JP2003535605A - 神経変性性障害のトランスジェニック動物モデル - Google Patents
神経変性性障害のトランスジェニック動物モデルInfo
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Abstract
Description
ヒト動物モデルに関する。より詳細には、本発明は、アルツハイマー病の病理モ
機構の特徴づけ、ならびに診断、治療および治療用化合物の開発を容易にするマ
ウスモデルに関する。
してなされており、その全てが本明細書において参考として援用されている。
的および環境的決定要因を含む、複雑な病因を有する。アルツハイマー病は、ア
ミロイドβペプチド(Aβ)から形成された脳のアミロイド沈着、神経欠損、お
よび神経原線維変化(NFT)として公知の細胞内沈着(微小管結合蛋白質タウ
(τ)の高リン酸化形態から構成される)によって特徴付けられる。
イドβ−ペプチド(Aβ)の生合成が、この疾患の病因において共通する特徴で
あることが示されている。第21染色体に関連した家系の場合、変異はエンドプ
ロテアーゼ部分に隣接し、この変異ではAβが、アルツハイマーアミロイド前駆
体タンパク質(APP)から切り取られるが、プレセニリン1および2における
変異は、AβのC末端境界(いわゆるγセクレターゼ部位)でAPPの切断を強
化すると考えられる。第17染色体上のタウ遺伝子は、ADでは変異していない
が、ミスセンス置換およびスプライス部位変異が、ADに対するいくつかの病理
的に類似性の条件(例えば、前頭側頭痴呆)で存在する。
る病理的経路の上流に存在することが示される。初期の議論は、Aβアミロイド
またはNFTのいずれが神経の欠損および機能不全を生じるかということに集中
していたが、現在では、両方のタイプのタンパク質凝集とも毒性であってADの
臨床的表現型に寄与しているようにみえる。
ク動物モデルは、ヒト疾患における重要な病理的事象を明確にし、そして順序付
ける能力を有する。しかし、労力の大きさにもかかわらず、満足なモデルはほと
んど存在しない。
型か、または「スウェーデン型」変異を有するかのいずれか)を発現し、そして
一般に出生から1年以内に進行性の神経学的障害を発症するトランスジェニック
マウスに関する。米国特許第6,037,521号は、ヒトAPPのカルボキシ
末端部分の99〜103アミノ酸をコードする導入遺伝子を有するアルツハイマ
ー病の動物モデルに関する。米国特許第5,894,078号は、トランスジェ
ニックマウスであって、そのゲノムが神経フィラメント遺伝子のエキソンIに挿
入されたヒトβAPPのカルボキシ末端の100アミノ酸をコードするDNA配
列を含むトランスジェニックマウスに関する。米国特許第5,850,003号
は、スウェーデン型変異を有するヒトAPP751をコードする導入遺伝子を保
有するトランスジェニックマウスに関する。
関する。ここでは、この動物は、変異プレセニリン1導入遺伝子、およびAPP695 導入遺伝子(スウェーデン型変異を保有する)の両方を保有し、かつ発現
する。
/またはその代謝体を生成することができず、そしてその警告を適用しない場合
、このトランスジェニック動物は、AD表現型の特定の側面しか示し得ない。神
経病理学に関して、ADにおいてみられるアミロイド沈着に非常に密接に類似し
ているアミロイド沈着、選択的神経欠損(ある場合には)、およびタウの高リン
酸化が存在し得るが、NFTの沈着は存在しない。さらに、これらの神経病理学
的異常は、8〜9ヶ月齢まで、または6ヶ月齢まで(二遺伝子(bigenic
)またはホモ接合性の動物の場合)出現し得ない。これらのモデルの作成におい
て遭遇する他の問題としては、APPの過剰発現に起因する新生児死亡率、複雑
な遺伝子背景の使用、および一般には明確な証拠のない進行性の認知機能不全が
挙げられる。
動物モデルの必要性が存在する。これによって動物は長期間維持される必要がな
くなり、そして診断および治療の化合物が開発され、そしてさらにかなり迅速に
そしてコストがかからずにスクリーニングできる。
る。この動物モデルは、好ましい実施形態において、TgCRND8と名付けら
れたトランスジェニックマウスを含むが、このトランスジェニックマウスは、3
ヶ月齢までにCNSにおいて、高レベルのAβ合成およびアミロイド沈着を示す
。さらに、TgCRND8マウスは、アミロイド沈着が開始する時点までに認知
の変化を示す。本発明はまた、アルツハイマー病のTgCRND8トランスジェ
ニック動物モデルの生成のための方法を提供する。
よって、この疾患の病因は、さらに良好に理解され得、そして有効な薬物治療を
含む、可能性のある処置が開発され、そして試験され得る。
ロイドタンパク質の発現、ならびに組織学的分析、神経学、および行動不全に基
づく、天然に存在するアルツハイマー病表現型に対する類似の大きさによって、
特徴付ける。
ムを生成する。770アミノ酸を含む最長のアイソフォーム(APP770)、
および751アミノ酸を含む2番目の長さのアイソフォーム(APP751)は
、ほとんどの組織で発現される。695アミノ酸を含む3番目の転写物(APP695 )は、脳において主に発現される。慣例により、より短いアイソフォーム
のコドン位置をいう場合でも、最長のアイソフォーム(APP770)のコドン
番号付けを用いる。
ォームの変異形態を発現する導入遺伝子を含む;この導入遺伝子は、「スウェー
デン型(Swedish)」APP変異および「インディアナ型(Indian
a)」APP変異の両方を保有する。
ンディアナ型変異)を含む(APP695のコドン番号付けを用いる)APP6 95 のcDNAを生成した。これらおよび他のAPP変異は、さらに一般的なA
PP770コドン番号付けシステムを用いて(すなわち、これらの2つの変異で
ある、K670N/M671L(スウェーデン型変異)およびV717F(イン
ディアナ変異)について)、一般に本明細書(特許請求の範囲を含む)において
言及されている。
sTetに挿入した。このベクターは、Sirian(シリア)ハムスタープリ
オンタンパク質遺伝子プロモーターを含む。次いで、このベクターをマウスの卵
母細胞にマイクロインジェクションして、TgCRND8と名付けられたトラン
スジェニック系統を作製した。これらのマウスは、3ヶ月齢までに複数の散在性
のアミロイド沈着を示し、この時点で空間学習における欠損が明らかになる。
有する種々の他のトランスジェニックマウスと交配して、さらに増強されたAD
関連神経病理を示す、二重トランスジェニック(bi−transgenic)
)マウスを産生する。
って、そのゲノムは、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を
含み、かつ異種アミロイド前駆体タンパク質695(APP695)ポリペプチ
ドをコードしており、ここで、このポリペプチドの670位のリジン残基は、ア
スパラギンで置換され、671位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そ
して717位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されており、そしてこの
導入遺伝子が発現される、トランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。
APP695はヒトAPP695である。
下: (a)ゲノムが導入遺伝子を含む第一のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を
、第二の遺伝子を含むゲノムを有する第二の非ヒト哺乳動物と交配して第一世代
の子孫を産生する工程であって、この導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に
連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種アミロイド前駆体タンパク質69
5(APP695)ポリペプチドをコードしており、ここで、このポリペプチド
の670位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、671位のメチオニン残
基は、ロイシンで置換され、そして717位のバリン残基は、フェニルアラニン
で置換されており、そしてこの導入遺伝子が発現され、そしてこの第二の遺伝子
は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ少なく
とも1つの選択された変異を有する選択されたタンパク質をコードする、工程;
ならびに (b)この第一世代の子孫から、少なくとも1つの第一導入遺伝子および少な
くとも1つの第二遺伝子を含むゲノムを有し、そしてこの少なくとも1つの第一
導入遺伝子およびこの少なくとも1つの第二遺伝子の両方を発現するトランスジ
ェニック非ヒト哺乳動物を選択する工程であって、この第一導入遺伝子は、プロ
モーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種APP69 5 ポリペプチドをコードし、ここでこのポリペプチドの670位のリジン残基は
、アスパラギンで置換され、671位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され
、そして717位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されており、そして
この第二遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含
み、かつ少なくとも1つの選択された変異体を有する上記選択されたタンパク質
をコードする、工程、 によって産生される、トランスジェニック非ヒト哺乳動物が提供される。
二の遺伝子を含むゲノムを有する第二のマウスと交配して第一世代の子孫を産生
する工程であって、この導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌ
クレオチド配列を含み、かつヒトAPP695ポリペプチドをコードしており、
ここで、このポリペプチドの670位のリジン残基は、アスパラギンで置換され
、671位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして717位のバリン
残基は、フェニルアラニンで置換されており、そしてこの導入遺伝子が発現され
、そしてこの第二の遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチ
ド配列を含み、かつ少なくとも1つの選択された変異を有する選択されたタンパ
ク質をコードする、工程;ならびに (b)この第一世代の子孫から、少なくとも1つの第一導入遺伝子および少な
くとも1つの第二遺伝子を含むゲノムを有し、そしてこの少なくとも1つの第一
導入遺伝子およびこの少なくとも1つの第二遺伝子の両方を発現するトランスジ
ェニックマウスを選択する工程であって、この第一導入遺伝子は、プロモーター
に作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種APP695ポリペ
プチドをコードし、ここでこのポリペプチドの670位のリジン残基は、アスパ
ラギンで置換され、671位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして
717位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されており、そしてこの第二
遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ
少なくとも1つの選択された変異を有するこの選択されたタンパク質をコードす
る、工程、 によって産生される、トランスジェニックマウスを提供する。
候補化合物をスクリーニングするための方法であって、以下の工程: (a)本明細書に記載されたような第一のトランスジェニックマウスにおける
、選択されたAD関連表現型特徴の出現の前に、このマウスに対してこの候補化
合物を投与する工程;および (b)このマウスにおいてこの選択されたAD関連表現型特徴が出現する年齢
を、この化合物を投与しなかった、同じタイプの第二のトランスジェニックマウ
スにおいてこの特徴が出現する年齢と比較する工程; を包含し、 ここでこの第二のマウスにおいてこの特徴が出現した年齢と比べた、この第一
のマウスにおいてこの特徴が出現した年齢の上昇は、この化合物の有効性を示す
、方法が提供される。
効性について候補化合物をスクリーニングするための方法であって、以下の工程
: (a)本明細書に記載のような第一のトランスジェニックマウスに対してこの
候補化合物を投与する工程; (b)記憶試験または学習試験においてこのマウスの能力を決定する工程;お
よび (c)このマウスのこの能力を、この化合物を投与しなかった、同じタイプの
第二のトランスジェニックマウスの能力と比較する工程; を包含し、 ここでこの第二のマウスの能力と比べた、この第一のマウスの改善された能力
は、この化合物の有効性を示す、方法が提供される。
スジェニック非ヒト哺乳動物を産生する方法であって、以下: (a)導入遺伝子をこの哺乳動物の受精した卵母細胞に導入する工程であって
、この導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を
含み、かつ異種アミロイド前駆体タンパク質695(APP695)ポリペプチ
ドをコードしており、ここで、このポリペプチドの670位のリジン残基は、ア
スパラギンで置換され、671位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そ
して717位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されている、工程; (b)偽妊娠哺乳動物中にこの受精卵母細胞を移植する工程; (c)この受精卵母細胞を生きて誕生した子孫中で発育させる工程;および (d)ゲノムが導入遺伝子を含む子孫を選択する工程であって、この導入遺伝
子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種
アミロイド前駆体タンパク質695(APP695)ポリペプチドをコードして
おり、ここで、このポリペプチドの670位のリジン残基は、アスパラギンで置
換され、671位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして717位の
バリン残基は、フェニルアラニンで置換されており、そしてこの導入遺伝子が発
現される、工程; を包含する、方法が提供される。
ペプチドの670位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、671位のメチ
オニン残基は、ロイシンで置換され、そして717位のバリン残基は、フェニル
アラニンで置換されている、ヌクレオチド配列が提供される。また、プロモータ
ーに作動可能に連結されたこのようなヌクレオチド配列を含む、ベクターも提供
される。
より好ましくはマウスを提供し、これは、アルツハイマー病(AD)、アルツハ
イマー病のレーヴィ体変種、および特定の型のクロイツフェルト−ヤーコプ病(
CJD)(これは、痴呆を引き起こす)、アミロイドーシスオランダ型(HCA
WA−D)を有する遺伝性小脳性血管障害、および脳出血を引き起こす老年性ア
ミロイド血管症のような多数のヒト障害において見られるものと同様の異常なA
β沈着を示す。
、組織学的および行動性欠損を示す。特に、本発明のトランスジェニック非ヒト
哺乳動物は、種々の面のヒトAD関連病態の促進された出現を示し、そしてAD
の改善された動物モデルを提供する。
ペプチド、好ましくはヒトAPP695ポリペプチドをコードする導入遺伝子を
そのゲノム中に有する哺乳動物を含み、このポリペプチドは、アルツハイマー病
アミロイド前駆タンパク質(APP)の「スウェーデン」変異および「インディ
アナ」変異の両方を保有する。これらの変異の両方は、ヒトにおいて、家族性ア
ルツハイマー病(FAD)に関連する。
ジェニックマウスを含み、これは、「スウェーデン」APP変異および「インデ
ィアナ」APP変異の両方を保有するAPP695導入遺伝子を有する。
ドメインのN末端およびC末端境界に隣接して位置する、2つのFAD変異:「
スウェーデン」変異(K670N、M671L)および「インディアナ」変異(
V717F)を含むように改変される。このカセットは、cosTet(CNS
ニューロンそしてより少ない程度で星状細胞における位置独立導入遺伝子発現を
指向するプリオンプロモーター発現ベクター)に導入された。微小注入は、ハイ
ブリッド遺伝的背景の卵母細胞(C3HおよびC57BL6株を含む)中に行な
った。得られたトランスジェニックマウス系統を、TgCRND8と命名した。
を指向する、任意のプロモーターが使用され得る。これらとしては、ニューロン
特異的エノラーゼ遺伝子プロモーター(37);ヒト血小板由来増殖因子Bサブ
ユニットプロモーター(38)、Thy−1プロモーター(19)および神経フ
ィラメントプロモーター(41)が挙げられる。
中に組み込まれた導入遺伝子コピーに比例して発現される、遺伝子由来のプロモ
ーター配列および遺伝子座位制御領域配列を含む。
ない;他のADモデルは、APP751(KM670/761NL+V717I
)(19)導入遺伝子またはAPP770(KM670/671NL+V717
F)(27)導入遺伝子を使用した。
反応性の球状プラークの形態で沈着する大量のCNSアミロイドを示す;このよ
うなプラークは、ヒトADに特徴的である。単離されたプラーク沈着物は、生後
66日ほども早く、TgCRND8マウスにおいて明白である。TgCRND8
マウスにおけるアミロイド沈着の出現は、任意の以前に報告された単一の導入遺
伝子を使用するADの動物モデルよりも、より早く生じる(表1を参照のこと)
。
の例が表1に列挙されている。列挙された特性から注目されるように、TgCR
ND8マウスは、他の現在利用可能なADの動物モデルに対して予想外かつ実質
的な改善を示す。
P22」マウス)(これは、二重変異APP751カセット(KM670/67
1NL+V717I)を使用した)は、18か月齢でのAβプラークの出現を示
し(19)、そしてJ9系統(二重変異APP770カセット(KM670/6
71NL+V717F))は、8〜10か月でプラークを発生することが報告さ
れた(27)。
0日齢由来の帯状皮質における最小のプラーク沈着を有したが(39)、最終的
に、6か月齢で、十分に形成された沈着物を示した(22)。
よび開発のため、ならびに疾患の病原性機構のより良い解明のために有用である
。
idden−platform)バージョンによって評価されるように、空間的
学習における欠損を示す。コントロールの非トランスジェニック同腹仔に対して
測定されるこれらの欠損は、11週齢ほども早くに検出され得る(図1)。
、10〜22週齢で、行動および神経病理の両方において有意な改善を生じるこ
とを示してきた。対照的に、Schenkらによって使用されたPDAPPマウ
スは、行動ではなく、神経病理において改善を示したのみであった(26)。
かつ広範に受け入れられた開始事象)の調節が、病理および行動の両方の改善を
生じることが示されている第1のAD動物モデルであり、従って、新しい治療を
試験するためおよび候補治療化合物をスクリーニングするための最新の最も適切
なモデルを提供する。
またはβAPPのタンパク質分解誘導体の除去を促進する際、PS1の機能を阻
害することを目的とし得る。これらのタンパク質分解APP誘導体は、Aβ自身
(これは、凝集形態で神経毒性であることが公知である)ならびにαAPPおよ
びβAPPの残りのγ−セクレターゼ切断から生じるC末端誘導体(C83/C
99−βAPP)(これは、神経毒性であることが示唆されている)を含む(2
5)。
であり得る。例えば、脳のAβ充填の推定アッセイまたはAβ蓄積に応答するニ
ューロンの損傷の試験は、本明細書中に記載されるトランスジェニックマウスを
用いて行なわれ得る。
ナ変異の両方を有するAPP695をコードする導入遺伝子を有する)は、「二
重トランスジェニック(bi−transgenic)哺乳動物」を生成するた
めに、導入遺伝子中かまたは内因性遺伝子中かのいずれかで異なる変異を保有す
る他の系統の哺乳動物と交配され得る。
ムが、異種APP695ポリペプチド、好ましくはヒトAPP695ポリペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子(スウェーデンAPP変異お
よびインディアナAPP変異ならびに選択された第2の遺伝子を保有する)、好
ましくは少なくとも1つの選択された変異を有するタンパク質をコードするヌク
レオチド配列を含む遺伝子を含む哺乳動物を意味する。
または少なくとも1つの選択された変異を保有する同種導入遺伝子もしくは異種
導入遺伝子であり得る。選択された変異は、例えば、AD関連変異またはAβプ
ロセシングに関連する遺伝子における変異であり得る。
合成経路がこれらのマウスにおいて飽和していないという点で、さらなるAD動
物モデルの作成のために有用であり、AD動物モデルを、他のトランスジェニッ
クマウスと交配し、アミロイドペプチド合成および沈着のAD関連病理学的プロ
セスのさらなる増強を有する二重トランスジェニックモデルを得ることが可能で
ある。
遺伝子、変異ニカストリン(nicastrin)遺伝子またはAPP遺伝子の
異なる変異を保有するトランスジェニック動物と交配され得る。
セニリン1タンパク質をコードする導入遺伝子を含むトランスジェニックマウス
; (b)変異プレセニリン2タンパク質、好ましくはPS2(M239V)プレ
セニリン2タンパク質をコードする導入遺伝子を含むトランスジェニックマウス
; (c)2つの変異を有するプレセニリン1タンパク質、好ましくはPS1(M
146L+L286L)プレセニリン1タンパク質をコードする導入遺伝子を含
むトランスジェニックマウス、 とTgCRND8マウスとを交配することによって生成される二重トランスジェ
ニックマウスを提供する。
に、従来の方法を使用して、第1および第2の導入遺伝子の両方存在および発現
についてスクリーニングする。
低密度リポタンパク質レセプター関連遺伝子、α2−マクログロブリン遺伝子ま
たはβ−セクレターゼ遺伝子)中に変異を保有するトランスジェニック動物と交
配され得る。
遺伝子を過剰発現するトランスジェニックマウスと交配した(表2)。プラーク
密度における強力な増加が、TgPS1(L286V)1274(これは、家族
性アルツハイマー病(FAD)変異を保有する)と表されるヒト変異プレセニリ
ン導入遺伝子を同時発現するTgCRND8マウスにおいて注目された。従って
、TgCRND8×TgPS1(L286V)1274マウスにおいて、死後の
AD脳に酷似するアミロイド負担はすでに、62日齢までに存在する(図1A:
パネルC中の117日齢のTgCRND8マウスと比較する)。
PS2遺伝子コード領域のアミノ酸残基239におけるメチオニンからバリンへ
の変異)を保有するマウスと交配することによってもまた、プラーク密度におけ
る強力な増加を生じる。TgCRND8マウスおよびTgCRND8×TgPS
2(M239V)マウス(ここで、PS2導入遺伝子系統は1379と命名され
る)の91日齢での比較は、図2に示される。
D変異を有するヒト変異プレセニリン導入遺伝子を保有するマウス(Tg(M1
46L+L286V)6500と表される)と交配することによって得られた。
TgCRND8×TgPS1(M146L+L286V)6500マウスにおい
て、海馬アミロイド沈着は、30日齢までで検出可能であり(図3)、これは、
任意の他の二重APP/PS1−Tgマウス(これは、代表的に6か月齢以降に
プラークを発生する)について以前に報告されたよりも、5か月早い(22、2
3)。
PS1親のいずれかと比較した場合、海馬アミロイドプラークのなおより促進さ
れた出現を示した(表2)。
えて、予備分析は、皮質ニューロンの実質的な喪失が、43週齢のTgCRND
8×TgPS1(M146L+L286V)6500二重導入遺伝子マウスにお
いて明らかであることを示す。
(TgPS2(M239V))のFAD対立遺伝子を発現するマウスと、TgC
RND8マウス(系統1379)を交配することによって作成された二重導入遺
伝子マウスにおいて見られる(図5)。
ば、AD関連変異)を保有する他のマウス系統とのこれらのマウスの交配は、本
明細書中にさらに記載されるように、多数の目的に有用である。
AD関連表現型形質)のいずれかの発生を防止または遅延する際にそれらの効力
について潜在的な薬学的化合物をスクリーニングするために使用され得る。従っ
て、ADの発生を防止または遅延する際にそれらの効力について候補化合物をス
クリーニングするための方法が提供される。このスクリーニング方法は、選択さ
れたAD関連表現型形質の出現の前に本発明のトランスジェニックマウスに候補
化合物を投与する工程、および未処置のトランスジェニックマウスにおけるその
形質の出現の齢と、選択された表現型形質が処置されたマウスにおいて出現する
齢を比較する工程を包含する。試験するための適切なAD関連形質は、異常な脳
の病歴の出現または行動的欠損の出現を含む。行動性欠損は、本明細書中に記載
されるように、例えば、水迷路のような記憶試験または学習試験におけるマウス
の成績を調査することによって、決定され得る。
は行動性欠損)の出現後、同様に投与することによって、そしてトランスジェニ
ック動物における候補化合物の効果を比較することによって、ADの症状を軽減
する際にそれらの効率について潜在的な薬学的化合物をスクリーニングするため
に使用され得る。
に研究するために、トランスジェニック動物の成長および発達の間に同定され得
る。脳において短期間にAβを迅速に過剰発現する本発明のトランスジェニック
動物が、ここで作製され、そして研究され、そして薬学的介入、遺伝子標的技術
、アンチセンス療法、抗体療法などを含む可能性のある治療法を研究するための
モデルとして使用される。さらに、トランスジェニックインビトロ細胞株はまた
、ここで、本発明に従って樹立され、そして疾患に関与する細胞内シグナル伝達
系を解明するため、ならびに潜在的な治療化合物を試験および同定するために使
用され得る。
よび開始すると疑われている状態または環境危険(例えば、頭部外傷または毒性
環境因子)を調査するために使用され得る。この場合、トランスジェニック動物
は、特定の状態に曝露され、次いでADをさらに引き起こすそして/または増強
する状態の能力の指標として、神経行動学的減退、早過ぎる死、神経膠症などを
決定するために観察される。
について有用であり、進行性の神経病理の病原性および分子事象の配列の決定の
解明を導く。トランスジェニック動物は、疾患の病理の種々の提唱された機構を
研究するために有用であり、疾患のよりよい処置を導く。
ずれかで役割を果たし得る以前に認識されていない遺伝子の同定のために有用で
ある。候補遺伝子を保有するトランスジェニックマウスは、本発明のトランスジ
ェニックマウスと交配され、そしてこのトランスジェニックのAD関連形質に関
する候補遺伝子の存在の効果が調査される。候補遺伝子は、アミロイド沈着およ
び障害性うっ血性動作のようなAD関連表現型を遅延または薄める場合、有益で
あるとしてスコア付けされる。逆に、候補遺伝子は、発現の齢を進行するかまた
はアミロイド沈着および障害性うっ血性動作のようなAD関連表現型の浸透を増
強する場合、ADの発生を支持するとしてスコア付けされる。
治療(例えば、さらなるコピーの正常なプレセニリン遺伝子の投与による遺伝子
治療)を試験するために有用である。
ハイマー病の非ヒト動物モデルを提供することが当業者によって理解される。こ
のようなモデルは、胚発生、成長および発達の間のβAPPおよびAβペプチド
の役割の同定、ならびにアルツハイマー病に関与するようなβAPPおよびAβ
ペプチドの機能の理解を提供する。
ら、これらは、飼うのが容易であり、比較的安価で、そして繁殖が容易であるた
めである。しかし、他の非ヒトトランスジェニック動物(例えば、これらに限定
されないが、サル、ヒツジ、ウサギおよびラット)がまた、本発明に従って作製
され得る。トランスジェニック動物は、連続する世代に継代される導入遺伝子を
保有する(すなわち、クローニングされた遺伝子が導入され、そして安定して組
み込まれた)動物である。本発明において、ヒトAPP695cDNAがクロー
ニングされ、そして2つのFAD変異(「スウェーデン」変異(K670N、M
671L)および「インディアナ」変異(V717F))を含むように改変され
た。次いで、この構築物をマウスのゲノムに安定して組み込んだ。
ランスジェニック動物モデルを作製する方法がいくつか存在する。
は、インビトロで使用される種々の酵素学的方法および化学的方法によって達成
され得る。最も一般的な方法の1つは、DNA配列における正確に設計された欠
失、挿入および点変異を作製するために、変異原として特定のオリゴヌクレオチ
ドを使用する方法である。第2に、野生型ヒト遺伝子および/またはヒト化マウ
ス遺伝子は、相同組換えによって挿入され得る。野生型または変異または人工プ
ロモーターエレメントを使用するゲノムまたはミニ遺伝子構築物として、変更さ
れたかまたは変異(単一または複数の)ヒト遺伝子を挿入することはまた可能で
ある。内因性マウス遺伝子のノックアウトは、相同組換えによって内因性遺伝子
の人工的に改変されたフラグメントの挿入によって達成され得る。この技術にお
いて、変異対立遺伝子は、相同組換えによって、胚性幹細胞に導入される。研究
されている遺伝子の1つの対立遺伝子においてノックアウト変異を含む胚性幹細
胞は、初期マウス胚に導入される。得られたマウスは、移植ES細胞および宿主
細胞の両方に由来する組織を含むキメラである。キメラマウスを、変異が生殖系
列に組み込まれたか否かを評価するために、交尾させる。各々がノックアウト変
異にヘテロ接合性であるこれらのキメラマウスを、ホモ接合性のノックアウトマ
ウスを生成するために交尾させる。
を置換するために使用される遺伝子の機能をインビボで評価することを可能にす
る。改変としては、変異終止コドンの挿入、DNA配列の欠失、またはCreリ
コンビナーゼのような酵素によって認識される組換えエレメント(lox p部
位)の包含が挙げられる。Cre−lox系は、所定の遺伝子の除去または遺伝
子配列の特定の一部の除去を可能にする。
され、その後受精が続く。次いで、異種接合性子孫が、サザンブロッティングに
よって同定され得、投薬による1つの対立遺伝子の喪失、またはRFLPマーカ
ーを使用する1つの親対立遺伝子を遺伝することの失敗を示す。
バージョンは、標準的技術の卵母細胞の微小注入もしくはトランスフェクション
または幹細胞へのトランスフェクションを使用して、マウス生殖系列に挿入され
得る。あるいは、内因性遺伝子を不活化または置換することが望ましい場合、幹
細胞を使用する相同組換えは、上記のように適用され得る。
は、ちょうど受精したマウス卵母細胞の前核に挿入され得る。次いで、この卵母
細胞は、偽妊娠仮母親に再移植される。次いで、生産マウスは、変更されたAP
P遺伝子配列の存在についてテールDNAの分析を使用して成分についてスクリ
ーニングされ得る。導入遺伝子は、YACもしくは染色体フラグメントとして注
入される完全ゲノム配列、天然プロモーターもしくは異種プロモーターのいずれ
かを有するcDNA、または最適な発現に必要であることが見出されている全て
のコード領域および他のエレメントを含むミニ遺伝子のいずれかであり得る。
われ得る。この方法において、変更された遺伝子は、キメラを生成するための発
生の初期段階の間にマウス胚を直接感染するために使用されるレトロウイルスベ
クターに挿入され、キメラのいくつかは、生殖系列伝達を生じる。
相同組換え事象を同定することを可能にする。一旦同定されると、これらは、マ
ウス胚盤胞の注入によってキメラを生成するために使用され、そして得られたマ
ウスの比率は、組換え系統からの生殖伝達を示す。この遺伝子標的化方法論は、
遺伝子の不活化が望ましい場合、特に有用である。例えば、遺伝子の不活化は、
選択マーカーに隣接するエキソン由来の配列を含むDNAフラグメントを設計す
ることによって、行なわれ得る。相同組換えは、エキソンの真ん中にマーカー配
列の挿入を生じ、遺伝子を不活化する。次いで、個々のクローンのDNA分析は
、相同組換え事象を認識するために使用され得る。
PCRによってスクリーニングすることによって、マウス生殖系列において変異
を作製することはまた可能である。
ような核酸構築物が、脳における増加したAβ生成を生じる変異APP695タ
ンパク質をコードする任意の適切な核酸配列を含み得ることを容易に理解する。
このような核酸配列は、好ましくは全長変異APP695cDNAであるが、タ
ンパク質の所望の変異形態が発現されそしてAβ生成が顕著に増加する限り、こ
のような配列の他の変更された誘導体を含み得る。
。
合成化学、タンパク質生化学およびペプチド生化学、分子生物学、組織学ならび
に免疫学の方法は、科学論文に報告されそして当業者に周知である。
5」)および271bpの3’非翻訳領域を含むヒトβ−アミロイド前駆体タン
パク質(1)(βAPP)cDNAカセットを変異誘発して、互いにシスの、家
族性アルツハイマー病(FAD)に関連する2つの変異を導入した。第一の変異
は、隣接する2つのコドンに影響するジヌクレオチドの変化(APP770転写
物のコドン/ヌクレオチド番号付け(1)を用いると、ヌクレオチド1785お
よび1786でKM670/671NL:GA→TC)である、「Swedis
h」変異(2)であった。第二の変異は、V717F置換を産生する単一ヌクレ
オチドの変化(3)であった(APP770転写物(1)のコドン/ヌクレオチ
ド番号付けを用いると、ヌクレオチド1924でG→T)。Kunitz Pr
otease Inhibitorドメインをコードするエキソン7および8を
欠くAPP695転写物は、脳で発現される主要な転写物である。βAPP二重
変異体cDNAカセットを、プリオンタンパク質コスミド発現ベクターcosT
et(10)に挿入した。
DNAを得て、そしてPrP遺伝子調節エレメントおよびAPPコード領域を含
む哺乳動物のDNA挿入物を、制限エンドヌクレアーゼNot1を用いた消化に
よって、この分子クローンの原核生物ベクター配列から切り出した。アガロース
ゲル電気泳動して、このトランスジーンNot1 DNAフラグメントを精製し
た後、精製したDNAを、標準のプロトコール(29)を用いてマウスの受精し
た卵母細胞((C3Hマウス×C57BL6マウス)の交配から誘導した)にマ
イクロインジェクションした。養母に移植後、生産児うちトランスジーン陽性子
孫を、SyrianハムスターPrP遺伝子(30)の3’非翻訳領域由来のD
NAプローブフラグメントを用いて、尾部のDNAのハイブリダイゼーション分
析によってスクリーニングした。
nnheim)を、トランスジーン陽性の子孫でのトランスジーンの発現を確証
するために用いた。0.32Mショ糖中で作製した10%脳ホモジネートを、L
aemlli緩衝液で希釈し、超音波処理し、そして10〜20%トリシン(t
ricine)勾配ゲル(Novex)で電気泳動した。ニトロセルロースに転
写後、ヒトAPPおよびPS1を、C末端特異的MabおよびN末端特異的Ma
bを用いて検出し、ECL(Amersham)によって発色させた。結果を図
6に示す。120kDaおよび100kDaの全長の成熟APPホロタンパク質
および未成熟APPホロタンパク質に加えて、ウエスタンブロット分析は、Tg
CRND8マウスの脳の抽出物における、より低い分子量種およびより低い発現
レベルのAPPを示した。6E10抗血清(α−セクレターゼ切断部位に対して
N末端に位置する)および抗体369を用いたこれらの種の検出は、これらがA
PPのC末端に由来することを示す。これらは、過剰発現によって高レベルで蓄
積され、そしてβ−セクレターゼ部位(いわゆるβ−stub)で始まるC末端
フラグメント(CTF)に対応する、APPプロセシング中間体のようであった
。老年期のTgCRND8マウスでは、動物が老化するのにつれて増加するレベ
ルの4kDaの種もまた、検出されたが、齢の一致した非Tg同腹仔でもTg2
576マウスでもこれは検出されなかった。4kDaの免疫応答性種は、これら
の動物の生涯の間に高レベルに蓄積するAβペプチドに対応する。
のように、マウスゲノム中にトランスジーンの無作為な挿入を導く。挿入したト
ランスジーンの制限エンドヌクレアーゼマッピングは、これらが、頭−尾(he
ad−to−tail)アレイで挿入され、1アレイあたりのトランスジーン数
(コピー数)は、一倍体ゲノムあたり100を超えるまでトランスジーンコピー
に達することを証明する(24)。
ために、好ましくは内在性発現レベルの5〜6倍のAPPの過剰発現を示すはず
である。脳でのAPP発現を、マウスAPPおよびヒトAPPの両方を認識する
22C11(Roche Diagnostics)のようなAPP指向性抗体
を用いたウエスタンブロット分析によって決定する。
スジーンの発現レベルがコピー数と並行して増加するような、トランスジーンア
レイの位置非依存性の発現を示している(4,40)。それゆえ、このベクター
を使用する場合、所望の高レベルのAPP発現を有するトランスジェニックマウ
スを、高いトランスジーンコピー数(好ましくは、少なくとも30コピー)を有
するトランスジーン陽性マウスを、ハイブリダイゼーション分析(30)で同定
することによって、最初に同定し得る。
んど明らかになっていない影響に起因して、成体早期で早死にする傾向があると
はいえ、この傾向は、C57系統およびC3H系統由来の遺伝的バックグラウン
ドにおいて弱まる。それゆえ、TgCRND8マウスは、Aβペプチドレベルを
、生存率を損なうことなしに許容させ得ることを確立する。
抗体4G8を用い、ホルマリン固定し、パラフィンワックス包埋した脳材料から
の切片を用いて行った。この免疫組織化学的手順のための標準プロトコールは、
別に記載されている(17,20,23)。単離したプラーク沈着物は、生後6
0日という早期にTgCRND8マウスにおいて可視化になり、びまん性アミロ
イド斑の頑強な沈着物は90日齢から可能になる。高密度の中心を有する斑は、
4〜5ヶ月齢で明らかであり、これらの型の沈着物の多くは、コンゴ−レッド(
β−シートリッチアミロイド沈着物中にインターカレートされる試薬)で染まり
、偏光下で緑/金複屈折をもたらす。同様の複屈折沈着物は、ヒトADの脳サン
プルに存在する。アミロイド沈着物は、TgCRND8マウスにおいて、ヒトア
ルツハイマー病によって重大な影響を受ける領域である海馬および大脳皮質(特
に前頭皮質)に顕著であった。散発性ADでは通常免れるが、ADの重症な早発
型症例でのびまん性Aβ沈着物によって穏やかに影響を受け得る小脳もまた、1
年齢のTgCRND8マウスおよび6ヶ月齢で変異体PS1または変異体PS2
を同時発現するTgCRND8マウスにおいて、穏やかに影響を受ける。
て全身性に発現したが、腎臓、骨格筋、および心筋はPrP mRNAの発現が
知られている部位であるにもかかわらず、アミロイド沈着物は、顕症のCNS沈
着物を有する老化した動物の腎臓、骨格筋、および心筋における免疫染色によっ
て視覚的に明らかではなかった。
ダイムのMorris水迷路(31)を用いて評価した。TgCRND8マウス
の行動分析は、11週齢という早期の水迷路の場所識別(同じ空間的位置の隠し
たプラットフォーム)バージョンにて評価された、それらの空間情報獲得の重大
な認知欠損を明らかにした。トレーニングの間、マウスは有意に遅い学習速度を
示し、この学習速度は、より長いエスケープ潜時および探索通路ならびに隠した
プラットフォームを含む四分区画の偶然のレベル探索に反映される(図1)。T
gCRND8マウスはまた、探索足跡(probe trail)で試験する場
合、空間記憶の欠損を示した。この試行の間、隠したプラットフォームを取り外
し、そしてマウスに60秒間その位置を探索させた。非Tgマウスは、プラット
フォーム位置に対する明らかで選択的な空間の偏りを示し(図1,EおよびF)
、TgCRND8マウスの探索は、非Tg同腹仔よりも全体にわたりかつTQ四
分区画に隣接して含まれ、そしてプラットフォーム位置の周りの環状部を有意に
少なく横断した。APP陽性マウスおよび非Tgマウスの両方の泳ぐ能力は、試
験の間は同等であり、従って、学習の尺度は偏らなかった。
スジェニックマウス) TgCRND8マウスを、TgPS1(L286V)系統1274と称される
FAD関連変異体プレセニリン1遺伝子を有するトランスジェニックマウスと交
配させた。これらの子孫を離乳させ、そしてゲノムDNAの調製のために尾部の
生検を取り出した。精製された尾部のDNAを、ナイロン膜上にニ連の「ドット
−ブロット」アレイで固定化し、そしてcDNAクローンから切り出したヒトA
PPコード領域の遺伝子特異的プローブまたはcDNAクローンから切り出した
ヒトPS1クローニング領域プローブフラグメントを用いてハイブリダイズさせ
た。これらのDNA制限フラグメントを、α−32p−dCTP(33)で無作
為にプライミングすることによって標識した。二連のナイロン膜を、APPまた
はPS1のいずれかのハイブリダイゼーションプローブとともにインキュベート
し、そして65℃の温度で0.1% ドデシル硫酸ナトリウム(sodium
dodecyl suphate)、0.1×クエン酸ナトリウム生理食塩水の
溶液(これは、マウスのゲノム内で内在性PS1遺伝子およびAPP遺伝子に由
来するシグナルを最少化するような「ストリンジェント」なハイブリダイゼーシ
ョン後の洗浄に対応する)中で洗浄した。二重トランスジェニックマウスを、対
応する尾部のDNAサンプルがAPP遺伝子特異的プローブおよびPS1遺伝子
特異的プローブの両方にハイブリダイズするという事実によって同定した。
クマウスでの神経病理学的変化) アミロイド沈着は、生じた二重トランスジェニックマウスにおいて増強された
。これらのマウスは、62日齢まで、死後のヒトADの脳に非常に似ているアミ
ロイド負荷量を示した。
スにおいて通常免れる構造体(例えば、小脳)に及ぶに十分に顕症であった。
スジェニックマウス) TgCRND8マウスをまた、同様のプリオンタンパク質コスミド発現ベクタ
ーcosTet中に変異プレセニリン2対立遺伝子を発現する、TgPS2(M
239V)系統1379と名づけたトランスジェニック系統と交配した。二重ト
ランスジェニックマウスTgCRND8xTgPS2(M239V)1379マ
ウスは、PS2コード領域DNAハイブリダイゼーションプローブを、PS1コ
ード領域ハイブリダイゼーションプローブの代わりに使用したことを除いて、上
に記載のTgCRND8xTgPS1(L286V)1274マウスとして遺伝
子型を特定した。
対して免疫反応性の球状プラークの形態で、大量のCNSのアミロイド沈着を呈
した。これらのアミロイド沈着は、ヒトアルツハイマー病によって重大な影響を
受ける領域である海馬および大脳皮質に局在した。通常、小脳は重症な早発型ア
ルツハイマー病の症例においてのみ、散在性Aβ沈着によって影響を受け;これ
は、マウスにおいて最も重いプラーク負荷で影響を受ける。
ックマウスでの行動変化) TgCRND8xTgPS2(M239V)1379二重トランスジェニック
マウスを2ヶ月齢で試験し、そして空間学習の獲得において40%範囲内にエフ
ェクトサイズを有する有意な認知欠陥を示した(図2、パネルAおよびB)。し
かしながら、以下の逆試験の間、最初は下位であったけれども、この二重トラン
スジェニックマウスは、試験の最後まで比較し得る能力を示した(導入遺伝子型
によって説明される分散の約20%)(図2、パネルCおよびC)。5ヶ月齢で
の再試験の間、同様の二重トランスジェニックマウスは、獲得試験および逆試験
の間に有意に高い学習欠陥を示した(それぞれ60%および70%の導入遺伝子
型に起因するエフェクトサイズ)(図2、パネルEおよびF)。また、この二重
トランスジェニックマウスは、任意の年齢で試験したこれらの泳ぐ速度において
、TgPS2(m239V)1379マウスと相違しなかった。変異したPS2
遺伝子の存在中の変異したヒトAPPの発現は、同系統の同様の組み合わせから
由来した非トランスジェニックマウスと同様の様式で行動するTgPS2(M2
39V)1379マウスの能力と比較して、2ヶ月齢程度の早さで空間学習およ
び記憶の障害を起こす。この障害は加齢に伴いかつ5ヶ月齢までに進行する。こ
のマウスは、常に新しい空間情報の獲得の欠陥を示す。
トランスジェニックマウス) TgCRND8マウスを、PS1(M146L+L286V)の2つの変異を
有するトランスジェニックマウスと交配した(34)。このPS1二重変異体マ
ウスを、先に記載のように(35)、標準プロトコールによって作製した。二重
トランスジェニックマウスを、上に記載のTgCRND8xTgPS1(L28
6V)1274二重トランスジェニックマウスのための、2つの独立したDNA
プローブを用いたハイブリダイゼーションによる尾部のDNAの遺伝子型分析に
よって同定した。
性Aβ(AB)アミロイドプラークを呈し、1ヶ月齢までに皮質におけるAβ(
AB)アミロイド沈着の斑点を示した。43日齢で現れるこのプラークのいくつ
かは、コンゴ−レッド色素性である(すなわち、コンゴ−レッド試薬で染色し得
る)。
化させる) TgCRND8マウスの群および非トランスジェニック同腹仔の群を、Sch
enkら(36)による記載のように、合成Aβ42ペプチドで免疫した。Tg
CRND8マウスおよび非トランスジェニック同腹仔のコントロール群を、コン
トロールアミロイド生成性ペプチド(糖尿病の病因と関連する島状のアミロイド
ポリペプチド(IAPP))で免疫した。水迷路試験でのこれらの2つのトラン
スジェニック群の能力を、上に記載のように、非Tg同腹仔の能力と比較した。
この結果を図3に示す。
gCRND8マウスの認知障害を減衰した。Aβ42または1APPを用いて免
疫にしたTgCRND8マウス(6週齢で免疫を開始した)の水迷路能力を、1
1週齢で試験した。Aβ42ペプチドを用いた免疫は、非Tg同腹仔と比較して
、逃避潜伏時間の長さ(パネルA)および通路探索の長さ(パネルD)によって
計測したように、TgCRND8マウスの認知欠陥を有意に減少させた。Aβ4
2で免疫したTgCRND8マウスは、非Tgマウスよりも全体に長い逃避潜伏
時間(パネルA)および通路探索(パネルD)、(潜伏時間および通路それぞれ
、F(1,30)=9.71,p<0.01;F(1,30)=10.9,p<
0.01)を示し、この違いは、これらの最初のより長い探索(群x日数の相互
作用:潜伏時間について、F(4,120)−2.83,p<0.05;通路に
ついて、F(3,120)=4.73,p<0.01)に起因した。トレーニン
グ最後の3日間のこれらの能力比較は、群間に有意差を示さなかった(潜伏時間
について、F(1,30)=0.64,p>0.05;通路について、F(1,
30)=1.24,p>0.05)。Aβ42で免疫したTgCRND8マウス
は、TQを探索する傾向はわずかに少ないが(F(1,30)=3.71,p=
0.06,パネルE)、それらの泳ぐ速度(パネルG)は、非Tgマウスと有意
な差(F(1,30)=1.33,p>0.05)がないことを示した。IAP
Pで免疫したTgCRND8マウスは、これらの非Tg同腹仔より有意に長い逃
避潜伏時間(パネルB)および通路探索(パネルC)を示した(潜時について、
F(1.26)=39.9,p<0.001;通路について、F(1,26)=
43.9,p<0.001)。トランスジェニックマウスは、非Tgマウスと最
初の探索において差異はなかったけれども、これらはトレーニングの間に能力を
改善しなかった(群x日数の相互作用:潜伏時間について、F(4,104)=
6.31,p<0.001;通路について、F(4,104)=5.69,p<
0.001)。これらはまた、標的四分区画の探索に有意にわずかな時間を費や
したが(F(1,26)=7.39,p<0.05,パネルF)、これらの泳ぐ
速度は免疫によって影響を受けなかった(F(1,26)=1.73,p>0.
05,パネルH)。
に続く8週での追加免疫は、11週齢で施行した水迷路のパラダイムにおいて、
TgCRND8マウスの認知能力を有意に改善した。一方、IAPPで免疫した
マウスは、非Tg同腹仔と比較して空間情報の獲得において有意に障害を示し(
図3)、そしてこの障害は、非免疫のTgCRND8マウスにおいて見られるの
と類似の性質であった(データは示していない)。
響しなかった。これらの発見は、Aβ42を用いた免疫(コントロールIAPP
ペプチドではなく)が、水迷路での能力改善し、そしてこの改善が、海馬のAβ
アミロイドプラークの最初の沈着が起こる時期と一致し得ることを示す。これら
の発見はまた、TgCRND8における認知の欠陥が、不可逆性の認知欠陥に起
因しないことを確立する。
よび修飾を特許請求の範囲内に含む。
れている。
CRND8マウス(n=5)は、非Tg同腹仔(n=8)よりも有意に長いエス
ケープ潜時(パネルA)、および通路探索(パネルB)を有し(それぞれ、F(
1,10)=28.8,p<0.001およびF(1,10)=22.0,p<
0.01)、そして結果的に、隠したプラットフォームを含む目標の四分区画(
TQ:Target Quadrant)への移動が有意に少なかった(F(1
,10)=14.9,p<0.01)(パネルC)。Tgマウスと非Tgマウス
との間の泳ぐ速さによって評価した移動能力(パネルD)は匹敵していた(F(
1,10)=0.48,p>0.05)。 TgCRND8マウスは、隠したプラットフォームがこのプールから取り除か
れた場合、探索試行(プローブトライアル)における60秒の泳ぎの間にその探
索パターンによって測定した場合、プラットフォーム位置に対する空間的記憶の
障害を示した。これらのマウスは、非Tgマウスよりも、TQを探索する傾向が
少なく(パネルE)、そしてプラットフォーム位置の正確な帯を横切ることがし
ばしば有意に少ない(t(10)=2.1,p=0.06)(パネルF)ことが
示された。
9V)1379の水迷路能力を示す。2ヶ月齢で試験した場合、二重トランスジ
ェニックマウス(n=5)は、単一のTgPS2(M239V)1379同腹仔
(n=8)よりも有意に長い(F(1,11)=8.1,p<0.05、遺伝子
型によるエフェクトサイズ(η2)=42%))エスケープ潜時(パネルA)、
および通路探索(F(1,11)=8.46,p<0.05、η2=43%)(
パネルB)を有した。隠したプラットフォームをもとのTQと反対の四分区画に
移動した場合、逆学習試験の直後には、二重トランスジェニックマウスは、さら
に長いエスケープ潜時の傾向を示した(F(1,11)=3.28,p=0.1
、η2=23%、パネルC)が、その経路探索(パネルD)は、単一TgPS2
(M239V)1379マウスとは有意に異ならなかった(F(1,11)=2
.46,p>0.05、η2=18%)。両方のトランスジェニック群における
マウスの泳ぐ速度は試験間で匹敵した。 5ヶ月齢で再試験した場合、二重トランスジェニックマウスは、単一のTgP
S2(M239V)1379同腹仔よりも、有意に長い(F(1,10)=16
.6,p<0.01、η2=62%(二重トランスジェニックマウスの1匹が死
んだ))エスケープ潜時(パネルE)、および有意に長い通路探索(F(1,1
0)=20.3,p<0.001、η2=66%、パネルF)を示した。この有
意な欠陥は、この試験における二重トランスジェニックマウスの最初の能力の乏
しさ(群×日数相互作用:潜時について、F(2,40)=3.32、p<0.
05、そして通路についてF(2,40)=2.85,p=0.07)に起因し
ていた。二重トランスジェニックマウスがなお、単一のT9同腹仔よりも、有意
に長い潜時(F(1,10)=28.58,p<0.001、η2=74%、パ
ネルG)および、長い通路探索(F(1,10)=27.43,p<0.001
、η2=73%、パネルH)を示した場合、学習獲得の欠陥は、逆試験において
持続した。このマウスは最終的に、逆トレーニング学習の最後には能力を改善し
たが、両方の測定に関する群×日数相互作用は、α=0.05で有意には達しな
かった。
12)および非トランスジェニック同腹仔(非Tg;n=20)、ならびにIA
PPペプチドで免疫したTgCRND8マウス(Tg(APP)8;n=9)お
よび非トランスジェニック同腹仔(非Tg;n=19)の水迷路能力を示す。A
β42ペプチドでの免疫は、非Tg同腹仔に比べて、エスケープ潜時および通路
探索によって測定した場合、TgCRND8マウスの認識欠陥を有意に減弱した
。Aβ42で免疫したTgCRND8マウスは、非Tgマウスよりも全体的に長
いエスケープ潜時(パネルA)、および通路探索(パネルC)を有した(潜時お
よび通路について、それぞれ、(F(1,30)=9.71,p<0.01;F
(1,30)=10.9,p<0.01)。この差異は、その最初の探索がより
長かったこと(群×日数相互作用:潜時について、F(4,120)=2.83
、p<0.05;通路についてF(3,120)=4.73,p<0.01)に
起因していた。トレーニングの最後の3日間のそれらの能力の比較は群間で有意
な差異を示さなかった(潜時について、F(1,30)=0.64、p>0.0
5;通路についてF(1,30)=1.24,p>0.05)。Aβ42で免疫
したTgマウスは、TQの探索がやや短い傾向(F(1,30)=3.71,p
=0.06、パネルE)を示したが、その泳ぐ速度は非Tgマウスと有意に異な
ることはなかった(F(1,30)=1.33,p>0.05)(パネルG)。 IAPPで免疫したTgCRND8マウスは、非Tg同腹仔よりも有意に長い
エスケープ潜時(パネルB)および通路探索(パネルD)を示した(潜時につい
て、F(1,26)=39.9、p<0.001;通路についてF(1,26)
=43.9、p<0.001)。これらのマウスは非Tgマウスとは最初の探索
は異ならなかったが、トレーニング中にはその能力は改善しなかった(群×日数
相互作用:潜時について、F(4,104)=6.31、p<0.001;通路
について、F(4,104)=5.69,p<0.001)。これらのマウスは
また、目標四分区画を探索するのにかかる時間が有意に短かった(F(1,26
)=7.39、p<0.05;パネルF)、しかしその泳ぐ速度は免疫によって
有意に影響されなかった(F(1,26)=1.73,p>0.05、パネルH
)。
Claims (35)
- 【請求項1】 ゲノムが導入遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動
物であって、該導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチ
ド配列を含み、かつ異種アミロイド前駆体タンパク質695(APP695)ポ
リペプチドをコードしており、ここで、該ポリペプチドの670位のリジン残基
は、アスパラギンで置換され、671位のメチオニン残基は、ロイシンで置換さ
れ、そして717位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されており、そし
て該導入遺伝子が発現される、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。 - 【請求項2】 前記哺乳動物がマウスである、請求項1に記載のトランスジ
ェニック哺乳動物。 - 【請求項3】 前記マウスが、(C3H×C57BL6)×C57マウスで
ある、請求項2に記載のトランスジェニックマウス。 - 【請求項4】 前記異種APP695がヒトAPP695である、請求項3
に記載のトランスジェニックマウス。 - 【請求項5】 前記マウスがその中枢神経系において異常なAβ沈着を示す
、請求項4に記載のトランスジェニックマウス。 - 【請求項6】 前記動物が、アルツハイマー病関連の病状の加速された出現
を示す、請求項4に記載のトランスジェニックマウス。 - 【請求項7】 祖先として請求項4に記載のトランスジェニックマウスを有
する、トランスジェニックマウス。 - 【請求項8】 トランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、以下: (a)請求項1に記載の第一のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を、第二の
遺伝子を含むゲノムを有する第二の非ヒト哺乳動物と交配して第一世代の子孫を
産生する工程であって、該第二の遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結され
たヌクレオチド配列を含み、かつ少なくとも1つの選択された変異を有する選択
されたタンパク質をコードする、工程;ならびに (b)該第一世代の子孫から、少なくとも1つの第一導入遺伝子および少なく
とも1つの第二遺伝子を含むゲノムを有し、そして該少なくとも1つの第一導入
遺伝子および該少なくとも1つの第二遺伝子の両方を発現するトランスジェニッ
ク非ヒト哺乳動物を選択する工程であって、該第一導入遺伝子は、プロモーター
に作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種APP695ポリペ
プチドをコードし、ここで該ポリペプチドの670位のリジン残基は、アスパラ
ギンで置換され、671位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして7
17位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されており、そして該第二遺伝
子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ少な
くとも1つの選択された変異を有する前記選択されたタンパク質をコードする、
工程、 によって産生される、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。 - 【請求項9】 前記選択されたタンパク質が、プレセニリンであり、そして
前記選択された変異がAD関連変異である、請求項8に記載のトランスジェニッ
ク非ヒト哺乳動物。 - 【請求項10】 前記選択されたタンパク質が、低密度リポタンパク質レセ
プター関連遺伝子、α2−マクログロブリン遺伝子およびβ−セクレターゼ遺伝
子からなる群より選択され、そして前記選択された変異がAβプロセシング関連
変異である、請求項8に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。 - 【請求項11】 前記動物がマウスである、請求項10に記載のトランスジ
ェニック非ヒト哺乳動物。 - 【請求項12】 トランスジェニックマウスであって、以下: (a)請求項4に記載の第一のトランスジェニックマウスを、第二の遺伝子を
含むゲノムを有する第二のマウスと交配して第一世代の子孫を産生する工程であ
って、該第二の遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配
列を含み、かつ少なくとも1つの選択された変異を有する選択されたタンパク質
をコードする、工程;ならびに (b)該第一世代の子孫から、少なくとも1つの第一導入遺伝子および少なく
とも1つの第二遺伝子を含むゲノムを有し、そして該少なくとも1つの第一導入
遺伝子および該少なくとも1つの第二遺伝子の両方を発現するトランスジェニッ
クマウスを選択する工程であって、該第一導入遺伝子は、プロモーターに作動可
能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種APP695ポリペプチドを
コードし、ここで該ポリペプチドの670位のリジン残基は、アスパラギンで置
換され、671位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして717位の
バリン残基は、フェニルアラニンで置換されており、そして該第二遺伝子は、プ
ロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ少なくとも1
つの選択された変異を有する該選択されたタンパク質をコードする、工程、 によって産生される、トランスジェニックマウス。 - 【請求項13】 前記第二の遺伝子が、内因性変異遺伝子である、請求項1
2に記載のトランスジェニックマウス。 - 【請求項14】 前記第二の遺伝子が、導入遺伝子である、請求項12に記
載のトランスジェニックマウス。 - 【請求項15】 前記第二の遺伝子が、AD関連アミノ酸置換を有する選択
されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項12に記載のト
ランスジェニックマウス。 - 【請求項16】 前記選択されたタンパク質が、プレセニリンである、請求
項15に記載のトランスジェニックマウス。 - 【請求項17】 請求項12に記載のトランスジェニックマウスであって、
以下: (a)請求項4に記載の第一のトランスジェニックマウスを、導入遺伝子を含
むゲノムを有する第二のトランスジェニックマウスと交配して第一世代の子孫を
産生する工程であって、該導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結された
ヌクレオチド配列を含み、かつ異種プレセニリン2ポリペプチドをコードしてお
り、ここで該ポリペプチドの239位のメチオニン残基がバリンで置換されてい
る、工程;ならびに (b)該第一世代の子孫から、少なくとも1つの第一導入遺伝子および少なく
とも1つの第二導入遺伝子を含むゲノムを有し、そして該第一導入遺伝子および
該第二遺伝子の両方を発現するトランスジェニックマウスを選択する工程であっ
て、該第一導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配
列を含み、かつ異種アミロイド前駆体タンパク質(APP)ポリペプチドをコー
ドし、ここで該ポリペプチドの670位のリジン残基は、アスパラギンで置換さ
れ、671位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして717位のバリ
ン残基は、フェニルアラニンで置換されており、そして該第二導入遺伝子は、プ
ロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種プレセニ
リン2ポリペプチドをコードし、ここで該ポリペプチドの239位のメチオニン
残基はバリンで置換されている、工程、 によって産生される、トランスジェニックマウス。 - 【請求項18】 請求項12に記載のトランスジェニックマウスであって、
以下: (a)請求項4に記載の第一のトランスジェニックマウスを、導入遺伝子を含
むゲノムを有する第二のトランスジェニックマウスと交配して第一世代の子孫を
産生する工程であって、該導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結された
ヌクレオチド配列を含み、かつ異種プレセニリン1ポリペプチドをコードしてお
り、ここで該ポリペプチドの286位のロイシン残基がバリンで置換されている
、工程;ならびに (b)該第一世代の子孫から、少なくとも1つの第一導入遺伝子および少なく
とも1つの第二導入遺伝子を含むゲノムを有し、そして該第一導入遺伝子および
該第二遺伝子の両方を発現するトランスジェニックマウスを選択する工程であっ
て、該第一導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配
列を含み、かつ異種アミロイド前駆体タンパク質(APP)ポリペプチドをコー
ドし、ここで該ポリペプチドの670位のリジン残基は、アスパラギンで置換さ
れ、671位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして717位のバリ
ン残基は、フェニルアラニンで置換されており、そして該第二導入遺伝子は、プ
ロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種プレセニ
リン1ポリペプチドをコードし、ここで該ポリペプチドの286位のロイシン残
基はバリンで置換されている、工程、 によって産生される、トランスジェニックマウス。 - 【請求項19】 請求項12に記載のトランスジェニックマウスであって、
以下: (a)請求項4に記載の第一のトランスジェニックマウスを、導入遺伝子を含
むゲノムを有する第二のトランスジェニックマウスと交配して第一世代の子孫を
産生する工程であって、該導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結された
ヌクレオチド配列を含み、かつ異種プレセニリン1ポリペプチドをコードしてお
り、ここで該ポリペプチドの146位のメチオニン残基がロイシンで置換されて
おり、そして286位のロイシン残基がバリンで置換されている、工程;ならび
に (b)該第一世代の子孫から、少なくとも1つの第一導入遺伝子および少なく
とも1つの第二導入遺伝子を含むゲノムを有し、そして該第一導入遺伝子および
該第二遺伝子の両方を発現するトランスジェニックマウスを選択する工程であっ
て、該第一導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配
列を含み、かつ異種アミロイド前駆体タンパク質(APP)ポリペプチドをコー
ドし、ここで該ポリペプチドの670位のリジン残基は、アスパラギンで置換さ
れ、671位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして717位のバリ
ン残基は、フェニルアラニンで置換されており、そして該第二導入遺伝子は、プ
ロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種プレセニ
リン1ポリペプチドをコードし、ここで該ポリペプチドの146位置のメチオニ
ン残基はロイシンで置換されており、そして286位のロイシン残基はバリンで
置換されている、工程、 によって産生される、トランスジェニックマウス。 - 【請求項20】 ADの発生を防止または遅延するのにおける有効性につい
て候補化合物をスクリーニングするための方法であって、該方法は、以下の工程
: (a)請求項1〜19のいずれか1項に記載の第一のトランスジェニックマウ
スにおける、選択されたAD関連表現型特徴の出現の前に、該マウスに対して該
候補化合物を投与する工程;および (b)該マウスにおいて該選択されたAD関連表現型特徴が出現する年齢を、
該化合物を投与しなかった、同じタイプの第二のトランスジェニックマウスにお
いて該特徴が出現する年齢と比較する工程; を包含し、 ここで該第二のマウスにおいて該特徴が出現した年齢と比べた、該第一のマウ
スにおいて該特徴が出現した年齢の上昇は、該化合物の有効性を示す、方法。 - 【請求項21】 前記特徴が行動障害である、請求項20に記載の方法。
- 【請求項22】 前記特徴が異常なCNSアミロイド沈着である、請求項2
0に記載の方法。 - 【請求項23】 アルツハイマー病の症状を寛解するのにおける有効性につ
いて候補化合物をスクリーニングするための方法であって、該方法は、以下の工
程: (a)請求項1〜19のいずれか1項に記載の第一のトランスジェニックマウ
スに対して該候補化合物を投与する工程; (b)記憶試験または学習試験において該マウスの能力を決定する工程;およ
び (c)該マウスの該能力を、該化合物を投与しなかった、同じタイプの第二の
トランスジェニックマウスの能力と比較する工程; を包含し、 ここで該第二のマウスの能力と比べた、該第一のマウスの改善された能力は、
該化合物の有効性を示す、方法。 - 【請求項24】 中枢神経系において異常なAβ沈着を示すトランスジェニ
ック非ヒト哺乳動物を産生する方法であって、該方法は以下: (a)導入遺伝子を該哺乳動物の受精した卵母細胞に導入する工程であって、
該導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み
、かつ異種アミロイド前駆体タンパク質695(APP695)ポリペプチドを
コードしており、ここで、該ポリペプチドの670位のリジン残基は、アスパラ
ギンで置換され、671位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして7
17位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されている、工程; (b)偽妊娠哺乳動物中に該受精卵母細胞を移植する工程; (c)該受精した卵母細胞を生きて誕生した子孫中で発育させる工程;および (d)ゲノムが導入遺伝子を含む子孫を選択する工程であって、該導入遺伝子
は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種ア
ミロイド前駆体タンパク質695(APP695)ポリペプチドをコードしてお
り、ここで、該ポリペプチドの670位のリジン残基は、アスパラギンで置換さ
れ、671位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして717位のバリ
ン残基は、フェニルアラニンで置換されており、そして該導入遺伝子が発現され
る、工程; を包含する、方法。 - 【請求項25】 前記哺乳動物がマウスである、請求項24に記載の方法。
- 【請求項26】 前記プロモーターが、プリオンタンパク質cos.Tet
プロモーターである、請求項24に記載の方法。 - 【請求項27】 異種アミロイド前駆体タンパク質695(APP695)
ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで該ポリペプチドの
670位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、671位のメチオニン残基
は、ロイシンで置換され、そして717位のバリン残基は、フェニルアラニンで
置換されている、ヌクレオチド配列。 - 【請求項28】 プロモーターに作動可能に連結された請求項27に記載の
ヌクレオチド配列を含む、ベクター。 - 【請求項29】 中枢神経系における異常なアミロイド沈着を罹患する哺乳
動物において、認識不全を減弱する方法であって、該方法は、認識不全を減弱す
るのに有効な量のAβペプチドを該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。 - 【請求項30】 前記異常なアミロイド沈着がAβ沈着である、請求項29
に記載の方法。 - 【請求項31】 前記投与されたペプチドがAβ42である、請求項29ま
たは30に記載の方法。 - 【請求項32】 前記哺乳動物が、アルツハイマー病に罹患しているヒトで
ある、請求項29〜31のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項33】 中枢神経系において異常なアミロイド沈着を罹患している
哺乳動物において認識不全を減弱するための医薬の製造のためのAβペプチドの
使用。 - 【請求項34】 前記AβペプチドがAβ42である、請求項33に記載の
使用。 - 【請求項35】 前記医薬がアルツハイマー病の予防または処置のための医
薬である、請求項33または34に記載の使用。
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