CN102083859A

CN102083859A - 人源化抗人干扰素-α抗体

Info

Publication number: CN102083859A
Application number: CN2009801164966A
Authority: CN
Inventors: L·A·斯文森; S·帕德克杰尔; B·弗莱德里施森; B·奥尔森克罗格; I·路德佩德森; J·菲勒克纳
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Co immunization company
Priority date: 2008-05-07
Filing date: 2009-05-06
Publication date: 2011-06-01
Anticipated expiration: 2029-05-06
Also published as: TWI453032B; CN102083859B; CA2722622C; US20130101602A1; RU2010150105A; WO2009135861A2; US8163885B2; BRPI0912570B8; EP2279207B1; BRPI0912570A2; IL208979B; JP2011519571A; EP2279207A2; RU2532832C2; ZA201008748B; HK1154251A1; US8658771B2; US20110213125A1; US8361463B2; AU2009245792A1

Abstract

本发明提供可用于人类治疗应用的人源化抗人IFN-α单克隆抗体。优选的抗体是鼠抗体ACO-1和ACO-2的人源化形式及其变体。

Description

人源化抗人干扰素-α抗体

技术领域

本发明涉及抗人干扰素α(IFN-α)的人源化抗体及其在治疗或预防人类患者的多种疾病和紊乱中的应用。

背景技术

基于许多不同的研究，干扰素α(IFN-α)是据信与大量自身免疫病有关的细胞因子。尽管系统性红斑狼疮(SLE)患者通常没有可检测到的血清IFN-α水平，他们似乎具有清楚的IFN-α基因标签。另外，通过用SLE患者血清处理DC诱导树突细胞(DC)成熟可以被抗-IFN-α抗体抑制。也已证明具有SLE表型的新西兰黑(NZB)鼠中IFN-α/β受体的敲除导致接近正常的表型(Santiago-Raber等人.，J Exp Med.2003；197(6)777-88)。

因此提示抗IFN-α抗体可以作为中和该细胞因子的活性的工具，单独或联合地用于治疗这些自身免疫病。识别宽范围的不同IFN-α亚型的特异性鼠抗体(ACO-1至ACO-6)如作为WO20060086586公布的国际专利申请所述产生和表征。但是，鼠抗体不适合用于人类，因为它们具有免疫原性，因此希望产生其中将鼠CDR移植到人支架抗体上的人源化抗体。但是，人源化抗体与鼠亲本抗体相比通常具有功能缺陷，例如，较低的亲和力和/或稳定性和/或不希望的免疫原性。人源化抗体的这些缺陷在有些情况下可能通过进行一个或几个回复点突变来补偿。通常希望不进行或只进行极少的回复点突变，因为太多回复突变的百分比倾向于导致不希望的低稳定性和/或不希望的程度的免疫原性。因此希望提供具有希望的生物学性质如保持人源化抗-IFN-α抗体对大量IFN-α亚型的亲和力和效价的安全且稳定的人源化抗-IFN-α抗体。

因此本领域需要在例如稳定性、特异性、安全性、免疫原性等特征方面具有理想的特征的人源化抗-IFN-α抗体。此外，本领域也需要有效的生产这样的抗体的方法。

发明内容

第一方面，本发明涉及特异性结合人干扰素-α(IFN-α)的人源化抗体或其抗原结合片段，该人源化抗体是鼠抗体ACO-1或ACO-2或其组合的人源化形式，包含比根据Kabat的鼠互补决定区(CDR)更少的供体氨基酸残基。

另一方面，本发明进一步涉及特异性结合IFN-α的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体能够结合IFN-α亚型A、2、B2、C、F、G、H2、I、J1、K、4a、4b和WA，但不结合亚型1或D，并且其中所述抗体包含比根据Kabat的非人CDR更少的供体氨基酸残基。

本发明进一步涉及获得这样的抗体的方法以及这样的抗体在治疗目的方面的应用和包含这样的抗体的组合物。

本发明的抗体可能适用于治疗各种炎性疾病。

附图说明

图1显示显示用于人源化(hz＝人源化的)的鼠ACO-1VH(A)和VL(B)序列的分析，其中遮罩(mask)以阴影文本显示，Kabat CDR以粗体显示，小鼠序列与人种系序列的差异以下划线文本显示，潜在的体细胞超突变残基以下划线粗体文本显示，潜在的回复突变残基以阴影下划线文本显示。ACO-1VH＝SEQ ID NO：1；人种系VH1_46/JH4＝SEQ IDNO：2；hzACO-1VH＝SEQ ID NO：3；ACO-1VL＝SEQ ID NO：4；人种系VKIII_L6/JK2＝SEQ ID NO：5；hzACO-1VL＝SEQ ID NO：6。

图2显示ACO-1和ACO-2VH(A)和VL(B)序列之间的比对，以及相应的小鼠种系序列。ACO-2VH＝SEQ ID NO：7；小鼠种系J558.33/D_/JH3_1＝SEQ ID NO：8；ACO-2VL＝SEQ ID NO：9；小鼠种系ae4/JK4_1＝SEQ ID NO：10。

图3显示为引入hzACO-1内而选择的ACO-2残基的位置。

图4显示在CPE试验中除对IFN-αD和IFN-α1以外，hzACO-1对检测的所有干扰素亚型的保护效果的抑制。

图5显示通过报道基因(RG)分析，hzACO-1对12个IFN-α种的抑制。将每个抗体浓度值标准化，并计算4次重复的平均值。数据表示为平均值+/-标准误差。采用Prism软件计算最佳拟合S形反应曲线。所有数据集的R2值均高于0.98(除了未进行曲线拟合的IFN-αD以外)。

图6显示使用IFN-αA(A)或IFN-αF(B)，hzACO-1与具有ACO-2-衍生突变A93V的hzACO-1变体的RG分析比较。数据计算如图5所述进行。

图7显示在不含添加剂的情况下，hzACO-1和变体在pH 3.5(A)、4.5(B)和5.5(C)时的转变温度。

图8显示通过X-射线结晶学确定的与IFN-α8结合的hzACO-1Fab片段链(H，L)的结构。

图9显示对于IFNAR1和IFNAR2的IFN-α8结合表位(Quadt-Akabayov S.R.等人.Protein Sci.15，2656-2668，2006和RoismanL.C等人.J.Mol.Biol.353，271-281，2005)，如IFN-α8序列下方的彩色方框所示。灰色方框所示的残基在所有IFN-α亚型之间部分保守，而黑色方框所示的残基完全保守。采用4

距离截值，IFN-α8上的hzACO-1结合表位以IFN-α8氨基酸序列上方的“*”表示。

图10显示小鼠ACO-1mAb与hzACO-1及其两种变体在RG分析中的比较。一种变体是携带完整CDRH2的人源化ACO-1(命名为hzACO-1-kabat CDRH2)，而hzACO-1如实施例2所述用较短的CDRH2构建。另外，该图显示另外一种为与IFN-αs(hzACO-1Y32E，T30R)相互作用而通过合理的设计优化的突变hzACO-1。如图所示，在抑制5种不同的代表性IFN-α亚型方面比较这四种重组mAb变体。

图11显示以人IgG1、IgG2和IgG4同种型表达的hzACO-1的蛋白质稳定性研究。在组氨酸缓冲液中孵育5周后通过HPLC测定聚集。

图12显示⁵¹Cr释放试验，说明hzACO-1IgG4、IFN-α及其不同组合在不同效应细胞∶靶细胞比值(E∶T)下缺乏ADCC。细胞+单独的PBMC而没有IFN-αpr hzACO-1确定背景裂解，而Triton-X 100显示了最大裂解。包括Rituxan作为阳性对照，其在所有E∶T比时均诱导可检测的细胞裂解。

图13显示通过ELISA进行的补体结合研究。表达为IgG4的hzACO-1当结合到IFN-α时不能固定补体。作为阳性对照，hzACO-1与抗-IgG4pAb交叉结合，并且检测到清楚的C4与抗-IgG4的剂量依赖性结合。

发明详述

本发明部分基于具有适合治疗人类患者的性质的抗-IFN-α抗体，所述患者患有IFN-α-相关病症或疾病，例如，狼疮疾病或紊乱，例如，SLE；移植物抗宿主病；1型糖尿病，AIDS，自身免疫性甲状腺炎，牛皮癣，幼年型皮肌炎和舍格伦综合征。这些抗体一般基于鼠ACO-1和/或ACO-2抗体的人源化形式。

已经确定ACO-1和ACO-2能够阻断13种重组IFN-α亚型以及病毒感染后产生的2种IFN-复杂混合物的生物活性(参见WO2006086586)。ACO-1和ACO-2也一致地阻断来自经微阵列分析确定为表现出IFN-α特征的SLE患者的血清的生物活性。ACO-1和ACO-2不明显中和IFN-α蛋白质亚型D和1的生物活性，但是中和SLE血清的IFN-α生物活性。尽管不限于理论，因此可能亚型D和1与SLE的病因学无明显相关性。

如实施例所述，可变区的结构模建揭示了可以使用比Kabat CDR更少的供体(鼠)残基对ACO-1和ACO-2进行人源化，从而进一步降低了人类患者中不利免疫应答的风险。该分析也确定了回复突变的有利位点。进一步发现，可能是由于ACO-1和ACO-2可变区之间的高序列相似性(仅有13个位点不同)，人源化ACO-1(hzACO-1)序列中的某些氨基酸残基可以在相应的位置被ACO-2残基代替。在CDR区内，可以在不使该抗体序列少于人类的情况下正常地进行突变。这种人源化程序导致人源化抗体具有提高的功能性质，如亲和力、稳定性、表达水平和IFN-α-抑制活性。

在人源化ACO-1抗体中，hzACO-1VH(SEQ ID NO：3)中示例性的突变包括V5Q、T28S、M69L、R71V、T73K、S76I、S76N、T77I、V78A、Y79F和A93V及其任意组合，采用Kabat编号。hzACO-1VL(SEQ IDNO：6)中的示例性的突变包括E1Q、D29G、L33F、L47W、S50G、I58V和F71Y及其任意组合。在一个实施方案中，hzACO-1VH区包含选自T28S、N31S和A93V的突变。在另一实施方案中，hzACO-1VH区包含选自T28S、N31S和A93V的突变，及其任意组合，例如，T28S和N31S、T28S和A93V，以及N31S和A93V。在另一实施方案中，hzACO-1VH区包含选自T28S、N31S和A93V的突变，或其组合，例如，T28S和N31S、T28S和A93V，或N31S和A93V；以及至少一个额外的突变。

定义

为了更好地理解本发明，正面定义了许多术语。

“ACO-1和ACO-2抗体”在WO20060086586中表征和描述。ACO-1以ATCC登录号PTA-6557(WO2006086586)保藏，ACO-2以ATCC登录号PTA-7778(WO2008021976)保藏。本发明的抗体是ACO-1和ACO-2的人源化变体。但是，本发明的ACO-1和ACO-2的人源化形式不包含全长鼠Kabat序列。在优选的实施方案中，至少一个CDR序列包含大约3-10个氨基酸、优选3-8个、更优选4-7个氨基酸的截短。该抗体优选地在CDR H2中包含截短，所述CDR H2优选地截短3-10个，优选3-8个，更优选4-7个，最优选6个氨基酸。此外，确定偶然的点突变可引入一个或多个CDR序列以及人支架抗体内。然而，术语“ACO-1和ACO-2抗体”还可包括任何能够结合IFN-α亚型A、2、B2、C、F、G、H2、I、J1、K、4a、4b和WA但不结合亚型1或D的IFN-α抗体。但是应当理解，ACO-1和ACO-2因此可以视为只是一种抗体，因为其CDR序列的差异只有几个氨基酸。似乎ACO-1和ACO-2代表同一抗体的体内体细胞超突变的两个阶段。本发明的ACO-1/ACO-2抗体因此是包含CDR序列的人源化抗体，该CDR序列具有与ACO-1和ACO-2的CDR序列至少90％的同一性，更优选为至少92％，最优选为至少95％。

术语“CDR截短”、“正向突变”和“CDR的缩短”在整个文件中可以互换使用。对于本发明，这些术语通常是指CDR-截短可以视为一行大量正向突变的事实——意味着缩短的鼠CDR片段可以移植到人构架上。较短CDR的移植倾向于产生免疫原性程度降低的抗体并不令人惊讶，实际上令人惊讶的是人源化抗体的其它有利特征可以得到保留，例如稳定性、特异性等。“回复突变”总是指构架中的突变(即，不是在CDR中)，回复突变一般是在选择的位点引入一个或多个“鼠”氨基酸残基，例如为了稳定化抗体结构。

此处使用的术语“干扰素α”(IFN-α)是指包括先天免疫性的一些主要效应物的蛋白质家族。人IFN-α有至少15个已知的亚型。IFN-α蛋白质亚型的名称和相应的编码基因列于下面的表1中。

表1IFN-α蛋白质亚型和基因

IFN-α蛋白质亚型	相应的IFN-α基因
		A	2a
2	2b
		B2	8
C	10
		D(Val¹¹⁴)	1
F	21
		G	5
H2	14
		I	17
J1	7
		K	6
4a	4a
		4b	4b

WA	16
		1(Ala¹¹⁴)	1

参见Pestka等人.(1997)″Interferon Standardization amd Designations″J Interferon Cytokine Res 17：Supplement 1，S9-S 14。IFN-αB2有时也被称为IFN-αB，并且不与IFN-β混淆。来自白细胞的天然IFN-α(白细胞IFN-)以及重组人IFN-α蛋白质亚型可从PBL Biomedical Labs，Pis-cataway，NJ(interferonsource.com)获得。天然IFN-α是IFN-α亚型的复杂混合物。检测和定量这些干扰素的方法，如ELISA和RIA，是本领域已知的。

术语“抗体”在此以最广的含义使用，特别包括全长单克隆抗体、多克隆抗体，并且除非上下文有不同的说明或者表示，还包括其抗原结合片段、抗体变体和多特异性分子，只要它们表现出希望的生物活性。通常，全长抗体是包含通过二硫键互联的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白或其抗原结合部分。每条重链由重链可变区(在此缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(在此缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步再分为超变区，命名为互补决定区(CDR)，散布有更保守的区域，称为构架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端向羧基末端的排列顺序如下：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。

抗体的“抗原结合片段”是包含全长抗体的一部分的分子，它能够可检测地结合抗原。抗原结合片段包括包含抗体的1、2、3个或更多抗原结合部分的多价分子，和单链构建体，其中VL和VH区或其选择的部分通过合成连接体或通过重组方法连接，以形成功能性的抗原结合分子。

术语“抗体衍生物”和“免疫偶联物”在此可互换使用，用来表示包含全长抗体或其抗原结合片段的分子，其中一个或多个氨基酸被化学修饰，例如，通过烷基化、PEG化、酰化、酯形成或酰胺形成等，例如，用于将抗体连接到第二分子上。示例性的修饰包括PEG化、半胱氨酸-PEG化、生物素化、放射性标记、和与第二试剂如可检测的试剂或细胞毒性剂偶联。

“多特异性分子”包括抗体或其抗原结合片段，其结合或连接到至少一个其它功能性分子(例如另一个肽或蛋白质，如另一个抗体或受体的配体)，以产生结合至少两个不同结合位点或靶分子的分子。示例性的多特异性分子包括双特异性抗体和连接到可溶性受体片段或配体上的抗体。

“人源化”抗体是含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列(CDR区)的人/非人嵌合抗体。人源化抗体因此是人免疫球蛋白(接受体抗体)，其中来自接受体的超变区的残基被替换为来自非人物种(供体抗体)的超变区的残基，如具有希望的特异性、亲和力和能力的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物。在某些情况中，人免疫球蛋白的FR残基被替换为相应的非人残基。此外，人源化抗体可包含在接受体抗体或供体抗体中未曾发现的残基。进行这些修饰的目的是进一步改善抗体的性能。通常，人源化抗体包含至少一个、一般两个可变域中的基本上全部，其中全部或基本上全部超变环对应于非人免疫球蛋白的超变环，全部或基本上全部FR残基是人免疫球蛋白序列的FR残基。人源化抗体任选地也可包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，一般是人免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分。

术语“超变区”在此使用时是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。超变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(轻链可变域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)和重链可变域中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；(Kabat等人.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242)和/或来自“超变环”的残基(轻链可变域中的残基26-32(L1)\、50-52(L2)和91-96(L3)和重链可变域中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol 1987；196：901-917)。典型地，该区中氨基酸残基的编号按照Kabat等人(同上)所述的方法进行。诸如“Kabat位置”、“Kabat残基”和“根据Kabat”等用语在此是指用于重链可变域或轻链可变域的该编号系统。采用Kabat编号系统，肽的实际线性氨基酸序列可含有较少的或额外的氨基酸，对应于可变域的FR或CDR的缩短或插入。例如，重链可变域在CDR H2的残基52之后可包括氨基酸插入(根据Kabat的残基52a、52b和52c)以及在重链FR残基82后插入残基(例如根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。可以通过抗体序列与“标准”Kabat编号序列的同源区比对来确定给定抗体的残基的Kabat编号。

“构架区”或“FR”残基是除此处定义的CDR以外的VH或VL残基。

在两个基本相同的氨基酸序列中的“相应的”氨基酸位置是通过此处提到的任何蛋白质分析软件比对的氨基酸位置，一般使用缺省参数。

“分离的”分子是相对于它所属的分子类别作为组合物中的优势物质存在的分子(即，它构成组合物中该分子类型的至少大约50％，一般构成组合物中的分子种类例如肽的至少大约70％，至少大约80％，至少大约85％，至少大约90％，至少大约95％，或更多)。通常，对于组合物中存在的所有肽种类中的抗体分子，或者至少相对于预期应用的基本活性肽种类，抗体分子的组合物显示98％、98％或99％的均一性。

在此使用的术语“选择性中和”是指分离的和纯化的抗体(例如，但不限于单克隆抗体)或其抗原结合片段，其选择性中和一个或多个IFN-α蛋白质亚型的至少大约40％、至少大约50％或至少大约60％的生物活性，但是不显著中和另一IFN-α蛋白质亚型的至少一个生物活性，其中该生物活性可以是，例如，MxA启动子的激活和/或抗病毒活性。

在本发明的上下文中，“治疗”是指预防、缓解、控制、治愈或减轻疾病或紊乱的一个或多个症状或临床相关的表现，除非同上下文抵触。例如，对没有疾病或紊乱的症状或临床相关表现的患者的“治疗”已经被确定为预防性的治疗，而对已经确定具有疾病或紊乱的症状或临床相关表现的患者的“治疗”通常不构成预防性治疗。

在此使用的用语“IFN-α-相关病症或疾病”是指已经与患者血清中的IFN-α水平升高相关联的异常状况、疾病或临床前疾病状态。其实例包括但不限于狼疮疾病或紊乱，如SLE、移植物抗宿主病(GVHD)、1型糖尿病、AIDS(由人免疫缺陷病毒(HIV)引起)、自身免疫性甲状腺炎和牛皮癣。测定IFNα水平的方法是本领域已知的。

人源化抗-IFN-α抗体

本发明的抗体是抗-IFN-α小鼠抗体ACO-1或ACO-2的人源化形式、其变体和/或其抗原结合片段，其特征在于特定功能和/或结构特征或性质。重组抗体可以通过标准技术在合适的宿主细胞系中产生，并且利用多种试验来表征，以评估其功能活性，如下所述。实际上，结果可以产生本发明的IFN-α抗体，与以传统方式人源化的IFN-α抗体相比，其具有明显提高的产率。

按照所谓的“最佳适配”法，针对已知人可变域序列的文库或人种系序列文库筛查啮齿动物抗体的可变域的序列。然后可以接受最接近啮齿动物的人序列作为用于人源化抗体的人构架区(Sims等人.，J.Immunol.1993；151：2296及以下；Chothia等人，Chothia和Lesk，J.Mol.Biol 1987；196：901-917)。另外一种方法采用来源于轻链或重链特定亚组的所有人抗体的共有序列的特定构架区。相同的构架可以用于几种不同的人源化抗体。

用于本发明抗体的优选的构架序列是结构上类似于ACO-1或ACO-2所用的构架序列的那些序列。因此，在一个实施方案中，本发明提供人源化ACO-1或ACO-2抗体，其包含来源于人VH1_46基因和人JH4基因的VH构架残基和来源于人VKIII_L6基因和人JK2基因的VL构架残基，并且特异性结合人IFN-α。

下面的实施例1描述了包含这样的构架序列的示例性人源化ACO-1抗体hzACO-1的设计。

功能性质

本发明的人源化抗体特异性结合IFN-α亚型A、2、B2、C、F、G、H2、I、J1、K、4a、4b和WA(表2)。在一个实施方案中，本发明的人源化ACO-1或ACO-2抗体以高亲和力结合IFN-α蛋白质亚型如IFN-αA，例如KD为大约10^-7M或更低，KD为大约10^-8M或更低，KD为大约5x10^-9M或更低，或KD为大约2x10^-9M或更低。在一个实施方案中，人源化抗体是以相当于或高于hzACO-1的亲和力结合IFN-αA、IFN-αF和/或另一种IFN-α蛋白质亚型的hzACO-1变体。

表2.hzACO-1对于一系列人IFN-α亚型的动力学参数

样品	ka(1/Ms)	kd(1/s)	KD(M)
				hIFN-αA	2.97E+05	3.94E-04	1.33E-09
hIFN-α1	不结合	-	-
				hIFN-α2	3.58E+05	3.51E-04	9.81E-10
hIFN-α4b	3.74E+05	6.22E-04	1.67E-09
				hIFN-αG	4.63E+05	4.26E-04	9.20E-10
hIFN-αH2	3.78E+05	1.21E-03	3.21E-09
				hIFN-αI	7.23E+05	2.03E-03	2.81E-09

hIFN-αJ1	6.81E+05	3.27E-03	4.81E-09
				hIFN-αWA	7.09E+05	2.91E-03	4.10E-09
hIFN-α4a	3.33E+04	1.15E-04	3.45E-09
				hIFN-αC	7.19E+05	7.53E-04	1.05E-09
hIFN-αK	5.74E+05	8.27E-04	1.44E-09

例如，hzACO-1变体的KD和hzACO-1的KD与IFN-αA蛋白质亚型之间的比值可以是大约1.0，大约0.8，大约0.7或大约0.6。在另一实施方案中，人源化抗体是hzACO-1变体，它以相当于或高于重组产生的ACO-1的亲和力结合IFN-αA、IFN-αF和/或另一IFN-α蛋白质亚型。在另一实施方案中，人源化抗体是hzACO-1变体，它以相当于或高于杂交瘤产生的ACO-1的亲和力结合IFN-αA、IFN-αF和/或另一IFN-α蛋白质亚型。

此外，本发明的人源化抗体能够选择性中和一个或多个IFN-α蛋白质亚型的生物活性。例如，与对照相比，人源化ACO-1或ACO-2变体能够选择性中和IFN-α蛋白质亚型A、2、B2、C、F、G、H2、I、J1、K、4a、4b或WA或其任意组合的至少大约40％、至少大约50％或至少大约60％的生物活性。在一个特定实施方案中，人源化抗体不显著中和IFN-α亚型D和/或1的生物活性。示例性的生物活性包括但不限于MxA启动子的激活、抗病毒活性或两者。人源化抗体中和这种IFN-α生物活性的能力可以利用例如此处所述的报道基因(RG)细胞病变抑制(CPE)分析来评估。在一个实施方案中，人源化抗体是在RG分析中其IC50相当于或低于hzACO-1的IC50的hzACO-1变体。在一个具体实施方案中，hzACO-1变体具有在RG分析中低于hzACO-1的IC50。

在一个实施方案中，本发明的人源化抗体竞争和/或结合IFN-α蛋白质亚型上与ACO-1和/或ACO-2所竞争和/或结合的相同的表位。这样的抗体可以根据它们在此处所述的标准IFN-α结合试验中与ACO-1和/或ACO-2交叉竞争的能力来鉴定。测试人源化抗体抑制ACO-1或ACO-2与一种或多种IFN-α蛋白质亚型结合的能力证明了该测试抗体能够与ACO-1或ACO-2竞争结合IFN-α，因此能够结合IFN-α蛋白质亚型上与ACO-1和/或ACO-2所结合的相同的表位(WO02066649和WO2005059106)。在一个具体实施方案中，该人源化抗体与鼠单克隆抗体9F3和MMHA-1、-2、-3、-6、-8、-9、-11、-13和-17(PBL Biomedical Laboratories，NJ，USA)和/或人单克隆抗体13H5、13H7和7H9中的任一种结合不同的人IFN-α表位，和/或与ACO-1或ACO-2的交叉竞争强于与一种或多种列出的鼠和人单克隆抗体的交叉竞争。

在一个实施方案中，本发明提供的hzACO-1、hzACO-2、hzACO-1变体或hzACO-2变体的免疫原性相当于或低于包含根据Kabat的鼠CDR的人源化ACO-1或ACO-2抗体(Kabat ACO-1)的免疫原性。人源化抗体的免疫原性可以通过例如Wadwha等人.，Dev Biol(Basel).2005；122：155-70)所述的一种或多种方法来评估，该文献通过参考全文并入本文。

另一方面，本发明的人源化抗体在适合对人类患者给药的制剂中是稳定的。在一个实施方案中，本发明的人源化ACO-1或ACO-2抗体至少与以传统方法人源化的包含全长鼠Kabat序列的IFN-α抗体一样稳定。抗体的稳定性可以利用本领域已知的方法来评估，包括实施例11所述的thermaflour分析。

本发明优选的人源化抗体表现出至少一个、更优选两个、三个、四个、五个或更多以下性质：(a)特异性结合IFN-α亚型A、2、B2、C、F、G、H2、I、J1、K、4a、4b和WA；(b)选择性中和IFN-α蛋白质亚型A、2、B2、C、F、G、H2、I、J1、K、4a、4b或WA的一种或多种生物活性；其任意组合，或其全部；(c)不显著中和IFN-α1或D的生物活性；(d)竞争和/或结合IFN-α蛋白质亚型上与ACO-1和/或ACO-2所竞争和/或结合的相同的表位；(e)与ACO-1或ACO-2的竞争强于与9F3、13H5、13H7和7H9中的任一种的竞争；(f)引发免疫应答的可能性低于包含根据Kabat的鼠CDR的hzACO-1或hzACO-2抗体；(g)在药物制剂中稳定；和(h)以10-8M或更低的KD结合IFN-α蛋白质亚型A、2、B2、C、F、G、H2、I、J1、K、4a、4b或WA中的至少一个。

结构性质

本发明优选的抗体是鼠单克隆抗体ACO-1和ACO-2的人源化形式。这样的抗体可以如实施例所述产生、分离和表征结构及功能。ACO-1、hzACO-1和ACO-2的全长、可变区和Kabat CDR序列在表3中列出并且在图1-3中示出。

表3引物、蛋白质和抗体的序列编号

抗体部分	序列组成	序列	SEQ IDNO：
				ACO-1VH	蛋白质	1
VH1_46/JH4	蛋白质		2
				hzACO-1VH	蛋白质	3
ACO-1VL	蛋白质		4
				VKIII_L6/JK2	蛋白质	5
hzACO-1VL	蛋白质		6
				ACO-2VH	蛋白质	7
J558.33/D_/JH3_1	蛋白质		8
				ACO-2VL	蛋白质	9
ae4/JK4_1	蛋白质		10

PCR引物ACO-1克隆	DNA		11
				PCR引物ACO-1克隆	DNA		12
ACO-1VH	DNA		13
				ACO-1VL	DNA		14
ACO-1CDR_H1	蛋白质	NYWMH	15
				ACO-1CDR_H2	蛋白质	EINPSHGRTIYNENFKS	16
ACO-1CDR_H3	蛋白质	GGLGPAWFAY	17
				ACO-1CDR_L1	蛋白质	SAGSSVDSSYLY	18
ACO-1CDR_L2	蛋白质	STSNLAS	19
				ACO-1CDR_L3	蛋白质	HQWSSYPFT	20
hzACO-1CDR_H2	蛋白质	EINPSHGRTIYAQKFQG	21
				ACO-2CDR_H1	蛋白质	SYWMH	22
ACO-2CDR_H2	蛋白质	EINPSHGRTSYNENFKS	23
				ACO-2CDR_L1	蛋白质	SAGSSVGSSYFY	24
ACO-2CDR_L2	蛋白质	GTSNLAS	25
				PCR引物ACO-2克隆	DNA		26
PCR引物ACO-2克隆	DNA		27
				ACO-2VH	DNA		28
ACO-2VL	DNA		29
				hlFN-α8	蛋白质		30
hzACO-1Fab HC	蛋白质		31

hzACO-1LC

蛋白质

32

hzACO-1CDR H1、H3、L1、L2和L3的序列与相应的ACO-1序列相同。ACO-2CDR H3和L3与相应的ACO-1CDR序列相同。在hzACO-1CDR_H2序列中以斜体显示的氨基酸对应于人构架序列-在传统人源化的抗体中，全长Kabat序列对应于ACO-1CDR_H2序列，其中所有氨基酸都来源于鼠抗体。

一方面，本发明提供鼠ACO-1和ACO-2抗体的人源化形式，其具有比Kabat CDR更少的供体残基，即比通过移植kabat CDR产生的人源化ACO-1或ACO-2抗体更少的鼠残基。

在一个实施方案中，人源化抗体特异性结合人IFN-α并且是鼠抗体ACO-1或ACO-2或其组合的人源化形式，包含比根据Kabat的鼠互补决定区(CDRs)更少的供体氨基酸残基。CDR H2序列可以例如包含比对应于Kabat残基50-65、50-64、50-63、50-62、50-61或50-60的序列更少的供体氨基酸残基。CDR H2供体残基可以包含Kabat残基50-59。另外或可替代地，CDR H2供体氨基酸残基可以由Kabat残基50-59组成。Kabat残基50-59对应于SEQ ID NOS：16、21和23的残基1-11。在一个实施方案中，其余的VH CDR可包含或由Kabat CDR组成(见图1-3)，即，包含对应于Kabat残基31-35的供体氨基酸残基的CDR H1序列，和包含对应于Kabat残基95-102的供体氨基酸残基的CDR H3序列。

在一个实施方案中，人源化ACO-1或ACO-2抗体可包含CDR L1、CDR L2和CDR L3，该CDR L1包含对应于ACO-1轻链(VL)可变区的Kabat残基24-34的供体氨基酸残基，CDR L2包含对应于ACO-1VL区的Kabat残基50-56的供体氨基酸残基，CDR L3包含对应于ACO-1VL区(SEQ ID NO：4)或ACO-2VL区(SEQ ID NO：9)区的Kabat残基89-97的供体氨基酸残基。另外或者可替代地，该抗体可包含由Kabat残基24-34组成的CDR L1供体氨基酸残基、由Kabat残基50-56组成的CDRL2供体氨基酸残基、和由Kabat残基89-97组成的CDR L3供体氨基酸残基。相应的氨基酸序列在表3中示出。

一方面，本发明提供特异性人源化ACO-1抗体。该人源化ACO-1抗体特异性结合人IFN-α，并且包含与SEQ ID NO：3的Kabat残基31-35、50-65和95-102序列基本相同的VH CDR序列，具有任选的N31S突变。该抗体可以包含，例如，包含SEQ ID NO：15的CDR H1序列；包含SEQID NO：21的CDR H2序列；和包含SEQ ID NO：17的CDR H3序列。另外或可替代地，该抗体可包含由SEQ ID NO：15组成的CDR H1序列；由SEQ ID NO：21组成的CDR H2序列；和由SEQ ID NO：17组成的CDRH3序列。在一个实施方案中，人源化ACO-1包含来源于人VH1_46基因和/或人JH4基因、优选来源于两者的VH构架残基。在一个具体实施方案中，人源化抗体包含对应于SEQ ID NO：3的VH序列。

人源化ACO-1抗体还可包含与SEQ ID NO：6的Kabat残基24-34、50-56和89-97序列基本相同的VL CDR序列。该抗体可以包含，例如，包含SEQ ID NO：18的CDR_L1序列；包含SEQ ID NO：19的CDR_L2序列；和包含SEQ ID NO：20的CDR_L3序列。另外或可替代地，该抗体可包含由SEQ ID NO：18组成的CDR_L1序列；由SEQ ID NO：19组成的CDRJ.2序列；和由SEQ ID NO：20组成的CDR_L3序列。在一个实施方案中，人源化ACO-1抗体包含来源于人VKIII_L6基因和/或人JK2基因、优选地来源于这两者的VL构架残基。在一个具体实施方案中，人源化抗体包含对应于SEQ ID NO：6的VL序列。

一方面，本发明提供一种包含ACO-2的CDR序列的抗体。该抗体可以特异性结合人IFN-α，并且包含与SEQ ID NO：7的Kabat残基31-35、50-59和95-102序列基本相同的VH CDR序列。在一个实施方案中，该抗体含有包含SEQ ID NO：22的CDR_H1序列；包含SEQ ID NO：23的CDR_H2序列；和包含SEQ ID NO：17的CDR_H3序列。在一个另外的或替代的实施方案中，该包含由SEQ ID NO：22组成的CDR_H1序列；由SEQ ID NO：23组成的CDR_H2序列；和由SEQ ID NO：17组成的CDR_H3序列。该抗体还可包含与SEQ ID NO：9的Kabat残基24-34、50-56、89-97序列基本相同的VL CDR序列。在一个实施方案中，该抗体含有包含SEQ ID NO：24的CDR_L1序列；包含SEQ ID NO：25的CDR_L2序列；和包含SEQ ID NO：20的CDR_L3序列。另外或可替代地，该抗体包含由SEQ ID NO：24组成的CDR_L1序列；由SEQ ID NO：25组成的CDR_L2序列；和由SEQ ID NO：20组成的CDR_L3序列。一方面，该抗体可以是人源化ACO-2抗体。

人源化ACO-1或ACO-2抗体还可包含人Fc-区的至少一部分(除非该抗体是不包含任何Fc-部分的抗原结合片段)。一般而言，选择Fc-区的大小以达到希望的抗体药代动力学性质；Fc-部分越大，清除越慢。在一个实施方案中，人源化抗体是全长抗体，优选地包含IgG4同种型Fc-区。在一个具体实施方案中，IgG4Fc-区包含S241P突变，编号根据Kabat；对应于采用EU编号系统的残基228(Edelman G.M.等人，Proc.Natl.Acad.USA 63，78-85(1969))。

如果ACO-1和ACO-2两者都结合IFN-α并且相似，则人源化VH和VL序列可以“混合并匹配”，以产生本发明的其它抗-IFN-α结合分子。这种“混合并匹配的”抗体的IFN-α结合可以利用此处所述的结合试验(例如流式细胞术、Biacore、ELISA)和/或采用一种或多种此处所述的功能性分析进行检测。优选地，当VH和VL链混合并匹配时，来自特定VH/VL配对的VH序列被替换为结构上相似的VH序列。同样，来自特定VH/VL配对的VL序列优选地被替换为结构上相似的VL序列。

因此，一方面，本发明提供一种人源化单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：(a)包含ACO-1或ACO-2VH CDR的VH区；和(b)包含ACO-1或ACO-2VL CDR的VL区；其中该抗体特异性结合IFN-α。优选的重链和轻链组合包括：(a)包含SEQ ID NOS：15-17的VH区，任选地省略SEQ ID NO：16的5个C-末端氨基酸中的几个或全部；和(b)包含SEQ ID NOS：18-20的轻链可变区；(a)包含SEQ ID NOS：15-17的VH区，任选地省略SEQ ID NO：16的5个C-末端氨基酸中的几个或全部；和(b)包含SEQ ID NOS：24，25和20的轻链可变区；(a)包含SEQ ID NOS：22、23和17的VH区，任选地省略SEQ ID NO：23的5个C-末端氨基酸中的几个或全部；和(b)包含SEQ ID NOS：18-20的轻链可变区；和(a)包含SEQ ID NOS：22、23和17的VH区，任选地省略SEQ ID NO：23的5个C-末端氨基酸中的几个或全部；和(b)包含SEQ ID NOS：24、25和20的轻链可变区。其它优选的重链和轻链组合包括(a)包含SEQ ID NO：3序列的VH区和(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO：4的VL区；(a)包含SEQID NOS：15、21和17的VH，和(b)包含SEQ ID NOS：18-20的VL；和(a)包含SEQ ID NOS：15、21和17的VH，和(b)包含SEQ ID NOS：24、25和20的VL。

另一方面，本发明提供包含ACO-1或ACO-2或其组合的重链和轻链CDR1、CDR2和/或CDR3的抗体。如果这些抗体中的每一个都能够结合IFN-α并且抗原结合特异性主要由CDR1、2和3区提供，则CDR H1、H2和H3序列和CDR L1、L2和L3序列可以“混合并匹配”(即，来自不同抗体的CDR可以混合并匹配，尽管每个抗体都能够含有CDR H1、H2和H3和CDR L1、L2和L3)，以产生本发明的其它抗-IFN-α结合分子。这种“混合并匹配的”抗体的IFN-α-结合可以利用以下和实施例中所述的结合分析(例如流式细胞术、Biacore或ELISA)进行检测。优选地，当VH CDR序列混合并匹配时，来自特定VH序列的CDR H1、H2和/或H3序列被替换为结构上相似的CDR序列。同样，当VL CDR序列混合并匹配时，来自特定VL序列的CDR L1、L2和/或L3序列优选地被替换为结构上相似的CDR序列。例如，ACO-1和ACO-2的CDR具有明显的结构相似性，因此适合混合并匹配。

因此，在另一方面，本发明提供一种人源化单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：(a)包含选自SEQ ID NOS：15和22的氨基酸序列的CDR H1；(b)包含选自SEQ ID NOS：16和23的至少残基1-12的氨基酸序列的CDR H2；(c)包含SEQ ID NO：17的CDR H3；(d)包含选自SEQID NOS：18和24的氨基酸序列的CDR L1；(e)包含选自SEQ ID NOS：19和25的氨基酸序列的CDR L2；和(f)包含SEQ ID NO：20的CDR L3；其中所述抗体特异性结合IFN-α。

在优选的实施方案中，抗体包含：(a)包含SEQ ID NO：15的CDR H1；(b)包含SEQ ID NO：16的至少残基1-12的CDR H2；(c)包含SEQ IDNO：17的CDR H3；(d)包含SEQ ID NO：18的CDR L1；(e)包含SEQ IDNO：19的CDR L2；和(f)包含SEQ ID NO：20的CDR L3。

在另一个优选的实施方案中，抗体包含：(a)包含SEQ ID NO：22的CDR H1；(b)包含SEQ ID NO：23的至少残基1-12的CDR H2；(c)包含SEQ ID NO：17的CDR H3；(d)包含SEQ ID NO：24的CDR L1；(e)包含SEQ ID NO：25的CDR L2；和(f)包含SEQ ID NO：20的CDR L3。

在一个优选的实施方案中，抗体包含：(a)包含SEQ ID NO：15的CDRH1；(b)包含SEQ ID NO：21的CDR H2；(c)包含SEQ ID NO：17的CDRH3；(d)包含SEQ ID NO：18的CDR L1；(e)包含SEQ ID NO：19的CDRL2；和(f)包含SEQ ID NO：20的CDR L3。

在另一个优选的实施方案中，抗体包含：(a)包含SEQ ID NO：22的CDR H1；(b)包含SEQ ID NO：16的至少残基1-12的CDR H2；(c)包含SEQ ID NO：17的CDR H3；(d)包含SEQ ID NO：18的CDR L1；(e)包含SEQ ID NO：19的CDR L2；和(f)包含SEQ ID NO：20的CDR L3。

在一个优选的实施方案中，抗体包含：(a)包含SEQ ID NO：15的CDRH1；(b)包含SEQ ID NO：16的至少残基1-12的CDR H2；(c)包含SEQID NO：17的CDR H3；(d)包含SEQ ID NO：24的CDR L1；(e)包含SEQID NO：19的CDR L2；和(f)包含SEQ ID NO：20的CDR L3。

在一个优选的实施方案中，抗体包含：(a)包含SEQ ID NO：15的CDRH1；(b)包含SEQ ID NO：16的至少残基1-12的CDR H2；(c)包含SEQID NO：17的CDR H3；(d)包含SEQ ID NO：18的CDR L1；(e)包含SEQID NO：25的CDR L2；和(f)包含SEQ ID NO：20的CDR L3。

人源化抗-IFN-α抗体变体

尽管抗体变体或衍生物一般具有至少一种与亲本抗体相比改变的性质，但是抗体变体或衍生物可以保留亲本抗-IFN-α抗体的一种、某些、大多数或全部功能性质，包括但不限于：(a)特异性结合IFN-α亚型A、2、B2、C、F、G、H2、I、J1、K、4a、4b和WA；(b)选择性中和IFN-α蛋白质亚型A、2、B2、C、F、G、H2、I、J1、K、4a、4b或WA的一种或多种生物活性；其任意组合，或其全部；(c)不显著中和IFN-α1或D的生物活性；(d)竞争和/或结合IFN-α蛋白质亚型上与ACO-1和/或ACO-2所竞争和/或结合的相同的表位；(e)与ACO-1或ACO-2的竞争强于与9F3、13H5、13H7和7H9中的任一种的竞争；(f)引发免疫应答的可能性低于包含根据Kabat的鼠CDR的hzACO-1或hzACO-2抗体；(g)在药物制剂中稳定；和(h)以10^-8M或更低的KD结合IFN-α蛋白质亚型A、2、B2、C、F、G、H2、I、J1、K、4a、4b或WA中的至少一种。本发明的抗体可以表现出上述功能特征的任意组合和/或实施例中所述的功能特征。

在某些实施方案中，本发明的人源化抗体含有包含CDR H1-H3序列的VH区和包含CDR L1-L3序列的VL区，其中这些CDR序列中的一个或多个包含基于此处所述的优选抗体的特定氨基酸序列；ACO-1和ACO-2或其保守修饰，且其中该抗体保持或提高了本发明的抗-IFN-α抗体的希望的功能性质。因此，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其含有包含CDR H1、CDR H2和CDR H3序列的重链可变区和包含CDR H1、CDR H2和CDR H3序列的轻链可变区，其中：(a)CDR H1包含选自SEQ ID NOS：15和22的氨基酸序列和其保守修饰；(b)CDR H2包含选自SEQ ID NOS：16和23的至少残基1-12的氨基酸序列，和其保守修饰，(c)CDR H3包含SEQ ID NO：17和其保守修饰；(d)CDRL1包含选自SEQ ID NOS：18和24的氨基酸序列，和其保守修饰；(e)CDRL2包含选自SEQ ID NOS：19和25的氨基酸序列，和其保守修饰；和(f)CDR L3包含SEQ ID NO：20和其保守修饰；其中该抗体特异性结合IFN-α。

因此，本发明抗体的CDR或FR区内的一个或多个氨基酸残基可以被替换为来自相同侧链家族的其它氨基酸残基，并且可以采用此处所述的功能性分析检测改变的抗体保留的功能(即，以上(c)、(d)和(e)所述的功能)。

抗体变体的功能性质可以采用本领域可以获得的和/或此处所述的标准分析进行评估。例如，抗体结合IFN-α的能力可以采用标准结合和生物效应(例如报道基因)分析进行确定，例如实施例中所述的那些(例如，Biacore或ELISA)。

可变区修饰

一方面，本发明提供一种在CDR或构架区具有突变的人源化ACO-1或ACO-2抗体。

人源化ACO-1中的突变的具体例子及其确认在实施例2和3中描述(也参见图1和3)。其中包括回复突变；向人源化ACO-1中引入ACO-1残基，以及向人源化ACO-1中引入ACO-2-衍生的残基的突变。hzACO-1VH(SEQ ID NO：3)中的回复突变的例子包括V5Q、M69L、R71V、T73K、S76I和V78A，及其任意组合，采用Kabat编号。hzACO-1VL(SEQ IDNO：6)中的回复突变的例子包括E1Q、L47W、I58V和F71Y，及其任意组合。hzACO-1VH(SEQ ID NO：3)中的ACO-2-衍生突变的例子包括T28S、N31S、I58S、S76N、T77I和A93V，及其任意组合。hzACO-1VL(SEQ ID NO：6)中的ACO-2衍生突变的例子包括D29G、L33F和S50G，及其任意组合。

此外，各种hzACO-1VH和VL变体序列可以与变体序列或亲本序列“混合并匹配”，以产生本发明的hzACO-1变体的文库。这些“混合并匹配”的抗体的IFN-α-结合可以采用此处所述的结合分析(例如，Biacore、ELISA)和/或采用一种或多种此处所述的功能性分析进行检测。

在一个实施方案中，本发明提供一种特异性结合人IFN-α的人源化抗体，该抗体含有可变域，该人抗体可变域中并入了来自结合人IFN-α的供体非人抗体的氨基酸，在选自重链可变域5、28、31、58、69、71、73、76、78、79和93的一个或多个位点处包含供体抗体氨基酸残基。

在一个实施方案中，本发明提供一种特异性结合人IFN-α的人源化抗体，该抗体含有可变域，该人抗体可变域中并入了来自结合人IFN-α的供体非人抗体的氨基酸，在选自轻链可变域1、29、33、47、50、58和71的一个或多个位点处包含供体抗体氨基酸残基。

在一个实施方案中，本发明提供一种特异性结合人IFN-α的人源化抗体，该抗体含有可变域，该人抗体可变域中并入了来自结合人IFN-α的ACO-1的CDR序列，在选自重链可变域28、31、58、76、77、78、79和93的一个或多个位点处还包含ACO-2氨基酸残基。在一个具体实施方案中，ACO-2氨基酸残基位于选自28、31和93的一个或多个位点处。

在一个实施方案中，本发明提供一种特异性结合人IFN-α的人源化抗体，该抗体含有可变域，该人抗体可变域中并入了来自结合人IFN-α的ACO-1的CDR序列，在选自轻链可变域29、33和50的一个或多个位点处还包含ACO-2氨基酸残基。

在一个实施方案中，本发明提供一种特异性结合人IFN-α的hzACO-1变体，该变体包含与SEQ ID NO：3的Kabat残基31-35、50-65，和95-102序列基本相同的VH CDR序列，具有N31S突变。该抗体可以包含，例如，包含具有N31S突变的SEQ ID NO：15的CDR H1序列；包含SEQ IDNO：21的CDR H2序列；和包含SEQ ID NO：17的CDR H3序列。另外或可替代地，该抗体可以包含由具有N31S突变的SEQ ID NO：15组成的CDR H1序列；由SEQ ID NO：21组成的CDR H2序列；和由SEQ IDNO：17组成的CDR H3序列。在一个实施方案中，人源化ACO-1包含来源于人VH1_46基因和/或人JH4基因、优选地来源于这两者的VH构架残基。在具体实施方案中，人源化抗体包含对应于SEQ ID NO：3的VH序列，在Kabat位点31处具有N到S的突变。如实施例所述，hzACO-1中的N31S突变提高了对IFN-αA的结合亲和力达到相当于ACO-1的水平，并且提高了在pH3.5和4.5时的稳定性。而且，由于残基31位于“供体”CDR残基中，突变不向hzACO-1序列中引入其它的鼠残基，从而在施用于人时不增加针对抗体的免疫应答的风险。具有相同优点的其它CDR突变包括hzACO-1VL中的D29G和S50G。

在一个实施方案中，本发明提供特异性结合人IFN-α的hzACO-1变体，其包含与SEQ ID NO：3的Kabat残基31-35、50-65和95-102序列基本相同的VH CDR序列，具有T28S突变。该抗体可以包含，例如，包含SEQ ID NO：15的CDR H1序列；包含SEQ ID NO：21的CDR H2序列；和包含SEQ ID NO：17的CDR H3序列。另外或可替代地，该抗体可以包含由SEQ ID NO：15组成的CDR H1序列；由SEQ ID NO：21组成的CDR H2序列；和由SEQ ID NO：17组成的CDR H3序列。在一个实施方案中，人源化ACO-1包含来源于人VH1_46基因的VH构架残基，进一步包含T28S突变。在具体实施方案中，人源化抗体包含对应于SEQ IDNO：3的VH序列，在Kabat位点28处具有T到S的突变。如实施例所述，hzACO-1中的T28S突变提高了对IFN-αA的结合亲和力达到相当于ACO-1的水平，并且提高了在pH3.5和4.5时的稳定性。

在一个实施方案中，本发明提供特异性结合人IFN-α的hzACO-1变体，其包含与SEQ ID NO：3的Kabat残基31-35、50-65和95-102的序列基本相同的VH CDR序列，具有A93V突变。该抗体可以包含，例如，包含SEQ ID NO：15的CDR H1序列；包含SEQ ID NO：21的CDR H2序列；和包含SEQ ID NO：17的CDR H3序列。另外或可替代地，该抗体可以包含由SEQ ID NO：15组成的CDR H1序列；由SEQ ID NO：21组成的CDR H2序列；和由SEQ ID NO：17组成的CDR H3序列。在一个实施方案中，人源化ACO-1包含来源于人VH1_46基因和人JH4基因的VH构架残基，进一步包含A93V突变。在具体实施方案中，人源化抗体包含对应于SEQ ID NO：3的VH序列，在Kabat位点93处具有A到V的突变。如实施例所述，hzACO-1中的A93V突变提高了对IFN-αA的结合亲和力达到相当于ACO-1的水平，如在RG分析中测定的提高了用于抑制IFN效应的能力，并且提高了在pH3.5和4.5时的稳定性。

在一个实施方案中，本发明提供特异性结合人IFN-α的hzACO-1变体，其包含与SEQ ID NO：3的Kabat残基31-35、50-65和95-102的序列基本相同的VH CDR序列，在VH CDR序列之一中还包含突变，其中所述突变不是位于Kabat残基58。该抗体可以包含，例如，由SEQ IDNO：3的Kabat残基31-35、50-65和95-102组成的VH CDR，在VH CDR序列之一中还包含突变，其中Kabat残基58是I。在一个实施方案中，人源化ACO-1包含来源于人VH1_46基因和人JH4基因的VH构架残基。如实施例所述，hzACO-1中的I58S突变大大降低了对IFN-αA的结合亲和力，并且如在RG分析中测定的降低了用于抑制IFN效应的能力。

另一种类型的构架修饰涉及突变构架区内的，或甚至一个或多个CDR区内的一个或多个残基，以除去T细胞表位，从而降低抗体的潜在的免疫原性。该方法也被称为″脱免疫″，在Carr等人的美国专利公开文本No.20030153043中有更详细的描述。

Fc修饰

另外，或者作为在构架或CDR区内进行的修饰的替代，本发明的抗体可以工程构建为在Fc区内包括修饰，一般用来改变抗体的一个或多个功能性质，如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合、蛋白质稳定性和/或抗原依赖性细胞毒性，或其缺乏。此外，本发明的抗体可以化学修饰(例如，一个或多个化学部分可以连接到抗体上)或者进行修饰以改变其糖基化，再次改变抗体的一个或多个功能性质。这些实施方案中的每一个都在下面进一步详细描述。Fc区中的残基按照Kabat编号。

如果需要，可以通过已知的技术“转换”抗体的类别。这样的技术包括，例如，采用直接重组技术(参见，例如，美国专利4,816,397)和细胞-细胞融合技术(参见，例如，美国专利5,916,771)。例如，最初作为IgM分子产生的抗体可以类别转换为IgG抗体。类别转换技术也可以用来将一个IgG亚类转换为另一IgG亚类，例如，从IgG1到IgG2。因此，本发明的抗体的效应功能可以通过同种型转换改变为，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM抗体，用于各种治疗应用。用于恒定区的示例性的cDNA序列可以从例如GenBank获得，其中每一个都通过参考全部并入本文，如下：

人IgG1重链恒定区：GenBank登录号：J00228；

人IgG2重链恒定区：GenBank登录号：J00230；

人IgG3重链恒定区：GenBank登录号：X04646；

人IgG4重链恒定区：GenBank登录号：K01316；和

人κ轻链恒定区：GenBank登录号：J00241。

在一个实施方案中，修饰CH1的铰链区，使得铰链区中半胱氨酸残基的数目改变，例如，增加或减少。这种方法在Bodmer等人的美国专利No.5,677,425中进一步详细记载。改变CH1的铰链区中的半胱氨酸残基数是为了，例如，促进轻链和重链的装配，或者提高或降低抗体的稳定性。

在另一实施方案中，抗体的Fc铰链区被突变，以缩短抗体的生物半衰期。更具体地，将一个或多个氨基酸突变引入Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区，使得该抗体相对于天然Fc-铰链结构域葡萄球菌蛋白A(SpA)结合具有减弱的SpA结合。该方法在Ward等人的美国专利No.6,165,745中进一步详细描述。在另一实施方案中，修饰该抗体以延长其生物半衰期。可以采用多种方法。例如，可以引入以下突变中的一个或多个：T252L、T254S、T256F，如Ward的美国专利No.6,277,375所述。或者，为了延长生物半衰期，可以在CH1或CL区内改变抗体，使之含有来自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环的补救受体结合表位，如Presta等人的美国专利Nos.5,869,046和6,121,022所述。在又另一实施方案中，通过将至少一个氨基酸残基替换为不同的氨基酸残基改变Fc区，以改变抗体的效应功能。例如，选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320和322的一个或多个氨基酸可以被替换为不同的氨基酸残基，使得该抗体对于效应配体的亲和力改变，但保留亲本抗体的抗原结合能力。对其亲和力改变的效应配体可以是，例如，Fc受体或补体的C1成分。该方法在Winter等人的美国专利Nos.5,624,821和5,648,260中进一步详细描述。在另一实例中，选自氨基酸残基329、331和322的一个或多个氨基酸可以被替换为不同的氨基酸残基，使得抗体的C1q结合改变和/或补体依赖的细胞毒性(CDC)降低或消除。该方法在Idusogie等人的美国专利No.6,194,551中进一步详细描述。在另一实例中，改变氨基酸位置231和239内的一个或多个氨基酸残基，从而改变抗体固定补体的能力。该方法在Bodmer等人的PCT公开文本WO94/29351中进一步描述。在另一实例中，通过修饰下列位点的一个或多个氨基酸修饰Fc区，以提高抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或提高抗体对Fcy受体的亲和力的能力：238，239，248，249，252，254，255，256，258，265，267，268，269，270，272，276，278，280，283，285，286，289，290，292，293，294，295，296，298，301，303，305，307，309，312，315，320，322，324，326，327，329，330，331，333，334，335，337，338，340，360，373，376，378，382，388，389，398，414，416，419，430，434，435，437，438或439。该方法在Presta的PCT公开文本WO 00/42072中进一步描述。而且，人IgG1上对于FcyRI、FcyRII、FcyRIII和FcRn的结合位点已经作图，并且具有改善的结合的变体已有描述(参见Shields，R.L.等人.(2001)J.Biol.Chem.276：6591-6604)。位点256、290、298、333、334和339处的特异性突变已证明改善与FcRIII的结合。另外，下列组合突变体已证明改善FcyRIII结合：T256A/S298A，S298A/E333A，S298A/K224A和S298A/E333A/K334A。

可以进一步修饰恒定区以稳定化抗体，例如，降低二价抗体分离为两个单价VH-VL片段的风险。例如，在IgG4恒定区中，残基S241可以突变为脯氨酸(P)残基，以允许在铰链处形成完整的二硫键(参见，例如，Angal等人.，Mol Immunol.1993；30：105-8)。

糖基化修饰

在另一实施方案中，抗体的糖基化被修饰。例如，可以制备无糖基化抗体(即，抗体缺乏糖基化)。可以改变糖基化，例如，以提高抗体对抗原的亲和力。这样的糖类修饰可以通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来完成。

抗原结合片段

本发明的抗-IFN-α抗体可以制备为全长抗体或其抗原结合片段。抗原结合片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab)2、F(ab′)2、F(ab)3、Fv(一般是抗体单臂的VL和VH结构域)、单链Fv(scFv；参见例如，Bird等人.，Science 1988；242：423-426；和Huston等人.PNAS 1988；85：5879-5883)、dsFv、Fd(一般是VH和CH1结构域)和dAb(一般是VH结构域)片段；VH、VL、VhH，和V-NAR结构域；包含单VH和单VL链的单价分子；小抗体(minibodies)、双抗体(diabodies)、三抗体(triabodies)、四抗体(tetrabodies)和κ抗体(kappa bodies)(参见，例如，Ill等人.，Protein Eng 1997；10：949-57)；骆驼IgG；IgNAR；以及一个或多个分离的CDR或功能互补位(paratope)，其中分离的CDR或抗原结合残基或多肽可以结合或连接在一起，从而形成功能性抗体片段。各种类型的抗体片段已经描述或综述于，例如，Holliger和Hudson，Nat Biotechnol 2005；23：1126-1136；WO2005040219和公布的美国专利申请20050238646和20020161201。

抗体片段可以采用传统重组或蛋白质工程技术获得，可以采用与完整抗体相同的方式针对抗原结合或其它功能筛选片段。

已经开发了各种用于生产抗体片段的技术。传统上，这些片段通过全长抗体的蛋白水解消化而衍生(参见，例如，Morimoto等人.，Journal of Biochemical and Biophysical Methods，24：107-117(1992)；和Brennan等人.，Science，229：81(1985))。但是，这些片段现在可以由重组宿主细胞直接产生。可替代地，Fab′-SH片段可以直接从大肠杆菌中回收，并化学偶联，以形成F(ab′)2片段(Carter等人.，Bio/Technology，10：163-167(1992))。根据另外一种方法，F(ab′)2片段可以从重组宿主细胞培养物中直接分离。在其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO1993/16185；美国专利No.5,571,894；和美国专利No.5,587,458。抗体片段也可以是″线性抗体″，例如，如美国专利No.5,641,870所述。这样的线性抗体片段可以是单特异性或双特异性的。

多特异性分子

另一方面，本发明提供包含本发明的抗-IFN-α抗体或其抗原片段的多特异性分子。这样的多特异性分子包括包含对于IFN-α的至少一个第一结合特异性和对于第二靶表位的第二结合特异性的双特异性分子。

一种类型的双特异性分子是双特异性抗体。双特异性抗体是具有对至少两个不同表位的结合特异性的抗体。制备双特异性抗体的方法是本领域已知的，全长双特异性抗体的传统生产通常基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两条链具有不同的特异性(Millstein等人.，Nature，305：537-539(1983))。双特异性抗体可以制备为全长抗体或抗体片段(例如F(ab′)2双特异性抗体)或者此处所述的任何其它抗原结合片段。

其它多特异性分子包括由IFN-α-结合抗体部分与一个或多个其它非抗体蛋白质融合产生的分子。这样的多特异性蛋白质和如何构建它们已经在本领域中记载。参见，例如，Dreier等人.(Bio-conjug.Chem.9(4)：482-489(1998))；美国专利6,046,310；美国专利公开文本No.20030103984；欧洲专利申请1 413 316；美国专利公开文本No.20040038339；von Strandmann等人.，Blood(2006；107：1955-1962.)和WO2004056873。

也涉及具有两个以上的化合价的多特异性分子。例如，可以制备三特异性抗体。Tutt等人.，J.Immunol，147：60(1991)。

本发明的多特异性分子可以通过利用本领域已知的方法将组成结合特异性偶联起来而制备。例如，多特异性分子的每个结合特异性可以分别产生，然后彼此偶联。当结合特异性为蛋白质或肽时，可以使用多种偶联剂或交联剂进行共价偶联。交联剂的例子包括蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰基-S-乙酰基-硫代醋酸酯(SATA)、5，5′-二硫双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻亚苯基二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)和磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸(sulfo-SMCC)(参见例如，Karpovsky等人.(1984)J.Exp.Med.160：1686；Liu，MA等人.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8648)。其它方法包括Paulus(1985)Behring Ins.Mitt.No.78，118-132；Brennan等人.(1985)Science 229：81-83和Glennie等人.(1987)J.Immunol.139：2367-2375所述的方法。优选的偶联剂是SATA和sulfo-SMCC，它们均可获自Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)。

当结合特异性是抗体时，它们可以通过两个重链的C末端铰链区的巯基键合进行偶联。在一个特别优选的实施方案中，在偶联之前修饰铰链区以包含奇数个巯基残基，优选一个。

此外，两个结合特异性可以在同一载体中编码并在同一宿主细胞中表达和装配。在双特异性分子为mAb x mAb、mAb x Fab、Fab x F(ab′)2或配体x Fab融合蛋白时，该方法特别有用。本发明的双特异性分子可以是包含一个单链抗体和结合决定簇的单链分子，或包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可以包含至少两个单链分子。制备双特异性分子的方法记载或综述于，例如，美国专利号5,260,203；美国专利号5,455,030；美国专利号4,881,175；美国专利号5,132,405；美国专利号5,091,513；美国专利号5,476,786；美国专利号：5,013,653；美国专利号5,258,498；美国专利号5,482,858；美国专利申请公开20030078385，Kontermann等人，(2005)Acta Pharmacological Sinica 26(1)：1-9；Kostelny等人，(1992)J.Immunol.148(5)：1547-1553；Hollinger等人.，(1993)PNAS(USA)90：6444-6448；和Gruber等人.(1994)J.Immunol.152：5368。

抗体衍生物

本发明范围内的抗体衍生物(或免疫偶联物)包括偶联或共价结合到第二试剂上的抗-IFN-α抗体。

例如，一方面，本发明提供包含偶联或共价键合到细胞毒性剂上的抗体的免疫偶联物，该细胞毒性剂可以选自治疗性放射性同位素、毒性蛋白质、毒性小分子，如药物、毒素、免疫调节剂、激素、激素拮抗剂、酶、寡核苷酸、酶抑制剂、治疗性放射性核素、血管生成抑制剂、化疗药物、长春花生物碱、蒽环类、表鬼臼毒素(epidophyllotoxins)，紫杉醇类、抗代谢物、烷化剂、抗生素、COX-2抑制剂、SN-38、抗有丝分裂剂、抗血管生成剂和和凋亡剂，特别是阿霉素、氨甲蝶呤、紫杉醇、CPT-11、喜树碱、氮芥、吉西他滨、烷基磺酸盐、亚硝基脲、三氮烯、叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物、铂配合配合物、假单胞菌外毒素、蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、5-氟尿嘧啶、核糖核酸酶(RNase)、DNaseI、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、多花白树毒蛋白、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单胞菌内毒素及其它(参见，例如，Remington′sPharmaceutical Sciences，19th Ed.(Mack Publishing Co.1995)；Goodman和Gilman′s The Pharmacological Basis of Therapeutics(McGraw Hill，2001)；Pastan等人.(1986)Cell 47：641；Goldenberg(1994)Cancer Journal for Clinicians 44：43；美国专利No.6,077,499；上述文献的全部公开内容都通过参考并入本文)。应当理解，毒素可以是动物、植物、真菌或微生物来源的，或者可以通过化学合成从头产生。

在另一实施方案中，抗体用放射性同位素衍生化，如治疗性放射性核素或适合检测目的的放射性核素。可以使用大量合适的放射性同位素中的任何一种，包括但不限于I-131、铟-111、镥-171、铋-212、铋-213、砹-211、铜-62、铜-64、铜-67、钇-90、碘-125、碘-131、磷-32、磷-33、钪-47、银-111、镓-67、镨-142、钐-153、铽-161、镝-166、钬-166、铼-186、铼-188、铼-189、铅-212、镭-223、锕-225、铁-59、硒-75、砷-77、锶-89、钼-99、铑-105、钯-109、镨-143、钷-149、铒-169、铱-194、金-198、金-199和铅-211。通常，放射性核素对于俄歇发射体优选地具有20-6,000keV范围，优选60-200keV范围的衰变能，对于β射线发射体为100-2,500keV，及对于α射线发射体为4,000-6,000keV。随着α-粒子的产生实质衰变的放射性核素也是优选的。

本发明的抗体偶联物可以用来修饰特定的生物反应，其中药物部分不应理解为只限于经典的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有希望的生物活性的蛋白质或多肽。这样的蛋白质可包括，例如，酶活性毒素或其活性片段，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质，如肿瘤坏死因子或干扰素-γ；或生物反应调节剂，例如，淋巴因子、白介素-1(″IL-1″)、白介素-2(″IL-2″)、白介素-6(″IL-6″)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(″GM-CSF″)、粒细胞集落刺激因子(″G-CSF″)或其它生长因子。

第二试剂可以采用大量可利用的方法中的任何一种直接或间接连接到抗体上。例如，试剂连接到还原的抗体成分的铰链区可以通过形成二硫键，采用交联剂如N-琥珀酰3-(2-叱咤基二硫代)丙酸酯(SPDP)，或经由抗体Fc区中的碳水化合物部分(参见，例如，Yu等人.(1994)Int.J.Cancer 56：244；Wong，Chemistry of Protein Conjugation amd Cross-linking(CRC Press 1991)；Upeslacis等人.，″Modification of Antibodies by Chemical Methods，″in Monocloncal antibodies：principles and applications，Birch等人.(eds.)，pages 187-230(Wiley-Liss，Inc.1995)；Price，″Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies，″in Monocloncal antibodies：Production，engineering and clinical application，Ritter等人.(eds.)，pages 60-84(Cambridge University Press 1995)，Cattel等人.(1989)Chemistry today 7：51-58，Delprino等人.(1993)J.Pharm.Sci82：699-704；Arpicco等人.(1997)Bioconjugate Chemistry 8：3；Reisfeld等人.(1989)Antibody，Immunicon.Radiopharrn.2：217；其全部内容通过参考并入本文)。参见，例如Arnon等人.，″Monocloncal Antibodies For Immuno-targeting Of Drugs In Cancer Therapy″，in Monocloncal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等人.(eds.)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等人.，″Antibodies For Drug Delivery″，in Controlled Drug Delivery(2nd Ed.)，Robinson等人.(eds.)，pp.623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，″Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review″，in Monocloncal Antibodies′84：Biological and Clinical Applications，Pinchera等人.(eds.)，pp.475-506(1985)；″Analysis，Results，和Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy″，in Monocloncal Antibodies For Cancer Detection and Therapy，Baldwin等人，(eds.)，pp.303-16(Academic Press 1985)，和Thorpe等人，″The Preparation and Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates″，Immunol.Rev.，62：119-58(1982)。

为了进一步讨论细胞毒素类型、用于偶联治疗剂和抗体的连接体和方法，也参见Saito，G.等人.(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55：199-215；Trail，P.A.等人.(2003)Cancer Immunol.Immunother.52：328-337；Payne，G.(2003)Cancer Cell 3：207-212；Allen，T.M.(2002)Nat.Rev.Cancer 2：750-763；Pastan，I.和Kreitman，R.J.(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs3：1089-1091；Senter，P.D.和Springer，C.J.(2001)Adv.Drug Deliv.Rev.53：247-264。

在其它实施方案中，第二试剂是可检测的部分，它可以是任何能够被定量或定性观察或测定的分子。可用于本发明的偶联抗体的可检测标记的例子有放射性同位素、荧光染料或互补结合对的成员，如以下任一个的成员：抗原/抗体(不是抗IFN-α抗体)、凝集素/碳水化合物；亲和素/生物素；受体/配体；或分子印迹聚合物/印迹分子系统。

第二试剂也可以是或者可替代地是例如旨在延长抗体的循环半衰期的聚合物。示例性的聚合物和将这样的聚合物连接到肽上的方法例如在美国专利Nos.4,766,106；4,179,337；4,495,285；和4,609,546中说明。其它说明性的聚合物包括聚氧乙烯化多元醇和聚乙二醇(PEG)部分。此处使用的术语“聚乙二醇”意在包括已经用于衍生化其它蛋白质的PEG的任何形式，如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。例如，全长抗体或抗体片段可以偶联到一个或多个分子量为大约1,000至大约40,000，如大约2000至大约20,000，例如大约3,000-12,000的PEG分子上。为了将抗体或其片段聚乙二醇化，一般在使一个或多个PEG基团能连接到该抗体或抗体片段上的条件下，该抗体或片段与聚乙二醇(PEG)如PEG的反应性酯或醛衍生物反应。优选地，聚乙二醇化通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应进行。在某些实施方案中，将要聚乙二醇化的抗体是无糖基化抗体。聚乙二醇化蛋白质的方法在本领域中公知，并且可以用于本发明的抗体。参见例如，Nishimura等人的EP 0 154 316和Ishikawa等人的EP 0 401 384。

抗体表征

产生或纯化后，或者作为筛选或选择程序的一部分，可以研究本发明的抗-IFN-α抗体的功能特征。

下面是用于抗体表征的示例性分析的简要说明。其中一些在其它章节进一步描述和/或在实施例中描述。

结合分析

本发明提供结合IFN-α的抗体及其抗原结合片段和免疫偶联物。可以利用多种多样的试验中的任何一种来评估抗体与IFN-α的结合。基于ELISA、放射免疫测定、Western印迹法、BIACORE和竞争性试验的方案尤其适用，也是本领域中公知的。

例如，可以使用简单结合分析，其中测试抗体在靶蛋白质或表位(例如，选自A、2、B2、C、F、G、H2、I、J1、K、4a、4b、WA、1和D的IFN-α蛋白质亚型、其部分或其任何组合)的存在下孵育，洗去未结合的抗体，和利用例如RIA、ELISA等评估结合的抗体的存在。这些方法是本领域技术人员公知的。高于非特异性对照抗体所见的量的任何结合量都表明该抗体特异性结合靶标。

在这样的试验中，测试抗体结合人IFN-α的能力可以与(阴性)对照蛋白质(例如针对结构无关的抗原的抗体，或非Ig肽或蛋白质)结合相同靶标的能力进行比较。采用任何合适的试验，结合IFN-α的抗体或片段的亲和力比对照蛋白质提高25％、50％、100％、200％、1000％或更高的，被称为与靶标“特异性结合”或“特异性相互作用”，并且优选用于以下所述的治疗方法。也可以评估测试抗体影响(阳性)对照抗IFN-α抗体(例如人源化ACO-1或ACO-2抗体)结合的能力。

一方面，本发明提供与人源化ACO-1或ACO-2抗体共有生物学特征和/或基本VH和/或VL序列同一性的人源化抗-IFN-α抗体。一种示例性的生物学特征是结合ACO-1或ACO-2表位，即特定IFN-α蛋白质亚型的胞外域中被ACO-1和ACO-2抗体结合的相应区域。为了筛查结合ACO-1或ACO-2表位的抗体，可以进行常规交叉阻断试验，如Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Ed Harlow and David Lane(1988)中所述的。

在示例性的交叉阻断或竞争试验中，ACO-1或ACO-2(对照)抗体和测试抗体混合(或预吸附)并加到含IFN-α的样品中。在某些实施方案中，在加到含IFN-α的样品中之前，预混合对照抗体与不同量的测试抗体(例如，1∶10或1∶100)一段时间。在其它实施方案中，对照和不同量的测试抗体可以在暴露于抗原/靶标样品的过程中简单地混合。只要可以区分结合的抗体与游离抗体(例如，通过使用分离或洗涤技术来除去未结合的抗体)以及对照抗体与测试抗体(例如，通过使用种特异性或同种型特异性第二抗体，通过用可检测标记特异性标记对照抗体，或者通过物理方法如质谱法来区别不同的化合物)，则将能够确定测试抗体是否降低对照抗体与抗原的结合，表明测试抗体识别与对照基本相同的表位。在该试验中，在完全无关的抗体存在下(标记的)对照抗体的结合是对照高值。对照低值通过将标记的(阳性)对照抗体与未标记的对照抗体一起孵育而获得，其中将发生竞争，并减少标记的抗体的结合。

在检测试验中，在测试抗体存在下标记抗体反应性的显著减少指示测试抗体识别相同的表位，即与标记对照抗体“交叉反应”的表位。在对照：测试抗体或化合物为大约1∶10到大约1∶100的任何比例下，减少标记对照与抗原/靶标的结合至少50％或更优选70％的任何测试抗体或化合物被认为是结合与对照基本相同的表位或决定簇的抗体或化合物。优选地，这些测试抗体或化合物将减少对照与抗原靶标的结合达至少90％。然而，减少对照抗体或化合物的结合达到任何可测量的程度的任何化合物或抗体可用于本发明。

生物活性

单核细胞的分化。活化的T和B淋巴细胞的产生需要抗原呈递细胞(“APC”)的募集和成熟。这些APC包括B细胞、单核细胞/巨噬细胞和树突细胞。SLE患者的血清含有IFN-α，其可以活化DC，活化的活性可以被本发明的人源化抗体制剂阻断。检测和定量该活性的方法在科学和专利文献中有记载(参见，例如，专利公开号US20040067232A1的第0136-0150段，其相关部分通过参考并入本文)。

MxA启动子的激活。IFN-α活化MxA启动子的能力和本发明的抗-IFN-α单克隆抗体阻断该活化的能力可以采用报道基因(RG)分析进行检测，其中MxA启动子融合到报道基因如氯霉素乙酰转移酶(CAT)或萤光素酶(luc)，优选萤光素酶。用于CAT和萤光素酶的分析是本领域技术人员已知的。优选地，在用MxA启动子/报道基因融合构建体稳定转化的A549细胞中检测MxA启动子的活性。A549细胞是可通过ATCC获得的肺癌细胞系(产品编号CC1-185)。MxA(a.k.a.Mxl)启动子可以是人、小鼠或大鼠的。人MxA启动子的序列和结构公开在Genbank登录号X55639，Chang等人.(1991)Arch Virol.117：1-15；和Ronni等人.(1998)JInterferon Cytokine Res.18：773-781中。人MxA启动子/萤光素酶融合构建体和萤光素酶分析公开在专利公开文本US20040209800和Rosmorduc等人.(1999)J of Gen Virol 80：1253-1262中。人MxA启动子/CAT融合构建体和CAT分析公开在Fernandez等人.(2003)J Gen Virol 84：2073-2082和Fray等人.(2001)J Immunol Methods 249：235-244中。小鼠MxA(Mxl)启动子公开在Genbank登录号M21104；Hug等人.(1988)Mol Cell Biol8：3065-3079；和Lleonart等人.(1990)Biotechnology 8：1263-1267中。小鼠MxA启动子/萤光素酶融合构建体和萤光素酶分析公开在Canosi等人.(1996)J Immunol Methods 199：69-67中。

细胞病变效应抑制(CPE)分析。CPE分析基于干扰素的抗病毒活性。通常，合适的细胞系在干扰素的存在下用病毒感染，定量干扰素对病毒繁殖或复制过程的抑制活性。该分析的读数可基于病毒产量的减少、病毒细胞病变效应的降低、RNA合成的病毒蛋白质的减少、病毒噬斑形成的减少。细胞病变分析可以用于确定抗体对干扰素活性的中和效应。示例性的CPE分析描述于Meager，A.1987.Quantification of interferons by anti-viral assays and their standardization.In：Clemens，M.J.，Morris，A.G.，Gearing，A.J.H.(Eds)，Lymphokines and interferons：A Practical Approach.IRL，Press，Oxford，p.129和Grossberg和Sedmak，1984.Assays of interferons In：Billiau，A.(Ed)Interferon，vol.1：General and Applied Aspects.Elsevier，Amsterdam，p.189，以及PCT公开WO2006086586的实施例6，第157-164段和图1。

药物制剂

本发明的另一目的是提供包含[蛋白质]化合物的药物制剂，该化合物的浓度为10-500mg/ml，如20-300mg/ml，优选30-100mg/ml，最优选50-100mg/ml，并且其中所述制剂的pH为2.0至10.0。该制剂还可包含缓冲液系统、防腐剂、张度剂、螯合剂、稳定剂和表面活性剂。在本发明的一个实施方案中，药物制剂是水性制剂，即含水的制剂。这种制剂一般是溶液或悬浮液。在本发明的另一实施方案中，药物制剂是水溶液。术语“水性制剂”被定义为含有至少50％w/w的水的制剂。同样，术语“水溶液”被定义为含有至少50％w/w的水的溶液；术语“水性悬浮液”被定义为含有至少50％w/w的水的悬浮液。

在另一实施方案中，药物制剂是冻干制剂，医生或患者在使用前向其中添加溶剂和/或稀释剂。

在另一实施方案中，药物制剂是不需任何预先溶解即可直接使用的干燥制剂(例如冻干或风干的)。

诊断应用

本发明的IFN-α抗体也具有非治疗应用。例如，抗-IFN-α抗体也可用于IFN-α蛋白的诊断试验，例如，检测其在特定细胞、组织或血清中的表达。例如，抗-IFN-α抗体可在选择用于抗-IFN-α治疗的患者的试验中使用。对于这样的目的，抗-IFN-α抗体可用于分析血清或组织标本中IFN-α的存在。对于诊断应用，抗体一般用可检测部分标记。

治疗应用

本发明也提供了使用此处所述的人源化抗-IFN-α抗体治疗患者的方法。在一个实施方案中，本发明提供此处所述的人源化抗体在制备用于施用于人类患者的药物组合物中的应用。一般地，所述患者患有与至少一种IFN-α亚型的异常表达有关的自身免疫病或炎性疾病或紊乱或具有患所述疾病的危险，该至少一种IFN-α亚型选自亚型A、2、B2、C、F、G、H2、I、J1、K、4a、4b和WA。

可用本发明抗体治疗的病症或紊乱的例子包括但不限于狼疮(例如，系统性红斑狼疮(SLE))、类风湿性关节炎、幼年型慢性关节炎、骨关节炎、脊椎关节病、系统性硬化病(硬皮病)、特发性炎性几病(皮几炎、多肌炎)、舍格伦综合征、脉管炎、系统性脉管炎、结节病、自身免疫性溶血性贫血(免疫全血细胞减少、阵发性睡眠性血红蛋白尿症)、自身免疫性血小板减少症(特发性血小板减少性紫癜、免疫介导的血小板减少症)、甲状腺炎(格雷夫斯氏病、桥本甲状腺炎、幼年型淋巴细胞性甲状腺炎、萎缩性甲状腺炎)、糖尿病、免疫介导的肾病(肾小球肾炎、肾小管间质性肾炎)、中枢和周围神经系统的脱髓鞘疾病如多发性硬化、特发性脱髓鞘性多神经病或格-巴二氏综合征，和慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、肝胆疾病，如传染性肝炎(甲、乙、丙、丁、戊型肝炎和其它非嗜肝病毒)、自身免疫性慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬变、肉芽肿性肝炎和硬化性胆管炎、炎性肠病(溃疡性结肠炎、克罗恩氏病)、乳糜泻、谷蛋白敏感性肠病和Whipple病、自身免疫或免疫介导的皮肤病，包括大疱性皮肤病、多形红斑和接触性皮炎、牛皮癣、变应性疾病如哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎、食物过敏和荨麻疹、肺的免疫性疾病如嗜酸细胞性肺炎、特发性肺纤维化和过敏性肺炎，和移植相关疾病，包括移植物排斥和移植物抗宿主病。在具体实施方案中，所述疾病、病症或紊乱选自狼疮、舍格伦综合征、牛皮癣、糖尿病、类风湿性关节炎和幼年型皮肌炎。在另一具体实施方案中，所述疾病、病症或紊乱是SLE。例如，一方面，抗-IFN-α抗体与一种或多种其它抗炎性剂联用，该抗炎性包括但不限于止痛剂、免疫抑制剂、皮质类固醇和抗-TNFa剂或其它抗细胞因子或抗细胞因子受体剂，和抗血管发生剂。具体实例包括氨甲蝶呤、TSG-6、

和CTLA4-Fc融合蛋白。联合治疗的其它例子在下面提供。

制品

在本发明的另一实施方案中，提供了含有可用于治疗上述疾病的材料的制品。例如，该制品可包括含有此处所述的人源化抗-IFN-α抗体的容器以及指导使用者使用有效量的该抗体治疗人类疾病如自身免疫病或或炎性疾病或紊乱的说明书。制品一般包括容器和位于容器上或与容器结合提供的标签或包装插页。合适的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器等。容器可以由诸如玻璃或塑料等多种材料制成。容器容纳可有效治疗病症的组合物，并且可以具有无菌进入孔(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针头穿透的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是此处所述的人源化抗-IFN-α抗体或抗原结合片段或包含这种抗体的抗体衍生物(例如，免疫偶联物)。标签或包装插页说明该组合物用于治疗选择的疾病，例如，SLE。

而且，制品可以包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中该组合物包含人或人源化抗体，和(b)其中含有组合物的第二容器，其中该组合物包含除所述人或人源化抗体以外的治疗剂。本发明的该实施方案中的制品还可包含说明所述第一和第二组合物可联合用于治疗自身免疫或炎性疾病或紊乱的包装插页。这样的治疗剂可以是前面章节所说的任何辅助治疗。可替代地或者另外，制品还可包含第二(或第三)容器，其中含有药学可接受的缓冲液，如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲液、林格液和葡萄糖溶液。它还可包括从商业和用户观点来说希望的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、填料、针头和注射器。

第二方面，本发明涉及一种特异性结合IFN-α的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体能够结合IFN-α亚型A、2、B2、C、F、G、H2、I、J1、K、4a、4b和WA，但不结合亚型1或D，且其中所述抗体包含比根据Kabat的非人CDR更少的供体氨基酸残基。

根据一个实施方案，CDR H2供体残基包含Kabat残基50-59。在另一实施方案中，所述抗体竞争和/或结合IFN-α亚型上与ACO-1和/或ACO-2抗体所竞争和/或结合的相同的表位。

根据优选的实施方案，抗体是IgG4亚型。在一个优选的实施方案中，抗体包含根据SEQ ID NO：21的CDR H2序列。

第三方面，本发明涉及一种生产本发明的抗体的方法，其中所述方法包括在适宜的条件下孵育编码所述抗体的宿主细胞，然后分离所述抗体。本发明还涉及通过这种方法获得的或可获得的抗体。

第四方面，本发明涉及包含本发明的抗体的组合物。本发明还涉及一种制备本发明的组合物的方法，其中所述方法包括混合抗体或其片段与赋形剂。本发明还涉及通过这些方法获得的或可获得的组合物。

第五方面，本发明涉及一种预防、控制、治疗或改善IFN-α相关炎性疾病或紊乱的方法，所述方法包括给需要的受试者施用预防或治疗有效量的本发明的抗体。

最后，本发明涉及本发明的抗体在制备适合治疗炎性疾病的药物中的应用。

实施例

本发明的进一步的细节通过以下非限制性实施例来说明。

实施例1-鼠ACO-1和ACO-2抗体的测序

本实施例描述了WO20060086586中所述的鼠抗体ACO-1和ACO-2的测序和重组表达，以及对ACO-2VH和VL序列的BLAST检索。

抗体克隆和测序

使用来自Qiagen的RNeasy(#634914)从杂交瘤(ACO-1.5.2和ACO-2.2.1)中提取总RNA。使用来自Clonetech的SMART-RACE cDNA扩增试剂盒从1μg总RNA合成cDNA。反应在42℃运行1.5小时，样品在75μl三羟甲基甲基甘氨酸(tricine)-EDTA中稀释。目标的PCR扩增在50μl反应液中进行，使用5μl cDNA作为模板。重链和轻链的正向引物均为SMART RACE试剂盒中包含的通用引物混合物(UPM)。ACO-1重链(HC)的反向引物序列设计如下：

5′-CTGGGCCAGGTGCTGGAGG(SEQ ID NO：11)和，

对于ACO-1轻链(LC)：

5′-CTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTC(SEQ ID NO：12)。

ACO-2重链(HC)的反向引物序列设计如下：

5′-CTAGCTAGCTCATTTACCCGGAGACCGGGAGATGG(SEQ IDNO：26)和，对于ACO-2轻链(LC)：

5′-GCTCTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTG(SEQ IDNO：27)。

PCR反应使用来自Clonetech的Advantage HF PCR试剂盒进行，PCR程序如下运行：一个94℃/2min的变性步骤，然后以下24个循环：94℃/30sec；55℃/30sec；72℃/1.5min。最终延伸步骤为72℃/10min。PCR产物在含有溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶上鉴定。使用来自GE Healthcare的GFX纯化试剂盒从凝胶中纯化PCR产物，然后克隆到Zero BluntTOPO PCR克隆试剂盒(#K2875-40)并转化到来自Invitrogen的TOP10大肠杆菌细胞中。

使用来自Qiagen的miniprep试剂盒(#27106)从大肠杆菌菌落提取DNA。由MWG Biotech，Matinsried，Germany使用测序引物M13rev(-29)和M13uni(-21)对质粒进行测序。使用VectorNTI根据鉴定的序列证实HC和LC。基于试剂盒的所有步骤都按照厂商说明进行。

从ACO-1.5.2杂交瘤细胞克隆单κLC和单IGg2a HC，其具有以下核酸和氨基酸序列。

ACO-1VH序列(SEQ ID NO：13(包括信号肽))：

atgggatggagctatatcatgctctttttggtagcaacagctacagatgtccactcccaggtccaactgcagcagcctggggctgaactggtgaagcctggggcttcagtgaagctgtcctgtaaggcttctggctacaccttcaccaactactggatgcactgggtgaagcagaggcctggacaaggccttgagtggattggagagattaatcctagccacggtcgtactatctacaatgaaaacttcaagagcaaggccacactgactgtagacaaatcctccatcacagccttcatgcaactcagcagcctgacatctgaggactctgcggtctatttctgtgcaagagggggactgggacccgcctggtttgcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgca

ACO-1VL序列(SEQ ID NO：14(包括信号肽))：

atggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgtctcagtcataatgtccagaggacaaattgttctcacccagtctccagcaatcatgtctgcttctcctggggagaaggtcaccttgacctgcagtgccggctcaagtgtagattccagctatttgtactggtaccagcagaagccaggatcctcccccaaactctggatttatagcacatccaacctggcttctggagtccctgctcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagcatggaggctgaagatgctgcctcttatttctgccatcagtggagtagttacccattcacgttcggctcggggacaaaattggaaataaaacgg

ACO-1VH(SEQ ID NO：1(不包括信号肽))

QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTNYWMHWVKQRPGQGLEWIGEINPSHGRTIYNENFKSKATLTVDKSSITAFMQLSSLTSEDSAVYFCARGGLGPAWFAYWGQGTLVTVSA

ACO-1VL(SEQ ID NO：4(不包括信号肽))

QIVLTQSPAIMSASPGEKVTLTCSAGSSVDSSYLYWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAASYFCHQWSSYPFTFGSGTKLEIKR

从ACO-2.2.1杂交瘤细胞克隆单κ型ACO-2轻链和单IGg2b ACO-2重链，其具有以下核酸和氨基酸序列。

ACO-2VH序列(SEQ ID 28(包括信号肽))

atgggatggagctatatcatcctctttttggtagcagcagctacagatgtccactcccaggtccaactgcagcagcctggggctgaactggtgaagcctggggcttcagtgaagctgtcctgcaaggcctctggctacagcttcaccagctactggatgcactgggtgaagcagaggcctggacaaggccttgagtggattggagagattaatcctagccacggtcgtactagctacaatgagaacttcaagagcaaggccacactgactgtagacaaatcctccaacatagtctacatgcaactcagcagcctgacatctgaggactctgcggtctattactgtgtaagagggggactgggacccgcctggtttgcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgta

ACO-2VL序列(SEQ ID NO：29(包括信号肽))

atggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgtctcagtcataatgtccagaggacaaattgttctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctcctggggagaaggtcaccttgacctgcagtgccggctcaagtgtaggttccagctacttttactggtaccagcagaagccaggatcctcccccaaactctggatttatggcacatccaacctggcttctggagtccctgctcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagcatggaggctgaagatgctgcctcttatttctgccatcagtggagtagttatccattcacgttcggctcggggacaaaattggaaataaaacgg

ACO-2VH序列(SEQ ID NO：7(不包括信号肽))：

QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYSFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEINPSHGRTSYNENFKSKATLTVDKSSNIVYMQLSSLTSEDSAVYYCVRGGLGPAWFAYWGQGTLVTVSV

ACO-2VL序列(SEQ ID NO：9(不包括信号肽))：

QIVLTQSPAIMSASPGEKVTLTCSAGSSVGSSYFYWYQQKPGSSPKLWIYGTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAASYFCHQWSSYPFTFGSGTKLEIKR

发现根据Kabat定义的ACO-2CDR序列如下。

CDR-H1：SYWMH (SEQ ID NO：22)

CDR-H2：EINPSHGRTSYNENFKS(SEQ ID NO：23)

CDR-H3：GGLGPAWFAY (SEQ ID NO：17)

CDR-L1：SAGSSVGSSYFY (SEQ ID NO：24)

CDR-L2：GTSNLAS (SEQ ID NO：25)

CDR-L3：HQWSSYPFT (SEQ ID NO：20)

实施例2-人源化ACO-1的设计和潜在回复突变残基的确认

小鼠ACO-1CDR的确认和表征

发现根据Kabat定义的ACO-1CDR序列如下。

CDR-H1：NYWMH (SEQ ID NO：15)

CDR-H2：EINPSHGRTIYNENFKS(SEQ ID NO：16)

CDR-H3：GGLGPAWFAY (SEQ ID NO：17)

CDR-L1：SAGSSVDSSYLY (SEQ ID NO：18)

CDR-L2：STSNLAS (SEQ ID NO：19)

CDR-L3：HQWSSYPFT (SEQ ID NO：20)

人种系的确认

使用MOE(分子操作环境(Molecular Operating Environment)；可从www.chemcomp.com获得)，用来自蛋白质数据库银行(PDB)的结构模板：1Z3G，建立三维蛋白质结构模型。PDB在Berman等人.(Nucl Acids Res2000；28：235-242)中描述，并可从www.rcsb.org/pdb获得。基于PDB数据库中抗体-抗原复合物的分析，发现互补位中最可能的残基是ACO-1VH的残基23-35、49-58、93-102和ACO-1VL的24-34、49-56、89-97。使用MOE，确定与互补位相互作用(疏水、氢键结合、电荷相互作用)的残基，一组组合残基(互补位+相互作用残基)作为图1所示的ACO-1的所谓遮罩。

用ACO-1VH和ACO-1VL检索种系V数据库返回以下潜在的构架模板(E-值在括号中给出)：

VH：VH1_46(3e-038)VH1_f(6e-037)，VH1_02(6e-037)，VH1_03(1e-036)，VH1_24(2e-034)，

VL：VKIII_L6(9e-035)，VKIII_A11(4e-034)，VKIII_A27(8e-034)，VKIII_L25(1e-033)，VKI_L8(1e-033).

用遮罩检索种系数据库返回以下潜在的构架模板(E-值在括号中给出)：

VH：VH1_46(3e-011)VH1_02(6e-011)，VH1_f(1e-010)，VH5_a(4e-010)，VH1_03(4e-010)，

VL：VKIII_A11(5e-009)，VKIII_L6(7e-009)，VKIII_A27(9e-009)，VKIII_L25(3e-008)，VKI_L9(6e-008).

在手工检查比对和命中结果后，选择VH1_46和VKIII_L6作为人支架。可以选择其它模板来改变或优化，例如，人源化抗体的物理化学性质。选择JH4和JK2作为种系J-区段(分别为SEQ ID NO：2和5)。

最佳人源化ACO-1的设计

人源化使用以下原则进行：

-遮罩以外的残基作为人的。

-遮罩以内的和Kabat CDR以内的残基作为鼠的。

-遮罩以内的和Kabat CDR以外的具有小鼠/种系共有序列的残基作为共有序列。

-遮罩以内的和Kabat CDR以外的具有小鼠/种系的残基作为种系序列，但是鼠差异经受可能的回复突变。

获得的最佳hzACO-1抗体的CDR为(根据Kabat定义)：

CDR_H1 NYWMH (SEQ ID NO：15)

CDR_H2 EINPSHGRTIYAQKFQG(SEQ ID NO：21)

CDR_H3 GGLGPAWFAY (SEQ ID NO：17)

CDR_L1 SAGSSVDSSYLY (SEQ ID NO：18)

CDR_L2 STSNLAS (SEQ ID NO：19)

CDR_L3 HQWSSYPFT (SEQ ID NO：20)

使用上述人源化方法，基于hzACO-1和IFN-αA的三维模型设计预测构成互补位的残基的遮罩，与简单的CDR移植相反，获得具有较少鼠残基的hzACO-1抗体，因为包含优化的hzACO-1CDR H2序列的5个C-末端氨基酸(如上以粗体突出显示)的肽与相应的人构架序列相同，而根据Kabat定义的ACO-1CDR H2序列中的相应肽为鼠源的。另外，在本分析中确认的人源化ACO-1抗体的CDR H1序列短于WO2006/086586所述。优化的hzACO-1抗体或包含hzACO-1VH序列的至少一部分的抗体或抗原结合片段因而可以在人类患者中提供降低的人-抗-小鼠-抗体(HAMA)-反应的风险。另外，在重链位点60-62中序列AQK代替NEN具有避免可能易于脱酰胺化的两个天冬酰胺残基的优点。

潜在回复突变的确认

ACO-1VH和VL序列的分析在图1中显示。在图1中，得到的人源化ACO-1(hzACO-1)VH(SEQ ID NO：3)和VL(SEQ ID NO：6)序列显示具有作为人残基的潜在的回复突变残基，即，不含任何回复突变。确认了构架区中的以下回复突变变体，用于获得一个或多个优化的hzACO-1抗体，为了保持原小鼠抗体的亲和力，这通常是需要的：

-hzACO-1VH：野生型(即，没有回复突变)，V5Q，M69L，R71V，T73K，S76I，V78A及其任何组合；

-hzACO-1VL：野生型，E1Q，L47W，I58V，F71Y及其任何组合；

-各种重链-轻链组合。

实施例3-为了hzACO-1的亲和力成熟，hzACO-1的基于ACO-2的变体的设计

如图2所示，ACO-1和ACO-2VH和VL序列的氨基酸序列比对显示相应的轻链和重链之间具有高序列同一性。不受理论的限制，可能来源于相同前体细胞的抗体具有相同的V-D-J重排并且与种系序列相比含有3个相同的突变。另外，抗体在13个氨基酸残基处不同，这可能是由于随后的体细胞超变。

在ACO-1和ACO-2VH和VL结构域的13个不同的氨基酸残基中，选择9个残基进行突变分析，以提高人源化ACO-1抗体的亲和力(图3)。ACO-2衍生的超变的单一添加可以潜在地确定有害的和有益的氨基酸残基，并且通过允许只引入有益的氨基酸，提高亲和力超过原小鼠ACO-1和ACO-2抗体。基于它们在轻链或重链CDR之一内的位置(根据Kabat定义)，或基于它们在基于抗原-抗体三维模建中概述为潜在抗原相互作用区的区域内的位置，选择针对的残基。

确定以下变体用于获得一种或多种优化的hzACO-1抗体：

-hzACO-1VH：野生型，T28S，N31S，I58S，S76N，T77I和A93V及选自T28S、N31S、I58S、S76N、T77I和A93V的至少两个突变的任意组合；

-hzACO-1VL：野生型，D29G，L33F，S50G及选自D29G、L33F和S50G的至少两个突变的任意组合；

-各种重链-轻链组合。

在hzACO-1轻链和重链构建体内，将残基分别从ACO-1序列突变为ACO-2序列，以评价每个残基对抗原结合的各自贡献。也产生了一系列组合突变体。

实施例4-ACO-1、ACO-2、hzACO-1的克隆和定点诱变

ACO-1、ACO-2和hzACO-1

将VH和VL序列转移到基于CMV启动子的表达载体(pTT载体)，该载体适合在Durocher等人.(Nucleic Acids Res.2002；30(2)：E9)所述的HEK293-EBNA(HEK293-6E)表达系统中瞬时表达。除了CMV启动子以外，该载体还含有pMB1起点、EBV起点和AmpR基因。将ACO-1和ACO-2的VH克隆到分别含有小鼠IgG2a和IgG2b的恒定区的CMV基载体中。将全长LC转移到用于ACO-1和ACO-2的空CMV基载体。hzACO-1可变区的DNA序列从Geneart，Regensburg，Germany订购。将交付的hzACO-1VH序列转移到含有人IgG4(S241P)(在铰链区含有S241P突变)恒定区的表达载体。将交付的hzACO-1VL序列转移到含有人κ轻链恒定区的载体。

hzACO-1的回复突变变体的产生

为了衡量每个残基对抗原结合的分别的贡献，将实施例2中确定的1O个可能的回复突变分别引入hzACO-1HC和LC构建体。也包括几个组合。具有延长的CDR H2的hzACO-1的变体(hzACO-1-Kabat CDRH2)，其对应于鼠CDR H2(SEQ ID NO：16)的Kabat定义，也通过定点诱变产生。

在hzACO-1LC和HC表达载体上进行定点诱变。为了产生单突变体，按照厂商方案使用来自Stratagene的

定点诱变试剂盒(cat.#200518)。所需突变的引入通过对每个突变体的质粒DNA制品进行测序加以证实(MWG Biotech，Matinsried，Germany)。

突变的LC构建体与hzACO-1HC组合用于表达，突变的HC构建体与hzACO-1LC组合用于抗体表达。

具有回复突变的轻链变体：

hzACO-1-E1Q

hzACO-1-L47W

hzACO-1-I58V

hzACO-1-F71Y

hzACO-1-L47W，I58V

具有回复突变的重链变体：

hzACO-1-V5Q

hzACO-1-M69L

hzACO-1-R71V

hzACO-1-T73K

hzACO-1-S76I

hzACO-1-V78A

hzACO-1-R71V，T73K

hzACO-1-M69L，R71V，T73K，S76I，V78A

hzACO-1-Kabat CDRH2

hzACO-1的基于ACO-2的变体的产生

如实施例3所述，为了提高亲和力将ACO-2特异性残基引入hzACO-1抗体的定点诱变，在hzACO-1LC和HC表达载体上进行。为了产生单突变体，按照厂商方案使用来自Stratagene的

定点诱变试剂盒(cat.#200518)。组合突变体使用

定点诱变和

多位点定点诱变试剂盒根据厂商方案产生(cat.#200513)。

对于每个突变体，理想的突变的引入通过对质粒DNA制剂进行测序得到证实(MWG Biotech，Matinsried，Germany)。

突变轻链构建体与hzACO-1重链组合用于表达，突变重链构建体与hzACO-1轻链组合用于抗体表达。

具有ACO-2-衍生突变的轻链变体：

hzACO-1-D29G

hzACO-1-L33F

hzACO-1-S50G

hzACO-1-D29G，L33F，S50G

具有ACO-2-衍生突变的重链变体：

hzACO-1-T28S

hzACO-1-N31S

hzACO-1-I58S

hzACO-1-S76N

hzACO-1-T77I

hzACO-1-A93V

hzACO-1-N31S，I58S

hzACO-1-T28S，N31S，I58S，A93V

hzACO-1-S76N，T77I

hzACO-1-T28S，N31S，I58S，S76N，T77I，A93V

hzACO-1-T28S，A93V

hzACO-1-N31S，A93V

hzACO-1-T28S，N31S，A93V

hzACO-1-T28S，N31S

实施例5-重组ACO衍生抗体的表达

按照普通抗体表达方案，ACO-1、ACO-2、hzACO-1和hzACO-1变体在瞬时转染的HEK293细胞中表达。下面描述了用于悬浮适应的HEK293细胞的转染方案。

细胞保持：悬浮适应的HEK293细胞在补充有25μg/ml遗传霉素

(Invitrogen cat.#：10131-019)、0.1％v/v

F-68(Invitrogen cat.#：12347-019)表面活性剂和1％v/v青霉素-链霉素(任选的)(Invitrogen cat.#15140-122)的

Freestyle^TM 293表达培养基(Invitrogen cat.#：12338-026)中生长。细胞以0.2-2×10⁶细胞/ml的细胞密度维持在37℃，8％CO₂和125rpm的孵箱摇床上的锥形摇瓶中。

DNA转染：用于转染的培养物的细胞密度为0.8-1.5×10⁶细胞/ml。每ml细胞培养液使用0.5μg轻链载体DNA+0.5μg重链载体DNA。293fectin^TM(Invitrogen cat.#：12347-019)用作转染试剂，浓度为每μg转染的DNA 1μl试剂。293fectin^TM在30倍体积的

(Invitrogen cat.#：51985-034)中稀释，混合，并置于室温(23-25℃)下5分钟。DNA在每μg总DNA 30μl

中稀释，混合，并置于室温(23-25℃)下5分钟。DNA和转染试剂稀释液以1∶1混合，并置于室温(23-25℃)下25分钟。将DNA-293fectin^TM混合物直接添加到细胞培养物中。将转染细胞培养物转移到37℃，8％CO₂和125rpm的孵箱摇床上。4-7天后，通过离心收集细胞培养上清液，然后通过0.22μm PES滤器(Corning cat.#：431098)过滤。抗体作为上清液分析或者采用标准蛋白A纯化技术纯化。

hzACO-1和hzACO-1-Kabat CDRH2的表达水平比较

比较hzACO-1和hzACO-1-Kabat CDRH2在HEK293-6E细胞中的瞬时表达水平，以确定远端CDR H2残基对细胞表达两种抗体变体中任一个的能力是否具有任何效应。

HEK293-6E细胞如上所述用用于hzACO-1轻链和hzACO-1或hzACO-1-Kabat CDRH2重链的pTT基表达载体转染。转染一式三份进行。对于每种抗体变体，使用DNA-293Fectin主混合物转录三个培养物(25ml)，以将移液不精确导致的影响最小化。如上所述，转染的培养物在摇床孵箱中孵育4天。在第4天，从培养物提取样品，用于细胞活力和细胞密度测量，其余的细胞培养上清液通过离心收集。使用FortéBioOctet系统和蛋白A生物传感器，通过生物层干涉测量法(Biolayer Interferometry)对澄清的细胞培养上清液直接进行抗体产生的定量分析。细胞培养密度和活力采用Cedex HiRes自动细胞培养分析仪进行测量。结果显示在下表4中。

表4.表达分析

表4中的结果出乎意料地显示hzACO-1(本发明的人源化IFN-α抗体)与hzACO-1-Kabat CDRH2(使用传统方法人源化的人源化IFN-α抗体，因此具有全长Kabat序列)相比的瞬时表达水平有显著差异。对于用两种hzACO-1变体中的任一种转染的细胞培养物，没有观察到细胞活力或密度的差异。hzACO-1的表达水平大约比hzACO-1-Kabat CDRH2抗体变体的表达水平高2倍。

通过移植比Kabat定义的CDRH2更短的CDRH2形式，抗体的表达水平惊人地显著提高。

不受理论约束，可以假定与携带延长的CDR H2(SEQ ID：16)的hzACO-1-Kabat CDRH2抗体相比，hzACO-1中的变体人种系衍生的残基影响HC折叠和潜在的LC-HC相互作用，导致蛋白质稳定性和表达产率提高。

这种由瞬时表达水平上观察到的蛋白质稳定性提高导致的蛋白质表达水平提高将反映在稳定的CHO基生产细胞系中。因此，通过移植较短形式的CDRH2(SEQ ID：21)，能够产生高产稳定的生产细胞系。

hzACO-1的IgG4，1和2变体的表达水平比较

比较hzACO-1和hzACO-1(IgG1)和hzACO-1(IgG2)的先导IgG4(S241P)变体在HEK293-6E细胞中的瞬时表达水平，以确定重链亚类转换对抗体表达水平是否具有任何影响。

实验的进行类似于上述表达分析，但是具有以下改变：该实验一式两份在5ml培养液中进行。培养液在过滤器加帽的50ml falcon管中在37℃，8％CO₂和250rpm的摇床孵箱中孵育。

预料之外地，hzACO-1(IgG1)和hzACO-1(IgG2)的平均表达水平大约为hzACO-1(IgG4)表达水平的65％。基于观察到的蛋白质表达的减少(～35％)，我们的结论是hzACO-1可变域和IgG4恒定域的组合优于与其它链亚类的组合，并且这种分子的开发极大促进了高产、稳定的生产细胞系的产生。

实施例6：IFN-α8在与hzACO-1-Fab的复合物中的晶体结构

使用X-射线晶体学，确定IFN-α8在与hzACO-1的Fab片段的复合物中的晶体结构，并精确到3.3

分辨率(图8)。

材料与方法

IFN-α8(SEQ ID NO：30的氨基酸1-166)和hzACO-1Fab(具有SEQID NO：32的轻链序列和SEQ ID NO：31的残基1-221的重链序列)混合，IFN-α8略微过量，并在凝胶过滤柱上纯化该复合物。将蛋白质复合物hzACO-1-Fab/IFN-α8置于25mM HEPES缓冲液，pH 7.5，+25mM NaCl的缓冲液中，并浓缩到5mg/ml。复合物在100mM HEPES缓冲液，pH 7.5，15％PEG 10,000和15％乙二醇(沉淀物溶液)中结晶。在采集衍射数据之前，将晶体在液氮中急冻。首先将晶体转移到为25％v/v 99％甘油和75％沉淀物溶液的混合物的冷冻溶液中。用beamline BLI911-3，MAX-Lab，Lund，Sweden采集衍射数据。采用XDS程序包(Kabsch，J.Appl.Crystallogr.1993；26：795-800)将衍射数据编入索引并集成。

使用CCP4包(Baily，1994，Acta Crystallogr.Sect.D-Biol.Crystallogr.50，760-763)的PHASER程序(Read，2001，Acta Crystallogr.Sect.D-Biol.Crystallo gr.57，1373-1382)，通过分子置换(MR)法确定三维结构。未复合的hzACO-1Fab的晶体结构在以前确定为1.52

的分辨率(R-和不含R分别为0.18和0.21)，数据未示出。随后在用于hzACO-1/IFN-α8复合物的MR计算中使用这些三维坐标。搜索模型分为三个部分：1)hzACO-1Fab的可变域，2)hzACO-1Fab的恒定域，和3)PDB保藏的IFNtau模型，蛋白质数据银行(Berman等人.，2000，Nucleic Acids Res.28，235-242)登录编码1B5L(RADHAKRISHNAN等人，1999，J.MOL.BIOL.v.286pp.151)，通过COOT程序突变以获得IFN-α8的序列SEQ ID NO：30。最终的空间群确定通过PHASER程序进行。空间群P4₁获得最高得分，其旋转函数峰RZ’s分别为10.7、4.4和2.6σ，平移峰(translation peak)TZ′s分别为24.1、26.4和8.0σ，log-概率增益(likelyhod gains)LLG′s分别为383、918和1134，与对称相关分子没有重叠。

分子置换后在COOT分子图形程序中对该模型进行一些调整，之后施加最多2000K的扭转模拟退火两次，而不改进(refinement)各温度因素。原始R值和无R值分别为0.416和0.439，模拟退火后的最终值分别为0.314和0.427。然后在COOT程序中对该模型进行手工干预，利用REFMAC5程序进行改进(Murshudov等人.，1997，Acta Crystallogr.Sect.D-Biol.Crystallogr.53，240-255)，导致分别为0.216和0.348的R值和无R值。该模型包含残基1-21，而残基22-23被改变为Ala残基，IFN-α8的28-101和114-164，hzACO-1轻链的1-215和hzACO-1重链的1-219。

改进中所见的R和无R之间的相对较大差异是由于有限的数据分辨率，3.3

以及存在在说明电子密度图时完全遗漏的IFN-α8X-射线模型的实质延伸。电子密度图清楚地定义了IFN-α8至hzACO-1-Fab的稳定化界面中的残基，而IFN-α8X-射线结构模型离开抗体位点的细节没有很好地定义，因此没有精确确定。

结果

通过CCP4套件的CONTACT计算机程序确定接触，Fab和IFN-α8分子之间的截止距离采用4.0

发现产生的对于人hzACO-1的表位包含IFN-α8(SEQ ID NO：30)的以下残基：Ser 55、His 58、Glu 59、Gln 62、Gln 63、Asn 66、Glu 97、Leu 118、Arg 121、Lys 122、Phe 124、Gln 125、Arg 126、Thr128、Leu 129、Thr132。参与与IFN-α8、互补位相互作用的hzACO-1的残基包括hzACO-1轻(L)链的Ser 32、Tyr 33、Tyr 35、Tyr50、Ser 51、Trp 92、Ser 93、Tyr 95和Phe 97(根据SEQ ID NO：32编号，不根据Kabat)，和重(H)链的Thr 30、Asn 31、Tyr 32、Trp 33、His 35、Glu 50、Asn 52、Ser 54、His 55、Arg 57、Leu 101、Gly 102、Trp105，表9(根据SEQ ID NO：31编号，而不根据Kabat)。

SEQ ID NO：30

＞IFN_a8

CDLPQTHSLGNRRALILLAQMRRISPFSCLKDRHDFEFPQEEFDDKQFQKAQAISVLHEM

IQQTFNLFSTKDSSAALDETLLDEFYIELDQQLNDLESCVMQEVGVIESPLMYEDSILAV

RKYFQRITLYLTEKKYSSCAWEVVRAEIMRSFSLSINLQKRLKSKE

SEQ ID NO：32

hzACO-1LC

1 EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCSAGSSVD SSYLYWYQQK PGQAPRLLIY

51 STSNLASGIP ARFSGSGSGT DFTLTISSLE PEDFAVYYCH QWSSYPFTFG

101 QGTKLEIKRT VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT ASVVCLLNNF YPREAKVQWK

151 VDNALQSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL TLSKADYEKH KVYACEVTHQ

201 GLSSPVTKSF NRGEC

SEQ ID NO：31

hzACO-1Fab HC

1 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYWMHWVRQA PGQGLEWMGE

51 INPSHGRTIY AQKFQGRVTM TRDTSTSTVY MELSSLRSED TAVYYCARGG

101 LGPAWFAYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APCSRSTSES TAALGCLVKD

151 YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTKTY

201 TCNVDHKPSN TKVDKRVESK

如图9中可见，IFN-α8上的hzACO-1相互作用表位与IFNAR1结合表位部分重叠，而IFNAR2结合表位不同于hzCAO-1结合表位。这提示hzACO-1中和IFN-α是通过中和IFN-α与IFNAR1的结合而不是与IFNAR2的结合而发生的。因此，可以想到hzACO-1结合IFN-α/IFNAR2复合物，但是抑制负责细胞内信号传导的三元受体复合物IFN-α/IFNAR1/IFNAR2的形成。

表5.用于结构确定的IFN-α8：hzACO-1-Fab复合物晶体的参数

表6.来自XDS包的XSCALE程序的X-射线数据统计表

表7.REFMAC程序的IFN-α8：hzACO-1-Fab的最后改进循环的统计数据

表8.IFN-α8-hzACO-1Fab L链相互作用

使用4.0

的截值。利用CCP4套件的CONTACT计算机程序确定接触。在最后一列中，“***”表示通过CONTACT计算，在该接触处有氢键的强烈的可能性(距离＜3.3

)，“*”表示弱可能性(距离＞3.3

)。空白表示程序认为没有氢键的可能性。

表9.IFN-α8-hzACO-1Fab H链相互作用

使用4.0

的截值。通过CCP4套件的CONTACT计算机程序来确定接触。在最后一列中，“***”表示通过CONTACT计算，在该接触处氢键的强烈的可能性(距离＜3.3)，“*”表示弱可能性(距离＞3.3

)。空白表示程序认为没有氢键的可能性。

实施例7：用于hzACO-1亲和力成熟的基于结构的突变的设计

如果抗体/抗原复合物的表位和互补位未知，为了提高抗体的亲和力，大量可能的氨基酸残基可能易于突变，而且，它们可以转化为20 种其余氨基酸残基中的任一种，以确定特定位置处的最佳残基。CDR区具有大约54个可以用于突变的残基。因此，为了提高相互作用的亲和力，可以只在CDR内产生54×20＝1080个类似物。另外，为了提高亲和力可以进行CDR外的突变。

然而，当抗体/抗原的结构已知时，基于结构预测可以预测和分析数量有限的可提高亲和力的突变。因此，基于如实施例6所述的IFN-α8在与hzACO-1的Fab片段的复合物中的晶体结构，确定了三个提高hzACO-1与所有IFN-α亚型结合的突变体。这三个突变体是hzACO-1HCT30R、hzACO-1LC Y32E和组合的hzACO-1Y32E，T30R(残基根据Kabat编号)。突变体的确认如下所述。

LC Y32E：可以看到，IFN-α8的残基Lys 122(它是与hzACO-1的结合表位的一部分)的电子密度表明相当高的迁移率。而且，hzACO-1轻链的残基Tyr 32(Kabat编号)的原子Oη指向Lys 122侧链的Cβ和Cγ原子。该相互作用不是任何最佳的残基-残基相互作用。将轻链Tyr 32突变为带负电荷的残基如Glu或Asp使得能够在抗体轻链Tyr 32残基和IFN-α8的带正电荷的Lys 122残基之间形成强离子键。由于该原因，将Y替换为E，以提高hzACO-1抗体的亲和力。

HC T30R：对于在X-射线结构中接近IFN-α8的每个hzACO-1残基，计算下列性质：核心侧链原子数(core)、外围侧链原子数(peri)、带电荷相互作用数(char)、氢键数(hybo)和疏水相互作用数(hyph)，并在下面给出：

表10.hzACO-1mAb的氨基酸的性质

通过将X-射线结构重叠在101×101×101节点网格上，并对每个网格点计算距该节点＜2.5

的原子数(N_ex)和＜3.5

的原子数(N_in)，由此计算核心和外围原子数。核心节点具有来自hzACO-1和IFN-8两者的N_ex＞0覆盖原子。外围节点具有来自hzACO-1和IFN-α8两者的N_ex＝0和N_in＞0覆盖原子。核心侧链原子现在是距任何节点＜2.5

的原子。外围侧链原子现在是距任何节点＞2.5

且＜3.5

的原子。

最后，外围残基被定义为只有外围原子、没有相互作用的残基，因此它们可以被修饰以产生结合。LC S92、HC T28、HC T30、HC P52、HC Q64和HC P99已经被确认。聚焦于重链非脯氨酸，通过目视观察看出，突变HC T28R将与D90具有可能的相互作用，HC T30R将与D90和E97两者具有可能的相互作用，Q64R将与E114具有可能的相互作用，但是也可以应用其它类似的突变。由于只有E97在所有干扰素α之间保守，预计HC T30R产生具有与hzACO-1类似性质的最佳结合。

设计特定突变HC T30R是为了在结合位点周围建立电荷-电荷相互作用，以提高hzACO-1的亲和力。

此外，也产生了含有LC Y32E和HC T30R突变的双突变体，被命名为hzACO-1Y32E，T30R，进行分析以确定这两个突变是否具有累加效应。

实施例8-hzACO-1、hzACO-1变体和重组人IFN-α亚型之间相互作用的动力学参数的确定

可以使用表面等离子体共振(SPR)分析实时监测蛋白质相互作用。在该研究中，在Biacore 3000和Biacore T100仪器上进行SRP分析，以在针对重组人干扰素α(IFN-α)的各种亚型的亲和力方面表征抗-IFNα单克隆抗体hzACO-1及其变体。

亲和力研究使用直接结合法进行，各自的单克隆抗体通过游离胺基团共价偶联到传感器芯片表面上的羧甲基化葡聚糖膜(CM5)上。重组IFN-α亚型(PBL Biomedical Laboratories，NJ，USA.)以不同浓度注射，然后是解离期，在传感器芯片表面上缓冲液恒定流动。使用这种实验设计，IFN-α与固定的单克隆抗体的结合可以视为1∶1结合，即一个IFN-α分子结合一个抗体结合位点。相互作用的动力学参数可以使用1∶1相互作用langmuir拟合模型进行计算。

将纯化的单克隆抗体固定在CM5型传感器芯片上的各个流动池中。固定采用标准胺偶联方法进行，目标固定水平为1000共振单位(RU)。

HBS-EP pH 7.4(10mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA和0.005％Polysorbat P20)用作电泳缓冲液和重组IFN-α的稀释剂。结合(注射)为4分钟，然后是12-30分钟的解离期。流速为50ul/min。在25℃下进行实验。同时检测所有流动池。1号流动池不含固定的抗体，用于减去背景和体积(bulk)。

使用1∶1langmuir结合模型，通过特定抗体-抗原组合的数据的整体拟合计算动力学参数。在计算动力学参数之前检查数据的质量转运限制。

实验在Biacore 3000和T100仪器上进行。使用Biaeval 4.1和BiacoreT100评价软件评价数据。

获得的动力学参数只在使用的缓冲液中用于抗原的重组形式时是有效的。

结果

为了产生保持亲和力的人源化ACO-1抗体，如实施例2、3和7所述使用不同策略产生了大量人源化变体。重组人IFN-α亚型和hzACO-1变体之间相互作用的动力学参数通过SPR分析获得。如表11所见，即使如实施例2所述产生的hzACO-1含有截短的CDR H2且没有回复突变，hzACO-1的亲和力与鼠ACO-1相比也得到保留，这通过hzACO-1的KD在小鼠抗体的2倍之内得到了证明。因此，如实施例2确定和描述的，人源化不需要在构架区中有进一步的从人到小鼠ACO-1的回复突变。另外，hzACO-1抗体的IFN-α亚型分布已经保留，如表2所示。

表11.重组IFN-αA与ACO-1和hzACO-1变体的相互作用的动力学参数

KD是平衡解离常数，ka是结合速率常数，kd是解离速率常数。

hzACO-1与通过传统CDR移植产生、因此含有大的鼠CDR H2的人源化ACO-1分子(命名为hzACO-1-kabat CDRH2)相比，与重组人IFN-αA相互作用的动力学参数在表12中列出。如表中所示，hzACO-1分子，如实施例2所述人源化并且含有比hzACO-1-kabat CDRH2分子更短的CDR H2的分子，其亲和力是相等的，表明实施例2所述的人源化方法产生的人源化变体与简单CDR移植产生的一样好，同时具有更多人序列。

表12.重组IFN-αA与hzACO-1和hzACO-1-kabat CDRH2相互作用的动力学参数

KD是平衡解离常数，ka是结合速率常数，kd是解离速率常数。

mAb	KD(M)	ka(1/Ms)	kd(1/s)	KD mAb/KD hzACO-1
					hzACO-1	1.9E+09	2.22E+05	4.15E-04	1
hzACO-1-kabat CDRH2	1.7E+09	2.05E+05	3.41E-04	0,9

此外，为了研究hzACO-1和hzACO-1-kabat CDRH2是否具有相当的与人IFN-α各种亚型结合的动力学参数，对选择的人IFN-α亚型进行解离比较实验(表13)。其显示，与hzACO-1-kabat CDRH2相比，hzACO-1对所有测试亚型的亲和力似乎得到保持，尽管其具有较短的小鼠CDRH2序列。

表13.重组人IFN-αA各种亚型分别与hzACO-1和hzACO-1-kabatCRH2之间相互作用的解离速率常数(kd)的比较

为了试图提高hzACO-1的亲和力超过小鼠ACO-1抗体，检测了IFN-αA和含有基于ACO-2序列的突变的不同hzACO-1变体之间的参数的动力学(表11)。为了将单独进行的实验获得的参数相关联，每个抗体的KD值都对相同实验中的hzACO-1标准化，各个mAb的KD值与相同实验中hzACO-1的KD的相关性显示在“KD mAb vs.KD hzACO-1”一列中。

亲和力确定进一步证实了所有ACO2衍生的hzACO-1抗体变体(除hzACO-1-I58S以外)的KD值在较低的nM范围内。KD值的较小变化主要与kd的差异有关。在hzACO-1中引入单氨基酸置换N31S、A93V或T28S及其组合略微提高了亲和力，达到类似于ACO-1的水平。hzACO-1-I58S突变对kd值具有明显的负效应，证实该特定氨基酸对于hzACO-1/IFNα-A复合物的稳定性的重要性。

基于hzACO-1Fab/IFN-α8晶体结构，在hzACO-1中引入许多氨基酸置换，以进一步提高亲和力(参见实施例7)。其中，两个单置换：轻链的Y32E和重链的T30R，对亲和力具有明显的正面效应(表14)，分别使针对IFN-αA的亲和力提高大约2和6倍。显著地，通过组合两种突变，含有Y32E和T30R的hzACO-1构建体，观察到针对IFN-αA的亲和力有大约10倍的提高(表15)。

表14.重组IFN-αA分别与hzACO-1和hzACO-1变体相互作用的动力学参数

KD是平衡解离常数，ka是结合速率常数，kd是解离速率常数。

mAb	KD(M)	ka(1/Ms)	kd(1/s)	KD mAb/KD hzACO-1
					hzACO-1	3.20E-09	1.39E+05	4.43E-04	1
hzACO-1LC Y32E	1.54E-09	2.47E+05	3.81E-04	0.5
					hzACO-1HC T30R	5.40E-10	1.31E+05	7.08E-05	0.16

表15.重组IFN-αA分别与hzACO-1和hzACO-1Y32E，T30R相互作用的动力学参数

KD是平衡解离常数，ka是结合速率常数，kd是解离速率常数。

mAb	KD(M)	ka(1/Ms)	kd(1/s)	KD mAb/KD hzACO-1
					hzACO-1	2.72E-09	1.78E+05	4.85E-04	1
hzACO-1Y32E，T30R	2,97E-10	1.49E+05	4.43E-05	0.1

表16的动力学数据说明，基于合理的设计方法产生的hzACO-1Y32E，T30R构建体已经保留其IFN-α亚型分布，因为它不结合IFN-α1，而结合检测的其余的亚型。为了验证Y32E，T30R突变引起的对动力学参数的影响反映在与人IFN-α各个亚型的结合中，对选择的人IFN-α亚型进行解离比较实验(表16)。尽管提到的双突变体hzACO-1构建体的突变基于IFN-α8的结构，不可预测地，对于检测的所有人IFN-α亚型都观察到改善的解离速率，在6-64倍之间变化。

表16.重组人IFN-α的各种亚型分别与hzACO-1和hzACO-1Y32E，T30R之间相互作用的解离速率常数(kd)的比较

实施例9-在CPE分析中对hzACO-1构建体的分析

本实施例表明，除了不受hzACO-1影响的IFN-α1和IFN-αD以外，hzACO-1能够抑制检测的所有IFN-α亚型的保护效应。

材料与方法

使用的该抗-IFN-α中和试验基于EMC病毒对A549细胞的裂解效应。所有IFN-α亚型都能够抑制EMC病毒在A549细胞中的复制，导致细胞存活，这可以作为细胞DNA染色来测量。抗-IFN-α抗体对不同IFN-α亚型的中和效应可以通过减少的细胞DNA染色来测量，对应于提高的细胞裂解。

该试验在96孔板(Nunc，Cat.No.167008)中进行，其中每个孔含有最终体积200μL。所有IFN-α制剂都来自PBL Bio-medical Laboratories，NJ，USA。

向每个孔中添加四种溶液(IFN-α，hzACO-1，细胞和病毒)，体积各为50μL。所有溶液都在含有10％FCS的F12Kaighn′s培养基(Gibco，Cat.no.21127)中制备。每种IFN-α亚型(列于以下表17中)的具体浓度来自于以前的研究。该试验中使用的抗体浓度基于使用例如鼠抗体ACO-1.5.2和ACO-2.2获得的现有数据进行选择。

每种IFN-α亚型与hzACO-1在37℃，5％CO₂下预孵育2小时。抗干扰素抗体如以下表17所示稀释。抗体与IFN-α预孵育后，添加50μL细胞溶液(300000个细胞/mL)，以获得15000个细胞/孔。在37℃，5％CO₂下孵育4.5小时后，添加50μL浓度为10^3.5TCID₅₀的EMC病毒，然后在37℃，5％CO₂下孵育48小时。

然后小心除去上清液，添加50μL结晶紫溶液(0,5％结晶紫，25％甲醇)。在室温下孵育15分钟后，用水洗孔，并干燥过夜。

然后向干燥的板中添加200μL/孔纯甲醇15分钟，以从细胞中提取结晶紫。提取后，将100μL上清液小心转移到一个新的96孔板上(Nunc，Cat.No.256510)，并向每孔添加100μL Milli-Q水。然后用ELISA读板器在590nm下测量。

从ELISA读板器获得的原始数据在分析之前针对甲醇和板背景进行修正。

表17.CPE分析参数

IFNα亚型	[IFNα](pg/μL)^＊	[hzACO-1](ng/mL)
			IFN-αA	1,25×10-1	2.500-＞0
IFN-α2	3,125×10-2	2.500-＞0
			IFN-αF	6,25×10-2	2.500-＞0
IFN-αK	6,25×10-2	2.500-＞0
			IFN-αWA	6,25×10-2	2.500-＞0
IFN-αB2	2,5×10-2	2.500-＞0
			IFN-αH2	1,25×10-1	2.500-＞0
IFN-αI	5,0×10-2	2.500-＞0
			IFN-αJ1	1,0×10-1	2.500-＞0
IFN-α4a	2,5×10-1	250-＞0
			IFN-αC	2,5×10-2	250-＞0
IFN-αG	2,5×10-1	250-＞0

IFN-α4b	1,25×10-1	250-＞0
			IFN-αD	3,75	50.000-＞0
IFN-α1	1,0	50.000-＞0

结果和讨论

在研究中在所有板上使用6种不同的对照(细胞，细胞+抗体，细胞+IFN-α，细胞+抗体+IFN-α，细胞+病毒，和细胞+IFN-α+病毒)，以确保在该分析中观察到的细胞病变效应不是由抗体和/或IFN-α的细胞毒性引起的，以及IFN-α保护细胞对抗病毒的任何缺乏也不引起细胞病变效应。在该分析中没有观察到明显的细胞病变效应，在对照中在任何干扰素水平下都没有细胞病变效应的迹象。

如图4所示，该CPE分析证明几乎所有干扰素亚型的保护效应能够被hzACO-1抑制。然而，IFN-αD和IFN-α1的保护效应不被hzACO-1抑制，甚至在抗体浓度为50000ng/mL时。因此，hzACO-1构建体中保留了小鼠ACO-1的特异性。

实施例10-在报道基因(RG)生物分析中对ACO衍生的抗体的分析

利用基于萤光素酶的报道基因分析评估hzACO-1抗体变体中和重组IFNα亚型的生物活性的能力。

材料

Dulbecco改良Eagle培养基“完全”：DMEM，包含酚红+10％FCS+2mM L-谷氨酰胺+青霉素+链霉素+2-me.，Nunc 96-孔光学底平板，处理的黑组织培养物，包含1mM Ca²⁺和1mM Mg²⁺的PBS，Steady-Glo萤光素酶测定系统(Promega)。

93D7细胞系通过用IFN-可诱导的构建体稳定转染A549细胞系(CLL-185，ATCC)而产生，该构建体带有驱动萤光素酶报道基因的Mx启动子。Mx启动子由含有鼠MxA启动子和从pSP64-Mxp(PstI-PvuII)-rβglo上切下的IFN反应元件的1.6kb BamHI片段组成(Lleonart等人.(1990)Biotechnology 8：1263-1267)。

使用的IFN-α亚型(均来自PBL Biomedical Laboratories，NJ，USA)在图5中列出。

方法

RG分析在不透明Nunc 96孔光学底板上一式四份进行。对于每个分析，包括阳性对照IFNα，以及含有未被刺激的细胞和在不存在IFNα刺激的情况下用抗体处理的细胞的阴性对照孔。

具体地，通过除去培养基，用PBS洗一次，并用胰蛋白酶消化，从摇瓶中收获贴壁的93D7细胞。使用完全DMEM终止胰蛋白酶消化。计数细胞，在完全DMEM中调整到600,000/ml。

纯化的抗-IFN-αmAb与重组IFN亚型在37℃+5％CO₂下在总体积为100μl的完全DMEM中预孵育1小时。抗体-IFN孵育后，加入50μl93D7细胞，并在37℃+5％CO₂下孵育5小时。

为了分析重组IFN亚种对MxA驱动的萤光素酶的诱导，调整IFN的浓度以含有将要置于每孔100μl中的量。100μl IFN置于一式四份的孔中，在37℃+5％CO₂下孵育1小时。然后加入50μl细胞，并继续孵育另外5小时。

为了使用纯化的mAb分析重组IFN亚种对MxA驱动的萤光素酶诱导的抑制，每孔加入50μl希望的重组IFN的稀释液。然后将在完全DMEM中稀释的50μl抗体加到孔中，并在37℃+5％CO₂下孵育1小时。该孵育后，加入细胞，并继续孵育另外5小时。

5小时孵育后，使用多通道移液器从细胞小心除去培养基。然后将粘性黑封阻体(black blocker)附加到96孔板的底部。向每孔添加100μl含Ca²⁺和Mg²⁺离子的PBS。向每孔添加100μl重配的Steady-Glo试剂，确保每孔中的内容物充分混合。用透明胶带将板密封。5分钟后，在暗处室温下孵育，用Topcount发光计数器(Perkin Elmer)读取发光。

为了计算抗体对IFN诱导的(MxA驱动的)萤光素酶活性发挥的抑制程度，当比较对无抗体时的活性水平标准化的各种IFN-α亚型的抗体抑制时计数，并将该值设定为100％。为了比较抗体的变体形式，单IFN-α抑制数据显示为原始萤光素酶计数。IFN在开始时在无抗体下滴定，以确定EC50和达到试验平台的IFN浓度。当检测抗体抑制时，通常以最大刺激水平的80％使用IFN，以确保该试验中萤光素酶的可靠诱导以及在低于饱和的水平上操作。Prism(GraphPad Software，Inc.，San Diego)软件用于计算和数据显示。

结果和讨论

在报道基因分析中评价人源化ACO-1构建体抑制各种人IFN-α亚型的能力。图5显示hzACO-1抗体对12种IFN-α亚型的抑制的标准化数据。将在不含抗体时的IFN-α刺激设定为100％，而假处理的细胞(只接受培养基)设定为0％。数据点同标准误差一同显示。使用Prism软件将曲线计算为最佳拟合S形反应曲线。hzACO-1能够抑制除了IFN-αD以外的所有检测的IFN-α亚种，因此亲本小鼠ACO-1抗体的特异性在hzACO-1抗体人源化过程中得到保留。抑制完全，因为在高抗体浓度时，IFN-α活性降低到背景水平。该研究中抑制各种IFN-α亚型的IC50的范围为28ng/ml至314ng/ml。IFN-αD甚至在较高的hzACO-1浓度时也不能被抑制。

图10显示RG分析中小鼠ACO-1Ab与人源化ACO-1(hzACO-1)及其两种变体的比较。一个变体是携带完整CDRH2的人源化ACO-1(命名为hzACO-1-kabat CDRH2)，而如实施例2所述构建含有较短的CDRH2的hzACO-1。另外，该图显示另一突变hzACO-1，其已经如实施例7所述通过合理设计优化用于与多种IFN-α相互作用(命名为hzACO-1Y32E，T30R)。这四种重组mAb变体在RG分析中在抑制5种不同典型IFN-α亚型方面进行比较。

hzACO-1显示对于全部5种IFN亚型有与小鼠ACO-1几乎相当的IC50值，根据实施例8报道的观察到的KD，定量的IC50低于2倍(相对IC50值参见表18)。因此人源化对于功能性抑制具有不到亲本ACO-1抗体两倍的亲和力丧失。结论是，ACO-1的mAb人源化产生保留对IFN-α的亲和力的抗体。因此，与原小鼠ACO-1相比，hzACO-1抗体中亲和力和效能都保留，而不需要进一步的回复突变。

如实施例2所述，ACO-1的人源化方法产生的抗体在CDR H2中具有比通过简单CDR移植的普通人源化相对更多的人氨基酸。预期这可导致人源化ACO-1对于IFN-α亚型中和的能力降低，如图10和表18所示，令人惊奇的是这不是事实，因为hzACO-1和hzACO-1-kabat CDRH2对检测的所有IFN-α亚型都具有同等的能力。这符合对于实施例8所述的两种ACO-1变体报道的亲和力。

表18.hzACO-1变体对IFN-α亚型抑制的IC50值

标准化的数据。对于每个IFN-α种的IC50值相对于hzACO-1的值标准化。因此小于1的值表示比IFN-α活性的hzACO-1抑制更强的抗体。而相反地，大于1的值表示具有较低能力的抑制。

为了确定ACO-2衍生的hzACO-1变体的效能，如实施例3所述，使用RG分析将它们与hzACO-1进行比较。使用两个IFN-α亚种(IFN-αF和IFN-αA)进行比较。测试了4个不同的单氨基酸置换：T28S(即位点28(根据Kabat)的苏氨酸被置换为丝氨酸)、I58S、N31S和A93V。

I58S变体抑制IFN-作用具有降低的能力，可能也具有降低的效能(IFN-αA)，而T28S和N31S变体都显示类似于hzACO-1的能力。但是，如RG分析所测定的，A93V置换的变体显示抑制IFN-效应的能力提高(图6)。尽管在不同IFN-α亚型之间可以检测到置换效应的差异，但是所有4种情况下两种形式的趋势是相同的。

通过使用实施例6的晶体结构合理设计，如实施例7所述，构建了有两个氨基酸改变的突变体：hzACO-1的HC T30R，LC Y32E(命名为ACO-1Y32E，T30R)，用于改善与IFN-α的结合。尽管突变是基于IFN-α8的结构，如图10(A-E)所见，令人惊奇的是该突变体具有提高的抑制所有测试的IFN-α的能力。此外，表18显示能力的提高依赖于特定亚型，能力提高的等级为16倍，直到50倍。

因此可见，从实施例6的晶体结构获得的表位信息可以用来设计对该表位的结合亲和力改善的其它抗体变体。也因此可见，这些根据本发明的人源化抗体变体包括在本发明的范围内。

实施例11-ACO衍生的人源化抗体的蛋白质表征

本实施例涉及hzACO-1和不同变体的热稳定性。

材料

抗体

hzACO-1表达为人IgG1、IgG2和IgG4同种型

hzACO-1-T28S

hzACO-1-N31S

hzACO-1-A93V

hzACO-1-T28S-N31S

以下是本研究中使用的缓冲液(100mM)及其pH值的列表：柠檬酸/柠檬酸钠，pH 3.0，3.5；乙酸钠，pH 4.0，4.5和5.0；组氨酸，pH 6.0，6.5；咪唑，pH 7.0；甘氨酸-甘氨酸pH 8.0，9.0，10.0。

以下是本研究中使用的添加剂及其浓度的列表：NaCl，100mM；蔗糖0.25M，0.50M；苯酚，0.5％；Tween 80，0.01％；甘油10％。

Thermofluor稳定性测量

向96孔PCR板(Biorad)的孔中添加10μl 400×SYPRO Orange蛋白质凝胶染料5000×浓缩物在DMSO中的溶液(Invitrogen Molecular Probes)、25μl缓冲液和10μl蛋白质(10μM)。用Microseal B粘性封膜MSB-1001(Biorad)将板密封并在MyiQ Single-Color实时PCR检测系统(Biorad)中从25℃至95℃以0.5℃的增量加热。用电荷耦合器件(CCD)照相机同时监测板孔中的荧光变化。激发和发射波长分别为490和575nm。以作为温度函数的荧光强度的第一衍生物最大值确定蛋白质解折叠转变的中点温度。

hzACO-1和变体的thermofluor图显示IgG蛋白质有两个预期的温度转变，反映有两个主要结构域Fc和Fab。该蛋白质在较低pH下显示较低的Tm。在pH 5.5以上转变中点相当恒定。

添加剂对不同抗体的效果相同。通常，0.5M蔗糖具有最好的稳定效果，而添加NaCl、苯酚和Tween 80似乎具有去稳定效果。

在较低pH(pH 3.5)时，在hzACO-1和不同变体之间观察到稳定性的差异(图7A)。双突变体hzACO-1-T28S-N31S和单突变体hzACO-1-A93V在该pH时显示最高的稳定性。这在治疗性抗体产品的纯化过程中可能非常重要，因为病毒灭活步骤通常在pH 3.5-4.0下进行。在较高pH(pH 4.5，5.5；分别见图7B和7C)时，这种稳定性差异降低。

溶液稳定性研究

hzACO-1-IgG4、hzACO-1-IgG1和hzACO-1-IgG2在15mM组氨酸pH 6.5、蔗糖20mg/ml和tween 800.01％中的溶液在40℃下孵育，在开始时和5周后取出样品进行分析。hzACO-1的完整蛋白质、可溶性聚集物和/或片段的分布使用大小排阻色谱法(SEC-HPLC)来确定。高效液相色谱(HPLC)系统1100或1200型液相色谱系统(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)与BIOSEP SEC 3000(Phenomenex)柱一起使用，流速为0.8mL/min，使用pH 7.2和磷酸盐缓冲液(PBS)作为流动相。通过监测215nm的OD检测蛋白质。计算总蛋白质面积中每个峰的百分比。

形成的高分子量形式的hzACO-1同种型的量在图11中显示，清楚地表明IgG4构建体显示在孵育过程中不形成聚集物，而IgG1和IgG2同种型两个都形成高分子量变体。

此外，hzACO-1-IgG1变体孵育后显示低分子量片段。片段的含量为1.3％。

因此，从稳定性观点出发，hzACO-1IgG4是比相应的IgG2和IgG1抗体更有吸引力的治疗性分子。

实施例12-ADCC分析

如实施例6所述，ACO-1mAb及其人源化形式可以通过抑制IFN-α与I型干扰素α受体亚单位1(IFNAR1)的结合阻断IFN-α的活性。因此，治疗性人源化ACO-1mAb可以结合细胞表面，形成由抗体、IFN-α和IFNAR2组成的复合物。这提高了ACO-1诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的风险。

为此目的，进行ADCC实验以评估表达为IgG4亚型的hzACO-1抗体在IFN-α2A的存在下的能力。

材料与方法

Raji细胞(人B细胞系(ATCC#CCL-86))用作靶细胞。Raji细胞在添加有10％胎牛血清、10mM HEPES，1mM丙酮酸钠、1mM谷氨酰胺、2.5g/l葡萄糖和1％青霉素/链霉素的RPMI1640中培养。高度纯化的干扰素-α2A用于该分析。使用前在报道基因分析中检测蛋白质的生物活性。当使用Raji细胞(它是表达B细胞表面抗原CD-20的B细胞系)时，使用

(Nomeco A/S，Denmark)作为ADCC的阳性对照。

收获靶细胞并用血细胞计数器计数。将1.5×10⁶细胞转移到15mL试管中并离心。完全除去上清液，将细胞沉淀物重悬浮在每10⁶个细胞100μCi⁵¹Cr(铬-51)中(根据衰变表调整体积)。在37℃下与IFN-α孵育1小时期间，每15分钟拍打小瓶。随后在培养基(RPMI1640，10％FCS)中洗涤细胞两次，并重悬浮在2mL分析培养基中。将5000个⁵¹Cr标记的细胞以50μL体积接种到96孔板(平底)中。一式三份分析所有样品。最大和最小释放在不含效应细胞的孔中测定。最大释放：5000个靶细胞/孔+1％Triton X-100。最小释放：5000个靶细胞/孔。效应细胞采用标准技术通过Ficoll密度离心从“血沉棕黄层”纯化。将分等级数目的新分离的人PBMC加到每个孔中。使用以下效应细胞∶靶细胞(E∶T)比例：10、20、40和80。在所有实验中，hzACO-1都在10μg/ml(66nM)的饱和浓度下检测。IFN-α2A以0.5、2.5、5和10nM的浓度检测。最终分析体积为200μL。在37℃孵育4小时后，将30μL上清液转移到Luma-Plate^TM并使之风干过夜。在TopCount NXT(PerkinElmer，USA)中检测放射性。将数据输入程序，计算三次重复的平均每分钟计数和相应的标准差。

结果

如图12所见，对于表达为IgG4的hzACO-1分子，在存在或不存在IFN-α的情况下，没有观察到高于背景(细胞或细胞与IFN-α)的ADCC的诱导。相反，用作阳性对照的Rituxumab在不同的效应细胞∶靶细胞比(E∶T)时均诱导细胞裂解。

实施例13-补体结合ELISA试验

如实施例6所述，ACO-1mAb和其人源化形式可以通过抑制IFN-α与I型干扰素α受体亚单位1(IFNAR1)的结合阻断IFN-α的活性。因此，治疗性人源化ACO-1mAb可以结合细胞表面，形成由抗体、IFN-α和IFNAR2组成的复合物。这提高了活化补体系统和诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)的风险。

本补体结合研究的目的是检测当表达为人IgG4同种型的hzACO-1与hIFN-α上的相应表位结合并形成复合物时，经典补体途径是否被活化。这使用ELISA完成，ELISA测量抗体与C4的结合。C4的结合表明C1s改变，并且补体级联已经启动。一旦C4已经结合，来自血浆的其它补体成分将依次被活化，结合，及酶切级联的下一成分。

材料与方法

链霉亲和素包被的微板孔(236001，NUNC)用作ELISA板。生物素化的hIFN-α2A用作抗原来源，平板用在洗涤缓冲液(10mM Na₃PO₄+145mM NaCl+0.05％Tween 20)中稀释的0.25μg/ml蛋白质以100μl/孔包被。已证明该hIFN-α浓度是ELISA中的最佳包被浓度。平板在室温和轻轻摇动下孵育60分钟，然后用洗涤缓冲液洗涤5次，将最后一次洗涤的缓冲液留在板中30分钟，以阻断板上可能残余的结合位点。从板上弃去缓冲液，以1μg/ml向板中添加在洗涤缓冲液中稀释的100μlhzACO-1mAb。平板在室温和轻轻摇动下孵育60分钟。用洗涤缓冲液洗板5次。多克隆抗-IgG4pAb通过hzACO-1IgG4mAb的交联用作阳性对照。抗-IgG4pAb mAb在洗涤缓冲液中稀释，并以从32μg/ml到32ng/ml的系列稀释度以100μl/孔加到板上。采用两种不同的抗-IgG4pAb纯化，一种是亲和力纯化的抗体，另一种是蛋白A纯化的抗体。平板在室温和轻轻摇动下孵育60分钟。用洗涤缓冲液洗板5次。以100μl/孔添加在血浆缓冲液(PBS，含0.3mM Ca²⁺，1mM Mg²⁺)中1∶200稀释的人血浆。平板在室温和轻轻摇动下孵育60分钟。洗板5次，并以100μl/孔向板上添加分别在洗涤缓冲液中1∶2000稀释的小鼠抗-人C4(HYB 162-02+HYB162-04，SSI)。平板在室温和轻轻摇动下孵育60分钟。用洗涤缓冲液洗板5次，之后添加100μl/孔的在洗涤缓冲液中1∶1000稀释的HRP-兔抗-小鼠IgG(DAKO P0260)。洗板5次，向所有孔添加100μl TMB底物。孵育大约6分钟后，向所有孔添加100μl 4M H₃PO₄以终止酶反应。用Victor读板器(Wallac)以分光光度法测量颜色。

结果

通过ELISA，使用IFN-α包被的板，检测表达为人IgG4同种型的hzACO-1结合补体成分的能力。这通过检测与C4的结合进行显示，C4是经典补体级联中的一种成分。如图13所示，hzACO-1IgG4不能固定补体。作为阳性对照，多克隆抗-IgG4pAb用来通过hzACO-1IgG4抗体的交联诱导结合。如果hzACO-1与抗-IgG4pAb交叉结合，则检测到C4与抗IgG4的清楚的剂量依赖性结合。

实施例14-抗体同种型的选择

当表达人源化单克隆抗体时，需要选择人抗体同种型用于表达全长人抗体。为了开发中和性抗-IFN-α抗体，不需要Fc介导的效应功能。

此外，尽管ACO-1衍生的抗体能够中和IFN-α活性(实施例9和实施例10)，但是如实施例6所述，ACO-1抗体变体的结合表位与IFNAR2受体亚单位和IFN-α的同时结合匹配。因此，尽管治疗性hzACO-1mAb结合可溶性IFN-α细胞因子，但是mAb实际上能够通过IFN-α/IFNAR2复合物结合到细胞表面，并且通过Fc介导的效应功能的补充引起细胞毒性。除此之外，对于抗I型IFNs(IFN-α和IFN-β)的抗体，抗体同种型的选择特别重要，因为已经记载抗-IFN mAb的Fc部分实际上可引起不希望的生物效应，导致某些细胞型中IFN加强而不是中和，如下所述(MollHP.等人J Immunol 180，1594-604，2008)。

在I型IFN的存在下，通常在其它细胞型中中和IFN活性的抗人IFN-α或IFN-β抗体，反而在IFN-α或IFN-β的存在下在人内皮细胞和PMBC中诱导IFN活性。这些研究中使用的抗体是小鼠IgG1同种型，已经知道它们交叉结合人Fc受体。IFN活性的诱导只见于完整的抗体，而未见于相同抗体的Fab或Fab2片段，并且似乎被抗体同种型对照mAb对Fc受体的阻断而抑制。因此，尽管该现象的分子机制未知，但是似乎要求这些mAb通过Fc部分结合到细胞表面受体。此外，该现象似乎对于I型IFN是特异性的，作为抗II型IFN(IFN-γ)的抗体，而对于抗I型IFN受体(IFNAR)的抗体没有观察到类似的现象(Moll HP.等人JImmunol 180，1594-604，2008)。

总之，对于用于中和IFN-α的治疗性抗-IFN mAb的开发，Fc介导的效应功能是不需要的，并且实际上可能通过在用抗-IFN-αmAb治疗的患者的某些细胞型中引起细胞毒性或加强IFN活性，导致不希望的生物效应。因此，不能诱导效应功能的人源化mAb的产生可能是关键性的。

存在4种不同的人抗体同种型，即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。其中，IgG1和IgG3在结合Fc受体和补体方面是最有效的，因此导致Fc介导的效应功能的激活，如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)(Salfeld JG.Biotechnol 25，1369-1372，2007)。消除各种Fc受体和C 1q的结合的突变已经在文献中记载(Hezareh M.等人J Virol 75，12161-12168，2001.Idusogie EE.等人.J Immunol 164，4178-4184，2000.LundJ.等人J Immunol.；147：2657-6，1991.和Chappel等人1991，CanfieldMS等人J Exp Med.173：1483-91，1991)。但是，例如选择IgG1同种型以及包含几个突变将可能能够导致免疫原性，并且导致人体针对Fc部分的免疫应答，因此修饰的Fc区在人体中将不会自然发生。

由于此原因，hzACO-1抗-IFN-αmAb表达为IgG2和IgG4同种型两种，它们都用作治疗性抗体(Salfeld JG.Biotech-nol 25，1369-1372，2007)。意料之外的是，IgG4构建体的表达水平明显高于IgG2hzACO-1变体(实施例5)，这将相当大地提高产率。此外，IgG2hzACO-1分子，而不是IgG4变体，容易聚集(实施例11)。这被认为是药物开发中的一个严重问题，因为聚集可降低生产过程中的产率，限制保存期，以及由于免疫原性提高而降低在患者中的效能。

因此，选择hzACO-1IgG4构建体，用于在IFN-α的存在下在ADCC分析中以及在补体固定ELISA分析中进一步表征，分别如实施例12和13所述。这些数据证实了hzACO-1IgG4分子确实不能导致不希望的细胞毒性。预想的IFN-α活性加强的缺乏也可以在PBMC和EC中得到证实，如Moll等人2008所述。

总之，hzACO-1IgG4分子似乎是特别合适的治疗性分子，因为它能够中和IFN-α而不诱导由Fc介导的效应功能引起的不希望的副作用，包括细胞毒性和IFN活性的加强，并且因为它是稳定的且良好表达的分子，使其适合于生产和向患者给药。

实施例15-T细胞表位的分析

基于标准免疫原性预测技术(De Groot，A.S.和Moise，L.Curr.Opin.Drug Discov.Devel.10，332-340，2007)，利用ProPred(Singh，H.&Raghava.G.P.ProPred.BiolFNormatics.17，1236-1237，2001)扩展的袋分布法(Sturniolo.T.等人.Nat.Biotechnol.17，555-561，1999)预测51个HLA-DRB等位基因之间的线性T-细胞表位。该方法计算评价的蛋白质内的9个残基长的给定肽可结合的等位基因数。如果结合多个等位基因的给定肽是非人来源的，则其可以用作免疫原性的间接量度。如果该肽是人源的，则预计由于相应T-细胞的早期负选择，没有免疫应答。

本实施例的目的是比较使用全长hzACO-1-kabat CDRH2的人源化程序与实际用于hzACO-1的人源化程序的预测的免疫原性。

作为向ProPred算法中的输入序列，使用在hzACO-1-kabat CDRH2周围增加10+10个残基的全长ACO-1CDR_H2：APGQGLEWMG/EINPSHGRTIYNENFKS/RVTMTRDTST(CDR_H2_Full)，

以及相同区域的可比的hzACO-1序列

APGQGLEWMG/EINPSHGRTIYAQKFQG/RVTMTRDTST(CDR_H2_Human)

使CDR_H2_Full通过T-细胞表位预测器运行获得以下3个表位：WMGEINPSH(结合4％的HLA-DRB等位基因)、INPSHGRTI(6％)和FKSRVTMTR(24％)。对于CDR_H2_Human，前两个次要表位相同，而最后一个主要表位转变为FQGRVTMTR(27％)。即使它仍然是T-细胞表位，但现在是完全人序列，并且根据自反应性T-细胞被胸腺中的负选择删除的假设，CDR_H2_Full中这一潜在的主要表位已经被CDR_H2_Human序列除去。

因此，预期hzACO-1的免疫原性低于传统的CDR移植的人源化ACO-1。

实施例16-CDR截短

如实施例2所述，通过非传统方法将小鼠ACO-1抗体人源化。这构成了基于hzACO-1和IFN-αA的三维模型预测包含互补位的残基遮罩的设计。应用该人源化方法产生具有比通过简单CDR移植人源化的抗体更少的鼠残基的hzACO-1抗体，因为包含优化hzACO-1CDR H2序列的5个C-末端氨基酸的肽与相应的人构架序列相同。相反，传统CDR移植的人源化抗体(hzACO-1-kabat CDRH2)中的相应的肽序列是鼠源的。因此，该人源化程序产生具有更多人序列的人源化抗体，在患者中引起免疫原性的可能性较低。CDR H2的序列分析揭示，通过减少hzACO-1中的小鼠氨基酸残基，含有小鼠氨基酸的MHC II类T细胞表位被移除并替换为预计患者将耐受的完全人表位。因此，这证实了预计hzACO-1的免疫原性低于传统CDR移植的人源化ACO-1抗体。

如实施例8所示，hzACO-1抗体的亲和力保持在小鼠ACO-1抗体的2倍以内。因此，不需要进一步的小鼠回复突变。此外，如实施例8、9和10所述，抗体的IFN-α亚型分布保留结合和中和除了IFN-α1/D以外的全部IFN-α亚型。尽管在CDR H2中含有较少的小鼠氨基酸，但是hzACO-1的亲和力与hzACO-1-kabat CDRH2抗体的亲和力和效能相同，后者含有来自小鼠ACO-1抗体的全长小鼠CDR H2(分别见实施例8和9)。

此外，利用希望的人源化方法用序列AQK替换重链位置60-62的NEN具有避免两个可能易于脱酰胺化的天冬酰胺残基的优点。脱酰胺化改变可能影响稳定性和/或特异性的蛋白质的净电荷。通过保持序列AQK，hzACO-1的同质性更好地保持。hzACO-1与传统CDR移植的hzACO-1-kabat CDRH2形式的比较揭示hzACO-1是高度稳定的蛋白质，而hzACO-1-kabat CDRH2抗体意外地具有聚集倾向(实施例11)。聚集被认为是药物开发中的一个严重问题，因为聚集可导致生产过程中较低的产率，限制保存期，以及由于免疫原性提高而降低在患者中的效能。另外，hzACO-1构建体的表达水平出乎意料地两倍于hzACO-1-kabatCDRH2变体(实施例5)。

总之，hzACO-1IgG4抗体被通过新型方法人源化，产生具有较少小鼠氨基酸的治疗性抗体，它在患者中引起免疫原性的可能性较低。尽管含有较少的来自原小鼠mAb的氨基酸，但是该人源化抗体具有与小鼠抗体和通过传统CDR移植产生的人源化形式相当的亲和力、效能和IFN-α亚型分布。此外，hzACO-1抗体较不容易脱酰胺化，并且具有较高的表达水平。因此，hzACO-1抗体是适合制备和施用于患者的稳定的、良好表达的分子。