KR20110042264A - 인간 인터페론-알파에 대한 인간화 항체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간에서 치료 용도에 유용한 인간화 항-인간 IFN-α 모노클로날 항체를 제공한다. 바람직한 항체는 뮤린 항체 ACO-1 및 ACO-2, 및 그의 변이체의 인간화 버전이다.

Description

인간 인터페론-알파에 대한 인간화 항체{HUMANIZED ANTIBODIES AGAINST HUMAN INTERFERON-ALPHA}

본 발명은 인간 인터페론 알파 (IFN-α)에 대한 인간화 항체 및 인간 환자에서 다양한 질병 및 질환을 치료 또는 예방하는데 있어서 그의 용도에 관한 것이다.

다양한 상이한 관찰에 기초하여, 인터페론 알파 (IFN-α)는 많은 자가면역 질병에 관여되는 것으로 생각되는 시토킨이다. 전신 홍반성 루푸스 (SLE) 환자는 종종 측정가능한 혈청 수준의 IFN-α를 갖지 않지만, 명백한 IFN-α 유전자 시그너쳐 (signature)를 갖는 것으로 보인다. 또한, 수지상 세포 (DC)를 SLE 환자 혈청으로 처리함에 의한 DC 성숙의 유도는 항-IFN-α 항체에 의해 억제될 수 있다. SLE 표현형을 갖는 뉴질랜드 블랙 (New Zeeland Black: NZB) 마우스에서 IFN-α/β 수용체의 낙아웃 (knockout)은 정상에 가까운 표현형을 생성시키는 것으로 또한 나타났다 (Santiago-Raber et al., J Exp Med. 2003; 197(6):777-88).

따라서, IFN-α에 대한 항체는 단독으로 또는 조합으로 상기 자가면역 질병의 치료를 위한, 상기 시토킨의 활성을 중화시키는 도구 (tool)로서 제안되었다. 매우 다양한 상이한 IFN-α 하위형을 인식하는 특이적 뮤린 항체 (ACO-1 내지 ACO-6)가 WO2006/0086586로서 공개된 국제 특허 출원에 설명된 바와 같이 생성되고 특성 결정되었다. 그러나, 뮤린 항체는 그의 면역원성으로 인해 인간에 사용하기에 적합하지 않고, 따라서 뮤린 CDR이 인간 스캐폴드 (scaffold) 항체 상에 그라프팅 (grafting)되는 인간화 항체를 생성하는 것이 바람직하다. 그러나 인간화 항체는 종종 뮤린 모 항체에 비해, 예를 들어 보다 낮은 친화도 및/또는 안정성 및/또는 바람직하지 않은 면역원성과 같은 기능적 결핍으로 인해 불리하다. 인간화 항체에서 그러한 결핍은 일부 경우에 하나 또는 소수의 복귀 (back) 점 돌연변이를 일으킴으로써 보상될 수 있다. 너무 많은 복귀 돌연변이의 존재는 바람직하지 않은 낮은 안정성 및/또는 바람직하지 않은 정도의 면역원성을 생성시키는 경향이 있으므로, 복귀 점 돌연변이를 수행하지 않거나 단지 매우 소수의 복귀 점 돌연변이를 수행하는 것이 대체로 바람직하다. 따라서, 예를 들어 매우 많은 IFN-α 하위형에 대해 인간화 항-IFN-α 항체의 친화도 및 효력을 보유하는 것과 같은 바람직한 생물학적 특성을 갖는, 안전하고 안정한 인간화 항-IFN-α 항체를 제공하는 것이 바람직하다.

따라서, 당업계에서 예를 들어 안정성, 특이성, 안전성, 면역원성 등과 같은 특징에 관하여 바람직한 특징을 갖는 인간화 항-IFN-α 항체가 필요하다. 또한, 당업계에서 그러한 항체를 생산하기 위한 효율적인 방법이 필요하다.

발명의 개요

제1 측면에서, 본 발명은 인간 인터페론-α (IFN-α)에 특이적으로 결합하는 인간화 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이고, 여기서 인간화 항체는 Kabat에 따른 뮤린 상보성 결정 구역 (CDR)보다 더 소수의 공여자 아미노산 잔기를 포함하는, 뮤린 항체 ACO-1 또는 ACO-2, 또는 그의 조합물의 인간화 버전이다.

다른 측면에서, 본 발명은 또한 IFN-α에 특이적으로 결합하는 인간화 항체, 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이고, 여기서 상기 항체는 IFN-α 하위형 A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b 및 WA에 결합할 수 있으나, 하위형 1 또는 D에 결합하지 않고, 상기 항체는 Kabat에 따른 비-인간 CDR보다 더 소수의 공여자 아미노산 잔기를 포함한다.

본 발명은 또한 그러한 항체를 얻는 방법뿐만 아니라, 치료 목적을 위한 그러한 항체의 용도 및 그러한 항체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 항체는 다양한 염증성 질병의 치료를 위해 적합할 수 있다.

도 1은 인간화 (hz=인간화)를 위한 뮤린 ACO-1 VH (A) 및 VL (B) 서열의 분석을 도시한 것이고, 여기서 마스크 (mask)는 음영진 글자로 도시하고, Kabat CDR은 굵은 글자로 도시하고, 마우스 서열과 인간 생식계열 서열 사이의 차이는 밑줄친 글자로 도시하고, 잠재적인 체세포 과돌연변이된 (hypermutated) 잔기는 굵은 밑줄친 글자로 도시하고, 잠재적인 복귀-돌연변이 잔기는 음영진 밑줄친 글자로 도시한다. ACO-1 VH = 서열 1; 인간 생식계열 VH1_46/JH4 = 서열 2; hzACO-1 VH = 서열 3; ACO-1 VL = 서열 4; 인간 생식계열 VKIII_L6/JK2 = 서열 5; hzACO-1 VL = 서열 6.
도 2는 ACO-1 및 ACO-2 VH (A) 및 VL (B) 서열 사이의 정렬뿐만 아니라 상응하는 마우스 생식계열 서열을 도시한 것이다. ACO-2 VH = 서열 7; 마우스 생식계열 J558.33/D_/JH3_1 = 서열 8; ACO-2 VL = 서열 9; 마우스 생식계열 ae4/JK4_1 = 서열 10.
도 3은 hzACO-1 내로 도입을 위해 선택된 ACO-2 잔기의 위치를 보여준다.
도 4는 CPE 분석에서 IFN-αD 및 IFN-α1을 제외한 시험된 모든 인터페론 하위형의 보호 효과의 hzACO-1 억제를 보여준다.
도 5는 리포터 유전자 (RG) 분석에 의한 12개의 IFN-α 종의 hzACO-1 억제를 보여준다. 각각의 항체 농도에 대한 값을 표준화하고, 4개 반복의 평균을 계산하였다. 데이타는 평균+/-표준 오차로서 나타낸다. 최적합 (best fit) s자형 반응 곡선은 Prism 소프트웨어를 사용하여 계산하였다. R2 값은 0.98을 초과한 모든 데이타세트에 대한 것이었다 (곡선 피팅 (fitting)이 그에 대해 이루어지지 않은 IFN-αD 제외).
도 6은 IFN-αA (A) 또는 IFN-αF (B)를 사용한, 단일 ACO-2-유래된 돌연변이 A93V를 갖는 hzACO-1 변이체와 hzACO-1의 RG 분석 비교를 보여준다. 데이타 계산은 도 5에 설명된 바와 같이 이루어졌다.
도 7은 첨가제 없이, pH 3.5 (A), 4.5 (B) 및 5.5 (C)에서 hzACO-1 및 변이체에 대한 전이 온도를 보여준다.
도 8은 X-선 결정학에 의해 결정된, FN-α8에 결합된 hzACO-1 Fab 단편 사슬 (H, L)의 구조를 보여준다.
도 9는 IFN-α8 서열 아래의 색 상자에 의해 표시되는 바와 같은, IFNAR1 및 IFNAR2에 대한 IFN-α8 결합 에피토프를 보여준다 ([Quadt-Akabayov S.R. et al., Protein Sci. 15, 2656-2668, 2006] 및 [Roisman L.C et al., J. Mol. Biol. 353, 271-281, 2005]). 회색 색 상자로 표시된 잔기는 모든 IFN-α 하위형 사이에서 부분적으로 보존되는 한편, 흑색 색 상자에 의해 표시된 잔기는 완전히 보존된다. 4Å 거리 컷-오프 (cut-off)를 사용하여 IFN-α8 상의 hzACO-1 결합 에피토프를 IFN-α8의 아미노산 서열 위에 "*"로 표시한다.
도 10은 RG 분석에서 hzACO-1 및 그의 2개의 변이체에 대한 마우스 ACO-1 mAb의 비교를 보여준다. 하나의 변이체는 전체 CDRH2를 수용하는 인간화 ACO-1 (hzACO-1-kabat CDRH2로 지정됨)인 한편, hzACO-1은 실시예 2에 설명된 바와 같이 보다 짧은 CDRH2를 사용하여 구성되었다. 또한, 도면에서는 합리적인 설계를 통해 IFN-α와의 상호작용을 위해 최적화된 또다른 돌연변이된 hzACO-1 (hzACO-1 Y32E, T30R)을 보여준다. 이들 4가지 재조합 mAb 변이체를 지시된 바와 같이 5가지 상이한 대표적인 IFN-α 하위형의 억제에 관하여 비교하였다.
도 11은 인간 IgG1, IgG2 및 IgG4 이소형을 사용하여 발현된 hzACO-1의 단백질 안정성 연구를 보여준다. 응집은 히스티딘 버퍼 내에서 5주 동안 인큐베이션 후에 HPLC에 의해 결정하였다.
도 12는 상이한 효과기:표적 세포 비 (E:T)에서 hzACO-1 IgG4, IFN-α 및 그의 상이한 조합물에 의한 ADCC의 결여를 설명하는 ⁵¹Cr 방출 분석을 보여준다. IFN-α 또는 hzACO-1이 없이 세포 + PBMC 단독은 배경 용해를 결정하고, Triton-X 100은 최대 용해를 설명한다. 리툭산 (Rituxan)이 양성 대조군으로서 포함되었고, 모든 E:T 비에서 검출가능한 세포 용해를 유도한다.
도 13은 Elisa에 의한 보체 결합 연구를 보여준다. IgG4로서 발현된 hzACO-1은 IFN-α에 결합될 때 보체를 고정할 수 없었다. 양성 대조군으로서, hzACO-1은 항-IgG4 pAb와 교차결합되었고, 항-IgG4에 대한 C4의 명백한 용량 의존 결합이 검출되었다.

본 발명은 부분적으로 예를 들어, SLE와 같은 루푸스 질병 또는 질환; 이식편 대 숙주 질병; 1형 당뇨병, AIDS, 자가면역 갑상선염, 건선, 연소성 피부근염 및 쇼그렌 (Sjogren) 증후군과 같은 IFN-α-관련 병태 또는 질병에 걸린 인간 환자를 치료하기 위해 적합한 특성을 갖는 항-IFN-α 항체에 기초한다. 항체는 대개 뮤린 ACO-1 및/또는 ACO-2 항체의 인간화 버전을 기초로 한다.

ACO-1 및 ACO-2는 13종의 재조합 IFN-α 하위형뿐만 아니라, 바이러스 감염 시에 생산된 IFN의 2종의 복합 혼합물의 생물활성을 차단할 수 있는 것으로 확인되었다 (WO2006/086586 참조). ACO-1 및 ACO-2는 또한 마이크로어레이 (microarray) 분석에 의해 IFN-α 시그너쳐를 나타낸 SLE 환자로부터의 혈청의 생물활성을 일관적으로 차단하였다. ACO-1 및 ACO-2는 IFN-α 단백질 하위형 D 및 1의 생물활성을 유의하게 중화시키지 않았지만, SLE 혈청의 IFN-α 생물활성을 중화시켰다. 따라서, 이론에 제한되지 않지만, 하위형 D 및 1이 SLE의 병인에 유의하게 연관되지 않는 것이 가능하다.

실시예에서 설명된 바와 같이, 가변 구역의 구조 모델링에 의해 Kabat CDR보다 더 소수의 공여자 (뮤린) 잔기를 사용하여 ACO-1 및 ACO-2를 인간화하고, 따라서 인간 환자에서 이상 면역 반응에 대한 위험을 추가로 감소시키는 것이 가능함이 밝혀졌다. 분석으로 복귀-돌연변이에 유리한 부위를 또한 확인하였다. 가능하게는 ACO-1 및 ACO-2 가변 구역 사이의 높은 서열 유사성 (단지 13개의 부위에서만 상이함)으로 인해, 인간화 ACO-1 (hzACO-1) 서열 내의 특정 아미노산 잔기가 상응하는 위치의 ACO-2 잔기에 의해 치환될 수 있음이 추가로 밝혀졌다. CDR 구역 내에서, 돌연변이는 항체 서열을 인간화 수준이 낮도록 만들지 않으면서 정상적으로 이루어질 수 있다. 상기 인간화 절차는 인간화 항체의 기능적 특성, 예를 들어 친화도, 안정성, 발현 수준 및 IFN-α-억제 활성을 개선시켰다.

인간화 ACO-1 항체에서, hzACO-1 VH (서열 3) 내의 예시적인 돌연변이는 Kabat 넘버링 (numbering)을 이용하여 V5Q, T28S, M69L, R71V, T73K, S76I, S76N, T77I, V78A, Y79F 및 A93V 및 그의 임의의 조합을 포함한다. hzACO-1 VL (서열 6) 내의 예시적인 돌연변이는 E1Q, D29G, L33F, L47W, S50G, I58V 및 F71Y 및 그의 임의의 조합을 포함한다. 한 실시태양에서, hzACO-1 VH 구역은 T28S, N31S 및 A93V 중에서 선택된 돌연변이를 포함한다. 다른 실시태양에서, hzACO-1 VH 구역은 T28S, N31S 및 A93V와 그의 임의의 조합, 예를 들어, T28S와 N31S, T28S와 A93V, 및 N31S와 A93V 중에서 선택된 돌연변이를 포함한다. 다른 실시태양에서, hzACO-1 VH 구역은 T28S, N31S 및 A93V 또는 그의 조합, 예를 들어, T28S와 N31S, T28S와 A93V, 또는 N31S와 A93V 중에서 선택된 돌연변이; 및 적어도 하나의 추가의 돌연변이를 포함한다.

정의

본 발명의 이해를 돕기 위해, 많은 용어를 아래에 정의한다.

"ACO -1 및 ACO -2 항체"는 WO2006/0086586에 특성 결정되고 설명되어 있다. ACO-1은 ATCC 기탁 번호 PTA-6557 (WO2006/086586)로 기탁되고, ACO-2는 ATCC 기탁 번호 PTA-7778 (WO2008/021976)로 기탁되어 있다. 본 발명에 따른 항체는 ACO-1 및 ACO-2의 인간화 변이체이다. 그러나, 본 발명에 따른 ACO-1 및 ACO-2의 인간화 버전은 전장 뮤린 Kabat 서열을 포함하지 않는다. 바람직한 실시태양에서, 적어도 하나의 CDR 서열은 약 3-10개의 아미노산, 바람직하게는 3-8개, 보다 바람직하게는 4-7개의 아미노산의 말단절단 (truncation)을 포함한다. 항체는 바람직하게는 CDR H2에서 말단절단을 포함하고, 여기서 상기 CDR H2는 바람직하게는 3-10개, 바람직하게는 3-8개, 보다 바람직하게는 4-7개, 가장 바람직하게는 6개 아미노산이 말단절단된다. 그리고, 때때로 발생하는 점 돌연변이가 하나 이상의 CDR 서열 내에 및 인간 스캐폴드 항체 내에 도입될 수 있음도 사실이다. 그러나, 용어 "ACO-1 및 ACO-2 항체"는 결합 IFN-α 하위형 A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b 및 WA에 결합할 수 있으나, 하위형 1 또는 D에 결합하지 않는 임의의 IFN-α 항체를 추가로 포함할 수 있다. 그러나, ACO-1 및 ACO-2는 그들의 CDR 서열의 차이가 단지 소수의 아미노산이므로 그 자체로 단지 하나의 항체로서 인식될 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, ACO-1 및 ACO-2는 동일한 항체의 생체내 체세포 과돌연변이의 2개의 단계를 나타낸다는 것이 타당할 것 같다. 따라서, 본 발명에 따른 ACO-1/ACO-2 항체는 ACO-1 및 ACO-2의 CDR 서열과 적어도 90％의 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 92％, 가장 바람직하게는 적어도 95％의 동일성을 갖는 CDR 서열을 포함하는 인간화 항체이다.

용어: "CDR 말단절단", "전진 ( forward ) 돌연변이" 및 "CDR 의 단축 (shortening)"은 문서 전체에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 본 발명과 연관하여, 상기 용어는 일반적으로 CDR-말단절단이 연이은 많은 전진 돌연변이로서 인지될 수 있다는 사실을 나타내고 - 이는 단축된 뮤린 CDR 단편이 인간 프레임워크 상에 그라프팅될 수 있음을 의미한다. 보다 짧은 CDR의 그라프팅은 면역원성 정도가 감소된 항체를 생성시키는 경향이 있다는 사실은 놀랍지 않을 수 있으나, 예를 들어 안정성, 특이성 등과 같은 인간화 항체의 다른 유리한 특징이 보유될 수 있다는 것은 실제로 놀라운 것이다. "복귀 돌연변이"는 항상 프레임워크 (즉, CDR이 아닌) 내의 돌연변이를 나타내고, 복귀 돌연변이는 대개 예를 들어 항체 구조를 안정화시키기 위해 선택된 부위에서 하나 이상의 "뮤린" 아미노산 잔기의 도입이다.

용어 "인터페론 알파" (IFN-α)는 본원에서 사용될 때, 선천 면역성의 주요 효과기의 일부를 포함하는 단백질의 패밀리를 나타낸다. 인간 IFN-α의 적어도 15종의 공지된 하위형이 존재한다. IFN-α 단백질 하위형 및 상응하는 코딩 유전자의 명칭을 아래 표 1에 나열한다.

문헌 [Pestka et al., (1997) "Interferon Standardization and Designations" J Interferon Cytokine Res 17: Supplement 1, S9-S14]을 참조한다. IFN-αB2는 때때로 IFN-αB로도 칭해지고, IFN-β와 혼동되지 않아야 한다. 백혈구로부터의 천연 IFN-α (백혈구 IFN-), 및 재조합 인간 IFN-α 단백질 하위형은 피비엘 바이오메디컬 랩스 (PBL Biomedical Labs, 미국 뉴저지주 피츠카타웨이 (interferonsource.com))로부터 이용가능하다. 천연 IFN-α는 IFN-α 하위형의 복합 혼합물이다. ELISA 및 RIA와 같은 이들 인터페론을 검출하고 정량하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.

용어 "항체"는 본원에서 가장 넒은 의미로 사용되고, 구체적으로 전장 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 및 달리 진술되거나 문맥에서 모순되지 않으면 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 그의 항원 결합 단편, 항체 변이체 및 다중특이적 분자를 포함한다. 일반적으로, 전장 항체는 디술피드 결합에 의해 상호연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L), 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 당단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 구역 (본원에서 VH로 약칭함) 및 중쇄 불변 구역으로 이루어진다. 중쇄 불변 구역은 3개의 도메인, 즉, CH1, CH2 및 CH3으로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 구역 (본원에서 VL로 약칭함) 및 경쇄 불변 구역으로 이루어진다. 경쇄 불변 구역은 하나의 도메인, 즉, CL로 이루어진다. VH 및 VL 구역은 프레임워크 구역 (FR)로 불리는 보다 보존되는 구역이 산재되는 상보성 결정 구역 (CDR)으로 불리는 초가변성 구역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단에서 카르복시-말단 쪽으로 다음 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어진다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 구역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다.

항체의 "항원 결합 단편"은 항원에 검출가능하게 결합할 수 있는 전장 항체의 일부를 포함하는 분자이다. 항원-결합 단편은 항체의 1, 2 또는 3개 이상의 항원-결합 부분을 포함하는 다가 분자, 및 VL 및 VH 구역, 또는 그의 선택된 부분이 합성 링커 (linker)에 의해 또는 재조합 방법에 의해 연결되어 기능적 항원 결합 분자를 형성하는 단일쇄 구성체를 포함한다.

용어 "항체 유도체" 및 "면역접합체"는 전장 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 분자를 나타내도록 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 여기서 하나 이상의 아미노산이 예를 들어 항체를 제2 분자에 연결하기 위해, 예를 들어 알킬화, PEG화, 아실화, 에스테르 형성 또는 아미드 형성 등에 의해 화학적으로 변형된다. 예시적인 변형은 PEG화, 시스테인-PEG화, 비오티닐화, 방사선 표지, 및 제2 물질, 예를 들어 검출가능한 물질 또는 세포독성제와의 접합을 포함한다.

"다중특이적 분자"는 적어도 하나의 다른 기능적 분자 (예를 들어, 또다른 펩티드 또는 단백질, 예를 들어 또다른 항체 또는 수용체에 대한 리간드)와 회합되거나 그에 연결되어 적어도 2개의 상이한 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 분자를 생성하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 예시적인 다중특이적 분자는 이중특이적 항체, 및 가용형 수용체 단편 또는 리간드에 연결된 항체를 포함한다.

"인간화" 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열 (CDR 구역)을 함유하는 인간/비-인간 키메라 항체이다. 따라서, 인간화 항체는 수여자의 초가변 구역으로부터의 잔기가 목적하는 특이성, 친화도 및 성능을 갖는 비-인간 종 (공여자 항체), 예를 들어 마우스, 래트, 토끼, 또는 비-인간 영장류의 초가변 구역으로부터의 잔기로 치환되는 인간 면역글로불린 (수여 항체)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 FR 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 교체된다. 또한, 인간화 항체는 수여 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 추가로 개선하기 위해 이루어질 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나의, 대개 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프 (loop)는 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 잔기는 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체는 임의로 적어도 면역글로불린 불변 구역 (Fc)의 일부, 대개 인간 면역글로불린의 것을 또한 포함할 수 있다.

용어 "초가변 구역"은 본원에서 사용될 때, 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 나타낸다. 초가변 구역은 일반적으로 "상보성 결정 구역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 (경쇄 가변 도메인 내의 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3), 및 중쇄 가변 도메인 내의 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3); [Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 잔기 (경쇄 가변 도메인 내의 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3), 및 중쇄 가변 도메인 내의 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3); [Chothia and Lesk, J. Mol. Biol 1987; 196:901-917])를 포함한다. 일반적으로, 상기 구역 내의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에 기재된 방법에 의해 수행한다. "Kabat 위치", "Kabat 잔기" 및 "Kabat에 따른"과 같은 어구는 본원에서 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 대한 상기 넘버링 시스템을 나타낸다. Kabat 넘버링 시스템을 사용하여, 펩티드의 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 CDR의 단축 또는 그 내부로의 삽입에 상응하는 보다 소수의 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 CDR H2의 잔기 52 뒤에 아미노산 삽입 (Kabat에 따른 잔기 52a, 52b 및 52c) 및 중쇄 FR 잔기 82 뒤에 삽입된 잔기 (예를 들어, Kabat에 따른 잔기 82a, 82b 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 Kabat 넘버링은 항체 서열의 상동성 구역에서 "표준" Kabat 넘버링된 서열과의 정렬에 의해 제시된 항체에 대해 결정될 수 있다.

"프레임워크 구역" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 정의된 CDR 이외의 VH 또는 VL 잔기이다.

2개의 실질적으로 동일한 아미노산 서열에서 "상응하는" 아미노산 위치는 본원에서 언급된 임의의 단백질 분석 소프트웨어에 의해, 대개 디폴트 파라미터를 사용하여 정렬된 것이다.

"단리된" 분자는 그가 속하는 분자의 클래스에 관하여 발견되는 조성물 내의 우세한 종인 분자이다 (즉, 이는 조성물 내의 분자의 종류의 적어도 약 50％를 구성하고, 대개 조성물 내의 분자, 예를 들어, 펩티드의 종의 적어도 약 70％, 적어도 약 80％, 적어도 약 85％, 적어도 약 90％, 적어도 약 95％ 이상을 구성할 것이다). 일반적으로, 항체 분자의 조성물은 조성물 내의 모든 존재하는 펩티드 종의 문맥에서 또는 적어도 제안된 용도의 문맥에서 실질적으로 활성인 펩티드 종에 관하여 항체 분자에 대해 98％, 98％, 또는 99％ 균질성을 나타낼 것이다.

용어 "선택적으로 중화하다" 및 "선택적으로 중화하는"은 본원에서 사용될 때, 하나 이상의 IFN-α 단백질 하위형의 생물활성의 적어도 약 40％, 적어도 약 50％, 또는 적어도 약 60％를 선택적으로 중화시키지만, 또다른 IFN-α 단백질 하위형의 적어도 하나의 생물활성을 유의하게 중화시키지 않는, 단리되고 정제된 항체 (예를 들어 모노클로날 항체 (이로 제한되지 않음)), 또는 그의 항원 결합 단편을 나타내고, 여기서 생물활성은 예를 들어 MxA 프로모터의 활성화 및/또는 항바이러스 활성일 수 있다.

본 발명의 문맥에서, "치료" 또는 "치료하는"은 문맥에서 모순되지 않으면, 질병 또는 질환의 하나 이상의 증상 또는 임상학상 관련된 징후를 예방, 완화, 관리, 치유 또는 감소시키는 것을 나타낸다. 예를 들어, 질병 또는 질환의 증상 또는 임상학상 관련된 징후가 확인되지 않은 환자의 "치료"는 보호 또는 예방 요법인 반면, 질병 또는 질환의 증상 또는 임상학상 관련된 징후가 확인된 환자의 "치료"는 일반적으로 보호 또는 예방 요법을 구성하지 않는다.

어구 "IFN -α-관련 병태 또는 질병"은 본원에서 사용될 때, 환자의 혈청 내에서 상승된 수준의 IFN-α와 관련된 이상 상태, 질병, 또는 전-임상 질병 상태를 나타낸다. 그러한 질병 또는 질환의 예는 루푸스 질병 또는 질환, 예를 들어 SLE, 이식편 대 숙주 질병 (GVHD), 1형 당뇨병, AIDS (인간 면역결핍 바이러스 (HIV)에 의해 유발된), 자가면역 갑상선염 및 건선을 포함하고 이로 제한되지 않는다. IFN-α의 수준을 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.

인간화 항- IFN -α 항체

본 발명의 항체는 특정 기능적 및/또는 구조적 특징 또는 특성을 특징으로 하는, 항-IFN-α 마우스 항체 ACO-1 또는 ACO-2, 그의 변이체, 및/또는 그의 항원 결합 단편의 인간화 버전이다. 재조합 항체는 적합한 숙주 세포주 내에서 표준 기술에 의해 생산되고, 아래에 설명된 바와 같이 그의 기능적 활성을 평가하기 위해 다양한 분석에 의해 특성 결정될 수 있다. 실제로, 본 발명에 따른 IFN-알파 항체가 전통적인 방식으로 인간화된 IFN-알파 항체에 비해 유의하게 개선된 수율로 생산될 수 있는 것으로 나타났다.

소위 "최적합" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열을 그러한 공지된 인간 가변-도메인 서열의 라이브러리 (library) 또는 인간 생식계열 서열의 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 이어서, 설치류의 것에 가장 가까운 인간 서열은 인간화 항체를 위한 인간 프레임워크 구역으로서 인정될 수 있다 ([Sims et al., J. Immunol. 1993;151: 2296 et seq.]; [Chothia et al., Chothia and Lesk, J. Mol. Biol 1987; 196:901-917]). 또다른 방법에서는 특정 하위군의 경쇄 또는 중쇄의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정 프레임워크 구역을 사용한다. 몇몇 상이한 인간화 항체에 대해 동일한 프레임워크가 사용될 수 있다.

본 발명의 항체에서 사용하기 위해 바람직한 프레임워크 서열은 ACO-1 또는 ACO-2에 의해 사용된 프레임워크 서열에 구조적으로 유사하다. 따라서, 한 실시태양에서, 본 발명은 인간 VH1_46 유전자 및 인간 JH4 유전자로부터 유래된 VH 프레임워크 잔기, 및 인간 VKIII_L6 유전자 및 인간 JK2 유전자로부터 유래된 VL 프레임워크 잔기를 포함하고, 인간 IFN-α에 특이적으로 결합하는 인간화 ACO-1 또는 ACO-2 항체를 제공한다.

아래 실시예 1은 그러한 프레임워크 서열을 포함하는 예시적인 인간화 ACO-1 항체인 hzACO-1의 설계를 설명한다.

기능적 특성

본 발명의 인간화 항체는 IFN-α 하위형 A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b, 및 WA에 특이적으로 결합한다 (표 2). 한 실시태양에서, 본 발명의 인간화 ACO-1 또는 ACO-2 항체는 IFN-α 단백질 하위형, 예를 들어 IFN-αA에 고친화도로, 예를 들어 약 10^-7 M 이하의 KD, 약 10^-8 M 이하의 KD, 약 5x10^-9 M 이하의 KD, 또는 약 2x10^-9 M 이하의 KD로 결합한다. 한 실시태양에서, 인간화 항체는 IFN-αA, IFN-αF, 및/또는 또다른 IFN-α 단백질 하위형에 hzACO-1에 상당하거나 더 높은 친화도로 결합하는 hzACO-1 변이체이다.

예를 들어, IFN-αA 단백질 하위형에 대한 hzACO-1 변이체의 KD 및 hzACO-1의 KD 사이의 비는 약 1.0, 약 0.8, 약 0.7, 또는 약 0.6일 수 있다. 다른 실시태양에서, 인간화 항체는 재조합 방식으로 생산된 ACO-1에 상당하거나 그보다 더 높은 친화도로 IFN-αA, IFN-αF 및/또는 또다른 IFN-α 단백질 하위형에 결합하는 hzACO-1 변이체이다. 다른 실시태양에서, 인간화 항체는 하이브리도마 (hybridoma)에서 생산된 ACO-1에 상당하거나 그보다 더 높은 친화도로 IFN-αA, IFN-αF 및/또는 또다른 IFN-α 단백질 하위형에 결합하는 hzACO-1 변이체이다.

또한, 본 발명의 인간화 항체는 하나 이상의 IFN-α 단백질 하위형의 생물활성을 선택적으로 중화할 수 있다. 예를 들어, 인간화 ACO-1 또는 ACO-2 변이체는 대조군에 비해 IFN-α 단백질 하위형 A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b, 또는 WA, 또는 그의 임의의 조합의 생물활성의 적어도 약 40％, 적어도 약 50％, 또는 적어도 약 60％를 선택적으로 중화할 수 있다. 특정 실시태양에서, 인간화 항체는 IFN-α 하위형 D 및/또는 1의 생물활성을 유의하게 중화시키지 않는다. 예시적인 생물활성은 MxA 프로모터의 활성화, 항바이러스 활성, 또는 둘 모두를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 그러한 IFN-α 생물활성을 중화시키는 인간화 항체의 능력은 예를 들어 본원에서 설명되는 리포터 유전자 (RG), 세포병변 억제 (CPE) 분석을 이용하여 평가할 수 있다. 한 실시태양에서, 인간화 항체는 RG 분석에서 hzACO-1의 IC50에 상당하거나 그보다 더 낮은 IC50을 갖는 hzACO-1 변이체이다. 특정 실시태양에서, hzACO-1 변이체는 RG 분석에서 hzACO-1의 IC50보다 더 낮은 IC50을 갖는다.

한 실시태양에서, 본 발명의 인간화 항체는 ACO-1 및/또는 ACO-2와 IFN-α 단백질 하위형 상의 동일한 에피토프와 경쟁하고/하거나 결합한다. 그러한 항체는 본원에서 설명되는 바와 같은 표준 IFN-α 결합 분석에서 ACO-1 및/또는 ACO-2와 교차-경쟁하는 그의 능력에 기초하여 확인할 수 있다. 하나 이상의 IFN-α 단백질 하위형에 대한 ACO-1 또는 ACO-2의 결합을 억제하는 시험 인간화 항체의 능력은 시험 항체가 IFN-α에 대한 결합을 위해 ACO-1 또는 ACO-2와 경쟁할 수 있고, 따라서 ACO-1 및/또는 ACO-2와 IFN-α 단백질 하위형 상의 동일한 에피토프에 결합할 수 있음을 입증한다 (WO02/066649 및 WO2005/059106). 특정 실시태양에서, 인간화 항체는 임의의 뮤린 모노클로날 항체 9F3, 및 MMHA-1, -2, -3, -6, -8, -9, -11, -13 및 -17 (피비엘 바이오메디컬 래보래토리스, 미국 뉴저지주) 및/또는 인간 모노클로날 항체 13H5, 13H7 및 7H9와 상이한 인간 IFN-α 에피토프에 결합하고/하거나, 하나 이상의 나열된 뮤린 및 인간 모노클로날 항체보다 ACO-1 또는 ACO-2와 더 많이 교차-경쟁한다.

한 실시태양에서, 본 발명에서 제공되는 hzACO-1, hzACO-2, hzACO-1 변이체 또는 hzACO-2 변이체는 Kabat에 따른 뮤린 CDR을 포함하는 인간화 ACO-1 (Kabat ACO-1) 또는 ACO-2 항체에 상당하거나 그보다 더 낮은 면역원성을 갖는다. 인간화 항체의 면역원성은 예를 들어 그 전부가 본원에 참고로 포함된 문헌 [Wadwha et al., Dev Biol (Basel). 2005; 122:155-70)]에 기재된 하나 이상의 방법에 의해 평가할 수 있다.

추가의 측면에서, 본 발명의 인간화 항체는 인간 환자에 투여하기 위해 적합한 제형 내에서 안정하다. 한 실시태양에서, 본 발명에 따른 인간화 ACO-1 또는 ACO-2 항체는 적어도 전장 뮤린 Kabat 서열을 포함하는 전통적인 방식으로 인간화된 IFN-알파 항체만큼 안정하다. 항체의 안정성은 실시예 11에 기재된 써모플루오르 (Thermofluor) 분석을 포함한 당업계의 공지의 방법을 이용하여 평가할 수 있다.

본 발명의 바람직한 인간화 항체는 적어도 하나, 보다 바람직하게는 2, 3, 4, 5개 이상의 다음 특성을 보인다: (a) IFN-α 하위형 A, 2, B2, C, F, G, H2, I, JI, K, 4a, 4b, 및 WA에 특이적으로 결합하고; (b) IFN-α 단백질 하위형 A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b, 또는 WA; 그의 임의의 조합, 또는 그 전부의 하나 이상의 생물활성을 선택적으로 중화시키고; (c) IFN-α1 또는 D의 생물활성을 유의하게 중화시키지 않고; (d) ACO-1 및/또는 ACO-2와 IFN-α 단백질 하위형 상의 동일한 에피토프와 경쟁하고/하거나 그에 결합하고; (e) 임의의 9F3, 13H5, 13H7 및 7H9보다 ACO-1 또는 ACO-2와 더 많이 경쟁하고; (f) Kabat에 따른 뮤린 CDR을 포함하는 hzACO-1 또는 hzACO-2 항체보다 면역 반응을 유발할 가능성이 더 작고; (g) 제약 제형 내에서 안정하고; (h) 적어도 하나의 IFN-α 단백질 하위형 A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b, 또는 WA에 10^-8 M 이하의 KD로 결합한다.

구조적 특성

본 발명의 바람직한 항체는 뮤린 모노클로날 항체 ACO-1 및 ACO-2의 인간화 버전이다. 그러한 항체는 실시예에 설명된 바와 같이 생산하고, 단리하고, 구조 및 기능적으로 특성 결정할 수 있다. ACO-1, hzACO-1 및 ACO-2의 전장, 가변 구역, 및 Kabat CDR 서열을 표 3에 제시하고, 도 1-3에 설명한다.

hzACO-1 CDR H1, H3, L1, L2, 및 L3의 서열은 상응하는 ACO-1 서열과 동일하다. ACO-2 CDR H3 및 L3은 상응하는 ACO-1 CDR 서열과 동일하다. hzACO-1 CDR_H2 서열에서 이탤릭체로 제시된 아미노산은 전통적인 방식으로 인간화된 항체 내의 인간 프레임워크 서열에 상응하고, 전장 Kabat 서열은 ACO-1 CDR_H2 서열에 상응하고, 여기서 모든 아미노산은 뮤린 항체로부터 유래한다.

한 측면에서, 본 발명은 Kabat CDR보다 더 소수의 공여자 잔기, 즉, kabat CDR의 그라프팅에 의해 생산된 인간화 ACO-1 또는 ACO-2 항체보다 더 소수의 뮤린 잔기를 갖는 뮤린 ACO-1 및 ACO-2 항체의 인간화 버전을 제공한다.

한 실시태양에서, 인간화 항체는 인간 IFN-α에 특이적으로 결합하고, Kabat에 따른 뮤린 상보성 결정 구역 (CDR)보다 더 소수의 공여자 아미노산 잔기를 포함하는 뮤린 항체 ACO-1 또는 ACO-2, 또는 그의 조합의 인간화 버전이다. CDR H2 서열은 예를 들어 Kabat 잔기 50-65, 50-64, 50-63, 50-62, 50-61, 또는 50-60에 상응하는 것보다 더 소수의 공여자 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. CDR H2 공여자 잔기는 Kabat 잔기 50-59를 포함할 수 있다. 추가로 또는 별법으로, CDR H2 공여자 아미노산 잔기는 Kabat 잔기 50-59로 이루어질 수 있다. Kabat 잔기 50-59는 서열 16, 21, 및 23의 잔기 1-11에 상응한다. 한 실시태양에서, 나머지 VH CDR은 Kabat CDR (도 1-3 참조), 즉, Kabat 잔기 31-35에 상응하는 공여자 아미노산 잔기를 포함하는 CDR H1 서열, 및 Kabat 잔기 95-102에 상응하는 공여자 아미노산 잔기를 포함하는 CDR H3 서열을 포함하거나 그로 이루어질 수 있다.

한 실시태양에서, 인간화 ACO-1 또는 ACO-2 항체는 ACO-1 경쇄 (VL)의 가변 구역의 Kabat 잔기 24-34에 상응하는 공여자 아미노산 잔기를 포함하는 CDR L1, ACO-1 VL 구역의 Kabat 잔기 50-56에 상응하는 공여자 아미노산 잔기를 포함하는 CDR L2, 및 ACO-1 VL 구역 (서열 4) 또는 ACO-2 VL 구역 (서열 9)의 Kabat 잔기 89-97에 상응하는 공여자 아미노산 잔기를 포함하는 CDR L3을 포함할 수 있다. 추가로 또는 별법으로, 항체는 Kabat 잔기 24-34로 이루어지는 CDR L1 공여자 아미노산 잔기, Kabat 잔기 50-56으로 이루어지는 CDR L2 공여자 잔기, 및 Kabat 잔기 89-97로 이루어지는 CDR L3 공여자 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 상응하는 아미노산 서열을 표 3에 제시한다.

한 측면에서, 본 발명은 특이적 인간화 ACO-1 항체를 제공한다. 인간화 ACO-1 항체는 인간 IFN-α에 특이적으로 결합하고, 선택적 N31S 돌연변이를 가지면서 서열 3의 Kabat 잔기 31-35, 50-65, 및 95-102의 서열에 실질적으로 동일한 VH CDR 서열을 포함한다. 항체는 예를 들어 서열 15를 포함하는 CDR H1 서열; 서열 21을 포함하는 CDR H2 서열; 및 서열 17을 포함하는 CDR H3 서열을 포함할 수 있다. 추가로 또는 별법으로, 항체는 서열 15로 이루어지는 CDR H1 서열; 서열 21로 이루어지는 CDR H2 서열; 및 서열 17로 이루어지는 CDR H3 서열을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 인간화 ACO-1은 인간 VH1_46 유전자 및/또는 인간 JH4 유전자로부터 유래된 VH 프레임워크 잔기, 바람직하게는 둘 모두를 포함한다. 특정 실시태양에서, 인간화 항체는 서열 3에 상응하는 VH 서열을 포함한다.

인간화 ACO-1 항체는 서열 6의 Kabat 잔기 24-34, 50-56, 및 89-97의 서열에 실질적으로 동일한 VL CDR 서열을 추가로 포함할 수 있다. 항체는 예를 들어 서열 18을 포함하는 CDR_L1 서열; 서열 19를 포함하는 CDR_L2 서열; 및 서열 20을 포함하는 CDR_L3 서열을 포함할 수 있다. 추가로 또는 별법으로, 항체는 서열 18로 이루어지는 CDR_L1 서열; 서열 19로 이루어지는 CDR_L2 서열; 및 서열 20으로 이루어지는 CDR_L3 서열을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 인간화 ACO-1 항체는 인간 VKIII_L6 유전자 및/또는 인간 JK2 유전자로부터 유래된 VL 프레임워크 잔기, 바람직하게는 둘 모두를 포함한다. 특정 실시태양에서, 인간화 항체는 서열 6에 상응하는 VL 서열을 포함한다.

한 측면에서, 본 발명은 ACO-2의 CDR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 항체는 인간 IFN-α에 특이적으로 결합할 수 있고, 서열 7의 Kabat 잔기 31-35, 50-59, 및 95-102의 서열에 실질적으로 동일한 VH CDR 서열을 포함한다. 한 실시태양에서, 항체는 서열 22를 포함하는 CDR_H1 서열; 서열 23을 포함하는 CDR_H2 서열; 및 서열 17을 포함하는 CDR_H3 서열을 포함한다. 추가의 또는 별도의 실시태양에서, 항체는 서열 22로 이루어지는 CDR_H1 서열; 서열 23으로 이루어지는 CDR_H2 서열; 및 서열 17로 이루어지는 CDR_H3 서열을 포함한다. 항체는 서열 9의 잔기 Kabat 잔기 24-34, 50-56, 및 89-97의 서열에 실질적으로 동일한 VL CDR 서열을 추가로 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 항체는 서열 24를 포함하는 CDR_L1 서열; 서열 25를 포함하는 CDR_L2 서열; 및 서열 20을 포함하는 CDR_L3 서열을 포함한다. 추가로 또는 별법으로, 항체는 서열 24로 이루어지는 CDR_L1 서열; 서열 25로 이루어지는 CDR_L2 서열; 및 서열 20로 이루어지는 CDR_L3 서열을 포함한다. 항체는 한 측면에서 인간화 ACO-2 항체일 수 있다.

인간화 ACO-1 또는 ACO-2 항체는 적어도 인간 Fc-구역의 일부를 추가로 포함할 수 있다 (항체가 임의의 Fc-부분을 포함하지 않는 항원 결합 단편이 아니라면). 일반적으로, Fc-구역의 크기는 항체의 목적하는 약동학적 특성을 달성하도록 선택된다; Fc-부분이 클수록 청소가 더 느리다. 한 실시태양에서, 인간화 항체는 바람직하게는 IgG4 이소형 Fc-구역을 포함하는 전장 항체이다. 특정 실시태양에서, IgG4 Fc-구역은 Kabat에 따른 넘버링에서 S241P 돌연변이를 포함하고; 이는 EU 넘버링 시스템에 따른 잔기 228에 상응한다 (Edelman G.M. et al., Proc. Natl. Acad. USA 63, 78-85 (1969)).

ACO-1 및 ACO-2가 모두 IFN-α에 결합할 수 있고 유사한 것을 감안하면, 인간화 VH 및 VL 서열은 본 발명의 다른 항-IFN-α 결합 분자를 생성하기 위해 "혼합 및 매치 (mixed and matched)"될 수 있다. 그러한 "혼합 및 매치된" 항체의 IFN-α 결합은 본원에 기재된 결합 분석 (예를 들어, 유동 세포측정, 비아코어 (Biacore), ELISA)을 이용하여 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 기능적 분석을 이용하여 시험할 수 있다. 바람직하게는, VH 및 VL 사슬이 혼합 및 매치될 때, 특정 VH/VL 쌍으로부터의 VH 서열이 구조적으로 유사한 VH 서열로 교체된다. 마찬가지로, 특정 VH/VL 쌍으로부터의 VL 서열은 바람직하게는 구조적으로 유사한 VL 서열로 교체된다.

따라서, 한 측면에서, 본 발명은 (a) ACO-1 또는 ACO-2 VH CDR을 포함하는 VH 구역, 및 (b) ACO-1 또는 ACO-2 VL CDR을 포함하는 VL 구역을 포함하는 인간화 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 제공하고; 여기서 항체는 IFN-α에 특이적으로 결합한다. 바람직한 중쇄 및 경쇄 조합은 (a) 임의로 서열 16의 5개의 C-말단 아미노산의 일부 또는 전부를 제외한, 서열 15-17을 포함하는 VH 구역, 및 (b) 서열 18-20을 포함하는 경쇄 가변 구역; (a) 임의로 서열 16의 5개의 C-말단 아미노산의 일부 또는 전부를 제외한, 서열 15-17을 포함하는 VH 구역, 및 (b) 서열 24, 25 및 20을 포함하는 경쇄 가변 구역; (a) 임의로 서열 23의 5개의 C-말단 아미노산의 일부 또는 전부를 제외한, 서열 22, 23 및 17을 포함하는 VH 구역, 및 (b) 서열 18-20을 포함하는 경쇄 가변 구역; 및 (a) 임의로 서열 23의 5개의 C-말단 아미노산의 일부 또는 전부를 제외한, 서열 22, 23 및 17을 포함하는 VH 구역, 및 (b) 서열 24, 25 및 20을 포함하는 경쇄 가변 구역을 포함한다. 다른 바람직한 중쇄 및 경쇄 조합은 (a) 서열 3의 서열을 포함하는 VH 구역 및 (b) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL 구역; (a) 서열 15, 21 및 17을 포함하는 VH 구역 및 (b) 서열 18-20을 포함하는 VL 구역; 및 (a) 서열 15, 21 및 17을 포함하는 VH 구역 및 (b) 서열 24, 25 및 20을 포함하는 VL 구역을 포함한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 ACO-1 또는 ACO-2의 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3, 또는 그의 조합을 포함하는 항체를 제공한다. 각각의 이들 항체가 IFN-α에 결합할 수 있고, 항원 결합 특이성은 주로 CDR1, 2 및 3 구역에 의해 제공되는 것을 감안하면, CDR H1, H2 및 H3 서열 및 CDR L1, L2 및 L3 서열은 본 발명의 다른 항-IFN-α 결합 분자를 생성하기 위해 "혼합 및 매치될" 수 있다 (즉, 각각의 항체는 CDR H1, H2 및 H3 및 CDR L1, L2 및 L3을 함유할 수 있지만 상이한 항체로부터의 CDR이 혼합 및 매치될 수 있다). 그러한 "혼합 및 매치된" 항체의 IFN-α-결합은 아래 및 실시예에 기재된 결합 분석 (예를 들어, 유동 세포측정, 비아코어, 또는 ELISA)를 이용하여 시험할 수 있다. 바람직하게는, VH CDR 서열이 혼합 및 매치될 때, 특정 VH 서열로부터의 CDR H1, H2 및/또는 H3 서열이 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 교체된다. 마찬가지로, VL CDR 서열이 혼합 및 매치될 때, 특정 VL 서열로부터의 CDR L1, L2 및/또는 L3 서열은 바람직하게는 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 교체된다. 예를 들어, ACO-1 및 ACO-2의 CDR은 실질적인 구조적 유사성을 공유하고, 따라서 혼합 및 매치될 수 있다.

따라서, 또다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 15 및 22로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR H1; (b) 적어도 서열 16 및 23의 잔기 1-12로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR H2, (c) 서열 17을 포함하는 CDR H3; (d) 서열 18 및 24로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR L1; (e) 서열 19 및 25로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR L2; 및 (f) 서열 20을 포함하는 CDR L3을 포함하는, 인간화 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 제공하고; 여기서, 항체는 IFN-α에 특이적으로 결합한다.

바람직한 실시태양에서, 항체는 (a) 서열 15를 포함하는 CDR H1; (b) 적어도 서열 16의 잔기 1-12를 포함하는 CDR H2; (c) 서열 17을 포함하는 CDR H3; (d) 서열 18을 포함하는 CDR L1; (e) 서열 19를 포함하는 CDR L2; 및 (f) 서열 20을 포함하는 CDR L3을 포함한다.

다른 바람직한 실시태양에서, 항체는 (a) 서열 22를 포함하는 CDR H1; (b) 적어도 서열 23의 잔기 1-12를 포함하는 CDR H2; (c) 서열 17을 포함하는 CDR H3; (d) 서열 24를 포함하는 CDR L1; (e) 서열 25를 포함하는 CDR L2; 및 (f) 서열 20을 포함하는 CDR L3을 포함한다.

바람직한 실시태양에서, 항체는 (a) 서열 15를 포함하는 CDR H1; (b) 서열 21을 포함하는 CDR H2; (c) 서열 17을 포함하는 CDR H3; (d) 서열 18을 포함하는 CDR L1; (e) 서열 19를 포함하는 CDR L2; 및 (f) 서열 20을 포함하는 CDR L3을 포함한다.

바람직한 실시태양에서, 항체는 (a) 서열 22를 포함하는 CDR H1; (b) 적어도 서열 16의 잔기 1-12를 포함하는 CDR H2; (c) 서열 17을 포함하는 CDR H3; (d) 서열 18을 포함하는 CDR L1; (e) 서열 19를 포함하는 CDR L2; 및 (f) 서열 20을 포함하는 CDR L3을 포함한다.

바람직한 실시태양에서, 항체는 (a) 서열 15를 포함하는 CDR H1; (b) 적어도 서열 16의 잔기 1-12를 포함하는 CDR H2; (c) 서열 17을 포함하는 CDR H3; (d) 서열 24를 포함하는 CDR L1; (e) 서열 19를 포함하는 CDR L2; 및 (f) 서열 20을 포함하는 CDR L3을 포함한다.

바람직한 실시태양에서, 항체는 (a) 서열 15를 포함하는 CDR H1; (b) 적어도 서열 16의 잔기 1-12를 포함하는 CDR H2; (c) 서열 17을 포함하는 CDR H3; (d) 서열 18을 포함하는 CDR L1; (e) 서열 25를 포함하는 CDR L2; 및 (f) 서열 20을 포함하는 CDR L3을 포함한다.

인간화 항- IFN -α 항체 변이체

항체 변이체 또는 유도체는 대개 모 항체에 비해 적어도 하나의 변경된 특성을 갖지만, 항체 변이체 또는 유도체는 다음을 포함하고 그로 제한되지 않는 본 발명의 항-IFN-α 항체의 기능적 특성의 하나, 일부, 대부분 또는 전부를 보유할 수 있다: (a) IFN-α 하위형 A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b, 및 WA에 특이적으로 결합하고; (b) IFN-α 단백질 하위형 A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b, 또는 WA; 그의 임의의 조합, 또는 그 전부의 하나 이상의 생물활성을 선택적으로 중화시키고; (c) IFN-α1 또는 D의 생물활성을 유의하게 중화시키지 않고; (d) ACO-1 및/또는 ACO-2와 IFN-α 단백질 하위형 상의 동일한 에피토프와 경쟁하고/하거나 그에 결합하고; (e) 임의의 9F3, 13H5, 13H7, 및 7H9보다 ACO-1 또는 ACO-2와 더 많이 경쟁하고; (f) Kabat에 따른 뮤린 CDR을 포함하는 hzACO-1 또는 hzACO-2 항체보다 면역 반응을 유발할 가능성이 더 작고; (g) 제약 제형 내에서 안정하고; (h) 적어도 하나의 IFN-α 단백질 하위형 A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b, 또는 WA에 10^-8 M 이하의 KD로 결합한다. 상기 설명된 기능적 특징 및/또는 실시예에 설명된 바와 같은 기능적 특징의 임의의 조합이 본 발명의 항체에 의해 제시될 수 있다.

특정 실시태양에서, 본 발명의 인간화 항체는 CDR H1-H3 서열을 포함하는 VH 구역 및 CDR L1-L3 서열을 포함하는 VL 구역을 포함하고, 여기서 하나 이상의 이들 CDR 서열은 본원에 기재된 바람직한 항체; ACO-1 및 ACO-2, 또는 그의 보존적 변형에 기초하여 특정된 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 항체는 본 발명의 항-IFN-α 항체의 목적하는 기능적 특성을 보유하거나 개선시켰다. 따라서, 본 발명은 CDR H1, CDR H2, 및 CDR H3 서열을 포함하는 중쇄 가변 구역 및 CDR L1, CDR L2, 및 CDR L3 서열을 포함하는 경쇄 가변 구역을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하고; (a) CDR H1은 서열 15 및 22로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열, 및 그의 보존적 변형을 포함하고; (b) CDR H2는 적어도 서열 16 및 23의 잔기 1-12로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열, 및 그의 보존적 변형을 포함하고, (c) CDR H3은 서열 17, 및 그의 보존적 변형을 포함하고; (d) CDR L1은 서열 18 및 24로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열, 및 그의 보존적 변형을 포함하고; (e) CDR L2는 서열 19 및 25로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열, 및 그의 보존적 변형을 포함하고; (f) CDR L3은 서열 20, 및 그의 보존적 변형을 포함하고; 여기서 항체는 IFN-α에 특이적으로 결합한다.

따라서, 본 발명의 항체의 CDR 또는 FR 구역 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 교체될 수 있고, 변경된 항체는 본원에 기재된 기능적 분석을 이용하여 보유된 기능 (즉, 상기 (c), (d) 및 (e)에 기재된 기능)에 대해 시험될 수 있다.

항체 변이체의 기능적 특성은 당업계에서 이용가능하고/하거나 본원에 기재된 표준 분석을 이용하여 평가할 수 있다. 예를 들어, IFN-α에 결합하는 항체의 능력은 표준 결합 및 생물학적 효과 (예를 들어, 리포터 유전자) 분석, 예를 들어 실시예에 기재된 것 (예를 들어, 비아코어 또는 ELISA)을 이용하여 결정할 수 있다.

가변 구역 변형

한 측면에서, 본 발명은 CDR 또는 프레임워크 구역 내에 돌연변이를 갖는 인간화 ACO-1 또는 ACO-2 항체를 제공한다.

인간화 ACO-1 내의 특정한 예시적인 돌연변이 및 그의 확인은 실시예 2 및 3에 설명되어 있다 (또한 도 1 및 3 참조). 이들은 ACO-1 잔기를 인간화 ACO-1 내로 도입시키는 복귀-돌연변이, 및 ACO-2-유래된 잔기를 인간화 ACO-1 내로 도입시키는 돌연변이를 모두 포함한다. hzACO-1 VH (서열 3)에서 예시적인 복귀-돌연변이는 Kabat 넘버링을 이용하여 V5Q, M69L, R71V, T73K, S76I 및 V78A 및 그의 임의의 조합을 포함한다. hzACO-1 VL (서열 6)에서 예시적인 복귀-돌연변이는 E1Q, L47W, I58V 및 F71Y 및 그의 임의의 조합을 포함한다. hzACO-1 VH (서열 3)에서 예시적인 ACO-2-유래된 돌연변이는 T28S, N31S, I58S, S76N, T77I 및 A93V 및 그의 임의의 조합을 포함한다. hzACO-1 VL (서열 6)에서 예시적인 ACO-2 유래된 돌연변이는 D29G, L33F 및 S50G 및 그의 임의의 조합을 포함한다.

또한, 다양한 hzACO-1 VH 및 VL 변이체 서열은 본 발명의 hzACO-1 변이체의 라이브러리를 생성하기 위해 변이체 서열 또는 모 서열과 "혼합 및 매치될" 수 있다. 그러한 "혼합 및 매치된" 항체의 IFN-α-결합은 본원에 기재된 결합 분석 (예를 들어, 비아코어, ELISA)를 이용하여 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 기능적 분석을 이용하여 시험할 수 있다.

한 실시태양에서, 본 발명은 인간 IFN-α에 특이적으로 결합하고, 인간 IFN-α에 결합하는 공여자 비-인간 항체로부터의 아미노산이 인간 항체 가변 도메인 내로 포함되고 중쇄 가변 도메인 내의 5, 28, 31, 58, 69, 71, 73, 76, 78, 79, 및 93 중에서 선택된 하나 이상의 부위에 공여자 항체 아미노산 잔기를 포함하는 가변 도메인을 함유하는 인간화 항체를 제공한다.

한 실시태양에서, 본 발명은 인간 IFN-α에 특이적으로 결합하고, 인간 IFN-α에 결합하는 공여자 비-인간 항체로부터의 아미노산이 인간 항체 가변 도메인 내로 포함되고 경쇄 가변 도메인 내의 1, 29, 33, 47, 50, 58, 및 71 중에서 선택된 하나 이상의 부위에 공여자 항체 아미노산 잔기를 포함하는 가변 도메인을 함유하는 인간화 항체를 제공한다.

한 실시태양에서, 본 발명은 인간 IFN-α에 특이적으로 결합하고, 인간 IFN-α에 결합하는 ACO-1로부터의 CDR 서열이 인간 항체 가변 도메인 내로 포함되고 중쇄 가변 도메인 내의 28, 31, 58, 76, 77, 78, 79, 및 93 중에서 선택된 하나 이상의 부위에 ACO-2 아미노산 잔기를 추가로 포함하는 가변 도메인을 함유하는 인간화 ACO-1 항체를 제공한다. 특정 실시태양에서, ACO-2 아미노산 잔기는 28, 31, 및 93 중에서 선택된 하나 이상의 부위에서 그러하다.

한 실시태양에서, 본 발명은 인간 IFN-α에 특이적으로 결합하고, 인간 IFN-α에 결합하는 ACO-1로부터의 CDR 서열이 인간 항체 가변 도메인 내에 포함되고, 경쇄 가변 도메인 내의 29, 33, 및 50 중에서 선택된 하나 이상의 부위에 ACO-2 아미노산 잔기를 추가로 포함하는 가변 도메인을 함유하는 인간화 ACO-1 항체를 제공한다.

한 실시태양에서, 본 발명은 인간 IFN-α에 특이적으로 결합하고, N31S 돌연변이를 가지면서 서열 3의 Kabat 잔기 31-35, 50-65, 및 95-102의 서열에 실질적으로 동일한 VH CDR 서열을 포함하는 hzACO-1 변이체를 제공한다. 항체는 예를 들어 N31S 돌연변이를 가지면서 서열 15를 포함하는 CDR H1 서열; 서열 21을 포함하는 CDR H2 서열; 및 서열 17을 포함하는 CDR H3 서열을 포함한다. 추가로 또는 별법으로, 항체는 N31S 돌연변이를 가지면서 서열 15로 이루어지는 CDR H1 서열; 서열 21로 이루어지는 CDR H2 서열; 및 서열 17로 이루어지는 CDR H3 서열을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 인간화 ACO-1은 인간 VH1_46 유전자 및/또는 인간 JH4 유전자, 바람직하게는 둘 모두로부터 유래된 VH 프레임워크 잔기를 포함한다. 특정 실시태양에서, 인간화 항체는 Kabat 위치 31에서 N에서 S로의 돌연변이를 갖는, 서열 3에 상응하는 VH 서열을 포함한다. 실시예에 제시된 바와 같이, hzACO-1에서 N31S 돌연변이는 IFN-αA에 대한 결합 친화도를 ACO-1에 상당하는 수준으로 증가시키고, pH 3.5 및 4.5에서 안정성을 증가시켰다. 또한, 잔기 31은 "공여자" CDR 잔기 내에 있으므로, 돌연변이는 추가의 뮤린 잔기를 hzACO-1 CDR 서열 내로 도입하지 않고, 따라서 인간에게 투여될 때 항체에 대한 면역 반응의 위험을 증가시키지 않는다. 동일한 잇점을 갖는 다른 CDR 돌연변이는 hzACO-1 VL 내의 D29G 및 S50G이다.

한 실시태양에서, 본 발명은 인간 IFN-α에 특이적으로 결합하고, T28S 돌연변이를 가지면서 서열 3의 Kabat 잔기 31-35, 50-65, 및 95-102의 서열에 실질적으로 동일한 VH CDR 서열을 포함하는 hzACO-1 변이체를 제공한다. 항체는 예를 들어 서열 15를 포함하는 CDR H1 서열; 서열 21을 포함하는 CDR H2 서열; 및 서열 17을 포함하는 CDR H3 서열을 포함할 수 있다. 추가로 또는 별법으로, 항체는 서열 15로 이루어지는 CDR H1 서열; 서열 21로 이루어지는 CDR H2 서열; 및 서열 17로 이루어지는 CDR H3 서열을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 인간화 ACO-1은 T28S 돌연변이를 추가로 포함하는, 인간 VH1_46 유전자로부터 유래된 VH 프레임워크 잔기를 포함한다. 특정 실시태양에서, 인간화 항체는 Kabat 위치 28에서 T에서 S로의 돌연변이를 가지면서 서열 3에 상응하는 VH 서열을 포함한다. 실시예에 제시된 바와 같이, hzACO-1에서 T28S 돌연변이는 IFN-αA에 대한 결합 친화도를 ACO-1에 상당하는 수준으로 증가시키고, pH 3.5 및 4.5에서 안정성을 증가시켰다.

한 실시태양에서, 본 발명은 인간 IFN-α에 특이적으로 결합하고, A93V 돌연변이를 가지면서 서열 3의 Kabat 잔기 31-35, 50-65, 및 95-102의 서열에 실질적으로 동일한 VH CDR 서열을 포함하는 hzACO-1 변이체를 제공한다. 항체는 예를 들어 서열 15를 포함하는 CDR H1 서열; 서열 21을 포함하는 CDR H2 서열; 및 서열 17을 포함하는 CDR H3 서열을 포함할 수 있다. 추가로 또는 별법으로, 항체는 서열 15로 이루어지는 CDR H1 서열; 서열 21로 이루어지는 CDR H2 서열; 및 서열 17로 이루어지는 CDR H3 서열을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 인간화 ACO-1은 A93V 돌연변이를 추가로 포함하는, 인간 VH1_46 유전자 및 인간 JH4 유전자로부터 유래된 VH 프레임워크 잔기를 포함한다. 특정 실시태양에서, 인간화 항체는 Kabat 위치 93에서 A에서 V로의 돌연변이를 가지면서, 서열 3에 상응하는 VH 서열을 포함한다. 실시예에 제시된 바와 같이, hzACO-1 내의 A93V 돌연변이는 IFN-αA에 대한 결합 친화도를 ACO-1에 상당하는 수준으로 증가시키고, RG 분석에서 측정될 때 IFN-효과의 억제에 대한 효력을 증가시키고, pH 3.5 및 4.5에서 안정성을 증가시켰다.

한 실시태양에서, 본 발명은 인간 IFN-α에 특이적으로 결합하고, 서열 3의 Kabat 잔기 31-35, 50-65, 및 95-102의 서열에 실질적으로 동일한 VH CDR 서열을 포함하고 VH CDR 서열 중 하나에서 돌연변이를 추가로 포함하는 hzACO-1 변이체를 제공하고, 여기서 돌연변이는 Kabat 잔기 58에 있지 않다. 항체는 예를 들어 서열 3의 Kabat 잔기 31-35, 50-65, 및 95-102로 이루어지는 VH CDR을 포함하고 VH CDR 서열 중 하나에서 돌연변이를 추가로 포함할 수 있고, 여기서 Kabat 잔기 58은 I이다. 한 실시태양에서, 인간화 ACO-1은 인간 VH1_46 유전자 및 인간 JH4 유전자로부터 유래된 VH 프레임워크 잔기를 포함한다. 실시예에 제시된 바와 같이, hzACO-1에서 I58S 돌연변이는 IFN-αA에 대한 결합 친화도를 실질적으로 감소시키고, RG 분석에서 측정될 때 IFN-효과의 억제에 대한 효력을 감소시켰다.

다른 종류의 프레임워크 변형은 T 세포 에피토프를 제거하여 항체의 잠재적인 면역원성을 감소시키기 위해, 프레임워크 구역 내에서 또는 심지어 하나 이상의 CDR 구역 내에서 하나 이상의 잔기를 돌연변이시키는 것을 포함한다. 상기 방안은 또한 "탈면역화"로서 불리고, 미국 특허 출원 공개 20030153043 (Carr et al.)에 추가로 상세히 설명되어 있다.

Fc 변형

프레임워크 또는 CDR 구역 내에 이루어진 변형에 추가로 또는 별법으로, 본 발명의 항체는 대개 항체의 하나 이상의 기능적 특성, 예를 들어 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합, 단백질 안정성 및/또는 항원-의존 세포 세포독성, 또는 그의 결핍 등을 변경시키기 위해, Fc 구역 내에 변형을 포함하도록 조작될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 다시 항체의 하나 이상의 기능적 특성을 변경시키기 위해 화학적으로 변형되거나 (예를 들어, 하나 이상의 화학적 모이어티 (moiety)가 항체에 부착될 수 있다), 그의 글리코실화를 변경시키도록 변형될 수 있다. 각각의 이들 실시태양은 아래에 추가로 상세히 기재되어 있다. Fc 구역 내의 잔기는 Kabat에 따라 넘버링된다.

원하는 경우에, 항체의 클래스는 공지의 기술에 의해 "스위칭 (switching)"될 수 있다. 그러한 기술은 예를 들어 직접 재조합 기술의 사용 (예를 들어, 미국 특허 4,816,397 참조) 및 세포-세포 융합 기술 (예를 들어, 미국 특허 5,916,771 참조)을 포함한다. 예를 들어, 원래 IgM 분자로서 생산된 항체는 IgG 항체로 클래스 스위칭될 수 있다. 클래스 스위칭 기술은 또한 하나의 IgG 하위클래스를 다른 것으로, 예를 들어 IgG1에서 IgG2로 전환하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체의 효과기 기능은 다양한 치료 용도를 위해, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, 또는 IgM 항체로 이소형 스위칭함으로써 변화될 수 있다. 불변 구역에 대한 예시적인 cDNA 서열은 예를 들어 각각 그 전부가 본원에 참고로 포함된 GenBank를 통해 이용가능하고, 다음과 같다:

인간 IgG1 불변 중쇄 구역: GenBank 기탁 번호: J00228;

인간 IgG2 불변 중쇄 구역: GenBank 기탁 번호: J00230;

인간 IgG3 불변 중쇄 구역: GenBank 기탁 번호: X04646;

인간 IgG4 불변 중쇄 구역: GenBank 기탁 번호: K01316; 및

인간 카파 경쇄 불변 구역: GenBank 기탁 번호: J00241.

한 실시태양에서, CH1의 힌지 구역은 힌지 구역 내의 시스테인 잔기의 수가 변경, 예를 들어, 증가 또는 감소되도록 변형된다. 상기 방안은 미국 특허 5,677,425 (Bodmer et al.)에 추가로 설명되어 있다. CH1의 힌지 구역 내의 시스테인 잔기의 수는 예를 들어 경쇄 및 중쇄의 조립을 용이하게 하기 위해 또는 항체의 안정성을 증가 또는 감소시키기 위해 변경된다.

다른 실시태양에서, 항체의 Fc 힌지 구역은 항체의 생물학적 반감기를 감소시키도록 돌연변이된다. 보다 구체적으로, 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 항체는 천연 Fc-힌지 도메인 SpA 결합에 비해 손상된 포도상구균 (Staphylococcyl) 단백질 A (SpA) 결합을 갖도록 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 계면 구역 내로 도입된다. 이 방법은 미국 특허 6,165,745 (Ward et al.)에 보다 상세하게 설명되어 있다. 다른 실시태양에서, 항체는 그의 생물학적 반감기를 증가시키도록 변형된다. 다양한 방법이 가능하다. 예를 들어, 미국 특허 6,277,375 (Ward)에서 설명된 바와 같이 하나 이상의 다음 돌연변이가 도입될 수 있다: T252L, T254S, T256F. 별법으로, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해, 항체는 미국 특허 5,869,046 및 6,121,022 (Presta et al.)에 기재된 바와 같이, IgG의 Fc 구역의 CH2 도메인의 2개의 루프로부터 유도된 샐비지 (salvage) 수용체 결합 에피토프를 함유하도록 CH1 또는 CL 구역 내에서 변경될 수 있다. 또다른 실시태양에서, Fc 구역은 항체의 효과기 기능(들)을 변경하기 위해 적어도 하나의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 교체함으로써 변경된다. 예를 들어, 아미노산 잔기 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 및 322로부터 선택된 하나 이상의 아미노산이, 항체가 효과기 리간드에 대한 변경된 친화도를 갖지만 모 항체의 항원 결합 능력을 보유하도록 상이한 아미노산 잔기로 교체될 수 있다. 그에 대한 친화도가 변경되는 효과기 리간드는 예를 들어 Fc 수용체 또는 보체의 C1 성분일 수 있다. 상기 방법은 미국 특허 5,624,821 및 5,648,260 (둘 모두 Winter et al.)에 보다 상세하게 기재되어 있다. 다른 예에서, 아미노산 잔기 329, 331 및 322 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산은 항체가 변경된 C1q 결합 및/또는 감소 또는 폐지된 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 갖도록 상이한 아미노산 잔기로 교체될 수 있다. 이 방법은 미국 특허 6,194,551 (Idusogie et al.)에 보다 상세하게 기재되어 있다. 다른 예에서, 아미노산 위치 231 및 239 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 보체를 고정하는 항체의 능력을 변경하도록 변경된다. 이 방법은 PCT 공개 WO 94/29351 (Bodmer et al.)에 추가로 기재되어 있다. 또 다른 예에서, Fc 구역은 다음 위치의 하나 이상의 아미노산을 변형함으로써 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 매개하는 항체의 능력을 증가시키고/시키거나 Fcγ 수용체에 대한 항체의 친화도를 증가시키도록 변형된다: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439. 이 방법은 PCT 공개 WO 00/42072 (Presta)에 추가로 기재되어 있다. 또한, FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 인간 IgG1 상의 결합 부위가 매핑되었고, 결합이 개선된 변이체가 문헌에 기재되어 있다 ([Shields, R.L. et al., (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604] 참조). 위치 256, 290, 298, 333, 334 및 339에서 특이적인 돌연변이는 FcRIII에 대한 결합을 개선하는 것으로 밝혀졌다. 추가로, 다음의 조합 돌연변이체는 FcγRIII 결합을 개선하는 것으로 밝혀졌다: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A 및 S298A/E333A/K334A.

불변 구역은 항체를 안정화시키기 위해, 예를 들어 2가 항체가 2개의 1가 VH-VL 단편으로 분리될 위험을 감소시키기 위해 추가로 변형될 수 있다. 예를 들어, IgG4 불변 구역에서, 잔기 S241은 힌지에서 완전한 디술피드 다리가 형성되도록 프롤린 (P) 잔기로 돌연변이될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Angal et al., Mol. Immunol. 1993;30:105-8] 참조).

글리코실화 변형

또다른 실시태양에서, 항체의 글리코실화는 변형된다. 예를 들어, 비글리코실화 항체가 제조될 수 있다 (즉, 항체에는 글리코실화가 결여된다). 글리코실화는 예를 들어, 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시키도록 변경될 수 있다. 그러한 탄수화물 변형은 예를 들어, 항체 서열 내의 하나 이상의 글리코실화의 부위를 변경함으로써 달성할 수 있다.

항원 결합 단편

본 발명의 항-IFN-α 항체는 전장 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서 제조될 수 있다. 항원 결합 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, F(ab)3, Fv (대개, 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인), 단일쇄 Fv (scFv; 예를 들어 문헌 [Bird et al., Science 1988;242:423-426]; 및 [Huston et al., PNAS 1988; 85:5879-5883] 참조), dsFv, Fd (대개 VH 및 CH1 도메인), 및 dAb (대개 VH 도메인) 단편; VH, VL, VhH, 및 V-NAR 도메인; 단일 VH 및 단일 VL 사슬을 포함하는 1가 분자; 미니바디 (minibody), 디아바디 (diabody), 트리아바디 (triabody), 테트라바디 (tetrabody) 및 카파 바디 (kappa body) (예를 들어, 문헌 [Ill et al., Protein Eng 1997; 10:949-57] 참조); 낙타 IgG; IgNAR; 및 하나 이상의 단리된 CDR 또는 기능적 파라토프 (paratope)를 포함하고, 여기서 단리된 CDR 또는 항원 결합 잔기 또는 폴리펩티드는 기능적 항체 단편을 형성하기 위해 회합되거나 연결될 수 있다. 다양한 종류의 항체 단편은 예를 들어, 문헌 [Holliger and Hudson, Nat Biotechnol 2005;23:1126-1136]; WO2005/040219 및 공개된 미국 특허 출원 20050238646 및 20020161201에 설명되거나 검토되어 있다.

항체 단편은 통상적인 재조합 또는 단백질 조작 기술을 사용하여 얻을 수 있고, 단편은 무손상 항체와 동일한 방식으로 항원 결합 또는 다른 기능에 대해 스크리닝될 수 있다.

항체 단편 생산을 위해 다양한 기술이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 전장 항체의 단백분해성 소화를 통해 유도되었다 (예를 들어, 문헌 [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24:107-117 (1992)]; 및 [Brennan et al., Science, 229:81 (1985)] 참조). 그러나, 이들 단편은 현재 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생산될 수 있다. 별법으로, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이 (E. coli)로부터 직접 회수되고, 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다 (Carter et al., Bio/Technology, 10:163-167 (1992)). 다른 방법에 따르면, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양액으로부터 직접 단리될 수 있다. 다른 실시태양에서, 선택되는 항체는 단일쇄 Fv 단편 (scFv)이다. WO 1993/16185; 미국 특허 5,571,894; 및 미국 특허 5,587,458을 참조한다. 또한, 항체 단편은 예를 들어, 미국 특허 5,641,870에 기재된 바와 같은 "선형 항체"일 수 있다. 그러한 선형 항체 단편은 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.

다중특이적 분자

또다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항-IFN-α 항체 또는 그의 항원 단편을 포함하는 다중특이적 분자를 특징으로 한다. 그러한 다중특이적 분자는 IFN-α에 대한 적어도 하나의 제1 결합 특이성 및 제2 표적 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 포함하는 이중특이적 분자를 포함한다.

하나의 종류의 이중특이적 분자는 이중특이적 항체이다. 이중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 항체이다. 이중특이적 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있고, 전통적인 전장 이중특이적 항체 생산은 대체로 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (여기서, 2개의 사슬은 상이한 특이성을 갖는다)의 동시-발현에 기초한다 (Millstein et al., Nature, 305: 537-539 (1983)). 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, F(ab')2 이중특이적 항체) 또는 본원에서 설명되는 임의의 다른 항원 결합 단편으로서 제조될 수 있다.

다른 다중특이적 분자는 하나 이상의 다른 비-항체 단백질에 대한 IFN-α-결합 항체 모이어티의 융합으로부터 생산된 것을 포함한다. 그러한 다중특이적 단백질 및 그의 제조 방법은 당업계에서 설명되었다. 예를 들어, 문헌 [Dreier et al., (Bioconjug. Chem. 9(4): 482-489 (1998))]; 미국 특허 6,046,310; 미국 특허 공개 20030103984; 유럽 특허 출원 1 413 316; 미국 특허 공개 20040038339; [von Strandmann et al., Blood (2006; 107:1955-1962)] 및 WO 2004056873을 참조한다.

2가 초과의 결합가를 갖는 다중특이적 분자도 또한 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체가 제조될 수 있다 (Tutt et al., J. Immunol, 147: 60 (1991)).

본 발명의 다중특이적 분자는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 구성 결합 특이성들을 접합시킴으로써 제조할 수 있다. 예를 들어, 다중특이적 분자의 각각의 결합 특이성을 따로 생성시킨 후 서로 접합시킬 수 있다. 결합 특이성이 단백질 또는 펩티드인 경우에, 공유 접합을 위해 다양한 커플링제 또는 가교결합제가 사용될 수 있다. 가교결합제의 예는 단백질 A, 카르보디이미드, N-숙신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트 (SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산) (DTNB), o-페닐렌디말레이미드 (oPDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP) 및 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (술포-SMCC)를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Karpovsky et al., (1984) J. Exp. Med. 160:1686]; [Liu, MA et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648] 참조). 다른 방법은 문헌 [Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132]; [Brennan et al., (1985) Science 229:81-83] 및 [Glennie et al., (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375]에 기재된 것을 포함한다. 바람직한 접합제는 SATA 및 술포-SMCC (둘 모두 피어스 케미컬 컴퍼니 (Pierce Chemical Co., 미국 일리노이주 록포드))로부터 이용가능함)이다.

결합 특이성이 항체인 경우에, 이들은 2개의 중쇄의 C-말단 힌지 구역의 술프히드릴 결합을 통해 접합될 수 있다. 특히 바람직한 실시태양에서, 힌지 구역은 접합 전에 홀수, 바람직하게는 1개의 술프히드릴 잔기를 함유하도록 변형된다.

별법으로, 두 결합 특이성은 모두 동일한 벡터 내에서 코딩되고, 동일한 숙주 세포에서 발현되고 조립된다. 상기 방법은 이중특이적 분자가 mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 또는 리간드 x Fab 융합 단백질인 경우에 특히 유용하다. 본 발명의 이중특이적 분자는 하나의 단일쇄 항체 및 결합 결정자를 포함하는 단일쇄 분자, 또는 2개의 결합 결정자를 포함하는 단일쇄 이중특이적 분자일 수 있다. 이중특이적 분자는 적어도 2개의 단일쇄 분자를 포함할 수 있다. 이중특이적 분자를 제조하기 위한 방법은 예를 들어 미국 특허 5,260,203; 미국 특허 5,455,030; 미국 특허 4,881,175; 미국 특허 5,132,405; 미국 특허 5,091,513; 미국 특허 5,476,786; 미국 특허: 5,013,653; 미국 특허 5,258,498; 미국 특허 5,482,858; 미국 특허 출원 공개 20030078385, 문헌 [Kontermann et al., (2005) Acta Pharmaocological Sinica 26(1):1-9]; [Kostelny et al., (1992) J. Immunol. 148(5): 1547-1553]; [Hollinger et al., (1993) PNAS (USA) 90:6444-6448]; 및 [Gruber et al., (1994) J. Immunol. 152:5368]에 기재되거나 검토되어 있다.

항체 유도체

본 발명의 범위 내의 항체 유도체 (또는 면역접합체)는 제2 물질에 접합 또는 공유 결합된 항-IFN-α 항체를 포함한다.

예를 들어, 한 측면에서, 본 발명은 세포독성제에 접합 또는 공유 결합된 항체를 포함하는 면역접합체를 제공하고, 상기 세포독성제는 치료적 방사성 동위원소, 독성 단백질, 독성 소분자, 예를 들어 약물, 독소, 면역조절제, 호르몬, 호르몬 길항제, 효소, 올리고뉴클레오티드, 효소 억제제, 치료적 방사성 핵종, 혈관신생 억제제, 화학치료 약물, 빈카 알칼로이드, 안트라사이클린, 에피도필로톡신, 탁산, 항대사물질, 알킬화제, 항생제, COX-2 억제제, SN-38, 항유사분열제, 항혈관형성 및 세포자멸제, 특히 독소루비신, 메토트렉세이트, 탁솔, CPT-11, 캄포테칸, 질소 머스타드, 겜시타빈, 알킬 술포네이트, 니트로소우레아, 트리아젠, 엽산 유사체, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체, 백금 배위 복합체, 슈도모나스 (Pseudomonas) 외독소, 리신, 아브린, 5-플루오로우리딘, 리보뉴클레아제 (RNase), DNase I, 포도상구균 장독소-A, 억새풀 (pokeweed) 항바이러스 단백질, 겔로닌, 디프테린 독소, 슈도모나스 외독소 및 슈도모나스 내독소 등 중에서 선택될 수 있다 (예를 들어, 그 전체 개시내용이 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Ed. (Mack Publishing Co. 1995)]; [Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics (McGraw Hill, 2001)]; [Pastan et al., (1986) Cell 47:641]; [Goldenberg (1994) Cancer Journal for Clinicians 44:43]; 미국 특허 6,077,499). 독소는 동물, 식물, 진균 또는 미생물에서 기원한 것일 수 있거나, 화학 합성에 의해 드 노보 (de novo)로 생성시킬 수 있음이 이해될 것이다.

다른 실시태양에서, 항체는 방사성 동위원소, 예를 들어 치료적 방사성 핵종 또는 검출 목적에 적합한 방사성 핵종으로 유도체화된다. I-131, 인듐-111, 루테튬-171, 비스무쓰-212, 비스무쓰-213, 아스타틴-211, 구리-62, 구리-64, 구리-67, 이트륨-90, 요오드-125, 요오드-131, 인-32, 인-33, 스칸듐-47, 은-111, 갈륨-67, 프라세오디뮴-142, 사마륨-153, 테르븀-161, 디스프로슘-166, 홀뮴-166, 레늄-186, 레늄-188, 레늄-189, 납-212, 라듐-223, 악티늄-225, 철-59, 셀레늄-75, 비소-77, 스트론튬-89, 몰리브덴-99, 로듐-105, 팔라듐-109, 프라세오디뮴-143, 프로메튬-149, 에르븀-169, 이리듐-194, 금-198, 금-199 및 납-211을 포함하고 이로 제한되지 않는 임의의 많은 적합한 방사성 동위원소가 사용될 수 있다. 일반적으로, 방사성 핵종은 바람직하게는 붕괴 에너지가 20 내지 6,000 keV 범위, 바람직하게는 오거 (Auger) 방사체에 대해 60 내지 200 keV 범위, 베타 방사체에 대해 100-2,500 keV, 및 알파 방사체에 대해 4,000-6,000 keV이다. 실질적으로 알파-입자의 생성과 함께 붕괴하는 방사성 핵종이 또한 바람직하다.

본 발명의 항체 접합체는 제시된 생물학적 반응을 변형시키기 위해 사용될 수 있고, 여기서 약물 모이어티는 고전적인 화학 치료제로 제한되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 약물 모이어티는 목적하는 생물학적 활성을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 그러한 단백질은 예를 들어, 효소 활성 독소 또는 그의 활성 단편, 예를 들어 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소 또는 디프테리아 독소; 단백질, 예를 들어 종양 괴사 인자 또는 인터페론-y; 또는 생물학적 반응 변형제, 예를 들어, 림포킨, 인터류킨-1 ("IL-1"), 인터류킨-2 ("IL-2"), 인터류킨-6 ("IL-6"), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 ("GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극 인자 ("G-CSF") 또는 다른 성장 인자를 포함할 수 있다.

제2 물질이 임의의 매우 많은 이용가능한 방법을 이용하여 항체에 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 예를 들어, 물질은 가교결합제, 예를 들어 N-숙시닐 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP)를 사용하는 디술피드 결합 형성을 통해 또는 항체의 Fc 구역 내의 탄수화물 모이어티를 통해 환원된 항체 성분의 힌지 구역에 부착될 수 있다 (예를 들어, 각각 그 전체 개시내용이 본원에 참고로 포함된 문헌 [Yu et al., (1994) Int. J. Cancer 56: 244]; [Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking (CRC Press 1991)]; [Upeslacis et al., "Modification of Antibodies by Chemical Methods," in Monoclonal antibodies: principles and applications, Birch et al., (eds.), pages 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995)]; [Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies," in Monoclonal antibodies: Production, engineering and clinical application, Ritter et al., (eds.), pages 60-84 (Cambridge University Press 1995)], [Cattel et al., (1989) Chemistry today 7:51-58], [Delprino et al., (1993) J. Pharm. Sci 82:699-704]; [Arpicco et al., (1997) Bioconjugate Chemistry 8:3]; [Reisfeld et al., (1989) Antibody, Immunicon. Radiopharm. 2:217] 참조). 또한, 예를 들어, 문헌 [Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al., (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)]; [Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al., (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)]; [Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al., (eds.), pp. 475-506 (1985)]; ["Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al., (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985)] 및 [Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)]를 참조한다.

세포독소의 종류, 링커 및 치료제를 항체에 접합하기 위한 방법에 대한 추가의 논의에 대해서는 문헌 [Saito, G. et al., (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55: 199-215]; [Trail, P.A. et al., (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337]; [Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212]; [Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763]; [Pastan, I. and Kreitman, R.J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091]; [Senter, P.D. and Springer, C.J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264]를 참조한다.

다른 실시태양에서, 제2 물질은 정량적으로 또는 정성적으로 관찰 또는 측정될 수 있는 임의의 분자일 수 있는, 검출가능한 모이어티이다. 본 발명의 접합된 항체에 유용한 검출가능 마커의 예는 방사성 동위원소, 형광 염료, 또는 상보성 결합쌍의 구성원, 예를 들어 항원/항체 (IFN-α에 대한 항체 외에), 렉틴/탄수화물; 아비딘/비오틴; 수용체/리간드; 또는 분자상으로 프린팅된 중합체/프린트 분자 시스템 중 임의의 하나의 구성원이다.

제2 물질은 또한 또는 별법으로 예를 들어, 항체의 순환 반감기를 증가시키기 위해 의도된 중합체일 수 있다. 예시적인 중합체 및 상기 중합체를 펩티드에 부착시키는 방법은 예를 들어 미국 특허 4,766,106; 4,179,337; 4,495,285; 및 4,609,546에 예시되어 있다. 추가의 예시적인 중합체는 폴리옥시에틸화 폴리올 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모이어티를 포함한다. 본원에서 사용될 때, 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 다른 단백질을 유도체화하기 위해 사용된 임의의 형태의 PEG, 예를 들어 모노(C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 포함하고자 의도된다. 예를 들어, 전장 항체 또는 항체 단편은 분자량이 약 1,000 내지 약 40,000, 예를 들어 약 2000 내지 약 20,000, 예를 들어 약 3,000 내지 12,000인 하나 이상의 PEG 분자에 접합될 수 있다. 항체 또는 그의 단편을 PEG화하기 위해, 항체 또는 단편은 대개 하나 이상의 PEG 기가 항체 또는 항체 단편에 부착되는 조건 하에 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 예를 들어 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 반응된다. 바람직하게는, PEG화는 반응성 PEG 분자 (또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 수행된다. 특정한 실시태양에서, PEG화시킬 항체는 비글리코실화된 항체이다. 단백질을 PEG화하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 본 발명의 항체에 적용될 수 있다. 예를 들어, EP 0 154 316 (Nishimura et al.) 및 EP 0 401 384 (Ishikawa et al.)를 참조한다.

항체 특성 결정

생산 또는 정제 후에, 또는 스크리닝 또는 선택 절차의 일부로서, 본 발명의 항-IFN-α 항체의 기능적 특징이 조사될 수 있다.

다음은 항체 특성 결정을 위한 예시적인 분석의 간단한 설명이다. 일부는 다른 섹션에 추가로 기재되고/되거나 실시예에 기재된다.

결합 분석

본 발명은 IFN-α에 결합하는 항체 및 그의 항원 결합 단편 및 면역접합체를 제공한다. 임의의 매우 다양한 분석이 IFN-α에 대한 항체의 결합을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 특히 ELISA, 방사성 면역분석, 웨스턴 블로팅 (Western blotting), BIACORE 및 경쟁 분석에 기반한 프로토콜이 사용하기 위해 적합하고, 당업계에 공지되어 있다.

예를 들어, 시험 항체가 표적 단백질 또는 에피토프의 존재 하에 인큐베이팅되고 (예를 들어, A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b, WA, 1 및 D, 그의 일부, 또는 그의 임의의 조합 중에서 선택된 IFN-α 단백질 하위형), 비결합된 항체가 세척 제거되고, 결합된 항체의 존재가 예를 들어 RIA, ELISA 등을 사용하여 평가되는 간단한 결합 분석을 이용할 수 있다. 그러한 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 대조군인 비-특이적 항체에서 보인 양을 넘는 임의의 양의 결합은 항체가 표적에 특이적으로 결합함을 나타낸다.

그러한 분석에서, 인간 IFN-α에 결합하는 시험 항체의 능력은 동일한 표적에 결합하는 (음성) 대조군 단백질, 예를 들어 구조적으로 관련되지 않은 항원에 대해 생성된 항체, 또는 비-Ig 펩티드 또는 단백질의 능력과 비교될 수 있다. 임의의 적합한 분석을 이용하여 대조군 단백질에 비해 25％, 50％, 100％, 200％, 1000％ 이상의 증가된 친화도 능력으로 IFN-α에 결합하는 항체 또는 단편은 표적에 "특이적으로 결합하는" 또는 "그와 특이적으로 상호작용하는" 것으로 말해지고, 아래 기재된 치료 방법에 사용하기 위해 바람직하다. IFN-α에 대한 (양성) 대조군 항체, 예를 들어 인간화 ACO-1 또는 ACO-2 항체의 결합에 영향을 미치는 시험 항체의 능력을 또한 평가할 수 있다.

한 측면에서, 본 발명은 인간화 ACO-1 또는 ACO-2 항체와 생물학적 특징 및/또는 실질적인 VH 및/또는 VL 서열 동일성을 공유하는 인간화 항-IFN-α 항체를 제공한다. 하나의 예시적인 생물학적 특징은 ACO-1 또는 ACO-2 에피토프, 즉, ACO-1 및 ACO-2 항체가 결합하는 특정한 IFN-α 단백질 하위형의 세포외 도메인 내의 각각의 구역에 대한 결합이다. ACO-1 또는 ACO-2 에피토프에 결합하는 항체에 대해 스크리닝하기 위해, 문헌 [Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)]에 기재된 바와 같은 일상적인 교차-차단 분석을 수행할 수 있다.

예시적인 교차-차단 또는 경쟁 분석에서, ACO-1 또는 ACO-2 (대조군) 항체 및 시험 항체는 혼합되고 (또는 예비-흡착되고), IFN-α를 함유하는 샘플에 적용된다. 특정한 실시태양에서, 대조군 항체를 IFN-α-함유 샘플에 적용하기 전의 일정 기간 동안 변하는 양의 시험 항체 (예를 들어, 1:10 또는 1:100)와 예비-혼합할 것이다. 다른 실시태양에서, 대조군 및 변하는 양의 시험 항체는 항원/표적 샘플에 대한 노출 동안 단순히 혼합될 수 있다. 결합된 항체를 유리 항체로부터 (예를 들어, 비결합된 항체를 제거하기 위한 분리 또는 세척 기술을 이용함으로써) 및 대조군 항체를 시험 항체로부터 (예를 들어, 종- 또는 이소형-특이적 2차 항체를 사용함으로써, 대조군 항체를 검출가능한 표지로 특이적으로 표지함으로써, 또는 상이한 화합물들을 구분하기 위한 물리적 방법, 예를 들어 질량 분광법을 사용함으로써) 구분할 수 있다면, 시험 항체가 대조군과 실질적으로 동일한 에피토프를 인식하는지를 나타내는, 시험 항체가 항원에 대한 대조군 항체의 결합을 감소시키는지를 결정할 수 있을 것이다. 상기 분석에서, 완전히 무관한 항체의 존재 하에 (표지된) 대조군 항체의 결합은 대조용의 높은 값이다. 대조용의 낮은 값은 표지된 (양성) 대조군 항체를 비표지된 대조군 항체와 함께 인큐베이팅함으로써 얻어지고, 여기서 경쟁이 일어나 표지된 항체의 결합을 감소시킬 것이다.

시험 분석에서, 시험 항체의 존재 하에 표지된 항체 반응성의 유의한 감소는 시험 항체가 표지된 대조군 항체와 동일한 에피토프를 인식한다는, 즉, "그와 교차-반응한다는" 표시이다. 약 1:10 내지 약 1:100의 임의의 비의 대조:시험 항체 또는 화합물에서 항원/표적에 대한 표지된 대조군의 결합을 적어도 50％ 이상, 바람직하게는 70％로 감소시키는 임의의 시험 항체 또는 화합물은 대조군과 실질적으로 동일한 에피토프 또는 결정자에 결합하는 항체 또는 화합물인 것으로 간주된다. 바람직하게는, 그러한 시험 항체 또는 화합물은 항원/표적에 대한 대조군의 결합을 적어도 90％ 감소시킬 것이다. 그럼에도 불구하고, 대조군 항체 또는 화합물의 결합을 임의의 측정가능한 정도로 감소시키는 임의의 화합물 또는 항체는 본 발명에서 사용될 수 있다.

생물학적 활성

단핵구의 분화. 활성화된 T 및 B 림프구의 생성에는 항원 제시 세포 ("APC")의 동원 및 성숙이 요구된다. 이들 APC는 B 세포, 단핵구/대식세포 및 수지상 세포를 포함한다. SLE 환자의 혈청은 DC를 활성화시킬 수 있는 IFN-α를 함유하고, 활성화된 활성은 본 발명에 따른 인간화 항체 제제로 차단될 수 있다. 상기 활성을 검출 및 정량하는 방법은 학술 및 특허 문헌 (예를 들어, 그 관련 부분이 본원에 참고로 포함된 특허 공개 번호 US20040067232A1의 문단번호 0136 내지 0150 참조)에 기재되어 있다.

MxA 프로모터의 활성화. MxA 프로모터를 활성화시키는 IFN-α의 능력, 및 상기 활성화를 차단하는 본 발명의 항-IFN-α 모노클로날 항체의 능력은 리포터 유전자 (RG) 분석을 이용하여 측정할 수 있고, 상기 분석에서 MxA 프로모터가 리포터 유전자, 예를 들어 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT) 또는 루시퍼라제 (luc), 바람직하게는 루시퍼라제에 융합된다. CAT 및 루시퍼라제에 대한 분석은 당업자에게 공지되어 있다. 바람직하게는, MxA 프로모터의 활성은 MxA 프로모터/리포터 유전자 융합 구성체로 안정적으로 형질전환된 A549 세포에서 측정된다. A549 세포는 ATCC를 통해 이용가능한 폐 암종 세포주 (제품 번호 CC1-185)이다. MxA (MxI로도 알려짐) 프로모터는 인간, 마우스 또는 래트의 것일 수 있다. 인간 MxA 프로모터의 서열 및 구조는 Genbank 기탁 번호 X55639, 문헌 ([Chang et al., (1991) Arch Virol. 1 17:1-15]; 및 [Ronni et al., (1998) J Interferon Cytokine Res. 18:773-781])에 개시되어 있다. 인간 MxA 프로모터/루시퍼라제 융합 구성체 및 루시퍼라제 분석은 특허 공개 US20040209800 및 문헌 [Rosmorduc et al., (1999) J of Gen Virol 80:1253-1262]에 개시되어 있다. 인간 MxA 프로모터/CAT 융합 구성체 및 CAT 분석은 문헌 [Fernandez et al., (2003) J Gen Virol 84:2073-2082] 및 [Fray et al., (2001) J Immunol Methods 249:235-244]에 개시되어 있다. 마우스 MxA (MxI) 프로모터는 Genbank 기탁 번호 M21104; 문헌 [Hug et al., (1988) Mol Cell Biol 8:3065-3079]; 및 [Lleonart et al., (1990) Biotechnology 8:1263-1267]에 개시되어 있다. 마우스 MxA 프로모터/루시퍼라제 융합 구성체 및 루시퍼라제 분석은 문헌 [Canosi et al., (1996) J Immunol Methods 199:69-67]에 개시되어 있다.

세포병변 효과 억제 ( CPE ) 분석. CPE 분석은 인터페론의 항바이러스 활성에 기초한 것이다. 일반적으로, 적합한 세포주는 인터페론의 존재 하에 바이러스로 감염되고, 인터페론의 억제 활성은 바이러스 전파 또는 복제 과정에 대해 정량된다. 분석의 판독은 바이러스 수율의 감소, 바이러스 세포병변 효과의 감소, RNA 합성의 바이러스 단백질의 감소, 바이러스 플라크 형성의 감소에 기초할 수 있다. 세포병변 분석은 인터페론의 활성에 대한 항체의 중화 효과를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 CPE 분석은 문헌 [Meager, A. 1987. Quantification of interferons by anti-viral assays and their standardization. In: Clemens, M.J., Morris, A.G., Gearing, A.J.H. (Eds), Lymphokines and interferons: A Practical Approach. IRL, Press, Oxford, p. 129] 및 [Grossberg and Sedmak, 1984. Assays of interferons In: Billiau, A. (Ed) Interferon, vol.1: General and Applied Aspects. Elsevier, Amsterdam, p. 189], 및 PCT 공개 WO2006/086586의 실시예 6, 문단 157-164 및 도 1에 기재되어 있다.

제약 제형

본 발명의 다른 목적은 10-500 mg/ml, 예를 들어 20-300 mg/ml, 바람직하게는 30-100 mg/ml, 가장 바람직하게는 50-100 mg/ml의 농도로 존재하는 [단백질] 화합물을 포함하고, pH가 2.0 내지 10.0인 제약 제형을 제공하는 것이다. 제형은 버퍼 시스템, 보존제(들), 등장화제(들), 킬레이팅제(들), 안정화제 및 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 한 실시태양에서, 제약 제형은 수성 제형, 즉, 물을 포함하는 제형이다. 상기 제형은 대개 용액 또는 현탁액이다. 본 발명의 추가의 실시태양에서, 제약 제형은 수용액이다. 용어 "수성 제형"은 적어도 50％ w/w의 물을 포함하는 제형으로서 규정된다. 마찬가지로, 용어 "수용액"은 적어도 50％ w/w의 물을 포함하는 용액으로서 규정되고, 용어 "수성 현탁액"은 적어도 50％ w/w의 물을 포함하는 현탁액으로서 규정된다.

다른 실시태양에서, 제약 제형은 의사 또는 환자가 사용 전에 용매 및/또는 희석제를 첨가하는 동결-건조된 제형이다.

다른 실시태양에서, 제약 제형은 임의의 사전 용해 없이 바로 사용할 수 있는 건조된 제형 (예를 들어, 동결건조 또는 분무건조된)이다.

진단 용도

본 발명의 IFN-α-항체는 또한 비-치료 용도를 갖는다. 예를 들어, 항-IFN-α 항체는 IFN-α 단백질의 진단 분석, 예를 들어 특이적 세포, 조직 또는 혈청에서 그의 발현의 검출에서 또한 유용할 수 있다. 예를 들어, 항-IFN-α 항체는 항-IFN-α 치료를 위한 환자를 선택하는 분석에서 사용될 수 있다. 그러한 목적을 위해, 항-IFN-α 항체는 혈청 또는 조직 시료 내에서 IFN-α의 존재에 대해 분석하기 위해 사용될 수 있다. 진단 용도를 위해, 항체는 대개 검출가능한 모이어티로 표지될 것이다.

치료 용도

본원에 기재된 바와 같이 인간화 항-IFN-α 항체를 사용하여 환자를 치료하는 방법이 또한 본 발명에 의해 제공된다. 한 실시태양에서, 본 발명은 인간 환자에 대한 투여를 위한 제약 조성물의 제조에서 본원에 기재된 바와 같은 인간화 항체의 용도를 제공한다. 일반적으로, 환자는 하위형 A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b, 및 WA로 이루어지는 군 중에서 선택되는 적어도 하나의 IFN-α 하위형의 비정상적 발현과 연관된 자가면역 또는 염증성 질병 또는 질환에 걸려 있거나 걸릴 위험이 있다.

본 발명의 항체로 치료할 예시적인 병태 또는 질환은 루푸스 (예를 들어, 전신 홍반성 루푸스 (SLE)), 류마티스 관절염, 연소성 만성 관절염, 골관절염, 척추관절병증, 전신 경화증 (경피증), 특발성 염증성 근육병증 (피부근염, 다발성 근육염), 쇼그렌 (Sjogren) 증후군, 혈관염, 전신 혈관염, 사르코이드증, 자가면역 용혈 빈혈 (면역 범혈구감소증, 발작성 야간 헤모글로빈뇨증), 자가면역 혈소판감소증 (특발성 혈소판감소성 자반증, 면역-매개된 혈소판 감소증), 갑상선염 (그레이브 (Grave) 병, 하시모또 (Hashimoto) 갑상선염, 연소성 림프구성 갑상선염, 위축성 갑상선염), 당뇨병, 면역-매개된 신장 질병 (사구체신염, 요세관간질 신장염), 중추 및 말초신경계의 탈수초성 질병, 예를 들어 다발성 경화증, 특발성 탈수초성 다발성 신경병증 또는 길랑-바레 (Guillain-Barre) 증후군, 및 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 간담 질병, 예를 들어 감염성 간염 (A, B, C, D, E형 간염 및 다른 비-간친화성 바이러스), 자가면역 만성 활성 간염, 원발성 담즙성 간경변, 육아종 간염, 및 경화 담관염, 염증성 장 질환 (궤양성 대장염, 크론 (Crohn) 병), 복강 질병, 글루텐-감수성 장병증, 및 휘플 (Whipple) 병, 자가면역 또는 면역-매개된 피부 질병, 예를 들어 물집 피부 질병, 다형 홍반 및 접촉성 피부염, 건선, 알레르기성 질병, 예를 들어 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 식품 과민성 및 두드러기, 폐의 면역 질병, 예를 들어 호산구 폐렴, 특발성 폐 섬유증 및 과민성 폐렴, 및 이식 관련 질병, 예를 들어 이식 거부 및 이식편 대 숙주 질병을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 특정 실시태양에서, 질병, 병태 또는 질환은 루푸스, 쇼그렌 증후군, 건선, 당뇨병, 류마티스 관절염, 및 연소성 피부근염 중에서 선택된다. 다른 특정 실시태양에서, 질병, 병태 또는 질환은 SLE이다. 예를 들어, 한 측면에서, 항-IFN-α 항체는 하나 이상의 다른 소염제, 비제한적으로 예를 들어 진통제, 면역억제제, 코르티코스테로이드, 및 항-TNFα 물질 또는 다른 항-시토킨 또는 항-시토킨 수용체 물질, 및 항-혈관형성제와 조합으로 사용된다. 구체적인 예로는 메토트렉세이트, TSG-6, 리툭산®, 및 CTLA4-Fc 융합 단백질을 포함한다. 조합 요법제의 추가의 예를 아래에 제공한다.

제품

본 발명의 다른 실시태양에서, 상기 기재된 질환의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제품을 제공한다. 예를 들어, 제품은 본원에 기재된 바와 같은 인간화 항-IFN-α 항체를 함유하는 용기를, 항체를 유효량으로 사용하여 인간에서 자가면역 또는 염증성 질병 또는 질환과 같은 질환을 치료하도록 사용자에게 지시하는 지시서와 함께 포함할 수 있다. 제품은 대개 용기, 및 용기 상의 또는 용기와 결합된 라벨 또는 포장삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어, 병, 바이알, 시린지 (syringe) 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로 형성될 수 있다. 용기는 질환을 치료하기 위해 효과적인 조성물을 보유하고, 멸균 접근 포트 (access port)를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개 (stopper)가 있는 정맥내 용액 백 (bag) 또는 바이알일 수 있다). 조성물 내의 적어도 하나의 활성제는 본원의 인간화 항-IFN-α 항체, 또는 그러한 항체를 포함하는 항원-결합 단편 또는 항체 유도체 (예를 들어, 면역접합체)이다. 라벨 또는 포장삽입물이 조성물이 예를 들어, SLE와 같은 선택된 병태를 치료하기 위해 사용됨을 지시한다.

또한, 제품은 (a) 본원의 인간 또는 인간화 항체를 포함하는 조성물이 그 내부에 담긴 제1 용기, 및 (b) 인간 또는 인간화 항체 외의 치료제를 포함하는 조성물이 그 내부에 담긴 제2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 실시태양에서 제품은 제1 및 제2 조성물이 자가면역 또는 염증성 질병 또는 질환을 치료하기 위해 조합으로 사용될 수 있음을 지시하는 포장삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 그러한 치료제는 선행 섹션에 기재된 임의의 보조 요법제일 수 있다. 별법으로, 또는 추가로, 제품은 제약상 허용되는 버퍼, 예를 들어 주사용 정균수 (BWFI), 포스페이트-완충 염수, 링거 (Ringer) 용액 및 덱스트로스 용액을 담은 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 제품은 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질, 예를 들어 다른 버퍼, 희석제, 필터, 바늘, 및 시린지를 추가로 포함할 수 있다.

따라서, 제1 측면에서, 본 발명은 인간 인터페론-α (IFN-α)에 특이적으로 결합하는 인간화 항체, 또는 그의 항원-결합 단편에 관한 것이고, 상기 인간화 항체는 Kabat에 따른 뮤린 상보성 결정 구역 (CDR)보다 더 소수의 공여자 아미노산 잔기를 포함하는 뮤린 항체 ACO-1 또는 ACO-2, 또는 그의 조합의 인간화 버전이다.

따라서, 제2 측면에서, 본 발명은 IFN-α에 특이적으로 결합하는 인간화 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이고, 여기서 상기 항체는 IFN-α 하위형 A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b 및 WA에 결합할 수 있으나, 하위형 1 또는 D에 결합하지 않고, 상기 항체는 Kabat에 따른 비-인간 CDR보다 더 소수의 공여자 아미노산 잔기를 포함한다.

한 실시태양에 따르면, CDR H2 공여자 잔기는 Kabat 잔기 50-59를 포함한다. 다른 실시태양에서, 상기 항체는 ACO-1 및/또는 ACO-2 항체와 IFN-α 하위형 상의 동일한 에피토프와 경쟁하고/하거나 그에 결합한다.

바람직한 실시태양에 따르면, 항체는 IgG4 하위형이다. 바람직한 실시태양에서, 항체는 서열 21에 따른 CDR H2 서열을 포함한다.

제3 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체를 코딩하는 숙주 세포를 적절한 조건 하에 인큐베이팅하고, 후속적으로 상기 항체를 단리하는 것을 포함하는, 본 발명에 따른 항체를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 상기 방법에 의해 수득되거나 수득가능한 항체에 관한 것이다.

제4 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 항체 또는 그의 단편을 부형제와 혼합하는 것을 포함하는, 본 발명에 따른 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 상기 방법에 의해 수득되거나 수득가능한 조성물에 관한 것이다.

제5 측면에서, 본 발명은 그를 필요로 하는 대상에게 본 발명에 따른 항체의 예방 또는 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, IFN-α 관련 염증성 질병 또는 질환을 예방, 관리, 치료 또는 개선하는 방법에 관한 것이다.

마지막으로, 본 발명은 염증성 질병의 치료에 적합한 의약의 제조를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도에 관한 것이다.

실시예

본 발명의 추가의 상세한 내용은 다음 비-제한적인 실시예에 의해 예시된다.

실시예 1 - 뮤린 ACO -1 및 ACO -2 항체의 서열 결정

본 실시예에서는 WO2006/0086586에 기재된 뮤린 항체 ACO-1 및 ACO-2의 서열결정 및 재조합 발현, 및 ACO-2 VH 및 VL 서열에 대한 BLAST 탐색을 설명한다.

항체 클로닝 및 서열 결정

RNeasy (#634914, 퀴아겐 (Qiagen))를 이용하여 하이브리도마 (ACO-1.5.2 및 ACO-2.2.1)로부터 총 RNA를 추출하였다. SMART-RACE cDNA 증폭 키트 (론테크 (Clonetech))를 이용하여 1 ㎍의 총 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 반응을 42℃에서 1.5h 동안 실행시키고, 샘플을 75 ㎕ 트리신-EDTA로 희석하였다. 표적의 PCR 증폭은 주형 (template)으로서 5 ㎕의 cDNA를 사용하여 50 ㎕ 반응액 내에서 수행하였다. 중쇄 및 경쇄 모두에 대한 전방향 프라이머는 SMART RACE 키트 내에 포함된 범용 (universal) 프라이머 믹스 (UPM)였다. ACO-1 중쇄 (HC) (서열 11) 및 ACO-1 경쇄 (LC) (서열 12)에 대한 역방향 프라이머 서열은 다음과 같이 설계되었다:

(서열 11),

(서열 12).

ACO-2 중쇄 (HC) (서열 26) 및 ACO-2 경쇄 (LC) (서열 27)에 대한 역방향 프라이머 서열은 다음과 같이 설계되었다:

(서열 26),

(서열 27).

PCR 반응은 어드밴티지 (Advantage) HF PCR 키트 (클론테크)를 이용하여 수행하고, PCR 프로그램은 94℃/2분의 단일 변성 단계 후 다음과 같은 24회의 사이클로 실행하였다: 94℃/30초; 55℃/30초; 72℃/1.5분. 최종 연장 단계는 72℃/10분이었다. PCR 생성물은 에티듐 브로마이드를 함유하는 1％ 아가로스 겔 상에서 확인하였다. PCR 생성물은 GFX 정제 키트 (지이 헬쓰케어 (GE Healthcare))를 이용하여 겔로부터 정제한 후, Zero Blunt TOPO PCR 클로닝 키트 (#K2875-40) 내로 클로닝하고, TOP10 이. 콜라이 세포 (인비트로겐 (Invitrogen)) 내로 형질전환시켰다.

미니프렙 (miniprep) 키트 (#27106, 퀴아겐)를 이용하여 이. 콜라이 콜로니로부터 DNA를 추출하였다. 플라스미드는 서열 결정 프라이머 M13 rev (-29) 및 M13 uni (-21)를 사용하여 엠더블유지 비오테크 (MWG Biotech, 독일 마틴스리드)에서 서열 결정하였다. HC 및 LC는 확인된 서열로부터 VectorNTI를 사용하여 확인하였다. 키트에 기초한 모든 절차는 제조자의 지시에 따라 수행하였다.

ACO-1.5.2 하이브리도마 세포로부터, 다음 핵산 및 아미노산 서열을 갖는 단일 카파 LC 및 단일 IGg2a HC를 클로닝하였다.

ACO-1 VH 서열 (서열 13 (신호 펩티드 포함)):

ACO-1 VL 서열 (서열 14 (신호 펩티드 포함)):

ACO-1 VH (서열 1 (신호 펩티드 미포함))

ACO-1 VL (서열 4 (신호 펩티드 미포함))

ACO-2.2.1 하이브리도마 세포로부터, 다음 핵산 및 아미노산 서열을 갖는 단일 카파 타입 ACO-2 경쇄 및 단일 IGg2b ACO-2 중쇄를 클로닝하였다.

ACO-2 VH 서열 (서열 28 (신호 펩티드 포함))

ACO-2 VL 서열 (서열 29 (신호 펩티드 포함))

ACO-2 VH 서열 (서열 7 (신호 펩티드 미포함)):

ACO-2 VL 서열 (서열 9 (신호 펩티드 미포함)):

Kabat 정의에 따른 ACO-2 CDR 서열은 다음과 같은 것으로 밝혀졌다.

(서열 22)

(서열 23)

(서열 17)

(서열 24)

(서열 25)

(서열 20)

실시예 2 - 인간화 ACO -1의 설계 및 잠재적인 복귀-돌연변이 잔기의 확인

마우스 ACO -1 CDR 의 확인 및 특성 결정

Kabat 정의에 따른 ACO-1 CDR 서열은 다음과 같은 것으로 밝혀졌다.

(서열 15)

(서열 16)

(서열 17)

(서열 18)

(서열 19)

(서열 20)

인간 생식계열의 확인

3D 단백질 구조 모델은 프로테인 데이타베이스 뱅크 (Protein Database Bank; PDB))로부터의 구조 주형: 1Z3G를 사용하는 MOE (분자 운영 환경; www.chemcomp.com에서 이용가능함)를 이용하여 작성하였다. PDB는 문헌 [Berman et al., (Nucl Acids Res 2000;28:235-242)]에 설명되고 www.rcsb.org/pdb에서 이용가능하다. PDB 데이타베이스 내의 항체-항원 복합체의 분석에 기초하여, 파라토프 내의 가장 유망한 잔기는 ACO-1 VH의 잔기 23-35, 49-58, 93-102, 및 ACO-1 VL의 24-34, 49-56, 89-97인 것으로 밝혀졌다. MOE를 사용하여, 파라토프와 상호작용하는 잔기 (소수성, 수소 결합, 전하 상호작용)를 확인하고, 잔기의 조합 세트 (파라토프 + 상호작용 잔기)를 도 1에 제시된 ACO-1의 소위 마스크로서 취하였다.

ACO-1 VH 및 ACO-1 VL을 사용한 생식계열 V 데이타베이스의 탐색은 다음 잠재적인 프레임워크 주형 (E-값은 괄호에 제시함)으로 되돌아갔다:

마스크를 사용한 생식계열 데이타베이스의 탐색은 다음 잠재적인 프레임워크 주형 (E-값은 괄호에 제시함)으로 되돌아갔다:

정렬 및 히트 (hit)의 수동 검사 후에, VH1_46 및 VKIII_L6을 인간 스캐폴드로서 선택하였다. 다른 주형은 예를 들어 인간화 항체의 물리-화학적 특성을 변경 또는 최적화하기 위해 선택될 수 있다. JH4 및 JK2는 생식계열 J-세그먼트로서 선택되었다 (각각 서열 2 및 5).

최적 인간화 ACO -1의 설계

인간화는 다음 규칙으로 수행하였다:

- 마스크 외부의 잔기는 인간으로서 취하였다.

- 마스크 내부 및 Kabat CDR 내부의 잔기는 뮤린로서 취하였다.

- 마우스/생식계열 컨센서스를 갖는, 마스크 내부 및 Kabat CDR 외부의 잔기는 컨센서스 서열로서 취하였다.

- 마우스/생식계열을 갖는, 마스크 내부 및 Kabat CDR 외부의 잔기는 생식계열 서열로서 취하였지만, 뮤린 차이를 잠재적으로 복귀 돌연변이시켰다.

얻어진 최적 hzACO-1 항체의 CDR은 다음과 같았다 (Kabat 정의에 따른):

(서열 15)

(서열 21)

(서열 17)

(서열 18)

(서열 19)

(서열 20).

상기 인간화 방법을 사용하여, 단순 CDR 그라프팅과는 반대로, hzACO-1 및 IFN-αA의 3D 모델에 기초한 파라토프를 구성하는 것으로 예측된 잔기의 마스크를 설계하여, 보다 소수의 뮤린 잔기를 갖는 hzACO-1 항체를 얻었고, 이는 최적화된 hzACO-1 CDR H2 서열의 5개의 C-말단 아미노산 (위에서 굵게 강조함)을 포함하는 펩티드는 상응하는 인간 프레임워크 서열에 동일한 반면, Kabat 정의에 따른 ACO-1 CDR H2 서열 내의 상응하는 펩티드는 뮤린에서 기원한 것이기 때문이다. 추가로, 본 분석에서 확인된 인간화 ACO-1 항체에 대한 CDR H1 서열은 WO2006/086586에 기재된 것보다 더 짧았다. 따라서, 최적화된 hzACO-1 항체, 또는 적어도 hzACO-1 VH 서열의 일부를 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 환자에서 인간-항-마우스-항체 (HAMA)-반응에 대한 감소된 위험을 제공할 수 있다. 또한, 중쇄의 위치 60-62에서 NEN 대신 서열 AQK로 교체하면 탈아미드화에 취약할 수 있는 2개의 아스파라긴 잔기를 피하는 잇점이 있다.

잠재적인 복귀-돌연변이의 확인

ACO-1 VH 및 VL 서열의 분석을 도 1에 제시한다. 도 1에서, 생성되는 인간화 ACO-1 (hzACO-1) VH (서열 3) 및 VL (서열 6) 서열을 인간으로서, 즉, 임의의 복귀-돌연변이 없이 잠재적인 복귀-돌연변이 잔기와 함께 제시한다. 원래의 마우스 항체의 친화도를 보유하기 위해 종종 요구되는, 하나 이상의 최적화된 hzACO-1 항체를 얻기 위해 프레임워크 구역 내의 다음 복귀-돌연변이 변이체가 확인되었다:

- hzACO-1 VH: 야생형 (즉, 복귀-돌연변이 없음), V5Q, M69L, R71V, T73K, S76I, V78A 및 이들의 임의의 조합;

- hzACO-1 VL: 야생형, E1Q, L47W, I58V, F71Y 및 이들의 임의의 조합;

- 다양한 중쇄-경쇄 조합.

실시예 3 - hzACO -1의 친화도 성숙을 위한 hzACO -1의 ACO -2-기반 변이체의 설계

도 2에 제시된 바와 같이, ACO-1 및 ACO-2 VH 및 VL 서열의 아미노산 서열 정렬로 각각의 경쇄와 중쇄 사이의 높은 서열 동일성을 보여주었다. 이론에 매이지 않지만, 동일한 V-D-J 재배열을 갖고 생식계열 서열에 비해 3개의 동일한 돌연변이를 함유하였으므로, 항체가 동일한 전구체 세포로부터 유도되는 것이 가능하다. 또한, 항체는 가능하게는 후속적인 체세포 과돌연변이로 인해 13개의 아미노산 잔기에서 상이하였다.

ACO-1 및 ACO-2 VH 및 VL 도메인의 13개의 동일하지 않은 아미노산 잔기 중에서, 9개의 잔기는 인간화 ACO-1 항체의 친화도를 개선시키기 위해 돌연변이 분석을 위해 선택되었다 (도 3). ACO-2 유래된 과돌연변이의 단일 첨가는 유해한 및 유익한 아미노산 잔기를 잠재적으로 확인할 수 있고, 유익한 아미노산만의 도입을 허용함으로써, 원래의 마우스 ACO-1 및 ACO-2 항체를 넘어 친화도를 개선시킬 수 있다. 표적화된 잔기는 경쇄 또는 중쇄 CDR (Kabat 정의에 따른) 중 하나 내의 그의 위치, 또는 항원-항체 3D-모델링에 기초한 잠재적인 항원-상호작용 구역으로서 개략된 구역 내의 그의 위치에 기초하여 선택되었다.

하나 이상의 최적화된 hzACO-1 항체를 얻기 위해 다음 변이체가 확인되었다:

- hzACO-1 VH: 야생형, T28S, N31S, I58S, S76N, T77I 및 A93V, 및 T28S, N31S, I58S, S76N, T77I 및 A93V로부터 선택된 적어도 2개의 돌연변이의 임의의 조합;

- hzACO-1 VL: 야생형, D29G, L33F, S50G, 및 D29G, L33F 및 S50G로부터 선택된 적어도 2개의 돌연변이의 임의의 조합,

- 다양한 중쇄-경쇄 조합.

잔기는 항원 결합에 대한 각각의 잔기의 개별적인 기여를 평가하기 위해, hzACO-1 경쇄 및 중쇄 구성체 내에서 ACO-1 서열로부터 ACO-2 서열로 별개로 돌연변이되었다. 일련의 조합 돌연변이체가 또한 생성되었다.

실시예 4 - ACO -1, ACO -2, hzACO -1의 클로닝 및 부위-지정 돌연변이 유발

ACO -1, ACO -2 및 hzACO -1

VH 및 VL 서열을 문헌 [Durocher et al., (Nucleic Acids Res. 2002; 30(2):E9)]에 기재된 HEK293-EBNA (HEK293-6E) 발현 시스템에서 일시 발현에 적합한 CMV 프로모터-기반 발현 벡터 (pTT 벡터)로 이송하였다. CMV-프로모터 이외에, 벡터는 pMB1 기원, EBV 기원 및 AmpR 유전자를 함유한다. ACO-1 및 ACO-2의 VH를 각각 마우스 IgG2a 및 IgG2b에 대한 불변 구역을 함유하는 CMV-기반 벡터 내로 클로닝하였다. 전장 LC를 ACO-1 및 ACO-2 둘 모두에 대한 빈 CMV-기반 벡터로 이송하였다. hzACO-1의 가변 구역에 대한 DNA 서열은 진아트 (Geneart, 독일 레겐스부르크)로부터 주문하였다. hzACO-1 VH에 대해 전달된 서열을 인간 IgG4에 대한 불변 구역을 함유하는 발현 벡터 (S241P) (힌지 구역에 S241P 돌연변이 함유)로 이송하였다. 전달된 hzACO-1 VL 서열을 인간 카파 경쇄에 대한 불변 구역을 함유하는 벡터로 이송하였다.

hzACO -1의 복귀-돌연변이 변이체의 생성

항원 결합에 대한 각각의 잔기의 개별적인 기여를 측정하기 위해, 실시예 2에서 확인된 10개의 잠재적인 복귀-돌연변이를 hzACO-1 HC 및 LC 구성체로 별개로 도입시켰다. 소수의 조합이 또한 포함되었다. 뮤린 CDR H2 (서열 16)의 Kabat 정의에 동등한 연장된 CDR H2를 갖는 hzACO-1의 변이체 (hzACO-1-kabat CDRH2)가 또한 부위-지정 돌연변이 유발에 의해 생성되었다.

부위 지정 돌연변이 유발을 hzACO-1 LC 및 HC 발현 벡터에 대해 수행하였다. 단일 돌연변이체를 생성하기 위해, 퀵체인지 (QuickChange)® 부위-지정 돌연변이 유발 키트 (스트라타젠 (Stratagene), cat.# 200518)를 제조자의 프로토콜에 따라 사용하였다. 목적하는 돌연변이의 도입은 각각의 돌연변이체에 대한 플라스미드 DNA 제제 (엠더블유지 비오테크, 독일 마틴스리드)를 서열 결정함으로써 입증하였다.

돌연변이된 LC 구성체를 발현을 위해 hzACO-1 HC와 조합하고, 돌연변이된 HC 구성체를 항체 발현을 위해 hzACO-1 LC와 조합하였다.

복귀-돌연변이를 갖는 경쇄 변이체:

복귀-돌연변이를 갖는 중쇄 변이체:

hzACO -1의 ACO -2-기반 변이체의 생성

실시예 3에 기재된 바와 같이, 친화도를 개선하기 위해 hzACO-1 항체 내로 ACO-2 특이적 잔기를 도입하는 부위 지정 돌연변이 유발을 hzACO-1 LC 및 HC 발현 벡터에 대해 수행하였다. 단일 돌연변이체를 생성하기 위해, 퀵체인지® 부위-지정 돌연변이 유발 키트 (스트라타젠, cat.# 200518)를 제조자의 프로토콜에 따라 사용하였다. 조합 돌연변이체는 퀵체인지® 부위-지정 돌연변이 유발 및 퀵체인지® 다중 부위-지정 돌연변이 유발 키트 (cat.# 200513)를 제조자의 프로토콜에 따라 사용하여 생성시켰다.

목적하는 돌연변이의 도입은 각각의 돌연변이체에 대한 플라스미드 DNA 제제 (엠더블유지 비오테크, 독일 마틴스리드)를 서열 결정함으로써 확인되었다.

돌연변이된 경쇄 구성체를 발현을 위해 hzACO-1 중쇄와 조합하고, 돌연변이된 중쇄 구성체를 항체 발현을 위해 hzACO-1 경쇄 구성체와 조합하였다.

ACO-2-유래된 돌연변이를 갖는 경쇄 변이체:

ACO-2-유래된 돌연변이를 갖는 중쇄 변이체:

실시예 5 - 재조합 ACO 유래된 항체의 발현

ACO-1, ACO-2, hzACO-1 및 hzACO-1 변이체를 일반 항체 발현 프로토콜에 따라 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포 내에서 발현시켰다. 다음은 현탁액 적응된 HEK293 세포에 대한 형질감염 프로토콜을 설명한다.

세포 유지: 현탁액 적응된 HEK293 세포를 25 ㎍/ml 제네티신 (Geneticin)® (인비트로겐 cat. #: 10131-019), 0.1％ v/v 플루로닉 (Pluronic)® F-68 (인비트로겐 cat. #: 12347-019) 계면활성제 & 1％ v/v 페니실린-스트렙토마이신 (선택 사항) (인비트로겐 cat. # 15140-122)을 보충한 깁코(GIBCO)® 프리스타일 (Freestyle)™ 293 발현 배지 (인비트로겐 cat. #: 12338-026) 내에서 성장시켰다. 세포를 얼렌마이어 진탕기 플라스크 내에서 0.2-2 x 10⁶개 세포/ml의 세포 밀도로 인큐베이터 진탕기에서 37℃, 8％ CO₂ 및 125 rpm에서 유지하였다.

DNA 형질감염: 형질감염을 위해 사용된 배양액의 세포 밀도는 0.8-1.5 x 10⁶개 세포/ml이었다. 세포 배양액 1 ml 당 0.5 ㎍ 경쇄 벡터 DNA + 0.5 ㎍ 중쇄 벡터 DNA를 사용하였다. 293fectin™ (인비트로겐 cat. #: 12347-019)을 형질감염 시약으로서 형질감염된 DNA 1 ㎍ 당 1 ㎕ 시약의 농도로 사용하였다. 293fectin™을 30x 부피로 희석하였다. Opti-MEM® (인비트로겐 cat. #: 51985-034)을 혼합하고 실온 (23-25℃)에서 5분 동안 방치하였다. DNA를 총 DNA ㎍당 30 ㎕ Opti-MEM® 내에 희석하고, 혼합하고, 실온 (23-25℃)에서 5분 동안 방치하였다. DNA 및 형질감염 시약 희석액을 1:1로 혼합하고, 실온 (23-25℃)에서 25분 동안 방치하였다. DNA-293fectin™ 믹스를 세포 배양액에 직접 첨가하였다. 형질감염 세포 배양액을 인큐베이터 진탕기에 37℃, 8％ CO₂ 및 125 rpm에서 옮겼다. 4-7일 후에, 원심분리한 후 0.22 ㎛ PES 필터 (코닝 (Corning) cat. #: 431098)를 통해 여과함으로써 세포 배양 상등액을 수거하였다. 항체를 상등액으로서 분석하고, 표준 단백질 A 정제 기술을 이용하여 정제하였다.

hzACO -1 및 hzACO -1- Kabat CDRH2 의 발현 수준 비교

HEK293-6E 세포 내의 일시 발현 수준을 hzACO-1 및 hzACO-1-Kabat CDRH2에 대해 비교하여, 원위 CDR H2 잔기가 2개의 항체 변이체 중 어느 하나를 발현하는 세포의 능력에 대한 임의의 효과를 갖는지 결정하였다.

HEK293-6E 세포를 hzACO-1 경쇄 및 hzACO-1 또는 hzACO-1-Kabat CDRH2 중쇄에 대한 pTT-기반 발현 벡터로 상기 기재된 바와 같이 형질감염시켰다. 형질감염은 삼중으로 수행하였다. 각각의 항체 변이체에 대해, 3개의 배양액 (25 ml)을 피펫 조작 부정확성의 영향을 최소화하기 위해 DNA-293Fectin 마스터 (master) 믹스를 이용하여 형질감염시켰다. 형질감염된 배양액을 진탕기 인큐베이터 내에서 4일 동안 상기 기재된 바와 같이 인큐베이팅하였다. 제4일에서, 세포 생존력 및 세포 밀도 측정을 위해 샘플을 배양액으로부터 추출하고, 남아있는 세포 배양 상등액을 원심분리에 의해 수거하였다. 항체 생산의 정량 분석은 바이오레이어 간섭계 (Biolayer Interferometry)에 의해 포르테바이오 옥테트 (ForteBio Octet) 시스템 및 단백질 A 바이오센서를 사용하여 청정화한 세포 배양 상등액에 대해 직접 수행하였다. 세포 배양액 밀도 및 생존력을 세덱스 하이레스 (Cedex HiRes) 자동화 세포 배양액 분석기를 사용하여 측정하였다. 결과를 아래 표 4에 제시한다.

예기치 않게, 표 4의 결과는 hzACO-1-Kabat CDRH2 (전통적인 절차를 이용하여 인간화된, 따라서 전장 Kabat 서열의 인간화 IFN-알파 항체)에 비해 hzACO-1 (본 발명에 따른 인간화 IFN-알파 항체)의 일시 발현 수준에서의 유의한 차이를 보여준다. 2개의 hzACO-1 변이체 중 어느 하나로 형질감염시킨 세포 배양액에 대해 세포 생존력 또는 밀도에서 차이는 관찰되지 않았다. hzACO-1에 대한 발현 수준은 hzACO-1-Kabat CDRH2 항체 변이체에 대한 발현 수준에 비해 약 2배 더 높았다.

Kabat-정의된 CDR H2에 비해 보다 짧은 버전의 CDR H2를 그라프팅함으로써, 항체의 발현 수준이 놀랍게도 유의하게 증가되었다.

이론에 매이지 않으면서, 연장된 CDR H2 (서열 16)를 보유하는 hzACO-1-Kabat CDRH2 항체 변이체에 비해 hzACO-1 내의 인간 생식계열-유래된 잔기가 HC 폴딩 (folding) 및 잠재적으로 LC-HC 상호작용에 영향을 미쳐서, 단백질 안정성 및 따라서 발현 수율을 개선한다는 가설을 세울 수 있다.

일시적인 발현 수준에서 관찰된 개선된 단백질 안정성에서 기인하는 그러한 개선된 수준의 단백질 발현은 안정한 CHO-기반 생산 세포주에서 반영될 것이다. 따라서, 짧은 버전의 CDR H2 (서열 21)를 그라프팅함으로써, 고-생산성의 안정한 생산 세포주의 생성이 가능하다.

hzACO -1의 IgG4 , 1 및 2 변이체의 발현 수준 비교

중쇄 하위클래스 스위칭이 항체 발현 수준에 대해 임의의 효과를 갖는지 결정하기 위해, HEK293-6E 세포 내에서 일시적인 발현 수준을 hzACO-1의 선도 IgG4 (S241P) 변이체 및 hzACO-1 (IgG1) 및 hzACO-1 (IgG2)에 대해 비교하였다.

실험은 상기 설명된 발현 분석과 유사하게 수행하였지만, 다음과 같이 변화시켰다: 실험은 5 ml 배양액 내에서 이중으로 수행하였다. 배양액을 필터 마개가 있는 50 ml 팔콘 (falcon) 튜브 내에서 진탕기 인큐베이터에서 37℃, 8％ CO₂ 및 250 rpm에서 인큐베이팅하였다.

예측불가능하게, hzACO-1 (IgG1) 및 hzACO-1 (IgG2)의 평균 발현 수준은 hzACO-1 (IgG4)의 발현 수준의 약 65％이었다. 단백질 발현에서 관찰된 감소 (~35％)에 기초하여, hzACO-1 가변 도메인 및 IgG4 불변 도메인의 조합이 다른 사슬 하위클래스와의 조합보다 더 우수하고, 상기 분자의 개발은 고-생산성의 안정한 생산 세포주의 생성을 크게 촉진한 것으로 결론지었다.

실시예 6: hzACO -1- Fab 와의 복합체에서 IFN -α8의 결정 구조

hzACO-1의 Fab 단편과의 복합체에서 IFN-α8의 결정 구조를 결정하고, X-선 결정학을 이용하여 3.3 Å 해상력으로 정밀화하였다 (도 8).

물질 및 방법

IFN-α8 (서열 30의 아미노산 1-166), 및 hzACO-1 Fab (서열 32의 경쇄 서열 및 서열 31의 잔기 1-221의 중쇄 서열을 갖는)를 약간 과량의 IFN-α8로 혼합하고, 복합체를 겔-여과 컬럼 상에서 정제하였다. 단백질 복합체 hzACO-1-Fab/IFN-α8을 25 mM HEPES 버퍼 (pH 7.5) + 25 mM NaCl에 넣고 5 mg/ml로 농축하였다. 복합체를 100 mM HEPES 버퍼 (pH 7.5), 15％ PEG 10,000 및 15％ 에틸렌 글리콜, 침전제 용액 내에서 결정화시켰다. 회절 데이타 수집 전에, 결정을 액체 N₂ 내에서 급속 동결시켰다. 결정을 먼저 99％ 글리세롤 및 75％ 침전제 용액의 25％ v/v 혼합물인 냉동 용액에 옮겼다. 회절 데이타는 빔라인 (beamline) BLI911-3 (맥스-랩 (MAX-Lab, 스웨덴 룬드))에서 수집하였다. 회절 데이타를 인덱싱하고 XDS 프로그램 패키지를 사용하여 통합시켰다 (Kabsch, J. Appl. Crystallogr. 1993;26:795-800).

3차원 구조는 CCP4 패키지 (Baily, 1994, Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 50, 760-763)의 PHASER 프로그램 (Read, 2001, Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 57, 1373-1382)을 사용하여 분자 치환 (Molecular Replacement; MR) 방법을 이용하여 결정하였다. hzACO-1 Fab (복합화되지 않은)의 결정 구조는 보다 이르게 1.52 Å 해상력 (각각 R- 및 R-프리 (free) 0.18 및 0.21)으로 결정되었고, 데이타를 제시하지 않는다. 이들 3D 좌표를 후속적으로 hzACO-1/IFN-α8 복합체에 대한 MR 계산에서 사용하였다. 탐색 모델은 3개 부분으로 나누어졌다: 1) hzACO-1 Fab의 가변 도메인, 2) hzACO-1 Fab의 불변 도메인, 및 3) IFN-α8의 서열 (서열 30)을 얻기 위해 COOT 프로그램에 의해 돌연변이된 PDB 기탁된 IFNtau 모델 (단백질 데이타 뱅크 (Berman et al., 2000, Nucleic Acids Res. 28, 235-242) 입력 코드 1B5L (RADHAKRISHNAN et al., 1999, J. MOL. BIOL. v.286pp.151). 최종 공간군 (space group) 결정은 PHASER 프로그램에 의해 이루어졌다. 최고 스코어는 공간군 P4₁에 대해 얻어졌고, 여기서 회전 기능 피크 (RZ's)는 각각 10.7, 4.4 및 2.6 σ이고, 번역 피크 (TZ's)는 각각 24.1, 26.4 및 8.0 σ이고, 로그-우도 (log-likelyhood) 득점 (LLG's)는 각각 383, 918 및 1134이고, 대칭 관련 분자에 겹침이 없었다.

분자 치환 후에 COOT 분자 그래픽 프로그램에서 모델에 대해 일부 조정하고, 그 후에 개별 온도 인자의 정밀화 없이 2000 K까지 비틀림 시뮬레이티드 어닐링 (torsional simulated annealing)을 2회 적용하였다. 원래의 R- 및 R-프리 값은 각각 0.416 및 0.439이고, 시뮬레이티드 어닐링 후의 최종 값은 각각 0.314 및 0.427이었다. 이어서, 모델을 COOT 프로그램에 수동으로 적용한 후, REFMAC5 프로그램 (Murshudov et al., 1997, Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 53, 240-255)으로 정밀화하여 각각 0.216 및 0.348의 R- 및 R-프리 값을 얻었다. 모델은 IFN-α8의 잔기 1-21 (잔기 22-23은 Ala 잔기로서 정밀화됨), 28-101 및 114-164, hzACO-1 경쇄의 1-215, 및 hzACO-1 중쇄의 1-219를 포함하였다.

정밀화에서 보인 R- 및 R-프리 사이의 비교적 큰 차이는 데이타의 제한된 해상력 (3.3 Å) 때문이고, 전자 밀도 맵의 해석에서 완전히 손실되는 IFN-α8 X-선 모델의 실질적인 확장 (stretch)이 존재한다. 전자 밀도 맵은 hzACO-1-Fab에 대한 IFN-α8의 안정화된 계면 내의 잔기를 명백하게 규정하는 반면, 항체 부위로부터 벗어나는 IFN-α8 X-선 구조 모델의 상세내역은 보다 덜 규정되고, 따라서 보다 덜 정확하게 결정된다.

결과

접촉은 Fab와 IFN-α8 분자 사이에 4.0 Å의 컷-오프 거리를 이용하여 CCP4 스위트 (suite)의 CONTACT 컴퓨터 프로그램에 의해 확인하였다. 인간 hzACO-1에 대한 생성되는 에피토프는 IFN-α8 (서열 30)의 다음 잔기를 포함하는 것으로 밝혀졌다: Ser 55, His 58, Glu 59, Gln 62, Gln 63, Asn 66, Glu 97, Leu 118, Arg 121, Lys 122, Phe 124, Gln 125, Arg 126, Thr 128, Leu 129, Thr 132). IFN-α8과의 상호작용에 관여하는 hzACO-1의 잔기 (파라토프)는 다음을 포함하였다: hzACO-1 경쇄 (L)의 Ser 32, Tyr 33, Tyr 35, Tyr 50, Ser 51, Trp 92, Ser 93, Tyr 95 및 Phe 97 (서열 32에 따른 넘버링, Kabat가 아님), 및 중쇄 (H)의 Thr 30, Asn 31, Tyr 32, Trp 33, His 35, Glu 50, Asn 52, Ser 54, His 55, Arg 57, Leu 101, Gly 102, Trp 105 (표 9 (서열 31에 따른 넘버링, Kabat가 아님)).

서열 30

서열 32

서열 31

도 9에서 볼 수 있는 바와 같이, IFN-α8 상의 hzACO-1 상호작용 에피토프는 IFNAR1 결합 에피토프와 부분적으로 겹치는 반면, IFNAR2 결합 에피토프는 hzCAO-1 결합 에피토프로부터 멀리 있다. 이러한 사실은 hzACO-1에 의한 IFN-α의 중화가 IFNAR2에 대한 것이 아니라 IFNAR1에 대한 IFN-α 결합의 중화에 의해 일어남을 제안한다. 따라서, hzACO-1은 IFN-α/IFNAR2 복합체에 결합하지만, 세포내 신호전달을 담당하는 3원 수용체 복합체 IFN-α/IFNAR1/IFNAR2의 형성을 억제하는 것으로 예상할 수 있다.

실시예 7: hzACO -1의 친화도 성숙을 위한 구조 기반 돌연변이의 설계

항체/항원 복합체의 에피토프 및 파라토프가 알려지지 않은 경우에, 매우 많은 가능한 아미노산 잔기는 항체의 친화도를 개선하기 위해 돌연변이되기 쉬울 수 있고, 또한, 특정 위치에서 최적의 잔기를 확인하기 위해 임의의 20개의 나머지 아미노산 잔기로 전환될 수 있다. CDR 구역은 돌연변이에 이용가능한 약 54개의 잔기를 보유한다. 따라서, 상호작용의 친화도를 개선하기 위해서, CDR 내에서만 54x20=1080개의 유사체가 생성될 수 있다. 또한, 친화도를 개선하기 위해 CDR 외부의 돌연변이가 이루어질 수 있다.

그러나, 항체/항원의 구조가 알려진 경우에, 친화도를 개선하는 보다 제한된 수의 정성된 돌연변이가 구조 예측에 기초하여 예측되고 분석될 수 있다. 따라서, 실시예 6에서 설명된 바와 같이, hzACO-1의 Fab 단편과의 복합체에서 IFN-α8의 결정 구조에 기초하여, 모든 IFN-α 하위형에 대한 hzACO-1 결합을 개선하는 3개의 돌연변이체가 확인되었다. 3개의 돌연변이체는 hzACO-1 HC T30R, hzACO-1 LC Y32E 및 조합된 hzACO-1 Y32E, T30R (Kabat에 따른 잔기 넘버링)이다. 돌연변이체의 확인은 아래에 설명된다.

LC Y32E: hzACO-1에 대한 결합 에피토프의 일부인, IFN-α8의 잔기 Lys 122에 대한 전자 밀도는 꽤 높은 이동성을 나타냄을 볼 수 있다. 또한, hzACO-1 경쇄의 잔기 Tyr 32 (Kabat 표기)의 원자 Oη는 Lys 122 측쇄의 Cβ 및 Cγ 원자를 향한다. 상기 상호작용은 임의의 최적 잔기-잔기 상호작용이 아니다. 경쇄 Tyr 32를 음대전 잔기, 예를 들어 Glu 또는 Asp로 돌연변이시키면, 항체 경쇄 Tyr 32 잔기와 IFN-α8의 양대전 Lys 122 잔기 사이에 강한 이온 결합을 형성할 가능성이 있다. 이러한 이유로, hzACO-1 항체의 친화도를 개선시키기 위해 Y가 E로 교환되었다.

HC T30R: X-선 구조에서 IFN-α8에 근접한 각각의 hzACO-1 잔기에 대해, 다음 특성을 계산하였다: 코어 측쇄 원자 (core)의 수, 주변 측쇄 원자 (peri)의 수, 전하 상호작용 (char)의 수, 수소 결합 (hybo)의 수 및 소수성 상호작용 (hyph)의 수를 아래 표 10에 제시한다:

코어 및 주변 원자의 수는 X-선 구조를 101 x 101 x 101 마디 격자 (node grid) 위에 겹쳐 놓고, 각각의 격자 점에 대해, 마디로부터 2.5 Å 미만인 원자의 수 (N_ex) 및 3.5 Å 미만인 원자의 수 (N_in)를 계산함으로써 계산하였다. 코어 마디는 hzACO-1 및 IFN-8 모두로부터의 원자를 포함하는 N_ex > 0을 갖는다. 주변 마디는 hzACO-1 및 IFN-α8 모두로부터의 원자를 포함하는 N_ex = 0 및 N_in > 0을 갖는다. 코어 측쇄 원자는 이제 임의의 마디로부터 2.5 Å 미만인 원자이다. 주변 측쇄 원자는 이제 임의의 마디로부터 2.5 Å 이상 및 3.5 Å 미만인 원자이다.

마지막으로, 주변 잔기는 주변 원자만을 갖고 상호작용하지 않는 잔기로서 정의되어, 이들은 결합을 생성하도록 변형될 수 있다. LC S92, HC T28, HC T30, HC P52, HC Q64 및 HC P99가 확인되었다. 중쇄 비-프롤린에 집중하면, 돌연변이 HC T28R은 D90과 상호작용 가능성이 있고, HC T30R은 D90 및 E97 모두와 상호작용 가능성이 있고, Q64R은 E114와 상호작용 가능성이 있을 것이지만, 다른 유사한 돌연변이도 또한 적용될 수 있음이 시각적 검사에 의해 밝혀졌다. E97만이 모든 인터페론 알파에 걸쳐 보존되기 때문에, HC T30R은 hzACO-1과 유사한 프로필로 최고 결합을 제공할 것으로 예상된다.

특이적 돌연변이 HC T30R은 hzACO-1의 친화도를 개선하기 위해 결합 부위의 주변에 전하-전하 상호작용을 확립하도록 설계되었다.

또한, LC Y32E 및 HC T30R 돌연변이 모두를 함유하는 이중 돌연변이체 (hzACO-1 Y32E,T30R로 명명함)를 생성시키고, 두 돌연변이가 추가 효과를 갖는지 결정하기 위해 분석하였다.

실시예 8 - hzACO -1, hzACO -1 변이체와 재조합 인간 I FN -α 하위형 사이의 상호작용에 대한 운동 파라미터의 결정.

단백질 상호작용은 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 분석을 이용하여 실시간으로 모니터링할 수 있다. 본 연구에서, SRP 분석은 재조합 인간 인터페론 알파 (IFN-α)의 다양한 하위형에 대한 친화도에 관하여, 항-IFNα 모노클로날 항체 hzACO-1 및 그의 변이체를 특성 결정하기 위해 비아코어 (Biacore) 3000 및 비아코어 T100 기기 상에서 수행하였다.

친화도 연구는 직접 결합 절차를 이용하여 수행하였고, 여기서 각각의 모노클로날 항체는 센서 칩 표면 상의 카르복시메틸화 덱스트란 막 (CM5)에 유리 아민기를 통해 공유 커플링되었다. 재조합 IFN-α 하위형 (피비엘 바이오메디컬 랩스, 미국 뉴저지주)을 다양한 농도로 주입한 후, 센서 칩 표면 상에 일정한 버퍼를 유동시켜 해리시켰다. 이러한 실험 설계를 사용하여, 고정된 모노클로날 항체에 대한 IFN-α의 결합은 하나의 IFN-α 분자가 하나의 항체 결합 부위에 결합하는 1:1 결합으로 간주될 수 있다. 상호작용에 대한 운동 파라미터는 1:1 상호작용 랭뮈어 (langmuir) 피팅 모델을 이용하여 계산할 수 있다.

정제된 모노클로날 항체를 CM5 타입 센서 칩 상의 개별 유동 셀 (cell)에 고정시켰다. 고정화는 1000 공명 단위 (RU)의 고정 수준을 목표로 하여, 표준 아민 커플링 절차를 이용하여 수행하였다.

HBS-EP pH 7.4 (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA 및 0.005％ 폴리소르베이트 P20)을 진행 버퍼, 및 재조합 IFN-α에 대한 희석제로서 사용하였다. 회합 (주입)은 4분이고, 이어서 12 내지 30분의 해리 기간이었다. 유동 속도는 50 ㎕/min이었다. 실험은 25℃에서 수행하였다. 모든 유동 셀 내의 검출은 동시에 이루어졌다. 유동 셀 #1은 고정된 항체를 포함하지 않았고, 배경 및 벌크 (bulk)의 공제를 위해 사용되었다.

운동 파라미터는 1:1 랭뮈어 결합 모델을 이용하는 제시된 항체-항원 조합에 대한 데이타의 포괄적 피팅에 의해 계산하였다. 데이타는 운동 파라미터의 계산 전에 대량-전송 제한에 대해 검사하였다.

실험은 비아코어 3000 및 T100 기기 상에서 수행하였다. 데이타는 비아에벌 (Biaeval) 4.1 및 비아코어 T100 평가 소프트웨어를 이용하여 평가하였다.

얻어진 운동 파라미터는 사용된 버퍼 내에서, 및 재조합 형태의 항원에서만 유효하다.

결과

친화도가 보유된 인간화 ACO-1 항체를 생성하기 위해, 상이한 전략을 이용하여 실시예 2, 3 및 7에 설명된 바와 같이 많은 인간화 변이체를 생성하였다. 재조합 인간 IFN-α 하위형과 hzACO-1의 변이체 사이의 상호작용에 대한 운동 파라미터는 SPR 분석에 의해 얻었다. 표 11에서 보이는 바와 같이, 비록 실시예 2에 기재된 바와 같이 생성된 hzACO-1이 말단절단된 CDR H2를 포함하고 복귀-돌연변이를 갖지 않지만, hzACO-1의 KD가 마우스 항체의 2배 내에 있는 것에 의해 알 수 있는 바와 같이 뮤린 ACO-1에 비해 hzACO-1의 친화도가 보유되었다. 따라서, 프레임워크 구역 내에서 인간으로부터 마우스 ACO-1로의 추가의 복귀-돌연변이가 실시예 2에서 확인되고 설명된 바와 같이 인간화를 위해 요구되지 않았다. 또한, hzACO-1 항체의 IFN-α 하위형 프로필가 표 2에 제시된 바와 같이 보유되었다.

전통적인 CDR 그라프팅에 의해 생성되고 따라서 큰 뮤린 CDR H2 (hzACO-1-kabat CDRH2로 지정됨)를 함유하는 인간화 ACO-1 분자에 비해 hzACO-1의 재조합 인간 IFN-αA와의 상호작용에 대한 운동 파라미터를 표 12에 나열한다. 제시된 바와 같이, 실시예 2에 설명된 바와 같이 인간화되고 hzACO-1-kabat CDRH2 분자보다 짧은 CDR H2를 함유하는 hzACO-1 분자의 친화도는 동일하였고, 이는 실시예 2에 기재된 인간화 과정이, 보다 많은 인간 서열을 가지면서 단순한 CDR 그라프팅에 의해 생성된 것만큼 우수한 인간화 변이체를 생성함을 보여준다.

또한, hzACO-1 및 hzACO-1-kabat CDRH2가 다양한 하위형의 인간 IFN-α 결합에 대한 동등한 운동 파라미터를 갖는지 조사하기 위해, 선택된 인간 IFN-α 하위형에 대해 해리 비교 실험을 수행하였다 (표 13). 이것은 보다 짧은 마우스 CDR H2 서열을 가짐에도 불구하고 hzACO-1-kabat CDRH2에 비해 모든 시험된 하위형에 대한 hzACO-1의 친화도가 보유되는 것으로 나타남을 보여준다.

hzACO-1의 친화도를 마우스 ACO-1 항체보다 개선하기 위해, IFN-αA 및 ACO-2 서열에 기초한 돌연변이를 함유하는 상이한 hzACO-1 변이체 사이의 운동 파라미터를 측정하였다 (표 11). 수행된 별개의 실험에서 얻어진 파라미터의 상관관계를 보여주기 위해, 각각의 개별 항체의 KD 값을 동일한 실험에서 hzACO-1의 값에 대해 표준화하고, 동일한 실험에서 hzACO-1의 KD 값에 대한 개별 mAb의 KD 값의 관계를 컬럼 "KD mAb vs. KD hzACO-1"에 제시한다.

친화도 결정은 모든 ACO2 유래된 hzACO-1 항체 변이체 (hzACO-1-I58S 제외)의 KD 값이 보다 낮은 nM 범위임을 추가로 입증하였다. KD 값에서 근소한 변동은 대개 kd의 차이에 관련한다. hzACO-1 내로 단일 아미노산 치환 N31S, A93V 또는 T28S 및 이들의 조합을 도입시키면 ACO-1와 유사한 수준으로 친화도를 약간 증가시켰다. hzACO-1-I58S 돌연변이는 kd 값에 대해 현저한 음의 효과를 갖고, 이는 hzACO-1/IFNα-A 복합체의 안정성에 대한 상기 특정 아미노산의 중요성을 입증한다.

hzACO-1 Fab/IFN-α8 결정 구조에 기초하여, 친화도를 훨씬 더 증가시키기 위해 많은 아미노산 치환을 hzACO-1 내에 도입하였다 (실시예 7 참조). 이 중에서, 2개의 단일 치환, 즉, 경쇄의 Y32E 및 중쇄의 T30R은 IFN-αA에 대한 친화도를 각각 약 2배 및 6배 증가시키는, 친화도에 대한 유의한 양의 효과를 가졌다 (표 14). 주목할 사실은 2개의 돌연변이를 조합함으로써, Y32E 및 T30R을 모두 함유하는 hzACO-1 구성체에서 IFN-αA에 대한 친화도의 약 10배 증가가 관찰되었다는 것이다 (표 15).

표 16의 운동 데이타는 합리적인 설계 방안에 기초하여 생성된 hzACO-1 Y32E,T30R 구성체가 IFN-α1에는 결합하지 않지만 시험된 나머지 하위형에 결합하기 때문에 그의 IFN-α 하위형 프로필을 보유하였음을 설명한다. Y32E,T30R 돌연변이에 의해 유발된 운동 파라미터에 대한 효과가 다양한 하위형의 인간 IFN-α에 대한 결합에 반영됨을 검증하기 위해, 선택된 인간 IFN-α 하위형에 대한 해리 비교 실험을 수행하였다 (표 16). 이중 돌연변이체 hzACO-1 구성체의 제안된 돌연변이는 IFN-α8의 구조에 기초한 것이지만, 예측 불가능하게, 6-64배로 변하는 개선된 오프율 (off-rate)이 모든 시험된 인간 IFN-α 하위형에 대해 관찰되었다.

실시예 9 - CPE -분석에서 hzACO -1 구성체의 분석

본 실시예에서는 hzACO-1이 hzACO-1에 의해 영향을 받지 않은 IFN-α1 및 IFN-αD를 제외한 시험된 모든 IFN-α 하위형의 보호 효과를 억제할 수 있음을 보여준다.

물질 & 방법

사용된 항-IFN-α 중화 분석은 A549 세포에 대한 EMC 바이러스의 용해 효과에 기초한다. 모든 IFN-α 하위형은 A549 세포에서 EMC 바이러스 복제를 억제하여 세포 생존을 유도할 수 있고, 이것은 세포성 DNA 염색으로서 측정할 수 있다. 상이한 IFN-α 하위형에 대한 항-IFN-α 항체의 중화 효과는 증가된 세포 용해에 상응하는, 세포성 DNA 염색의 감소에 의해 측정할 수 있다.

분석은 96 웰 플레이트 (넝크 (Nunc), Cat. No. 167008)에서 수행하였고, 여기서 각각의 웰은 최종 부피 200 ㎕를 함유하였다. 모든 IFN-α 제제는 피비엘 바이오메디컬 래보래토리스 (미국 뉴저지주)로부터 입수하였다.

각각의 웰에 4가지 용액 (IFN-α, hzACO-1, 세포 및 바이러스)을 각각 50 ㎕ 부피로 첨가하였다. 모든 용액은 10％ FCS가 존재하는 F12Kaighn 배지 (깁코, Cat. no.21127) 내에 제조하였다. 각각의 IFN-α 하위형에 대한 구체적인 농도 (아래 표 17에 나열된)는 선행 연구에서 유도되었다. 분석에 사용된 항체 농도는 예를 들어, 뮤린 항체 ACO-1.5.2 및 ACO-2.2를 사용하여 얻은 기존의 데이타에 기초하여 선택하였다.

각각의 IFN-α 하위형을 hzACO-1과 함께 2시간 동안 37℃, 5％ CO₂에서 예비-인큐베이팅하였다. 항-인터페론 항체를 아래 표 17에 제시된 바와 같이 희석하였다. 항체를 IFN-α와 함께 예비-인큐베이팅한 후, 50 ㎕의 세포-용액 (300000개 세포/mL)을 첨가하여 15000개 세포/웰을 얻었다. 37℃, 5％ CO₂에서 4.5시간 인큐베이팅한 후, 50 ㎕ EMC 바이러스를 10＾3.5 TCID₅₀의 농도에서 첨가한 후, 48시간 동안 37℃, 5％ CO₂에서 인큐베이팅하였다.

후속적으로 상등액을 조심스럽게 제거하고, 50 ㎕ 크리스탈 바이올렛 용액 (0.5％ 크리스탈 바이올렛, 25％ 메탄올)을 첨가하였다. 실온에서 15분 인큐베이션 후에, 웰을 물로 세척하고, 철야 건조하였다.

이어서, 건조된 플레이트에 200 ㎕/웰의 순수 메탄올을 15분 동안 첨가하여 세포로부터 크리스탈 바이올렛을 추출하였다. 추출 후에, 100 ㎕의 상등액을 새로운 96-웰 플레이트 (넝크, Cat. No. 256510)에 조심스럽게 옮기고, 100 ㎕ Milli-Q 물을 각각의 웰에 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 ELISA 판독기에서 590 nm에서 측정하였다.

ELISA 판독기에서 구한 비처리 데이타를 분석 전에 메탄올 및 플레이트 배경에 대해 교정하였다.

결과 및 논의

분석에서 관찰된 세포병변 효과가 항체 및/또는 IFN-α의 세포독성에 의해 유발되지 않거나 바이러스에 대한 세포의 IFN-α-보호의 임의의 결여가 세포병변 효과를 유발하지 않았음을 보장하기 위해, 연구의 모든 플레이트에 대해 6개의 상이한 대조군 (세포, 세포+항체, 세포+IFN-α, 세포+항체+IFN-α, 세포+바이러스, 및 세포+IFN-α+바이러스)을 사용하였다. 분석에서 유의한 세포독성 효과는 관찰되지 않았고, 어떠한 인터페론 수준에서도 대조군에서 세포병변 효과의 징후가 존재하지 않았다.

도 4에 제시된 바와 같이, 상기 CPE-분석은 거의 모든 인터페론 하위형의 보호 효과가 hzACO-1에 의해 억제될 수 있음을 보여주었다. 그러나, IFN-αD 및 IFN-α1의 보호 효과는 50000 ng/mL의 항체 농도에서도 hzACO-1에 의해 억제되지 않았다. 따라서, 마우스 ACO-1의 특이성은 hzACO-1 구성체 내에 보유되었다.

실시예 10 - 리포터 유전자 ( RG ) 생물학적 분석에서 ACO - 유래된 항체의 분석

재조합 IFNα 하위형의 생물학적 활성을 중화하는 hzACO-1 항체 변이체의 능력을 평가하기 위해, 루시퍼라제-기반 리포터 유전자 분석을 이용하였다.

물질

둘베코 (Dulbecco) 개질 이글 (Eagle) 배지 "완전": 페놀 레드 포함 DMEM + 10％ FCS + 2 mM L-글루타민 + 페니실린 + 스트렙토마이신 + 2-me, 넝크 96-웰 광학 바닥 플레이트, 흑색 조직 배양 처리됨, 1 mM Ca^{2 +} 및 1 mM Mg^{2 +}를 포함하는 PBS, 스테디-글로 (Steady-Glo) 루시퍼라제 분석 시스템 (프로메가 (Promega)).

루시퍼라제 리포터 유전자를 추진시키는 Mx 프로모터를 보유하는 IFN-유도가능 구성체를 사용한 A549 세포주 (CLL-185, ATCC)의 안정한 형질감염에 의해 93D7 세포주를 유도하였다. Mx 프로모터는 뮤린 MxA 프로모터를 함유하는 1.6 kb BamHI 단편, 및 pSP64-Mxp(PstI-PvuII)-rβglo로부터 절제된 IFN 반응 성분으로 이루어진다 (Lleonart et al., (1990) Biotechnology 8: 1263-1267).

사용된 IFN-α 하위형 (모두 피비엘 바이오메디컬 래보래토리스 (미국 뉴저지주))을 도 5에 나열한다.

방법

RG 분석은 불투명한 넝크 96-웰 광학 바닥 플레이트에서 4중 웰 내에서 수행하였다. 모든 분석을 위해, 양성 대조군 IFNa를 비-자극된 세포 및 IFNα 자극의 부재 하에 항체로 처리된 세포를 함유하는 음성 대조군 웰로서 포함시켰다.

구체적으로, 부착성 93D7 세포는 배양 배지를 제거함으로써 플라스크로부터 수거하고, PBS로 1회 세척하고, 트립신 처리하였다. 트립신 처리는 완전 DMEM을 사용하여 중지시켰다. 세포를 계수하고, 완전 DMEM 내에 600,000/ml로 조정하였다.

정제된 항-IFN-α mAb를 재조합 IFN 하위형과 함께 총 부피 100 ㎕의 완전 DMEM 내에서 1 h 동안 37℃ + 5％ CO₂에서 예비-인큐베이팅하였다. 항체-IFN 인큐베이션 후에, 50 ㎕ 93D7 세포를 첨가하고, 5 h 동안 37℃ + 5％ CO₂에서 인큐베이팅하였다.

재조합 IFN 하위종에 의한 MxA-추지된 루시퍼라제 유도를 분석하기 위해, IFN 농도는 각각의 웰에 넣는 양을 100 ㎕ 내에 함유되도록 조정하였다. 100 ㎕의 IFN을 4중 웰에 넣고, 1 h 동안 37℃ + 5％ CO₂에서 인큐베이팅하였다. 후속적으로, 50 ㎕ 세포를 첨가하고, 추가로 5 h 동안 계속 인큐베이팅하였다.

정제된 mAb를 사용하여 재조합 IFN 하위종에 의한 MxA-추진된 루시퍼라제 유도의 억제를 분석하기 위해, 재조합 IFN의 목적하는 희석액 50 ㎕을 웰마다 첨가하였다. 이어서, 완전 DMEM 내에 희석시킨 항체 50 ㎕을 웰에 첨가하고, 1 h 동안 37℃ + 5％ CO₂에서 인큐베이팅하였다. 상기 인큐베이션 후에, 세포를 첨가하고, 추가로 5 h 동안 계속 인큐베이팅하였다.

5 h 인큐베이션 후에, 다중채널 피펫을 사용하여 배지를 세포로부터 조심스럽제 제거하였다. 이어서, 접착 흑색 블로커 (blocker)를 96 웰 플레이트의 바닥에 고정시켰다. Ca^{2 +} 및 Mg^{2 +} 이온이 존재하는 PBS 100 ㎕을 각각의 웰에 첨가하였다. 100 ㎕의 재구성된 스테디-글로 시약을 각각의 웰에 첨가하고, 각각의 웰 내의 내용물을 완전히 혼합하였다. 플레이트를 투명한 접착 스트립으로 밀봉하였다. 실온에서 암소에서 5분 인큐베이션 후에, 발광을 탑카운트 (Topcount) 발광 계수기 (퍼킨 엘머 (Perkin Elmer))에서 판독하였다.

IFN 유도된 (MxA 추진된) 루시퍼라제 활성에 대한 항체에 의해 발휘된 억제 정도의 계산을 위해, 계수는 항체의 부재 하의 활성 수준에 표준화된 다양한 IFN-α 하위형의 Ab 억제와 비교하였고, 이 값을 100％로 설정하였다. 변이체 형태의 항체를 비교하기 위해, 단일 IFN-α 데이타의 억제를 비처리 루시퍼라제 계수로서 제시한다. IFN는 초기에 분석에서 평탄역에 도달한 EC50 및 IFN 농도를 결정하기 위해 항체의 부재 하에 적정하였다. 항체 억제에 대해 시험할 때, IFN은 일반적으로 루시퍼라제의 견고한 유도뿐만 아니라 분석에서 포화 미만 수준에서 작동하는 것을 보장하기 위해 최대 자극 수준의 80％에서 사용되었다. Prism (그래프패드 소프트웨어, 인크. (GraphPad Software, Inc.), 미국 샌디에고) 소프트웨어를 계산 및 데이타 디스플레이를 위해 사용하였다.

결과 및 논의

인간화 ACO-1 구성체를 리포터 유전자 분석에서 다양한 인간 IFN-α 하위형을 억제하는 그의 능력에 대해 평가하였다. 도 5는 hzACO-1 항체에 의한 12가지 IFN-α 하위형의 억제에 대한 표준화된 데이타를 보여준다. 항체의 부재 하의 IFN-α 자극을 100％ 설정한 한편, 모의 (mock) 처리 세포 (배지만을 공급함)를 0％로 설정하였다. 데이타 점을 표준 오차와 함께 제시한다. 곡선은 최적합 s자형 반응 곡선으로서 Prism 소프트웨어를 사용하여 계산하였다. hzACO-1은 IFN-αD를 제외하고 IFN-α의 모든 시험된 하위종을 억제할 수 있고, 따라서, 모 마우스 ACO-1 항체의 특이성이 hzACO-1 항체에서 인간화 동안 보유되었다. 높은 항체 농도에서 IFN-α 활성이 배경 수준으로 감소된다는 점에서, 억제가 완료되었다. 다양한 IFN-α 하위형의 억제에 대한 IC50은 본 연구에서 28 ng/ml 내지 314 ng/ml 범위였다. IFN-αD는 심지어 보다 높은 hzACO-1 농도에서도 억제될 수 없었다.

도 10은 RG 분석에서 인간화 ACO-1 (hzACO-1) 및 그의 2개의 변이체에 대한 마우스 ACO-1 Ab의 비교를 보여준다. 하나의 변이체는 전체 CDR H2를 수용하는 인간화 ACO-1 (hzACO-1-kabat CDRH2로 지정됨)인 반면, hzACO-1은 실시예 2에 설명된 바와 같이 보다 짧은 CDR H2를 사용하여 구성되었다. 또한, 도면에서는 실시예 7에 설명된 바와 같이, 합리적인 설계를 통해 IFN-α와의 상호작용을 위해 최적화된 또다른 돌연변이된 hzACO-1 (hzACO-1 Y32E,T30R로 지정됨)을 보여준다. 이들 4가지 재조합 mAb 변이체를 RG 분석에서 5가지 상이한 대표적인 IFN-α 하위형의 억제에 관하여 비교하였다.

hzACO-1은 5가지의 모든 IFN 하위형에 대해 마우스 ACO-1에 거의 유사한 IC50 값을 디스플레이하였고, 여기서 정량적으로, IC50은 실시예 8에서 보고된 관찰된 KD보다 2배 더 작다 (상대적인 IC50 값에 대해서는 표 18 참조). 따라서, 인간화는 기능적 억제에 대해 모 ACO-1 항체의 2배 미만의 친화도 손실을 보이면서 달성되었다. 결론적으로, ACO-1의 mAb 인간화로 IFN-α에 대한 친화도를 보유한 항체를 생산하였다. 따라서, 친화도 및 효력은 모두 원래의 마우스 ACO-1에 비해 hzACO-1 항체 내에 보유되는 것으로 간주되었고, 추가의 복귀-돌연변이가 요구되지 않았다.

실시예 2에 설명된 바와 같이, ACO-1의 인간화 방법으로 단순한 CDR 그라프팅에 의한 일반적인 인간화에 비해 CDR H2 내에 비교적 더 많은 인간 아미노산을 갖는 항체를 생성하였다. 이는 도 10 및 표 18에서 보이는 바와 같이 IFN-α 하위형의 중화를 위한 인간화 ACO-1의 효력을 감소시킬 것으로 예상될 수 있으나, 놀랍게도 hzACO-1 및 hzACO-1-kabat CDRH2가 시험된 모든 IFN-α 하위형에 대해 동등한 효력을 가지기 때문에 이는 그렇지 않다. 이는 실시예 8에 설명된 바와 같이 2가지 ACO-1 변이체에 대해 보고된 친화도와 일치한다.

실시예 3에 설명된 바와 같이 ACO-2 유래된 hzACO-1 변이체의 효력을 결정하기 위해, 이들을 RG 분석을 이용하여 hzACO-1와 비교하였다. 비교는 2가지 IFN-α 하위종 (IFN-αF 및 IFN-αA)를 사용하여 이루어졌다. 4가지 상이한 단일 아미노산 치환을 시험하였다: T28S (즉, 위치 28에서, (Kabat에 따른) 트레오닌이 세린으로 치환되었다), I58S, N31S 및 A93V.

I58S 변이체는 IFN-작용을 감소된 효력으로 및 가능하게는 또한 감소된 효능으로 (IFN-αA) 억제하였고, T28S 및 N31S 변이체는 모두 hzACO-1과 유사한 효력을 디스플레이하였다. 그러나, A93V 치환된 변이체는 RG 분석에서 측정될 때 IFN-효과의 억제에 대해 증가된 효력을 보였다 (도 6). 치환의 효과 차이가 상이한 IFN-α 하위형 사이에서 검출될 수 있으나, 경향은 4개의 모든 경우에서 2가지 형태에 대해 동일하였다.

실시예 6의 결정 구조를 사용한 합리적인 설계를 통해, IFN-α에 대한 결합을 개선하기 위해 실시예 7에 설명된 바와 같이 2개의 아미노산이 변화된 돌연변이체, 즉, hzACO-1의 HC T30R, LC Y32E (ACO-1 Y32E,T30R로 지정됨)를 구성하였다. 돌연변이는 도 10 (A-E)에서 보이는 바와 같이 IFN-α8의 구조에 기초하였지만, 놀랍게도 상기 돌연변이체는 모든 시험된 IFN-α의 억제에 대해 증가된 효력을 가졌다. 또한, 표 18은 효력 증가분이 구체적인 하위형에 의존적인 반면, 16배 및 50배까지의 효력 개선의 순서임을 보여준다.

실시예 6에서 결정 구조로부터 얻어진 에피토프 정보는 상기 에피토프에 개선된 결합 친화도를 갖는 다른 항체 변이체를 설계하기 위해 사용될 수 있다는 결론이 도출된다. 또한, 본 발명에 따른 그러한 인간화 항체 변이체는 본 발명의 범위에 포함된다고 결론지을 수 있다.

실시예 11 - 인간화 ACO - 유래된 항체의 단백질 특성 결정

본 실시예는 hzACO-1 및 상이한 변이체의 열 안정성에 관한 것이다.

물질

항체

인간 IgG1, IgG2 및 IgG4 이소형을 사용할 때 발현된 hzACO-1

hzACO-1-T28S

hzACO-1-N31S

hzACO-1-A93V

hzACO-1-T28S-N31S

다음은 연구에서 사용된 버퍼 (100 mM) 및 그의 pH 값의 목록이다: 시트르산/시트르산나트륨, pH 3.0, 3.5; 아세트산나트륨, pH 4.0, 4.5, 및 5.0; 히스티딘, pH 6.0, 6.5; 이미다졸, pH 7.0; 글라이신-글라이신 pH 8.0, 9.0, 10.0.

다음은 연구에서 사용된 첨가제 및 그의 농도의 목록이다: NaCl, 100 mM; 수크로스 0.25 M, 0.50 M; 페놀, 0.5％; 트윈 (Tween) 80, 0.01％; 글리세롤 10％.

써모플루오르 안정성 측정

DMSO 중 10 ㎕ 400X SYPRO 오렌지 단백질 겔 스테인 5000X 농축액의 용액 (인비트로겐 (Invitrogen Molecular Probes)), 25 ㎕ 버퍼 및 10 ㎕ 단백질 (10 ㎛)을 96-웰 PCR-플레이트 (바이오라드 (Biorad))의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 Microseal B 접착 밀봉제 MSB-1001 (바이오라드)로 밀봉하고, MyiQ 단일-색상 실시간 PCR 검출 시스템 (바이오라드) 내에서 25에서 95℃로 0.5℃의 증가분으로 가열하였다. 플레이트의 웰 내의 형광 변화를 전하 결합 소자 (CCD) 카메라를 사용하여 동시에 모니터링하였다. 여기 및 방출 파장은 각각 490 및 575 nm이었다. 단백질 언폴딩 (unfolding) 전이에 대한 중간점 온도는 온도의 함수로서 형광 강도의 제1 유도 최대값으로서 결정되었다.

hzACO-1 및 변이체에 대한 써모플루오르 그래프는 IgG 단백질에 대한 2개의 예상된 온도 전이를 보여주었고, 이는 2개의 주요 도메인 Fc 및 Fab를 반영한다. 단백질은 보다 낮은 pH에서 보다 낮은 Tm을 보여주었다. pH 5.5를 초과하면, 전이 중간점은 다소 일정하였다.

첨가제의 효과는 상이한 항체에 대해 동일하였다. 일반적으로, 0.5M의 수크로스가 가장 큰 안정화 효과를 보인 반면, NaCl, 페놀 및 트윈 80의 첨가는 탈안정화 효과를 갖는 것으로 보였다.

보다 낮은 pH (pH 3.5)에서, hzACO-1 및 상이한 변이체 사이의 안정성 차이가 관찰되었다 (도 7A). 이중 돌연변이체 hzACO-1-T28S-N31S 및 단일 돌연변이체 hzACO-1-A93V는 상기 pH에서 최고 안정성을 보여주었다. 이것은 바이러스 불활성화 단계가 종종 pH 3.5-4.0에서 수행되므로, 치료 항체 생성물에 대한 정제 과정에서 중요할 수 있다. 보다 높은 pH (pH 4.5, 5.5; 각각 도 7B 및 7C)에서, 상기 안정성 차이는 감소하였다.

용액 안정성 연구

15 mM 히스티딘 (pH 6.5), 수크로스 20 mg/ml 및 트윈 80 0.01％ 내의 hzACO-1-IgG4, hzACO-1-IgG1 및 hzACO-1-IgG2의 용액을 40℃에서 인큐베이팅하고, 최초에 및 5주 후에 분석을 위해 샘플을 취하였다. hzACO-1의 무손상 단백질, 가용형 응집물 및/또는 단편의 분포를 크기 배제 크로마토그래피 (SEC-HPLC)를 이용하여 결정하였다. 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 시스템 모델 1100 또는 1200 액체 크로마토그래피 시스템 (애길런트 테크놀로지스 (Agilent Technologies, 미국 캘리포니아주 팔로 알토))을 0.8 mL/min의 유속에서 pH 7.2를 이용하고 이동상으로서 포스페이트-완충 염수 (PBS)를 사용하여 BIOSEP SEC 3000 (페노메넥스 (Phenomenex)) 컬럼과 함께 사용하였다. 단백질은 215 nm에서 OD를 모니터링함으로써 검출하였다. 총 단백질 면적 내의 각각의 피크의 백분율을 계산하였다.

형성된 고분자량 형태의 hzACO-1-이소형의 양을 도 11에 제시하고, 이는 IgG4 구성체가 인큐베이션 동안 응집물 형성을 보이지 않았지만, IgG1 및 IgG2 이소형은 모두 고분자량 변이체를 형성하였음을 명백하게 보여준다.

또한, hzACO-1-IgG1 변이체는 인큐베이션 후에 저분자량 단편을 보여주었다. 단편의 양은 1.3％이었다.

따라서, 안정성 관점에서, hzACO-1 IgG4가 상응하는 IgG2 및 IgG1 항체보다 더 매력적인 치료 분자이다.

실시예 12 - ADCC 분석.

실시예 6에 설명된 바와 같이, ACO-1 mAb 및 그의 인간화 버전은 타입 I 인터페론 알파 수용체 서브유닛 1 (IFNAR1)에 대한 IFN-α의 결합을 억제함으로써 IFN-α의 활성을 차단할 수 있다. 따라서, 치료적 인간화 ACO-1 mAb는 세포 표면에 결합하여, 항체, IFN-α 및 IFNAR2로 이루어지는 복합체를 형성할 수 있다. 이것은 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 유도하는 ACO-1의 위험을 상승시킨다.

이를 위해, IFN-α2A의 존재의 존재 하에 IgG4 하위형으로서 발현된 hzACO-1 항체의 능력을 평가하기 위해 ADCC 실험을 수행하였다.

물질 및 방법.

Raji 세포 (인간 B 세포주 (ATCC # CCL-86))을 표적 세포로서 사용하였다. Raji 세포를 10％ 태소 혈청, 10 mM HEPES, 1 mM 피루브산나트륨, 1 mM 글루타민, 2,5 g/l 글루코스 및 1％ 페니실린/스트렙타마이신을 보충한 RPMI1640 내에서 배양하였다. 고도로 정제된 인터페론-α2A를 분석을 위해 사용하였다. 단백질을 사용하기 전에 생물학적 활성에 대해 리포터 유전자 분석에서 시험하였다. 리툭산® (노메코 에이/에스 (Nomeco A/S, 덴마크))을 B 세포 표면 항원 CD-20을 발현하는 B 세포주인 Raji 세포를 사용할 때 ADCC에 대한 양성 대조군으로 사용하였다.

표적 세포를 수거하고, 혈구계산기에서 계수하였다. 1.5*10⁶ 세포를 15 ml 튜브에 옮기고 원심분리하였다. 상등액을 완전히 제거하고, 세포 펠렛을 10⁶ 세포당 100 μCi ⁵¹Cr (크롬-51) 내에 재현탁하였다 (부피는 붕괴표에 따라 조정하였다). 37℃에서 IFN-α와 함께 1시간 인큐베이션 기간 동안, 바이알을 15분마다 두드렸다. 후속적으로, 세포를 배지 (RPMI1640, 10％ FCS)로 2회 세척하고, 2 ml의 분석 배지 내에 재현탁하였다. 5000개의 ⁵¹Cr 표지된 세포를 96 웰 플레이트 (평저)에서 50 ㎕의 부피 내에 플레이팅하였다. 모든 샘플을 삼중으로 분석하였다. 최대 및 최소 방출을 효과기 세포 없이 웰 내에서 결정하였다. 최대 방출: 5000개의 표적 세포/웰 + 1％ Triton X-100. 최소 방출: 5000 표적 세포/웰. 효과기 세포를 표준 기술을 이용하여 피콜 (Ficoll) 밀도 원심분리에 의해 '버피 코트 (buffy coat)'로부터 정제하였다. 등급별 수의 새로 단리된 인간 PBMC를 각각의 웰에 첨가하였다. 다음 효과기 대 표적 (E:T) 세포의 비를 사용하였다: 10, 20, 40 및 80. 모든 실험에서, hzACO-1을 10 ㎍/mL (66 nM)의 포화 농도에서 시험하였다. IFN-α2A는 0.5, 2.5, 5, 및 10 nM에서 시험하였다. 최종 분석 부피는 200 ㎕이었다. 37℃에서 4시간의 인큐베이션 후에, 30 ㎕의 상등액을 LumaPlate™에 옮기고 철야 대기 건조시켰다. 방사성은 탑카운트 NXT (퍼킨엘머, 미국)에서 결정하였다. 데이타를 GraphPrism® 프로그램에 입력하고, 삼중 실험의 분당 평균 계수 및 상응하는 표준 편차를 계산하였다.

결과.

도 12에서 보이는 바와 같이, 배경 (세포 또는 IFN-α를 갖는 세포)을 넘는 ADCC의 유도는 IFN-α의 존재 또는 부재 하에 IgG4로서 발현된 hzACO-1 분자에 대해 관찰될 수 있다. 이와 대조적으로, 양성 대조군으로서 사용된 리툭수맙은 상이한 비의 효과기 및 표적 세포 비 (E:T)에서 세포 용해를 유도하였다.

실시예 13 - 보체 결합 ELISA 분석.

실시예 6에서 설명한 바와 같이, ACO-1 mAb 및 그의 인간화 버전은 타입 I 인터페론 알파 수용체 서브유닛 1 (IFNAR1)에 대한 IFN-α의 결합을 억제함으로써 IFN-α의 활성을 차단할 수 있다. 따라서, 치료적 인간화 ACO-1 mAb는 세포 표면에 결합하여, 항체, IFN-α 및 IFNAR2로 이루어지는 복합체를 형성할 수 있다. 이것은 보체계를 활성화시키고 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 유도하는 위험을 상승시킨다.

상기 보체 결합 연구의 목적은 인간 IgG4 이소형으로서 발현된 hzACO-1이 hIFN-α 상의 대응하는 에피토프에 결합하여 그와 복합체를 형성할 때 고전적인 보체 경로가 활성화되는지 여부를 시험하는 것이었다. 이것은 C4에 대한 항체의 결합을 측정하는 ELISA를 이용함으로써 달성된다. C4의 결합은 C1s가 변화되고 보체 캐스케이드가 시작되었음을 나타낸다. 일단 C4가 결합되면, 혈장으로부터 다른 보체 성분이 다시 활성화되고, 캐스케이드의 다음 성분에 결합하여, 그를 효소에 의해 절단시킬 것이다.

물질 및 방법

스트렙타비딘-코팅된 미량적정 플레이트 (236001, 넝크)를 ELISA 플레이트로서 사용하였다. 비오티닐화 hIFN-α2A를 항원 공급원으로서 사용하고, 플레이트를 세척 버퍼 (10 mM Na₃PO₄ + 145 mM NaCl + 0.05％ 트윈 20)로 희석시킨 0.25 ㎍/ml 단백질에 의해 100 ㎕/웰로 코팅하였다. 상기 IFN-α 농도는 ELISA에서 최적 코팅 농도인 것으로 나타났다. 플레이트를 60분 동안 RT에서 부드럽게 진탕하면서 인큐베이팅한 후, 세척 버퍼로 5회 세척하고, 여기서 마지막 세척으로부터의 버퍼를 플레이트 상의 가능한 잔여 결합 부위를 차단하기 위해 30분 동안 플레이트 내에 남겨두었다. 버퍼를 플레이트로부터 버리고, 세척 버퍼로 희석시킨 100 ㎕ hzACO-1 mAb를 플레이트에 1 ㎍/ml로 첨가하였다. 플레이트를 60분 동안 RT에서 부드럽게 진탕하면서 인큐베이팅하였다. 플레이트를 세척 버퍼로 5회 세척하였다. 폴리클로날 항-IgG4 pAb를 hzACO-1 IgG4 mAb의 가교결합에 의한 양성 대조군으로서 사용하였다. 항-IgG4 pAb mAb를 세척 버퍼 내로 희석하고, 32 ㎍/ml로부터 32 ng/ml까지 연속 희석액으로 100 ㎕/웰로 플레이트에 첨가하였다. 항-IgG4 pAb의 2가지 상이한 정제, 즉 하나의 친화도 정제된 항체 및 하나의 단백질 A 정제된 항체를 사용하였다. 플레이트를 60분 동안 RT에서 부드럽게 진탕하면서 인큐베이팅하였다. 플레이트를 세척 버퍼로 5회 세척하였다. 혈장 버퍼 (PBS w/ 0.3 mM Ca^{2 +}, 1 mM Mg^{2 +}) 내에 1:200으로 희석시킨 인간 혈장을 100 ㎕/웰로 첨가하였다. 플레이트를 60분 동안 37℃에서 부드럽게 진탕하면서 인큐베이팅하였다. 플레이트를 5회 세척하고, 각각 세척 버퍼 내에 1:2000으로 희석시킨 마우스 항-인간 C4 (HYB162-02 + HYB162-04, SSI)를 플레이트에 100 ㎕/웰로 첨가하였다. 플레이트를 60분 동안 RT에서 부드럽게 진탕하면서 인큐베이팅하였다. 플레이트를 5회 세척한 후, 세척 버퍼 내에 1:1000으로 희석시킨 HRP-토끼 항-마우스 IgG (DAKO P0260)를 100 ㎕/웰로 첨가하였다. 플레이트를 5회 세척하고, 모든 웰에 100 ㎕의 TMB 기질을 첨가하였다. 약 6분의 인큐베이션 후에, 100 ㎕의 4M H₃PO₄를 모든 웰에 첨가하여 효소 반응을 중지시켰다. 색상을 빅터 (Victor) 플레이트 판독기 (월락 (Wallac))에 의해 분광광도계로 측정하였다.

결과.

인간 IgG4 이소형으로서 발현된 hzACO-1을, IFN-α로 코팅된 플레이트를 사용하여 ELISA에 의해 보체 성분에 결합하는 능력에 대해 시험하였다. 이는 고전적인 보체 캐스케이드 내의 성분 중 하나인 C4에 대한 결합을 검출함으로써 시각화하였다. 도 13에 제시된 바와 같이, hzACO-1 IgG4는 보체를 고정할 수 없었다. 양성 대조군으로서, hzACO-1 IgG4 항체의 가교결합에 의한 결합을 유도하기 위해 폴리클로날 항-IgG4 pAb를 사용하였다. hzACO-1이 항-IgG4 pAb와 교차결합되면, 항-IgG4에 대한 C4의 명백한 용량 의존 결합이 검출되었다.

실시예 14 - 항체 이소형의 선택.

인간화 모노클로날 항체를 발현시킬 때, 전장 인간 항체의 발현을 위해 인간 항체 이소형을 선택할 필요가 있다. 중화 항-IFN-α 항체의 개발을 위해, Fc-매개된 효과기 기능이 요구되지 않는다.

또한, ACO-1 유도된 항체는 IFN-α 활성을 중화할 수 있지만 (실시예 9 및 실시예 10), 실시예 6에서 설명한 바와 같이 ACO-1 항체 변이체의 결합 에피토프는 IFNAR2 수용체 서브유닛과 IFN-α의 동시 결합에 대해 적합성이다. 따라서, 치료적 hzACO-1 mAb는 가용형 IFN-α 시토킨에 결합하지만, mAb는 사실상 Fc 매개된 효과기 기능의 동원에 의해 세포독성을 야기하는 IFN-α/IFNAR2 복합체 능력을 통해 세포 표면에 결합할 수 있다. 이에 추가로, 타입 I IFN (IFN-α 및 IFN-β)에 대한 항체의 경우에, 항-IFN mAb의 Fc 부분은 사실상 아래에 설명된 특정 세포 종류에서 IFN의 중화 대신에 강화를 일으키는 바람직하지 않은 생물학적 효과를 유발시킬 수 있는 것으로 설명되었기 때문에 (Moll HP. et al., J Immunol 180, 1594-604, 2008) 항체 이소형의 선택이 특히 중요하다.

타입 I IFN의 존재 하에, 다른 세포 종류에서 IFN 활성을 정상적으로 중화하는 인간 IFN-α 또는 IFN-β에 대한 항체는 대신에 IFN-α 또는 IFN-β의 존재 하에 인간 내피 세포 및 PMBC 내에서 IFN 활성을 유도한다. 이들 연구에 사용된 항체는 인간 Fc 수용체에 교차 결합하는 것으로 알려진 마우스 IgG1 이소형이다. IFN 활성의 유도는 동일한 항체의 Fab 또는 Fab2 단편이 아니라 무손상 항체에서만 관찰되고, 항체 이소형 대조군 mAb를 사용한 Fc 수용체의 차단에 의해 억제되는 것으로 보인다. 따라서, 상기 현상의 분자 기전은 알려지지 않았지만, 이들 mAb가 Fc 부분을 통해 세포 표면 수용체에 결합할 것을 요구하는 것으로 보인다. 또한, 타입 II IFN, IFN-γ에 대한 항체, 및 유사한 현상이 타입 I IFN 수용체, IFNAR에 대한 항체에 대해 관찰되지 않았기 때문에, 상기 현상은 타입 I IFN에 특이적인 것으로 보인다 (Moll HP. et al., J Immunol 180, 1594-604, 2008).

요약하면, IFN-α Fc 매개 효과기 기능의 중화를 위한 치료적 항-IFN mAb의 개발은 요구되지 않고, 실제로 세포독성을 유발하거나 항-IFN-a mAb로 처리된 환자에서 특정 세포 종류 내에서 IFN 활성을 강화함으로써 바람직하지 않은 생물학적 효과를 유발할 수 있다. 따라서, 효과기 기능을 유도할 수 없는 인간화 mAb의 생성이 중요할 수 있다.

4가지 상이한 인간 항체 이소형, 즉 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4가 존재한다. 이들 중에서 IgG1 및 IgG3은 Fc 수용체 및 보체에 대한 결합에서 가장 효율적이고, 따라서 Fc 매개된 효과기 기능, 예를 들어 세포 의존 세포성 세포독성 (ADCC) 및 보체-의존성 세포독성 (CDC)의 활성화를 유발시킨다 (Salfeld JG. Biotechnol 25, 1369-1372, 2007). 다양한 Fc 수용체 및 C1q의 결합을 제거하는 돌연변이는 문헌에 기재되어 있다 ([Hezareh M. et al., J Virol 75, 12161-12168, 2001], [Idusogie EE. et al., J Immunol 164, 4178-4184, 2000], [Lund J. et al., J Immunol. 147:2657-6, 1991] 및 [Chappel et al., 1991], [Canfield MS et al., J Exp Med. 173:1483-91, 1991]). 그러나, 변형된 Fc 구역은 인간에서 자연 발생하지 않을 것이므로, 예를 들어 IgG1 이소형의 선택 및 몇몇 돌연변이의 포함은 잠재적으로 면역원성을 일으키고 인간에서 Fc 부분에 대한 면역 반응을 유발할 것이다.

이러한 이유로 인해, hzACO-1 항-IFN-α mAb를, 둘 모두 많은 치료 항체에서 사용되는 IgG2 및 IgG4 이소형 모두를 사용하여 발현시켰다 (Salfeld JG. Biotechnol 25, 1369-1372, 2007). 예기치 않게, IgG4 구성체의 발현 수준은 IgG2 hzACO-1 변이체 (실시예 5)보다 유의하게 더 높았고, 이는 생산 수율을 상당하게 개선시킬 것이다. 또한, IgG2 hzACO-1 분자는 응집되는 경향이 있으나, IgG4 변이체는 그렇지 않았다 (실시예 11). 응집은 생산 동안 수율을 저하시키고, 저장 수명을 제한하고, 증가된 면역원성 때문에 환자에서 효력을 감소시킬 수 있으므로, 이는 약물 개발에서 심각한 문제로 간주된다.

따라서, hzACO-1 IgG4 구성체를 각각 실시예 12 및 13에 기재된 바와 같이, IFN-α의 존재 하의 ADCC 분석 및 보체 고정 ELISA 분석에서 추가의 특성 결정을 위해 선택하였다. 이들 데이타는 hzACO-1 IgG4 분자가 바람직하지 않은 세포독성을 실제로 유발할 수 없음을 확인해 준다. 또한, IFN-α 활성 강화의 예상된 결여는 문헌 [Moll et al., 2008]에 기재된 바와 같이 PBMC 및 EC에서 확인할 수 있다.

요약하면, hzACO-1 IgG4 분자는 세포독성 및 IFN 활성의 강화를 포함한 Fc-매개된 효과기 기능에 의해 유발된 바람직하지 않은 부작용을 유도하지 않으면서 IFN-α를 중화할 수 있으므로, 및 제조 및 환자에의 투여에 적합하게 되는 안정하고 잘 발현되는 분자이므로 특히 적합한 치료 분자인 것으로 보인다.

실시예 15 - T-세포 에피토프의 분석

면역원성 예측을 위한 표준 기술 (De Groot, A.S. and Moise, L. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 10, 332-340, 2007)에 기초하여, ProPred (Singh, H. & Raghava. G.P. ProPred. BioINFormatics. 17, 1236-1237, 2001)에 의해 연장된 바와 같이 포켓 (pocket) 프로필 방법 (Sturniolo.T. et al., Nat. Biotechnol. 17, 555-561,1999)을 사용하여 51가지의 HLA-DRB 대립유전자 사이에서 선형 T-세포 에피토프를 예측하였다. 상기 방법에서는 평가 중의 단백질 내의 제시된 9개 잔기 길이의 펩티드가 결합할 수 있는 대립유전자의 수를 계산하였다. 많은 대립유전자에 결합하는 제시된 펩티드가 비-인간 기원일 경우, 이것은 면역원성의 간접적인 척도로서 사용될 수 있다. 펩티드가 인간 기원일 경우, 상응하는 T-세포의 조기 음성 선택 때문에 면역 반응은 예상되지 않는다.

본 실시예의 목적은 전장 hzACO-1-kabat CDRH2를 사용하는 인간화 절차의 예측된 면역원성을 hzACO-1에 적용된 실제 인간화 절차에 비교하는 것이다.

ProPred 알고리즘에의 입력 서열로서, 10 + 10 잔기가 hzACO-1-kabat CDRH2 주변에 첨가된 전장 ACO-1 CDR_H2 (CDR_H2_전장)가 동일한 영역에서 상당하는 hzACO-1 서열 (CDR_H2_인간)과 함께 사용된다:

(CDR_H2_전장)

(CDR_H2_인간)

CDR_H2_전장을 T-세포 에피토프 예측기를 통해 진행시켜 다음의 3개의 에피토프를 얻는다: WMGEINPSH (HLA-DRB 대립유전자의 4％에 결합함), INPSHGRTI (6％) 및 FKSRVTMTR (24％). CDR_H2_인간에 대해, 처음 2개의 소수 에피토프는 동일한 반면, 마지막 주요 에피토프는 FQGRVTMTR (27％)로 전환된다. 이는 여전히 T-세포 에피토프이기는 하지만, 이제 전체 인간 서열이고, 자가 반응성 T-세포는 흉선에서 음성 선택에 의해 결실된다는 추정으로부터 CDR_H2_전장 내의 상기 잠재적인 주요 에피토프는 CDR_H2_인간 서열에 의해 제거되었다.

따라서, hzACO-1은 전통적인 CDR 그라프팅된 인간화 ACO-1보다 면역원성이 더 적은 것으로 예상된다.

실시예 16 - CDR 말단절단

실시예 2에 설명된 바와 같이, 마우스 ACO-1 항체를 비전통적인 방법에 의해 인간화하였다. 이는 hzACO-1 및 IFN-αA의 3D 모델에 기초하여, 파라토프를 포함하는 것으로 예측된 잔기의 마스크 설계로 이루어진다. 최적화된 hzACO-1 CDR H2 서열의 5개의 C-말단 아미노산을 포함하는 펩티드는 상응하는 인간 프레임워크 서열과 동일하였으므로, 상기 인간화 방법을 적용하면 단순한 CDR 그라프팅에 의해 인간화된 항체보다 더 소수의 뮤린 잔기를 갖는 hzACO-1 항체를 생성시켰다. 이와 반대로, 전통적으로 CDR 그라프팅된 인간화 항체 (hzACO-1-kabat CDRH2) 내의 상응하는 펩티드 서열은 뮤린 기원의 것이었다. 따라서, 상기 인간화 절차로 보다 많은 인간 서열을 갖는 인간화 항체를 생성시켰고, 이는 환자에서 면역원성을 덜 유발시키는 것으로 보인다. CDR H2의 서열을 분석하면, hzACO-1 내의 마우스 아미노산 잔기를 감소시킴으로써, 마우스 아미노산을 함유하는 MHC 클래스 II T 세포 에피토프가 제거되고 완전 인간의 것으로 교체되고, 이에 대해 환자는 관용성일 것으로 예상될 것이다. 따라서, 이것은 hzACO-1이 전통적인 CDR 그라프팅된 인간화 ACO-1 항체보다 덜 면역원성일 것으로 예상됨을 확인해 준다.

hzACO-1 항체의 친화도는 실시예 8에 제시된 바와 같이 마우스 ACO-1 항체의 2배 내에서 보유되었다. 따라서, 추가의 마우스 복귀-돌연변이는 요구되지 않았다. 또한, 실시예 8, 9 및 10에서 설명된 바와 같이 IFN-α1/D를 제외한 모든 IFN-α 하위형에 결합하고 중화시키는 항체의 IFN-α 하위형 프로필이 보유되었다. CDR H2 내에 보다 소수의 마우스 아미노산을 함유함에도 불구하고, hzACO-1의 친화도는 마우스 ACO-1 항체로부터의 전장 마우스 CDR H2를 함유하는 hzACO-1-kabat CDRH2 항체의 친화도 및 효력과 동일하였다 (각각 실시예 8 및 9).

또한, 설명된 인간화 방법을 이용하여 중쇄 내의 위치 60-62에서 NEN 대신 서열 AQK로 치환하면 탈아미드화하는 경향이 있을 수 있는 2개의 아스파라긴을 피하는 잇점이 있다. 탈아미드화는 단백질의 순수 전하를 변화시키고, 이는 안정성 및/또는 특이성에 영향을 미칠 수 있다. 서열 AQK를 지킴으로써, hzACO-1의 균질성이 보다 잘 보존될 것이다. hzACO-1을 전통적으로 CDR 그라프팅된 hzACO-1-kabat CDRH2 버전에 비교하면, hzACO-1이 고도로 안정한 단백질인 반면 hzACO-1-kabat CDRH2 항체는 예기치 않게 응집하는 경향이 있는 것으로 밝혀졌다 (실시예 11). 응집은 생산 동안 수율을 저하시키고, 저장 수명을 제한하고, 증가된 면역원성 때문에 환자에서 효력을 감소시킬 수 있으므로, 응집은 약물 개발에서 심각한 문제로 간주된다. 또한, hzACO-1 구성체의 발현 수준은 예기치 않게 hzACO-1-kabat CDRH2 변이체의 2배였다 (실시예 5).

요약하면, hzACO-1 IgG4 항체는 신규한 방법에 의해 인간화되어, 환자에서 면역원성을 덜 유발시키는 것으로 보이는 보다 적은 마우스 아미노산을 갖는 치료 항체를 생성시켰다. 원래의 마우스 mAb의 아미노산을 보다 적게 함유함에도 불구하고, 상기 인간화 항체는 마우스 항체 및 전통적인 CDR 그라프팅에 의해 생성된 인간화 버전에 상당하는 친화도, 효력 및 IFN-α 하위형 프로필을 가졌다. 또한, hzACO-1 항체는 탈아미드화하는 경향이 더 적고, 보다 큰 발현 수준을 갖는다. 따라서, hzACO-1 항체는 제조 및 환자에의 투여에 적합한 안정하고 잘 발현되는 분자이다.

SEQUENCE LISTING <110> Novo Nordisk A/S <120> Humanized antibodies against human interferon alpha <130> 7815 <160> 32 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 119 <212> PRT <213> mus musculus <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Ser His Gly Arg Thr Ile Tyr Asn Glu Asn Phe 50 55 60 Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ile Thr Ala Phe 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Leu Gly Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 2 <211> 113 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 2 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser <210> 3 <211> 119 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Humanized murine sequence <400> 3 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Ser His Gly Arg Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Leu Gly Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 4 <211> 109 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 4 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Ser Ala Gly Ser Ser Val Asp Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Ala Ala Ser Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 5 <211> 107 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 5 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 6 <211> 109 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Humanized sequence <400> 6 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Gly Ser Ser Val Asp Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 7 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Ser His Gly Arg Thr Ser Tyr Asn Glu Asn Phe 50 55 60 Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Ile Val Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Gly Gly Leu Gly Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Val 115 <210> 8 <211> 113 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 8 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110 Ser <210> 9 <211> 109 <212> PRT <213> mus musculus <400> 9 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Ser Ala Gly Ser Ser Val Gly Ser Ser 20 25 30 Tyr Phe Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Ala Ala Ser Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 10 <211> 109 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 10 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Ala Ala Ser Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Primer <400> 11 ctgggccagg tgctggagg 19 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Primer <400> 12 ctaacactca ttcctgttga agctc 25 <210> 13 <211> 414 <212> DNA <213> mus musculus <400> 13 atgggatgga gctatatcat gctctttttg gtagcaacag ctacagatgt ccactcccag 60 gtccaactgc agcagcctgg ggctgaactg gtgaagcctg gggcttcagt gaagctgtcc 120 tgtaaggctt ctggctacac cttcaccaac tactggatgc actgggtgaa gcagaggcct 180 ggacaaggcc ttgagtggat tggagagatt aatcctagcc acggtcgtac tatctacaat 240 gaaaacttca agagcaaggc cacactgact gtagacaaat cctccatcac agccttcatg 300 caactcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt tctgtgcaag agggggactg 360 ggacccgcct ggtttgctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgca 414 <210> 14 <211> 393 <212> DNA <213> mus musculus <400> 14 atggattttc aagtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgtctcagt cataatgtcc 60 agaggacaaa ttgttctcac ccagtctcca gcaatcatgt ctgcttctcc tggggagaag 120 gtcaccttga cctgcagtgc cggctcaagt gtagattcca gctatttgta ctggtaccag 180 cagaagccag gatcctcccc caaactctgg atttatagca catccaacct ggcttctgga 240 gtccctgctc gcttcagtgg cagtgggtct gggacctctt actctctcac aatcagcagc 300 atggaggctg aagatgctgc ctcttatttc tgccatcagt ggagtagtta cccattcacg 360 ttcggctcgg ggacaaaatt ggaaataaaa cgg 393 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> mus musculus <400> 15 Asn Tyr Trp Met His 1 5 <210> 16 <211> 17 <212> PRT <213> mus musculus <400> 16 Glu Ile Asn Pro Ser His Gly Arg Thr Ile Tyr Asn Glu Asn Phe Lys 1 5 10 15 Ser <210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> mus musculus <400> 17 Gly Gly Leu Gly Pro Ala Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 18 <211> 12 <212> PRT <213> mus musculus <400> 18 Ser Ala Gly Ser Ser Val Asp Ser Ser Tyr Leu Tyr 1 5 10 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> mus musculus <400> 19 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> mus musculus <400> 20 His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Phe Thr 1 5 <210> 21 <211> 17 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Humanized murine sequence <400> 21 Glu Ile Asn Pro Ser His Gly Arg Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 22 <211> 5 <212> PRT <213> mus musculus <400> 22 Ser Tyr Trp Met His 1 5 <210> 23 <211> 17 <212> PRT <213> mus musculus <400> 23 Glu Ile Asn Pro Ser His Gly Arg Thr Ser Tyr Asn Glu Asn Phe Lys 1 5 10 15 Ser <210> 24 <211> 12 <212> PRT <213> mus musculus <400> 24 Ser Ala Gly Ser Ser Val Gly Ser Ser Tyr Phe Tyr 1 5 10 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> mus musculus <400> 25 Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 26 <211> 35 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Primer <400> 26 ctagctagct catttacccg gagaccggga gatgg 35 <210> 27 <211> 31 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Primer <400> 27 gctctaacac tcattcctgt tgaagctctt g 31 <210> 28 <211> 414 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 28 atgggatgga gctatatcat cctctttttg gtagcagcag ctacagatgt ccactcccag 60 gtccaactgc agcagcctgg ggctgaactg gtgaagcctg gggcttcagt gaagctgtcc 120 tgcaaggcct ctggctacag cttcaccagc tactggatgc actgggtgaa gcagaggcct 180 ggacaaggcc ttgagtggat tggagagatt aatcctagcc acggtcgtac tagctacaat 240 gagaacttca agagcaaggc cacactgact gtagacaaat cctccaacat agtctacatg 300 caactcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgtaag agggggactg 360 ggacccgcct ggtttgctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgta 414 <210> 29 <211> 393 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 29 atggattttc aagtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgtctcagt cataatgtcc 60 agaggacaaa ttgttctcac ccagtctcca gcaatcatgt ctgcatctcc tggggagaag 120 gtcaccttga cctgcagtgc cggctcaagt gtaggttcca gctactttta ctggtaccag 180 cagaagccag gatcctcccc caaactctgg atttatggca catccaacct ggcttctgga 240 gtccctgctc gcttcagtgg cagtgggtct gggacctctt actctctcac aatcagcagc 300 atggaggctg aagatgctgc ctcttatttc tgccatcagt ggagtagtta tccattcacg 360 ttcggctcgg ggacaaaatt ggaaataaaa cgg 393 <210> 30 <211> 166 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 30 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Glu Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Asp Lys Gln Phe 35 40 45 Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr 50 55 60 Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Leu Asp Glu Thr 65 70 75 80 Leu Leu Asp Glu Phe Tyr Ile Glu Leu Asp Gln Gln Leu Asn Asp Leu 85 90 95 Glu Ser Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Ile Glu Ser Pro Leu Met 100 105 110 Tyr Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr 115 120 125 Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Ser Cys Ala Trp Glu Val Val 130 135 140 Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Ile Asn Leu Gln Lys 145 150 155 160 Arg Leu Lys Ser Lys Glu 165 <210> 31 <211> 220 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Humanized sequence <400> 31 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Ser His Gly Arg Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Leu Gly Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys 210 215 220 <210> 32 <211> 215 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Humanized sequence <400> 32 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Gly Ser Ser Val Asp Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

Claims (13)

1. Kabat에 따른 뮤린 상보성 결정 구역 (CDR)보다 더 소수의 공여자 아미노산 잔기를 포함하며, 뮤린 항체 ACO-1 또는 ACO-2, 또는 그의 조합물의 인간화 버전인, 인간 인터페론-α (IFN-α)에 특이적으로 결합하는 인간화 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
2. IFN-α 하위형 A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b 및 WA에 결합할 수 있으나, 하위형 1 또는 D에 결합하지 않고, Kabat에 따른 비-인간 CDR보다 더 소수의 공여자 아미노산 잔기를 포함하는, IFN-α에 특이적으로 결합하는 인간화 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, CDR H2 공여자 잔기가 Kabat 잔기 50-59를 포함하는 것인 항체.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, ACO-1 및/또는 ACO-2 항체와 IFN-α 하위형 상의 동일한 에피토프와 경쟁하고/하거나 상기 에피토프에 결합하는 항체.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, IgG4 하위형인 항체.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 21에 따른 CDR H2 서열을 포함하는 항체.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체를 코딩하는 숙주 세포를 적절한 조건 하에 인큐베이팅하고, 상기 항체를 후속적으로 단리하는 것을 포함하는, 상기 항체의 생산 방법.
8. 제7항에 따른 방법에 의해 얻은 항체.
9. 제1항 내지 제6항 및 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는 조성물.
10. 항체 또는 그의 단편을 부형제와 혼합하는 것을 포함하는, 제9항에 따른 조성물의 제조 방법.
11. 제9항에 따른 방법에 의해 얻은 조성물.
12. 예방 또는 치료 유효량의 제1항 내지 제6항 및 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체를 IFN-α 관련 염증성 질병 또는 질환의 예방, 관리, 치료 또는 개선을 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, IFN-α 관련 염증성 질병 또는 질환을 예방, 관리, 치료 또는 개선하는 방법.
13. 염증성 질병의 치료에 적합한 의약의 제조를 위한, 제1항 내지 제6항 및 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체의 용도.

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