JP5833438B2 - レドックス関連因子発現促進剤 - Google Patents

Description

本発明は、ケンフェロール、クエルセチン若しくはこれらの配糖体又はこれらの組み合わせを有効成分として含んで成るレドックス関連因子発現促進剤、ならびにイチョウ葉抽出物、サンナ抽出物又はこれらの組み合わせを有効成分として含んで成るレドックス関連因子発現促進剤に関する。

生体は、その生存維持、恒常性維持のため、レドックス調節を行っている。生体内のレドックス調節は、主に細胞内のタンパク質に存在するシステイン残基上のチオール基の可逆的な酸化還元反応に基づいており、様々な細胞機能を制御している。レドックス調節に関わる因子（レドックス関連因子）は、細胞内を還元状態に保ち、細胞の生存に必須の役割を果たす一方で、生体内の活性酸素種の消去においても重要な役割を果たすことが知られている。かかるレドックス関連因子が正常に機能しない場合、生体内の活性酸素種が過剰に産生し、過度の酸化ストレスに曝されることになる。このような過度の酸化ストレスは、ＤＮＡやタンパク質、脂質の生体高分子を酸化することによってこれらに傷害を与え、様々な疾患や老化の原因となるものと考えられている。このため、近年、酸化ストレスをもたらす活性酸素種の消去系として作用するレドックス関連因子の研究が盛んに行われている。

生体の酸化ストレスに対する防御機構として働くレドックス関連因子としては、グルタチオン系が知られている。グルタチオンは哺乳動物に存在するトリペプチドであり、分子内のチオール基による還元作用、補酵素としての作用、メルカプツール酸の生成及びその他の解毒機構への関与、チオール酵素又はその他の細胞成分の保護作用、有害物の排泄作用促進、コリンエステラーゼの活性を高めることによる抗アレルギー作用、酵素賦活作用を有することが報告されている。しかしながら、グルタチオンは製剤中で沈殿を生じ、また多くの細胞においてグルタチオンを取り込むことができないため、細胞内においてグルタチオンの産生を促進させるための成分は極めて有用となり得る。このような成分としてはこれまでにγ−トコフェロール又はδ−トコフェロールが報告されており、これらの成分を含有するグルタチオン産生促進剤が開示されている（特開2007-284430（特許文献１））。

また、ほかのレドックス関連因子としてはチオレドキシン系が知られており、チオレドキシン系もまた生体における酸化ストレスに対する防御機構として働く（細胞工学Vol.25、No.2、2006、p143-148（非特許文献１））。また、チオレドキシンのトランスジェニックマウスは長寿になること（Mitsui A, et al: Antioxid Redox Signal (2002) 4: 693-696（非特許文献２））、ならびにチオレドキシンは脳梗塞、糖尿病への抵抗性を有すること（Takagi Y, et al: Proc Natl Acad Sci USA(1999) 96:4131-4136（非特許文献３）, Hotta M, et al: J Exp Med (1998) 188:1445-1451（非特許文献４））やアレルギー性皮膚炎に有効であること（特開2007-269671（特許文献２））が報告されており、チオレドキシンは活性酸素消去剤として幅広く使用されている（特開平9-157153（特許文献３））。しかしながら、チオレドキシン系は高分子タンパク質であるため、これらの化合物を対象に直接投与したとしても、これらの分子を細胞内に取り込むことができない。このため、生体内においてチオレドキシン系の発現を促進させることが望ましいが、これらの発現を促進する成分としては、これまでにヨモギ抽出物又は青ジソ抽出物が知られているだけである（国際公開番号WO2006/033351（特許文献４））。

上述のとおり、グルタチオン系やチオレドキシン系といったレドックス関連因子を生体に直接投与したとしても細胞内に効率よく取り込むことができないため、生体内においてレドックス調節機能や抗酸化機能を発揮できないおそれがある。これらのレドックス関連因子の発現は、紫外線照射ストレスによって亢進されることが知られているが、生体に安全かつ有効に作用する化学物質についてはこれまでほとんど知られておらず、生体内におけるレドックス関連因子の発現機序についても詳しくは解明されていない。したがって、生体内においてレドックス関連因子の発現を促進するための安全かつ有効な成分の発見が依然として期待されている。

特開２００７−２８４４３０ 特開２００７−２６９６７１ 特開平９−１５７１５３ 国際公開番号ＷＯ２００６／０３３３５１

細胞工学Vol.25、No.2、2006、p143-148 Mitsui A, et al: Antioxid Redox Signal (2002) 4: 693-696 Takagi Y, et al: Proc Natl Acad Sci USA(1999) 96:4131-4136 Hotta M, et al: J Exp Med (1998) 188:1445-1451

本発明は、生体内においてレドックス関連因子の発現を促進することにより、安全かつ効率的に生体の酸化ストレスを減少させ、健康を維持し、また酸化ストレスに起因する様々な疾患及び症状を防ぐことを課題とする。

本発明者らはこのたび、生体内におけるレッドクス関連因子としてグルタチオン系及びチオレドキシン系の発現及び活性を亢進する成分として、フラボノール類に属するケンフェロール及びクエルセチンを見出した。意外なことに、かかる作用はフラボノール類の中でもケンフェロールとクエルセチンに特異的なものであり、構造が類似するミリセチンには認められなかった。グルタチオン系やチオレドキシン系の分子を直接適用する場合と比較して、ケンフェロールやクエルセチンの適用は生体内のグルタチオン系やチオレドキシン系といったレッドクス関連因子の発現及び活性を有効に促進することが可能となるため、本発明により、生体内の多種多様な酸化ストレスをより強力に軽減することができる。ケンフェロールやクエルセチンといったフラボノール類は茶葉の植物に広く分布しており、生体にとって無毒であり安全に摂取することができる。このように、ケンフェロール及びクエルセチンを生体内におけるレッドクス関連因子の発現を促進するための有効成分とすることによって、適用される生体にストレスを与えることなく、生体内の過剰な活性酸素種を消去することが可能となる。

したがって、本願は以下の発明を包含する：
［１］ ケンフェロール、クエルセチン若しくはこれらの配糖体又はこれらの組み合わせを有効成分として含んで成る、レドックス関連因子発現促進剤。
［２］ 前記レドックス関連因子が、チオレドキシン、チオレドキシンレダクターゼ、グルタチオンレダクターゼ及びグルタレドキンから成る群から選択される１又は複数の物質であることを特徴とする、［１］に記載のレドックス関連因子発現促進剤。
［３］ イチョウ葉抽出物、サンナ抽出物又はこれらの組み合わせを有効成分として含んで成る、レドックス関連因子発現促進剤。
［４］ 前記レドックス関連因子が、チオレドキシン、チオレドキシンレダクターゼ、グルタチオンレダクターゼ及びグルタレドキンから成る群から選択される１又は複数の物質であることを特徴とする、［３］に記載のレドックス関連因子発現促進剤。
［５］ レドックス関連因子発現促進剤を調製するための、ケンフェロール、クエルセチン若しくはこれらの配糖体又はこれらの組み合わせの使用。
［６］ レドックス関連因子発現促進剤を調製するための、イチョウ葉抽出物、サンナ抽出物又はこれらの組み合わせの使用。

生体内におけるレドックス関連因子の発現を促進することにより、安全かつ効率的に生体内の活性酸素種を減少させ、酸化ストレスから生体を防御することができる。これにより生体の健康を維持し、また酸化ストレスに起因する様々な疾患及び症状を防ぐことが可能となる。

ケンフェロールによる生体内におけるレドックス発現因子の発現の亢進を示す図である。 ケンフェロールによる皮膚等価モデルにおけるレドックス関連因子の発現の亢進を示す図である。 フラボノイド化合物によるチオレドキシン系の発現の亢進作用における比較を示す図である。 イチョウ葉抽出液及びサンナ抽出液によるチオレドキシンレダクターゼの発現の亢進を示す図である。 ケンフェロール及びクエルセチンによるチオレドキシンレダクターゼの活性促進効果を示す図である。 ケンフェロール、ならびにイチョウ葉抽出液及びサンナ抽出液による炎症性サイトカイン（ＩＬ１β）の産生を抑制する効果を示す図である。

本発明の１実施態様において、ケンフェロール、クエルセチン若しくはこれらの配糖体又はこれらの組み合わせを有効成分として含んで成るレドックス関連因子発現促進剤が供される。

本明細書において「レドックス関連因子」は、生体、例えば哺乳類、好ましくは人間の体内に存在するタンパク質のシステイン残基のチオール基と酸化的又は還元的に反応し、細胞内を還元状態に保つ因子のことを意味する。細胞の活性化や情報伝達物質のプロセシング、すなわちシグナル伝達機構においては、特に細胞内のタンパク質に存在するシステイン残基上のチオール基の酸化によるタンパク質−タンパク質間の相互作用における修飾が重要な役割を果たしているものと考えられている。このシステイン残基上のチオール基の酸化・還元（レドックス）は、遺伝子の転写、タンパク質の細胞内局在、合成、分解の調節、ならびに細胞の増殖や細胞死等の様々な生命現象の調節に関与している。このような生体内におけるレドックスに関連する系としては、グルタチオン系及びチオレドキシン系が知られており、これらはそれぞれ一群の分子によって構成される。これらのレドックス関連因子は、生体内で発生する及び存在する活性酸素種の消去にも関与することが知られている。

チオレドキシン系は、特にチオレドキシンとチオレドキシンレダクターゼ等の因子から構成される。チオレドキシン（ＴＲＸ）は、大腸菌のＤＮＡ合成に必須な酵素であるリボヌクレオチドレダクターゼに水素を供与する補酵素として発見された。ＴＲＸは原核生物やヒトの多様な生体で保存されている約１２ｋＤａのタンパク質であり、４つのβストランドと３つのαへリックスから成る立体構造を持ち、−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−という活性部位を有している。ＴＲＸはその活性部位の２つのシステイン残基の間でジスルフィド結合を作る酸化型（Ｓ−Ｓ）と、還元型（−ＳＨ，ＳＨ−）が存在し、還元型は基質タンパク質のジスルフィド結合を還元し、自ら酸化型となる。酸化型ＴＲＸは、ＮＡＤＰＨとチオレドキシンダクターゼにより還元され、還元型に再生される。基質タンパク質のひとつとして、ペルオキシレドキシンと総称されるH₂O₂消去酵素ファミリーが知られている。還元型ペルオキシレドキシンがH₂O₂を還元する。そして、酸化型となったペルオキシレドキシンが基質となりチオレドキシンにより還元される。酸化型となったチオレドキシンはチオレドキシンレダクターゼにより還元される。このような活性酸素種の無毒化システムにチオレドキシン系は重要な役割を果たしている。

グルタチオン系は、特にグルタチオン、グルタチオンレダクターゼ及びグルタレドキシン等の因子から構成される。グルタチオンは、グルタミン酸、システイン及びグリシンから成るトリペプチドであり、非タンパク質性のチオール成分として細胞内に多量に存在しており、細胞内の親水性区画における主要な抗酸化物質として知られている。グルタチオンは、活性酸素種（例えばスーパーオキシド又は過酸化水素）と反応して安定なグルタチオンラジカルを形成し、２量体（ＧＳＳＧ：酸化型グルタチオン）に変化するが、これはさらにグルタチオンレダクターゼがＮＡＤＰＨからの電子をＧＳＳＧに転移して、ＧＳＨ（還元型グルタチオン）に再生される。グルタレドキシン（ＧＲＸ）は、チオレドキシンと共通した−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−という活性部位を有しており、チオレドキシンとの共通性からチオレドキシンスーパーファミリーと呼ばれる。その活性部位の２つのシステイン残基の間でジスルフィド結合を作る酸化型（Ｓ−Ｓ）と、還元型（−ＳＨ，ＳＨ−）が存在する。チオレドキシンと同様に、還元型は基質タンパク質のジスルフィド結合を還元し、自ら酸化型となる。その生物活性に関しては不明な点も多いが、生体内のレドックス調節や酸化ストレス応答に関与することが知られている。

このように、チオレドキシン、チオレドキシンレダクターゼ、グルタチオンレダクターゼ及びグルタレドキンといったレドックス関連因子を活性化し、あるいはその発現を促進することによって、生体内の過剰な活性酸素種を減少し、酸化ストレスから生体を防御することができる。

上述のとおり、本発明者らはこのたび、ケンフェロール及びクエルセチンが上記レドックス関連因子を活性化し、そしてその発現を促進するという驚くべき知見を得た。ケンフェロール及びクエルセチンを含むフラボノール類は、以下に示される一般式：

を有し、これらは植物中に広く分布しているフラボノイド化合物の１つである。これらのフラボノール類は、抗酸化作用を有することが知られており、またこれらのフラボノール類は血管強化作用や抗炎症作用を有することも報告されている。しかしながら、これまでにフラボノール類が生体内におけるレドックス関連因子の発現を促進することについては知られておらず、またその化学構造が極めて近似するこれらのフラボノール類の中で、ケンフェロール及びクエルセチンのみがレドックス関連因子の発現を特異的に促進することは極めて意外である。かかる知見から、ケンフェロール及びクエルセチンがレドックス関連因子の発現を促進するための活性成分として極めて有用であることは明らかである。

また、フラボノール類が様々な配糖体を形成することは周知であり、本発明のレドックス関連因子発現促進剤においても、ケンフェロール及びクエルセチンの配糖体を活性成分として使用できる。本発明においてこれらと配糖体を形成する糖は、制限されることなく、アルドースとして、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、フコース、ラムノース、アラビノース、キシロース、及びケトースとして、例えばフルクトースが挙げられる。

上述のとおりケンフェロール、クエルセチン及びこれらの配糖体は植物に広く分布している成分であることから、これらの成分を含む植物抽出物もまた生体内におけるレドックス関連因子の発現を促進するために有用である。本発明者らは、植物抽出物の中でも、特にイチョウ葉抽出物及びサンナ抽出物が生体内レドックス関連因子の発現を顕著に促進することを見出した。したがって、本発明のほかの実施態様においては、イチョウ葉抽出物、サンナ抽出物又はこれらの組み合わせを有効成分として含んで成るレドックス関連因子発現促進剤が供される。

本発明のレドックス関連因子発現促進剤に有効成分として使用されるケンフェロール、クエルセチン若しくはこれらの配糖体又はこれらの組み合わせの配合量は特に限定されないが、0.00001〜0.5質量％、好ましくは0.0001〜0.001質量％、そして最も好ましくは0.0001質量％〜0.0005質量％程度である。また、本発明のレドックス関連因子発現促進剤に有効成分として使用されるイチョウ葉抽出物、サンナ抽出物又はこれらの組み合わせの配合量は抽出物乾燥残分に換算して、例えば0.00001〜0.5質量％、好ましくは0.0001〜0.1質量％、そして最も好ましくは0.0001〜0.01質量％程度である。

本発明において、上記有効成分はこれらを含有するレドックス関連因子発現促進剤として経口的又は非経口的に投与することでき、これは例えば経口用組成物又は外用組成物として調製することが可能である。また、本発明のレドックス関連因子発現促進剤によって生体の健康を維持し、また酸化ストレスに起因する様々な疾患及び症状を防ぐことが可能である。このような疾患及び症状としては、制限されることなく、癌、糖尿病、自己免疫疾患、例えば関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、抗リン脂質抗体症候群、皮膚筋炎、全身性皮膚硬化症、シェーグレン症候群、ギラン・バレー症候群、慢性萎縮性胃炎、大動脈炎症候群、グッドパスチャー症候群、急速進行性糸球体腎炎、バセドウ病、慢性円板状エリテマトーデス又は習慣性流産、虚血性疾患、例えば狭心症、心筋梗塞、脳梗塞又は閉塞性動脈硬化症、アレルギー疾患、例えば気管支ぜんそく、アレルギー性鼻炎、花粉症、アレルギー性胃腸炎、じんま疹、接触皮膚炎又はアトピー性皮膚炎、皮膚の老化、色素沈着、皴、脂漏症、日焼け、火傷、アクネ、皮膚のたるみ、肥満、高血圧、メタボリックシンドローム、貧血が挙げられる。このため本発明のレドックス関連因子発現促進剤の用途に関しては無限の可能性があり、食品、飲料、化粧品、医薬品、医薬部外品等の原料並びに添加物として治療的又は美容学的に使用することができる。

経口用組成物として取りうる形態としては、例えば一般食品の他、機能性食品、栄養補助食品、特定保健用食品、未熟児用調製乳、乳児用調製乳、乳児用食品、妊産婦食品、老人用食品、飲料、機能性食品、医薬品の形態が挙げられ、例えば、錠剤、粉末、顆粒、トローチ、内服液、懸濁液、乳濁液、シロップ等の加工形態であってもよい。

また本発明のレドックス関連因子発現促進剤は、本発明の有効成分以外に、一般に飲食品、医薬品または医薬部外品に用いられる各種担体や抗酸化剤等の添加物を含んでよい。例えば本発明のレドックス関連因子の発現促進剤は、本発明の有効成分以外に、担体として、各種キャリアー担体、イクステンダー剤、希、釈剤、増量剤、分散剤、賦形剤、結合剤溶剤（例、水、エタノール、植物油）、溶解補助剤、緩衝剤、溶解促進剤、ゲル化剤、懸濁化剤、小麦粉、米粉、でん粉、コーンスターチ、ポリサッカライド、ミルクタンパク質、コラーゲン、米油、レシチンを含んでよい。添加剤としては、例えば、ビタミン類、甘味料、有機酸、着色剤、香料、湿化防止剤、ファイバー、電解質、ミネラル、栄養素、抗酸化剤、保存剤、芳香剤、湿潤剤、天然の食物抽出物、野菜抽出物を挙げることができるが、これらに限定しているわけではない。また抗酸化剤としては、例えば、トコフェロール類、フラボン誘導体、フィロズルシン類、コウジ酸、没食子酸誘導体、カテキン類、フキ酸、ゴシポール、ピラジン誘導体、セサモール、グァヤオール、グァヤク酸、p-クマリン酸、ノールジヒドログァヤテッチク酸、ステロール類、テルペン類、核酸塩基類、カロチノイド類、リグナン類のような天然抗酸化剤およびアスコルビン酸パリミチン酸エステル、アスコルビン酸ステアリン酸エステル、ブチルヒドロキシアニソール（BHA）、ブチルヒドロキシトルエン（BHT）、モノ-t-ブチルヒドロキノン（TBHQ）、4-ヒドロキシメチル-2,6-ジ-t-ブチルフェノール（HMBP）に代表されるような合成抗酸化剤を挙げることができる。

外用組成物として取りうる形態としては、例えば軟膏、クリーム、プロテクター、貼付剤、パック、化粧水、乳液、ローション、浴用剤、ヘアーローション、ヘアートニック、ヘアーリキッド、シャンプー、リンス等の剤型に調製することができ、通常の外用剤として慣習的に用いられる成分、例えば美白剤、保湿剤、油性成分、紫外線吸収剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色剤、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。さらに、本発明のレドックス関連因子発現促進剤には、外用剤に慣用の助剤、例えばエデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、グルコン酸等の金属封鎖剤、カフェイン、タンニン、ベラパミル、トラネキサム酸およびその誘導体、甘草抽出物、グラブリジン、カリンの果実の熱水抽出物、各種生薬、酢酸トコフェロール、グリチルリチン酸およびその誘導体またはその塩等の薬剤、ビタミンＣ、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸グルコシド、アルブチン、コウジ酸等の美白剤、グルコース、フルクトース、マンノース、ショ糖、トレハロース等の糖類、レチノイン酸、レチノール、酢酸レチノール、パルミチン酸レチノール等のビタミンA類も適宜配合することができる。

本発明において投与されるレドックス関連因子発現促進剤の代表的な処方例を以下に示す。

プロテクターA
組成 配合量（質量％）
デカメチルシクロペンタシロキサン 3
メチルフェニルポリシロキサン 3
ベヘニルアルコール 1
１，３−ブチレングリコール 5
イソステアリン酸ポリオキシエチレングリセリル 1.5
モノステアリン酸ポリオキシエチレングリセリン 1
レドックス関連因子発現促進剤：イチョウ葉抽出液（乾燥残分）0.0001
レドックス関連因子発現促進剤：クエルセチン 0.0001
エデト酸３ナトリウム 0.1
パラメトキシ桂皮酸２−エチルヘキシル 7
キサンタンガム 0.1
カルボキシビニルポリマー 0.3
フェノキシエタノール 適量
精製水 残量
香料 適量

プロテクターB
組成 配合量（質量％）
ワセリン 1
ジメチルポリシロキサン 3
メチルフェニルポリシロキサン 3
ステアリルアルコール 0.5
グリセリン 7
ジプロピレングリコール 3
１，３−ブチレングリコール 7
キシリトール 3
スクワラン 1
イソステアリン酸 0.5
ステアリン酸 0.5
モノステアリン酸ポリオキシエチレングリセリン 1
モノステアリン酸グリセリン 2
水酸化カリウム 0.05
レドックス関連因子発現促進剤：サンナ抽出液（乾燥残分） 0.0001
レドックス関連因子発現促進剤：ケンフェロール 0.0001
アセチル化ヒアルロン酸ナトリウム 0.1
ＥＤＴＡ３ナトリウム 0.05
４−ｔ−ブチル−４’−メトキシジベンゾイルメタン 2
パラメトキシ桂皮酸２−エチルヘキシル 5
カルボキシビニルポリマー 0.1
フェノキシエタノール 適量
精製水 残量
香料 適量

２層タイプクリーム
組成 配合量（質量％）
ジメチルポリシロキサン 5
デカメチルシクロペンタシロキサン 25
トリメチルシロキシケイ酸 5
ポリオキシエチレン・メチルポリシロキサン共重合体 2
ジプロピレングリコール 5
パルミチン酸デキストリン被覆微粒子酸化亜鉛（60nm） 15
レドックス関連因子発現促進剤：イチョウ葉抽出液（乾燥残分）0.01
レドックス関連因子発現促進剤：ケンフェロール 0.0005
パラベン 適量
フェノキシエタノール 適量
エデト酸三ナトリウム 適量
パラメトキシ桂皮酸２−エチルヘキシル 7.5
ジメチルジステアリルアンモニウムヘクトライト 0.5
球状ポリアクリル酸アルキル粉末 5
ブチルエチルプロパンジオール 0.5
精製水 残量
香料 適量

軟膏
組成 配合量（質量％）
レドックス関連因子発現促進剤：イチョウ葉抽出液（乾燥残分）0.01
レドックス関連因子発現促進剤：ケンフェロール 0.001
レドックス関連因子発現促進剤：クエルセチン 0.0001
ステアリルアルコール 18.0
モクロウ 20.0
ポリオキシエチレン（２０）モノオレイン酸エステル 0.25
グリセリンモノステアリン酸エステル 0.3
ワセリン 40.0
精製水 残量

貼付剤
組成 配合量（質量％）
レドックス関連因子発現促進剤：サンナ抽出液（乾燥残分） 0.0001
レドックス関連因子発現促進剤：ケンフェロール 0.0001
レドックス関連因子発現促進剤：クエルセチン 0.0001
クロタミトン 3.2
パナセート８７５Ｒ 2.5
スクワラン 1.0
ｄｌ−カンフル 0.07
ポリオキシエチレン（６０モル）硬化ヒマシ油 1.2
濃グリセリン 5.0
ゼラチン 1.2
ポリビニルピロリドンＫ−９０ 0.6
メチルパラベン 適量
ｄ−ソルビトール液 35.0
水酸化アルミニウム 0.2
尿素 1.3
亜硫酸ナトリウム 適量
エデト酸ナトリウム 適量
クエン酸 適量
ハイビスワコー１０４Ｒ 0.22
ポリアクリル酸ナトリウム 0.24
カルボキシメチルセルロースナトリウム 2.8
カオリン 1.0
精製水 残量

イオン導入剤
組成 配合量（質量％）
レドックス関連因子発現促進剤：イチョウ葉抽出液（乾燥残分）0.0001
レドックス関連因子発現促進剤：サンナ抽出液（乾燥残分） 0.0001
レドックス関連因子発現促進剤：ケンフェロール 0.0001
レドックス関連因子発現促進剤：クエルセチン 0.0001
グリセリン 5.0
１，３−ブチレングリコール 5.0
ヒアルロン酸 0.05
クエン酸（食品） 0.35
イオン交換水 残量

キャンディーＡ
組成 配合量（質量％）
レドックス関連因子発現促進剤：イチョウ葉抽出液（乾燥残分）0.5
砂糖 50.000
水飴 残量
香料 1.000

錠剤Ｃ
組成 配合量（質量％）
レドックス関連因子発現促進剤：サンナ抽出液（乾燥残分） 0.1
レドックス関連因子発現促進剤：クエルセチン 0.5
ショ糖エステル 4.667
メチルセルロース 2.400
グリセリン 1.667
Ｎ−アセチルグルコサミン 24.7998
ヒアルロン酸 20.000
ビタミンＥ 12.000
ビタミンＢ６ 1.333
ビタミンＢ２ 0.667
α−リポ酸 1.333
コエンザイムＱ１０ 2.667
セラミド（コンニャク抽出物） 3.333
Ｌ−プロリン 20.000
結晶セルロース 残量

ソフトカプセルＢ
組成 配合量（質量％）
レドックス関連因子発現促進剤：イチョウ葉抽出液（乾燥残分）0.1
レドックス関連因子発現促進剤：ケンフェロール 0.001
レドックス関連因子発現促進剤：クエルセチン 0.0001
食用大豆油 35.333
ローヤルゼリー 16.4668
マカ 2.000
ＧＡＢＡ 2.000
ミツロウ 4.000
ゼラチン 残量
グリセリン 8.000
グリセリン脂肪酸エステル 7.000

顆粒Ａ−Ｂ
組成 配合量（質量％）
レドックス関連因子発現促進剤：イチョウ葉抽出液（乾燥残分）0.01
レドックス関連因子発現促進剤：サンナ抽出液（乾燥残分） 0.02
レドックス関連因子発現促進剤：ケンフェロール 0.001
大豆イソフラボン 42.2998
還元乳糖 45.000
大豆オリゴ糖 3.000
エリスリトール 3.000
デキストリン 2.500
クエン酸 2.000
香料 残量

ドリンクＡ
組成 配合量（質量％）
レドックス関連因子発現促進剤：イチョウ葉抽出液（乾燥残分）0.001
レドックス関連因子発現促進剤：サンナ抽出液（乾燥残分） 0.001
レドックス関連因子発現促進剤：ケンフェロール 0.0001
レドックス関連因子発現促進剤：クエルセチン 0.0001
還元麦芽糖水飴 65.3998
エリスリトール 16.000
クエン酸 4.000
香料 2.600
Ｎ−アセチルグルコサミン 2.000
ヒアルロン酸 1.000
ビタミンＥ 0.600
ビタミンＢ６ 0.400
ビタミンＢ２ 0.200
α-リポ酸 0.400
コエンザイムＱ１０ 2.400
セラミド（コンニャク抽出物） 0.800
Ｌ−プロリン 4.000
精製水 残量

クッキー
組成 配合量（質量％）
レドックス関連因子発現促進剤：イチョウ葉抽出液（乾燥残分）0.5
レドックス関連因子発現促進剤：ケンフェロール 0.5
薄力粉 48.7998
バター 17.500
グラニュー糖 20.000
卵 12.500
香料 残余
バターを撹拌しながら、グラニュー糖を徐々に添加した後、卵、イチョウ葉抽出液、サンナ抽出液、ケンフェロール、クエルセチンおよび香料を添加しさらに攪拌する。十分に混合した後、均一に振るった薄力粉を加え、低速にて撹拌し塊状で冷蔵庫に寝かせる。その後、成型し１７０℃１５分焼成しクッキーとする。

例１．チオレドキシン系を発現亢進する薬剤の探索
正常なヒト表皮角化細胞（KK-4009, KURABO）をDefined Keratinocyte-SFM培地（10744-019,GIBCO）中、高湿、CO₂ 5%、37℃で培養した。最終密度100%の細胞をカルシウム濃度1.5mMに調整したEpiLife^TM CalciuM-Free Phenol Red Free 培地(M-EPICF/PRF-500, KURABO)に置換した。24時間後、これらにケンフェロール（K0018、東京化成工業株式会社）、ビタミンE（95240、FULKA）、及びリポ酸（(+/−)-α-リポ酸）（T1395、SIGMA）を終濃度10μMになるよう添加した。

薬剤添加後、24時間後にQIAZOL Lysis Reagent(79306、QIAGEN)を用いてRNAを単離し、RNeasy kit(74106、QIAGEN)を用いてRNAを精製した。その後、QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit（204243, QIAGEN）を用いて、ライトサイクラーソフトウェア（Roche）によりチオレドキシンレダクターゼ、チオレドキシン、グルタチオンレダクターゼ、グルタレドキシン、内部標準としてリボソーマルプロテインのmRNA量を定量した。用いたプライマーの配列を以下に示す。
チオレドキシンレダクターゼ・フォワードプライマー：
TGCTGGCAATAGGAAGAGATGGCTTGCAC
チオレドキシンレダクターゼ・リバースプライマー：
GCAATCTTCCTGCCTGCCTGGATTGCAACTGG
チオレドキシン・フォワードプライマー：
TCGGTCCTTACAGCCGCTCGTCAGACTCCA
チオレドキシン・リバースプライマー：
AGGCCCACACCACGTGGCTGAGAAGTCAAC
グルタチオンレダクターゼ・フォワードプライマー：
GATCCTGTCAGCCCTGGGTTCTAAGACATC
グルタチオンレダクターゼ・リバースプライマー：
TAACCATGCTGACTTCCAAGCCCGACAA
グルタレドキシン・フォワードプライマー：
ATCACAGCCACCAACCACACTAACGAGA
グルタレドキシン・リバースプライマー：
GTTACTGCAGAGCTCCAATCTGCTTTAGCC
リボソーマルプロテイン・フォワードプライマー：
ACAGAGGAAACTCTGCATTCTCGCTTCCTG
リボソーマルプロテイン・リバースプライマー：
CACAGACAAGGCCAGGACTCGTTTGTACC
チオレドキシンレダクターゼ、チオレドキシン、グルタチオンレダクターゼ、及びグルタレドキシンのmRNA量を、リボソーマルプロテインのmRNA量で除したものをmRNA発現量とした。

その結果、ケンフェロールは、抗酸化作用を有することが知られているビタミンE及びリポ酸と比較して、レドックス関連因子の発現を有意に亢進した（図１）。

例２．皮膚等価モデル中のレドックス関連因子の発現におけるケンフェロールの作用
正常なヒト、正常ヒト角化細胞（Invitrogen）、正常ヒト線維芽細胞（ATCC)及びコラーゲンI（Sigma）から皮膚等価モデルを作製し、そしてDulbecco's Modified Eagle's培地（D-MEM)(Invitrogen）中、高湿、CO₂ 5%、37度において培養した。2mM又は10mMのケンフェロールを該培養培地に添加し、そして該モデルを24時間培養した。その後、QIAGEN mRNA単離キットを用いて皮膚等価モデルの上皮層からRNAを単離した。続いて、Real-time PCRキット(Bio-Rad)を用いたq-PCR（Bio-Rad MyiQ単色リアルタイムPCR検出システムによる定量PCR）により、チオレドキシンレダクターゼ及びグルタチオンレダクターゼ、ならびに内部標準として36B4のmRNAを定量した。プライマーはQIAGENから購入した（TXNRD2: #QT00070371; GSR; #QT00038325)。チオレドキシンレダクターゼ量及びグルタチオンレダクターゼ量を36B4のmRNA量で除算し、mRNA発現レベルを得た。

その結果、ケンフェロールは皮膚等価モデル中のレドックス関連因子の発現を有意に亢進した（図２）。

例３．チオレドキシン系を発現亢進する薬剤の探索−フラボノイド化合物
正常ヒト表皮角化細胞（KK-4009, KURABO）をDefined Keratinocyte-SFM培地（10744-019,GIBCO）中、高湿、CO₂ 5%、37度において培養した。最終密度100%の細胞をカルシウム濃度1.5mMに調整したEpiLife^TM CalciuM-Free Phenol Red Free培地(M-EPICF/PRF-500, KURABO)に置換した。24時間後に、下記薬剤を終濃度10μMになるよう添加した。
ケンフェロール（K0018、東京化成工業株式会社）
クエルセチン（173-00403、和光純薬工業（株））
ミリセチン（70050、FLUKA）
エピガロカテキンガレート（E4143、CIAL）
ヘスペリジン（086-07342、和光純薬工業（株））
アピゲニン（012-18913、和光純薬工業（株））
ゲニステイン（070-04681、和光純薬工業（株））
薬剤添加後24時間後に上記例１の方法でレドックス関連因子のmRNAの発現量を定量した。

その結果、上記フラボノイド化合物のうち、ケンフェロールとクエルセチンのみがチオレドキシン系の発現を有意に亢進した（図３）。

例４．チオレドキシン系を発現亢進する薬剤の探索−植物エキスの探索
正常ヒト表皮角化細胞（KK-4009, KURABO）をDefined Keratinocyte-SFM培地（10744-019,GIBCO）中、高湿、CO₂ 5%、37度において培養した。終密度100%の細胞をカルシウム濃度1.5mMに調整したEpiLife^TM CalciuM-Free Phenol Red Free培地(M-EPICF/PRF-500,KURABO)に置換した。24時間後に下記薬剤を終濃度0.1%になるよう添加した。
サンナ抽出液：サンナ（Kaempferia galanga）の根茎を50% 1,3-ブチレングリコールにより抽出して得られるもの；
イチョウ葉抽出液：イチョウ（Ginkgo biloba L.）の葉の50%エタノール抽出物を1,3-ブチレングリコールに転溶して得られるもの；
テンチャエキス：甜茶（Rubus Suavissimus Shugan Lee.(Rosaseae)）の熱湯抽出物を50% 1,3-ブチレングリコールに転溶して得られるもの。
薬剤添加後24時間後に例１の方法でレドックス関連因子のmRNAの発現量を定量した。

その結果、ケンフェロール、クエルセチン及びこれらの配糖体を含有することが知られている植物抽出液のうち、イチョウ葉抽出液又はサンナ抽出液が特にチオレドキシン系の発現を亢進することが確認された（図４）。

例５．チオレドキシンレダクターゼ活性促進効果
正常ヒト表皮角化細胞（KK-4009, KURABO）をDefined Keratinocyte-SFM培地（10744-019,GIBCO）中、高湿、CO₂ 5%、37度において培養した。終密度100%の細胞をカルシウム濃度1.5mMに調整したEpiLife^TM CalciuM-Free Phenol Red Free培地(M-EPICF/PRF-500,KURABO)に置換した。24時間後に、ケンフェロール（K0018、東京化成工業株式会社）又はクエルセチン（173-00403、和光純薬工業（株））を終濃度10μMになるよう添加した。薬剤添加後24時間後に溶解バッファーに溶解させ、不溶性画分を14,000rpmにて15分、4℃での遠心分離操作により除去した。可溶性画分中の総タンパク質量を定量後、Arne Holmgrenらによるチオレドキシンレダクターゼ活性測定方法（METHODS IN ENZYMOLOGY,1995,252,199-）に準じて活性測定を行った。

その結果、ケンフェロール及びクエルセチンは、チオレドキシンレダクターゼの活性を促進することが確認された（図５）。

例６．ケンフェロール、サンナ抽出液、イチョウ葉抽出液による炎症性サイトカイン（IL1β）の発現抑制効果
正常ヒト表皮角化細胞（KK-4009, KURABO）をDefined Keratinocyte-SFM培地（10744-019,GIBCO）中、高湿、CO2 5%、37度において培養した。終密度100%の細胞をカルシウム濃度1.5mMに調整したEpiLife^TM CalciuM-Free Phenol Red Free培地(M-EPICF/PRF-500,KURABO)に置換した。24時間後にケンフェロールを終濃度10μM、下記植物抽出液を終濃度0.1%になるよう添加した。
ケンフェロール（K0018、東京化成工業株式会社）
サンナ抽出液：サンナ（Kaempferia galanga）の根茎を50% 1,3-ブチレングリコールにより抽出して得られるもの
イチョウ葉抽出液：イチョウ（Ginkgo biloba L.）の葉の50%エタノール抽出物を1,3-ブチレングリコールに転溶して得られるもの
薬剤添加後24時間後に例１の方法でRNAを抽出し、炎症関連因子(IL1β)のmRNA発現量を定量した。用いたプライマーは以下の通りである。
ＩＬ１β・フォワードプライマー：
GGCCATGGACAAGCTGAGGAAGATGCTG
ＩＬ１β・リバースプライマー：
TGCATCGTGCACATAAGCCTCGTTATCCC
IL1βのmRNA量をリボソーマルプロテインのmRNA量で除したものをmRNA発現量とした。

その結果、ケンフェロール、ならびにサンナ抽出液及びイチョウ葉抽出液によって、炎症性サイトカインであるIL1βの産生が抑制されたことから、これらの成分は抗炎症作用を有することが確認された（図６）。

Claims (9)

1. ヒト対象の皮膚におけるレドックス関連因子の発現を促進するための剤であって、前記 剤が、ケンフェロール及び／又はその配糖体を有効成分として含んで成り、前記レドック ス関連因子が、チオレドキシン、チオレドキシンレダクターゼ、グルタチオンレダクター ゼ及び／又はグルタレドキシンからなる群から選択される１又は複数の物質であり、そし て、前記剤が、ヒト表皮におけるＩＬ−１βの発現を抑制するために用いられることを特 徴とする、剤。
2. ヒト対象の皮膚におけるレドックス関連因子の発現を促進するための剤であって、前記 剤が、イチョウ葉抽出物を有効成分として含んで成り、前記レドックス関連因子が、チオ レドキシン及び／又はチオレドキシンレダクターゼであり、そして、前記剤が、ヒト表皮 におけるＩＬ−１βの発現を抑制するために用いられることを特徴とする、剤。
3. ヒト対象の皮膚におけるレドックス関連因子の発現を促進するための剤であって、前記 剤が、ヒト表皮細胞におけるレドックス関連因子の発現を促進するために十分な量のサン ナ抽出物を有効成分として含んで成ることを特徴とする、剤。
4. 前記レドックス関連因子が、チオレドキシン、チオレドキシンレダクターゼ、グルタチ オンレダクターゼ及びグルタレドキシンから成る群から選択される１又は複数の物質であ ることを特徴とする、請求項３に記載の剤。
5. 前記剤が、ヒト表皮におけるＩＬ−１βの発現を抑制するために用いられることを特徴 とする、請求項３又は４に記載の剤。
6. 前記レドックス関連因子がチオレドキシンである、請求項１〜５のいずれか１項に記載 の剤。
7. 前記レドックス関連因子がチオレドキシンレダクターゼである、請求項１〜５のいずれ か１項に記載の剤。
8. 前記レドックス関連因子がグルタチオンレダクターゼである、請求項１、３、４又は５ のいずれか１項に記載の剤。
9. 前記レドックス関連因子がグルタレドキシンである、請求項１、３、４又は５のいずれ か１項に記載の剤。

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