845
Tamaño del grupo de prueba con valor libre de R (%)
5.0
Conteo del grupo de prueba con valor libre de R
552
Ajuste en el BIN de resolución más alta
Número total de BINS utilizados
20
Rango alto de resolución de BIN
3.300
Rango bajo de resolución de BIN
3.384
Reflexión en BIN (grupo de trabajo)
761
Integridad de BIN (trabajo + prueba) (%)
96.06
Valor R de BIN (grupo de trabajo)
0.290
Recuento del grupo de valor libre de R de BIN
44
Valor libre de R de BIN
0.446
Valores de B
A partir del gráfico de WILSON (A**2)
NULL
Valor promedio de B (total, A**2)
52.314
Valor de B anisotrópico total
B11 (A**2)
-0.96
B22 (A**2)
-0.96
B33 (A**2)
1.92
B12 (A**2)
0.00
B13 (A**2)
0.00
B23 (A**2)
0.00
Error total estimado de coordenadas
ESU con base en el valor R (A)
NULL
ESU con base en el valor libre de R (A)
0.776
ESU con base en la probabilidad máxima (A)
0.574
ESU para valores B con base en la probabilidad máxima (A**2)
33.433
Coeficientes de correlación
Coeficiente de correlación FO-FC
0.901
Coeficiente de correlación libre de FO-FC
0.727
Desviaciones de RMS de los valores ideales
Recuento RMS Peso
Átomos refinados por las longitudes de enlace (A)
4628 0.014 0.022
Átomos refinados por los ángulos de enlace (grados)
6285 1.738 1.953
Ángulos de torsión, período 1 (grados)
577 8.885 5.000
Ángulos de torsión, período 2 (grados)
195 40.409 24.205
Ángulos de torsión, período 3 (grados)
770 23.636 15.000
Ángulos de torsión, período 4 (grados)
22 18.930 15.000
Restricciones del centro quiral (A**3)
704 0.110 0.200
Átomos refinados en planos generales (A)
3478 0.007 0.021
Tabla 8. Interacciones de cadena L de IFN-α8-hzACO-1 Fab
Se usó un corte de 4.0 Å. Los ,contactos se identificaron mediante el programa de ordenador CONTACT de la suite CCP4. En la última columna “***" indica una fuerte posibilidad de un enlace de hidrógeno en este contacto (distancia < 3.3 Å) como la calculada por CONTACT, “*" indica una débil posibilidad (distancia > 3.3 Å). Blanco indica que el programa consideró que no hay posibilidad de un enlace de hidrógeno.
Átomos de IFN-α8
Átomos de hzACO-1 Fab L Distancia (Å)
Leu 118I CB
Tyr 95L CE2 3.78
Leu 118I CG
Tyr 95L CE2 3.68
Tyr 95L CD2
3.90
Leu 118I CD1
Tyr 95L CG 3.95
Tyr 95L CE2
3.53
Tyr 95L CD2
3.21
Ser 93L O
3.70
Tyr 95L N
3.96
Phe 97L CE1
3.62
Leu 118I CD2
Trp 92L O 3.84
Arg 121I NH2
Tyr 95L OH 3.93 *
Lys 122I CA
Tyr 33L OH 3.38
Lys 122I CB
Tyr 33L OH 3.12
Lys 122I CG
Tyr 33L CE1 3.75
Tyr 33L CZ
3.37
Tyr 33L OH
2.93
Lys 122I CD
Tyr 33L CZ 3.74
Tyr 33L OH
3.40
Lys 122I CE
Tyr 33L OH 3.33
Lys 122I C
Tyr 33L OH 3.70
Lys 122I O
Tyr 33L OH 3.41 *
Gln 125I CG
Tyr 92L CH2 3.18
Tyr 33L CE1
3.80
Trp 92L CZ2
3.63
Gln 125I CD
Trp 92L CH2 3.70
Tyr
35L OH 3.81
Trp
92L CZ2 3.58
Gln
125I OE1 Tyr 35L OH 3.50 *
Gln
125I NE2 Ser 32L O 3.24 ***
Ser
51L OG 3.37 *
Tyr
33L CE1 3.94
Tyr
35L OH 3.59 *
Trp
92L CZ2 3.67
Arg
126I CD Tyr 33L OH 3.94
Leu
129I CD1 Ser 51L CB 3.80
Ser
51L OG 3.77
Ser
32L OG 3.40
Leu
129I CD2 Ser 51L OG 3.90
Thr
132I OG1 Tyr 50L OH 3.90*
Tabla 9. Interacciones de cadena H de IFN-α8-h2ACO-1 Fab
Se usó un corte de 4.0 Å. Los ,contactos se identificaron mediante el programa de ordenador CONTACT de la suite CCP4. En la última columna “***" indica una fuerte posibilidad de un enlace de hidrógeno en este contacto (distancia < 3.3 Å) como la calculada por CONTACT, “*" indica una débil posibilidad (distancia > 3.3 Å). Blanco indica que el programa consideró que no hay posibilidad de un enlace de hidrógeno.
Átomos de IFN-α8
Átomos de hzACO-1 Fab H Distancia (Å)
Ser 55I CB
Arg 57H NH2 3.58
Ser 55I OG
Arg 57H NE 3.18 ***
Arg 57H CZ
3.30
Arg 57H NH2
2.80 ***
(continuación)
Se usó un corte de 4.0 Å. Los ,contactos se identificaron mediante el programa de ordenador CONTACT de la suite CCP4. En la última columna “***” indica una fuerte posibilidad de un enlace de hidrógeno en este contacto (distancia < 3.3 Å) como la calculada por CONTACT, “*” indica una débil posibilidad (distancia > 3.3 Å). Blanco indica que el programa consideró que no hay posibilidad de un enlace de hidrógeno.
Átomos de IFN-α8
Átomos de hzACO-1 Fab H Distancia (Å)
His 58I CG
His 55H CD2 3.73
His 58I CE1
Asn 52H ND2 3.94
Ser 54H CB
3.90
Ser 54H OG
3.79
His
58I NE2 His 55H CD2 3.53
Ser
54H CB 3.60
Ser
54H OG 3.20 ***
His
58I CD2 His 55H CD2 3.19
Glu
59I CD Trp 33H NE1 3.90
Glu
59I OE2 Trp 33H CD1 3.74
Trp
33H NE1 3.01 ***
Gln
62I CD Asn 52H OD1 3.44
Thr
30H O 3.71
Gln
62I OE1 Asn 52H CG 3.91
Asn
52H OD1 3.02 ***
Ser
54H CB 3.67
Thr
30H C 3.69
Thr
30H O 2.55 ***
Asn
31H CA 3.87
Gln
62I NE2 Asn 52H CG 3.77
Asn
52H OD1 3.13 ***
Asn
52H ND2 3.95 *
Gln
63I CD Leu 101H CD1 3.83
Gln
63I OE1 Leu 101H CG 3.87
Leu
101H CD1 2.96
Gln
63I NE2 Leu 101H CD2 3.79
Asn
66I CG Asn 31H O 3.94
Asn
66I OD1 Tyr 32H CE1 3.54
Asn
31H CB 3.89
Asn
31H C 3.86
Asn
31H O 2.80 ***
Tyr
32H CZ 3.82
Asn
66I ND2 Asn 31H OD1 3.79 *
Glu
97I CG Ser 54H OG 3.85
Glu
97I CD Ser 54H O 3.97
Ser
54H OG 3.24
Glu
97I OE1 Ser 54H O 3.54 *
Glu
97I OE2 Ser 54H CB 3.88
Ser
54H OG 2.56 ***
Arg
121I CZ Glu 50H CD 3.73
Glu
50H OE1 3.31
Glu
50H OE2 3.30
Arg
121I NH1 His 35H CE1 3.89
Glu
50H CD 3.78
Glu
50H OE1 3.06 ***
Glu
50H OE2 3.66 *
Trp
105H CZ3 3.82
Arg
121I NH2 Glu 50H CD 3.08
Glu
50H OE1 2.80 ***
Glu
50H OE2 2.73 ***
Trp
33H CG 3.66
Trp
33H CE2 3.33
(continuación)
Se usó un corte de 4.0 Å. Los ,contactos se identificaron mediante el programa de ordenador CONTACT de la suite CCP4. En la última columna “***" indica una fuerte posibilidad de un enlace de hidrógeno en este contacto (distancia < 3.3 Å) como la calculada por CONTACT, “*" indica una débil posibilidad (distancia > 3.3 Å). Blanco indica que el programa consideró que no hay posibilidad de un enlace de hidrógeno.
Átomos de IFN-α8
Átomos de hzACO-1 Fab H Distancia (Å)
Trp 33H CD2
3.51
Trp 33H CZ2
3.88
Trp 33H CD1
3.54
Trp 33H NE1
3.35 *
Phe 124I CB
Leu 101H CD1 3.79
Gln 125I CD
Gly 102H N 3.69
Gln 125I OE1
Leu 101H CA 3.76
Leu 101H CB
3.38
Leu
101H C 3.57
Gly
102H N 2.55 ***
Gly
102H CA 3.24
Thr
128I OG1 Leu 101H CB 3.84
Ejemplo 7-Diseño de mutaciones con base en la estructura para maduración por afinidad de hzACO-1
Si no se conoce el epítopo y el parátopo de un complejo de anticuerpo/antígeno, un gran número de posibles residuos de aminoácidos pueden estar propensos a mutaciones a fin de mejorar la afinidad de un anticuerpo y además, se
5 pueden convertir en cualquiera de los 20 residuos restantes de aminoácidos para identificar el residuo óptimo en la posición particular. La región CDR retiene aproximadamente 54 residuos disponibles para mutaciones. De esta manera, a fin de mejorar la afinidad de la interacción, se pueden generar 54 x 20 = 1080 análogos solo dentro de las CDR. Además, se pueden hacer mutaciones fuera de las CDR a fin de mejorar la afinidad.
Sin embargo, cuando se conoce la estructura del anticuerpo/antígeno se puede predecir y analizar un número más
10 limitado de mutaciones calificadas que mejoran la afinidad, con base en predicciones estructurales. Por consiguiente, con base en la estructura cristalina de IFN-α8 en complejo con el fragmento Fab de hzACO-1, como se describe en el Ejemplo 6, se identificaron tres mutantes que mejoran el enlazamiento de hzACO-1 con todos los subtipos de IFN-α. Los 3 mutantes son hzACO-1 HC T30R, hzACO-1 LC Y32Y y hzACO-1 Y32E, T30R combinados (numeración de residuos de acuerdo a Kabat). La identificación de los mutantes se describe a continuación.
15 LA Y32E: Se puede observar que la densidad electrónica para los residuos Lys 122 de IFN-α8, que es parte del epítopo de enlazamiento con hzACO-1, indica una movilidad más bien alta. Además, el átomo sobre el residuo Tyr 32 (notación de Kabat) de la cadena ligera de hzACO-1 se dirige hacia los átomos Cβ yCγ de la cadena lateral de Lys 122. Esa interacción no es ninguna interacción óptima residuo-residuo. La mutación de la cadena lateral de Tyr 32 en un residuo negativamente cargado tal como Glu o Asp, produce la posibilidad de formar un fuerte enlace iónico entre el residuo Tyr
20 32 de la cadena ligera del anticuerpo y el residuo Lys 122 positivamente cargado de IFN-α8. Por esa razón, se intercambio Y por E a fin de mejorar la afinidad del anticuerpo hzACO-1.
HC T30R: Para cada residuo de hzACO-1 cercano a IFN-α8 en la estructura de rayos X, se calcularon las siguientes propiedades: número de átomos de cadena lateral de núcleo (núcleo), número de átomos de la cadena lateral periférica (peri), número de interacciones cargadas (carg), número de enlaces de hidrógeno (hybo) y el número de interacciones
25 hidrófobas (hyph) y se presentan en la Tabla 10 a continuación.

Tabla 10. Propiedades de los aminoácidos del mAb hzACO-1
Cadena ligera
Kabat
Res core peri char hybo hyph
29
D 1 2 1
31
S 2 1
32
Y 5 3 6
34
Y 3 2
49
Y 3 1 1 2
50
S 2 8
53
N 1 3 1
91
w 5 2 9
92
S 1
93
S 4
94
Y 6 2
96
F 2 2
Cadena pesada
28
T 3
30
T 3
31
N 4 1
32
Y 6 2 1
33
W 10 3
35
H 2 2
50
E 4 1 1 1
52
N 3 1 1
Cadena pesada
52A
P 1
53
S 2 2 2
54
H 4 2 6
56
R 5 2 1 1
58
I 2 2 2
64
Q 1
71
R 1 1
97
L 4 3
98
G 1
99
P 2
100A
W 2 3 1
El número de átomos del núcleo y la periferia se calculó al traslapar la estructura de rayos X en una rejilla de 101 x 101 x 101 nodos y para cada punto de la rejilla calculando el número de átomos < 2.5 Å (Nex) y átomos < 3,5 Å (Nin) del nodo. Los nodos del núcleo tienen Nex > 0 átomos de cobertura tanto de hzACO-1 como de IFN-8. Los nodos periféricos tienen Nex = 0 y Nin > 0 átomos de cobertura tanto de hzACO-1 como de IFN-α8. Los átomos de la cadena lateral del núcleo ahora son átomos < 2.5 Å de cualquier nodo. Los átomos de la cadena lateral periférica ahora son átomos > 2.5 Å y < 3.5 Å de cualquier nodo.
Finalmente, los residuos de la periferia se definen como los residuos con solo átomos periféricos y sin interacciones, de modo que se pueden modificar para crear un enlace. Se han identificado LC S92, HC T28, HC T30, l-IC P52, HC Q64 y HC P99. Enfocándose en las no prolinas de cadena pesada, se observa por inspección visual que la mutación HC T28R tendría una posible interacción con D90, HC. T30R tendría una posible interacción tanto con D90 como con E97 y Q64R tendría una posible interacción con E114, pero también se pueden aplicar otras mutaciones similares. Puesto que solo E97 se conserva a través de todos los interferones alfa, se espera que HC T30R produzca el mejor enlazamiento con un perfil similar como el de hzACO-1.
La mutación específica HC T30R se diseñó para establecer una interacción carga-carga en la periferia del sitio de enlazamiento para mejorar la afinidad de hzACO-1.
Adicionalmente, se generó y analizó un doble mutante que contiene tanto las mutaciones LC Y32E como HC T30R, llamado hzACO-1 Y32E, T30R para determinar si las dos mutaciones tendrían efectos aditivos.
Ejemplo 8.-Determinación de los parámetros cinéticos para la interacción entre hzACO-1, variantes de hzACO-1 y subtipos recombinantes de IFN-α humano.
Se puede hacer seguimiento a las interacciones de proteína en tiempo real usando análisis de resonancia de plasmón superficial (SPR). En este estudio, se realizó el análisis de SRP en instrumentos Biacore 3000 y Biacore T100 a fin de caracterizar el anticuerpo monoclonal anti-IFN-α, hzACO-1 y variantes del mismo, con respecto a la afinidad hacia varios subtipos de interferón alfa humano recombinante (IFN-α).
Se realizaron estudios de afinidad usando un procedimiento de enlazamiento directo, con el respectivo anticuerpo monoclonal acoplado covalentemente mediante grupos amina libres a la membrana de dextrano carboximetilada (CM5) en la superficie del chip sensor. Se inyectaron subtipos recombinantes de IFN-α (PBL Biomedical Laboratories, NJ, EE.UU.) en varias concentraciones, seguido por un periodo de disociación con flujo constante de regulador sobre la superficie del chip sensor. Usando este diseño experimental, se puede considerar el enlazamiento de IFN-α al anticuerpo monoclonal inmovilizado como un enlazamiento 1:1, con una molécula de IFN-α que se enlaza a un sitio de enlazamiento con el anticuerpo. Los parámetros cinéticos para la interacción se pueden calcular usando un modelo de ajuste de Langmuir de interacción 1:1.
Los anticuerpos monoclonales purificados se inmovilizaron en celdas de flujo individuales en un chip sensor de tipo CM5. Se realizaron las inmovilizaciones usando un procedimiento estándar de acoplamiento de amina, que tiene como finalidad un nivel de inmovilización de 1000 unidades de resonancia (RU).
Se usó HBS-EP pH 7.4 (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM y Polisorbato P20 al 0,005 %) como el regulador para la corrida, y diluyente para los IFN-α recombinantes. La asociación (inyección) fue de 4 minutos, seguida por un período de disociación de 12 a 30 minutos. La velocidad de flujo fue de 50 ul/min. Los experimentos se realizaron a 25ºCc. La detección en todas las celdas de flujo fue de forma simultánea. La celda de flujo # 1 no contenía anticuerpo inmovilizado, y se usó, para la sustracción del fondo y el volumen.
Los parámetros cinéticos se calcularon por ajuste global de los datos para una combinación dada de anticuerpoantígeno usando un modelo de enlazamiento de Langmuir de 1:1. Se inspeccionaron los datos para las limitaciones de transporte de masa antes del cálculo de los parámetros cinéticos.
Se realizaron los experimentos en instrumentos Biacore 3000 y T100. Los datos se evaluaron usando el software de evaluación Biaeval 4.1 y Biacore T100;
Los parámetros cinéticos obtenidos son solo válidos en el regulador usado, y con la forma recombinante del antígeno.
Resultados
A fin de generar un anticuerpo ACO-1 humanizado con afinidad retenida, se generaron diferentes variantes humanizadas como se describe en los ejemplos 2, 3 y 7, usando diferentes estrategias. Los parámetros cinéticos para la interacción entre los subtipos humanos recombinantes de IFN-α y las variantes de hzACO-1 se obtuvieron mediante análisis de SPR. Como se observa en la Tabla 11 aunque el hzACO-1, generado como se describe en el Ejemplo 2, contiene una CDR H2 truncada y sin retromutaciones, se ha retenido la afinidad del hzACO-1 en comparación al ACO-1 murino, como se muestra por la KD del hzACO-1 que está dentro de dos veces la del anticuerpo de ratón. Por consiguiente, no se requirieron para la humanización retroalimentaciones adicionales de ACO-1 humano en ACD-1 de ratón en las regiones marco, como se identifica y describe en el ejemplo 2. Además, el perfil del subtipo de IFN-α del anticuerpo hzACO-1 se ha retenido, como se muestra en la Tabla 2.

Tabla 11. Parámetros cinéticos para la interacción de IFN-αA recombinante con variantes de ACO-1 y hzACO-1
KD es la constante de disociación de equilibrio, ka es la constante de velocidad de asociación y kd es la constante de la velocidad de disociación.
mAb anti-IFN-α
KD (M) ka (1/Ms) kd (1/s) KD mAb/KD hzACO-1
ACO-1
3.09E-09 1.24E+05 3.75E-04 0.60
hzACO-1
4.46E-09 1.24E+05 5.56E-04 1
hzACO-1-L33F
4.86E-09 1.89E+05 9.18E-04 1.17
hzACO-1-S50G
4.94E-09 1.98E+05 9.78E-04 1.19
hzACO-1-T28S
2.97E-09 1.58E+05 4.68E-04 0.63
hzACO-1-N31S
2.20E-09 1.16E+05 2.55E-04 0.61
hzACO-1-I58S
1.93E-08 1.93E+05 3.74E-03 4.09
hzACO-1-S76N
5.07E-09 1.16E+05 5.88E-04 1.09
hzACO-1-T77I
6.79E-09 9.80E+04 6.65E-04 1.46
hzACO-1-A93V
2.16E-09 1.08E+05 2.34E-04 0.60
hzACO-1-T28S,N31S
2.22E-09 1.56E+05 3.45E-04 0.77
hzACO-1-N31S,A93V
1.51E-09 1.59E+05 2.40E-04 0.52
hzACO-1-T28S,A93V
1.66E-09 1.61E+05 2.68E-04 0.69
hzACO-1-T28S,N31S,A93V
1.57E-09 1.85E+05 2.91 E-04 0.65
Los parámetros cinéticos para la interacción de hzACO-1 en comparación con una molécula de ACO-1 humanizada, generada mediante injerto tradicional de CDR y que por lo tanto contiene una CDR H2 grande de murino (denominada
5 CDRH2 de hzACO-1-kabat), con IFN-αA humano recombinante, se enlistan en la Tabla 12. Como se muestra, la afinidad de la molécula de hzACO-1 humanizada como se describe en el ejemplo 2 y que contiene una CDR H2 más corta que la molécula CDR H2 de hzACO-1-kabat, fueron iguales, demostrando que el proceso de humanización descrito en el ejemplo 2 genera una variante humanizada tan buena como aquella generada por el injerto simple de CDR, aunque tiene una secuencia más humana.
10 Tabla 12. Parámetros cinéticos para la interacción de IFN-αA recombinante con CDR H2 de hzACO-1 y hzACO-1-kabat
La KD es la constante de disociación de equilibrio, ka es la constante de velocidad de asociación y kd es la constante de velocidad de disociación.
mAb
KD (M) ka (1/Ms) kd (1/s) KD mAb/KD hzACO-1
hzACO-1
1.9E+09 2.22E+05 4.15E-04 1
hzACO-1-kabat CDRH2
1.7E+09 2.05E+05 3.41E-04 0,9
Adicionalmente, a fin de investigar si CDRH2 de hzACO-1 y hzACO-1-kabat tenían parámetros cinéticos comparables del enlazamiento a varios subtipos de IFN-α humano, se realizó un experimento de comparación de disociación en subtipos seleccionados de IFN-α humano (Tabla 13). Esto muestra que la afinidad del hzACO-1 parece ser retenida en
comparación con CDRH2 de hzACO-1-kabat para todos los subtipos probados a pesar de tener una secuencia de CDR H2 más corta de ratón.
Tabla 13. Comparación de las constantes de velocidad disociación (kd) de la interacción entre varios subtipos de IFN-αA humano recombinante con CDR H2 de hzACO-1 y hzACO-1-kabat, respectivamente.
mAb Subtipo
hzACO-1 hzACO-1-kabat CDRH2 hzACO-1/hzACO-1-kabat CDRH2
kd (1/s)
kd (1/s)
Relación
IFN-αH2
4.13E-04 3.28E-04 1,26
IFN-αK
2.89E-04 3.41E-04 0,85
IFN-α4b
2.17E-04 1.55E-04 1,40
IFN-αWA
2.91E-04 3.66E-04 0,80
A fin de intentar mejorar la afinidad de hzACO-1 más allá de aquella del anticuerpo ACO-1 de ratón, se midieron la cinética de los parámetros entre IFN-αA y diferentes variantes de hzACO-1 que contienen mutaciones basadas en la secuencia de ACO-2 (Tabla 11). A fin de correlacionar los parámetros obtenidos en los experimentos separados realizados, se normalizó el valor de KD de cada anticuerpo individual contra aquel de hzACO-1 en el mismo
10 experimento, y se muestra la relación del valor de KD del mAb individual con la KD de hzACO-1 en el mismo experimento en la columna "KD mAb versus KD hzACO-1".
La determinación de la afinidad demostró adicionalmente valores de KD de todas las variantes de anticuerpo hzACO-1 derivadas de ACO-2 (excepto hzACO-1-I58S) en el intervalo menor de nM. Las variaciones menores en los valores de KD se relacionan predominantemente con diferencias en la kd. La introducción de las sustituciones individuales de
15 aminoácidos N31 S, A93V o T28S, y combinaciones de los mismos, en el hzACO-1 incrementó ligeramente la afinidad hasta un nivel similar a aquel de ACO-1. La mutación hzACO-1-I58S tiene un efecto negativo pronunciado en el valor de kd, demostrando la importancia de este aminoácido particular para la estabilidad del complejo hzACO-1/IFN-αA.
Con base en la estructura cristalina de hzACO-1 Fab/IFN-α8, se introdujeron una cantidad de sustituciones de aminoácidos en hzACO-1 a fin de incrementar la afinidad aún más (véase el ejemplo 7); De estas, dos sustituciones
20 individuales, Y32E de la cadena ligera y T30R de la cadena pesada, tienen efectos positivos significativos sobre la afinidad (Tabla 14) incrementando la afinidad aproximadamente 2 y 6 veces, respectivamente, contra IFN-αA. De forma notable, al combinar las dos mutaciones, el constructo hzACO-1 que contiene tanto Y32E como T30R, se observó un incremento de aproximadamente 10 veces en la afinidad contra IFN-αA (Tabla 15).

Tabla 14. Parámetros cinéticos para la interacción de IFN-αA recombinante con hzACO-1 y variantes de hzACO-1, 25 respectivamente.
La KD es la constante de disociación de equilibrio, ka es la constante de velocidad de asociación y kd es la constante de velocidad de disociación.
mAb
KD (M) ka (1/Ms) kd (1/s) KD mAb/KD hzACO-1
hzACO-1
3.20E-09 1.39E+05 4.43E-04 1
hzACO-1 LC Y32E
1.54E-09 2.47E+05 3.81 E-04 0.5
(continuación)
La KD es la constante de disociación de equilibrio, ka es la constante de velocidad de asociación y kd es la constante de velocidad de disociación.
mAb
KD (M) ka (1/Ms) kd (1/s) KD mAb/KD hzACO-1
hzACO-1 HC T30R
5.40E-10 1.31E+05 7.08E-05 0.16

Tabla 15. Parámetros cinéticos para la interacción de IFN-αA recombinante con hzACO-1, Xi hzACO-1 Y32E, T30R, respectivamente.
La KD es la constante de disociación de equilibrio, ka es la constante de velocidad de asociación y kd es la constante de velocidad de disociación.
mAb
KD (M) ka (1/Ms) kd (1/s) KD mAb/KD hzACO-1
hzACO-1
2.72E-09 1.78E+05 4.85E-04 1
hzACO-1 Y32E,T30R
2,97E-10 1.49E+05 4.43E-05 0.1
Los datos cinéticos en la Tabla 16 ilustran que un constructo hzACO-1 Y32E, T30R generado con base en un enfoque de diseño racional, ha retenido su perfil de subtipo de IFN-α puesto que no se enlaza a IFN-α1 sino que se enlaza a los subtipos restantes probados. A fin de validar que el efecto en los parámetros cinéticos causado por las mutaciones Y32E, T30R se reflejaron en el enlazamiento con varios subtipos de IFN-α humano, se realizó un experimento de
10 comparación de disociación en subtipos seleccionados de IFN-α humano (Tabla 16). Aunque las mutaciones sugeridas del constructo hzACO-1 mutante doble se basaron en la estructura del IFN-α8, de manera impredecible se observaron constantes de disociación mejoradas para todos los subtipos probados de IFN-α humano que varían entre 6-64 veces.

Tabla 16. Comparación de constantes de velocidad de disociación (kd) de la interacción entre varios subtipos de IFN-α humano recombinante con hzACO-1 y hzACO-1 Y32E, T30R, respectivamente.
mAb Subtipo
hzACO-1 hzACO-1 Y32E, T30R hzACO-1/hzACO-1 Y32E, T30R
kd (1/s)
kd (1/s)
Relación
IFN-αA
6.24E-04 3.28E-04 9,1
IFN-α1
Sin enlazamiento Sin enlazamiento -
IFN-α4b
1.12E-03 1.74E-05 64,4
IFN-αI
1.55E-03 3.15E-05 49,2
IFN-αJ1
4.54E-03 1,95E-04 23,3
IFN-αWA
2,47E-03 4.05E-04 6,1
15 Ejemplo 9.-Análisis de constructos de hzACO-1 en un ensayo de CPE
Este ejemplo muestra que hzACO-1 fue capaz de inhibir el efecto protector de todos los subtipos de IFN-α probados, excepto aquellos de IFN-α1 e IFN-αD, que no se vieron afectados por hzACO-1.
Materiales y métodos
Este ensayo de neutralización anti-IFN-α usado se basa en el efecto lítico del virus EMC en células A549. Todos los subtipos de IFN-α pueden inhibir la replicación del virus EMC en células A549, dando como resultado la supervivencia de las células, que se puede medir como tinción del ADN celular. El efecto neutralizante de un anticuerpo anti-IFN-α en
5 diferentes subtipos de IFN-α se puede medir por tinción disminuida de ADN celular, que corresponde a una mayor lisis celular.
El ensayo se realizó en placas con 96 pozos (Nunc, Cat. No. 167008), donde cada pozo contenía un volumen final de 200 µL. Todas las preparaciones de IFN-α fueron de PBL Biomedical Laboratories, NJ, EE.UU.
A cada pozo, se le adicionaron cuatro soluciones (IFN-α, hzACO-1, células y virus) hasta un volumen de 50 µL cada
10 uno. Todas las soluciones se prepararon en el medio F12Kaighn (Gibco, Cat. No. 21127) con FACS al 10%. La concentración específica de cada subtipo de IFN-α (listada en la Tabla 17 a continuación) se derivo de estudios previos. Las concentraciones de los anticuerpos usadas en el ensayo se seleccionaron con base en los datos existentes obtenidos del uso, por ejemplo, de anticuerpos murinos ACD-1.5.2 y ACO-2.2.
Cada subtipo de IFN-α se incubó previamente con hzACO-1 durante 2 horas a 37ºC, 5 % de CO2. El anticuerpo anti
15 interferón se diluyó como se muestra en la Tabla 17 a continuación. Después de la incubación previa del anticuerpo con IFN-α, se adicionaron 50 µL de solución celular (300000 células/mL) para obtener 15000 células/pozo. Después de 4.5 horas de incubación a 37ºC, 5% de CO2, se adicionaron 50 µL del virus EMC a una concentración de 10^3. Se añadieron 5 TCID50 seguido por incubación durante 48 horas a 37ºC, 5% de CO2.
Se removió posteriormente el sobrenadante de forma cuidadosa, y se adicionaron 50 µL de solución cristal violeta (0,5
20 % de cristal violeta, 25 % de metanol). Después de 15 minutos de incubación a temperatura ambiente, se lavaron los pozos en agua, y se secaron durante la noche.
A las placas secas se les adicionó luego 200 µL/pozo de metanol puro durante 15 minutos para extraer el cristal violeta de las células. Después de la extracción, se transfirieron cuidadosamente 100 µL del sobrenadante a una nueva placa de 96 pozos (Nunc, Cat. No. 256510), y se adicionaron 100 µL de agua Mili-Q a cada pozo. Luego se midió la placa en
25 un lector de ELISA a 590 nm.
Los datos en bruto recuperados del lector de ELISA se corrigieron por el metanol y el fondo de la placa antes del análisis.

Tabla 17. Parámetros de ensayo de CPE
Subtipo de IFNα
[IFNα] (pg/µL)* [hzACO-1] (ng/mL)
IFN-αA
1,25x10-1 2.500->0
IFN-α2
3,125x10-2 2.500->0
IFN-αF
6,25x10-2 2.500->0
IFN-αK
6,25x10-2 2.500->0
IFN-αWA
6,25x10-2 2.500->0
IFN-αB2
2,5x10-2 2.500->0
IFN-αH2
1,25x10-1 2.500->0
IFN-αl
5,0x10-2 2.500->0
IFN-αJ1
1,0x10-1 2.500->0
IFN-α4a
2,5x10-1 250->0
IFN-αC
2,5x10-2 250->0
IFN-αG
2,5x10-1 250->0
IFN-α4b
1,25x10-1 250->0
IFN-αD
3,75 50.000->0
IFN-α1
1,0 50.000->0
Resultados y discusión
Se usaron seis diferentes controles en todas las placas en el estudio (células, células + anticuerpo, células + IFN-α, células + anticuerpo + IFN-α, células + virus, y células + IFN-α + virus) para asegurarse que el efecto citopático observado en el ensayo no fue provocado por la citotoxicidad del anticuerpo y/o IFN-α, ni que la carencia de protección de IFN-α de las células contra el virus fue el causante del efecto citopático. No se observó efecto citotóxico significativo en los ensayos, y con ningún nivel de interferón hubo signo de un efecto citopático en los controles.
Como se muestra en la Figura 4, este ensayo de CPE mostró que el efecto protector de casi todos los subtipos de interferón podría ser inhibido por hzACO-1. Sin embargo, los efectos protectores de IFN-αD y de IFN-α1 no se inhibieron por hzACO-1, incluso con concentraciones de anticuerpo de 50000 ng/mL. Por consiguiente, la especificidad del ACO-1 de ratón se retuvo en el constructo hzACO-1.
Ejemplo 10 -Análisis de anticuerpos derivados de ACO en un bioensayo de gen reportero (RG)
Se utilizó un ensayo del gen reportero basado en luciferasa para evaluar la capacidad de las variantes del anticuerpo hzACO-1 para neutralizar la actividad biológica de los subtipos recombinantes de IFN-α.
Materiales
Medio “completo" de Eagle modificado de Dulbecco: DMEM incluyendo rojo fenol + FCS al 10% + L-glutamina 2 mM + penicilina + estreptomicina + 2-me, placa de fondo óptico de 96 pozos Nunc, cultivo de tejido negro tratado, PBS que incluye Ca2+ 1 mM y Mg2+ 1 mM, sistema de ensayo de luciferasa Steady-Glo (Promega).
La línea de células 93D7 se derivó por transfección estable de la línea de células A549 (CLL-185, ATCC) con un constructo inducible por IFN, que alberga al promotor Mx que dirige un gen reportero de luciferasa. El promotor Mx consiste del fragmento BamHI de 1.6 kb que contiene el promotor MxA murino y elementos de respuesta de IFN escindidos de pSP64-MXp(P5tl-Pvu11)-rβglo (Lleonart y colaboradores (1990) Biotecnology 8: 1263-1267).
Los subtipos de IFN-α (todos de PBL Biomedical Laboratories, NJ, EE.UU.) usados se listan en la Figura 5.
Métodos
Se realizaron ensayos de RG en pozos por cuadruplicado en placa de fondo óptico de 96 pozos, Nunc, opacas. Para cada ensayo, se incluyó un IFN-α de control positivo así como pozos de control negativo que contienen células no estimuladas y células tratadas con el anticuerpo en ausencia de estimulación con IFN-α.
Específicamente, se recolectaron células 93D7 adherentes de matraces mediante la remoción del medio de cultivo, lavando una vez con PBS, y tratando con tripsina. El tratamiento con tripsina se detuvo usando DMEM completo. Se contaron las células y ajustaron hasta 600000/mL en DMEM completo.
Se incubaron previamente los mAb anti-IFN-α purificados con subtipos recombinantes de IFN durante 1 hora en un volumen total de 100 µL en DMEM completo a 37ºC + 5% de CO2. Después de la incubación del anticuerpo IFN, se adicionaron 50 µL de células 93D7 y se incubaron durante 5 horas a 37ºC + 5% de CO2.
Para analizar la inducción de luciferasa inducida por MXA por las subespecies recombinantes de IFN, se ajustó la concentración de IFN para contener la cantidad que se va a colocar en cada pozo en 100 µL. Se colocaron 100 µL de IFN en pozos por cuadruplicado, se incubaron durante 1 hora a 37ºC + 5% de CO2. Posteriormente, se adicionaron 50 µL de células y se continúo la incubación durante 5 horas adicionales.
Para analizar la inhibición de la inducción de luciferasa inducida por MXA por las subespecies recombinantes de IFN usando mAb purificados, se adicionaron 50 µl de una dilución deseada de IFN recombinante por pozo. Se adicionaron
luego 50 µl de anticuerpo diluido en DMEM completo y se incubó durante 1 hora a 37ºC + 5% de CO2. Después de esta incubación, se adicionaron las células y se continuó la incubación durante 5 horas adicionales.
Después de las incubaciones durante 5 h, se removió cuidadosamente el medio de las células usando una pipeta multicanal. Luego, se fijo un bloqueador negro adhesivo al fondo de la placa de 96 pozos. Se adicionaron a cada pozo 100 µl de PBS con iones Ca2+ y Mg2+ . Se adicionaron a cada pozo 100 µl de reactivo Steady-Glo reconstituido, asegurándose que los contenidos en cada pozo se mezclaran completamente. Las placas se sellaron con una tira adhesiva clara. Después de 5 minutos de incubación a temperatura ambiente en la oscuridad, se leyó la luminiscencia en un contador de luminiscencia TopCount (Perkin Elmer).
Para el cálculo del grado de inhibición ejercido por el anticuerpo a la actividad de luciferasa inducida por IFN (inducida por MxA), se hizo el recuento cuando se comparó la inhibición por Ab de varios subtipos de IFN-α normalizados para niveles de actividad en presencia del anticuerpo y este valor se ajustó a 100%. Para comparar la inhibición de la forma variante del anticuerpo de los IFN-α individuales, los datos se muestran como recuentos brutos de luciferasa. Inicialmente se titularon los IFN en ausencia de anticuerpo para determinar la EC50 y la concentración de IFN a la cual se alcanzó la meseta en el ensayo. Cuando se analizó la inhibición del anticuerpo, se usó en general IFN en niveles de 80% de estimulación máxima para asegurar tanto una inducción sólida de luciferasa como para operar a un nivel por abajo de la saturación en el ensayo. Se usó el software Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego) para los cálculos y la presentación de los datos.
Resultados y discusión
Se evaluaron los constructos de ACO-1 humanizados por su capacidad para inhibir varios subtipos de IFN-α humano en el ensayo del gen reportero. La Figura 5 muestra los datos normalizados para la inhibición de 12 subtipos de IFN-α por el anticuerpo hzACO-1. La estimulación de IFN-α en ausencia de anticuerpo se estableció como el 100 % en tanto que las células tratadas en forma simulada (que solo reciben el medio), se estableció como el 0%. Los puntos de datos se muestran con el error estándar. Las curvas se calcularon como curvas de respuesta sigmoidal de mejor ajuste usando el software Prism. El hzACO-1 fue capaz de inhibir todas las subespecies probadas de IFN-α excepto para IFN-αD, y por consiguiente se retuvo la especificidad del anticuerpo ACO-1 progenitor de ratón durante la humanización en el anticuerpo hzACO-1. La inhibición fue completa ya que, con altas concentraciones de anticuerpo, se redujo la actividad de IFN-α a los niveles de fondo. La IC50 para la inhibición de los diferentes subtipos de IFN-α varió en este estudio de 28 ng/ml hasta 314 ng/ml. No se pudo inhibir la IFN-αD incluso con concentraciones mayores de hzACO-1.
La Figura 10 muestra una comparación del Ab ACO-1 de ratón con el ACO-1 humanizado (hzACO-1) así como dos variantes del mismo en el ensayo de RG. Una variante es un ACO-1 humanizado que tiene la CDRH2 completa (designada como CDRH2 de hzACO-1-kabat) mientras que se construyó el hzACO-1 con una CDRH2 más corta como se describe en el ejemplo 2. Adicionalmente, las figuras muestran otro hzACO-1 mutado que se ha optimizado para la interacción con los IFN-α (designados hzACO-1 Y32E, T30R) a través del diseño racional, como se describe en el ejemplo 7. Estas cuatro variantes recombinantes de mAb se compararon con respecto a la inhibición de cinco diferentes subtipos representativos de IFN-α en el ensayo de RG.
El hzACO-1 mostró para todos los cinco subtipos de IFN, valores de IC50 casi comparables a los de ACO-1 de ratón, siendo las IC50 cuantitativamente menores a dos veces (véase la Tabla 18 para valores relativos de IC50) de acuerdo con las KD observadas reportadas en el ejemplo 8. De esta manera se logró la humanización con una pérdida de afinidad menor a dos veces del anticuerpo ACO-1 progenitor para inhibición funcional. En conclusión, la humanización de mAb de ACO-1 ha producido un anticuerpo que ha retenido la afinidad para los IFN-α. Por consiguiente, se consideró que se retuvieron tanto la afinidad como la potencia en el anticuerpo hzACO-1 en comparación al ACO-1 original de ratón, y no se requirieron retromutaciones adicionales.
Como se describe en el ejemplo 2, el método de humanización de ACO-1 dio como resultado un anticuerpo con relativamente más aminoácidos humanos en la CDR H2 en comparación con la humanización común por simple injerto de CDR. Aunque podría esperarse que esto conduzca a una potencia reducida en el ACO-1 humanizado para la neutralización de los subtipos de IFN-α, como se muestra en la Figuras 10 y en la Tabla 18, de manera sorprendente este no es el caso, puesto que los CDRH2 de hzACO-1 y hzACO-1-kabat son equipotentes para todos los subtipos probados de IFN-α. Esto está de acuerdo con las afinidades reportadas para las dos variantes de ACO-1 como se describe en el ejemplo 8.

Tabla 18. Valores de IC50 para la inhibición de los subtipos de IFN-α por las variantes de hzACO-1
Datos normalizados. Los valores de IC50 fueron normalizados para cada especie de IFN-α a aquella de hzACO-1. Un valor menor de 1 indica por lo tanto un anticuerpo más potente que la inhibición de hzACO-1 de la actividad de IFN-α, en tanto que por el contrario, valores mayores que 1 indican inhibición con menor potencia.
Valores de IC50 con relación a hzACO-1
Variante de mAb
IFN-αA IFN-αB2 IFN-αF IFN-αG IFN-αJ1
hzACO-1
1,00 1,00 1,00 1,00 1,00
ACO-1
0,60 0,47 0,82 0,56 0,58
hzACO-1 Y32E, T30R
0,03 0,02 0,05 0,06 0,02
hzACO-1-kabat CDRH2
0,95 0,88 0,95 0,78 1,15
Para determinar la potencia de las variantes de hzACO-1 derivadas de ACO-2, como se describe en el ejemplo 3, estas se compararon con hzACO-1 usando el ensayo de RG. Se hicieron las comparaciones usando dos subespecies de IFN5 α (IFN-αF e IFN-αA). Se probaron cuatro diferentes sustituciones de aminoácidos individuales: T28S (es decir, en la posición 28 (de acuerdo a Kabat) se sustituyó la treonina con serina), 158S, N31 S y A93V.
Aunque la variante 158S inhibió la acción de IFN con potencia reducida, y posiblemente también con eficiencia reducida (IFN-αA), las variantes T28S y N31S mostraron ambas potencias similares a aquellas de hzACO-1. La variante sustituida A93V, sin embargo, mostró mayor potencia para la inhibición de los efectos de IFN como se mide en el
10 ensayo de RG (Figura 6). Aunque las diferencias en los efectos de las sustituciones se pueden detectar entre diferentes subtipos de IFN-α, la tenencia fue la misma para las dos formas en los cuatro casos.
A través del diseño racional usando la estructura cristalina en el Ejemplo 6, se construyó mutante que tiene dos aminoácidos cambiados, HC T30R, LC Y32E de hzACO-1 (designado como ACO-1 Y32E, T30R), como se describe en el ejemplo 7, para mejorar el enlazamiento a IFN-α. Aunque las mutaciones se basaron en la estructura de IFN-α8,
15 como se observa a partir de la Figura 10 (A-E) sorprendentemente este mutante tenía mayor potencia para la inhibición de todas las IFN-α probadas. Adicionalmente, la Tabla 8 muestra que aunque el incremento en la potencia depende del subtipo específico, está en el orden de 16 veces y hasta 50 veces de mejora de la potencia.
Se sigue de esto que la información del epítopo obtenida de la estructura del cristal en el Ejemplo 6 se puede usar para diseñar otras variantes de anticuerpo con afinidad mejorada de enlazamiento con este epítopo. También se sigue de
20 aquí que estas variantes humanizadas de anticuerpo de acuerdo con la presente invención están abarcadas por el alcance de la presente invención.
Ejemplo 11 -Caracterización de la proteína de los anticuerpos humanizados derivados de ACO
Este ejemplo se refiere a la estabilidad térmica de hzACO-1 y de diferentes variantes.
Materiales
25 Anticuerpos
hzACO-1 expresado como con isotipos IgG1, IgG2 e IgG4 humanos
hzACO-1-T28S
hzACO-1-N31S
hzACO-1-A93V
30 hzACO-1-T28S-N31S
Lo siguiente es una lista de los reguladores (100 mM) y sus valores de pH usados en el estudio: ácido cítrico/citrato de sodio, pH 3.0, 3,5; acetato de sodio, pH 4.0, 4.5 y 5.0; histidina, pH 6.0, 6.5; imidazol, pH 7.0; glicina-glicina pH 8.0, 9.0,
10.0.
La siguiente es una lista de aditivos y sus concentraciones usadas en este estudio: NaCl 100 mM, sacarosa 0.25 M,
0.50 M; fenol, 0,5%; Tween al 80, 0,01 %, glicerol 10%
Mediciones de estabilidad termoflúor
Se añadieron soluciones de 10 µl de concentrado 5000X de colorante en gel de proteína 400X SYPRO en DMSO (Invitrogen Molecular Probes), 25 µl de regulador y 10 µl de proteína (10 µM) a los pozos de una placa de PCR de 96 pozos (Biorad). Se sellaron las placas con un sellador Adhesivo Microseal B, MSB-1001 (Biorad) y se calentaron en un sistema de detección de PCR en tiempo real monocromático MyiQ (Biorad) de 25 a 95ºC en incrementos de 0,5ºC. Los cambios de fluorescencia en los pozos de la placa se monitorearon simultáneamente con una cámara de dispositivo acoplado a la carga (CCD). Las longitudes de onda para excitación y emisión fueron 490 y 575 nm, respectivamente. La temperatura de punto medio para la transición del despliegue de la proteína se determinó como la primera derivada del máximo de intensidad de fluorescencia en función de la temperatura.
Los gráficos termoflúor para hzACO-1 y las variantes mostraron las dos transiciones de temperatura esperadas para las proteínas de IgG, que reflejan los dos dominios principales, Fc y Fab. Las proteínas mostraron una Tm menor a pH menor. Por arriba de pH 5.5, el punto medio de transición fue bastante constante.
El efecto de los aditivos fue el mismo para los diferentes anticuerpos. En general, sacarosa a 0.5 M tenía el efecto más estabilizador, en tanto que la adición de NaCl, fenol y Tween 80 pareció tener un efecto desestabilizador.
A pH menor (pH 3.5), se observó una diferencia en estabilidad entre hzACO-1 y las diferentes variantes (Figura 7A). El mutante doble hzACO-1-T28S-N31S y el mutante sencillo hzACO-1-A93V mostraron la más alta estabilidad a este pH. Esto puede ser importante en un proceso de purificación para un producto de anticuerpo terapéutico, ya que las etapas de inactivación del virus frecuentemente se llevan a cabo a pH 3.5-4.0. A un mayor pH (pH 4.5, 5.5; Figura 7B y 7C, respectivamente) disminuye esta diferencia en la estabilidad.
Estudio de estabilidad de la solución
Se incubaron soluciones de hzACO-1-IgG4, hzACO-1-IgG1, y hzACO-1-IgG2 en histidina 15 mM, pH 6.5, sacarosa 20 mg/ml y Tween 80 al 0.01 % a 40ºC y se extrajeron muestras para análisis al inicio y después de 5 semanas. La distribución de la proteína intacta, del agregado soluble y/o de los fragmentos de hzACO-1 se determinó usando cromatografía de exclusión por tamaño (SEC-HPLC). Se usó un sistema de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), modelo 1100 o un sistema de cromatografía líquida modelo 1200 (Agilent Technologies, Palo alto, CA) con una columna BIOSEP SEC 3000 (Phenomenex) a una velocidad de flujo de 0,8 mL/min usando pH 7.2 y con solución salina amortiguada con fosfato (PBS) como la fase móvil. La proteína se detectó al monitorear la DO a 215 nm. Se calculó el porcentaje de cada pico en el área de proteína total.
La cantidad de formas de alto peso molecular formadas de los isotipos de hzACO-1 se muestran en la Figura 11 y muestran claramente que el constructo de IgG4 no mostró formación de agregados durante la incubación mientras que tanto los isotipos IgG1 como IgG2 formaron variantes de alto peso molecular.
Adicionalmente, la variante hzACO-1-IgG1 mostró un fragmento de bajo peso molecular después de la incubación. La cantidad del fragmento fue de 1.3%
Por consiguiente, desde un punto de vista de estabilidad, la IgG4 de hzACO-1 es una molécula terapéutica más atractiva que los correspondientes anticuerpos IgG2 e IgG1.
Ejemplo 12 -Análisis de ADCC
Como se describe en el ejemplo 6, el mAb ACO-1 y versiones humanizadas del mismo pueden bloquear la actividad de IFN-α mediante la inhibición del enlazamiento de IFN-α a la subunidad 1 del receptor de interferón alfa tipo I (IFNAR1). Por consiguiente, un mAb ACO-1 terapéutico humanizado puede enlazarse a la superficie celular formando un complejo que consiste del anticuerpo, IFN-α e IFNAR2. Esto aumenta el riesgo de que ACO-1 induzca citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC).
Para este fin, se realizó un experimento de ADCC para valorar la capacidad del anticuerpo hzACO-1 expresado como un subtipo de IgG4 en presencia de IFN-α2A.
Materiales y métodos
Se usaron células Raji (línea de células B humanas (ATCC # CCL-86)) como células objetivo. Se cultivaron células Raji en RPMI1640 complementado con 10% de suero de ternera fetal, HEPES 10 mM, piruvato de sodio 1 mM, glutamina 1 mM, 2,5 g/l de glucosa y 1% de penicilina/estreptomicina. Se usó interferón-α2A altamente purificado para el ensayo. La proteína se probó en un ensayo de gen reportero para la actividad biológica antes del uso. Se usó Rituxan® (Nomeco A/S, Dinamarca) como control positivo para ADCC, cuando se utilizan células Raji, que es una línea de células B que expresa el antígeno CD-20 de superficie de células B.
Las células objetivo fueron cosechadas y se contaron en un hemocitómetro. Se transfirieron 1,5 * 106 células a un tubo de 15 ml y se centrifugó. El sobrenadante se eliminó completamente y se resuspendió el sedimento celular en 100 µCi51Cr (cromo 51) por 106 células (se ajustó el volumen de acuerdo a la tabla de decaimiento). Durante un período de incubación de 1 hora a 37°C con IFN-α se golpeó ligeramente el vial cada 15 minutos. Posteriormente se lavaron las células dos veces en medio (RPMI 1640, 10% de FCS), y se resuspendió en 2 ml de medio del medio del ensayo. Se sembraron en placa 5000 células marcadas con 51Cr en un volumen de 50 µl en placas de 96 pozos (fondo plano). Se analizaron todas las muestras máximo por triplicado -y se determinaron las liberaciones mínimas en los pozos sin células efectoras. Liberación máxima: 5000 células objetivo / pozo + 1% de Triton X-100. Liberación mínima: 5.000 células objetivo/pozo. Se purificaron las células efectoras a partir de "capas leucocitarias'' por centrifugación de densidad Ficoll utilizando técnicas estándar. Se añadieron a cada pozo números graduados de las PBMC humanas recién aisladas. Se usaron las siguientes relaciones de efector con respecto a las células objetivo (E:T): 10, 20, 40 y 80. En todos los experimentos se probó hzACO-1 en una concentración de saturación de 10 µg/mL (66 nM). Se ensayó IFNα2A a 0,5, 2,5, 5, y 10 nM. El volumen final del ensayo fue de 200 µL. Después de 4 horas de incubación a 37°C, se transfirieron 30 µl del sobrenadante a un Luma-PlateMR y dejó secar al aire durante la noche. Se determinó la radiactividad en TopCount NXT (Perkin Elmer, EE.UU.). Los datos fueron introducidos en el programa GraphPrism® y se calcularon lo recuentos promedio por minuto de los triplicados y la desviación estándar correspondiente.
Resultados
Como se observa en la figura 12, no se puede observar inducción de ADCC por encima del fondo (células o células con IFN-α) para la molécula de hzACO-1, expresada como una IgG4 en presencia o en ausencia de IFN-α. En contraste, Rituximab, que se utilizó como control positivo indujo lisis celular en diferentes proporciones de relaciones de células efectoras y objetivo (E:T).
Ejemplo 13 -Ensayo de ELISA de enlazamiento con el complemento
Como se describe en el ejemplo 6, el mAh ACD-1 y versiones humanizadas del mismo puede bloquear la actividad de IFN-α mediante la inhibición del enlazamiento de IFN-α con la subunidad 1 del receptor de interferón alfa tipo I (IFNAR1). Por consiguiente, un mAb ASO-1 terapéutico humanizado puede unirse a la superficie celular constituyendo un complejo que consiste del anticuerpo, IFN-α e IFNAR2. Esto aumenta el riesgo de activar el sistema de complemento y de inducir citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).
El propósito del presente estudio de enlazamiento con el complemento fue probar si la ruta clásica del complemento se activa cuando el hzACO-1 expresado como un isotipo de IgG4 humana se une a, y forma, un complejo con un epítopo correspondiente en hIFN-α. Esto se logra al usar un ELISA, que mide el enlazamiento de los anticuerpos a C4. El enlazamiento de C4 indica que se cambian los C1 y se inició la cascada del complemento. Una vez que se ha enlazado C4, los otros componentes del complemento del plasma se activarán a su vez, uniéndose, y escindiendo enzimáticamente los siguientes componentes de la cascada.
Materiales y métodos
Se usaron placas de microtitulación revestidas con estreptavidina (236001, NUNC) como placas de ELISA. Se usó hIFN-α2A biotinilado como fuente de antígeno y se revistieron las placas en 100 µL/pozo por 0.25 µg/ml de proteína diluida en regulador de lavado (Na3PO4 10 mM + NaCl 145 mM + Tween 20 al 0,05 %). Se demostró que esta concentración de hIFN-α es la concentración óptima de revestimiento en un ELISA. Las placas se incubaron durante 60 minutos a temperatura ambiente y agitación suave y luego se lavaron cinco veces en regulador de lavado, dejando el regulador del último lavado en las placas durante 30 minutos para bloquear los posibles sitios de enlazamiento residual en las placas. Se descartó el regulador de las placas y se adicionaron 100 µl del mAb hzACO-1 diluidos en el regulador de lavado. Las placas se incubaron durante 60 minutos a temperatura ambiente y agitación suave. Se lavaron cinco veces las placas en regulador de lavado. Se usó un pAb anti-IgG4 policlonal como control positivo por entrecruzamiento del mAb IgG4 hzACO-1. El mAb pAb anti-IgG4 se diluyó en regulador de lavado y se adicionó a las placas en diluciones en serie desde 32 µg/ml hasta 32 ng/ml en 100 µl/pozo. Se usaron dos diferentes purificaciones del pAb anti-IgG4, un anticuerpo purificado por afinidad y un anticuerpo purificado por proteína A. Las placas se incubaron durante 60 minutos a temperatura ambiente y agitación suave. Se lavaron las placas cinco veces en regulador de lavado. Se añadió el plasma humano diluido 1:200 en regulador de plasma (PBS con Ca2+ 0,3 mM, Mg2+ 1 mM) a 100 µl/pozo. Las plantas se
incubaron durante 60 minutos a 37ºC con agitación suave. Se lavaron las placas cinco veces y se añadió a las placas a razón de 100 µl/pozo C4 anti-humano de ratón (HYB162-02 + HYB162-04, SSI), cada uno diluido 1:2000 en regulador de lavado. Se incubaron las placas durante 60 minutos a temperatura ambiente con agitación suave. Se lavaron las placas cinco veces en regulador de lavado antes de la adición de 100 µl/pozo de IgG antirratón de conejo-HRP (DAKO P0260), diluido 1:1000 en regulador de lavado. Se lavaron las placas cinco veces y a todos los pozos se del añadió 100 µl de sustrato TMB. Después de aproximadamente 6 minutos de incubación, se adicionaron 100 µl de H3PO4 4 M a todos los pozos para detener la reacción enzimática. Se midió el color de manera espectrofotométrica mediante un lector de placas Victor (Wallac).
Resultados
El hzACO-1 expresado como un isotipo de IgG4 humana, se probó por la capacidad para enlazarse a componentes del complemento por ELISA usando placas revestidas con IFN-α. Esto se visualizó mediante la detección del enlazamiento a C4 que es uno de los componentes en la cascada clásica del complemento. Como se muestra en la figura 13, IgG4 hzACO-1 fue incapaz de fijar el complemento. Como control positivo, se usó un pAb anti-IgG4 policlonal para inducir el enlazamiento por entrecruzamiento del anticuerpo IgG4 hzACO-1. Si el hzACO-1 se enlazara de forma cruzada con un pAb anti-IgG4, se detectó un claro enlazamiento dependiente de la dosis de C4 al anti-IgG4.
Ejemplo 14 -Selección del isotipo de anticuerpo
Cuando se expresa un anticuerpo monoclonal humanizado, se necesita seleccionar un isotipo de anticuerpo humano para la expresión del anticuerpo humano de longitud completa. Para el desarrollo de un anticuerpo anti-IFN-α neutralizante, no se requieren funciones efectoras mediadas por Fc.
Adicionalmente, aunque los anticuerpos derivados de ACO-1 son capaces de neutralizar la actividad neutralizante de IFN-α (ejemplo 9 y ejemplo 10), el epítopo de enlazamiento de las variantes del anticuerpo ACO-1, como se describe en el ejemplo 6, es compatible con el enlazamiento simultáneo de la subunidad del receptor de IFNAR2 e IFN-α. Por consiguiente, aunque el mAb hzACO-1 terapéutico se enlaza a la citoquina IFN-α soluble, el mAb puede en realidad ser capaz de enlazarse a las superficies celulares a través del complejo IFN-α/IFNAR2 provocando citotoxicidad por reclutamiento de las funciones efectoras mediadas por Fc. Además de esto, para los anticuerpos contra los IFN tipo I (IFN-α e IFN-β), la selección del isotipo de anticuerpo es de importancia particular, puesto que se ha descrito que la parte Fc de los mAb anti-IFN pueden provocar en realidad efectos biológicos indeseados que dan como resultado potenciación en lugar de neutralización de IFN en ciertos tipos de células como se describe más adelante (Moll HP colaboradores J Immunol 180, 1594-604, 2008).
En presencia de los IFN Tipo I, los anticuerpos contra IFN-α o IFN-β humano que neutralizan normalmente la actividad de IFN en otros tipos de células, en vez de inducir la actividad de IFN en células endoteliales humanas y las PMBC en presencia de IFN-α o IFN-β. Los anticuerpos usados en estos estudios son del isotipo IgG1 de ratón, que se sabe que se enlazan de forma cruzada a los receptores Fc humanos. La inducción de la actividad de IFN solo se observa para anticuerpos intactos y no para los fragmentos Fab o Fab2 de los mismos anticuerpos y parece que se inhibe por el bloqueo de los receptores de Fc con un mAb de control del isotipo del anticuerpo. Por consiguiente, aunque no se conoce un mecanismo molecular de este fenómeno, parece que requiere que estos mAb se enlacen a los receptores de superficie celular a través de la parte Fc. Adicionalmente, este fenómeno parece que es específico para los IFN Tipo I puesto que los anticuerpos contra IFN Tipo II, IFN-γ, y no se observa un fenómeno similar para los anticuerpos contra el receptor de IFN Tipo I, IFNAR (Moll HP y colaboradores J Immunol 180, 1594-604, 2008).
En resumen, para el desarrollo de un mAb anti-IFN terapéutico para la neutralización de IFN-α, no se requiere una función efectora mediada por Fc y puede causar en realidad efectos biológicos indeseados provocando citotoxicidad o potenciando la actividad de IFN en ciertos tipos de células en pacientes tratados con un mAb anti-IFN-α. En consecuencia, la generación de un mAb humanizado que es incapaz de inducir funciones efectoras puede ser crucial.
Existen cuatro diferentes isotipos de anticuerpos humanos, es decir, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. De estos IgG1 e IgG3 son los más eficientes en el enlazamiento con receptores de Fc y el complemento y en consecuencia causan la activación de funciones efectoras mediadas por Fc tales como citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) (Salfeld JG. Biotechnol 25, 1369-1372, 2007). Las mutaciones que anulan el enlazamiento de varios receptores de Fc y C1q han sido descritas en la literatura (Hezareh M. y colaboradores, J Virol 75, 12161-12168, 2001. Idusogie EE. y colaboradores J Immunol 164, 4178-4184, 2000. Lund J. y colaboradores J Immunol., 147: 2657-6, 1991. y Chappel y colaboradores 1991, Canfield MS y colaboradores J Exp Med. 173: 1483-91, 1991). Sin embargo, la selección por ejemplo de un isotipo de IgG1 y la inclusión de varias mutaciones será potencialmente capaz de dar como resultado una inmunogenicidad y provocar una respuesta inmune contra la parte Fc en humanos, tal como una región Fc modificada no se presentará de forma natural en humanos.
Por esta razón, el mAb anti-IFN-α hzACO-1 se expresó tanto con los isotipos IgG2 como IgG4, que son ambos utilizados en varios anticuerpos terapéuticos (Salfeld JG. Biotechnol 25, 1369-1372, 2007). De manera inesperada, los niveles de
expresión del constructo IgG4 fue significativamente mayor que la de la variante hzACO-1 tipo IgG2 (ejemplo 5) que mejorará considerablemente el rendimiento de producción. Adicionalmente, la molécula hzACO-1 tipo IgG2 pero no la variante IgG4 fue propensa a agregación (ejemplo 11). Esto se consideró un problema serio en el desarrollo de fármacos, puesto que la agregación puede reducir el rendimiento durante la producción, limitar la vida en anaquel y dar por resultado una potencia reducida en pacientes debido a una mayor inmunogenicidad.
Por consiguiente, el constructo IgG4 hzACO-1 se seleccionó para caracterización adicional en un ensayo de ADCC en presencia de IFN-α, así como un ensayo de ELISA de fijación del complemento, como se describe en los ejemplos 12 y 13, respectivamente. Estos datos confirman que la molécula de IgG4 hzACO-1 en realidad es incapaz de provocar citotoxicidad indeseada. La carencia esperada de potenciación de la actividad de IFN-α también se puede confirmar en las PBMC y en las EC, como se describe en Moll y colaboradores 2008.
En resumen, la molécula de.lgG4 hzACO-1 parece ser una molécula terapéutica adecuada particular puesto que es capaz de neutralizar IFN-α sin inducción de efectos secundarios indeseados provocados por funciones efectoras mediadas por Fc incluyendo citotoxicidad y potenciación de la actividad de IFN, y puesto que es una molécula estable y bien expresada la hace adecuada para fabricación y administración a los pacientes.
Ejemplo 15-Análisis de los epítopos de células T
Con base en tecnologías estándar para predicciones de inmunogenicidad (De Groot, A.S. y Moise, L. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 10, 332-340, 2007) se usó el método de perfil de bolsillo (Sturniolo,T. y colaboradores Nat. Biotechnol. 17, 555-561,1999) como el promovido por ProPred (Singh, H. & Raghava, G.P. ProPred. BiolFNormatics. l7, 1236-1237, 2001) para predecir epítopos de células T lineales entre 51 alelos HLA-DRE. El método calcula el número de alelos que pueden enlazarse a un péptido determinado de 9 residuos de largo dentro de la proteína bajo evaluación. Si un péptido determinado que enlaza muchos alelos es de origen no humano, este puede ser usado como una medida indirecta de inmunogenicidad. Si el péptido es de origen humano, no se espera respuesta inmune debido a la selección negativa temprana de las células T correspondientes.
Es el propósito de este ejemplo comparar la inmunogenicidad predicha de un procedimiento de humanización usando la CDRH2 de hzACO-1-kabat de longitud completa con el procedimiento de humanización real aplicado para hzACO-1.
Como secuencias de entrada para el algoritmo ProPred, se usa CDR_H2 de ACO-1 de longitud completa con 10 + 10 residuos adicionados alrededor de la CDRH2 de hzACO-1-kabat:
APGQGLEWMG/ EINPSHGRTIYNENFKS/RVTMTRDTST (CDR_H2_Completa),
junto con la secuencia comparable de hzACO-1
APGQGLEWMG/EINPSHGRTIYAQKFQG/RVTMTRDTST (CDR_H2_Humana)
en la misma área.
La corrida de CDR_H2_Completa a través del predictor del epítopo de células T produce los siguientes tres epítopos: WMGEINPSH (que se enlaza con 4% de los alelos HLA-DRE), INPSHGRTI (6%) y FKSRVTMTR (24%). Para CDR_H2_Humana, los primeros dos epítopos menores son idénticos, mientras que el último epítopo principal se convierte en FQGRVTMTR (27%) Aunque aún es un epítopo de células T, ahora es una secuencia humana completa y a partir de la suposición, que las células T autoreactivas son suprimidas por selección negativa en el timo, este epítopo potencial principal en CDR_H2_Completa ha sido removido por la secuencia de CDR_H2_Humana.
Por consiguiente, se espera que hzACO-1 sea menos inmunogénico, que un ACO-1 humanizado tradicional injertado en CDR.
Ejemplo 16-Truncamiento de CDR
Como se describe en el ejemplo 2, el anticuerpo ACO-1 de ratón se humanizó por un método no tradicional. Esto constituye el diseño de una máscara de residuos que se predice que comprende al parátopo, con base en un modelo tridimensional de hzACO-1 e IFN-αA. La aplicación de este método de humanización dio como resultado un anticuerpo hzACO-1 con menos residuos murinos que un anticuerpo humanizado por injerto simple de CDR, ya que el péptido que comprende los 5 aminoácidos del terminal C de la secuencia de CDR H2 de hzACO-1 era idéntico a la secuencia correspondiente del marco humano. En contraste, la secuencia peptídica correspondiente en un anticuerpo humanizado injertado tradicionalmente en CDR (la CDR H2 de hzACO-1-kabat) fue de origen murino. Por consiguiente, este procedimiento de humanización dio como resultado un anticuerpo humanizado con una secuencia más humana, que probablemente provoca menos inmunogenicidad en los pacientes. Los análisis de las secuencias de la CDR H2 revelaron que al reducir los residuos de aminoácido de ratón en el hzACO-1, se remueve un epítopo de célula T clase II
de MHC que contiene los aminoácidos de ratón y se reemplaza con uno completamente humano, que se espera que sea tolerado por los pacientes. Por consiguiente, esto confirmó que se espera que hzACO-1 sea menos inmunogénico que un anticuerpo ACO-1 humanizado injertado tradicional de CDR.
La afinidad del anticuerpo hzACO-1 se retuvo, dentro de dos veces la afinidad del anticuerpo ACO-1 de ratón, como se muestra en el ejemplo 8. Por consiguiente, no se requirieron retromutaciones adicionales de ratón. Adicionalmente, se ha retenido el perfil del subtipo de IFN-α del anticuerpo, enlazando y neutralizando todos los subtipos de IFN-α excepto el IFN-α1/D, como se describe en los ejemplos 8, 9 y 10. A pesar de contener menos aminoácidos de ratón en la CDR H2, fue idéntica la afinidad del hzACO-1 a la afinidad y potencia del anticuerpo de CDR H2 de hzACO-1-kabat, que contiene la CDR H2 de ratón de longitud completa del anticuerpo ACO-1 de ratón (Ejemplos 8 y 9, respectivamente).
Además, el reemplazo de la secuencia AQK en lugar de NEN en la posición 60-62 en la cadena pesada mediante el uso del método de humanización descrito tiene la ventaja de evitar dos asparaginas que son más propensas a la desamidación. La desamidación cambia la carga neta de las proteínas lo que puede afectar la estabilidad y/o la especificidad. Al mantener la secuencia AQK, se conservará mejor la homogeneidad de hzACO-1. La comparación del hzACO-1 con la versión de CDR H2 de hzACO-1-kabat injertado tradicionalmente con CDR, reveló que el hzACO-1 es una proteína altamente estable, mientras que el anticuerpo CDRH2 de hzACO-1-kabat tiene inesperadamente una tendencia a agregarse (ejemplo 11). La agregación se considera un problema serio en el desarrollo de fármacos, puesto que la agregación puede dar como resultado un menor rendimiento durante la producción, vida limitada en anaquel y una potencia reducida en los paciente debido a una mayor inmunogenicidad. Además, los niveles de expresión del constructo hzACO-1 fueron inesperadamente dos veces aquellos de la variante CDRH2 de hzACO-1-kabat (ejemplo 5).
En resumen, el anticuerpo IgG4 hzACO-1 se humanizó por un enfoque novedoso que resulta en un anticuerpo terapéutico con menos aminoácidos de ratón que es menos probable que cause inmunogenicidad en los pacientes. A pesar de que contiene menos amino ácidos del mAb original de ratón, este anticuerpo humanizado tenía una afinidad, potencia y perfil del subtipo IFN-α comparables al anticuerpo de ratón y una versión humanizada generada por injerto tradicional CDR. Además, el anticuerpo hzACO-1 es menos propenso a desamidación y tiene un mayor nivel de expresión. Por lo tanto, el anticuerpo hzACO-1 es una molécula estable y bien expresada adecuada para fabricación y administración a los pacientes.
Listado de secuencias
<110> Novo Nordisk A/S
<120> Anticuerpos humanizados contra interferón alfa humano
<130> 7815
<160> 32
<170> PatentIn versión 3.5
<210> 1
<211> 119
<212> PRT
<213> mus musculus
<400> 1
<210> 2
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 2
<210> 3
<211> 119
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia humanizada de murino
<400> 3
<210> 4
<211> 109
<212> PRT
<213> Mus Musculus
<400> 4
<210> 5
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 5
<210> 6
<211> 109
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia humanizada
<400> 6
<210> 7
<211> 119
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 7
<210> 8
<211> 113
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 8
<210> 9
<211> 109
<212> PRT
<213> mus musculus
<400> 9
<210> 10
<211> 109
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 10
<210> 11
<211> 19
10 <212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 11
ctgggccagg tgctggagg
19
5
<210> 12
<211> 25
<212> ADN
<213> artificial
<220>
10
<223> Cebador
<400> 12
ctaacactca ttcctgttga agctc
25
<210> 13
<211> 414
15
<212> ADN
<213> mus musculus
<400> 13
<210> 14
20 <211> 393
<212> ADN
<213> mus musculus
<400> 14
<210> 15
<211> 5
<212> PRT
<213> mus musculus
<400> 15
<210> 16
<211> 17
10 <212> PRT
<213> mus musculus
<400> 16
<210> 17
15 <211> 10
<212> PRT
<213> mus musculus
<400> 17
20 <210> 18
<211> 12
<212> PRT
<213> mus musculus
<400> 18
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> mus musculus
<400> 19
<210> 20
10 <211> 9
<212> PRT
<213> mus musculus
<400> 20
15 <210> 21
<211> 17
<212> PRT
<213> artificial
<220> 20 <223> Secuencia humanizada de murino
<400> 21
<210> 22
<211> 5
25 <212> PRT
<213> mus musculus
<400> 22
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> mus musculus
<400> 23
<210> 24
10 <211> 12
<212> PRT
<213> mus musculus
<400> 24
15 <210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> mus musculus
<400> 25
<210> 26
<211> 35
<212> ADN
<213> artificial
25 <220>
<223> Cebador
<400> 26
ctagctagct catttacccg gagaccggga gatgg
35
<210> 27
<211> 31
<212> ADN
5
<213> artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 27
gctctaacac tcattcctgt tgaagctctt g
31
10
<210> 28
<211> 414
<212> ADN
<213> Mus musculus
<400> 28
<210> 29
<211> 393
<212> ADN
<213> Mus musculus
20 <400> 29
<210> 30
<211> 166
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 30
<210> 31
<211> 220
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia humanizada
<400> 31
<210> 32
<211> 215
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia humanizada
<400> 32

Claims (13)

  1. Reivindicaciones
    1. Un anticuerpo humanizado anti-IFN-α, o un fragmento del mismo de enlazamiento al antígeno, que comprende las siguientes secuencias de CDR del VH:
    (a)
    una secuencia de CDR H1 que consiste de la SEQ ID NO: 15;
    (b)
    una secuencia de CDR H2 que consiste de la SEQ ID NO: 21; y
    (c)
    una secuencia de CDR H3 que consiste de la SEQ ID NO: 17;
    y comprende además las siguientes secuencias de CDR de VH:
    (d)
    una secuencia de CDR L1 que consiste de la SEQ ID NO: 18;
    (e)
    una secuencia de CDR L2 que consiste de la SEQ ID NO: 19; y
    (f)
    una secuencia de CDR L3 que consiste de la SEQ ID NO: 20.
  2. 2.
    Un anticuerpo o anticuerpo o fragmento del mismo de enlazamiento al antígeno de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo de enlazamiento al antígeno compite con y/o se enlaza al mismo epítopo en un subtipo de IFN-α como el anticuerpo ACO-1.
  3. 3.
    Un anticuerpo o fragmento del mismo de enlazamiento a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo de enlazamiento al antígeno es un subtipo IgG4.
  4. 4.
    El anticuerpo o fragmento del mismo de enlazamiento a antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo de enlazamiento al antígeno comprende un dominio VH que comprende la SEQ ID NO: 3 y un dominio VL que comprende la SEQ ID NO: 6.
  5. 5.
    El anticuerpo o fragmento del mismo de enlazamiento a antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo de enlazamiento al antígeno comprende un dominio VH que comprende una secuencia que contiene una mutación T30R de la SEQ ID NO: 3.
  6. 6.
    El anticuerpo o fragmento del mismo de enlazamiento a antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo de enlazamiento al antígeno comprende las mutaciones A93V de la SEQ ID NO: 3.
  7. 7.
    Una composición terapéutica que comprende un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1
  8. 6.
  9. 8.
    Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para uso en la prevención, manejo, tratamiento o mejoría de una enfermedad o trastorno autoinmune o inflamatorio relacionado con IFN-alfa seleccionado del grupo que consiste de: SLE, artritis reumatoide, artritis crónica juvenil, osteoartritis, espondiloartropatías; escleroderma, dermatomiositis, polimiositis, síndrome de Sjogren, vasculitis, vasculitis sistémica, sarcoidosis, pancitopenia inmune, hemoglobinuria paroxística nocturna, púrpura trombocitopénica idiopática, trombocitopenia mediada en forma inmune, enfermedad de Grave, SIDA, tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis linfocítica juvenil, tiroiditis atrófica, diabetes tipo I, glomerulonefritis, nefritis tubulointersticial, esclerosis múltiple, polineuropatía desmielinizante idiopática, síndrome de Guillain-Barre, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis D, hepatitis E, hepatitis activa crónica autoinmune, cirrosis biliar primaria, hepatitis granulomatosa, colangitis esclerosante, colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn, enfermedad celíaca, enteropatía sensible al gluten, enfermedad de Whipple, enfermedad bullosa de la piel, eritema multiforme, dermatitis de contacto, psoriasis, asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, hipersensibilidad a los alimentos, urticaria, neumonía eosinofílica, fibrosis pulmonar idiopática, neumonitis por hipersensibilidad, rechazo de injerto, y enfermedad de injerto contra huésped.
  10. 9.
    Uso de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 en la preparación de un medicamento para la prevención, manejo, tratamiento o mejoría de una enfermedad o trastorno autoinmune o inflamatorio relacionado con IFN-alfa seleccionado del grupo que consiste de: SLE, artritis reumatoide, artritis crónica juvenil, osteoartritis, espondiloartropatías, escleroderma, dermatomiositis, polimiositis, síndrome de Sjogren, vasculitis, vasculitis sistémica, sarcoidosis, pancitopenia inmune, SIDA, hemoglobinuria paroxística nocturna, púrpura trombocitopénica idiopática, trombocitopenia mediada en forma inmune, enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis linfocítica juvenil, tiroiditis atrófica, diabetes tipo I, glomerulonefritis, nefritis tubulointersticial, esclerosis múltiple, polineuropatía desmielinizante idiopática, síndrome de Guillain-Barre, polineuropatía desmielinizante inflamatoria
    crónica, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis D, hepatitis E, hepatitis activa crónica autoinmune, cirrosis biliar primaria, hepatitis granulomatosa, colangitis esclerosante, colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn, enfermedad celíaca, enteropatía sensible al gluten, enfermedad de Whipple, enfermedad bullosa de la piel, eritema multiforme, dermatitis de contacto, psoriasis, asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, hipersensibilidad a los alimentos, urticaria, neumonía eosinofílica, fibrosis pulmonar idiopática, neumonitis por hipersensibilidad, rechazo de injerto, y enfermedad de injerto contra huésped.
  11. 10.
    Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno autoinmune o inflamatorio asociado con la expresión anormal de al menos un subtipo de IFNalfa seleccionado del grupo que consiste en de los subtipos A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b y WA, en donde dicha enfermedad o trastorno se selecciona entre el grupo que consiste de: SLE, artritis reumatoide, artritis crónica juvenil, osteoartritis, espondiloartropatías; escleroderma, dermatomiositis, polimiositis, síndrome de Sjogren, vasculitis, vasculitis sistémica, sarcoidosis, pancitopenia inmune, hemoglobinuria paroxística nocturna, púrpura trombocitopénica idiopática, trombocitopenia mediada en forma inmune, enfermedad de Grave, SIDA, tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis linfocítica juvenil, tiroiditis atrófica, diabetes tipo I, glomerulonefritis, nefritis tubulointersticial, esclerosis múltiple, polineuropatía desmielinizante idiopática, síndrome de Guillain-Barre, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis D, hepatitis E, hepatitis activa crónica autoinmune, cirrosis biliar primaria, hepatitis granulomatosa, colangitis esclerosante, colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn, enfermedad celíaca, enteropatía sensible al gluten, enfermedad de Whipple, enfermedad bullosa de la piel, eritema multiforme, dermatitis de contacto, psoriasis, asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, hipersensibilidad a los alimentos, urticaria, neumonía eosinofílica, fibrosis pulmonar idiopática, neumonitis por hipersensibilidad, rechazo de injerto, y enfermedad de injerto contra huésped.
  12. 11.
    Uso de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para la preparación de un medicamento adecuado para el tratamiento de una enfermedad o trastorno autoinmune o inflamatorio asociado con la expresión anormal de al menos un subtipo de IFN-alfa seleccionado del grupo que consiste en de los subtipos A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b y WA, en donde dicha enfermedad o trastorno se selecciona entre el grupo que consiste de: SLE, artritis reumatoide, artritis crónica juvenil, osteoartritis, espondiloartropatías, escleroderma, dermatomiositis, polimiositis, síndrome de Sjogren, vasculitis, vasculitis sistémica, sarcoidosis, pancitopenia inmune, SIDA, hemoglobinuria paroxística nocturna, púrpura trombocitopénica idiopática, trombocitopenia mediada en forma inmune, enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis linfocítica juvenil, tiroiditis atrófica, diabetes tipo I, glomerulonefritis, nefritis tubulointersticial, esclerosis múltiple, polineuropatía desmielinizante idiopática, síndrome de Guillain-Barre, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis D, hepatitis E, hepatitis activa crónica autoinmune, cirrosis biliar primaria, hepatitis granulomatosa, colangitis esclerosante, colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn, enfermedad celíaca, enteropatía sensible al gluten, enfermedad de Whipple, enfermedad bullosa de la piel, eritema multiforme, dermatitis de contacto, psoriasis, asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, hipersensibilidad a los alimentos, urticaria, neumonía eosinofílica, fibrosis pulmonar idiopática, neumonitis por hipersensibilidad, rechazo de injerto, y enfermedad de injerto contra huésped.
  13. 12.
    Un anticuerpo para el uso de acuerdo con la reivindicación 8 o 10 o el uso de acuerdo con la reivindicación 9 o 11, en donde la enfermedad o el trastorno se selecciona entre el grupo que consiste en SLE, artritis reumatoide, SIDA, diabetes tipo I, y psoriasis.
ES09742079.8T 2008-05-07 2009-05-06 Anticuerpos humanizados contra interferón alfa humano Active ES2549903T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP08103847 2008-05-07
EP08103847 2008-05-07
PCT/EP2009/055448 WO2009135861A2 (en) 2008-05-07 2009-05-06 Humanized antibodies against human interferon-alpha

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2549903T3 true ES2549903T3 (es) 2015-11-03

Family

ID=40901961

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES09742079.8T Active ES2549903T3 (es) 2008-05-07 2009-05-06 Anticuerpos humanizados contra interferón alfa humano

Country Status (16)

Country Link
US (3) US8163885B2 (es)
EP (1) EP2279207B1 (es)
JP (1) JP5766598B2 (es)
KR (1) KR101687032B1 (es)
CN (1) CN102083859B (es)
AU (1) AU2009245792B2 (es)
BR (1) BRPI0912570B8 (es)
CA (1) CA2722622C (es)
ES (1) ES2549903T3 (es)
HK (1) HK1154251A1 (es)
IL (1) IL208979B (es)
MX (1) MX2010012052A (es)
RU (1) RU2532832C2 (es)
TW (1) TWI453032B (es)
WO (1) WO2009135861A2 (es)
ZA (1) ZA201008748B (es)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8080638B2 (en) 2005-02-10 2011-12-20 Baylor Research Institute Anti-interferon alpha monoclonal antibodies and methods for use
KR20140043402A (ko) * 2011-05-25 2014-04-09 메디뮨 엘엘씨 인터페론-알파에 대한 항체를 사용하여 전신홍반루푸스, 피부경화증 및 근육염을 치료하는 방법
US9366677B2 (en) * 2011-09-06 2016-06-14 Max-Planck-Gesellshaft Zur Foerderung Der Wissenschaften E.V. Methods for analyzing biological macromolecular complexes and use thereof
CA2906526C (en) * 2013-03-15 2022-12-06 Ellen Chi Interferon alpha and omega antibody antagonists
CA2917112C (en) * 2013-07-03 2022-07-05 Immunoqure Ag Human anti-ifn-alpha antibodies
TWI713453B (zh) 2014-06-23 2020-12-21 美商健生生物科技公司 干擾素α及ω抗體拮抗劑
US10689703B2 (en) * 2015-04-27 2020-06-23 National Jewish Health Methods of identifying and treating subjects having acute respiratory distress syndrome
CN108204958A (zh) * 2016-12-19 2018-06-26 伊缪泰普有限公司 结合测定
CN114728179A (zh) * 2019-08-19 2022-07-08 潘迪恩运营公司 利用pd-1激动剂的靶向免疫耐受
RU2737466C1 (ru) * 2019-12-30 2020-11-30 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) Гуманизированное нейтрализующее антитело к интерферону-бета человека
CN112500476B (zh) * 2020-12-16 2024-02-23 南京基蛋生物医药有限公司 一种扩增鼠单抗重轻链基因序列的方法及其引物和筛选该引物的方法
CN116355079B (zh) * 2022-08-19 2023-12-26 上海迈科康生物科技有限公司 检测重组人轮状病毒vp8抗原（vp8 p[8]）的单克隆抗体及其应用

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4423147A (en) 1980-04-11 1983-12-27 Secher David S Monoclonal antibody to interferon-α
US4362155A (en) 1981-03-24 1982-12-07 Skurkovich Simon V Method and apparatus for the treatment of autoimmune and allergic diseases
US4605394A (en) 1982-12-03 1986-08-12 Simon V. Skurkovich Methods for the treatment of pathological conditions by removing interferon from the organism
US4824432A (en) 1981-03-24 1989-04-25 S.V.S. Laboratories, Inc. Method for treating AIDS and other immune deficiencies and immune disorders
DE3211263A1 (de) 1981-03-31 1983-01-27 Otsuka Pharmaceutical Co. Ltd., Tokyo Human-interferon verwandte peptide, antigene und antikoerper, sowie verfahren zu deren herstellung
WO1984003106A1 (en) 1983-02-04 1984-08-16 Wadley Inst Of Molecular Medic Production and characterization of hybridoma antibodies directed specifically against common determinant(s) present among closely related, but distinct proteins
GB2148299B (en) 1983-09-01 1988-01-06 Hybritech Inc Antibody compositions of therapeutic agents having an extended serum half-life
FR2560212B1 (fr) 1984-02-24 1989-12-29 Unicet Anticorps monoclonaux contre l'interferon a2 et hybridomes produisant de tels anticorps
JPH05507614A (ja) 1991-04-17 1993-11-04 メデイサツプ・インターナシヨナル・エヌ・ブイ インターフェロンα及びβに対して高親和性を有する水溶性ポリペプチド
DE69214656T2 (de) 1991-08-30 1997-03-13 Genentech Inc Therapeutisches verfahren zur behandlung von iddm
EP0563487A1 (en) 1992-03-31 1993-10-06 Laboratoire Europeen De Biotechnologie S.A. Monoclonal antibodies against the interferon receptor, with neutralizing activity against type I interferon
US5821078A (en) 1992-09-03 1998-10-13 Yeda Research And Development Co. Ltd. Nucleic acid encoding interferon-α/β binding protein
US5888511A (en) 1993-02-26 1999-03-30 Advanced Biotherapy Concepts, Inc. Treatment of autoimmune diseases, including AIDS
US5780027A (en) 1995-07-14 1998-07-14 Meiogen Biotechnology Corporation Methods of treatment of down syndrome by interferon antagonists
IL118096A0 (en) 1996-05-01 1996-09-12 Yeda Res & Dev Antibodies against interferon alpha/beta receptor
US6713609B1 (en) 1996-07-16 2004-03-30 Genentech, Inc. Monoclonal antibodies to type I interferon receptor
WO1998006431A2 (en) 1996-08-16 1998-02-19 Osther Kurt B Method for treating diabetes
US5899921A (en) 1997-07-25 1999-05-04 Innovasive Devices, Inc. Connector device and method for surgically joining and securing flexible tissue repair members
US20030018174A1 (en) 1997-10-06 2003-01-23 Genentech, Inc. Monoclonal antibodies to IFNAR2
EP1115737A4 (en) 1998-09-23 2004-11-24 Cleveland Clinic Foundation NEW GENES STIMULATED OR REPRESSED BY INTERFERON
AUPP670698A0 (en) 1998-10-23 1998-11-19 Monash University A method of regulation
KR20000034847A (ko) 1998-11-17 2000-06-26 성재갑 인간 4-1비비 분자에 대한 인간화 항체 및 이를 포함하는 약학조성물
CN1454215B (zh) 1999-11-15 2013-01-02 米勒腾尼生物技术有限公司 树突状细胞特异的抗原结合片段、组合物及其使用方法、被其识别的抗原及由其获得的细胞
GB0001712D0 (en) 2000-01-25 2000-03-15 Pharma Pacific Pty Ltd Therapeutic peptides
GB0001710D0 (en) 2000-01-25 2000-03-15 Pharma Pacific Pty Ltd Therapeutic treatment
US6846486B1 (en) 2000-02-24 2005-01-25 Advanced Biotherapy Concepts, Inc. Method of treating allergy by administering an anti-histamine antibody
GB0013810D0 (en) * 2000-06-06 2000-07-26 Celltech Chiroscience Ltd Biological products
AU2001294577A1 (en) 2000-09-21 2002-04-02 Schering Corporation Methods for preparing interferon producing dentitric cells
US20020160974A1 (en) 2001-01-09 2002-10-31 Banchereau Jacques F. Methods for treating autoimmune diseases in a subject and in vitro diagnostic assays
DE20100503U1 (de) 2001-01-12 2001-05-10 Josef Schiele Ohg Beschichtungsvorrichtung für ein langgestrecktes Werkstück
US7087726B2 (en) 2001-02-22 2006-08-08 Genentech, Inc. Anti-interferon-α antibodies
FR2822845B1 (fr) 2001-03-30 2003-12-12 Genodyssee Nouveaux polynucleotides comportant des polymorphismes de type snp fonctionnels dans la sequence nucleotidique du gene ifn-alpha-21 ainsi que de nouveaux polypeptides codes par ces polynucleotides et leurs utilisations therapeutiques
MXPA04007583A (es) * 2002-02-11 2005-04-25 Genentech Inc Variantes de anticuerpo con tasas mas rapidas de asociacion a antigeno.
AU2003261071C1 (en) 2002-03-13 2008-12-11 Biogen Idec Ma Inc. Anti-AlphavBeta6 antibodies
US7538195B2 (en) 2002-06-14 2009-05-26 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
KR20050086628A (ko) 2002-11-15 2005-08-30 젠맵 에이/에스 Ｃｄ25에 대한 인간 모노클로날 항체
LT2418220T (lt) 2003-12-10 2017-10-10 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Interferono-alfa antikūnai ir jų panaudojimas
CN101035564A (zh) * 2004-09-10 2007-09-12 惠氏公司 人源化的抗5t4抗体和抗5t4抗体/加利车霉素缀合物
KR20070083809A (ko) 2004-10-07 2007-08-24 유니베르시태트 취리히 건선 예방 및 치료용 ⅰ형 인터페론 차단제
WO2008021976A2 (en) * 2006-08-09 2008-02-21 Baylor Research Institute Anti-interferon alpha monoclonal antibodies and methods for use
US8080638B2 (en) 2005-02-10 2011-12-20 Baylor Research Institute Anti-interferon alpha monoclonal antibodies and methods for use
US7888481B2 (en) 2005-02-10 2011-02-15 Baylor Research Institute Anti-interferon alpha monoclonal antibodies and methods for use

Also Published As

Publication number Publication date
BRPI0912570A2 (pt) 2016-04-26
TW200950807A (en) 2009-12-16
TWI453032B (zh) 2014-09-21
IL208979A0 (en) 2011-01-31
CN102083859B (zh) 2014-09-17
RU2010150105A (ru) 2012-06-20
US20110213125A1 (en) 2011-09-01
JP5766598B2 (ja) 2015-08-19
CN102083859A (zh) 2011-06-01
IL208979B (en) 2018-02-28
ZA201008748B (en) 2013-02-27
HK1154251A1 (zh) 2012-04-13
RU2532832C2 (ru) 2014-11-10
WO2009135861A3 (en) 2010-01-28
KR20110042264A (ko) 2011-04-26
EP2279207A2 (en) 2011-02-02
MX2010012052A (es) 2010-12-14
CA2722622C (en) 2018-01-02
CA2722622A1 (en) 2009-11-12
JP2011519571A (ja) 2011-07-14
BRPI0912570B8 (pt) 2021-05-25
KR101687032B1 (ko) 2016-12-15
BRPI0912570B1 (pt) 2021-04-06
WO2009135861A2 (en) 2009-11-12
US8163885B2 (en) 2012-04-24
AU2009245792B2 (en) 2012-11-01
EP2279207B1 (en) 2015-09-09
US8658771B2 (en) 2014-02-25
US20130101602A1 (en) 2013-04-25
US20120195888A1 (en) 2012-08-02
AU2009245792A1 (en) 2009-11-12
US8361463B2 (en) 2013-01-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2549903T3 (es) Anticuerpos humanizados contra interferón alfa humano
DK2426150T3 (en) ANTI-NKG2A ANTIBODIES AND APPLICATIONS THEREOF
US10189904B2 (en) Antibodies that bind and block triggering receptor expressed on myeloid cells-1 (TREM-1)
JP6893970B2 (ja) インターフェロンアルファ及びオメガ抗体アンタゴニスト
KR20110039218A (ko) 항－인간 인터루킨－２０ 항체
CA2662701A1 (en) Interleukin-13 binding proteins
US20180312584A1 (en) Anti-il-17a and il-17f cross reactive antibody variants and compositions comprising and methods of making and using same
JP2019081766A (ja) インターフェロンアルファ及びオメガ抗体アンタゴニスト
CA3091307A1 (en) Csf1r binding agents
ES2750209T3 (es) Anticuerpos que se unen a y bloquean al receptor desencadenante expresado en células mieloides-1 (TREM-1)
EP3999541A1 (en) Antibodies against human trem-1 and uses thereof
AU2013200711A1 (en) Interleukin -13 binding proteins