TWI453032B

TWI453032B - 抗人類干擾素－α的人體化抗體

Info

Publication number: TWI453032B
Application number: TW098115102A
Authority: TW
Inventors: Lars Anders Svensson; Birgitte Friedrichsen; Berit Olsen Krogh; Inger Lund Pedersen
Original assignee: Argos Therapeutics Inc
Priority date: 2008-05-07
Filing date: 2009-05-07
Publication date: 2014-09-21
Also published as: BRPI0912570A2; TW200950807A; US20130101602A1; CA2722622A1; JP2011519571A; ZA201008748B; WO2009135861A2; EP2279207A2; BRPI0912570B8; CN102083859B; US20120195888A1; CA2722622C; RU2010150105A; IL208979B; AU2009245792B2; ES2549903T3; MX2010012052A; JP5766598B2; US20110213125A1; BRPI0912570B1

Description

抗人類干擾素-α的人類化抗體

本發明係關於對抗人類干擾素α(IFN-α)的人類化抗體，及其等在治療或預防人類患者之各種疾病和病症上的用途。

基於各種不同的觀察，干擾素α(INF-α)是一種細胞介素，咸相信其涉及若干自體免疫疾病。雖然系統性紅斑性狼瘡(systemic lupus erythomatosus,SLE)患者通常沒有測得到的INF-α之血清水平，但其等似乎有明確的IFN-α基因簽名。此外，可藉著抗INF-α抗體抑制藉著以SLE患者血清處理DCs所誘導之樹突細胞(DC)成熟。亦已經顯示在具有SLE表現型之紐西蘭黑色(New Zeeland Black,NZB)小鼠中IFN-α/β受體的基因剔除，結果導致幾乎正常的表現型(Santiago-Raber等人,J Exp Med. 2003;197(6):777-88)。

因此，已經提議以對抗INF-α的抗體作為中和該細胞介素之活性的工具，用以單獨或組合治療這類自體免疫疾病。按照在以WO20060086586發表之國際專利申請案中的描述產製認得各種不同INF-α亞型的專一鼠類抗體(ACO-1到ACO-6)，並定性之。然而，鼠類抗體不適合用在人類，因為其等之免疫原性，並因此想要產製人類化抗體，其中將鼠類CDR移植到人類鷹架抗體上。然而，與鼠類親本相比較，人類化抗體經常受損於功能缺陷，像是例如低親和力及/或穩定性及/或不想要的免疫原性。在某些情況下，可藉著製造一或幾個回復點突變來補償在人類化抗體中的這類缺陷。通常不想要進行任何回復點突變，或僅進行極少的回復點突變，因為出現太多次回復突變易於產生不想要的低穩定性及/或不想要程度的免疫原性。因此希望提供安全且穩定，並具有想要之生物特性(例如保留人類化抗IFN-α抗體對許多IFN-α亞型之親和力和效力)的人類化抗IFN-α抗體。

因此在技術領域中，需要具有想要特徵之人類化抗IFN-α抗體，這類特徵為例如穩定性、專一性、安全性、免疫原性等等。因此，在技術領域中亦需要產生這類抗體的有效方法。

在第一方面，本發明係關於專一地結合人類干擾素-α(IFN-α)的人類化抗體，或其抗原結合性片段，該人類化抗體為鼠類抗體ACO-1或ACO-2或其組合的人類化版本，且包括比根據Kabat之鼠類互補決定區(complementary determining region,CDR)少的供者胺基酸殘基。

另一方面，本發明更關於專一地結合IFN-α的人類化抗體，或其抗原結合性片段，其中該抗體能夠結合IFN-α亞型A、2、B2、C、F、G、H2、I、J1、K、4a、4b和WA，但不與亞型1或D結合，且其中該抗體包括比根據Kabat之非人類CDR少的供者胺基酸殘基。

本發明更關於獲得這類抗體的方法，以及這類抗體在治療上之用途和包括這類抗體之組合物。

根據本發明之抗體可適用於治療各種發炎性疾病。

本發明一部分是基於抗IFN-α抗體，其具有適合治療罹患IFN-α相關症狀或疾病(像是例如狼瘡疾病或病症，像是例如SLE；移植對宿主疾病；第1型糖尿病、AIDS、自體免疫甲狀腺炎(thyroiditis)、牛皮癬(psoriasis)、幼年型皮肌炎(juvenile dermatomyositis)和薛格連氏徵候群(syndrome))之人類患者的特性。該抗體典型地是基於鼠類ACO-1及/或ACO-2抗體的人類化版本。

已經鑑認ACO-1和ACO-2能夠阻斷13個重組IFN-α亞型和兩個在病毒感染後產生之IFN-複合混合物的生物活性(參見WO2006086586)。藉著微陣列分析，ACO-1和ACO-2亦一致地阻斷得自展現IFN-α簽名之SLE患者之血清的生物活性。ACO-1和ACO-2並未明顯地中和IFN-α蛋白質亞型D和1的生物活性，但中和SLE血清之IFN-α生物活性。雖然無意受理論限制，但亞型D和1因此可能並未顯著地涉及SLE的病因學。

如同在實施例中描述的，建立可變區的結構模型，顯示人類化ACO-1和ACO-2有可能使用比Kabat CDR少的供者(鼠類)殘基，因此進一步降低了在人類患者中不利免疫反應的風險。分析亦鑑認出對回復突變有利的位置。更進一步發現，可能歸因於在ACO-1和ACO-2可變區之間的高序列類似性(僅在13個位置有差異)，可藉著在相對應位置處的ACO-2殘基置換在人類化ACO-1(hzACO-1)序列中的某些胺基酸殘基。在CDR區內，可正常地進行突變，不會使抗體序列成為較不似人類的。該人類化程序結果改善了功能特性，如人類化抗體的親和力、穩定性、表現水平和IFN-α-抑制活性。

在人類化ACO-1抗體中，在hzACO-1 VH(SEQ ID NO:3)中的典型突變包括V5Q、T28S、M69L、R71V、T73K、S76I、S76N、T77I、V78A、Y79F和A93V，及其任何組合(使用Kabat編號)。在hzACO-1 VL(SEQ ID NO:6)中的典型突變包括E1Q、D29G、L33F、L47W、S50G、I58V和F71Y，及其任何組合。在一具體事實中，該hzACO-1 VH區包括選自T28S、N31S和A93V的突變。在另一具體事實中，該hzACO-1 VH區包括選自T28S、N31S和A93V，及其任何組合，像是例如T28S和N31S、T28S和A93V，以及N31S和A93V的突變。在另一具體事實中，該hzACO-1 VH區包括選自T28S、N31S和A93V，或其組合，像是例如T28S和N31S、T28S和A93V或N31S和A93V的突變；以及至少一個額外的突變。

定義

為更容易了解本發明，如下定義一些術語。

「ACO-1和ACO-2抗體」在WO20060086586中定性並描述。以ATCC登錄編號PTA-6557(WO2006086586)存放ACO-1，並以ATCC登錄編號PTA-7778(WO2008021976)存放ACO-2。根據本發明之抗體是ACO-1和ACO-2的人類化變體。然而，根據本發明之ACO-1和ACO-2的人類化版本不包括全長的鼠類Kabat序列。在較佳的具體事實中，至少一個CDR序列包括大約3-10個胺基酸，較佳的是3-8個，更佳的是4-7個胺基酸的截短。抗體較佳的是包括在CDR H2中的截短，該CDR H2較佳的是被截短3-10個，較佳的是3-8個，更佳的是4-7個，而最佳的是6個胺基酸。而且推斷可將偶發的點突變導入一或多個CDR序列中，以及在人類鷹架抗體內。然而，術語「ACO-1和ACO-2抗體」更可能包含任何能夠與IFN-α亞型A、2、B2、C、F、G、H2、1、J1、K、4a、4b和WA結合，但不與亞型1或D結合的IFN-α抗體。然而，要瞭解可能察覺ACO-1和ACO-2本身是唯一的抗體，因為在其等CDR序列中的差異只是幾個胺基酸。因此ACO-1和ACO-2代表相同抗體之活體內體細胞超突變的兩個階段似乎是合理的。因此，根據本發明之ACO-1/ACO-2抗體是人類化抗體，其包括與ACO-1和ACO-2之CDR序列有至少90%，更佳的是至少92%，而最佳的是至少95%同一性的CDR序列。

術語「CDR截短」、「前進突變」和「CDR的縮短」在整個文件中是可交替使用。關於本發明，這類術語通常意指可能察覺CDR-截短是一些連接的前進突變的事實-意指可將經縮短之鼠類CDR片段移植到人類架構上。雖然移植較短的CDR，結果有降低抗體之免疫原性程度的傾向可能並不令人意外，但可保留人類化抗體之其他有利特徵(如穩定性、專一性等等)實際上卻是令人意外的。「回復突變」總是意指在架構中的突變(即並非在CDR中)-且回復突變典型地是在經選擇的位置導入一或多個「鼠類」胺基酸殘基(例如為了使抗體結構穩定)。

當在本文中使用時，術語「干擾素α」(IFN-α)意指包括一些先天性免疫之主要效應物的蛋白質家族。有至少15個人類IFN-α的已知亞型。在下文表1中列舉IFN-α蛋白質亞型的名稱和相對應之編碼基因。

參見Pestka等人(1997)「干擾素標準化和稱呼(Interferon Standardization and Designations)」J Interferon Cytokine Res 17：附錄1,S9-S14。IFN-αB2有時亦稱為IFN-αB，但不可與IFN-β混淆。天然的IFN-α得自白血球(白血球IFN-)，並可從PBL Biomedical Labs,Piscataway,NJ(interferonsource.com)獲得重組的人類IFN-α蛋白質亞型。天然的IFN-α是IFN-α亞型的複雜混合物。偵測和定量這些干擾素的方法，如ELISA和RIA為在技術領域中已知的。

在本文中術語「抗體」以最廣義使用，且明確地包括全長的單株抗體、多株抗體，除非另行陳述或與前後文相牴觸，還有抗原結合性片段、抗體變體及其多專一性分子，只要其等顯示出想要的生物活性即可。通常，全長抗體是包括至少兩個重(H)鏈和兩個輕(L)鏈，之間以二硫鍵連接的糖蛋白，或其抗原結合性部分。每個重鏈包括重鏈可變區(在本文中縮寫為VH)和重鏈恆定區。重鏈恆定區包括三個功能部位，CH1、CH2和CH3。每個輕鏈包括輕鏈可變區(在本文中縮寫為VL)和輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包括一個功能部位，CL。可再將VH和VL區細分成高變區，稱為互補決定區(CDR)，其散布在較經保留、稱為架構區(FR)的區域之間。每個VH和VL分別由三個CDR和四個FRs構成，以下列順序從胺基-端到羧基-端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重和輕鏈的可變區含有與抗原交互作用的結合性功能部位。

抗體的「抗原結合性片段」是包括全長抗體之能夠以可偵測方式與抗原結合的一部分的分子。抗原結合性片段包括多價分子，其包括抗體的一、二、三或多個抗原結合性部分，以及單-鏈構築體，其中藉著合成的連接子(linker)或藉著重組方法連接VL和VH區或其經選擇部分，以形成有功能的抗原結合性分子。

術語「抗體衍生物」和「免疫共軛物」在本文中是可交替使用，且代表包括全長抗體或其抗原結合性片段的分子，其中以化學方式修改一或多個胺基酸，例如藉著烷基化、PEG化、醯化、酯形成或醯胺形成或其類似者，例如將抗體與第二個分子連接。典型的修改包括PEG化、半胱胺酸-PEG化、生物素基化、放射線標示，以及與第二劑共軛，像是可偵測或胞毒性製劑。

「多專一性分子」包括抗體或其抗原結合性片段，其與至少一個有其他功能之分子(例如另一個肽或蛋白質，如另一個抗體或受體之配體)結合或連接，以產生與至少兩個不同結合位置或目標分子結合的分子。典型的多專一性分子包括雙-專一性抗體和與可溶性受體片段或配體連接的抗體。

「人類化」抗體是人類/非人類嵌合型抗體，其含有衍生自非人類免疫球蛋白的最少序列(CDR區)。因此，人類化抗體是人類免疫球蛋白(接受者抗體)，其中以得自具有想要專一性、親和力和能力的非人類物種(供者抗體)-如小鼠、大鼠、兔子或非人類靈長類之高變區的殘基置換得自接受者之高變區的殘基。在某些情況下，藉著相對應的非人類殘基置換人類免疫球蛋白的FR殘基。而且，人類化抗體可包括不是在接受者抗體中或在供者抗體中找到的殘基。進行這些修改以便進一步精確化抗體性能。通常，人類化抗體會包括實質上所有的至少一個，且典型地兩個可變功能部位，其中所有或實質上所有的高變環(其與非人類免疫球蛋白的那些一致)，以及所有或實質上所有的FR殘基(其為人類免疫球蛋白序列的那些)。人類化抗體亦可視需要包括至少一部分的免疫球蛋白恆定區(Fc)，典型地是人類免疫球蛋白的恆定區。

當在本文中使用時，術語「高變區」意指抗體中為抗原結合之原因的胺基酸殘基。高變區通常包括得自「互補決定區」或「CDR」的胺基酸殘基(在輕鏈可變功能部位中之殘基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)，以及在重鏈可變功能部位中之31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等人(1991)免疫學上感興趣的蛋白質序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第五版,U.S. Department of Health and Human Services,NIH出版物第91-3242號))，及/或得自「高變環」的那些殘基(在輕鏈可變功能部位中之殘基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)，以及在重鏈可變功能部位中之26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk,J. Mol. Biol 1987；196:901-917)。典型地，藉著在Kabat等人，在前中描述的方法，進行在該區域中胺基酸殘基的編號。在本文中，像是「Kabat位置」、「Kabat殘基」和「根據Kabat」之類的片語，意指重鏈可變功能部位或輕鏈可變功能部位的該編號系統。使用Kabat編號系統，肽的實際直線胺基酸序列可能含有較少或額外的胺基酸，與可變功能部位之FR或CDR的縮短或插入一致。例如，重鏈可變功能部位可在CDR H2的殘基52之後包含胺基酸插入(殘基52a、52b和52c，根據Kabat)，並在重鏈FR殘基82之後包含經插入殘基(例如殘基82a、82b和82c等等，根據Kabat)。可藉著使特定抗體在與具有「標準」Kabat編號序列之抗體序列有同種性的區域排比，判定其殘基的Kabat編號。

「架構區」或「FR」殘基是如本文定義之CDR以外的那些VH或VL殘基。

在兩個實質上相同之胺基酸序列中「相對應的」胺基酸位置是藉著任何在本文中提及之蛋白質分析軟體，典型地使用預設參數排比的那些。

「經分離之」分子是在發現其之組合物中，關於其所屬之分子種類為優勢物種的分子(即其構成在該組合物中至少大約50%的分子類型，並典型地會構成在該組合物中至少大約70%、至少大約80%、至少大約85%、至少大約90%、至少大約95%或更多的分子物種，例如肽)。通常，抗體分子之組合物會對於在組合物中在所有現存肽物種之前後文中的抗體分子，或在建議用途之前後文中至少關於實質上有活性之肽物種，顯示出98%、98%或99%均一性。

當在本文中使用時，術語「選擇性地中和」意指經分離和純化之抗體(像是但不限於單株抗體)或其抗原結合性片段，其選擇性地中和至少大約40%、至少大約50%或至少大約60%一或多個IFN-α蛋白質亞型的生物活性，但沒有明顯地中和其他IFN-α蛋白質亞型的至少一個生物活性，其中該生物活性可以是例如MxA啟動基因的活化及/或抗病毒活性。

在本發明的前後文中，「治療」意指預防、減輕、管理、治癒或減少疾病或病症的一或多個徵候或臨床相關症狀，除非與前後文相牴觸。例如，在尚未鑑認疾病或病症之徵候或臨床相關症狀的患者中之「治療」為預防或預防性治療，而在已經鑑認疾病或病症之徵候或臨床相關症狀的患者中之「治療」則通常不包括預防或預防性治療。

當在本文中使用時，片語「IFN-α相關症狀或疾病」意指異常症狀、疾病或前-臨床疾病狀態(其業已與在患者血清中升高的IFN-α水平發生關連)。這類實例包括，但不限於狼瘡疾病或病症，如SLE、移植對宿主疾病(graft versus host disease,GVHD)、第1型糖尿病、AIDS(由人類免疫不全病毒(human immunodeficiency virus,HIV)引起)、自體免疫甲狀腺炎和牛皮癬。測定IFNα水平的方法為在技術領域中已知的。

人類化抗IFN-α抗體

本發明之抗體是抗IFN-α小鼠抗體ACO-1或ACO-2的人類化版本、其變體及/或其抗原結合性片段，其特徵在於特殊的功能及/或結構特徵或特性。可在適當的宿主細胞株中，藉著標準技術產生重組抗體，並如下述藉著各種測定定性，以評估其等之功能活性。事實上，結果與以傳統方式人類化的IFN-α抗體相比較，可以顯著改善之產量產生根據本發明之IFN-α抗體。

根據所謂的「最佳配適」方法，針對這類已知人類可變-功能部位序列的庫或人類生殖種系序列的庫篩選囓齒動物抗體之可變功能部位的序列。然後可接受最接近囓齒動物序列的人類序列作為人類化抗體用的人類架構區(Sims等人,J. Immunol. 1993；151:2296及以下；Chothia等人,Chothia和Lesk,J. Mol. Biol. 1987；196:901-917)。其他方法使用衍生自具有輕或重鏈之特殊亞組的所有人類抗體之一致序列的特殊架構區。對於數個不同的人類化抗體，可使用相同的架構。

用在本發明之抗體中的較佳架構序列是在結構上類似由ACO-1或ACO-2所使用之架構序列的那些。因此，在一具體事實中，本發明提供人類化ACO-1或ACO-2抗體，其包括衍生自人類VH1_46基因和人類JH4基因之VH架構殘基，以及衍生自人類VKⅢ_L6基因和人類JK2基因之VL架構殘基，且專一地結合人類IFN-α。

下文實施例1描述典型的人類化ACO-1抗體hzACO-1的設計，其包括這類架構序列。

功能特性

本發明之人類化抗體專一地結合IFN-α亞型A、2、B2、C、F、G、H2、I、J1、K、4a、4b和WA(表2)。在一具體事實中，本發明之人類化抗體ACO-1或ACO-2抗體以高親和力，例如以大約10^-7 M或更低之KD、大約10^-8 M或更低之KD、大約5x10^-9 M或更低之KD，或大約2x10^-9 M或更低之KD與IFN-α蛋白質亞型，如IFN-αA結合。在一具體事實中，該人類化抗體是hzACO-1變體，其以可與hzACO-1相比擬或更高之親和力，與IFN-αA、IFN-αF及/或其他IFN-α蛋白質亞型結合。

例如，在hzACO-1變體之KD和hzACO-1對IFN-αA蛋白質亞型之KD之間的比例，可能是大約1.0、大約0.8、大約0.7或大約0.6。在另一具體事實中，該人類化抗體是hzACO-1變體，其以可與重組產生之ACO-1的親和力可相比擬或比其高的親和力與IFN-αA、IFN-αF及/或其他的IFN-α蛋白質亞型結合。在另一具體事實中，該人類化抗體是hzACO-1變體，其以可與融合瘤產生之ACO-1之親和力可相比擬或比其高的親和力與IFN-αA、IFN-αF及/或其他的IFN-α蛋白質亞型結合。

而且，本發明之人類化抗體能夠選擇性地中和一或多個IFN-α蛋白質亞型的生物活性。例如，與對照組相比較，人類化ACO-1或ACO-2變體可能能夠選擇性地中和至少大約40%、至少大約50%或至少大約60%IFN-α蛋白質亞型A、2、B2、C、F、G、H2、I、J1、K、4a、4b或WA，或其任何組合的生物活性。在特殊的具體事實中，該人類化抗體並未顯著地中和IFN-α亞型D及/或1之生物活性。典型的生物活性包括，但不限於MxA啟動基因的活化、抗病毒活性或兩者。可使用例如在本文中描述的報告子基因(RG)細胞病變抑制(cytopathic inhibition,CPE)測定，評估人類化抗體中和這類IFN-α生物活性的能力。在一具體事實中，該人類化抗體是hzACO-1變體，其在RG測定中具有可與hzACO-1之IC50相比擬或比其低的IC50。在特定的具體事實中，該hzACO-1變體在RG測定中具有比hzACO-1之IC50低的IC50。

在一具體事實中，本發明之人類化抗體與ACO-1及/或ACO-2在IFN-α蛋白質亞型上競爭及/或結合相同的抗原決定基。可基於其等在如本文描述之標準IFN-α結合測定中與ACO-1及/或ACO-2交叉競爭的能力，來鑑認這類抗體。受試人類化抗體抑制ACO-1或ACO-2與一或多個IFN-α蛋白質亞型結合的能力，證實該受試抗體可與ACO-1或ACO-2競爭對IFN-α的結合，並因此可與在IFN-α蛋白質亞型上與ACO-1及/或ACO-2相同的抗原決定基結合(WO02066649和WO2005059106)。在特殊的具體事實中，該人類化抗體與與鼠類單株抗體9F3和MMHA-1、-2、-3、-6、-8、-9、-11、-13和-17(PBL Biomedical Laboratories,NJ,USA)及/或人類單株抗體13H5、13H7和7H7不同的人類IFN-α抗原決定基結合，及/或比起與一或多個所列舉之鼠類和人類單株抗體，更與ACO-1或ACO-2交叉競爭。

在一具體事實中，由本發明提供之hzACO-1、hzACO-2、hzACO-1變體或hzACO-2變體，具有可與包括根據Kabat之鼠類CDR(Kabat ACO-1)的人類化ACO-1或ACO-2抗體相比擬或比其低的免疫原性。可藉著例如一或多個在Wadwha等人,Dev Biol(Basel). 2005;122:155-70中描述的方法，評估人類化抗體的免疫原性，全部以引用方式納入本文中。

在更進一步的觀點中，本發明之人類化抗體在適合投予人類患者之調配物中是穩定的。在一具體事實中，根據本發明之人類化ACO-1或ACO-2抗體至少像以傳統方式人類化之IFN-α抗體(其包括全長鼠類Kabat序列)一樣地穩定。可使用在技術領域中已知的方法，包括在實施例11中描述的熱螢光(thermoflour)分析，評估抗體的穩定性。

本發明較佳的人類化抗體顯示至少一個，更佳的是二、三、四、五或更多個下列特性：(a)專一地結合IFN-α亞型A、2、B2、C、F、G、H2、I、J1、K、4a、4b和WA；(b)選擇性地中和一或多個IFN-α蛋白質亞型A、2、B2、C、F、G、H2、I、J1、K、4a、4b或WA；其任何組合或其全部的生物活性；(c)並未顯著地中和IFN-α1或D的生物活性；(d)與ACO-1及/或ACO-2在IFN-α蛋白質亞型上競爭及/或結合相同的抗原決定基；(e)比起與任何9F3、13H5、13H7和7H9更與ACO-1或ACO-2競爭；(f)比包括根據Kabat之鼠類CDR的hzACO-1或hzACO-2抗體更不可能誘發免疫反應；(g)在藥學調配物中是穩定的；以及(h)以10^-8 M或更低之KD與至少一個IFN-α蛋白質亞型A、2、B2、C、F、G、H2、I、J1、K、4a、4b或WA結合。

結構特性

本發明之較佳抗體是鼠類單株抗體ACO-1和ACO-2的人類化版本。可按照在實施例中的描述，產生、分離並定出這類抗體的結構和功能特徵。在表3中陳述並在圖1-3中描述ACO-1、hzACO-1和ACO-2的全長、可變區和Kabat CDR序列。

hzACO-1 CDR H1、H3、L1、L2和L3的序列是與相對應之ACO-1序列相同的。ACO-2 CDR H3和L3則是與相對應之ACO-1 CDR序列相同的。在hzACO-1 CDR-H2序列中以斜體顯示之胺基酸相當於人類架構序列-在以傳統方式人類化的抗體中，全長Kabat序列相當於ACO-1 CDR_H2序列，其中所有的胺基酸均衍生自鼠類抗體。

本發明一方面提供鼠類ACO-1和ACO-2抗體的人類化版本，具有比Kabat CDR少的供者殘基，即比藉著移植kabat CDR產生之人類化ACO-1或ACO-2抗體少的鼠類殘基。

在一具體事實中，該人類化抗體專一地結合人類IFN-α，並為鼠類抗體ACO-1或ACO-2或其組合的人類化版本，其包括比根據Kabat之鼠類互補決定區(CDR)少的供者胺基酸殘基。CDR H2序列可，例如包括比相當於Kabat殘基50-65、50-64、50-63、50-62、50-61或50-60的那些少的供者胺基酸殘基。CDR H2供者殘基可包括Kabat殘基50-59。額外或可供選擇地，CDR H2供者胺基酸殘基亦可由Kabat殘基50-59構成。Kabat殘基50-59相當於SEQ ID NO:16、21和23的殘基1-11。在一具體事實中，剩下的VH CDR可包括或由Kabat CDR(參見圖1-3)構成，即CDR H1序列包括相當於Kabat殘基31-35的供者胺基酸殘基，且CDR H3序列包括相當於Kabat殘基95-102的供者胺基酸殘基。

在一具體事實中，該人類化ACO-1或ACO-2抗體可包括CDR L1(其包括相當於ACO-1輕鏈(VL)之可變區的Kabat殘基24-34之供者胺基酸殘基)、CDR L2(其包括相當於ACO-1 VL區之Kabat殘基50-56的供者胺基酸序殘基)，以及CDR L3(其包括相當於ACO-1 VL區(SEQ ID NO:4)或ACO-2 VL區(SEQ ID NO:9)之Kabat殘基89-97的供者胺基酸殘基)。額外或可供選擇地，該抗體亦可包括由Kabat殘基24-34構成的CDR L1供者胺基酸殘基，由Kabat殘基50-56構成的CDR L2供者殘基，以及由Kabat殘基89-97構成的CDR L3供者胺基酸殘基。在表3中出示相對應的胺基酸序列。

本發明一方面提供專一的人類化ACO-1抗體。該人類化ACO-1抗體專一地結合人類IFN-α，並包括VH CDR序列，其實質上與SEQ ID NO:3之Kabat殘基31-35、50-65和95-102的序列是相同的，並帶有可選擇的N31S突變。該抗體可，例如包括CDR H1序列(包括SEQ ID NO:15)；CDR H2序列(包括SEQ ID NO:21)；和CDR H3序列(包括SEQ ID NO:17)。額外或可供選擇地，該抗體亦可包括CDR H1序列(由SEQ ID NO:15構成)；CDR H2序列(由SEQ ID NO:21構成)；和CDR H3序列(由SEQ ID NO:17構成)。在一具體事實中，該人類化ACO-1包括衍生自人類VH1_46基因及/或人類JH4基因，較佳是兩者的VH架構殘基。在特定的具體事實中，該人類化抗體包括相當於SEQ ID NO:3的VH序列。

該人類化ACO-1抗體可更進一步包括VL CDR序列，其實質上與SEQ ID NO:6之Kabat殘基24-34、50-56和89-97的序列是相同的。該抗體可，例如包括CDR_L1序列(包括SEQ ID NO:18)；CDR_L2序列(包括SEQ ID NO:19)；和CDR_L3序列(包括SEQ ID NO:20)。額外或可供選擇地，其亦可包括CDR_L1序列(由SEQ ID NO:18構成)；CDR_L2序列(由SEQ ID NO:19構成)；和CDR_L3序列(由SEQ ID NO:20構成)。在一具體事實中，該人類化ACO-1抗體包括衍生自人類VKⅢ_L6基因及/或人類JK2基因，較佳是兩者的VL架構殘基。在特定的具體事實中，該人類化抗體包括相當於SEQ ID NO:6的VL序列。

本發明一方面提供包括ACO-2之CDR序列的抗體。該抗體可專一地結合人類IFN-α，並包括VH CDR序列，其實質上與SEQ ID NO:7之Kabat殘基31-35、50-59和95-102的序列是相同的。在一具體事實中，該抗體包括CDR_H1序列(包括SEQ ID NO:22)；CDR_H2序列(包括SEQ ID NO:23)；和CDR_H3序列(包括SEQ ID NO:17)。在額外或可供選擇的具體事實中，該抗體包括CDR_H1序列(由SEQ ID NO:22構成)；CDR_H2序列(由SEQ ID NO:23構成)；和CDR_H3序列(由SEQ ID NO:17構成)。該抗體可更進一步包括VL CDR序列，其實質上與SEQ ID NO:9之Kabat殘基24-34、50-56和89-97的序列是相同的。在一具體事實中，該抗體包括CDR_L1序列(包括SEQ ID NO:24)；CDR_L2序列(包括SEQ ID NO:25)；和CDR_L3序列(包括SEQ ID NO:20)。額外或可供選擇地，該抗體亦包括CDR_L1序列(由SEQ ID NO:24構成)；CDR_L2序列(由SEQ ID NO:25構成)；和CDR_L3序列(由SEQ ID NO:20構成)。該抗體，一方面可以是人類化ACO-2抗體。

人類化ACO-1或ACO-2抗體可更進一步包括至少一部分的人類Fc-區(除非該抗體是抗原結合性片段，不含任何Fc-部分)。典型地，選擇Fc-區的尺寸，以獲得抗體想要的藥物動力學特性；Fc-部分越大，清除就越慢。在一具體事實中，該人類化抗體是全長抗體，較佳的是包括IgG4同型物Fc-區。在特殊的具體事實中，該IgG4 Fc-區包括S241P突變(根據Kabat編號)；相當於每個EU編號系統的殘基228(Edelman G.M.等人,Proc. Natl. Acad. USA 63,78-85(1969))。

假如ACO-1和ACO-2兩者均可與IFN-α結合，並為類似的，則人類化VH和VL序列可能是「經混合和配對的」，以創造本發明其他的抗IFN-α結合分子。可使用在本文中描述的結合測定(例如流動式細胞測量術、Biacore、ELISAs)及/或使用一或多個如在本文中描述的功能測定，測試這類「經混合和配對之」抗體的IFN-α結合。較佳的是，當混合並配對VH和VL鏈時，以在結構上類似的VH序列置換得自特殊VH/VL對的VH序列。同樣地，較佳的是以在結構上類似的VL序列置換得自特殊VH/VL對的VL序列。

因此，本發明一方面提供人類化單株抗體，或其抗原結合性部分，包括：(a)包括ACO-1或ACO-2 VH CDR的VH區和(b)包括ACO-1或ACO-2 VL CDR的VL區；其中該抗體專一地結合IFN-α。較佳的重和輕鏈組合包括：(a)包括SEQ ID NO:15-17的VH區，可視需要省略一些或全部的SEQ ID NO:16之5C-端胺基酸，和(b)包括SEQ ID NO:18-20的輕鏈可變區；(a)包括SEQ ID NO:15-17的VH區，可視需要省略一些或全部的SEQ ID NO:16之5C-端胺基酸，和(b)包括SEQ ID NO:24、25和20的輕鏈可變區；(a)包括SEQ ID NO:22、23和17的VH區，可視需要省略一些或全部的SEQ ID NO:23之5C-端胺基酸，和(b)包括SEQ ID NO:18-20的輕鏈可變區；以及(a)包括SEQ ID NO:22、23和17的VH區，可視需要省略一些或全部的SEQ ID NO:23之5C-端胺基酸，和(b)包括SEQ ID NO:24、25和20的輕鏈可變區。其他較佳的重和輕鏈組合包括(a)包括SEQ ID NO:3之序列的VH區和(b)包括SEQ ID NO:4之胺基酸序列的VL區；(a)包括SEQ ID NO:15、21和17之VH和(b)包括SEQ ID NO:18-20之VL；以及(a)包括SEQ ID NO:15、21和17之VH和(b)包括SEQ ID NO:24、25和20之VL。

另一方面，本發明提供包括ACO-1或ACO-2之重鏈和輕鏈CDR1s、CDR2s及/或CDR3s，或其組合的抗體。假定這些抗體的每一個均可與IFN-α結合，且主要由CDR1、2和3區提供抗原-結合專一性，則CDR H1、H2和H3序列和CDR L1、L2和L3序列便可能是「經混合和配對的」(即可混合並配對來自不同抗體的CDR，雖然每個抗體可含有CDR H1、H2和H3以及CDR L1、L2和L3)，以創造本發明其他的抗IFN-α結合性分子。可使用下文和在實施例中描述的結合測定(例如流動式細胞測量術、Biacore或ELISAs)，測試這類「經混合和配對之」抗體的IFN-α-結合。較佳的是，當混合並配對VH CDR序列時，以在結構上類似的CDR序列置換得自特殊VH序列之CDR H1、H2及/或H3序列。同樣地，當混合並配對VL CDR序列時，較佳的是以在結構上類似的CDR序列置換得自特殊VL序列之CDR L1、L2及/或L3序列。例如，ACO-1和ACO-2的CDR共享相當大的結構類似性，並因此可接受混合和配對。

因此，本發明另一方面提供人類化單株抗體或其抗原結合性部分，包括：(a)包括選自由SEQ ID NO:15和22所組成之群組的胺基酸序列的CDR H1；(b)包括選自由至少SEQ ID NO:16和23的殘基1-12所組成之群組的胺基酸序列的CDR H2，(c)包括SEQ ID NO:17之CDR H3；(d)包括選自由SEQ ID NO:18和24所組成之群組的胺基酸序列的CDR L1；(e)包括選自由SEQ ID NO:19和25所組成之群組的胺基酸序列的CDR L2；以及(f)包括SEQ ID NO:20的CDR L3；其中該抗體專一地結合IFN-α。

在較佳的具體事實中，該抗體包括:(a)包括SEQ ID NO:15的CDR H1；(b)至少包括SEQ ID NO:16之殘基1-12的CDR H2;(c)包括SEQ ID NO:17之CDR H3;(d)包括SEQ ID NO:18的CDR L1；(e)包括SEQ ID NO:19的CDR L2；和(f)包括SEQ ID NO:20的CDR L3。

在另一較佳的具體事實中，該抗體包括：(a)包括SEQ ID NO:22的CDR H1；(b)至少包括SEQ ID NO:23之殘基1-12的CDR H2；(c)包括SEQ ID NO:17的CDR H3；(d)包括SEQ ID NO:24的CDR L1；(e)包括SEQ ID NO:25的CDR L2；和(f)包括SEQ ID NO:20的CDR L3。

在較佳的具體事實中，該抗體包括：(a)包括SEQ ID NO:15的CDR H1；(b)包括SEQ ID NO:21的CDR H2；(c)包括SEQ ID NO:17的CDR H3；(d)包括SEQ ID NO:18的CDR L1；(e)包括SEQ ID NO:19的CDR L2；和(f)包括SEQ ID NO:20的CDR L3。

在較佳的具體事實中，該抗體包括：(a)包括SEQ ID NO:22的CDR H1；(b)至少包括SEQ ID NO:16之殘基1-12的CDR H2；(c)包括SEQ ID NO:17的CDR H3；(d)包括SEQ ID NO:18的CDR L1；(e)包括SEQ ID NO:19的CDR L2；和(f)包括SEQ ID NO:20的CDR L3。

在較佳的具體事實中，該抗體包括:(a)包括SEQ ID NO:15的CDR H1；(b)至少包括SEQ ID NO:16之殘基1-12的CDR H2；(c)包括SEQ ID NO:17的CDR H3；(d)包括SEQ ID NO:24的CDR L1；(e)包括SEQ ID NO:19的CDR L2；和(f)包括SEQ ID NO:20的CDR L3。

在較佳的具體事實中，該抗體包括:(a)包括SEQ ID NO:15的CDR H1；(b)至少包括SEQ ID NO:16之殘基1-12的CDR H2；(c)包括SEQ ID NO:17的CDR H3；(d)包括SEQ ID NO:18的CDR L1；(e)包括SEQ ID NO:25的CDR L2；和(f)包括SEQ ID NO:20的CDR L3。

人類化抗IFN-α抗體變體

雖然抗體變體或衍生物與親本抗體相比較，典型地具有至少一個經改變的特性，但抗體變體或衍生物可保留親本抗IFN-α抗體的一個、一些、大部分或所有的功能特性，包括但不限於：(a)專一地結合IFN-α亞型A、2、B2、C、F、G、H2、I、J1、K、4a、4b和WA；(b)選擇性地中和IFN-α蛋白質亞型A、2、B2、C、F、G、H2、I、J1、K、4a、4b或WA的一或多個生物活性；其任何組合，或其全部；(c)並未顯著地中和IFN-α1或D的生物活性；(d)與ACO-1及/或ACO-2在IFN-α蛋白質亞型上競爭及/或結合相同的抗原決定基；(e)比起與任何9F3、13H5、13H7和7H9更與ACO-1或ACO-2競爭；(f)比包括根據Kabat之鼠類CDR的hzACO-1或hzACO-2抗體更不可能誘發免疫反應；(g)在藥學調配物中是穩定的；以及(h)以10^-8 M或更低之KD，與至少一個IFN-α蛋白質亞型A、2、B2、C、F、G、H2、I、J1、K、4a、4b或WA結合。可由本發明之抗體顯示出上述之功能特徵的任何組合，及/或如在實施例中描述之功能特徵。

在某些具體事實中，本發明之人類化抗體包括VH區(包括CDR H1-H3序列)和VL區(包括CDR L1-L3序列)，其中這些CDR序列的一或多個包括基於在本文中描述之較佳抗體所指定的胺基酸序列；ACO-1和ACO-2或其保留性修改，且其中該抗體已經保留或改良了本發明之抗IFN-α抗體想要的功能特性。因此，本發明提供經分離之單株抗體，或其抗原結合性片段，包括重鏈可變區(包括CDR H1、CDR H2和CDR H3序列)，以及輕鏈可變區(包括CDR L1、CDR L2和CDR L3序列)，其中：(a)CDR H1，包括選自由SEQ ID NO:15和22，及其保留性修改所組成之群組的胺基酸序列；(b)CDR H2，包括選自由SEQ ID NO:16和23之至少殘基1-12，及其保留性修改所組成之群組的胺基酸序列；(c)CDR H3，包括SEQ ID NO:17，及其保留性修改；(d)CDR L1，包括選自由SEQ ID NO:18和24，及其保留性修改所組成之群組的胺基酸序列；(e)CDR L2，包括選自由SEQ ID NO:19和25，及其保留性修改所組成之群組的胺基酸序列；和(f)CDR L3，包括SEQ ID NO:20，及其保留性修改；其中該抗體專一地結合IFN-α。

因此，可利用得自相同側鏈家族之其他胺基酸殘基置換在本發明抗體之CDR或FR區內的一或多個胺基酸殘基，並可針對經保留之功能(即在上文(c)、(d)和(e)中陳述之功能)，使用在本文描述的功能測定，測試經改變之抗體。

可使用可在技術領域中取得及/或在本文中描述的標準測定，評估抗體變體的功能特性。例如，可使用標準結合和生物學影響(例如報告子基因)測定，如在實施例中陳述的那些(例如Biacore或ELISAs)，測定抗體與IFN-α結合的能力。

可變區修改

本發明一方面提供在CDR或架構區中帶有突變的人類化ACO-1或ACO-2抗體。

在實施例2和3中描述了在人類化ACO-1中特定典型的突變及其鑑認(亦參見圖1和3)。這些包括兩種回復突變；將ACO-1殘基導入人類化ACO-1內，以及其中將ACO-2-衍生之殘基導入人類化ACO-1內的突變。在hzACO-1 VH(SEQ ID NO:3)中的典型回復-突變包括V5Q、M69L、R71V、T73K、S76I和V78A，及其任何組合(使用Kabat編號)。在hzACO-1 VL(SEQ ID NO:6)中的典型回復-突變包括E1Q、L47W、I58V和F71Y，及其任何組合。在hzACO-1 VH(SEQ ID NO:3)中典型的ACO-2-衍生突變，包括T28S、N31S、I58S、S76N、T77I和A93V，及其任何組合。在hzACO-1 VL(SEQ ID NO:6)中典型的ACO-2衍生突變，包括D29G、L33F和S50G，及其任何組合。

而且，可將各種hzACO-1 VH和VL變體序列與變體序列或親本序列「混合並配對」，以創造本發明之hzACO-1變體庫。可使用在本文中描述的結合測定(例如Biacore、ELISAs)，及/或使用一或多個如在本文中描述的功能測定，測試這類「經混合並配對之」抗體的IFN-α-結合。

在一具體事實中，本發明提供人類化抗體，其專一地結合人類IFN-α，並含有已經併人人類抗體可變功能部位內的可變功能部位、得自與人類IFN-α結合之供者非人類抗體的胺基酸，在重鏈可變功能部位中，在選自5、28、31、58、69、71、73、76、78、79和93的一或多個位置處包括供者抗體胺基酸殘基。

在一具體事實中，本發明提供人類化抗體，其專一地結合人類IFN-α，並含有已經併入人類抗體可變功能部位內的可變功能部位、得自與人類IFN-α結合之供者非人類抗體的胺基酸，在輕鏈可變功能部位中，在選自1、29、33、47、50、58和71的一或多個位置處包括供者抗體胺基酸殘基。

在一具體事實中，本發明提供人類化ACO-1抗體，其專一地結合人類IFN-α，並含有已經併入人類抗體可變功能部位內的可變功能部位、得自與人類IFN-α結合之ACO-1的CDR序列，且更進一步在重鏈可變功能部位中，在選自28、31、58、76、77、78、79和93的一或多個位置處包括ACO-2胺基酸殘基。在特定的具體事實中，ACO-2胺基酸殘基是在選自28、31和93的一或多個位置。

在一具體事實中，本發明提供人類化ACO-1抗體，其專一地結合人類IFN-α，並含有已經併入人類抗體可變功能部位內的可變功能部位、得自與人類IFN-α結合之ACO-1的CDR序列，且更進一步在輕鏈可變功能部位中，在選自29、33和50的一或多個位置處包括ACO-2胺基酸殘基。

在一具體事實中，本發明提供hzACO-1變體，其專一地結合人類IFN-α，並包括實質上與SEQ ID NO:3之Kabat殘基31-35、50-65和95-102之序列相同的VH CDR序列，並帶有N31S突變。該抗體可以，例如包括CDR H1序列(包括有N31S突變的SEQ ID NO:15)；CDR H2序列(包括SEQ ID NO:21)；和CDR H3序列(包括SEQ ID NO:17)。額外或，可供選擇地，該抗體亦可包括CDR H1序列(由有N31S突變的SEQ ID NO:15構成)；CDR H2序列(由SEQ ID NO:21構成)；和CDR H3序列(由SEQ ID NO:17構成)。在一具體事實中，該人類化ACO-1包括衍生自人類VH1_46基因及/或人類JH4基因，較佳是兩者的VH架構殘基。在特定的具體事實中，該人類化抗體包括相當於SEQ ID NO:3的VH序列，在Kabat位置31處有N到S的突變。如同在實施例中所示，在hzACO-1中的N31S突變，增加了對IFN-αA的結合親和力，至可與ACO-1相比擬的水平，並增加了在pH3.5和4.5處的穩定性。再者，因為殘基31是在「供者」CDR殘基中，故該突變不會將更多鼠類殘基導入hzACO-1序列內，因此不會在投予人類時增加對該抗體之免疫反應的風險。其他具有相同優點的CDR突變，包括在hzACO-1 VL中的D29G和S50G。

在一具體事實中，本發明提供hzACO-1變體，其專一地結合人類IFN-α，並包括實質上與SEQ ID NO:3之Kabat殘基31-35、50-65和95-102之序列相同的VH CDR序列，並帶有T28S突變。該抗體可以，例如包括CDR H1序列(包括SEQ ID NO:15)；CDR H2序列(包括SEQ ID NO:21)；和CDR H3序列(包括SEQ ID NO:17)。額外或可供選擇地，該抗體亦可包括CDR H1序列(由SEQ ID NO:15構成)；CDR H2序列(由SEQ ID NO:21構成)；和CDR H3序列(由SEQ ID NO:17構成)。在一具體事實中，該人類化ACO-1包括衍生自人類VH1_46基因的VH架構殘基，更進一步包括T28S突變。在特定的具體事實中，該人類化抗體包括相當於SEQ ID NO:3的VH序列，在Kabat位置28處有T到S的突變。如同在實施例中所示，在hzACO-1中的T28S突變，增加了對IFN-αA的結合親和力，至可與ACO-1相比擬的水平，並增加了在pH3.5和4.5處的穩定性。

在一具體事實中，本發明提供hzACO-1變體，其專一地結合人類IFN-α，並包括實質上與SEQ ID NO:3之Kabat殘基31-35、50-65和95-102之序列相同的VH CDR序列，並帶有A93V突變。該抗體可以，例如包括CDR H1序列(包括SEQ ID NO:15)；CDR H2序列(包括SEQ ID NO:21)；和CDR H3序列(包括SEQ ID NO:17)。額外或可供選擇地，該抗體亦可包括CDRH1序列(由SEQ ID NO:15構成)；CDR H2序列(由SEQ ID NO:21構成)；和CDR H3序列(由SEQ ID NO:17構成)。在一具體事實中，該人類化ACO-1包括衍生自人類VH1_46基因和人類JH4基因的VH架構殘基，更進一步包括A93V突變。在特定的具體事實中，該人類化抗體包括相當於SEQ ID NO:3的VH序列，在Kabat位置93處有A到V的突變。如同在實施例中所示，在hzACO-1中的A93V突變，增加了對IFN-αA的結合親和力，至可與ACO-1相比擬的水平，增加了在RG測定中測量到的抑制IFN-影響之效力，並增加了在pH3.5和4.5處的穩定性。

在一具體事實中，本發明提供hzACO-1變體，其專一地結合人類IFN-α，並包括實質上與SEQ ID NO:3之Kabat殘基31-35、50-65和95-102之序列相同的VH CDR序列，更進一步包括在VH CDR序列之一中的突變，其中該突變不是在Kabat殘基58中。該抗體可以，例如包括由SEQ ID NO:3之Kabat殘基31-35、50-65和95-102構成的VH CDR，更進一步包括在VH CDR序列之一中的突變，其中Kabat殘基58為1。在一具體事實中，該人類化ACO-1包括衍生自人類VH1_46基因和人類JH4基因的VH架構殘基。如同在實施例中所示，在hzACO-1中的158S實質上降低了對IFN-αA的結合親和力，並降低了在RG測定中測量到的抑制IFN-影響之效力。

其他類型的架構修改涉及使在架構區內，或甚至是在一或多個CDR區內的一或多個殘基突變，以移除T細胞抗原決定基，藉此降低該抗體可能的免疫原性。該方法亦稱為「去免疫化(deimmunization)」，並在Carr等人的美國專利公開案第20030153043號中更詳細地描述。

Fc修改

除了在架構或CDR區內進行修改之外，或作為可供選擇的，可設計本發明之抗體以便在Fc區內納入修改，典型地改變該抗體的一或多個功能特性，如血清半衰期、補體固定、Fc受體結合、蛋白質穩定性及/或抗原-依賴性細胞之胞毒性或缺乏其等。而且，可以化學方式修改本發明之抗體(例如可將一或多個化學部分附接至該抗體)，或加以修改以改變其等之糖基化，再次改變抗體的一或多個功能特性。在下文中更詳細地描述這些具體事實中的每一個。根據Kabat將在Fc中的殘基編號。

若需要，可藉著已知的技術「轉換」抗體的種類。這類技術包括，例如使用直接重組技術(參見，例如美國專利第4,816,397號)，以及細胞-細胞融合技術(參見，例如美國專利第5,916,771號)。例如，一開始以IgM分子產生的抗體，可將其種類轉換成IgG抗體。亦可使用種類轉換技術將一IgG亞類轉變成另一種，例如從IgG1到IgG2。因此，可為了各種治療用途，藉著同型物轉變成例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、1gD、IgA、IgE或IgM抗體，改變本發明抗體的效應物功能。可經由例如GenBank獲得恆定區典型的cDNA序列，分別全部以引用方式納入本文中，如下：人類IgG1恆定重鏈區：GenBank登錄編號：J00228；人類IgG2恆定重鏈區：GenBank登錄編號：J00230；人類IgG3恆定重鏈區：GenBank登錄編號：X04646；人類IgG4恆定重鏈區：GenBank登錄編號：K01316；和人類κ輕鏈恆定區：GenBank登錄編號：J00241。

在一具體事實中，修改CH1的鉸鏈區，而得以改變(例如增加或減少)在鉸鏈區中半胱胺酸殘基的數目。在Bodmer等人的美國專利第5,677,425號中進一步描述了該方法。改變在CH1之鉸鏈區中半胱胺酸殘基的數目，例如，有助於輕和重鏈的裝配，或增加或減少抗體的穩定性。

在另一具體事實中，使抗體的Fc鉸鏈區突變，以減少該抗體的生物半衰期。更明確地說，將一或多個胺基酸突變導入Fc-鉸鏈片段之CH2-CH3功能部位介面區內，使得該抗體相對於原來的Fc-鉸鏈功能部位SpA結合，有受損的葡萄球菌(Staphylococcyl)蛋白質A(SpA)結合。在Ward等人的美國專利第6,165,745號中更詳細地描述了該方法。在另一具體事實中，修改抗體以增加其生物半衰期。各種方法都有可能。例如，可導入一或多個下列的突變：T252L、T254S、T256F，如同在Ward之美國專利第6,277,375號中描述的。或者，欲增加生物半衰期，可在CH1或CL區內改變該抗體，使其含有取自IgG之Fc區的CH2功能部位之兩環的補救受體結合性抗原決定基，如同在Presta等人之美國專利第5,869,046號和6,121,022號中描述的。在另一具體事實中，藉著以不同的胺基酸殘基置換至少一個胺基酸殘基來改變Fc區，以改變該抗體的效應物功能。例如，可利用不同的胺基酸殘基置換選自胺基酸殘基234、235、236、237、297、318、320和322的一或多個胺基酸，使得該抗體對效應物配體具有經改變之親和力，但仍保留親本抗體的抗原-結合能力。改變對其之親和力的效應物配體可以是，例如Fc受體或補體的Cl組份。在Winter等人的美國專利第5,624,821號和5,648,260號兩者中更詳細地描述了該方法。在另一實施例中，可利用不同的胺基酸殘基置換選自胺基酸殘基329、331和322的一或多個胺基酸，使得該抗體具有經改變之Clq結合及/或經降低或廢除之補體依賴性胞毒性(CDC)。在Idusogie等人的美國專利第6,194,551號中更詳細地描述了該方法。在另一實施例中，改變在胺基酸位置231和239內的一或多個胺基酸殘基，藉此改變該抗體固定補體的能力。在Bodmer等人的PCT公開案WO94/29351中更進一步描述了該方法。在另一實施例中，修改Fc區以增加該抗體介導抗體依賴性細胞之胞毒性(ADCC)的能力，及/或藉著修改在下列位置的一或多個胺基酸，增加該抗體對Fcy受體的親和力：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。在Presta的PCT公開案WO00/42072中更進一步描述了該方法。而且，已經將在人類IgG1上對FcyRⅠ、FcyRⅡ、FcyRⅢ和FcRn的結合位置作圖，並已經描述具有經改良結合的變體(參見Shields,R.L.等人(2001)J. Biol. Chem. 276:6591-6604)。顯示在位置256、290、298、333、334和339處的專一突變，改善了對FcRⅢ的結合。此外，亦顯示下列的組合突變種改善了FcyRⅢ結合：T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K334A和S298A/E333A/K334A。

可進一步修改恆定區，以使抗體穩定，例如降低二價抗體分離成兩個單價VH-VL片段的風險。例如，在IgG4恆定區中，可使殘基S241突變成脯胺酸(P)殘基，以允許在鉸鏈處形成完整的二硫橋(參見例如Angal等人,Mol Immunol. 1993;30:105-8)。

糖基化修改

在另一具體事實中，修改抗體的糖基化。例如，可製造無糖基化的抗體(即該抗體缺少糖基化)。可改變糖基化，例如以增加該抗體對抗原的親和力。可藉著例如改變在抗體序列內的一或多個糖基化位置，來完成這類碳水化合物修改。

抗原結合性片段

可將本發明之抗IFN-α抗體製備成全長抗體或其抗原結合性片段。抗原結合性片段的實例包括Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2、F(ab)3、Fv(典型地為抗體單臂的VL和VH功能部位)、單鏈Fv(scFv；參見例如Bird等人,Science 1988;242:423-426；和Huston等人PNAS 1988;85:5879-5883)、dsFv、Fd(典型地為VH和CH1功能部位)和dAb(典型地為VH功能部位)片段；VH、VL、VhH和V-NAR功能部位；包括單一VH和單一VL鏈的單價分子；微型抗體(minibodies)、雙鏈抗體(diabodies)、三鏈抗體(triabodies)、四鏈抗體(tetrabodies)和卡巴抗體(kappa bodies)(參見例如Ill等人,Protein Eng 1997;10:949-57)；駱駝IgG；IgNAR；以及一或多個經分離CDR或有功能之抗原互補位(paratope)，其中經分離CDR或抗原結合性殘基或多肽可結合或連接在一起，以致於形成有功能的抗體片段。已經在例如Holliger和Hudson,Nat Biotechnol 2005;23:1126-1136；WO2005040219和已發表的美國專利申請案20050238646和20020161201中，描述或回顧了各種類型的抗體片段。

可使用傳統的重組或蛋白質設計技術獲得抗體片段，並可針對抗原-結合或其他功能，以與完整抗體相同的方式篩選該片段。

已經發展出各種技術，來生產抗體片段。在傳統上，經由全長抗體的蛋白水解消化衍生這些片段(參見例如Morimoto等人,Journal of Biochemical and Biophysical Methods,24:107-117(1992)；和Brennan等人,Science,229:81(1985))。然而，現在可藉著重組宿主細胞直接產生這些片段。或者，可從大腸桿菌(E.coli)中直接回收Fab’-SH片段，並以化學方式偶聯，形成F(ab’)2片段(Carter等人,Bio/Technology,10:163-167(1992))。根據其他方法，可從重組宿主細胞培養物中直接分離F(ab’)2片段。在另外的具體事實中，選出的抗體為單-鏈Fv片段(scFv)。參見WO 1993/16185；美國專利第5,571,894號；以及美國專利第5,587,458號。抗體片段亦可以是「線性抗體」，例如，像是在美國專利第5,641,870號中的描述。這類線性抗體片段可以是單專一性或雙專一性的。

多專一性分子

另一方面，本發明之特徵為多專一性分子，其包括本發明之抗IFN-α抗體，或其抗原-片段。這類多專一性分子包括雙專一性分子，其包括至少一個對IFN-α的第一個結合專一性，和對第二個目標抗原決定基的第二個結合專一性。

一種類型的雙專一性分子為雙專一性抗體。雙專一性抗體是具有對至少兩個不同抗原決定基之結合專一性的抗體。製造雙專一性抗體的方法為在技術領域中已知的，且全長雙專一性抗體的傳統生產，經常是基於兩個免疫球蛋白重-鏈-輕-鏈對的共同表現，其中兩個鏈具有不同的專一性(Millstein等人,Nature,305;537-539(1983))。可將雙專一性抗體製備成全長抗體或抗體片段(例如F(ab’)2雙專一性抗體)，或在本文中描述之任何其他的抗原結合性片段。

其他多專一性分子包括從IFN-α-結合性抗體部分與一或多個其他非抗體蛋白質之融合中產生的那些。已經在技術領域中描述了這類多專一性蛋白質，以及如何建構其等。參見，例如Dreier等人(Bioconjug. Chem. 9(4):482-489(1998))；美國專利第6,046,310號；美國專利公開案第20030103984號；歐洲專利申請案1 413 316；美國專利公開案第20040038339號；von Strandmann等人,Blood(2006;107:1955-1962)和WO 2004056873。

亦期待具有兩價以上的多專一性分子。例如，可製備三專一性抗體。Tutt等人,J. Immunol,147:60(1991)。

可藉著使用在技術領域中已知的方法，使組成的結合專一性共軛，來製備本發明之多專一性分子。例如，可分別產製多專一性分子的每個結合專一性，然後彼此共軛。當結合專一性是蛋白質或肽時，可使用各種偶聯或交-聯劑進行共價結合。交聯劑之實例包括蛋白質A、碳化二醯亞胺、N-琥珀醯亞胺基-S-乙醯基-硫代乙酸酯(SATA)、5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、鄰-苯二順丁烯二醯亞胺(oPDM)、N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)和磺基琥珀醯亞胺基4-(N-順丁烯二醯亞胺甲基)環己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)(參見例如Karpovsky等人(1984)J. Exp. Med. 160:1686；Liu,MA等人(1985)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648)。其他方法包括在Paulus(1985)Behring Ins. Mitt. 78期,118-132；Brennan等人(1985)Science 229:81-83，和Glennie等人(1987)J. Immunol. 139:2367-2375中描述的那些。較佳的共軛劑是SATA和磺基-SMCC，兩者均可獲自Pierce Chemical Co.(Rockford,IL)。

當結合專一性是抗體時，可經由兩個重鏈之C-端鉸鏈區的硫氫基結合共軛其等。在特佳的具體事實中，在共軛之前先修改鉸鏈區，以使其含有奇數的硫氫基殘基，較佳的是一個。

或者，可在相同載體中編碼兩個結合專一性，並在相同的宿主細胞中表現和組裝。在雙專一性分子為mAbxmAb、mAbxFab、FabxF(ab’)2或配體xFab融合蛋白之處，該方法是特別有用的。本發明之雙專一性分子可以是包括一單鏈抗體和一結合決定位的單鏈分子，或包括兩個結合決定位的單鍵雙專一性分子。雙專一性分子可包括至少兩個單鏈分子。在例如美國專利第5,260,203號；美國專利第5,455,030號；美國專利第4,881,175號；美國專利第5,132,405號；美國專利第5,091,513號；美國專利第5,476,786號；美國專利第5,013,653號；美國專利第5,258,498號；美國專利第5,482,858號；美國專利申請公開案20030078385；Kontermann等人,(2005)Acta Pharmacological Sinica 26(1):1-9；Kostelny等人,(1992)J. Immunol. 148(5):1547-1553；Hollinger等人(1993)PNAS (USA)90:6444-6448；和Gruber等人,(1994)J. Immunol. 152:5368中描述或回顧了製備雙專一性分子的方法。

抗體衍生物

在本發明範圍內的抗體衍生物(或免疫共軛物)包含與第二劑共軛或共價結合的抗IFN-α抗體。

例如，本發明一方面提供包括與胞毒劑共軛或共價結合之抗體的免疫共軛物，其中胞毒劑可選自治療性放射性同位素、毒性蛋白質、毒性小分子，如藥物、毒素、免疫調節劑、激素、激素拮抗劑、酵素、寡核苷酸、酵素抑制劑、治療性放射性核種、血管生成抑制劑、化療藥物、長春花生物鹼、氨茴環黴素、表鬼臼毒素(epidophyllotoxins)、紫杉烷(Taxanes)、抗代謝產物、烷基化劑、抗生素、COX-2抑制劑、SN-38、抗有絲分裂劑(antimitotics)、抗血管生成和細胞凋亡劑，特別是阿黴素(doxorubicin)、胺甲碟呤(methotrexate)、紫杉醇(taxol)、CPT-11、喜樹鹼(camptothecans)、氮芥(nitrogen mustards)、吉西他濱(gemcitabine)、磺酸烷基酯、亞硝基脲(nitrosoureas)、三氮烯(triazenes)、葉酸類似物、嘧啶類似物、嘌呤類似物、鉑配位複合物、假單胞菌(Pseudomonas)外毒素、蓖麻毒素(ricin)、雞母珠毒蛋白(abrin)、5-氟尿嘧啶、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌腸毒素-A、美洲商陸(pokeweed)抗病毒蛋白、白樹毒素(gelonin)、白喉(diphtherin)毒素、假單胞菌外毒素和假單胞菌內毒素及其他(參見例如雷明頓氏藥理學(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，第19版(Mack Publishing Co. 1995)；古德曼和吉爾曼氏治療的藥理學基礎(Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics)(McGraw Hill,2001)；Pastan等人(1986)Cell 47:641；Goldenberg(1994)Cancer Journal for Clinicians 44:43；美國專利第6,077,499號；將其完整揭示內容以引用方式納入本文中)。會察知毒素可以是動物、植物、真菌或微生物來源的，或可藉著化學合成重新創造。

在另一具體事實中，利用放射性同位素衍生該抗體，如治療性放射性核種或適合檢測目的的放射性核種。可使用任何適當的放射性同位素，包括但不限於I-131、銦-111、鎦-171、鉍-212、鉍-213、砈-211、銅-62、銅-64、銅-67、釔-90、碘-125、碘-131、磷-32、磷-33、鈧-47、銀-111、鎵-67、鐠-142、釤-153、鋱-161、鏑-166、鈥-166、錸-186、錸-188、錸-189、鉛-212、鐳-223、錒-225、鐵-59、硒-75、砷-77、鍶-89、鉬-99、銠-105、鈀-109、鐠-143、鉕-149、鉺-169、銥-194、金-198、金-199和鉛-211。通常，放射性核種較佳的是對於俄歇電子發射(Auger emitter)具有在20到6,000keV之範圍內，較佳的是在60到200keV之範圍內的衰變能，對於β發射為100-2,500keV，而對於α發射為4,000-6,000keV。較佳的還有實質上衰變同時產生α-粒子的放射性核種。

可使用本發明之抗體共軛物，以修改特定的生物反應，其中不應將該藥物部分解釋為受限於典型的化學治療劑。例如，該藥物部分可以是具有想要生物活性的蛋白質或多肽。這類蛋白質可包括，例如有酵素活性的毒素，或其活性片段，如雞母珠毒蛋白、蓖麻毒素A、假單胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白質，如腫瘤壞死因子或干擾素-y；或生物反應改性劑，像是例如淋巴細胞介素(lymphokines)、介白素-1(「IL-1」)、介白素-2(「IL-2」)、介白素-6(「IL-6」)、粒性細胞巨噬細胞集落刺激性因子(「GM-CSF」)、粒性細胞集落刺激性因子(「G-CSF」)或其他生長因子。

可將第二劑與抗體直接或間接連接，使用任何可利用的許多方法。例如，可經由二硫鍵形成、使用交聯劑(如N-琥珀醯3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP))，或經由在抗體之Fc區中的碳水化合物部分，將製劑附接在經還原抗體組份之鉸鏈區(參見例如Yu等人(1994)Int. J. Cancer 56:244；Wong,Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking (CRC Press 1991)；Upeslacis等人,「藉著化學方法修改抗體(Modification of Antibodies by Chemical Methods)」,在單株抗體：原理和應用(Monoclonal antibodies:principles and applications),Birch等人(編輯),第187-230頁(Wiley-Liss,Inc. 1995)中；Price,「合成肽-衍生之抗體的生產和定性(Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies)」，在單株抗體：生產、設計和臨床應用(Monoclonal antibodies:Production,engineering and clinical application),Ritter等人(編輯),第60-84頁(Cambridge University Press 1995)中；Cattel等人(1989)Chemistry today 7:51-58；Delprino等人(1993)J. Pharm. Sci 82:699-704；Arpicco等人(1997)Bioconjugate Chernistry 8:3；Reisfeld等人(1989)Antihody,Immunicon.Radiopharrn.2:217；將其完整揭示內容分別以引用方式納入本文中)。亦參見，例如Arnon等人，「在癌症治療中適合藥物之免疫靶定的單株抗體(Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy)」，在單株抗體和癌症治療(Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy),Reisfeld等人(編輯)，第243-56頁(Alan R. Liss,Inc. 1985)中；Hellstrom等人，「適合藥物遞送的抗體(Antibodies For Drug Delivery)」，在經控制之藥物遞送(Controlled Drug Delivery)(第2版),Robinson等人(編輯)，第623-53頁(Marcel Dekker,Inc. 1987)中；Thorpe,「在癌症治療中胞毒劑的抗體載劑:回顧(Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review)」，在單株抗體84年：生物學和臨床應用(Monoclonal Antibodies '84:Biological And Clinical Applications),Pinchera等人(編輯)，第475-506頁(1985)中；「在癌症治療中，經放射性標示之抗體的分析、結果和未來期望之治療用途(Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy)」，適合癌症偵測和治療的單株抗體(Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy),Baldwin等人(編輯)，第303-16頁(Academic Press 1985)中；以及Thorpe等人，「抗體-毒素共軛物之製備和胞毒特性(The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates)」,Immunol. Rev.,62:119-58(1982)。

關於細胞毒素之類型、連接子和使治療劑與抗體共軛之方法的更多討論，亦參見Saito,G.等人(2003)Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215；Trail,P.A.等人(2003)Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337；Payne,G.(2003)Cancer Cell 3:207-212；Allen,T.M.(2002)Nat. Rev. Cancer 2:750-763；Pastan,I.和Kreitman,R.J.(2002)Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091；Senter,P.D.和Springer,C.J.(2001)Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264。

在其他的具體事實中，第二劑是可偵測的部分，其可以是任何可定量或定性觀察或測量的分子。可用在本發明之經共軛抗體中的可偵測標記之實例，為放射性同位素、螢光染料，或互補結合對的成員，如下列任一之成員：抗原/抗體(對IFN-α之抗體以外的)、外源凝集素/碳水化合物；抗生物素蛋白/生物素；受體/配體；或經分子銘印之聚合物/印刷分子系統。

第二劑也可以或可供選擇地是聚合物，企圖例如增加該抗體之循環半衰期。在例如美國專利第4,766,106號；4,179,337號；4,495,285號；和4,609,546號中說明了典型的聚合物，以及將這類聚合物附接至肽的方法。其他舉例說明的聚合物包括經聚氧乙基化之多元醇和聚乙二醇(PEG)部分。當在本文中使用時，術語「聚乙二醇」企圖包括已經用來衍生其他蛋白質之任何形式的PEG，如單(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇，或聚乙二醇-順丁烯二醯亞胺。例如，可使全長抗體或抗體片段與一或多個分子量在大約1,000到大約40,000之間，如在大約2000到大約20,000之間，例如大約3,000-12,000的PEG分子共軛。欲PEG化抗體或其片段，典型地在其中可使一或多個PEG基團變成與抗體或抗體片段附接的條件下，使該抗體或片段與聚乙二醇(PEG)-如PEG的反應性酯或醛衍生物反應。較佳的是，經由與反應性PEG分子(或類似之反應性水溶性聚合物)的醯化反應或烷基化反應，完成PEG化。在某些具體事實中，欲經PEG化之抗體是無糖基化的抗體。PEG化蛋白質的方法為在技術領域中已知的，並可適用於本發明之抗體。參見例如Nishimura等人的歐洲專利0 154 316和Ishikawa等人的歐洲專利0 401 384。

抗體定性

在生產和純化之後，或作為篩選或選擇程序的一部分，可調查本發明之抗IFN-α抗體的功能特徵。

下列的是抗體定性之典型測定的簡單說明。有些會在其他章節中更進一步描述，及/或在實施例中描述。

結合測定

本發明提供與IFN-α結合的抗體、抗原結合性片段及其免疫共軛物。可使用任何的各種測定來評估抗體對IFN-α的結合。特別適合使用基於ELISAs、放射性免疫測定、西方墨點法、BIACORE和競爭測定的協定，並為在技術領域中已熟知的。

例如，可使用簡單的結合測定，其中在目標蛋白質或抗原決定基(例如選自A、2、B2、C、F、G、H2、I、J1、K、4a、4b、WA、1和D的IFN-α蛋白質亞型、其一部分或其任何組合)的存在下培養受試抗體，洗掉未結合的抗體，並使用例如RIA、ELISA等等評估已結合抗體的存在。這類方法為熟諳此藝者已熟知的。任何超過在對照組、非專一性抗體中看到之量的結合量，表示該抗體專一地結合目標。

在這類測定中，可將受試抗體與人類IFN-α結合的能力，與(陰性)對照組蛋白質(例如對在結構上無關之抗原升高的抗體)，或非Ig肽或蛋白質與相同目標結合的能力相比較。使用任何適當的測定，若抗體或片段相對於對照組蛋白質，與IFN-α之結合有25%、50%、100%、200%、1000%或更高的增加親和力之能力，該抗體或片段就是與目標「專一地結合」或與目標「專一地交互作用」，且對於用在下述之治療方法中是較佳的。亦可評估受試抗體影響(陽性)對照組抗體，例如人類化ACO-1或ACO-2抗體，與IFN-α結合的能力。

本發明一方面提供與人類化ACO-1或ACO-2抗體共享生物特徵及/或實質之VH及/或VL序列同一性的人類化抗IFN-α抗體。一個典型的生物特徵為與ACO-1或ACO-2抗原決定基，即在某些IFN-α蛋白質亞型之細胞外功能部位中與ACO-1和ACO-2抗體結合的個別區域結合。欲篩選與ACO-1或ACO-2抗原決定基結合的抗體，可進行例行的交叉阻斷測定，如在抗體，實驗室手冊(Antibodies,ALaboratory Manual),Cold Spring Harbor Laboratory,編輯Harlow和David Lane(1988)中描述的。

在典型的交叉阻斷或競爭測定中，混合(或預先-吸附)ACO-1或ACO-2(對照組)抗體和受試抗體，並施用在含有IFN-α的試樣中。在某些具體事實中，在施用於含有IFN-α之試樣中之前，會預先混合對照組抗體與變化量的受試抗體(例如1:10或1:100)一段時間。在其他的具體事實中，可在接觸抗原/目標試樣的期間，簡單地混合對照組和變化量的受試抗體。只要可區別已結合和自由抗體(例如藉著使用分離或沖洗技術，以排除未結合的抗體)，以及對照組抗體和受試抗體(例如藉著使用物種-或同型物-專一之二級抗體，藉著以可偵測標記專一地標示對照組抗體，或藉著使用物理方法，如質譜分析，以區別不同的化合物)即可，吾人能夠測定受試抗體是否減少了對照組抗體與抗原之結合，表示受試抗體實質上認得與對照組相同的抗原決定基。在該測定中，(經標示之)對照組抗體在完全無關之抗體存在下的結合，為對照組高值。藉著將經標示之(陽性)對照組抗體與未經標示之對照組抗體一起培養，獲得對照組低值，其中會發生競爭，並減少經標示之抗體的結合。

在測試測定中，在受試抗體存在下，在經標示之抗體反應性上的顯著降低，代表該受試抗體認得相同的抗原決定基，即與經標示之對照組抗體「交叉反應」的抗原決定基。將在大約1:10到大約1:100之間的對照組：受試抗體或化合物之任何比例下，降低經標示對照組與抗原/目標之結合至少50%，或更佳的是70%的任何受試抗體或化合物，視為與實質上與對照組相同之抗原決定基或決定位結合的抗體或化合物。較佳的是，這類受試抗體或化合物會降低對照組與抗原/目標的結合至少90%。然而，在本發明中可使用降低對照組抗體或化合物之結合至任何可測量之程度的任何化合物或抗體。

生物活性

單核細胞的分化。經活化T和B淋巴細胞的產生，需要提交抗原之細胞(antigen presenting cells,「APC」)的招募和成熟。這些APC包括B細胞、單核細胞/巨噬細胞和樹突細胞。SLE患者的血清含有IFN-α，其可活化DCs，並可利用根據本發明之人類化抗體製劑阻斷該經活化之活性。

在科學和專利文獻中，描述了偵測和定量該活性的方法(參見，例如專利公開案第US20040067232A1的段落0136到0150，將其相關部分以引用方式納入本文中)。

MxA啟動基因的活化。可使用報告子基因(RG)測定，其中將MxA啟動基因與報告子基因融合，如氯黴素乙醯轉移酶(chloramphenicol acetyltransferase,CAT)或蟲螢光素酶(1uc)，較佳的是蟲螢光素酶，測量IFN-α活化MxA啟動基因的能力，以及本發明之抗IFN-α單株抗體阻斷該活化的能力。CAT和蟲螢光素酶的測定為熟諳此藝者已知的。較佳的是，在以MxA啟動基因/報告子基因融合構築體穩定轉型的A549細胞中，測量MxA啟動基因的活性。A549細胞是肺癌細胞株，可經由ATCC獲得(產品編號CC1-185)。MxA(亦名MxI)啟動基因可以是人類、小鼠或大鼠的。在GenBank登錄編號X55639，Chang等人(1991)Arch Virol. 117:1-15；和Ronni等人(1998)J Interferon Cytokine Res. 18:773-781中揭示了人類MxA啟動基因的序列和結構。在專利公開案US20040209800和Rosmorduc等人(1999)J of Gen Virol 80:1253-1262中揭示了人類MxA啟動基因/蟲螢光素酶融合構築體和蟲螢光素酶測定。在Fernandez等人(2003)J Gen Virol 84:2073-2082和Fray等人(2001)J Immunol Methods 249:235-244中揭示了人類MxA啟動基因/CAT融合構築體和CAT測定。在GenBank登錄編號M21104；Hug等人(1988)Mol Cell Biol 8:3065-3079；和Lleonart等人(1990)Biotechnology 8:1263-1267中揭示了小鼠MxA(MxI)啟動基因。在Canosi等人(1996)J Immunol Methods 199:69-67中揭示了小鼠MxA啟動基因/蟲螢光素酶融合構築體和蟲螢光素酶測定。

細胞病變效應(Cytopathic effect,CPE)抑制測定。CPE測定是基於干擾素的抗病毒活性。通常，在干擾素的存在下以病毒感染適當的細胞株，並對病毒繁殖或複製過程定量干擾素的抑制活性。測定的讀值可能是基於病毒產量的降低、病毒細胞病變效應的降低、病毒蛋白質或RNA合成的降低、病毒溶菌斑形成的降低。可使用細胞病變測定，以測定抗體對干擾素活性的中和效果。在Meager,A. 1987藉著抗病毒測定定量干擾素，及其等之標準化(Quantification of interferons by anti-viral assays and their standardization.)在：Clemens,M.J.,Morris,A.G.,Gearing,A.J.H.(編輯),淋巴細胞介素和干擾素：實施方法(Lymphokines and interferons:A Practical Approach.)IRL,Press,Oxford,第129頁中，以及Grossberg和Sedmak,1984.干擾素的測定(Assays of interferons)在：Billiau,A.(編輯)干擾素(Interferon),第1冊：普通和應用觀點(General and Applied Aspects.)Elsevier,Amsterdam,第189頁中，以及在PCT公開案WO2006086586的實施例6、段落157-164和圖1中，描述了典型的CPE測定。

藥學調配物

本發明的其他目標是提供藥學調配物，其包括以從10-500毫克/毫升之濃度存在的[蛋白質]化合物，像是例如20-300毫克/毫升，較佳的是30-100毫克/毫升，且最佳的是50-100毫克/毫升，且其中該調配物具有從2.0到10.0之pH值。該調配物更可包括緩衝系統、防腐劑、張力劑、螯合劑、穩定劑和表面活性劑。在本發明之一具體事實中，該藥學調配物是水性調配物，即調配物包括水。這類調配物典型地為溶液或懸浮液。在本發明更進一步之具體事實中，該藥學調配物是水溶液。將術語「水性調配物」定義為包括至少50重量%水的調配物。同樣地，將術語「水溶液定義為包括至少50重量%水的溶液，並將術語「水性懸浮液」定義為包括至少50重量%水的懸浮液。

在另一具體事實中，該藥學調配物是冷凍-乾燥的調配物，在使用之前由醫師或患者將溶劑及/或稀釋劑加至其中。

在另一具體事實中，該藥學調配物是經乾燥的調配物(例如冷凍-乾燥或噴霧-乾燥)，隨時可使用，不需任何之前的分解。

診斷應用

本發明之IFN-α-抗體亦具有非治療用途。例如，抗IFN-α抗體亦可用在IFN-α蛋白質的診斷測定中，例如偵測其在特定細胞、組織或血清中的表現。例如，抗IFN-α抗體可用在替抗IFN-α治療挑選患者的測定中。為了這類目的，可使用抗IFN-α抗體來分析IFN-α在血清或組織樣本中的存在。為了診斷應用，典型地會以可偵測部分來標示該抗體。

治療應用

亦由本發明提供使用如在本文中描述之人類化抗IFN-α抗體治療患者的方法。在一具體事實中，本發明提供了如在本文中描述之人類化抗體，在製備投予人類患者之醫藥組合物上的用途。典型地，該患者罹患或處在自體免疫或發炎性疾病或病症之風險下，該疾病或病症與至少一個選自由亞型A、2、B2、C、F、G、H2、I、J1、K、4a、4b和WA所組成之群組的IFN-α亞型之異常表現有關。

欲以本發明之抗體治療的典型症狀或病症，包括但不限於狼瘡(例如系統性紅斑性狼瘡(SLE))、風濕性關節炎(rheumatoid arthritis)、幼年型慢性關節炎、骨關節炎(osteoarthritis)、脊柱關節病(spondyloarthropathies)、系統性硬皮病(systemic sclerosis(硬皮病(scleroderma))、特發性炎性肌病(idiopathic inflammatory myopathies)(皮肌炎(dermatomyositis)、多肌炎(polymyositis))、薛格連氏徵候群、脈管炎(vasculitis)、系統性脈管炎、類肉瘤病(sarcoidosis)、自體免疫溶血性貧血(autoimmune hemolytic anemia)(免疫泛血球減少症(immune pancytopenia)、陣發性睡眠性血紅蛋白尿(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria))、自體免疫性血小板減少症(autoimmune thrombocytopenia)(特發性血小板減少性紫斑(idiopathic thrombocytopenic purpura)、免疫-介導之血小板減少症(immune-mediated thrombocytopenia))、甲狀腺炎(葛瑞夫茲病(Grave's disease)、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、幼年型淋巴細胞性甲狀腺炎(juvenile lymphocytic thyroiditis)、萎縮性甲狀腺炎(atrophic thyroiditis))、糖尿病、免疫-介導之腎病(腎小球性腎炎(glomerulonephritis)、腎小管間質性腎炎(tubulointerstitial nephritis))、中樞和周圍神經系統的脫髓鞘疾病，如多發性硬化症(multiple sclerosis)、特發性脫髓鞘性多發性神經病(idiopathic demyelinating polyneuropathy)或格林-巴厘徵候群(Guillain-Barresyndrome)和慢性發炎性脫髓鞘性多發性神經病(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy)、肝膽疾病，如傳染性肝炎(A、B、C、D、E型肝炎及其他非嗜肝病毒)、自體免疫性慢性主動性肝炎(autoimmune chronic active hepatitis)、原發性膽汁性肝硬化(primary bitiary cirrhosis)、肉芽腫性肝炎(granulomatous hepatitis)和硬化性膽管炎(sclerosing cholangitis)、發炎性腸病(inflammatory bowel disease)(潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis)、克隆氏症(Crohn's disease))、乳糜瀉(celiac disease)、麩質過敏性腸病(gluten-sensitive enteropathy)和惠普爾病(Whipple's disease)、自體免疫或免疫-介導之皮膚疾病，包括大皰性皮膚病(bullous skin diseases)、多形紅斑(erythema multiforme)和接觸性皮膚炎(contact dermatitis)、牛皮癬、過敏疾病，如氣喘(asthma)、過敏性鼻炎(allergic rhinitis)、異位性皮膚炎(atopic dermatitis)、食物過敏(food hypersensitivity)和蕁麻疹(urticaria)、肺的免疫學疾病，如嗜曙紅細胞性肺炎(eosinophilic pneumonias)、特發性肺纖維變性(idiopathic pulmonary fibrosis)和過敏性肺炎(hypersensitivity pneumonitis)，以及與移植有關的疾病，包括移植排斥和移植-對-宿主疾病。在特定的具體事實中，該疾病、症狀或病症係選自狼瘡、薛格連氏徵候群、牛皮癬、糖尿病、風濕性關節炎和幼年型皮肌病。在另一特定的具體事實中，該疾病、症狀或病症為SLE。例如，一方面將抗IFN-α抗體與一或多個其他的消炎藥併用，包括但不限於止痛藥、免疫抑制劑、皮質類固醇和抗TNFα劑，或其他抗細胞介素或抗細胞介素受體製劑，以及抗血管生成劑。特定的實例包括胺甲碟呤、TSG-6、美羅和CTLA4-Fc融合蛋白。在下文中提供組合治療更進一步的實例。

製造物件

在本發明另一具體事實中，提供包含可用來治療上述病症之材料的製造物件。例如，該製造物件可包括含有如在本文中描述之人類化抗IFN-α抗體，連同指示使用者以有效量之抗體來治療人類病症(如自體免疫或發炎性疾病或病症)之說明書的容器。製造物件典型地包括容器和在容器上或與其結合之標籤或包裝插入物。適當的容器包括，例如瓶子、小瓶、注射筒等等。可由各種材料形成容器，如玻璃或塑料。該容器裝有有效治療症狀的組合物，並具有無菌進入孔(例如該容器可以是靜脈內溶液袋，或具有可由皮下注射針頭刺穿之塞子的小瓶)。在該組合物中，至少一個活性劑是本文之人類化抗IFN-α抗體或抗原結合性片段，或包括這類抗體的抗體衍生物(例如免疫共軛物)。標籤或包裝插入物指示使用該組合物來治療所選擇的症狀，像是例如SLE。

此外，製造物件可包括(a)其中含有組合物的第一個容器，其中該組合物包括本文之人類或人類化抗體，和(b)其中含有組合物的第二個容器，其中該組合物包括人類或人類化抗體以外的治療劑。在本發明之具體事實中的製造物件，可進一步包括包裝插入物，指示可併用第一和第二個組合物，以治療自體免疫或發炎性疾病或病症。這類治療劑可以是任何在先前段落中描述的輔助治療。可供選擇或額外地，製造物件可進一步包括第二個(或第三個)容器，其包括在藥學上可接受的緩衝溶液，如制菌的注射用水(BWFI)、磷酸緩衝之生理鹽水、林格氏液和右旋糖溶液。其可進一步含有在商業和使用者觀點上想要的其他材料，包括其他的緩衝溶液、稀釋劑、濾器、針頭和注射筒。

因此在第一項觀點中，本發明係關於人類化抗體，或其抗原結合性片段，其專一地結合人類干擾素-α(IFN-α)，該人類化抗體是鼠類抗體ACO-1或ACO-2，或其組合的人類化版本，包括比根據Kabat之鼠類互補決定區(CDR)少的供者胺基酸殘基。

因此在第二項觀點中，本發明係關於專一地結合IFN-α的人類化抗體，或其抗原結合性片段，其中該抗體能夠結合IFN-α亞型A、2、B2、C、F、G、H2、I、J1、K、4a、4b和WA，但不與亞型1或D結合，且其中該抗體包括比根據Kabat之非人類CDR少的供者胺基酸殘基。

根據一具體事實，該CDR H2供者殘基包括Kabat殘基50-59。在另一具體事實中，該抗體與ACO-1及/或ACO-2抗體在IFN-α亞型上競爭及/或結合相同的抗原決定基。

根據較佳的具體事實，該抗體為IgG4亞型。在較佳的具體事實中，該抗體包括根據SEQ ID NO:21的CDR H2序列。

在第三項觀點中，本發明係關於產生根據本發明之抗體的方法，其中該方法包括在適當的條件下培養編碼該抗體之宿主細胞，且隨後分離該抗體。而且，本發明係關於藉著這類方法獲得或可藉此獲得的抗體。

在第四項觀點中，本發明係關於包括根據本發明之抗體的組合物。而且，本發明係關於製備根據本發明之組合物的製程，其中該方法包括將抗體或其片段與賦形劑混合。而且，本發明係關於藉著這類方法獲得或可藉此獲得的組合物。

在第五項觀點中，本發明係關於預防、管理、治療或改善與IFN-α有關之發炎性疾病或病症的方法，該方法包括對需要其之個體投予預防或治療有效量的根據本發明之抗體。

最後，本發明係關於根據本發明之抗體在製備適合用來治療發炎性疾病之醫藥品上的用途。

實施例

藉著下列非限制性之實施例，解釋本發明的細節。

實施例1-鼠類ACO-1和ACO-2抗體的定序

本實施例說明在WO20060086586中描述之鼠類抗體ACO-1和ACO-2的定序和重組表現，以及對ACO-2 VH和VL序列的BLAST搜尋。

抗體選殖和定序

使用得自Qiagen的RNeasy(#634914)，從融合瘤(ACO-1.5.2和ACO-2.2.1)中萃取總RNA。使用得自Clonetech的SMART-RACE cDNA擴大套組，從1微克總RNA來合成cDNA。該反應在42℃下執行1.5小時，並以75微升曲辛(tricine)-EDTA稀釋試樣。在50微升反應中進行目標的PCR擴大，使用5微升cDNA作為模板。在SMART RACE套組中含有重和輕鏈兩者的前進引子，其為萬能引子混合物(universal primer mix,UPM)。如下設計ACO-1重鏈(HC)的逆向引子序列：5’-CTGGGCCAGGTGCTGGAGG(SEQ ID NO:11)，和ACO-1輕鏈(LC)的逆向引子序列：5’-CTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTC(SEQ ID NO:12)。如下設計ACO-2重鏈(HC)的逆向引子序列：5’-CTAGCTAGCTCATTTACCCGGAGACCGGGAGATGG(SEQ ID NO:26)，和ACO-2輕鏈(LC)的逆向引子序列：5’-GCTCTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTG(SEQ ID NO:27)。

使用得自Clonetech的Advantage HF PCR套組進行PCR反應，並以在94℃/2分鐘下的單一變性步驟，接著是94℃/30秒；55℃/30秒；72℃/1.5分鐘的24次循環，執行PCR程式。最後的延伸步驟為72℃/10分鐘。在含有溴化乙錠的1%瓊脂糖凝膠上鑑認PCR產物。使用得自GE Healthcare的GFX純化套組，從凝膠中純化PCR產物，接著選殖到Zero Blunt TOPO PCR選殖套組(#K2875-40)內，並轉型到得自Invitrogen之TOP10大腸桿菌細胞內。

使用得自Qiagen的miniprep套組(#27106)，從大腸桿菌菌落中萃取DNA。在MWG Biotech,Matinsried,Germany，使用定序引子M13 rev(-29)和M13 uni(-21)定序質體。藉著使用VectorNTI證實HC和LC得自經鑑認之序列。所有基於套組的程序均根據製造者的指示進行。

從ACO-1.5.2融合瘤細胞中，選殖單一κ LC和單一IgG2a HC，具有下列的核酸和胺基酸序列。

ACO-1 VH序列(SEQ ID NO:13(包含信號肽))：

ACO-1 VL序列(SEQ ID NO:14(包含信號肽))：

ACO-1 VH(SEQ ID NO:1(排除信號肽))：

ACO-1 VL(SEQ ID NO:4(排除信號肽))：

從ACO-2.2.1融合瘤細胞中，選殖單一κ型ACO-2輕鏈和單一IgG2b ACO-2重鏈，具有下列的核酸和胺基酸序列。

ACO-2 VH序列(SEQ ID NO:28(包含信號肽))：

ACO-2 VL序列(SEQ ID NO:29(包含信號肽))：

ACO-2 VH序列(SEQ ID NO:7(排除信號肽))：

ACO-2 VL序列(SEQ ID NO:9(排除信號肽))：

發現根據Kabat定義之ACO-2 CDR序列為如下。

CDR-H1:SYWMH　(SEQ ID NO:22)

CDR-H2:EINPSHGRTSYNENFKS　(SEQ ID NO:23)

CDR-H3:GGLGPAWFAY　(SEQ ID NO:17)

CDR-L1:SAGSSVGSSYFY　(SEQ ID NO:24)

CDR-L2:GTSNLAS　(SEQ ID NO:25)

CDR-L3:HQWSSYPFT　(SEQ ID NO:20)

實施例2-設計人類化ACO-1並鑑認可能的回復-突變殘基

小鼠ACO-1 CDR的鑑認和定性

發現根據Kabat定義之ACO-1 CDR序列為如下。

CDR-H1:NYWMH　(SEQ ID NO:15)

CDR-H2:EINPSHGRTIYNENFKS　(SEQ ID NO:16)

CDR-H3:GGLGPAWFAY　(SEQ ID NO:17)

CDR-L1:SAGSSVDSSYLY　(SEQ ID NO:18)

CDR-L2:STSNLAS　(SEQ ID NO:19)

CDR-L3:HQWSSYPFT　(SEQ ID NO:20)

人類生殖種系的鑑認

使用MOE(藥物研發環境(Molecular Operating Environment)；可在www.chemcomp.com獲得)，利用得自蛋白質資料庫銀行(Protein Database Bank,PDB)的結構模板：1Z3G，建立3D蛋白質結構模型。在Berman等人(Nucl Acids Res 2000;28:235-242)中描述了PDB，並可在www.rcsb.org/pdb獲得。基於在PDB資料庫中之抗體-抗原複合物的分析，發現在抗原互補位中最有可能的殘基是ACO-1 VH的殘基23-35、49-58、93-102，和ACO-1 VL的24-34、49-56、89-97。使用MOE，鑑認出與抗原互補位交互作用(忌水性、氫鍵、電荷交互作用)的殘基，並以在圖1中出示，所謂的ACO-1遮罩，獲得混合的殘基組(抗原互補位+交互作用性殘基)。

以ACO-1 VH和ACO-1 VL搜尋生殖種系V資料庫，歸還下列可能的架構模板(在小括弧中提供E-值)：VH：VH1_46(3e-038)、VH1_f(6e-037)、VH1_02(6e-037)、VH1_03(1e-036)、VH1_24(2e-034)，VL：VKⅢ_L6(9e-035)、VKⅢ_A11(4e-034)、VKⅢ_A27(8e-034)、VKⅢ_L25(1e-033)、VKI_L8(1e-033)。

以遮罩搜尋生殖種系資料庫，歸還下列可能的架構模板(在小括弧中提供E-值)：VH：VH1_46(3e-011)、VH1_02(6e-011)、VH1_f(1e-010)、VH5_a(4e-010)、VH1_03(4e-010)，VL：VKⅢ_A11(5e-009)、VKⅢ_L6(7e-009)、VKⅢ_A27(9e-009)、VKⅢ_L25(3e-008)、VKI_L9(6e-008)。

在排比的手工檢查和命中之後，選出VH1_46和VKⅢ_L6作為人類鷹架。可選擇其他的模板，以改變或最適化(例如)人類化抗體的物-化特性。選出JH4和JK2作為生殖種系J-斷片(分別為SEQ ID NO:2和5)。

設計最適切的人類化ACO-1

利用以下的規則進行人類化：

-取得遮罩外側的殘基，當作人類的。

-取得遮罩內側和Kabat CDR內側的殘基，當作鼠類的。

-取得遮罩內側和具有小鼠/生殖種系一致之Kabat CDR外側的殘基，當作一致序列。

-取得遮罩內側和具有小鼠/生殖種系之Kabat CDR外側的殘基，當作生殖種系序列，但使鼠類差異接受可能的回復-突變。

所獲得之最適切hzACO-1抗體的CDR為(根據Kabat定義)：

CDR_H1:NYWMH　(SEQ ID NO:15)

CDR_H2:EINPSHGRTIYAQK FQG 　(SEQ ID NO:21)

CDR_H3:GGLGPAWFAY　(SEQ ID NO:17)

CDR_L1:SAGSSVDSSYLY　(SEQ ID NO:18)

CDR_L2:STSNLAS　(SEQ ID NO:19)

CDR_L3:HQWSSYPFT　(SEQ ID NO:20)

使用以上的人類化方法，設計基於hzACO-1和IFN-αA之3D模型，預測構成抗原互補位之殘基的遮罩，與單純的CDR移植相反，獲得具有較少鼠類殘基的hzACO-1抗體，因為包括經最適化hzACO-1 CDR H2序列之5C-端胺基酸的肽(在上文中以粗體強調)，與相對應之人類架構序列是相同的，同時在根據Kabat定義之ACO-1 CDR H2序列中的相對應肽是鼠類來源的。另外，在本分析中鑑認的人類化ACO-1抗體之CDR H1序列，比在WO2006/086586中描述的序列短。因此，經最適化的hzACO-1抗體，或包括至少一部分hzACO-1VH序列的抗體或抗原結合性片段，在人類患者中可能對於人類抗小鼠抗體(HAMA)-反應有降低的風險。此外，在重鏈之位置60-62中，序列AQK代替NEN的置換，有避免兩個天冬醯胺殘基的優點，其可能有脫醯胺的傾向。

鑑認可能的回復突變

在圖1中解釋了ACO-1VH和VL序列的分析。在圖1中，顯示所得之人類化ACO-1(hzACO-1)VH(SEQ ID NO:3)和VL(SEQ ID NO:6)序列，有像人類一樣可能的回復突變殘基，即沒有任何的回復突變。為了獲得一或多個經最適化hzACO-1抗體，鑑認出在架構區中下列的回復-突變變體，通常需要其等以便保留原始小鼠抗體的親和力：

-hzACO-1VH：野外型(即沒有回復-突變)、V5Q、M69L、R71V、T73K、S761、V78A，及其任何組合；

-hzACO-1VL：野外型、E1Q、L47W、I58V、F71Y，及其任何組合；

-以各種重-輕鏈組合。

實施例3-為了hzACO-1的親和力成熟，設計hzACO-1之基於ACO-2的變體

如同在圖2中所示，ACO-1和ACO-2VH和VL序列的胺基酸序列排比，顯示在個別輕和重鏈之間的高序列同一性。無意受理論限制，該抗體可能衍生自相同的前驅物細胞，因為其等具有相同的V-D-J重排，且與生殖種系序列比較，含有3個相同的突變。此外，該抗體在13個胺基酸殘基處有差異，可能歸因於後續的體細胞超突變。

在ACO-1和ACO-2 VH和VL功能部位之13個不相同的胺基酸殘基中，選擇9個殘基進行突變分析，以便改善人類化ACO-1抗體的親和力(圖3)。單獨加入ACO-2衍生之超突變，可能鑑認出有害和有利的胺基酸殘基，並藉著允許僅導入有利的胺基酸，而改善親和力超越原始的小鼠ACO-1和ACO-2抗體。基於其等在輕或重鏈CDR之一內的位置(根據Kabat定義)，或基於其等在基於抗原-抗體3D模型，描繪為可能的抗原-交互作用區之區域內的所在地，選出所靶定之殘基。

為了獲得一或多個經最適化hzACO-1抗體，鑑認下列的變體：

-hzACO-1 VH：野外型、T28S、N31S、I58S、S76N、T77I和A93V，以及至少兩個選自T28S、N31S、I58S、S76N、T77I和A93V之突變的任何組合；

-hzACO-1 VL：野外型、D29G、L33F、S50G，以及至少兩個選自D29G、L33F和S50G之突變的任何組合；

-以各種重-輕鏈組合。

分別使殘基從在hzACO-1輕和重鏈構築體內的ACO-1序列突變成ACO-2序列，以便評估每個殘基對抗原結合的個別貢獻。亦產生一連串的組合突變種。

實施例4-選殖ACO-1、ACO-2、hzACO-1和特定位突變

ACO-1、ACO-2和hzACO-1

將VH和VL序列轉移至基於CMV啟動基因的表現載體(pTT載體)，其適合在由Durocher等人(Nucleic Acids Res. 2002;30(2):E9)描述的HEK293-EBNA(HEK293-6E)表現系統中暫時表現。除了CMV-啟動基因之外，該載體含有pMB1起點、EBV起點和AmpR基因。將ACO-1和ACO-2的VH選殖到分別含有小鼠IgG2a和IgG2b之恆定區的基於CMV之載體內。關於ACO-1和ACO-2兩者，將全長LC轉移至空的基於CMV之載體。從Geneart,Regensburg,Germany訂購hzACO-1之可變區的DNA序列。將遞送hzACO-1 VH的序列轉移至含有人類IgG4之恆定區(S241P)(在鉸鏈區中含有S241P突變)的表現載體。將遞送hzACO-1 VL的序列轉移至含有人類κ輕鏈之恆定區的載體。

產製hzACO-1之回復-突變變體

將在實施例2中鑑認之10個可能的回復-突變，分別導入hzACO-1 HC和LC構築體，以便判斷每個殘基對抗原結合的個別貢獻。納入少數一樣好的組合。亦藉著特定位突變，產生帶有經延伸CDR H2的hzACO-1變體(hzACO-1-Kabat CDRH2)，該經延伸CDR H2相當於Kabat定義的鼠類CDR H2(SEQ ID NO:16)。

在hzACO-1 LC和HC表現載體上進行特定位突變。欲產生單一突變種，根據製造者協定，使用得自Stratagene的特定位突變套組(目錄#200518)。藉著對每個突變種定序質體DNA製劑(MWG Biotech,Matinsried,Germany)，證實想要突變的導入。

為了表現，將經突變之LC構築體與hzACO-1 HC混合，並為了抗體表現，將經突變之HC構築體與hzACO-1 LC混合。

帶有回復-突變的輕鏈變體：

hzACO-1-E1Q

hzACO-1-L47W

hzACO-1-I58V

hzACO-1-F71Y

hzACO-1-L47W、I58V

帶有回復-突變的重鏈變體：

hzACO-1-V5Q

hzACO-1-M69L

hzACO-1-R71V

hzACO-1-T73K

hzACO-1-S76I

hzACO-1-V78A

hzACO-1-R71V、T73K

hzACO-1-M69L、R71V、T73K、S76I、V78A

hzACO-1-Kabat CDRH2

產製hzACO-1之基於ACO-2的變體

為了改善親和力，按照在實施例3中的描述，對hzACO-1 LC和HC表現載體進行將ACO-2專一殘基導入hzACO-1抗體內的特定位突變。欲產製單一突變種，根據製造者協定，使用得自Stratagene的特定位突變套組(目錄#200518)。根據製造者協定，使用特定位突變和多重特定位突變套組(目錄#200513)兩者，產生組合突變種。

藉著對每個突變種定序質體DNA製劑(MWG Biotech,Matinsried,Germany)，證實想要突變的導入。

為了表現，將經突變之輕鏈構築體與hzACO-1重鏈混合，並為了抗體表現，將經突變之重鏈構築體與hzACO-1輕鏈構築體混合。

帶有ACO-2-衍生之突變的輕鏈變體：

hzACO-1-D29G

hzACO-1-L33F

hzACO-1-S50G

hzACO-1-D29G、L33F、S50G

帶有ACO-2-衍生之突變的重鏈變體：

hzACO-1-T28S

hzACO-1-N31S

hzACO-1-I58S

hzACO-1-S76N

hzACO-1-T77I

hzACO-1-A93V

hzACO-1-N31S、I58S

hzACO-1-T28S、N31S、I58S、A93V

hzACO-1-S76N、T77I

hzACO-1-T28S、N31S、I58S、S76N、T77I、A93V

hzACO-1-T28S、A93V

hzACO-1-N31S、A93V

hzACO-1-T28S、N31S、A93V

hzACO-1-T28S、N31S。

實施例5-重組ACO衍生之抗體的表現

依據一般的抗體表現協定，在經暫時轉染的HEK293細胞中表現ACO-1、ACO-2、hzACO-1和hzACO-1變體。以下描述適應懸浮之HEK293細胞的轉染協定。

細胞維持：使適應懸浮之HEK293細胞生長在補充有25微克/毫升選擇試劑(Invitrogen目錄#：10131-019)、0.1體積%普魯尼克F-68(Invitrogen目錄#：12347-019)表面活性劑和1體積%青黴素-鏈黴素(任意的)(Invitrogen目錄#：15140-122)的FreeStyle^TM 293表現培養基(Invitrogen目錄#：12338-026)中。在37℃、8%CO₂ 和125rpm下的恆溫震盪器中，以在0.2-2x10⁶ 個細胞/毫升之間的細胞密度，將細胞維持在錐形震盪燒瓶中。

DNA轉染：用於轉染之培養物的細胞密度是0.8-1.5 x10⁶ 個細胞/毫升。每毫升細胞培養物使用0.5微克輕鏈載體DNA+0.5微克重鏈載體DNA。以每微克經轉染DNA 1微升試劑的濃度，使用293fectin^TM (Invitrogen目錄#：12347-019)作為轉染試劑。以30倍體積之(Invitrogen目錄#：51985-034)稀釋293fectin^TM ，混合並留置於室溫下(23-25℃)持續5分鐘。以每微克總DNA 30微升Opti-稀釋DNA，混合並留置於室溫下(23-25℃)持續5分鐘。1:1混合DNA和轉染試劑稀釋物，並留置於室溫下(23-25℃)持續25分鐘。直接將DNA-293fectin^TM 混合物加至細胞培養物中。將轉染細胞培養物轉移至在37℃、8%CO₂ 和125rpm下的恆溫震盪器。在4-7天之後，藉著離心收穫細胞培養上清液，接著通過0.22微米PES濾紙(Corning目錄#：431098)過濾。以上清液分析抗體，或使用標準蛋白質A純化技術純化。

比較hzACO-1和hzACO-1-KabatCDRH2的表現水平

比較hzACO-1和hzACO-1-Kabat CDRH2在HEK293-6E細胞中的暫時表現水平，以測定末端CDR H2殘基是否對細胞表現兩種抗體變體任一者的能力有任何影響。

按照上述以hzACO-1輕鏈和hzACO-1或hzACO-1-Kabat CDRH2重鏈的基於pTT之表現載體轉染HEK293-6E細胞。以一式三份進行該轉染。對於每個抗體變體，使用DNA-293Fectin主要混合物轉染三個培養物(25毫升)，以便將來自吸移錯誤的影響減至最少。按照上述，在震盪恆溫箱中培養經轉染之培養物4天。在第4天，從培養物中萃取試樣，進行細胞存活力和細胞密度測量，並藉著離心收穫剩餘的細胞培養上清液。藉著Biolayer干涉術(Interferometry)，使用ForteBio Octet系統和蛋白質A生物感測器，直接對經澄清之細胞培養上清液進行抗體生產的定量分析。使用Cedex HiRes自動細胞培養分析儀，測量細胞培養物密度和存活力。在下文表4中出示結果。

在表4中的結果，意外地顯示與hzACO-1-Kabat CDRH2(使用傳統程序人類化的人類化IFN-α抗體，並因此有全長Kabat序列)相比較，hzACO-1(根據本發明之人類化IFN-α抗體)在暫時表現水平上有顯著差異。對於以兩種hzACO-1變體任一種轉染的細胞培養物，在細胞存活力或密度上都沒有觀察到任何差異。hzACO-1的表現水平比hzACO-1-Kabat CDRH2抗體變體的表現水平高大約2-倍。

藉著移植比Kabat定義之CDRH2短的CDR H2版本，意外地顯著增加了抗體的表現水平。

無意與理論結合，可假設在hzACO-1中人類生殖種系衍生之殘基，當與hzACO-1-Kabat CDRH2抗體變體相比較時，攜帶經延伸之CDR H2(SEQ ID NO:16)，影響了HC摺疊，可能還有LC-HC交互作用，結果改善了蛋白質穩定性並因此改善了表現產量。

在暫時表現水平中觀察到這類起因於改善蛋白質穩定性的經改善之蛋白質表現水平，會反映在穩定的基於CHO之生產細胞株中。因此，藉著移植短版本的CDRH2(SEQ ID NO:21)，有可能產生高-生產性的穩定生產細胞株。

比較hzACO-1之IgG4、1和2變體的表現水平

比較hzACO-1之前導IgG4(S241P)變體和hzACO-1(IgG1)和hzACO-1(IgG2)在HEK293-6E細胞中的暫時表現水平，測定重鏈亞類轉換是否對抗體表現水平有任何影響。

以類似上述表現測定之方式進行實驗，但有下列改變：以一式兩份在5毫升培養物中進行實驗。在37℃、8%CO₂ 和125rpm下的震盪恆溫箱中，在經濾紙加帽之50毫升離心管(falcon tube)中培養該培養物。

不可預測地，hzACO-1(IgG1)和hzACO-1(IgG2)的平均表現水平約為hzACO-1(IgG4)之表現水平的65%。基於在蛋白質表現上觀察到的降低(約35%)，吾人推論hzACO-1可變功能部位與IgG4恆定功能部位的組合優於與其他鏈亞類的組合，且該分子的發展大大地助長了高-生產性穩定生產細胞株的產製。

實施例6-在帶有hzACO-1-Fab之複合物中IFN-α8的結晶結構

測定在帶有hzACO-1之Fab片段的複合物中IFN-α8的結晶結構，並使用X射線結晶學精確化至3.3解析度(圖8)。

材料和方法

以IFN-α8稍微過量，將IFN-α8(SEQ ID NO:30的胺基酸1-166)與hzACO-1 Fab(帶有SEQ ID NO:32之輕鏈序列和SEQ ID NO:31之殘基1-221的重鏈序列)混合，並在凝膠-過濾管柱上純化該複合物。將蛋白質複合物hzACO-1-Fab/IFN-α8放在25mM HEPES緩衝溶液，pH7.5+25mM NaCl的緩衝溶液中，並濃縮至5毫克/毫升。使該複合物在沉澱溶液(100mM HEPES緩衝溶液，pH7.5、15%PEG 10,000和15%乙二醇)中形成結晶。在收集繞射數據之前，在液態N₂ 中急速冷凍該結晶。首先將結晶移至低溫溶液中，其為25體積%之99%甘油和75%沉澱溶液的混合物。在光束線BLI911-3、MAX-Lab,Lund,Sweden下收集繞射數據。將繞射數據編入索引中，並使用XDS套裝程式(Kabsch,J. Appl. Crystallogr. 1993;26:795-800)積分。

使用分子置換(Molecular Replacement,MR)法，使用CCP4套裝軟體(Baily,1994,Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 50,760-763)的PHASER程式(Read,2001,Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 57,1373-1382)測定三維結構。未經複合之hzACO-1 Fab的結晶結構為線性的，已經測定至1.50解析度(R-和R-自由分別為0.18和0.21)，數據未顯示。隨後將那些3D座標使用在hzACO-1/IFN-α8複合物的MR計算中。將搜尋模型分成三個部分：1)hzACO-1 Fab的可變功能部位，2)hzACO-1 Fab的恆定功能部位，和3)PDB存放之IFNtau模型，蛋白質數據銀行(Protein Data Bank)(Berman等人,2000,. Nucleic Acids Res. 28,235-242)登錄碼1B5L(RADHAKRISHNAN等人,1999,J. MOL. BIOL.第286冊，第151頁)，藉著COOT程式突變，以獲得IFN-α8的序列，SEQ ID NO:30。藉著PHASER程式進行最後的間隔基測定。間隔基P4₁ 得到最高的分數，其具有分別為10.7、4.4和2.6σ之旋轉函數峰值RZ’s，分別為24.1、26.4和8.0σ之平移峰值TZ’s，分別為383、918和1134之對數概度(log-likelihood)增益LLG’s，且沒有與有對稱關係的分子部分重疊。

在對COOT分子圖學程式中的模型進行一些調整之後進行分子置換，隨後施加兩次高達2000K的扭轉模擬控溫，但沒有個別溫度因子的精確化。原始的R-和R-自由值分別為0.416和0.439，而在模擬控溫之後的最終值分別為0.314和0.427。然後使該模型接受在COOT程式中的手工介入，接著是使用REFMAC5程式(Murshudov等人,1997,Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 53,240-255)的精確化，結果分別產生0.216和0.348之R-和R-自由值。該模型包括殘基1-21，同時將殘基22-23精確化為Ala殘基，IFN-α8的28-101和114-164、hZACO-1輕鏈的1-215和hZACO-1重鏈的1-219。

在精確化中看到在R-和R-自由之間有相對較大的差異，係歸因於受限的數據解析度，3.3，並有IFN-α8 X射線模型的實際拉伸，這在電子密度圖的解釋中完全找不到。電子密度圖清楚定義了在IFN-α8對hZACO-1-Fab之經穩定化介面中的殘基，同時仍未完全定義遠離抗體位置之IFN-α8 X射線結構模型的細節，並因此較不能精確測定。

結果

藉著CCP4套件的CONTACT電腦程式，使用在Fab和IFN-α8分子之間4.0的截止距離，鑑認接觸。發現所得的人類hzACO-1之抗原決定基包括IFN-α8的下列殘基(SEQ ID NO:30)：Ser 55、His 58、Glu 59、Gln 62、Gln 63、Asn 66、Glu 97、Leu 118、Arg 121、Lys 122、Phe 124、Gln 125、Arg 126、Thr 128、Leu 129、Thr 132。涉及與IFN-α8交互作用之HzACO-1的殘基，抗原互補位，包括hzACO-1輕(L)鏈的Ser 32、Tyr 33、Tyr 35、Tyr 50、Ser 51、Trp 92、Ser 93、Tyr 95和Phe 97(根據SEQ ID NO:32編號，而非Kabat)，以及重(H)鏈的Thr 30、Asn 31、Tyr 32、Trp 33、His 35、Glu 50、Asn 52、Ser 54、His 55、Arg 57、Leu 101、Gly 102、Trp 105，表9(根據SEQ ID NO:31編號，而非Kabat)。

如同在圖9中所見，在IFN-α8上的hzACO-1交互作用抗原決定基，與IFNAR1結合性抗原決定基部分重疊，而IFNAR2結合性抗原決定基則遠離hzACO-1結合性抗原決定基。這暗示IFN-α被hzACO-1中和，是經由IFN-α與IFNAR1，不是與IFNAR2結合的中和作用而發生。因此，可想像hzACO-1與IFN-α/IFNAR2複合物結合，但抑制為細胞內發送信號之原因的三元受體複合物IFN-α/IFNAR1/IFNAR2的形成。

表9. IFN-α8-hzACO-1 Fab H鏈交互作用

使用4.0之截止值。藉著CCP4套件的CONTACT電腦程式鑑認接觸。在最後一欄中「***」代表藉著CONTACT計算，在該接觸點有氫鍵的強可能性(距離<3.3)，「*」代表弱可能性(距離>3.3)。空白代表程式認為這裡不可能有氫鍵。

實施例7：基於hzACO-1之親和力成熟的突變來設計結構

若不知道抗體/抗原複合物的抗原決定基和抗原互補位，許多可能的胺基酸殘基可能有突變的傾向，以便改善抗體的親和力，況且可能使其等轉變為20個剩餘胺基酸殘基中的任一個，以鑑認在特殊位置的最佳殘基。CDR區容納大約54個殘基，可用以進行突變。因此，為了改善交互作用的親和力，可僅在CDR內產生54x20=1080個類似物。此外，亦可進行CDR外側的突變，以便改善親和力。

然而，在已知抗體/抗原的結構時，可基於結構預測，預測並分析較有限數目的改善親和力之合格突變。因此，基於在帶有hzACO-1之Fab片段的複合物中IFN-α8的結晶結構，如同在實施例6中描述的，鑑認出三個突變種，其改善了對所有IFN-α亞型的hzACO-1結合。這三個突變種為hzCAO-1 HC T30R、hzACO-1 LC Y32E和混合的hzACO-1 Y32E、T30R(根據Kabat的殘基編號)。在下文中描述突變種的身分。

LC Y32E：可看到IFN-α8之殘基Lys 122的電子密度，其為與hzACO-1結合之抗原決定基的一部分，代表稍微高的移動性。此外，hzACO-1輕鏈之殘基Tyr 32(Kabat標記)的原子Oη指向Lys 122側鏈的Cβ和Cγ原子。該交互作用不是任何最佳的殘基-殘基交互作用。使輕鏈Tyr 32突變成帶負電的殘基，像Glu或Asp，便有可能在抗體輕鏈Tyr 32殘基與IFN-α8之帶正電Lys 122殘基之間形成強離子鍵。由於這個緣故，將Y換成E，以便改善hzACO-1抗體的親和力。

HC T30R：對於在X射線結構中每個接近IFN-α8的hzACO-1殘基，計算下列的特性：核心側鏈原子的數目(核心)、周圍側鏈原子的數目(周圍)、帶電交互作用的數目(電荷)、氫鍵的數目(氫鍵)和忌水性交互作用的數目(忌水)，並在下文表10中提供。

藉著將X射線結構覆蓋在101x101x101節點網格上，並對每個網格點計算離節點<2.5之原子(N_外 )和<3.5之原子(N_內 )的數目，計算核心和周圍原子的數目。具有N_外 >0之核心節點涵蓋得自hzACO-1和IFN-8兩者的原子。具有N_外 =0且N_內 >0之周圍節點涵蓋得自hzACO-1和IFN-α8兩者的原子。核心側鏈原子現在是離任何節點<2.5的原子。周圍側鏈原子現在是離任何節點≧2.5＆<3.5的原子。

最後將周圍殘基定義為僅有周圍原子且沒有交互作用的殘基，故可修改其等以創造結合。已經鑑認出LC S92、HC T28、HC T30、HC P52、HC Q64和HC P99。集中在重鏈非脯胺酸上，藉著目視檢查看到突變HC T28R會有可能與D90產生交互作用，HC T30R會有可能與D90和E97兩者產生交互作用，且Q64R會有可能與E114產生交互作用，但亦可應用於其他類似的突變。因為跨越所有干擾素α僅有E97受到保留，故預期HC T30R以類似hcACO-1之輪廓提供最佳的結合。

設計專一突變HC T30R，以建立在結合位置周圍的電荷-電荷交互作用，改善hzACO-1的親和力。

此外，亦產製並分析含有LC Y32E和HC T30R突變兩者的雙突變種(稱為hzACO-1 Y32E、T30R)，以測定兩個突變是否會有加成影響。

實施例8-測定在hzACO-1、hzACO-1變體和重組人類IFN-α亞型之間交互作用的動力學參數

可使用表面電漿子共振(surface plasmon resonance,SPR)分析，即時監視蛋白質交互作用。在本研究中，在Biacore 3000和Biacore T100儀器上進行SRP分析，以便就其等對重組人類干擾素α(1FN-α)之各種亞型的親和力，定性抗IFN-α單株抗體hzACO-1及其變體。

使用直接結合程序進行親和力研究，利用各自的單株抗體，其經由自由胺基團與在感測器晶片表面上的經羧甲基化之葡聚醣膜(CM5)共價偶聯。以各種濃度注射重組的IFN-α亞型(PBL Biomedical Laboratories,NJ,USA)，接著是解離期，使恆定緩衝溶液流到感測器晶片表面上。使用該實驗設計，可將IFN-α對經固定之單株抗體的結合視為1:1結合，即一個IFN-α分子與一個抗體結合位置結合。可使用1:1交互作用朗繆(langmuir)擬合模型，計算該交互作用的動力學參數。

將經純化之單株抗體固定在在CM5型感測器晶片上的個別流動格子中。使用標準胺偶聯程序進行固定，目標是1000共振單位(Resonance Units,RU)的固定水平。

使用HBS-EP pH7.4(10mM HEPES,150mM NaCl,3mM EDTA和0.005%聚山梨醇P20)作為執行緩衝溶液，以及重組IFN-α’s的稀釋劑。締合(注射)為4分鐘，接著是12至30分鐘的解離期。流速為50微升/分鐘。在25℃下進行實驗。在所有流動格子中同時偵測。流動格子#1不含經固定之抗體，並用來扣除背景和散積。

藉著數據對特定抗體-抗原組合的全面擬合，使用1:1朗繆結合模型，計算動力學參數。在計算動力學參數之前，先檢查數據的質量-運載限制。

在Biacore 3000和T100儀器上進行實驗。使用Biaeval 4.1和Biacore T100評估軟體評估數據。

所得之動力學參數僅在使用緩衝溶液，和利用重組形式之抗原時是有效的。

結果

為了產製具有經保留親和力的人類化ACO-1抗體，按照在實施例2、3和7中的描述，使用不同策略產製一些人類化變體。藉著SPR分析獲得在重組人類IFN-α亞型與hzACO-1變體之間交互作用的動力學參數。如同在表11中所見，即使是根據實施例2產生的hzACO-1(其含有經截短之CDR H2且沒有回復突變)，當與鼠類ACO-1比較時，已經保留了hzACO-1的親和力，如同藉著hzACO-1之KD是在小鼠抗體兩倍的範圍內所示。因此，沒有更多在架構區中從人類到鼠類ACO-1的回復突變需要進行人類化，如同在實施例2中鑑認和描述的。此外，已經保留hzACO-1抗體的IFN-α亞型輪廓，如同在表2中所示。

表11.重組IFN-αA與ACO-1和hzACO-1變體之交互作用的動力學參數

KD為平衡解離常數，ka為締合率常數，且kd為解離率常數。

在表12中列舉，與藉著傳統CDR移植產生，並因此含有較大之鼠類CDR H2的人類化ACO-1分子(稱為hzACO-1-kabat CDRH2)相比較，hzACO-1與重組人類IFN-αA之交互作用的動力學參數。如同所示，hzACO-1分子(根據在實施例2中之描述人類化，並含有比hzACO-1-kabat CDRH2分子短的CDR H2)之親和力是相等的，顯示在實施例2中描述之人類化製程所產製的人類化變體像藉著簡單CDR移植所產生的一樣好，同時具有較多的人類序列。

表12.重組IFN-aA與hzACO-1和hzACO-1-kabat CDRH2之交互作用的動力學參數。

KD為平衡解離常數，ka為締合率常數，且kd為解離率常數。

而且，為了調查hzACO-1和hzACO-1-kzbat CDRH2是否對於與人類IFN-α之各種亞型結合，具有可相比擬的動力學參數，對所選擇之人類IFN-α亞型進行解離比較實驗(表13)。這顯示與hzACO-1-kabat CDRH2對所有受試亞型相比較，hzACO-1的親和力似乎受到保留，不管其具有較短的小鼠CDR H2序列。

為了嘗試改善hzACO-1的親和力超過小鼠ACO-1抗體的，測量在IFN-αA和不同hzACO-1變體(含有基於ACO-2序列之突變)之間參數的動力學(表11)。為了使在進行不同實驗時獲得的參數發生關連，將每個個別抗體之KD值對在相同實驗中hzACO-1的值標準化，並在欄位「KD mAb對KD hzACO-1」中出示個別mAb之KD值對在相同實驗中hzACO-1之KD值的關係。

親和力測定進一步證實所有ACO2衍生之hzACO-1抗體變體(除了hzACO-1-I58S)的KD值均在較低的nM範圍內。在KD值中的最少改變主要與在KD中的差異有關。在hzACO-1中導入單一胺基酸取代N31S、A93V或T28S及其組合，稍微增加了親和力，至類似的ACO-1的水平。hzACO-1-I58S突變對KD值有深遠的負面影響，證實該特定胺基酸對於hzACO-1/IFN-αA複合物之穩定性的重要。

基於hzACO-1 Fab/IFN-α8結晶結構，將一些胺基酸取代導入hzACO-1中，以便更進一步增加親和力(參見實施例7)。在這些之中，兩個單一取代-輕鏈的Y32E和重鏈的T30R，對親和力有顯著正面的影響(表14)，分別增加了對IFN-αA的親和力大約2和6倍。顯然，藉著混合兩種突變，觀察到含有Y32E和T30R的hzACO-1構築體對IFN-αA之親和力增加了大約10倍(表15)。

在表16中的動力學數據說明了基於合理之設計方法產製的hzACO-1 Y32E、T30R構築體，已經保留其IFN-α亞型輪廓，因為它不與IFN-α1結合，但與其餘受試的亞型結合。為了確認由Y32E、T30R突變引起之對動力學參數的影響，反映在與人類IFN-α之各種亞型的結合上，對所選擇之人類IFN-α亞型進行解離比較實驗(表16)。雖然所提出之雙突變種hzACO-1構築體的突變是基於IFN-α8的結構，但對於所有受試之人類IFN-α亞型觀察到不可預測經改良的解離率，在6-64倍之間變化。

實施例9-在CPE-測定中分析hzACO-1構築體

本實施例顯示hzACO-1能夠抑制所有受試之IFN-α亞型的保護效果，除了IFN-α1和IFN-αD的那些，其等不受hzACO-1影響。

材料和方法

基於EMC病毒對A549細胞的溶解影響，使用該抗IFN-α中和測定。所有的IFN-α亞型均可抑制EMC病毒在A549細胞中複製，結果導致細胞存活，其可利用細胞DNA染色來測量。可藉著減少細胞的DNA染色(相當於增加細胞溶解)，測量抗IFN-α抗體對不同IFN-α亞型的中和效果。

在具有96孔的培養盤(Nunc,目錄第167008號)上進行測定，其中每孔含有200微升之終體積。所有IFN-α製劑均得自PBL Biomedical Laboratories,NJ,USA。

以各50微升之體積，在每孔中加入4種溶液(IFN-α、hzACO-1、細胞和病毒)。所有溶液均在帶有10%FCS的F12Kaighn’s培養基(Gibco,目錄第21127號)中製備。每個IFN-α亞型的比濃度(在下文表17中列舉)均衍生自先前的研究。基於獲自使用例如鼠類抗體ACO-1.5.2和ACO-2.2的現存數據，選擇在本測定中使用的抗體濃度。

在37℃，5%CO₂ 下，將每個IFN-α亞型與hzACO-1預先培養2小時。按照在下文表17中所示，稀釋抗干擾素抗體。在抗體與IFN-α的預先培養之後，加入50微升細胞-溶液(300000個細胞/毫升)，以獲得15000個細胞/孔。在37℃，5%CO₂ 下培養4.5小時之後，以10^3.5 TCID₅₀ 之濃度加入50微升EMC病毒，接著在37℃，5%CO₂ 下培養48小時。

隨後小心地移出上清液，並加入50微升結晶紫溶液(0.5%結晶紫，25%甲醇)。在室溫下培養15分鐘之後，以水沖洗各孔並脫水隔夜。

然後在經脫水的培養盤中加入200微升/孔的純甲醇15分鐘，以便從細胞中萃取結晶紫。在萃取之後，將100微升上清液小心地移至新的96-孔培養盤(Nunc,目錄第256510號)中，並在各孔中加入100微升Milli-Q水。然後在590奈米下在ELISA判讀器中測量該盤。

在分析之前，對甲醇和培養盤背景校正從ELISA判讀器取回的未加工數據。

結果和討論

在本研究中，對所有培養盤使用六個不同的對照組(細胞、細胞+抗體、細胞+IFN-α、細胞+抗體+IFN-α、細胞+病毒和細胞+IFN-α+病毒)，以確保在本測定中觀察到的細胞病變效應不是由於抗體及/或IFN-α之胞毒性引起，也不是因為細胞對病毒缺少任何IFN-α-保護所引起的細胞病變效應。在本測定中沒有觀察到任何顯著的胞毒影響，且在對照組中沒有任何干擾素的水平有細胞病變效應的徵兆。

如同在圖4中所示，該CPE-測定顯示幾乎所有干擾素亞型的保護效果均會受到hzACO-1抑制。然而，IFN-αD和IFN-α1的保護效果卻不受hzACO-1抑制，即使在50000毫微克/毫升的抗體濃度下。因此，在hzACO-1構築體中保留了小鼠ACO-1的專一性。

實施例10-在報告子基因(RG)生物測定中分析ACO-衍生之抗體

利用基於蟲螢光素酶之報告子基因測定，評估hzACO-1抗體變體中和重組IFN-α亞型之生物活性的能力。

材料

杜貝可氏經過修改的鷹式培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)「完全的」：DMEM包含酚紅+10%FCS+2mML-穀胺醯胺+青黴素+鏈黴素+2-me.，Nunc 96-孔光學底培養盤，黑色組織培養處理，含有1mM Ca²⁺ 和1mM Mg²⁺ 的PBS，Steady-Glo蟲螢光素酶測定系統(Promega)。

藉著以IFN-可誘導之構築體(其帶有駕馭蟲螢光素酶報告子基因之Mx啟動基因)穩定轉染A549細胞株(CLL-185，ATCC)，衍生93D7細胞株。Mx啟動基因由含有鼠類MxA啟動基因之1.6kb BamHI片段和刪除pSP64-Mxp(PstI-PvuII)-rβglo的IFN反應元件(Lleonart等人(1990)Biotechnology 8:1263-1267)構成。

在圖5中列舉所使用之IFN-α亞型(均得自PBL Biomedical Laboratories,NJ,USA)。

方法

以一式四孔在不透明Nunc 96-孔光學底培養盤中進行RG測定。對每個測定，納入陽性對照組IFNα，以及含有未-經刺激細胞和在缺乏IFNα刺激下以抗體處理之細胞的陰性對照組孔。

明確地說，藉著移除培養基，以PBS沖洗一次，並以胰蛋白酶消化，從燒瓶中收穫附著的93D7細胞。使用DMEM完全的，停止胰蛋白酶消化。計算細胞數目，並以完全的DMEM調整成600,000個/毫升。

在37℃+5%CO₂ 下，在總體積100微升DMEM完全的中，將經純化之抗IFN-α mAbs與重組IFN亞型預先培養1小時。在抗體-IFN培養之後，加入50微升93D7細胞，並在37℃+5%CO₂ 下培養5小時。

欲測定由重組IFN亞物種誘導之MxA-駕馭的蟲螢光素酶，調整IFN之濃度，以便使放在每孔中所含的量為100微升。以一式四孔放置100微升IFN，在37℃+5%CO₂ 下培養1小時。隨後加入50微升細胞，並繼續培養另外5小時。

欲測定使用經純化之mAbs，抑制由重組IFN亞物種誘導之MxA-駕馭的蟲螢光素酶，每孔中加入50微升想要稀釋度的重組IFN。然後在各孔中加入以DMEM完全的稀釋之50微升抗體，並在37℃+5%CO₂ 下培養1小時。在該培養之後，加入細胞，並繼續培養另外5小時。

在5小時的培養之後，使用多通道吸移管，從細胞中小心地移除培養基。接下來，將有黏性黑色阻斷劑固定在96孔培養盤的底部。在各孔中加入帶有Ca²⁺ 和Mg²⁺ 離子之100微升PBS。在各孔中加入100微升經重建的Steady-Glo試劑，確定徹底混合在每孔中的內容物。以明淨的有黏性長條密封該培養盤。在室溫下在暗處培養5分鐘之後，在Topcount發光計數器(Perkun Elmer)中讀取發光。

為了計算由抗體對IFN誘導(MxA駕馭之)蟲螢光素酶活性施加的抑制程度，在比較計數時，使各種IFN-α亞型的Ab抑制對在缺少抗體下之活性水平(並將該值設定為100%)標準化。為了比較抗體之變體形式，以未加工之蟲螢光素酶計數，來表示單一IFN-αs數據的抑制。一開始在缺少抗體下滴定IFNs，以測定EC50，以及在本測定中達到高原時的IFN濃度。在測試抗體抑制時，通常以最大刺激水平的80%使用IFN，以確保蟲螢光素酶的可靠誘導，且在本測定中在低於飽和的水平下操作。使用Prism(GraphPad Software,Inc.,San Diego)軟體進行計算和數據展示。

結果和討論

針對其等在報告子基因測定中，抑制各種人類IFN-α亞型的能力，評估人類化ACO-1構築體。圖5顯示藉著hzACO-1抗體抑制12種IFN-α亞型的標準化數據。將在缺少抗體下之IFN-α刺激設定為100%，同時將經模仿處理之細胞(僅接受培養基)設定為0%。顯示帶有標準誤差的數據點。根據最佳配適S形反應曲線，使用Prism軟體計算曲線。hzACO-1能夠抑制IFN-αs所有受試的亞物種，除了IFN-αD，並因此在hzACO-1抗體的人類化期間，保留了親本小鼠ACO-1抗體的專一性。在高抗體濃度下，抑制也是完全的，使IFN-α活性降低至背景水平。在本研究中，各種IFN-α亞型之抑制的IC50，範圍是從28毫微克/毫升到314毫微克/毫升。即使在較高的hzACO-1濃度下，也不能抑制IFN-αD。

圖10顯示在RG測定中，小鼠ACO-1 Ab與人類化ACO-1(hzACO-1)及其兩個變體的比較。一個變體為帶有完整CDRH2的人類化ACO-1(稱為hzACO-1-kabat CDRH2)，但另一個則按照在實施例2中之描述，以較短CDRH2建構的hzACO-1。此外，該圖顯示另一個經突變的hzACO-1，其已經經由合理的設計，對與IFN-αs之交互作用最適化(稱為hzACO-1 Y32E、T30R)，如同在實施例7中的描述。在RG測定中，針對五個不同的代表性IFN-α亞型之抑制，比較這四個重組的mAb變體。

hzACO-1對所有五個IFN亞型均展現出幾乎可與小鼠ACO-1相比擬的IC50值，根據在實施例8中報告所觀察到的KDs，在定量上IC50s小於兩倍(關於相對IC50值，參見表18)。因此，以低於親本ACO-1抗體對功能抑制之兩倍的親和力，完成人類化。總之，ACO-1的mAb人類化已經產生了保留IFN-αs之親和力的抗體。因此，均認為與原始的小鼠ACO-1相比較，在hzACO-1抗體中保留了親和力和效力兩者，且不需要更多的回復突變。

如同在實施例2中所述，ACO-1的人類化方法，與藉著簡單CDR移植的普通人類化相比較，結果產生了在CDR H2中具有相對上較多人類胺基酸的抗體。然而，這可預期在人類化ACO-1中導致降低了中和IFN-α亞型的效力，如同在圖10和表18中所示，驚訝地是事情的真相並非如此，因為hzACO-1和hzACO-1-kabat CDRH2對所有受試的IFN-α亞型都是同樣有效的。這與對兩個ACO-1變體報告的親和力一致，如同在實施例8中描述的。

為測定ACO-2衍生之hzACO-1變體的效力，如同在實施例3中描述的，使用RG測定比較這些與hzACO-1。使用兩個IFN-α亞物種(IFN-αF和IFN-αA)進行比較。測試四個不同的單一胺基酸取代：T28S(即在位置28處(根據Kabat)，以絲胺酸取代蘇胺酸)、I58S、N31S和A93V。

然而，I58S變體以降低之效力，並可能亦以降低之效率(IFN-αA)抑制IFN-作用，T28S和N31S變體兩者皆展現出類似hzACO-1的效力。然而，A93V經取代變體在RG測定中測量到對IFN-影響之抑制顯示出增加的效力(圖6)。雖然可在不同的IFN-α亞型之間偵測到在取代影響上的差異，但在所有四種情況下對兩種形式都有相同的傾向。

經由合理的設計，使用在實施例6中的結晶結構，建構具有兩個胺基酸改變，hzACO-1之HC T30R、LC Y32E的突變種(稱為ACO-1 Y32E、T30R)，如同在實施例7中描述的，以改良對IFN-α的結合。即使該突變是基於IFN-α8之結構，如同從圖10(A-E)中所見，該突變種意外地增加了抑制所有受試之IFN-αs的效力。而且，表18顯示效力的增加視特定的亞型而定，其為16倍的等級，且最高到50倍的效力改良。

當然可使用在實施例6中獲自結晶結構的抗原決定基資訊，來設計對該抗原決定基具有經改良之結合親和力的其他抗體變體。當然根據本發明的這類人類化抗體變體，亦包含在本發明之範圍內。

實施例11-人類化ACO-衍生之抗體的蛋白質定性

本實施例係關於hzACO-1和不同變體的熱穩定性

材料

抗體

以人類IgG1、IgG2和IgG4同型物表現的hzACO-1

hzACO-1-T28S

hzACO-1-N31S

hzACO-1-A93V

hzACO-1-T28S-N31S

下列的是在研究中所使用之緩衝溶液(100mM)及其等pH值的列表：檸檬酸/檸檬酸鈉，pH3.0、3.5；醋酸鈉，pH4.0、4.5和5.0；組胺酸，pH6.0、6.5；咪唑，pH7.0；甘胺酸-甘胺酸pH8.0、9.0、10.0。

下列的是在研究中所使用之添加物及其等濃度的列表：NaCl,100mM；蔗糖0.25M、0.50M；酚，0.5%；吐溫80，0.01%；甘油10%。

熱螢光穩定性測量

將10微升在DMSO中之400X SYPRO橘色蛋白質凝膠染色5000X濃縮物的溶液(Invitrogen Molecular Probes)、25微升緩衝溶液和10微升蛋白質(10uM)，加至96-孔PCR培養盤(Biorad)的孔中。以Microseal B有黏性之密封材料MSB-1001(Biorad)密封該盤，並在MyiQ單-色即時PCR偵測系統(Biorad)中，以0.5℃之增量，從25℃加熱至95℃。同時以電荷耦合元件(charge-coupled device,CCD)攝影機，監視在培養盤孔中的螢光改變。激發和發射波長分別為490和575奈米。測定蛋白質無折疊轉變的中點溫度，是螢光強度的第一個微分最大值，為溫度之函數。

hzACO-1和變體的熱螢光圖，顯示對IgG蛋白質的兩個預期溫度轉變，反映兩個主要的功能部位，Fc和Fab。蛋白質在較低pH下顯示出較低的Tm。在pH5.5以上轉變中點反而是恆定的。

添加物對不同抗體的影響是相同的。通常，0.5M的蔗糖有最大穩定化的影響，而NaCl、酚和吐溫80的添加，似乎有去穩定化的影響。

在較低的pH值(pH3.5)下，在hzACO-1與不同變體之間觀察到穩定性的差異(圖7A)。在此pH值下，雙突變種hzACO-1-T28S-N31S和單一突變種hzACO-1-A93V顯示出最高的穩定性。這在治療性抗體產物的純化製程中可能是很重要的，因為經常在pH3.5-4.0下進行病毒失活步驟。在較高的pH值下(pH4.5、5.5；分別為圖7B和7C)，減少了在穩定性上的此項差異。

溶液穩定性研究

在40℃下培養在15mM組胺酸pH6.5、蔗糖20毫克/毫升和吐溫80 0.01%中之hzACO-1-IgG4、hzACO-1-IgG1和hzACO-1-IgG2的溶液，並在一開始和5週之後，取回試樣進行分析。使用尺寸排阻層析法(size exclusion chromatography,SEC-HPLC)測定完整蛋白質、可溶性聚集體及/或hzACO-1之片段的分布。使用高效率液體層析(HPLC)系統1100型或1200型的液體層析系統(Agilent Technologies,Palo Alto,CA)，利用BIOSEP SEC 3000(Phenomenex)管柱，以0.8毫升/分鐘之流速，使用pH7.2之磷酸緩衝生理鹽水(PBS)作為移動相。藉著監視在215奈米處的OD值，偵測蛋白質。計算在總蛋白質區中每個高峰的百分比。

在圖11中出示形成hzACO-1-同型物之高分子量形式的量，並清楚顯示IgG4構築體在培養期間顯示沒有任何聚集體形成，而IgG1和IgG2同型物兩者則形成高分子量變體。

此外，hzACO-1-IgG1變體在培養後顯示出低分子量片段。該片段的量為1.3%。

因此，從穩定性的觀點來看，hzACO-1 IgG4是比相對應之IgG2和IgG1抗體更具吸引力的治療性分子。

實施例12-ADCC分析

如同在實施例6中描述的，ACO-1 mAb及其人類化版本可藉著抑制IFN-α與第I型干擾素α受體次單元1(IFNAR1)結合，來阻斷IFN-α的活性。因此，人類化治療性ACO-1 mAb可與細胞表面結合，做出由抗體、IFN-α和IFNAR2構成的複合物。這提高了ACO-1誘導抗體依賴性細胞之胞毒性(ADCC)的風險。

為了這個目的，進行ADCC實驗，以評估hzACO-1抗體在IFN-α2A存在下以IgG4亞型表現的能力。

材料和方法

使用Raji細胞(人類B細胞株(ATCC#CCL-86))作為目標細胞。將Raji細胞培養在補充有10%胎牛血清、10mM HEPES、1mM丙酮酸鈉、1mM穀胺醯胺、2.5克/公升葡萄糖和1%青黴素/鏈黴素的RPMI1640中。本測定使用經高度純化的干擾素-α2A。在使用之前，在報告子基因測定中測試蛋白質的生物活性。使用美羅(Nomeco A/S,Denmark)作為ADCC的陽性對照組，此時使用Raji細胞，其為表現B細胞表面抗原CD-20的B細胞株。

收穫目標細胞，並以血球計計數。將1.5x10⁶ 個細胞移至15毫升試管中並離心之。完全移除上清液，並將細胞小球每10⁶ 個細胞再懸浮於100微居里⁵¹ Cr(鉻-51)中(根據蛻變表調整體積)。在37℃下與IFN-α培養1小時的期間內，每15分鐘放流至小瓶。隨後以培養基(RPMI1640，10%FCS)沖洗細胞兩次，並再懸浮於2毫升測定培養基中。以50微升之體積，將5000個經⁵¹ Cr標示之細胞平舖在96孔培養盤(平底)中。以一式三份分析所有的試樣，在沒有效應物細胞的孔中測定最大-和最小釋放。最大釋放：5000個目標細胞/孔+1%曲拉通X-100。最小釋放：5000個目標細胞/孔。使用標準技術，藉著Ficoll密度離心，從’膚色血球層(buffy coat)’中純化效應物細胞。在各孔中加入按數目分級之新近分離的人類PBMC。使用以下的效應物對目標(E:T)細胞比例：10、20、40和80。在所有的實驗中，以10微克/毫升(66nM)之飽和濃度測試hzACO-1。以0.5、2.5、5和10nM測試IFN-α2A。終測定體積為200微升。在37℃下培養4小時之後，將30微升上清液移至LumaPlate^TM ，並讓它風乾隔夜。在TopCount NXT(PerkinElmer,USA)中測定放射性。將數據登入程式中，並計算一式三份的每分鐘平均計數和相對應之標準偏差。

結果

如同在圖12中所見，對於在有或無IFN-α之下，以IgG4表現的hzACO-1分子沒有觀察到任何超過背景(細胞或細胞與IFN-α)的ADCC。相反的，用來作為陽性對照組的美羅華，在不同比例的效應物和目標細胞比例(E:T)下，誘導細胞溶解。

實施例13-補體結合ELISA測定

如同在實施例6中的描述，ACO-1 mAb及其人類化版本可藉著抑制IFN-α與第I型干擾素α受體次單元1(IFNAR1)的結合，來阻斷IFN-α的活性。因此，人類化治療性ACO-1 mAb可與細胞表面結合，做出由抗體、IFN-α和IFNAR2構成的複合物。這提高了活化補體系統並誘導補體依賴性胞毒性(CDC)的風險。

本補體結合研究的目的是測試當以人類IgG4同型物表現hzACO-1，與在hIFN-α上相對應之抗原決定基結合並形成複合物時，是否活化典型的補體路徑。這可藉著使用測量抗體對C4之結合的ELISA來完成。C4的結合表示改變了Cls並業已開始補體級聯。一旦C4已經結合，便會轉而活化來自血漿的其他補體組份，其結合並以酵素方式切開級聯的下一個組份。

材料和方法

使用經鏈黴菌抗生物素蛋白-塗佈的微量滴定盤(236001，NUNC)作為ELISA盤。使用經生物素基化之hIFN-α2A作為抗原來源，並以100微升/孔0.25微克/毫升以沖洗緩衝溶液(10mM Na3PO4+145mM NaCl+0.05%吐溫20)稀釋之蛋白質塗佈該盤。顯示該hIFN-α濃度為在ELISA中最佳的塗佈濃度。在室溫下培養該盤60分鐘，並溫和地搖動，然後以沖洗緩衝溶液沖洗五次，將最後一次沖洗的緩衝溶液留在盤中30分鐘，以阻斷在盤中可能的殘餘結合位置。拋棄盤中的緩衝溶液，並以1微克/毫升在盤中加入100微升以沖洗緩衝溶液稀釋的hzACO-1 mAb。在室溫下培養該盤60分鐘，並溫和地搖動。以沖洗緩衝溶液沖洗該盤五次。藉著hzACO-1 IgG4 mAb的交聯，使用多株抗IgG4 pAb作為陽性對照組。以沖洗緩衝溶液稀釋抗IgG4 pAb mAb，並以從32微克/毫升到32毫微克/毫升的連續稀釋，以100微升/孔加至該盤。使用兩種不同純化的抗IgG4 pAb，一個經親和力純化的抗體和一個經蛋白質A純化的抗體。在室溫下培養該盤60分鐘，並溫和地搖動。以沖洗緩衝溶液沖洗該盤五次。以100微升/孔加入以血漿緩衝溶液(PBS帶有0.3mM Ca²⁺ 、1mM Mg²⁺ )稀釋1:200的人類血漿。在37℃下培養該盤60分鐘，並溫和地搖動。沖洗該盤五次，並以100微升/孔，在該盤中加入以沖洗緩衝溶液分別稀釋1:2000之小鼠抗人類C4(HYB162-02+HYB162-04，SSI)。在室溫下培養該盤60分鐘，並溫和地搖動。以沖洗緩衝溶液沖洗該盤五次，然後加入100微升/孔，以沖洗緩衝溶液稀釋1:1000的HRP兔子抗小鼠IgG(DAKO P0260)。沖洗該盤五次，並在所有的孔中加入100微升TMB受質。在培養大約6分鐘之後，在所有的孔中加入100微升4M H3PO4，以中止酵素反應。藉著Victor培養盤判讀器(Wallac)，以分光光度法測量顏色。

結果

藉著ELISA，使用以IFN-α塗佈之培養盤，針對其與補體組份結合的能力，測試以人類IgG4同型物表現的hZACO-1。藉著偵測與C4(其為在典型補體級聯中的組份之一)的結合而使其可見。如同在圖13中所示，hzACO-1 IgG4不能固定補體。使用多株抗IgG4 pAb作為陽性對照組，以誘導藉著hzACO-1 IgG4抗體之交-聯的結合。若hzACO-1與抗IgG4 pAb交叉結合，則偵測到C4與抗IgG4的明確劑量依賴性結合。

實施例14-抗體同型物的選擇

當表現人類化單株抗體時，需要就全長人類抗體的表現來選擇人類抗體同型物。為了發展中和性抗IFN-α抗體，必須沒有任何Fc-介導之效應物功能。

而且，雖然ACO-1衍生之抗體能夠中和IFN-α活性(實施例9和實施例10)，但如同在實施例6中描述的，ACO-1抗體變體的結合性抗原決定基可與IFNAR2受體次單元和IFN-α的同時結合相容。因此，雖然治療性hzACO-1 mAb與可溶性IFN-α細胞介素結合，但事實上mAb能夠經由IFN-α/IFNAR2複合物手與細胞表面結合，藉著招募Fc介導之效應物功能而引起胞毒性。除此之外，關於對抗第I型IFNs(IFN-α和IFN-β)的抗體，選擇抗體同型物是特別重要的，因為已經描述了抗IFN mAbs的Fc部分實際上會引起不想要的生物學影響，結果在如下述的某些細胞類型中，產生增效作用，代替IFN的中和作用(Moll HP等人J Immunol 180,1594-604,2008)。

在第I型IFNs存在下，正常在其他細胞類型中中和IFN活性之對抗人類IFN-α或IFN-β的抗體，在人類內皮細胞和PMBCs中，在IFN-α或IFN-β的存在下，改而誘導IFN活性。在這些研究中使用的抗體是屬於小鼠IgG1同型物，已知其與人類Fc受體交叉結合。僅對完整抗體看到IFN活性的誘導，對相同抗體的Fab或Fab2片段則否，且似乎藉著以抗體同型物對照組mAb阻斷Fc受體而抑制。因此，雖然該現象之分子機制是未知的，但顯然需要這些mAbs經由Fc部分與細胞表面受體結合。此外，該現象似乎是第Ⅰ型IFNs特有的，如對抗第Ⅱ型IFN，IFN-γ的抗體，但對於對抗第I型IFN受體，IFNAR之抗體並沒有觀察到類似的現象。(Moll HP.等人J Immunol 180,1594-604,2008)。

總之，對於治療性抗IFN mAb的發展而言，不需要中和IFN-α Fc介導之效應物功能，且事實上可能藉著在以抗IFNα mAb治療之患者的某些細胞類型中引起胞毒性或增效性IFN活性，而引起不想要的生物學影響。因此，人類化mAb的產製不能引起效應物功能可能是關係重大的。

現存有四種不同的人類抗體同型物，即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。其中IgG1和IgG3在與Fc受體和補體結合上是最有效的，因此引起Fc介導之效應物功能的活化，如-依賴性細胞之胞毒性(ADCC)和補體依賴性胞毒性(CDC)(Salfeld JG. Biotechnol 25,1369-1372,2007)。已經在文獻中描述了廢除各種Fc受體和Clq結合的突變(Hezareh M.等人J Virol 75,12161-12168,2001；Idusogie EE.等人J Immunol 164,4178-4184,2000；Lund J.等人J Immunol.;147:2657-6,1991；以及Chappel等人1991,Canfield MS等人J Exp Med. 173:1483-91,1991)。然而，選擇例如IgG1同型物，並包含數個突變，結果可能會產生免疫原性，並在人體中引起對抗Fc部分的免疫反應，因為這類經修改之Fc區並不是天然出現在人類中的。

為了那個理由，以IgG2和IgG4同型物表現hzACO-1抗IFN-α mAb，在一些治療性抗體中使用這兩者(Salfeld JG. Biotechnol 25,1369-1372,2007)。意外地，IgG4構築體的表現水平明顯比IgG2 hzACO-1變體高(實施例5)，這會大大地改善生產量。此外，IgG2 hzACO-1分子而不是IgG4變體有聚集的傾向(實施例11)。認為這在藥物發展中是嚴重的問題，因為聚集可能在生產期間降低產量、限制儲存壽命，且結果因為增加免疫原性而在患者中導致降低的效力。

因此，選擇hzACO-1 IgG4構築體，在IFN-α存在下的ADCC測定中，以及在補體固定ELISA測定中進一步定性，如同分別在實施例12和13中描述的。這些數據證實hzACO-1 IgG4分子確實不能引起不想要的胞毒性。在PBMC和EC中亦可證實如預期地缺少IFN-α活性之增效作用，如同在Moll等人2008中描述的。

總之，hzACO-1 IgG4分子似乎是特別適合的治療性分子，因為它能夠中和IFN-α，但不會誘導由Fc-介導之效應物功能引起的不想要副作用，包括胞毒性和IFN活性的增效作用，且因為它是穩定且完美表現的分子，使其適用於製造及投予患者。

實施例15-T細胞抗原決定基的分析

基於免疫原性預測的標準技術(De Groot,A.S.和Moise,L. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 10,332-340,2007)，使用由ProPred(Singh,H. ＆ Raghava,G.P. ProPred. BioIFNormatics. 17,1236-1237,2001)擴大的袋狀輪廓法(pocket profile method)(Sturniolo,T.等人Nat. Biotechnol. 17,555-561,1999)，預測在51個HLA-DRB對偶基因中之線性T-細胞抗原決定基。該方法計算可與在接受評估之蛋白質內之特定9個殘基長的肽結合之對偶基因的數目。若與許多對偶基因結合的特定肽是非人類來源的，便可用來作為免疫原性的間接測量。若該肽為人類來源的，則預期沒有任何的免疫反應，因為相對應T-細胞的早期否定選擇。

本實施例之目的是比較全長hzACO-1-kabat CDRH2所使用之人類化程序與施用於hzACO-1之現行人類化程序的經預測免疫原性。

當對ProPred演算法輸入序列時，使用全長的ACO-1 CDR_H2，帶有加在hzACO-1-kabat CDRH2周圍的10+10個殘基：APGQGLEWMG/EINPSHGRTIYNENFKS/RVTMTRDTST(CDR_H2_全)，連同在相同區域之相當的hzACO-1序列APGQGLEWMG/EINPSHGRTIYAQKFQG/RVTMTRDTST(CDR_H2_人類)。

通過T-細胞抗原決定基預測器跑CDR_H2_全，得到下列3個抗原決定基：WMGEINPSH(與4% HLA-DRB對偶基因結合)、INPSHGRTI(6%)和FKSRVTMTR(24%)。至於CDR_H2_人類，前兩個次要抗原決定基是相同的，但最後一個主要抗原決定基則換成FQGRVTMTR(27%)。即使它仍是T-細胞抗原決定基，它現在卻完全是人類序列，且從藉著在胸腺中之否定選擇刪除自我反應性T-細胞的假定，已經藉著CDR_H2_人類序列移除在CDR_H2_全中這個可能的主要抗原決定基。

因此預期hzACO-1具有比經傳統CDR移植之人類化ACO-1低的免疫原性。

實施例16-CDR截短

如同在實施例2中的描述，藉著非傳統方法將小鼠ACO-1抗體人類化。這制定了殘基遮罩的設計，基於hzACO-1和IFN-α的3D模型而預測其包括抗原互補位。該人類化方法的應用，結果產生hzACO-1抗體，其具有比藉著單純CDR移植人類化之抗體少的鼠類殘基，因為包括經最適化hzACO-1 CDRH2序列之5C-端胺基酸的肽，與相對應之人類架構序列是相同的。相反的，在經傳統CDR移植之人類化抗體(hzACO-1-kabat CDRH2)中的相對應肽序列則是鼠類來源的。因此，該人類化程序結果產生具有較多人類序列的人類化抗體，較不可能在患者中引起免疫原性。CDR H2序列的分析，顯示藉著在hzACO-1中減少小鼠胺基酸殘基，移除在小鼠胺基酸中所含有之MHC第Ⅱ類T細胞抗原決定基，並完全以人類的置換，預期患者會較能容忍它。因此，這證實預期hzACO-1會有比經傳統CDR移植之人類化ACO-1抗體少的免疫原性。

如同在實施例8中所示，保留hzACO-1抗體的親和力在小鼠ACO-1抗體的兩倍以內。因此，不需要更多的小鼠回復突變。此外，亦已經保留抗體的IFN-α亞型輪廓、結合並中和IFN-α1/D以外所有的IFN-α亞型，如同在實施例8、9和10中所述。儘管在CDR H2含有較少的小鼠胺基酸，但hzACO-1的親和力與hzACO-1-Kabat CDRH2抗體(其含有得自小鼠ACO-1抗體的全長小鼠CDR H2)之親和力和效力是相同的(分別在實施例8和9)。

再者，在重鏈之位置60-62中，藉著使用所描述之人類化方法，以序列AQK置換取代NEN，具有避免兩個天冬醯胺的優點，其可能有脫醯胺的傾向。脫醯胺改變了蛋白質的淨電荷，其可能影響穩定性及/或專一性。藉著保持序列AQK，會更完美地保護hzACO-1的均一性。比較hzACO-1和經傳統CDR移植之hzACO-1-Kabat CDRH2版本，顯示 hzACO-1是極為穩定的蛋白質，而hzACO-1-Kabat CDRH2意外地有聚集的傾向(實施例11)。認為聚集在藥物發展中是嚴重的問題，因為聚集可能在生產期間導致降低的產量、限制儲存壽命，並因為增加免疫原性而在患者中導致降低的效力。此外，hzACO-1構築體的表現水平意外地是hzACO-1-Kabat CDRH2變體的兩倍(實施例5)。

總之，藉著新穎方法人類化的hzACO-1 IgG4抗體，結果產生了治療性抗體，其具有較少的小鼠胺基酸，較不可能在患者中引起免疫原性。儘管含有較少的得自原始小鼠mAb之胺基酸，該人類化抗體仍具有可與小鼠抗體和藉著傳統CDR移植產生之人類化版本相比擬的親和力、效力和IFN-α亞型輪廓。而且，hzACO-1抗體較沒有脫醯胺的傾向，且具有較高的表現水平。因此，hzACO-1抗體是穩定且完美表現的分子，適用於製造及投予患者。

圖1顯示用於人類化之鼠類ACO-1 VH(重鏈)(A)和VL(輕鏈)(B)序列的分析(hz=人類化)，其中以陰影顯示遮罩，以粗體顯示Kabat CDR，以下標線顯示在小鼠序列和人類生殖種系序列之間的差異，以粗體下標線顯示可能經體細胞超突變(hypermutated)之殘基，並以陰影下標線顯示可能的回復突變殘基。ACO-1 VH=SEQ ID NO：1；人類生殖種系VH1_46/JH4=SEQ ID NO：2；hzACO-1 VH=SEQ ID NO：3；ACO-1 VL=SEQ ID NO：4；人類生殖種系VK Ⅲ _L6/JK2=SEQ ID NO：5；hzACO-1 VL=SEQ ID NO：6。

圖2顯示在ACO-1和ACO-2 VH(重鏈)(A)和VL(輕鏈)(B)序列，以及相對應之小鼠生殖種系序列之間的排比。ACO-2 VH=SEQ ID NO：7；小鼠生殖種系J558.33/D_/JH3_1=SEQ ID NO：8；ACO-2 VL=SEQ ID NO：9；小鼠生殖種系ae4/JK4_1=SEQ ID NO：10。

圖3顯示為了導入hzACO-1內而選擇的在重鏈(A)與輕鏈(B)中ACO-2殘基的位置。

圖4顯示在CPE測定中，除了IFN-αD和IFN-α1之外所有受試干擾素亞型之保護效果的hzACO-1抑制。

圖5藉由報告子基因(reporter gene，RG)測定顯示12個IFN-α物種的hzACO-1抑制。將每個抗體濃度的數值標準化，並計算四個重複的平均值。以平均值+/-標準偏差顯示數據。使用Prism軟體計算最佳配適S形反應曲線。對所有的數據組而言，R2值均大於0.98(除了IFN-αD，沒有對其進行曲線擬合)。

圖6顯示使用IFN-αA(A)或IFN-αF(B)，hzACO-1與具有單一ACO-2-衍生之突變A93V的hzACO-1變體的RG測定比較。按照在圖5中所描述者進行數據計算。IC50值是針對hzACO-1之值標準化；對於IFN-αA，ACO-1之IC50相對值為0.473而hzACO-1 A93V之IC50相對值為0.332。對於IFN-αF，ACO-1之IC50相對值為0.277且hzACO-1 A93V之IC50相對值為0.156。

圖7顯示hzACO-1和變體在pH3.5(A)、4.5(B)和5.5(C) 的轉變溫度，沒有添加物。

圖8顯示與IFN-α8結合之hzACO-1 Fab片段鏈(H、L)的結構，其係藉由X射線結晶學測定。

圖9顯示對IFNAR1和IFNAR2的IFN-α8結合性抗原決定基(Quadt-Akabayov S.R.等人Protein Sci.15,2656-2668,2006和Roisman L.C等人J.Mol.Biol.353,271-281,2005)，以在IFN-α8序列下面的有色方塊表示。藉著灰色方塊表示的殘基，在所有IFN-α亞型中部分保留，而以黑色方塊表示的殘基則是完全保留。以在IFN-α8之胺基酸序列上方的「^★ 」表示在IFN-α8上的hzACO-1結合性抗原決定基(使用4Å間隔截止)。

圖10顯示在RG測定中，小鼠ACO-1 mAb對hzACO-1及其兩個變體的比較。一變體為帶有完整CDRH2的人類化ACO-1(稱為hzACO-1-kabat CDRH2)，而hzACO-1是按照在實施例2中的描述，以較短的CDRH2建構。此外，該圖顯示另一個經突變的hzACO-1，其已經由合理的設計針對與IFN-αs的交互作用將最適化(hzACO-1 Y32E、T30R)。如指示，針對對五種不同的代表性IFN-α亞型的抑制，比較這四個重組的mAb變體。

圖11顯示以人類IgG1、IgG2和IgG4同型物表現之hzACO-1的蛋白質穩定性研究。在組胺酸緩衝溶液中培養5週之後，藉著HPLC測定聚集作用。

圖12顯示藉著hzACO-1 IgG4、IFN-α及其不同組合，在不同的效應物：目標細胞比例(E：T)下，說明缺少ADCC 的⁵¹ Cr釋放測定。細胞+單獨PBMC但沒有IFN-α或hzACO-1決定背景溶解，而曲拉通(Triton)-X 100說明最大溶解。納入美羅華(Rituxan)作為陽性對照組，並在所有的E：T比例下誘導可偵測的細胞溶解。

圖13顯示藉由ELISA的補體結合研究。表現成IgG4的hzACO-1當與IFN-α結合時不能固定補體。作為陽性對照組，hzACO-1與抗IgG4 pAb交叉結合，並偵測到C4對抗IgG4之明確的劑量依賴性結合。

Claims

一種人類化抗IFN-α 抗體或其抗原結合性片段，其包括以下VH CDR序列：(a)包括SEQ ID NO：15(NYWMH)的CDR H1序列；(b)包括SEQ ID NO：21的CDR H2序列；與(c)包括SEQ ID NO：17的CDR H3序列；且進一步包括以下VL CDR序列：(d)包括SEQ ID NO：18(SAGSSVDSSYLY)的CDR L1序列；(e)包括SEQ ID NO：19(STSNLAS)的CDR L2序列；與(f)包括SEQ ID NO：20的CDR L3序列。
如申請專利範圍第1項之抗體或其抗原結合性片段，其中該抗體或其抗原結合性片段包括包含SEQ ID NO：3的VH區與包含SEQ ID NO：6的VL區。
如申請專利範圍第1或2項之抗體或其抗原結合性片段，其為IgG4亞型。
如申請專利範圍第1項之抗體或其抗原結合性片段，其中該抗體或其抗原結合性片段包括包含含有SEQ ID NO：3之T30R突變的序列的VH區。
一種產生如申請專利範圍第1-4項中任一項之抗體或其抗原結合性片段的方法，其中該方法包括在適當的條件下培養編碼該抗體或其抗原結合性片段之宿主細胞，並隨後分離該抗體或其抗原結合性片段。
一種抗體或其抗原結合性片段，其係藉著如申請專利範圍第5項之方法獲得。
一種組合物，其包括如申請專利範圍第1-4和6項中任一項之抗體或其抗原結合性片段。
一種製備如申請專利範圍第7項之組合物的方法，其中該方法包括將抗體或其抗原結合性片段與賦形劑混合。
一種組合物，其可藉著如申請專利範圍第8項之方法獲得。
一種如申請專利範圍第1-4和6項中任一項之抗體或其抗原結合性片段的用途，其係用於製造供預防、管理、治療、或改善與IFN-α有關之發炎性疾病或病症之用的醫藥品。
如申請專利範圍第10項的用途，其中該醫藥品係適合用來治療發炎性疾病或病症。
一種專一地結合人類干擾素-α 的人類化抗體或其抗原結合性片段，其中該抗體或其抗原結合性片段包括以下VH CDR序列：(a)包含SEQ ID NO：15(NYWMH)的CDR H1序列；(b)包含SEQ ID NO：21的CDR H2序列；與(c)包含SEQ ID NO：17的CDR H3序列；且更包括以下VL CDR序列：(d)包含胺基酸序列SAGSSVDSSELY的CDR L1序列；(e)包含SEQ ID NO：19(STSNLAS)的CDR L2序列；與 (f)包含SEQ ID NO：20的CDR L3序列。
如申請專利範圍第12項之抗體或其抗原結合性片段，其中該重鏈進一步具有鄰接於該CDR H1的胺基酸殘基R，以使得該重鏈之胺基酸序列進一步包括胺基酸序列RNYWMH。
如申請專利範圍第12或13項之抗體或其抗原結合性片段，其中該重鏈進一步具有在位置93的胺基酸殘基V。
如申請專利範圍第12項之抗體或其抗原結合性片段，其為IgG4亞型抗體。
如申請專利範圍第12項之抗體或其抗原結合性片段，其為抗體片段，其中該抗體片段專一性地中和IFN-α 蛋白質亞型A、2、B2、C、F、G、H2、I、J1、K、4a、4b與WA之生物活性，但不顯著地中和IFN-α 蛋白質亞型D之該生物活性，其中該生物活性為MxA啟動基因之活化或抗病毒活性。
一種如申請專利範圍第12-16項中任一項之抗體或其抗原結合性片段之用途，其係用於製造供預防、管理、治療、或改善與IFN-α有關之發炎性疾病或病症之用的醫藥品。
如申請專利範圍第10、11、或17項之用途，其中該疾病或病症係選自由系統性紅斑性狼瘡(systemic lupus erythomatosus,SLE)、第一型糖尿病、牛皮癬、及AIDS所組成的群組。