WO2011093469A1 - レドックス関連因子発現促進剤 - Google Patents

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redox
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extract
thioredoxin
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美郷 菅原
勝田　雄治
城太郎 仲西
サム ダブリュー． リー
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株式会社資生堂
ザ ジェネラル ホスピタル コーポレーション
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Definitions

  • the present invention includes a redox-related factor expression promoter comprising kaempferol, quercetin or a glycoside thereof or a combination thereof as an active ingredient, and a ginkgo biloba leaf extract, a sanna extract or a combination thereof as an active ingredient. It is related with the redox related factor expression promoter which consists of.
  • redox regulation The living body performs redox regulation to maintain its survival and homeostasis.
  • In vivo redox regulation is mainly based on reversible redox reactions of thiol groups on cysteine residues present in intracellular proteins and controls various cellular functions.
  • Factors involved in redox regulation are known to play an important role in the elimination of reactive oxygen species in the body, while maintaining the intracellular state in a reduced state and playing an essential role in cell survival. It has been. When such a redox-related factor does not function normally, reactive oxygen species in the living body are excessively produced and exposed to excessive oxidative stress.
  • the glutathione system is known as a redox-related factor that acts as a defense mechanism against oxidative stress in the living body.
  • Glutathione is a tripeptide present in mammals. It is a reducing action by thiol groups in the molecule, action as a coenzyme, production of mercapturic acid and other detoxification mechanisms, thiol enzymes or other cellular components. It has been reported that it has a protective action, promotion of harmful substance excretion, antiallergic action by increasing cholinesterase activity, and enzyme activation action.
  • glutathione precipitates in the preparation and cannot take up glutathione in many cells, components for promoting glutathione production in cells can be extremely useful.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2007-284430 (Patent Document 1)).
  • thioredoxin system As another redox-related factor, the thioredoxin system is known, and the thioredoxin system also works as a defense mechanism against oxidative stress in the living body (Cell Engineering Vol. 25, No. 2, 2006, p143-148 (non-patent literature). 1)).
  • thioredoxin transgenic mice have a long life (Mitsui A, et al: Antioxid Redox Signal (2002) 4: 693-696), and thioredoxin has resistance to cerebral infarction and diabetes.
  • a redox-related factor such as glutathione or thioredoxin
  • glutathione or thioredoxin is directly administered to the living body, it cannot be efficiently taken into the cell, and thus there is a possibility that the redox regulating function or antioxidant function cannot be exhibited in the living body.
  • the expression of these redox-related factors is known to be enhanced by UV irradiation stress, but little is known about chemical substances that act safely and effectively on the living body. The mechanism of factor expression has not been elucidated in detail. Therefore, the discovery of safe and effective components for promoting the expression of redox-related factors in vivo is still expected.
  • the present invention promotes the expression of redox-related factors in vivo, thereby reducing oxidative stress in the body safely and efficiently, maintaining health, and preventing various diseases and symptoms caused by oxidative stress. Is an issue.
  • the present inventors have recently discovered kaempferol and quercetin belonging to flavonols as components that enhance the expression and activity of glutathione and thioredoxin systems as Redox-related factors in vivo. Surprisingly, this action is specific to kaempferol and quercetin among flavonols, and was not observed for myricetin having a similar structure. Compared with the direct application of glutathione and thioredoxin molecules, the application of kaempferol and quercetin can effectively promote the expression and activity of Redox-related factors such as glutathione and thioredoxin in vivo. Therefore, according to the present invention, various oxidative stresses in the living body can be more strongly reduced.
  • Flavonols such as kaempferol and quercetin are widely distributed in tea leaf plants and are non-toxic to living organisms and can be safely ingested. In this way, by using kaempferol and quercetin as active ingredients to promote the expression of Redox-related factors in vivo, the excess reactive oxygen species in the organism can be eliminated without applying stress to the applied organism. It becomes possible to do.
  • a redox-related factor expression promoter comprising kaempferol, quercetin, a glycoside thereof, or a combination thereof as an active ingredient.
  • the redox-related factor is one or more substances selected from the group consisting of thioredoxin, thioredoxin reductase, glutathione reductase, and glutaredoxin.
  • a redox-related factor expression promoter comprising a ginkgo biloba extract, a sanna extract or a combination thereof as an active ingredient.
  • a redox-related factor expression promoter comprising kaempferol, quercetin, a glycoside thereof, or a combination thereof as an active ingredient is provided.
  • redox-related factor refers to a factor that reacts oxidatively or reductively with the thiol group of a cysteine residue of a protein present in a living body, for example, a mammal, preferably a human body, to keep the cell in a reduced state.
  • a living body for example, a mammal, preferably a human body
  • redox-related factor refers to a factor that reacts oxidatively or reductively with the thiol group of a cysteine residue of a protein present in a living body, for example, a mammal, preferably a human body, to keep the cell in a reduced state.
  • This oxidation / reduction (redox) of the thiol group on the cysteine residue controls the transcription of genes, the intracellular localization of proteins, the regulation of synthesis and degradation, and the regulation of various biological phenomena such as cell proliferation and cell death. Is involved.
  • a glutathione system and a thioredoxin system are known, each of which is constituted by a group of molecules. These redox-related factors are known to be involved in the elimination of reactive oxygen species generated and present in vivo.
  • the thioredoxin system is composed of factors such as thioredoxin and thioredoxin reductase.
  • Thioredoxin (TRX) was discovered as a coenzyme that donates hydrogen to ribonucleotide reductase, an enzyme essential for DNA synthesis in E. coli.
  • TRX is a protein of approximately 12 kDa that is conserved in various prokaryotic and human organisms, and has a three-dimensional structure consisting of four ⁇ -strands and three ⁇ -helices. Has a site.
  • TRX has an oxidized form (SS) that forms a disulfide bond between two cysteine residues in the active site and a reduced form (-SH, SH-), and the reduced form reduces the disulfide bond of the substrate protein.
  • Oxidized TRX is reduced by NADPH and thioredoxin dactase and regenerated to a reduced form.
  • the H 2 O 2 erasing enzyme family collectively known as peroxiredoxin is known.
  • Reduced peroxiredoxin reduces H 2 O 2 .
  • the oxidized peroxiredoxin becomes a substrate and is reduced by thioredoxin.
  • the oxidized thioredoxin is reduced by thioredoxin reductase.
  • the thioredoxin system plays an important role in such a detoxification system for reactive oxygen species.
  • the glutathione system is composed of factors such as glutathione, glutathione reductase and glutaredoxin.
  • Glutathione is a tripeptide composed of glutamic acid, cysteine, and glycine, and is present in a large amount in cells as a non-protein thiol component, and is known as a main antioxidant in the intracellular hydrophilic compartment.
  • Glutathione reacts with reactive oxygen species (eg, superoxide or hydrogen peroxide) to form stable glutathione radicals, which are converted to dimers (GSSG: oxidized glutathione), which is further converted from NADPH by glutathione reductase. Are transferred to GSSG and regenerated into GSH (reduced glutathione).
  • Glutaredoxin has an active site called -Cys-Pro-Tyr-Cys- in common with thioredoxin, and is called the thioredoxin superfamily because of the commonality with thioredoxin.
  • SS oxidized form
  • -SH reduced form
  • the reduced form reduces the disulfide bond of the substrate protein and becomes the oxidized form itself.
  • redox-related factors such as thioredoxin, thioredoxin reductase, glutathione reductase, and glutaredoxin, or by promoting their expression, it reduces excessive reactive oxygen species in the body and protects the body from oxidative stress Can do.
  • Flavonols including kaempferol and quercetin have the general formula shown below: These are one of the flavonoid compounds widely distributed in plants. These flavonols are known to have an antioxidant action, and these flavonols have also been reported to have a blood vessel strengthening action and an anti-inflammatory action.
  • flavonols promote the expression of redox-related factors in vivo, and among these flavonols whose chemical structures are very close, only kaempferol and quercetin are It is very surprising to specifically promote the expression of redox-related factors. From this finding, it is clear that kaempferol and quercetin are extremely useful as active ingredients for promoting the expression of redox-related factors.
  • flavonols form various glycosides
  • kaempferol and quercetin glycosides can be used as active ingredients in the redox-related factor expression promoter of the present invention.
  • sugars that form glycosides with these are not limited, and aldoses include, for example, glucose, mannose, galactose, fucose, rhamnose, arabinose, xylose, and ketose, for example, fructose.
  • kaempferol, quercetin and their glycosides are components widely distributed in plants, so that plant extracts containing these components also promote the expression of redox-related factors in vivo.
  • plant extracts containing these components also promote the expression of redox-related factors in vivo.
  • the present inventors have found that among plant extracts, in particular, ginkgo biloba extract and sanna extract significantly promote the expression of in vivo redox-related factors. Therefore, in another embodiment of the present invention, a redox-related factor expression promoter comprising a ginkgo biloba extract, a sanna extract or a combination thereof as an active ingredient is provided.
  • the blending amount of kaempferol, quercetin, or a glycoside thereof, or a combination thereof used as an active ingredient in the redox-related factor expression promoter of the present invention is not particularly limited, but is 0.00001 to 0.5% by mass, preferably 0.0001 to 0.001. % By mass, and most preferably about 0.0001% by mass to 0.0005% by mass.
  • the amount of ginkgo biloba extract, sanna extract or a combination thereof used as an active ingredient in the redox-related factor expression promoter of the present invention is, for example, 0.00001 to 0.5% by mass in terms of the extract dry residue. It is preferably about 0.0001 to 0.1% by mass, and most preferably about 0.0001 to 0.01% by mass.
  • the active ingredient can be administered orally or parenterally as a redox-related factor expression promoter containing them, and can be prepared, for example, as an oral composition or an external composition. Moreover, the health of a living body can be maintained by the redox-related factor expression promoter of the present invention, and various diseases and symptoms caused by oxidative stress can be prevented.
  • Such diseases and symptoms include, without limitation, cancer, diabetes, autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, antiphospholipid antibody syndrome, dermatomyositis, systemic sclerosis, Sjogren's syndrome, Guillain Valley syndrome, chronic atrophic gastritis, aortitis syndrome, Goodpasture syndrome, rapidly progressive glomerulonephritis, Graves' disease, chronic discoid lupus erythematosus or habitual abortion, ischemic diseases such as angina, myocardial infarction, brain Infarct or obstructive arteriosclerosis, allergic diseases such as bronchial asthma, allergic rhinitis, hay fever, allergic gastroenteritis, urticaria, contact dermatitis or atopic dermatitis, skin aging, pigmentation, wrinkles, oil Leakage, sunburn, burns, acne, sagging skin, obesity, hypertension, metabolic syndrome, anemia
  • the redox-related factor expression promoter of the present invention is used therapeutically or cosmetically as a raw material and additive for foods, beverages, cosmetics, pharmaceuticals, quasi drugs, etc. be able to.
  • Possible forms of oral compositions include, for example, general foods, functional foods, dietary supplements, foods for specified health use, premature infant formulas, infant formulas, infant foods, maternal foods, and elderly
  • Examples include foods, beverages, functional foods, and pharmaceutical forms, and may be processed forms such as tablets, powders, granules, troches, oral liquids, suspensions, emulsions, and syrups.
  • the redox-related factor expression promoter of the present invention may contain additives such as various carriers and antioxidants generally used in foods and drinks, pharmaceuticals or quasi drugs.
  • the expression promoter for the redox-related factor of the present invention includes various carrier carriers, extender agents, dilutes, additives, extenders, dispersants, excipients, binder solvents in addition to the active ingredient of the present invention.
  • solubilizer, buffer, solubilizer, gelling agent, suspending agent, flour, rice flour, starch, corn starch, polysaccharides, milk protein, collagen, rice oil, lecithin May be included.
  • additives include vitamins, sweeteners, organic acids, colorants, flavors, anti-wetting agents, fibers, electrolytes, minerals, nutrients, antioxidants, preservatives, fragrances, wetting agents, natural foods
  • An extract and a vegetable extract can be mentioned, but it is not necessarily limited to these.
  • Antioxidants include, for example, tocopherols, flavone derivatives, phyllozulcins, kojic acid, gallic acid derivatives, catechins, fuxic acid, gossypol, pyrazine derivatives, sesamol, guaiaol, guaiac acid, p-coumaric acid, nordihydro Natural antioxidants such as guaiatic acid, sterols, terpenes, nucleobases, carotenoids, lignans and ascorbic acid pariminate, ascorbyl stearate, butylhydroxyanisole (BHA), butylhydroxytoluene Examples include synthetic antioxidants such as (BHT), mono-t-butylhydroquinone (TBHQ), and 4-hydroxymethyl-2,6-di-t-butylphenol (HMBP).
  • BHT mono-t-butylhydroquinone
  • HMBP 4-hydroxymethyl-2,6-di-t-but
  • Examples of forms that can be used as an external composition include preparations such as ointments, creams, protectors, patches, packs, lotions, emulsions, lotions, bath preparations, hair lotions, hair lotions, hair liquids, shampoos and rinses.
  • Ingredients conventionally used as normal external preparations such as whitening agents, moisturizers, oily ingredients, UV absorbers, surfactants, thickeners, alcohols, powder ingredients, colorants, aqueous ingredients Water, various skin nutrients, and the like can be appropriately blended as necessary.
  • the redox-related factor expression promoter of the present invention includes auxiliary agents commonly used for external preparations, for example, metals such as disodium edetate, trisodium edetate, sodium citrate, sodium polyphosphate, sodium metaphosphate, and gluconic acid.
  • auxiliary agents commonly used for external preparations for example, metals such as disodium edetate, trisodium edetate, sodium citrate, sodium polyphosphate, sodium metaphosphate, and gluconic acid.
  • Sequestrant caffeine, tannin, verapamil, tranexamic acid and its derivatives, licorice extract, grabrizine, hot water extract of karin fruit, various herbal medicines, drugs such as tocopherol acetate, glycyrrhizic acid and its derivatives or their salts, vitamins C, whitening agent such as magnesium ascorbate phosphate, glucoside ascorbate, arbutin, kojic acid, sugars such as glucose, fructose, mannose, sucrose, trehalose, vitamin A such as retinoic acid, retinol, retinol acetate, retinol palmitate, etc. Also suitable It can mix
  • blend suitably.
  • Redox-related factor expression promoter Ginkgo biloba leaf extract (dry residue) 0.01 Redox-related factor expression promoter: kaempferol 0.001 Redox-related factor expression promoter: quercetin 0.0001 Stearyl alcohol 18.0 Owl 20.0 Polyoxyethylene (20) monooleate 0.25 Glycerin monostearate 0.3 Vaseline 40.0 Purified water remaining
  • Patch composition Composition amount (% by mass) Redox-related factor expression promoter: Sanna extract (dry residue) 0.0001 Redox-related factor expression promoter: kaempferol 0.0001 Redox-related factor expression promoter: quercetin 0.0001 Crotamiton 3.2 Panacet 875R 2.5 Squalane 1.0 dl-Camphor 0.07 Polyoxyethylene (60 mol) hydrogenated castor oil 1.2 Concentrated glycerin 5.0 Gelatin 1.2 Polyvinylpyrrolidone K-90 0.6 Methylparaben appropriate amount d-sorbitol 35.0 Aluminum hydroxide 0.2 Urea 1.3 Sodium sulfite appropriate amount Sodium edetate appropriate amount Citric acid appropriate amount Hibiswako 104R 0.22 Sodium polyacrylate 0.24 Sodium carboxymethylcellulose 2.8 Kaolin 1.0 Purified water remaining
  • Redox-related factor expression promoter Ginkgo biloba extract (dry residue) 0.0001 Redox-related factor expression promoter: Sanna extract (dry residue) 0.0001 Redox-related factor expression promoter: kaempferol 0.0001 Redox-related factor expression promoter: quercetin 0.0001 Glycerin 5.0 1,3-butylene glycol 5.0 Hyaluronic acid 0.05 Citric acid (food) 0.35 Ion exchange water
  • Redox-related factor expression promoter Sanna extract (dry residue) 0.1 Redox-related factor expression promoter: quercetin 0.5 Sucrose ester 4.667 Methylcellulose 2.400 Glycerin 1.667 N-acetylglucosamine 24.7998 Hyaluronic acid 20.000 Vitamin E 12.000 Vitamin B6 1.333 Vitamin B2 0.667 ⁇ -Lipoic acid 1.333 Coenzyme Q10 2.667 Ceramide (konjac extract) 3.333 L-proline 20.000 Crystalline cellulose
  • Redox-related factor expression promoter Ginkgo biloba leaf extract (dry residue) 0.1 Redox-related factor expression promoter: kaempferol 0.001 Redox-related factor expression promoter: quercetin 0.0001 Edible soybean oil 35.333 Royal Jelly 16.4668 Maca 2.000 GABA 2.000 Beeswax 4.000 Gelatin remaining Glycerin 8.000 Glycerin fatty acid ester 7.000
  • Granule AB Composition Blending amount (% by mass) Redox-related factor expression promoter Ginkgo biloba leaf extract (dry residue) 0.01 Redox-related factor expression promoter: Sanna extract (dry residue) 0.02 Redox-related factor expression promoter: kaempferol 0.001 Soy isoflavone 42.2998 Reduced lactose 45.000 Soybean oligosaccharide 3.000 Erythritol 3.000 Dextrin 2.500 Citric acid 2.000 Perfume remaining
  • Redox-related factor expression promoter Ginkgo biloba extract (dry residue) 0.001 Redox-related factor expression promoter: Sanna extract (dry residue) 0.001 Redox-related factor expression promoter: kaempferol 0.0001 Redox-related factor expression promoter: quercetin 0.0001 Reduced maltose starch syrup 65.3998 Erythritol 16.000 Citric acid 4.000 Fragrance 2.600 N-acetylglucosamine 2.000 Hyaluronic acid 1.000 Vitamin E 0.600 Vitamin B6 0.400 Vitamin B2 0.200 ⁇ -Lipoic acid 0.400 Coenzyme Q10 2.400 Ceramide (konjac extract) 0.800 L-proline 4.000 Purified water remaining
  • Redox-related factor expression promoter Ginkgo biloba leaf extract (dry residue)
  • Redox-related factor expression promoter kaempferol 0.5
  • Soft flour 48.7998 Butter 17.500 Granulated sugar 20.000 Egg 12.500
  • Flavor Residue After stirring butter, granulated sugar is gradually added, and egg, ginkgo biloba leaf extract, sanna extract, kaempferol, quercetin and flavor are added and further stirred. After mixing well, add the weakly shaken flour, stir at a low speed and put it in a lump in the refrigerator. Thereafter, it is molded and baked at 170 ° C. for 15 minutes to obtain cookies.
  • Example 1 Search for drugs that enhance the expression of the thioredoxin system Normal human epidermal keratinocytes (KK-4009, KURABO) are cultured in Defined Keratinocyte-SFM medium (10744-019, GIBCO) at high humidity, 5% CO 2 at 37 ° C. did. Cells with a final density of 100% were replaced with EpiLife TM CalciuM-Free Phenol Red Free medium (M-EPICF / PRF-500, KURABO) adjusted to a calcium concentration of 1.5 mM.
  • Keratinocyte-SFM medium 10744-019, GIBCO
  • EpiLife TM CalciuM-Free Phenol Red Free medium M-EPICF / PRF-500, KURABO
  • kaempferol K0018, Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.
  • vitamin E 95240, FULKA
  • lipoic acid ((+/-)- ⁇ -lipoic acid) (T1395, SIGMA) were added to a final concentration of 10 ⁇ M. It added so that it might become.
  • Thioredoxin reductase forward primer TGCTGGCAATAGGAAGAGATGGCTTGCAC
  • Thioredoxin reductase reverse primer GCAATCTTCCTGCCTGCCTGGATTGCAACTGG Thioredoxin forward primer: TCGGTCCTTACAGCCGCTCGTCAGACTCCA Thioredoxin reverse primer: AGGCCCACACCACGTGGCTGAGAAGTCAAC
  • Glutathione reductase forward primer GATCCTGTCAGCCCTGGGTTCTAAGACATC
  • Glutaredoxin forward primer ATCACAGCCACCAACCACACTAACGAGA
  • Glutaredoxin reverse primer GTTACTGCAGAGCTCCAATCTGCTTTAGCC Ribosomal protein forward primer: ACAGAGGAAACTCTGCATTCTCGCTTCCTG Ribosomal protein reverse primer: CACAGACAAGGCCAGGACTCGTTTGTACC The mRNA expression
  • kaempferol significantly increased the expression of redox-related factors as compared with vitamin E and lipoic acid, which are known to have an antioxidant effect (FIG. 1).
  • Example 2 Effect of kaempferol on the expression of redox-related factors in the skin equivalent model
  • a skin equivalent model was created from normal human, normal human keratinocytes (Invitrogen), normal human fibroblasts (ATCC) and collagen I (Sigma), Then, the cells were cultured in Dulbecco's Modified Eagle's medium (D-MEM) (Invitrogen) at high humidity, CO 2 5%, 37 ° C. 2 mM or 10 mM kaempferol was added to the culture medium and the model was cultured for 24 hours. Subsequently, RNA was isolated from the epithelial layer of the skin equivalent model using the QIAGEN mRNA isolation kit.
  • D-MEM Dulbecco's Modified Eagle's medium
  • thioredoxin reductase and glutathione reductase as well as 36B4 mRNA as an internal standard were quantified by q-PCR using the Real-time PCR kit (Bio-Rad) (quantitative PCR using the Bio-Rad MyiQ single-color real-time PCR detection system). did. Primers were purchased from QIAGEN (TXNRD2: # QT00070371; GSR; # QT00038325). The amount of thioredoxin reductase and the amount of glutathione reductase were divided by the amount of 36B4 mRNA to obtain the mRNA expression level.
  • Example 3 Search for drugs that enhance the expression of thioredoxin system-Flavonoid compounds Normal human epidermal keratinocytes (KK-4009, KURABO) in Defined Keratinocyte-SFM medium (10744-019, GIBCO), high humidity, CO 2 5%, 37 degrees Incubated in Cells having a final density of 100% were replaced with EpiLife TM CalciuM-Free Phenol Red Free medium (M-EPICF / PRF-500, KURABO) adjusted to a calcium concentration of 1.5 mM. After 24 hours, the following drugs were added to a final concentration of 10 ⁇ M.
  • Example 4 Search for drugs that enhance the expression of thioredoxin system-Search for plant extracts Normal human epidermal keratinocytes (KK-4009, KURABO) in Defined Keratinocyte-SFM medium (10744-019, GIBCO) in high humidity, 5% CO 2 Cultured at 37 degrees. Cells having a final density of 100% were replaced with EpiLife TM CalciuM-Free Phenol Red Free medium (M-EPICF / PRF-500, KURABO) adjusted to a calcium concentration of 1.5 mM. After 24 hours, the following drugs were added to a final concentration of 0.1%.
  • Sanna extract obtained by extracting the rootstock of Sanna (Kaempferia galanga) with 50% 1,3-butylene glycol; Ginkgo biloba extract: Ginkgo biloba L. leaves obtained by dissolving 50% ethanol extract of 1,3-butylene glycol; Tencha extract: A hot water extract of ⁇ cha (Rubus Suavissimus Shugan Lee. (Rosaseae)), obtained by dissolving in 50% 1,3-butylene glycol. The amount of redox-related factor mRNA expression was quantified by the method of Example 1 24 hours after the addition of the drug.
  • Example 5 Thioredoxin reductase activity promoting effect Normal human epidermal keratinocytes (KK-4009, KURABO) were cultured in Defined Keratinocyte-SFM medium (10744-019, GIBCO) at high humidity, CO 2 5%, 37 ° C. Cells having a final density of 100% were replaced with EpiLife TM CalciuM-Free Phenol Red Free medium (M-EPICF / PRF-500, KURABO) adjusted to a calcium concentration of 1.5 mM. After 24 hours, kaempferol (K0018, Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) or quercetin (173-00403, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to a final concentration of 10 ⁇ M.
  • Keratinocyte-SFM medium 10744-019, GIBCO
  • Kaempferol, Sanna extract, Ginkgo biloba extract suppresses inflammatory cytokine (IL1 ⁇ ) expression
  • Normal human epidermal keratinocytes (KK-4009, KURABO) in Defined Keratinocyte-SFM medium (10744-019, GIBCO)
  • Keratinocyte-SFM medium 10744-019, GIBCO
  • M-EPICF / PRF-500 EpiLife TM CalciuM-Free Phenol Red Free medium
  • IL1 ⁇ forward primer GGCCATGGACAAGCTGAGGAAGATGCTG
  • IL1 ⁇ reverse primer TGCATCGTGCACATAAGCCTCGTTATCCC
  • the mRNA expression level was obtained by dividing the IL1 ⁇ mRNA level by the ribosomal protein mRNA level.
  • IL1 ⁇ which is an inflammatory cytokine
  • kaempferol, Sanna extract and Ginkgo biloba extract As a result, production of IL1 ⁇ , which is an inflammatory cytokine, was suppressed by kaempferol, Sanna extract and Ginkgo biloba extract, and it was confirmed that these components have an anti-inflammatory effect (FIG. 6). .

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Abstract

　生体内においてレドックス関連因子の発現を促進することにより、安全かつ効率的に生体の酸化ストレスを減少させ、健康を維持し、また酸化ストレスに起因する様々な疾患及び症状を防ぐことを課題とする。　本発明は、ケンフェロール、クエルセチン若しくはこれらの配糖体又はこれらの組み合わせを有効成分として含んで成るレドックス関連因子発現促進剤、ならびにイチョウ葉抽出物、サンナ抽出物又はこれらの組み合わせを有効成分として含んで成るレドックス関連因子発現促進剤に関する。

Description

レドックス関連因子発現促進剤
　本発明は、ケンフェロール、クエルセチン若しくはこれらの配糖体又はこれらの組み合わせを有効成分として含んで成るレドックス関連因子発現促進剤、ならびにイチョウ葉抽出物、サンナ抽出物又はこれらの組み合わせを有効成分として含んで成るレドックス関連因子発現促進剤に関する。
　生体は、その生存維持、恒常性維持のため、レドックス調節を行っている。生体内のレドックス調節は、主に細胞内のタンパク質に存在するシステイン残基上のチオール基の可逆的な酸化還元反応に基づいており、様々な細胞機能を制御している。レドックス調節に関わる因子（レドックス関連因子）は、細胞内を還元状態に保ち、細胞の生存に必須の役割を果たす一方で、生体内の活性酸素種の消去においても重要な役割を果たすことが知られている。かかるレドックス関連因子が正常に機能しない場合、生体内の活性酸素種が過剰に産生し、過度の酸化ストレスに曝されることになる。このような過度の酸化ストレスは、ＤＮＡやタンパク質、脂質の生体高分子を酸化することによってこれらに傷害を与え、様々な疾患や老化の原因となるものと考えられている。このため、近年、酸化ストレスをもたらす活性酸素種の消去系として作用するレドックス関連因子の研究が盛んに行われている。
　生体の酸化ストレスに対する防御機構として働くレドックス関連因子としては、グルタチオン系が知られている。グルタチオンは哺乳動物に存在するトリペプチドであり、分子内のチオール基による還元作用、補酵素としての作用、メルカプツール酸の生成及びその他の解毒機構への関与、チオール酵素又はその他の細胞成分の保護作用、有害物の排泄作用促進、コリンエステラーゼの活性を高めることによる抗アレルギー作用、酵素賦活作用を有することが報告されている。しかしながら、グルタチオンは製剤中で沈殿を生じ、また多くの細胞においてグルタチオンを取り込むことができないため、細胞内においてグルタチオンの産生を促進させるための成分は極めて有用となり得る。このような成分としてはこれまでにγ－トコフェロール又はδ－トコフェロールが報告されており、これらの成分を含有するグルタチオン産生促進剤が開示されている（特開2007-284430（特許文献１））。
　また、ほかのレドックス関連因子としてはチオレドキシン系が知られており、チオレドキシン系もまた生体における酸化ストレスに対する防御機構として働く（細胞工学Vol.25、No.2、2006、p143-148（非特許文献１））。また、チオレドキシンのトランスジェニックマウスは長寿になること（Mitsui A, et al: Antioxid Redox Signal (2002) 4: 693-696（非特許文献２））、ならびにチオレドキシンは脳梗塞、糖尿病への抵抗性を有すること（Takagi Y, et al: Proc Natl Acad Sci USA(1999) 96:4131-4136（非特許文献３）, Hotta M, et al: J Exp Med (1998) 188:1445-1451（非特許文献４））やアレルギー性皮膚炎に有効であること（特開2007-269671（特許文献２））が報告されており、チオレドキシンは活性酸素消去剤として幅広く使用されている（特開平9-157153（特許文献３））。しかしながら、チオレドキシン系は高分子タンパク質であるため、これらの化合物を対象に直接投与したとしても、これらの分子を細胞内に取り込むことができない。このため、生体内においてチオレドキシン系の発現を促進させることが望ましいが、これらの発現を促進する成分としては、これまでにヨモギ抽出物又は青ジソ抽出物が知られているだけである（国際公開番号WO2006/033351（特許文献４））。
　上述のとおり、グルタチオン系やチオレドキシン系といったレドックス関連因子を生体に直接投与したとしても細胞内に効率よく取り込むことができないため、生体内においてレドックス調節機能や抗酸化機能を発揮できないおそれがある。これらのレドックス関連因子の発現は、紫外線照射ストレスによって亢進されることが知られているが、生体に安全かつ有効に作用する化学物質についてはこれまでほとんど知られておらず、生体内におけるレドックス関連因子の発現機序についても詳しくは解明されていない。したがって、生体内においてレドックス関連因子の発現を促進するための安全かつ有効な成分の発見が依然として期待されている。
特開２００７－２８４４３０ 特開２００７－２６９６７１ 特開平９－１５７１５３ 国際公開番号ＷＯ２００６／０３３３５１
細胞工学Vol.25、No.2、2006、p143-148 Mitsui A, et al: Antioxid Redox Signal (2002) 4: 693-696 Takagi Y, et al: Proc Natl Acad Sci USA(1999) 96:4131-4136 Hotta M, et al: J Exp Med (1998) 188:1445-1451
　本発明は、生体内においてレドックス関連因子の発現を促進することにより、安全かつ効率的に生体の酸化ストレスを減少させ、健康を維持し、また酸化ストレスに起因する様々な疾患及び症状を防ぐことを課題とする。
　本発明者らはこのたび、生体内におけるレッドクス関連因子としてグルタチオン系及びチオレドキシン系の発現及び活性を亢進する成分として、フラボノール類に属するケンフェロール及びクエルセチンを見出した。意外なことに、かかる作用はフラボノール類の中でもケンフェロールとクエルセチンに特異的なものであり、構造が類似するミリセチンには認められなかった。グルタチオン系やチオレドキシン系の分子を直接適用する場合と比較して、ケンフェロールやクエルセチンの適用は生体内のグルタチオン系やチオレドキシン系といったレッドクス関連因子の発現及び活性を有効に促進することが可能となるため、本発明により、生体内の多種多様な酸化ストレスをより強力に軽減することができる。ケンフェロールやクエルセチンといったフラボノール類は茶葉の植物に広く分布しており、生体にとって無毒であり安全に摂取することができる。このように、ケンフェロール及びクエルセチンを生体内におけるレッドクス関連因子の発現を促進するための有効成分とすることによって、適用される生体にストレスを与えることなく、生体内の過剰な活性酸素種を消去することが可能となる。
　したがって、本願は以下の発明を包含する：
［１］　ケンフェロール、クエルセチン若しくはこれらの配糖体又はこれらの組み合わせを有効成分として含んで成る、レドックス関連因子発現促進剤。
［２］　前記レドックス関連因子が、チオレドキシン、チオレドキシンレダクターゼ、グルタチオンレダクターゼ及びグルタレドキンから成る群から選択される１又は複数の物質であることを特徴とする、［１］に記載のレドックス関連因子発現促進剤。
［３］　イチョウ葉抽出物、サンナ抽出物又はこれらの組み合わせを有効成分として含んで成る、レドックス関連因子発現促進剤。
［４］　前記レドックス関連因子が、チオレドキシン、チオレドキシンレダクターゼ、グルタチオンレダクターゼ及びグルタレドキンから成る群から選択される１又は複数の物質であることを特徴とする、［３］に記載のレドックス関連因子発現促進剤。
［５］　レドックス関連因子発現促進剤を調製するための、ケンフェロール、クエルセチン若しくはこれらの配糖体又はこれらの組み合わせの使用。
［６］　レドックス関連因子発現促進剤を調製するための、イチョウ葉抽出物、サンナ抽出物又はこれらの組み合わせの使用。
　生体内におけるレドックス関連因子の発現を促進することにより、安全かつ効率的に生体内の活性酸素種を減少させ、酸化ストレスから生体を防御することができる。これにより生体の健康を維持し、また酸化ストレスに起因する様々な疾患及び症状を防ぐことが可能となる。
ケンフェロールによる生体内におけるレドックス発現因子の発現の亢進を示す図である。 ケンフェロールによる皮膚等価モデルにおけるレドックス関連因子の発現の亢進を示す図である。 フラボノイド化合物によるチオレドキシン系の発現の亢進作用における比較を示す図である。 イチョウ葉抽出液及びサンナ抽出液によるチオレドキシンレダクターゼの発現の亢進を示す図である。 ケンフェロール及びクエルセチンによるチオレドキシンレダクターゼの活性促進効果を示す図である。 ケンフェロール、ならびにイチョウ葉抽出液及びサンナ抽出液による炎症性サイトカイン（ＩＬ１β）の産生を抑制する効果を示す図である。
　本発明の１実施態様において、ケンフェロール、クエルセチン若しくはこれらの配糖体又はこれらの組み合わせを有効成分として含んで成るレドックス関連因子発現促進剤が供される。
　本明細書において「レドックス関連因子」は、生体、例えば哺乳類、好ましくは人間の体内に存在するタンパク質のシステイン残基のチオール基と酸化的又は還元的に反応し、細胞内を還元状態に保つ因子のことを意味する。細胞の活性化や情報伝達物質のプロセシング、すなわちシグナル伝達機構においては、特に細胞内のタンパク質に存在するシステイン残基上のチオール基の酸化によるタンパク質－タンパク質間の相互作用における修飾が重要な役割を果たしているものと考えられている。このシステイン残基上のチオール基の酸化・還元（レドックス）は、遺伝子の転写、タンパク質の細胞内局在、合成、分解の調節、ならびに細胞の増殖や細胞死等の様々な生命現象の調節に関与している。このような生体内におけるレドックスに関連する系としては、グルタチオン系及びチオレドキシン系が知られており、これらはそれぞれ一群の分子によって構成される。これらのレドックス関連因子は、生体内で発生する及び存在する活性酸素種の消去にも関与することが知られている。
　チオレドキシン系は、特にチオレドキシンとチオレドキシンレダクターゼ等の因子から構成される。チオレドキシン（ＴＲＸ）は、大腸菌のＤＮＡ合成に必須な酵素であるリボヌクレオチドレダクターゼに水素を供与する補酵素として発見された。ＴＲＸは原核生物やヒトの多様な生体で保存されている約１２ｋＤａのタンパク質であり、４つのβストランドと３つのαへリックスから成る立体構造を持ち、－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－という活性部位を有している。ＴＲＸはその活性部位の２つのシステイン残基の間でジスルフィド結合を作る酸化型（Ｓ－Ｓ）と、還元型（－ＳＨ，ＳＨ－）が存在し、還元型は基質タンパク質のジスルフィド結合を還元し、自ら酸化型となる。酸化型ＴＲＸは、ＮＡＤＰＨとチオレドキシンダクターゼにより還元され、還元型に再生される。基質タンパク質のひとつとして、ペルオキシレドキシンと総称されるH2O2消去酵素ファミリーが知られている。還元型ペルオキシレドキシンがH2O2を還元する。そして、酸化型となったペルオキシレドキシンが基質となりチオレドキシンにより還元される。酸化型となったチオレドキシンはチオレドキシンレダクターゼにより還元される。このような活性酸素種の無毒化システムにチオレドキシン系は重要な役割を果たしている。
　グルタチオン系は、特にグルタチオン、グルタチオンレダクターゼ及びグルタレドキシン等の因子から構成される。グルタチオンは、グルタミン酸、システイン及びグリシンから成るトリペプチドであり、非タンパク質性のチオール成分として細胞内に多量に存在しており、細胞内の親水性区画における主要な抗酸化物質として知られている。グルタチオンは、活性酸素種（例えばスーパーオキシド又は過酸化水素）と反応して安定なグルタチオンラジカルを形成し、２量体（ＧＳＳＧ：酸化型グルタチオン）に変化するが、これはさらにグルタチオンレダクターゼがＮＡＤＰＨからの電子をＧＳＳＧに転移して、ＧＳＨ（還元型グルタチオン）に再生される。グルタレドキシン（ＧＲＸ）は、チオレドキシンと共通した－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－という活性部位を有しており、チオレドキシンとの共通性からチオレドキシンスーパーファミリーと呼ばれる。その活性部位の２つのシステイン残基の間でジスルフィド結合を作る酸化型（Ｓ－Ｓ）と、還元型（－ＳＨ，ＳＨ－）が存在する。チオレドキシンと同様に、還元型は基質タンパク質のジスルフィド結合を還元し、自ら酸化型となる。その生物活性に関しては不明な点も多いが、生体内のレドックス調節や酸化ストレス応答に関与することが知られている。
　このように、チオレドキシン、チオレドキシンレダクターゼ、グルタチオンレダクターゼ及びグルタレドキンといったレドックス関連因子を活性化し、あるいはその発現を促進することによって、生体内の過剰な活性酸素種を減少し、酸化ストレスから生体を防御することができる。
　上述のとおり、本発明者らはこのたび、ケンフェロール及びクエルセチンが上記レドックス関連因子を活性化し、そしてその発現を促進するという驚くべき知見を得た。ケンフェロール及びクエルセチンを含むフラボノール類は、以下に示される一般式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 を有し、これらは植物中に広く分布しているフラボノイド化合物の１つである。これらのフラボノール類は、抗酸化作用を有することが知られており、またこれらのフラボノール類は血管強化作用や抗炎症作用を有することも報告されている。しかしながら、これまでにフラボノール類が生体内におけるレドックス関連因子の発現を促進することについては知られておらず、またその化学構造が極めて近似するこれらのフラボノール類の中で、ケンフェロール及びクエルセチンのみがレドックス関連因子の発現を特異的に促進することは極めて意外である。かかる知見から、ケンフェロール及びクエルセチンがレドックス関連因子の発現を促進するための活性成分として極めて有用であることは明らかである。
　また、フラボノール類が様々な配糖体を形成することは周知であり、本発明のレドックス関連因子発現促進剤においても、ケンフェロール及びクエルセチンの配糖体を活性成分として使用できる。本発明においてこれらと配糖体を形成する糖は、制限されることなく、アルドースとして、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、フコース、ラムノース、アラビノース、キシロース、及びケトースとして、例えばフルクトースが挙げられる。
　上述のとおりケンフェロール、クエルセチン及びこれらの配糖体は植物に広く分布している成分であることから、これらの成分を含む植物抽出物もまた生体内におけるレドックス関連因子の発現を促進するために有用である。本発明者らは、植物抽出物の中でも、特にイチョウ葉抽出物及びサンナ抽出物が生体内レドックス関連因子の発現を顕著に促進することを見出した。したがって、本発明のほかの実施態様においては、イチョウ葉抽出物、サンナ抽出物又はこれらの組み合わせを有効成分として含んで成るレドックス関連因子発現促進剤が供される。
　本発明のレドックス関連因子発現促進剤に有効成分として使用されるケンフェロール、クエルセチン若しくはこれらの配糖体又はこれらの組み合わせの配合量は特に限定されないが、0.00001～0.5質量％、好ましくは0.0001～0.001質量％、そして最も好ましくは0.0001質量％～0.0005質量％程度である。また、本発明のレドックス関連因子発現促進剤に有効成分として使用されるイチョウ葉抽出物、サンナ抽出物又はこれらの組み合わせの配合量は抽出物乾燥残分に換算して、例えば0.00001～0.5質量％、好ましくは0.0001～0.1質量％、そして最も好ましくは0.0001～0.01質量％程度である。
　本発明において、上記有効成分はこれらを含有するレドックス関連因子発現促進剤として経口的又は非経口的に投与することでき、これは例えば経口用組成物又は外用組成物として調製することが可能である。また、本発明のレドックス関連因子発現促進剤によって生体の健康を維持し、また酸化ストレスに起因する様々な疾患及び症状を防ぐことが可能である。このような疾患及び症状としては、制限されることなく、癌、糖尿病、自己免疫疾患、例えば関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、抗リン脂質抗体症候群、皮膚筋炎、全身性皮膚硬化症、シェーグレン症候群、ギラン・バレー症候群、慢性萎縮性胃炎、大動脈炎症候群、グッドパスチャー症候群、急速進行性糸球体腎炎、バセドウ病、慢性円板状エリテマトーデス又は習慣性流産、虚血性疾患、例えば狭心症、心筋梗塞、脳梗塞又は閉塞性動脈硬化症、アレルギー疾患、例えば気管支ぜんそく、アレルギー性鼻炎、花粉症、アレルギー性胃腸炎、じんま疹、接触皮膚炎又はアトピー性皮膚炎、皮膚の老化、色素沈着、皴、脂漏症、日焼け、火傷、アクネ、皮膚のたるみ、肥満、高血圧、メタボリックシンドローム、貧血が挙げられる。このため本発明のレドックス関連因子発現促進剤の用途に関しては無限の可能性があり、食品、飲料、化粧品、医薬品、医薬部外品等の原料並びに添加物として治療的又は美容学的に使用することができる。
　経口用組成物として取りうる形態としては、例えば一般食品の他、機能性食品、栄養補助食品、特定保健用食品、未熟児用調製乳、乳児用調製乳、乳児用食品、妊産婦食品、老人用食品、飲料、機能性食品、医薬品の形態が挙げられ、例えば、錠剤、粉末、顆粒、トローチ、内服液、懸濁液、乳濁液、シロップ等の加工形態であってもよい。
　また本発明のレドックス関連因子発現促進剤は、本発明の有効成分以外に、一般に飲食品、医薬品または医薬部外品に用いられる各種担体や抗酸化剤等の添加物を含んでよい。例えば本発明のレドックス関連因子の発現促進剤は、本発明の有効成分以外に、担体として、各種キャリアー担体、イクステンダー剤、希、釈剤、増量剤、分散剤、賦形剤、結合剤溶剤（例、水、エタノール、植物油）、溶解補助剤、緩衝剤、溶解促進剤、ゲル化剤、懸濁化剤、小麦粉、米粉、でん粉、コーンスターチ、ポリサッカライド、ミルクタンパク質、コラーゲン、米油、レシチンを含んでよい。添加剤としては、例えば、ビタミン類、甘味料、有機酸、着色剤、香料、湿化防止剤、ファイバー、電解質、ミネラル、栄養素、抗酸化剤、保存剤、芳香剤、湿潤剤、天然の食物抽出物、野菜抽出物を挙げることができるが、これらに限定しているわけではない。また抗酸化剤としては、例えば、トコフェロール類、フラボン誘導体、フィロズルシン類、コウジ酸、没食子酸誘導体、カテキン類、フキ酸、ゴシポール、ピラジン誘導体、セサモール、グァヤオール、グァヤク酸、p-クマリン酸、ノールジヒドログァヤテッチク酸、ステロール類、テルペン類、核酸塩基類、カロチノイド類、リグナン類のような天然抗酸化剤およびアスコルビン酸パリミチン酸エステル、アスコルビン酸ステアリン酸エステル、ブチルヒドロキシアニソール（BHA）、ブチルヒドロキシトルエン（BHT）、モノ-t-ブチルヒドロキノン（TBHQ）、4-ヒドロキシメチル-2,6-ジ-t-ブチルフェノール（HMBP）に代表されるような合成抗酸化剤を挙げることができる。
　外用組成物として取りうる形態としては、例えば軟膏、クリーム、プロテクター、貼付剤、パック、化粧水、乳液、ローション、浴用剤、ヘアーローション、ヘアートニック、ヘアーリキッド、シャンプー、リンス等の剤型に調製することができ、通常の外用剤として慣習的に用いられる成分、例えば美白剤、保湿剤、油性成分、紫外線吸収剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色剤、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。さらに、本発明のレドックス関連因子発現促進剤には、外用剤に慣用の助剤、例えばエデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、グルコン酸等の金属封鎖剤、カフェイン、タンニン、ベラパミル、トラネキサム酸およびその誘導体、甘草抽出物、グラブリジン、カリンの果実の熱水抽出物、各種生薬、酢酸トコフェロール、グリチルリチン酸およびその誘導体またはその塩等の薬剤、ビタミンＣ、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸グルコシド、アルブチン、コウジ酸等の美白剤、グルコース、フルクトース、マンノース、ショ糖、トレハロース等の糖類、レチノイン酸、レチノール、酢酸レチノール、パルミチン酸レチノール等のビタミンA類も適宜配合することができる。
　本発明において投与されるレドックス関連因子発現促進剤の代表的な処方例を以下に示す。
プロテクターA
　組成　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　配合量（質量％）
　デカメチルシクロペンタシロキサン　　　　　　　　　　　　　3
　メチルフェニルポリシロキサン　　　　　　　　　　　　　　　3
　ベヘニルアルコール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1
　１，３－ブチレングリコール　　　　　　　　　　　　　　　　5
　イソステアリン酸ポリオキシエチレングリセリル　　　　　　　1.5
　モノステアリン酸ポリオキシエチレングリセリン　　　　　　　1
　レドックス関連因子発現促進剤：イチョウ葉抽出液（乾燥残分）0.0001
　レドックス関連因子発現促進剤：クエルセチン　　　　　　　　0.0001
　エデト酸３ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.1
　パラメトキシ桂皮酸２－エチルヘキシル　　　　　　　　　　　7
　キサンタンガム　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.1
　カルボキシビニルポリマー　　　　　　　　　　　　　　　　　0.3
　フェノキシエタノール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　適量
　精製水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　残量
　香料　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　適量
プロテクターB
　組成　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　配合量（質量％）
　ワセリン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1
　ジメチルポリシロキサン　　　　　　　　　　　　　　　　　　3
　メチルフェニルポリシロキサン　　　　　　　　　　　　　　　3
　ステアリルアルコール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.5
　グリセリン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　7
　ジプロピレングリコール　　　　　　　　　　　　　　　　　　3
　１，３－ブチレングリコール　　　　　　　　　　　　　　　　7
　キシリトール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　3
　スクワラン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1
　イソステアリン酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.5
　ステアリン酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.5
　モノステアリン酸ポリオキシエチレングリセリン　　　　　　　1
　モノステアリン酸グリセリン　　　　　　　　　　　　　　　　2
　水酸化カリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.05
　レドックス関連因子発現促進剤：サンナ抽出液（乾燥残分）　　0.0001
　レドックス関連因子発現促進剤：ケンフェロール　　　　　　　0.0001
　アセチル化ヒアルロン酸ナトリウム　　　　　　　　　　　　　0.1
　ＥＤＴＡ３ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.05
　４－ｔ－ブチル－４’－メトキシジベンゾイルメタン　　　　　2
　パラメトキシ桂皮酸２－エチルヘキシル　　　　　　　　　　　5
　カルボキシビニルポリマー　　　　　　　　　　　　　　　　　0.1
　フェノキシエタノール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　適量
　精製水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　残量
　香料　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　適量
２層タイプクリーム
　組成　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　配合量（質量％）
　ジメチルポリシロキサン　　　　　　　　　　　　　　　　　　5
　デカメチルシクロペンタシロキサン　　　　　　　　　　　　　25
　トリメチルシロキシケイ酸　　　　　　　　　　　　　　　　　5
　ポリオキシエチレン・メチルポリシロキサン共重合体　　　　　2
　ジプロピレングリコール　　　　　　　　　　　　　　　　　　5
　パルミチン酸デキストリン被覆微粒子酸化亜鉛（60nm）　　　　15
　レドックス関連因子発現促進剤：イチョウ葉抽出液（乾燥残分）0.01
　レドックス関連因子発現促進剤：ケンフェロール　　　　　　　0.0005
　パラベン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　適量
　フェノキシエタノール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　適量
　エデト酸三ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　　　適量
　パラメトキシ桂皮酸２－エチルヘキシル　　　　　　　　　　　7.5
　ジメチルジステアリルアンモニウムヘクトライト　　　　　　　0.5
　球状ポリアクリル酸アルキル粉末　　　　　　　　　　　　　　5
　ブチルエチルプロパンジオール　　　　　　　　　　　　　　　0.5
　精製水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　残量
　香料　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　適量
軟膏
　組成　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　配合量（質量％）
　レドックス関連因子発現促進剤：イチョウ葉抽出液（乾燥残分）0.01
　レドックス関連因子発現促進剤：ケンフェロール　　　　　　　0.001
　レドックス関連因子発現促進剤：クエルセチン　　　　　　　　0.0001
　ステアリルアルコール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　18.0
　モクロウ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　20.0
　ポリオキシエチレン（２０）モノオレイン酸エステル　　　　　0.25
　グリセリンモノステアリン酸エステル　　　　　　　　　　　　0.3
　ワセリン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　40.0
　精製水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　残量
貼付剤
　組成　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　配合量（質量％）
　レドックス関連因子発現促進剤：サンナ抽出液（乾燥残分）　　0.0001
　レドックス関連因子発現促進剤：ケンフェロール　　　　　　　0.0001
　レドックス関連因子発現促進剤：クエルセチン　　　　　　　　0.0001
　クロタミトン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　3.2
　パナセート８７５Ｒ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2.5
　スクワラン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1.0
　ｄｌ－カンフル　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.07
　ポリオキシエチレン（６０モル）硬化ヒマシ油　　　　　　　　1.2
　濃グリセリン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　5.0
　ゼラチン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1.2
　ポリビニルピロリドンＫ－９０　　　　　　　　　　　　　　　0.6
　メチルパラベン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　適量
　ｄ－ソルビトール液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　35.0
　水酸化アルミニウム　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.2
　尿素　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1.3
　亜硫酸ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　適量
　エデト酸ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　適量
　クエン酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　適量
　ハイビスワコー１０４Ｒ　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.22
　ポリアクリル酸ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　0.24
　カルボキシメチルセルロースナトリウム　　　　　　　　　　　2.8
　カオリン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1.0
　精製水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　残量
イオン導入剤
　組成　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　配合量（質量％）
　レドックス関連因子発現促進剤：イチョウ葉抽出液（乾燥残分）0.0001
　レドックス関連因子発現促進剤：サンナ抽出液（乾燥残分）　　0.0001
　レドックス関連因子発現促進剤：ケンフェロール　　　　　　　0.0001
　レドックス関連因子発現促進剤：クエルセチン　　　　　　　　0.0001
　グリセリン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　5.0
　１，３－ブチレングリコール　　　　　　　　　　　　　　　　5.0
　ヒアルロン酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.05
　クエン酸（食品）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.35
　イオン交換水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　残量
キャンディーＡ
　組成　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　配合量（質量％）
　レドックス関連因子発現促進剤：イチョウ葉抽出液（乾燥残分）0.5
　砂糖　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　50.000
　水飴　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　残量
　香料　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1.000
錠剤Ｃ
　組成　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　配合量（質量％）
　レドックス関連因子発現促進剤：サンナ抽出液（乾燥残分）　　0.1
　レドックス関連因子発現促進剤：クエルセチン　　　　　　　　0.5
　ショ糖エステル　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　4.667
　メチルセルロース　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2.400
　グリセリン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1.667
　Ｎ－アセチルグルコサミン　　　　　　　　　　　　　　　　　24.7998
　ヒアルロン酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　20.000
　ビタミンＥ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　12.000
　ビタミンＢ６　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1.333
　ビタミンＢ２　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.667
　α－リポ酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1.333
　コエンザイムＱ１０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2.667
　セラミド（コンニャク抽出物）　　　　　　　　　　　　　　　3.333
　Ｌ－プロリン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　20.000
　結晶セルロース　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　残量
ソフトカプセルＢ
　組成　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　配合量（質量％）
　レドックス関連因子発現促進剤：イチョウ葉抽出液（乾燥残分）0.1
　レドックス関連因子発現促進剤：ケンフェロール　　　　　　　0.001
　レドックス関連因子発現促進剤：クエルセチン　　　　　　　　0.0001
　食用大豆油　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　35.333
　ローヤルゼリー　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　16.4668
　マカ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2.000
　ＧＡＢＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2.000
　ミツロウ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　4.000
　ゼラチン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　残量
　グリセリン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　8.000
　グリセリン脂肪酸エステル　　　　　　　　　　　　　　　　　7.000
顆粒Ａ－Ｂ
　組成　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　配合量（質量％）
　レドックス関連因子発現促進剤：イチョウ葉抽出液（乾燥残分）0.01
　レドックス関連因子発現促進剤：サンナ抽出液（乾燥残分）　　0.02
　レドックス関連因子発現促進剤：ケンフェロール　　　　　　　0.001
　大豆イソフラボン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　42.2998
　還元乳糖　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　45.000
　大豆オリゴ糖　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　3.000
　エリスリトール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　3.000
　デキストリン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2.500
　クエン酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2.000
　香料　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　残量
ドリンクＡ
　組成　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　配合量（質量％）
　レドックス関連因子発現促進剤：イチョウ葉抽出液（乾燥残分）0.001
　レドックス関連因子発現促進剤：サンナ抽出液（乾燥残分）　　0.001
　レドックス関連因子発現促進剤：ケンフェロール　　　　　　　0.0001
　レドックス関連因子発現促進剤：クエルセチン　　　　　　　　0.0001
　還元麦芽糖水飴　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　65.3998
　エリスリトール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　16.000
　クエン酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　4.000
　香料　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2.600
　Ｎ－アセチルグルコサミン　　　　　　　　　　　　　　　　　2.000
　ヒアルロン酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1.000
　ビタミンＥ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.600
　ビタミンＢ６　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.400
　ビタミンＢ２　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.200
　α-リポ酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 0.400
　コエンザイムＱ１０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2.400
　セラミド（コンニャク抽出物）　　　　　　　　　　　　　　　0.800
　Ｌ－プロリン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　4.000
　精製水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　残量
クッキー
　組成　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　配合量（質量％）
　レドックス関連因子発現促進剤：イチョウ葉抽出液（乾燥残分）0.5
　レドックス関連因子発現促進剤：ケンフェロール　　　　　　　0.5
　薄力粉　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　48.7998
　バター　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　17.500
　グラニュー糖　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　20.000
　卵　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　12.500
　香料　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　残余
　バターを撹拌しながら、グラニュー糖を徐々に添加した後、卵、イチョウ葉抽出液、サンナ抽出液、ケンフェロール、クエルセチンおよび香料を添加しさらに攪拌する。十分に混合した後、均一に振るった薄力粉を加え、低速にて撹拌し塊状で冷蔵庫に寝かせる。その後、成型し１７０℃１５分焼成しクッキーとする。
例１．チオレドキシン系を発現亢進する薬剤の探索
　正常なヒト表皮角化細胞（KK-4009, KURABO）をDefined Keratinocyte-SFM培地（10744-019,GIBCO）中、高湿、CO2 5%、37℃で培養した。最終密度100%の細胞をカルシウム濃度1.5mMに調整したEpiLifeTM CalciuM-Free Phenol Red Free 培地(M-EPICF/PRF-500, KURABO)に置換した。24時間後、これらにケンフェロール（K0018、東京化成工業株式会社）、ビタミンE（95240、FULKA）、及びリポ酸（(+/－)-α-リポ酸）（T1395、SIGMA）を終濃度10μMになるよう添加した。
　薬剤添加後、24時間後にQIAZOL Lysis Reagent(79306、QIAGEN)を用いてRNAを単離し、RNeasy kit(74106、QIAGEN)を用いてRNAを精製した。その後、QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit（204243, QIAGEN）を用いて、ライトサイクラーソフトウェア（Roche）によりチオレドキシンレダクターゼ、チオレドキシン、グルタチオンレダクターゼ、グルタレドキシン、内部標準としてリボソーマルプロテインのmRNA量を定量した。用いたプライマーの配列を以下に示す。
　チオレドキシンレダクターゼ・フォワードプライマー：
　TGCTGGCAATAGGAAGAGATGGCTTGCAC
　チオレドキシンレダクターゼ・リバースプライマー：
　GCAATCTTCCTGCCTGCCTGGATTGCAACTGG
　チオレドキシン・フォワードプライマー：
　TCGGTCCTTACAGCCGCTCGTCAGACTCCA
　チオレドキシン・リバースプライマー：
　AGGCCCACACCACGTGGCTGAGAAGTCAAC
　グルタチオンレダクターゼ・フォワードプライマー：
　GATCCTGTCAGCCCTGGGTTCTAAGACATC
　グルタチオンレダクターゼ・リバースプライマー：
　TAACCATGCTGACTTCCAAGCCCGACAA
　グルタレドキシン・フォワードプライマー：
　ATCACAGCCACCAACCACACTAACGAGA
　グルタレドキシン・リバースプライマー：
　GTTACTGCAGAGCTCCAATCTGCTTTAGCC
　リボソーマルプロテイン・フォワードプライマー：
　ACAGAGGAAACTCTGCATTCTCGCTTCCTG
　リボソーマルプロテイン・リバースプライマー：
　CACAGACAAGGCCAGGACTCGTTTGTACC
　チオレドキシンレダクターゼ、チオレドキシン、グルタチオンレダクターゼ、及びグルタレドキシンのmRNA量を、リボソーマルプロテインのmRNA量で除したものをmRNA発現量とした。
　その結果、ケンフェロールは、抗酸化作用を有することが知られているビタミンE及びリポ酸と比較して、レドックス関連因子の発現を有意に亢進した（図１）。
例２．皮膚等価モデル中のレドックス関連因子の発現におけるケンフェロールの作用
　正常なヒト、正常ヒト角化細胞（Invitrogen）、正常ヒト線維芽細胞（ATCC)及びコラーゲンI（Sigma）から皮膚等価モデルを作製し、そしてDulbecco's Modified Eagle's培地（D-MEM)(Invitrogen）中、高湿、CO2 5%、37度において培養した。2mM又は10mMのケンフェロールを該培養培地に添加し、そして該モデルを24時間培養した。その後、QIAGEN mRNA単離キットを用いて皮膚等価モデルの上皮層からRNAを単離した。続いて、Real-time PCRキット(Bio-Rad)を用いたq-PCR（Bio-Rad MyiQ単色リアルタイムPCR検出システムによる定量PCR）により、チオレドキシンレダクターゼ及びグルタチオンレダクターゼ、ならびに内部標準として36B4のmRNAを定量した。プライマーはQIAGENから購入した（TXNRD2: #QT00070371;　GSR; #QT00038325)。チオレドキシンレダクターゼ量及びグルタチオンレダクターゼ量を36B4のmRNA量で除算し、mRNA発現レベルを得た。
　その結果、ケンフェロールは皮膚等価モデル中のレドックス関連因子の発現を有意に亢進した（図２）。
例３．チオレドキシン系を発現亢進する薬剤の探索－フラボノイド化合物
　正常ヒト表皮角化細胞（KK-4009, KURABO）をDefined Keratinocyte-SFM培地（10744-019,GIBCO）中、高湿、CO2 5%、37度において培養した。最終密度100%の細胞をカルシウム濃度1.5mMに調整したEpiLifeTM　CalciuM-Free Phenol Red Free培地(M-EPICF/PRF-500, KURABO)に置換した。24時間後に、下記薬剤を終濃度10μMになるよう添加した。
　ケンフェロール（K0018、東京化成工業株式会社）
　クエルセチン（173-00403、和光純薬工業（株））
　ミリセチン（70050、FLUKA）
　エピガロカテキンガレート（E4143、CIAL）
　ヘスペリジン（086-07342、和光純薬工業（株））
　アピゲニン（012-18913、和光純薬工業（株））
　ゲニステイン（070-04681、和光純薬工業（株））
　薬剤添加後24時間後に上記例１の方法でレドックス関連因子のmRNAの発現量を定量した。
　その結果、上記フラボノイド化合物のうち、ケンフェロールとクエルセチンのみがチオレドキシン系の発現を有意に亢進した（図３）。
例４．チオレドキシン系を発現亢進する薬剤の探索－植物エキスの探索
　正常ヒト表皮角化細胞（KK-4009, KURABO）をDefined Keratinocyte-SFM培地（10744-019,GIBCO）中、高湿、CO2 5%、37度において培養した。終密度100%の細胞をカルシウム濃度1.5mMに調整したEpiLifeTM　CalciuM-Free Phenol Red Free培地(M-EPICF/PRF-500,KURABO)に置換した。24時間後に下記薬剤を終濃度0.1%になるよう添加した。
　サンナ抽出液：サンナ（Kaempferia galanga）の根茎を50% 1,3-ブチレングリコールにより抽出して得られるもの；
　イチョウ葉抽出液：イチョウ（Ginkgo biloba L.）の葉の50%エタノール抽出物を1,3-ブチレングリコールに転溶して得られるもの；
　テンチャエキス：甜茶（Rubus Suavissimus Shugan Lee.(Rosaseae)）の熱湯抽出物を50% 1,3-ブチレングリコールに転溶して得られるもの。
　薬剤添加後24時間後に例１の方法でレドックス関連因子のmRNAの発現量を定量した。
　その結果、ケンフェロール、クエルセチン及びこれらの配糖体を含有することが知られている植物抽出液のうち、イチョウ葉抽出液又はサンナ抽出液が特にチオレドキシン系の発現を亢進することが確認された（図４）。
例５．チオレドキシンレダクターゼ活性促進効果
　正常ヒト表皮角化細胞（KK-4009, KURABO）をDefined Keratinocyte-SFM培地（10744-019,GIBCO）中、高湿、CO2 5%、37度において培養した。終密度100%の細胞をカルシウム濃度1.5mMに調整したEpiLifeTM　CalciuM-Free Phenol Red Free培地(M-EPICF/PRF-500,KURABO)に置換した。24時間後に、ケンフェロール（K0018、東京化成工業株式会社）又はクエルセチン（173-00403、和光純薬工業（株））を終濃度10μMになるよう添加した。薬剤添加後24時間後に溶解バッファーに溶解させ、不溶性画分を14,000rpmにて15分、4℃での遠心分離操作により除去した。可溶性画分中の総タンパク質量を定量後、Arne Holmgrenらによるチオレドキシンレダクターゼ活性測定方法（METHODS IN ENZYMOLOGY,1995,252,199-）に準じて活性測定を行った。
　その結果、ケンフェロール及びクエルセチンは、チオレドキシンレダクターゼの活性を促進することが確認された（図５）。
例６．ケンフェロール、サンナ抽出液、イチョウ葉抽出液による炎症性サイトカイン（IL1β）の発現抑制効果
　正常ヒト表皮角化細胞（KK-4009, KURABO）をDefined Keratinocyte-SFM培地（10744-019,GIBCO）中、高湿、CO2 5%、37度において培養した。終密度100%の細胞をカルシウム濃度1.5mMに調整したEpiLifeTM　CalciuM-Free Phenol Red Free培地(M-EPICF/PRF-500,KURABO)に置換した。24時間後にケンフェロールを終濃度10μM、下記植物抽出液を終濃度0.1%になるよう添加した。
　ケンフェロール（K0018、東京化成工業株式会社）
　サンナ抽出液：サンナ（Kaempferia galanga）の根茎を50% 1,3-ブチレングリコールにより抽出して得られるもの
　イチョウ葉抽出液：イチョウ（Ginkgo biloba L.）の葉の50%エタノール抽出物を1,3-ブチレングリコールに転溶して得られるもの
　薬剤添加後24時間後に例１の方法でRNAを抽出し、炎症関連因子(IL1β)のmRNA発現量を定量した。用いたプライマーは以下の通りである。
　ＩＬ１β・フォワードプライマー：
　GGCCATGGACAAGCTGAGGAAGATGCTG
　ＩＬ１β・リバースプライマー：
　TGCATCGTGCACATAAGCCTCGTTATCCC
　IL1βのmRNA量をリボソーマルプロテインのmRNA量で除したものをmRNA発現量とした。
　その結果、ケンフェロール、ならびにサンナ抽出液及びイチョウ葉抽出液によって、炎症性サイトカインであるIL1βの産生が抑制されたことから、これらの成分は抗炎症作用を有することが確認された（図６）。

Claims (4)

  1. 　ケンフェロール、クエルセチン若しくはこれらの配糖体又はこれらの組み合わせを有効成分として含んで成る、レドックス関連因子発現促進剤。
  2. 　前記レドックス関連因子が、チオレドキシン、チオレドキシンレダクターゼ、グルタチオンレダクターゼ及びグルタレドキンから成る群から選択される１又は複数の物質であることを特徴とする、請求項１に記載のレドックス関連因子発現促進剤。
  3. 　イチョウ葉抽出物、サンナ抽出物又はこれらの組み合わせを有効成分として含んで成る、レドックス関連因子発現促進剤。
  4. 　前記レドックス関連因子が、チオレドキシン、チオレドキシンレダクターゼ、グルタチオンレダクターゼ及びグルタレドキンから成る群から選択される１又は複数の物質であることを特徴とする、請求項３に記載のレドックス関連因子発現促進剤。
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