JP2011511007A

JP2011511007A - タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態を治療するための方法

Info

Publication number: JP2011511007A
Application number: JP2010545262A
Authority: JP
Inventors: ローラセガトリ; ティンウェイムー; ジェフリーダブリュ．ケリー
Original assignee: ザスクリプスリサーチインスティチュート
Priority date: 2008-02-01
Filing date: 2009-02-02
Publication date: 2011-04-07
Also published as: CA2712593A1; EP2271213A1; US20090203605A1; EP2271213A4; WO2009100037A1; AU2009332930A1

Abstract

タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態の治療を必要とする患者において、タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態を治療するための方法が提供される。タンパク質ホメオスタシスを改善または回復させて、患者の状態を軽減もしくは排除する、またはその発生もしくは再発を阻止するのに有効な量のタンパク質恒常性制御因子を患者に投与する工程を含む、タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態の治療を必要とする患者において、タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態を治療するための方法が提供される。前記状態は、リソソーム性蓄積症などの機能喪失型障害、または加齢関連疾患などの機能獲得型障害でもよい。

Description

関連出願の相互参照
本願は、2008年2月1日に出願された米国特許仮出願第61/025,705号の恩典を主張する。米国特許仮出願第61/025,705号はその全体が参照として本明細書に組み入れられる。

政府の支援に関する記載
本発明は、米国立衛生研究所からの助成金番号DK75295による政府支援によってなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。

分野
本発明は、概して、タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態の治療を必要とする患者において、タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態を治療するための方法に関する。タンパク質ホメオスタシスを改善または回復させて、患者の状態を軽減もしくは排除する、またはその発生もしくは再発を阻止するのに有効な量および投与間隔で、タンパク質恒常性制御因子を患者に投与する工程を含む、タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態の治療を必要とする患者において、タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態を治療するための方法が提供される。

背景
通常、細胞は、センサーおよび経路ネットワークを用いて、タンパク質ホメオスタシスとも呼ばれる、タンパク質合成、フォールディング、輸送、凝集、および分解のバランスを維持する。Sitia et al., Nature 426: 891-894, 2003; Ron et al., Nat Rev Mol Cell Biol 8: 519-529, 2007。ヒト機能喪失型疾患は、多くの場合、正常なタンパク質ホメオスタシスが破壊された結果であり、典型的には、ある特定のタンパク質の変異によって、タンパク質の細胞フォールディングが損なわれ、効率的に分解されることよって引き起こされる。Cohen et al., Nature 426: 905-909, 2003。従って、変異体タンパク質の濃度が非常に低いために、機能は十分でない。

リソソーム内にある1種類の変異酵素の機能に欠損があり、対応する基質が蓄積すること起因するリソソーム性蓄積症(LSD)が少なくとも40種類ある。Futerman et al., Nat Rev Mol Cell Biol 5:554-565, 2004; Sawkar et al., Cell Mol Life Sci 63:1179-1192, 2006。現在、LSDは酵素補充療法によって治療されており、この療法は、組換え酵素をリソソームに入れるためにエンドサイトーシス系を利用しなければならないので困難な場合がある。Desnick et al., Nat Rev Genet 3:954-966, 2002。

最もよく見られるLSDはゴーシェ病(GD)であり、糖脂質加水分解酵素であるグルコセレブロシダーゼ(GC)の活性が欠損することによって引き起こされる。Zhao et al., Cell Mol Life Sci 59:694-707, 2002。ゴーシェ病の単球-マクロファージ細胞におけるグルコシルセラミドの蓄積は、肝腫大、巨脾腫、貧血、血小板減少、骨病変、重篤な場合では、中枢神経系(CNS)合併症につながる。Beutler et al., The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Diseases, New York: McGraw-Hill, 3635-3668, 2001。CNS合併症のない患者はI型(軽度成人発症型)と分類されるのに対して、CNS合併症のある患者は、II(急性小児発症型)またはIII型(亜急性若年型または早期成人発症型)と分類される。臨床上最も重要なGC変異、例えば、I型GDに関連する最もよく見られる変異であるN370S、およびCNS合併症の原因となる最も優勢な変異であるL444Pがあると、GCは小胞体(ER)の中で誤って折り畳まれやすくなり、これらの変種はER関連分解(ERAD)に供され、リソソームに輸送される通常量の変異体GCが減少する。従って、リソソームの中の変異体GC濃度は大幅に低下する。Ron et al., Hum Mol Genet 14: 2387-2398, 2005;Sawkar et al., ACS Chem Biol 1:235-251, 2006。フォールディング欠損GC変種の多くは、適切に折り畳まれた時にはわずかな比活性を示す。このことは、変異酵素のフォールディングおよび輸送を増強できれば、疾患は寛解する可能性が高いことを証明している。Liou et al., J Biol Chem 281:4242-4253, 2006。

FDAは、I型ゴーシェ病の治療のために酵素補充療法および基質抑制療法(substrate reduction therapy)を認可している。Sawkar et al., Cell Mol Life Sci 63:1179-1192, 2006; Futerman et al., Trends Pharmacol Sci 25: 147-151, 2004。現在、神経障害性ゴーシェ病(II型およびIII型)に有効な療法は無い。組換えGC酵素は血液脳関門を通過せず、CNSにおける基質抑制療法の効能は依然として明らかにされていない。従って、神経障害性ゴーシェ病に対する新たな方針が喜んで受け入れられるだろう。薬理学的シャペロニング(pharmacological chaperoning)は、折り畳まれた状態のある特定の酵素に結合し、安定化して、ゴルジ体へ、およびその先のリソソームへの輸送を可能にするER透過性低分子を用いた新しく浮上しつつある治療方針である。Fan et al., Nat Med 5:112-115, 1999; Sawkar et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:15428-15433, 2002; Matsuda et al., Proc Natl Acad Sci USA 100:15912-15917, 2003; Alfonso et al., Blood Cells Mol Dis 35: 268-276, 2005; Sawkar et al. Chem Biol 12:1235-1244, 2005; Steet et al., Proc Natl Acad Sci USA 103:13813-13818, 2006; Lieberman et al., Nat Chem Biol 3:101-107, 2007; Parenti et al., Mol Ther 15: 508-514, 2007; Tropak et al., Chem Biol 14:153-164, 2007; Yu et al., IJ Med Chem 50:94-100, 2007; Zheng et al., Proc Natl Acad Sci USA 104:13192-13197, 2007。ほとんどのGD関連変異を有する患者由来細胞は薬理学的シャペロニングを受け入れられるように見えるのに対して、L444P GC変異を有する細胞株はこれまでに難治性であることが分かっているが、最終的には別の投与計画が有用になるかもしれない。Sawkar et al. Chem Biol 12: 1235-1244, 2005。

α-マンノシドーシスおよびIIIA型ムコ多糖症(MPS)は、それぞれ、リソソームが糖タンパク質およびヘパラン硫酸を分解できないために引き起こされる神経障害性LSDである。Sawkar et al., Cell Mol Life Sci 63:1179-1192, 2006; Michalski et al., Biochim Biophys Acta-Mol Basis Dis 1455:69-84, 1999; Yogalingam et al., Hum Mutat 18:264-281, 2001。リソソームα-マンノシダーゼにP356R変異があるとフォールディングのエネルギー地形が変化して、急速な精神機能低下に関連する重度の小児型α-マンノシドーシスの原因となる。Gotoda et al., Am J Hum Genet 63:1015-1024, 1998。IIIA型MPSにおいて優勢なS66WまたはR245Hスルファミダーゼ変異が生じると、リソソーム中の変異体酵素濃度が低下する。これは、フォールディングが損なわれ、スルファミダーゼが効率的に折り畳まれおよび輸送される代わりにERADを受けて、ヘパラン硫酸が蓄積し、重度のCNS変性が生じたことによる可能性が最も高い。Perkins et al., J Biol Chem 274:37193-37199, 1999。現在、α-マンノシドーシスまたはIIIA型MPSに有効な療法は無く、従って、これらの神経障害性LSDに対する新たな方針が喜んで受け入れられるだろう。

タンパク質ホメオスタシスすなわちタンパク質恒常性を細胞において維持することは、プロテオームを構成する個々のタンパク質のコンホメーション、結合相互作用、位置、および濃度を制御することを意味している。タンパク質は全ての生物の生理機能において中心的な役割を果たしているので、適切なタンパク質フォールディング、局在化、および分解の正常なバランスの消失は非常に多くの疾患に影響を及ぼすか、または非常に多くの疾患の原因となる。Albanese, V., et al., Cell 124:75-88, 2006; Brown et al., J Clin Invest 99:1432-1444, 1997; Cohen et al., Nature 426:905-909, 2003; Deuerling et al., Crit Rev Biochem Molec Biol 39:261-277, 2004; Horwich et al., Encyclopedia Biol Chem 1:393-398, 2004; Imai et al., Cell Cycle 2:585-589, 2003; Kaufman, J Clin Invest 110:1389-1398, 2002; Ron et al., Nat Rev Mol Cell Biol 8:519-529, 2007; Young et al., Nat Rev Mol Cell Biol 5:781-791, 2004。インビボでのタンパク質フォールディングは、折り畳まれているポリペプチド鎖と、凝集を最小限にする、複数のクラスのシャペロンおよびフォールディング酵素を含む高分子細胞成分が相互作用することによって達成される。Wiseman et al., Cell 131: 809-821, 2007。ある特定の区画によって生成される有機溶質および無機溶質が、フォールディングの物理化学的特性に影響を及ぼす、疎水性作用を含む非共有結合力によるポリペプチド鎖の救出(salvation)に影響を及ぼすので、代謝酵素もまた細胞タンパク質のフォールディング効率に影響を及ぼす。折り畳まれた状態の特定のタンパク質に結合し、安定化して、フォールディング平衡をシフトさせることでフォールディングを増強することができる低分子リガンドもまた代謝経路によって生成される。Fan et al., Nature Med., 5, 112 (Jan 1999); Hammarstrom et al., Science 299, 713 (2003)。ある特定のタンパク質がある特定の細胞タイプにおいて折り畳まれるかどうかは、シャペロン、フォールディング酵素、代謝産物などの分布、濃度、および細胞下局在に依存する。Wiseman et al., Cell 131:809-821, 2007。

機能喪失型疾患は、多くの場合、変異タンパク質が分泌経路の中で適切に折り畳まれず、分泌経路を通ることができないために、広範囲の小胞体(ER)関連分解(ERAD)を受け、従って、目的地の環境におけるタンパク質の濃度が低いために引き起こされる。Brodsky, Biochem J 404:353-363, 2007; Brown et al., J Clin Invest 99:1432-1444, 1997; Cohen et al., Nature 426:905-909, 2003; Moyer et al., Emerg Ther Targets 5:165-176, 2001; Sawkar et al., Cell Mol Life Sci 63:1179-1192, 2006a; Schroeder et al., Ann Rev Biochem 74:739-789, 2005; Ulloa-Aguirre et al., Traffic 5:821-837, 2004; Wang et al., Cell 127:803-815, 2006; Wiseman et al., Cell 131:809-821, 2007。リソソーム性蓄積症(LSD)は、多くの場合、変異リソソーム酵素が適切に折り畳まれ、リソソームに輸送される代わりに広範囲のERADを受けることによって引き起こされる機能喪失型疾患である。Fan, Front Biotechnol Pharm 2:275-291, 2001; Fan et al., Nat Med 5:112-115, 1999; Futerman et al., Nat Rev Mol Cell Biol 5:554-565, 2004; Sawkar et al., Chem Biol 12:1235-1244, 2005; Sawkar et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:15428-15433, 2002; Sawkar et al., Cell Mol Life Sci 63:1179-1192, 2006a; Sawkar et al., ACS Chem Biol 1:235-251, 2006b; Schmitz et al., Int J Biochem Cell Biol 37:2310-2320, 2005; Yu et al., J Med Chem 50:94-100, 2007b; Zimmer et al., J Pathol 188:407-414, 1999。これらは基質の蓄積を特徴とし、典型的には、変異リソソーム酵素の活性が正常値の約10％未満に低下した時に生じる。Conzelmann et al., Dev Neurosci 6:58-71, 1984; Schueler et al., J Inherit Metab Dis 27: 649-658, 2004。LSDは、現在、損傷を受けた酵素を、エンドサイトーシス経路を利用してリソソームに到達する野生型組換えバージョンに交換することによって治療されている。Futerman et al., Nat Rev Mol Cell Biol 5:554-565, 2004; Beutler et al., Proc Natl Acad Sci USA 74:4620-4623, 1977; Brady, Ann Rev Med 57:283-296, 2006。組換え酵素が血液脳関門を通過しないので、神経障害性LSDの酵素補充療法は失敗している。Sawkar et al., Cell Mol Life Sci 63:1179-1192, 2006a。誤って折り畳まれ、ERADによって分解される変異リソソーム酵素の多くは、適切な条件下では、例えば、細胞が低い許容温度で増殖する場合には、折り畳まれ、部分活性を示すことができる。Futerman et al., Nat Rev Mol Cell Biol 5:554-565, 2004; Sawkar et al., ACS Chem Biol 1:235-251, 2006b。ほとんどの変異糖脂質処理酵素の問題は、リソソームの酸性環境とは別個のERの中性pH環境における折り畳みである。Sawkar et al., ACS Chem Biol 1:235-251, 2006b。

機能喪失型疾患、例えば、リソソーム性蓄積症および神経障害性リソソーム性蓄積症、または機能獲得型疾患、例えば、年齢に伴う発症(age-onset)に関連する疾患、例えば、加齢黄斑変性、封入体筋炎(inclusion body myositosis)、II型糖尿病、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病またはパーキンソン病につながり得る、細胞内タンパク質ミスフォールディングおよびタンパク質輸送の変化に関連する疾患に有効な療法を開発するために、新たな方針が必要とされている。現行の治療は、酵素補充療法または基質抑制療法のために認可された化合物に限定されているので、タンパク質ホメオスタシスの機能不全に関連するタンパク質機能喪失型疾患または機能獲得型疾患を治療するために、新たな治療アプローチが当技術分野において必要とされている。

概要
本発明は、概して、タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態の治療を必要とする患者において、タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態を治療するための方法に関する。タンパク質ホメオスタシスの機能不全は、タンパク質ミスフォールディング、タンパク質凝集、欠陥のあるタンパク質輸送、タンパク質分解、またはそれらの組み合わせの結果であり得る。この方法は、タンパク質ホメオスタシスを改善または回復させるのに有効な量および投与計画でタンパク質恒常性制御因子を患者に投与する工程を含んでもよい。タンパク質恒常性制御因子は、シグナル伝達を熱ショック応答(HSR)経路および/もしくは小胞体ストレス応答(unfolded protein response：UPR)経路を介して、または寿命および若々しさの制御に加えてタンパク質ホメオスタシス能力を制御する加齢関連シグナル伝達経路によりアップレギュレートする細胞機構を介して、作用し得る。

タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態の治療を必要とする患者において、タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態を治療するための方法であって、タンパク質ホメオスタシスを改善または回復させて、患者の状態を軽減もしくは排除する、またはその発生もしくは再発を阻止するのに有効な量のタンパク質恒常性制御因子を患者に投与する工程を含む方法が提供される。状態は、機能喪失型障害、例えば、リソソーム性蓄積症、α1-アンチトリプシン関連気腫、または嚢胞性線維症でもよい。状態には、ゴーシェ病、α-マンノシドーシス、IIIA型ムコ多糖症、ファブリー病、テイ・サックス病、およびポンペ病が含まれるが、これに限定されない。タンパク質恒常性制御因子は、シャペロンネットワークまたはネットワークの一部の転写または翻訳を協調してアップレギュレートしてもよく、ネットワーク成分の代謝回転を妨害してもよく、タンパク質恒常性制御因子は変異体タンパク質の分解を阻害してもよい。状態は、機能獲得型障害、例えば、障害を引き起こす疾患、例えば、封入体筋炎、筋萎縮性側索硬化症、加齢黄斑変性、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、またはパーキンソン病でもよい。タンパク質恒常性制御因子による疾患または状態の治療は、熱ショック応答(HSR)経路および/または小胞体ストレス応答(UPR)経路を介してシグナル伝達をアップレギュレートすることができ、これらの経路に関連する遺伝子または遺伝子産物のアップレギュレーションが含まれる。タンパク質恒常性制御因子は、タンパク質シャペロンの転写もしくは翻訳をアップレギュレートすることによって、またはタンパク質シャペロンの分解を阻害することによって、タンパク質シャペロンおよび/またはフォールディング酵素を調節することができる。タンパク質恒常性制御因子は、凝集経路またはディスアグリガーゼ(disaggregase)活性をアップレギュレートすることができる。タンパク質恒常性制御因子は、1つもしくは複数のタンパク質シャペロン、1つもしくは複数のフォールディング酵素、またはそれらの組み合わせの分解を阻害することができる。加齢に関連するシグナル伝達経路の変更は、タンパク質ホメオスタシス経路を調節するための別のアプローチである。細胞内Ca⁺⁺イオン濃度の変更は、タンパク質ホメオスタシス能力を協調して増強するためのさらなるアプローチである。

タンパク質恒常性制御因子は、化学小分子、タンパク質、アンチセンス核酸、ショートヘアピンRNA、短鎖干渉RNA、またはリボザイムを含むが、これに限定されない組成物でよい。タンパク質恒常性制御因子は、ウイルス感染に対する患者の感受性または癌に対する感受性を高めない量で投与することができる。

さらなる局面において、治療するための方法は、薬理学的シャペロンまたはキネティック安定剤を投与する工程をさらに含んでもよい。治療するための方法は、第2の機構的に別個のタンパク質恒常性制御因子を投与する工程をさらに含んでもよい。第1および第2のタンパク質恒常性制御因子は、凝集制御因子、脱凝集制御因子、タンパク質分解制御因子、またはタンパク質フォールディング制御因子の1つまたは複数でもよい。

タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態の治療を必要とする患者において、タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態を治療するための方法であって、薬理学的シャペロンまたはキネティック安定剤と組み合わせて、タンパク質ホメオスタシスを改善または回復させて、患者の状態を軽減もしくは排除する、またはその発生もしくは再発を阻止するのに有効な量のタンパク質恒常性制御因子を患者に投与する工程を含む方法が提供される。状態は機能喪失型障害でもよい。タンパク質恒常性制御因子は、変異酵素、例えば、リソソーム酵素の正しいフォールディングを促進する。治療するための方法は、変異リソソーム酵素を交換するために、正常活性を有するリソソーム酵素をコードするポリヌクレオチドまたはポリペプチドを投与する工程をさらに含んでもよい。さらなる局面において、タンパク質恒常性制御因子は小胞体関連分解を阻害することができる。状態はゴーシェ病でもよい。薬理学的シャペロンは、N-(n-ノニル)デオキシノジリマイシンでもよい。状態はテイ・サックス病でもよく、薬理学的シャペロンは2-アセトアミド-2-デオキシノジリマイシンでもよい。さらなる局面において、状態は機能獲得型障害でもよい。状態には、封入体筋炎、加齢黄斑変性、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、またはパーキンソン病が含まれるが、これに限定されない。

機能喪失型疾患の治療を必要とする患者において機能喪失型疾患を治療するための方法であって、変異タンパク質の活性を改善または回復させて、患者の機能喪失型疾患を軽減もしくは排除する、またはその発生もしくは再発を阻止するのに有効な量のタンパク質恒常性制御因子を前記患者に投与する工程を含む方法が提供される。治療するための方法は、変異タンパク質を交換するために、正常活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはポリペプチドを投与する工程をさらに含んでもよい。

1つの局面において、タンパク質恒常性制御因子は変異タンパク質の正しいフォールディングを促進し、かつ変異タンパク質に結合しない。タンパク質恒常性制御因子は、タンパク質シャペロンの小胞体関連分解を軽減または排除することができる。タンパク質恒常性制御因子はプロテアソーム阻害剤でもよい。1つの局面において、機能喪失型疾患は嚢胞性線維症でもよく、変異タンパク質は嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)でもよい。

さらなる局面において、タンパク質恒常性制御因子は小胞体中のCa²⁺濃度を上げる、および/またはサイトゾル中のCa²⁺濃度を下げる。さらに別の局面において、タンパク質恒常性制御因子はCa²⁺チャンネル遮断薬である。別の局面において、タンパク質恒常性制御因子は、リアノジン受容体(RyR)を阻害する薬剤である。さらに別の態様において、タンパク質恒常性制御因子はジルチアゼムまたはベラパミルである。

機能喪失型疾患はリソソーム性蓄積症でもよく、変異タンパク質はリソソーム酵素でもよい。リソソーム性蓄積症は、神経障害性リソソーム性蓄積症、ゴーシェ病、神経障害性ゴーシェ病、α-マンノシドーシス、IIIA型ムコ多糖症、ファブリー病、テイ・サックス病、またはポンペ病でもよい。リソソーム性蓄積症はゴーシェ病でもよく、酵素は、グルコセレブロシダーゼ、例えば、変異体酵素L444PグルコセレブロシダーゼまたはN370Sグルコセレブロシダーゼでもよい。リソソーム性蓄積症はα-マンノシドーシスでもよく、酵素は、α-マンノシダーゼ、例えば、変異体酵素P356R α-マンノシダーゼでもよい。リソソーム性蓄積症はIIIA型ムコ多糖症でもよく、酵素は、スルファミダーゼ、例えば、S66WスルファミダーゼまたはR245Hスルファミダーゼでもよい。さらなる局面において、疾患はテイ・サックス病であり、酵素はβ-ヘキソサミンA、または変異体酵素、G269Sβ-ヘキソサミンAである。タンパク質恒常性制御因子は、例えば、セラストロールまたはMG-132でもよい。

タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態の治療を必要とする患者において、タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態を治療するための方法であって、少なくとも2つの機構的に別個のタンパク質恒常性制御因子を前記患者に投与する工程を含み、タンパク質恒常性制御因子が、タンパク質ホメオスタシスを改善または回復させて、患者の状態を軽減もしくは排除する、またはその発生もしくは再発を阻止するのに有効な量で投与される方法が提供される。タンパク質恒常性制御因子の少なくとも1つは、変異タンパク質の正しいフォールディングを増強することができる。タンパク質恒常性制御因子の少なくとも1つは、変異タンパク質の小胞体関連分解を阻害することができる。さらなる局面において、変異タンパク質は変異酵素でもよい。

患者においてタンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態を診断するための方法であって、細胞をベースとするアッセイ系において患者からの細胞または組織とタンパク質恒常性制御因子とを接触させる工程、細胞内のタンパク質フォールディング、タンパク質凝集、タンパク質輸送、またはタンパク質分解に及ぼすタンパク質恒常性制御因子の影響を測定する工程、および患者の細胞または組織におけるタンパク質ホメオスタシスの欠損を特定する工程を含む方法が提供される。状態は機能喪失型障害でもよく、方法は、タンパク質のフォールディングまたは輸送における欠損を特定する工程をさらに含んでもよい。状態は機能獲得型障害でもよく、方法は、タンパク質の分解における欠損を特定する工程をさらに含んでもよい。欠損はタンパク質シャペロンの合成にあってもよい。タンパク質恒常性制御因子は、熱ショック応答(HSR)経路もしくは小胞体ストレス応答(UPR)経路、またはそれらの組み合わせを介してシグナル伝達をアップレギュレートすることができる。タンパク質恒常性制御因子は、1つもしくは複数のタンパク質シャペロン、1つもしくは複数のフォールディング酵素、またはそれらの組み合わせの転写もしくは翻訳をアップレギュレートすることができる。タンパク質恒常性制御因子は、1つもしくは複数のタンパク質シャペロン、1つもしくは複数のフォールディング酵素、またはそれらの組み合わせの分解を阻害することができる。タンパク質恒常性制御因子は凝集経路または脱凝集経路をアップレギュレートすることができる。

2つまたはそれ以上のタンパク質恒常性成分を同定することによって治療法をデザインする方法であって、タンパク質恒常性成分の活性と標準とを比較する工程;標準の活性に対してタンパク質恒常性成分の活性を改変するタンパク質恒常性制御因子を選択する工程;および制御因子を必要する患者に、制御因子を投与する工程を含む方法が提供される。

セラストロール処理が変異体グルコセレブロシダーゼ(GC)の活性およびリソソームへのGCの細胞輸送を増強することを示す。セラストロール処理が変異体グルコセレブロシダーゼ(GC)の活性およびリソソームへのGCの細胞輸送を増強することを示す。セラストロール処理が変異体グルコセレブロシダーゼ(GC)の活性およびリソソームへのGCの細胞輸送を増強することを示す。プロテアソーム阻害剤MG-132がGC活性を強力に増強し、L444P GC線維芽細胞内でのリソソームへのGCの細胞輸送を増強することを示す。プロテアソーム阻害剤MG-132がGC活性を強力に増強し、L444P GC線維芽細胞内でのリソソームへのGCの細胞輸送を増強することを示す。プロテアソーム阻害剤MG-132がGC活性を強力に増強し、L444P GC線維芽細胞内でのリソソームへのGCの細胞輸送を増強することを示す。図3A、3B、3C、3D、3E、および3Fは、薬理学的シャペロンおよびタンパク質恒常性制御因子がフォールディング、輸送、および細胞酵素活性の増強において相乗作用を示すことを示す。図4A、4B、4C、および4Dは、PRが単独で、または酵素特異的薬理学的シャペロンと組み合わせて、G269S/1278insTATC HexAテイ・サックス病線維芽細胞株のHexα部位活性を増強することを示す。図5A、5B、5C、および5Dは、MG-132およびセラストロールが両方ともL444P GC線維芽細胞において熱ショック応答を活性化することを示す。図6A、6B、6C、6D、および6Eは、MG-132およびセラストロールによるGCタンパク質恒常性の調節が、小胞体ストレス応答を介して起こり得ることを示す。 GCタンパク質恒常性回復経路を示し、図5および図6からのデータを統合している。これは、場合によっては、PRが、HSRおよびUPR両方の成分をアップレギュレートすることを証明している。図30に模式的に示したように、PRは、Ca²⁺ホメオスタシスの1つまたは複数の局面も調節することができる。 L444P GC線維芽細胞におけるGC輸送のウエスタンブロット分析を示す。図9A、9B、および9Cは、L444P GC線維芽細胞におけるセラストロール投与計画の最適化を示す。 L444P GC線維芽細胞におけるGC活性に及ぼすプロテアソーム阻害剤の影響を示す。 L444P線維芽細胞における他のWTリソソーム酵素、ならびにWT GC線維芽細胞におけるGCの活性に及ぼすMG-132およびセラストロールの影響を示す。図12A、12B、12C、および12Dは、セラストロールおよびNN-DNJを含有する培地を用いて培養されたG202RおよびN370S GC患者由来線維芽細胞のGC活性を示す二次元プロットを示す。図13Aおよび13Bは、t=0、30、60、72、102、および132hでインキュベーション培地を交換した以外は図12に記載のものと同じ実験計画に従って、細胞をプレートおよび処理したことを示す。図14A、14B、14C、および14Dは、MG-132およびセラストロール、またはMG-132およびNN-DNJを含有する培地を用いて培養された患者由来線維芽細胞における相対L444P GC活性を示す。図15Aおよび15Bは、MG-132およびADNJを含有する培地を用いて培養されたG269S/1278insTATC HexAテイ・サックス病線維芽細胞における相対Hexα部位活性を示す。 L444P GC線維芽細胞におけるGC活性に及ぼす、Hsp70阻害剤である化合物101を単独で、またはMG-132と組み合わせた場合の影響を示す。図17A、17B、17C、17D、17E、および17Fは、ゴーシェ病患者由来線維芽細胞におけるグルコセレブロシダーゼ(GC)変種活性に及ぼす低分子の影響を示す。図18A、18B、18C、18D、18E、18F、18G、および18Hは、L444PおよびN370S/V394LのGCフォールディングおよび輸送に及ぼすジルチアゼムの影響を示す。 L444PおよびN370S/V394L GC線維芽細胞において細胞内Ca²⁺イオン濃度がGC活性に影響を及ぼすことを示す。未処理およびジルチアゼム処理L444P GC線維芽細胞におけるシャペロン発現レベルを示す。患者由来線維芽細胞における変異体α-マンノシダーゼおよびヘパラン硫酸スルファミダーゼ(SGSH)活性に及ぼすジルチアゼムおよびベラパミルの影響を示す。 1〜4日間培養した後のゴーシェ病患者由来線維芽細胞におけるL444Pグルコセレブロシダーゼ(GC)活性に及ぼすルテニウムレッドの影響を示す。リソソーム酵素の活性に及ぼすジルチアゼムの影響の影響を示す。インタクト細胞のGC活性アッセイを用いて求められた、ジルチアゼムと1時間インキュベートされたL444PおよびN370S/V394L GC細胞のGC活性を示す。 L444P GC線維芽細胞におけるGC活性に及ぼすタプシガルジンおよびジルチアゼムの影響を示す。未処理およびジルチアゼム処理N370S/V394L GC細胞における定量RT-PCR分析を示す。 IRE1αまたはPERKのsiRNAノックダウンによって、L444P GC活性を増大させるMG-132(DMSO中で0.25μM)の能力がブロックされることを示している。活性は、非標的siRNA(対照)およびDMSOビヒクルを用いて処理されたL444P GC細胞に対して標準化した。図28Aおよび28Bは、非標的siRNA(対照)+DMSO(ビヒクル)またはHSF1、IRE1α、ATF6、およびPERK siRNAと、(DMSOビヒクルだけで)またはDMSOに溶解した0.25μM MG-132(A)もしくは0.8μMセラストロール(B)を用いて処理された線維芽細胞における、L444P GCのウエスタンブロット分析を示す。 MG-132(0.8μM)またはセラストロール(0.8μM)で72時間処理した後のL444P GC線維芽細胞プロテオーム(A)の変化を示す。ある特定のタンパク質が未処理試料および処理試料の両方において検出された場合、薬物処理試料対未処理試料の標準化されたスペクトルカウント比を用いて、タンパク質の数をlog₂ (上)およびlog₁₀ (下)スケールでの倍率変化に対してプロットした。小胞体(ER)におけるCa²⁺ホメオスタシスの模式図を示す。Ca²⁺レベルは、IP₃受容体(IP₃R)およびリアノジン受容体(RyR)放出チャンネル、ならびに筋小胞体Ca²⁺-ATPアーゼ(SERCA)ポンプを含む多くの系によって制御される。図31Aおよび31Bは、RyR阻害剤ダントロレンの存在下でのL444P(A)およびN370S(B)線維芽細胞における相対グルコセレブロシダーゼ(GC)活性を示す。 RyR阻害剤ダントロレンへの曝露前および曝露後のL444P線維芽細胞のEndo H感受性のウエスタンブロット分析を示す。図33A、33B、33C、33D、および33Eは、IP₃R阻害剤XeC(A)、クロロキニン(B)、キニーネ(C)、チメロサール(D)、およびKN93(E)を用いて処理した際のL444P線維芽細胞における相対GC活性を示す。 RyR阻害剤ダントロレンを用いた処理後の、L444P線維芽細胞におけるGCおよびリボソーム大タンパク質(RiboP)対照の相対mRNA発現レベルを示す。図35Aおよび35Bは、SERCA2ポンプ(A)を過剰発現するL444P線維芽細胞のEndo H感受性(A)および相対GC活性を示す。図36Aおよび36Bは、ジルチアゼムへの様々な曝露後のL444P GC線維芽細胞における細胞質Ca²⁺レベルを示す。図37A、37B、および37Cは、RyR1、RyR2、およびRyR3、ならびにRyR1/3およびRyR2/3の組み合わせに対するsiRNAへの曝露後の、L444P線維芽細胞のEndoH感受性(A、B)および相対GC活性(C)を示す。 L444P GC線維芽細胞におけるRyR1、RyR2、およびRyR3の相対発現レベルを示す。このことから、RyR3は最も豊富に発現されるアイソフォームであることが分かる。ダントロレン(A)、ダントロレン+EDTA(B)、またはジルチアゼム(C)への曝露後のL444P GCタンパク質とERシャペロンカルネキシンとの結合レベルを示す。ダントロレン(A)、ダントロレン+EDTA(B)、またはジルチアゼム(C)への曝露後のL444P GCタンパク質とERシャペロンカルネキシンとの結合レベルを示す。ダントロレン(A)、ダントロレン+EDTA(B)、またはジルチアゼム(C)への曝露後のL444P GCタンパク質とERシャペロンカルネキシンとの結合レベルを示す。図40Aおよび40Bは、L444P、N370S、およびG202R GCタンパク質と、ERシャペロンカルネキシン、カルレチキュリン、およびBiPとの結合レベル(A)、ならびにダントロレンへの曝露後の、wtGCタンパク質とカルレチキュリン(CRT)の結合レベル(B)を示す。ダントロレンへの様々な曝露後のL444P GC線維芽細胞における、細胞質シャペロンHsp40、Hsp70、Hsp90、Hsp27、およびαβ-クリスタリン(CRYAB)の相対発現レベルを示す。図42Aおよび42Bは、ダントロレンへの曝露後の、ER関連タンパク質C/EBP相同タンパク質(CHOP)およびXボックス結合タンパク質1(XBP-1)(A)、ならびにER関連シャペロンBiP、CRTおよびGRP94、ER関連フォールディング酵素ERp57およびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ(PDI)、ならびに細胞質シャペロンHsp70およびHsp90(B)の相対発現レベルを示す。図43Aおよび43Bは、カルネキシン過剰発現L444P線維芽細胞のEndoH感受性(A)および相対GC活性(B)を示す。ダントロレン単独で、および薬理学的シャペロンと組み合わせた場合のN370S線維芽細胞の相対GC活性を示す。

詳細な説明
本発明は、機能獲得型疾患および機能喪失型疾患の原因となるタンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態の治療を必要とする患者において、タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態を治療するための方法に関する。状態は、代謝障害、腫瘍障害、神経変性障害、および心血管障害を含む。機能喪失型疾患、例えば、神経障害性の変種、嚢胞性線維症、またはα1-アンチトリプシン欠損関連気腫を含むリソソーム性蓄積症(LSD)は、多くの場合、タンパク質ホメオスタシスすなわちタンパク質恒常性の機能不全によって引き起こされ、時として、タンパク質フォールディング、輸送、および分解の正常なバランスを損なう、分泌経路を通り抜けるタンパク質の変異に起因する。機能獲得型疾患は、多くの場合、年齢発症関連疾患、例えば、筋萎縮性側索硬化症、加齢黄斑変性、封入体筋炎、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、またはパーキンソン病である。本明細書に記載のように、タンパク質恒常性制御因子、例えば、低分子化合物タンパク質恒常性制御因子、RNAi、shRNA、リボザイム、アンチセンスRNA、またはタンパク質、タンパク質類似体、もしくはミメティックを細胞に投与することによって、何もしなければ誤って折り畳まれ、分解される変異酵素を折り畳むように、生得的な細胞タンパク質ホメオスタシス機構を適応させることができる。本発明は、細胞質および/または小胞体のタンパク質恒常性環境の組成を変えることによって、それぞれ別個のリソソーム性蓄積症に関連する非相同変異体酵素のフォールディング、輸送、および機能を部分的に回復することができるタンパク質恒常性制御因子を投与することによって、タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態を治療するための方法を提供する。タンパク質恒常性制御因子と共に酵素特異的薬理学的シャペロンが同時投与された時に、これらの別個の作用機構のために、さらなる相乗的なタンパク質恒常性回復が観察された。タンパク質恒常性制御因子を投与することによって、または薬理学的シャペロンおよびタンパク質恒常性制御因子の組み合わせを投与することによって、機能喪失型疾患および/または機能獲得型疾患を寛解することができる可能性がある。

タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態の治療を必要とする患者において、タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態を治療するための方法であって、タンパク質ホメオスタシスを改善または回復させて、患者の状態を軽減もしくは排除する、またはその発生もしくは再発を阻止するのに有効な量および投与計画でタンパク質恒常性制御因子を患者に投与する工程を含む方法が提供される。状態は、機能喪失型障害、例えば、リソソーム性蓄積症でもよい。状態には、ゴーシェ病、α-マンノシドーシス、IIIA型ムコ多糖症、ファブリー病、テイ・サックス病、ポンペ病、嚢胞性線維症、およびα1-アンチトリプシン欠損関連気腫が含まれるが、これに限定されない。タンパク質恒常性制御因子は、タンパク質シャペロンまたはシャペロンネットワークの転写もしくは翻訳をアップレギュレートしてもよく、タンパク質シャペロンまたはシャペロンネットワークの分解を阻害してもよい。状態は、機能獲得型障害、例えば、障害を引き起こす疾患、例えば、封入体筋炎、筋萎縮性側索硬化症、加齢黄斑変性、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、またはパーキンソン病でもよい。タンパク質恒常性制御因子による疾患または状態の治療は、熱ショック応答(HSR)経路および/または小胞体ストレス応答(UPR)経路を介したシグナル伝達を協調してアップレギュレートすることができ、これらの経路に関連する遺伝子または遺伝子産物のアップレギュレーションが含まれる。寿命および若さに関連するシグナル伝達経路に影響を及ぼすことが、タンパク質恒常性ネットワークを調節するための別のアプローチであることも明らかである。

タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする機能喪失型状態の治療を必要とする患者において、タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする機能喪失型状態を治療するための方法は、損傷を受けた酵素を交換する代わりに、タンパク質恒常性の生得的な細胞生物学的特性を適応させることによって、ミスフォールディングおよび分解(ER関連分解、ERAD)を受けやすい変異リソソーム酵素の部分的なフォールディング、輸送、および機能を回復させることが可能な治療方針を支持する。同様に、機能獲得型疾患の治療でも、折り畳まれた機能的状態のタンパク質に結合してキネティック安定性をタンパク質に与え、それによって変性および凝集物への誤った集合を阻止する低分子であるキネティック安定剤の代わりに、またはこれに加えて、細胞生物学的特性またはタンパク質恒常性の適応を使用することができる。細胞タンパク質ホメオスタシスを増強する小さな化学分子または生物学的因子(タンパク質ミメティックまたは類似体、RNAi、shRNA、リボザイム、またはアンチセンスRNA)、すなわち「タンパク質恒常性制御因子」は、多くの場合、熱ショック応答、小胞体ストレス応答、および寿命関連シグナル伝達経路を含むシグナル伝達経路を操作することによって機能して、タンパク質恒常性ネットワーク成分の転写および翻訳をもたらす。例えば、低分子化合物であるセラストロールは熱ショック応答を活性化して、シャペロン、コシャペロン、フォールディング酵素などの発現を増強する。Westerheide et al., J Biol Chem 279: 56053-56060, 2004; Yang et al., Cancer Res 66: 4758-4765, 2006。

タンパク質恒常性ネットワークは多くのクライアント(client)タンパク質のフォールディングおよび輸送を同時に支持するように進化してきたので、1種類のタンパク質恒常性制御因子によって、複数の疾患におけるタンパク質恒常性が回復できるはずである。さらに、タンパク質恒常性制御因子は作用機構が異なるために、薬理学的シャペロン/キネティック安定剤の確立されている有用性を補うはずである。Asano et al., Eur J Biochem 267: 4179-4186, 2000; Bouvier, Chem Biol 14: 241-242, 2007; Fan et al., Nat Med 5: 112-115, 1999; Sawkar et al., Proc Natl Acad Sci USA 99: 15428-15433, 2002; Brown et al., J Clin Invest 99: 1432-1444, 1997; Ulloa-Aguirre et al., Traffic 5: 821-837, 2004。薬理学的シャペロン/キネティック安定剤は、既にある定常状態レベルの折り畳まれた変異体タンパク質に結合し、折り畳みを安定化することによってフォールディング平衡を化学的に増強する。Bouvier, Chem Biol 14: 241-242, 2007; Fan et al., Nat Med 5: 112-115, 1999; Sawkar et al., Proc Natl Acad Sci USA 99: 15428-15433, 2002。対照的に、タンパク質恒常性制御因子は、多くの場合、シャペロンおよびフォールディング酵素レベル、ならびに部分的に折り畳まれたコンホメーションアンサンブルに結合して、よりネイティブな構造を有する中間体に進ませ、最終的には、輸送されるように折り畳まれた変異体タンパク質の濃度を上げる高分子を協調して増やすことによって、フォールディングの生物学的特性に影響を及ぼす。

タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態を治療するための方法は、異なるリソソーム性蓄積症(LSD)からの患者由来細胞株において機能するタンパク質恒常性制御因子を発見することに焦点を当てている。最もよく見られるLSDであるゴーシェ病は、典型的には、広範囲のERADおよびリソソーム中でのGCの機能喪失につながってグルコシルセラミド蓄積の原因となるN370SまたはL444Pグルコセレブロシダーゼ(GC)変異によって引き起こされる。Beutler et al., Blood Cells Mol Dis 35: 355-364, 2005; Sawkar et al., Cell Mol Life Sci 63: 1179-1192, 2006a; Sawkar et al., ACS Chem Biol 1: 235-251, 2006b。L444P変異は、多くの場合、神経障害性ゴーシェ病につながり、(N370S変種とは異なり)薬理学的シャペロンにあまり応答しない。これは、おそらく、折り畳まれたL444P GCの濃度が非常に低いためである。Sawkar et al., Chem Biol 12: 1235-1244, 2005; Sawkar et al., Proc Natl Acad Sci USA 99: 15428-15433, 2002; Sawkar et al., ACS Chem Biol 1: 235-251, 2006b; Yu et al., J Med Chem 50: 94-100, 2007b。テイ・サックス病(TSD)は、G269Sを含むβ-ヘキソサミニダーゼA(HexA)変異によって引き起こされ得る別の機能喪失型LSDである。Jeyakumar et al., Neuropathol Appl Neurobiol 28: 343-357, 2002。この変異がα-サブユニットにあると、α-サブユニットおよびβ-サブユニットからなるヘテロ二量体糖タンパク質であるHexAのフォールディングおよび輸送が損なわれ、かなりのERADを受け、その基質であるGM2ガングリオシドがニューロンに貯蔵される。Maegawa et al., J Biol Chem 282: 9150-9161, 2007。HexAのフォールディング、輸送、および活性は、活性部位特異的薬理学的シャペロンによる処理の際に、G269Sα-サブユニット変異を有する患者由来線維芽細胞において部分的に回復することが知られている。Maegawa et al., J Biol Chem 282: 9150-9161, 2007; Tropak et al., J Biol Chem 279: 13478-13487, 2004。

ゴーシェ病およびテイ・サックス病患者由来細胞株においてグルコセレブロシダーゼおよびHexAタンパク質恒常性および機能を部分的に回復させる2種類のタンパク質恒常性制御因子が本明細書に記載されている。このことは、1種類のタンパク質恒常性制御因子を用いて複数のLSDを治療することが可能だという原理の証拠となっている。これらのタンパク質恒常性制御因子は、熱ショック応答および小胞体ストレス応答を活性化して、それぞれ、細胞質およびERの中のタンパク質恒常性成分を変えることによって機能するように見える。さらに、いずれの場合でも、これらの結果は、タンパク質恒常性制御因子と活性部位特異的薬理学的シャペロンを組み合わせると、これらの別個の作用機構の結果として、患者由来線維芽細胞における変異体酵素機能の相乗的回復が得られることを証明している。

熱ショック応答および小胞体ストレス応答の活性化が特定の用途に必要とされるかどうかは、タンパク質恒常性制御因子および熱ショック応答シグナル伝達経路を開始するHSF1に対するRNAiもしくはsiRNA、またはタンパク質恒常性制御因子および小胞体ストレス応答シグナル伝達経路の3つのアーム(arm)を活性化するのに必要な成分に対するRNAiもしくはsiRNAを適用することによって分かる。個々の成分(シャペロン、フォールディング酵素、代謝産物)が必要かどうかも、タンパク質恒常性制御因子および患者由来細胞に対するRNAiまたはsiRNAを適用することによって分かる。ある特定のRNAiを同時投与することによってタンパク質恒常性制御因子が機能喪失すると、その経路または経路成分がタンパク質恒常性の回復に重要であることが分かる。

Ca²⁺イオンは普遍的かつ極めて重要な細胞内シグナル伝達イオンである。Ca²⁺シグナル伝達は、多様な経路による非常に多くの細胞機能に影響を及ぼし、小胞体(ER)機能の主な制御因子である。Berridge et al., Nat Rev Mol Cell Biol 4: 517-529, 2003; Burdakov et al., Cell Calsium 38: 303-310, 2005; Gorlach et al., Antioxid Redox Signal 8: 1391-1418, 2006。新たに浮上しつつある証拠から、カルシウムシグナル伝達は、多くのリソソーム性蓄積症(LSD)を含む、タンパク質ホメオスタシスの欠損に関連する疾患に影響を及ぼす可能性があることが分かっている。Futerman et al., Nat Rev Mol Cell Biol 5: 554-565, 2004; LaFerla, Nat Rev Neurosci 3: 862-872, 2002; Petersen et al., Cell Calcium 38: 161-169, 2005。この仮説は、筋形質/内質カルシウム(SERCA)ポンプ阻害剤、例えば、タプシガルジンによってカルシウムホメオスタシスを操作すると、ΔF508嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)およびクルクミンのフォールディングおよび輸送が増強されるという観察によって裏付けられている。Egan et al., Nat Med 8: 485-492, 2002; Egan et al., Science 304: 600-602, 2004。

さらに、本発明は、LSDにつながる変異体酵素ホメオスタシスの欠陥を改善するように細胞内カルシウムホメオスタシスを操作することによって、タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態を治療するための方法に関する。サイトゾルカルシウム濃度を下げる、および/または小胞体(ER)カルシウム濃度を上げる薬剤が、ゴーシェ病、マンノシドーシス、およびムコ多糖症IIIA型などのLSDに関連する変異体酵素のフォールディングおよび活性を増強することが見出されている。さらに、下記の実施例に示したように、ER中のカルシウム濃度を上げると、カルシウム結合シャペロンタンパク質の活性が増強した。従って、本発明の1つの態様は、ER中のカルシウム濃度を上げる、および/またはサイトゾル中のカルシウム濃度を下げる、および/またはER中のカルシウム結合シャペロンの活性を増強する薬剤の投与により、変異体リソソーム酵素のフォールディングを増強することによってLSDを治療することに関する。異なるLSDに関連する複数の細胞株において内因性変異体リソソーム酵素のフォールディング、輸送、および機能を増強し、従って、カルシウムホメオスタシスを変えることによって、損傷を受けた酵素を交換する代わりに修復することによって機能を回復させる薬剤を調べた。これらを下記で詳述する。例えば、FDAは、薬物ジルチアゼムおよびベラパミルを認可した。両薬物ともL型電位依存性カルシウムチャンネル遮断薬であり、非相同酵素のフォールディング欠陥によって引き起こされる3つの別個のLSDにおいて変異体リソソーム酵素の機能を部分的に回復させることが発見された。これらの結果は、カルシウムチャンネル遮断薬が、様々なLSDにおけるリソソーム酵素ホメオスタシスを増強する有望な候補であることを示唆している。

LSDはリソソーム酵素活性の欠損に起因し、従って、変異体酵素の基質はリソソーム中で蓄積して、異常を引き起こす。全てではないが多くのLSDでは、臨床上最も重要な変異があると、酵素の細胞フォールディングが損なわれ、酵素は適切に折り畳まれ、リソソームに輸送される代わりに、小胞体関連分解に供される。部分的な変異体酵素フォールディング、輸送、および活性を回復させる薬剤、例えば、低分子または高分子が、特に、1種類の薬剤の作用機構によって複数の別個のリソソーム性蓄積症が寛解できれば、極めて望ましいだろう。両方ともFDAに認可された高血圧薬であるジルチアゼムまたはベラパミルを用いてL型Ca²⁺チャンネルを阻害すると、ゴーシェ病患者由来線維芽細胞において、N370SおよびL444Pグルコセレブロシダーゼ(GC)ホメオスタシスが部分的に回復する。後者の変異は難治性神経障害性疾患に関連する。ジルチアゼム構造-活性研究から、ミスフォールディングを受けやすいタンパク質を折り畳む小胞体の能力を増強するのは、このCa²⁺チャンネル遮断薬活性であることが示唆されている。重要なことに、ジルチアゼムおよびベラパミルは、糖タンパク質およびヘパラン硫酸分解に必須の酵素が関与する他の2つの別個のLSD、すなわち、それぞれ、α-マンノシドーシスおよびIIIA型ムコ多糖症でも、酵素ホメオスタシスを部分的に回復させる。

従って、本発明の1つの態様は、カルシウムチャンネル遮断薬を投与する工程を含むLSDを治療する方法に関する。「カルシウムチャンネル遮断薬」という用語は、電位依存性カルシウムチャンネルを遮断する薬剤を指す。「カルシウムチャンネル遮断薬」という用語の同義語は、カルシウムチャンネルアンタゴニスト、カルシウムチャンネル阻害剤、およびカルシウム流入遮断薬であり、これらの用語は本明細書において同義に用いられる。カルシウムチャンネル遮断薬には、「律速」薬剤、例えば、ベラパミルおよびジルチアゼム、ならびにジヒドロピリジングループのカルシウムチャンネル遮断薬が含まれる(Meredith et al. (2004). J of Hypertension 22: 1641-1648)。カルシウムチャンネル遮断薬の具体例は、アムロジピン、フェロジピン、イスラジピン、ラシジピン、ニカルジビン、ニフェジピン、ニグルジピン、ニルジピン、ニモジピン、ニソルジピン、ニトレンジピン、ニバルジピン、リョシジン(ryosidine)、アニパミル(anipamil)、ジルチアゼム、フェンジリン、フルナリジン、ガロパミル、ミベフラジル、プレニルアミン、チアパミル、ベラパミル、マレイン酸ペルヘキシリン、フェンジリンおよびプレニルアミン、ならびにその任意の塩、エステル、アミド、プロドラッグ、または他の誘導体である。本発明の1つの態様において、カルシウムチャンネル遮断薬はL型Ca²⁺チャンネル遮断薬である。別の態様において、本発明は、L型カルシウムチャンネルの活性を阻害する工程を含む、LSDを治療する方法である。さらなる態様において、本発明は、ER中の1つまたは複数のカルシウム結合シャペロンの発現を増やす工程を含む、LSDを治療する方法である。さらなる態様において、本発明は、ER中の1つまたは複数のカルシウム結合シャペロンの活性を増やす工程を含む、LSDを治療する方法である。さらに別の態様において、本発明は、L型Ca²⁺カルシウムチャンネル遮断薬を投与することによって、ER中の1つまたは複数のカルシウム結合シャペロンの発現および/または活性を増やす方法である。例示的なカルシウム結合シャペロンタンパク質は、BiP、カルネキシン、およびカルレチキュリンである。

カルシウムホメオスタシスを操作する別のアプローチは、ERカルシウム受容体の活性を調節することによるものである。ERカルシウム受容体には、例えば、リアノジン受容体(RyR)、イノシトール3-リン酸受容体(IP3R)、およびSERCAポンプタンパク質が含まれる。RyRおよびIP3Rは、ERからのカルシウム流出を媒介するのに対して、SERCAポンプタンパク質は、ERへのカルシウム流入を媒介する。1つの態様において、ER中のカルシウム濃度は、RyRを阻害することによって増加する。3種類のRyRサブタイプ、RyR1、RyR2、およびRyR3がある。RyR受容体を阻害する例示的な方法は、受容体アンタゴニストの投与、および、例えば、アンチセンス核酸を投与することによる、またはRNA干渉もしくはDNA干渉を使用することによる受容体の発現の阻害である。例示的なRyR受容体アンタゴニストは、ダントロレン、リアノジン、アズモレン(azumolene)、カルクエストリン(calquestrin)、およびプロカインである。1つの態様において、RyRアンタゴニストはダントロレンである。さらなる態様において、ER中のカルシウム濃度は、少なくとも2種類のRyRサブタイプを阻害することによって増加する。

さらに別の態様において、本発明は、RyRを阻害し、薬理学的シャペロンを投与する工程を含む、LSDを治療する方法である。下記に示したように、ダントロレンと薬理学的シャペロンと組み合わせて投与すると、相乗作用して、変異体グルコセレブロシダーゼ(GC)活性が回復する。

さらなる態様において、本発明は、LSDを治療する方法を必要とする患者に、ジルチアゼムおよびベラパミルおよびその塩、エステル、アミド、プロドラッグからなる群より選択されるタンパク質恒常性制御因子を投与する工程を含む、LSDを治療する方法である。

本発明は、特定の方法、試薬、化合物、組成物、または生物システムに限定されず、もちろん、これらは異なってもよいことが理解されるはずである。本明細書において使用する用語は特定の態様を説明するのにすぎず、限定を目的としないことも理解されるはずである。本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は、特に内容によってはっきり規定されていない限り複数の指示物を含む。従って、例えば、「細胞(a cell)」についての言及は、2つまたはそれ以上の細胞の組み合わせを含む。

本明細書で使用する「約」とは、測定可能な値、例えば、量、期間などを指している場合、指定値からの±20％または±10％、より好ましくは±5％、さらにより好ましくは±1％、さらにより好ましくは±0.1％のばらつきが、開示された方法を実施するのに適しているので、このようなばらつきを含むことを意味する。

特に定義のない限り、本明細書において使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および材料に類似するまたは均等な任意の方法および材料を、本発明を試験するための実施において使用することができるが、好ましい材料および方法を下記で説明する。本発明の説明および特許請求の範囲では、以下の用語が用いられる。

「タンパク質ホメオスタシス」または「タンパク質恒常性」とは、多くの場合、転写および翻訳の変化によって細胞の生得的な生物学的特性を再適応させることによって、プロテオームを構成する個々のタンパク質の濃度、コンホメーション、結合相互作用、例えば、四次構造、および位置を制御することを指す。タンパク質恒常性は、タンパク質フォールディング/ミスフォールディングの化学的特性の影響を受け、ならびにタンパク質合成、フォールディング、コンホメーション、結合相互作用、輸送、脱凝集および分解に影響を及ぼす、相互作用および競合する生物学的経路からなる非常に多くの調節されたネットワークの影響を受ける。

タンパク質交換および薬理学的シャペロン/キネティック安定剤アプローチとは対照的に、タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする疾患を治療するために本明細書において提供される方法は、タンパク質恒常性制御因子の使用を含む、タンパク質恒常性を回復させる治療方針を提供する。タンパク質恒常性制御因子は、タンパク質交換および薬理学的シャペロン/キネティック安定剤アプローチとは別個のものである。これらのタンパク質恒常性制御因子は、細胞の生得的な生物学的特性を再適応させることによって、ある特定のタンパク質またはタンパク質ファミリーの濃度、コンホメーション、結合相互作用、例えば、四次構造、および/または位置を操作するのに使用することができる低分子または生物学的因子(siRNA、shRNA、アンチセンスRNA、リボザイム、cDNA、またはタンパク質)でもよい。これは、タンパク質合成、フォールディング、輸送、および分解経路に影響を及ぼすことに関与するプロセスを含むタンパク質恒常性ネットワークを変えることによって達成することができる。タンパク質恒常性制御因子は、多くの場合、寿命およびタンパク質ホメオスタシス、ならびに/またはシャペロン、フォールディング酵素、および代謝経路によって作られた低分子を含むタンパク質恒常性ネットワークを含むある特定の経路の成分の転写および翻訳を制御する、熱ショック応答(HSR)経路、小胞体ストレス応答(UPR)経路、およびCa²⁺シグナル伝達経路を含むシグナル伝達経路を操作することによって機能する。タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態の治療を必要とする患者において、タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態を治療するための方法は、欠陥のあるタンパク質恒常性に関連する機能喪失型疾患および機能獲得型疾患の両方を含み、これらは、タンパク質恒常性制御因子を用いて治療することができる。

「タンパク質恒常性制御因子」とは、細胞タンパク質ホメオスタシスを増強する低分子、siRNA、生物学的因子を指す。タンパク質恒常性制御因子は、熱ショック応答もしくは小胞体ストレス応答またはその両方を含むが、これに限定されないシグナル伝達経路を操作して、タンパク質恒常性ネットワーク成分の転写および翻訳を引き起こすことによって機能する。例えば、セラストロールは熱ショック応答を活性化して、シャペロン、コシャペロンなどの発現を増強させる。Westerheide et al., J Biol Chem 279: 56053-56060, 2004; Yang et al., Cancer Res 66: 4758-4765, 2006。タンパク質恒常性制御因子はまた、タンパク質シャペロンの転写もしくは翻訳をアップレギュレートすることによって、またはタンパク質シャペロンの分解を阻害することによってタンパク質シャペロンを調節することができる。さらに、タンパク質恒常性制御因子は、凝集経路またはディスアグリガーゼ活性をアップレギュレートすることができる。タンパク質恒常性ネットワークは多くのクライアントタンパク質のフォールディングおよび輸送を同時に支持するように進化してきたので、1種類のタンパク質恒常性制御因子によって、複数の疾患におけるタンパク質恒常性が回復できるはずである。

さらに、タンパク質恒常性制御因子は、薬理学的シャペロン/キネティック安定剤とは別個の作用機構を有し、薬理学的シャペロン/キネティック安定剤の確立されている有用性を補う。Asano et al., Eur J Biochem 267: 4179-4186, 2000; Bouvier, Chem Biol 14: 241-242, 2007; Fan et al., Nat Med 5: 112-115, 1999; Sawkar et al., Proc Natl Acad Sci USA 99: 15428-15433, 2002; Brown et al., J Clin Invest 99: 1432- 1444, 1997; Ulloa-Aguirre et al., Traffic 5: 821-837, 2004。1つの局面において、タンパク質恒常性制御因子は、変異タンパク質のホメオスタシスを増強できるが、変異タンパク質に結合しない点でシャペロンとは別個のものである。別の局面において、1つの分子がタンパク質恒常性制御因子部分およびシャペロン部分を含み、二重機能性を有する。

タンパク質恒常性を変える細胞内調節シグナル伝達経路には、細胞質タンパク質恒常性を調節する「熱ショック応答(HSR)」、エキソサイトーシス経路タンパク質恒常性を維持する「小胞体ストレス応答(UPR)」、および生物の寿命管理に関連し、タンパク質ホメオスタシスも制御する経路が含まれる。これらには、インシュリン/インシュリン増殖因子受容体シグナル伝達経路および食事制限に関連する経路ならびにミトコンドリア電子伝達系プロセスに関連するプロセスが含まれる。発生中に絶えず変化するプロテオームが存在するために、新たなタンパク質が存在するために、および加齢により誤って折り畳まれたタンパク質が蓄積するために、細胞タンパク質恒常性の時間的適応が必要である。プロテオームの忠実度は、発生および加齢の間に、ならびに高いタンパク質フォールディングおよび輸送能力を要求する病原体への曝露によって攻撃されるので、細胞は、タンパク質恒常性制御の消失に応答するためにストレスセンサーおよび誘導性経路を利用する。これらには、細胞質タンパク質恒常性を調節する「熱ショック応答(HSR)」ならびにエキソサイトーシス経路タンパク質恒常性の維持を助ける「小胞体ストレス応答(UPR)」が含まれる。

「薬理学的シャペロン」または「キネティック安定剤」とは、既にある定常状態レベルの折り畳まれた変異体タンパク質に結合し、折り畳みを安定化することによってフォールディング平衡を化学的に増強する化合物を指す。Bouvier, Chem Biol 14: 241-242, 2007; Fan et al., Nat Med 5: 112-115, 1999; Sawkar et al., Proc Natl Acad Sci USA 99: 15428-15433, 2002; Johnson and Kelly, Accounts of Chemical Research 38: 911-921, 2005。対照的に、タンパク質恒常性制御因子は、多くの場合、部分的に折り畳まれたコンホメーションアンサンブルに結合して、よりネイティブな構造を有する中間体に進ませ、最終的には、輸送されるように折り畳まれた変異体タンパク質の濃度を上げる、シャペロン/コシャペロンおよびフォールディング酵素レベルを協調して増やすことによって、フォールディングの生物学的特性に影響を及ぼす。

「凝集経路」または「凝集活性」とは、タンパク質を集合および凝集する、生物によって示される活性、時として、毒性前駆体を毒性の低い凝集物に凝集する活性を指す。タンパク質フォールディングの完全性は、寿命の決定および凝集関連タンパク質毒性(proteotoxicity)の寛解において役割を果たしている可能性がある。

「脱凝集経路」、「脱凝集活性」、または「ディスアグリガーゼ」とは、タンパク質凝集物、例えば、アミロイドタンパク質またはその前駆体を脱集合およびタンパク分解する、ヒトを含む多くの生物によって示される活性を指す。

「小胞体ストレス応答(UPR)経路」とは、小胞体(ER)の中のストレス感知機構を指す。ERは、総称して小胞体ストレス応答とも呼ばれる、3つまでの統合された細胞内シグナル伝達経路アーム、例えば、UPR関連ストレスセンサー、IRE1、ATF6、およびPERKを活性化することによって、内腔の中の折り畳まれていないタンパク質の蓄積に応答する。小胞体ストレス応答は、分泌経路内で機能する非常に多くの遺伝子の発現を調節する。Ron et al., Nat Rev Mol Cell Biol 8: 519-529, 2007; Schroeder et al., Ann Rev Biochem 74: 739-789, 2005。UPR関連シャペロンには、BiP、GRP94、およびカルレチキュリンが含まれるが、これに限定されない。

「熱ショック応答(HSR)経路」とは、可溶性内腔酵素として分泌経路内で折り畳まれ、輸送されるタンパク質のタンパク質恒常性に影響を及ぼし得る、サイトゾル中の高発現の熱ショックタンパク質(シャペロン/コシャペロン/フォールディング酵素)を指す。シャペロンを含むサイトゾル因子は、フォールディングおよび輸送を許容するように分泌経路を適応させるのに必須である可能性が高い。Bush et al., J Biol Chem 272: 9086-9092, 1997; Liao et al., J Cell Biochem 99: 1085-1095, 2006; Westerheide et al., J Biol Chem 279: 56053-56060, 2004。

HSR関連シャペロンには、Hsp/c40ファミリーメンバー、Hsp/c70ファミリーメンバー、Hsp/c90ファミリーメンバー、Aha1、オーキシリン、Bag1、CSPを含むHsp/c40/70/90コシャペロン、ならびに熱ショック小タンパク質ファミリーメンバーが含まれるが、これに限定されない。HSR経路はまた、細胞質内にあり、機能するプロテオームに直接影響を及ぼす。

UPR関連シャペロンには、GRP78/BiP、GRP94/gp96、GRP170/ORP150、GRP58/ERp57、PDI、ERp72、カルネキシン、カルレチキュリン、EDEM、Herp、ならびにコシャペロンSIL1およびP58IPKが含まれるが、これに限定されない。

「フォールディング酵素」とは、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ(PDI)によるジスルフィド結合形成およびペプチジルプロリルcis-transイソメラーゼ(PPI)によるペプチジル-プロリルcis-transアミド結合異性化を含むが、これに限定されない、フォールディングにおいてゆっくりとした段階を触媒するタンパク質を指す。

「治療する」または「治療」は、疾患の症状、合併症、または生化学的徴候の発症を阻止または遅延して、症状を緩和または寛解するために、あるいは疾患、状態、または障害(例えば、機能獲得型障害すなわち毒性凝集物の蓄積に関連する疾患、例えば、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、加齢黄斑変性、封入体筋炎、およびパーキンソン病;または機能喪失型障害、例えば、リソソーム性蓄積症、嚢胞性線維症、またはα1-アンチトリプシン欠損関連気腫)のさらなる発症を停止または阻害するために、本発明の局面の組成物、化合物、または薬剤を投与することを含む。本明細書で使用する、「状態を軽減する」もしくは「状態を軽減するために」または「疾患を軽減する」もしくは「疾患を軽減するために」という句は、状態または疾患の1つまたは複数の症状を寛解することを含む。「状態を排除する」もしくは「状態を排除するために」または「疾患を排除する」もしくは「疾患を排除するために」という句は、状態または疾患の症状の全てまたは実質的に全てを寛解することを指す。「治療する」とは、客観的パラメータまたは主観的パラメータ、例えば、寛解;軽快;症状の減少、もしくは患者に対する疾患状態の忍容性の増大;変性速度の遅延もしくは低下;または最終的な変性時点の衰弱の緩和を含めて、疾患、状態、または障害(例えば、機能獲得型障害すなわち毒性タンパク質凝集物の蓄積に関連する疾患または機能喪失型障害、例えば、リソソーム性蓄積症)の治療または寛解または阻止が成功したという任意の徴候をさらに指す。症状の治療または寛解は、医師による検査の結果を含めて客観的パラメータまたは主観的パラメータに基づいてもよい。従って、「治療する」という用語は、機能獲得型障害すなわち毒性凝集物の蓄積に関連する疾患または機能喪失型障害、例えば、リソソーム性蓄積症に関連する症状または状態の発症を阻止もしくは遅延するために、緩和するために、または停止もしくは阻害するために、本発明の局面の化合物または薬剤を投与することを含む。「治療効果」という用語は、被験体における疾患、疾患の症状、または疾患の副作用を軽減、排除、または阻止することを指す。本発明の方法を用いて「治療する」または「治療」は、機能獲得型障害すなわち毒性凝集物の蓄積に関連する疾患または機能喪失型障害、例えば、リソソーム性蓄積症の高いリスクがあり得るが、症状をまだ経験していないもしくは症状を示していない被験体において症状の発症を阻止すること、疾患の症状を阻害すること(疾患の発症を遅延もしくは停止すること)、疾患の症状もしくは副作用を緩和すること(対症療法を含む)、および変性疾患の症状を緩和すること(後退させること)を含む。治療は、(疾患の発症を阻止もしくは遅延するために、またはその臨床症状もしくは準臨床症状の発現を阻止するために)予防的でもよく、疾患または状態が発現した後の症状の治療的抑制または緩和でもよい。特定の疾患または状態を治療するためにタンパク質恒常性制御因子を投与するための投与計画は、同じ疾患または状態を治療するために用いられる他の薬物の投与計画より頻度が少ない可能性が高い。

「患者」、「被験体」、「脊椎動物」、または「哺乳動物」は同義に用いられ、哺乳動物、例えば、ヒト患者および非ヒト霊長類、ならびに実験動物、例えば、ウサギ、ラット、およびマウス、ならびに他の動物を指す。動物には、全ての脊椎動物および無脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、例えば、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、線虫(Cenorhabditis elegans)、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)、両生類、およびハ虫類が含まれる。

機能喪失型疾患およびリソソーム性蓄積症
「機能喪失型疾患」とは、不十分なタンパク質フォールディングによってタンパク質が過剰に分解されることを特徴とする疾患の一群を指す。機能喪失型疾患には、例えば、嚢胞性線維症、リソソーム性蓄積症、およびフォンヒッペル・リンダウ(VHL)病が含まれる。嚢胞性線維症において、変異または欠陥のある酵素は嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)である。このタンパク質の最もよく見られる変異の1つは、3つのヌクレオチドの欠失(Δ)であるΔF508であり、これにより、タンパク質の508番目(508)の位置にあるアミノ酸フェニルアラニン(F)が消失する。1つの態様において、本発明は、機能喪失型疾患を治療する方法を必要とする患者において機能喪失型疾患を治療する方法であって、変異酵素の活性を改善または回復するのに有効な量のタンパク質恒常性制御因子を前記患者に投与する工程を含む方法に関する。さらなる態様において、タンパク質恒常性制御因子は、変異酵素の正しいフォールディングを促進することによって変異酵素の活性を回復させる。

「リソソーム性蓄積症」とは、様々な組織において生じ得る特定のリソソーム酵素が欠損しており、そのために、欠損酵素によって通常分解される分子が蓄積することを特徴とする疾患の一群を指す。リソソーム酵素の欠損は、リソソーム加水分解酵素またはリソソーム輸送に関与するタンパク質にあってもよい。代表的なリソソーム疾患および関与する欠陥酵素を表1に列挙する。

ゴーシェ病は1882年にPhillipe C. E. Gaucherによって初めて述べられ、知られている最も古くかつ最もよく見られるリソソーム性蓄積症である。認められている3つの臨床型の中でI型が最もよく見られ、神経系が関与しない慢性経過をたどる。2型および3型は両方ともCNS成分を有し、前者は2歳までに死亡する急性小児型であり、後者は亜急性若年型である。1型ゴーシェ病の発生率は、一般的に、出生児50,000人あたり約1人、アシュケナージ系ユダヤ人(Ashkenazim)では出生児400人あたり約1人である。Kolodny et al., 1998, 「Storage Diseases of the Reticuloendothelial System」, In: Nathan and Oski's Hematology of Infancy and Childhood, 5th ed., vol. 2, David G. Nathan and Stuart H. Orkin, Eds., W.B. Saunders Co., pages 1461-1507。ゴーシェ病はグルコシルセラミドリピドーシスとも知られ、酵素グルコセレブロシダーゼの不活性化およびグルコセレブロシドの蓄積によって引き起こされる。グルコセレブロシダーゼは、通常、グルコセレブロシドからグルコースおよびセラミドへの加水分解を触媒する。ゴーシェ病では、グルコセレブロシドは、詰め込まれている組織マクロファージに蓄積し、典型的には、肝臓、脾臓および骨髄に、時として、肺、腎臓、および腸に見出される。特徴的な進行性肝脾腫ならびに二次的な病的骨折を伴う骨壊死および骨減少を含む骨格合併症に加えて、二次的な血液学的続発症には重篤な貧血および血小板減少が含まれる。例えば、米国特許出願第2007/0280925号を参照されたい。

ファブリー病は、セラミドトリエキソシダーゼとも知られるα-ガラクトシダーゼA(α-GalA)の欠損を特徴とするX連鎖劣性遺伝性LSDであり、末端α-ガラクトシル残基を有するスフィンゴ糖脂質、例えば、グロボトリアオシルセラミド(GL-3)の蓄積を介して血管性および他の疾患発現を引き起こす。Desnick R J et al., The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease 7:2741-2784, 1995。症状には、無汗症(発汗が無いこと)、指の痛み、左心室肥大、腎臓症状、および虚血性脳卒中が含まれることがある。症状の重篤度は劇的に異なる。Grewal, J. Neurol. 241: 153-156,1994。心臓に限定される症状のある変種が認められており、その発生率は、かつて考えられていたものより高い可能性がある。Nakao, N. Engl. J. Med. 333: 288-293, 1995。まれな変種はかなり晩年になってから認められるが、臨床的覚醒状態のある場合は小児期での診断が可能である。Ko et al., Arch. Pathol. Lab. Med. 120: 86-89,1996; Mendez et al., Dement. Geriatr. Cogn. Disord. 8: 252-257, 1997; Shelley et al., Pediatric Derm. 12: 215-219, 1995。ファブリー病が診断される平均年齢は29歳である。

ニーマン・ピック病はスフィンゴミエリンリピドーシスとも知られ、細網内皮系の泡沫細胞浸潤を特徴とする障害の一群を含む。ニーマン・ピック病の泡沫細胞にはスフィンゴミエリンが詰め込まれ、さらに少ない程度で、コレステロールを含む他の膜脂質が詰め込まれている。ニーマン・ピック病は、A型およびB型の疾患では酵素スフィンゴミエリナーゼの不活性化によって引き起こされ、残存酵素活性はB型の方が27倍高い。Kolodny et al., 1998, 同上。ニーマン・ピック病における主要な臓器系の病態生理は以下の通り簡単にまとめることができる。脾臓は、A型およびB型患者の最も広範に関与する臓器である。肺は様々な程度で関与し、B型患者における肺症状は、慢性気管支肺炎による死亡の主因である。肝臓合併症は様々であるが、重篤な患者は、生命をあやうくする肝硬変、門脈圧亢進症、および腹水を有する場合がある。リンパ節の合併症は、疾患の重篤度に応じて様々である。中枢神経系(CNS)合併症によって、ニーマン・ピック病の主要な型が区別される。ほとんどのB型患者はCNS合併症を経験しないのに対して、CNS合併症はA型患者の特徴である。腎臓は、ニーマン・ピック病に中程度にしか関与しない。

ムコ多糖症(MPS)は、デルマタン硫酸およびヘパラン硫酸として知られる特定のグリコサミノグリカン(ムコ多糖またはGAG)の分解を触媒する酵素の欠損によって引き起こされるLSDの一群を含む。GAGは、反復二糖単位を特徴とする長い非分枝多糖を含有し、体内では、プロテオグリカンを形成するコアタンパク質と連結した状態で見出される。プロテオグリカンは主に細胞外マトリックス内および細胞表面上にあり、関節をなめらかにし、構造完全性に寄与する。Neufeld et al., The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Diseases 7:2465-2494, 1995。

いくつかのムコ多糖症は、GAG分解に影響を及ぼす特定の酵素によって区別される。例えば、MPS I(ハーラー・シャイエ症候群)は、デルマタン硫酸の末端α-L-イズロン酸残基を加水分解するα-L-イズロニダーゼの欠損によって引き起こされる。MPS Iの症状は、軽度(MPS ISまたはシャイエ病)、中間型(MPS IHSまたはハーラー・シャイエ病)から重度(MPS IHまたはハーラー病)までの臨床連続(clinical continuum)に沿って変化し、臨床症状は、残存する酵素活性の程度と相関する。ハーラー症候群と診断される平均年齢は約9ヶ月であり、最初に現われる症状は、多くの場合、以下:きめの粗い顔つき、骨格異常、不器用、硬直、感染症、およびヘルニアの中に含まれる。Cleary et al., Acta. Paediatr. 84: 337-339, 1995; Colville et al., Child: Care, Health and Development 22: 31-361996, 1996。

ムコ多糖症の他の例には、ハンター症候群 (MPS IIまたはイズロン酸スルファターゼ欠損症)、モルキオ症候群(MPS IV;A型およびB型ではそれぞれガラクトサミン-6-スルファターゼ欠損症およびβ-ガラクトシダーゼ欠損症)、ならびにマロトー・ラミー症候群(MPS VIまたはアリールスルファターゼB欠損症)が含まれる。Neufeld et al., 1995, 同上; Kolodny et al., 1998, 同上。

ポンペ病(糖原貯蔵症II型、酸性マルターゼ欠損症、および糖原病II型とも知られる)は、α-グルコシダーゼ(酸性α-グルコシダーゼおよび酸性マルターゼとも知られる)の欠損を特徴とする常染色体劣性LSDである。酵素α-グルコシダーゼは、通常、リソソーム内でのグリコーゲンからグルコースへの分解に関与し、マルトースも分解することができる。Hirschhorn, The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease 7:2443-2464, 1995。ポンペ病の3つの認められている臨床型(小児型、若年型、および成人型)は、残存しているα-グルコシダーゼ活性のレベルと相関付けられている。Reuser et al., Muscle & Nerve Supplement 3: S61-S69, 1995。

小児型ポンペ病(I型またはA型)は最もよく見られ、かつ最も重篤であり、生後二年目以内での発達不全、全身性筋緊張低下、心肥大、および心呼吸系不全を特徴とする。若年型ポンペ病(II型またはB型)は重篤度が中程度であり、心臓肥大を伴わない筋肉症状の優勢を特徴とする。若年型ポンペ病の個体は、通常、呼吸不全により、通常、20歳になる前に死亡する。成人型ポンペ病(III型またはC型)は、ゆっくりと進行する筋障害として、10代にまたは60歳と年を取ってから現われることが多い。Felice et al., Medicine 74:131-135,1995。

ポンペ病では、α-グルコシダーゼは、グリコシル化、リン酸化、およびタンパク質分解プロセシングによって広範囲に翻訳後修飾されることが示されている。最適なグリコーゲン触媒作用には、リソソーム内でのタンパク質分解によって110キロダルトン(kDa)前駆体から76kDaおよび70kDa成熟型に変換されることが必要である。

α-1アンチトリプシン関連気腫は、白人集団において最もよく見られる遺伝性疾患の1つである。最もよく見られる症状は肺疾患(気腫)である。α-1アンチトリプシン疾患にかかっている人は肝臓疾患および/または肝臓癌も発症する可能性がある。この疾患は、タンパク質α-1アンチトリプシンの欠損によって引き起こされる。肺疾患の発症は、有害環境、例えば、喫煙タバコへの曝露によって促進される。α-1アンチトリプシン疾患には遺伝的要素がある。発症年齢、進行速度、および症状のタイプは家族間および家族内で異なる。

フォンヒッペル・リンダウ病(VHL)は、身体のある特定の部分の異常な腫瘍成長(血管腫症)を特徴とする、まれな遺伝性の多系統性障害である。中枢神経系(CNS)の腫瘍は良性であり、血管の集まり(血管芽腫)からなる。血管芽腫は、脳、目の網膜、および神経系の他の領域において発症することがある。他のタイプの腫瘍が副腎、腎臓、または膵臓において発生する。VHLの個体はまた、ある特定のタイプの癌、特に、腎臓癌について正常より高いリスクがある。VHLの場合、タンパク質恒常性制御因子が酵素機能を間接的に回復することができる。機能喪失型疾患の治療を必要とする患者において機能喪失型疾患を治療する方法であって、タンパク質、例えば、酵素のアダプターとして役立つ、変異したVHLタンパク質(pVHL)の活性を改善または回復させるのに有効な量のタンパク質恒常性制御因子を投与する工程を含む方法。pVHLのミスフォールディングは、ポリユビキチン化およびプロテアソーム分解のために酵素が低酸素誘導性転写因子(HIF)を標的とする能力を損なわせ、癌を引き起こす。タンパク質恒常性制御因子は酵素機能を間接的に回復させて、VHL病などの疾患を治療することができる。

遺伝性痙性対麻痺(HSPs)は進行性の下肢痙縮および脱力を特徴とする。大きなグアノシン三リン酸分解酵素であるアトラスチン(atlastin)酵素をコードするSPG3A遺伝子における変異が、常染色体優性遺伝性痙性対麻痺の2番目に最もよく見られる原因である。70人の遺伝性痙性対麻痺被験者からなる大規模なSPG3Aスクリーニングにおいて、新規のインフレーム欠失、p.del436Nが同定された。この欠失を特徴付けることによって、アトラスチンのグアノシン三リン酸分解酵素活性も、アトラスチンとスパスチン(spastin)との相互作用も影響を受けないことが分かった。興味深いことに、罹患患者からのリンパ芽球のイムノブロット分析から、アトラスチンタンパク質レベルがかなり低いことが証明され、このことは機能喪失型疾患機構を裏付けている。Annals of Neurology 61(6): 599-603, 2007。

マリネスコ・シェーグレン症候群の基礎となる遺伝子が同定されている。マリネスコ・シェーグレン症候群は、小脳性失調、進行性筋障害、および白内障を特徴とする。SIL1に4つの予想された疾患関連機能喪失型変異があることが同定された。SIL1は、熱ショックタンパク質70(HSP70)シャペロンHSPA5のヌクレオチド交換因子酵素をコードする。これらのデータは、Sil1およびHspa5の類似する空間的および時間的組織発現パターンと共に、SIL1-HSPA5相互作用およびタンパク質フォールディングの妨害がマリネスコ・シェーグレン症候群における主な病理であることを示唆している。Nature Genetics 37(12):1309-1311, 2005。

常染色体優性肥大性心筋症(HCM)は、筋節タンパク質の遺伝性欠陥によって引き起こされる。筋節タンパク質欠陥がホモ接合になることで劣性HCMが引き起こされるという仮説が試験された。3人の同胞において中腔(mid-cavitary)肥大および拘束性生理現象を特徴とする早期発症型心筋症が認められた家系を試験した。常染色体優性HCMの8つの遺伝子にわたるDNAマーカーのジェノタイピングによって、罹患した小児による必須のミオシン軽鎖遺伝子座において同一の父親ハプロタイプおよび母親ハプロタイプが遺伝していることが明らかになった。配列決定によって、これらの個体は、高度に保存されたアミノ酸のGlul43Lys置換がホモであり、この置換は150人の対照には存在しないことが分かった。Glul43Lys対立遺伝子を1つ有する家族には、晩年でも心エコー図およびECGが正常であったが、変異体対立遺伝子を2つ有する家族は小児期に重篤な心筋症を発症した。これらの知見は、心臓におけるミオシン軽鎖構造および機能の以前の研究と合わせると、機能喪失型疾患機構を示唆している。同じ筋節タンパク質に影響を及ぼす別個の変異によって、優性または劣性の心筋症が引き起こされることがある。高度に保存されたアミノ酸の静電荷逆転は、心臓の構造および機能を保存する代償機構の結果としてヘテロ接合体の状態では良性の場合がある。対照的に、筋節タンパク質欠陥のホモ接合体保因者は悪性経過を有する場合がある。Circulation 105(20):2337-2340, 2002。

機能獲得型疾患
「機能獲得型疾患」とは、高い凝集関連タンパク質毒性を特徴とする疾患を指す。これらの疾患において、細胞内および/または細胞外での排除より凝集が上回っている。機能獲得型疾患は加齢に関連することが多く、「毒性機能獲得」疾患とも呼ばれる。1つの態様において、本発明は、機能獲得型疾患を治療する方法を必要とする患者において機能獲得型疾患を治療する方法であって、タンパク質の凝集を減らすのに有効な量のタンパク質恒常性制御因子を前記患者に投与する工程を含む方法に関する。さらなる態様において、タンパク質恒常性制御因子は、タンパク質の正しいフォールディングを促進することによって、凝集経路を阻害することによって、またはディスアグリガーゼの活性を刺激することによって、タンパク質の凝集を減らす。さらなる態様において、タンパク質恒常性制御因子は、細胞傷害性を少なくするやり方で凝集に影響を及ぼす。

機能獲得型疾患には、タンパク質内にあるポリグルタミン反復または他のアミノ酸、例えば、アラニンにある反復の凝集に関連する神経変性疾患、レヴィー小体疾患、およびα-シヌクレイン凝集に関連する他の障害、筋萎縮性側索硬化症、トランスサイレチン関連凝集疾患、アルツハイマー病、年齢関連黄斑変性、封入体筋炎、ならびにプリオン病が含まれるが、これに限定されない。ポリグルタミン凝集に関連する神経変性疾患には、ハンチントン舞踏病、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症および淡蒼球ルイ体萎縮症、いくつかの種類の脊髄小脳失調症、ならびに脊髄性筋萎縮症および延髄性筋萎縮症が含まれるが、これに限定されない。アルツハイマー病は、2つのタイプの凝集物:Aβペプチドの細胞内凝集物および細胞外凝集物と微小管関連タンパク質tauの細胞内凝集物の形成を特徴とする。トランスサイレチン関連凝集疾患には、例えば、老人性全身性アミロイドーシス、家族性アミロイドニューロパシー、および家族性アミロイド心筋症が含まれる。レヴィー小体疾患はα-シヌクレインタンパク質の凝集を特徴とし、例えば、パーキンソン病を含む。プリオン病(伝達性海綿状脳症とも知られる)はプリオンタンパク質の凝集を特徴とする。例示的なヒトプリオン病は、クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)、変異型クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー症候群、致死性家族性不眠症、およびクールーである。

Gタンパク質およびシグナル伝達の分子障害は、機能獲得型疾患または機能喪失型疾患の原因となることがある。機能獲得型疾患は、GTPアーゼ活性の抑制によるGαの反応亢進によって引き起こされる。αs遺伝子(gsp)およびαi(gip2)の変異によって内分泌腫瘍が発生し、gspの異常発現によってマッキューン・オールブライト症候群および成長ホルモン分泌下垂体腺腫が発生する。AS変異、すなわち、αsのAla366→Ser(αs-A366S)による機能獲得型疾患および機能喪失型疾患は、精巣中毒症、およびオールブライト遺伝性骨形成異常を伴う偽性副甲状腺機能低下症Ia型を示す。αs-A366Sはドミナントポジティブ効果およびドミナントネガティブ効果を示す。αs-A366Sは受容体によるGs活性化を模倣し、温度感受性の特徴を示す。αsの様々な様式の機能喪失が特定されており、ドミナントネガティブ効果機構につながる。Jikken Igaku 14(2): 219-224, 1996。

RNA干渉法およびDNA干渉法
A.短鎖干渉RNA(RNAi)
RNA干渉(RNAi)は、二本鎖RNA(dsRNA)によって媒介される転写後遺伝子サイレンシング機構であり、アンチセンスおよびリボザイムをベースとするアプローチとは別個のものである。Jain, Pharmacogenomics 5: 239-42, 2004。RNA干渉は、タンパク質ホメオスタシスを改善または回復させて、患者の状態を軽減もしくは排除する、またはその発生もしくは再発を阻止するのに有効な量のタンパク質恒常性制御因子を患者に投与することによって、タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態の治療を必要とする患者において、タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態を治療するための方法において有用である。dsRNA分子は、最初に、DICERと呼ばれるRNアーゼIII様酵素によりプロセシングされて、2つの21nt鎖からなるさらに小さなdsRNA分子にされた後に、様々なタイプの細胞においてmRNAの配列特異的分解を誘導すると考えられている。これらの鎖はそれぞれ5'リン酸基および3'ヒドロキシルを有し、他方の鎖と正確に相補する19nt領域を含み、その結果、2nt-3'オーバーハングに隣接する19nt二重鎖領域がある。Bernstein et al., Nature 409: 363, 2001。このように、RNAiは短鎖干渉RNA(siRNA)によって媒介され、siRNAは、典型的には、それぞれの鎖に、長さが約19ヌクレオチドの二本鎖領域と1〜2ヌクレオチドの3'オーバーハングを含み、その結果、全長が約21〜23ヌクレオチドとなる。哺乳動物細胞において、約30ヌクレオチドより長いdsRNAは、典型的には、インターフェロン応答を介して非特異的mRNA分解を誘導する。しかしながら、哺乳動物細胞にsiRNAが存在すると、インターフェロン応答が誘導されるのではなく、配列特異的遺伝子サイレンシングが起こる。

一般的に、短鎖干渉RNA(siRNA)は、好ましくは、約19塩基対長のRNA二重鎖を含み、任意で、1つまたは2つの一本鎖オーバーハングまたはループをさらに含む。siRNAは、一緒にハイブリダイズした2本のRNA鎖を含んでもよく、自己ハイブリダイズ部分を含む1本のRNA鎖を含んでもよい。siRNAは、1つまたは複数の遊離鎖末端を含んでもよく、リン酸基および/またはヒドロキシル基を含んでもよい。siRNAは、典型的には、標的転写物とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする部分を含む。siRNAの一方の鎖(またはsiRNAの自己ハイブリダイズ部分)は、典型的には、標的転写物の一領域と正確に相補する。このことは、siRNAが、ミスマッチが1つもなく標的転写物にハイブリダイズすることを意味する。完全な相補性が実現しない本発明のある特定の態様では、一般的に、siRNA末端に、またはsiRNA末端の近くにミスマッチが位置することが好ましい。

siRNAは、トランスフェクション、エレクトロポレーション、もしくはマイクロインジェクションなどの方法によって哺乳動物細胞に導入された時に、または任意の様々なプラスミドをベースとするアプローチによって細胞内で発現された時に、遺伝子の発現をダウンレギュレートすることが示されている。siRNAを用いたRNA干渉は、例えば、Tuschl, Nat. Biotechnol. 20: 446-448, 2002において概説されている。Yu, J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci, 99: 6047-6052, 2002; Sui, et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA. 99: 5515-5520, 2002; Paddison, et al., Genes and Dev. 16: 948-958, 2002; Brummelkamp, et al., Science 296: 550-553, 2002; Miyagashi, et al., Nat. Biotech. 20: 497-500, 2002; Paul, et al., Nat. Biotech. 20: 505-508, 2002も参照されたい。これらのおよび他の参考文献に記載のように、siRNAは、2本の個々の核酸鎖、またはヘアピン(ステム-ループ)構造を形成することができる自己相補領域を有する1本の鎖からなってもよい。構造、長さ、ミスマッチの数、ループの大きさ、オーバーハングにおけるヌクレオチドの同一性などの多くのばらつきが、siRNAにより誘発される有効な遺伝子サイレンシングと一致する。どの理論にも理論に拘束されるつもりはないが、様々な異なる前駆体が細胞内プロセシング(例えば、DICERにより細胞内プロセシング)されると、遺伝子サイレンシングを効果的に媒介することができるsiRNAが生成されると考えられている。一般的に、イントロンではなくエキソンを標的化することが好ましく、標的転写物の3'部分の中の領域に相補的な配列を選択することも好ましい場合がある。一般的に、ほぼ等モル比の異なるヌクレオチドを含有する配列を選択し、1種類の残基が複数回繰り返される領域を避けることが好ましい。

従って、siRNAは、それぞれの鎖に、長さが約19ヌクレオチドの二本鎖領域と1〜2ヌクレオチドの3'オーバーハングを有し、その結果、全長が約21〜23ヌクレオチドとなるRNAを含んでもよい。本明細書で使用するように、siRNAは、インビボでプロセシングされて、このような分子を生じ得る様々なRNA構造も含む。このような構造は、互いにハイブリダイズしてステムを形成する2つの相補要素、ループ、任意で、オーバーハング、好ましくは、3'オーバーハングを含有するRNA鎖を含む。好ましくは、ステムは約19bp長であり、ループは、約1〜20、より好ましくは約4〜10、最も好ましくは約6〜8nt長であり、および/またはオーバーハングは、約1〜20、より好ましくは約2〜15nt長である。本発明のある特定の態様において、ステムは長さが最小で19ヌクレオチドであり、長さが約29ヌクレオチドまででもよい。4ヌクレオチドまたはそれ以上からなるループは、さらに短いループより立体的制約を受ける可能性が低く、従って、好ましい場合がある。オーバーハングは5'リン酸および3'ヒドロキシルを含んでもよい。オーバーハングは複数のU残基、例えば、1〜5個のU残基を含んでもよいが、これを含む必要はない。前記の古典的なsiRNAは、標的とされたmRNAの分解を誘発し、それによって、タンパク質合成速度も遅くする。古典的経路を介して作用するsiRNAに加えて、テンプレート転写物の3'UTRに結合するある特定のsiRNAは、古典的なRNA干渉に関連するが、別個の機構によって、例えば、転写物の安定性を弱めるのではなく転写物の翻訳を少なくすることによって、テンプレート転写物によってコードされるタンパク質の発現を阻害してもよい。このようなRNAはミクロRNA(mRNA)とも呼ばれ、典型的には、長さが約20〜26ヌクレオチド、例えば、長さが22ntである。これらは、小分子RNA(stRNA)またはmRNA前駆体として知られる、さらに大きな前駆体から得られると考えられている。これらの前駆体は、典型的には、約4〜15ntループを有する約70nt長である。Grishok, et al., Cell 106: 23-24, 2001; Hutvagner, et al., Science 293: 834-838, 2001; Ketting, et al., Genes Dev., 15: 2654-2659, 2001。このタイプの内因性 RNAは、哺乳動物を含む多くの生物において同定されており、この転写後遺伝子サイレンシング機構が広範囲にあり得ることを示唆している。 Lagos-Quintana, et al., Science 294: 853-858, 2001; Pasquinelli, Trends in Genetics 18: 171-173, 2002、および前述の2つの論文の中の参考文献。マイクロRNAは、哺乳動物細胞において、標的部位を含有する標的転写物の翻訳をブロックすることが示されている。Zeng, et al., Molecular Cell 9: 1-20, 2002。

siRNA、例えば、3'UTR(または標的転写物内の他の場所)に結合し、翻訳を阻害する天然または人工の(すなわち、ヒトによって設計された)mRNAは、siRNA/テンプレート二重鎖の多数のミスマッチ、特に、二重鎖の中心領域内のミスマッチを許容することができる。実際に、天然のstRNAは、インビトロで翻訳を阻害すると示されているmRNAと同様に、このようなミスマッチを頻繁に示すので、いくらかのミスマッチが望ましいまたは必要とされる可能性があるという証拠がある。このようなsiRNAは、例えば、標的転写物とハイブリダイズする時、ミスマッチ領域で分けられた完全に相補する2つの領域を頻繁に含む。様々な構造が可能である。例えば、mRNAは複数の非同一性領域(ミスマッチ)を含むことがある。標的およびmRNAが両方とも不対ヌクレオチドを含むという点で、非同一性領域(ミスマッチ)は対称になる必要はない。典型的には、完全に相補する領域は長さが少なくとも5ヌクレオチド、例えば、長さが6、7、またはそれ以上のヌクレオチドであるのに対して、ミスマッチ領域は、例えば、長さが1、2、3、または4ヌクレオチドでもよい。

siRNAおよびmRNA前駆体を模倣するように設計されたヘアピン構造は細胞内でプロセシングされて、標的転写物の発現を下げるまたは阻害することができる分子になる。McManus, et al., RNA 8: 842-850, 2002。これらのヘアピン構造は、19bp二重鎖構造を形成する2本のRNA鎖からなる古典的なsiRNAをベースとしており、クラスIまたはクラスIIヘアピンとして分類される。クラスIヘアピンは、アンチセンスsiRNA鎖(すなわち、阻害が望ましい標的転写物に相補的な鎖)の5'末端または3'末端のいずれかにループを組み込んでいるが、他の点では古典的なsiRNAと同一である。クラスIIヘアピンは、ステムにある1つまたは複数のヌクレオチドミスマッチに加えて、19nt二重鎖領域および二重鎖のアンチセンス鎖の5'末端または3'末端にループを含む点でmRNA前駆体に似ている。これらの分子は細胞内でプロセシングされて、サイレンシングを媒介することができる小さなRNA二重鎖構造になる。これらは、天然のmRNAおよびstRNAの場合と同様に考えられているように、翻訳抑制ではなく標的mRNAの分解によってその効果を発揮するように見える。

従って、二重鎖構造を含有するRNA分子の多様なセットが様々な機構によってサイレンシングを媒介できることは明らかである。本発明の目的のために、分解の誘発によるものでも、翻訳の阻害によるものでも、他の手段によるものでも、標的転写物に結合し、その発現を低下させる、任意のこのようなRNA、このようなRNAの一部は、siRNAと見なされ、このようなsiRNAを生じる(すなわち、RNAに対する前駆体として役立つ)任意の構造が本発明の実施において有用である。

本発明の状況において、siRNAは、治療目的に、例えば、タンパク質ホメオスタシスの改善または回復を必要とする患者において、タンパク質ホメオスタシスを改善または回復させるのに有効な量のタンパク質恒常性制御因子として作用させるために有用であり、タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態の治療を必要とする患者において、タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態を治療するための化合物を同定するための様々な本発明の方法に有用である。好ましい態様において、機能喪失型障害、例えば、リソソーム性蓄積症の場合は、抗体、アンチセンスベクター、または二本鎖RNAベクターを用いた治療的処置が有用であり、機能獲得型障害の場合は、抗体、アンチセンスベクター、または二本鎖RNAベクターを用いた治療的処置が有用である。

従って、本発明は、タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態の治療を必要とする患者において、タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態を治療するための方法を提供する。前記方法は、タンパク質ホメオスタシスを改善または回復させて、患者の状態を軽減もしくは排除する、またはその発生もしくは再発を阻止するのに有効な量の、siRNAであるタンパク質恒常性制御因子を患者に投与する工程を含む。タンパク質恒常性制御因子は、熱ショック応答(HSR)経路、小胞体ストレス応答(UPR)経路、および/またはCa²⁺シグナル伝達経路を介してシグナル伝達をアップレギュレートすることができる。本発明のある特定の態様によれば、生物システムは細胞を含み、接触させる工程は、細胞内でsiRNAを発現させる工程を含む。本発明のある特定の態様によれば、生物システムは、被験体、例えば、哺乳動物被験体、例えば、マウスまたはヒトを含み、接触させる工程は、被験体にsiRNAを投与する工程を含むか、または被験体においてsiRNAを発現させる工程を含む。本発明のある特定の態様によれば、siRNAは、誘導により、および/または細胞タイプ特異的もしくは組織特異的に発現される。

「生物システム」とは、生体分子(例えば、核酸、ポリペプチド、多糖、脂質など)などが入っている任意の入れ物、くぼみ、または容器;細胞または細胞の集団;組織;臓器;生物などを意味する。典型的には、生物システムは細胞または細胞の集団であるが、精製タンパク質または組換えタンパク質を用いて入れ物の中で前記方法を実施することもできる。

本発明は、熱ショック応答(HSR)経路、小胞体ストレス応答(UPR)経路、および/またはCa²⁺シグナル伝達経路を介してシグナル伝達をアップレギュレートする遺伝子または遺伝子産物に標的化されたsiRNA分子を提供する。特に、本発明は、このような転写物の多型変種をコードする転写物に選択的または特異的に標的化されたsiRNA分子を提供する。ここで、被験体における多型変種の存在は、タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態に対する感受性またはその存在を示す。この状況において、「選択的に」または「に特異的に標的化された」という用語は、siRNAが、変種の発現を、他の変種(すなわち、被験体に存在しても、機能喪失型障害、例えば、リソソーム性蓄積症、または機能獲得型障害に対する感受性またはその存在を示さない変種)の発現より大きく減らすことを示すことが意図される。siRNAまたはsiRNAの集まりは、適宜、さらなる成分と共にキットに形で提供されてもよい。

B.ショートヘアピンRNA(shRNA)
RNA干渉(RNAi)は、二本鎖RNA(dsRNA)によって媒介される転写後遺伝子サイレンシング機構であり、ストリンジェントな条件下で標的遺伝子にハイブリダイズして、標的遺伝子の発現を弱める核酸分子(例えば、dsRNA)を投与することによって、タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態の治療を必要とする患者において、タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態を治療するための方法において有用である。RNAiおよびsiRNAの総説については、Jain, Pharmacogenomics 5: 239-42, 2004を参照されたい。本発明におけるさらなるRNA干渉方法は、ショートヘアピンRNA(shRNA)の使用である。トランスフェクションまたはウイルスを介した感染によって、特定の望ましいsiRNA配列をコードするDNA配列を含有するプラスミドが標的細胞に送達される。細胞内に送達されたら、DNA配列は、それ自体でループになり、分子内塩基対合によってヘアピン構造を形成するRNA分子に連続して転写される。これらのヘアピン構造は細胞によってプロセシングされると、転写されたsiRNA分子と同等のものになり、望ましいタンパク質のRNAiを媒介するために細胞によって用いられる。shRNAはタンパク質発現を安定して長期間阻害することができるので、shRNAの使用にはsiRNAトランスフェクションを上回る利点がある。転写siRNAによるタンパク質発現の阻害は、数日より長く起こらない一過的な現象である。場合によっては、これが好ましくかつ望ましい場合がある。これより長い期間のタンパク質阻害が必要な場合、shRNAによって媒介される阻害が好ましい。

C.完全長および部分長のアンチセンスRNA転写物
アンチセンスRNA転写物は、同じ細胞内で他の任意のRNA転写物の一部または全てに相補的な塩基配列を有する。このような転写物は、RNAスプライシングの調節、RNA輸送の調節、およびmRNA翻訳の調節を含む様々な機構を介して遺伝子発現を調節することが示されている。Denhardt, Ann N Y Acad. Sci 660: 70, 1992; Nellen, Trends Biochem. Sci 18: 419, 1993; Baker et al., Biochim. Biophys. Acta, 1489: 3, 1999; Xu, et al., Gene Therapy 7: 438, 2000; French et al., Curr. Opin. Microbiol. 3: 159, 2000; Terryn et al., Trends Plant Sci. 5: 1360, 2000。

D.アンチセンスRNAおよびDNAオリゴヌクレオチド
アンチセンス核酸は、一般的に、標的核酸(例えば、mRNA転写物)の一部に相補的であり、従って、標的に結合して二重鎖を形成することができる一本鎖核酸(DNA、RNA、改変されたDNA、または改変されたRNA)である。典型的には、アンチセンス核酸は、長さが15〜35ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであるが、長さが10〜約50までのヌクレオチドでもよい。結合は、典型的には、標的核酸の機能を軽減または阻害する。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ゲノムDNAに結合した時には転写をブロックしてもよく、mRNAに結合した時には翻訳を阻害してもよく、および/または核酸を分解してもよい。タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態を治療するための標的ポリペプチドの発現の低下は、ポリペプチドをコードするmRNAの配列に相補的な配列を含むアンチセンス核酸またはペプチド核酸を投与することによって達成することができる。アンチセンス技術およびその用途は当技術分野において周知であり、Phillips, M. I. (ed.) Antisense Technology, Methods Enzymol., 2000, Volumes 313 and 314, Academic Press, San Diego、およびこの中で言及された参考文献に記載されている。Crooke, S. (ed.)「ANTISENSE DRUG TECHNOLOGY: PRINCIPLES, STRATEGIES, AND APPLICATIONS」(1^st Edition) Marcel Dekker、およびこの中で引用された参考文献も参照されたい。

アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞内の任意のRNA転写物の一部に相補的な塩基配列を用いて合成することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、RNAスプライシングの調節、RNA輸送の調節、およびmRNA翻訳の調節を含む様々な機構を介して遺伝子発現を調節することができる(Denhardt, 1992)。安定性、毒性、組織分布、ならびに細胞取り込みおよび結合親和性を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドの様々な特性は、(i)ホスホジエステルバックボーンの置換(例えば、ペプチド核酸、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、およびホスホルアミダートオリゴヌクレオチド)、(ii)糖ベースの改変(例えば、2'-O-プロピルリボースおよび2'-メトキシエトキシリボース)、ならびに(iii)ヌクレオシドの改変(例えば、C-5プロピニルU、C-5チアゾールU、およびフェノキサジンC)を含む化学的改変によって変えることができる。Wagner, Nat. Medicine 1: 1116, 1995; Varga, et al., Immun. Lett. 69: 217, 1999; Neilsen, Curr. Opin. Biotech. 10: 71, 1999; Woolf, Nucleic Acids Res. 18: 1763, 1990。

従って、本発明は、タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態の治療を必要とする患者において、タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態を治療するための方法を提供する。この方法は、タンパク質ホメオスタシスを改善または回復させて、患者の状態を軽減もしくは排除する、またはその発生もしくは再発を阻止するのに有効な量のタンパク質恒常性制御因子を患者に投与する工程を含み、タンパク質恒常性制御因子はアンチセンス分子である。本発明のある特定の態様によれば、生物システムは細胞を含み、接触させる工程は、細胞内でsiRNAを発現させる工程を含む。本発明のある特定の態様によれば、生物システムは、被験体、例えば、哺乳動物被験体、例えば、マウスまたはヒトを含み、接触させる工程は、siRNAを被験体に投与する工程を含むか、被験体においてsiRNAを発現させる工程を含む。本発明のある特定の態様によれば、siRNAは、誘導により、および/または細胞タイプ特異的もしくは組織特異的に発現される。

E.リボザイム
リボザイムまたはデオキシリボザイムと呼ばれるある特定の核酸分子は、RNA分子の配列特異的切断を触媒することが示されている。切断部位は、RNA酵素またはDNA酵素の中にあるヌクレオチドと標的RNAの中にあるヌクレオチドとの相補対によって決まる。従って、任意のRNA分子を切断し、それによって、その分解速度を速めるように、RNA酵素およびDNA酵素を設計することができる。Cotten et al., EMBO J. 8: 3861-3866, 1989; Usman et al., Nucl. Acids Mol. Biol. 10: 243, 1996; Usman, et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 1: 527, 1996; Sun, et al., Pharmacol. Rev., 52: 325, 2000。例えば、 Cotten et al., EMBO J. 8: 3861-3866, 1989も参照されたい。

タンパク質恒常性制御因子のハイスループットアッセイ
熱ショック応答(HSR)経路、小胞体ストレス応答(UPR)経路、および/またはCa²⁺シグナル伝達経路を介してシグナル伝達をアップレギュレートすることができるタンパク質恒常性制御因子として試験される化合物は、任意の有機低分子または生物学的実体、例えば、タンパク質、例えば、抗体もしくはペプチド、糖、核酸、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、RNAi、またはリボザイム、または脂質でよい。典型的には、試験化合物は、有機低分子、ペプチド、脂質、および脂質類似体である。

タンパク質恒常性制御因子のハイスループットアッセイのために、細胞をベースとするアッセイを使用することができる。患者由来細胞を使用すると、患者由来細胞の機能喪失を治す化合物をスクリーニングすることによって(タンパク質の機能を測定することによって)、または患者由来細胞の機能獲得を治す化合物をスクリーニングすることによって(タンパク質毒性の寛解もしくは凝集の低下を評価することによって)タンパク質恒常性制御因子について化合物ライブラリーをスクリーニングすることができる。

本発明のアッセイにおける潜在的なモジュレーターまたはリガンドとして、本質的に全ての化合物を使用することができるが、ほとんどの場合、水溶液または有機溶液(特に、DMSOをベースとする溶液)に溶解することができる化合物が用いられる。アッセイは、アッセイ段階を自動化し、任意の便利な供給源に由来する化合物をアッセイに供給することによって、大きな化合物ライブラリーをスクリーニングするように設計され、アッセイは典型的には並列処理される(例えば、ロボットアッセイではマイクロタイター形式でマイクロタイタープレート上で行われる)。Sigma(St. Louis, MO)、Aldrich(St. Louis, MO)、Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)、Fluka Chemika-Biochemica Analytika(Buchs, Switzerland)などを含む、多くの化合物供給業者がいることが理解されるだろう。

1つの好ましい態様において、ハイスループットスクリーニング方法は、多数の潜在的な治療用化合物(潜在的なモジュレーターまたはリガンド化合物)を含有するコンビナトリアル有機低分子またはペプチドライブラリーの準備を伴う。次いで、このような「コンビナトリアル化合物ライブラリー」または「リガンドライブラリー」は、望ましい特徴的な活性を示すライブラリーメンバー(特定の化学種またはサブクラス)を同定するために、本明細書に記載の1つまたは複数のアッセイにおいてスクリーニングされる。このように同定された化合物は従来の「リード化合物」として役立ってもよく、それ自体が潜在的なまたは実際の治療剤として用いられてもよい。

コンビナトリアルライブラリーとは、多数の化学的「基本単位」、例えば、試薬を組み合わせることによって、化学合成または生物学的合成によって生成された多様な化合物の集まりである。例えば、直線状コンビナトリアル化合物ライブラリー、例えば、ポリペプチドライブラリーは、一組の化学的基本単位(アミノ酸)を、ある特定の化合物の長さ(すなわち、ポリペプチド化合物中のアミノ酸の数)について、あらゆる可能なやり方で組み合わせることによって形成される。化学的基本単位のこのようなコンビナトリアル混合を介して、何百万個もの化合物を合成することができる。

コンビナトリアル化合物ライブラリーの調製およびスクリーニングは当業者に周知である。このようなコンビナトリアル化合物ライブラリーには、ペプチドライブラリーが含まれるが、これに限定されない。米国特許第5,010,175号, Furka, Int. J. Pept. Prot. Res. 37: 487-493, 1991、およびHoughton et al., Nature 354: 84-88, 1991。化学多様性ライブラリーを作製する他の化学も使用することができる。このような化学には、ペプトイド(例えば、PCT国際公開公報第91/19735号)、コードペプチド(例えば、PCT国際公開公報第93/20242号)、ランダムバイオオリゴマー(例えば、PCT国際公開公報第92/00091号)、ベンゾジアゼピン(例えば、米国特許第5,288,514号)、ダイバーソーマー(diversomer)、例えば、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、およびジペプチド(Hobbs et al., Proc. Nat. Acad. Sci USA 90: 6909-6913, 1993)、ビニロガス(vinylogous)ポリペプチド(Hagihara et al., J. Amer. Chem. Soc. 114: 6568, 1992)、グルコース骨格を有する非ペプチド性ペプチドミメティック(Hirschmann et al., J. Amer. Chem. Soc. 114: 9217-9218, 1992)、低分子化合物ライブラリーの類似有機合成(Chen et al., J. Amer. Chem. Soc. 116: 2661, 1994)、オリゴカルバメート(Cho et al., Science 261: 1303, 1993)、ならびに/またはペプチジルホスホネート(Campbell et al., J. Org. Chem. 59: 658, 1994)、核酸ライブラリー(Ausubel、Berger、およびSambrook、全て前記を参照されたい)、ペプチド核酸ライブラリー(例えば、米国特許第5,539,083号を参照されたい)、抗体ライブラリー(例えば、Vaughn et al., Nature Biotechnology, 14: 309-314, 1996およびPCT/US96/10287を参照されたい)、炭水化物ライブラリー(例えば、Liang et al., Science 274: 1520-1522, 1996および米国特許第5,593,853号を参照されたい)、有機低分子ライブラリー(例えば、ベンゾジアゼピン, Baum C&EN, Jan 18, page 33 (1993);イソプレノイド, 米国特許第5,569,588号;チアゾリジノンおよびメタチアザノン, 米国特許第5,549,974号;ピロリジン, 米国特許第5,525,735号および同第5,519,134号;モルホリノ化合物, 米国特許第5,506,337号;ベンゾジアゼピン, 米国特許第5,288,514号を参照されたい)が含まれるが、これに限定されない。

コンビナトリアルライブラリーを調製するための装置は市販されている(例えば、357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA, 433A Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050 Plus, Millipore, Bedford, MAを参照されたい)。さらに、非常に多くのコンビナトリアルライブラリーそのものが市販されている(例えば、ComGenex, Princeton, N.J., Asinex, Moscow, Ru, Tripos, Inc., St. Louis, MO, ChemStar, Ltd, Moscow, RU, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MDなどを参照されたい)。

候補化合物は、機能喪失型障害、例えば、リソソーム性蓄積症、または機能獲得型障害を含むが、これに限定されない障害を治療するための薬物を同定する戦略の一部として有用である。熱ショック応答(HSR)経路、小胞体ストレス応答(UPR)経路、Ca²⁺シグナル伝達経路、および/または寿命経路を介してシグナル伝達をアップレギュレートするタンパク質恒常性制御因子として作用する試験化合物が候補化合物と見なされる。

熱ショック応答(HSR)経路、小胞体ストレス応答(UPR)経路、および/もしくはCa²⁺シグナル伝達経路を介してシグナル伝達をアップレギュレートするタンパク質恒常性制御因子として作用する候補化合物または試験化合物を同定するためのスクリーニングアッセイも本発明に含まれる。試験化合物は、生物学的ライブラリー;空間的にアドレス指定可能な平行固相または液相ライブラリー;デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法;「1ビーズ1化合物」ライブラリー法;およびアフィニティクロマトグラフィー選択を用いた合成ライブラリー法を含むが、これに限定されない当該技術分野において公知のコンビナトリアルライブラリー法における非常に多くの任意のアプローチを用いて入手することができる。生物学的ライブラリーアプローチは、例えば、ペプチドライブラリーに使用することができるのに対して、他の4つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマー、または低分子の化合物ライブラリーに適用することができる。Lam, Anticancer Drug Des. 12: 145, 1997。分子ライブラリーを合成する方法の例は、当技術分野において、例えば、DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6909, 1993; Erb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37: 2678, 1994; Cho et al., Science 261: 1303, 1993; Carrell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059, 1994; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061, 1994;およびGallop et al., J. Med. Chem. 37: 1233, 1994において見つけることができる。一部の態様において、試験化合物は、タンパク質恒常性制御因子の変種を活性化する。

化合物ライブラリーは溶解状態にあってもよく(例えば、Houghten, Bio/Techniques 13: 412-421, 1992)、ビーズ(Lam, Nature 354: 82-84, 1991)、チップ(Fodor, Nature 364: 555-556, 1993)、細菌(米国特許第5,223,409号)、胞子(米国特許第5,571,698号、同第5,403,484号、および同第5,223,409号)、プラスミド(Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-1869, 1992)、またはファージ(Scott et al., Science 249: 386-390, 1990; Devlin, Science 249: 404-406, 1990; Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378-6382, 1990;およびFelici, J. Mol Biol. 222 301-310, 1991)に付着してもよい。

試験化合物が、タンパク質恒常性制御因子またはその生物学的に活性な部分として、熱ショック応答(HSR)経路、小胞体ストレス応答(UPR)経路、および/またはCa²⁺シグナル伝達経路を介してシグナル伝達の活性を調節する能力は、例えば、試験化合物の存在下で細胞における生物学的凝集または脱凝集の阻害または活性化をモニタリングすることによって確かめることができる。タンパク質恒常性制御因子またはその生物学的に活性な部分としての活性の調節は、細胞における生物学的凝集または脱凝集を測定することによって確かめることができる。結合アッセイは細胞をベースとしてもよく、無細胞でもよい。

試験化合物が、細胞における熱ショック応答(HSR)経路、小胞体ストレス応答(UPR)経路、および/またはCa²⁺シグナル伝達経路を介してシグナル伝達をアップレギュレートするタンパク質恒常性制御因子として作用する能力は、直接結合を確かめるための本明細書に記載の方法または当技術分野において公知の方法の1つによって確かめることができる。1つの態様において、タンパク質恒常性制御因子が、熱ショック応答(HSR)経路、小胞体ストレス応答(UPR)経路、および/もしくはCa²⁺シグナル伝達経路を介したシグナル伝達のアップレギュレーションに関与する遺伝子もしくは遺伝子産物に結合する能力、またはこれらと相互作用する能力を確かめることができる。このアッセイは凝集アッセイでもよく脱凝集アッセイでもよい。一般的に、このようなアッセイは、試験化合物が、熱ショック応答(HSR)経路、小胞体ストレス応答(UPR)経路、および/またはCa²⁺シグナル伝達経路を介したシグナル伝達のアップレギュレーションに影響を及ぼす能力を確かめるために用いられる。

一般的に、試験化合物が細胞の凝集活性または脱凝集活性に影響を及ぼす能力は、試験化合物の非存在下で凝集活性または脱凝集活性が求められる対照と比較される。場合によっては、あらかじめ決められた参照値が用いられる。このような参照値は対照に相関して求めることができ、この場合、参照とは異なる試験試料は、化合物が関心対象の分子に結合することを示すか、または発現を調節する、例えば、熱ショック応答(HSR)経路、小胞体ストレス応答(UPR)経路、および/またはCa²⁺シグナル伝達経路を介したシグナル伝達を調節する、活性化する、もしくは阻害することを示す。参照値はまた、標準を用いて観察されたタンパク質恒常性制御因子による凝集または脱凝集の量(例えば、抗体の親和性または凝集活性もしくは脱凝集活性の調節)を反映してもよい。この場合、参照と類似する(例えば、参照と等しいまたは参照より少ない)試験化合物は、化合物が候補化合物であることを示す(例えば、参照抗体と等しい程度または参照抗体より大きな程度まで凝集活性または脱凝集活性を示す)。

さらに、本発明は、前記のスクリーニングアッセイによって同定された新規の薬剤および本明細書に記載のように治療するためのその使用に関する。

1つの態様において、本発明は、タンパク質恒常性制御因子、または熱ショック応答(HSR)経路、小胞体ストレス応答(UPR)経路、および/もしくはCa²⁺シグナル伝達経路を介したシグナル伝達のためにアップレギュレートされる、天然または組換えの遺伝子または遺伝子産物を発現する細胞もしくは組織を用いた可溶性アッセイを提供する。別の態様において、本発明は、ハイスループット形式での、固相をベースとするインビトロアッセイを提供する。このアッセイでは、熱ショック応答(HSR)経路、小胞体ストレス応答(UPR)経路、および/またはCa²⁺シグナル伝達経路を介したシグナル伝達のためにアップレギュレートされる遺伝子または遺伝子産物は、共有結合相互作用または非共有結合相互作用を介して固相基板に取り付けられる。本明細書に記載のアッセイのいずれか1つをハイスループットスクリーニング用に合わせることができる。

液体または固体の本発明のハイスループットアッセイでは、数千種類までのモジュレーターまたはリガンドを1日でスクリーニングすることができる。この方法は、熱ショック応答(HSR)経路、小胞体ストレス応答(UPR)経路、および/またはCa²⁺シグナル伝達経路を介したシグナル伝達のためにアップレギュレートされる遺伝子または遺伝子産物をアッセイするために使用することができる。特に、選択された潜在的なモジュレーターに対して別々のアッセイを行うために、マイクロタイタープレートの各ウェルが用いられてもよく、濃度またはインキュベーション時間の影響を観察しようとするのであれば、5〜10ウェルごとに1種類のモジュレーターを試験してもよい。従って、標準的なマイクロタイタープレートが1個だけあれば、約100(例えば、96)種類のモジュレーターをアッセイすることができる。1536ウェルプレートを使用すれば、1個のプレートだけで、約100〜約1500種類の化合物から容易にアッセイを行うことができる。1日に多数のプレートをアッセイすることができる。本発明の統合されたシステムを用いれば、約6,000種類、20,000種類、50,000種類まで、または100,000種類を超える化合物のアッセイスクリーニングを行うことができる。

固体反応の場合、融合タンパク質の一部として、関心対象のタンパク質もしくはその断片、例えば、細胞外ドメイン、または関心対象のタンパク質もしくはその断片を含む細胞もしくは膜は、固体成分に直接的にまたは間接的に、共有結合または非共有結合、例えば、タグを介して結合させることができる。タグは様々な成分の中のいずれでもよい。一般的に、タグに結合する分子(タグ結合剤)が固体支持体に固定され、タグがつけられた関心対象の分子は、タグおよびタグ結合剤の相互作用によって固体支持体に取り付けられる。

文献においてよく説明されている公知の分子相互作用に基づいて、多くのタグおよびタグ結合剤を使用することができる。例えば、タグが、天然の結合剤、例えば、ビオチン、プロテインA、またはプロテインGを有する場合、適切なタグ結合剤(アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、免疫グロブリンのFc領域など)と共に使用することができる。天然の結合剤、例えば、ビオチンを有する分子に対する抗体もまた、広範囲に利用可能なかつ適切なタグ結合剤である。SIGMA Immunochemicals 1998 catalogue SIGMA, St. Louis MOを参照されたい。

同様に、任意のハプテン化合物または抗原性化合物を適切な抗体と組み合わせて、タグ/タグ結合剤ペアを形成することができる。数千種類もの特異的抗体が市販されており、多くのさらなる抗体が文献において説明されている。例えば、一般的な構成の1つにおいて、タグは第1の抗体であり、タグ結合剤は、第1の抗体を認識する第2の抗体である。抗体-抗原相互作用に加えて、受容体-リガンド相互作用もまた、タグおよびタグ-結合剤ペア、例えば、細胞膜受容体(例えば、細胞受容体-リガンド相互作用、例えば、toll様受容体、トランスフェリン、c-kit、ウイルス受容体リガンド、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、インターロイキン受容体、免疫グロブリン受容体および抗体、カドヘリンファミリー、インテグリンファミリー、セレクチンファミリーなど。例えば、Pigott & Power, The Adhesion Molecule Facts Book I, 1993を参照されたい）のアゴニストおよびアンタゴニストとして適している。同様に、毒素および毒液、ウイルスエピトープ、ホルモン(例えば、アヘン剤、ステロイドなど)、細胞内受容体(例えば、ステロイド、甲状腺ホルモン、レチノイドおよびビタミンD;ペプチドを含む、様々な小さなリガンドの作用を媒介する)、薬物、レクチン、糖、核酸(線状ポリマーおよび環式ポリマーの構成)、オリゴ糖、タンパク質、リン脂質、ならびに抗体も全て様々な細胞受容体と相互作用することができる。

合成ポリマー、例えば、ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ尿素、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリアリーレンスルフィド、ポリシロキサン、ポリイミド、およびポリアセテートもまた適切なタグまたはタグ結合剤を形成することができる。他の多くのタグ/タグ結合剤ペアもまた、本開示を吟味すれば当業者に明らかなように、本明細書に記載のアッセイ系において有用である。

一般的なリンカー、例えば、ペプチド、ポリエーテルなどもまたタグとして役立つことがあり、ポリペプチド配列、例えば、約5〜200アミノ酸からなるポリgly配列を含む。このような可撓性リンカーは当業者に公知である。例えば、ポリエチレングリコールリンカーは、Shearwater Polymers, Inc. Huntsville, Alabamaから入手可能である。これらのリンカーは、任意で、アミド結合、スルフヒドリル結合、ヘテロ官能基結合を有する。

タグ結合剤は、現在利用可能な様々な任意の方法を用いて固体基板に固定化される。固体基板は、一般的に、基板の全てまたは一部を、タグ結合剤の一部と反応する化学基を表面に固定する化学試薬に曝露することによって誘導体化または官能化される。例えば、さらに長い鎖の部分に取り付けるのに適した基には、アミン基、ヒドロキシル基、チオール基、およびカルボキシル基が含まれるだろう。様々な表面、例えば、ガラス表面を官能化するために、アミノアルキルシランおよびヒドロキシアルキルシランを使用することができる。このような固相生体高分子アレイの構築は文献においてよく説明されている。例えば、Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154, 1963(固相合成、例えば、ペプチドの固相合成について述べている);Geysen et al., J. Immun. Meth. 102: 259-274, 1987(ピン上での固相成分合成について述べている);Frank & Doring, Tetrahedron 44: 6031-6040, 1988(セルロースディスク上での様々なペプチド配列の合成について述べている); Fodor et al., Science 251:767-777, 1991; Sheldon et al., Clinical Chemistry 39: 718-719, 1993;およびKozal et al., Nature Medicine 2: 753-759, 1996(全て、固体基板に固定化された生体高分子アレイについて述べている)を参照されたい。タグ結合剤を基板に固定化するための非化学的アプローチには、他の一般的な方法、例えば、加熱、UV照射による架橋結合などが含まれる。

治療用途
本明細書に記載のタンパク質恒常性制御因子および本明細書に記載の方法によって同定されたタンパク質恒常性制御因子は、タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態の治療を必要とする患者において、タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態を治療するための様々な方法において使用することができる。従って、本発明は、機能喪失型障害、例えば、リソソーム性蓄積症、または機能獲得型障害に関連する疾患を治療するための組成物および方法を提供する。1つの態様において、組成物は、熱ショック応答(HSR)経路、小胞体ストレス応答(UPR)経路、および/またはCa²⁺シグナル伝達経路を介してシグナル伝達をアップレギュレートするタンパク質恒常性制御因子として作用する低分子化合物または生物学的因子、ならびに薬学的に許容される担体を含む。別の態様において、組成物は、タンパク質シャペロンの転写もしくは翻訳をアップレギュレートすることによって、またはタンパク質シャペロンの分解を阻害することによって、タンパク質シャペロンを調節する低分子化合物または生物学的因子を含む。さらに別の局面において、組成物は、凝集経路またはディスアグリガーゼをアップレギュレートする低分子化合物または生物学的因子を含む。

組成物は、単独で、または他の組成物と組み合わせて投与することができる。タンパク質恒常性制御因子組成物は、単独で、または他の組成物と組み合わせて投与することができる。1つの局面において、タンパク質恒常性制御因子は、治療しようとする疾患または状態に特異的な薬理学的シャペロン/キネティック安定剤と組み合わせて投与される。別の局面において、薬理学的シャペロン/キネティック安定剤は、治療しようとする疾患または状態に特異的なものである。治療しようとする疾患もしくは状態に特異的な薬理学的シャペロン/キネティック安定剤は、疾患または状態に関連する、および/またはホメオスタシスの機能不全に関連するタンパク質のフォールディングを安定化する薬理学的シャペロン/キネティック安定剤である。さらなる局面において、本発明は、タンパク質恒常性制御因子および薬理学的シャペロン/キネティック安定剤を含む組成物である。さらに別の局面において、本発明は、タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態を治療する方法を必要とする患者において、タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態を治療する方法であって、薬理学的シャペロン/キネティック安定剤と組み合わせてタンパク質恒常性制御因子を患者に投与する工程を含む方法に関する。ここで、この組み合わせは、タンパク質ホメオスタシスを回復させるのに十分な量で投与される。

さらなる局面において、本発明は、少なくとも2つの機構的に別個のタンパク質恒常性制御因子の投与に関する。タンパク質恒常性制御因子は、それぞれが異なるもしくは別個のタンパク質のタンパク質ホメオスタシスを回復させる、および/または異なるタンパク質恒常性シグナル伝達経路を調節するのであれば機構的に別個のものである。例示的なシグナル伝達経路は、HSR、UPRおよびCa²⁺シグナル伝達経路である。下記の実施例に示される別の例では、2つの機構的に別個のタンパク質恒常性制御因子はそれぞれ、2つの異なる変異糖脂質加水分解酵素であるグルコセレブロシダーゼおよびβ-ヘキソサミンAのフォールディング、輸送、および機能を部分的に回復させた。1つの局面において、1つの機構的に別個のタンパク質恒常性制御因子が、他の少なくとも1つの機構的に別個のタンパク質恒常性制御因子と共に投与される。さらに別の態様において、本発明は、UPRまたはCa²⁺シグナル伝達経路を調節するタンパク質恒常性制御因子と組み合わせて、HSRを調節するタンパク質恒常性制御因子の投与を含む。さらなる態様において、本発明は、HSRまたはCa²⁺シグナル伝達経路を調節するタンパク質恒常性制御因子と組み合わせて、UPRを調節するタンパク質恒常性制御因子の投与を含む。さらなる局面において、本発明は、タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態を治療する方法を必要とする患者において、タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態を治療する方法であって、少なくとも2つの機構的に別個のタンパク質恒常性制御因子を、タンパク質ホメオスタシスを回復させるのに十分な量で患者に投与する工程を含む方法に関する。

本発明はまた、タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態を治療する方法を必要とする患者において、タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態を治療する方法であって、タンパク質ホメオスタシスを回復させるが、ウイルス感染に対する患者の感受性を高めない量でタンパク質恒常性制御因子を前記患者に投与する工程を含む方法も含む。タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態を治療する方法を必要とする患者において、タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態を治療する方法であって、タンパク質ホメオスタシスを回復させるが、腫瘍に対する患者の感受性を高めない量でタンパク質恒常性制御因子を前記患者に投与する工程を含む方法も本発明に含まれる。さらに別の態様において、タンパク質恒常性制御因子は、ウイルスタンパク質のフォールディングも細菌タンパク質の合成も増強しない。さらなる態様において、タンパク質恒常性制御因子は、腫瘍細胞のタンパク質フォールディングおよび輸送の能力を増強しない。

本明細書に記載のタンパク質恒常性制御因子組成物は、タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態を予防または治療するための方法を必要とする患者において、タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態を予防または治療するための方法において使用することができる。タンパク質恒常性制御因子がどういったものであるかということは、熱ショック応答(HSR)経路、小胞体ストレス応答(UPR)経路、および/またはCa²⁺シグナル伝達経路を介してシグナル伝達をアップレギュレートする因子として潜在的に臨床で使用するために特に重要である。従って、タンパク質恒常性制御因子、例えば、低分子化合物は、生存分子(survival molecule)として、並外れた安全性と最小限の副作用を有する。従って、タンパク質恒常性制御因子は、機能喪失型障害、例えば、リソソーム性蓄積症、または機能獲得型障害に関連する広範囲の疾患を治療するのに使用することができる。従って、タンパク質恒常性制御因子組成物は、疾患治療のための新しくかつより優れた治療選択肢を提供する。

好ましくは、本発明の1つの局面において、タンパク質恒常性制御因子組成物を用いた治療は、治療を必要とする患者においてタンパク質ホメオスタシスを改善もしくは回復させるのに有効な量で、または患者において疾患を軽減もしくは排除するのに必要な量で有効量のタンパク質恒常性制御因子を投与することによるものでもよい。前記のように、疾患の軽減は、疾患に関連する1つまたは複数の症状の軽減または寛解を含む。さらに、本明細書において提供されるタンパク質恒常性制御因子組成物は、機能喪失型障害、例えば、リソソーム性蓄積症、または機能獲得型障害を軽減または排除するのに使用することができる。

本発明は、タンパク質ホメオスタシスを改善または回復させるのに有効な量でタンパク質恒常性制御因子を患者に投与する工程を含む、タンパク質ホメオスタシスの機能不全に関連する状態を治療する方法に関する。本発明の1つの局面において、状態は、グルコセレブロシダーゼ、ヘキソサミンA、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子、アスパルチルグルクサミニダーゼ、α-ガラクトシダーゼA、システイン輸送体、酸性セラミダーゼ、酸性α-L-フコシダーゼ、保護タンパク質、カテプシンA、酸性β-グルコシダーゼ、酸性β-ガラクトシダーゼ、イズロン酸2-スルファターゼ、α-L-イズロニダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、酸性α-マンノシダーゼ、酸性β-マンノシダーゼ、アリールスルファターゼB、アリールスルファターゼA、N-アセチルガラクトサミン-6-硫酸スルファターゼ、酸性β-ガラクトシダーゼ、N-アセチルグルコサミン-1-ホスホトランスフェラーゼ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、NPC-1、酸性α-グルコシダーゼ、β-ヘキソサミンB、ヘパランN-スルファターゼ、α-N-アセチルグルコサミニダーゼ、α-グルコサミニドN-アセチルトランスフェラーゼ、N-アセチルグルコサミン-6-硫酸スルファターゼ、α-N-アセチルガラクトサミニダーゼ、α-ノイラミダーゼ、β-グルクロニダーゼ、β-ヘキソサミンAおよび酸性リパーゼ、ポリグルタミン、α-シヌクレイン、Abペプチド、tauタンパク質、ならびにトランスサイレチンからなる群より選択されるタンパク質のホメオスタシスの機能不全に関連する。

薬学的組成物
本発明の組成物および方法において有用なタンパク質恒常性制御因子組成物は、立体異性体、プロドラッグ、薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和化合物、酸塩水和物、N-酸化物、もしくはその異種同形結晶型の形で、または治療有効量で、例えば、タンパク質恒常性の機能喪失型障害、例えば、リソソーム性蓄積症、もしくは機能獲得型障害を治療するのに有効な量で化合物と適切な担体もしくは賦形剤が混合された薬学的組成物の形で、ヒト患者自身に投与することができる。

「治療有効量」とは、障害の1つもしくは複数の症状を寛解するのに十分な、または障害の進行を阻止するのに十分な、障害を後退させるのに十分な、または別の治療剤の治療効果を増強もしくは改善するのに十分な、治療剤、タンパク質恒常性制御因子組成物の量を指す。機能喪失型障害、例えば、リソソーム性蓄積症、または機能獲得型障害の治療に関して、治療有効量とは、疾患を軽減または排除するのに十分な治療剤の量を指す。好ましくは、治療有効量の治療剤は、疾患を、少なくとも5％、好ましくは少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも100％軽減または排除する。「治療プロトコール」とは、1つまたは複数の治療剤、例えば、タンパク質恒常性制御因子として作用する化学小分子組成物を投与するための、および投与の時間を調節するための方法を指す。

薬学的に許容される担体は、部分的には、投与されている特定の組成物によって、ならびに組成物を投与するのに用いられた特定の方法によって決まる。従って、抗体組成物を投与するために、薬学的組成物の多種多様な適切な製剤がある(例えば、参照として本明細書に組み入れられる、Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, PA.の最新版を参照されたい)。薬学的組成物は、一般的に、患者への投与に適した形をしたタンパク質恒常性制御因子組成物を含む。薬学的組成物は、一般的に、無菌で、実質的に等張性であり、米食品医薬品局の全てのGood Manufacturing Practice(GMP)規則に完全に準拠したものとして処方される。

治療法
本発明の局面は、薬学的に許容される担体と共に処方されたタンパク質恒常性制御因子組成物の1つまたは組み合わせを含む薬学的組成物を提供する。組成物の中には、複数の種類の(例えば、2種類またはそれ以上の)タンパク質恒常性制御因子組成物またはその誘導体の組み合わせを含むものもある。

予防用途において、薬学的組成物または医用薬剤は、疾患もしくは状態、すなわち、タンパク質恒常性の機能喪失型障害もしくは能獲得型障害にかかりやすい、または疾患もしくは状態のリスクがある患者に、疾患の生化学的症状、組織学的症状、および/または行動症状、疾患の発症中に現れるその合併症および中間の病理学的表現型を含む疾患のリスクを無くすもしくは軽減する、疾患の重篤度を下げる、または疾患の発症(outset)を遅らせるのに有効な量で投与される。治療用途において、組成物または医用薬剤は、このような疾患の疑いがある、または既にこのような疾患に罹患している患者に、疾患の発症中に現れるその合併症および中間の病理学的表現型を含む、疾患の症状(生化学的症状、組織学的症状、および/または行動症状)を治癒させる、または少なくとも部分的にくい止めるのに有効な量で投与される。治療的処置または予防的処置を実現するのに十分な量は、治療有効量または予防有効量と定義される。予防法および治療法において、薬剤は、通常、十分な免疫応答が得られるまで、いくつかの投与量に分けて投与される。典型的には、免疫応答はモニタリングされ、免疫応答が衰え始めたら、繰り返し投与される。

有効投与量
本明細書に記載のタンパク質恒常性の機能喪失型障害または機能獲得型障害を治療するためのタンパク質恒常性制御因子組成物の有効量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトまたは動物であるかどうか、投与される他の薬物療法、および処置が予防であるか治療であるかどうかを含む多くの異なる要因によって異なる。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含む非ヒト哺乳動物も治療することができる。安全性および効能を最適化するために、治療投与量を決定する必要がある。

1種類または複数の種類のタンパク質恒常性制御因子組成物を投与する場合、投与量は、約0.0001〜100mg/宿主体重kg、より通常は0.01〜5mg/宿主体重kgである。例えば、投与量は1mg/kg体重でもよく、10mg/kg体重でもよく、1〜10mg/kgの範囲内でよい。例示的な治療法は、2週間ごとに1回の投与、または1ヶ月に1回の投与、または3〜6ヶ月ごとに1回の投与を必要とする。一部の方法では、異なる結合特異性を有する2種類またはそれ以上のタンパク質恒常性制御因子ポリペプチド、またはそのミメティック、類似体、もしくは誘導体が同時に投与される。この場合、それぞれのタンパク質恒常性制御因子組成物の投与量は、通常、複数回投与される。投与間の間隔は、数日、週単位、月単位、または年単位でもよい。間隔は、患者におけるタンパク質恒常性制御因子組成物またはタンパク質恒常性ネットワーク組成物の血中濃度を測定することによって示されるように不規則でもよい。一部の方法では、投与量は、タンパク質恒常性制御因子組成物の濃度が1〜1000μg/mlとなるように調節され、一部の方法では、25〜300μg/mlとなるように調節される。または、タンパク質恒常性制御因子組成物は徐放製剤として投与されてもよく、この場合、頻度の少ない投与が必要とされる。投与量および頻度は患者における化合物の半減期に応じて異なる。投与量および投与頻度は、処置が予防であるか治療であるかどうかに応じて異なってもよい。予防用途では、比較的少ない投与量が、長期間にわたって比較的少ない頻度で投与される。患者の中には死ぬまで治療を受け続けるものもいる。治療用途では、疾患の進行が弱まるまたは止まるまで、好ましくは、患者がタンパク質恒常性の機能喪失型障害または機能獲得型障害の症状の部分的または完全な寛解を示すまで、比較的短い期間で比較的多量に投与されることが必要とされる。その後で、この特許を予防法として投与することができる。

タンパク質恒常性制御因子組成物をコードする核酸ベクターの用量は、患者1人につき約10ng〜1g、100ng〜100mg、1μg〜10mg、または30〜300μgのDNAである。感染性ウイルスベクターの用量は、1用量あたり10〜100個またはそれ以上のビリオンである。

プロドラッグ
本発明はまた、本明細書において開示される方法によって得られる薬剤のプロドラッグに関する。プロドラッグは、インビボで活性型に変換される薬剤である。R.B. Silverman, The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action, Academic Press, Chp. 8, 1992。プロドラッグは、特定の薬剤の生体内分布を変えるために(例えば、典型的にプロテアーゼの反応部位に入らない薬剤を許可するために)または薬物動態を変えるために使用することができる。例えば、カルボン酸基を、例えば、メチル基またはエチル基でエステル化して、エステルを得ることができる。このエステルが被験体に投与されると、酵素的にまたは非酵素的に、還元的に、酸化的に、または加水分解的に切断されて、アニオン基が現われる。アニオン基は、切断されると中間体薬剤が現われる部分(例えば、アシルオキシメチルエステル)でエステル化することができる。この中間体薬剤は後に分解して、活性薬剤が生じる。プロドラッグ部分は、インビボでエステラーゼまたは他の機構によってカルボン酸に代謝されてもよい。

プロドラッグおよびその使用の例は当技術分野において周知である。例えば、Berge et al., J. Pharm. Sci. 66:1-19,1977。プロドラッグは、薬剤の最後の単離および精製の間に、または遊離酸の形をした精製薬剤と適切な誘導体化剤を別々に反応させることによってインサイチューで調製することができる。カルボン酸は、触媒の存在下でアルコールで処理することによってエステルに変換することができる。

切断可能なカルボン酸プロドラッグ部分の例には、置換および非置換、分枝または非分枝の低級アルキルエステル部分(例えば、エチルエステル、プロピルエステル、ブチルエステル、ペンチルエステル、シクロペンチルエステル、ヘキシルエステル、シクロヘキシルエステル)、低級アルケニルエステル、低級ジアルキル-アミノ低級アルキルエステル(例えば、ジメチルアミノエチルエステル)、アシルアミノ低級アルキルエステル、アシルオキシ低級アルキルエステル(例えば、ピバロイルオキシメチルエステル)、アリールエステル(フェニルエステル)、アリール-低級アルキルエステル(例えば、ベンジルエステル)、置換(例えば、メチル、ハロ、またはメトキシ置換基を有する)アリールおよびアリール-低級アルキルエステル、アミド、低級アルキルアミド、低級ジアルキルアミド、およびヒドロキシアミドが含まれる。

投与経路
機能喪失型障害または機能獲得型障害を治療または寛解するためのタンパク質恒常性制御因子組成物は、予防的処置のために、機能喪失型障害、例えば、リソソーム性蓄積症、もしくは機能獲得型障害を標的とするタンパク質恒常性制御因子組成物の吸入剤として、および/または治療的処置のために、非経口手段、局所手段、静脈内手段、経口手段、皮下手段、動脈内手段、頭蓋内手段、腹腔内手段、鼻腔内手段、または筋肉内手段によって投与することができる。免疫原性薬剤の最も典型的な投与経路は皮下経路であるが、他の経路も等しく有効であり得る。その次に一般的な経路は筋肉内注射である。このタイプの注射剤は、最も典型的には、腕または脚の筋肉に行われる。抗体の投与には筋肉内注射または静脈内注入が好ましい。一部の方法では、抗体は徐放性組成物または装置、例えば、Medipad(商標)装置として投与される。

本発明の薬剤は、任意で、タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態の治療を必要とする患者における、タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態の治療において、少なくとも部分的に有効な他の薬剤と組み合わせて投与することができる。

製剤
機能喪失型障害、例えば、リソソーム性蓄積症、または機能獲得型障害を治療するためのタンパク質恒常性制御因子組成物は、活性のある治療剤および様々な他の薬学的に許容される成分を含む薬学的組成物として投与されることが多い。Remington's Pharmaceutical Science (Mack Publishing Company, Easton, Pa.)の最新版を参照されたい。好ましい形態は目的の投与様式および治療用途によって決まる。組成物はまた、所望の製剤に応じて、薬学的に許容される無毒の担体または希釈剤を含んでもよく、これらは、動物またはヒトへの投与のために薬学的組成物を処方するのに一般的に用いられるビヒクルとして定義される。希釈剤は、組み合わせの生物学的活性に影響を及ぼさないように選択される。このような希釈剤の例は、蒸留水、生理的リン酸緩衝食塩水、リンガー液、デキストロース溶液、およびハンクス液である。さらに、薬学的組成物または製剤はまた、他の担体、アジュバント、または無毒の、非治療的な、非免疫原性の安定剤などを含んでもよい。

薬学的組成物はまた、大きな、ゆっくりと代謝される高分子、例えば、タンパク質、多糖、例えば、キトサン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびコポリマー(例えば、ラテックス官能化Sepharose(商標)、アガロース、セルロースなど)、重合アミノ酸、アミノ酸コポリマー、ならびに脂質凝集物(例えば、油滴またはリポソーム)を含んでもよい。さらに、これらの担体は免疫賦活剤(すなわち、アジュバント)として機能してもよい。

非経口投与の場合、本発明の局面の組成物は、無菌の液体、例えば、水、油、食塩水、グリセロール、またはエタノールでもよい薬学的担体による生理学的に許容される希釈剤に溶解した物質の溶液または懸濁液の注射投与物として投与することができる。さらに、補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、界面活性剤、pH緩衝物質などが組成物に存在してもよい。薬学的組成物の他の成分は、石油、動物、野菜、または合成に由来するもの、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、および鉱油である。一般的に、グリコール、例えば、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールが好ましい液体担体であり、特に注射液に好ましい液体担体である。抗体は、デポー注射剤、または活性成分を徐放するように処方することができる移植片調製物の形で投与することができる。例示的な組成物は、50mM L-ヒスチジン、150mM NaClからなり、HClでpH6.0に調節された水性緩衝液に溶解して処方された5mg/mLのモノクローナル抗体を含む。

典型的には、組成物は、液体の溶液または懸濁液として注射液として調製され、注射の前に液体ビヒクルに溶解または懸濁するのに適した固体形態も調製することができる。調製物はまた、前記のようにアジュバント効果を高めるために、乳化されてもよく、リポソームまたは微粒子、例えば、ポリラクチド、ポリグリコリド、またはコポリマーに入れられてもよい。Langer, Science 249: 1527, 1990およびHanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28: 97-119, 1997。本発明の薬剤は、デポー注射剤、または活性成分を徐放または拍動放出(pulsatile release)するように処方することができる移植片調製物の形で投与することができる。

他の投与態様に適したさらなる製剤には、経口製剤、鼻腔内製剤、および肺製剤、坐剤および経皮適用が含まれる。

坐剤の場合、結合剤および担体は、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドを含む。このような坐剤は、0.5％〜10％、好ましくは1％〜2％の活性成分を含有する混合物から形成することができる。経口製剤には、賦形剤、例えば、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、および炭酸マグネシウムが含まれる。これらの組成物は、溶剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル、徐放製剤または散剤の形をとり、10％〜95％の活性成分、好ましくは25％〜70％の活性成分を含有する。

局所適用によって経皮的または皮内に送達することができる。局所投与は、薬剤と、コレラ毒素またはその無毒化した誘導体もしくはサブユニットあるいは他の類似の細菌毒素を同時投与することによって容易にすることができる。Glenn et al., Nature 391: 851, 1998。同時投与は、混合物として、または化学的架橋もしくは融合タンパク質としての発現によって得られた連結分子として成分を使用することによって達成されてもよい。

または、経皮送達は、皮膚パッチを用いて、またはトランスフェロソーム(transferosome)を用いて達成されてもよい。Paul et al., Eur. J. Immunol. 25: 3521-24, 1995; Cevc et al., Biochem. Biophys. Acta 1368: 201-15, 1998。

薬学的組成物は、一般的に、無菌で、実質的に等張性であり、米食品医薬品局の全てのGood Manufacturing Practice(GMP)規則に完全に準拠したものとして処方される。

毒性
好ましくは、本明細書に記載の治療有効量のタンパク質恒常性制御因子組成物は、実質的な毒性を引き起こすことなく治療利益を提供する。

本明細書に記載のタンパク質の毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって、例えば、LD₅₀ (集団の50％を殺す用量)またはLD₁₀₀ (集団の100％を殺す用量)を求めることによって確かめることができる。毒性効果と治療効果の用量比が治療指数である。これらの細胞培養アッセイおよび動物試験によって得られたデータは、ヒトでの使用に対して無毒の投与量範囲を示すことにおいて使用することができる。本明細書に記載のタンパク質の投与量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性のない有効量を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、使用される剤形および使用される投与経路に応じて、この範囲内で異なってもよい。的確な製剤、投与経路、および投与量は、患者の状態を考慮して医師一人一人によって選択することができる。例えば、Fingl et al., The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1., 1975。

キット
本発明の局面のタンパク質恒常性制御因子組成物および使用説明書を含むキットも本発明の範囲内にある。キットは、少なくとも1種類のさらなる試薬または本発明の局面の1種類もしくは複数の種類のさらなるヒト抗体(例えば、第1のヒト抗体とは別個の、抗原にあるエピトープに結合する相補活性を有するヒト抗体)をさらに含んでもよい。キットは、典型的には、キットの内容物の目的の用途を示すラベルを含む。ラベルという用語は、キットに取り付けられて供給される、もしくはキットと共に供給される、または他の方法でキットに付随する、任意の筆記具または記録された資料を含む。

本開示を考慮すれば、他の態様および使用は当業者に明らかであろう。

本発明は、以下の実施例を参照してさらに説明される。しかしながら、本発明はこのような実施例に限定されないことが理解されるはずである。

例示的な態様
実施例1
セラストロールはゴーシェ病患者由来線維芽細胞におけるタンパク質恒常性制御因子である
本発明者らは、サルブリナル(salubrinal)[Boyce et al., Science 307:935-939, 2005]、セラストロール[Westerheide et al., J Biol Chem 279:56053-56060, 2004]、インドメタシン、およびサリチル酸ナトリウム(natrium salycilate)を含む、タンパク質恒常性に影響を及ぼすことが知られている低分子を、薬理学的シャペロニング耐性であることが知られているL444P GCゴーシェ病線維芽細胞株(GM08760)に投与した[Sawkar et al., Chem Biol 12:1235-1244, 2005; Sawkar et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:15428-15433, 2002; Sawkar et al., ACS Chem Biol 1:235-251, 2006b]。以前に報告されたインタクト線維芽細胞アッセイと合成基質4-メチルウンベリフェリルβ-D-グルコシドを用いて、リソソームGC活性を評価した[Sawkar et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:15428-15433, 2002]。本発明者らはまた、溶解細胞アッセイを用いて、野生型(WT)および変種GCを有する様々な細胞株によって天然基質C12β-D-グルコシルセラミドを分解できたことを証明した。このアッセイでは、反応は薄層クロマトグラフィーによって追跡された。酵素活性は、使用するアッセイ条件に強く依存するので、変異体リソソーム酵素活性は、未処理細胞における変異体GC活性を基準とした倍率変化として、および全く同様に測定されたWT GC活性の割合として報告した。(ゴーシェ病関連GC変種の相対リソソーム活性については、図1Cの挿入図を参照されたい;活性の低下は、比活性が低下し、リソソーム濃度が低下した結果である)。Sawkar et al., Chem Biol 12:1235-1244, 2005。

37℃で72時間のインキュベーション期間後に、セラストロール(0.8μM)は、L444P GCの活性を1.8倍に(細胞WT GC活性の23％まで)増加させたが、評価した他の化合物は増加させなかった(図1A)。これは、本発明者らが、薬理学的シャペロンによってL444P GC活性の統計的に有意な増加を以前に一度も観察したことがなかったので注目に値する。Sawkar et al., Chem Biol 12:1235-1244, 2005; Sawkar et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:15428-15433, 2002; Sawkar et al., ACS Chem Biol 1:235-251, 2006b。セラストロールは、熱ショック応答をヒト細胞において誘導する熱ショック因子1(HSF1)転写活性化因子であることが知られている。熱ショック応答は、ストレスを緩和する際にタンパク質恒常性を回復させるために分子シャペロンおよび他の高分子がアップレギュレーションされることで可能になる、タンパク質変性/凝集に対する細胞質の保存された反応である。Westerheide et al., J Biol Chem 279:56053-56060, 2004; Lindquist, Ann Rev Biochem 55:1151-1191, 1986; Westerheide et al., J Biol Chem 280:33097-33100, 2005。セラストロール自体が薬物候補と見なされた場合は、0.5〜約1μMというセラストロールの狭い治療域が懸念すべき問題であろう。治療域が狭いのは、トリパンブルー染色により、これより高濃度では細胞傷害性が現われるためである。それよりも、原理の証拠を証明し、毒性がより低い同等物の発見の動機となるために、セラストロールをここで用いる。

L444P GCタンパク質恒常性の部分的な回復は、ゴルジ体領域を介したGC輸送に関連する別個のグリコシル化パターンを分析することによってさらに裏付けられた。Ron et al., Hum Mol Genet 14:2387-2398, 2005; Zimmer et al., J Pathol 188:407-414, 1999。セラストロールの存在下または非存在下で増殖させた線維芽細胞を、指示した時間で溶解し、エンドグリコシダーゼH(endoH)で処理した後に、L444P GCのグリコシル化をウエスタンブロットによって分析した(図1B)。PNGase Fによる消化は、高MW endoH耐性バンドがグリコシル化していたことを裏付けている(図8)。典型的には、endoH処理後に、ERを離れなかった、endoH感受性の、部分的にグリコシル化されたGCに対応する低分子量バンドが検出された。Ron et al., Hum Mol Genet 14:2387-2398, 2005; Sawkar et al., ACS Chem Biol 1:235-251, 2006b; Schmitz et al., Int J Biochem Cell Biol 37:2310-2320, 2005; Zimmer et al., J Pathol 188:407-414, 1999。endoH耐性リソソームGCグリコフォームに対応する高分子量バンドは、WT線維芽細胞(図8レーン2)について観察されたが、ゴーシェ病関連GC変種では、あったとしてもわずかにしか観察されなかった。Ron et al., Hum Mol Genet 14:2387-2398, 2005; Sawkar et al., ACS Chem Biol 1:235-251, 2006b; Schmitz et al., Int J Biochem Cell Biol 37:2310-2320, 2005; Zimmer et al., J Pathol 188:407-414, 1999。ER後GCグリコフォームバンドのデンシトメトリー定量から、このバンドの濃度はセラストロールで処理された細胞の方が高かったことは明らかである(黒色のバー、図1Bと比較のこと)。セラストロールで処理された線維芽細胞におけるL444P GCは、酵素活性のある、ネイティブに折り畳まれ、ネイティブにグリコシル化されたGC(黒色のバー、図1B)と、適切にグリコシル化されていない、ERに保持されたGC(白色のバー、図1B)の混合物である。

ER中に保持される2つの変種である、N370SおよびG202R GC変異を有するゴーシェ病患者由来線維芽細胞をセラストロールで処理(<0.8μM培地中濃度、72時間)することによって、それぞれ、1.5倍に(細胞WT GC活性の約39％まで)および1.9倍に(細胞WT GC活性の約20％まで)増加することが明らかになった(図1C)。重度神経障害性変異であると考えられているL444P GCの活性が、セラストロールによって、N370S GCの活性と同程度まで回復することは注目に値する。Sawkar et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:15428-15433, 2002。t=0時間、24時間、48時間、72時間、および96時間で様々な濃度のセラストロールにくりかえし曝露したL444P GC線維芽細胞は、t=120時間で、2.1倍の(WT GC活性の約26％まで)活性増加を示し(0.2μMセラストロール)(図9A、赤色の線)、1回のセラストロール曝露(図9A、青色のライン)よりわずかに増加した。L444P GC活性の時間依存性を調べると、単回投与後96時間および複数回投与で120時間の活性が高いことが明らかになった(図9Bおよび9Cを参照されたい)。従って、変異体GCはそのタンパク質恒常性環境に対して感受性であることが明らかである。

図1は、セラストロール処理によって、変種グルコセレブロシダーゼ(GC)の活性およびリソソームへの細胞輸送が増強されることを示す。A)セラストロール(0.2〜1.2μM)含有培地におけるL444P GC線維芽細胞の相対リソソームGC活性。セラストロールをt=0で添加し、培地交換無しで、GC活性を120時間にわたって24時間ごとにアッセイした。報告された活性は同じタイプの未処理細胞の活性に対して標準化し(左y軸)、WT GC活性に対するパーセントとして現した(右y軸)。B)0.8μMセラストロールに24時間、72時間、および120時間曝露した後の、線維芽細胞内のL444P GC輸送のウエスタンブロット分析。GCバンドはマウス抗GC抗体を用いて検出した。β-アクチンはゲルローディング対照として役立つ。endoH処理試料におけるウエスタンブロットバンドは、NIH(http://rsb.info.nih.gov/ij/)のJava画像処理分析ソフトウェアによって定量した。バーの白色部分は、下部のendoH感受性バンドを定量したものであり、バーの黒色部分は、高MW、endoH耐性バンドを表している。C)野生型GCならびに患者由来線維芽細胞におけるゴーシェ病関連N370S、G202R、およびL444P GC変種の相対リソソーム活性。細胞を増殖させ、図1Aのようにセラストロールで処理した。標準化されたGC活性は、72時間のインキュベーション期間後に評価した。挿入図は、以前に報告したような本発明者らのアッセイ条件下でのWT GC活性に対するパーセントとして表したGC変種酵素活性を示している。Sawkar et al., Chem Biol 12:1235-1244, 2005。

実施例2
プロテアソーム阻害剤MG-132はL444P GC線維芽細胞におけるタンパク質恒常性制御因子である
プロテアソーム阻害剤はシャペロン発現レベルを増強し、ERADを阻害するので、強力なタンパク質恒常性制御因子であり得ることが示唆された。Bush et al., J Biol Chem 272:9086-9092, 1997; Liao et al., J CeIl Biochem 99:1085-1095, 2006; Chillaron et al., Mol Biol Cell 11:217-226, 2000; Wiseman et al., Cell 131:809-821, 2007。この仮説を試験するために、L444P GC線維芽細胞を、0.1〜1.5μMの培地中濃度の公知のプロテアソーム阻害剤MG-132、PSI、PS IV、およびチロペンチン(Tyropentin) Aに一回曝露した。L444P GC活性は、96時間にわたって24時間ごとにモニタリングした。PS IVおよびチロペンチン AはL444P GC活性を増強しなかったが(図10)、PS Iは、中程度に1.25倍に増加させた(図10)。これに対して、MG-132は、120時間後に、L444P GC活性を4倍に(WT GC活性の約50.0％まで)増加させた(図2A)。ウエスタンブロット分析から、成熟し、折り畳まれた、リソソーム型のL444P GCの増加、特に、72時間での増加と一致して、MG-132処理細胞におけるendoH耐性GCバンドが著しく増加したことが明らかになった(図2B、黒色のバー)。L4444P GCのendoH感受性ERバンドの強度の注目に値する増加は、最初の72時間、ERAD阻害剤として役立ったMG-132と一致し(図2B、白色のバー)、セラストロール投与による、観察された、このバンドの増加より大きい(図1B)。MG-132投与計画の最適化(例えば、72時間超の間隔を開けた複数回投与)によって、L444P GCリソソーム活性がさらに増強するかもしれない。GCタンパク質恒常性制御因子の機能には一般的なプロテアソーム阻害は十分でないが、MG-132はタンパク質恒常性制御因子であるように見える。

包括的なタンパク質生合成に及ぼすPR処理の影響を理解するために、質量分析をベースとするプロテオーム分析(multidimensional protein identification technology[MudPIT])を使用した(Liu et al., Anal. Chem. 76, 4193-4201 (2004); Liao et al., J. Proteome Res. 6, 1059-1071 (2007); Rikova et al., Cell 131, 1190-1203 (2007))。L444P GC線維芽細胞をMG-132(0.8μM)で3日間処理すると、未処理試料および処理試料において検出された2100のタンパク質のうち、198のタンパク質がアップレギュレートされ、255のタンパク質がダウンレギュレートされたのに対して(図29、左)、セラストロール(0.8μM)で3日間処理すると、199のタンパク質がアップレギュレートされ、292のタンパク質がダウンレギュレートされた(図29、右)。従って、PRは、エネルギー的に不安定にされた酵素を直す環境を提供することができるが、プロテオームには中程度にしか影響を及ぼさない。

免疫蛍光研究から、WT GCはリソソームマーカーLAMP2と共局在していたことが分かっている(図2C、上の横列、GC緑色、LAMP2赤色、重複は人為的に白色にした)。このことは、WT GCがリソソームに適切に輸送されたことを立証している。Sawkar et al., ACS Chem Biol 1:235-251, 2006b。L444P GC線維芽細胞を0.25μM MG-132無しで、および0.25μM MG-132と共に3日間インキュベートした後に、顕微鏡観察のためにプレートした。L444P GCは、薬物処理が無い場合では、広範囲のERADのために、ほとんど目に見えなかった。L444P GCはMG-132処理後には容易に検出され(図2C、横列3および2を比較のこと)、リソソームマーカーLAMP2との共局在を示した(図2C、横列3、縦列3)。活性、endo H耐性、および蛍光顕微鏡データ(図2)をひとまとめにすると、適切に折り畳まれたL444P GCはERから出て、ゴルジ体を通って輸送され、リソソームに到達したことが証明される。対照として、7種類のWTリソソーム加水分解酵素の細胞活性に及ぼすMG-132およびセラストロールの影響をL444P GC線維芽細胞において評価した(図11)。セラストロール処理によって、これらの酵素活性は有意に増加しなかった。MG-132によって、α-ガラクトシダーゼの活性は1.8倍に増加したのに対して、モニタリングされた他の酵素の活性は平均して1.2倍に増加した(図11)。どちらも、セラストロール処理により増加した正常線維芽細胞WT GC活性ではなかった。

図2は、プロテアソーム阻害剤MG-132がL444P GC線維芽細胞内でGC活性を強力に増強し、リソソームへの細胞輸送を促進することを示す。A)t=0でMG-132に曝露し、培地交換無しで、120時間インキュベートしたL444P GC線維芽細胞のGC活性。GC活性は24時間、48時間、72時間、96時間、および120時間で測定し、同じタイプの未処理細胞の活性を基準にして(左y軸)、およびWT GC活性に対するパーセントとして報告した(右y軸)。B)t=0でMG-132(0.8μM)に曝露した線維芽細胞株からのL444P GCのウエスタンブロット分析。細胞タンパク質を、24時間、72時間、および120時間で採取し、図1Bに記載のようにERおよびリソソームGCグリコフォームを測定および定量した。C)L444P GCおよびWT細胞(正の対照)におけるGCの免疫蛍光顕微鏡分析。L444P GC細胞を0.25μM MG-132と3日間インキュベートした(下の横列)、または処理しなかった(真ん中の横列)。GCはマウス抗GC抗体8E4(縦列1)を用いて検出した。ウサギ抗LAMP2抗体はリソソームマーカー(縦列2)として使用した。GC(緑色)およびLAMP2(赤色)の共局在は人為的に白色にした(縦列3)。

図8は、L444P GC線維芽細胞におけるGC輸送のウエスタンブロット分析を示す。L444P GC線維芽細胞を0.25μM MG-132で72時間(Mの印をした)または0.8μMセラストロールで72時間(Cの印をした)処理した。未処理WT細胞および未処理L444P細胞は、それぞれ、正の対照および負の対照として役立った。溶解細胞からの等量の総タンパク質を緩衝液のみ、EndoH、またはPNGaseFで消化した後に、10％SDS-PAGEゲルで分離し、マウス抗GC抗体2E2を用いて検出した。EndoH耐性GCバンドは、成熟した、リソソームに局在するGCグリコフォームを反映している。PNGase F消化によって、脱グリコシルしたGC形態が得られた。両ゲル画像とも、露出時間の異なる同じブロットから撮影した。EndoH耐性バンドを視覚化するには、長い露出時間が必要である。α-アクチンはローディング対照として役立った。

図9は、L444P GC線維芽細胞におけるセラストロール投与計画の最適化を示す。報告された活性は未処理L444P細胞の活性に対して標準化し(左y軸)、WT GC活性に対するパーセントとして表した(右y軸)。A)0.1〜1.2μMの培地中濃度のセラストロールで120時間処理した線維芽細胞内のL444P GC活性は、未処理細胞の活性を基準にして報告した。青色の曲線は、セラストロールをt=0で投与し、その後に、培地またはセラストロールを交換しなかったことを示すのに対して、赤色の曲線は、t=0時間、24時間、48時間、72時間、および96時間で培地交換をしてセラストロールを投与したことによるものである。B)時間0でセラストロールに曝露し、その後に、72時間で、培地を、セラストロールを含まない培地と交換したL444P GC線維芽細胞の相対GC活性。L444P GC活性は、72時間、96時間、120時間、144時間、168時間、および192時間で測定した。セラストロールを介したL444P GC活性は、単回投与後96時間、活性を増加させた。C)t=0時間、24時間、および48時間でセラストロールに曝露したL444P GC線維芽細胞の相対GC活性。72時間で、培地を、セラストロールを含まない培地と交換し、L444P GC活性を72時間、96時間、120時間、144時間、168時間、および192時間で測定した。これは、120時間、活性が保持されたことを示した。

図10は、L444P GC線維芽細胞のGC活性に及ぼすプロテアソーム阻害剤の影響を示す。L444P GC線維芽細胞を、t=0で、0.1〜1.5μMの培地中濃度の様々なプロテアソーム阻害剤(MG-132、PS I、PS IV、およびチロペンチンA)に曝露した。細胞を培地交換無しで96時間インキュベートし、GC活性を測定し、同じタイプの未処理細胞の活性を基準にして(左y軸)およびWT GC活性に対するパーセントとして(右y軸)報告した。

図11は、L444P線維芽細胞における他のWTリソソーム酵素ならびにWT GC線維芽細胞におけるGC(星印で示した)の活性に及ぼすMG-132およびセラストロールの影響を示す。0.8μM MG-132または0.8μMセラストロールと24時間インキュベーションした後に、L444P GC線維芽細胞については、α-マンノシダーゼ、α-グルコシダーゼ、α-グルクロニダーゼ、α-ガラクトシダーゼ、α-ガラクトシダーゼ、ヘパラン硫酸スルファミダーゼ(SGSH)、およびα-N-アセチルグルコサミニダーゼ(NAGLU)の活性をアッセイし、WT GC線維芽細胞についてはGC活性をアッセイし、これらの対応する基質と、以前に説明した溶解細胞酵素活性アッセイを用いた。Sawkar et al. Chem Biol 12:1235-1244, 2005。処理細胞の酵素活性は、同じタイプの未処理細胞の酵素活性に対して標準化した。報告された各データ点は、各プレートにおいて少なくとも三通り、および異なる日に3回評価した。

図12は、セラストロールおよびNN-DNJを含有する培地を用いて培養されたG202RおよびN370S GC患者由来線維芽細胞のGC活性を示す2Dプロットを示す。A)G202R GC線維芽細胞株の相対GC活性。4つの培養セットを調製し、0μM、0.4μM、0.6μMまたは0.8μMのセラストロールとインキュベートした。各セットには、1〜20μMの範囲の培地濃度のNN-DNJをさらに添加した。GC活性は、増殖させて4日後に測定し、未処理細胞のGC活性によって標準化した。B)G202R GC線維芽細胞株の相対GC活性。4つの培養セットを調製し、0μM、2μM、5μMまたは20μMのNN-DNJとインキュベートした。各セットには、0.2〜1.2μMの培地中濃度のセラストロールをさらに添加した。GC活性は、増殖させて4日後に測定し、未処理細胞のGC活性によって標準化した。C)N370S GC線維芽細胞株の相対GC活性。細胞を増殖および処理し、GC活性をAに記載のように測定した。D)N370S GC線維芽細胞株の相対GC活性。細胞を増殖および処理し、GC活性をBに記載のように測定した。

実施例3
薬理学的シャペロンおよびタンパク質恒常性制御因子は相乗作用を示す
阻害濃度以下の濃度のGC阻害剤/薬理学的シャペロン、例えば、N-(n-ノニル)デオキシノジリマイシン(NN-DNJ;<30μM)をN370SおよびG202R GCゴーシェ病患者由来線維芽細胞に添加すると、変異体GCフォールディング、輸送効率、および活性が増加した。Sawkar et al., Chem Biol 12:1235-1244, 2005; Sawkar et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:15428-15433, 2002; Sawkar et al., ACS Chem Biol 1:235-251, 2006b; Yu et al., J Med Chem 50:94-100, 2007b。従って、本発明者らは、薬理学的シャペロンとタンパク質恒常性制御因子、例えば、セラストロールとの組み合わせには、これらの別個の作用機構によりGC タンパク質恒常性の増強に対して相乗作用があるのではないかと考えた。Bouvier, Chem Biol 14:241-242, 2007; Fan et al., Nat Med 5:112-115, 1999; Sawkar et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:15428-15433, 2002。GC薬理学的シャペロンは、折り畳まれた状態のアンサンブルを安定化して、さらに多くのGC集団がER輸送機構に関与できるようになるのに対して(図3A)、タンパク質恒常性制御因子は、シャペロンを介したフォールディング経路をアップレギュレートして、部分的に折り畳まれた中間体に結合するシャペロンによるGCフォールディング効率を高めて、凝集を弱めながらフォールディングを促進する。図3A。Wiseman et al., Cell 131:809-821, 2007。

NN-DNJおよびセラストロールを、濃度の関数として、薬理学的シャペロニングの対象となることが知られているGC変異(N370SおよびG202R GC)を有する線維芽細胞に同時投与した。セラストロール単独(0.4μM)とインキュベートされたG202R線維芽細胞は、活性が2倍に増加した、すなわち100単位または100％増加したのに対して、NN-DNJ(<20μM)単独では、G202R GC活性は1.8倍に増加した、すなわち80単位増加したことが観察された。セラストロール(0.4μM)およびNN-DNJ(5μM)を同時投与すると、G202R活性は4.2倍に増加した、すなわち320単位(WT GC活性の44％まで)増加した(図3Bならびに12Aおよび12B)。これは、合計した2.8倍または180単位のほぼ2倍であり、相乗効果を証明している。N370S GC線維芽細胞を用いて、忠実に似せた実験を行った。セラストロール単独(0.8μM)だとGC活性は1.5倍に増加したのに対して、NN-DNJ単独(<20μM)では2.2倍に増加した。0.5μMセラストロールおよび2μM NN-DNJで処理されたN370S GC線維芽細胞は、N370S GC活性が3.5倍に(WT GC活性の約112％まで)増加した。これは、合計した2.7倍より大きく、これも相乗効果を証明している(図3Cならびに12Cおよび12D)。投与計画を最適化することによって、G202RおよびN370S GCのフォールディング、輸送、および機能のさらなる相乗的増加が得られる可能性が高い。

実施例4
難治性L444P GC細胞株におけるタンパク質恒常性制御因子および薬理学的シャペロンの相乗作用
L444P GCは、通常、N370SおよびG202R GCが薬理学的シャペロニングの対象となる条件下では薬理学的シャペロニングの対象とならないが、本発明者らは、NN-DNJおよびセラストロールを同時投与することによって、L444P GCを用いた類似の実験セットを試みた。Sawkar et al., Chem Biol 12:1235-1244, 2005; Sawkar et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:15428-15433, 2002。細胞を<2μMの濃度のNN-DNJ単独と12時間までインキュベートすることによって、L444P GC活性はかろうじて有意に1.2倍に増加した(図13A)。セラストロールおよびNN-DNJが、線維芽細胞においてN370SおよびG202R GC活性を増強するのに最適な単回投与濃度で組み合わされた時、観察されたL444P GC活性は、セラストロール単独で得られた活性より低かった(1.8倍の増強、図1A)。さらに、さらなる実験から、GC活性の減少は、使用したNN-DNJ濃度と比例することが明らかになった。このことは、L444P GCは、NN-DNJによるGC阻害に対して非常に感受性であることを示唆している。Sawkar et al., ACS Chem Biol 1:235-251, 2006b。この感受性を回避するために、リソソームL444P GCの阻害が薬理学的シャペロニングより優位に立つ濃度より細胞NN-DNJ濃度を低くすることを想定して、短時間(12時間)のNN-DNJパルスを使用した。この投与計画(図3D)は、144時間でL444P GC活性の3.9倍(290単位)(WT GC活性の49％まで)の増加をもたらした。これは、合計して2.0倍すなわち100単位よりほぼ300％大きく、相乗効果を証明している(図13Aおよび13Bも参照されたい)。投与計画のさらなる最適化が神経障害性ゴーシェ病介入に有用であるかもしれない。

薬理学的シャペロンおよびタンパク質恒常性制御因子の相乗作用の普遍性を調べるために、セラストロールおよびNN-DNJの相乗的使用のために確立された最適な投与プロトコールを用いて、NN-DNJおよびMG-132をL444P GC線維芽細胞に同時投与した(図3D)。L444P GC活性の6.2倍(細胞WT GC活性の約78％まで)の増加が観察された(MG-132(0.4μM)およびNN-DNJ(0.5μM))(図3Eならびに14Aおよび14B)。

実施例5
2種類のタンパク質恒常性制御因子の同時投与は相乗作用を示す
タンパク質恒常性制御因子および薬理学的シャペロンは組み合わされると相乗的なGCレスキューを示すので、本発明者らは、タンパク質恒常性制御因子が組み合わされると相乗作用が生じるのではないかと考えた。MG-132(0.6μM)およびセラストロール(0.2μM)をL444P GC線維芽細胞に同時投与すると、96時間インキュベーション期間後に、L444P GC活性が6倍に(500単位)(細胞WT GC活性の約75.0％まで)相乗的に増加した(図3F、14Cおよび14D)。L444P GC活性は、MG-132単独では4倍に(300単位)、セラストロール単独では1.8倍に(80単位)増加した。これらのデータは、タンパク質恒常性制御因子の併用は強力であり得ることを証明している。

図3は、薬理学的シャペロンおよびタンパク質恒常性制御因子が相乗作用を示すことを示す。A)薬理学的シャペロンおよびタンパク質恒常性制御因子の別個の作用機構への洞察。B〜E)セラストロールおよびNN-DNJまたはMG-132およびNN-DNJを含有する培地に曝露した患者由来線維芽細胞内のGC活性。全ての3Dプロットにおいて、セラストロール/MG132およびNN-DNJ培地中濃度をx軸およびy軸に示し、変異体GC活性をz軸に示した。図12、13、14A、および14Bには、相対変異体GC活性対NN-DNJおよびセラストロール/MG132濃度の2Dプロットを報告する。投与の概要は図3B〜3Eに下部に示した。報告された活性は、同じタイプの未処理細胞の活性に対して標準化し(左z軸)、WT GC活性に対するパーセントとして表した(右z軸)。F)t=0でセラストロールおよびMG-132に曝露したL444P GC線維芽細胞株のGC活性。3Dプロットは、x軸およびy軸にセラストロールおよびMG-132培地中濃度を示し、z軸には、培地交換無しで96時間後に測定されたL444P GC活性を、同じタイプの未処理細胞の活性を基準にして(左z軸)およびWT GC活性に対するパーセントとして(右z軸)示す。白色領域は、内挿するのにデータが不十分な領域を反映している。図14Cおよび14Dにはそれぞれ、相対L444P GC活性対セラストロールおよびMG-132濃度の2Dプロットを報告する。

図13は、t=0時間、30時間、60時間、72時間、102時間、および132時間でインキュベーション培地を交換した以外は図12に記載のものと同じ実験計画に従って、細胞をプレートおよび処理したことを示す。t=0時間、30時間、72時間、および102時間では、培地にセラストロールを添加したのに対して、t=60時間および132時間では、培地にセラストロールおよびNN-DNJを両方とも添加した(図3Dの下部にある概要も参照されたい)。L444P GC活性は144時間後に測定し、未処理細胞の活性に対して標準化した。A)0.25〜5μMの培地中濃度のNN-DNJ、および0μM、0.1μM、0.2μM、0.4μM、または0.6μMの一定濃度のセラストロールとインキュベートしたL444P GC線維芽細胞の相対GC活性。B)0.2〜1.2μMの培地中濃度のセラストロール、および0μM、0.5μM、1μM、2μM、または4μMの一定濃度のNN-DNJとインキュベートしたL444P GC線維芽細胞の相対GC活性。

図14は、MG-132およびセラストロールまたはMG-132およびNN-DNJを含有する培地を用いて培養された患者由来線維芽細胞における相対L444P GC活性を示す。相対L444P GC活性は、同じタイプの未処理細胞の活性に対して標準化した。A)0.25〜5μMの培地中濃度のNN-DNJおよび0μM、0.2μM、0.4μM、0.6μM、または0.8μMの一定濃度のMG-132とインキュベートしたL444P GC線維芽細胞の相対GC活性。培地は、図13においてセラストロールおよびNN-DNJについて述べられ、図3Eの概要に示された同じ手順に従って複数回交換した。GC活性アッセイは6日後に行った。B)0.2〜1.2μMの範囲の培地中濃度のMG-132および0μM、0.5μM、1μM、5μM、または10μMの一定濃度のNN-DNJとインキュベートしたL444P GC線維芽細胞の相対GC活性。培地は、図13においてセラストロールおよびNN-DNJについて述べられ、図3Eの概要に示された同じ手順に従って交換した。GC活性アッセイは6日後に行った。C)0.2〜1.2μMの培地中濃度のセラストロールおよび0μM、0.2μM、0.4μM、または0.6μMの一定濃度のMG-132とインキュベートしたL444P GC線維芽細胞の相対GC活性。L444P GC線維芽細胞株をt=0でセラストロールおよびMG-132に曝露し、増殖させて4日後に相対L444P GC活性を測定した。D)0.2〜1.2μMの培地中濃度のMG-132および0μM、0.2μM、0.4μM、または0.6μMの一定濃度のセラストロールとインキュベートしたL444P GC線維芽細胞の相対GC活性。L444P GC線維芽細胞株をt=0でセラストロールおよびMG-132に曝露し、増殖させて4日後に相対L444P GC活性を測定した。

図15は、MG-132およびADNJを含有する培地を用いて培養されたG269S/1278insTATC HexAテイ・サックス病線維芽細胞株における相対Hexα部位活性を示す。G269S/1278insTATC HexA線維芽細胞株をt=0でMG-132およびADNJに曝露し、増殖させて6日後に、同じタイプの未処理細胞の活性を基準にして、相対Hexα部位活性を測定した。A)2〜50μMの培地中濃度のADNJおよび0μM、0.2μM、0.4μM、0.6μM、0.8μM、または1.0μMの一定濃度のMG-132とインキュベートしたG269S/1278insTATC HexA細胞の相対Hexα部位活性。B)0.2〜1.2μMの培地中濃度のMG-132および0μM、2μM、5μM、10μM、20μM、または50μMの一定濃度のADNJとインキュベートしたG269S/1278insTATC HexA細胞の相対Hexα部位活性。

実施例6
セラストロールおよびMG-132はテイ・サックス病におけるタンパク質恒常性制御因子としても役立つ
セラストロールおよびMG-132は、分泌経路における変異体タンパク質フォールディングの障害に関連する他の機能喪失型疾患におけるタンパク質恒常性を回復できるはずである。従って、本発明者らは、これらのタンパク質恒常性制御因子が、α-サブユニットおよびβ-サブユニットからなるヘテロ二量体酵素であり、リソソーム内のGM2ガングリオシドを分解するHexAの部分的な機能を回復させる能力を評価した。β-ヘキソサミニダーゼAα-サブユニットに変異があると、HexAは広範囲のERADを受けて、テイ・サックス病(TSD)の原因となり得る。Jeyakumar et al., Neuropathol Appl Neurobiol 28:343-357, 2002。HexA活性を、テイ・サックス病患者において見られる最も優勢なβ-ヘキソサミニダーゼAα-サブユニット変異の1つ(G269S)および第2の変異HexA対立遺伝子(1278insTATC)と停止コドンを有する複合ヘテロ接合性線維芽細胞株(GM13204)において研究した。MUGS基質を用いて、HexA酵素の中のα部位の活性を測定した。これにより、未処理G269S HexA線維芽細胞はWT Hexα部位活性の10％を有することが明らかになった。Tropak et al., J Biol Chem 279:13478-13487, 2004。MG-132 投与(0.8〜1μM)によって、144時間インキュベーション期間後に、G269S Hexα部位活性は1.8倍に(細胞WT Hexα部位活性の約18％まで)増加したのに対して(図4A)、96時間のインキュベーション後に、セラストロール(0.4〜0.6μM)によって1.6倍に(細胞WT HexAα部位活性の約16％まで)増加した(図4B)。

実施例7
テイ・サックス病におけるタンパク質恒常性制御因子および薬理学的シャペロンの相乗作用
2-アセトアミド-2-デオキシノジリマイシン(ADNJ)は、多くのテイ・サックス病患者由来細胞株において薬理学的シャペロンとして機能することが報告されている。Tropak et al., J Biol Chem 279:13478-13487, 2004。複合ヘテロ接合性G269S/1278insTATC HexA線維芽細胞株を、培地交換せずにADNJ(20〜50μM)に1回曝露した。192時間後に、細胞Hexα部位活性は2.5倍に(150単位)(細胞WT Hexα部位活性の約25％まで)増加した(図4C)。前記のゴーシェ病の実施例に基づいて、本発明者らは、タンパク質恒常性制御因子(MG-132)および薬理学的シャペロン(ADNJ)を同時投与することによって、Hexα部位活性のレスキューが増強されると予想した。MG-132(0.8μM)およびADNJ(20μM)に1回曝露された144時間後に、5倍(400単位)(細胞WT Hexα部位活性の約50％まで)のG269S Hexα部位活性増加が検出された(図4Dならびに15Aおよび15B)。これは、個々の効果を合計した3.3倍(230単位)より大きく、相乗作用を証明している。投与計画が最適化されると、観察された大幅な活性増加がさらに増強されるはずである。

図4は、タンパク質恒常性制御因子を単独で、または酵素特異的薬理学的シャペロンと組み合わせて用いると、G269S/1278insTATC HexAテイ・サックス病線維芽細胞株のHexα部位活性が増強されることを示す。G269S/1278insTATC HexA線維芽細胞を、A)0.2〜1.2μM MG-132に曝露し、Hexα部位活性を96時間、120時間、144時間、168時間、192時間で測定した;B)0.2〜1.2μMセラストロールおよびHexα部位活性を24時間、48時間、72時間、96時間、120時間で測定した;C)5〜100μM ADNJに曝露し、Hexα部位活性を96時間、120時間、144時間、168時間、192時間で測定した。全ての活性は、同じタイプの未処理細胞の活性を基準にして(左y軸)、WT Hexα部位活性に対するパーセントとして(右y軸)報告した。D)t=0でMG-132およびADNJを含む培地に曝露したG269S/1278insTATC HexA線維芽細胞株のHexα部位活性。3Dプロットは、x軸およびy軸にMG-132およびADNJ培地中濃度を示し、z軸には、増殖させて144時間後に測定されたHexα部位活性を、同じタイプの未処理細胞の活性を基準にして(左z軸)、WT Hexα部位活性に対するパーセントとして(右z軸)示す。図15Aおよび15Bにはそれぞれ、G269S/1278insTATC HexA細胞における相対Hexα部位活性対ADNJおよびMG-132濃度の2Dプロットを報告する。

実施例8
MG-132およびセラストロールの作用機構への洞察
セラストロールおよびMG-132は熱ショック応答(HSR)を誘導して、サイトゾル中の熱ショックタンパク質の発現を増強することが以前に証明されている。Bush et al., J Biol Chem 272:9086-9092, 1997; Liao et al., J Cell Biochem 99:1085-1095, 2006; Westerheide et al., J Biol Chem 279:56053-56060, 2004。熱ショック応答が、折り畳まれ、可溶性内腔酵素として分泌経路内に輸送されるGCのタンパク質恒常性にかなりの影響を及ぼし得ることは、最初のうちは驚くべきことかもしれない。しかしながら、さらによく考えてみると、シャペロンを含むサイトゾル因子は、フォールディングおよび輸送を許容するように分泌経路を適応させるのに必須である可能性が高い。さらに、MG-132およびセラストロールはまた、フォールディングおよび輸送を許容するように、分泌経路、特に、ERを再構築する小胞体ストレス応答(UPR)の3つのアームの1つまたは複数も誘導する可能性がある。Ron et al., Nat Rev Mol Cell Biol 8:519-529, 2007; Schroeder et al., Ann Rev Biochem 74:739-789, 2005。

セラストロールおよびMG-132による処理によって、どの程度までHSRおよびUPRが誘導されたかどうかモニタリングするために、定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)分析を行った(プライマーを表2に列挙した)。L444P GC細胞を0.8μM MG-132または0.8μMセラストロール単独と24時間インキュベートした後に、総RNAを抽出した。代表的な細胞質HSR関連シャペロン(Hsp40、Hsp70、Hsp90、Hsp27、αB-クリスタリン)、ER内腔UPR関連シャペロン(BiP、GRP94、カルレチキュリン)、およびERシャペロンカルネキシンの相対mRNA発現レベルをモニタリングした。これらの報告されたレベルは、未処理細胞におけるレベルに対して標準化した(図5AおよびB)。ハウスキーピング対照としてモニタリングされたグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼのレベルは、処理細胞および未処理細胞において変化しなかった。

タンパク質恒常性制御因子による処理は、細胞質シャペロンおよびER内腔シャペロンをアップレギュレートする。両タンパク質恒常性制御因子とも、サイトゾル中のHsp40、Hsp70、およびHsp90、αB-クリスタリンのmRNA発現レベル、ならびにER内腔中のBiPのmRNA発現レベルを有意にアップレギュレートし、いずれもGRP94およびカルレチキュリンの転写を変えなかった(図5AおよびB)。しかしながら、違いもある。セラストロールは、Hsp27の転写を有意に増加したのに対して、MG-132処理は増加しなかった。逆に、MG-132処理はカルネキシン転写を有意にアップレギュレートしたが、セラストロール処理はアップレギュレートしなかった。Hsp70が50倍にアップレギュレートされたことは、このシャペロンが、変異体GC機能の部分的な回復に特に重要であり得ることを示唆している。HSP70阻害剤101を未処理L444P GC線維芽細胞に添加すると、L444P GC活性が低下した(図16)。さらに、この阻害剤とMG-132が同時投与されると、MG-132によるL444P GC活性の増強が拮抗された(図16)。このことは、サイトゾルシャペロンであるHSP70が線維芽細胞のGCタンパク質恒常性において重要なシャペロンであることを裏付けている。

図16。Hsp70阻害剤である化合物101単独、またはMG-132と組み合わせた場合の、L444P GC線維芽細胞におけるGC活性に及ぼす影響。化合物101を、0.25μM MG-132無しで、または0.25μM MG-132と共に24時間適用し、L444P GC活性をアッセイし、未処理L444P GC細胞の活性に対して標準化し(左y軸)、WT GC活性に対するパーセントとして表した(右y軸)。

Hsp70シャペロンレベルの変化と、セラストロールを介したHsp70転写増加を相関付けるために、ならびにHsp70レベル変化の時間依存性を調べるために、L444P GC線維芽細胞を、セラストロール(0.8μM)に1回、示された期間にわたって曝露し、細胞溶解産物中のHsp70発現レベルをウエスタンブロット分析によって分析した。セラストロールで処理された細胞(図5C、赤色のバー)において、Hsp70レベルは、未処理細胞(青色のバー)よりかなり高く、24時間後に最大となり、120時間でのL444P GC活性ピークの一因となった(図1A)。N370SおよびG202R GC線維芽細胞について、厳密に類似する結果が観察された。未処理L444P GC細胞(図5C、青色のバー)は、48時間、72時間、および96時間で、中程度に増強したHsp70レベルしか示さない。このことは、72時間後、特に120時間後に、図1Bにおいて観察されたセラストロール曝露非存在下でのGCレベルの増強を少なくとも部分的に説明しているが、これらのGCおよびHsp70レベルの増加は、GC活性の測定可能な増加をもたらさなかった。HSR活性化の産物であるHsp70は、HSF1に結合して、熱ショック遺伝子転写を抑制することによるHSR自己調節に結びつけられてきた(図7)。Morimoto, Genes Dev 12:3788-3796, 1998; Westerheide et al., J Biol Chem 280:33097-33100, 2005。従って、セラストロール(0.8μM)に1回または96時間にわたって24時間ごとに曝露した線維芽細胞は、時と共にHsp70発現レベルの減少を示した。これは、HSRの自己調節と一致している(図5C)。

HSF1は、セラストロールのHSR誘導を担っている可能性が高いので、本発明者らはHSF1レベルをモニタリングした。Westerheide et al., J Biol Chem 279:56053-56060, 2004。セラストロールまたはMG-132で指示された期間にわたって処理した後のL444P GC線維芽細胞におけるHSF1レベルを、ウエスタンブロット分析によってモニタリングした(図5D)。報告したように、セラストロールは、24時間にわたってHSF1レベルを増加させたが、MG-132で処理しても、HSF1レベルは同じ期間にわたって一定のままであった。このことは、MG-132はHSF1を有意にアップレギュレートせずにHSRを誘導するという報告と一致している。Awasthi, et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 46:2082-2091, 2005; Bush et al., J Biol Chem 272:9086-9092, 1997。

図5は、MG-132およびセラストロールは両方ともL444P GC線維芽細胞において熱ショック応答を活性化することを示す。0.8μMセラストロール(A)または0.8μM MG-132(B)で処理されたL444P GC線維芽細胞において定量RT-PCRによって、相対シャペロンmRNA発現レベルを調べた。L444P GC細胞を薬物と24時間インキュベートした。処理されたL444P GC細胞の相対mRNA発現レベルは、ハウスキーピング対照であるGAPDHの発現レベルに対して補正した後、未処理細胞に対して標準化した。C)時間の関数としての、セラストロールを使用した(+)、セラストロールを使用しなかった(-)、L444P GC細胞におけるHsp70レベルのウエスタンブロット分析。細胞アリコートを120時間にわたって24時間ごとに溶解してタンパク質を抽出し、等量のタンパク質をロードした。β-アクチンはゲルローディング対照として役立った。セラストロールに一度も曝露しなかった細胞(-)、t=0でセラストロールに曝露した細胞(+)、またはt=0でセラストロール(0.8μM)に曝露し、24時間ごとに培地交換した細胞

からのHsp70バンドを、図1Bに記載のように定量した。D)セラストロールおよびMG-132で処理したL444P GC細胞におけるHSF1タンパク質発現レベル。L444P GC細胞を、指示された時間にわたって、0.8μMセラストロールおよび0.8μM MG-132で処理した後、SDS-PAGE分析のために溶解した。ウエスタンブロット分析を用いてHSF1を調べた。β-アクチンはローディング対照として役立った。

実施例9
セラストロール処理およびMG-132処理によって小胞体ストレス応答(UPR)が誘導される
ERは、総称して小胞体ストレス応答と呼ばれる、細胞内シグナル伝達経路の統合された3つまでのアームを活性化することによって、ER内腔にある折り畳まれていないタンパク質の蓄積に応答する。小胞体ストレス応答は、分泌経路内で機能する非常に多くの遺伝子の発現を調節する。Ron et al., Nat Rev Mol Cell Biol 8:519-529, 2007; Schroeder et al., Ann Rev Biochem 74:739-789, 2005。セラストロール処理またはMG-132処理によってUPRが活性化されたかどうか調べるために、本発明者らは、十分に確立した3つのUPR関連ストレスセンサー:ER中のフォールディング状態を感知し、ER膜を横断して細胞質および核にシグナルを伝達して、最終的には転写を活性化することができる内在性膜タンパク質である、IRE1、ATF6、およびPERKをモニタリングした。Ron et al., Nat Rev Mol Cell Biol 8:519-529, 2007; Schroeder et al., Ann Rev Biochem 74:739-789, 2005。

IRE1は、オリゴマー化することによって、そのエンドヌクレアーゼ機能を活性化するトランス自己リン酸化を起こして、転写因子XBP1をコードするmRNAを正確にスプライシングすることによってストレスに応答する。Ron et al., Nat Rev Mol Cell Biol 8:519-529, 2007; Schroeder et al., Ann Rev Biochem 74:739-789, 2005。XBP1のスプライシングされたmRNAを検出するために、RT-PCRを行った。L444P GC線維芽細胞をセラストロール(0.8μM)に1回曝露すると、スプライシングされた形のXbp-1は4〜24時間の間に現われた。このことから、UPRのIRE1アームが活性化されたことが分かる(図6A)。対照的に、MG-132に1回曝露しても、スプライシングされたXbp-1はL444P GC細胞において検出できなかった(図6A)。このことから、この期間の間にIRE1は活性化されなかったことが分かる。予想されたように、WT線維芽細胞でもXbp-1スプライシングは観察されなかった。

ATF6は、ゴルジ体内で調節されたタンパク質分解を受けて、UPR遺伝子のサブセットを活性化するATF6サイトゾル断片を遊離することによってストレスに応答する。Ron et al., Nat Rev Mol Cell Biol 8:519-529, 2007; Schroeder et al., Ann Rev Biochem 74:739-789, 2005。ATF6の切断をウエスタンブロット分析によってモニタリングした。未処理L444P GC線維芽細胞では、切断および活性化された、かなりの量の50kD型ATF6が観察されたのに対して、未処理WT細胞では何も検出されなかった(図6B)。L444P GC線維芽細胞ではATF6は構成的に活性化されるという本発明者らの観察は、慢性ストレスから細胞を保護する長期にわたるER機能をATF6αが最適化するという最近の報告と一致している。Wu et al., Dev Cell 13:351-364, 2007。セラストロールまたはMG132(0.8μM)を2時間適用すると、切断されたATF6のレベルが増加した。このことから、UPRのATF6アームが活性化されたことが分かる。さらに長期間(24時間)、セラストロールまたはMG132とインキュベーションすると、AFT6活性化は減少した。

PERKは、eIF2のαサブユニットをオリゴマー化およびリン酸化して、ATF4を介してCHOPおよびシャペロンを含む他のタンパク質を産生させることによってストレスに応答する。Ron et al., Nat Rev Mol Cell Biol 8:519-529, 2007; Schroeder et al., Ann Rev Biochem 74:739-789, 2005。MG-132またはセラストロール(0.8μM)で処理すると、定量RT-PCR分析によって認められるように、CHOPのmRNA発現レベルが有意にアップレギュレートされた(図6CおよびD,右パネル)。BiPもまた、MG-132またはセラストロール(0.8μM)で処理されたL444P GC線維芽細胞においてアップレギュレートされた(図6CおよびD、左パネル)。BiPは細胞を保護すると考えられているのに対して、CHOPは、よく理解されていない機構を介してアポトーシスを引き起し得る。Ron et al., Nat Rev Mol Cell Biol 8:519-529, 2007; Schroeder et al., Ann Rev Biochem 74:739-789, 2005。PERK活性化は包括的なタンパク質合成の低下につながり得るが、L444P GC線維芽細胞にセラストロールおよびMG-132を投与することによって、GCレベルが増加した(図1B、2B)。

UPRおよびHSRはセラストロールおよびMG-132によって活性化されるので、本発明者らは、L444P GC PR活性に機能的に重要なストレス関連シグナル伝達経路を識別するために短鎖干渉RNA(siRNA)処理を使用した。(HSRを担う)HSF1またはIRE1αもしくはATF6もしくはPERK(UPRの3つのアーム)に対するsiRNAを1つずつPRと共に同時投与した。この実験は、L444P GC線維芽細胞をsiRNAで24時間前処理した後に、(DMSOビヒクル対照と共に)DMSOに溶解したPRで24時間処理することを伴う。ウエスタンブロット分析から、非標的siRNAを用いた偽のトランスフェクションまたは負の対照(示さず)と比較して、対応するsiRNAによってトランスフェクションされた後48時間、HSF1、IRE1α、およびATF6の発現が停止したことが明らかになった。トランスフェクション後、少なくとも48時間のHSF1、ATF6、およびPERKの遺伝子ノックダウンは定量RT-PCR分析でも確認された(示さず)。

L444P GC線維芽細胞を、対応するsiRNAで24時間処理し、次いで、MG-132(DMSO中0.25μM)でもう24時間処理した後、インタクト細胞GC活性アッセイまたはウエスタンブロット分析のための溶解を行った。MG-132を非標的対照siRNAと共に同時適用した時は、L444P GC活性が増加した(図5C)。HSF1 siRNAまたはATF6 siRNAのいずれかの同時投与によって、MG-132処理によって得られるGC活性増加はあまり減少しなかった(図27)。このことから、HSF1およびATF6はMG-132 PR機能に必要でないことが分かる。IRE1α siRNAまたはPERK siRNAのいずれかとMG-132との同時適用によって、GC活性増加は有意に減少した(図27)。このことから、IRE1αおよびPERK UPR アームはMG-132 PR機能に重要であることが分かる。

GCウエスタンブロット分析によって、これらの観察を確認した。非標的対照siRNAが同時適用された時に、MG-132はGCバンド強度を有意に増加させた(図28A、レーン1および2と比較のこと)。MG-132およびHSF1 siRNAまたはATF6 siRNAのいずれかとの同時適用によって、GCバンド強度増加はあまり減少しなかった(図28A、レーン3および4ならびにレーン5および6と比較のこと)。対照的に、IRE1α siRNAおよびMG-132またはPERK siRNAおよびMG-132の同時適用によって、L444P GCバンド強度増加は有意に減少した(図28A、レーン7および8ならびにレーン9および10と比較のこと)。このことは、IRE1αおよびPERKがMG-132 L444P GC PR機能に必要であるという前記で導かれた結論と一致している。

L444P GCレベルのウエスタンブロット分析から、セラストロールと、ATF6、IRE1α、およびPERKに対するsiRNAの同時適用によって、セラストロールのL444P GC PR機能は部分的にブロックされたが、HSF1または非標的対照siRNAの同時適用ではブロックされないことが証明された(図28B)。MG-132と同様に、UPRは、セラストロールのPR機能を媒介するのに必須であるように見えるが、セラストロールの場合、UPRの3つ全てのアームが重要であるように見える。

まとめると、セラストロールは、UPRの3つ全てのアームを明らかに活性化するのに対して、MG-132は、ATF6およびPERKアームを用いるように見えるが、IRE1アームを用いるようには見えない。

実施例10
プロテアソームの阻害はGCタンパク質恒常性制御因子の機能には十分であるようには見えない
Angらは、セラストロールがインビトロでおよび細胞培養においてプロテアソーム阻害剤としても作用できるという証拠を公表した。このことは、プロテアソーム阻害によって非常に多くのシャペロンの発現レベルが増強されることが既に確証されているので、タンパク質恒常性制御因子としてのその役割が、この活性の影響も受け得ることを示唆している。Yang et al., Cancer Res 66:4758-4765, 2006; Bush et al., J Biol Chem 272:9086-9092, 1997; Liao et al., J Cell Biochem 99:1085-1095, 2006。L444P細胞を、濃度の関数として、プロテアソーム阻害剤であるセラストロール、MG-132、またはラクタシスチンと2時間インキュベートした後、プロテアソームキモトリプシン様活性を測定した。MG-132、ラクタシスチン、およびセラストロールは、それぞれ、44.1±5.4nM、58.1±6.4nM、および17.2±2.1μMの最大半量阻害濃度(IC₅₀)値を示した(図6E)。セラストロールは、これらの研究に使用した0.8μM濃度ではプロテアソームキモトリプシン様活性をほとんど阻害せず(図6E)、そのタンパク質恒常性制御因子活性が主にプロテアソームによって媒介される可能性は低い。MG-132が、使用した0.8μM濃度でプロテアソームキモトリプシン様活性を阻害することは明らかであるが、GCタンパク質恒常性制御因子ではない選択性のさらに高いプロテアソーム阻害剤であるラクタシスチンのほぼ正確な用量反応曲線は、プロテアソームキモトリプシン様活性の阻害がGCタンパク質恒常性制御因子の機能には十分でないことを示唆している。MG-132はアルデヒド官能基を含有し、これは他のプロテアーゼを阻害することが知られている。従って、未知のプロテアーゼの活性がGCタンパク質恒常性制御因子の機能にも寄与しているという可能性がある。この仮説と一致して、MG-132は、ラクタシスチンとは別個にCFTR成熟にも影響を及ぼす。Jensen et al., Cell 83:129-135, 1995。

図6は、MG-132およびセラストロールによるGCタンパク質恒常性制御が小胞体ストレス応答(unfolded folded protein response)を介して起こり得ることを示す。A)0.8μM MG-132または0.8μMセラストロールで2時間、4時間、6時間、および24時間処理されたL444P GC線維芽細胞における、RT-PCRによる、スプライシングされたXbp-1 mRNAの検出。WT細胞も対照として調べ、GAPDHをハウスキーピング対照として使用した。Xbp1-uは、スプライシングされていないXbp-1、289bpアンプリコンに相当し、Xbp1-sは、スプライシングされたXbp-1、263bpアンプリコンに相当する。B)セラストロールまたはMG-132で処理されたL444P GC細胞におけるATF6の切断。L444P GC細胞を処理しないか、または0.8μMセラストロールもしくは0.8μM MG-132で2時間、6時間、および24時間処理した後、SDS-PAGE分析のために溶解した。WT細胞は対照として役立った。ウエスタンブロット分析を用いてATF6を調べた。β-アクチンはローディング対照として役立った。^*3回の別々の実験において、MG-132で24時間処理した後に、切断されたATF6は検出できなかった。セラストロール(C)またはMG-132(D)で処理されたL444P GC線維芽細胞において、定量RT-PCRによって調べられたBiPおよびCHOPの相対mRNA発現レベル。L444P GC細胞を処理しないか、または0.8μMセラストロール(C)またはMG-132(D)と2時間、4時間、6時間、および24時間インキュベートした。処理L444P GC細胞の相対mRNA発現レベルは、ハウスキーピング対照であるGAPDHの発現レベルに対して補正した後、未処理細胞に対して標準化した。E)L444P GC細胞におけるセラストロール、MG-132、またはラクタシスチンによるプロテアソームキモトリプシン様活性の阻害。L444P細胞を、様々な濃度のセラストロール、MG-132、またはラクタシスチンと2時間インキュベートした後に、プロテアソームキモトリプシン様活性を測定するために、細胞をベースとするアッセイを行った。

実施例11
疾患を治療するためのタンパク質恒常性回復
本結果から、何もしなければ分解されて、機能喪失型疾患を引き起こす変異酵素を折り畳み、輸送し、機能を回復させるように細胞タンパク質恒常性ネットワークを適応させることは実現可能であることが証明された。少なくともHSR遺伝子およびUPR遺伝子サブセットを転写的に活性化する低分子タンパク質恒常性制御因子によって可能になる、タンパク質恒常性の部分的な回復は、機能喪失型疾患を治療するのに魅力的な方針である。なぜなら、タンパク質恒常性ネットワークは何千種類ものタンパク質を同時に取り扱うように進化してきたので、複数の疾患に対して1種類の分子を使用できるからである。分泌経路のフォールディングおよび輸送能力を増強するために、Hsp70を含む細胞質シャペロンがかなり影響を及ぼすことには、重要なかかわり合いがある。このうちの1つは、現在認められているよりも大きな、UPRとHSRとの間の相互依存的調節があり得ることである(図7)。

図7は、GCタンパク質恒常性の回復経路を示す。タンパク質恒常性制御因子であるセラストロールおよびMG-132は熱ショック応答および小胞体ストレス応答を活性化し、熱ショック応答および小胞体ストレス応答は相互依存的に調節されている可能性がある。これらの応答の直接的な結果は、フォールディングおよび輸送を助け、変異体酵素の分解を最小限にする分子シャペロンのアップレギュレーションである。

1種類のタンパク質恒常性制御因子を用いて、異なる化学反応を行う非相同のミスフォールディングしやすい変異酵素を有する2種類のLSD細胞株において部分的な酵素機能を回復できると証明されたことは魅力的である。40種類以上のLSDがあり、PRは、多くのPRが治療効果を発揮する共通のフォールディング経路、輸送経路、および/または他の経路を介して、タンパク質恒常性関連状態に対する広範囲の有効性を有する。Beutler et al., Mol Genet Metab 88:208-215, 2006; Jeyakumar et al., Neuropathol Appl Neurobiol 28:343-357, 2002。MG-132およびセラストロールはそれぞれ、2種類の変異糖脂質分解酵素(患者由来ゴーシェ病細胞株におけるグルコセレブロシダーゼおよびテイ・サックス病細胞株におけるヘキソサミニダーゼA)のフォールディング、輸送、および機能を部分的に回復させ、この結果は、MG-132およびセラストロールが、LSDに関連するミスフォールディングしやすい他の変異酵素に対しても有効であることを示唆している。

薬理学的シャペロンは、ある特定のミスフォールディングしやすいタンパク質の折り畳まれたコンホメーションアンサンブルに結合し、安定化して、輸送機構に関与し得る集団を増やし、従って、目的地の環境におけるその集団を増やす(図3A)。LSDでは、酵素阻害剤を阻害濃度以下の濃度でそのまま使用できることが多いので、ミスフォールディングを受けやすい酵素の薬理学的シャペロンを発見するのは簡単である。現在、ゴーシェ病およびファブリー病を含む特定のLSDを対象にして、いくつかの薬理学的シャペロンの臨床試験が行われている。Fan et al., Nat Med 5:112-115, 1999; Sawkar et al., Cell Mol Life Sci 63:1179-1192, 2006a; Yu et al., FEBS Lett 274:4944-4950, 2007a。タンパク質フォールディングに対するシャペロンの効果がLSDにおける機能喪失を回復させるのに十分であるかどうか試験するために、ER関連シャペロンであるカルネキシンをL444P GC線維芽細胞において過剰発現させ、GC活性(図43B)およびGCグリコシル化パターン(図43A)を測定した。カルネキシンはGC活性を有意に増強し、グリコシル化パターンを生じた。このことから、活性のある、完全に折り畳まれ、グリコシル化されたGCの割合はカルネキシンの存在下で上昇することが分かる。

折り畳まれた状態のある特定のタンパク質を安定化する薬理学的シャペロンとは異なり、HSRおよびUPRまたはその成分を転写的に活性化するタンパク質恒常性制御因子は、競合する凝集を最小限にしながら、タンパク質フォールディング中間体が折り畳まれた状態に進む効率を高めることによって働く(図3A)。従って、薬理学的シャペロンおよびタンパク質恒常性制御因子は、大きく異なる機構を介して働く(図3A)。このことは、本発明者らが、タンパク質恒常性制御因子および酵素特異的薬理学的シャペロンの同時投与によって、難治性L444P GC神経障害性ゴーシェ病細胞株(ならびにN370SおよびG202R GC線維芽細胞株)ならびにG269Sテイ・サックス病細胞株においてリソソーム酵素機能の相乗的増加を観察した理由を説明している。

まとめると、本結果から、2種類のタンパク質恒常性制御因子はそれぞれHSRおよびUPRを転写的に活性化し、ゴーシェ病患者由来細胞株におけるグルコセレブロシダーゼおよびテイ・サックス病患者由来細胞株におけるβ-ヘキソサミニダーゼAのホメオスタシスを部分的に回復させることが分かった。これは、1種類のタンパク質恒常性制御因子を用いて複数のLSDを治療できることを証明している。さらに、本結果は、タンパク質恒常性制御因子および活性部位特異的薬理学的シャペロンが併用されると、ゴーシェ病患者由来線維芽細胞およびテイ・サックス病患者由来線維芽細胞において変異体酵素機能の相乗的回復が得られることを証明している。これらのタンパク質恒常性制御因子の化学的特性および生物学的特性ならびにその投与計画の最適化、さらなるタンパク質恒常性制御因子の発見、ならびに薬理学的シャペロンおよびタンパク質恒常性制御因子または2種類のタンパク質恒常性制御因子を併用するための投与方針の強化によって、LSD、おそらく他の機能喪失型疾患の臨床候補が得られる見込みがある。

実施例12
実験手順
試薬
セラストロール、MG-132、PS I、PS IV、チロペンチンA、およびラクタシスチンは、Calbiochem(San Diego, CA)から入手した。N-(n-ノニル)デオキシノジリマイシン(NN-DNJ)、2-アセトアミド-2-デオキシノジリマイシン(ADNJ)、4-メチルウンベリフェリル6-スルホ-2-アセトアミド-2-デオキシ-β-D-グルコピラノシド(MUGS)、コンズリトールBエポキシド(CBE)は、Toronto Research Chemicals(Downsview, ON, Canada)から入手した。4-メチルウンベリフェリルβ-D-グルコシド(MUG)は、Sigma (St. Louis, MO)から入手した。D-グルコシル-β1-1'-N-ドデカノイル-D-エリスロ-スフィンゴシン(C12β-D-グルコシルセラミド)およびN-ラウロイル-D-エリスロ-スフィンゴシン(C12セラミド)は、Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL)から入手した。Hsp70阻害剤である化合物101は、Jeffrey Brodsky教授(University of Pittsburgh, Pittsburgh, PA)の好意により提供を受けた。細胞培地はGibco(Grand Island, NY)から購入した。

細胞培養
初代皮膚線維芽細胞培養物は、G202R(c.721G>A)およびN370S(c.1226A>G)変異についてホモ接合性の患者から樹立した。野生型初代皮膚線維芽細胞(GM05659、GM00498)、L444P(c.1448T>C)変異についてホモ接合性のGD線維芽細胞株(GM08760)、およびG269S(c.805G>A)変異および4塩基対挿入(c.1278insTATC)についてヘテロ接合性のTSD線維芽細胞株(GM13204)は、Coriell Cell Repositories (Camden, NJ)から入手した。10％熱失活胎仔ウシ血清および1％グルタミンPen-Strepを添加したアール塩を含む最小必須培地において、線維芽細胞を37℃、5％CO₂において増殖させた。細胞培地は3日または4日ごとに交換した。コンフルエンシーに達したら、TrypLE Expressを用いて単層を継代した。

酵素活性アッセイ
インタクト細胞GC活性アッセイは以前に述べられている。Sawkar et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:15428-15433, 2002。簡単に述べると、約10⁴個の細胞を、96ウェルプレートの各ウェルに、細胞接着するように一晩プレートした(100μl/ウェル)。培地を新鮮な低分子含有培地と交換し、プレートを37℃でインキュベートした。薬物処理後に、トリパンブルー染色を用いて細胞生存率を測定した。次いで、培地を除去し、単層をPBSで洗浄した。アッセイ反応は、2.5mM MUG を含む0.2M酢酸緩衝液(pH4.0)50μlを各ウェルに添加することによって開始した。プレートを37℃で7時間インキュベートし、0.2Mグリシン緩衝液(pH10.8)150μlを各ウェルに添加することによって反応を停止した。遊離した4-メチルウンベリフェロン(励起365nm、発光445nm)を、SpectraMax Geminiプレートリーダー(Molecular Device, Sunnyvale, CA)を用いて測定した。非特異的非リソソームGC活性の程度を評価する対照実験は、CBEをアッセイ反応に添加することによって行った。典型的には、一晩インキュベーションした後に(時間0)、培地を低分子含有培地と交換した。または、L444P GC線維芽細胞をセラストロールと、またはNN-DNJおよびセラストロールとインキュベートした場合、時間0で化合物を添加した後に、24時間ごとに(またはそれぞれの特定の実験について結果および図に示したように)、培地を、結果のセクションに記載のように各ウェルに元々存在していた同じ化合物濃度を含有する新鮮な培地と交換した。測定されたGC活性は、各試料の対応するタンパク質濃度に対して標準化した。

Hexα部位細胞アッセイは以前に述べられている。Tropak et al., J Biol Chem 279:13478-13487, 2004。GCアッセイについて述べたように細胞をプレートした。1〜8日間インキュベーションした後、培地を除去し、細胞をPBSで洗浄し、0.5％ヒト血清アルブミンおよび0.5％Triton X-100を含有する10mMクエン酸/リン酸緩衝液pH4.2(CP緩衝液)60μlを用いて溶解した。アリコート30μlを96ウェルプレートに移し、3.2mM MUGS を含有するCP緩衝液30μlを各ウェルに添加し、プレートを37℃で1〜7時間インキュベートすることによって、Hexα部位活性を測定した。200μlの0.1M 2-アミノ-2-メチル-1-プロパノールpH10.5を添加することによって反応を停止し、蛍光を測定した(励起365nm、発光450nm)。

Hexα部位およびGC活性アッセイの両方について、報告された各データ点は、各プレートにおいて少なくとも三通り、および異なる日に3回評価した。報告されたデータは未処理細胞の活性に対して標準化し、それぞれの異なる細胞株のWT酵素活性に対するパーセントとして表した。

天然GC基質の分解
WT GCおよび変種GCを有する様々な細胞株を、コンプリートプロテアーゼインヒビターカクテルを含有するコンプリートライシス-M緩衝液(Roche, Nutley, NJ)を用いて溶解した。総タンパク質30μgを、0.15％ Triton X-100(v/v, Fisher)および0.15％タウロデオキシコール酸(w/v, Calbiochem)の存在下で、天然GC基質である1mg/ml C12β-D-グルコシルセラミドを含有する0.1M酢酸緩衝液(pH5.0)50μlの中で37℃でインキュベートした。C12β-D-グルコシルセラミドからC12セラミドへの分解反応は、メタノール/ジクロロメタン(1:9)の溶媒中で展開した薄層クロマトグラフィー(TLC)によってモニタリングし、ヨウ素染色によって視覚化した。R_f値0.25を有するスポット(C12β-D-グルコシルセラミドに対応する)からR_f値0.52を有するスポット(C12セラミドに対応する)への変換は、天然基質が分解されたことを示す。この実験を3回行い、類似した結果を得た。

ウエスタンブロット分析
細胞を、コンプリートプロテアーゼインヒビターカクテルを含有するコンプリートライシス-M緩衝液(Roche, Nutley, NJ)を用いて溶解した。総細胞タンパク質を、Micro BCAアッセイ試薬(Pierce, Rockford, IL)を用いて測定した。各試料を同じタンパク質濃度まで希釈した。EndoHおよびPNGase F(New England Biolabs, Ipswich, MA)によるタンパク質処理には、会社の仕様書に従った。細胞溶解産物のアリコートを10％SDS-PAGEゲル上で分離し、適切な抗体を用いてウエスタンブロット分析を行った。ウサギ抗Hsp70、抗HSF1、および抗アクチンは、Stressgen(Victoria, BC, Canada)から入手した。マウスモノクローナル抗GC2E2は、Novus Biologicals(Littleton, CO)から入手した。マウスモノクローナル抗ATF6はIMGENEX(San Diego, CA)から入手した。二次ヤギ抗ウサギおよびヤギ抗マウスHRP結合抗体はPierceから入手した。ブロットは、SuperSignal West Femto Maximum SensitivityまたはWest Pico Substrate (Pierce)を用いて視覚化した。endoH処理試料のウエスタンブロットバンドは、NIH(http://rsb.info.nih.gov/ij/)から入手したJava画像処理分析ソフトウェアによって定量した。

細胞をベースとするキモトリプシン様プロテアソーム活性アッセイ
Proteasome-Glo Cell-Based Assayキット(Promega, Madison, WI)を用いて、キモトリプシン様プロテアソーム活性を測定した。簡単に述べると、約5x10³個のL444P GC細胞を96ウェルプレートの各ウェルに、細胞接着するように一晩プレートした(100μl/ウェル)。培地を、様々な濃度のプロテアソーム阻害剤を含有する新鮮な培地と交換した。37℃で2時間のインキュベーション後に、会社の説明書に従って、100μl/ウェルのProteasome-Glo Cell-Based試薬を添加した。発光は、SpectraMax Geminiプレートリーダーを用いて測定した。処理細胞の発光は、バックグラウンドを差し引いた後の未処理細胞の発光に対して標準化した。IC₅₀値は、データを式:y=IC₅₀/(IC₅₀+x)にあてはめることによって計算した。式中、yは、標準化された発光シグナルであり、xは、阻害剤濃度である。各データ点は少なくとも三通り、および異なる日に3回評価した。報告されたデータは、本文中ではIC₅₀±SDと表した。

免疫蛍光法
免疫蛍光法は以前に述べられている。Sawkar et al., ACS Chem Biol 1:235-251, 2006。簡単に述べると、カバーガラス上で増殖させた細胞を、PBSに溶解した3.7％パラホルムアルデヒドで15分間固定した。カバーガラスをPBSで洗浄し、PBSに溶解した15mMグリシンで10分間クエンチし、PBSに溶解した0.2％サポニンで15分間、透過処理した。0.2％サポニンおよび5％ヤギ血清の存在下で、PBSに溶解して抗体を調製した。細胞を、一次抗体(マウスモノクローナル抗GC 8E4の場合、1:100、およびウサギ抗LAMP2の場合、1:10,000)と1時間インキュベートし、PBSに溶解した5％ヤギ血清で洗浄し、次いで、Molecular Probes(Eugene, OR)から入手した二次抗体(Alexa Fluor 488ヤギ抗マウスIgGおよびAlexa Fluor 546ヤギ抗ウサギIgGと1時間インキュベートした。カバーガラスをマウントし、密封した。Nikon TE2000-U顕微鏡に取り付けたBio-Rad(Zeiss) Radiance 2100 Rainbowレーザー走査型共焦点顕微鏡を用いて、画像を収集し、NIH Image Jソフトウェアを用いて解析した。実験を3回行い、類似した結果を得た。

Multidimensional Protein Identification Technology(MudPIT)によるタンパク質発現レベル変化の相対的定量
各試料からのタンパク質を、25％トリクロロ酢酸(v/v)および氷冷アセトンを用いて沈殿させた。ペレットを風乾し、100mM Tris-HCl pH8.5に溶解した、1xInvitrosol(Invitrogen, Carlsbad, CA)を含有する8M尿素を用いて懸濁した。タンパク質濃度はBCA Protein Assay Kit(Pierce)を用いて測定した。最初に、200μgの量の総タンパク質を、5mMのTris(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)と30分間インキュベートすることによって還元し、次いで、10mMのヨードアセトアミド(IAA)と20分間、暗所でインキュベートすることによってアルキル化した。その後に、試料を、100mM Tris-HCl,pH8.5を用いて2M尿素まで希釈し、1mM CaCl₂にし、酵素/基質比1:30のsequence grade modified trypsin(Promega, Madison, WI)を添加し、37℃で一晩インキュベートすることによって消化した。消化反応は、蟻酸を5％(v/v)まで添加してpHを2〜3まで下げることによって停止した。すぐに分析しない試料は-80℃で保管した。各試料について、毎回、60μgのタンパク質消化物を3つ複製したものを、MudPIT(Link et al., 1999; Washburn et al., 2001)によって分析した。ペプチド混合物を、2.5cm Partisphere強陽イオン交換体(Whatman, Clifton, NJ)および2.5cm 5μm Aqua C18材料(Phenomenex, Ventura, CA)が充填された250μm i.d.溶融シリカキャピラリーカラムに圧力によりローディングした。95％水、5％アセトニトリル(ACN)、および0.1％蟻酸を含有する緩衝液でカラムを30分間洗浄した。脱塩後、これを、12cm 5μm Aqua C18材料が充填された5μmプルドチップ(pulled tip)を備える100μm i.d.キャピラリーに取り付けた。カラム全体を、Agilent 1100クオータナリーHPLC(Agilent, Palo Alto, CA)とインラインに置いた。完全自動化された12工程の分離手順を用いて試料を分析した。クロマトグラフィーに使用した緩衝溶液は、5％ACN/0.1％FA(緩衝液A)、80％ACN/0.1％FA(緩衝液B)、および500mM酢酸アンモニウム/0.1％FA(緩衝液C)であった。最初の工程は、0〜100％緩衝液Bの100分間の勾配からなった。工程2〜11のプロファイルは以下の通りであった。100％緩衝液Aを3分間、X％緩衝液Cを3分間、0〜15％緩衝液Bの勾配を10分間、および15〜55％緩衝液Bの勾配を97分間。3分間の緩衝液Cのパーセント(X)は、それぞれ、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、および90％であった。最後の工程において、勾配は、100％緩衝液Aを3分間、100％緩衝液Cを10分間、0〜15％緩衝液Bの勾配を10分間、15〜100％緩衝液Bの勾配を107分間からなった。ペプチドがマイクロキャピラリーカラムから溶出されると同時に、2.4kVスプレー電圧を印加して、リニアLTQイオントラップ質量分析計(ThermoFinnigan, San Jose, CA)に直接エレクトロスプレーした。1サイクルのフルスキャン質量スペクトル(400〜1400m/z)の後に、5つのデータ依存性MS/MSスペクトルを、35％標準化衝突エネルギー(normalized collision energy)で、ダイナミックエクスクルージョン(dynamic exclusion)を可能にして、多次元分離の各工程の全体を通して連続して繰り返した。

取得したタンデム質量スペクトルを、European Bioinformatics Institute International Protein Indexヒトタンパク質データベース(バージョン3.30、2007年6月28日にリリース)に対して検索した。信頼水準および偽陽性率を計算するために、逆の配列を含むデコイ(decoy)データベースをターゲットデータベースに付け加え、SEQUEST(Eng et al., 1994)アルゴリズムを用いて、この組み合わされたデータベースから最もマッチする配列を見つけ出した。SEQUEST結果を集め、DTASelect (Tabb et al., 2002)によってフィルタリングした。1つのタンパク質につき少なくとも2つのペプチド、およびタンパク質レベルで1％未満の偽陽性率が必要であった。

広範に適用されてきた相対定量法(Liu et al., 2004)として、スペクトルカウントに基づくタンパク質量の評価を用いた(Cao et al., 2008; Liao et al., 2007; Rikova et al., 2007)。測定ごとのばらつきを平均するために、各試料の3つの複製からのスペクトルカウントを合わせて一緒にした。スペクトルの総数はいずれの2つの試料間でも似ていたが、正規化係数(normalization factor)(F=対照試料におけるスペクトルの総数/処理試料におけるスペクトルの総数)を適用した。すなわち、処理試料対対照試料のスペクトルカウント比を正規化係数で掛けると、標準比が得られる。タンパク質が未処理試料および処理試料において検出されれば、以下の規準:(1)同じタンパク質が両試料において同定され、スペクトルカウントが10超の場合、2またはそれ以上の標準化スペクトルカウント比を増加とみなし、同様に、0.5またはそれ以下の標準化スペクトルカウント比を減少とみなす;(2)同じタンパク質が両試料において同定され、いずれかのスペクトルカウントが10未満であるが、2つの差が10超であれば、2.5またはそれ以上の標準化スペクトルカウント比を増加とみなし、同様に、0.4またはそれ以下を減少とみなす、に従って、発現レベルが変化したタンパク質をフィルタリングする。タンパク質が1つの試料しか同定されなければ、20超のスペクトルカウントを用いて、有意な変化とみなす。このカテゴリーの予備分析から、このカテゴリーにおいて検出された1000のタンパク質のうち、L444P GC線維芽細胞をMG-132(0.8μM)で3日間処理すると、83のタンパク質がアップレギュレートされ、85のタンパク質がダウンレギュレートされたのに対して、L444P GC線維芽細胞をセラストロール(0.8μM)で3日間処理すると、106のタンパク質がアップレギュレートされ、87のタンパク質がダウンレギュレートされた。このことと、タンパク質が未処理試料および処理試料の両方で検出された図2Aに示したデータから、PR処理はプロテオームに包括的な中程度の影響を及ぼすことが分かる。

定量RT-PCR
細胞を、薬物と37℃で、指示された時間インキュベートした。RNeasy Mini Kit(Qiagen＃74104)を用いて、細胞から総RNAを抽出した。QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen＃205311)を用いて、総RNA 500ngからcDNAを合成した。定量PCR反応は、ABI PRISM 7900システム(Applied Biosystems)において、cDNA、QuantiTect SYBR Green PCR Kit(Qiagen＃204143)および対応するプライマーを用いて行った。Hsp40、Hsp70、Hsp90、Hsp27、αB-クリスタリン(CRYAB)、BiP、GRP94、カルネキシン(CNX)、カルレチキュリン(CRT)、Xbp-1、およびCHOP、ならびに内因性ハウスキーピング遺伝子GAPDHのフォワードプライマーおよびリバースプライマーを表2に列挙した。試料を95℃で15分間加熱し、94℃で15秒、57℃で30秒、72℃で30秒の45サイクルで増幅した。分析はSDS2.1ソフトウェア(Applied Biosystems)を用いて行った。PCR増幅プロットから閾値サイクル(threshold cycle)(C_T)を抽出した。標的遺伝子のC_Tとハウスキーピング遺伝子のC_Tの差を表わすために、ΔC_T値を使用した:ΔC_T=C_T (標的遺伝子)-C_T (ハウスキーピング遺伝子)。薬物処理細胞の標的遺伝子の相対mRNA発現レベルは、未処理細胞に対して標準化した:相対mRNA発現レベル=2exp[-(ΔC_T (処理細胞)-ΔC_T (未処理細胞))]。各データ点は三通り評価し、3回測定した。

Xbp-1スプライシングのRT-PCR分析
定量RT-PCRにおいてcDNAを合成した。PCR反応は、cDNA、Taq DNAポリメラーゼ(Roche)、および表2に列挙した対応するプライマーを用いて行った。試料を95℃で5分間加熱し、95℃で60秒、58℃で30秒、および72℃で30秒、ならびに72℃で5分の30サイクルで増幅した。PCR産物を2.5％アガロースゲルに供した。スプライシングされていないXbp-1は289bpアンプリコンを生じ、スプライシングされたXbp-1は263bpアンプリコンを生じた。実験を3回行い、類似した結果を得た。

実施例13
L型Ca²⁺チャンネル遮断薬であるジルチアゼムおよびベラパミルは、ゴーシェ病患者由来線維芽細胞株においてリソソームGC活性を増強する
細胞溶解産物中の等量の総タンパク質によって反映される同数の細胞が有する変異体GCの相対活性を識別するために、いくつかのI型、II型、およびIII型ゴーシェ病線維芽細胞株を評価した。溶解細胞活性アッセイを用いて、GC変異体の残存酵素活性を測定した。図17A。使用したアッセイ条件下では、L444P GCは野生型(WT)GCの活性の12％、N370S GCはWT GCの活性の32％、N370S/V394L GCはWT GCの活性の28％、N370S/84GG GCはWT GCの活性の19％、G202R GCはWT GCの活性の10％を示す。測定された正確な酵素活性はアッセイ条件に強く依存する。Sawkar et al. Chem Biol 12:1235-1244, 2005。示された酵素活性は同じタイプの未処理細胞の活性に対して標準化し、倍率変化として表した。さらに、リーダーを較正するために、処理前および処理後の変異体GC活性もWT GC活性に対するパーセントとして表した。

37℃の代わりに30℃で増殖させた、L444P GC変異を有するゴーシェ病患者由来線維芽細胞は、高いフォールディング、輸送、リソソーム局在化、およびL444P GC活性を示す。 Sawkar et al., ACS Chem Biol 1:235-251, 2006。温度変化によって、L444Pタンパク質の物理化学的特性および細胞タンパク質ホメオスタシス機構の両方が変化するので、温度感受性TRPチャンネルを介して細胞がタンパク質ホメオスタシス能力を再調節するという仮説を試験した。15種類の温度感受性TRPチャンネルモジュレーター(カプサイシン、レシニフェラトキシン、ピペリン、オルバニル、アナンダミド、2-APB、ショウノウ、4α-PDD、メントール、ユーカリプトール、イシリン(icilin)、シンナムアルデヒド、イソチオシアン酸アリル、カプサゼピン、およびルテニウムレッド)をホモ接合性L444P GC患者由来線維芽細胞に投与した。Voets et al., Nat Chem Biol 1:85-92, 2005; Dhaka et al., Annu Rev Neurosci 29:135-161, 2006。インタクト細胞GC酵素アッセイを用いて測定されたリソソームL444P GC活性の増加から、高いL444P GCフォールディングおよび輸送を推論することができた。5日のインキュベーション期間後に、ルテニウムレッドしかL444P GC活性を著しく増加しなかった(図22)。リソソームL444P GC活性を増強した唯一のTRPチャンネルモジュレーターは非特異的Ca²⁺チャンネル遮断薬でもあったので、観察された増加は、低い細胞内Ca²⁺イオン濃度の結果である可能性があり、従って、温度によって細胞内タンパク質ホメオスタシス能力が調節される手段がTRPチャンネル調節である可能性は低いように見えた。

図22は、1日(黒色のライン)、3日間(ピンク色のライン)、および5日間(緑色のライン)培養した後のゴーシェ病患者由来線維芽細胞における、L444Pグルコセレブロシダーゼ(GC)活性に及ぼすルテニウムレッドの影響を示す。処理細胞のGC活性は未処理L444P GC細胞に対して標準化し(左y軸)、WT GC活性に対するパーセントとして表した(右y軸)。

この手段によってルテニウムレッドが細胞内Ca²⁺イオン濃度を下げ、GCフォールディング忠実度を増強したという仮説を、電位依存性カルシウムチャンネル(VGCCs)およびイオンチャネル型グルタミン酸受容体を含むカルシウムチャンネルを介した細胞へのカルシウム流入を遮断することによって実験により精査した。Berridge et al., Nat Rev Mol Cell Biol 4:517-529, 2003; Elmslie, J Neurosci Res 75:733-741, 2004; Mayer et al., Annu Rev Physiol 66:161-181, 2004。9種類の代表的なVGCC遮断薬、すなわち、ジルチアゼム、ベラパミル、ニフェジピン、ニモジピン、ロペラミド、ミベフラジル、エトサクシミド、フルナリジン、およびベプリジル、5種類の代表的なイオンチャネル型グルタミン酸受容体阻害剤、すなわち、CGP39551、5,7-ジクロロキヌレン酸、DNQX、エバンスブルー、およびフェルバメート、ならびに他のカルシウムチャンネル遮断薬、例えば、アミオダロン、シンナリジン、およびSKF96365をL444P GC患者由来線維芽細胞に適用した後に、リソソームL444P GC活性を評価した。インタクト細胞GC活性アッセイから、ジルチアゼムおよびベラパミル(化学構造を図17Bに示した)のみがL444P GC活性を有意に増加したことが明らかになった。ジルチアゼムは、10μM濃度で、5日のインキュベーション期間の後に、L444P GC活性を最大2.0倍に(正常細胞WT GC活性の約24％まで)、および7日のインキュベーション期間後に2.3倍に増加させた(図17C、左パネル)(言及した全ての濃度は、特に定めのない限り細胞培養濃度である)。このことは、リソソームL444P GC濃度が増加したことを意味している。ジルチアゼムを介した細胞L444P GC活性増加の時間依存性は、薬理学的シャペロン処理の際に観察される細胞N370S GC活性増加の時間依存性とよく似ている[Sawkar et al. Chem Biol 12:1235-1244, 2005]。GC変種の活性のゆっくりとした増加は、部分的には、以前のパルスチェイス実験によって明らかにされたように、この変種のフォールディングおよび輸送が遅い結果であり、他の理由、例えば、選択されたシャペロンの転写および翻訳が明らかに必要なためである可能性が高い(下記参照)。Steet et al., Proc Natl Acad Sci USA 103:13813-13818, 2006; Schmitz et al., Int J Biochem Cell Biol 37:2310-2320, 2005。薬理学的シャペロンまたはジルチアゼムが投与された際の、このゆっくりとした変異体GC活性の増加は、異なるリソソーム性蓄積症、例えば、ファブリー病、テイ・サックス病、およびポンペ病において薬理学的シャペロンが投与された際にも観察される。Fan et al., Nat Med 5:112-115, 1999; Parenti et al., Mol Ther 15:508-514, 2007; Tropak et al., J Biol Chem 279:13478-13487, 2004。

ジルチアゼムの影響が1種類のL444P GC患者由来細胞株に制限されないことを確認するために、さらに2種類の患者由来ホモ接合性L444P GC線維芽細胞株をジルチアゼム(15μM)で処理した。II型細胞株において、ジルチアゼムは、5日のインキュベーション期間後に、GC活性を2.0倍まで増加させ、7日間の処理後に2.5倍まで増加させた(図17C、中央のパネル)。III型ゴーシェ病患者由来細胞株をジルチアゼム(10μM)で処理すると、5日のインキュベーション期間後に、L444P GC活性を最大2.1倍に増加させ、7日のインキュベーション期間後に2.3倍まで増加させた(図17C、右パネル)。リソソームL444P GC活性は、評価された全ての神経障害性線維芽細胞株において改善した。

ジルチアゼムは、一般的な機構、例えば、細胞シャペロンを介した機構によって変異体 GCホメオスタシスを調節し、誘導された薬理学的シャペロニングに結合することよって調節しないのであれば、ホモ接合性および複合ヘテロ接合性ゴーシェ病患者由来細胞株におけるミスフォールディングを受けやすい他のGC変種のフォールディング、輸送、および活性も増強できるはずである。ジルチアゼム(10μM)は、ホモ接合体からのN370S GC線維芽細胞において、N370S GC活性を5日インキュベーション期間後に2.0倍まで(未処理WT GC活性の約64％まで)増加させ、7日インキュベーション期間後に2.5倍まで増加させた(図17D、左パネル)。これは、最適化された薬理学的シャペロンを用いて得られた最良の結果と類似している。Yu et al., I J Med Chem 50:94-100, 2007。複合ヘテロ接合性N370S/V394L GC細胞株の場合、ジルチアゼム(10μM)は、GC活性を5日のインキュベーション期間後に3.2倍まで(細胞WT GC活性の約89％まで)増加させ、7日間の処理後に3.7倍まで増加させた(図17D、中央のパネル)。類似するN370S/84GG GC細胞株において、ジルチアゼム(10μM)は、5日間の処理後に、GC活性を1.9倍まで(細胞WT GC活性の約36％まで)増加させた(図17D、右パネル)。ジルチアゼム(20μM)は、5日のインキュベーション期間後に、G202R GC活性を4.6倍まで(細胞WT GC活性の約46％まで)増加させた(図17E、緑色のライン)。このことは、GCタンパク質ホメオスタシスを調節するジルチアゼムの普遍性を証明している。特に、ジルチアゼム(20μM)は、5日間の処理後に、WT GC活性を2.6倍まで増加させ(図17E、ピンク色のライン)、他のタンパク質、例えば、Gタンパク質共役受容体[Ulloa-Aguirre et al., ACS Chem Biol 1:631-638, 2006]およびイオンチャンネル[Green et al., Trends Neurosci 18:280-287, 1995]の場合のように、WT GCのフォールディングおよび輸送が不十分であることを示唆している。

他の細胞WTリソソーム加水分解酵素、すなわちα-マンノシダーゼ、α-グルコシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、α-ガラクトシダーゼ、およびβ-グルクロニダーゼの細胞活性に及ぼすジルチアゼムの影響を評価した。WT線維芽細胞およびL444P GC線維芽細胞を、ジルチアゼム(10μM)と5日間インキュベートした後に、分析を行った(図23)。ジルチアゼム処理はGC活性を増加させたが、他のWTリソソーム酵素の活性をあまり増加させなかった。このことは、これらの酵素のフォールディングおよび輸送がほぼ最適であることを意味している。

図23は、リソソーム酵素の活性に及ぼすジルチアゼムの影響を示す。10μMジルチアゼムと5日間インキュベーションした後、WT線維芽細胞のGC、α-マンノシダーゼ、α-グルコシダーゼ、およびβ-ガラクトシダーゼの活性を、インタクト細胞酵素活性アッセイを用いてアッセイし、L444P GC細胞のGC、α-マンノシダーゼ、α-グルコシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、α-ガラクトシダーゼ、およびβ-グルクロニダーゼの活性を、溶解細胞酵素活性アッセイを用いてアッセイした。処理細胞の酵素活性は、同じタイプの未処理細胞に対して標準化した。

第2のL型Ca²⁺チャンネル遮断薬であるベラパミル(3μM)は、7日のインキュベーション期間後に、L444P GC活性を1.5倍まで(細胞WT GC活性の約18％まで)およびN370S/V394L GC活性を1.9倍まで(細胞WT GC活性の約53％まで)増加させた(図17F;溶解細胞活性アッセイ)。別個の化学構造(図17B)を有するCa²⁺チャンネル遮断薬であるジルチアゼムおよびベラパミルが両方とも細胞変異体GCのフォールディング、輸送、および活性を増強することは、細胞内Ca²⁺ホメオスタシスの変化がリソソーム酵素ホメオスタシスに影響を及ぼすという仮説を裏付けている。

図17は、ゴーシェ病患者由来線維芽細胞におけるグルコセレブロシダーゼ(GC)変種活性に及ぼす低分子の影響を示す。(A)溶解産物の同じ総タンパク質含有量から確かめられた同数の細胞を使用する溶解細胞GC活性アッセイを用いた、GC変異体の残存活性。N370S、N370S/V394L、N370S/84GG、L444P、およびG202R GCの残存活性は、それぞれ、WT GC活性に対するパーセントとして示した(前記の各列の数)。(B)ジルチアゼム(化合物1)およびベラパミルの化学構造。(C)(1)3種類の別個のホモ接合性L444P GC患者由来細胞株:II型患者からのL444P GC線維芽細胞(左パネル)、別のII型患者からのL444P GC線維芽細胞(中央のパネル)、およびIII型患者からのL444P GC線維芽細胞(右パネル)におけるL444P GC活性に及ぼすジルチアゼムの影響。これらの細胞株を、それぞれ、5日間(緑色のライン)および7日間(オレンジ色のライン)、ジルチアゼムと共に培養した。処理細胞のGC活性は、同じタイプの未処理細胞に対して標準化し(左y軸)、WT GC活性に対するパーセントとして表した(右y軸)。(D)ホモ接合性N370S/N370S GC線維芽細胞(左パネル)、ヘテロ接合性N370S/V394L線維芽細胞(中央のパネル)、およびヘテロ接合性N370S/84GG線維芽細胞(右パネル)におけるN370S GC活性に及ぼすジルチアゼムの影響。これらの細胞株を、それぞれ、3日間(ピンク色のライン)、5日(緑色のライン)、および7日(オレンジ色のライン)、ジルチアゼムと共に培養した。処理細胞のGC活性は、同じタイプの未処理細胞に対して標準化し(左y軸)、WT GC活性に対するパーセントとして表した(右y軸)。(E)WTおよびG202R GC活性に及ぼすジルチアゼムの影響。WTおよびG202R GC細胞株を、それぞれ、5日間、ジルチアゼムと共に培養した。GC活性は、WT GC活性に対するパーセントとして表した。(F)L444PおよびN370S/V394L GC活性に及ぼすベラパミルの影響。これらの細胞株を、それぞれ、7日間、ベラパミルで処理した。GC活性は、WT GC活性に対するパーセントとして表した。

実施例14
GCは、ジルチアゼム処理によって用量依存的な濃度増加を示す
ウエスタンブロット分析から、II型ゴーシェ病線維芽細胞をジルチアゼムで7日間処理した後に、L444P GC濃度が用量依存的に上昇したことは明らかである(図18A)。同量の総タンパク質が各レーンにロードされたことを保証するためにβ-アクチンが役立った。GCバンド強度は、添加されたジルチアゼムの濃度(0μM、0.1μM、1μM、および10μM)と共に増加し、このことは、観察された用量依存的なGC酵素活性増加と一致する(図17C、左パネル)。

患者由来N370S/V394L GC細胞株もジルチアゼム(0.1〜10μM)と7日間培養した。このことから、類似する用量依存的なGCバンド強度増加が明らかであり(図18B)、濃度依存的なGC活性増加と一致している(図17D、真ん中のパネル)。適切なリソソーム輸送に関連する、GCの成熟リソソームグリコフォームが生成されたことを証明するために、処理および未処理N370S/V394L GC細胞に対してendo-H消化を行った。7日間の細胞培養後に、同数のジルチアゼム処理細胞(10μM)および未処理細胞(同量の総タンパク質によって反映される)をendo-H処理または緩衝液のみの処理に供した後に、10％SDS-PAGEゲル上で分離し、ウエスタンブロット分析によってGCを検出した(図18C)。endo-H耐性の成熟リソソームGCグリコフォームに対応するレーン2および4の上部バンドは、ジルチアゼム処理によって増加する[10]。このことは、ジルチアゼム処理後に、実質的により適切に折り畳まれたGCタンパク質がERから出てリソソームに輸送されたことを証明している。レーン2および4の下部バンドはendo-H感受性のER GCグリコフォームに対応する。

実施例15
薬理学的シャペロニング機構および直接的なリソソームGC活性化機構を除外する
現在まで発見されたGC薬理学的シャペロンは全て活性部位特異的安定剤であり、従って、酵素阻害剤である。従って、本発明者らは、ジルチアゼムが活性部位に結合し、GCを阻害するかどうか評価した。溶解L444P線維芽細胞および溶解N370S/V394L細胞をジルチアゼム(0.01〜1000μM)とインキュベートし、アッセイした。どちらの場合でも、有意なGC阻害は観察されなかった(図18D、ピンク色および緑色のライン)。WT GCの組換え型であるCerezymeもまたジルチアゼム(0.01〜1000μM)とインキュベートした。このことから、阻害されなかったことは明らかである(図18D、黒色のライン)。正の対照として、確立したGC薬理学的シャペロンであるN-(n-ノニル)デオキシノジリマイシン(NN-DNJ)は、Cerezymeに対して1.08μMの最大半量阻害濃度(IC₅₀)値を示し(図18D、青色のライン)、阻害を示した。Sawkar et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:15428-15433, 2002。ひとまとめにすると、これらの結果は、ジルチアゼムがエクスビボでGC活性部位に結合せず、薬理学的シャペロンとして機能する可能性は低いことを証明している。

ジルチアゼムが既存のリソソームGCプールを直接活性化できたかどうか評価するために、L444PおよびN370S/V394L GC線維芽細胞を、ジルチアゼム(1μM〜100μM)と1時間インキュベートし、インタクト細胞アッセイを用いてGC活性を測定した。活性増加は観察されなかった(図24)。このことは、このような短時間では、GC活性増加が達成できなかったことを証明している。この結果は、直接的なジルチアゼム誘導性サポシンを介したGC活性化と相反する。ジルチアゼムがリソソーム内L444P GC活性を最大で2.0倍に増加させるのに(図17C、左パネル)、およびN370S/V394L GC活性を最大で3.2倍に増加させるのに(図17D、中央のパネル)、比較的長いインキュベーション期間(5日)が必要であり、これは、ジルチアゼム処理および薬理学的シャペロン処理によって媒介された、ほぼ同一のGC活性増加速度を示した以前の知見と一致している。Sawkar et al. Chem Biol 12:1235-1244, 2005。

図24は、L444PおよびN370S/V394L GC細胞をジルチアゼムと1時間インキュベートし、インタクト細胞GC活性アッセイを用いて、これらのGC活性を評価したことを示す。処理細胞のGC活性は同じタイプの未処理細胞に対して標準化した。

実施例16
ジルチアゼムはGC転写に影響を及ぼさない
10μMジルチアゼム無しで、または10μMジルチアゼムと6時間、12時間、1日間、3日間、および5日間インキュベートしたL444P GC線維芽細胞に対して、定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)分析を行った。L444P GCを有する細胞から抽出した総RNA試料から逆転写した総DNAに対して、リアルタイムPCR反応を行った。PCR増幅プロットを図18E、左パネルに示した。ΔC_Tは、GC遺伝子の閾値サイクル(C_T)値とハウスキーピング遺伝子のC_T値の差と定義した。相対GC mRNA発現レベルは、対応するΔC_T値から計算された未処理GC細胞に対して標準化した(材料および方法を参照されたい)。未処理L444P GC細胞およびジルチアゼム処理L444P GC細胞を比較した時に、GC mRNA発現レベルに有意差は観察されなかった(図18E、右パネル、左エントリー)。このことは、ジルチアゼムがL444P GC細胞においてGC転写に影響を及ぼさないことを証明している。ジルチアゼム処理N370S/V394L GC細胞について、厳密に類似する結果が得られた(図18E、右パネル、右エントリー)。

実施例17
ジルチアゼムは適切なGCフォールディングおよび輸送を増強する
L444PおよびN370S/V394L GCの細胞輸送は、ERADがフォールディングおよび輸送を上回るので低いように見える。Ron et al., Hum Mol Genet 14:2387-2398, 2005。以前に、蛍光顕微鏡を用いて、活性部位特異的薬理学的シャペロンが、G202R GCのフォールディングおよびリソソームへの輸送を増強することが証明された[10]。厳密に類似する免疫蛍光顕微鏡観察法を用いて、Ca²⁺チャンネル遮断薬は、リソソームへのL444PおよびN370S/V394L GC輸送を増加させることが証明された。L444P GCを有する線維芽細胞を10μMジルチアゼム無しで、または10μMジルチアゼムと共に14日間培養した後に、顕微鏡観察のためにプレートした。WT GC線維芽細胞も正の対照として同様に研究した。適切に折り畳まれ、輸送されたGCタンパク質はリソソームマーカーLAMP2と共局在する[10]。WT GCは点状に分散し、LAMP2と共局在した(図18F、縦列3、横列3、GC緑色、LAMP2赤色、重複部分は人為的に白色にした)。このカラースキームは、共局在の横列にのみ使用した。単回染色実験(最初の2つの横列)について、コントラストを改善するために、蛍光画像を人為的に白色にした。ジルチアゼム処理しなければ、L444P GC変種は広範囲のERADのために目に見えなかったが、ジルチアゼム処理後には容易に検出され、点状に分布していた(図18G、縦列1)。ジルチアゼム処理後に、L444P GCはLAMP2と共局在した(図18G、縦列3、GC緑色、LAMP2赤色、重複部分は人為的に白色にした)。このことから、細胞GC濃度の増加(図18A)および酵素活性の増加(図17C)と一致して、リソソーム輸送が増加したことが分かる。

以前の実験から、N370S GC分布は部分的にリソソームにあることが証明されている[10]。ジルチアゼム処理に反応して観察された、適切にグリコシル化されたN370S/V394L GCタンパク質の増加(図18C)が、リソソームへの適切な輸送の増加をもたらすかどうか確かめるために、定量免疫蛍光顕微鏡観察を行った。N370S/V394L GC線維芽細胞を、5μMジルチアゼム無しで、または5μMジルチアゼムと7日間インキュベートした後に、顕微鏡観察のためにプレートした。WT GC線維芽細胞は対照として役立った。測定可能なN370S/V394L GCはリソソームと共局在するが、リソソームの中のN370S/V394L GCはWT GCと比較してかなり少ない(図18F、縦列2と縦列3を比較のこと)。このことは、有意なERADがあったことと一致している。ジルチアゼム処理によって、リソソームへのN370S/V394L GC輸送は著しく増強された(図18F、縦列1と縦列2を比較のこと)。このことは、成熟GCグリコフォームの濃度を上げるジルチアゼムの能力と一致している。図18B/C。各試料について、20個のランダムな顕微鏡視野を用いて、GCタンパク質とリソソームマーカーとの共局在を、ピアソン相関係数(PCC)を用いて定量した。WT GC、未処理N370S/V394L GC、およびジルチアゼム処理N370S/V394L GC線維芽細胞のPCC値は、それぞれ、0.70±0.06、0.60±0.05、および0.68±0.05である(図18H)。未処理N370S/V394L GC細胞のPCC値とジルチアゼム処理N370S/V394L GC細胞のPCC値との差は有意である(p<0.001,n=20)。このことは、ジルチアゼムが、リソソームへのN370S/V394L GCの輸送をほぼWTレベルまで増加させたことを証明している。

図18は、L444PおよびN370S/V394L GCのフォールディングおよび輸送に及ぼすジルチアゼムの影響を示す。(A)未処理L444P GC細胞およびジルチアゼム処理L444P GC細胞のウエスタンブロット分析。L444P GC細胞を、ジルチアゼム無しで、または様々な濃度のジルチアゼムと共に7日間培養した後、SDS-PAGEおよびウエスタンブロット分析のために細胞を溶解した。マウス抗GC抗体2E2を用いてGCを検出した。β-アクチンはローディング対照として役立った。(B)未処理N370S/V394L GC細胞およびジルチアゼム処理N370S/V394L GC細胞のウエスタンブロット。N370S/V394L GC細胞を、様々な濃度のジルチアゼムと7日間インキュベートした後に、SDS-PAGEおよびマウス抗GC抗体8E4を用いたウエスタンブロット分析のために、細胞を溶解した。(C)未処理N370S/V394L GC細胞およびジルチアゼム処理N370S/V394L GC細胞のendo-H感受性。N370S/V394L GC細胞を10μMジルチアゼム無しで、または10μMジルチアゼムと7日間インキュベートした後、endo-H消化、SDS-PAGE、およびマウス抗GC抗体8E4を用いたウエスタンブロット分析のために、細胞を溶解した。(D)L444P GC細胞およびN370S/V394L GC細胞を溶解し、等量の総細胞タンパク質をジルチアゼムとインキュベートし、溶解細胞GC活性アッセイを用いて、これらのGC活性を評価した。組換えWT GCタンパク質であるCerezymeのGC活性もまた、ジルチアゼム(黒色のライン)または公知の阻害剤である薬理学的シャペロンNN-DNJ(青色のライン)で処理した後に試験した。(E)未処理およびジルチアゼム処理L444P GC細胞およびN370S/V394L GC細胞における定量RT-PCR。L444P GC細胞およびN370S/V394L GC細胞を、それぞれ、10μMジルチアゼムと6時間、12時間、1日間、3日間、および5日間インキュベートした。左にある図は、L444P GC細胞を用いた定量PCRサイクルのための代表的な増幅プロットである。右にある図は、未処理細胞に対して標準化した、ジルチアゼム処理L444P GC細胞(左エントリー)およびN370S/V394L GC細胞(右エントリー)それぞれの相対GC mRNA発現レベルを示す。(F)N370S/V394L GCおよびWT線維芽細胞におけるGCの免疫蛍光法による共局在分析。N370S/V394L GC細胞を5μMジルチアゼムと7日間インキュベートしたか(縦列1)、または薬物無しで培養した(縦列2)。未処理WT細胞は正の対照として観察した(縦列3)。GCは、マウス抗GC抗体16B3(横列2)を用いて視覚化され、ウサギ抗LAMP2抗体はリソソームマーカー(横列1)として適用した。横列3では、GC(緑色)およびLAMP2(赤色)の共局在を白色で示した。バー=10μm。(G)L444P GC細胞におけるGCの免疫蛍光法による共局在分析。L444P GC細胞を10μMジルチアゼムと14日間インキュベートしたか(下の横列)、または処理しなかった(上の横列)。GCは、マウス抗GC抗体8E4(縦列1)を用いて視覚化した。ウサギ抗LAMP2抗体はリソソームマーカー(縦列2)として使用した。縦列3では、GC(緑色)およびLAMP2(赤色)の共局在は人為的に白色にした。バー=20μm。(H)ピアソン相関係数を用いたGCタンパク質とリソソームマーカーとの共局在の定量。実験条件は図18Fに述べた。

実施例18
細胞外Ca²⁺濃度は細胞内フォールディング能力に影響を及ぼす
ジルチアゼムおよびベラパミルは両方とも、細胞外培地から細胞へのCa²⁺流入を阻害する強力なL型電位依存性カルシウムチャンネル遮断薬であり、従って、細胞内のカルシウムホメオスタシスを変える。Triggle, Curr Pharm Design 12:443-457, 2006。細胞質遊離Ca²⁺イオン濃度(約100nM)は、定常状態の正常細胞環境では、細胞外Ca²⁺イオン濃度(約2mM)より非常に低い。本発明者らは、細胞外Ca²⁺濃度を長期間操作すると、細胞内GCフォールディング、輸送、および活性が変わるかどうか調べた。

Ca²⁺を含まない細胞培地(FBSを添加した)に添加した異なる濃度のCa²⁺イオン(0mM、0.5mM、1mM、1.5mM、および2mM CaCl₂)を、L444P GC細胞に10日間およびN370S/V394 GC細胞に7日間適用した。次いで、溶解細胞GC活性アッセイを用いて、GC活性を評価した。本明細書において報告された他の実験に用いられた濃度とほぼ同じ2mM Ca²⁺が培地に添加した状態で観察されたGC活性に対して、GC活性を標準化した。1mM Ca²⁺をL444P GC細胞およびN370S/V394L GC細胞の培地に添加した時に、GC活性は最大に増加した(1.5倍)。このことは、GCフォールディングおよび輸送に及ぼす、細胞外Ca²⁺イオン濃度の重要な影響を証明している(図19A)。

Ca²⁺イオンがGCタンパク質と直接相互作用できるかどうかを調べた。溶解されたL444PおよびN370S/V394L GC細胞を様々なイオン濃度(25nM〜2mM)のCa²⁺とインキュベートし、溶解細胞GC活性アッセイを用いてアッセイした。このことは、GC活性の変化が有意でなかったことを示している(図19B)。WT GCの組換え型であるCerezymeも同様に評価し、活性が変化しないことを示した(図19B、黒色のライン)。これらの結果から、Ca²⁺イオンはエクスビボでGCタンパク質を直接、活性化も阻害しないことが証明される。

実施例19
GC活性の増強はCa²⁺イオンチャンネル遮断薬の活性と相関する
ジルチアゼムが、そのCa²⁺イオンチャンネル遮断薬活性を介してGC活性を増強するという仮説をさらに調べるために、ある範囲の効力を示す5種類のジルチアゼム類似体を入手した(図19C)。以前に報告されたCa²⁺チャンネル遮断薬のIC₅₀値は、1(ジルチアゼム、IC₅₀=0.98μM)>2(2.46μM)>3(45.5μM)>4(126.7μM)である。Li et al., J Med Chem 35:3246-3253, 1992。類似体5および6は、ベンズアゼピノンに関して報告された構造活性相関(SAR)研究およびジルチアゼムに関する定量SAR研究により、ベンゾチアゼピン環骨格の中のN5に結合している鍵となる塩基性アミノ窒素ファーマコフォアを欠いているので、Ca²⁺イオンチャンネル活性を遮断しないはずである。Kimball et al., J Med Chem 35:780-793, 1992; Kettmann et al., Quant Struct-Act Relat 17:91-101, 1998。

L444P GC線維芽細胞を化合物1〜6(0.3〜100μM)と共に7日間培養し、インタクト細胞GC活性アッセイを用いて用量反応曲線を記録した(図19D)。化合物1(IC₅₀=0.98μM)および2(IC₅₀=2.46μM)は強力なCa²⁺チャンネルアンタゴニストであり、10μMで、注目に値するL444PリソソームGC活性増加を1については最大2.3倍まで、2については2.1倍まで示す(図19D、黒色のライン)。化合物3(IC₅₀=45.5μM)および4(IC₅₀=126.7μM)は弱いCa²⁺チャンネルアンタゴニストであり、かつ弱いL444P GC活性エンハンサーである。特に、これらの低効力類似体は、非常に高い濃度(30μM)のみで、3については1.3倍の最大L444P GC活性増加、4については1.2倍の最大L444P GC活性増加を示す(図19D、ピンク色のライン)。化合物5および6は、Ca²⁺チャンネルアンタゴニストではなく、従って、これらの密接に関連する類似体はL444P GC活性を増加しない(図19D、緑色のライン)。これらのデータは、Ca²⁺イオンチャンネル遮断薬が強力になればなるほど、高いリソソームGC活性増強が観察されることを証明している。ジルチアゼムおよびその類似体をN370S/V394L線維芽細胞においても同様に試験した(図19E)。化合物1(10μM)は、N370S/V394L GC活性を最大3.6倍まで増加させたのに対して、化合物2(10μM)は2.8倍に増加させ、これらは、L444P細胞を用いて観察された増加を上回る。高濃度の化合物5および6(>10μM)は、L444PおよびN370S/V394L線維芽細胞の両方に対して毒性がある。化合物1〜4はまた100μMで、細胞傷害性によりGC活性を弱める。

図19は、L444PおよびN370S/V394L GC線維芽細胞において、細胞内Ca²⁺イオン濃度がGC活性に影響を及ぼすこと示す。(A)様々な細胞培地中濃度のCa²⁺イオンをL444P GC細胞に10日間適用し、N370S/V394 GC細胞に7日間適用した後、溶解細胞GC活性アッセイを使用した。両方の場合とも、GC活性は、2mM Ca²⁺が培地に添加された時のGC活性に対して標準化した。(B)L444PおよびN370S/V394L GC細胞を溶解し、等量の総細胞タンパク質をCa²⁺イオンとインキュベートし、溶解細胞GC活性アッセイを用いて、これらのGC活性を評価した。組換えWT GC酵素であるCerezymeの活性もまた、Ca²⁺処理後に試験した。(C)ジルチアゼム類似体の化学構造(化合物2〜6;化合物1に関連する別個の部分構造を赤色で示した)と、報告されたCa²⁺チャンネル遮断薬のIC₅₀値。Li et al., J Med Chem 35:3246-3253, 1992。(D)L444P GC活性に及ぼす様々な効力のCa²⁺イオンチャンネル遮断薬の影響。L444P GC細胞を化合物1〜6と7日間インキュベートした後に、インタクト細胞GC活性アッセイを用いてリソソームGC活性を評価した。(E)N370S/V394L GC活性に及ぼす様々な効力のCa²⁺イオンチャンネル遮断薬の影響。N370S/V394L GC細胞を化合物1〜6と7日間インキュベートした後に、インタクト細胞活性アッセイを用いてGC活性を評価した。(D)および(E)の両方について、処理細胞のGC活性は、同じタイプの未処理細胞に対して標準化し(左y軸)、WT GC活性に対するパーセントとして表した(右y軸)。

ジルチアゼムが原形質膜Ca²⁺イオンチャンネルを遮断し、従って、細胞内Ca²⁺濃度を下げることによってGC活性を増強するという考えをさらに調べるために、強力なSERCAポンプ阻害剤であるタプシガルジンを、10μMジルチアゼム無しで、または10μMジルチアゼムと共にL444P GC細胞に7日間適用した。タプシガルジンはサイトゾルからERへのCa²⁺流入を阻害して、おそらく、細胞質内のCa²⁺イオン濃度を増加させる。Egan et al., Nat Med 8:485-492, 2002。従って、ジルチアゼムおよびタプシガルジンは、サイトゾルカルシウムホメオスタシス調節において反対の作用を有する。タプシガルジン単独では、1nMの濃度に達するまでGC活性に影響を及ぼさなかった。この濃度を上回ると、タプシガルジンは、7日間のインキュベーション後にL444P GC活性を有意に減少させた(図25、ピンク色のライン)。様々な濃度のタプシガルジンと10μMジルチアゼムを同時適用することによって、GC活性のタプシガルジン用量依存的減少が明らかになった(図25、青色のライン)。これは、これらの化合物が細胞質Ca²⁺イオンレベルに対して反対の影響を及ぼし、高い細胞内Ca²⁺レベルではなく低い細胞内Ca²⁺レベルが変異体GCホメオスタシスを増強するという仮説と一致している。

図25は、L444P GC線維芽細胞におけるGC活性に及ぼすタプシガルジンおよびジルチアゼムの影響を示す。タプシガルジンを、10μMジルチアゼム無しで、または10μMジルチアゼムと共に7日間適用した。処理細胞のGC活性は、未処理L444P GC細胞に対して標準化し(左y軸)、WT GC活性に対するパーセントとして表した(右y軸)。

実施例20
ジルチアゼム処理はシャペロンの発現をアップレギュレートする
分子シャペロンは、細胞タンパク質ホメオスタシスの維持に必須であることが知られている。従って、高いシャペロン発現レベルは、観察された、ジルチアゼムを介したリソソーム酵素ホメオスタシス増強の一因となり得た可能性がある。Ron et al., Nat Rev Mol Cell Biol 8:519-529, 2007; Young et al., Nat Rev Mol Cell Biol 5:781-791, 2004; Bukau et al., Cell 125:443-451, 2006; Williams, J Cell Sci 119:615-623, 2006。10μMジルチアゼム無しで、または10μMジルチアゼムと1日間および7日間インキュベートしたL444P GC線維芽細胞に対して、定量RT-PCR分析を行った。Hsp40、Hsp70、BiP、Hsp90、GRP94、カルネキシン、カルレチキュリン、HIPおよびHOPを含む、代表的な細胞質シャペロンおよびER内腔シャペロンの相対mRNA発現レベルを調べ、未処理細胞において見出されたレベルに対して標準化した(図20A)。リボソーム大タンパク質(RiboP)を対照としてモニタリングした。使用した全てのプライマーペアを表3に列挙した。7日間のジルチアゼム処理後に、BiP、Hsp40、およびHsp90のmRNA発現レベルはそれぞれ、1.8倍、1.8倍、および1.9倍まで増加したのに対して、Hsp70、GRP94、カルネキシン、およびカルレチキュリンのmRNA発現レベルはあまり変化しなかった。N370S/V394L GC線維芽細胞の厳密に類似するRT-PCR分析から、7日間のジルチアゼム処理後に、Hsp40のmRNA発現レベルが同様に増加したことが明らかになったが、BiPおよびHsp90はそれほど増加しない(図26)。ジルチアゼム(10μM)無しで、またはジルチアゼム(10μM)と4日間および7日間インキュベートしたL444P GC線維芽細胞に対して、ウエスタンブロット分析も行った(図20B)。7日間のジルチアゼム処理後に、BiP、Hsp40、およびHsp90のタンパク質発現レベル増加が確認された。GRP94、Hsp70、カルネキシン、およびカルレチキュリンの発現レベルがあまり増加しなかったこともタンパク質レベルで確認された。これらの分子シャペロン発現レベル、特に、細胞質Hsp40レベルの増加は、ERのGCフォールディング能力の増加を説明しているように見え、新たな転写が必要とされることも、カルシウムチャンネル遮断薬処理の際の比較的ゆっくりとしたリソソーム酵素レベル増加の一因となっているのかもしれない。ERの高度に動的な特性を考えれば、タンパク質フォールディングおよび輸送に最適化されたERを作り出すことにおいてサイトゾルシャペロンは役割を果たしていると予想される。

図20は、未処理L444P GC線維芽細胞およびジルチアゼム処理L444P GC線維芽細胞におけるシャペロン発現レベルを示す。(A)未処理およびジルチアゼム処理L444P GC細胞に対する定量RT-PCR。L444P GC細胞を、10μMジルチアゼムと1日間および7日間インキュベートした。ジルチアゼム処理L444P GC細胞の相対mRNA発現レベルは未処理細胞に対して標準化した。対応するプライマーペアを用いて、Hsp40、Hsp70、Hsp90、HIP、HOP、BiP、GRP94、カルネキシン、およびカルレチキュリンを調べた。リボソーム大タンパク質(RiboP)はハウスキーピング対照として役立った。(B)L444P GC細胞を10μMジルチアゼムで4日間および7日間処理した後に、それぞれ、SDS-PAGE分析のために溶解した。ウエスタンブロット分析を用いて、Hsp40、Hsp70、Hsp90、BiP、GRP94、カルネキシン、およびカルレチキュリンを調べた。β-アクチンはローディング対照として役立った。

図26は、未処理N370S/V394L GC細胞およびジルチアゼム処理N370S/V394L GC細胞に対する定量RT-PCR分析を示す。N370S/V394L GC細胞を、10μMジルチアゼムと1日間および7日間インキュベートした。ジルチアゼム処理N370S/V394L GC細胞の相対mRNA発現レベルは未処理細胞に対して標準化した。対応するプライマーペアを用いて、Hsp40、Hsp70、Hsp90、HIP、HOP、BiP、GRP94、カルネキシン(CNX)、およびカルレチキュリン(CRT)を調べた。リボソーム大タンパク質(RiboP)はハウスキーピング遺伝子対照として役立った。

実施例21
Ca²⁺チャンネル遮断薬は、糖タンパク質およびヘパラン硫酸の蓄積に関連する2つのさらなるリソソーム性蓄積症において酵素ホメオスタシスを改善する
リソソームα-マンノシダーゼは、規則正しい糖タンパク質分解に関与する広範囲特異性エキソグリコシダーゼである。Michalski et al., Biochim Biophys Acta-Mol Basis Dis 1455:69-84, 1999。α-マンノシダーゼ酵素にP356R変異があると、フォールディングおよび輸送が損なわれて、非常に低いリソソームα-マンノシダーゼ活性および重篤なα-マンノース症が引き起こされるように見える。Gotoda et al., Am J Hum Genet 63:1015-1024, 1998。P356Rα-マンノシダーゼを有する細胞の活性は、使用したアッセイ条件下ではWTα-マンノシダーゼの約18％である。これらの細胞と、ある範囲のジルチアゼムまたはベラパミル濃度を1日間、4日間、7日間、および10日間にわたってインキュベーションすることによって、溶解細胞酵素活性分析を行うことができた。ジルチアゼム(35μM)は、7日間のインキュベーション期間後に、P356Rα-マンノシダーゼ活性を2.0倍まで増加させた(WTα-マンノシダーゼの活性の約36％;図21A)。ベラパミル(50μM)は、4日間のインキュベーション期間後に、P356Rα-マンノシダーゼ活性を3.1倍(WTα-マンノシダーゼの活性の約56％)まで増加させた。図21B。P356Rα-マンノシダーゼを有する細胞をジルチアゼムまたはベラパミルに短時間(1日)曝露しても、α-マンノシダーゼ活性はあまり増加しなかった(図21Aおよび21B)。このことは、ジルチアゼムおよびベラパミルが細胞タンパク質ホメオスタシスに影響を及ぼすには新たなタンパク質合成が必要である可能性が高いことを示している。このことは、前記のゴーシェ病細胞株から得られた結果と一致している(図17および図24)。

リソソーム性蓄積症ムコ多糖症(MPS)IIIA型は、酵素スルファミダーゼ(SGSH)が欠損して、グリコサミノグリカンであるヘパラン硫酸の分解に欠陥が生じ、蓄積することによって引き起こされる。Yogalingam et al., Hum Mutat 18:264-281, 2001。IIIA型MPSに、よく見られるS66WおよびR245H変異があると、比活性が低下し(S66WおよびR245Hそれぞれについて正常比活性の15％および83％)、細胞濃度が下がる。これは、スルファミダーゼ変種のフォールディングおよびリソソームへの輸送が損なわれた結果である可能性が高い。Perkins et al., J Biol Chem 274:37193-37199, 1999。インタクト細胞酵素活性アッセイを用いてジルチアゼムまたはベラパミルの影響を評価するために、2種類の複合ヘテロ接合性MPS細胞株を使用した。S66W/V131M MPS細胞の場合、ジルチアゼム(50μM)またはベラパミル(10μM)処理によって、5日間の処理後に、S66W/V131Mスルファミダーゼ活性は、それぞれ、2.1倍および1.9倍(WTスルファミダーゼ活性の約30％)まで増加した(図21C)。R245H/E447K MPS細胞の場合、ジルチアゼム(25μM)は、R245H/E447K SGSH活性を2.5倍(WTスルファミダーゼ活性の約207％)まで増加させたのに対して、ベラパミルは、5日間の処理後にスルファミダーゼ活性をあまり変えなかった(図21D)。

図21は、患者由来線維芽細胞における変異体α-マンノシダーゼおよびヘパラン硫酸スルファミダーゼ(SGSH)活性に及ぼすジルチアゼムおよびベラパミルの影響を示す。処理細胞の酵素活性は同じタイプの未処理細胞に対して標準化し(左y軸)、WT酵素活性に対するパーセントとして表した(右y軸)。(A)1日間(黒色のライン)、4日間(ピンク色のライン)、7日間(青色のライン)、および10日間(黄色のライン)培養した後の、P356Rα-マンノシダーゼ活性に及ぼすジルチアゼムの影響。(B)1日間(黒色のライン)、4日間(ピンク色のライン)、7日間(青色のライン)、および10日間(黄色のライン)培養した後の、P356Rα-マンノシダーゼ活性に及ぼすベラパミルの影響。(C)5日間培養した後の、S66W/V131M SGSH活性に及ぼすジルチアゼム(ピンク色のライン)およびベラパミル(緑色のライン)の影響。(D)5日間培養した後の、R245H/E447K SGSH活性に及ぼすジルチアゼム(ピンク色のライン)およびベラパミル(緑色のライン)の影響。図17および図19とは異なり、図21Cおよび図21DのWTを基準とした％活性は、文献に報告されたS66WおよびR245Hの比活性から計算した。Perkins et al., J Biol Chem 274:37193-37199, 1999。

実施例22
L型Ca²⁺チャンネル遮断薬は部分的なフォールディング、輸送、および酵素機能を回復させる
本明細書において示される結果は、L型Ca²⁺チャンネル遮断薬であるジルチアゼムおよびベラパミルが、別個の化学反応を行う非相同リソソーム酵素の欠損に関与する障害である3種類のリソソーム性蓄積症の患者由来線維芽細胞に対して、部分的なフォールディング、輸送、および酵素機能を回復させるという発見に関する。これらのCa²⁺チャンネル遮断薬が両方ともFDAにより認可された薬物ということは、神経障害性ゴーシェ病および関連するLSDを最終的に治療するための有望な候補かどうか見分けるための、さらに必要な効能実験および安全性実験を行う動機となる。幸運にも、ジルチアゼムは血液脳関門を通過し、血漿中ではμM濃度範囲で生物利用可能である。Naito et al., Arzneimittelforschung 36-1:25-28, 1986; Buckley et al., Drugs 39:757-806, 1990。

ジルチアゼムおよびその類似体のCa²⁺イオンチャンネル遮断薬の効力は、これらが、ER中のGCフォールディングを増強して、患者由来線維芽細胞株における変異体GCの輸送およびリソソーム局在化を可能にする効率と相関する。Kraus et al., J Biol Chem 273:27205-27212, 1998。だが、ジルチアゼムによる原形質膜L型Ca²⁺チャンネルの遮断が、変異体GCホメオスタシスの増強とどのようにつながっているのであろうか？これらのチャンネルが活性化されると、細胞外Ca²⁺はサイトゾルに進入できるようになり、その後に、ER膜内のCa²⁺イオンチャンネルであるリアノジン受容体が活性化されることによって、細胞内Ca²⁺貯蔵、例えば、ERからのCa²⁺イオン放出がさらに誘導される。このカルシウム誘導性カルシウム放出(CICR)経路を阻害すると、ER Ca²⁺貯蔵の枯渇が最小限になる。これは、サイトゾルシャペロンおよびERシャペロンのサブセット、特に、Hsp40の発現をアップレギュレートするように思われるプロセスである。Putney et al., Cell Mol Life Sci 57:1272-1286, 2000。

SERCAポンプ阻害剤、例えば、クルクミンおよびタプシガルジンによるER Ca²⁺イオン濃度の低下によって、ΔF508 CFTRのフォールディングおよび輸送が増強されることも報告されている。Egan et al., Science 304:600-602, 2004; Egan et al., Nat Med 8:485-492, 2002。しかしながら、タプシガルジンは、L444P GCフォールディング、輸送、およびリソソーム活性を増強しない(図25)。ジルチアゼムによる処理でも、原形質膜へのΔF508 CFTRの輸送は増加しない。ジルチアゼムはサイトゾルへのカルシウム流入を遮断するのに対して、タプシガルジンは、サイトゾルからERへのカルシウム移動を阻害する。従って、ジルチアゼムおよびタプシガルジンはカルシウムホメオスタシスを反対方向に調節する。このことは、恐らく、ジルチアゼムおよびタプシガルジンがそれぞれゴーシェ病および嚢胞性線維症におけるタンパク質ホメオスタシスの欠陥を部分的に直す説明となっている。

ジルチアゼムは、アンギナおよび高血圧を治療するために用いられるFDAにより認可された低分子であり、Cardizem、Dilacor、およびTiazecを含む名前で販売されている。GCに直接結合して、ゴルジ体におよびリソソーム上に輸送するためにER中の折り畳まれた酵素を安定化する薬理学的シャペロンとは異なり、ゴーシェ病患者に由来する線維芽細胞をジルチアゼムで処理すると、ERの生物学的フォールディング能力が変化するように見える。ジルチアゼムは忍容性が良好であり、副作用の発生率は低い。その薬理学的適性は広範囲に研究および調査されている。Buckley et al., Drugs 39:757-806, 1990; Tartaglione et al., Drug Intell Clin Pharm 16:371-379, 1982; Chaffman et al., Drugs 29:387-454, 1985。ジルチアゼムは、患者由来線維芽細胞におけるGC活性の増大において、培養濃度10μMで用いられた時に最大の効能を示すが、最小の有効な細胞培地中濃度は0.1μM〜1μMであり(図18および図19)、経口投与によって得られるヒト血漿中濃度と同等である。

FDAにより認可された強力なL型Ca²⁺チャンネル遮断薬であるジルチアゼムおよびベラパミルは、3種類のリソソーム性蓄積症に関連する変異体リソソーム酵素のERフォールディング能力、輸送、および活性を増大させた。これらの化合物は、Ca²⁺イオンを介して、細胞質シャペロンおよびER内腔シャペロンのサブセットをERアップレギュレーションすることによって作用する可能性が高い。ΔF508 CFTRフォールディング効率およびいくつかの他の細胞WT酵素のフォールディング効率が、これらのCa²⁺チャンネル遮断薬の影響を受けないので、ERカルシウムレベルの増大は、患者由来細胞における変異体リソソーム酵素ホメオスタシスを部分的に回復させる比較的選択性のある戦略であるように見える。

実施例22
変異体タンパク質のフォールディング、輸送、および機能に対するER Ca²⁺ホメオスタシスの重要性をさらに試験するために、3つの系:IP₃受容体(IP₃R)、リアノジン受容体(RyR)放出チャンネル、および筋小胞体Ca²⁺-ATPアーゼ(SERCA)ポンプを標的とすることによって、ER Ca²⁺レベルを調整した(図30)。

リアノジン受容体アンタゴニストであるダントロレンの、GC活性に及ぼす影響を、L444P GC(図31A)およびN370S GC(図31B)線維芽細胞において試験した。ダントロレンはER膜中のリアノジン受容体(RyR)を強力に遮断し、それによって、ERからのCa²⁺放出を阻害し、ER Ca²⁺レベルを増加させる。ダントロレンは、GC mRNA発現レベルを有意に高めることなく(図34)、L444P GC活性のレベルを有意に増加させた(31Aおよび31B)。このことは、リアノジン受容体アンタゴニストがGCのタンパク質恒常性制御因子(PR)であることを示している。ダントロレンに曝露したL444P GC線維芽細胞がグリコシル化したことから(図32)、ダントロレンはL444P GCのフォールディングおよび/または輸送を増強することが分かり、このことは変異体GCのPRとしてのダントロレンの役割をさらに裏付けている。

L444P GC線維芽細胞を、個々のリアノジン受容体(RyR1〜RyR3)に対するsiRNAおよびそれらの組み合わせに曝露し、GC活性(図37C)ならびにEndoH感受性(図37Aおよび図37B)を測定した。結果から、RyRアイソフォームに個々に作用するPRおよびRyRアイソフォームの組み合わせに作用するPRは、例えば、GCフォールディングおよび/または輸送を促進することによってL444P GCタンパク質ホメオスタシスを部分的に回復できることが示唆された。潜在的なPR標的にはRyR3が含まれた。RyR3は、L444P GC線維芽細胞において最も豊富に発現しているアイソフォームである(図38)。

ダントロレンのPR活性の機構を調査するために、細胞質シャペロンHsp40、Hsp70、Hsp90、Hsp27、およびαβ-クリスタリン(CRYAB)の相対発現レベルを、L444P GC線維芽細胞において、ダントロレンへの様々な曝露後に測定した(図41)。ダントロレンは細胞質シャペロンを有意に活性化するようには見えない。

ダントロレンがGCのPRであることが証明されたので、本発明者らは、ダントロレンと薬理学的シャペロンを組み合わせた影響を調べた。N370S GC線維芽細胞のGC活性を、ダントロレンおよびダントロレンと薬理学的シャペロン(PC)との組み合わせの存在下で測定した。ダントロレンおよびPCは両方ともN370S GC活性を有意に増強し、ダントロレンおよびPCの組み合わせは、個々の化合物の合計より大きな程度で、N370S GC活性を相乗的に増強した(図44)。

L444P GC線維芽細胞においてSERCAポンプを過剰発現させ、GCグリコシル化(図35A)およびGC活性(図35B)を測定することによって、変異体GCのタンパク質恒常性に及ぼすER Ca²⁺レベルの影響をさらに調べた。SERCA過剰発現はL444P GC活性に中程度の影響を及ぼしたが、L444P GCのフォールディングおよび輸送は有意に増強された。これらの結果から、ER Ca²⁺レベルの上昇は、例えば、ERシャペロンレベルおよび/または活性をアップレギュレートすることによって、タンパク質恒常性を増強するという知見がさらに裏付けられる。

ER Ca²⁺レベルを調整する、もう1つの潜在的な方法は、イノシトール三リン酸(IP₃)シグナル伝達経路を介した方法である。IP₃とジアシルグリセロールは、ER膜上にあるIP₃受容体に結合し、活性化すると、筋小胞体(SR)にあるCa²⁺チャンネルが開口し、細胞質および筋形質にカルシウムが放出される。Ca²⁺濃度の上昇は正のフィードバック機構として作用し、次に、SRの中にあるリアノジン受容体を刺激して、さらなるCa²⁺を放出させる。IP₃R経路が調整されることによってタンパク質恒常性が調節されるかどうか試験するために、IP₃R阻害剤XeC(33A)、クロロキニン(33B)、キニーネ(33C)、チメロサール(33D)、およびKN93(33E)を含む、いくつかのIP₃Rモジュレーター(図33)の存在下で、L444P GC線維芽細胞のGC活性を測定した。化合物はいずれもL444P GC活性を増強せず、化合物のいくつかはマイクロモルレベルでL444P GC活性を有意に減少させた。

実施例24
材料および方法
試薬
塩酸ジルチアゼム(1)およびベラパミルは、Tocris Bioscience(Ellisville, MO)から入手した。化合物2は、Synfine(Richmond Hill, ON, Canada)から入手した。化合物3および4はサポート情報の通り合成した。ルテニウムレッド、化合物5および6、4-メチルウンベリフェリルβ-D-グルコピラノシド、4-メチルウンベリフェリルα-D-マンノピラノシド、4-メチルウンベリフェリルα-D-グルコピラノシド、4-メチルウンベリフェリルβ-D-ガラクトピラノシド、4-メチルウンベリフェリルα-D-ガラクトピラノシド、および4-メチルウンベリフェリルβ-D-グルクロニドは、Sigma(St. Louis, MO)から入手した。N-(n-ノニル)デオキシノジリマイシン(NN-DNJ)、コンズリトールBエポキシド(CBE)、および4-メチルウンベリフェリル2-スルファミノ-2-デオキシ-α-D-グルコピラノシドは、Toronto Research Chemicals(Downsview, ON, Canada)から入手した。試験した他の低分子は全て、Tocris BioscienceまたはSigmaから入手した。細胞培地はGibco(Grand Island, NY)から入手した。ヒト注射用組換えWT GCタンパク質(商品名Cerezyme)は、Genzyme(Cambridge, MA)から入手した。

細胞培養
初代皮膚線維芽細胞培養物は、N370S GC(c.1226A>G)変異またはG202R GC(c.721G>A)変異についてホモ接合性のゴーシェ病患者から樹立した。明らかに正常な線維芽細胞(GM00498)、L444P GC(c.1448T>C)変異を含有する3種類のホモ接合性ゴーシェ病線維芽細胞(GM08760、GM10915、およびGM20272)、N370S/V394L GC変異(GMO1607)およびN370S/84GG GC変異(GM00372)を含有する2種類の複合ヘテロ接合性ゴーシェ病線維芽細胞、P356Rα-マンノシダーゼ変異を含有するホモ接合性α-マンノース症線維芽細胞(GM04518)、ならびにS66W/V131M SGSH変異(GM01881)およびR245H/E447K SGSH変異(GM00879)を含有する2種類の複合ヘテロ接合性IIIA型ムコ多糖症線維芽細胞は、Coriell Cell Repositories(Camden, NJ)から入手した。10％熱失活胎仔ウシ血清および1％グルタミンPen-Strepを添加したアール塩を含む最小必須培地において、線維芽細胞を37℃、5％CO₂において維持した。

酵素活性アッセイ
インタクト細胞GC活性アッセイは以前に述べられている。Sawkar et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:15428-15433, 2002。簡単に述べると、細胞を48ウェルアッセイプレート(500μl/ウェル)にプレートした。細胞接着後に、培地を低分子含有培地と交換した。培地は3日ごとに交換した。37℃で、指示された時間インキュベーションした後に、インタクト細胞GC活性アッセイを行った。単層をDPBSで洗浄した。3mM 4-メチルウンベリフェリルβ-D-グルコピラノシドを含む0.2M酢酸緩衝液(pH4.0)150μlを各ウェルに添加し、その後に、37℃で1時間〜7時間インキュベーションすることによって、反応を開始した。非特異的GC活性の程度を評価するために、対照としてCBEを使用した。0.2Mグリシン緩衝液(pH10.8)750μlを用いて細胞を溶解することによって、反応を停止した。遊離した4-メチルウンベリフェロン(励起365nm, 発光445nm)を、SpectraMax Geminiプレートリーダー(Molecular Device, Sunnyvale, CA)を用いて測定した。溶解細胞GC活性アッセイは以前に述べられている。Sawkar et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:15428-15433, 2002。簡単に述べると、インタクト細胞を採取し、ペレットを、コンプリートプロテアーゼインヒビターカクテルを含有するコンプリートライシス-M緩衝液(Roche ＃10799050001)を用いて溶解した。Micro BCAアッセイ試薬(Pierce, Rockford, IL, ＃23235)を用いて、総細胞タンパク質を測定した。GC活性については、総細胞タンパク質30μgを、0.15％TritonX-100(v/v,Fisher)および0.15％タウロデオキシコール酸(w/v,Calbiochem)の存在下で、3mM 4-メチルウンベリフェリルβ-D-グルコピラノシドを含有する0.1M酢酸緩衝液(pH5.0)100μlに溶解してアッセイした。非特異的GC活性の程度を評価するために、対照としてCBEを使用した。37℃で1時間〜7時間インキュベーションした後に、0.2Mグリシン緩衝液(pH10.8)200μlを用いて反応を停止し、蛍光を記録した(励起365nm、発光445nm)。組換えWT GC酵素のGC活性アッセイは以前に述べられている[Sawkar et al., ACS Chem Biol 1:235-251, 2006]。GC活性については、組換えWT GCタンパク質25ngを、0.15％TritonX-100(v/v,Fisher)および0.15％タウロデオキシコール酸(w/v, Calbiochem)の存在下で、3mM 4-メチルウンベリフェリルβ-D-グルコピラノシドを含有する0.1M酢酸緩衝液(pH5.0)50μlに溶解してアッセイした。試験化合物を添加した後に、反応物を37℃で20分間インキュベートし、0.2Mグリシン緩衝液(pH10.8)75μlで停止し、蛍光を記録した(励起365nm、発光445nm)。

リソソームα-マンノシダーゼの活性は、以前に述べられたように少し変更を加えて、基質として2mM 4-メチルウンベリフェリルα-D-マンノピラノシドを用いて求めた。Gotoda et al., Am J Hum Genet 63:1015-1024, 1998。リソソームSGSHの活性は、以前に述べられたように少し変更を加えて、0.5mM 4-メチルウンベリフェリル2-スルファミノ-2-デオキシ-α-D-グルコピラノシドを用いて求めた。Karpova et al., J Inherit Metab Dis 19:278-285, 1996。リソソーム酵素α-グルコシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、α-ガラクトシダーゼ、およびβ-グルクロニダーゼの活性は、以前に述べられたように、それぞれ、対応する基質4-メチルウンベリフェリルα-D-グルコピラノシド、4-メチルウンベリフェリルβ-D-ガラクトピラノシド、4-メチルウンベリフェリルα-D-ガラクトピラノシド、および4-メチルウンベリフェリルβ-D-グルクロニドを用いて求めた。Sawkar et al. Chem Biol 12:1235-1244, 2005。

低分子は、各濃度で少なくとも三通り評価し、各分子は少なくとも3回アッセイした。報告したデータは、同じタイプの未処理細胞の酵素活性に対して標準化し、WT酵素活性に対するパーセントとして表した。

定量RT-PCR
細胞を、10μMジルチアゼムと37℃で、指示された時間インキュベートした。RNeasy Mini Kit(Qiagen＃74104)を用いて、細胞から総RNAを抽出した。QuantiTect Reverse Transcription Kit(Qiagen＃205311)を用いて、総RNA 500ngからcDNAを合成した。定量PCR反応は、ABI PRISM 7900システム(Applied Biosystems)においてQuantiTect SYBR Green PCR Kit(Qiagen ＃204143)および対応するプライマーを用いて行った。GC、Hsp40、Hsp70、Hsp90、HIP、HOP、BiP、GRP94、カルネキシン(CNX)、およびカルレチキュリン(CRT)、ならびに内因性ハウスキーピング遺伝子リボソーム大タンパク質(RiboP)のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを表3に列挙した。試料を95℃で15分間加熱し、94℃で15秒、59℃で30秒、72℃で30秒の45サイクルで増幅した。分析はSDS2.1ソフトウェア(Applied Biosystems)を用いて行った。PCR増幅プロットから閾値サイクル(C_T)を抽出した。標的遺伝子のC_Tとハウスキーピング遺伝子のC_Tの差を表わすために、ΔC_T値を使用した:ΔC_T=C_T (標的遺伝子)-C_T (ハウスキーピング遺伝子)。ジルチアゼム処理細胞の標的遺伝子の相対mRNA発現レベルは、未処理細胞に対して標準化した:相対mRNA発現レベル=2exp[-(ΔC_T (処理細胞)-ΔC_T (未処理細胞))]。

ウエスタンブロット
細胞を、コンプリートプロテアーゼインヒビターカクテルを含有するコンプリートライシス-M緩衝液(Roche＃10799050001)を用いて溶解した。総細胞タンパク質を、Micro BCAアッセイ試薬を用いて測定した。EndoH(New England Biolabs ＃P0703)を用いて、会社の説明書に従って細胞溶解産物を消化した。等量の総タンパク質を含有する細胞溶解産物を10％SDS-PAGEで分離した。ウエスタンブロット分析はマウスモノクローナル抗GC 8E4抗体を用いて行った。Ginns et al., Clin Chim Acta 131:283-287, 1983。マウスモノクローナル抗GC 2E2は、Novus Biological(＃H00002629-M01, Littleton, CO)から入手した。カルネキシンに対する抗体(＃SPA-860)、カルレチキュリンに対する抗体(＃SPA-601)、Hsp40に対する抗体(＃SPA-400)、Hsp70に対する抗体(＃SPA-812)、およびHsp90に対する抗体(＃SPA-830)は、Stressgen(Victoria, BC, Canada)から入手した。BiPに対する抗体(＃SC-13968)およびGRP94に対する抗体(＃SC-11402)は、Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA)から入手した。マウスモノクローナル抗βアクチンAC-15はSigma(＃A1978)から入手した。二次抗体(ヤギ抗マウスについては＃31430およびヤギ抗ウサギについては＃31460)はPierceから入手した。バンドは、SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate(Pierce＃34078)またはSuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate(Pierce＃34095)を用いて視覚化した。

免疫蛍光法
免疫蛍光法は以前に説明されている。Sawkar et al., ACS Chem Biol 1:235-251, 2006。カバーガラス上で増殖させた細胞をPBSで洗浄し、PBSに溶解した3.7％パラホルムアルデヒドで15分間固定した。カバーガラスをPBSで洗浄し、PBSに溶解した15mMグリシンで10分間クエンチし、PBSに溶解した0.2％サポニンで15分間、透過処理した。0.2％サポニンおよび5％ヤギ血清の存在下で、PBSに溶解して抗体を調製した。細胞を、一次抗体(マウスモノクローナル抗GC 16B3の場合、1:100、8E4の場合、1:100、およびウサギ抗LAMP2の場合、1:10,000)と1時間インキュベートし、PBSに溶解した5％ヤギ血清で洗浄し、次いで、Molecular Probes(Eugene, OR)から入手した二次抗体(Alexa Fluor 488ヤギ抗マウスIgG(＃A11029)およびAlexa Fluor 546ヤギ抗ウサギIgG(＃A11035))と1時間インキュベートした。Beutler et al., Proc Natl Acad Sci USA 81:6506-6510, 1984; Carlsson et al., J Biol Chem 263:18911-18919, 1988。カバーガラスをマウントし、密封した。Nikon TE2000-U顕微鏡に取り付けたBio-Rad(Zeiss) Radiance 2100 Rainbowレーザー走査型共焦点顕微鏡を用いて、画像を収集した。定量共局在分析のために、各フレームのZ-stackを平面化し、ピアソン相関係数はNIH Image Jソフトウェアを用いて計算した。各スライドからのランダムなフレームを平均し、両側スチューデントt検定を用いて共局在の差異を解析した。

化合物3および4の合成および構造の特徴付け
試薬はAldrichから購入した。NMRスペクトルは、Varian FT NMR分光計において、400MHzのプロトン周波数で記録した。高分解能質量スペクトル(HRMS)を、The Scripps Research Institute Center for Mass Spectrometryにおいて得た。高速液体クロマトグラフィー(HPLC)による分離は、分取HPLC用のPhenomenex Jupiter 4u Proteo 90A逆相C18カラム(250x21.20mm)を用いて、Waters 2487 PDA(光ダイオードアレイ)UV検出器を備えたWatersデュアル600ポンプ液体クロマトグラフィーシステムにおいて行った。

化合物3および4の合成は以前に報告されているが、多工程が必要であったか、または全収率が低かった。Miyazaki et al., Chem Pharm Bull 26:2889-2893, 1978, Li et al., J Med Chem 35:3246-3253, 1992。本明細書中では、本発明者らは、2工程で化合物3および4を得るために出発物質として安価な市販の化合物を利用し、収率はそれぞれ良好であった。化合物3の合成経路をスキーム1に示した。化合物2は、市販の塩酸ジルチアゼムから定量収率で調製した。米国特許第4,547,495号。化合物3は、触媒量のBF₃の存在下でSiCl₄/LiIを用いて、2をO-脱メチルすることによって81％の収率で得た。Zewge et al., Tetrahedron Lett 45:3729-3732, 2004。化合物4の合成経路をスキーム2に示した。化合物7は、以前に報告されたように、市販の化合物6から71％の収率で調製した。Miyazaki et al., Chem Pharm Bull 26:2889-2893, 1978。化合物4は、ワンポットでBBr₃を用いて、O-脱メチルおよび化合物7からのCbz保護基の除去によって61％の収率で得た。McOmie et al., Tetrahedron 24:2289-2292, 1968; Felix, J Org Chem 39:1427-1429, 1974; Li et al., J Med Chem 35:3246-3253, 1992。

(2S,3S)-5-[2-(ジメチルアミノ)エチル]-2,3-ジヒドロ-3-ヒドロキシ-2-(4-ヒドロキシフェニル)-1,5-ベンゾチアゼピン-4(5H)-オン(3)
2(1.16mmol)432mgを無水トルエン15mlに溶解した。LiI(11.6mmol)1553mgおよびアセトニトリル5mlを添加した後に、CH₂Cl₂に溶解した1M SiCl₄11.6ml(11.6mmol)およびBF₃・OEt₂ 294μl(2.32mmol)を添加した。混合物を70℃で16時間攪拌した。メタノール25mlおよび過剰な固体Na₂CO₃を添加することによって反応を止め、濾過し、濃縮した。混合物をCHCl₃25mlおよびH₂O 25mlに再溶解した。飽和Na₂CO₃溶液を用いて、pH値を9.0まで調節した。CHCl₃ (15mlx3)を用いて、混合物を抽出した。混合した有機層をNa₂SO₄上で乾燥させ、ロータリーエバポレーションにかけた。フラッシュクロマトグラフィー(1:9メタノール/CH₂Cl₂)によって、淡黄色の粉末として337mg(81％)の3を得た。

(2S,3S)-2,3-ジヒドロ-3-ヒドロキシ-2-(4-ヒドロキシフェニル)-5-[2-(メチルアミノ)エチル]-1,5-ベンゾチアゼピン-4(5H)-オン(4)
7(0.28mmol)138mgを含む無水CH₂Cl₂ 5mlを-18℃まで冷却した。CH₂Cl₂に溶解した1M BBr₃ 2ml(2mmol)を滴下した。反応物を-18℃で1時間攪拌し、次いで、室温でもう10時間攪拌した。H₂O 10mlを混合物に滴下した。NaOH溶液を用いて、pH値を9.0まで調節した。酢酸エチル(20mlx3)を用いて混合物を抽出した。混合した有機層をNa₂SO₄上で乾燥させ、ロータリーエバポレーションにかけた。粗生成物を、逆相C18カラムを用いて分取HPLCで精製して、白色粉末として78mg(61％)の4のCF₃COOH塩を得た。

本明細書において引用された全ての刊行物および特許出願はその全体が、それぞれ個々の刊行物または特許出願が全ての目的のために参照により組み入れられるように詳細かつ個々に示されるのと同じ程度に、全ての目的のために参照により本明細書に組み入れられる。

前述の発明は、はっきりと理解できるようにするために例示および実施例によっていくらか詳細に説明されたが、添付の特許請求の範囲の精神または範囲を逸脱することなく、ある特定の変化および変更が加えられ得ることは、本発明の開示を考慮すれば当業者に容易に明らかであろう。

Claims

タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態の治療を必要とする患者において、タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態を治療するための方法であって、タンパク質ホメオスタシスを改善または回復させて、患者の状態を軽減もしくは排除する、またはその発生もしくは再発を阻止するのに有効な量のタンパク質恒常性制御因子を患者に投与する工程を含む、方法。
タンパク質ホメオスタシスの機能不全が、タンパク質ミスフォールディングの結果である、請求項1記載の方法。
タンパク質ホメオスタシスの機能不全が、タンパク質凝集の結果である、請求項1記載の方法。
タンパク質ホメオスタシスの機能不全が、欠陥のあるタンパク質輸送の結果である、請求項1記載の方法。
タンパク質ホメオスタシスの機能不全が、タンパク質分解の結果である、請求項1記載の方法。
前記状態が機能喪失型障害である、請求項1記載の方法。
前記状態がリソソーム性蓄積症である、請求項6記載の方法。
前記状態が機能獲得型障害である、請求項1記載の方法。
タンパク質恒常性制御因子が、熱ショック応答(HSR)経路、小胞体ストレス応答(unfolded protein response：UPR)経路、Ca²⁺シグナル伝達経路、またはそれらの組み合わせを介してシグナル伝達をアップレギュレートする、請求項1記載の方法。
タンパク質恒常性制御因子が、1つもしくは複数のタンパク質シャペロン、1つもしくは複数のフォールディング酵素、またはそれらの組み合わせの転写または翻訳をアップレギュレートする、請求項6記載の方法。
タンパク質恒常性制御因子が、1つまたは複数のタンパク質シャペロン、1つまたは複数のフォールディング酵素、またはそれらの組み合わせの分解を阻害する、請求項6記載の方法。
タンパク質恒常性制御因子が凝集経路または脱凝集経路をアップレギュレートする、請求項7記載の方法。
前記状態が、ゴーシェ病、α-マンノシドーシス、IIIA型ムコ多糖症、ファブリー病、テイ・サックス病、またはポンペ病である、請求項6記載の方法。
機能喪失型障害が、変異リソソーム酵素に起因するリソソーム性蓄積症である、請求項6記載の方法。
変異リソソーム酵素を交換するために、正常活性を有するリソソーム酵素をコードするポリヌクレオチドまたはポリペプチドを投与する工程をさらに含む、請求項15記載の方法。
前記状態が、封入体筋炎、加齢黄斑変性、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、またはパーキンソン病である、請求項8記載の方法。
タンパク質恒常性制御因子が、化学小分子、タンパク質、アンチセンス核酸、ショートヘアピンRNA、短鎖干渉RNA、またはリボザイムである、請求項1記載の方法。
タンパク質恒常性制御因子が、ウイルス感染に対する患者の感受性を高めない量で投与される、請求項1記載の方法。
タンパク質恒常性制御因子が、癌に対する患者の感受性を高めない量で投与される、請求項1記載の方法。
薬理学的シャペロンまたはキネティック安定剤を投与する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
第2の機構的に別個のタンパク質恒常性制御因子を投与する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
第1および第2のタンパク質恒常性制御因子が、凝集制御因子、脱凝集制御因子、タンパク質分解制御因子、またはタンパク質フォールディング制御因子の1つまたは複数である、請求項21記載の方法。
タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態の治療を必要とする患者において、タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態を治療するための方法であって、薬理学的シャペロンまたはキネティック安定剤と組み合わせて、タンパク質ホメオスタシスを改善または回復させて、患者の状態を軽減もしくは排除する、またはその発生もしくは再発を阻止するのに有効な量のタンパク質恒常性制御因子を該患者に投与する工程を含む、方法。
前記状態が機能喪失型障害である、請求項23記載の方法。
タンパク質恒常性制御因子が変異酵素の正しいフォールディングを促進する、請求項23記載の方法。
変異酵素がリソソーム酵素である、請求項25記載の方法。
変異リソソーム酵素を交換するために、正常活性を有するリソソーム酵素をコードするポリヌクレオチドまたはポリペプチドを投与する工程をさらに含む、請求項26記載の方法。
タンパク質恒常性制御因子が小胞体関連分解を阻害する、請求項23記載の方法。
前記状態がゴーシェ病である、請求項23記載の方法。
薬理学的シャペロンがN-(n-ノニル)デオキシノジリマイシンである、請求項24記載の方法。
前記状態がテイ・サックス病である、請求項23記載の方法。
薬理学的シャペロンが2-アセトアミド-2-デオキシノジリマイシンである、請求項31記載の方法。
前記状態が機能獲得型障害である、請求項23記載の方法。
前記状態が、封入体筋炎、加齢黄斑変性、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、またはパーキンソン病である、請求項33記載の方法。
機能喪失型疾患の治療を必要とする患者において機能喪失型疾患を治療するための方法であって、変異タンパク質の活性を改善または回復させて、患者における機能喪失型疾患を軽減もしくは排除する、またはその発生または再発を阻止するのに有効な量のタンパク質恒常性制御因子を該患者に投与する工程を含む、方法。
タンパク質恒常性制御因子が変異タンパク質の正しいフォールディングを促進し、かつ変異タンパク質に結合しない、請求項35記載の方法。
タンパク質恒常性制御因子が、タンパク質シャペロンの小胞体関連分解を軽減または排除する、請求項35記載の方法。
タンパク質恒常性制御因子がプロテアソーム阻害剤である、請求項35記載の方法。
機能喪失型疾患がリソソーム性蓄積症であり、変異タンパク質がリソソーム酵素である、請求項35記載の方法。
機能喪失型疾患が嚢胞性線維症であり、変異タンパク質が嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)である、請求項35記載の方法。
変異タンパク質を交換するために、正常活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはポリペプチドを投与する工程をさらに含む、請求項35記載の方法。
リソソーム性蓄積症が神経障害性リソソーム性蓄積症である、請求項39記載の方法。
リソソーム性蓄積症が、ゴーシェ病、α-マンノシドーシス、IIIA型ムコ多糖症、ファブリー病、テイ・サックス病、またはポンペ病である、請求項39記載の方法。
タンパク質恒常性制御因子が小胞体中のカルシウム濃度を上げる、請求項39記載の方法。
タンパク質恒常性制御因子がCa²⁺チャンネル遮断薬である、請求項44記載の方法。
タンパク質恒常性制御因子がカルシウム結合シャペロンタンパク質の発現を高める、請求項44記載の方法。
カルシウム結合シャペロンタンパク質がカルネキシンおよびカルレチキュリンからなる群より選択される、請求項46記載の方法。
タンパク質恒常性制御因子がリアノジン受容体を阻害する、請求項44記載の方法。
タンパク質恒常性制御因子がリアノジン受容体アンタゴニストである、請求項48記載の方法。
タンパク質恒常性制御因子がリアノジン受容体の発現を阻害する、請求項48記載の方法。
タンパク質恒常性制御因子が少なくとも2つのリアノジン受容体サブタイプを阻害する、請求項48記載の方法。
タンパク質恒常性制御因子がジルチアゼムまたはベラパミルである、請求項39記載の方法。
リソソーム性蓄積症がゴーシェ病である、請求項43記載の方法。
リソソーム性蓄積症が神経障害性ゴーシェ病である、請求項53記載の方法。
酵素がグルコセレブロシダーゼである、請求項53記載の方法。
酵素がL444Pグルコセレブロシダーゼである、請求項55記載の方法。
酵素がN370Sグルコセレブロシダーゼである、請求項55記載の方法。
リソソーム性蓄積症がα-マンノシドーシスである、請求項43記載の方法。
酵素がα-マンノシダーゼである、請求項58記載の方法。
酵素がP356R α-マンノシダーゼである、請求項59記載の方法。
リソソーム性蓄積症がIIIA型ムコ多糖症である、請求項43記載の方法。
酵素がスルファミダーゼである、請求項61記載の方法。
酵素がS66WスルファミダーゼまたはR245Hスルファミダーゼである、請求項62記載の方法。
タンパク質恒常性制御因子がCa²⁺チャンネルアンタゴニストである、請求項39記載の方法。
タンパク質恒常性制御因子がL型電位依存性カルシウムチャネル遮断薬である、請求項64記載の方法。
タンパク質恒常性制御因子がジルチアゼムまたはベラパミルである、請求項65記載の方法。
タンパク質恒常性制御因子がジルチアゼムの類似体である、請求項65記載の方法。
前記疾患がテイ・サックス病である、請求項43記載の方法。
酵素がβ-ヘキソサミンAである、請求項68記載の方法。
酵素がG269S β-ヘキソサミンAである、請求項69記載の方法。
タンパク質恒常性制御因子がセラストロールである、請求項70記載の方法。
タンパク質恒常性制御因子がMG-132である、請求項70記載の方法。
タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態の治療を必要とする患者において、タンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態を治療するための方法であって、少なくとも2つの機構的に別個のタンパク質恒常性制御因子を該患者に投与する工程を含み、該タンパク質恒常性制御因子は、タンパク質ホメオスタシスを改善または回復させて、患者の状態を軽減もしくは排除する、またはその発生もしくは再発を阻止するのに有効な量で投与される、方法。
タンパク質恒常性制御因子の1つが変異タンパク質の正しいフォールディングを増強する、請求項73記載の方法。
タンパク質恒常性制御因子の1つが変異タンパク質の小胞体関連分解を阻害する、請求項73記載の方法。
変異タンパク質が変異酵素である、請求項73記載の方法。
患者においてタンパク質ホメオスタシスの機能不全を特徴とする状態を診断するための方法であって、以下の工程を含む方法:
細胞をベースとするアッセイ系において患者からの細胞または組織とタンパク質恒常性制御因子とを接触させる工程、
細胞内のタンパク質フォールディング、タンパク質凝集、タンパク質輸送、またはタンパク質分解に及ぼすタンパク質恒常性制御因子の影響を測定する工程、および
患者の細胞または組織におけるタンパク質ホメオスタシスの欠損を特定する工程。
タンパク質のフォールディングまたは輸送の欠損を特定する工程を含む方法であって、前記状態が機能喪失型障害である、請求項77記載の方法。
タンパク質分解における欠損を特定する工程を含む方法であって、前記状態が機能獲得型障害である、請求項77記載の方法。
欠損がタンパク質シャペロンの合成におけるものである、請求項79記載の方法。
タンパク質恒常性制御因子が、熱ショック応答(HSR)経路、小胞体ストレス応答(UPR)経路、Ca²⁺シグナル伝達経路、またはそれらの組み合わせを介してシグナル伝達をアップレギュレートする、請求項79記載の方法。
タンパク質恒常性制御因子が、1つもしくは複数のタンパク質シャペロン、1つもしくは複数のフォールディング酵素、またはそれらの組み合わせの転写または翻訳をアップレギュレートする、請求項79記載の方法。
タンパク質恒常性制御因子が、1つもしくは複数のタンパク質シャペロン、1つもしくは複数のフォールディング酵素、またはそれらの組み合わせの分解を阻害する、請求項79記載の方法。
タンパク質恒常性制御因子が凝集経路または脱凝集経路をアップレギュレートする、請求項77記載の方法。
2つまたはそれ以上のタンパク質恒常性成分を同定することによって治療法をデザインする方法であって、タンパク質恒常性成分の活性と標準とを比較する工程;標準の活性に対してタンパク質恒常性成分の活性を改変するタンパク質恒常性制御因子を選択する工程;および該制御因子を必要する患者に該制御因子を投与する工程を含む、方法。