CN1381502A - 甲醇酵母分泌型表达重组胸腺素α1 - Google Patents

Abstract

人胸腺素是胸腺分泌的多肽,在体内起重要的免疫调节作用。其中胸腺素α₁是胸腺分泌的主要功能因子,作为一种免疫增强剂,主要用于免疫缺陷和免疫耐受抑制的疾病治疗。本发明应用基因工程的方法,建立了高效、稳定的胸腺素α₁的甲醇营养型酵母分泌表达系统,并经发酵和纯化得到了高纯度、高活性的重组胸腺素α₁。

Description

甲醇酵母分泌型表达重组胸腺素α1

1961年，Miller等首先发现了胸腺的功能，新生老鼠在胸腺被摘除后，生长以及淋巴组织和发育都受到严重阻碍。以后的一些研究表明，胸腺是一种重要的免疫器官，它在淋巴系统发育中起着决定性作用。在这些研究中发现，一种胸腺制备物，TF5(thymosinfraction 5)有很强的免疫增强功能。这一制备物可以纠正某些由于缺乏胸腺功能而造成的免疫缺陷，以及治疗某些免疫系统受抑制的癌症。TF5制备物的热稳定性很好，可耐80℃达25分钟。它由一组分子量1000-15000的多肽组成，还含有微量非蛋白成分如碳水化合物等。对TF5进一步分离后得到胸腺素α1(thym osinα-1，简称T_α1)，是一个酸性多肽，比原来TF5制备物的生物活性高10-1000培。

T_α1是由28个氨基酸组成的酸性多肽，等电点4.2，N端被乙酰化，其氨基酸顺序是：N-Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-COOH，不含甲硫氨酸、半胱氨酸和芳香氨基酸。从人、鼠、牛来源的T_α1多肽序列完全一致，T_α1N端乙酰化与否对其活性影响不显著。T_α1来源于一前体prothymosin α1的113个氨基酸的酸性蛋白质，T_α1处于其2-29位。人与鼠的T_α1前体之间有90％以上的同源性。pro T_α1mRNA广泛分布于肾、肝、脾以及淋巴组织，其合成受细胞分裂因子的诱导。T_α1的一级结构与VIP(vascotive intestinepeptide血管活性肠肽)以及HIV病毒GAG基因产物以及HIV的一种装配辅助多肽Octapeptide T有较高同源性。

尽管相应的受体并没有被克隆，但人们普遍认为T_α1通过受体与靶细胞作用。用免疫检测方法，发现T_α1存在于鼠胸腺细胞的表面。T_α1是一种生物反应调节因子，首先是一种针对T淋巴系统的免疫增强剂，它可以促使T细胞成熟和分化，可促使成熟的T细胞、NK细胞分泌各种淋巴因子如白介素-2和γ-干扰素，也同时促进白介素-2受体的生成，促使高亲和力白介素-2受体IL-2R的生成。T_α1的生物活性检测有下列方法：E-Rosette玫瑰花实验法，巨噬细胞移动抑制因子法，(macrophage m igration in hibitoryfactor，M IF)，Lyt1⁺、2⁺、3⁺淋巴细胞表面标记法，NK杀伤活性法，白介素-2及其受体诱因法。诱导外周血淋巴细胞合成更多的巨噬细胞移动抑制因子，这样可以造成巨噬

细胞的聚集发挥免疫功能。

T_α1作为一种免疫增强剂，主要用于免疫缺陷和免疫受抑制的疾病。当病人感染某些病毒如HIV、HBV或癌症以及经过放疗或化疗后，其免疫系统往往会被逐渐抑制乃至破坏，而不能发挥对病毒或癌细胞的功能正常杀伤作用。T_α1可以恢复T淋巴细胞的功能并促进成熟T细胞的增殖，促进淋巴细胞在病原组织及癌细胞周围的聚集，促进淋巴因子及淋巴因子受体的产生，这样就大大增强了免疫细胞的作用，提高了对病毒和癌症的抵抗能力。T_α1在医药市场上有巨大的价值，用于治疗一些免疫系统受抑制或受破坏的疾病，包括慢性乙型肝炎、丙型肝炎、癌症、爱滋病等。目前胸腺素α1(商品名：日达仙)已在包括中国在内的多个国家上市，但系化学方法合成，成本高。本专利应用基因工程的方法，特别是甲醇酵母分泌型表达生产重组胸腺素α1，大大降低了成本。

已有报道尝试采用大肠杆菌基因工程的方法进行表达重组T_α1，但由于在大肠杆菌中表达量低，纯化困难等而无法形成生产规模。所以本专利发明应用酵母分泌型表达系统，将人工合成胸腺素α1基因整合在酵母染色体上，稳定不易丢失。通过高拷贝筛选，实现高表达和目的产物分泌至培养基中的酵母表达系统。此系统表达重组T_α1产量高易纯化，成本低等特点适宜工业化生产重组胸腺素α1。

本发明中重组胸腺素α1的制备主要特征是：1.目的基因的获得选择人胸腺素α1的氨基酸序列，根据酵母偏爱的密码子，分3段合成胸腺素1的基因，并在5’端引入XhoI位点，3’端引入EcoRI位点和一个终止子，然后用PCR法获得完整的胸腺素α1基因。2.测序质粒的构建

上述PCR产物用XhoI和EcoRI双酶切后，与XhoI和EcoRI双酶切后的pBSK(+)质粒用T4连接酶进行连接，然后转化DH5α菌，涂布含有X-gal的LB平板，选白色菌落，用XhoI和EcoRI双酶切鉴定。重组质粒P^BSK-Tα1用于CDNA测序和T_α1模板基因来源。3.毕节酵母表达质粒PIC9K-Tα1的构建

pBSK(+)用XhoI和EcoRI双酶切后，回收小片段Tα1，把表达载体PIC9用XhoI和EcoRI双酶切后，回收大片段，与上述Tα1片段用T4连接酶连接，再转化Ecoli Top10F’中，用酶切法筛选阳性克隆PIC9-Tα1。得到的PIC9-Tα1用BamHI，SalI双酶切回收小片段，而PIC9K质粒用BamHI，SalI双酶切后挥手大片段作为载体，与上述小片段用T4连接酶连接，转化Ecoli Top10F’中，用酶切法筛选阳性克隆，即为PIC9K-Tα1。4.酵母表达工程菌的获得

把质粒PIC9K-Tα1用SalI单酶切线形化，回收，电转酵母SMD1168，然后电转后的酵母涂平板，得到长出的白色菌落，各菌落分别进行表达培养。经免疫印迹和电泳检测，G418高拷贝筛选，获得高效表达T_α1的工程菌命名为SMT_α1。5.重组T_α1酵母工程菌发酵和纯化

毕节酵母工程菌SMT_α1经5升发酵罐发酵培养96小时后达到400mg/L的表达量，经培养液超滤浓缩后，用阳离子交换层析和反相层析获得纯度大于98％的重组胸腺素α1，回收率在50％。重组T_α1与化学合成的T_α1具有相同的生物活性。

                          实例

           甲醇酵母分泌型表达重组胸腺素α₁举例一.上游表达菌株的构建以及工程菌株的筛选。1.目的基因的获得

根据基因Bank以及有关文献的报道，人、牛，鼠的T_α1氨基酸序列完全一致。参照下面人的T_α1氨基酸序列，合成一段单链模板和正反向引物各一条，并在5’端引入XhoI位点，3’端引入EcoRI位点。在合成序列时把氨基酸的密码子转换成酵母偏爱型的同功密码子，单链和核苷酸序列如下：

T_α1氨基酸序列：Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-

                Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn

人工合成的单链模板：5’TCC GAC GCT GCT GTT GAC ACT TCC TCC GAG ATC ACC ACC AAG

                    AGC TTG AAG GAG AAG AAG GAG GTT GAG GAG GCT G 3’用于PCR的引物5’引物：5’CCT TCT CAG GAA AAG ATC CGA CGC CGC TGC TGT TGA C 3’用于PCR的引物3’引物：5’CTC GAA TTC CTA GTT CTC AGC CTC CTC AAC AAC C 3’

取以上模板与引物按照《分子克隆》中PCR方法项下有关要求进行PCR扩增，反应结果经5％的PAGE胶电泳检验，证明得到一条100bp左右片段与实验设计的结果相符。2.测序质粒的构建

取出部分反应产物经XhoI、EcoRI双切后与XhoI、EcoRI双切的pBSK(+)质粒在14度下用T4连接酶反应5小时。用CaCl₂法转到DH5α中，并均匀涂到涂有x-gal的LB平板上，在37度，20hr，选出明显的白色菌落，经培养后提质粒，用XhoI、EcoRI双切鉴定，选出嵌合上了100bp片段的质粒菌(命名为pBSK-Ta1)，一方面用于测序，一方面用于为表达质粒提供有效目的基因。3.Ta1表达质粒pIC9-Ta1、pIC9K-Ta1的构建

把pBSK-Ta1中目的基因用XhoI、EcoRI双切下后，用1％LMP agrose回收待插入片段。3.1  把表达载体pIC9质粒用XhoI、EcoRI双切后，回收大片段作为载体，与上述Ta1片段用T4连接酶连接，再用CaCl₂法转化到Ecoli Top10F’中。重组质粒的设计和构建见示意图1，用酶切法筛选阳性克隆，有100bp条带者为插入Ta1基因质粒，命名为pIC9-Ta1。3.2  把表达载体pIC9K质粒用BamHI、SalI双切后回收大片段作为载体，把pIC9-Ta1质粒用BamHI、SalI双切后回收小片段作为目的基因，与上述的pIC9K大片段用T4连接酶连接，用CaCl₂法转化到Ecoli Top10F’中。重组质粒的设计和构建见示意图2，用酶切筛选阳性克隆，有约100bp左右条带者为插入Ta1基因质粒，命名为pIC9K-Ta1。4.表达工程菌的获得

将p^IC9k-Ta1质粒用SalI线性化后电转入毕节酵母宿主菌SM1168，从电转仪上取下用1M山梨醇混匀后，取300uL电转液均匀涂到含有G418浓度(0.25，0.5，1，1.5，2，4mg/mL)差的MD平板上，放到30度48小时后长出单克隆白斑，克隆数分别为137，80，35，11，3，0，说明多拷贝筛选成功。从含G4182mg/mL MD平板上选出一个高表达菌株，经过48小时诱导，采用HPLC方法检定，获得一株表达量相对较高的菌株定为工程菌(SMTa1)。二.发酵

重组Ta1蛋白表达是采用本公司构建的SMTa1工程菌来完成。SMD1168是pichia酵母表达系统中的一种以BMGY培养活化，增殖的酵母细胞，属于mUS⁺strain(甲酵快速利用型和蛋白酶缺陷型)。挑取单克隆工程菌于100mlBMGY在500ml摇瓶中培养，30℃、300rpm过夜培养(16-18h)，OD₆₀₀＝4.0-6.0。次日将100ml第一代种子液以50ml为单位，分别转入含250mlYPD培养液的两个1000ml摇瓶中，瓶口覆以通气多层纱布，30℃、300rpm继续培养12-14h，即开始上罐。

将3L酵母盐培养基倒入5L发酵罐，121℃、30min高压灭菌后，调工艺参数至30℃、400rpm、罐压0.02mpa、通气量800L/h。将500ml第二代种子液转入罐中，40％氨水调PH＝5.0，发酵培养约24h至甘油耗尽。此时流加50％甘油(含12ml/L PTM1)1L，流加速度以DO值维持在20％左右为准，同时转速提升至650rpm、通气量调为1500L/h。待甘油再次耗尽，DO值急速上升时，开始流加甲醇(含12ml/L PTM1)诱导，流加速度以控制DO值在20-50％为限，诱导时间64h。发酵液离心保留上清，表达是经电泳和HPLC分析结果为400mg/L的产量。三.纯化1.阳离子交换层析

3升发酵液上清用无离子水稀释后调pH至3.0，SP Sepharose Fast Flow层析介质用平衡液50mM Gly-NaOH，pH3.0平衡，上样饱和结束后，洗脱用含0.5M NaCl的50mMGly-NaOH，pH3.0的溶液进行梯度洗脱，收集含重组Ta1的蛋白峰。2.Soure30 RPC反相层析

阳离子交换收集的重组Ta1蛋白组分，直接上反相Source30 RPC介质。洗脱条件为水和0-80％异丙醇的梯度，收集含重组Ta1的组分。经真空减压除去有机溶剂后获得的重组Ta1水溶液中加入0.15M氯化钠和20mm磷酸盐缓冲液(pH7.4)于-30℃中保存。

3升发酵液经过二步层析纯化，得到重组Ta1 680mg，其纯度大于98％，总回收率大于50％。四.性质鉴定1.分子量和纯度

15％Tricine电泳显示表达的重组Ta1经纯化后为3KD的单一蛋白带，与理想值一致。用C18反相柱检测HPLC分析，本法获得的重组Ta1与人工合成的Ta1保留时间一致，纯度大于98％。2.生物活力

用人源T淋巴细胞的E玫瑰花结实验测定，本法制备的重组Ta1和人工合成的Ta1(日达仙)的生物活性，结果显示两者刺激形成的E玫瑰花结百分率一致。

Claims (4)

1.本发明中甲醇酵母分泌型表达重组胸腺素α₁，其特征包括人工合成胸腺素α₁基因，构建酵母表达重组质粒，转化酵母菌，表达筛选和重组制备。

2.条款1中重组胸腺素α1的氨基酸序列与人胸腺素α1的序列完全一致，序列是：

    Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-

    Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn

3.条款1中重组胸腺素α1为N-末段未乙酰化。

4.条款1中甲醇酵母指毕节酵母和汉斯氏酵母体系。