상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 에피카테킨을 유효성분으로 하는 항암제 등의 약제 또는 방사선 또는 이들의 병용 치료시 유발되는 청각세포 사멸을 억제하는 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 유효량은 40μM미만에서는 그 효과가 미약하고, 200μM를 초과하는 경우에는 더 이상의 추가적인 보호효과가 나타나지 않아서, 40μM에서 200μM 범위가 가장 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 항암제 등 청각에 독성을 가지는 약제는 시스프라틴,카보프라틴(Carboplatin), 질소 머스타드(nitrogen mustard), 빈크리스틴(Vincristine), 아미카신(Amikacin), 아지트로마이신(Azithromycin), 카프레오마이신(Capreomycin), 크로람페니콜(Chloramphenicol), 디베카신(Dibekacin), 디하이 드로스트렙토마이신(Dihydrostreptomycin), 에티오마이신(Etiomycin), 에리트로마이신(Erythromycin), 젠타마이신(Gentamicin), 메트로니디졸(Metronidizole), 네오마이신(neomycin), 네틸마이신(Netilmicin), 폴리믹신(Polymyxin) B, 스트렙토마이신, 토브라마이신(Tobramycin), 반코마이신(Vancomycin), 프록신, 마크로라이드(macrolide), 라식(Lasix;furosemide), 부멕스(Bumex;bumetanide), 에데크린(Edecrin;ethacrynic acid), 피레타마이드(Piretamide), 퀴니덱스(Quinidex), 아타브린(Atabrine), 프라퀘닐(Plaquenil), 퀴닌 설페이트(Quinine Sulfate), 메프로퀸(mefloquine;Lariam), 클로로퀸(Chloroquine), 또는 아스피린을 포함하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 약학적 조성물 및 투여 형태는 또한 하나 이상의 부가적 활성 성분을 더 포함할 수 있다. 결과적으로, 본 발명의 약학적 조성물 및 투여 형태는 본 명세서에서 개시된 활성 성분을 포함한다.
본 발명의 단일 유닛 투여 형태는 환자에게 경구, 점막(예를 들어, 비강, 설하, 질, 버칼, 또는 직장), 비경구적(예를 들어, 피하, 정맥, 볼루스 주입, 근육내 또는 동맥내), 국소(예를 들어, 눈), 경피(transdermal) 또는 피부통과(transcutaneous) 투여하기에 적절하다. 투여 형태의 예는 정제; 캐프릿(caplets); 부드러운 탄성 젤라틴 캅셀과 같은 캅셀제; 캐세트(cachets); 트로키; 로젠즈(lozenges); 분산제; 좌제; 파우더; 에어로솔(예를 들어, 비강 스프레이 또는 인홀러); 겔; 현탁제제(예를 들어, 수상 또는 비-수상 액상 현탁제제, 수중유형 유제, 또는 유중수형 액상 유제) 용액제 및 엘릭실제를 포함하는 환자에게 경구 또는 점막 투여하기에 알맞은 액상 투여 제형; 환자에게 주사 투여하기에 알맞은 액상 투여 제형; 국소 투여하기에 적당한 아이 드랍(eye drop) 또는 다른 안과 제제; 및 환자에게 주사 투여하기에 적당한 액상 투여 형태를 제공하기 위하여 재구성될 수 있는 멸균 고상제제(예를 들어, 결정형 또는 무정형 고체)를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 투여 형태의 조성물, 모양, 및 타입은 일반적으로 그들의 사용에 따라 매우 다양하다. 예를 들어, 질환의 급성 치료를 위해 사용된 투여 형태는 동일한 질환의 만성 치료를 위해 사용되는 투여 형태보다 그것이 포함하는 하나 이상의 활성 성분의 많은 양을 함유할 수 있다. 유사하게, 비경구적 투여 형태는 동일 질환을 치료하기 위해 사용된 경구 투여 형태보다 그것이 포함하는 하나 이상의 활성 성분의 더 적은 양을 함유할 수 있다. 본 발명에 의해 포함되는 특정 투여 형태의 이러한 및 다른 방식들은 각각 매우 다양하고 본 발명이 속한 분야에 있어 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다. 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing, Easton PA (1990) 참조.
전형적인 약학적 조성물 및 투여 형태는 하나 이상의 부형제를 포함한다. 적절한 부형제는 약학 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있고, 적절한 부형제의 비-한정적 예는 본 명세서에 개시되어 있다. 특정 부형제가 약학적 조성물 또는 투여 형태에 포함되는 것이 바람직한지 여부는 투여 형태가 환자에게 투여되는 방식을 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 본 발명이 속한 분야에서 잘 알려진 여러 가지 인자에 달려 있다. 예를 들어, 정제와 같은 경구 투여 형태 비경 구 투여 형태에서의 사용에 알맞지 않은 부형제를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 활성 성분이 분해하는 속도를 줄일 수 있는 하나 이상의 화합물을 함유하는 약학적 조성물 및 투여 형태를 포함한다. 그러한 화합물은 안정화제, 아스코르빅 산과 같은 항산화제, pH 완충제, 또는 염 완충제를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
부형제의 양 및 타입과 같이, 투여 형태 내에서 활성 성분의 양 및 특정 형태는 환자에게 투여되는 경로와 같은, 하지만 이에 한정되지 않는, 인자들에 따라 다를 수 있다.
경구 투여를 위해 적당한 본 발명의 약학적 조성물은 정제(예를 들어, 츄어블정), 캐플릿(caplet), 캅셀, 및 액제(예를 들어, 가향된(flavored) 시럽)와 같은, 하지만 이에 한정되지 않는, 별개의 투여 형태로 존재할 수 있다. 그러한 투여 형태는 미리 정해진 양의 활성 성분을 포함하고, 본 발명이 속한 분야에서 잘 알려진 약학 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing, Easton PA (1990) 참조.
본 발명의 일반적 경구 투여 형태는 활성 성분을 적어도 하나의 부형제와 통상적인 약학적 혼합 기술에 따라서 치밀한 혼합물로 혼합함으로써 제조된다. 부형제는 투여를 위해 바람직한 제제의 형태에 따라 매우 다양한 형태일 수 있다. 예를 들어, 경구 액상 또는 에어로솔 투여 형태의 사용에 적합한 부형제는 물, 글리콜, 오일, 알코올, 향료 성분, 보존제, 및 착색 성분을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 고형 경구 투여 형태(예를 들어, 파우더, 정제, 캅셀제 및 캐플릿)에서 사 용하기에 알맞은 부형제의 예는 전분, 설탕, 미결정 셀룰로오스, 부형제, 과립화제, 활택제, 결합제, 및 붕해제를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
투여의 편리함 때문에, 정제 및 캅셀제는 가장 유용한 경구 투여 유닛 형태이고, 이 경우 고형 부형제가 적용된다. 바람직하다면, 정제는 표준 수상 또는 비수상(nonaqueous) 기술을 이용하여 코팅될 수 있다. 그러한 투여 형태는 약학 분야의 어떠한 방법에 의해서도 제조될 수 있다. 일반적으로, 약학적 조성물 및 투여 형태는 활성 성분과 액상 운반체, 미세하게 분리된 고체 운반체, 또는 둘 모두와 균일하고 친밀하게(intimately) 혼합하고, 그 후 필요하다면 바람직한 형태로 만들기 위해 프로덕트를 모양냄으로써 제조된다.
예를 들어, 정제는 압축 또는 몰딩(molding)에 의해 제조될 수 있다. 압축 정제는 적당한 기기를 사용하여 파우더 또는 과립과 같은 유동성이 있는 형태인 활성 성분을, 선택적으로 부형제와 혼합하여 압축함으로써 제조될 수 있다. 주조 정제(molded tablet)는 적당한 기기를 사용하여 비활성의 액상 부형제로 습윤된 분말화된 혼합물을 몰딩함으로써 제조될 수 있다. 본 발명의 경구 투여 형태에서 사용될 수 있는 부형제의 예는 결합제, 충진제, 붕해제, 및 활택제를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 약학적 조성물 및 투여 형태에서의 사용에 적당한 결합제는 옥수수 전분, 감자 전분, 또는 다른 전분, 젤라틴, 아카시아와 같은 천연 및 합성 검류, 소디움 알지네이트, 알지닉 산, 다른 알지네이트, 분말 트라가칸트(powdered tragacanth), 구아 검(guar gum), 셀룰로오스 및 그의 유도체(예를 들어, 에틸 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 카복시메틸 셀룰로오스 칼슘, 소디움 카복시메 틸 셀룰로오스), 폴리비닐 파이로리돈, 메틸 셀룰로오스, 프리-젤라틴화 전분, 하이드록시프로필 메틸 셀룰로로스, (예를 들어, Nos. 2208, 2906, 2910), 미결정 셀룰로오스, 및 그들의 혼합물을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
미결정 셀룰로오스의 적절한 형태는 AVICEL-PH-101, AVICEL-PH-103, AVICEL RC-581, AVICEL-PH-105 (FMC Corporation, American Viscose Division, Avicel Sales, Marcus Hook, PA에서 상업적으로 구입 가능함)이란 명칭으로 팔리는 물질 및 그들의 혼합물을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 특정 결합제는 AVICEL RC-581이라는 명칭으로 시판되는 미결정 셀룰로오스와 소디움 카복시메틸 셀룰로오스의 혼합물이다. 적당한 무수 또는 낮은 수분 첨가제 또는 부가제는 AVICEL-PH-103TM 및 Starch 1500 LM을 포함한다.
본 명세서에서 개시된 약학적 조성물 및 투여 형태에서의 사용에 적절한 충진제의 예는 탈크, 칼슘 카보네이트(예를 들어, 과립 또는 파우더), 미결정 셀룰로오스, 분말 셀룰로오스, 덱스트레이트, 카올린, 만니톨, 실리식 산, 소르비톨, 전분, 프리-젤라틴환 전분, 및 그들의 혼합물을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물의 결합제 또는 충진제는 일반적으로 약학적 조성물 또는 투여 형태의 약 50 내지 약 99 중량 퍼센트 존재한다.
붕해제는 정제가 수성 환경에 노출되었을 때 붕해되도록 하기 위하여 본 발명의 조성물에 사용된다. 너무 많은 붕해제를 함유한 정제는 보관 중에 붕해될 수 있는 반면, 너무 적게 함유한 정제는 바람직한 조건 하에서 바람직한 속도로 붕해 되지 않는다. 따라서 활성 성분의 방출을 조절하는데 나쁘지 않도록 너무 많지도 너무 적지도 않은 충분한 붕해제의 양이 본 발명의 고형 경구 투여 형태를 형성하기 위해 사용되어야 한다. 사용된 붕해제의 양은 제제의 타입에 따라 다양하고, 본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 쉽게 판단할 수 있다. 전형적인 약학적 조성물은 약 0.5 내지 약 15 중량 퍼센트의 붕해제, 바람직하게는 약 1 내지 약 5 중량 퍼센트의 붕해제를 함유한다.
본 발명의 약학적 조성물 및 투여 형태에서 사용될 수 있는 붕해제는 아가-아가, 알지닉 산, 칼슘 카보네이트, 미결정 셀룰로오스, 크로스카멜로스 소디움, 크로스포비돈, 포라크릴린 포타시움, 소디움 전분 글리콜레이트, 감자 또는 타피오카 전분, 다른 전분, 프리-젤라틴화 전분, 다른 전분, 점토, 다른 알진, 다른 셀룰로오스, 검류, 및 그들의 혼합물을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물 및 투여 형태에서 사용될 수 있는 활택제는 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 미네랄 오일, 경(light) 미네랄 오일, 글리세린, 소르비톨, 만니톨, 폴리에틸렌 글리콜, 다른 글리콜, 스테아릭 산, 소디움 라우릴 설페이트, 탈크, 수소화 식물유(예를 들어, 땅콩 유, 면실 유, 해바라기 유, 참깨 유, 올리브 유, 옥수수 유, 및 콩 유), 진크 스테아레이트, 에틸 올레에이트, 에틸 라우레에이트, 아가, 및 그들의 혼합물을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 부가적 활택제는 예를 들어, 실로이드 실리카 (AEROSIL200, W. R. Grace Co. 제조, Baltimore, MD), 합성 실리카의 응고 에어로솔(coagulated aerosol of synthetic silica, Degussa Co. 제조, Plano, TX), CAB-O-SIL (pyrogenic silicon dioxide product, Cabot Co., Boston, MA), 및 그들의 혼합물을 포함한다. 만약 사용된다면, 활택제는 일반적으로 그것이 포함된 약학적 조성물 또는 투여 형태의 약 1 중량 퍼센트 이하의 양으로 사용된다.
본 발명의 바람직한 고체 경구 투여 형태는 본 발명의 선택적 사이토카인 억제 약물, 무수 락토스, 미결정 셀룰로오스, 폴리비닐파이로리돈, 스테아릭 산, 콜로이달 무수 실리카, 및 젤라틴을 함유한다.
본 발명의 활성 성분은 조절 방출 수단에 의해서 또는 본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려진 전달 장치에 의해서 투여될 수 있다. 예는 미국특허 제3,845,770호; 제3,916,899호; 제3,536,809호; 제3,598,123호; 및 제4,008,719호, 제5,674,533호, 제5,059,595호, 제5,591,767호, 제5,120,548호, 제5,073,543호, 제5,639,476호, 제5,354,556호, 및 제5,733,566호에 개시된 것들을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 인용문헌은 그 인용에 의하여 본 명세서에 포함된다. 그러한 투여 형태는 예를 들어 다양한 비율로 바람직한 방출 프로파일을 제공하기 위한 하이드로프로필메틸 셀룰로오스, 다른 폴리머 매트릭스들, 겔, 투과성 막, 삼투 시스템, 다층 코팅, 마이크로파티클, 리포솜, 마이크로스피어, 또는 그들의 혼합물을 사용하여 하나 또는 그 이상의 활성 성분의 느린 또는 조절-방출을 제공하기 위하여 사용될 수 있다. 본 명세서에서 개시된 것을 포함하는 본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 적절한 조절-방출 제제는 본 발명의 활성 성분에 있어 사용을 위해 쉽게 선택될 수 있다. 본 발명은 따라서 조절-방출을 위해 적합한 정제, 캅셀제, 겔캡제(gelcaps), 및 캐플릿과 같 은, 하지만 이에 한정되지 않는, 경구 투여를 위해 적당한 단일 유닛 투여 형태를 포함한다.
모든 조절-방출 약학적 조성물은 그들의 비-조절된 대응물에 의해 달성되는 약물 치료 효과를 개선하고자 하는 일반적인 목적을 가진다. 이상적으로, 의료 치료에 있어 최적으로 설계된 조절-방출 제제의 사용은 최소의 시간 내에 상태를 치료 또는 조절하도록 채택된 최소 약물 물질에 의해 특징져진다. 조절-방출 제제의 이점은 약물의 확장된 활성, 감소된 투여 주기, 및 증가된 환자의 복약순응도를 포함한다. 부가적으로, 조절-방출 제제는 작용의 개시 시기 또는 약물의 혈중 레벨과 같은 다른 특성을 조절하기 위해 사용될 수 있고, 따라서 부가 반응(예를 들어, 부작용)의 발생에 영향을 미칠 수 있다.
대부분의 조절-방출 제제는 초기에 바람직한 치료 효과를 즉시 나타낼 수 있는 약물(활성 성분)의 양을 방출하고, 점차적으로 연속하여 확장된 시기 동안 치료적 또는 예방적 효과의 레벨을 유지하기 위한 약물의 다른 양을 방출하도록 설계된다. 체내에서 이러한 일정한 약물 레벨을 유기하기 위해서, 약물은 투여 형태로부터 체내에서 배출 및 대사되는 약물의 양을 대체하는 속도로 방출되어야 한다. 활성 성분의 조절-방출은 pH, 온도, 효소, 수분, 또는 다른 생리적인 조건 또는 화합물을 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 다양한 조건에 의해 촉진될 수 있다.
비경구적 투여 형태는 환자에게 피하, 정맥(볼루스 주입을 포함), 근육내, 및 동맥내 경로를 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 그러한 투여는 일반적으로 오염원에 대한 환자의 자연적 방어를 우 회할 수 있기 때문에, 비경구적 투여 형태는 바람직하게는 멸균 또는 환자에게 투여 전에 멸균될 수 있어야 한다. 비경구적 투여 형태의 예는 주사용 용액, 주사를 위한 약학적으로 허용 가능한 비히클로 용이하게 용해 또는 현탁될 수 있는 건조 프로덕트, 주사용 현탁액, 및 유제를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 비경구적 투여 형태를 제공하기 위해 사용될 수 있는 적당한 비히클은 본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있다. 예는 USP 주사용 증류수; 소디움 클로라이드 주사액, 링거 주사액, 덱스트로스 주사액, 덱스트로스 및 소디움 클로라이드 주사액, 및 락테이티드 링거 주사액과 같은, 하지만 이에 한정되지 않는, 수성 비히클; 에틸 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 및 폴리프로필렌 글리콜과 같은, 하지만 이에 한정되지 않는, 물-혼화성 비히클; 옥수수 유, 면실 유, 땅콩 유, 참깨 유, 에틸 올레에이트, 이소프로필 미리스테이트, 및 벤질 벤조에이트와 같은, 하지만 이에 한정되지 않는, 비-수상 비히클을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 개시된 하나 이상의 활성 성분의 용해도를 증가시킬 수 있는 화합물 또한 본 발명의 비경구적 투여 형태에 포함될 수 있다. 예를 들어, 사이클로덱스트린 및 그 유도체는 본 발명의 선택적 사이토카인 억제 약물 및 그의 유도체의 용해도를 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국특허 제5,134,127호 참조. 상기 문헌은 인용에 의하여 본 명세서에 포함된다.
본 발명의 국소 및 점막 투여 형태는 스프레이, 에어로솔, 용액, 유제, 서스펜션, 아이 드랍 또는 다른 안과 제제, 또는 본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식 을 가진 자에게 알려진 다른 형태를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th and 18th eds., Mack Publishing, Easton PA (1980 & 1990); 및 Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 4th ed., Lea & Febiger, Philadelphia (1985) 참조. 구강 내 점막 조직을 치료하기 위해 적당한 투여 형태는 양치질 약(mouthwash) 또는 경구 겔제로 제제화될 수 있다.
본 발명에 의해 포함되는 국소 및 점막 투여 형태를 제공하기 위해 사용될 수 있는 적당한 첨가제(예를 들어, 운반체 및 부형제) 및 다른 물질들은 약학 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있고, 주어진 약학적 조성물 또는 투여 형태가 적용될 특정 조직에 의존한다. 상기 사실을 염두에 두고, 용액, 유제 또는 겔제를 형성하기 위한 전형적인 첨가제는 물, 아세톤, 에탄올, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 부탄-1,3-디올, 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 미네랄 오일 및 이들의 혼합물을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니며, 이들은 비-독성이고 약학적으로 허용 가능하다. 가습제(moisturizer) 또는 습윤제(humectant) 또한 바람직하다면 약학적 조성물 및 투여 형태에 첨가될 수 있다. 그러한 부가적 성분의 예는 본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th and 18th eds., Mack Publishing, Easton PA (1980 & 1990) 참조.
약학적 조성물 또는 투여 형태의 pH 또한 하나 이상의 활성 성분의 전달을 개선하기 위하여 조정될 수 있다. 유사하게, 용매 운반체의 극성, 그의 이온 강도, 또는 삼투압도 전달을 개선하기 위하여 조절될 수 있다. 스테아레이트와 같은 화합물이 전달을 개선하기 위하여 하나 이상의 활성 성분의 친수성 또는 친유성을 이롭게 조정하기 위하여 약학적 조성물 또는 투여 형태에 첨가될 수 있다. 이러한 관점에서, 스테아레이트는 제제화를 위한 지질 비히클로써, 유화제로써 또는 계면활성화제로써, 및 전달-촉진 또는 침투-촉진 성분으로써 사용될 수 있다. 활성 성분의 다른 염, 수화물 또는 용매화물이 생성되는 조성물의 물성을 더 조절하기 위하여 사용될 수 있다.
이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
실시예 1: MTT assay
청각세포인 HEI-OC1를 대상으로 MTT assay를 시행하였다. 96well plate에 청각세포주를 well당 2x103cells로 seeding을 한 뒤 37℃, 5% CO2 incubator에서 2일간 배양하였다. H31을 0, 5, 10, 20, 40, 80, 100, 150, 200μM로 각 sample당 5번의 실험이 되도록 한 뒤 incubator에서 16시간 배양하였다. Well당 1mg/ml의 MTT solution으로 처리한 뒤 4시간 incubator에서 배양한 뒤 well당 100㎕ DMSO로 formazan을 용해시킨뒤, 540nm에서 용해된 formazan의 optical density를 측정하였다.
실시예 2: DNA fragmentation Analysis
ApopLadder EXTM DNA fragmentation kit (TaKaRa, Korea)를 사용하여 apoptosis에 의한 DNA fragmentation을 확인하였다. 60 mm dish에 3×105 cell을 seeding하여 배양한 뒤 24시간동안 starvation 시킨 후 조건별로 약물을 처리하여 24시간 배양하였다. 배양액을 제거하고 PBS로 2회 세척 후 lysis buffer 100 ㎕를 첨가하여 12,000 xg에서 5분간 원심분리하였다. 새로운 tube에 상등액을 수거하고 SDS solution 10 ㎕를 넣어 56℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 다시 enzyme B 10 ㎕를 넣어 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, precipitation colution을 첨가하여 DNA를 추출하였다. DNA를 Tris-EDTA solution에 녹인 후, etidium bromide가 포함된 2% agarose gel에 전기영동을 하여 관찰하였다.
실시예 3: TUNEL Assay
TUNEL 방법을 사용한 in situ cell death detection kit, POD(Roche, Germany)를 이용하여 에피카테킨을 처리한 HEI-OC1의 apoptosis를 확인하였다. 6-well에 3×105 cell을 seeding하여 배양한 뒤 24시간동안 starvation 시킨 후 조건별로 약물을 처리하여 24시간 배양하였다. 4% paraformaldehyde를 첨가하여 상온에서 30분간 고정한 후, PBS로 2회 세척하고, 0.1% Triton X-100이 포함된 permeablilization 용액을 상온에서 10분간 처리하였다. PBS로 다시 2회 세척한 후 terminal deoxynucleotidyl transferase (TDT)와 nucleotide mixture를 첨가하고 37℃에서 빛을 차단한 후 1시간 배양하였다. PBS로 2회 세척하고 난 후, 형광 현미경하에서 세포의 apotosis를 조사하였다. apotosis가 일어나지 않은 세포의 대조 염색을 위하여 4, 6-diamino -2-phenylindole (DAPI, sigma) 용액을 이용하였다.
실시예 4: Annexin V- FITC 로 FACScan
Annexin V-FITC Apoptosis Detection kit I (BD Biosciences, San Diego, CA)를 이용하여 apoptosis 정도를 분석하였다. 60 mm dish에 3×105 cell을 seeding하여 배양한 뒤 24시간 동안 starvation 시킨 후 조건별로 약물을 처리하여 24시간 배양하였다. 배양액을 제거하고 PBS로 2회 세척 후 binding buffer에 세포수가 1×106 cells/ml이 되도록 부유시킨 후 이 용액 100 ㎕를 5 ml tube로 옮기고 5 ㎕의 Annexin V-FITC를 tube에 첨가한 후 잘 혼합하여 약 15분간 암처에서 반응시켰다. 이후 400 ㎕의 binding buffer를 첨가한 후 Becton Dicki nson FACSscan (Lysis II Ver. 1.0)에서 10,000개 이상이 될 때까지 세포를 측정하였으며 FACScan 유세포계측기 (flowcytometry)의 판독결과를 Annexin V-FITC의 발현유무에 따라 apoptosis 정도를 측정하였다. 또한 형광현미경하에서 세포의 apoptosis 정도를 측정하였다.
실시예 5: RT- PCR
청각 세포주 1ml의 TRIzol(GIBCOBRL, Grand Island, NY, USA) 시약에 균질화시킨 후, 총 RNA를 추출하였다. 청각세포주에서 추출된 총 RNA 2㎍을 각각Omniscript Reverse Transcriptase kit(20511, Qiagen Germany)의 반응혼합물 10X Buffer RT 2.0㎕, dNTP Mix(5mM each dNTP) 2.0㎕, Oligo-dT primer(10μM) 2.0㎕, RNase inhibitor(10units/μl) 1.0㎕, Omniscript Reverse Transcriptase 2units, RNase-free water 20㎕에 넣고 37℃에서 60분, 94℃에서 5분간 역전사하여 cDNA를 합성하였다. PCR은 MinicyclerTM(MJ research, USA)를 사용하였고 합성된 cDNA를 Taq DNA polymerase 1 unit(Roche Diagnostics Co, Indianapolis, USA)과 각각의 primer를 넣어 증폭시켰다.
PCR과정은 초기변성을 96℃에서 3분간 실시한 후 96℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초간을 총 30 cycles을 실시하고 신전(extension)은 72℃에서 5분간 시행하였다.
RT-PCR에 사용한 primer는 다음과 같다.
상기 표 1에서 괄호 안에 표시된 숫자는 서열번호를 나타낸다.
실시예 6: Western Blotting
청각 세포주를 phosphate buffered saline (PBS)으로 세척한 다음 단백질분해 억제제(100㎍/㎖ phenylmethylsulfonyl fluoride, 1㎍/㎖ leupeptin)가 첨가된 RIPA(RadioImmunoPrecipitation) buffer 1㎖ 150mM NaCl, 1% NP-40, 50 mM Tris(pH 8.0), 1 mM EDTA, 0.5% Deoxycholate에 넣고 균질화 하였다. 이 균질액을 15,000 rpm에서 10분간 원심분리 후 상층액을 Western blot analysis에 이용하였는데 단백질의 양은 Bio-Rad protein assay (Bio-Rad, Hercules, CA USA)를 이용하여 측정하였다. Well 당 20㎍의 단백질을 분리하기 위해 sodium dodesyl sulfate (SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)를 사용하여 분리한 후 nitrocellulose filter (Amersham, Arlington Heights, IL. USA)에 옮긴 다음 4℃에서 하루 밤 동안 항 c-Met항체를 반응시켰다. 다음날 filter를 0.1% Tween-20이 함유된 Tris buffered saline(TBS) 용액으로 세척한 후 peroxidase-conjugated donkey anti-rabbit antibody (Amersham)와 donkey anti-mouse antibody (Amersham)로 각각 반응시킨 후 enhanced chemiluminescence detection system (ECL, Amersham)을 이용하여 X-ray film으로 확인하였다.
실시예 7: Neuromast Evaluation - in vivo zebrafish model
zebra fish( Danio rerio )의 embryo(dfp 4)에 Danieu's Solution에 희석한 cisplatin을 농도별(0, 25, 50, 75, 100 uM)로 처리하여 에피카테킨의 효과를 보기위해서 에피카테킨을 농도별(50, 100, 150, 200 uM)로 처리한 후 1시간 동안 28.5℃ incubator에서 배양 한 다음, 신선한 0.3 X Danieu's Soltion으로 3번 씻어 주고, 3 시간 동안 28.5℃에서 배양하였고 4일째 된 larvae를 fluorescent vital dye인 Yo - pro 1( Molecular probe, USA ) 2uM 의 농도로 30분 ~ 1시간 염색시킨 후, 재빨리 0.3 X Danieu's Soltion로 씻어주었다. 염색된 zebra fish를 MS222( 3-aminobenzoic acid ethyl ester, methanesulfonate salt, Sigma )에 8ug/ml의 농도로 마취하여 고정한 뒤 고정된 zebra fish를 슬라이드 글라스에 올려 물기를 제거한 후 형광현미경을 사용하여 사진을 찍었다.
상기 실시예의 결과는 다음과 같다.
(1) 녹차추출물의 분획중 하나인
에피카테킨(epicatechin)의
구조식
녹차에서 확인되는 카테킨은 크게 네 가지로 (-)-epigallocatechin-3-gallate(EGCG), (-)-epicatechin(EC), (-)-epigallocatechin(EGC) 와 (-)-epicatechiin-3-gallate(ECG)로 구성되어 있다. 이중 EGCG가 가장 큰 비중(60%)정도를 차지하고 가장 강력하고 주된 polyphenol로 알려져 있으며 EC가 가장 적은 분획을(10%이하) 차지하는 것으로 알려져 있다. 도 1은 본 연구에서 항암 방사선치료시에 청각보호효과를 보이는 물질인 에피카테킨의 구조식이다.
(2) 항암제인
cisplatin
에 의해 유도되는 청각세포사멸을 억제하는
에피카테킨의
효능을
MTT
assay
를 통해 분석
청각세포에 cisplatin을 농도에 따라 처리하였을 때 농도에 따라 청각세포의 세포사멸이 증가되는 것을 확인할 수 있었고 청각세포의 사멸은 100 uM 정도까지는 급속한 세포사멸을 이루다가 이후 cisplatin의 농도에 따라 완만한 세포사멸을 나타냈다.(도 2a)
청각세포에 에피카테킨을 처리하였을 때 에피카테킨의 용량이 증가함에 따라 청각세포의 증식이 유도되는 것을 MTT assay로 확인한 결과와 청각세포의 세포사멸을 유도하는 대표적인 항암제인 cisplatin에 의해 유도되는 청각세포사멸을 에피카테킨에 의해 효과적으로 억제하는 것을 보여주는 결과로 에피카테킨의 용량이 증가함에 따라 청각세포의 사멸을 효과적으로 억제할 수 있었으며 효과적인 세포사멸 억제용량범위는 40 uM에서 200 uM까지로 나타났고 200 uM이 넘는 범위에서는 더 이상의 추가적인 보호효과가 나타나지는 않았다.(도 2b)
도 2b는 에피카테킨을 처리하지 않은 0 ml에 대한 에피처리에 따른 증가율을 표시한 것이다. 따라서 에피카테킨만 처리한 그래프는 에피카테킨과 시스플라틴 같이 처리한 군과 비교의 대상은 아니다. 즉 각각의 그래프의 0 ml에 대한 상대적인 생존율인 것이다. 본 발명의 바람직한 처리 범위선정은 MTT assay에서 보여준 것처럼 에피카테킨이 200 uM을 초과하면서 plateu를 형성한다고 보았고 에피카테킨+시스플라틴에서는 계속 상승하는 것으로 보이지만 실제 약물로서 이 이상의 고용량은 의미없다고 판단되어 200uM을 범위로 결정하였고 40uM 이상부터 MTT에서 의미가 있다고 판단하여 이와 같이 정하였다.
(3) 방사선에 의해 유도되는 청각세포사멸을 억제하는
에피카테킨의
효능을
MTT
assay를 통해 분석
청각세포에 세포사멸을 유도하는 것으로 알려진 방사선을 0, 8, 12, 18, 24, 30, 36 Gy 처리하여 방사선에 으해 유도되는 청각세포사멸을 MTT assay로 측정하였고 방사선 조사량이 증가함에 따라 청각세포의 사멸이 증가함을 알 수 있었다. (도 3)
(4) 항암 방사선 동시투여시 청각세포의 사멸을 억제하는
에피카테킨의
효능을
MTT
assay을 통해 분석
항암제인 cisplatin 50 uM과 방사선 조사(10, 20 Gy)를 함께 시행한 경우에도 에피카테킨의 용량이 증가함에 따라 청각세포의 사멸이 억제되는 것을 확인할 수 있었으며 에피카테킨의 보호효과는 40 uM에서 200 uM까지 에피카테킨의 농도에 비례하여 증가되었다. (도4a)
항암방사선을 함께 처리한 실험에서 cisplatin 50 uM과 방사선 20 Gy처리했을때 청각유모세포의 85%이상이 세포사멸이 되나 에피카테킨 투여시 청각세포사멸이 30%이하로 감소되는 결과를 확인할 수 있어 항암방사선 동시투여시에 에피카테킨의 청각세포사멸억제 기능이 탁월함을 알 수 있었다. (도 4b)
(5)
cisplatin
에 의한 청각세포사멸을 억제하는
에피카테킨의
효능을
TUNEL
assay로 분석
cisplatin에 의해 유도되는 청각세포사멸현상을 관찰하기 위해 cisplatin 50 uM을 청각세포에 처리하고 에피카테킨의 효과가 가장 좋았던 농도인 200 uM 처리전후의 청각세포의 세포사멸 억제현상을 관찰한 결과 cisplatin에 의해 유도되는 세포사멸이 에피카테킨에 의해 효과적으로 억제되는 것을 확인할 수 있었다.(도 5 a)
(6) 방사선조사에 의한 청각세포사멸을 억제하는
에피카테킨의
효능을
TUNEL
assay로 분석
방사선조사에 의해 유도되는 청각세포사멸현상을 관찰하기 위해 방사선조사 20 Gy을 청각세포에 처리하고 에피카테킨의 효과가 가장 좋았던 농도인 200 uM 처리전후의 청각세포의 세포사멸 억제현상을 관찰한 결과 방사선 조사에 의해 유도되는 세포사멸이 에피카테킨에 의해 효과적으로 억제되는 것을 확인할 수 있었다.(도 5 b)
(7)
cisplatin
에 의한 청각세포사멸을 억제하는
에피카테킨의
효능을
FACS
로 분석
cisplatin에 의해 유도되는 청각세포사멸현상을 관찰하기 위해 cisplatin 50 uM을 청각세포에 처리하고 에피카테킨의 효과가 가장 좋았던 농도인 200 uM 처리전후의 청각세포의 세포사멸 억제현상을 관찰한 결과 cisplatin에 의해 유도되는 세포사멸(조기와 후기)이 에피카테킨 처리시 감소하는 것을 알 수 있었다.(도 6a)
(8) 방사선조사에 의한 청각세포사멸을 억제하는
에피카테킨의
효능을
FACS
로 분석
방사선조사에 의해 유도되는 청각세포사멸현상을 관찰하기 위해 방사선조사 20 Gy을 청각세포에 처리하고 에피카테킨의 효과가 가장 좋았던 농도인 200 uM 처리전후의 청각세포의 세포사멸 억제현상을 관찰한 결과 cisplatin에 의해 유도되는 세포사멸이 에피카테킨 처리시 감소하는 것을 알 수 있었다.(도 6b)
(9)
cisplatin
이 유도하는 청각세포사멸에 대한
에피카테킨의
zebrafish
in
vivo
결과
zebrafish을 이용한 in vivo실험을 시행하여, 부화된지 4일째 zebrafish에 청각유모세포를 포함한 감각신경계인 neuromast을 YO - PRO 1으로 염색한 사진으로 cisplatin에 의해 소실되었던 청각유모세포를 포함한 neuromast가 에피카테킨에 의해 효과적으로 보호되는 현상을 확인할 수 있었다. 청각세포의 감소는 cisplatin 의 초기용량에서부터 나타나 cisplatin 50 uM에서는 청각세포의 70%이상이 감소하고, 100 uM에서는 청각세포가 거의 모두 소실되는 소견을 보였다. 이러한 이독성과 신경독성은 에피카테킨에 의해 효과가 나타났으며 에피카테킨의 저농도에서는 효과가 약했으나 100 uM 이후 청각과 신경보호효과가 급격히 좋아지는 양상을 보였고, 200 uM에서 가장 효과가 좋았다. 이러한 에피카테킨의 청각 및 신경보호효과는 청각과 신경보호효과가 있다고 알려진 토코페놀(tocoperol)과 은행잎추출물(Gingko)에 비해 우수한 것으로 판명되었다.(도 7a)
(10) 방사선조사가 유도하는 청각세포사멸에 대한
에피카테킨의
zebrafish
in
vivo
결과
zebrafish을 이용한 in vivo실험을 시행하여, 부화된지 4일째 zebrafish에 청각유모세포를 포함한 감각신경계인 neuromast을 YO - PRO 1으로 염색한 사진으로 방사선에 의해 소실되거나 발현은 되나 형태학적 변형이 관찰되는 청각유모세포를 포함한 neuromast가 에피카테킨에 의해 효과적으로 보호되는 현상을 확인할 수 있었다. 청각세포의 감소와 변형은 방사선조사의 초기부터 나타나 방사선 10 Gy 부터는 청각세포의 감소와 변형이 일어나고, 20 Gy에서는 청각세포와 neuromast가 1/3정도 감소되며 확대사진에서 청각세포와 neuromast가 응축되면서 작아지고 변연이 불규칙한 형태로 변형되는 것이 잘 관찰되었다. 이러한 청각세포 및 neuromast의 소실과 변형은 에피카테킨에 의해 효과적으로 보호되었으며, 에피카테킨의 저농도에서는 효과가 약했으나 100 uM 이후 청각과 신경보호효과가 급격히 좋아지는 양상을 보였고, 200 uM에서 가장 효과가 좋았다.(도 7b)
도 7은 EC의 용량에 따른 결과를 보여주는 사진들이다. 방사선 처리시에는 일단 시스플란틴에서 얻은 결과를 기초로 해서 EC을 200에 고정하고 방사선 조사를 변화해서 관찰한 실험이다.
(11)
cisplatin
에 대한
에피카테킨의
청각세포사멸
조절기전분석
cisplatin의 농도에 따른 청각세포사멸기전에 관여하는 Bax, Apaf1, Caspase 3, Caspase 9을 RT-PCR로 분석한 결과 Bax, Apaf1, Caspase 3의 발현은 cisplatin의 증가에 따라 증가되는 것을 확인하였고, JNK, P53, Bcl-2, Bax, cytochrome C, caspase 3 변화를 Western Blot으로 측정한 결과 phosph-JNK, phospho-p53, cleaved caspase 3의 발현이 cisplatin의 양이 증가함에 따라 증가하는 것을 확인할 수 있었다. (도 8a)
Western Blot을 통해 cisplatin 20μM과 에피카테킨 200μM을 처리한 뒤 3, 6, 9, 12, 24시간에 따라 Caspase와 c-jun에 대한 변화를 측정한 결과 에피카테킨 처리시 세포사멸시 증가되는 cleaved Caspase 3와 c-jun이 감소하는 것으로 나타났다. (도 8b)