CN103145853A - 重组Tα1-BP5融合肽、基因、工程菌及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了重组Tα1-BP5融合肽、基因、工程菌及应用。该重组融合肽为胸腺素α1和法氏囊五肽BP5通过柔性Linker融合而成。本发明将重组Tα1-BP5融合肽基因插入表达载体，转化大肠杆菌，获得高效表达重组Tα1-BP5融合肽的基因工程菌，通过液体培养、纯化制得的重组Tα1-BP5融合肽，该融合肽经N端带有His标签的肠激酶去除硫氧还蛋白，再经亲和层析纯化，可获得单一的重组Tα1-BP5融合肽。本发明的重组Tα1-BP5融合肽可作为配合疫苗使用的新型多肽免疫佐剂，能够有效增强机体细胞免疫和体液免疫水平，具有广阔的应用前景。

Description

重组Tα1-BP5融合肽、基因、工程菌及应用

技术领域

本发明涉及一种胸腺素α1与法氏囊五肽BP5重组融合肽，同时还涉及编码该重组融合肽的基因，表达该融合肽的工程菌及应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

胸腺是免疫系统中重要的中枢免疫器官，负责细胞的分化和成熟，胸腺组织产生多种激素或因子，其中胸腺素α1（Tα1）是一种高度保守的小分子活性肽，富含酸性氨基酸，由28个氨基酸组成，Tα1是由胸腺上皮细胞和胸腺内分泌细胞产生，广泛存在于机体的胸腺上皮细胞、外周血、大脑、垂体、精液、滤泡液和羊水中；在某些保护细胞及激活的淋巴细胞上清中也存在着Tα1；在某些肿瘤细胞中存在着相当水平的Tα1；甚至在某些昆虫、蟹、原生动物、真菌和细菌中也出现了类似Tαl的活性物质。除此以外，培养的胸腺上皮细胞、含有ProTα的人外周血细胞以及微孔小室胎胸腺上皮细胞上清中也含有高水平的Tα1。研究表明，Tα1也存在于McF-7细胞的胞浆中和结肠腺细胞的核膜上。Tα1主要作用于胸腺细胞成熟的早期和晚期，诱导T细胞分化成熟，能够增加T细胞在各种抗原或致有丝分裂原激活后产生INF-α（干扰素α）、INF-γ、IL-1（白细胞介素）、IL-2、IL-3、IL-6、IL-7和CSF（集落刺激因子）等多种淋巴因子的分泌，增加T细胞表面淋巴因子受体的水平。Tα1能调节NK细胞的发育分化、成熟以及存活。

法氏囊（bursa of Fabricus，BF）是禽类独有的中枢免疫器官，其功能类似于哺乳动物中的骨髓。法氏囊超滤物（1KD以下）中含有许多生物活性物质，特别是一些小肽对禽类具有免疫调节功能，能促进禽类、哺乳动物细胞的分化发育，促进免疫器官的成熟。其中的法氏囊活性五肽（BP5）是法氏囊中新分离出来的一种新的活性小肽，其氨基酸结构序列为：Cys-Lys-Asp-Val-Tyr。研究发现，BP5可以促进T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖，不但具有提高机体体液免疫和细胞免疫功能，还具有平衡Th1和Th2类型免疫反应的功能。而法氏囊活性五肽的免疫平衡作用是一般免疫增强剂所不具备的。

由于法氏囊五肽BP5只能从鸡的法氏囊组织中提取，胸腺素α1从胸腺组织中提取，来源受到很大的限制，而且其它杂蛋白含量高，纯化难度大，其实际效果也受到很大程度的影响。而化学合成的胸腺素α1或法氏囊活性五肽BP5成本高，不适合田间推广。因此采用基因工程的方法进行研究具有非常重大的意义。

发明内容

本发明的目的是提供重组Tα1-BP5融合肽。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是提供重组Tα1-BP5融合肽，该融合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

本发明的目的还在于提供一种重组Tα1-BP5融合肽的基因。

本发明所采用的技术方案还在于提供一种重组Tα1-BP5融合肽的基因，该融合肽基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；该融合肽基因由胸腺素α1基因和法氏囊五肽BP5基因通过柔性连接肽Linker基因串联而成，并在5’端加有肠激酶识别位点基因序列。

本发明的目的还在于提供一种重组Tα1-BP5融合肽的工程菌。

本发明所采用的技术方案还在于提供一种重组Tα1-BP5融合肽的工程菌，该工程菌的构建方法包括以下步骤：

1）重组Tα1-BP5融合肽基因SOE-PCR扩增

根据猪大肠杆菌偏嗜密码子设计重组Tα1-BP5融合肽基因，并针对该融合肽基因设计引物F₁、F₂和F₃，然后进行SOE-PCR扩增；将PCR扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切下目的条带进行回收，回收产物中片段大小为114bp的为重组Tα1-BP5融合肽基因；

2）携带重组Tα1-BP5融合肽基因的工程菌的构建

将重组Tα1-BP5融合肽基因和质粒载体pET32a用EcoRI、SalI双酶切，并将酶切的重组Tα1-BP5融合肽基因和质粒载体pET32a连接，连接产物转化E.coli DH5α；提取质粒，并将重组表达质粒进行HindIII缺失酶鉴定；酶切鉴定为阳性的质粒测序，命名为pET32a-Tα1-BP5；将重组质粒pET32a-Tα1-BP5转化进入大肠杆菌BL21中，筛选阳性克隆，即为表达重组Tα1-BP5融合肽的工程菌。

所述引物

F₁：5’-CCGGAATTCAGCGACGCTGCTGTTGACACTAGCAGCGAAATCACTACTAAAGACTTG-3’；

F₂：5’-GTTCGGGGTGCTGCCGCCGCCGCCGTTTTCAGCTTCTTCAACAACTTCTTTTTTTTCTTTCAAGTCTTTAGTAGT-3’；

F₃：5’-GGCGGCGGCGGCAGCTGCAAAAATGTGTATTAAGTCGACTCG-3’。

本发明的目的还在于提供一种重组Tα1-BP5融合肽的制备方法。

本发明所采用的技术方案还在于提供一种重组Tα1-BP5融合肽的制备方法，包括以下步骤：

1）将携带重组Tα1-BP5融合肽基因的工程菌接种到LB液体培养基培养，当菌体浓度OD₆₀₀=0.4-0.6时，加入IPTG进行诱导表达4～6h，IPTG终浓度为1mM；

2）将诱导表达的菌液12000rmp离心10min，收集沉淀，用洗涤液重悬沉淀，并超声波裂解10min；然后12000rmp离心10min，收集上清液；

3）将上清液用Ni柱亲和层析进行纯化，得到N端连有硫氧还蛋白的重组Tα1-BP5融合肽的纯化产物；

4）将步骤3）的纯化产物通过N端带有His标签的肠激酶切去除硫氧还蛋白后，再进行Ni柱亲和层析，收集穿透峰，并用PBS进行透析，得到重组Tα1-BP5融合肽。

本发明将重组Tα1-BP5融合肽基因插入表达载体，转化大肠杆菌，获得高效表达重组Tα1-BP5融合肽的基因工程菌，通过液体培养、纯化制得的重组Tα1-BP5融合肽，该融合肽经N端带有His标签的肠激酶去除硫氧还蛋白，再经亲和层析纯化，可获得单一的重组Tα1-BP5融合肽。

本发明的目的还在于提供一种重组Tα1-BP5融合肽在作为免疫佐剂方面的应用。

本发明所采用的技术方案还在于提供一种重组Tα1-BP5融合肽在作为免疫佐剂方面的应用。

将重组Tα1-BP5融合肽与单独的胸腺素α1或法氏囊五肽BP5进行免疫活性比较，结果显示，重组的Tα1-BP5融合肽在体外淋巴细胞增殖试验中表现出比单独的胸腺素α1和法氏囊五肽BP5更高的刺激淋巴细胞增殖的活性。本发明的重组Tα1-BP5融合肽可作为配合疫苗使用的新型多肽免疫佐剂，与疫苗配合单一胸腺素α1或疫苗配合单一法氏囊五肽BP5相比，具有更好的免疫佐剂效果，能够有效增强机体细胞免疫和体液免疫水平，具有广阔的应用前景。

另外，本发明的重组Tα1-BP5融合肽具有抗病毒、抗感染及抑制肿瘤生长的作用，将本发明的重组Tα1-BP5融合肽与抗病毒、抗感染或抗肿瘤药剂混合在一起，可以达到提高治疗效果目的。本发明的重组Tα1-BP5融合肽与疫苗通过物理或简单混合的方法也可以制成疫苗复合物。

附图说明

图1为重组表达质粒pET32a-Tα1-BP5的缺失酶鉴定图；

图中，1：DL2000DNA Marker；2：HindIII酶切重组质粒pET32a-Tα1-BP5；3：重组质粒pET32a-Tα1-BP5

图2为重组Tα1-BP5融合肽在大肠杆菌中不同诱导时间的SDS-PAGE电泳图；

图中，1：低分子量蛋白质Marker；2：诱导的大肠杆菌BL21(DE3)：3：诱导0h的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET32a-Tα1-BP5；4：诱导1h的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET32a-Tα1-BP5；5：诱导2h的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET32a-Tα1-BP5；6：诱导3h的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET32a-Tα1-BP5；7：诱导4h的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET32a-Tα1-BP5；8：诱导5h的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET32a-Tα1-BP5；9：诱导6h的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET32a-Tα1-BP5；10：诱导7h的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET32a-Tα1-BP5

图3为重组Tα1-BP5融合肽在大肠杆菌BL21中的表达的SDS-PAGE分析图；

图中，1：低分子量蛋白质Marker；2：未诱导的大肠杆菌BL21(DE3)；3：未诱导的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET32a-Tα1-BP5；4：诱导的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET32a-Tα1-BP5

图4为重组Tα1-BP5融合肽体外活性测定结果；

图5为禽流感H9N2HA抗体亚型IgG1检测结果；

图6为禽流感H9N2HA抗体亚型IgG2a检测结果；

图7为小鼠血清中细胞因子IFN-γ含量测定；

图8为小鼠血清中细胞因子IL-4含量测定；

图9为小鼠脾脏淋巴细胞增殖分析结果。

具体实施方式

实施例1、表达重组Tα1-BP5融合肽工程菌的构建

1、重组Tα1-BP5融合肽基因SOE-PCR扩增

1）设计引物

根据猪大肠杆菌偏嗜密码子设计重组Tα1-BP5融合肽基因，如下：

5’-AGCGACGCTGCTGTTGACACTAGCAGCGAAATCACTACTAAAGACTTGAAAGAAAAAAAAGAAGTTGTTGAAGAAGCTGAAAACGGCGGCGGCGGCAGCTGCAAAAATGTGTAT-3’（SEQ ID NO:1）

并针对该融合肽基因设计引物F₁、F₂和F₃，其中在引物F₁中加上EcoRI酶切位点，引物F₃中加上终止密码子和SalI酶切位点，引物由上海Invitrongen公司合成，如下：

F₁：5’-CCGGAATTCAGCGACGCTGCTGTTGACACTAGCAGCGAAATCACTACTAAAGACTTG-3’（SEQ ID NO:2），其中下划线部分为EcoRI酶切位点；

F₂：5’-GTTCGGGGTGCTGCCGCCGCCGCCGTTTTCAGCTTCTTCAACAACTTCTTTTTTTTCTTTCAAGTCTTTAGTAGT-3’（SEQ ID NO:3）；

F₃：5’-GGCGGCGGCGGCAGCTGCAAAAATGTGTATTAAGTCGACTCG-3’（SEQ IDNO:4），其中下划线部分为SalI酶切位点。

2）SOE-PCR扩增

PCR反应体系：10×PCR Buffer5μL，MgCl₂3μL，10mmol/L的dNTP1μL，终浓度为20pmol/L的引物F₁、F₂和F₃各2μL，TaKaRa ExTaq0.5μL，灭菌超纯水34.5μL，反应总体积50μL。

PCR反应程序：94℃预变性2min，进入PCR循环：94℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸6min，其中变性和退火共30个循环。

将PCR产物经含有溴化乙锭（Ethidium Bromide，EB）1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切下目的条带，随后按胶回收试剂盒（大连TaKaRa公司）使用说明进行回收，并对回收产物进行电泳鉴定，片段大小为114bp的即为重组Tα1-BP5融合肽基因，对基因序列测定后，推导其编码的重组Tα1-BP5融合肽为38个氨基酸。

2、携带重组Tα1-BP5融合肽基因的工程菌的构建

将重组Tα1-BP5融合肽基因和质粒载体pET32a用EcoRI、SalI双酶切，并置于37℃水浴2h，将酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，胶回收试剂盒进行回收鉴定。经过酶切的重组Tα1-BP5融合肽基因和质粒载体pET32a按摩尔比1:3的比例在4℃过夜连接。取连接产物加入含有100μL感受态DH5α的聚丙烯离心管中，轻轻混匀后冰浴30min。将聚丙烯离心管从冰中取出后42℃热休克90s，然后立即冰浴2min。取出加入37℃预热的LB培养基800μL中，于37℃振摇（120rpm）45min。取100μL菌液均匀涂布在含氨苄青霉素(Amp)50μg/mL的琼脂LB平板上，37℃放置20min后，倒置培养18h。

按《分子克隆实验指南》上的碱裂解法提取质粒。对提取的质粒用HindIII对质粒进行缺失酶鉴定，即将酶切产物进行DNA电泳鉴定，DNA电泳结果显示质粒没有被HindIII切出相应条带，表明重组质粒已经缺失HindIII酶切位点，如图1所示。并将重组阳性质粒命名为pET32a-Tα1-BP5。将重组质粒pET32a-Tα1-BP5送上海Invitrongen公司测序。采用CaCl₂转化法，将重组质粒pET32a-Tα1-BP5转化进入大肠杆菌BL21（DE3）中，筛选阳性克隆，即为表达重组Tα1-BP5融合肽的工程菌，命名为BL21(DE3)/pET32a-Tα1-BP5。

实施例2、重组Tα1-BP5融合肽的制备

1、将表达重组Tα1-BP5融合肽的工程菌接种到3mL LB液体培养基（50μg/mL氨苄青霉素）中，于37℃振摇培养过夜；第二天从中取出菌液加到3mL LB液体培养基中，使菌体浓度达到OD₆₀₀≈0.1后，37℃振摇培养，当菌体浓度OD₆₀₀≈0.4-0.6时，加入IPTG进行诱导表达4h，IPTG的终浓度为1mM；每隔1小时收集100μL菌液，对重组Tα1-BP5融合肽在大肠杆菌中不同诱导时间的表达量进行SDS-PAGE分析，如图2所示。将菌液4000rpm离心10min，收集菌体，将收集的菌体用100μL PBS重悬后，加等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液（100mmol/L Tris·Cl(pH6.8)、200mmol/L二硫苏糖醇(DTT)、4%SDS(电泳级)、0.2%溴酚蓝及20%甘油），100℃煮沸5min以使蛋白质变形，然后取10μL进行SDS-PAGE凝胶电泳，SDS-PAGE电泳凝胶的配制及电泳条件参照分子克隆手册，具体步骤如下：

1）分离胶（15%）的配制：水3.4mL；30%丙烯酰胺溶液4.0mL；1.5M Tris·HCl（pH8.8）2.5mL；10%SDS0.10mL；10%过硫酸铵0.05mL；TEMED0.01mL。

按以上顺序加样后快速灌胶，小心地在液面上覆盖一层去离子水。在室温下放置10min待胶凝固后弃取水，用吸水纸吸干。

2）浓缩胶（5%）的配制：水5.7mL；30%丙烯酰胺溶液1.7mL；1.5M Tris·HCl（pH6.8）2.5mL；10%SDS0.1mL；10%过硫酸铵0.05mL；TEMED0.01mL。

3）将浓缩胶液体混匀后覆盖在分离胶之上，随后插入梳子，于室温下放置10min待胶凝固后，拔去梳子，向电泳槽内倒入Tris-甘氨酸电泳缓冲液（25mmol/L Tris、250mmol/L甘氨酸(电泳级)(pH8.3)、0.1%SDS），加样结束后接通电源。电源负极端接上槽，正极端接下槽。在浓缩胶中电压为80V，进入分离胶中电压调整为120V。直到样品到达分离胶底部后关闭电源，取出凝胶，用考马斯亮蓝染色1h，随后在脱色摇床上脱色1-2h，观察SDS-PAGE电泳蛋白染色结果。

2、将诱导表达的菌液12000rmp离心10min，收集菌体，用洗涤液（5mM咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，pH7.9）重悬菌体，后经超声波裂解10min，12000rmp离心10min，收获包涵体沉淀和上清液。SDS-PAGE电泳鉴定表达产物主要以可溶性表达，如图3所示。将此上清液用Ni柱亲和层析进行纯化，具体操作过程如下：

将树脂摇匀后，向柱子里加入5.0mL树脂悬液，置于室温下使其自然沉降，确保柱床体积为2.5mL，随后分别加入3倍体积的纯水、5倍体积1×Charge buffer、3倍体积1×Bindingbuffer。当1×Binding buffer流到柱床底部时，向柱子里加入上清液，控制流速，以每小时25mL的流量过柱，确保蛋白能充分地结合到柱子上。接着加入25mL1×Bingding buffer进行洗涤，随后用15mL1×Wash buffer洗涤，最终用15mL的1×Elute buffer洗脱蛋白，即得到重组Tα1-BP5融合肽的纯化产物，分子量约24KDa。该融合蛋白在重组Tα1-BP5融合肽N端连有硫氧还蛋白。

3、将重组Tα1-BP5融合肽的纯化产物通过N端带有His标签的肠激酶切去除硫氧还蛋白，可获得保持天然N端的重组Tα1-BP5融合肽。再次进行Ni柱亲和层析，收集穿透峰，将纯化的蛋白用PBS进行透析，得到纯度极高分子量约4KDa的重组Tα1-BP5融合肽。将得到的重组Tα1-BP5融合肽在蛋白核酸测定仪（型号GeneQuant pro RNA/DNA Calculator）定量后冷冻干燥。

实验例1、重组Tα1-BP5融合肽的体外活性测定

采用常规方法分离小鼠淋巴细胞，置于CO₂培养箱中37℃培养6h；将不同浓度的重组Tα1-BP5融合肽（20μmoL/L、10μmoL/L、5μmoL/L、2.5μmoL/L、1.25μmoL/L）加入含淋巴细胞的孔中，每孔100μL，并设对照组（PBS、10μmoL/L硫氧还蛋白(TRx)、10μmoL/L标准品Tα1、10μmoL/L BP5），MTT法测定重组Tα1-BP5融合肽体外活性，结果如图4所示。从图4中可以看出，本发明的重组Tα1-BP5融合肽可显著促进淋巴细胞的分裂、增殖，与单一的胸腺素α1和法氏囊五肽BP5相比，本发明的重组Tα1-BP5融合肽刺激淋巴细胞增殖活性更强，且重组Tα1-BP5融合肽浓度为5μmoL/L、20μmoL/L时差异显著（P＜0.05），浓度为10μmoL/L时差异极显著（P＜0.01）。

实验例2、重组Tα1-BP5融合肽作为免疫佐剂的效果分析

将本发明的重组Tα1-BP5融合肽配合禽流感H9N2灭活疫苗联合免疫，分析其免疫增强效果。禽流感灭活疫苗（H9N2亚型，SDS696株）购自乾元浩生物股份有限公司。

将6周龄雌性BALB/c小鼠分为5组，分别为灭活疫苗组、灭活疫苗+重组Tα1-BP5融合肽组、灭活疫苗+单独胸腺素α1组、灭活疫苗+单独法氏囊活性肽BP5组及PBS对照组，每组10只，重组Tα1-BP5融合肽、单独胸腺Tα1和单独法氏囊活性肽BP5使用剂量均为10μg/鼠。采用腹膜内注射，间隔两周免疫一次，共免疫三次，最后一次免疫一周后尾静脉采血。分别测定不同组中小鼠禽流感H9N2病毒抗体亚型、血清中IL-4和IFN-γ的含量，并同时分离小鼠脾脏淋巴细胞检测脾淋巴细胞增殖，结果如图5-9所示。

小鼠禽流感H9N2病毒抗体亚型IgG检测结果如图5、6所示。从图5、6中可以看出，单独禽流感H9N2疫苗主要诱导IgG1的产生，而重组Tα1-BP5融合肽+灭活疫苗组不但能诱导高水平IgG1的产生，而且诱导IgG2a产生的能力好于单独禽流感H9N2疫苗组。同时，重组Tα1-BP5融合肽+灭活疫苗诱导IgG1和IgG2a的能力好于灭活疫苗+单独胸腺素α1和灭活疫苗+单独法氏囊活性肽BP5，重组Tα1-BP5融合肽二者联合免疫后诱导小鼠的抗体分泌水平强于其他组。

小鼠血清中IL-4和IFN-γ的含量检测结果如图7、8所示。从图7、8中可以看出，灭活疫苗+单独胸腺素α1主要诱导IL-4的分泌，灭活疫苗+单独法氏囊活性肽BP5主要诱导IFN-γ的分泌，而灭活疫苗+重组Tα1-BP5融合肽诱导IL-4和IFN-γ的分泌明显高于灭活疫苗+单独胸腺素α1和灭活疫苗+单独法氏囊活性肽BP5。另外，重组Tα1-BP5融合肽能平衡两种细胞因子的分泌。

将二次加强免疫14天后的小鼠杀死，分离脾脏淋巴细胞，用大肠杆菌表达的H9N2HA抗原蛋白进行刺激，然后检测淋巴细胞的增殖情况，如图9所示。从图9中可以看出，使用重组Tα1-BP5融合肽作为免疫佐剂的小鼠组淋巴细胞的增殖最强，远远高于其他组，其差异极显著（P＜0.05）。

Claims (6)

1.重组Tα1-BP5融合肽，其特征在于，该融合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

2.一种编码权利要求1所述的重组Tα1-BP5融合肽的基因，其特征在于，该融合肽基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.根据权利要求2所述的一种编码重组Tα1-BP5融合肽的基因，其特征在于，所述融合肽基因由胸腺素α1基因和法氏囊五肽BP5基因通过柔性连接肽Linker基因串联而成，并在5’端加有肠激酶识别位点基因序列。

4.一种表达权利要求1所述的重组Tα1-BP5融合肽的工程菌，其特征在于，该工程菌的构建方法包括以下步骤：

1）重组Tα1-BP5融合肽基因SOE-PCR扩增

根据猪大肠杆菌偏嗜密码子设计重组Tα1-BP5融合肽基因，并针对该融合肽基因设计引物F₁、F₂和F₃，然后进行SOE-PCR扩增；将PCR扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切下目的条带进行回收，回收产物中片段大小为114bp的为重组Tα1-BP5融合肽基因；

2）携带重组Tα1-BP5融合肽基因的工程菌的构建

将重组Tα1-BP5融合肽基因和质粒载体pET32a用EcoRI、SalI双酶切，并将酶切的重组Tα1-BP5融合肽基因和质粒载体pET32a连接，连接产物转化E.coli DH5α；提取质粒，并将重组表达质粒进行HindIII缺失酶鉴定；酶切鉴定为阳性的质粒测序，命名为pET32a-Tα1-BP5；将重组质粒pET32a-Tα1-BP5转化进入大肠杆菌BL21中，筛选阳性克隆，即为表达重组Tα1-BP5融合肽的工程菌。

5.根据权利要求4所述的重组Tα1-BP5融合肽基因的工程菌，其特征在于，所述引物

F₁：5’-CCGGAATTCAGCGACGCTGCTGTTGACACTAGCAGCGAAATCACTACTAAAGACTTG-3’；

F₂：5’-GTTCGGGGTGCTGCCGCCGCCGCCGTTTTCAGCTTCTTCAACAACTTCTTTTTTTTCTTTCAAGTCTTTAGTAGT-3’；

F₃：5’-GGCGGCGGCGGCAGCTGCAAAAATGTGTATTAAGTCGACTCG-3’。

6.一种如权利要求1所述的重组Tα1-BP5融合肽在作为免疫佐剂方面的应用。

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