EP1534826A2 - Transgene ratte und ihre verwendung im tiermodell f r die hu mane chorea huntington erkrankung sowie nukleins urekonstruk te, vektoren und zellen zu ihrer erzeugung - Google Patents

Abstract

Die Chorea Huntington (Huntington's Disease, HD) ist eine autosomal dominant vererbte progrediente neurodegenerative Erkrankung aus der Gruppe der 'CAG-repeat'/Polyglutamin-Erkrankungen und imponiert durch eine Trias aus psychiatrische Veränderungen, Demenz und Motorfunktionsstörungen. Auf subzellulärer Ebene ist eine Mutation mit verlängerten CAG-Trinukleotidrepeats als Ursache der Chorea Huntington identifziert worden. Die therapeutischen Effekte bestimmter Substanzen können auf die in neurochemisch-indizierten und transgenen Tiermodellen mit expandierte CAG-Repeats getestet werden. In der vorliegenden Erfindung wurden daher transgene Ratten für die humane HD generiert und charakterisiert. Dieses Rattenmodell für die humane HD und andere Erkrankungen des ZNS trägt 51 CAG Repeats unter der Kontrolle eines Rattenpromotors und weist einen langsam progredienten neurologischen Phänotyp auf, der eng das humane HD-Syndrom widerspiegelt. Die Vergleichbarkeit des Rattenmodells zur humanen HD zeigt sich in neuropathologischen, neuroradiologischen und neurochemischen Veränderungen einhergehend mit typischen Verhaltensauffälligkeiten.

Description

Transgene Ratte und ihre Verwendung im Tiermodell für die humane Chorea Huntington Erkrankung sowie Nukleinsäurekonstrukte, Vektoren und Zellen zu ihrer Erzeugung

Die Erfindung betrifft ein Nukleinsäurekonstrukt, das Nukleinsäurekonstrukt enthaltende Vektoren und Zellen, sowie die Verwendung dieser Mittel zur Erzeugung eines transgenen nichtmenschlichen Säugers, insbesondere einer Ratte als Tiermodell für die humane Chorea-Huntington-Erkrankung.

Die Chorea Huntington (Huntington ' s Disease, HD) ist eine autosomal dominant vererbte neurodegenerative Erkrankung aus der Gruppe der „CAG- repeat"/Polyglutamin-Erkrankungen. Der Verlauf ist typischerweise langsam progredient über einen Zeitraum von 15-20 Jahren. Der Beginn liegt im mittleren Lebensalter und imponiert zunächst eher durch emotionale Störungen und psychiatrische Veränderungen (Depression, Sucht, Psychosen). Mit Fortschreiten der Erkrankung kommt es zu Demenz ebenso wie zu hypo- oder hyperkinetische (Chorea) Motorfunktionsstörungen. Pathophysiologisch liegt zu diesem Zeitpunkt auf zellulärer Ebene eine selektive Degeneration striataler und korti- kaler Neurone vor, was im Endstadium zu einer Erweiterung der lateralen Ventrikel im Gehirn führt. Auf subzellulärer Ebene ist pathogenetisch eine Mutation (Gen IT15; Chrom. 4) mit verlängerten CAG-Trinukleotidrepeats als Ursache der HD identifiziert worden. Trinukleotidverlängerungen mit mehr als n > 37 Re- peats führen zu einem HD Phänotyp, wobei bei steigenden Repeatanzahlen der Erkrankungsverlauf schwerer ausfällt und der Erkrankungsbeginn früher auftritt. Intranukleäre Aggregate aus Huntingtin, Hitzeschockproteinen und Ubiquitin in striatalen Neuronen sind pathognomonisch für die HD. Eine Reihe von Tiermodellen sowohl durch Injektion von Neurotoxinen als auch durch genetische Ver- änderung von Mäusen und Drosophila sind bisher generiert worden. Hierbei findet gegenwärtig die R6/2 Maus als Modell die häufigstes Anwendung, obwohl der Erkrankungsverlauf in diesem Mausmodell protrahiert ist und auch Diabetes mellitus als Komorbidität auftritt. Verlaufsstudien (z.B. radiologisch durch MRT oder PET) und Therapiestudien (z.B. neurochirurgisch durch Stammzelltransplantation) sind z.B. in der R6/2 Maus durch den fulminanten Verlauf der Krankheit im Vergleich mit dem Verlauf beim Menschen nur eingeschränkt möglich.

Choreatische Bewegungsstörungen beim Menschen

Die Gruppe choreatiformer Bewegungsstörungen beruht auf unterschiedlichen neuropathologischen Störungen mit Auswirkung auf die sehr vulnerablen Stammganglien. Als Ursachen kommen viele Formen vaskulärer, infektiöser, traumatischer, neo- und paraneoplastischer, metabolischer oder immunologischer und vor allem neurodegenerativer Erkrankungen mit zum Teil hereditärer Komponente in Frage (Tabelle 1 ).

Tabelle 1 : Hereditäre und sekundäre Ursachen choreatischer Bewegungsstörungen.

Genetisch bedingte choreatische Bewegungsstörungen

Nach Ausschluss der sekundären Ursachen choreatiformer Bewegungsstörun- gen bzw. anderer genetisch bedingter Erkrankungen, bei denen die Chorea ein Begleitsymptom darstellt, muss differentialdiagnostisch vor allem die HD (Chorea Huntington, Chorea major, Morbus Huntington) in Betracht gezogen werden. Gerade in jüngster Zeit konnte durch molekulargenetische Methoden jedoch auch gezeigt werden, dass es außer der ^"Chorea Huntington weitere, kli- nisch kaum abgrenzbare erbliche Erkrankungen (Huntington-ähnliche Erkrankung) gibt (Tabelle 2).

Tabelle 2: Genorte hereditärer choreatischer Bewegungsstörungen

Abkürzungen: AD: autosomal dominant, AR: autosomal rezessiv, XR: X- chromosomal rezessiv Morbus Huntington (Chorea Huntington, Chorea major, Huntington 's Disease, HD)

Klinische Symptomatik der HD Die klinischen Symptome der HD lassen sich mit der „klassischen" Trias aus Bewegungsstörung, organischer Wesensänderung (psychiatrische Auffälligkeiten) und kognitiven Leistungseinbußen (Demenz) zusammenfassen. Die Symptome treten bei den meisten Betroffenen zwischen dem 35. und 45. Lebensjahr auf, jedoch manifestieren zwischen 5 und 10% bereits vor dem 20. Le- bensjahr. Oft beginnt die Krankheit mit psychiatrischen Auffälligkeiten, v.a. Depressionen und kognitiven Leistungseinbußen, die den anderen Krankheitszeichen um Jahre vorausgehen. Motorische Störungen bei HD Die HD wird landläufig noch immer als „Chorea Huntington", „Chorea major" oder „erblicher Veitstanz" bezeichnet. Diese Bezeichnung trägt dem Hauptsymptom Rechnung, der choreatiformen (tänzelnden) Bewegungsstörung, die bei der Mehrzahl der Patienten das auffälligste Merkmal der Erkrankung darstellt. Neben der typischen choreatiformen Symptomatik treten bei einigen Patienten andere Bewegungsstörungen auf. Häufig sind Dystönien, die besonders in di- stalen Extremitätenregionen oder im Hals- und Nackenbereich eine unnatürliche

Haltung hervorrufen. Prinzipiell aber können alle Formen von Überbeweglichkeiten, also z.B. auch (Hemi-)Ballismus, Asterixis, Myoklonie und Tremor vorkommen.

Eine Sonderform der Erkrankung ist die sogenannte akinetisch-rigide, juvenile Form oder „Westphal-Variante" (3-10%). Sie tritt vorwiegend nach paternaler Vererbung bei jungen Patienten mit hohen CAG-Repeat-Zahlen auf (siehe Genetik). Klinisch imponiert eine parkinsonähnliche Symptomatik mit ausgeprägter Brady- oder Akinese, hochgradiger Muskeltonuserhöhung und rapider Progredi- enz. Auch die dementielle Entwicklung verläuft bei diesen Patienten in der Regel schneller. Die dystone Komponente ist stärker ausgeprägt als bei der hyperkinetischen Form, die Patienten sind massiv verlangsamt und nach vorne gebeugt. Die Schluckstörung führt früh zu einem stark vermehrten Speichelfluss. Auch Mischformen mit gleichzeitig bestehender Hyperkinese und Dystonie oder rigider Tonuserhöhung sind bei jüngeren Patienten oft zu beobachten und können dann die Diagnose verschleiern. Psychische Störungen bei HD

Frühe psychiatrische Auffälligkeiten bei der Erkrankung sind depressive Verstimmungen. Bei den meisten Patienten besteht eine ausgeprägte Nichtwahr- nehmung bis zur Verleugnung von Krankheitszeichen. Überhaupt äußert sich die depressive Grundstimmung oft in einer Somatisierung, besonders Schmerzsym- ptome sind häufig. Die Art der Persönlichkeitsveränderung und besonders der affektiven Störung hängt oft von der gesunden Primärpersönlichkeit des Patienten ab. Dazu kommt wahnhafte Verkennung, die sich als Eifersuchtswahn oder paranoide Psychose manifestieren kann. Echte schizophrene Symptome, wie etwa optische oder akustische Halluzinationen scheinen in frühen Stadien außer bei der Westphal-Variante und den Mischformen eher selten zu sein, treten aber mit fortschreitender Erkrankung auf. Kognitive Störungen bei HD

Die progressive dementieile Entwicklung manifestiert sich früh in einer beruflichen Leistungseinbuße. Der Abbau der intellektuellen Fähigkeiten betrifft zu- nächst die Konzentrationsfähigkeit und die Merk- und Gedächtnisleistung im

Neugedächtnis. Häufig ist eine starke Denkverlangsamung und Auffassungsstörung, wie sie für die subkortikale Demenz typisch ist, dazu kommt ein ausgeprägtes Haften auf bestimmte Denkinhalte. Die Integration verschiedener kognitiver Funktionen, die konstruktiven Leistungen und besonders das verbale Ar- beitsgedächtnis sind gestört, im Gegensatz aber etwa zur Demenz vom Alzheimer-Typ treten Sprachstörungen, wie Aphasie, oder eine Apraxie in frühen Stadien kaum auf. Die kognitiven Einbußen beim M. Huntington sind zudem verbunden mit Störungen des Antriebs, des Affekts und mit ausgeprägten Persönlichkeitsveränderungen. Neuropathologie bei HD Bei Patienten mit HD findet sich neuropathologisch eine Degeneration von Nervenzellen im ZNS, ganz überwiegend im Corpus caudatum, Nucleus subthala- micus und Putamen. Am stärksten sind mittelgroße Neuronen betroffen, die gamma-Aminobuttersäure und Enkephalin oder gamma-Aminobuttersäure und Substanz P als Neurotransmitter enthalten (Martin und Gusella 1986). Im fortgeschrittenen Stadium ist oftmals das gesamte Gehirn atrophisch, was makroskopisch mit einer Verbreiterung der Sulci, einem Schrumpfen der Gyri und einer Reduktion der Gesamtgehirnmasse einhergeht. Die stark beeinträchtigte Bewegungskoordiantion führt auch zu Problemen beim Schlucken von Nahrung, was zur Abmagerung führt und bei einem Teil der Patienten Pneumonie verursacht. Diese ist auch die häufigste Todesursache (33%) bei HD-Patienten, gefolgt von Herz-Kreislaufkrankheiten (24%). Das durchschnittliche Todesalter bei HD liegt bei 57 Jahren. Weiterführende Diagnostik bei HD Die klinisch-apparative Diagnostik setzt sich zusammen aus bildgebenden Verfahren, neuropsychologischer Testung und feinmotorischen Spezialuntersu- chungen. Dazu kommen elektrophysiologische Untersuchungen, besonders die somatosensibel-evozierten Potentiale (SSEP) und die sog. „long-loop-reflexe", die in der Frühdiagnostik, vor Einführung der genetischen Testung, eine große Bedeutung hatten.

Unter den bildgebenden Verfahren ist die kranielle Computertomographie (CCT) am besten untersucht. Neben vielfältigen anderen Atrophiemarkern hat sich die Ausmessung der Weite der Ventrikelvorderhörner im Vergleich zur Weite der Hinterhörner in Höhe des 3. Ventrikels, bzw. das Verhältnis von Vorderhornwei- te zur Gesamtweite des Temporalhirns auf dieser Höhe bewährt. Beide Parameter bewerten letztlich die Atrophie des Caput nuclei caudati, der als Teil der Stammganglien beim Morbus Huntington früh degeneriert und dessen Größe durch seine Vorwölbung in die Vorderhörner der Seitenventrikel direkt bestimmt werden kann (sog. Huckmannzahl). In späteren Stadien weicht diese selektive Atrophie einem generalisierten Nervenzelluntergang, der auch kortikale Anteile erfasst, die Untersuchung ist also wenig spezifisch. Für einen geübten Untersucher kann auch die Ausmessung der Seitenventrikel in der transkraniellen Duplexsonographie Aufschluss über die subkortikale Atrophie, bzw. die Progredienz geben. Die Positronenemissionstomographie (PET) (v.a. FDG, Kuwert et al. 1990) gibt Aufschluss über Perfusion und Glukoseme- tabolismus der Basalganglien und kann als Frühdiagnostikum verwendet werden, bleibt aber in der Regel spezifischen Fragestellungen vorbehalten. Als apparative feinmotorische Testserie kann eine Testbatterie der „Motorischen Leistungsserie" (Schoppe 1974) eingesetzt werden. Die neuropsychologische Testung kann durch eine aufwendige Testbatterie mit Gedächtnisleistungserfassung, besonders im Bereich des verbalen Gedächtnisses, aber auch der visuo-konstruktiven Leistung erfolgen. Neben der Gedächtnisleistungsstörung soll früh der Handlungsteii im Hamburg-Wechsler Intelligenztest (HAWIE) gestört sein (Lyle und Gottesman 1977). Für eine schnelle klinische Erfassung der kognitiven Fähigkeiten haben sich Wortfindungstests (Bildung möglichst vieler Wörter aus einzelnen Buchstaben), Stroop-Tests (z.B. Interferenz: die Farbe eines Wortes, das eine andere Farbe beschreibt, soll benannt werden) und der Inter-Digit-Span-Test (Zahlen sollen bestimmten Symbolen zugeordnet werden) erwiesen, die auch zur Verlaufskontrolle benutzt werden können. Häufigkeit und Genetik der HD

Morbus Huntington (HD) ist eine autosomal dominant vererbte, neurodegenerative Erkrankung. HD kommt mit einer Häufung von 4 - 8 Betroffenen pro 100 000 Einwohner bei Mitteleuropäern vor. Bei Japanern (4: 1 Mio), Finnen (5: 1 Mio) und Afrikanern (6:10 Mio) ist die Erkrankung seltener (Überblick in Harper, 1992). Neumutationen sind äußerst selten und meist auf fehlende klinische Daten oder frühen Tod der Eltern zurückzuführen. Maximal 3% der Patienten mit gesichertem HD erkranken aufgrund einer Neumutation. Phänotyp-Genotyp-Korrelation bei Patienten mit HD Zwischen der Repeatlänge und dem Auftreten der ersten Symptome bei HD be- steht eine inverse Korrelation. Patienten, die erst nach dem 60. Lebensjahr erkranken, tragen in der Regel weniger als 45 CAG-Einheiten auf dem betroffenen Allel. Dagegen erkranken Personen mit 55 und mehr Einheiten meist vor dem 30. Lebensjahr. Die expandierte Repeatlänge, nicht jedoch das Normalallel, bestimmt bis zu 60% der Variabilität des Erkrankungsalters von MH-Patienten. Andere genetische Faktoren scheinen das Erkrankungsalter mitzubestimmen, wie der Glutamatrezeptor R6 (Rubinsztein et al. 1997), das Transactivatorpro- tein CA150 (Holbert et al. 2001 ) oder auch das elterliche Erkrankungsalter. Eine Relevanz für die klinische Praxis bzw. für prädiktive Analysen haben diese Analysen jedoch nicht. Juvenile Chorea (Westphal-Variante) Bis zu zehn Prozent der HD-Patienten erkranken vor ihrem 20. Lebensjahr (zur klinischen Symptomatik siehe vorhergehenden Abschnitt). In einigen Fällen zeigen die Kinder erste Symptome bereits vor ihren Eltern, was den Eindruck einer Neumutation bzw. des Überspringens einer Generation vermittelt. Über 80% der juvenilen Patienten haben die (CAG)n-Mutation von ihrem Vater geerbt, die in der Regel während der paternalen Transmission weiter expandierte. Alle juvenilen Patienten hatten mehr als 45 CAG-Repeateinheiten. Kinder, die bereits erste Symptome vor ihrem 10. Lebensjahr zeigten, trugen mehr als 75 CAG- Einheiten. Eine Analyse der Repeatlänge in Spermazellen von betroffenen Individuen zeigt eine deutliche somatische Instabilität, d.h. ein Großteil der männli- chen Keimzellen trägt ein längeres Allel als im peripheren Blut nachweisbar ist.

Der Grad der somatischen Instabilität des CAG-Repeats im Sperma steht in direktem Zusammenhang mit dem Grad der Repeatexpansion während der Transmission auf die Nachkommen (Telenius et al., 1995). Zusammenfassend kann gesagt werden, dass das klinische Phänomen der Antizipation, d.h. ein früheres Auftreten von Symptomen mit schnellerer Progression bei den Nachkommen von betroffenen Eltern, durch eine Expansion der CAG-Repeateinheiten vorwiegend (wenn auch nicht ausschließlich) während der paternalen Transmission hervorgerufen wird und dass ein juveniler Beginn der Erkrankung durch sehr lange Expansionen bedingt ist. Der Intermediärbereich von 30-40 Repeateinheiten Der Bereich der CAG-Einheiten, welcher bei Gesunden und nachweislich Betroffenen nachgewiesen werden konnte, zeigt nur bei wenigen Personen eine Überlappung. So sind weltweit 7 HD-Patienten beschrieben, die nur 36 CAG- Repeats tragen, wohingegen einige wenige Individuen mit 36-39 CAG-Einheiten selbst im hohen Lebensalter (über 90 Jahre) keine Symptome der Erkrankung aufweisen (Rubinsztein et al. 1996). Diagnostische Vorgehensweise bei HD

Traditionell wurde die Diagnose eines HD klinisch durch eine positive Familienanamnese, progrediente Störungen der willkürlichen und unwillkürlichen Motorik und/oder durch psychiatrische Auffälligkeiten gestellt. Der Nachweis einer Atrophie des C. caudatus und Putamen im CT oder MRT erhärten die Diagnose. Durch Positions-Emissions-Tomographie (PET) kann ein reduzierter Glukose- Stoffwechsel im Nucleus caudatus sichtbar gemacht werden bevor der Zellverlust im CT oder MRT nachweisbar ist. Trotz dieser Kriterien sind falsch-positive und falsch-negative Fehldiagnosen mit jeweils etwa 10% häufig. Einen definitiven Ausschluß oder Nachweis der HD bietet selbst im Frühstadium nur die DNA-Analyse. Eine CAG-Repeat-Anzahl von mehr als 38 Einheiten im Hunting- t/n-Gen wird als sicherer Nachweis für die Erkrankung angesehen. Molekulargenetische Ursachen der HD 1983 wurde der Defekt, der zum HD führt, auf dem kurzen Arm des Chromosoms 4 beim Menschen lokalisiert (Subregion 4p16.3). Erst 10 Jahre später konnte das Huntingtin-Gew, ursprünglich auch genannt, isoliert werden (The Huntingtons disease collaborative research group 1993). Der molekulare Defekt wurde in Form eines expandierten (CAG) > 38 Repeats in der ko- dierenden Region des Gens identifiziert (Kremer et al. 1994; Zühlke et al. 1993). Das verlängerte CAG-Repeat, nicht jedoch die Normalallele, verhält sich meiotisch instabil, d.h. es kann während der Keimzellentwicklung verkürzt (selten) oder verlängert an die Nachkommen weitergegeben werden (meiotische Instabilität), was Ursache für das klinische Phänomen der Antizipation ist (Tele- nius et al. 1995). Gerade bei sehr stark expandierten Allelen findet man auch mitotische Instabilität, insbesondere in den Basalganglien und im zerebralen Cortex (Telenius et al. 1994). Funktion des Huntingtin-Proteins bei der HD

Das (CAG)_n-Repeat des Huntingtin-Gexxs kodiert für die Aminosäure "Glutamin", so dass man bei der HD auch von einer Polyglutaminerkrankung spricht. Die DNA-Sequenzanalyse des ergab keine Hinweise auf eine Homologie zu bekannten Genen und damit auf die Funktion des Genprodukts. Personen, denen eines der beiden Chromosomenabschnitte fehlt, die das Hunting- tin-Gen tragen, entwickeln keine für HD typischen Symptome. Man geht daher davon aus, dass die Polyglutaminexpansion zu einer neuartigen Eigenschaft des Proteins führt, möglicherweise zu einer unspezifischen Bindung des verlängerten Polyglutaminrests mit einem anderen Protein. Das normale Huntingtin scheint möglicherweise eine Funktion bei der Transkriptionsstimulation des ge- hirn-spezifischen neurotrophen Wachstumsfaktors, BDNF, zu spielen (Zuccato et al. 2001 ). Mutiertes Huntingtin stimuliert die BDNF Expression nur unzureichend.

Pathogenetische Charakteristika bei der HD

Die mutmaßliche Struktur der verlängerten Polyglutaminketten ließ frühzeitig darauf schließen, dass Huntingtin sich möglicherweise mit sich selbst bzw. mit anderen Proteinen aneinanderlagert (Perutz 1996). Zellkulturarbeiten (Scherzinger et al. 1997) und immunhistochemische Arbeiten an transgenen Tieren (Da- vies et al. 1997) und später auch bei verstorbenen Patienten (DiFiglia et al. 1997) erbrachten schliesslich mit dem Nachweis von Huntingtin-positiven Aggregaten in den Zellkernen der Nervenzellen den Beweis für Perutz' Theorie. Diese neuronalen nuklearen Einschlusskörperchen konnten danach auch bei fast allen anderen Polyglutaminerkrankungen, wie bei der SBMA, der DRPLA und der SCA1 , 2, 3 und 7 nachgewiesen werden. Eine Überexpression von Hitzeschockproteinen bzw. eine Stimulation der Hitzeschockreaktion durch Pharmaka wie Geldanamycin vermindert die Huntingtin-Aggregation (Sittler et al. 2001 ). Gegenwärtig vorliegende Tiermodelle für die HD Während der letzten 20 Jahre sind eine Reihe von Versuchen zur Generierung von Tiermodellen für die HD unternommen worden. Besondere Bedeutung haben dabei zunächst die Excitotoxin- und die 3-Nitropropionsäuremodelle gewonnen, da sich viele histologische und einige Motorfunktionssymptome ein- schließlich von Gangveränderungen und kognitiven Symptome der HD replizieren lassen (Boriongan et al., 1995; Brouillet et al., 1995; Brouillet et al., 1999). Da diese Modelle allerdings neurochemisch induziert werden, sind die einhergehenden Veränderungen nicht wirklich progredient. Die neurotoxischen Modelle sind daher für Therapiestudien nur eingeschränkt nutzbar, wenn diese auf eine Verhinderung oder Verlangsamung des Verlaufs der HD abzielen.

Es ist daher wichtig, dass transgene Modelle der HD entwickelt werden. Transgene Mausmodelle der HD (Hodgson et al., 1999; Mangiarini et al., 1996; Red- dy et al., 1998; Schilling et al., 1999; Shelbourne et al., 1999; Wheeler et al., 2000; Yamamoto et al., 2000) ermöglichen neue Ansätze zur Untersuchung der kausalen Mechanismen ihrer Progredienz (Li et al., 2000) und der pathogeneti- schen Ursachen der HD (Brouillet et al., 1995, 1999, 2000). Die therapeutischen Effekte bestimmter Substanzen hinsichtlich des Erkrankungsausbruches und auf die Progredienz der HD können somit auch in Tiermodellen getestet werden. Allen Modellen ist gemeinsam, dass das beim Patienten expandierte CAG-Repeat in die Keimbahn der Mäuse oder von Drosophila eingebracht wurde

(transgene Tiere). Das bisher am weitesten verbreitete Tiermodell (R6/2 Mäuse) ist durch die Generierung eines Bruchstückes des Huntingtin-Gens mit mehr als 1 13 CAG-Repeats entstanden (Mangiarini et al. 1996). Die R6/2 transgene Maus exprimiert das erste Exon des humanen HD Gens mit 1 14-157 CAG Wie- derholungen (Repeats) und entwickelt ein Reihe von typischen Symptomen der HD, einschließlich der progressiver Motorfunktionsstörungen (Mangiarini et al., 1996; Dunnett et al., 1998; Carter et al., 1999) und neuropathologisch das Auftreten von neuronalen Einschlusskörperchen (Davies et al., 1997). Dieses Mausmodell weist außerdem eine verschlechterte Lernfähigkeit (Lione et al., 1999) und reduzierte Ängstlichkeit (File et al., 1998) auf. Somit belegen zahl- reiche Verhaltensstudien die prinzipielle Vergleichbarkeit der Pathologie und Symptome bei den Mäusen zur Erkrankung beim Menschen. Allerdings zeigen die R6/2 Mäuse auch einen sehr schnellen Verlauf mit fullmi- nant progredientem Phänotyp. Diesen Verlauf findet man beim Menschen nur sehr selten, und nur dann, wenn bereits Kinder von der Erkrankung betroffen sind (sog. Westphal-Variante). Diabetes mellitus ist häufig bereits in jungen Tieren zu beobachten (Carter et al., 1999). Diese rasche Progredienz und die Ko- morbidität erschweren die Bestimmung der Effektivität von potentiellen Thera- peutika und Reparaturstrategien (neuronale Zelltransplantation) zur Behandlung der verschiedenen Symptome der HD.

Therapie und Verlaufsstudien in transgenen Tiermodellen der HD Die therapeutischen Effekte bestimmter Substanzen auf die Progredienz der HD können in transgenen Tiermodellen mit expandierten CAG-Repeats getestet werdenohne das dies bisher in großem Umfang publiziert wurde. Eine Ausnah- me bilden Versuche in Drosophila, die belegen, dass eine Überexpression von Chaperonen der HSP70-Genfamilie ein Absterben der Nervenzellen verhindert (Warrick et al. 1999). Es konnte anhand der R6/2 Linie auch gezeigt werden, dass Caspase-Hemmung zu einer Verlangsamung der Erkrankungsprogression führt (Ona et al. 1999). Dieser Effekt kann auch mit Minozyklin, einem Medi- kament zur Akne-Behandlung welches Caspase-1 und 3 hemmt, reproduziert werden (Chen et al. 2000). Schließlich konnte in R6/2 Mäusen gezeigt werden, dass Haltung dieser Tiere in einer stimulierenden Umgebung (environmental en- richment) zu einer deutlichen Verzögerung der neurologischen Auffälligkeiten führt (van Dellen et al. 2000, Hockly et al. 2002). Prinzipiell scheint auch die zukünftige Behandlung bereits betroffener Patienten nicht hoffnungslos zu sein. Wenn es gelänge, die Dysfunktion des aberranten Proteins, dessen Abbau zu beschleunigen bzw. dessen Transport in den Zellkern zu verhindern, wären eventuell sogar deutliche Therapieerfolge zu erwarten. Diese Schlussfolgerung wurde zumindest durch ein weiteres Tiermodell gesichert, bei dem man das Transgen induzierbar an- und abschalten kann (Ya- mamoto et al. 2000). Dabei konnte gezeigt werden, dass bei Tieren, die zu- nächst deutliche Symptome zeigten, der HD-Phänotyp nach Abschalten des Transgens wieder reversibel war und sich auch neuropathologische Merkmale wie die Einschlusskörperchen zurück bildeten. Letztere Untersuchungen belegen also grundsätzlich die Reversibilität des HD-Phänotyps. Es besteht daher ein dringender Bedarf für transgene Tiermodelle zur Untersuchung der Chorea Huntington und für die Suche nach geeigneten therapeutischen Maßnahmen.

Als gegenwärtige Probleme bei Therapie- und Verlaufsstudien in Tiermodellen der HD lassen sich folgende Sachverhalte zusammenfassen: (1 ) Neurochemisch induzierte Tiermodelle zeigen keine Progredienz; (2) das weit verbreitete transgene Tiermodell der R6/2 Maus zeigt einen fulminanten, rasch progredienten Verlauf; (3) die R6/2 Maus weist Komorbidität in Form von Diabetes mellitus auf. Die Aufgabe der Erfindung bestand daher darin, ein transgenes Tier für die neu- rodegenerative Erkrankung Chorea Huntington Krankheit als Modell zur Verfügung zu stellen, dass den Krankheitsverlauf beim Menschen besonders eng widerspiegelt und dabei insbesondere einen langsameren Krankheitsverlauf als bei bekannten Tiermodellen zeigt. Mit der Chorea Huntington nicht in Zusammenhang stehende Effekte, die beispielsweise durch eine bestimmte Komorbidität ausgelöst werden, sollten nach Möglichkeit nicht auftreten.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein spezielles, nachfolgend noch näher beschriebenes Nukleinsäurekonstrukt auf Basis des Ratten-Huntingtin-Gens (RDH10) sowie zugehörige Vektoren und Zellen, mit welchen es möglich ist, einen transgenen Säuger, nämlich insbesondere eine transgene Ratte zu gene- rieren, die die Nachteile im Stand der Technik nicht aufweist. Überraschenderweise konnte nachgewiesen werden, dass die erfindungsgemäße transgene Ratte den humanen Krankheitsverlauf besser abbildet als die bislang verwendeten Mausmodelle, obwohl es sich in beiden Fällen um Nager handelt. Der bei den Mäusen verbreitete Diabetes mellitus scheint nicht aufzu- treten. Auch andere Komorbiditäten sind nicht erkennbar. Der Krankheitsverlauf ist bei der Ratte gegenüber der Maus deutlich verlangsamt, so dass sich Ver- laufsstudien (über mehrere sich langsam entwickelnde Stadien) besser durchführen lassen. Ein vorteilhafter Nebeneffekt besteht bei der Ratte darin, dass sie etwas größer als die Maus ist, so dass sich bildgebende Verfahren und Operationen besser durchführen lassen. In der vorliegenden Erfindung wurde ein Rattenmodell für die humane HD entwickelt, welches einen langsam progredienten neurologischen Phänotyp aufweist und insbesondere die häufigste spät manifestierende und langsam pro- grediente Form der HD- widerspiegelt. Dies ist das erste funktionierende Rattenmodel für eine humane neurodegenerative Erkrankung des ZNS, welches durch ein Transgen induziert wird und unter der Kontrolle eines Rattenpromo- tors steht. Dieses Rattentiermodell wird nach aller Voraussicht für Langzeitver- laufsmonitoring mit Verhaltenstests und PET, für Langzeitbehandlungen und viele andere therapeutische Ansätze wie z.B. Mikrochirurgie und Stammzelltransplantation eine herausragende Bedeutung erlangen. Die Vergleichbarkeit des Rattenmodells zur humanen HD zeigt sich in neuropathologischen (Einschlusskörperchen im Striatum), neuroradiologischen (erweiterte laterale Ventrikel, fokale Läsionen im Striatum im MRT, reduzierte Glukoseu- tilisation im PET) und neurochemischen (Tryptonphanmetablismus im ZNS) Veränderungen einhergehend mit typischen Verhaltensauffälligkeiten. Die Auffällig- keiten im Verhalten spiegeln den Verlauf der Veränderungen beim Menschen wieder: Die Tiere imponieren bereits im Alter von zwei Monaten durch emotionale Auffälligkeiten wie z.B. reduzierter Angst im „elevated plus maze" und im „social interaction test of anxiety" und reduzierter Neugier (Exploration im „ho- leboard test"). Im Alter von 10 Monaten treten deutliche kognitive Veränderun- gen auf, wie z.B. vermehrte „working memory errors" und „reference memory errors" im „radial maze test" auf spatiales Lernen auf. Im Alter von spätestens 10-15 Monaten kommt es zu deutlichen Defiziten in Tests auf Motorfunktionen wie z.B. dem „accellerod test". Etwa ab dem 16 Lebensmonat tritt auch vermehrt Kachexie mit erhöhter Letalität auf. Diese HDtg-Ratten stellen somit das weltweit erste Rattenmodell für eine humane neurodegenerative Erkrankung des

ZNS dar und zeigen eine ganze Reihe von Parallelen zur humanen HD. Insge- samt ist davon auszugehen, dass diese Tiere ein geeignetes Modell für Therapiestudien bei neurodegenerativen Erkrankungen im allgemeinen und besonders für die „CAG-Repeat-Erkrankungen" darstellen.

Die Erfindung umfasst zunächst ein Nukleinsäurekonstrukt, welches für die Er- zeugung transgener Säuger für Tiermodellstudien verwendet wird. Das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt enthält wenigstens eine carboxyterminal verkürzte Sequenz des Ratten-Huntingtin-Gens (RDH10) wenigstens 36, insbesondere ca. 40, weiter vorzugsweise mehr als 50 CAG-Trinukleotid- Wiederholungen und außerdem stromaufwärts wenigstens einen wirksamen Teil eines Huntingtin-Gen-spezifischen Promotors.

Die zu stellenden Minimalanforderungen an das Konstrukt umfassen daher eine Regulationseinheit (Promotor) und das eigentliche Gen als Träger der proteinkodierenden Information, das hier aus einem CAG-Repeat-enthaltenden, ergänzten Ratten-Huntingtin-Gen-Abschnitt besteht. Der zu verwendende Promotor richtet sich zunächst nach der Spezies des zu generierenden transgenen Tieres, es können jedoch auch speziesfremde Promotoren eingesetzt werden, sofern diese die gewünschte Regulation bewirken. In Frage kommen in erster Linie Promotoren von Mensch, Ratte oder Maus, bevorzugt ist der native Ratten-Huntingtin-Gen-Promotor oder ein funktioneller Be- standteil davon. Im Prinzip kann jeder Promotor für HD-transgene Nager verwendet werden, der im Gehirn exprimiert wird. Beispiele sind der Priongenpro- motor, der PDGF-Promotor und der menschliche Huntington-Promotor. In Weiterbildung der Erfindung ist das Nukleinsäurekonstrukt so ausgestattet, dass die CAG-Trinukleotid-Wiederholungen innerhalb eines in das Konstrukt in- tegrierten humanen Huntingtin-Genabschnittes vorliegen, der beispielsweise aus Patienten-DNA gewonnen wurde. Die Gewinnung des humanen Genabschnitts mit den CAG-Repeats kann beispielsweise durch PCR-Reproduktion mit den Primern Hu 4 (ATGGCGACCCTGGAAAAGCTGATGAA) und Hu3-510 (GGGCGCCTGAGGCTGAGGCAGC) erfolgen. In der Regel wird das Nukleinsäurekonstrukt stromabwärts vom Ratten- Huntingtin-Gen eine Polyadenylierungssequenz enthalten, welche nach Transkription eine Poly-A-Anheftung an die mRNA und eine Erhöhung der mRNA- Stabilität vermittelt. Der Ersatz einzelner Komponenten des im Beispiel angegebenen Konstrukts durch solche mit entsprechenden Funktionen ist möglich. Beispielsweise kann, wie oben angegeben ein anderer Promotor werwendet werden (z.B. aus Mensch, Ratte oder Maus), ein kürzeres oder längeres cDNA Genfragment bzw. Konstrukt oder es kann sogar ein direkter Einbau kompletter menschlicher, Ratten- oder Maus-cDNA-Sequenzen erfolgen. Schließlich können sich Konstrukte durch Verwendung unterschiedlicher Poly-A-Signale (SV40 häufig) unterscheiden. Die Reihenfolge aller Teile wiederum ist immer festgelegt. Der Promotor liegt am δ'-Ende, 3' unmittelbar durch die cDNA flankiert, deren Ende durch ein Stoppkodon und das Poly-A-Signal bestimmt ist. Die Sequenz des Ratten-Huntingtin-Gens (auch bezeichnet als IT-15), bzw. des hier relevanten carboxyterminal verkürzten Abschnitts RHD10, ist beschrieben in Schmitt et al., 1995 (s. Lit.), und unter GenBank Accession Nr. U 18650 veröffentlicht. Vorzugsweise wird das CAG-Repeats-enthaltende N-terminale Ende des inkompletten Ratten-Huntingtin-Gens (RHD10) durch humane Patien- ten-DNA, die wenigstens 36 CAG-Repeats enthält, ersetzt. Dieses geschieht weiter vorzugsweise durch Einfügen eines PCR-Fragments, welches von einem Chorea-Huntington-Patienten generiert wurde.

Die Erfindung umfasst weiter Vektoren und Säugetierzellen, ausgenommen embryonale menschliche Zellen, die das Nukleinsäurekonstrukt enthalten, bzw. mit diesem transfiziert sind.

Das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt, die Vektoren und Zellen werden dann mit Hilfe im Stand der Technik bekannten Verfahren zur Erzeugung trans- gener Tiere verwendet. Bevorzugt werden nichtmenschliche transgene Säuger generiert, insbesondere transgene Drosophila, Mäuse und Ratten. Die erzeugte transgene Ratte zeichnet sich dadurch aus, dass sie im Genom ihrer Keimbahn- und somatischen Zellen eine aberrante, um CAG-Repeat- Einheiten erweiterte Sequenz des Huntingtin-Gens (HD10) enthält, welche in dieses Tier oder einen seiner Vorfahren eingeschleust wurde. Vorzugsweise weist die Gensequenz wenigstens 36, insbesondere ca. 40 CAG-Trinukleotid- Wiederholungen auf, weiter vorzugsweise mehr als 50 (im Beispiel 51 ).

Die erzeugte transgene Ratte wird als Modelltier für die Durchführung von Studien zum Verlauf der Chorea-Huntington-Krankheit, für die Entwicklung thera- peutischer und/oder prophylaktischer Mittel gegen diese Krankheit und vergleichbarer Krankheiten, für die Untersuchung von Therapiekonzepten, für die Durchführung mikrochirurgischer Operationen, Stammzelltransplantationen oder gentherapeutischer Behandlungen oder Antisensebehandlungen verwendet.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen und anhand von Abbildungen näher erläutert

Kurze Beschreibungen der Abbildungen Abbildung 1 zeigt in A eine allgemeine Übersicht des genetischen Konstrukts „RHD/Prom51A" für HDtg-Ratten. Der gesamte Klon der kodierenden Ratten- cDNA wäre 9333 bp lang. Für die transgenen Tiere wurde nur ein Teil der cDNA (1 -1963 bp) aus dem RHD10 Konstrukt genommen (Schmitt et al. 1995). Als Promoter wurde der native Ratten-Huntingtin-Promoter (885 bp) ge- nommen (Holzmann et al. 1998). Abbildung 1 B zeigt eine weitere Übersicht des Konstrukts. Die ersten 154 bp einer inkompletten Ratten-Huntingtin-cDNA (RHD10) (Schmitt et al., 1995) wurden ersetzt durch das PCR-Produkt eines Alieis von einem erkrankten HD-Patienten. Die cDNA liegt unter Kontrolle eines 885 bp Fragments aus dem Ratten-HD-Promotor (Position -900 bis -15 bp) (Holzmann et al., 1998). Ein 200 bp Fragment mit einem SV40 Polyadenylie- rungssignal ist schließlich downstream (3') angefügt, was insgesamt das RHD/Prom51 A Konstrukt ergibt.

Abbildung 2 zeigt eine Westernblotanalyse (Schmidt et al., 1998) aus Gehirngewebe von Wildtyp- und HDtg Ratten der Linien 2771 (heterozygotes Tier) und 2762 (heterozygotes und homozygotes Tier). Der polyklonale Anti- Huntingtin-Antikörpers 675 wurde verwendet. Es zeigt sich ein 75 kD Reaktionsprodukt, welches die Expression des Transgens auf niedrigerem Niveau als das endogene Protein belegt. Homozygote Ratten exprimieren ungefähr die doppelte Menge des transgenen Proteins im Vergleich zu den heterozygoten Tieren.

Abbildung 3 zeigt neuropathologische Veränderungen in frontalen histologi- schen Schnitten durch das Striatum von HDtg-Ratten in Form von nuklearen Einschlusskörperchen und Neurophilaggregaten. Die schwarz/weiß Photos A und B zeigen gering vergrößerte mikroskopische Sichtfelder von Wildtyp- (A) und HDtg- (B) Rattengehirnen im Alter von 14 Monaten. Die EM48- Immunoreaktivität ist besonders angereichert im vorderen Teil des Striatums (Str) in unmittelbarer Nähe zu den lateralen Ventrikeln (Pfeil) im HDtg Rattengehirn. Ctx: Kortex. Maßstab: 50μm. (C) Im Nukleus caudatus des Striatum der HDtg Ratten finden sich viele nukleare Aggregate und kleine Neurophilaggrega- te. Neurophilaggregate (Pfeile) finden sich ebenfalls im lateralen Gyrus pallidus (LGP). Maßstab: 25μm. (D) Starke Vergrößerung aus dem Striatum von HDtg Ratten sowohl mit EM48-positiven nuklearen Aggregaten (Pfeilköpfe) als auch mit kleinen Neuorphilaggregaten (Pfeile). Maßstab: 10μm). Abbildung 4 zeigt spezifische Unterschiede in einzelnen Gehirnregionen der HDtg Ratten in den Gewebekonzentration von Dopamin und Kynureninsäurede- rivaten. Die Spiegel von Dopamin (A, B), DOPAC (C, D), Tryptophan (E, F) und Xanturinsäure (G, H) im Striatum (A, C, E, G) oder im parietalen Kortex (B, D, F, H) von Wildtyp-

(-/-) oder transgenen heterozygoten ( + /-) bzw. homozygoten ( + / + ) Ratten sind dargestellt. Sternchen bezeichnen signifikante Unterschiede zwischen Wildtyp- Kontrollratten (-/-)und hetero- bzw. homozygoten HDtg Ratten (*p < 0.05, **p < 0.001 , ***p < 0.0001 ). Diese Untersuchungen zeigen mittels neuroche- mischer Analysen, dass die HDtg Ratten zur humanen HD beim Menschen vergleichbare Veränderungen aufweisen.

Abbildung 5 zeigt neuroradiologische Veränderungen in schwarz/weiß Abzügen von Magnetresonanztomographien (MRT) des Gehirns von HDtg-Ratten in Form von fokalen Läsionen im Striatum und in Form von erweiterten lateralen Ventrikeln. (A-D) MRT-Scans der lateralen Ventrikel in koronaler (frontaler) (A) und sagitaler (B) Schnittebene von Wildtyp- (A,B) und HDtg (C, D) Rattengehirnen. (E, F) MRT-Scans auf koronaler Ebene des Striatum eines Wildtyp- (E) und eines HDtg Tieres (F) im Alter von 8 Monaten. Beachte die Vergrößerung der lateralen Ventrikel (Pfeile in C und D) und die fokalen Läsionen im Striatum (Pfeile in F). Diese Untersuchungen zeigen unter Anwendung der neuroradiologischen Methode des MRT, dass die HDtg Ratten im Vergleich zur humanen HD ähnliche Veränderungen aufweisen. Abbildung 6 zeigt Veränderungen in der Glukoseutilisation im [¹⁸F]FDG hochauflösenden Kleintier-PET in HDtg-Ratten. Die Abbildung setzt sich zusammen aus schwarz/weiß-konvertierten repräsentativen Images (Originale in farbig) aus dem [¹⁸F]FDG Kleintier-PET in horizontaler (B-D) und koronaler (F-H) Schnittebene gemeinsam mit individuellen MRT-Scans (A, E) und ex vivo Autoradiographi- en (J, K). MRT-Scans (A, E) eines Wildtypkontrolltieres sind parallel aufgezeichnet mit den entsprechenden [¹⁸F]FDG-PET Images (B, F). Die Schnittebenen liegen auf Höhe des Caudato-Putamenkomplexes. Die Schnitte für die Autoradio- graphie (J, K) sind aus den selben Tieren wie auch die [¹⁸F]FDG-PET Aufnahmen (B, F, D, H). Messbereich (regions of interest) innerhalb der [¹⁸F]FDG-PET Images sind definiert unter Verwendung der korrespondierenden MRT-Scans (verdeutlicht mittels der weißen Linien). Die lokale Rate des Glukosemetabolismus (ICMR_Q ist absolut quantifiziert (siehe Schwarz-Weißskalen). Die starke Anreicherung von Aktivität im Caudato-Putamenbereich ist deutlich sichtbar in [¹⁸F]FDG-PET Images (F, G, H) und in den Autoradiographien (J, K). Homozy- gote transgene Ratten zeigen signifikant (p < 0.05) erniedrigte ICMR_G,_U Werte in Vergleich zu den Wildtypkontrollen, sowohl in [¹⁸F]FDG-PET (34.54 ± 18.52 vs. 54.98 ± 15.53) als auch in den ex vivo Autoradiographien (43.54 ± 6.77 vs. 63.02 ± 8.24). Diese Untersuchungen zeigen mittels der neuroradiologi- schen Methode des PET, dass die HDtg Ratten im Vergleich zur humanen HD vergleichbare Störungen in der Glukoseutilisation aufweisen. Der Ansatz belegt weiterhin, dass es in den HDtg-Ratten möglich ist, über wiederholte PET- Analysen Verlaufsstudien durchzuführen, die in der Maus nicht möglich sind. Abbildung 7 zeigt die Körpergewichtsentwicklung von Wildtyp-Kontrollratten (- /-; n = 10) im Vergleich zu heterozygoten ( +/-; n = 15) und homozygoten ( +/ + ; n = 15) Huntington 's Disease (HD) transgenen (tg) Ratten über den Zeitraum von zwei Jahren (Ende der Untersuchung) mit wöchentlichen Messzeitpunkten. Die Varianzanalyse für wiederholte Messungen zeigt einen signifikanten Effekt des Faktors „Genotyp" mit F(3, 32): 12.4, p = 0.0004, einen signifikanten Effekt der Faktors für wiederholte Messung von Körpergewicht F(2, 63): 882, p < 0.0001 und eine signifikante Interaktion der Faktoren (Genotyp x Körpergewicht) mit F(2, 126): 3.6, p< 0.0001 . Die signifikante Interaktion in der ANOVA kommt durch die zunehmende Verlangsamung der Körpergewichtszunahme in den HDtg-Ratten über den Messzeitraum zustande. Die HDtg-Ratten sind im Alter von 6 Monaten 5% leichter und wiegen im Alter von 24 Monaten 20% weniger als die Kontrolltiere. Alle Datenpunkte repräsentieren Mittelwerte ± Standardfehler. Dieses Monitoring belegt den differentiellen Effekt des Transgens auf die Wachstumsrate und eine langsame Progredienz der Erkrankung.

Abbildung 8 zeigt die kumulative Überlebensrate von Wildtyp-Kontrollratten (-/-; n = 10) im Vergleich zu heterozygoten ( +/-; n = 15) und homozygoten ( + / + ; n = 15) Huntington 's Disease (HD) transgenen (tg) Ratten über den Zeitraum von zwei Jahren (Ende der Untersuchung) mit monatlichen Aufnahmezeitpunkten. Der „Log-Rank (MantelCox) Test" für „Event time in months" aus der Kaplan-Meier Analyse ergibt bei einem Chiquadrat von 6.2 bei einem Freiheitsgrad von 2 einen signifikanten Gruppenunterschied mit p = 0.04. Dieses Monitoring belegt den Effekt des Transgens auf die Überlebensrate der HDtg-Ratten. Abbildung 9 zeigt die Verhaltensveränderungen im „Elevated plus maze test of anxiety" von männlichen Wildtyp-Kontrollratten (-/-; n = 10) im Vergleich zu heterozygoten ( +/-; n = 15) und homozygoten ( +/ + ; n - 15) HDtg Ratten im Alter von zwei Monaten. Der prozentuale Anteil an Zeit auf den offenen Armen des Labyrinths ist ein gut validierter Parameter für Ängstlichkeit in Nagern. Vermehrte und verlängerte Besuche auf den offenen Armen belegen einen an- xiolyseartigen Effekt. HDtg Ratten ( +/-, gestrichelte Säulen und +/+ , schwarze Säulen) verbringen signifikant (**p< 0.001 ; ***p < 0.0001 ) mehr Zeit auf den offenen Armen. Auch die Zahl der Eintritte in die offenen Arme (*p <0.01 ; **p< 0.001 ) ist erhöht. Kein Unterschied zeigte sich in der Aktivität der Tiere. Dieser Verhaltenstest belegt den differentiellen Effekt des Transgens auf den emotionalen Parameter „Ängstlichkeit" in HDtg-Ratten und ist daher vergleichbar mit Befunden in R6/2 Mäusen und den frühen emotionalen Auffälligkeiten in HD Patienten. Abbildung 10 zeigt die Verhaltensveränderungen im „Social interaction test of anxiety" von männlichen Wildtyp-Kontrollratten (-/-; n = 1 1 ) im Vergleich zu heterozygoten ( +/-; n = 13) und homozygoten ( +/ + ; n - 1 1 ) HDtg Ratten im Alter von zehn Monaten. Die Zeitdauer, welche die Tiere in aktiver sozialer Interaktion in neuer Umgebung mit einer Partnertestratte des gleichen Genotyps verbringen ist ein Indikator für Ängstlichkeit bei Nagern. Die Daten repräsentieren den Mittelwert ( ± Standardfehler) aus den Summen der Zeiten in aktiven sozialen Interaktion beider Testtiere. Verlängerte aktive soziale Interaktion gilt als Indikator für einen anxiolyseartigen Effekt. Die Varianzanalyse zeigt signifikante Effekte für den Faktor „Genotyp" mit F(2, 32): 12.4, p = 0.0001 . Die HDtg Ratten ( + /-, gestrichelte Säulen und +/ + , schwarze Säulen) verbringen signifikant (**p = 0.0004; ***p<0.0001 ) mehr Zeit in aktiver sozialer Interaktion. Diese Untersuchung belegt den Effekt des Transgens auf den emotionalen Parameter „Änglichkeit" in einem weiteren Verhaltenstest, der sich im Unterschied zum „Elevated plus maze test of anxiety" auch für wiederholte Untersu- chungen als Verlauf kontrolle für die emotionalen Parameter eignet. Abbildung 1 1 zeigt die Verhaltensveränderungen im „Holeboard test of explora- tory behavior" von männlichen Wildtyp-Kontrollratten (-/-; n = 10) im Vergleich zu heterozygoten ( + /-; n = 15) und homozygoten ( + / + ; n = 10) HDtg Ratten im Alter von drei Monaten. Der Anzahl des Kopfbewegungen in die Löcher im Boden des Testapparats (vertikale Aktivität) hinein dient als ein Maß für das Explorationsverhalten (Neugier) der Tiere, während die Zahl der Lichtschrankenunterbrechungen in horizontaler Ebene die generelle körperliche Aktivität widerspiegelt (A). Die Varianzanalyse zeigt signifikante Effekte für den Faktor „Genotyp" mit F(2, 32): 4.3, p = 0.023. Die homozygoten HDtg Ratten ( + / + , schwarze Säulen) untersuchen die Löcher im Boden des Testapparats signifikant seltener (*p = 0.006) bei unveränderter motorischer Aktivität gegenüber den Wildtypkontrollen (B). Dieser Verhaltenstest belegt den differentiellen Effekt des Transgens in HDtg-Ratten auf den emotional/kognitiven Parameter „Explo- ration". Die Ergebnisse sind vergleichbar mit den frühen emotionalen Auffällig- keiten in HD Patienten.

Abbildung 12 zeigt die Verhaltensveränderungen im „Radial maze test of spatial learning and memory" von männlichen Wildtyp-Kontrollratten (-/-; n = 9) im Vergleich zu heterozygoten ( + /-; n = 14) und homozygoten ( +/ + ; n = 10) HDtg Ratten im Alter von zehn Monaten. Ein „Allozentrisches ReversaT-Design wurde abgetestet. Zunächst waren vier zufällig ausgewählte Arme des Acht- arm-Radialmaze mit Futterpellets belohnt. Diese belohnten Arme wurden während der ersten fünf Tage nicht gewechselt. Am sechsten Testtag wurden andere Arme mit Futter belohnt. Die Startarme wurden zufällig aus den unbelohn- ten Armen ausgewählt. Die Orientierung im Maze verlief für die Ratten „allozen- frisch", also über sichtbare Reize außerhalb des Maze (Wände, Regale, Tür, etc.). „Egozentrische" Information (z.B. eine Strategie wie „immer jeder zweite Arm rechts herum") konnte durch die Tiere nicht angewendet werden, da die Startarme zufällig gewählt wurden. Die Tiere wurden vier mal an einem Tag getestet. Die Anzahl der mehrfachen Besuche in bereits zuvor besuchten Armen innerhalb eines Tests (Working memory errors) (A) und die Anzahl der Besuche in unbelohnte Arme (Reference memory errors) (B) wurden erhoben und Mittel- werte pro Testtag aus vier Läufen berechnet. Die Varianzanalyse für wiederholte Messungen zeigt signifikante Effekte in beiden Analysen für den Faktor „Genotyp" mit F(3, 30): 7.7, p = 0.002 für „Working memory errors" (A) und mit F(3, 30): 14.5, p < 0.0001 für „Reference memory errors", als auch jeweils si- gnifikante Effekte für die Faktoren der wiederholten Messung, was den Lern- prozess belegt. Posthoc-Analysen zeigen signifikant erhöhte Fehlerzahlen in den transgenen Ratten beider Genotypen mit jeweils p < 0.001. Alle Datenpunkte repräsentieren Mittelwerte ± Standardfehler. Die Ergebnisse belegen eine „Working memory amnesia" (Arbeitsgedächtnisschwäche), was dann auch die Ausbildung eines „Reference memory" (Langzeitgedächtnis) unterbindet. Dieser Verhaltenstest belegt den Effekt des Transgens in HDtg-Ratten auf den kognitiven Parameter „Spatiales Lernen"und ist daher vergleichbar mit Befunden in R6/2 Mäusen und den kognitiven Auffälligkeiten in HD Patienten. Abbildung 13 zeigt die Verhaltensveränderungen im „Two way active avoidan- ce Shuttle box test of associative leaming" (Assoziatives Lernen in „Zwei- Wege-Aktive-Vermeidung-Transfer-Kammern") von männlichen Wildtyp- Kontrollratten (-/-; n = 9) im Vergleich zu heterozygoten ( +/-; n = 13) und homozygoten ( +/ + ; n — 10) HDtg Ratten im Alter von 9 Monaten. Assoziative Lernfähigkeit im Rahmen eines Konditionierungsprozesses wurde abgetestet. Während mehrfacher Durchläufe an aufeinander folgenden Tagen lernen die Tiere einen angekündigten (Licht oder Ton) aversiven Stimulus (Stromschlag) durch eigene Aktivitätsleistung (Transferbewegung in ein anderes Komparti- ment) zu vermeiden. Der Test ist im Gegensatz zum Radial Maze durch ein hohes Stressniveau charakterisiert. Die Anzahl korrekter Vermeidungsreaktionen, die „active avoidance" (Transfer in das „sichere" Kompartment nach dem Signalstimulus und vor dem aversiven Stimulus) wurden erhoben. Die Varianzanalyse für wiederholte Messungen zeigt signifikante Effekte für den Faktor der wiederholten Messung „Avoidance" mit F(3, 30): 7.7, p = 0.002 und eine signifikante Interaktion zwischen Genotyp und Avoidance mit F(3, 30): 14.5, p < 0.0001 was einen differentiellen Lernprozess zwischen den einzelnen Genotypen belegt. Einfaktorielle Varianzanalysen mit anschließender Posthoc-Analyse zeigen signifikant erhöhte Vermeidungsreaktionen in den transgenen Ratten beider Genotypen mit jeweils p < 0.01 ab dem sechsten Testtag. Alle Datenpunkte repräsentieren Mittelwerte ± Standardfehler. Die Ergebnisse zeigen, dass die transgenen Ratten unter Stress eine einfache assoziative Lernaufgabe besser bewältigen, was häufig bei funktionellen Beeinträchtigungen des Hippo- campus beobachtet wird. Die Ergebnisse dieses Verhaltenstests könnten wegweisend für ein erweitertes Verständnis der Pathologie der HD sein, da sie auf eine wichtige Rolle stressregulativer Systeme hindeuten und eine Verknüpfung der Basalganglien mit dem Hippocampus belegen. Abbildung 14 zeigt die Verhaltensveränderungen in wiederholten "Accellerod- tests of motor coordination" von männlichen Wildtyp-Kontrollratten (-/-; n = 8) im Vergleich zu heterozygoten ( +/-; n = 10) und homozygoten ( + / + ; n = 9) Huntington 's Disease (HD) transgenen (tg) Ratten. Nach einer Trainingsphase von fünf Tagen wurde die Fähigkeit, sich auf einen konstant von 4 bis 40 Dre- hungen pro Minute beschleunigendem Drehbalken zu halten, in drei Tests pro Tag an drei aufeinander folgenden Tagen getestet. Die Zeitdauer in Sekunden bis zum Herunterfallen und die maximal erreichte Drehgeschwindigkeit des Drehbalken in „rounds per minute" (rpm [n max]) wurden jeweils pro Testtag gemittelt und in 5, 10 und 15 Monate alten HDtg Ratten erfasst. Die Varianza- naiyse für wiederholte Messungen zeigt für die Tests im Alter von 5 Monaten keinen signifikanten Effekt des Faktor „Genotyp" (A). Im Alter von 10 Monaten (B) zeigen sich signifikante Effekte für den Faktor „Genotyp" in der Zeitdauer auf dem Drehbalken mit F(2, 24): 4.6, p = 0.02 und der maximal erreichten Drehgeschwindigkeit mit F(2, 24): 4.2, p = 0.03. Im Alter von 15 Monaten (C) zeigen sich signifikante Effekte für den Faktor „Genotyp" in der Zeitdauer auf dem Drehbalken mit F(2, 24): 6.6, p = 0.005 und der maximal erreichten Drehgeschwindigkeit mit F(2, 24): 7.0, p = 0.004, was eine progrediente Verschlechterung der Motorfunktionsleistung der HDtg belegt. Diese progrediente Verschlechterung des Parameters „Gleichgewicht und Motorkoordination" findet sich in einem gut validierten Verhaltenstest, der sich auch für wiederholte Untersuchungen als Verlaufskontrolle eignet. Die Motorfunktionsstörungen in den HDtg-Ratten kommen im Vergleich zum Zeitpunkt des Auftretens der emotionalen und/oder kognitiven Veränderungen später zur vollen Ausprägung, was eine weitere Parallele zur humanen HD darstellt.

Abbildung 1 5 zeigt die Verhaltensveränderungen im „Beam walk test of motor functions" von männlichen Wildtyp-Kontrollratten (-/-; n = 10) im Vergleich zu heterozygoten ( + /-; n = 14) und homozygoten ( +/ + ; n = 10) HDtg Ratten im Alter von fünf Monaten. Nach einer Trainingsphase von drei Tagen wurde an zwei weiteren aufeinanderfolgenden Tagen die Fähigkeit getestet, sich auf einem dünnen Balken fortzubewegen und ggf. festzuhalten. Unterschiedliche run- de und viereckige Balken (125cm Länge) wurden verwendet. Die Überque- rungszeitdauer in Sekunden und die Häufigkeit des Herunterfallens wurden er- fasst. Die Varianzanalyse für wiederholte Messungen zeigt für die Tests auf einen runden Balken von 16 mm Durchmesser einen signifikanten Effekt des Faktors „Genotyp" in der Überquerungszeitdauer mit F(2, 31 ): 8.1 , p = 0.0015 und der Absturzhäufigkeit mit F(2, 31 ): 5.4, p = 0.0096. Posthoc-Analysen mittels des PLSD-Tests zeigten, dass der statische overall-Effekt in diesem Motorfunktionstest auf einer signifikanten (** = p < 0.0001 ) Verschlechterung in den homozygoten HDtg beruht. Diese differentiellen Motorfunktionsstörungen im Alter von fünf Monaten zwischen den hetero- und homozygoten HDtg-Ratten zeigen, dass der Beginn und möglichweise auch die Spezifität der Motorfunktionstörungen von der Gendosis abhängig sind.

BEISPIELE Beispiel 1

Zunächst wurde ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß Abbildung 1 erzeugt. Das Konstrukt kontrolliert mittels seiner Regulationseinheit wo (topografisch: in welchem Gewebe) und wann (ontogenetisch: embryonal oder adult) das dahinter geschaltete Gen angeschaltet wird. Als Regulationseinheit in dem vorliegenden HDtg Konstrukt wurde der native Ratten-Huntingtin-Promotor verwendet (Abb. 1 B). Der Ratten-Huntingtin-Promotor wurde in Vorarbeiten durch die Erfinder charakterisiert und im Detail beschrieben (Holzmann et al. 1998). Als zweiter wichtiger Bestandteil des Konstrukts, dem eigentlichen Gen, wurde in den HDtg Ratten ein Teil des durch die Erfinder isolierten Ratten-Huntingtin- Gens verwendet (Schmitt et al., 1995). Dieses Ratten-Huntingtin-Gen trägt eine krankheitsspezifische Mutation, die aus der DNA eines Patienten mittels PCR generiert wurde. Dabei wurden die ersten 154 bp einer inkompletten Huntingtin cDNA aus der N-terminalen Rattensequenz (RHD10) und durch das PCR-Produkt eines Allels von einem erkrankten HD Patienten ersetzt (Abb. 1 B). Als dritter Bestandteil ist das Polyadenylierungssignal zu nennen, welches nach der Transkription ermöglicht, dass ein Poly-A-Ende an die mRNA angeheftet wird und damit der mRNA Stabilität gegen Abbauprozesse verleiht (Abb. 1 B). Das ge- samte Konstrukt wird in einen Vektor gebracht, mit dem Ziel, das Konstrukt zunächst in Bakterien zu vervielfältigen um möglichst viele Kopien von dem Ge- samtkonstrukt zu generieren. Diese werden dann in den männlichen Vorkern der befruchteten Eizelle injiziert. Die aus den reimplantierten transgenen Eizellen gewachsenen Nachkommen werden gezüchtet und die Expression und Funktion des Transgens in den Tieren charakterisiert (Abb. 2 und folgende). Material und Methoden der Generierung der HDtg Ratten (Beispiel 1 ) Generierung des Konstrukts

Für die Generierung des Konstrukts wurde eine PCR mit DNA eines HD Patienten mit 51 CAGs mittels der Primer Hu 4 (ATGGCGACCCTGGAAAAGCTGATGAA) und Hu3-510

(GGGCGCCTGAGGCTGAGGCAGC) durchgeführt. Das resultierende PCR Pro- dukt wurde anschließend mit Eccßλ \ verdaut. Die ersten 154 Nukleotide der cDNA RHD10 mit nt 1 -1962 des Ratten-Huntingtin-Gens (Schmitt et al., 1995) wurden entfernt durch Restriktion des Klons mit EcoKsi und Ecc&'W. Das resultierende Fragment wurde durch das PCR-Produkt ergänzt (Abb. 1 B). Anschlie- ßend wurde ein 885 bp langes Fragment aus dem Ratten-Huntingtin-Promotor von Position -900 bis -15 (Holzmann et al., 1998) oberhalb (upstream) der cDNA und ein 200 bp Fragment mit dem SV 40 Polyadenylierungssignal unterhalb (downstream) der cDNA angeschlossen, was insgesamt das RHD/Prom51 A-Konstrukt ergibt (Abb. 1 B). Alle Klonierungsschritte wurden durch Sequenzierungen überwacht. Das mittels Klonierungsvektor vervielfältigte Konstrukt wurde mit Xbά und Ssfi aus dem Vektor geschnitten und durch Mi- kroinjektion in den männlichen Vorkern von Oozyten aus Sprague-Dawley (SD) Rattenspendern übertragen (Mullins et al., 1990; Schinke et al., 1999) und autolog intrauterin reimplantiert. Nach dem Austragen wurde DNA von jedem der Nachkommen aus Schwanzbiopsien gemäß Standardprozeduren gewonnen. Southemblotanalysen mit ÄöRI-verdauter DNA wurden zur Identifikation der transgenen „heterozygoten" Gründertiere (Founder) durchgeführt. Zwei transgene Tiere als Gründer der Linien 2771 und 2762 wurden auf diesem Wege identifiziert und weiteren Analyse-, Charakterisierungs- und Zuchtschritten zu- geführt (Abb. 2 und folgende).

Kontrolle der Huntingtinexpression

Um die Expression des Transgens zu überprüfen, wurden zunächst Westernblo- tanalysen an Gehirnproben durchgeführt (Abb. 2). Dazu wurden gefrorene Gehirnhälften homogenisiert und Protein unter Schutz von Proteinaseinhibitoren über Ultra-Thurrax extrahiert. Nach Zugabe von Nonidet P-40 (Endkonzentration 1 %) wurde das Homogenat für 15 Minuten auf Eis inkubiert. Die Proteinextrakte (30 /g/Spur) wurden auf SDS-PAGE (4%) aufgetragen und elektrophoretisch auf Immobilon-P Membranen (Milipore) geblottet. Ein bereits gefärbter Kontrollmarker für die Identifikation verschiedener Proteingrößen (Novex Multimark, Invitrogen, Karlsruhe, Germany) wurde in eine weitere Spur aufgetragen. Wildtyp- und transgenes Huntingtinprotein wurden durch den polyklonalen anti- huntingtin-Antikörper 675 (Verdünnung 1 :1.000) detektiert (Schmidt et al., 1998).

Westernblotanalyse aus Gehirngewebe von Wildtyp- und HDtg Ratten der Linien 2771 (heterozygotes Tier) und der Linie 2762 (heterozygotes und homozygotes Tier): Der polyklonale Anti-Huntingtin-Antikörper 675 wurde verwendet. Es zeigt sich ein 75 kD großes Reaktionsprodukt, welches die Expression des Transgens auf niedrigerem Niveau als das endogene Protein belegt. Homozy- gote Ratten exprimieren ungefähr die doppelte Menge des transgenen Proteins im Vergleich zu den heterozygoten Tieren. Ergebnisse (Beispiel 1 )

Das aus 1963 bp bestehenden Ratten-HDcDNA-Fragment (Schmitt et al, 1995) mit einer Verlängerung von 51 CAG Repeats unter Kontrolle von 885 bp des endogenen Ratten-HD-Promotors (Holzmann et al., 1998) (Abb. 1A,B) konnte erfolgreich für die Mikroinjektion verwendet werden. Zwei transgene Gründer- tiere (Founder) wurden nach Reimplantation der Oozyten ausgetragen. Die beiden Founder wurden erfolgreich zur Etablierung der weiteren Zucht verwendet. Die Linie 2762 wurden über mehr als zwei Jahre weiter charakterisiert. In dieser Linie waren die CAG Repeats über mehr als 147 Meiosen stabil und die Expression des Transgens konnte im Westernblot (Abb. 2) nachgewiesen werden. Diskussion (Beispiel 1 )

Die Ergebnisse belegen die Generierung von HDtg Ratten und die Expression des transgenen Huntingtins im Gehirn. Es ist damit erstmals die Generierung einer transgenen Rattenlinie für eine humane neurodegenerative Erkrankung gelungen. Beispiel 2

Einleitung: Identifikation pathognomonischer Veränderungen im zentralen Nervensystem von HDtg Ratten

Im vorhergehenden Beispiel haben wir die Generierung von HDtg Ratten und die Expression des transgenen Huntingtins im Gehirn zweier transgener Rattenlinien beschrieben. In dem nun folgendem Beispiel 2 wird die Identifikation von HD typischen Veränderungen in HDtg Ratten der Linie 2762 im Detail beschrieben. Es sind dies die Beschreibung von (1 ) Einschlusskörperchen und Neurophilag- gregaten im Striatum durch Immunhistologie, von (2) neurochemischen Veränderungen des Tryptophanmetabolismus und seiner Kynurenine-, Katechol- und Indoleamin-Metabolite im ZNS durch HPLC-Analysen, von (3) erweiterten Ven- trikeln und fokalen Läsionen im Striatum durch MRT-Untersuchungen und von (4) einer reduzierten Glukoseutilisation im Striatum und Kortex durch PET- Untersuchungen.

Materialen und Methoden der neuropathologischen Untersuchungen und des Neuroimaging (Beispiel 2) Immunhistologische Identifizierung von Einschlusskörperchen und Neurophilag- gregaten

Die Gehirne von 18 Monaten alten HDtg Ratten und entsprechenden Wild- Typkontrollen wurden über den linken Ventrikel der Herzens unter tiefer Anästhesie mit Pufferlösung (PBS) bei ph 7.2 für 30-60 Sekunden perfundiert. Es schloss sich eine Perfusion mit 4%iger Paraformaldehydiösung in 0.1 M Phos- patpuffer (PB) bei ph 7.2 bis zur kompletten Fixation an. Nach Entnahme wurden die Gehirne in derselben Fixationslösung für 6-8h nachfixiert und anschließend in Phosphatpuffer mit 0.1 % Natriumazid bei + 4°C gelagert. Frei flotie- rende Schnitte der Gehirne wurde mit 4%igem normalem Ziegenserum in PBS mit 0.1 %igem Triton X und Avidin (10μg/ml) vorbehandelt, um eine Reduktion unspezifischer Bindungen des Antikörpers zu erreichen. Die Schnitte wurden dann mit dem Antikörper EM48 (1 :400 Verdünnung) bei + 4°C über 24h inkubiert (Gutekunst et al., 1999; Li et al., 2000). EM48-positive Immunpräzepitate wurden dann mit der ABC-Methode (Avidin-Biotin Complex Kit; Vector ABC Elite, Burlingame, CA, USA) in lichtmikroskopisch sichtbare Komplexe umgewandelt. Ein Axioskop 2 Mikroskop mit einer Digitalkamera wurden zur Bildverarbeitung verwendet. Altersangepaßte Wildtypratten dienten als Kontrollen. Neurotransmitterspiegel im Gehirn Tryptophan und seine Kynurenin, Katechol- und Indoleamin Metabolite wurde mittels einer neu entwickelten und sensitiven HPLC-Methode gemessen (Vaar- man et al., 2002). Das Gehirn wurde in einzelne Gehirnregionen disseziert und anschließend Striatum und parietaler Kortex bei -80°C gelagert. Die gefrorenen Gehirnproben wurden gewogen und homogenisiert für 30 s in 100-500μl von 0.1 M Perchlorsäure. Die Homogenate wurden zentrifugiert mit 13000 g bei +4 °C für 20 min und 20 μl Überstand wurden in ein „High Pressure Liquid Chro- matographie" (HPLC) -System (ESA Modell 5600 CoulArray mit Pumpe Modell 582 und Autosampier Modell 540; Chelmsford, MA, USA) gespritzt. Zwei cou- lometrisch arbeitende Arrays, jedes ausgestattet mit vier Elektroden, wurden verwendet. Detektorpotentialen waren wie folgt: Kanal 1 - 50 mV, 2 -150 mV, 3 -250 mV, 4- 350 mV, 5 - 550mV, 6 - 900 und 7 - 1000 mV. Der pH Wert der flüssigen Phase wurde auf 4.1 eingestellt, diese gefiltert und gepumpt mit 0.5ml/min. Chromatographische Trennung wurde über eine ESA MD-150 rever- sed-phase C₁₈ analytische Säule (3μm Teilchengröße, 150 x 3.0 mm ID) mit einer Hypersilvorsäule (C₁₈, 7.5x4.6 mm ID, 5μm) erreicht. Alle Standards und Reagenzien waren von analytischem Reinheitsgrad und über Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) bzw. von Merck (Darmstadt, Germany) bezogen. Magnetresonanztomographie in HDtg Ratten

Die Ratten wurden mit 2% Isofluran anaesthetisiert und in einem stereotaktischem Rahmen fixiert. Die Tiere wurden dann im Zentrum des MRT Magneten plaziert. Die Magnetresonanztomographie wurden mittels eines 4.7-T BRUKER Biospec Tomographen durchgeführt. Eine Ganzkörperresonator ermöglicht dabei eine homogenes Erregungsfeld. Die Aufnahmeprozedur umfasste 1 1 axiale und 7 koronale Schnittbildaufnahmen über das gesamte Gehirn mit einer Schnittdik- ke von 1.3-1.5 mm mit einem Sichtfeld von 3,2x3,2 cm und einer von Matrix: 256x256 bei TR/TE 3000/19 ms über 6 Mittelwerte. Die Bilder wurden durch Scion Image Software (Scion Corporation, Maryland, USA) ausgewertet. Positronenemissionstomographie (PET) in HDtg Ratten

Neunzehn erwachsene männliche HDtg Ratten mit Wildtypkontrollen im Alter von 24 Monaten wurden untersucht. Diese teilten sich auf in homozygote Tiere ( + / + ; n = 6; 410 - 520 g; 451 .7 g ± 17.6), heterozygote Ratten ( + /-; n = 7; 460 - 580 g; 502.1 g ± 16.1 ), und altersangepasste Wildtypkontrollen (-/-; n = 6; 537 - 660 g; 589.5 g ± 20.7 ). Alle Tiere kamen aus identischen Standarthaltungsbedingungen. Die [¹⁸F]FDG-PET Untersuchungen wurden durch ex ι//ι/σ [¹⁸F]FDG Messungen direkt nach den PET-Untersuchungen kalibriert, um die Verlässlichkeit der in vivo Messungen zu überprüfen.

Die PET Untersuchungen wurden mittels eines hochauflösenden Kleintier-PET- Scanner, "TierPET", durchgeführt (Weber et al., 2000). Eine präzise Identifikation anatomischer Strukturen wurden Parallelaufnahmen von MRT-Aufnahmen gewährleistet. Für das hochauflösende TierPET erhielten die anaesthetisierten Tiere eine Injektion mit 0.3 ml [¹⁸F]FDG (1 mCi/ml, gelöst in NaCI 0.9 %). Parallel wurden Blutglukosebestimmungen vorgenommen. Während der Untersu- chungen befanden sich die Tiere auf einem Koordinatentisch zur präzisen Lokalisation innerhalb der x-, y- und z-Achsen. Für die ex vivo FDG Autoradiographie wurden die Gehirne entnommen und koronale Schnitte (20 μm) an einem Kryo- tom (CM 3050, Leica, Germany) angefertigt und diese gegen Phosphoraufnahmeplatte exponiert (BAS-SR 2025, Fuji, Germany) zusammen mit kalibrierten [¹⁸F] Gehirngewebestandart für 18 Stunden. Die Aufnahmeplatten wurden dann mittels „high-performance imaging plate reader" (BAS5000 BiolmageAnalyzer, Fujii, Germany) bei einer Auflösungen 50 μm gemessen und unter Berücksichtigung von Standards, Dosierung, Körpergewicht, Blutglukosespiegeln, etc. mittels spezieller Software (AIDA 2.31 , Raytest, Deutschland) ausgewertet. Die Berechnung der lokalen Glukoseutilisationsrate (ICMR_G,_C) (Sokoloff et al., 1977) erfolgte gemäß Ackermann und Kollegen (Ackermann et al., 1989) anhand der folgenden Konstanten: k₇ = 0.30; k₂ = 0.40; k₃ = 0.068; LC = 0.60. Die Ergebnisse der FDG-PET-Untersuchung und der ex vivo Autoradiographie wurden mittels liniearer Regressionsanalyse verglichen und statistisch ausgewertet.

Ergebnisse der neuropathologischen Untersuchungen und des Neuroimaging (Beispiel 2)

Spezifische Anreicherung von Huntingtinaggregaten und nuklearen Einschlusskörperchen im Striatum Zur Untersuchung der Frage, ob mutantes Huntingtin Aggregate im Gehirn von

18 Monate alten HDtg Ratten bildet, wurde der Antikörper EM48 eingesetzt (Gutekunst et al., 1999; Li et al., 2000), welcher spezifisch mutantes Huntingtin und seine Aggregate erkennt. Abbildung 3 zeigt neuropathologische Veränderungen in frontalen histologischen Schnitten durch das Striatum von HDtg Ratten in Form von nuklearen Einschlusskörperchen und Neurophilaggregaten. Am häufigsten wurde EM48 positive Immunreaktivität im Striatum gefunden und zeigte sich als punktierte Färbung typisch für Huntingtinaggregate. Die Huntingtinaggregate fehlen völlig in Wildtypkontrollen (Abb. 3A) und waren hauptsächlich konzentriert in der vorderen Region des Striatum (Str) in unmittelbarer Nähe der lateralen Ventrikel (Pfeil) von HDtg Ratten (Abb. 3B). Auch im Nukleus caudatus des Striatum der HDtg Ratten finden sich viele nukleare Aggregate und kleine Neurophilaggregate (Abb. 3C). Neurophilaggregate (Pfeile) finden sich ebenfalls im lateralen Gyrus pallidus (LGP). Stärkere Vergrößerung aus dem Striatum von HDtg Ratten zeigt sowohl EM48-positiven nuklearen Aggregaten (Pfeilköpfe) als auch kleine Neurophilaggregaten (Abb. 3D; Pfeile). Im Kortex (Ctx) zeigen sich nur wenige EM48 Aggregate und in anderen Hirnregionen wie dem Hippocampus oder dem Kleinhirn zeigte sich sehr schwache oder keine Immunreaktivität.

Zwei unterschiedliche Arten von EM48-Färbung sind zu beobachten: Nukleare Einschlusskörperchen und Neurophilaggregate. Einige Neurophilaggregate zeigen eine Perlenkettenartige Anordnung (Abb. 3C). Diese Färbemuster ist annähernd identisch mit anderen Tiermodellen der HD (Gutekunst et al., 1999). Einzelne nukleare Einschlusskörperchen werden häufig im Striatum beobachtet (Abb. 3D) und finden in ähnlicher Weise in auch in anderen Mausmodellen der HD (Davie et al., 1997; Li et al., 2000). Da Projektionsfasern aus dem Striatum mit ihren Axonen im lateralen Globus pallidus (LGP) enden, wurde auch die kaudale Region des Striatum untersucht. Während sowohl nukleare Färbungen als auch Neurophilaggregate häufig im Striatum sind, zeigen sich im LGP hauptsächlich Neurophilaggregate. Postmortale Konzentration an Tryptophan und biogener Amine Um neurochemische Veränderungen im Gehirn der HDtg Ratten zu identifizieren, wurde ein neues und sensitives HPLC-Verfahren angewendet, welches die gleichzeitige Bestimmung von verschiedenen Transmittern aus einzelnen Proben ermöglicht. Im Alter von 18 Monaten, zeigte sich ein 20% Erniedrigung der striatalen Dopaminspiegel in heterozygoten HDtg Ratten und eine dreifache Erniedrigung in den homozygoten HDtg Ratten (Abb. 4A). Die Dopaminspiegel im parietalen Kortex waren nicht signifikant Unterschiedlich zu den Wildtypkontrollen (Abb. 4B). Die Spiegel an DOPAC waren ebenfalls unverändert (Abb. 4D, E). In Übereinstimmung mit vorangegangenen Hinweisen für einen Veränderten Tryptophanmetabolismus in HD zeigte sich auch in den HDtg Ratten eine zweifachen Erniedrigung in striatalem Tryptophan (Abb. 4E). Außerdem zeigte sich ein Trend in Richtung einer Erniedrigung von Tryptophan im parietalen Kortex (Abb. 4F). Interessanterweise waren die Spiegel von Xanturinsäure, einem Me- taboliten aus 3-hydroxykynurin mit neuroprotektiven Eigenschaften, dramatisch erniedrigt im Striatum von homozygoten HDtg Ratten (Abb. 4G) und nicht de- tektierbar im parietalen Kortex (Abb. 4H). Im Gegensatz dazu zeigten sich er- höhte Spiegel von Xanturinsäure im parietalen Kortex (Abb. 4H) und unveränderte Spiegel im Striatum (Fig. 4G). Insgesamt zeigen diese Untersuchungen, dass die HDtg Ratten neurochemisch im ZNS Veränderungen aufweisen, die mit der humanen HD vergleichbar sind. Fokale Läsionen im Striatum und erweiterte laterale Ventrikel des Gehirns Um zu untersuchen, ob die HDtg Ratten auch neuropathologische Veränderungen aufweisen, die durch Neuroradiologie nachweisbar sind, wurden die o.a. MRT Untersuchungen an 8 Monate alten weiblichen HDtg Ratten der verschiedenen Genotypen und Wildtypkontrollen durchgeführt. Im Vergleich zu den Kontrollen (Abb. 5A, B) zeigten sich bei den homozygoten transgenen Weib- chen offensichtlich erweiterte laterale Ventrikel in koronaler (frontaler) (Abb. 5C; Pfeile) und sagitaler (Abb. 5D, Pfeile) Schnittebene. Der Vergleich von MRT-Scans auf koronaler Ebene des Striatum eines Wildtyp- (Abb. 5E) und eines HDtg Tieres (Abb. 5F) zeigt deutliche fokalen Läsionen im Striatum der HDtg Ratte (Pfeile in Abb. 5F). Diese Untersuchungen zeigen unter Anwendung der neuroradiologischen Methode des MRT, dass die HDtg Ratten im Vergleich zur humanen HD ähnliche Veränderungen aufweisen. Quantitative in vivo Bestimmung des lokalen Gehirnmetabolismus mittels hochauflösender Positronenemissionstomographie (PET)

[¹⁸F]FDG und PET wird zur Bestimmung der lokalen Metabolisation von Glukose (ICMR_G,_C) in HD Patienten verwendet. Diese Untersuchungen haben bisher kon- stant erniedrigte Metabolisationsraten ergeben. Um zu Untersuchen, ob derartige Veränderungen auch in den HDtg Ratten zu finden sind und somit dieses Tiermodell einem kontinuierlichen in vivo Monitoring zugänglich ist, wurde eine Studie mit [¹⁸F]FDG und hochauflösendem KleintierPET durchgeführt und die Ergebnisse mit MRT-Aufnahmen zur Identifikation der „Regions of interest" (ROI) und mit ex vivo [¹⁸F]FDG Messungen direkt nach der PET Untersuchung verglichen.

Die Harderschen Drüsen, der Bulbus Olfactorius, und verschiedene Gehirnregionen wie das Striatum bzw. der Caudatoputamenkomplex sind klar zu abzugrenzen (Abb. 6). Die Abbildung setzt sich zusammen aus repräsentativen Images aus dem [¹⁸F]FDG Kleintier-PET in horizontaler (B-D) und koronaler (F-H) Schnittebene gemeinsam mit individuellen MRT-Scans (A, E) und ex vivo Autoradio- graphien (J, K). MRT-Scans (A, E) eines Wildtypkontrolltieres sind parallel aufgezeichnet mit den entsprechenden [¹⁸F]FDG-PET Images (B, F). MRT-Scans (A, E) eines Wildtypkontrolltieres sind parallel aufgezeichnet mit den entsprechen- den [¹⁸F]FDG-PET Images (B, F). Die Schnittebenen liegen auf Höhe des Cauda- to-Putamenkomplexes. Die Schnitte für die Autoradiographie (J, K) sind aus den selben Tieren wie auch die [¹⁸F]FDG-PET Aufnahmen (B, F, D, H). Messbereiche (regions of interest; ROI) innerhalb der [¹⁸F]FDG-PET Images sind definiert unter Verwendung der korrespondierenden MRT-Scans (verdeutlicht mittels der wei- ßen Linien; Abb. 6A, E). Die lokale Rate des Glukosemetabolismus (ICMR_{G l}) ist absolut quantifiziert (siehe Schwarz-Weißskalen; Abb. 6). Die starke Anreicherung von Aktivität im Caudato-Putamenbereich ist deutlich sichtbar in [ ⁸F]FDG- PET Images (F, G, H) und in den Autoradiographien (J, K). Die mittleren ICMR_G,_C

Werte waren 54.98 ± 15.53 [μmol/100 g ^■ min] für das Gesamtgehirn und er- niedrigt in hetero- und homozygoten transgenen Ratten (siehe Legende Abb. 6).

Homozygote transgene Ratten zeigen signifikant (p < 0.05) erniedrigte ICMR_G|U Werte in Vergleich zu den Wildtypkontrollen, sowohl in [¹⁸F]FDG-PET (34.54 ± 18.52 vs. 54.98 ± 15.53) als auch in den ex vivo Autoradiographien (43.54 + 6.77 vs. 63.02 + 8.24). Diese Untersuchungen zeigen mittels der neuroradiologischen Methode des PET, dass die HDtg Ratten im Vergleich zur humanen HD vergleichbare Störungen in der Glukoseutilisation aufweisen. Der Ansatz belegt weiterhin, dass es in den HDtg Ratten möglich ist, über wiederholte PET- Analysen Verlaufsstudien durchzuführen, welche bisher in der Maus nicht möglich sind. Diskussion der neuropathologischen Untersuchungen und des Neuroimaging (Beispiel 2)

Obwohl die Maus nach wie vor die bevorzugte Spezies für genetische Manipulationen darstellt, gibt eine Reihe von Fragestellungen, die in der Ratte besser durchzuführen wären. Es sind dies unter anderem neuroradiologische Methoden wie MRT und PET, da sie auf Grund der Speziesgröße bisher nur in Ratten oder größeren Spezies durchführbar sind und da sie wiederholte Bestimmungen und damit Verlaufsstudien ermöglichen.

Das hier vorgestellte transgene Rattenmodel der HDtg Ratte zeigt auf neuropa- thologischer Ebene nukleare Enschlußkörperchen und Neurophilaggregate besonders im Striatum vergleichbar mit HD Mausmodellen (Wheeler et al., 2000; Li et al., 2000). Neurochemisch zeigen sich reduziert Tryptophanspiegel ganz ähnlich wie bei HD Patienten (Stone, 2001 ). Außerdem zeigt sich besonders ein fast vollständiger Verlust an Xantinsäure im Striatum und im Kortex von homozygoten HDtg Ratten. Hingegen finden sich noch Xantinsäurespiegel in den weniger deutlich betroffenen heterozygoten HDtg Ratten. Diese Befunde deuten auf den Verlust eines wichtigen neuroprotektiven Mediators in den homozygoten HDtg Ratten hin (Stone, 2001 ) und belegen möglicherweise einen protekti- ven Kompensationsmechanismus in den heterozygoten HDtg Ratten gegenüber excitotoxischen Metaboliten aus einem überaktiven Indolamin (2,3)- Dioxygenase Metabiismus (Widner et al., 1999). Normale DOPAC-Spiegel und reduzierte Xanturinsäurespiegel stehen möglicherweise kausal mit einer erhöhten Bildung von Quinolinsäure im Zusammenhang, welche neuroexitatorische und neurotoxische Eigenschaften aufweist. Gemeinsam mögen sowohl eine erhöhte Produktion von Quinolinsäure (Bruyn et al., 1990) und eine reduzierte Produktion neuroprotektiver Metabolite aus Tryptophan (Stone, 2001 ) zur Pa- thogenese der HD beitragen. Der herausragende Vorteil der vorliegenden Erfindung ist jedoch ihre Anwendbarkeit für in vivo neuroradiologische Methoden, welche nicht in der Maus anwendbar sind. Die MRT Aufnahmen zeigen ganz vergleichbar mit der humane adulten Form der HD vergrößerte laterale Ventrikel, die auf eine Schrumpfung des Striatums zurückzuführen sind. Außerdem finden sich hier im Striatum fo- kale Läsionen, die als Gliose interpretiert werden könnten. Weiterhin zeigt sich ein signifikant erniedrigter Glukosemetabolismus. In späten Stadien der humanen HD zeigen klinische Studien übereinstimmend einen reduzierten ICMR_G,_C im Striatum (Kuwert et al., 1990; Young et al., 1986). Damit belegt dieses Beispiel, dass es sich bei der vorliegenden Erfindung um ein transgenes Rattenmo- dell handelt, welches eng die humane Neuropathologie widerspiegelt, und welches sich in bisher einmaliger Weise für ein in vivo Monitoring von Neuroradio- pathologie, Gehirnstoffwechsel und andere in vivo Parameter wie Rezeptordichte- und Enzymaktivitätsmessungen eignet. Es sei abschließend noch einmal darauf hingewiesen, dass es in dem vorliegenden Tiermodell im Gegensatze zur R6/2 Maus zu keinem Diabetes mellitus kommt. Beispiel 3

Einleitung: Charakterisierung typischer Verhaltensveränderungen in HDtg Ratten Im vorhergehenden Beispielen haben wir die Generierung von HDtg Ratten und die Expression des transgenen Huntingtins im Gehirn zweier transgener Ratten- linien (Beispiel 1 ) und die Identifikation von typischen für die HD pathognomo- nischen Veränderung im Gehirn der Linie 2762 beschrieben. Außerdem konnte die Eignung der Erfindung, bzw. des Modell für Neuroradiologische Methoden wie MRT und PET belegt werden. In dem nun folgenden Beispiel 3 wird die weitere Charakterisierung des Phänotyps als auch die Verhaltenscharakterisierung der HDtg Ratten der Linie 2762 im Detail beschrieben. Dies umfasst (1 ) das Monitoring von Wachstum, Reflexen und Letalität, (2) die Beschreibung von emotionalen Veränderungen, (3) von kognitiven Unterschieden und (4) von Motorfunktionsdefiziten. Generell erfolgte die Charakterisierung der HDtg Ratten nach Grundsätze für die Charakterisierung von Mäusen mit unbekannten Phänotyp (Crawley et al., 1998) mit spezifischer Anpassung für die speziellen Bedürf- nisse für die Testung von Ratten.

Methodik Verhaltensphänotypisierung (Beispiel 3)

Entwicklung, Körpergewichtsentwicklung und Letalität

Die Tiere wurden regelmäßig auf ihren generellen Gesundheitsstatus untersucht.

Die umfasste alle auch bei Crawley (1998) genannten Tests für neurologische Reflexe und Sinneswahrnehmung. Das Monitoring der Körpergewichtsentwicklung von Wildtyp-Kontrollratten (-/-; n = 10) vor dem Sprague Dawley Hintergrund im Vergleich zu heterozygoten ( +/-; n = 15) und homozygoten ( + / + ; n - 15) Huntington ' s Disease (HD) transgenen (tg) Ratten über den Zeitraum von zwei Jahren (Ende der Untersuchung) wurde durch wöchentliches Wiegen der Tiere erreicht. Das Versterbensalter wurde protokolliert und anschließend mittels Kaplan-Meier-Statistik analysiert.

Elevated Plus Maze Test (Angehobenes Kreuzlabyrinth zur Testung von Angst in Nagern) Das Elevated Plus Maze (EPM) ist eines der am weitesten verbreiteten Paradig- men zur Messung von Angstverhalten. Dabei ist es von Vorteil, dass es eine einfache Prozedur ist, die leicht durchzuführen ist und eine hohe Retest- Reliabilität für zwei Testdurchgänge aufweist (Pellow et al., 1985). Das EPM besteht aus zwei offenen und zwei an den Seiten durch Begrenzungswände geschlossenen Armen, die in Form eines „ + " angeordnet sind. Es konnte ge- zeigt werden, dass Ratten dazu tendieren, sich in den geschlossenen Armen aufzuhalten. Sowohl die Zahl der Eintritte als auch die Aufenthaltszeit ist für die geschlossenen Arme größer als für die offenen. Wird ein Tier in das EPM gesetzt (typischerweise in den Kreuzungspunkten der vier Arme), so orientiert es sich tendenziell eher zu einem der geschlossenen Arme. Diese natürliche Ten- denz kann durch die Gabe von Anxiolytika (z.B. Diazepam) abgeschwächt wer- den, so dass eine Erhöhung der Zahl der Eintritte und der Aufenthaltszeit in den offenen Armen zu beobachten ist.

Das EPM besteht aus insgesamt vier Armen (50x1 Ocm), wobei zwei gegenüberliegende Arme von Seitenwänden (40cm hoch) umschlossen werden. Es wurde ein mit Lichtschranken versehenes computergestütztes Gerät der Firma TSE-System (Bad Homburg) verwendet. Die Arme befinden sich 50cm über dem Boden. Die Beleuchtungsstärke lag bei 0.3 Lux unter Rotlichtbedingungen und die Tests wurden im Dunkelzyklus der Tiere durchgeführt. Das Verhalten der Tiere wurde für 5min aufgezeichnet. Nach jedem Testdurchgang wird das EPM mit 70%igem Alkohol gereinigt. Untersuchungsparameter sind: Zahl der Eintritte, Aufenthaltsdauern in den Armen und im Zentrum. Details des Tests wurde bereits detailliert beschrieben (Breivik et al., 2001 ). Die prozentuale Aufenthaltsdauer und Anzahl der Eintritte in die offenen Arme des EPM ist ein gut validierter Parameter für Ängstlichkeit in Nagern. Altersgematched männlichen Wildtyp-Kontrollratten (-/-; n = 10) vor dem Sprague Dawley Hintergrund wurden mit heterozygoten ( + /-; n = 15) und homozygoten ( + / + ; n = 15) HDtg Ratten im Alter von zwei Monaten getestet. Vermehrte und verlängerte Besuche auf den offenen Armen belegen einen anxiolyseartigen Effekt. Aktive Soziale Interaktion in neuer Umgebung (Social interaction test of anxie- ty)

Der soziale Interaktionstest nach File (1980) ist ein Test für Ängstlichkeit, der nicht auf irgendein Deprivationsmodell oder starke aversive Reize zurückgreifen muss. Es wird hier auf negative Verstärkung wie z.B. Stromschläge verzichtet. Die Unsicherheit der Tiere wird durch die Plazierung in eine neue Umgebung erreicht (und durch Manipulation der Lichtverhältnisse). Die Zeit, die die Ratten in aktiver sozialer Interaktion verbringen ist maximal, wenn die Ratten in eine gewohnte Umgebung gesetzt werden, die nur schwach ausgeleuchtet wird. Die Abnahme der Sl-Zeit ist aber korreliert mit einer Zunahme anderer Verhaltensweisen, die auf gesteigerte Emotionalität hinweisen w.z.B. Defäkation, „Free- zing". Soziale Interaktionszeit ist somit korreliert mit Emotionalität, nicht aber mit Exploration. Die Testarena bestand aus einem offenem Feld (Openfield) mit 50x50cm, das sich in einer Soundisolationsbox befindet. Bei der Beleuchtung handelt es sich um eine Weißlichtquelle (60watt) - die Helligkeit im Openfield liegt zwischen 175-190lux. Das Verhalten der Tiere wird online aufgenommen - dafür wird eine Videokamera verwendet, die innerhalb der Isolationsbox über dem Openfield angebracht ist. Online werden die betretenen Felder und die Sl-Zeit aufgenommen - die Frequenzen der einzelnen Verhaltensweisen werden danach anhand der Videoaufzeichnungen analysiert. Die Tiere werden direkt nacheinander in die Mitte des Openfield gesetzt und 10sek später beginnt die Datenaufnah- me. Folgende Parameter werden aufgenommen: Zeitdauer des Beriechens, Fol- gens, Unter- und Überkriechen, nicht aber passiver Körperkontakt zwischen den Tieren (wie Ruhen/Schlafen) ohne aktive soziale Interaktion. Die Methodik ist vor kurzem detailliert beschrieben und im unserem Labor validiert worden (Kask et al., 2001 ). Männlichen Wildtyp-Kontrollratten (-/-; n - 1 1 ) wurden mit he- terozygoten ( + /-; n = 13) und homozygoten ( + / + ; n = 1 1 ) HDtg Ratten im Alter von zehn Monaten verglichen. Die Zeitdauer, welche die Tiere in aktiver sozialer Interaktion in neuer Umgebung mit einer Partnertestratte des gleichen Genotyps verbringen wurde als ein Indikator für Ängstlichkeit bei Nagern gewertet. Der statistischen Analyse mittels einfaktorieller Varianzanalyse (ANOVA; Faktor: Genotyp) liegen Summen der Zeiten in aktiven sozialen Interaktion beider Testtiere zu Grunde. Verlängerte aktive soziale Interaktion gilt als Indikator für einen anxiolyseartigen Effekt.

Lochbretttest auf Explorationsverhalten (Holeboard test of exploration) Der Holeboard Test untersucht sowohl die „gerichtete" Exploration als auch bewegungsabhängige Verhaltensparameter (File und Wardill, 1975). Den Kopf durch ein Loch im Boden zu stecken (head dipping) ist ein spontan hervorgerufenes Verhalten der Ratte, dessen Häufigkeit das Ausmaß der Neugier repräsentiert ("inquisitive exploration"; Robbins und Iversen, 1973). Der Holeboard Apparat besteht aus hölzernen Boxen (65x65x40 cm) mit 16 Löchern im Boden, die im gleichen Abstand zueinander angebracht worden sind. Jedes Loch hat einen Durchmesser von 3cm. Unter diesen Löchern befinden sich mit einem Computer in Verbindung stehende Lichtschranken. Jedes Hindurchstrecken des Kopfes durch ein Loch (Head dipps) wird automatisch erfasst. In der horizontalen Ebene werden von Lichtschranken in den Wänden insgesamt 25 Quadrate von 13x13cm umschlossen, um so auch gerichtete Aktivität in der Ebene zu erfassen. In den vorliegenden Studien wurden Ratten in einen schallisolierten Testraum transportiert. Die Anzahl der „Head Dipps" wurde aufgezeichnet und als gerichtete Aktivität in der senkrechten Vertikalen interpretiert. Die Bewegungsaktivität wurde ebenfalls ermittelt. Männlichen Wildtyp-Kontrollratten (-/-; n = 10) wurden mit altersangepassten heterozygoten ( + /-; n = 15) und ho- mozygoten (---/ + ; n = 10) HDtg Ratten im Alter von drei Monaten verglichen. Der Anzahl des Kopfbewegungen in die Löcher im Boden des Testapparats (vertikale Aktivität) hinein dient als ein Maß für das Explorationsverhalten (Neugier) der Tiere, während die Zahl der Lichtschrankenunterbrechungen in horizontaler Ebene die generelle körperliche Aktivität widerspiegelt Der Test wurde ohne vorherige Habituation während der Dunkelphase durchgeführt. Die Methodik ist im Detail vor Kurzem beschrieben worden (Breivik et al., 2001 ). Die Testdaten wurden erst in Excel-Tabellen und dann auf ein Statistikprogramm übertragen (Stat View 5.0) und mittels ANOVA für wiederholte Messungen mit dem Faktor „Genotyp" auf einem Macintosh G3 Computer ausgewertet. Dieser Datenaufbe- reitung folgte eine Analysen mittels einfaktorieller ANOVA mit Fischers PLSD post-hoc-Test, sofern sinnvoll. Spatielles Lernen im 8-Armlabyrinth (Radialmaze)

Im radialen 8-Armlabyrinth wird das zuvor futterdeprivierte Testtier in definierten Gängen des Labyrinths mit Nahrung belohnt. Die Aufgabe der Tiere besteht darin zu behalten, welche Arme des Maze im letzten Durchgang belohnt wurden und welche Arme das Tier im laufenden Durchgang schon exploriert hat. Die Ratte muss dafür die räumlichen Relationen zwischen den Armen des Labyrinths und den Hinweisreizen aus der räumlichen Umgebung erlernen. Das Radialmaze der Firma TSE-Systems besteht aus einer achteckigen Grundplatte, auf die acht Arme sternförmig aufgesetzt werden (550/425x150/145x225mm - LxBxH). Die Armwände bestehen aus undurchsichtigem, grauen PVC. An den Stirnwänden der Arme befindet sich in einer Schale je eine Futtermulde, in die das Futter eingebracht wird. In der Schale befindet sich ein Sensor, mit dem die Futterentnahme detektiert wird. An jedem Arm befindet sich ca. 10cm hinter dem Armeingang eine spezielle Lichtschrankenanordnung (drei in Bodennähe und die vierte Lichtschranke mittig oberhalb der drei anderen). An diesen Stellen sind die Armseitenwände unterbrochen. Mit Hilfe der Lichtschranken kann erkannt werden, ob sich das Tier in einem Arm oder in der Mitte befindet. Die Datenaufnahme erfolgt mit Hilfe einer Steuereinheit von TSE-Systems GmbH Bad Homburg, die die Daten direkt auf einen Computer mit entsprechender Software weiterleitet. Altersangepaßte männlichen Wildtyp-Kontrollratten (-/-; n = 9) wurden mit heterozygoten ( +/-; n = 14) und homozygoten ( + / + ; n = 10) HDtg Ratten im Alter von zehn Monaten verglichen. Ein „Allozentrisches Reversal" Design nach Hölscher und Schmidt (1998) wurde abgetestet. Nach Habituations- und Explorationstests (Daten nicht gezeigt) wurden zunächst vier zufällig ausgewählte Arme des Achtarm-Radialmaze mit Futterpellets belohnt. Diese belohnten Arme wurden während der ersten fünf Tage nicht gewechselt. Am sechsten Testtag wurden andere Arme mit Futter belohnt. Die Startarme wurden zufällig aus den unbelohnten Armen ausgewählt. Die Orientierung im Maze verlief für die Ratten „allozentrisch", also über sichtbare Reize außerhalb des Maze (Wände, Regale, Tür, etc.). „Egozentrische" Information (z.B. eine

Strategie wie „immer jeder zweite Arm rechts herum") konnte durch die Tiere nicht angewendet werden, da die Startarme zufällig gewählt wurden. Die Tiere wurden vier mal an einem Tag getestet. Die Anzahl der mehrfachen Besuche in bereits zuvor besuchten Arme innerhalb eines Tests (Working memory errors) und die Anzahl der Besuche in unbelohnte Arme (Reference memory errors) wurden erhoben und Mittelwerte pro Testtag aus vier Läufen berechnet. Eine Varianzanalyse für wiederholte Messungen über den Faktors „Genotyp" und der wiederholten Messung des jeweiligen Parameters wurde durchgeführt. Bei signifikanten Interaktionen zwischen den Faktoren schloss sich eine einfaktorielle Varianzanalyse getrennt nach Testtagen über den Faktor „Genotyp" an, auf die im Falle von signifikanten Gesamteffektinteraktionen eine Posthoc-Analyse (Fis- hers PLSD) folgte.

Assoziatives Lernen in „Zwei-Wege-Aktive-Vermeidung-Transfer-Kammern" (Two way active avoidance Shuttle box test of associative learning) Shuttlebox-Lernen mit aktiver Vermeidung eines aversiven Stimulus ist ein typischer gut etablierter und validierter Test für assoziatives Lernvermögen in Ratten. Ein TSE Shuttle box System (Technical & Scientific Equipment GmbH, Bad Homburg, Germany) wurde verwendet, welches aktive und passive Vermeidungslernexperimente in Ratten ermöglicht. Es besteht aus zwei über ein Tür miteinander verbundenen und mit Lichtschranken versehenen Kammern, einer Kontrolleinheit und Computer mit Steuer- und Akquisitionssoftware. Ein elektrischer Stromschlag, der unkonditionierte Stimulus, wird über ein Metallgitter am Boden der Boxen appliziert. Der Konditionierte Stimulus kann entweder ein einzelner (Ton oder Licht) oder ein verbundener Stimulus (Ton mit Licht) sein. Die Tests wurden in männlichen Wildtyp-Kontrollratten (-/-; n = 9), heterozygoten ( +/-; n - 13) als auch homozygoten ( +/ + ; n = 10) HDtg Ratten im Alter von 9 Monaten durchgeführt. Assoziative Lernfähigkeit im Rahmen eines Konditio- nierungsprozesses wurde abgetestet. Während mehrfacher Durchläufe an aufeinander folgenden Tagen lernen die Tiere einen angekündigten (Licht oder Ton) aversiven Stimulus (Stromschlag) durch eigene Aktivitätsleistung (Transferbewegung in ein anderes Kompartiment) zu vermeiden. Der Test ist im Gegensatz zum Radial Maze durch ein hohes Stressniveau charakterisiert. Die Anzahl korrekter Vermeidungsreaktionen, die „active avoidance" (Transfer in das „sichere" Kompartiment nach dem Signalstimulus und vor dem aversiven Stimulus) wur- den erhoben. Die Daten wurden mittels Varianzanalyse für wiederholte Messungen über den Faktor der wiederholten Messung „Avoidance" und dem Faktor „Genotyp" analysiert. Dieser Analyse schlössen sich einfaktorielle Varianzanalysen mit anschließender Posthoc-Analyse getrennt nach Testtagen an. Alle Datenpunkte repräsentieren Mittelwerte ± Standardfehler. Motorfunktionstestung auf dem beschleunigten Drehbalken (Accelerodtest) Der Rotarodtest und seine Unterform, der Accelerodtest, sind die am häufigsten genutzten Tests, um bei Nagetieren die neuromotorischen Fähigkeiten und die Balance zu überprüfen. Die für die vorliegenden Untersuchungen genutzte Apparatur des Drehbalken stammt von TSE-Systems (Bad Homburg). Die Rolle hat einen Durchmesser von 7cm und ist insgesamt 50cm lang, wobei sie durch 5 Scheiben in 4 Abschnitte unterteilt wird. Jeder Abschnitt ist 12,5cm breit (Maße für Ratten). Somit können die Ratten in einem Testdurchlauf zu viert gleichzeitig getestet werden. Damit die Ratten nicht einfach von der Rolle springen, befindet sich die Rolle 26cm über dem Boden. Je höher die Rolle vom Boden entfernt ist, desto größer ist auch die Motivation der Tiere, sich auf der Rolle zu halten. Wird die Apparatur im Accelerodmodus verwendet, bedeutet dies, dass die Geschwindigkeit, die Umdrehungszahl der Rolle, sich automatisch kontinuierlich bis zu einem individuell einstellbaren Maximum erhöht (von z.B. 4rpm/min in 4er-Schritten auf letztlich 40rpm/min innerhalb von 5min.). Wird die Umdrehungsgeschwindigkeit konstant gehalten und dann stufenweise erhöht, so verwendet man den Rotarodmodus. Die Untersuchung zur motorischen Leistungsfähigkeit der Tiere ist in eine Trainings- und zwei Testphasen aufgeteilt. Versuchsparameter sind Latenz bis zum Herunterfallen in Sekunden, und maximal erreichte Umdrehungsgeschwindigkeit in Umdrehungen pro Minute (rpm). In der Trainingsphase werden die Tiere fünf Tage lang jeweils zweimal am Tag für 2min auf das Rotarod bei einer Umdrehungsgeschwindigkeit von 20rpm gesetzt. Wenn die Tiere während der Trainingsphase herunterfallen, werden sie nach 10sek. wieder auf die Apparatur gesetzt. Es finden zwei Durchläufe im Abstand von 1 h. Pro Durchlauf werden die Testtiere maximal fünfmal auf die Rolle aufgesetzt; nach jedem Trainingsdurchgang werden die Walzen gereinigt. Während der Accelerodtestphase werden die Tiere bei niedrigster Umdrehungszahl auf die Apparatur gesetzt (4rpm); die Apparatur ist auf Accelerod geschaltet und beschleunigt so innerhalb von 4.5min auf die höchste Umdrehungsgeschwindigkeit (40rpm), wobei der Durchlauf maximal 5min dau- ert (danach werden die Tiere von der Rolle heruntergenommen). Es wird festgehalten, wann und bei welcher Stufe die Tiere herunterfallen; es finden an drei aufeinander folgenden Tagen je drei Durchläufe statt - im Abstand von 2h. Es wurden männlichen Wildtyp-Kontrollratten (-/-; n = 8) mit heterozygoten ( +/-; n = 10) und homozygoten ( + / + ; n - 9) Huntington 's Disease (HD) transgenen (tg) Ratten im Alter von fünf, zehn und fünfzehn Monaten verglichen. Die Ergebnisse pro Testtag werden gemittelt und die Ergebnisse über drei aufeinander folgenden werden dann einer Varianzanalyse für wiederholte Messungen unterzogen und anschließend ggf. über einfaktorielle ANOVA mit posthoc Test die Zwischengruppenunterschiede bestimmt. Motorfunktionstestung im Balkentest (Beam walk test) In diesem häufig verwendeten Test für Motorfunktionsleistung müssen Nager über einen Balken unterschiedlichen Durchmessers, Beschaffendheit und Länge von einem Kompartiment in ein anderes gelangen. In der vorliegenden Untersuchung bestand der Balken aus einen runden Holzstab ohne Lackierung von 16mm Durchmesser und 125 cm Länge, der horizontal 60 cm über dem Boden zwei Kompartimente miteinander verbindet. Das Startkompartiment war eine weiße hell erleuchtete Box und das Zielkompartiment eine schwarze abgedunkelte Nach einer Trainingsphase von drei Tagen wurde an zwei weiteren aufeinander folgenden Tagen die Fähigkeit getestet, sich auf diesem dünnen Balken fortzubewegen und ggf. festzuhalten. Altersangepaßte männlichen Wildtyp- Kontrollratten (-/-; n = 10) wurden mit heterozygoten ( + /-; n = 14) und homozygoten ( + / + ; n = 10) HDtg Ratten im Alter von fünf Monaten verglichen. Die Überquerungszeitdauer in Sekunden und die Häufigkeit des Herunterfallens wurden erfasst. Eine Varianzanalyse für wiederholte Messungen schloss sich an. Ergebnisse der Verhaltensphänotypisierung (Beispiel 3) Entwicklung, Körpergewichtsentwicklung und Letalität:

Bei Geburt sind die HDtg Ratten nicht von ihren Wildtyp Geschwistern zu unterscheiden. Nachkommen beider Geschlechter sind fruchtbar und es fand sich kein Hinweis auf eine Atrophie der Sexualorgane. Blutglukosespiegel lagen zu allen Messzeitpunkten im physiologischen alterabhängigen Normalbereich. Während der ersten drei Lebensmonate sind die transgenen Tiere ca. 5% leichter als ihre Wildtypgeschwister. HDtg Ratten zeigen gelegentlich opisthotonusartige Kopfbewegungen und von insgesamt 280 bisher untersuchten Ratten zeigten 6 Tiere Drehverhalten, welches im Alter von ca. 1 Jahr wieder verschwant. Zu keinem Zeitpunkt waren Ruhetremor, Ataxie, Zusammenschlagen der Beine (engl.: „Clasping"), ungewöhnliche Lautäußerungen, Dyskinesien oder Krampfanfälle zu beobachten.

Die Körpergewichtsentwicklung von Wildtypkontrollratten im Vergleich zu he- tero- und homozygoten HDtg Ratten ist in Abb. 7 verdeutlicht. Die Varianzanalyse, für wiederholte Messungen zeigt einen signifikanten Effekt des Faktors „Genotyp" mit F(3, 32): 12.4, p = 0.0004, einen signifikanten Effekt der Faktors für wiederholte Messung von Körpergewicht F(2, 63): 882, p <0.0001 und eine signifikante Interaktion der Faktoren (Genotyp x Körpergewicht) mit F(2, 126): 3.6, p < 0.0001 . Die signifikante Interaktion in der ANOVA kommt durch die zunehmende Verlangsamung der Körpergewichtszunahme in den HDtg Rat- ten über den Messzeitraum zustande. Die HDtg Ratten sind im Alter von 6 Monaten 5% leichter und wiegen im Alter von 24 Monaten 20% weniger als die Kontrolltiere. Abbildung 8 zeigt die kumulative Überlebensrate von Wildtyp- Kontrollratten (-/-; n = 10) vor dem Sprague Dawley Hintergrund im Vergleich zu heterozygoten ( + /-; n = 15) und homozygoten ( +/ + ; n = 15) Hunting- ton 's Disease (HD) transgenen (tg) Ratten über den Zeitraum von zwei Jahren (Ende der Untersuchung) mit monatlichen Aufnahmezeitpunkten. Der „Log-Rank (MantelCox) Test" für „Event time in months" aus der Kaplan-Meier Analyse ergibt bei einem Chiquadrat von 6.2 bei einem Freiheitsgrad von 2 einen signifikanten Gruppenunterschied mit p = 0.04. Die Ursache für Kachexie und Tod sind bisher noch unklar, es zeigen sich jedoch vermehrt Tumore unterschiedlicher Lokalisation in den transgenen Ratten. Elevated Plus Maze (EPM)

Die Verhaltensveränderungen im EPM sind in Abbildung 9 dargestellt. HDtg Ratten ( + /-, gestrichelte Säulen und +/ + , schwarze Säulen) verbringen signifikant (**p < 0.001 ; ***p < 0.0001 ) mehr Zeit auf den offenen Armen. Auch die Zahl der Eintritte in die offenen Arme (*p <0.01 ; **p < 0.001 ) ist erhöht. Kein Unterschied zeigte sich in der Aktivität der Tiere. Social interaction test of anxiety:

Abbildung 10 zeigt die Verhaltensveränderungen im „Social interaction test of anxiety". Die Daten repräsentieren den Mittelwert ( ± Standardfehler) aus den Summen der Zeiten in aktiven sozialen Interaktion beider Testtiere. Verlängerte aktive soziale Interaktion gilt als Indikator für einen anxiolyseartigen Effekt. Die Varianzanalyse zeigt signifikante Effekte für den Faktor „Genotyp" mit F(2, 32): 12.4, p = 0.0001 . Die HDtg Ratten ( + /-, gestrichelte Säulen und +/ + , schwar- ze Säulen) verbringen signifikant (**p = 0.0004; ***p < 0.0001 ) mehr Zeit in aktiver sozialer Interaktion. Holeboard Test auf Exploration

Abbildung 1 1 zeigt die Verhaltensveränderungen im „Holeboard test of explora- tory behavior". Die Varianzanalyse zeigt signifikante Effekte für den Faktor „Genotyp" mit F(2, 32): 4.3, p = 0.023 für Exploration bzw. Neugier. Die homozygoten HDtg Ratten ( +/ + , schwarze Säulen) untersuchen die Löcher im Boden des Testapparats (Abb. 1 1 A) signifikant seltener (*p = 0.006) bei unveränderter motorischer Aktivität gegenüber den Wildtypkontrollen (Abb. 1 1 B). Spatiales Lernen im 8-Armlabyrinth Die Ergebnisse für spatielles Lernen im „Radial maze test of spatial learning and memory" sind in Abbildung 12 dargestellt. Die Varianzanalyse für wiederholte Messungen zeigt signifikante Effekte in beiden Analysen für den Faktor „Genotyp" mit F(3, 30): 7.7, p = 0.002 für „Working memory errors" (Abb. 12A) und mit F(3, 30): 14.5, p < 0.0001 für „Reference memory errors" (Abb. 12B), als auch jeweils signifikante Effekte für die Faktoren der wiederholten Messung, was den Lemprozess belegt. Posthoc-Analysen zeigen signifikant erhöhte Fehlerzahlen in den transgenen Ratten beider Genotypen mit jeweils p < 0.001. Alle Datenpunkte repräsentieren Mittelwerte ± Standardfehler. Assoziatives Lernen in „Zwei-Wege-Aktive-Vermeidung-Transfer-Kammern" Die Ergebnisse der Tests in Shuttleboxen auf assoziatives Lernen sind in Abbildung 13 zusammengefasst. Während mehrfacher Durchläufe an aufeinander folgenden Tagen lernen die Tiere einen angekündigten (Licht oder Ton) aversiven Stimulus (Stromschlag) durch eigene Aktivitätsleistung (Transferbewegung in ein anderes Kompartiment) zu vermeiden. Die Anzahl korrekter Vermeidungsreaktionen, die „active avoidance" (Transfer in das „sichere" Kompartiment nach dem Signalstimulus und vor dem aversiven Stimulus) sind dargestellt. Die Varianzanalyse für wiederholte Messungen zeigt signifikante Effekte für den Faktor der wiederholten Messung „Avoidance" mit F(3, 30): 7.7, p = 0.002 und eine signifikante Interaktion zwischen Genotyp und Avoidance mit F(3, 30): 14.5, p < 0.0001 was einen differentiellen Lernprozess zwischen den einzelnen Genotypen über die wiederholten Tests belegt. Einfaktorielle Varianzanalysen mit anschließender Posthoc-Analyse zeigen signifikant erhöhte Vermeidungsreaktionen in den transgenen Ratten beider Genotypen mit jeweils p < 0.01 ab dem sechsten Testtag. Motorfunktionstestung im Accelerodtest Die Ergebnisse aus den wiederholten Accelerodtests sind in Abbildung 14 verdeutlicht. Nach einer Trainingsphase von fünf Tagen wurde die Fähigkeit, sich auf einen konstant von 4 bis 40 Drehungen pro Minute beschleunigendem Drehbalken zu halten, in drei Tests pro Tag an drei aufeinander folgenden Tagen getestet. Die Zeitdauer in Sekunden bis zum Herunterfallen und die maximal erreichte Drehgeschwindigkeit des Drehbalken in „rounds per minute" (rpm [n max]) wurden jeweils in 5, 10 und 15 Monate alten HDtg Ratten erfasst. Die Varianzanalyse für wiederholte Messungen zeigt für die Tests im Alter von 5 Monaten keinen signifikanten Effekt des Faktor „Genotyp" (Abb. 14A). Im Alter von 10 Monaten (Abb. 14B) zeigen sich signifikante Effekte für den Faktor „Genotyp" in der Zeitdauer auf dem Drehbalken mit F(2, 24): 4.6, p = 0.02 und der maximal erreichten Drehgeschwindigkeit mit F(2, 24): 4.2, p = 0.03. Im Alter von 15 Monaten (Abb. 14C) zeigen sich signifikante Effekte für den Faktor „Genotyp" in der Zeitdauer auf dem Drehbalken mit F(2, 24): 6.6, p = 0.005 und der maximal erreichten Drehgeschwindigkeit mit F(2, 24): 7.0, p = 0.004, was eine progrediente Verschlechterung der Motorfunktionsleistung der HDtg belegt. Motorfunktionstestung im Balkentest (Beam walk test)

Die Motorfunktionsleistung im Beam walk Test sind in Abbildung 15 dargestellt. Die Varianzanalyse für wiederholte Messungen zeigt für die Tests auf einen runden Balken von 16 mm Durchmesser einen signifikanten Effekt des Faktors „Genotyp" in der Überquerungszeitdauer mit F(2, 31 ): 8.1 , p = 0.0015 und der Absturzhäufigkeit mit F(2, 31 ): 5.4, p = 0.0096. Posthoc-Analysen mittels des PLSD-Tests zeigten, dass der statische overall-Effekt in diesem Motorfunktionstest auf einer signifikanten (p< 0.0001 ) Verschlechterung in den homozygoten HDtg beruht. Diskussion der Verhaltensphänotypisierung (Beispiel 3)

In der vorliegenden Erfindung beschreiben wir das erste transgene Rattenmodel für die humane HD, welches sehr eng die häufige Spätform humane Erkrankung widerspiegelt. HDtg Ratten zeigen einen langsam progredienten Phänotyp mit emotionalen Veränderungen, kognitiven Störungen und Motorfunktionschwä- ehe.

HDtg Ratten sind bis auf gelegentlich dyskinetische Bewegungen des Kopfes zunächst im Phänotyp nicht von ihren Geschwistertieren zu unterscheiden. Dieses Körpergewichtsmonitoring belegt den differentiellen Effekt des Transgens auf die Wachstumsrate und eine langsame Progredienz der Erkrankung, die mit zunehmenden Körpergewichtsverlust einhergeht. Zusätzlich belegt die Kaplan- Meier-Analyse den Effekt des Transgens auf die Überlebensrate der HDtg Ratten in Form von ansteigender Letalität ab einem Alter von 18 Monaten. Diese Befunden sind in Übereinstimmung mit der humanen HD, denn auch die humane Erkrankung geht mit Kachexie und erhöhter Letalität einher. Eine der frühesten Verhaltensauffälligkeiten ist eine dramatisch reduzierte Angst der HDtg Ratten im Elevated plus maze test of anxiety. Dieser Verhaltenstest belegt den differentiellen Effekt des Transgens auf den emotionalen Parameter „Ängstlichkeit" in HDtg Ratten und ist daher vergleichbar mit Befunden in R6/2 Mäusen (File et al., 1998) und den frühen emotionalen Auffälligkeiten in HD Patienten. Der Befund im Plus maze wird gestützt durch gleichgerichtete Effekte im Social interaction test of anxiety. Diese Untersuchung belegt den Effekt des Transgens auf den emotionalen Parameter „Ängstlichkeit" in einem weiteren Verhaltenstest, der sich im Unterschied zum „Elevated plus maze test of anxiety" auch für wiederholte Untersuchungen als Verlaufkontrolle für die emotionalen Parameter eignet. Interessanterweise geht die reduzierte Angst in den HDtg Ratten nicht erhöhter Exploration einher, wie der Holeboard test of Exploration zeigt. Der Holeboard Test auf Explorationsverhalten belegt den differentiellen Effekt des Transgens in HDtg Ratten auf den emotional/kognitiven Parameter „Exploration". Die Ergebnisse sind also insgesamt vergleichbar mit den frühen emotionalen Auffälligkeiten in HD Patienten und könnte als „pathologi- sehe Angstlosigkeit" umschrieben werden.

Kognitive Einschränkungen in den HDtg Ratten zeigten sich zunächst im Alter von 10 Monaten beim Test auf spatiales Lernen im 8-Armlabyrinth. Die Ergebnisse belegen eine „Working memory amnesia" (Arbeitsgedächtnisschwäche), was dann auch die Ausbildung eines „Reference memory" (Langzeitgedächtnis) unterbindet. Dieser Verhaltenstest belegt den , Effekt des Transgens in HDtg Ratten auf den kognitiven Parameter „Spatiales Lemen"und ist daher vergleichbar mit Befunden in R6/2 Mäusen und den kognitiven Auffälligkeiten in HD Patienten. Interessanterweise zeigte sich in Assoziativen Lerntests, dem „Zwei- Wege-Aktive-Vermeidung-Transfer-Kammern", welche unter hohen Stress ab- laufen, dass die transgenen Ratten unter Stress eine einfache assoziative Lernaufgabe besser bewältigen, was häufig bei funktionellen Beeinträchtigungen des Hippocampus beobachtet wird (Hölscher und Schmidt, 1998). Die Ergebnisse dieses Verhaltenstests könnten wegweisend für ein erweitertes Verständnis der Pathologie der HD sein, da sie auf eine wichtige Rolle stressregula- tiver Systeme hindeuten und eine Verknüpfung der Basalganglien mit dem Hippocampus belegen. Kognitiver Abbau ist häufig bei HD Patienten zu beobachten (Mohr et al., 1991 ). Schon früh in der Erkrankung zeigen die Patienten Einschränkungen in der spatialen Lernfähigkeit (Lawrence et al., 1996; 2000). Vergleichbar finden sich auch bei R6/2 Mäusen Arbeitsgedächtnisstörungen (Murphy et al., 2000) und andere kognitive Defizite (Lione et al., 1999). Motorfunktionsstörungen, welche schließlich der humanen Chorea Huntington zu ihrem Namen verholfen haben, treten sowohl beim Patienten als auch in der vorliegenden Erfindung erst später voll in Erscheinung. Im Alter von fünf Monaten sind die Tiere im Accelerodtest noch symptomlos und nur im Beam walk Test zeigen die homozygoten Tiere Auffälligkeiten, obwohl bereits emotional deutliche Unterschiede bestehen. Die Ergebnisse im Accelerodtest belegen eine progrediente Verschlechterung der Motorfunktionsleistung der HDtg Ratten. Diese progrediente Verschlechterung des Parameters „Gleichgewicht und Motorkoordination" findet sich in einem gut validierten Verhaltenstest, der sich auch für wiederholte Untersuchungen als Verlaufskontrolle eignet. Die Motorfunktionsstörungen in den HDtg Ratten kommen im Vergleich zum Zeitpunkt des Auftretens der emotionalen und/oder kognitiven Veränderungen später zur vollen Ausprägung, was eine weitere Parallele zur humanen HD darstellt. Die differentiellen Motorfunktionsstörungen im Alter von fünf Monaten zwischen den hetero- und homozygoten HDtg Ratten im Beam walk Test belegen, dass der Beginn und möglicherweise auch die Spezifität der Motorfunktionstörungen von der Gendosis abhängig sind, da in diesen Alter zunächst nur die homozygoten Tiere eine Verschlechterung zeigen. Das Ziel der vorliegenden Erfindung war es, ein transgenes Tiermodell für die humane HD zu entwickeln, welches den späten und langsam progredienten

Verlauf der häufigsten humanen Form der HD widerspiegelt, und welches in vivo Verlaufskontrollen durch Neuroimaging ermöglicht, damit zukünftige Therapieformen daran getestet werden können. Unter Verwendung des endogenen Ratten HD Promotors und einer humanen cDNA mit 51 CAG Repeateinheiten ist dies erstmal gelungen. Es erscheint nun möglich, den Verlauf der Erkrankung und neue Therapieerfolge z.B. durch MRT und PET nachzuverfolgen. Somit hat die vorliegende Erfindung das Potential zu einem wichtigen Werkzeug für die Aufklärung des Pathomechanismus und für Testung zukünftiger Therapieansätze unter Verwendung von Langzeitbehandlung, Mikrochirurgie, Stammzelltrans- plantation oder Antisensebehandlung zu werden. Literaturnachweis

Ackermann RF, Lear JL (1989) Glycolysis-induced discordance between gluco- se metabolic rates measured with radiolabeled fluorodeoxyglucose and glucose. J Cereb Blood Flow Metab 9:774-785. Almqvist EW, Bloch M, Brinkman R et al. (1999) A Worldwide Assessment of the Frequency of Suicide, Suicide Attempts, or Psychiatrie Hospitalization after Predictive Testing for Huntington Disease. Am J Hum Genet 64: 1293-1304 Auburger G, Ratzlaff T, Lunkes A et al. (1996) A gene for autosomal dominant paroxysmal choreoathetosis/spasticity (CSE) maps to the vicinity of a potassi- um Channel gene cluster on chromosome 1 p, probably within 2 cM between D1 S443 and D1 S197. Genomics 31 :90-94

Benitez J, Robledo M, Ramos C et al. (1995) Somatic stability in chorionic villi samples and other Huntington fetal tissues. Hum Genet 96(2):229-232 Boriongan CV, Koutouzis TK, Freeman TB et al. (1995) Behavioral pathology induced by repeated systemic injeetions of 3-nitropropionic aeid mimics the mo- toric Symptoms of Huntington's disease. Brain Res 697:254-257. Breivik T, Stephan M, Brabant GE et al. (2002) Postnatal LPS-induced illness predisposes to periodontal disease in adulthood. Brain Behav Immun http://www.idealibrary.com/ servlet/doi/ 10.1006/ brbi.2001 .0642: Brouillet E, Hantraye P, Ferrante RJ et al. (1995) Chronic mitochondrial energy impairment produces selective striatal degeneration and abnormal choreiform movements in primates. Proc Natl Acad Sei U S A 92:7105-7109. Brouillet E (2000) Animal modeis of Huntington's disease: from basic research on neuronal death to assessment of new therapeutic strategies. Funct Neurol 1 5:239-251 .

Brouillet E, Conde F, Beal MF et al. (1999) Replicating Huntington's disease phenotype in experimental animals. Prog Neurobiol 59:427-468. Bruyn RP, Stoof JC (1990) The quinolinic aeid hypothesis in Huntington's chorea. J Neurol Sei 95:29-38. Burke JR, Enghild JJ, Martin ME et al. (1996) Huntingtin and DRPLA proteins interact with the enzyme GAPDH. Nat Med 2:347-350 Carter RJ, Lione LA, Humby T et al. (1999) Characterization of Progressive Motor Deficits in Mice Transgenic for the Human Huntington's Disease Mutation. J Neurosci 19(8):3248-3257

Chen M, Ona VO, Li M et al. (2000) Minocycline inhibits caspase-1 and caspa- se-3 expression and delays mortality in a transgenic mouse model of Huntigton disease. Nat Med 6, 797-801

Crawley JN (1999) Behavioral phenotyping of transgenic and knockout mice: experimental design and evaluation of general health, sensory functions, motor abilities, and specific behavioral tests. Brain Res 835: 18-26. Davies SW, Turmaine M, Cozens BA et al. (1997) Formation of Neuronal Intra- nuclear Inclusions Underlies the Neurological Dysfunction in Mice Transgenic for the HD Mutation. Cell 90:537-548

Dellen A van, Blakemore C, Deacon R, York D, Hannan AJ (2000) Delaying the onset of Huntington's in mice. Nature 404:721 -722 Demirkiran M, Jankovic J (1995) Paroxysmal dyskinesias: clinical features and classification. Ann Neurol 38:571 -579

DiFiglia M, Sapp E, Chase KO et al. (1997) Aggregation of Huntingtin in Neuronal Intranuclear Inclusions and Dystrophie Neuntes in Brain. Science 277: 1990- 1993 Dunnett SB, Carter RJ, Watts C et al. (1998) Striatal transplantation in a transgenic mouse model of Huntington's disease. Exp Neurol 154:31 -40. File SE, Mahal A, Mangiarini L et al. (1998) Striking changes in anxiety in Huntington's disease transgenic mice. Brain Res 805:234-240. Fink J, Rainier S, Wilkowski J et al. (1996) Paroxysmal dystonic choreoatheto- sis: tight linkage to chromosome 2q. Am J Hum Genet 59: 140-145

Goldberg YP, Kremer B, Andrew SE, et al. (1993) Molecular analysis of new mutations for Huntington's disease: intermediate alleles and sex of origin ef- fects. Nat Genet 5: 174-179 Goldberg YP, Nicholson DW, Rasper DM, et al. (1996) Cleavage of huntingtin by apopain, a proapoptotic cysteine protease, is modulated by the polyglutami- ne tract. Nat Genet 13:442-449 Goodenough DJ, Fariello RG, Annis BL, Chun RWM (1978) Familial and acqui- red paroxysmal dyskinesias: a proposed classification with delineation of clinical features. Arch Neurol 35:827-831

Guidelines for the molecular genetics predictive test in Huntington's disease. (1994) Neurology 44: 1533-1536

Gutekunst CA, Li SH, Yi H et al. (1999) Nuclear and neuropil aggregates in

Huntington's disease: relationship to neuropathology. J Neurosci 19:2522-

2534.

Hardie RJ, Pullon HW, Harding AE et al. (1982) „New" clinical features of Mc Leod syndrome. Transfusion 22:404

Harper PS (1992) The epidemiology of Hutington's disease. Hum Genet

89:365-376

Harper PS. Huntington 's Disease, (W.B. Saunders, London, 1996).

Hayden MR, Martin WR, Stoessl AJ et al. (1986) Positron emission tomography in the early diagnosis of Huntington's disease. Neurology 36:888-894.

Hennig J, Nauerth A, Friedburg H (1986) RARE imaging: a fast imaging method for clinical MR. Magn Reson Med 3:823-833.

Hodgson JG, Agopyan N, Gutekunst CA et al. (1999) A YAC mouse model for

Huntington's disease with full-length mutant huntingtin, cytoplasmic toxicity, and selective striatal neurodegeneration. Neuron 23: 181 -192.

Hockly E, Cordery PM, Woodman B, et al. (2002) Environmental enrichment slows disease progression in R6/2 Huntington's disease mice. Ann Neurol

51 :235-242

Holbert S, Denghien I, Kiechle T et al. (2001 ) The Gln-Ala repeat transcriptional activator CA1 50 interacts with huntingtin: Neuropathologic and genetic evi- dence for a role in Huntington's disease pathogenesis. PNAS 98: 181 1 -1816

Holscher C, Schmidt WJ (1994) Quinolinic aeid lesion of the rat entorhinal cor- tex pars medialis produces selective amnesia in allocentric working memory

(WM), but not in egocentric WM. Behav Brain Res 63: 187-194. Holzmann C, Maueler W, Petersohn D et al. (1998) Isolation and characterizati- on of the rat huntingtin promoter. Biochem J 336:227-234. Jacobs RE, Cherry SR (2001 ) Complementary emerging techniques: high- resolution PET and MRI. Curr Opin Neurobiol 1 1 :621 -629. Kambouris M, Bohlega S, Al-Tahan A, Meyer BF (2000) Localization of the Gene for a Novel Autosomal Recessive Neurodegenerative Huntington-Like Disor- der to 4p15.3. Am J Hum Genet 66:445-452

Kompoliti K (1999) Estrogen and movement disorders. Clin Neuropharmacol 22 (6) : 318-326.

Kremer B, Squitieri F, Telenius H, Andrew SE, Theilmann J, Spence N, Goldberg YP, Hayden MR (1993) Molecular analysis of late onset Huntington's di- sease. J Med Genet 30:991 -995

Kremer B, Goldberg P, Andrew SE et al. (1994) A worldwide study of the Huntington's disease mutation. New Engl J Med 330: 1401 -1406 Kuge Y, Minematsu K, Hasegawa Y et al. (1997) Positron emission tomography for quantitative determination of glucose metabolism in normal and ischemic brains in rats: an insoluble problem by the Harderian glands. J Cereb Blood Flow Metab 17:1 16-120.

Kühl DE, Phelps ME, Markham CH et al. (1982) Cerebral metabolism and atro- phy in Huntington's disease determined by 18FDG and computed tomographic scan. Ann Neurol 12:425-434. Kuwert T, Lange HW et al. (1990) Cortical and subcortical glucose consumpti- on measured by PET in patients with Huntington's disease. Brain 1 13: 1 05- 1423.

Lawrence AD, Sahakian BJ, Hodges JR et al. (1996) Executive and mnemonic functions in early Huntington's disease. Brain 1 19: 1633-1645. Lawrence AD, Watkins LH, Sahakian BJ et al. (2000) Visual object and visuos- patial cognition in Huntington's disease: implications for information processing in corticostriatal circuits. Brain 123: 1349-1364.

Li H, Li SH, Cheng AL et al. (1999) Ultrastructural localization and progressive formation of neuropil aggregates in Huntington's disease transgenic mice. Hum Mol Genet 8: 1 227-1236. Li H, Li SH, Johnston H et al. (2000) Amino-terminal fragments of mutant huntingtin show selective accumulation in striatal neurons and synaptic toxicity. Nat Genet 25:385-389.

Lione LA, Carter RJ, Hunt MJ et al (1999) Selective Discrimination Leaming Impairments in Mice Expressing the Human Huntington's Disease Mutation. J Neurosci 19(23): 10428-10337

Lüesse H-G, Schiefer J, Spruenken A et al. (2001 ) Evaluation of R6/2 HD transgenic mice for therapeutic studies in Huntington ' s disease: behavioral te- sting and impact of diabetes mellitus. Beh. Brain Res. in press: Lyle OE, Gottesman II (1977) Premorbid psychometric indicators of the gene for Huntington's disease. J Consult Clin Psychol 45 : 101 1 -1022. Malandrini A, Fabrizi GM, Truschi F et al. (1994) Atypical McLeod syndrome manifested as X-Iinked chorea-acanthocytosis, neuromyopathy and dilated car- diomyopathy: report of a family. J Neurol Sei 124:89-94 Mangiarini L, Sathasivam K, Seiler M et al. (1996) Exon 1 of the HD Gene with an Expanded CAG Repeat Is Sufficient to Couse a Progressive Neurological Phenotype in Transgenic Mice. Cell 87:493-506

Margolis RL, O'Hearn E, Rosenblatt A et al. (2001 ) A disorder similar to Huntington's disease ist associated with a novel CAG repeat expansion. Ann Neurol in press

Martin JB, Gusella JF (1986) Huntington's disease: Pathogenesis and manage- ment. New Engl J Med 315: 1267-1276

Mohr E, Brouwers P, Claus JJ et al. (1991 ) Visuospatial cognition in Huntington's disease. Mov Disord 6:127-132. Moore TH, Osteen TL, Chatziioannou TF et al. (2000) Quantitative assessment of longitudinal metabolic changes in vivo after traumatic brain injury in the adult rat using FDG-microPET. J Cereb Blood Flow Metab 20:1492-1501. Mullins JJ, Peters J, Ganten D (1990) Fulminant hypertension in transgenic rats harbouring the mouse Ren-2 gene. Nature 344:541 -544. Murphy KP, Carter RJ, Lione LA et al. (2000) Abnormal synaptic plasticity and impaired spatial cognition in mice transgenic for exon 1 of the human Huntington's disease mutation. J Neurosci 20:51 15-5123.

Ona VO, Li M, Vonsattel JPG et al. (1999) Inhibition of caspase-1 slows disea- se progression in a mouse model of Huntington's disease. Nature 399:263-267 Paulson HL, Fischbeck KH (1996) Trinucleotide repeats in neurogenetic disor- ders. Annu Rev Neurosci 19:79-107.

Peters MF, Ross CA (2001 ) Isolation of a 40 kDa Huntingtin-Associated Protein. J Biol Chem 276:3188-3194 Phelps ME (2000) PET: The merging of biology and imaging into molecular imaging. J. Nucl. Med. 41 :661 -681 .

Pietrzyk U, Herholz K, Heiss WD (1990) Three-dimensional alignment of func- tional and morphological tomograms. J Comput Assist Tomogr 14:51 -59. Provencher SW (1993) Estimation of metabolite concentrations from localized in vivo proton NMR spectra. Magn Reson Med 30:672-679.

Quarrell OW, Youngman S, Sarfarazi M, Harper PS (1988) Absence of dose linkage between benign hereditary chorea and the locus D4S10 (probe G8). J Med Genet 25: 191 -194 Rampoldi L, Dobson-Stone C, Rubio JP et al. (2001 ) A conserved sorting- associated protein is mutant in chorea-acanthocytosis. Nat Genet 28: 1 19-120

Reddy PH, Williams M, Charles V et al. (1998) Behavioural abnormalities and selective neuronal loss in HD transgenic mice expressing mutated full-length HD cDNA. Nat Genet 20:198-202.

Rubinsztein DC, Leggo J, Coles R et al. (1996) Phenotypic characterization of individuals with 30-40 CAG repeats in the Huntington disease (HD) gene re- veals HD cases with 36 repeats and apparently normal elderly individuals with 36-39 repeats. Am J Hum Genet 59:16-22

Rubinsztein DC, Leggo J, Chiano M et al. (1997) Genotypes at the GluR6 kai- nate receptor locus are associated with Variation in the age of onset of Hun- tington disease. Proc Natl Acad Sei U S A 94:3872-3876 Russo D, Redman C, Lee S (1998) Association of XK and Kell blood group proteins. J Biol Chem 273:13950-13956

Saudou F, Finkbeiner S, Devys D, Greenberg ME (1998) Huntingtin Acts in the Nucleus to induce Apoptosis but Death Does Not Correlate with the Formation of Intranuclear Inclusions. Cell 95:55-66

Scherzinger E, Lurz R, Turmaine M et al. (1997) Huntingtin-Encoded Polygluta- mine Expansions Form Amyloid-like Protein Aggregates in vitro and in vivo. Cell

90:549-558

Schilling G, Becher MW, Sharp AH et al. (1999) Intranuclear inclusions and neuritic aggregates in transgenic mice expressing a mutant N-terminal fragment of huntingtin. Hum Mol Genet 8:397-407.

Schinke M, Baltatu O, Böhm M et al. (1999) Blood pressure reduction and dia- betes insipidus in transgenic rats deficient in brain angiotensinogen. Proc Natl Acad Sei U S A 96:3975-3980. Schmidt T, Landwehrmeyer GB, Schmitt I et al. (1998) An isoform of ataxin-3 aecumulates in the nucleus of neuronal cells in affected brain regions of SCA3 patients. Brain Pathol 8:669-679.

Schmitt I, Bachner D, Megow D et al. (1995) Expression of the Huntington disease gene in rodents: cloning the rat homologue and evidence for downregula- tion in non-neuronal tissues during development. Hum Mol Genet 4: 1 173-1 182. Schoenfield M, Myers RH (1984) Increased rate of suicide among patients with Huntington's disease. J Neurol Neurosurg Psychiat 47: 1283. Schoppe KJ (1974) Das MLS-Gerät: Ein neuer Testapparat zur Messung feinmotorischer Leistungen. Diagnostica 20:43-46. Shelbourne PF, Killeen N, Hevner RF et al. (1999) A Huntington's disease CAG expansion at the murine Hdh locus is unstable and associated with behavioural abnormalities in mice. Hum Mol Genet 8:763-774.

Shinotoh H, Calne DB, Snow B, Hayward M, Kremer B, Theilmann J, Hayden MR (1994) Normal CAG repeat length in the Huntington's disease gene in se- nile chorea. Neurology 44:2183-2184 Sittler A, Lurz R, Lueder G et al. (2001 ) Geldanamycin activates a heat shock response and inhibits huntingtin aggregation in a cell culture model of Huntington's disease. Hum Mol Genet 10: 1307-1315

Sokoloff L, Reivich M, Kennedy C et al. (1977) The [14C]deoxyglucose method for the measurement of local cerebral glucose utilization: theory, procedure, and normal values in the conscious and anesthetized albino rat. J Neurochem

28:897-916.

Stone TW (2001 ) Kynurenines in the CNS: from endogenous obscurity to the- rapeutic importance. Prog Neurobiol 64: 185-218. Swerdlow NR, Geyer MA (1998) Using an animal model of deficient sensorimo- tor gating to study the pathophysiology and new treatments of schizophrenia.

Schizophr Bull 24:285-301 .

Szepetowski P, Rochette J, Berquin P et al. (1997) Familial Infantile Convulsi- ons and Paroxysmal Choreoathetosis: A New Neurological Syndrome Linked to the Pericentromeric Region of Human Chromosome 16. Am J Hum Genet

61 :889-898

Telenius H, Kremer HPH, Theilmann J et al. (1993) Molecular analysis of juve- nile Huntington disease: the major influence on (CAG)n repeat length is the sex of the affected parent. Hum Mol Genet 2:1 535-1540 Telenius H, Kremer B, Goldberg YP et al. (1994) Somatic and gonadal mosai- cism of the Huntington disease gene CAG repeat in brain and sperm. Nat Genet

6(4):409-414

Telenius H, Almquist E, Kremer B et al. (1995) Somatic mosaicism in sperm is associated with intergenerational (CAG)n changes in Huntington disease. Hum Mol Genet 4: 189-195

The Huntington's disease collaborative research group (1993) A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell 72:971 -983

Tomita H, Nagamitsu S, Wakui K et al (1999) Paroxysmal kinesigenic choreoa- thetosis locus maps to chromosome 16p1 1 .2-q12.1 . Am J Hum Genet

65:1688-1697 Tzagournissakis M, Fesdjian C, Shashidharan P, Plaitakis A (1995) Stability of the Huntington disease (CAG)n repeat in a late-onset form occuring on the Island of Crete. Hum Mol Genet 4:2239-2243

Ueno S, Maruki Y, Nakamura M et al. (2001 ) The gene encoding a newly dis- covered protein, chorein, is mutated in chorea-acanthocytosis. Nat Genet 28: 121 -122

Vaarmann A, Kask A, Mäeorg U (2002) A novel and sensitive HPLC method for determination of catecholamine and kynurenine derivatives of tryptophan using couulometric array detector. J. Chromatography 769: 145-153. Vries BBA de, Arts WFM, Breedveld GJ et al. (2000) Benign Hereditary Chorea of Early Onset Maps to Chromosome 14q. Am J Hum Genet 66: 136-142 Warner JP, Barron LH, Brock DJH (1993) A new polymerase chain reaction (PCR) assay for the trinucleotide repeat that is unstable and expanded on Huntington's disease chromosomes. Mol Cell Probes 7:235-239 Warner TT, Lennox GG (1994) Autosomal-dominant dentatorubropallidoluysian atrophy in the United Kingdom. Mov Disord 9: 289-296.

Warrick JM, Chan HYE, Gray-Board GL et al. (1999) Suppression of polygluta- mine-mediated neurodegeneration in Drosophila by the molecular chaperone HSP70. Nat Genet 23:425-428 Weindl A, Conrad B (1996) Chorea und choreatische Bewegungsstörungen, in: Conrad B, Ceballos-Baumann A O: Bewegungsstörungen in der Neurologie. Thieme 1996: 155-180.

Weber S, Bauer A, Herzog F et al. (2000) Recent Results of the TierPET Scanner. IEEE Trans. Nucl. Sei. 47: 1665-1669. Wheeler VC, White JK, Gutekunst CA et al. (2000) Long glutamine tracts cau- se nuclear localization of a novel form of huntingtin in medium spiny striatal neurons in HdhQ92 and HdhQ1 1 1 knock-in mice. Hum Mol Genet 9:503-513. Widner B, Werner ER, Schennach H et al. (1999) An HPLC method to determi- ne tryptophan and kynurenine in serum simultaneously. Adv Exp Med Biol 467:827-832. Yamamoto A, Lucas JJ, Hen R (2000) Reversal of neuropathology and motor dysfunction in a conditional model of Huntington's disease. Cell 101 :57-66. Young AB, Penney JB, Starosta-Rubinstein S et al. (1986) PET scan investiga- tions of Huntington's disease: cerebral metabolic correlates of neurological fea- tures and functional decline. Ann Neurol 20:296-303Xiang F, Almqvist EW, Huq M et al. (1998) A Huntington Disease-Like Neurodegenerative Disorder Maps to Chromosome 20p. Am J Hum Genet 63: 1431 -1438 Zuccato C, Ciammola A, Rigamonti D et al. (2001 ) Loss of Huntingtin-Mediated BDNF Gene Transcription in Huntington's Disease. Science 14: in press Zühlke C, Riess O, Schröder K, et al. (1993) Expansion of the (CAG)n repeat causing Huntington's disease in 352 patients of German origin. Hum Mol Genet 2: 1467-1469

Claims

Patentansprüche:

1 . Nukleinsäurekonstrukt, welches eine carboxyterminal verkürzte Sequenz des Ratten-Huntingtin-Gens (RHD10), wenigstens 36 CAG-Trinukleotid- Wiederholungen und weiter stromaufwärts wenigstens einen wirksamen Teil eines Huntingtin-Gen-spezifischen Promotors enthält.

2. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die CAG-Trinukleotid-Wiederholungen innerhalb eines in das Konstrukt integrierten humanen Huntingtin-Genabschnittes vorliegen, wobei das Ratten-Huntingtin- Gen N-terminal um die CAG-Repeat-Region verkürzt wurde.

3. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Ratten-Huntingtin-Gen N-terminal um 154 Basenpaare verkürzt wurde.

4. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass der in das Nukleinsäurekonstrukt integrierte aberrante humane Huntingtin- Genabschnitt mit den CAG-Trinukleotid-Wiederholungen durch PCR- Reproduktion mit den Primern Hu 4 (ATGGCGACCCTGGAAAAGCTGATGAA) und

Hu3-510 (GGGCGCCTGAGGCTGAGGCAGC) aus der DNA eines Chorea- Huntington-Patienten gewonnen wurde.

5. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekenn- zeichnet, dass es stromabwärts vom Ratten-Huntington-Gen eine Polyadenylie- rungs-Sequenz enthält.

6. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es wenigstens 36, insbesondere ca. 40, weiter vorzugsweise wenigstens 50 bis mehrere Hundert CAG-Trinukleotid-Wiederholungen enthält.

7. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Huntingtin-Gen-spezifische Promotor ein im Gehirn exprimie- render Promotor ist, vorzugsweise der native Ratten-Huntingtin-Promotor oder ein funktioneller Bestandteil davon.

8. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das funktionelle Ratten-Huntingtin-Gen-Fragment ein Teilstück der Sequenz gemäß GenBank Accession Nr. U 18650 ist.

9. Vektor, enthaltend das Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 8.

10. Säugetierzelle, ausgenommen embryonale menschliche Stammzelle, transfi- ziert mit dem Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder dem Vektor nach Anspruch 9.

1 1 . Verwendung des Nukleinsäurekonstrukts nach einem der Ansprüche 1 bis 8, des Vektors nach Anspruch 9 oder der Säugetierzelle nach Anspruch 10 zur Erzeugung transgener nichtmenschlicher Säuger.

12. Transgene Ratte, die im Genom ihrer Keimbahn- und somatischen Zellen eine aberrante, um CAG-Repeat-Einheiten erweiterte Sequenz des Ratten- Huntingtin-Gens enthält, welche in dieses Tier oder einen seiner Vorfahren eingeschleust wurde.

13. Transgene Ratte nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Gensequenz wenigstens 36 CAG-Trinukleotid-Wiederholungen aufweist, wobei die Anzahl der Wiederholungen vorzugsweise 40, weiter vorzugsweise 50 bis 200 beträgt.

14. Transgene Ratte nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 1 bis 8 oder der Vektor nach Anspruch 9 in die Ratte oder eine ihrer Vorfahren eingeschleust wurde.

15. Verwendung der transgenen Ratte nach einem der Ansprüche 12 bis 14 als Modelltier für die Durchführung von Studien zum Pathomechanismus und Verlauf der Krankheit Chorea-Huntington und anderer neurodegenerativer Erkrankungen des zentralen Nervensystems, für die Entwicklung therapeutischer und/oder prophylaktischer Mittel gegen diese Krankheiten, für die Untersuchung von Therapiekonzepten, für die Durchführung mikrochirurgischer Operationen, Stammzelltransplantationen oder gentherapeutischer Behandlungen oder Anti- sensebehandlungen und für die Verlaufskontrolle mittels bildgebender Verfahren, insbesondere PET und MRI.