CN100393742C - 一种抗菌三肽及其化学修饰物与应用 - Google Patents
一种抗菌三肽及其化学修饰物与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种抗菌三肽及其化学修饰物与应用。本发明公开了一种抗菌三肽，其序列为His Glu Leu，具有抗绿脓杆菌、嗜水气单胞菌、溶藻弧菌、多杀巴斯德杆菌的效果。经过化学修饰的抗菌三肽也具有抗嗜水气单胞菌、绿脓杆菌、溶藻弧菌等的效果。这将为抗生素开发提供新的先导化合物。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体的说涉及一种抗菌三肽及其化学修饰产物与应用。
背景技术
抗生素指由细菌、霉菌或其它微生物在代谢过程中产生的具有抗病原体或其它活性的一类物质，是人类20世纪最伟大的发现之一。自1940年以来，青霉素开始应用于临床，不计其数的人从中受益。然而，耐药性问题也随之而产生，在使用第一代青霉素时细菌就已经出现耐药性。迄今为止，不存在对抗生素完全敏感的细菌。在国际上享有“人类对付顽固性耐药菌株的最后一道防线”美誉的万古霉素，已经发现了相应的耐药细菌而面临着失效的危险。有关调查显示，大肠杆菌对喹诺酮类抗菌药物的耐药性已高达70％，幽门螺旋杆菌的耐药率则升至82％(方敏，2004年全国抗生素学术会议报道，中国处方药，2004，32(11)：65)。截至上世纪末，全世界每年死于细菌性感染的人数已达到2000万，这是40年前的3倍。耐药性病原体增多特别是多重耐药性病原体的增多使人类面临耐药菌感染的威胁。如果不解决抗生素的耐药性问题，终有一天将会导致人类本身对所有抗生素药品都有耐药性，而“无药可用”。解决耐药性问题的有效方法是开发新药(刘秋云，赫然，一种分离抗菌肽的方法与分离的抗菌肽.2004，申请号：200410005199.3，公开号：CN 1557960A，授权专利号：ZL 2004 1 0005199.3)，其他解决方法包括老药新用与改进现有制剂，合理用药，探索新的抗菌治疗方法，抗菌疫苗的开发与应用等等。
研究表明许多生物的基因组中也有编码抗生素的基因。这些基因编码的多为一些短肽，称为抗菌肽(Brahmachary M，Krishnan SP，Koh JL，Khan AM，Seah SH，Tan TW，Brusic V，Bajic VB.ANTIMIC：a database of antimicrobial sequences.Nucleic Acids Res.2004；32(Database issue)：D586-9)。抗菌肽一般携带正电荷，其具有抗菌活性强、不易产生耐药性等特点。但抗菌肽一般长为10到40个氨基酸，具有一定的免疫原性与较差的生物可及性。一般生物可及性好的药物分子量都在数百道尔顿。如果能够发现小分子抗菌寡肽，则能够开发新的抗生素的资源。所以，抗菌寡肽的分离具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于针对细菌普遍对抗生素有耐药性的问题，提供一种能够抑制细菌生长的抗菌三肽。
本发明的另一个目的是提供上述抗菌三肽的化学修饰物。
本发明的另一个目的是提供上述抗菌三肽及其化学修饰物在制备抗菌药物中的应用。
本发明的抗菌三肽，其DNA序列为CACGAATTA，氨基酸序列为His Glu Leu。本发明的抗菌三肽可以采用基因工程的方法生产，也可以采用化学合成法合成。通过对该抗菌三肽进行化学修饰，其化学修饰物同样具有很好的抗菌效果。例如，本发明通过对该抗菌三肽进行α-氨基端乙酰化，得到其化学修饰物Ac-His GluLeu。对其进行羧基端酰氨化，得到另一种化学修饰物His Glu Leu-NH2。
本发明中抗菌三肽His Glu Leu的分离是通过以下技术措施实现的：构建酵母α交配因子前导肽与随机肽的融合DNA片段，用于随机肽的分泌表达；插入用EcoR I和Xba I双酶切的含有诱导型启动子的酿酒酵母载体；为避免未连接的线状DNA在转化后与酵母基因组DNA发生重组，用核酸外切酶III和绿豆芽核酸酶对其进行消化处理；纯化后电激转化酿酒酵母；转化子转接至半乳糖诱导表达平板，过夜生长后用含细菌菌种的上层培养基覆盖，观测抑菌圈；用液体培养基诱导表达后测抑菌率；对阳性克隆进行PCR扩增，测序；化学合成部分抗菌肽，用琼脂糖扩散法检测活性。
本发明的抗菌三肽及其化学修饰物具有很好的抗菌效果，可以用于开发新的抗生素。本发明的抗菌三肽及其化学修饰物能够抑制绿脓杆菌、嗜水气单胞菌、溶藻弧菌等等细菌的生长。抗菌三肽His Glu Leu及其化学修饰物His GluLeu-NH2能够很好的抑制绿脓杆菌、嗜水气单胞菌、溶藻弧菌、多杀巴斯德杆菌的生长；化学修饰物Ac-His Glu Leu能够很好的抑制绿脓杆菌、嗜水气单胞菌、溶藻弧菌的生长。
本发明的有益效果：本发明的抗菌三肽及其化学修饰物具有分子量小、生物可及性好的优点，同时不具高的免疫原性，可以作为抗生素开发的先导化合物。绿脓杆菌是比较严重的感染原，现在急需开发新的药物。而本发明的抗菌三肽及其化学修饰物具有抗绿脓杆菌的效果。另外，由于本发明的三肽对水产养殖常见菌具有抗菌效果，因此能够在水产业得到应用。
附图说明
图1为琼脂糖覆盖实验图；图1a为阳性转化子对上层的绿脓杆菌形成抑菌圈结果图；图1b为空载体转化子对上层的绿脓杆菌抑制效果图；
图2为全自动合成的、纯度为99.3％的抗菌三肽His Glu Leu(HL3)、纯度为98.5％的抗菌三肽Ac-His Glu Leu(ACHL3)、纯度为99.1％的抗菌三肽His GluLeu-NH2(HL3NH2)点样100μg在含嗜水气单胞菌的培养基所形成的抑菌圈结果图；
图3为全自动合成的、纯度为99.3％的抗菌三肽His Glu Leu(HL3)点样100μg在含绿脓杆菌的培养基所形成的抑菌圈结果图；
图4分别为全自动合成的、纯度为98.5％的抗菌三肽Ac-His Glu Leu(ACHL3)、纯度为99.1％的抗菌三肽His Glu Leu-NH2(HL3NH2)点样100μg在含绿脓杆菌的培养基所形成的抑菌圈结果图；
图5分别为全自动合成的、纯度为99.3％的抗菌三肽His Glu Leu(HL3)、纯度为98.5％的抗菌三肽Ac-His Glu Leu(ACHL3)、纯度为99.1％的抗菌三肽His GluLeu-NH2(HL3NH2)点样100μg在含溶藻弧菌的培养基所形成的抑菌圈；
图6分别为全自动合成的、纯度为99.3％的抗菌三肽His Glu Leu(HL3)、纯度为98.5％的抗菌三肽Ac-His Glu Leu(ACHL3)、纯度为99.1％的抗菌三肽His GluLeu-NH2(HL3NH2)点样100μg在含多杀巴斯德杆菌的培养基所形成的抑菌圈；其中，在图2中，上部为0.1μl 50mg/ml庆大霉素的正对照；在图4中，上部为0.1μl 100mg/ml庆大霉素的正对照；在图5中，上部为0.1μl 50mg/ml庆大霉素的正对照；在图6中，上部为0.1μl 100mg/ml氨苄青霉素的正对照。
具体实施方式
实施例1
(1)构建酵母α交配因子前导肽与随机肽的融合DNA片段，用于随机肽的分泌表达。两个引物分别为<1>GCGAATTCAAAAATGAGATTTCCTTCAA。<2>CGTCTAGATCA(N)9TCTTTTCTCGAGAGAT。用具有高保真活性的PfuDNA聚合酶扩增。扩增模板使用量为每1ml PCR反应液50ng质粒pPICZαA(Invitrogen产品，含酵母α交配因子前导肽DNA序列)。扩增条件为：94℃ 5分钟预变性；94℃ 30秒，50℃ 30秒，72℃ 20秒， 25个循环；72℃ 5分钟补平。扩增产物用1/10 2.5M NaAc，pH5.2和2.5倍无水乙醇于13000rpm沉淀7分钟。用70％乙醇洗涤，13000rpm沉淀3分钟。电吹风吹干。悬浮在无菌蒸馏水里。用EcoR I和Xba I双酶切过夜，总体积为30μl。70℃热失活20分钟。
(2)5μg pYES2/CT(Invitrogen产品)用EcoR I和Xba I双酶切过夜，总体积为30μl。70℃热失活20分钟。取6.5μl双酶切的pYES2/CT，加入6μl双酶切的PCR产物，1.5μl 10X连接酶缓冲液，1μl T4 DNA连接酶，16℃连接过夜。
(3)为避免未连接的线状DNA在转化后与酵母基因组DNA发生重组，需用核酸酶对其进行消化处理。连接产物用Qiagen公司的PCR纯化柱纯化(见产品说明书)。用30μl H2O洗脱。加3.5μl 10X核酸外切酶III缓冲液和1μl(20单位)核酸外切酶III，37℃处理1小时。70℃失活15分钟。加入3.5μl 10X绿豆芽核酸酶缓冲液和30μl H2O，再加入1μl(20单位)绿豆芽核酸酶，37℃处理1小时20分钟。用Qiagen公司的PCR纯化柱纯化，用13μl H2O洗脱。取10μl做电激。
(4)首先制备酵母感受态细胞。用过夜培养的酿酒酵母菌种INVScl接种200ml YPD。30℃摇瓶培养到0D值1.3，将培养物分装在50ml离心管，5000rpm，4℃离心5分钟。去上清。重悬在总体积10ml醋酸锂/二硫苏糖醇预处理液中，25℃保温1小时。重悬在总体积200ml冰预冷的无菌水中。5000rpm，4℃离心5分钟。去上清。重悬在总体积100ml冰预冷的无菌水中。5000rpm，4℃离心5分钟。去上清。重悬在20ml冰预冷的1mol/L山梨醇中。5000rpm，4℃离心5分钟。去上清。重悬于0.2ml冰预冷的1mol/L山梨醇中。冰浴。每个无菌管中加80μl酵母悬浮液和100ng的DNA(总体积为10μl)及20μg单链DNA(鲑鱼精DNA)，轻轻混匀，转移至0.2-cm无菌电激杯，10℃水浴5分钟。1.8千伏、25微法、200欧姆做电激。立刻加入650μl 1mol/L山梨醇到电激杯中。轻轻混匀，转移到培养管，加650μl 2X YPD/1mol/L山梨醇，混匀之后30℃摇床培养1小时。用水洗掉YPD培养基。
(5)将电激混合物涂布葡萄糖/山梨醇选择平板，于30℃生长3天。转接至不含山梨醇的葡萄糖选择平板。
(6)转接至甘油/半乳糖诱导表达平板，于30℃生长1天。提前一天接种用于检测抗菌肽活性的绿脓杆菌，于37℃过夜生长。将5μl过夜生长的绿脓杆菌加至10ml 50℃左右高压灭菌过的0.7％琼脂糖/LB。轻轻倒在长有酵母转化子的甘油/半乳糖诱导表达平板上。静置10分钟凝固。在没有转化子的地方用枪头尖打一个小孔，加入抗生素作为正对照，置超净台5分钟。在37℃培养箱倒置过夜生长。观察抑菌圈，记录，拍照。图1a为阳性转化子对上层的绿脓杆菌形成的抑菌圈。
(7)从酵母转化子扩增插入片段。取生长于葡萄糖选择培养基的对数生长晚期的酵母菌1.5ml，13000rpm离心15秒，去上清。用双蒸水洗涤一次，13000rpm离心15秒。沉淀悬浮于30μl TE缓冲液。在沸水上煮3min。13000rpm离心1min。将上清储存在-20℃。取3μl用来做PCR。根据载体pYES2/CT序列设计上下游引物。<3>CCTCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACCCCGGATCG。<4>GGCGTGAATG TAAGCGTGACATAACTAATTACATGATGCG。扩增条件为：95℃ 5分钟预变性；94℃ 30秒，68℃ 2分钟，72℃ 30秒，4个循环；94℃ 30秒，68℃ 40秒，72℃ 30秒，41个循环；72℃ 5分钟补平。选用上海博亚公司的Taq DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶。100μl反应加5单位Taq DNA聚合酶和2单位Pfu DNA聚合酶。扩增片段长为570bp，由上海申有技术有限公司纯化并全自动测序。测序引物为<5>TAATACGACTCACTATAGGG；<6>TAGGATCAGCGGGTTTAAACTC。测得的1个抗菌三肽序列为：克隆为三肽，DNA序列为CACGAATTA，氨基酸序列为HisGlu Leu。
所用的醋酸锂/二硫苏糖醇预处理液配方为(每100ml)：0.1M醋酸锂(终浓度)，10mM Tris(终浓度)，pH 7.5，1mM EDTA(终浓度)，高压灭菌后加入过滤灭菌的10ml 0.1M二硫苏糖醇至90ml上述溶液(终浓度为10mM)。
所用的葡萄糖/山梨醇选择平板培养基配方为(每升)：1.7g YNB(无氨基酸酵母氮源，Amresco，Inc.)，1M山梨醇，10g葡萄糖，30mg亮氨酸，20mg组氨酸，30mg色氨酸，20g琼脂。高压灭菌。倒平板。
所用的不含山梨醇的葡萄糖选择平板配方为(每升)：1.7g YNB(无氨基酸酵母氮源，Amresco，Inc.)，10g葡萄糖，30mg亮氨酸，20mg组氨酸，30mg色氨酸，20g琼脂。高压灭菌。倒平板。
所用的甘油/半乳糖诱导表达平板配方为(每升)：1.7g YNB(Amresco，Inc.)，调pH值为4.1，30ml甘油，30mg亮氨酸，20mg组氨酸，30mg色氨酸，20g琼脂。高压灭菌。加入过滤除菌的终浓度为0.5％的半乳糖。倒平板。
所用的LB配方为(500ml)：5g蛋白胨，2.5g酵母抽提物，5g氯化钠，蒸馏水，pH7.0。
实施例2
在上海博亚公司用多肽合成仪合成三肽His Glu Leu。利用Fmoc/tBu固相多肽合成法合成。用20％六氢吡啶、二甲基甲酰胺脱Fmoc。二甲基甲酰胺，甲醇，二氯甲烷洗涤。粗品经制备HPLC纯化，冷冻，得纯品。称取适当重量的三肽，加水，煮沸8分钟。
实施例3
经过羧基端酰胺化的三肽His Glu Leu-NH2由吉尔生化(上海)有限公司利用Fmoc/tBu固相多肽合成法合成。使用Rink Amide AM resin。用20％六氢吡啶、二甲基甲酰胺脱Fmoc。二甲基甲酰胺，甲醇，二氯甲烷洗涤。粗品经制备HPLC纯化，冷冻，得纯品。称取适当重量的三肽，加水，煮沸8分钟。
实施例4
经过氨基端乙酰化的三肽Ac-His Glu Leu由吉尔生化(上海)有限公司利用Fmoc/tBu固相多肽合成法合成。使用Fmoc-Leu(trt)-Wang resin。用20％六氢吡啶、二甲基甲酰胺脱Fmoc。二甲基甲酰胺，甲醇，二氯甲烷洗涤。粗品经制备HPLC纯化，冷冻，得纯品。称取适当重量的三肽，加水，煮沸8分钟。
实施例5
将5μl过夜生长的菌种(绿脓杆菌、嗜水气单胞菌、溶藻弧菌、多杀巴斯德杆菌)分别加至10ml 50℃左右高压灭菌过的0.7％琼脂糖/LB，倒平板，静置10分钟凝固。用枪头尖打多个小孔，3个小孔各加入100μg三肽His Glu Leu(HL3)、三肽Ac-His Glu Leu(ACHL3)、His Glu Leu-NH2(HL3NH2)，一个小孔加入水作为负对照，部分平板的一个小孔加入0.1μl 50mg/ml庆大霉素或氨苄青霉素作为正对照。置超净台5分钟。在37℃培养箱倒置过夜生长。观察抑菌圈，记录，拍照。结果见图2、3、4、5、6。
实施例6
将5μl过夜生长的菌种(绿脓杆菌、嗜水气单胞菌、溶藻弧菌、多杀巴斯德杆菌、枯草杆菌)分别加至10ml 50℃左右高压灭菌过的0.7％琼脂糖/LB，倒平板，静置10分钟凝固。用枪头尖打多个小孔，3个小孔各加入100μg三肽His GluLeu(HL3)、三肽Ac-His Glu Leu(ACHL3)、His Glu Leu-NH2(HL3NH2)，一个小孔加入水作为负对照，部分平板的一个小孔加入0.1μl 50mg/ml庆大霉素或氨苄青霉素作为正对照。置超净台5分钟。在37℃培养箱倒置过夜生长。观察抑菌圈，测抑菌圈直径，如表1所示。
表1
实施例7
将5μl过夜生长的菌种(绿脓杆菌、嗜水气单胞菌、溶藻弧菌、多杀巴斯德杆菌、枯草杆菌)分别加至10ml 50℃左右高压灭菌过的0.7％琼脂糖/LB，倒平板，静置10分钟凝固。用枪头尖打多个小孔，3个小孔各加入150μg三肽His GluLeu(HL3)、三肽Ac-His Glu Leu(ACHL3)、His Glu Leu-NH2(HL3NH2)，一个小孔加入水作为负对照，部分平板的一个小孔加入0.1μl 50mg/ml庆大霉素或氨苄青霉素作为正对照。置超净台5分钟。在37℃培养箱倒置过夜生长。观察抑菌圈，测抑菌圈直径，结果如表2所示。
表2
一种抗菌三肽及其化学修饰物与应用序列表
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学
<120> 一种抗菌三肽及其化学修饰物与应用
<130>
<160> 7
<170>
<210> 1
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
CACGAATTA
<210> 2
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
His Glu Leu
<210> 3
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Ac-His Glu Leu
<210> 4
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
His Glu Leu-NH2
<210> 5
<211>
<212> DNA
<213> 一对引物
<400> 5
引物1：GCGAATTCAAAAATGAGATTTCCTTCAA
引物2：CGTCTAGATCA(N)。TCTTTTCTCGAGAGAT
<210> 6
<211>
<212> DNA
<213> 一对引物
<400> 6
引物1：CCTCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACCCCGGATCG
引物2：GGCGTGAATG TAAGCGTGACATAACTAATTACATGATGCG
<210> 7
<211>
<212> DNA
<213> 一对引物
<400> 7
引物1：TAATACGACTCACTATAGGG
一种抗菌三肽及其化学修饰物与应用序列表
引物2： TAGGATCAGCGGGTTTAAACTC
Claims (5)
1.一种抗菌三肽，其氨基酸序列为His Glu Leu。
2.权利要求1所述抗菌三肽的化学修饰物，其特征在于为α-氨基端乙酰化的抗菌三肽，氨基酸序列为：Ac-His Glu Leu。
3.权利要求1所述抗菌三肽的化学修饰物，其特征在于为羧基端酰氨化的抗菌三肽，氨基酸序列为：His Glu Leu-NH2。
4.权利要求1所述抗菌三肽或权利要求3所述抗菌三肽的化学修饰物在制备抗绿脓杆菌、嗜水气单胞菌、溶藻弧菌、多杀巴斯德杆菌药物中的应用。
5.权利要求2所述抗菌三肽的化学修饰物在制备抗绿脓杆菌、嗜水气单胞菌、溶藻弧菌药物中的应用。
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| an efficient and pratical method for solid-phase synthesis of tripeptide-bearing glycopeptide antibiotics:combinatorial parallel synthesis of carboxamide derivatives of chloroorienticin B. Tatsuro Yasukata et al.Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters,Vol.Vol.12 No.No.21. 2002 * |
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20080611 Termination date: 20120727 |