DE69733763T2

DE69733763T2 - Für polykationen sensitiver rezeptor von aquatischen lebewesen und methoden für seine verwendung.

Info

Publication number: DE69733763T2
Application number: DE69733763T
Authority: DE
Inventors: William H. Harris; Edward Brown; Steven Hebert
Original assignee: Brigham and Womens Hospital Inc
Current assignee: Brigham and Womens Hospital Inc
Priority date: 1996-03-27
Filing date: 1997-03-27
Publication date: 2006-06-01
Anticipated expiration: 2017-03-28
Also published as: US7038014B2; DE69733763D1; EP0934407A1; EP0934407B1; CA2250069A1; ATE299935T1; EP0934407A4; WO1997035977A1; US20030166908A1; JP2000507822A; US6337391B1

Description

Hintergrund der Erfindung
Es ist allgemein anerkannt, dass die Stagnation oder die Abnahme der Produktion von verzehrbaren Meeresfrüchten, insbesondere von Fisch, durch die Fischfangindustrie auf einer weltweiten Basis aufgetreten ist. Weil die Weltbevölkerung sich um ungefähr 100 Millionen pro Jahr erhöht, wird die Aufrechterhaltung des gegenwärtigen Kaloriengehaltes der durchschnittlichen Nahrung die Produktion von zusätzlichen 19 Millionen Tonnen Meeresfrüchten pro Jahr erfordern (United Nations Food and Agriculture Organization, The State of the World Fisheries and Aquaculture, Rom, Italien (1995)). Zusätzlich werden Fischprodukte in zunehmendem Maße zu anderen Zwecken als zu Nahrungszwecken verwendet, beispielsweise bei der Produktion von Muschelschalen und Perlen. Um dieses Niveau der Produktion zu erreichen, muss die Aquakultur (die Kultivierung von Meeresarten bzw. Seespezies) ihre Produktion in den nächsten 15 Jahren verdoppeln und Wildpopulationen von Seespezies müssen wiederhergestellt werden.
Aquatische Spezies schließen Knochen- und Elasmobranchier-Fische, Süßwasserknochenfische, euryhaline Fische, Crustaceen, Mollusken und Echinodermen ein. Die Knochenfische leben in Seewasser mit einer hohen Osmolalität von ungefähr 1.000 mOsm. Süßwasserknochenfische leben normalerweise in Wasser von weniger als 50 mOsm. Euryhaline Fische weisen die Fähigkeit auf, sich in nahezu jeder dieser Umgebungen zu akklimatisieren. Die Ionenzusammensetzung und Osmolalität von Fischkörperflüssigkeiten werden in diesen stark unterschiedlichen Umgebungen durch Kiemen-, Nieren- und Gastrointestinaltrakt-Epithelzellfunktion aufrechterhalten.
Ein Hauptproblem in der Aquakultur besteht darin, eine Methodik zur Züchtung von marinem bzw. See-Knochenfisch, wie beispielsweise Kabeljau, Flunder und Heilbutt unter Süßwasserbrutbedingungen zu entwickeln. Bis heute wurden Faktoren, die zur Akklimatisierung und zum Überleben von Seespezies gegenüber Frischwasserumgebungen notwendig sind und die Kontrolle dieser Faktoren, nicht vollständig beleuchtet.
Versuche, solche Methodologien zu entwickeln, wurden durch Probleme mit dem Füttern der reifen Larvenformen dieser Fische kompliziert. Die Entwicklung von Kabeljau-, Heilbutt- oder Flunder-Spezies, die in Frischwasser bzw. Süßwasser gezüchtet werden können, hätte einen großen potentiellen Vorteil in dieser Hinsicht. Unter kontrollierten Süßwasserbedingungen könnten sich entwickelnde Formen dieser Fische in Abwesenheit einer bakteriellen Kontamination gezüchtet werden, die normalerweise in Seewasser vorhanden ist, und es könnten neue Süßwassernahrungsquellen verwendet werden, die potentiell ihr Überleben verbessern würden.
Die Aquakulturindustrie verwendet die Fähigkeit von jungen Fischen, beispielsweise von Lachs (auch Parr genannt), anfänglich in Süßwasser gezüchtet werden zu können und anschließend zum „Auswachsen" in Salzwasserbehälter übertragen werden, als Mittel zur Erzeugung großer Mengen von erwachsenen Fischen (junger Lachs, der gegenüber Salzwasser tolerant ist, wird als Smolt bezeichnet). Verbesserungen sowohl beim Überleben als auch der Gesundheit der Fische, die den Parr-Smolt-Übergang durchmachen, wäre für Züchter von Aquakulturen sehr wertvoll.
Darüber hinaus ist Lachs, der in küstennahen Seegehegen zum „Auswachsen" während des Winters gehalten wird, einem konstanten Risiko unterworfen, weil sowohl Winterstürme wie auch die Exposition gegenüber extrem kalten Seewasser das Einfrieren und Abtöten der Fische verursachen kann. Diese Risiken werden weiterhin durch die Tatsache kompliziert, dass, wenn erwachsener Lachs an das Salzwasser angepasst ist, er nicht in einfacher Weise wieder an Süßwasserumgebungen angepasst werden kann. Daher hat ein fehlendes Verständnis der Mittel zur Wiederanpassung von erwachsenem Lachs von Salz- an Süßwasser einen Verlust von Lachs zur Folge.
Es ist deswegen offensichtlich, dass ein sofortiger Bedarf zur Entwicklung von Verfahren zur Förderung des Überlebens von Fisch in Süßwasser und Seewasser, sowohl in einer natürlichen Umgebung als auch in der Umgebung einer Aquakultur, besteht.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Identifizierung und Charakterisierung eines mehrwertigen Kation-wahrnehmenden Rezeptorproteins (ebenfalls hierin als der aquatische mehrwertige Kationen-wahrnehmende Rezeptor oder aquatische PVCR bezeichnet), der in verschiedenen Geweben von Meeresspezies vorhanden ist. Wie hierin definiert, schließen aquatische Arten Fisch (Elasmobranchier-Fisch wie beispielsweise Haie, Rochen; Knochenfisch wie beispielsweise Flunder, Lachs, Kabeljau, Heilbutt, Seehase und Forelle), Crustaceen (beispielsweise Hummer bzw. Lobster, Krabben und Shrimps) und Mollusken (beispielsweise Muscheln, Miesmuscheln und Austern) ein.
Wie hierin beschrieben, wurde zum ersten Mal ein mehrwertiges Kation-wahrnehmendes Rezeptorprotein in aquatischen Arten identifiziert, das sich an den Plasmamembranen von Zellen im Gastrointestinaltrakt, Nieren, Ovarien, Lunge, Gehirn und Herz und im Fischgehirn, Kiemen, Herz, Darm, Harnblase, Rektaldrüse und Nierentubuli befindet. Die weite Verbreitung des aquatischen PVCR-Proteins auf den Plasmamembranen von Epithelzellen ebenso wie im Gehirn zeigt die Einbeziehung von aquatischen PVCR in die Modulation des Epithel-Ionen- und Wassertransportes und in die Endokrinfunktion. Die hierin demonstrierten Daten zeigen, dass das aquatische PVCR eine entscheidende Rolle in der Akklimatisierung von Fisch an Umgebungen von verschiedenen Salzgehalten spielt. Der aquatische mehrwertige Kation-wahrnehmende Rezeptor ermöglicht die erfolgreiche Anpassung von Fischen, wie beispielsweise Flundern, an Meeres- und Süßwasserumgebungen.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst aquatische PVCR-Proteine, die in Geweben von Meeresarten exprimiert werden. Aquatische PVCR-Proteine wurden als in ausgewählten Epithelzellen in Meeres-, Süßwasser- und Euryhalin-Fisch-Niere, -Darm, -Kiemen, -Harnblase und -Gehirn vorhanden identifiziert. Insbesondere wurde das aquatische PVCR-Protein auf den Plasmamembranen von Epithelzellen von Fischnierentubuli, insbesondere im Sammelkanal (CD) und im späten distalen Tubulus (Late Distal Tubule = LDT) identifiziert. Die vorliegende Erfindung soll diese aquatischen PVCR-Proteine, deren Aminosäuresequenzen und Nucleinsäuresequenzen (DNA oder RNA) umfassen, die diese aquatischen PVCR-Proteine codieren. Die Anmeldung offenbart Verfahren zur Regulierung der Salztoleranz in Fischen.
Die hierin präsentierten Daten zeigen, dass der aquatische PVCR ein „Haupt- bzw. Masterschalter" sowohl für die endokrine als auch die Nierenregulation von adulten Fischnieren- und -Intestinum Ionen und -Wassertransport ist, ebenso wie für die Schlüssel-Entwicklungsschritte innerhalb des Fischembryos. Die Modulierung der Expression des aquatischen mehrwertigen Kationen-wahrnehmenden Rezeptors wird den aquatischen PVCR-vermittelten Ionentransport und Endokrin-Veränderungen aktivieren oder hemmen, die es dem Fisch ermöglichen, sich an Süß- oder Salzwasser anzupassen.
Beispielsweise sind Verfahren offenbart, um die Salztoleranz von Fisch, der an Süßwasserumgebungen angepasst ist, durch Aktivierung des aquatischen PVCR in ausgewählten Epithelzellen zu erhöhen. Es sind ebenfalls Verfahren zur Senkung der Salztoleranz von Fischen offenbart, die an eine Salzwasserumgebung angepasst sind, indem die Aktivität des aquatischen PVCR in ausgewählten Epithelzellen gehemmt wird.
Es sind in der Anmeldung Verfahren offenbart, um eine Substanz zu identifizieren, die zum Regulieren der Ionenzusammensetzung von Fischflüssigkeiten (beispielsweise der Salztoleranz in Fisch) und der endokrinen Funktion in der Lage ist, durch Bestimmen der Wirkung, die die Substanz auf die Aktivierung oder Hemmung des aquatischen CaR aufweist. Wie hierin beschrieben, wurde die Nucleinsäuresequenz, die einen aquatischen PVCR codiert, bestimmt und rekombinante PVCR-Proteine können beispielsweise in Eizellen des Frosches Xenopus laevis exprimiert werden. Das Oocyten- bzw. Eizellassaysystem ermöglicht das Screening einer großen Bibliothek von Verbindungen, die entweder die aquatische PVCR-Funktion hemmen oder aktivieren wird. Es können weiterhin Kandidatenverbindungen in beispielsweise einem In-vitro-Assaysystem gescreent werden, unter Verwendung von isolierten Flunder-Blasenzubereitungen zum Messen des transepithelialen Transportes von Ionen, die für die Salz-Adaption von Bedeutung sind.
Als Folge der hierin beschriebenen Arbeit wurden aquatische PVCR-Proteine identifiziert und ihre Rolle in der Aufrechterhaltung der Osmoregulation wurde charakterisiert. Als weiteres Ergebnis der hierin beschriebenen Arbeit sind Verfahren nunmehr verfügbar, um die Aktivierung des aquatischen CaR zu modulieren, was Verfahren zur Regulierung der Salztoleranz in Meeres- und Süßwasserfischarten zur Folge hat und somit die Aquakultur von Meeresfischen erleichtert. Verfahren zur Regulierung der Salztoleranz stellen ebenfalls ein Mittel bereit, um neue Arten von Meeresfischen zu entwickeln, die leicht an eine Süßwasseraquakultur anpass bar sind. Eine erfolgreiche Entwicklung von neuen Arten von Meeresfischen würde es diesen Arten erlauben, anfänglich in geschützten Frischwasserbrutstätten gezüchtet zu werden und danach in die Meeresumgebung übertragen zu werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1A–F sind Photographien von Immuncytochemie-Ergebnissen, die die Verteilung von PVCR-Proteinen in verschiedenen Geweben des Elasmobranchier-Fisches einschließlich Dornhai (Squalus acanthias) und kleinem Rochen (Raja crinacca) darstellt.
Die 2A–F sind Photographien von Immuncytochemie-Ergebnissen, die die Verteilung von PVCR-Proteinen in verschiedenen Geweben von Knochenfischen einschließlich der Flunder (Pseudopleuronectes americanus), der Forelle (Onchorhychus nerka) und des Killifisches (Fundulus heteroclitus) zeigt.
3A–B sind Autoradiogramme, die RNA-Blottinganalysen zeigen.
Die 4A–G zeigen die Nukleotidsequenz von Hai-Nieren-Calciumrezeptor-verwandtem Protein (SKCaR-RP) (SEQ ID NO: 1), wobei der ORF bei nt 439 beginnt und bei 3.516 endet.
Die 5A–B zeigen die abgeleiteten Aminosäuresequenzen des Hai-Nieren-Calciumrezeptor-verwandten Proteins (SKCaR-RP) (SEQ ID NO: 2).
6 ist ein Autoradiogramm, das die Ergebnisse von Northern-Blot-Analysen von A + RNA aus verschiedenen Hai-Geweben zeigt.
7A–B sind Autoradiogramme, die die Ergebnisse von RT-PCR-Amplifikationen von PolyA + RNA aus verschiedenen aquatischen Spezies zeigen.
8 ist eine Photographie von Immuncytochemie-Ergebnissen, die die PVCR-Expressionen aus gewählten Geweben von Fundulus nach 18 Tagen Exposition entweder gegenüber Salz- oder Süßwasser zeigen, wie durch RNA-Blotting-Analyse bestimmt wurde.
9A–D sind Photographien, die die Ergebnisse von Immuncytochemie-Analysen der PVCR-Expression in den Nierentubuli von Fundulusfischen entweder chronisch (18 Tagen) oder akut (7 Tage) zeigen, angepasst entweder an Salz- oder Süßwasser.
Ausführliche Beschreibung
Hierin beschrieben ist zum ersten Mal ein Zelloberflächenrezeptor, der als mehrwertiges Kation-wahrnehmendes Rezeptorprotein bezeichnet wird, der in ausgewählten Epithelzellen in Gewebe und Organen von aquatischen Arten, wie beispielsweise Fischnieren, -darm, -blase, -rektaldrüse, -kiemen und -gehirn vorliegt. Dieses aquatische Rezeptorprotein wird ebenfalls hierin als aquatisches PVCR bezeichnet. Hierin wird ebenfalls der Beweis dafür geliefert, dass die Expression des aquatischen PVCR in Fisch, der von Süß- zu Salzwasser transferiert wird, moduliert wird. Die Kombination dieser Daten und das Wissen der Osmoregulation in Fischen und anderen Meeresarten, die unten kurz besprochen sind, legen in starker Weise nahe, dass der aquatische PVCR der „Masterschalter" bzw. „Hauptschalter" sowohl für die endokrine als auch die Nieren-Regulation der Nieren-, Darm-, Ionen- und Wassertransporte von Meeresspezies ist. Zusätzlich kann die aquatische PVCR-Funktion die Reifung und die Entwicklungsstadien in Meeresarten kontrollieren oder stark beeinflussen.
In Säugetieren wurden Calcium/mehrwertige-Kation-wahrnehmende Rezeptorproteine oder terrestrische CaR-Proteine (hierin ebenfalls als Säugetier-CaR bezeichnet) in verschiedenen Geweben in Menschen und Ratten identifiziert. Garrett et al. (1995), The Journal of Biological Chemistry, 270: 12919–12925, offenbart die Sequenz eines mehrwertigen Kationen-wahrnehmenden Rezeptors vom Menschen (CaR; humane Nebenschilddrüsen-Calciumrezeptor-cDNAs). Säugetier CaR-Protein wurde isoliert und es wurde gezeigt, dass es der Zelloberflächenrezeptor ist, der es Säugetiernebenschilddrüsen- und Calictonin-Zellen ermöglicht, auf Veränderungen im extrazellulären Ca²⁺ zu reagieren. (Brown, E. M. et al., New Engl. J. Med., 333: 243, (1995)). Säugetier-CaR ist ein Membranprotein, das ein Mitglied der G-Protein-gekoppelten Rezeptorfamilie ist. Wenn es durch externes Ca²⁺ aktiviert wird, moduliert CaR verschiedene intrazelluläre Signalübertragungswege und verändert bestimmte Funktionen in den ausgewählten Zellen, einschließlich der Sekretion verschiedener Hormone (PTH, Calcitonin, ACTH und Prolactin) durch Endokrin/Gehirnzellen und den Ionentransport durch Epithelzellen.
Anschließende Arbeiten haben gezeigt, dass reichlich CaR in Epithelzellen des dicken aufsteigenden Schenkels (Thick Ascending Limb = TAL) und der distalen gewundenen Tubuli (Distal Convoluted Tubules = DCT) der Säugetierniere vorhanden ist, wobei es den transepithelialen Salztransport moduliert (Riccardi, D. J. et al., Proc, Nat. Acad. Sci. USA, 92: 131–135 (1995). Kürzliche Forschungsarbeiten demonstrierten, dass CaR auf der apikalen Oberfläche von Epithelzellen des Säugetiernieren-Medullärsammelkanales vorliegt, wobei es Harn-Ca²⁺ wahrnimmt und die Vasopressin-vermittelte Wasserreabsorption durch die Niere einstellt (Sands, J. M. et al., Nature (Medicine) (1995)). Als letzes ist CaR ebenfalls in verschiedenen Bereichen des Gehirns vorhanden, wobei es in die Regulation des Durstes und in damit assoziiertes Verhalten involviert ist (Brown, E. M. et al., New England J. of Med., 333: 234–240 (1995)).
Ein weiteres Protein, das für die Osmoregulation in Säugetieren von Bedeutung ist, ist der NaCl-Cotransporter. Der NaCl-Cotransporter liegt im DCT von humanen Nieren vor, wo er NaCl absorbiert und die Reabsorption von Ca²⁺ erleichtert. Ein NaCl-Cotransporterprotein wurde ebenfalls aus der Harnblase der Flunder isoliert (Gamba, G. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA), 90-2749-2753 (1993)). Es wurde kürzlich demonstriert, dass die NaCl-Reabsorption, die durch diesen NaCl-Transporter im DCT von Menschen vermittelt wird, durch Säugetier-PVCR moduliert wird (Plotkin, M. et al., J. Am. Soc. Nephrol., 6: 349A (1995)).
Wie hierin beschrieben, wurde ein mehrwertiges Kation-wahrnehmendes Rezeptorprotein (hierin als aquatisches PVCR bezeichnet) ebenfalls in speziellen Epithelzellen in Geweben identifiziert, die für die Ionen-Hämostase in Meeresarten entscheidend sind (dieses Protein wird hierin ebenfalls als CaR-verwandtes Protein bezeichnet). Es ist vernünftig anzunehmen, dass der aquatische PVCR eine ähnlich entscheidende Rolle in biologischen Funktionen in Meeresarten einnimmt, wie der Säugetier-CaR in Säugetieren.
Insbesondere waren aquatische PVCR-Proteine in Arten von Elasmobrancher- und Knochenfischarten zu finden. Elasmobrancher sind Knorpelfische, beispielsweise Haie, Rayidae und Rochen und sind in erster Linie Meeresfische; Knochenfische, beispielsweise Flunder, Kabeljau, Forelle, Killifisch und Lachs können Süßwasser, Seewasser oder euryhalin sein.
Meeresknochenfische leben in Salzwasser, das eine hohe Osmolalität (1.000 mOsm) besitzt, das normalerweise 10 Millimolar (mM) Ca²⁺, 50 mM Mg²⁺ und 450 mM NaCl enthält (Evans, D. H., Osmotic and Ionic Rgulation, Kapitel 11 in The Physiology of Fishes, CRC Press, Boca Raton, FL (1993)). Weil ihre Körperflüssigkeiten 300–400 mOsm sind, sind diese Fische dazu gezwungen, Salzwasser zu trinken, Salz durch ihren Darm zu absorbieren und große Mengen NaCl durch ihre Kiemen und Mg²⁺ und Ca²⁺ über ihre Nieren zu sezernieren. Ihre Nieren produzieren nur kleine Mengen an isotonischem Urin.
Im Gegensatz hierzu besitzt Süßwasserknochenfisch Körperflüssigkeiten von 300 mOsm und lebt normalerweise in Wasser von weniger als 50 mOsm, das 5–20 mM NaCl und weniger als 1 mM Ca²⁺ und Mg²⁺ enthält. Diese Fischen trinken wenig, absorbieren jedoch große Mengen an Wasser aus ihrer verdünnten Umgebung. Als Folge erzeugen die Nieren ausgiebig verdünnten Urin, um die Wasserbalance aufrechtzuerhalten. Süßwasserfischkiemengewebe weist eine geringe Permeabilität gegenüber Ionen auf, und Kiemenepithelzellen extrahieren NaCl aus dem Wasser (Evans, D. H., „Osmotic and Ionic Regulation", Kapitel 11 in The Physiology of Fishes, CRC Press, Boca Raton, FL (1993)).
Euryhaline Fische akklimatisieren sich an verschiedene Salinitäten bzw. Salzgehalte durch Vor- und Zurückschalten zwischen diesen beiden Grundmustern des Ionen- und Wassertransportes. Wenn beispielsweise Süßwasser-angepasster Knochenfisch mit einer höheren Salinität konfrontiert wird, ändern ihre Kiemenepithelien rasch den Netto-NaCl-Einstrom derart, dass NaCl eher sezerniert als reabsorbiert wird (Zadunaisky, J. A. et al., Bull. MDI Biol. Lab., 32: 152–156 (1992)). Die Patentanmeldung USA 3 777 709 offenbart ein Verfahren zur Adaption von Fisch aus Süßwasser an Salzwasser. Die Reduktion von extrazellulärem Ca²⁺ aus 10 mM zu 10 μm hemmt diesen Transportprozess tiefgreifend (Zadunaisky, J. A. et al., Bull. MDI Biol. Lab., 32: 152–156 (1992)). In Flunderspezies aktiviert der Transfer in Salzwasser eine Reihe von Veränderungen in der Niere, die die Sekretion großer Mengen an Ca²⁺ und Mg²⁺ durch Nierenepithelien und die Wiedergewinnung von Wasser über einen Thiazid-empfindlichen NaCl-Cotransporter in der Harnblase ermöglicht (Gamba, G. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA), 90-2749-2753 (1993)).
In einer ähnlichen Weise ist die Adaption von Meereseuryhalin-Fisch an Süßwasser wegen eines Nettowechsels der Epithelionengradienten möglich, so dass NaCl aktiv reabsorbiert wird und die zweiwertige Metallionensekretion abnimmt (Zadunaisky, J. A. et al., Bull. MDI Biol. Lab., 32: 152–156 (1992)). Diese Veränderungen werden durch Veränderungen in Hormonen vermittelt, insbesondere von Prolactin, Cortison und Arginin-Vasotocin (Norris, D. O., „Endocrine Regulation of Iono-Osmotic Balance in Teleosts", Kapitel 16 in Vertebrate Endocrinology, Lea und Febiger, Philadelphia, PA (1985)). Diese Veränderungen in einer großen Gruppe entscheidender Hormone und funktionelle Veränderungen im Epitheltransport in den Kiemen, Dünndarm, in der Blase und den Nieren, sind nicht nur für die rasche Euryhalin-Anpassung überlebenswichtig, sondern auch während der gesamten Entwicklung von Fischembryos, Larven und während der Metamorphose.
Wie ausführlich in Beispiel 1 beschrieben ist, wurden aquatisches PVCR-Protein auf der Plasmamembran von ausgewählten Epithelzellen in Meeresarten lokalisiert. Insbesondere wurde aquatischer PVCR auf der apikalen Membran von Epithelzellen der Sammelleitung und des späten distalen Tubulus der Elasmobranchier-Niere lokalisiert. Aquatisches PVCR-Protein wurde ebenfalls auf den Apikalmembranen von Epithelzellen in Nierentubuli, Kiemen, Harnblasen und Darm von Knochenfischen gefunden. Wie hierin verwendet, betrifft der Begriff „Apikalmembran" oder „apikale Seite" die „Außenseite" der Epithelzellen, die gegenüber beispielsweise Urin exponiert sind, eher als die basale Seite der Zelle, die beispielsweise gegenüber dem Blut exponiert ist. Die Apikalmembran wird ebenfalls hierin als zum Lumen oder zum Innenraum beispielsweise des Nierentubulus oder des Dünndarms hin gerichtet bezeichnet. Der aquatische PVCR ist ebenfalls in speziellen Regionen des Knochenfischgehirnes zu finden.
Das aquatische PVCR-Protein, das hierin beschrieben ist, kann aufgrund seiner physikalischen Eigenschaften (beispielsweise Molekulargewicht bzw. Molekülmasse, isoelektrischer Punkt) unter Verwendung von Labortechniken isoliert und charakterisiert werden, die in der Proteinaufreinigung üblich sind, beispielsweise durch Aussalzen, Immunpräzipitation, Säulenchromatographie, Hochdruckflüssigkeitschromatographie oder Elektrophorese. Aquatische PVCR-Proteine, die hierin als „isoliert" bezeichnet werden, sind aquatische PVCR-Proteine, die von anderen Proteinen und Zellmaterial von ihrer Ursprungsquelle abgetrennt wurden. Diese isolierten aquatischen PVCR-Proteine schließen im Wesentlichen reines Protein, Protein, das durch chemische Synthese erzeugt wurde, durch Kombinationen von biologischen und chemischen Synthesen und durch rekombinante Verfahren, ein.
Aquatische PVCR-Proteine können weiter bezüglich ihrer DNA und der codierten Aminosäuresequenzen wie folgt charakterisiert werden: Eine komplementäre DNA (cDNA), die einen hoch konservierten Bereich des Säugetier-CaR codiert, wie in Brown, E. G. et al., Nature, 366: 575–580 (1993) oder Riccardi, D. J. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 92: 131–135 (1995) beschrieben, kann als Sonde dazu verwendet werden, eine cDNA-Bibliothek bzw. Bank zu screenen, die beispielsweise aus Flunder-Harnblasenzellen hergestellt wurde, um homologe Rezeptorproteine zu identifizieren. Techniken zur Herstellung einer cDNA-Bank sind dem Fachmann auf dem Gebiet wohlbekannt. Beispielsweise können Techniken wie solche, die in Riccardi, D. J. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 92: 131–135 (1995) beschrieben wurden, verwendet werden. Positive Klone können isoliert werden, können subkloniert werden und ihre Sequenzen können bestimmt werden. Unter Verwendung der Sequenzen entweder in voller Länge oder mehrerer Teil-cDNAs kann die vollständige Nucleotidsequenz der Flunder-PVCR gewonnen und die codierte Aminosäuresequenz abgeleitet werden. Die Sequenzen des aquatischen PVCR können mit Säugetier-CaRs verglichen werden, um Unterschiede und Ähnlichkeiten zu vergleichen. Ähnliche Techniken können dazu verwendet werden, homologe aquatische PVCR in anderen Meeresarten zu identifizieren.
Rekombinante aquatische PVCR-Proteine können gemäß Verfahren exprimiert werden, die dem Fachmann auf dem Gebiet wohlbekannt sind. Beispielsweise kann PVCR in Eizellen des Frosches Xenopus laevis expandiert werden, sowohl um die Identität des cDNA-Klons zu beweisen als auch das Profil der Aktivierung von aquatischen PVCR-Proteinen im Vergleich zu Säugetier-CaR-Proteinen zu bestimmen. Beispielhafte Techniken sind in Brown, E. G. et al., Nature, 366: 575–580 (1993); Riccardi, D. J. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 92: 131–135 (1995) beschrieben.
Wie in Beispiel 2 beschrieben, wurde ein 4,4 kb Homolog des Säugetier-CaR in Flunder-Harnblase zusammen mit reichlichem 3,8 kb Thiazid-empfindlichen NaCl-Cotransportertranskript gefunden. Unter Verwendung einer Homologie/Klonierungsstrategie wurde eine cDNA-Bibliothek aus Dornhai-Nieren hergestellt und gescreent, um multiple cDNA-Klone mit einer Teilhomologie zu Säugetier-CaRs zu gewinnen, wie in Beispiel 3 beschrieben ist. Ein Klon, der Hai-Nieren-Calciumrezeptor-verwandtes Protein (SKCaR-RP) genannt wurde, wurde isoliert und charakterisiert. SKCaR-RP (ebenfalls hierin als Hai-aquatisches PVCR bezeichnet) weist eine Größe von 4.131 Nucleotiden auf (SEQ ID NO: 1). Wie in 4 dargestellt ist, zeigt die vollständige Nucleotidsequenz von SKCaR-RP, dass der Klon aus 438 Nucleotiden einer 5'-untranslatierten Region oder UTR zusammengesetzt ist, gefolgt von einem einzigen Open Reading Frame bzw. offenen Leseraster (ORF) von 3.082 Nucleotiden, gefolgt von 610 Nucleotiden einer 3'-UTR-enthaltenden Region von PolyA + RNA.
5 zeigt das ORF des SKCaR-RP im Ein-Buchstaben-Aminosäurecode (SEQ ID NO: 2). Die abgeleitete Aminosäuresequenz von SKCaR-RP sagt ein Protein von ungefähr 110,00 Dalton voraus, d. h. 74% homolog sowohl zu Rattennieren-PVCR-Protein als auch zu bovinem Nebenschilddrüsen-PVRC-Protein. Eine Analyse der Aminosäuresequenz zeigt, dass SKCaR-RP allgemeine Merkmale besitzt, die zu PVCR-Proteinen homolog sind, einschließlich einer großen extrazellulären Domäne, der 7-Transmembrandomäne und der cytoplasmatischen Carboxyl-terminalen Domäne. In dieser Hinsicht demonstrierten viele Aminosäuren, die für die PVCR-Funktion entscheidend sind, dass sie mit SKCaR-RP identisch sind, im Vergleich zu Säugetier-PVCR-Proteinen, die spezifische Regionen einer extrazellulären Domäne und die 7 Transmembrandomänen einschließen. Im Gegensatz hierzu sind andere Regionen hoch divergent, einschließlich der Aminosäuren Nr. 351–395 in der extrazellulären Domäne ebenso wie die am meisten Carboxyl-terminale Region (beispielsweise Aminosäuren 870–1.027). In bedeutender Weise ist die Region von Aminosäuren, die in Säugetier-CaRs vorliegt, die zur Erzeugung von Anti-CaR-Serum verwendet wurden, ebenfalls in SKCaR-RP vorhanden.
Wie in 6 dargestellt ist, zeigt die Northern-Blot-Analyse von mRNA aus verschiedenen Hai-Geweben den höchsten Grad an SKCaR-RP in Kiemen, gefolgt von Nieren und danach der Rektaldrüse. Diese Daten sind hoch signifikant, weil diese Gewebe demonstriert haben, dass sie in den Ionen- und Wassertransport und die Körperhämostase involviert sind und besitzen Epithelzellen, die mit Anti-CaR-Antiserum färben. Es scheinen zumindest drei unterschiedliche mRNA-Spezies von ungefähr 7 kb, 4,2 kb und 2,6 kb zu existieren, die an SKCaR-RP hybridisieren. Das 4,2 kb entspricht wahrscheinlich dem oben beschriebenen SKCaR-RP-Klon.
RT-PCR-Amplifikationen wurden wie in Beispiel 3 beschrieben nach Isolation von PolyA + RNA aus verschiedenen aquatischen Arten durchgeführt. Primer, die eine selektive Amplifikation einer Region von CaRs (Nucleotide 597–981 von RaKCaR-cDNA) ermöglichen, die in allen Säugetier-CaRs zu 100% konserviert ist, wurden dazu verwendet, die Sequenzen ähnlicher CaRs in Meeresarten zu gewinnen. Dieser Primer amplifizieren eine Sequenz von 384 Nucleotiden, die in der extrazellulären Domäne von CaRs vorliegt, und ist vermutlich in die Bindung zweiwertiger Metallionen involviert. Die sich ergebende amplifizierte 384 bp cDNA wurde in einen Klonierungsvektor ligiert und in E. coli-Zellen bezüglich Wachstum, Aufreinigung und Sequenzierung transformiert.
Wie in den 7A und 7B dargestellt ist, wurden Teil-cDNA-Klone aus: Dornhai-Niere (Bahn 2), Flunder-Harnblase (Bahn 3), Seehasen-Leber (Bahn 5), Hummer-Muskel (Bahn 8), Muschel-Kiemen (Bahn 9) und Seegurken-Atemwegsgewebe (Bahn 10) unter Verwendung dieser identischen Primer gewonnen. Einige Gewebe (Flunder-Gehirnbahn 7) enthielten keine entsprechende 384 nt cDNA trotz vorsichtiger Kontrollen. In ähnlicher Weise wurde keine 384 nt cDNA gewonnen, wenn nur Wasser und nicht RT-Reaktionsgemisch zugesetzt wurde. Diese Daten legen nahe, dass diese 384 nt cDNAs spezifisch sind und nicht in allen Geweben von aquatischen Organismen exprimiert werden. Jede dieser 384 nt cDNAs wurde sequenziert und enthielt eine konservierte Nucleotidsequenz, die mit derjenigen identisch ist, die in Säugetier-CaRs vorliegt. Diese Daten legen das Vorhandensein von CaR-verwandten Proteinen in Klassen von aquatischen Organismen nahe, die in der Evolution in breitem Maße divergieren. Diese schließen Knochenfisch (Flunder, Seehase), Elasmobranchier-Fisch (Dornhai), Crustaceen (Hummer), Mollusken (Muscheln) und Echinodermen (Seegurken) ein.
Es ist wichtig zu erwähnen, dass die aquatische PVCR-Sequenz, die aus diesen Klonen gewonnen wurde, eine vollständige Identität der 384 nt Segmente von Säugetier-CaRs teilt. Jedoch war dies nicht der Fall für die aquatische PVCR-Sequenz, die aus dem Hainieren-Klon gewonnen wurde. Diese Daten legen nahe, dass zumindest zwei unterschiedliche Klassen an polyvalenten Kation-wahrnehmenden Rezeptoren existieren.
Die vorliegende Erfindung soll aquatische PVCR-Proteine und Proteine und Polypeptide umfassen, die Aminosäuresequenzen aufweisen, die mit den Aminosäuresequenzen von aquatischen PVCR-Proteinen analog sind. Solche Polypeptide sind hierin als aquatische PVCR-Analoga (beispielsweise Homologe) oder Derivate definiert. Analoge Aminosäuresequenzen sind hierin so definiert, dass die Aminosäuresequenzen mit ausreichender Identität mit einer aquatischen PVCR-Aminosäuresequenz aufweisen, dass sie die biologische Aktivität einer aquatischen PVCR besitzen. Beispielsweise kann ein analoges Polypeptid mit „stillen" Veränderungen in der Aminosäuresequenz erzeugt werden, wobei ein oder mehrere Aminosäurereste sich von den Aminosäureresten des aquatischen PVCR-Proteins unterscheiden und noch die biologische Aktivität von aquatischen PVCR besitzen. Beispiele für solche Unterschiede schließen Additionen, Deletionen oder Substitutionen von Resten der Aminosäuresequenz von aquatischem PVCR ein. Ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfasst sind analoge Polypeptide, die eine größere oder geringere biologische Aktivität der aquatischen PVCR-Proteine der vorliegenden Erfindung zeigen.
Die „biologische Aktivität" von aquatischen PVCR-Proteinen ist hierin so definiert, dass sie die osmoregulatorische Aktivität von aquatischen PVCRs bedeutet. Säugetier-PVCR-Proteine haben sich als Vermittler von physiologischen Reaktionen gegenüber Veränderungen in der Körperosmolalität und im Salzgehalt in der Niere, Nebenschilddrüse, Calcitonin und Gehirnzellen gezeigt (Brown, E. M. et al., New Eng. J. Med., 333: 243 (1995); Riccardi, D. J. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 92: 131–135 (1995); Sands, J. M. et al., Nature (Medicine) (1995); Brown, E. M. et al., New England J. of Med., 333: 234–240 (1995)). Es ist vernünftig anzunehmen, dass aquatische PVCR-Proteine identische oder ähnliche osmoregulatorische Aktivitäten wie die kürzlich identifizierten Säugetier-CaR-Proteine in Fisch-Nieren-, -Kiemen, -Blase, -Dünndarm, -Rektaldrüse und -Gehirnzellen besitzen wird. Assaytechniken zum Evaluieren der biologischen Aktivität von aquatischen PVCR-Proteinen und ihren Analoga sind in Brown, E. M. et al., New Eng. J. Med., 333: 243 (1995); Riccardi, D. J. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 92: 131–135 (1995); Sands, J. M. et al., Nature (Medicine) (1995); Brown, E. M. et al., New England J. of Med., 333: 234–240 (1995) beschrieben. Zusätzliche Assays zum Evaluieren der biologischen Aktivität von PVCR-Proteinen sind in der US-Serien-Nr. 60/003697 beschrieben.
Die „biologische Aktivität" von aquatischem PVCR ist ebenfalls hierin so definiert, dass sie die Fähigkeit des aquatischen PVCR meint, die Signalübertragungswege in speziellen Zellen von Meeresarten zu modulieren. In Säugetieren haben Studien in normalem Gewebe, in Eizellen unter Verwendung von rekombinant exprimierten CaR und in kultivierten Zellen demonstriert, dass Säugetier-CaR-Protein dazu in der Lage ist, mit zumindest zwei unterschiedlichen Arten von GTP-bindenden (G) Proteinen zu komplexieren, die die Aktivierung von CaR durch eine Zunahme von extrazellulärem Calcium auf verschiedene intrazelluläre Signaltransduktionswege übermitteln. Ein Weg besteht aus einer Säugetier-CaR-Kopplung mit einem inhibitorischen Gi-Protein, das wiederum mit Adenylatcyclase koppelt, um intrazelluläre cAMP-Konzentrationen zu reduzieren. Ein zweiter getrennter Weg besteht aus der CaR-Kopplung an stimulatorische Gq/Gα11 G-Protein, das mit Phospholipase C koppelt, um Inositol-1,4,5-triphosphat zu erzeugen, das wiederum sowohl Proteinkinase-C-Aktivität sti muliert als auch intrazelluläre Ca²⁺-Konzentrationen erhöht. Somit modulieren biologisch aktive Säugetier-CaRs zelluläre Funktionen, abhängig von der Verteilung und Art verschiedener Signaltransduktionswegs-Proteine, die in den Zellen exprimiert werden, in einer entweder inhibitorischen oder stimulatorischen Art und Weise. Es ist vernünftig anzunehmen, dass biologisch aktives Meeres-PVCR eine ähnliche Signaltransduktionsaktivität besitzt.
Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls biologisch aktive Polypeptidfragmente der aquatischen PVCR-Proteine, die hierin beschrieben sind. Solche Fragmente können nur einen Teil der Volle-Länge-Aminosäure einer Meeres-PVCR einschließen, die noch eine osmoregulatorische Aktivität besitzen. Beispielsweise können Polypeptidfragmente, die Deletionsmutanten der aquatischen PVCR-Proteine umfassen, entwickelt und durch wohl bekannte Laborverfahren exprimiert werden. Solche Polypeptidfragmente können bezüglich ihrer biologischen Aktivität wie hierin beschrieben evaluiert werden.
Antikörper können gegen die aquatischen PVCR-Proteine und Analoga unter Verwendung von Techniken gezüchtet werden, die dem Fachmann auf dem Gebiet wohl bekannt sind. Diese Antikörper können polyklonal, monoklonal oder chimer sein, oder Fragmente hiervon können zur Immunaffinitätsaufreinigung oder zum Identifizieren von aquatischen PVCR-Proteinen, die in einem Gemisch von Proteinen enthalten sind, unter Techniken verwendet werden, die dem Fachmann auf dem Gebiet wohl bekannt sind. Diese Antikörper oder Antikörperfragmente können dazu verwendet werden, das Vorhandensein von aquatischen PVCR-Proteinen und von Homologen in anderen Geweben unter Verwendung von Standardimmunchemie-Verfahren nachzuweisen.
Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls isolierte Nucleinsäuresequenzen, die die hierin beschriebenen aquatischen PVCR-Proteine codieren, und Fragmente von Nucleinsäuresequenzen, die biologisch aktive PVCR-Protein codieren. Fragmente der Nucleinsäuresequenzen, die hierin beschrieben sind, sind als Sonden von Nutzen, um das Vorhandensein von Meeresarten-CaR nachzuweisen. Insbesondere sind für die vorliegende Erfindung DNA/RNA-Sequenzen bereitgestellt, die aquatische PVCR-Proteine codieren, die voll komplementären Stränge dieser Sequenzen und Allel-Variationen hiervon. Ebenfalls von der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sind Nucleinsäuresequenzen, DNA oder RNA, die im Wesentlichen zu den DNA-Sequenzen, die aquatische PVCR codieren, komplementär sind, und die insbesondere mit den aquatischen PVCR-DNA-Sequenzen unter Bedingungen einer Stringenz hybridisieren, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, wobei solche Bedingungen dazu ausreichend sind, DNA-Sequenzen mit einer beträchtlichen Nucleinsäureidentität zu identifizieren. Wie hierin definiert, bedeutet im Wesentlichen komplementär, dass die Sequenz nicht die exakte Sequenz einer aquatischen PVCR-DNA widerspiegeln muss, jedoch in ihrer Identität mit dieser Sequenz so ausreichend ähnlich sein muss, dass sie mit aquatischer PVCR-DNA unter stringenten Bedingungen hybridisiert. Stringenzbedingungen sind beispielsweise in Ausebel, F. M., et al., Current Protocols in Molecular Biology, (Current Protocols, 1994) beschrieben. Beispielsweise können nicht-komplementäre Basen in der Sequenz miteingefügt sein, oder die Sequenzen können länger oder kürzer als aquatische PVCR-DNA sein, vorausgesetzt, dass die Sequenz eine ausreichende Anzahl von Basen aufweist, die mit aquatischer PVCR komplementär sind, um damit zu hybridisieren. Beispielhafte Hybridisierungsbedingungen sind hierin beschrieben und in Brown, E. M., et al., Nature, 366: 575 (1993). Beispielsweise können Bedingungen, wie beispielsweise 1 × SSC 0,1% SDS, 50°C oder 0,5 × SSC, 0,1% SDS, 50°C wie in den Beispielen 2 und 3 beschrieben verwendet werden.
Die aquatische PVCR-DNA-Sequenz oder ein Fragment hiervon kann als Sonde verwendet werden, um zusätzliche aquatische PVCR-Homologe zu isolieren. Beispielsweise kann eine cDNA oder genomische DNA-Bibliothek aus dem geeigneten Organismus mit markierter aquatischer PVCR-DNA gescreent werden, um homologe Gene zu identifizieren, wie beispielsweise in Ausebel, F. M., et al., Current Protocols in Molecular Biology, (Current Protocols, 1994) beschrieben ist.
Typischerweise umfasst die Nucleinsäure-Sonde eine Nucleinsäuresequenz (beispielsweise SEQ ID NO: 1) und weist eine ausreichende Länge und Komplementarität auf, um spezifisch an Nucleinsäuresequenzen zu hybridisieren, die PVCR von aquatischer Spezies codieren. Die Erfordernisse einer ausreichenden Länge und Komplementarität können einfach durch den Fachmann auf dem Gebiet bestimmt werden.
Wie in Beispiel 4 beschrieben, wird demonstriert, dass das aquatische PVCR-Protein eine entscheidende Rolle in der Anpassung von Euryhalin-Fisch an Umgebungen mit verschiedenem Salzgehalt spielt. Die Anpassung des Killifisches, Fundulus heteroculitus, an Süßwasser hatte eine Steady-State-Expression von aquatischer PVCR-mRNA in verschiedenen Geweben zur Folge.
Es wird hierin ebenfalls demonstriert, dass PVCR-Protein eine Umlagerung innerhalb von Epithelzellen der Harnblase in der Flunder durchmacht, die an Brackwasser angepasst ist, im Vergleich zu voll konzentriertem Meereswasser. Dies korreliert direkt mit Veränderungen der Rate des NaCl-Transportes durch diese Zellen.
Die Winterflunder wurde zu einem Leben in 1/10tel Salzwasser (100 mOsm/kg) durch Reduktion der Salinität von 450 mM NaCl zu 45 mM NaCl über ein Intervall von 8 Stunden angepasst. Nach einem zehntägigen Intervall wurde dieser Fisch mit normalen Nahrungsmitteln gefüttert, die Verteilung des PVCR in ihren Harnblasenepithelzellen wurde unter Verwendung von Immuncytochemie überprüft. Eine PVCR-Immunfärbung wird reduziert und in erster Linie an der Apikalmembran von Epithelzellen in der Harnblase lokalisiert. Im Gegensatz hierzu ist die Verteilung von PVCR in Epithelzellen, die die Harnblase von Kontrollflundern auskleiden, die kontinuierlich gegenüber Meereswasser mit voller Stärke exponiert wurden, reichlich vorhanden und liegt sowohl in den Apikalmembranen als auch in punktierten Regionen in der gesamten Zelle vorhanden. Diese Daten sind mit früheren Northern-Daten konsistent, weil mehr PVCR-Protein in der Harnblase von Salzwasserfischen gegenüber Fischen vorliegt, die an Brackwasser angepasst sind. Diese Daten legen nahe, dass PVCR-Protein in Vesikeln in Epithelzellen der Harnblase vorliegen kann und dass in Reaktion auf Veränderungen des Salzgehaltens diese Vesikeln sich vom Zellcytoplasma zur apikalen Oberfläche dieser Epithelzellen bewegen. Weil diese selben Epithelzellen reichlich NaCl-Cotransporterprotein besitzen, das für die Wasserreabsorption in der Harnblase verantwortlich ist, legen diese Daten nahe, dass das PVCR-Protein den NaCl-Transport in der Flunder-Harnblase moduliert, durch Veränderung des Verhältnisses von NaCl-Cotransporterprotein, das in der Apikalmembran vorliegt. Weil Harn Mg²⁺- und Ca²⁺-Konzentrationen sich erhöhen, wenn Fisch in voll konzentriertem Meereswasser vorliegt, verursacht die Aktivierung des apikalen PVCR-Proteins eine Endocytose und eine Entfernung des NaCl-Cotransporters aus der Apikalmembran und somit eine Reduktion des Harnblasen-Wassertransportes.
Als Ergebnis der hierin beschrieben Arbeit werden Verfahren bereitgestellt, die die Euryhalin-Adaption bzw. Anpassung von Fisch erleichtern und die Anpassung verbessern. Insbesondere sind nunmehr Verfahren verfügbar, um die Salztoleranz in Fischen durch Modulieren (oder Verändern) der Aktivität des aquatischen PVCR-Proteins, das in den Epithelzellen vorliegt, zu regulieren, das in den Ionentransport involviert ist, ebenso wie in Endokrin- und Nerven gewebe. Beispielsweise kann die Salztoleranz von Fisch, der an Süßwasser angepasst (oder akklimatisiert) ist, durch Aktivieren des aquatischen PVCR erhöht werden, beispielsweise durch Erhöhen der Expression von aquatischem PVCR in ausgewählten Epithelzellen, die die Sekretion von Ionen und die Salzwasseranpassung zur Folge hat. Dies würde insbesondere regulatorische Ereignisse miteinschließen, die die Umwandlung von Epithelzellen der Kiemen, des Dünndarms und der Niere kontrollieren. In der Niere wird die PVCR-Aktivierung die Excretion von zweiwertigen Metallionen, einschließlich von Ca²⁺ und Mg²⁺ durch Harntubuli erleichtern. In den Kiemen wird die PVCR-Aktivierung die Reabsorption von Ionen durch Kiemenzellen reduzieren, die in Süßwasser eintritt, und die Netto-Excretion von Ionen durch Kiemenepithelien fördern, die in Salzwasser eintritt. Im Dünndarm wird die PVCR-Aktivierung die Reabsorption von Wasser und Ionen durch den Gi-Trakt nach Aufnahme durch den Fisch ermöglichen.
Alternativ kann die Salztoleranz von an Salzwasser angepasstem Fisch durch Hemmen des aquatischen PVCR gesenkt werden, beispielsweise durch Senken der Expression der aquatischen PVCR in ausgewählten Epithelzellen, was Veränderungen in der Absorption von Ionen und der Frischwasseradaption zur Folge hat. Ausgewählte Epithelzellen schließen beispielsweise Nieren-, Blasen-, Dünndarm- und Kiemenzellen ein.
Das Vorhandensein von aquatischer PVCR in Gehirn spiegelt sowohl dessen Einbeziehung in die grundlegende Neurotransmitterfreisetzung über synaptische Vesikeln (Brown, E. M., et al., New England J. of Med., 333: 234–240 (1995)) ebenso wie dessen Aktivität zur Auslösung verschiedener hormoneller und Verhaltensänderungen wider, die zur Adaption entweder an Süßwasser- oder an Meeresumgebungen notwendig sind. Beispielsweise wird eine Zunahme der Wasseraufnahme durch die Fische nach Exposition gegenüber Salzwasser durch eine PVCR-Aktivierung in einer Art und Weise vermittelt, die derjenigen ähnlich ist, die für Menschen beschrieben wurde, wobei die PVCR-Aktivierung durch Hyperkalziämie im subfornikalen Organ des Gehirns eine Zunahme im Wassertrinkverhalten zur Folge hat (Brown, E. M. et al., New England J. of Med., 333: 234–240 (1995)). In Fischen werden Prozesse, die sowohl Veränderungen der Serumhormonkonzentrationen als auch Verhaltensänderungen mit sich bringen, werden durch das Gehirn vermittelt. Diese schließen die Reproduktion und das Laichen von euryhalinen Fischen in Süßwasser nach deren Migration aus Salzwasser ebenso wie den Nachweis der Salinität ihrer Umgebung für Zwecke des Fütterns, des Nistens, der Migration und des Laichens ein.
Kürzlich von Säugetieren bezogene Daten legen nunmehr nahe, dass die PVCR-Aktivierung eine entscheidende Rolle in der Koordinierung dieser Ereignisse spielt. Beispielsweise wurden Veränderungen im Plasmacortison als entscheidend für Veränderungen im Ionentransport bewiesen, der zur Adaption an Lachs-Smolts aus Süßwasser an Salzwasser notwendig sind (Veillette, P. A., et al., Gen. And comp. Physiol., 97: 250–258 (1995). Wie kürzlich in Menschen demonstriert, werden Plasma-adrenocorticotrophe Hormon(ACTH)-Konzentrationen, die die Plasmacortison-Konzentrationen regulieren, durch die PVCR-Aktivierung verändert.
Der Begriff „Aktivierung" wie hierin verwendet, bedeutet biologisch funktionell machen, beispielsweise einen Zelloberflächenrezeptor dazu fähig zu machen, einen Second-Messenger zu stimulieren, der die Modulation einer Ionensekretion zur Folge hat. Dies könnte in Form entweder einer Hemmung eines Signalweiterleitungs- bzw. Transduktionsweges, beispielsweise über ein Gi-Protein, oder über die Stimulation anderer Wege über beispielsweise ein Gq/Gα11-Protein erfolgen. Als Folge dieser Veränderungen wird der Ionentransport durch Epithelzellen reduziert oder stimuliert.
Beispielsweise kann eine Verbindung oder Substanz, die als Agonist mit dem aquatischen PVCR interagiert oder an diesen bindet, wodurch der aquatische PVCR aktiviert wird, eine Zunahme der Ionensekretionen ausgewählter Epithelzellen zur Folge haben. Ein Agonist kann jede Substanz oder Verbindung sein, die mit dem aquatisches PVCR interagiert oder an diesen bindet, was die Aktivierung des aquatichen PVCR zur Folge hat. Agonisten, die von der vorliegenden Erfindung umfasst sind, schließen anorganische Ionen, wie beispielsweise mehrwertige Kationen, Calcium, Magnesium oder Gandolinium ein, und organische Moleküle, wie beispielsweise Neomycin. Weitere Agonisten schließen anorganische Verbindungen, Nucleinsäuren oder Proteine ein, die unter Verwendung der hierin beschriebenen Techniken bestimmt werden können.
Agonisten, die ebenfalls von der vorliegenden Erfindung offenbart werden, können Proteine oder Peptide oder Antikörper einschließen, die an den aquatischen PVCR binden, was dessen Aktivierung zur Folge hat. Die Aktivierung des aquatischen PVCR ist typischerweise eine direkte Aktivierung. Beispielsweise bindet ein anorganisches Molekül oder Peptid direkt an das Rezeptorprotein, was die Aktivierung von aquatischem PVCR zur Folge hat. Jedoch kann die Aktivierung der aquatischen PVCR ebenfalls eine indirekte Aktivierung sein, beispielwei se wie sie eintreten würde, wenn beispielsweise ein Antikörper verfügbar ist, um einen aquatischen PVCR-Antagonisten zu binden und somit die Aktivierung des aquatischen PVCR ermöglicht.
Der Begriff „Deaktivierung" oder „Inaktivierung", wie hierin verwendet, bedeutet die vollständige Hemmung oder Abnahme der biologischen Funktion. Beispielsweise ist eine Deaktivierung vorhanden, wenn ein Zelloberflächenrezeptor nicht dazu in der Lage ist, einen Second-Messenger zu stimulieren. Insbesondere tritt, wie hierin verwendet, eine Deaktivierung des aquatischen PVCR auf, wenn der aquatische PVCR dazu unfähig gemacht wird, mit einem zweiten Messenger bzw. Second-Messenger zu koppeln oder diesen zu stimulieren, was die Absorption von Ionen in ausgewählten Epithelzellen zur Folge hat. Die Deaktivierung kann direkt oder indirekt erfolgen. Beispielsweise kann ein Antagonist direkt an den aquatischen PVCR binden oder mit diesem interagieren, wodurch der aquatische PVCR zur Stimulation eines Messenger- bzw. Botenstoff-Proteines unfähig gemacht wird. Alternativ kann die Deaktivierung indirekt sein. Beispielsweise kann ein Antagonist den aquatischen PVCR deaktivieren, indem ein Antagonist von einer Interaktion mit dem aquatischen PVCR gehemmt oder verhindert wird.
Beispielsweise kann ein Chelator Calciumionen binden und somit verhindern, dass Calciumionen an einen aquatischen PVCR binden.
Antagonisten des aquatischen PVCR können jede Substanz sein, die dazu in der Lage ist, direkt mit dem aquatischen PVCR zu interagieren oder zu binden oder an einen Agonisten des aquatischen PVCR zu binden oder mit diesem zu interagieren, was eine Deaktivierung des aquatischen PVCR zur Folge hat. Antagonisten, die von der vorliegenden Erfindung mitumfasst werden, schließen beispielsweise anorganische Moleküle, organische Moleküle, Proteine oder Peptide ein. Antagonisten können ebenfalls Nucleinsäuren, wie beispielsweise Anti-Sense-DNA- oder RNA-Sequenzen sein, die an die DNA binden, die den aquatischen PVCR bindet, wodurch die Transkription in mRNA verhindert oder gehemmt wird. Antagonisten können ebenfalls Anti-Sense-RNA sein, die an das PVCR-Transkript bindet, wodurch eine Translation verhindert oder gehemmt wird.
Kandidatensubstanzen (beispielsweise Verbindungen, Peptide oder Nucleinsäuren), die bezüglich ihrer Fähigkeit evaluiert werden sollen, die aquatische PVCR-Aktivität zu regulieren, können in Assaysystemen gescreent werden, um eine Aktivität zu bestimmen. Beispielsweise kann ein Assaysystem, das verwendet werden kann, das Frosch-Eizellsystem sein, das aquatischen PVCR exprimiert, wie in Brown, E. G., et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 92: 131–135 (1995) beschrieben ist.
Ein funktioneller Assay zum Screening nach Verbindungen, die die PVCR-vermittelte NaCl-Transportfunktion in adulten Flunder-Harnblasen verändern, können ebenfalls dazu verwendet werden, nach Kandidatenverbindungen bezüglich ihrer Fähigkeit zu screenen, aquatischen PVCR zu modulieren. Der Transport von NaCl über den Thiazid-empfindlichen NaCl-Cotransporter in der Flunder-Harnblase ist in seiner Anpassung an verschiedene Salinitäten von Bedeutung. Der NaCl-Transport wird in leichter Weise unter Verwendung einer isolierten Blasenzubereitung aus einer adulten Flunder und Messung des transepithelialen Ca²⁺-empfindlichen Kurzschluss-Stromes, wie in Gamba, G., et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 90-2749-2753 (1993)) beschrieben, quantifiziert. Die Verwendung dieses isolierten In-vitro-Assaysystems kann eine direkte Wirkung der aquatischen PVCR-Funktion oder des transepithelialen Transportes von Ionen etablieren, die für die Anpassung der Salinität von Bedeutung ist. Verbindungen, die unter Verwendung des Froscheizell-Assays und in vitro-NaCl-Transportassaysystems identifiziert werden, können weiterhin in Ganztier-Adaptionsexperimenten getestet werden.
Um beispielsweise nach PVCR-reaktiven Verbindungen (sowohl Agonisten als auch Antagonisten) zu screenen, wurde ein Assay, der früher zur Untersuchung von Ionen- und Wassertransport in isolieren Flunder-Harnblasen verwendet wurde (Renfro, L. J., Am. J. Physiol. 228: 52–61, 1975) verwendet. Wie hierin beschrieben (Beispiel 5) wurde dieser Assay nunmehr so angepasst, dass nach PVCR-Agonisten gescreent wird und Daten bereitgestellt werden, die zeigen, dass die Wasserreabsorption um > 85% durch Anwendung von Thiazid gehemmt wird (spezifischer Inhibitor des Thiazid-empfindlichen NaCl-Cotransporters); die Wasserreabsorption um > 90% gehemmt wird durch Verabreichung bzw. Anwendung von Gandolinium (ein PVCR-spezifischer Agonist); die Wasserreabsorption um > 50% gehemmt wird durch Verabreichung von Neomycin (ein PVCR-spezifischer Agonist); und die Exposition der Blase gegenüber PVCR-Antagonisten nach Entfernung von entweder Gandolinium oder Neomycin umkehrbar ist.
Als weiteres Resultat dieser Arbeit sind Verfahren offenbart, um die Funktion von PVCR in sich entwickelnden Fischen zu testen und spezifisch nach Fischen zu selektieren, die eine veränderte PVCR-Funktions- und osmotische Toleranz aufweisen. Die entwicklungsbedingte Expression von PVCR in sich entwickelnden Embryonen, Larven und Metamorphosen-Formen von Fischen kann unter Verwendung von Antikörpern bestimmt werden, die aquatischen PVCT und/oder Säugetier-CaR erkennen können, oder durch Verwendung von aquatischen und/oder Säugetier-cDNA-Sonden oder eine Kombination dieser Techniken. Ein initiales Screenen von Gameten, Larven und Metamorphose-Formen von Fischen kann unter Verwendung einer Immunhistochemie getestet werden, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist, um zu bestimmen, in welchem Stadium der Entwicklung das PVCR-Protein im sich entwickelnden Fisch exprimiert wird.
Auf Grundlage der Immunchemie-Studien der aquatischen PVCR-Struktur, Funktion und Entwicklungs-Expression können spezifische Selektionsassays entwickelt werden, um Fische zu identifizieren, beispielsweise Flunder, Heilbutt oder Kabeljau, die eine veränderte aquatische PVCR-Funktion aufweisen, die in Süßwasser überleben können, während solche, die eine normale PVCR-Funktion aufweisen, sterben werden. Diese akuten Überlebensassays können die Gesamtwirkung von PVCR-Agonisten und -Antagonisten evaluieren, die beispielsweise durch den Froscheizell-Expressionsassay identifiziert wurden. Diese Assays werden die Potenz bzw. die Wirkstärke verschiedener PVCR-aktiver Verbindungen bezüglich einer Verbesserung oder Reduzierung des Überlebens von verschiedenen Fischen oder Embryonen testen. Die Fähigkeit, einen einzelnen individuellen Fisch mit Veränderungen in der PVCR-Funktion und Osmoregulation aus vielen Wildtypfischen zu identifizieren, die normale Eigenschaften aufweisen, ermöglicht die Vermehrung von spezifischen Stämmen von Fischen, die spezielle Salztoleranzeigenschaften zeigen. Die Entwicklung von Larvenformen von Kabeljau, Heilbutt oder Flundern, die in Frischwasser überleben können, kann dann in Experimenten dazu verwendet werden, zu testen, ob neue Nahrungsmittelquellen in ihrer Aufzucht verwendet werden können. Die erfolgreiche Entwicklung dieser Ziele würde dann diesen Arten ermöglichen, anfänglich in geschützten Süßwasserbrutplätzen gezüchtet zu werden und später zu Meeresbedingungen übertragen zu werden, die denjenigen ähnlich sind, die gegenwärtig für die Aquakultur von Lachs verwendet werden.
Ebenfalls von der vorliegenden Erfindung offenbart sind Verfahren zum Modulieren der Aktivierung des aquatischen PVCR durch Verändern der DNA, die den aquatischen PVCR co diert, und somit durch Verändern der anschließenden Expression von aquatischem PVCR-Protein in verschiedenen Geweben. Beispielsweise können Anti-Sense-Nucleinsäuresequenzen (entweder DNA oder RNA) entweder in beispielsweise Epithelzellen in Fischnieren, wo die Anti-Sense-Sequenz an das aquatische PVCR-Gen bindet und dieses hemmt, eingebracht werden oder im Wesentlichen seine Transkription in mRNA senken. Alternativ kann die Anti-Sense-Sequenz an aquatische PVCR-mRNA binden und hemmen oder im Wesentlichen ihre Translation in die Aminosäuresequenz senken.
Alternativ kann ein mutiertes oder chimeres aquatisches PVCR-Genkonstrukt (beispielsweise eine mutierte oder chimere SEQ ID NO: 1) in beispielsweise Fischeier eingefügt werden, um neue Meeresstämme mit verbesserten oder gesenkten aquatischen PVCR-Proteinaktivitäten zu produzieren. Die Anti-Sense-Sequenz oder das Genkonstrukt wird in die Zellen unter Verwendung von Techniken eingebracht, die dem Fachmann auf dem Gebiet wohl bekannt sind. Solche Techniken sind in Hew, C. L., et al., Mol. Aquatic Biol. Biotech., 1: 3807–17 (1992) und Du, S. J., et al., Biotechnology, 10: 176–181 (1992) beschrieben, deren Lehren hierin durch Bezugnahme mitaufgenommen sind.
Auf Grundlage der hierin beschriebenen Arbeiten sind nunmehr neue Methodologien, die die Anpassung von Fischen, insbesondere Flunder, Heilbutt, und Kabeljau an Umgebungen mit variierenden Salzgehalten regulieren, nunmehr verfügbar. Beispielsweise sind nunmehr Verfahren verfügbar, um sich entwickelnde Formen von Flundern, Heilbutt oder Kabeljau an Frischwasserumgebungen anzupassen. Eine Aufzucht dieser Spezies in Süßwasser ermöglicht neue Ansätze bezüglich der Probleme des Fütterns und der erfolgreichen Aufzucht von Larvenformen dieser Fischspezies. Es sind ebenfalls Verfahren nunmehr zur Selektion und Vermehrung neuer Stämme von Fischen (beispielsweise Flunder, Heilbutt und Kabeljau) verfügbar, die Veränderungen in der Salztoleranz besitzen, derart, dass sie in Süßwasser gezüchtet werden können, danach auf Salzwasser übertragen werden. Dieser Ansatz weist viele Vorteile auf, weil er sowohl die Aquakulturindustrie verändern wird als auch die Verwendung existierender Brutstätten und Einrichtungen zur Erzeugung von Flundern, Kabeljau oder Heilbutt ebenso wie Lachs ermöglichen wird.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele veranschaulicht, die jedoch keinesfalls als einschränkend betrachtet werden sollten.
Beispiel 1: Immunhistochemie des PVCR-Proteins, das in Epithelzellen von aquatischen Arten vorliegt
Gewebe von Fischen wurden durch Perfusion mit 2% Paraformaldehyd in einer geeigneten Ringer'schen Lösung fixiert, entsprechend der Osmolalität der Fische nach Anästhesieren des Tieres mit MS-222. Die Gewebsproben wurden dann durch Schnitt gewonnen, durch Eintauchen in 2% Paraformaldehyd fixiert, in Ringer'scher Lösung gewaschen und danach in eine Einbettungsverbindung, beispielsweise O.C.T.^TM Miles, Inc. Elkahart, Indiana, eingefroren, unter Verwendung von Methylbutan, das mit flüssigem Stickstoff gekühlt war. Nach Schneiden in 4 μm Gewebsschnitte mit einem Cryostat wurden individuelle Schnitte verschiedenen Färbevorschriften unterworfen. Kurz gesagt, waren die Schnitte, die auf Glasobjektträgern befestigt wurden, die folgenden:
1) blockiert mit Serum, gewonnen aus der Fischart, 2) inkubiert mit Kaninchen-Anti-CaR-Antiserum und 3) gewaschen und inkubiert mit Peroxidase-konjugiertem affinitätsaufgereinigtem Ziegen-anti-Kaninchen-Antiserum. Die Orte des gebundenen Peroxidase-konjugierten Ziegen-anti-Kaninchen-Antiserums wurden durch Entwicklung eines rosafarbenen Aminoethylcarbazol-Reaktionsproduktes visualisiert. Einzelne Schnitte wurden befestigt, angesehen und durch Standard-Lichtmikroskopietechniken photographiert. Das Anti-CaR-Antiserum, das zum Nachweisen von Fisch-PVCR-Protein verwendet wurde, wurde in Kaninchen unter Verwendung eines 23mer-Peptids gezüchtet, das den Aminosäure-Nummern 214 bis 237 entsprach, lokalisiert in der extrazellulären Domäne des RaKCaR-Proteins.
In beiden Spezies der Elasmobranchier, die untersucht wurden (Dornhai, Squatus acanthias und kleiner Rochen, Raja Erinacea), war das PVCR-Protein an den Apikalmembranen ausgewählter Epithelzellen lokalisiert. Die Verteilung von PVCR im Elasmobranchier-Gewebe ist in den 1A–F dargestellt. Eine dunkelschwarze Färbung ist zu sehen, wenn eine Anti-CaR-Antikörperbindung konsistent in Gewebsflächen vorhanden ist, die durch Pfeilspitzen bezeichnet sind. 1A: Nieren-PVCR-Expression liegt auf Apikalmembranen von Epithelzellen des späten distalen Tubulus (LDT) und der Sammelleitung (CD) vor. 1B: Die Kiemen-PVCR-Expression ist auf den Epithelzellen von Kiemenarkaden lokalisiert. 1C: Die Gehirn-PVCR-Expression ist in unterschiedlichen Gruppen von Neuronen im Gehirn lokalisiert. 1D: Rektaldrüsen-PVCR-Expression ist in den Apikalmembranen von Zellen lokalisiert, die die Leitungen der Rektaldrüse auskleiden. 1E: Die Dünndarm-PVCR-Expression ist an den Apikalmembranen von Epithelzellen lokalisiert, die die Lumina des Darmes auskleiden. 1F: Die ovariale PVCR-Expression ist sowohl in Eizellen als auch den umgebenden follikulären Zellen vorhanden.
Die 2A–F zeigen die Verteilung von PVCR in der Flunder (Pseudopleuronectes americanus) und in der Süßwasserforelle (Onchorhynchus nerka). Die 2A–F zeigen eine dunkelschwarze Färbung, wobei Anti-CaR-Antikörperbindung konsistent in den Gewebsflächen vorhanden ist, die durch Pfeilspitzen gekennzeichnet sind. 2A: Die Nieren-PVCR-Expression ist auf Apikalmembranen von Epithelzellen der großen Tubuli (LT) und der Sammelröhren bzw. Leitungen (CD) vorhanden. 2B: Die Kiemen-PVCR-Expression ist auf Epithelzellen von Kiemenarkaden lokalisiert. 2C: Die Gehirn-PVCR-Expression ist in unterschiedlichen Gruppen von Neuronen im Gehirn lokalisiert. 2D: Die Harnblasen-PVCR-Expression ist auf Apikalmembranen von Zellen lokalisiert, die die Harnblase auskleiden. 2E: Die Darm-PVCR-Expression ist auf den Apikalmembranen von Epithelzellen lokalisiert, die die Lumina des Darmes auskleiden. 2F: Die ovariale PVCR-Expression ist sowohl in Eizellen als auch in den umgebenden follikularen Zellen vorhanden.
Beispiel 2: RNA-Blottinganalysen von Winterflunder-Gewebe
5 Mikrogramm Proben von PolyA + RNA, hergestellt aus verschiedenen Winterflunder-Geweben, einschließlich Muskel (Bahn 1), Herz (Bahn 2), Hoden (Bahn 3) und Harnblase (Bahn 4) wurden RNA-Blottinganalysen unterworfen (3A und B).
Wie in 3A dargestellt, wurde ein einziger Filter zunächst unter Verwendung eines ³²p-markierten ECO R1/XHO1 5'-Fragmentes von Rattennieren-PVCR-cDNA (Brown, E. M., et al., Nature, 366: 575 (1993)) hybridisiert, bei reduzierter Stringenz gewaschen (1 × SSC, 0,1% SDS, 50°C) und für 10 Tage einer Autoradiographie ausgesetzt.
Wie in 3B dargestellt, wurde derselbe, in 3A dargestellte Filter nach Abziehen und Hybridisierung mit einer ³²p-markierten Volle-Länge-3,8 kb-TSC-cDNA, die bei 0,5 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C gewaschen wurde, einer einstündigen Autoradiogramm-Exposition unterworfen. Die gezeigten Daten sind für insgesamt 5 getrennte Experimente repräsentativ.
Diese Daten zeigen das Vorhandensein eines 4,4 kb Homologs von Säugetier-CaR, das in PolyA + RNA von Harnblase zusammen mit reichlich 3,8 kb Thiazid-empfindlichem NaCl- Cotransportertranskript vorliegen und legen nahe, dass keine PVCR-Transkripte in anderen Geweben vorhanden sind, einschließlich Muskel, Herz oder Testes.
Beispiel 3: Molekulare Klonierung von Hai-Nieren-Calciumrezeptor-verwandtem Protein (SKCaR-RP)
Eine Hai-XZAP-cDNA-Bibliothek wurde unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Standardreagenzien mit cDNA hergestellt, die aus PolyA + RNA synthetisiert wurde, isoliert aus Hai-Nierengewebe, wie in Siner et al., Am. J. Physiol. 270: C372–C381, 1996 beschrieben und veröffentlicht. Die Hai-cDNA-Bibliothek wurde ausplattiert, und die sich ergebenden Phagen-Plaques wurden unter Verwendung einer ³²p-markierten Volle-Länge-Rattennieren-CaR (RaKCaR) cDNA-Sonde unter Mittelstringenz-Bedingungen gescreent (0,5 × SSC, 0,1% SDS, 50°C). Individuelle positive Plaques wurden durch Autoradiographie identifiziert, isoliert und unter Verwendung einer Phagemid-Infektion zur Übertragung von cDNA an den KS-Bluescript-Vektor wiederhergestellt. Die vollständige Nucleotidsequenz, 4 (SEQ ID NO: 1) des 4,1 kb Hainieren-PVCR-verwandten Proteins (SKCaR-RP) Klons wurde unter Verwendung von kommerziell erhältlichen automatisierten Sequenzierungs-Dienstleistungen gewonnen, die eine Nucleotidsequenzierung unter Verwendung der Didesoxyketten-Terminationstechnik durchführt. Die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 2) ist in 5 dargestellt. Northern-Analysen wurden wie in Sinner et al., am. J. Physiol. 270: C372–C381, 1996 beschrieben durchgeführt. Die SKCaR-RP-Nucleotidsequenz wurde mit anderen CaRs unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Nucleotid- und Proteindatenbankdiensten einschließlich GENBANK und SWISS PIR verglichen.
Eine Amplifikation durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) von ausgewählten cDNA-Sequenzen, die durch reverse Transkriptase (RT) synthetisiert wurden, wurde unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen RT-PCR-Kits von Promega Biotech, Madison, WI, durchgeführt. Eine selektive Amplifikation einer konservierten Region von CaRs (Nucleotide 597–981 der RaKCaR cDNA) hat 384 nt cDNA zur Folge, wie in 7 dargestellt. Diese amplifizierte 384 bp wurden dann in den TA-Klonierungsvektor (Promega Biotech, Madison, WI) ligiert, der dann zu kompetenten DH5α E. coli-Zellen unter Verwendung von Standardtechniken transformiert wurde. Nach Aufreinigung der Plasmid-DNA unter Verwendung von Standardtechniken wurde die 384 nt cDNA wie oben beschrieben sequenziert.
Beispiel 4: PVCR-Expression in Geweben von Fundulus heteroclitus
Um zu bestimmen, ob die PVCR-Expression durch Adaption von Fundulus entweder an Süß- oder Salzwasser moduliert wurde, wurde in einer Flussmündung gesammelter Killifisch zunächst für ein Intervall von 18 Tagen Süß- oder Salzwasser-adaptiert (chronische Adaption). Ausgewählte Individuen aus jeder Gruppe wurden danach der entsprechenden Salinität angepasst (Süß zu Salz; Salz zu Süß) für ein Intervall von 7 Tagen (akute Anpassung).
Die Ergebnisse sind in 8 dargestellt. Ein Blot, der RNA (40 μg/Bahn) enthält, hergestellt aus Kontroll-Xenopus-Nieren (Bahn 1) oder Fundulus-Herz (das ultimobranchiales Gewebe enthält) (Bahnen 2, 5), Nieren (Bahn 3, 6) und Kiemen (Bahn 4, 7) wurden mit einer ³²p-markierten Xenopus-PVCR-cDNA sondiert, gewaschen (0,01 × SSC, 65°C) und einer Autoradiographie unterworfen. Wie in 8 dargestellt ist, sind im Vergleich zur Kontroll-mRNA (Bahn 1) die Steady-State-Konzentrationen von PVCR-mRNA in Geweben aus Meerwasser angepasstem Fisch (Bahnen 5 bis 7) gegenüber solchen in Süßwasser (Bahnen 2 bis 4) größer.
Fundulus-Fisch wurde entweder chronisch (9A oder 9B) oder akut (9C und 9D) an Salzwasser (9A und 9C) oder Süßwasser (9B und 9D) angepasst.
Das Vorhandensein von PVCR in Nierentubuli wurde durch Immuncytochemie bestimmt. Die chronische Anpassung an Salzwasser (9A) hatte eine erhöhte PVCR-Expression in Nierentubuli im Vergleich zu derjenigen zur Folge, die in Süßwasser vorlag (9B). Die Nierentubuli-PVCR-Expression in Salzwasserfischen wurde durch akute Anpassung an Süßwasser verringert (9C). Im Gegensatz hierzu war die Nierentubulus-PVCR-Expression in Süßwasserfisch nach akuter Adaption an Salzwasser (9D) erhöht.
Beispiel 5: Assay nach PVCR-Agonisten und Antagonisten unter Verwendung der Flunder-Harnblase
Um einen weiteren Beweis bereitzustellen, der die aquatischen PVCRs mit der Fisch-Osmoregulation in Verbindung bringt, wurden isolierte Harnblasen von Winterflundern zur Untersuchung verwendet, ob PVCRs den Ionentransport in Epithelzellen modulieren. Frühere Arbeiten haben demonstriert, dass die Flunder-Harnblase in der Osmoregulation von Bedeu tung ist, weil sie die Wiedergewinnung sowohl von NaCl als auch Wasser über einen Thiazid-empfindlichen NaCl-Cotransport-Prozess ermöglicht, der zuerst durch den proximalen Tubulus der Niere erzeugt wurde. Die Wasserreabsorption aus Urin, der in der Harnblase aufbewahrt wird, ermöglicht Konzentrationen von sowohl Mg²⁺ als auch Ca²⁺ auf Werte von 84 mM bzw. 7 mM in Meeresflundern anzusteigen (Elger, E. B., et al., J. Comp. Physiol., B157: 21 (1987)).
Die apikale zu basolaterale Nettowasserströmung (Jv) wurde gravimetrisch in 10-minütigen Intervallen unter Verwendung von individuellen Harnblasen gemessen, die aus der Winterflunder ausgeschnitten wurden. Kurz gesagt, wurden isolierte Blasen in einer flüssigen Lösung suspendiert (typischerweise eine physiologisch kompatible Lösung), wie in (Renfro, L. J., Am. J. Physiol. 228: 52–61, 1975) beschrieben, deren Lehren hierdurch durch Bezugnahme mitaufgenommen sind. Das Gewicht der Blase wurde vor und nach der experimentellen Periode gemessen, wobei die experimentelle Periode die Zeitspanne umfasste, in der die isolierte Blase gegenüber der Testverbindung exponiert wurde. Die zu testende Verbindung (beispielsweise Testverbindung) wurde sowohl serosalen als auch mucosalen Lösungen zugesetzt. Die Blasen wurden getrocknet und wie in Renfro et al. beschrieben gewogen. Der Unterschied des Blasengewichtes vor und nach der Exposition gegenüber der Testverbindung ist ein Hinweis auf die Wasserreabsorption durch die Blase.
Die Quantifizierung der Wasserreabsorpton (Jv) durch isolierte Blasen unter Verwendung des Verfahrens von Renfro et al. zeigte, dass Jv signifikant (p < 0,05) durch Zusatz von 100 μm Hydrochlorothiazid (86 ± 2%) hemmte, was mit der Rolle des Thiazid-empfindlichen NaCl-Cotransporters in diesem Prozess übereinstimmt. Die Harnblasen-Jv war ebenfalls signifikant durch PVCR-Agonisten gehemmt, einschließlich 100 μm Gd³⁺ (75 ± 5%) und 200 μm Neomycin (52 ± 4%). (Kontroll-Jv-Werte (130 ± 28 μl/g/h) wurden von Tieren September bis Oktober gewonnen und sind ungefähr 21% des Jv, der von Renfro et al. berichtet wurde. Diese Unterschiede spiegeln wahrscheinlich jahreszeitliche Veränderungen des Harnblasentransportes wider. Die halbmaximale Hemmkonzentration für die Harnblasen-Jv (IC₅₀) für Gd³+ (15 μm) war derjenigen ähnlich, die für Säugetier-CaRs berichtet wurde, während der IC₅₀ für Neomycin (150 μm) ungefähr dreimal größer war im Vergleich zu Säugetier-CaRs (50 μm). Diese inhibitorische Wirkung von PVCR-Agonisten auf Jv war voll umkehrbar. Die Aktivierung von apikalen PVCRs durch hohe Konzentrationen an Mg²⁺ und Ca²⁺, die sich aus einer NaCl-vermittelten Wasserreabsorption aus Blasenurin ergab, würde optimale Wiedergewin nung von Wasser durch die Harnblase bereitstellen. Dieser Mechanismus würde das Fortschreiten der Reabsorption von Wasser ermöglichen, bis die Konzentrationen von zweiwertigen Kationen sich Konzentrationen annähern, die eine Kristallbildung fördern. Dieser Gesamtprozess ist demjenigen ähnlich, der für Säugetier-CaRs in Ratten und humanem IMCD beschrieben wurde. Zusätzliche Aspekte dieser Säugetier- und Knochenfisch-Nierenepithelien können ebenfalls weitere Ähnlichkeiten miteinander teilen, weil die Harnblase von Knochenfischen sowohl anatomisch als auch funktionell der Säugetier-Urniere homolog ist.
Sequenzprotokoll

Claims

Isolierte Nukleinsäuresequenz, die einen ein mehrwertiges Kation wahrnehmenden Rezeptor kodiert, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure Folgendes umfasst: (a) SEQ ID NO: 1, (b) das Komplement von SEQ ID NO: 1, (c) die kodierende Region von SEQ ID NO: 1, (d) ein Fragment von SEQ ID NO: 1 oder (e) eine Sequenz, die unter hoch stringenten Bedingungen von 0,5 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C (beispielsweise Waschbedingungen) an SEQ ID NO: 1, die kodierende Region von SEQ ID NO: 1 oder ihren komplementären Strang hybridisiert; wobei die Nukleinsäuresequenz ein Polypeptid oder ein biologisch aktives Fragment kodiert, das durch Wahrnehmung der Konzentrationen des mehrwertigen Kations eine osmoregulatorische Aktivität in Fisch, Crustaceen oder Mollusken aufweist, einschließlich einer oder mehrerer der folgenden Funktionen: (i) Wahrnehmung der Kationenkonzentrationen im Serum oder im umgebenden Milieu; (ii) Anpassen an die sich verändernden Kationenkonzentrationen im Serum oder im umgebenden Milieu; oder (iii) Veränderung der Wasseraufnahme, Wasserabsorption oder des Urin Outputs.
Isolierte Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1, die (a) SEQ ID NO: 1, (b) das Komplement von SEQ ID NO: 1, (c) die kodierende Region von SEQ ID NO: 1 oder (d) ein Fragment von SEQ ID NO: 1 umfasst.
Isolierte Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1, die unter hoch stringenten Bedingungen von 0,5 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C (beispielsweise Waschbedingungen) an SEQ ID NO: 1, die kodierende Region von SEQ ID NO: 1 oder dessen komplementären Strang hybridisiert.
Sonde, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die einen ein mehrwertiges Kation wahrnehmenden Rezeptor kodiert, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure Folgendes umfasst: (a) SEQ ID NO: 1, (b) ein Fragment von SEQ ID NO: 1, (c) die kodierende Region von SEQ ID NO: 1, (d) eine Sequenz, die zu SEQ ID NO: 1 komplementär ist oder (e) eine Sequenz, die unter hoch stringenten Bedingungen von 0,5 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C (beispielsweise Waschbedingungen) an SEQ ID NO: 1, ihren komplementären Strang, die kodierende Region von SEQ ID NO: 1 oder ihren komplementären Strang hybridisiert; wobei die Nukleinsäuresequenz ein Polypeptid kodiert, das durch Wahrnehmung der Konzentrationen des mehrwertigen Kations eine osmoregulatorische Aktivität in Fisch, Crustaceen oder Mollusken aufweist, einschließlich einer oder mehrerer der folgenden Funktionen: (i) Wahrnehmung der Kationenkonzentrationen im Serum oder im umgebenden Milieu; (ii) Anpassen an die sich verändernden Kationenkonzentrationen im Serum oder im umgebenden Milieu; oder (iii) Veränderung der Wasseraufnahme, Wasserabsorption oder des Urin Outputs.
Sonde nach Anspruch 4, die eine Nukleinsäuresonde ist, die (a) SEQ ID NO: 1, (b) ein Fragment von SEQ ID NO: 1, (e) die kodierende Region von SEQ ID NO: 1, (d) eine Sequenz, die zu SEQ ID NO: 1 komplementär ist, umfasst.
Sonde nach Anspruch 4, die unter hoch stringenten Bedingungen von 0,5 × SSC, 0,1 SDS bei 65°C (beispielsweise Waschbedingungen) an SEQ ID NO: 1, ihren komplementären Strang, die kodierende Region von SEQ ID NO: 1 oder ihren komplementären Strang hybridisiert.
Isoliertes biologisch aktives Polypeptid, das die Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1, 2 oder 3 kodiert, wobei das biologisch aktive Polypeptid durch Wahrnehmung der Konzentrationen mehrwertiger Kationen eine osmoregulatorische Aktivität in Fischen, Crustaceen oder Mollusken aufweist, einschließlich einer oder mehrerer der folgenden Funktionen: (i) Wahrnehmung der Kationenkonzentrationen im Serum oder im umgebenden Milieu; (ii) Anpassen an die sich verändernden Kationenkonzentrationen im Serum oder im umgebenden Milieu; oder (iii) Veränderung der Wasseraufnahme, Wasserabsorption oder des Urin Outputs.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 7, das sich an der Plasma- (beispielsweise Apikal)-Membran von Epithelzellen von Elasmobranch-Fisch befindet, wobei die Epithelzellen in Geweben zu finden sind, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Folgendem besteht: dem Sammelkanal und dem späten distalen Tubulus in der Niere; den Kiemen; der Rektaldrüse; den Gonaden und dem Gehirn.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 7, das sich auf der Plasma- (beispielsweise Apikal)-Membran von Epithelzellen befindet, die in Teleost-Fisch zu finden sind, wobei die Epithelzellen in Geweben zu finden sind, ausgewäht aus der Gruppe, die aus Folgendem besteht: dem Sammelkanal der Niere; der Harnblase; dem Dünndarm; den Kiemen, den Gonaden und dem Gehirn.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 4, das sich auf der Plasma- (beispielsweise Apikal)-Membran von Epithelzellen befindet, die in sich entwickelnden oder embryonalen Teleost-Fisch zu finden sind, wobei die Epithelzellen in Geweben zu finden sind, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Folgendem besteht: dem Dünndarm; den Kiemen; der Niere; dem Gehirn und der Haut.
Isoliertes Polypeptid, das ein biologisch aktives Fragment von SEQ ID NO: 2 umfasst, wobei das Fragment ein Polypeptid kodiert, das durch Wahrnehmung der Konzentrationen an mehrwertigem Kation eine osmoregulatorische Aktivität in Fisch, Crustaceen oder Mollusken aufweist, einschließlich einer oder mehrerer der folgenden Funktionen: (i) Wahrnehmung der Kationenkonzentrationen im Serum oder im umgebenden Milieu; (ii) Anpassen an die sich verändernden Kationenkonzentrationen im Serum oder im umgebenden Milieu; oder (iii) Veränderung der Wasseraufnahme, Wasserabsorption oder des Urin Outputs.
Antikörper, der spezifisch an das Polypeptid von Anspruch 7 bindet.
Isolierte Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1, die ein Polypeptid kodiert, das ein biologisch aktives Fragment von SEQ ID NO: 2 umfasst, wobei das Polypeptid durch Wahrnehmung der Konzentrationen an mehrwertigem Kation eine osmoregulatorische Aktivität in Fisch, Crustaceen oder Mollusken aufweist, einschließlich einer oder mehrerer der folgenden Funktionen: (i) Wahrnehmung der Kationenkonzentrationen im Serum oder im umgebenden Milieu; (ii) Anpassen an die sich verändernden Kationenkonzentrationen im Serum oder im umgebenden Milieu; oder (iii) Veränderung der Wasseraufnahme, Wasserabsorption oder des Urin Outputs.
Isolierte Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und 13, wobei die Nukleinsäure RNA ist.
Vektor oder Plasmid, das eine Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und 13 umfasst.
Wirtszelle, die mit einem Vektor nach Anspruch 15 transformiert ist.