JPH06510061A - Ｉｄｄｍの治療法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＩＤＤＭの治療法 本発明は、Ｉ型糖尿病の開始または熟成の予防法または改善法に関する。

発明の背景 Ｉ型糖尿病（インスリン依存性糖尿病またはＩＤＤＭ）は臨床上、良く知られて いる［ワインガーデンら（Ｗｙｎｇａａｒｄｅｎ　ｅｔ　ａｌ、　）　Ｃｅｃｉ ｌ　Ｔｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、　１９８８］。それは十分な 量のインスリンを生産することができないことに起因しており、究極的には、イ ンスリンを生産する膵臓のβ島細胞の欠如による。低インスリン血症および高グ ルカゴン血症（ｂｙｐｅｒｇｌｕｃａｇｏｎｅｍｉａ）がＩＤＤＭの特徴であり 、患者はケトーンス並びに他の重篤で消耗性の症状を発現し易い。最初の臨床症 状が提示される時期には、数日または数週間前まて症状を逆行することが可能で ある。多くの場合、島細胞の破壊は症状発現の数カ月前、しばしば数年前であり 、ＩＤＤＭ患者には、残渣量の島細胞しか残っていないことが多い［ＩＤＤＭ患 者から摘出した３７の膵臓の内、３４が残渣量のβ細胞を有していた［フォラリ スら（Ｆｏｕｌｉｓ　ｅｔ　ａｌ、）　Ｌａｎｃｅｔ、　Ｄｅｃｅｍｂｅｒ　１ ９．１９８７、　ｐｐ　１４２３−１４２７）　３゜ある症例では患者の、グル コースチャレンジに対する適切な応答を測定することにより、あるいは循環液中 の島細胞またはインスリンに対する抗体を分析することにより、症状発現前にＩ ＤＤＭを検出することができる。ＩＤＤＭ発現のピークは１１−１３才であるが 、それ以後の年令でも実質的な発病が起きている。４０才以後のＩＤＤＭの発病 はほとんどない。

［）ＤＭと診断されたら、カロリー制御の厳密な処方が導入され、患者はインス リン治療を受ける。多くの叡者では初期の治療に続いて、疾患が緩解し、インス リンが殆どまたはまったく無用のソノ１ウントまたは「ノ１不ムーン」期間がみ られる。緩解は、数週間または数カ月、時には１または２年間持続し得る内因性 インスリン分泌の部分的な回復による。しかしながら、究極的には、疾患は再発 し、インスリン治療が永久的に必要となる。

ＩＤＤＭの病因は大いに議論されている。それは遺伝的素因や環境の影響などを 含む複数因子によると思われる。ＩＤＤＭと、第６染色体の短腕に位置する主要 組織適合性複合体領域によってコードされている特異的ＨＬＡ類との間に強い関 連性が同定された。王たる高すスクアレルはＤＲ３およびＤＲ４である。

ウィルスを含む環境因子は重要と考えられ、幾つかの証拠がこの見解を支持して いる。ある種の糖尿病原性または関連ウィルス（耳下腺炎ウィルス、麻疹ウィル ス、風疹ウィルス、脳を髄炎Ｍウィルス、コクサラキーウィルスＢ１およびレオ ウィルス（ｒｈｅｏｖｉｒｕｓ））が疫学的にＩＤＤＭの発現に関連しており、 あるいは醤歯類に接種したとき糖尿病を起こし得る。糖尿病原性ウィルスは直接 、培養Ｂ細胞に感染することができる。加えて、重篤なケトアンド−シスで死亡 した、新規発病ＩＤＤＭの少年の膵臓からコクサラキーウィルスＢ４が単離され 、このウィルスは実験動物で糖尿病を誘発し、感染動物のＢ細胞内にはウィルス 抗原があった。フォラリスら（前掲）はＩＤＤＭ患者のＢ細胞はアルファインタ ーフェロンを分泌しており、このことから、ＩＤＤＭの幾つかの症例における病 因として、Ｂ細胞の慢性ウィルス感染があると結論している。

自己免疫もＩＤＤＭに関与している。９０％に上る新規発病ＩＤＤＭが島細胞に 対する抗体価を有する。抗体誘発の、および細胞に仲介される免疫現象の両方が ＩＤＤＭの病因に関与しているだろう。

ＩＤＤＭに関連する様々な因子の相互関係は不明瞭であり、患者ごとに異なるで あろう。

外因性インスリンの投与によるＩＤＤＭの治療は多くの点で満足できない。

頻繁な注射の必要性の外に、摂取カロリーおよび成分が変化することによって必 要なインスリンが変化することにより、またインスリン製剤の供給源および型、 そのデリバリ−経路、吸収速度および純度、およびインスリン製剤の特性が様々 であることにより、現実には正常血糖を維持することが困難である。連続的なイ ンスリン皮下注入、または他の徐放性製剤によってインスリンホメオスタンスを 改善する試みがなされているが、実質的には、血液中のグルコースの変化は通常 である。さらに、外因性インスリンの主たる組成物は低血糖性であり、それは、 潜在的にインシュリン過剰投与による、生命に脅威的な状態である。

インスリンを分泌することができる組織移植の開発が研究されているが、ＩＤＤ Ｍの発病時に進行を阻止することにより、患者自身の高細胞を保護することが好 ましいであろう。しかし、現在までのところ、ＩＤＤＭの病因が不明かつ多重性 であることから、治療ターゲットの同定が非常に困難であった。

従って、本発明の目的は、ＩＤＤＭの発現の早期段階および症状発現前の段階で 、高細胞の壊死を阻止し、逆行させ、あるいは妨げるための組成物および方法を 提供することにある。

本発明はまた、ＩＤＤＭの治療のための組成物を提供することを目的とする。

本発明の他の目的は、ＩＤＤＭの治療法または予防法を提供することにある。

これらのおよび他の目的は本明細書全体を考慮することにより、明らかとな本発 明者らはインスリンプロモーターの制御（コントロール）下で高細胞特異的アル ファインターフェロンを発現するトランスジェニック動物がインスリン依存性糖 尿病および膵炎を発現していることを見いだした。そこで、本発明者らは、高細 胞による内因性アルファインターフェロンの発現がｒＤＤＭに関与している（責 任がある）と結論した。従って、本発明の目的は、症状発現前の段階の、または 最近発病したＩＤＤＭ患者であって、少なくとも、いくらかの、インスリンを分 泌する能力が残存しているベータ島細胞を有する患者に治療有効量のアルファイ ンターフェロン拮抗物質（アンタゴニスト）を投与することにより達成された。

ガンマインスリンの高い局所濃度が自己免疫性糖尿病を誘発することが示された 。これはヒトインスリンプロモーターとマウスガンマインターフェロン遺伝子と の融合遺伝子を有し、それにより、膵臓の高細胞でガンマインターフェロンが発 現されるトランスジェニックマウスの創製によって達成された。これによって、 局所炎症と島のインスリン産生細胞の破壊が起きる。この結果は科学的に興味深 いが、ＩＤＤＭの初期段階との関連性には限界がある。ガンマインターフェロン は通常免疫細胞（高細胞でな（）によって発現されるので、炎症が開始した後に のみ存在し、その任務をを果すことができる。即ち、ガンマインターフェロンは ＩＤＤＭの後期段階に関与し得るが、開始するものではない。

ＩＤＤＭを開始し得る因子または事象の検索は幾つかの因子を考慮して行った。

まず、第１に、上記のように、かなりの数の研究が、ウィルスの疾患の開始への 関与を示唆していた。しかしながら、これらのウィルスはベータ細胞の急性の損 失を起こさないので、間接的な関係であろう。第２に、予め炎症が存在している 訳ではないので、疾患の早期段階には、高細胞それ自身が関係しているに違いな い。第３に、ベータ細胞が構成的にＭＨＣ抗原（クラスＩまたはクラスＩＩ）を 発現するトランスジェニックマウスでの以前の研究で、高細胞は自己抗原または 外来抗原の自己提示のみでは、自己免疫疾患を開始し得ないことが示された。

これらを考慮し、本発明者らは、ベータ細胞のウィルス感染が、在住マクロファ ージ（これらの細胞は膵臓を含む、大多数の正常組織に存在する）を刺激し得る タンパク質の合成および放出を導（可能性があると考えた。一度、これらのマク ロファージが活性化されると、様々なリンホカインおよびサイトカインが放出さ れ破壊的な炎症が開始され得る。ウィルス感染に応答して、ベータ細胞のような 上皮細胞によって作られる可能性のある１つの因子がアルファインターフェロン である。このインターフェロンは刺激に応答して高細胞で作られるのみならず、 マクロファージを刺激し得る。新規にＩＤＤＭと診断された患者の高細胞でアル ファインターフェロンが産生されることが知られている（ＦｏｕＬｉｓら、前掲 ）が、このリンホカインの発現を病因と結論する根拠はない。

従って、ベータ細胞がアルファインターフェロンを作成するよう、トランスジェ ニックマウスを操作することを決定した。トランスシーンに関する拘束事項は以 下の通りである　１）プロモーターは、遺伝子をベータ細胞内で発現させること （好ましい候補はインスリンプロモーターターであり、実際、このプロモーター はトランスジェニックマウス内で高細胞に異種の遺伝子を直接発現させることが 示された）、２）アルファインターフェロンがマウス細胞上で活性であること（ インターフェロンの作用には、かなりの種特異性がある）：３）理想的には、究 極の治療が受容体に対抗する、あるいはりガント（アルファインターフェロン） に対抗する、のいずれを目的とするものがが不確かなので、有効な拮抗物質のス クリーニングに便利なよう、アルファインターフェロンがヒト性であることをめ た。即ち、ヒトインスリン５°非転写領域、ヒトインスリン第１エクソン、第１ イントロン、およびヒトインスリン第２エクソンド５′から翻訳開始部位までの 部分がヒトアルファインターフェロンＡ／ＤＢｇｌＩＩをコードするｃＤＮＡに 結合されている融合遺伝子を製造した。これは、共通のＢｇｌＩＩ制限エンドヌ クレアーゼ部位を融合のために用い、インビトロでＣＤＮＡを構築した、ヒトア ルファインターフェロンＡおよびＤの遺伝子のハイブリッドである。このハイブ リッドとトアルファインターフェロンはマウス細胞上で活性である（大多数のヒ トアルファインターフェロンとは異なり）。次いで、アルファインターフェロン ｃＤＮＡに、肝炎表面抗原のポリＡシグナルを付加した。

このＩｎ５−Ｉｆｎ、　ａｌｆａ融合遺伝子を単一細胞マウス胚の前核に注入し て融合遺伝子を担持するトランスジェニックマウスを生成させた。注入された卵 の生産に用いたマウスはＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ雌とＤＢＡ／２雄のＦ１ハイブ リッド（ＢＤＦＩ）であった。元のトランスジェニックマウスを、次いでＢ　Ａ 　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスに戻し交配し、トランスジェニック子孫を分析した。こ れらのマウスはヒトアルファインターフェロン遺伝子を発現しており（免疫細胞 化学（イムノサイトケミストリー）で測定）、この発現に伴って、重篤な膵炎、 それは最初島細胞に集中した、を起こした。これは、ベータ細胞におけるアルフ ァインターフェロンの無節制な生産が炎症を起こすことを示している。しかしな がら、これらのマウスは糖尿病（食餌後、または飢餓状態での低血糖）を発現し なかった。ＢＡＬＢ／ｃマウスはウィルス性または化学物質による糖尿病誘発に 抵抗性であることが分かっている。そこで、本発明者らは、感受性のマウス株で は島を殺す物質（リンホカイン類、ＣＴＬ類、スーーパーオキシドラジカル（過 酸化物ラジカル））に対して、ＢＡＬＢ／ｃマウスが抵抗性であるか、ＢＡＬＢ ／ｃマウスがベータ細胞の壊死の進行に歩調を合わせた速度で島を修復すること ができるか、のいずれかの理由で、重篤な膵臓炎はあったが、糖尿病は発病しな かった可能性があると考えた。

アルファインターフェロンの役割の解明のために、マウスをＣ５７Ｂ１／６およ びＣＤ−１株に戻し交配し、糖尿病に対する感受性を誘発した。戻し交配マウス の第２世代を得、高血糖症を監視した。これまで２匹のトランスジェニック雄（ ５匹のトランスジェニック雄および４匹のトランスジェニック雌の内）が糖尿病 に罹り（１匹は４月令で、１匹は５月令で）、系統の進行に伴ってさらなる変化 が予測される。

トランスジェニックマウスのベータ細胞内で、動物を、これらの「外来」抗原に 対して免疫学的に耐性にするために様々なタンパク質を発現させた。幾つかの例 では、それらタンパク質は有害であり［口ら（Ｌｏ　ｅｔ　ａｌ、）　、　Ｃｅ １ｌ　５３：１５９：１６８　（１９８８）］　、幾つかの例では有害な結果物 によって耐性が破壊され〔オオハシら（Ｏｈａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ、）　Ｃｅ１ １．６５：３０５−３１７　（１９９１）；オールドストーンら（Ｏｌｄｓｔｏ ｎｅ　ｅｔ　ａｌ、）　、　Ｃｅ１１．６５：３１９−３３１　（１９９１）］ 　、そして少なくとも１つの例では、有害でない結果物によって耐性が破壊され 得た［ｈｕＣＤ４、スチュワードら（Ｓｔｅｗａｒｔ　ｅｔ　ａｌ、　）未公開 コ。例えばヘルペスｇＤ１サブスタンスＰ１ラット成長ホルモン、胎盤ラクトー ゲンおよびＮＧＦのような他のタンパク質は発現されても糖尿病を誘発しながっ た。他の例では、島がウィルス抗原、またはガンマインターフェロンを発現する トランスジェニックマウスにおいて非耐性（およびインスリン炎）が発現した［ アダムスら（＾ｄａｎ＋ｓ　ｅｔ　ａｌ、　）　、　Ｎａｔｕｒｅ　３２５：２ ２３−２２８（１９８７）：サルベトニクら（Ｓａｒｖｅｔｎｉｃｋ　ｅｔ　ａ ｌ、　）　、　Ｃｅ１ｌ　５２ニア７３７３−７８２（１９８］。本明細書記載 のアルファインターフェロンの場合におけるアルファインターフェロンの有害作 用は、通常、アルファインターフェロンはウィルス感染への応答などにおいて一 時的に発現されるにすぎないのに、ベータ細胞から慢性および長期的に発現され ることにに起因（トランスジェニック動物及びＴＤＤＭにおいて）している。

インターフェロンはウィルスまたは他の物質に応答して大多数のを推動物で発現 される分泌タンパクであり、その特徴は、様々な標的細胞に抗ウイルス状態を誘 導することができることにある［スチュヮーｈ　（Ｓｔｅｗａｒｔ）による総説 。

Ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ、　１９７９］　ｏインターフェ ロンはＴリンパ球、８９２８球、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、およ びその他の免疫応答に関与する細胞の活性を調整し、腫瘍細胞および他の増殖性 細胞型の増殖を制御することが示された。細胞起源、生化学的および抗原性特性 に基づいて、幾つかの型のインターフェロンに分類されている。ＩＦＮ−αおよ びＩＦＮ−β（Ｉ型インターフェロンとしても知られている）は、ウィルス、２ 本鎖ＲＮＡまたは他のインデューサーによる処理に引き続いて、白血球および線 維芽細胞のそれぞれによって産生される主たるインターフェロンである。ＩＦＮ −γはミトゲンまたは特異的抗原層により刺激されたＴ−リンパ球によって産生 される。

ヒトＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−γは独特の遺伝子によって特定されるＣダニグチ ら（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ、　）　、　Ｎａｔｕｒｅ　２８５：５４ ７−５４９　（１９８０）；プリンクら（Ｄｅｒｙｎｃｋ　ｅｔ　ａｌ、　）、 　Ｎａｔｕｒｅ　２８５：５４２−５４７　（１９８０）；ゲラデルら（Ｇｏｅ ｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ、　）　mｕ ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　８：４０５７−４０７４　（１９８０ｂ） コ。ＨｕＩＦＮ−βの遺伝子はイントロンを欠き〔ローンら（Ｌａｗｎ　ｅｔ　 ａｌ、　）　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　７８：５４ ３５−５４３９（１９８１ｂ）　：デグレープら（Ｄｅｇｒａｖｅ　ｅｔ　ａｌ 、　）　、　Ｇｅｎｅ　１４：１３７−１４３　（１９Ｕ）；オーツら（Ｏｈｎ ｏ　ｅｔ　ａｌ、　）　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　７ ８：５３０５−５３０９１９８］コ、ＨｕｌＦＮ−Ｃ１と２９％のアミノ酸相同 性を有するタンパク質をコードしており、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−β遺伝子が 共通の先祖から発展したことを示している［タニグチら（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ　 ｅｔ　ａｌ、　）　、　Ｎａｔｕｒｅ　２８５：５４７−５４９　（１９８０） コ。対して、Ｈｕ　ＩＦＮ−γ暗号化領域は３つのイントロンによって分離され ており［グレイら（Ｇｒａｙ　ｅｔ　ａｌ、　）　、　Ｎａｔｕｒｅ　２９８： ８５９−８６３　（１９８２）コ、ＨｕｌＦＮ−１１２１とのアミノ酸相同性は 極めて限定されている［グレイら（Ｇｒａｙ　ｅｔ　ａｌ、　）　、　Ｎａｔｕ ｒｅ　２９５：５０３−５０８　（１９ｇ２）：エプスタイン（Ｅｐｓｔｅｉｎ ）　、Ｎａｔｕｒｅ　２９５：４５３−４５４　（１９８２）コ。興味深いこと には、ＨｕｒＦＮ−β遺伝子は１個のみが明白に同定されているが、ウシＩＦＮ −βは５またはそれ以上の相同な、しかし別個の遺伝子ファミリーによってコー ドされている［ラングら（Ｌｅｕｎｇ　ｅｔ　ａｌ、　）　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ　１９８４］。さらに、ＩＦＮ−β遺伝子ファミリーの大きさは異な る哺乳類種間でかなり相違しているＣラングら（Ｌｅｕｎｇ）　、Ｂｉｏｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙ、　１９８４コ。

本発明の目的から、アルファインターフェロンは、既に同定されているアルファ インターフェロンファミリーの全メンバー、並びに、ファミリーの既知のメンバ ーをコードするＤＮＡと低ストリンジエンシー条件下でハイブリダイズし得る核 酸によってコードされており、１つのアルファインターフェロンの生物学的活性 の少なくとも１つを、質的に有するファミリーの将来のメンバーを包含する。低 ストリンジエノンーハイブリダイゼーション条件の定義は下記の通りである。フ ィルターに吸収された核酸とのハイブリダイゼーションは、２０％ホルムアミド を含有する、５ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣ１；！０．０１５Ｍ　ＮａＣＬ　０．１５ Ｍ　ＮａＣ１，０，０１５Ｍクエン酸ナトリウム）、５Ｘデンハート溶液　（Ｄ ｅｎｈａｒｄｔ、　１９６６）、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）　 、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５０　ｕ　ｇ／ｍｌの音波処理した変性鮭精 子ＤＮＡ、および１０％硫酸デキストラン中で行う。４２℃でインキュベーショ ンした後、フィルターを室温にて、０．２％ＳＤＳ含有２ｘＳＳＣ中で洗浄する 。

これまでに同定されたアルファインターフェロンポリペプチドは、それぞれ別個 の複数のタンパク質を含む、クラスＩおよびクラスＩＩの主要なりラスに属する ［バロンら（Ｂａｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　）　Ｃｒ１ｔｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ ｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１０：１７９−１９０　（１９９０） ：ナカタら（Ｎａｇａｔａ　ｅｔ　ａｌ、）　Ｎａｔｕｒｅ　２８７：　４０１ −４０８　（１９８０ａ）、ナガタら（Ｎａｇａｔａ　ｅｔ　ａｌ、　）　、　 Ｎａｔｕｒｅ　２８４：　３１６−３２０　（１９８０ｂ）＋スツルリら（Ｓｔ ｒｅｕｌｉ　ａｌ、　）　、　５ｃｉｅｎｃｅ　２０９＋１３４３−１３４７　 （１９８０）；ゲラデルら（Ｇｏｅｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｔA　） 、Ｎａｔｕｒｅ　２８７：　４１１−４１６　（１９８０ａ）；ケラデルら（Ｇ ｏｅｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ、　）　、　Ｎａｔｕｒｅ　２９O ：　２０−２６　（１９８１）：ローンら（Ｌａｗｎ　ｅｔ　ａｌ、　）　、　 ５ｃｉｅｎｃｅ　２１２：１１５９−１１６２　（１９８１＝j； ウルリッヒら（Ｕｌｌｒｉｃｈ　ｅｔ　ａｌ、）　、　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、 　１５６：４６７−４８６　（１９８２）：ワイスマンら（ｌｅｉｓｓｍａｎｎ 　ｅｔ　ａｌ。）　、　Ｐｈ１１．Ｔｒａｎｓ、Ｒ，Ｓｏｃ、Ｌｏｎｄ、　８２ ９９°７−２８　（１９８２）G ルンドら（Ｌｕｎｄ　ｅｔ　ａｌ、　）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ＾ｃａｄ、ｓｃ ｉ、　８１：２４３５−２４３９　（１９８４）：カポンら（Ｃａｐｏｎ　ｅｔ 　ａｌ、）　１１ｏ１．ｃｅｌｌ、Ｂｉｏｌ、５ニア６ｇ　（１９８５）］ｏア ルファインターフェロンにはＩＦＮ−アルファに、ＩＦＮ−アルファ５、ＩＦＮ −アルファＡ（ＩＦＮ−アルファ２）、ＩＦＮ−アルファＤ（ＩＦＮ−アルファ １）、ＩＦＮ−アルファＨ１ｒＦＮ−アルファＢ、ＩＦＮ−アルファＢＳ　ＩＦ Ｎ−アルファ４ｂ、ＩＦＮ−アルファ６、ＩＦＮ−アルファＣ１、ＩＦＮ−アル ファＣＳ　ｆＦＮ−アルファし、ＩＦＮ−アルファＪ１、ＩＦＮ−アルファＪ２ 、ＩＦＮ−アルファ７４、ＩＦＮ−アルファ１、ＩＦＮ−アルファＦ、ＩＦＮ− アルファＷＡ、ＩＦＮ−アル７７Ｇ、ＩＦＮ−アル７ｙ７６　ＣＩＦＮ−アルフ ｙ４ａ）、（ＩＦＮ−アルファ８８）およびそのアレルが含まれる。

アルファインターフェロン拮抗物質はインビボでのアルファインターフェロンの 生物学的活性を阻害し得る任意の物質と定義する。拮抗物質は、完全にアルファ インターフェロンを中和する必要はなく、インヒポでＩＤＤＭ治療作用が発揮さ れるに十分な程度、中和すればよい。アルファインターフェロンは複数の生物学 的活性を有することが知られている。本発明で用いる拮抗物質は、これらの活性 の任意の１つまたはそれ以上を減少、阻害または中和する。通常、拮抗物質は、 アルファインターフェロンの、抗ウィルス活性、抗増殖活性または免疫調節活性 の少なくとも１つ（そして好ましくは全部）を阻害するであろう。

通常、拮抗物質は幾つかのカテゴリーから選択される。可溶型のアルファインタ ーフェロン受容体、アルファインターフェロンの結合またはそれの受容体との適 切な相互作用を阻止する抗アルファインターフェロン受容体抗体、アルファイン ターフェロン自身と結合し中和し得る抗体、アルファインターフェロン活性と拮 抗するインターフェロンフラグメントまたは他のアルファインターフェロンのア ミノ酸配列変異体、およびアルファインターフェロンと受容体結合部位を競合す るがそれ自身では実質上、アルファインターフェロン活性を示さない非インター フェロンポリペプチド。しかしながら、非ペプチド性アルファインターフェロン 拮抗物質または他のポリペプチドアルファインターフェロン拮抗物質が将来開発 される可能性があり、本発明はこれらのカテゴリーに制限されるものではない。

抗アルファインターフェロン拮抗物質抗体は自体周知であるＣツクイら（Ｔｓｕ ｋｕｉ　ｅｔ　ａｌ、）　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、３０：１１２ ９−３９　（１９８６）；ドユアルテら（Ｄｕａｒｔｅ　ｅｔ　ａｌ、　）　、 　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、　４：２２１−２３２　（１ ９８７）；バーソエインら（Ｂａ■ ｓｏａｉｎ　ｅｔ　ａｔ、　）　、Ｊ、　１ｍ１Ｉｌｕｎｏ１．１４３：５０７ −５１２　（１９８９）；イックスレーら（Ｅｘｌｅｙ　ｅ■ ａｌ、）　、Ｊ、ＧｅｎＪｉｒｏｌ、６５：２２７７−８０（１９８４）；　ン エレルら（Ｓｈｅａｒｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　）　、Ｊ、　ｒｍｍｕｎｏｌ、１３ ３：３０９６−１０１　（１９８４）＋アルカンら（Ａｌｋａｎ　ｅｔ　ａｌ、 　）　、　Ｃ１ｂａ　Ｇｅｉｇｙ　Ｆｏ■ ｎｄａｔｉｏｎ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　１１９：２６４−７８　（１９８６）； 　ノルら（Ｎｏｌｌ　ｅｔ　ａｌ、　）　、　ＢｉｏｍｅｄA　Ｂｉ。

ｃｈｉｍ、Ａｃｔａ　４ｇ＋１６５−１７６　（１９８９）；ヘルツォッグら（ Ｉｌｌｅｒｔｚｏｇ　ｅｔ　ａｌ、　）　、　Ｊ、　Ｉｎｔ■■ ｆｅｒｏｎ　Ｒｅｓ、　１θ（Ｓｕｐｐｌ、　ｌＸ１９９０）　ニオ−バーオー ルら（Ｏｖｅｒａｌｌ　ｅｔ　ａｌ、　）　、　１．　Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔ ｈｏｄｓ　１１９：２７−３３　（１９８９）；カワダら（Ｋａｖａｄａ　ｅｔ 　ａｌ、　）　、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ■ ５６：４８９−４９５（１９８５）　：コンチクら（Ｋｏｎｔｓｅｋ　ｅｔ　ａ 、ｉ、　）　、　Ｊ、　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　Ｒｅｓ、　iｓｐｅ ｃｉａｌ　１ｓｓｕｅ）７３−８２（１９９１）；アドルフら（Ａｄｏｌｆ　ｅ ｔ　ａｌ、）　ＥＰ　１１９．４７６；ウイズニブスキーら（Ｗｉｓｎｉｅｖｓ ｋｉ　ｅｔ　ａｌ、）　ＤＤ　２７７０８７；ハウブトマンら（ｌｉａｕｐｔｍ ａｎｎｅｔ　ａｌ、）　、　ＵＳ　４．９１７．８８７；ニブレインら（Ｅｂｒ ａｉｎ　ｅｔ　ａｌ、　）　、　ＧＢ　２．１９５．３４２〕。

好ましくは、ベータ島細胞によって産生されるアルファインターフェロン（類） のサブタイプの生物学的活性を中和するように抗体を選択することが好ましい〔 例えば、サブタイプ特異的中和抗体については、ライドンら＜Ｌｙｄｏｎ　ｅｔ 　ａｌ、　）、　Ｂｉｏｃｈｅｍｓｉｔｒｙ　２４：４１３１−４１４１　（１ ９８５）参照］。■ＤＤＭベータ島細胞によって発現されるサブタイプは症状発 現前のＩＤＤＭの也者またはＩＤＤＭ治療の「ハネムーン」相の患者から得たベ ータ島細胞のパネルをスクリーニングすることによって容易に決定することがで きる。

あるいは、治療すべき患者のサブタイプを決定するために患者のバイオプシーを とることができる。検定は、多くの実施可能な方法で容易に行える。例えば、ｃ ＤＮＡを切除したばかりの膵臓標本から調製し、各アルファインターフェロンサ ブタイプに特異的なプライマーバンクを用いて増幅することができる。

あるいは、サブタイプ特異抗体を用いる免疫組織化学分析によってサブタイプを 決定することができる。さらに、抗体はアルファインターフェロンの、抗つイ／ ｌ／ス活性［例えば、ニスベットら（Ｎｉ、５ｂｅｔ　ｅｔ　ａｌ、　）　、　 Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｉｎｔ、　１１：３０１−３０９　（１９８５）コ、および 抗増殖活性［例えば、セブレインら（Ｃｅｂｒａｉｎ　ｅｔ　ａｌ、　）前掲、 またはエビンガーら（Ｅｖｉｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅ ｎｚｙｍｏｌ、　７９＋３６２−３６８　（１９８１）］を中和し得るべきであ り、最も好ましくは、免疫調節活性のみを中和する。中和されるべき免疫調節活 性は、好ましくはＩＦＮで増進されたＮＫ活性「セブレインら（Ｃｅｂｒａｉｎ 　ｅｔ　ａｌ、　）　、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３８＋４８４−４９０　 （１９８７）　；リーら（Ｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ、　）　、　Ｃｎａｃｅｒ　Ｒｅ ｓ、　４２：１３１２　（１９８２）］または単球またはマクロファージ機能、 例えば、プロテアーゼ生産［ジョーンズら（Ｊｏｎｅｓ　ｅｔ　ａｔ、　）　、 　Ｊ、　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　Ｒｅｓ、　２：３７７　（１９８２）コ、の増 大である。

アルファインターフェロン中和抗体は島細胞によって生産される天然に存在する インターフェロンと結合する能力を有するべきである。従って、抗体を生産し、 選択するために用いられるシステムは、治療すべきＩＤＤＭの動物種の細胞系、 体液または１次培養から生成された天然産物を標的とするものであろう。抗体は 望ましくは、天然に存在する形のインターフェロンと結合し、中和するが、現在 シェリングプラウ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）社およびホンフマンラロ ツンユ（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ　Ｒｏｃｈｅ）社から販売されているインター フェロンアルファ２変異体のような、選択された組換え型アルファインターフェ ロンを中和しない（または、中和程度が低い）よう、選択される。通常、これは 大腸菌のような組換え低級生物の産物でなく、哺乳顕細胞産物を中和することが できることを意味する［ツクイら（Ｔｓｕｋｕｉ　ｅｔ　ａｌ、　）　、　Ｍｉ ｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　３０：１２７１−９　（１９８６）コ。

所望の中和抗体を選択する工程は常法である。適当な方法は上記の各参考文献に 開示されている。一般に、それ以外は通常のターゲットアッセイにおいて、用量 −関連の、アルファインターフェロンの生物学的活性を阻害および抑制する抗体 の能力を測定する。必要最小量で検出可能なアルファインターフェロン阻害を生 じさせる抗体、そして、特に、インターフェロンをアッセイシステムに導入した 後にも、阻害することができる抗体を本明細書に用いる。

他の適当なアルファインターフェロン拮抗物質群はアルファインターフェロン受 容体ポリペプチドの活性を阻害し得る抗体である。現時点では、少なくとも２つ のそのような受容体ポリペプチドが同定されている［レベル（Ｒｅｖｅｌ　ｅｔ ａｌ、）　、　ＥＰ　３６９．８７７；モゲンセンら（Ｍｏｇｅｎｓｅｎ　ｅｔ 　ａｌ、　）　ｔｏ　９１１０５８６２；コラモニチら（ＣｏＬａｍｏｎｉｃｈ ｉ　ｅｔ　ａｌ、）　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、　８７： ７２３０−７２３４　（１X９０） ］。しかし、これらの文献に記載のタンパク質が、協同的に作用するタンパク質 であるか、独立して作用するタンパク質であるかは不明である。明らかに、アル ファインターフェロンおよびベータインターフェロンは同じ受容体構造を認識す るが、ガンマインターフェロンは他の構造を認識する（Ｃｏｌａｍｏｎｉｃｈｉ ら、前掲）。Ｃｏｌａｍｏｎｉｃｈｉら（前掲）はアルファインターフェロン受 容体構造は２つのポリペプチド鎖を含有しており、その１つ、アルファ鎖が抗体 によって免疫沈降されると報告した。この約１１０ｋｄタンパク質は、Ｍｏｇｅ ｎｓｅｎら（前掲）によってアルファインターフェロン受容体であると推定され た９５−１００ｋｄタンパク質であろう。本発明の目的から、拮抗物質抗体はＲ ｅｖｅｌら、Ｍｏｇｅｎｓｅｎらあるいは（、Ｏｌａｍｏｎｉｃｈｉらによって 記載されたタンパク質のいずれかに対して惹起されたか、結合し得るものであり 、アルファインターフェロンと競合し得るか、さもなくば拮抗し得る。抗体は受 容体結合部位のアルファインターフェロンと置換することができ、アルファイン ターフェロンよりも受容体に高い親和性を有することが理想的である。抗体は、 アルファインターフェロンとその受容体結合部位との相互作用を阻害することさ えできれば、必ずしもアルファインターフェロン受容体結合部位に結合する必要 がなく、そのような例として１、単に該部位の近隣に結合し、該部位を立体阻害 し、それを隔離することにより上記の作用をあられす。また、それらはアルファ インターフェロンよりも大きい能力を有する必要もない。なぜなら、この点に関 する不足は用量の増加で補償できるからである。

抗受容体中和抗体は抗アルファインターフェロン抗体と同様の方法、即ち、アル ファインターフェロンの通常のバイオアッセイにおいて、アルファインターフェ ロンの生物学的活性を阻害または干渉する能力によって、同定できる。

抗受容体抗体の場合、抗体の、それ自体でアルファインターフェロンのアゴニス トとして作用する能力をもスクリーニングする必要がある。アゴニスト抗体は、 アルファインターフェロン受容体と交差結合するかそれを凝集させ、そうするこ とによりアルファインターフェロンの作用を模倣する。それらはアルファインタ ーフェロンの代わりに用いるには適するが、本発明に用いるのに望ましくないこ とは明らかである。

拮抗物質抗体は一般に１価の形、即ち、１度に単一の受容体とのみ結合し得る形 、て調製されるであろう。構造的には、そのような抗体は、例えば、Ｆａｂまた はＦａｂ’　フラグメントの場合のように、単一の重鎖／軽鎖アームのみを有す る。それらは先端を切断した重鎮と軽鎖を組換え発現するが、無傷の電価抗体を 得ることにより、常法通り調製することができる。

抗アルファインターフェロンまたは受容体抗体は、Ｉ　ｇＧＳ　Ｉ　ｇＭ、Ｉ　 ｇＡ、またはＩｇＤなどの、任意の抗体クラスまたはサブクラスであってよい。

それらはポリクローナル抗体、モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体の 混合物であってよい。抗体はＩｇＧであり、補体を活性化しないサブクラスのも のであること（あるいは同様の効果を達成すべく突然変異したもの）が好ましい 。抗体には、ヘテロ２機能性抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’　および（Ｆａｂ’）２、 −重鎖抗体（これは外因性ポリペプチドによって重鎮と軽鎖が結合したもの）、 キメラ抗体（種間、またはクラス間またはサブタイプ間ン、ＣＤＲ−グラフト種 間抗体およびポリエチレンングリコール置換、または共有結合的に修飾した抗体 を含む、天然抗体のアミノ酸配列変異体、または他の共有結合性修飾物を包含す る。ヘテロ２機能性抗体には抗体の１個の腕がアルファインターフェロンまたは その受容体と結合し中和することができ、他の腕は、異なるインターフェロンま たはインターフェロン受容体エピトープのような、異なるインターフェロンの、 あらかじめ決定されたエピトープまたは抗原、あるいはインスリンまたは高細胞 表面抗原と結合するものが含まれる。ヒト治療に用いる場合、抗体への免疫応答 を最小にするために抗体はヒトのものであるか、ヒト抗体配列にＣＤＲ−グラフ トしたちのでる。

アルファインターフェロンと結合し得るアルファインターフェロン受容体ポリペ プチドもアルファインターフェロン拮抗物質として有用である。これらは実質上 、アルファインターフェロン中和抗体と同様の方法で用いることができる。好ま しくは、そのような受容体ポリペプチドは、これまでに治療目的で開発された他 の受容体と同じ方法で、実質上、ＥＰ　ｔｏ　３１４，３１７．　ｔｏ　９１１ ０８２９８．１０９０１０６９５３に記載のように、トランスメンブラン領域の 欠失または不活化、および、所望により、受容体タンパク質のトランスメンブラ ンおよび細胞質領域を長い半減期を有するポリペプチドで置換することにより、 修飾される。

本発明で用いる他のクラスの拮抗物質にはインビボで組織内アルファインターフ ェロンの発現をダウンレギュレートする物質が含まれる。

さらに他のクラスの拮抗物質には、デルカイアら［Ｄｅｌｃａｙｒｅ　ｅｔ　ａ ｌ、　ＥＭＢＯＪａｕｎａｌ　１０：９１９−９２６　（１９９１）コが記載し たものがある。Ｄｅｌｃａｙｒｅらは、エプスタインバーウィルス／補体Ｃ３ｄ 受容体が１つのアルファインターフェロン受容体であり、Ｒａ　ｊ　ｉ細胞に結 合するアルファインターフェロンが抗ＣＲ２抗体により、ＣＲ２結合モチーフを 有するペプチドにより、および部分的にはＣ３ｂ１／Ｃ３ｄにより、阻害される ことを開示した。即ち、ＣＲ２受容体またはそのインターフェロン結合モチーフ を含有するポリペプチドは、先端切除または免疫グロブリン定常領域との融合の ような変異体形での使用をも含めて、上記のインターフェロン受容体ポリペプチ ドと同様に用いることができる。Ｃ１４結合部位配列を含有するポリペプチドも アルファインターフェロンの競合的拮抗物質として用いることができる。

他の拮抗物質には天然のインターフェロンと競合するがインターフェロンの生物 学的活性を殆どまたは全く持たないアルファインターフェロンのアミノ酸配列変 異体のフラグメントが含まれる。１つの例は、Ｄｅｌｃａｙｒｅら（前掲）が記 載した９２−９９モチーフポリペプチドｐＩＦＮａｌｐｈａである。

上記は適当な拮抗物質と考えられる物質の例にすぎない。将来、他の拮抗物質が 開発されることが理解され、本発明は、それらをＩＤＤＭに治療に用いることを 想定している。

同一クラスまたは異なるクラスからの、各拮抗物質の１．２またはそれ以上を使 用することも本発明の範囲内である。さらに、拮抗物質はアゾチオプリン、ツク ロスポリンのような免疫抑制剤、およびインスリンのようなＩＤＤＭのための他 の治療剤と一緒に投与することができる。

拮抗物質は外因性供給源を介して投与するか、それ自体で生成することで与える 。後者の場合、対象を内因性アルファインターフェロンまたはその受容体に対し て免疫することにより拮抗物質抗体を生成させる。これはインターフェロンまた はその受容体と高度に免疫原性のタンパク質とを結合（コンジュゲート）させ、 アジュバント（ＴＮＦなどの）および担体と一緒に皮下投与することによって、 最もうまく行うことができる。しかしながら、外因性拮抗物質によってＩＤＤＭ を治療することが好ましい。

もちろん、各拮抗物質の医薬組成物は選択した拮抗物質の化学的および物理的性 質に依存する。結局、拮抗物質は製剤的に許容される無菌組成物、即ち、等張性 組成物、に製剤化され、純度は、少なくとも、タンパク質重量の９５％である。

糖アルコールや非活性タンパク質（例えばアルブミン）のような代表的な賦形剤 を凍結乾燥組成物に用いる。抗酸化剤やキレート化剤のような安定化剤も必要に 応じて含有させる。拮抗物質は、気密的にシールした容器に入れ、通常、注射針 を到達させることができるように、弾力性のある栓で密封する。

拮抗物質の治療有効量は患者の症状、拮抗物質の競合能力、その循環液中での半 減期、および通常の医者によって決定される他のパラメーターにに依存するであ ろう。患者の実質上、すべての内因性循環内アルファインターフェロンおよび細 胞表面アルファインターフェロンンを押えるに十分な計算量のアルファインター フェロンまたは可溶性受容体に対する抗体を投与する。これは、一般に抗受容体 抗体に関して用いられている用量よりも多いが、おそらくアルファインターフェ ロン競合阻害剤に関して必要な量よりも少ないであろう。

拮抗物質で治療されるべき患者は症状発現前のＩＤＤＭ患者または最近ＩＤＤＭ を発病した患者である。患者の高細胞がもはや生存しない状態になる時まで、患 者は本発明の治療法の候補者である。ＩＤＤＭ発現のできるだけ早期に拮抗物質 を投与し、高細胞の保存に必要な長さの期間、治療を継続することが望ましい。

インスリンを監視することによって、適切な島応答および島壊死の減少、および 他の指標（例えば、抗インスリンおよび抗島抗体）が示されるまで、患者を治療 し、その後の期間、試みに拮抗物質治療を停止するが、その期間中、患者のイン スリン応答および抗島抗体を、再発に関して監視する。

静脈内、腹腔内、皮下、肺内、経鼻的などの常法により、拮抗物質を患者に投与 する。好ましくは、静脈内連続注射により投与する。

国際調査報告　ＤｒＴ／ＩＩ（Ｑ）ｌＩ’１７ｎＱＩＩ

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．少なくともインスリン分泌能力が残存しているベータ島細胞を有する患害に おけるインスリン依存性糖尿病の治療または予防のための方法であって、患者に 治療有効量のアルファインターフェロン拮抗物質を投与することを含む方法。
2. ２．拮抗物質が、アルファインターフェロン受容体ポリペプチドと結合し得る抗 体である請求項１の方法。
3. ３．拮抗物質が、アルファインターフェロンと結合し、その生物学的活性を中和 し得る抗体である請求項１の方法。
4. ４．拮抗物質が、アルファインターフェロン受容体ポリペプチドである請求項１ の方法。
5. ５．アルファインターフェロンが、ＩＦＮ−アルファＫ、ＩＦＮ−アルファ５、 ＩＦＮ−アルファＡ（ＩＦＮ−アルファ２）、ＩＦＮ−アルファＤ（ＩＦＮ−ア ルファ１）、ＩＦＮ−アルファＨ１、ＩＦＮ−アルファＢ２、ＩＦＮ−アルファ Ｂ、ＩＦＮ−アルファ４ｂ、ＩＦＮ−アルファＣ、ＩＦＮ−アルファＬ、ＩＦＮ −アルファＪ１、ＩＦＮ−アルファＪ２、ＩＦＮ−アルファ１、ＩＦＮ−アルフ ァＦ、ＩＦＮ−アルファＷＡ、ＩＦＮ−アルファＧｘ１、ＩＦＮ−アルファ７６ 、ＩＦＮ−アルファ８８およびそのアレルからなる群から選択されるものである 請求項３の方法。
6. ６．抗体が、１またはそれ以上のインターフェロンと結合し中和することができ るものである請求項５の方法。
7. ７．生物学的活性が、抗増殖活性および抗ウイルス活性から選択されるものであ る請求項３の方法。
8. ８．抗体が、真核性細胞によって合成されたアルファインターフェロンと結合し 中和することができるが、実質上、組換え細菌細胞培養で合放された同じサプク ラスのアルファインターフェロンを中和することかできないものである請求項３ の方法。
9. ９．アルファインターフェロンが、クラス１アルファインターフェロンである請 求項３の方法。
10. １０．アルファインターフェロンが、クラスＩＩアルファインターフェロンであ る請求項３の方法。
11. １１．拮抗物質が、リバウンド期間中に患者に投与される請求項１の方法。
12. １２．拮抗物質が、インスリン依存症の発現前に患者に投与される請求項１の方 法。
13. １３．アルファインターフェロン拮抗物質の製剤的に許容し得る製剤を含有する インスリン依存性糖尿病の治療または予防のための組成物。
14. １４．拮抗物質が、アルファインターフェロン受容体ポリペプチドと結合し得る 抗体である請求項１３の組成物。
15. １５．製剤が無菌性および等張性である請求項１３の組成物。
16. １６．弾力性エレメントで栓をした気密的にシールした容器内にある請求項１６ の組成物。
17. １７．拮抗物質が、実質上、ヒト抗体配列からなる抗体である請求項１３の組成 物。
18. １８．拮抗物質が、少なくとも１個の、ヒトアルファインターフェロンを中和し 得る非ヒト抗体のＣＤＲ残基を含有する抗体であり、抗体の他の部分がヒト抗体 配列である請求項１７の組成物。
19. １９．拮抗物質が、実質上、ヒトにおいて非免疫原性の抗体である請求項１３の 組成物。
20. ２０．抗体が、受容体と交差結合し得ないものである請求項１４の組成物。