ES2627758T3 - Producción de proteínas en microorganismos del filo Labyrinthulomycota - Google Patents

Producción de proteínas en microorganismos del filo Labyrinthulomycota Download PDF

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Abstract

Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende: (a) la secuencia de polinucleótidos que tiene al menos el 85 % de identidad con SEQ ID NO:38, en la que la secuencia de polinucleótidos codifica un polipéptido que actúa como péptido señal; o (b) una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido, en la que el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:37 o un fragmento de la misma, en la que la secuencia de aminoácidos o un fragmento de la misma actúa como péptido señal.

Description

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exógenas en las células hospedadoras de Labyrinthulomycota incluyen, pero no se limitan a, bombardeo de partículas, electroporación, microinyección, lipofección, adsorción, infección y fusión de protoplastos. En algunas realizaciones, moléculas de ácidos nucleicos exógenas, que incluyen vectores recombinantes, se introducen en una célula microbiana que está en una fase estacionaria. En algunas realizaciones, moléculas de ácidos nucleicos exógenas, que incluyen vectores recombinantes, se introducen en una célula microbiana durante la fase de crecimiento exponencial. En algunas realizaciones, moléculas de ácidos nucleicos exógenas, que incluyen vectores recombinantes, se introducen en células cuando alcanzan una densidad óptica de 1,5 a 2 a 600 nm.
También se describe un método de transformación de una célula hospedadora, que comprende: (a) pretratar la célula hospedadora con una enzima que tiene actividad de proteasa, y (b) introducir una molécula de ácido nucleico en la célula hospedadora por electroporación. La célula hospedadora puede transformarse con eficiencia más alta tras el pretratamiento con enzima antes de la electroporación que sin pretratamiento con enzima. La enzima incluye, pero no se limita a, una actividad enzimática asociada a polvo de acetona de caracol, proteasa IX, proteasa XIV, sulfatasa, β-glucuronidasa, y combinaciones de los mismos. En algunos métodos descritos, la célula hospedadora se pretrata con aproximadamente 0,05 mg/ml, aproximadamente 0,1 mg/ml, aproximadamente 0,15 mg/ml, aproximadamente 0,2 mg/ml, aproximadamente 0,25 mg/ml, aproximadamente 0,3 mg/ml, aproximadamente 0,4 mg/ml, aproximadamente 0,5 mg/ml, aproximadamente 0,6 mg/ml, 0,7 mg/ml, 0,8 mg/ml, 0,9 mg/ml, o aproximadamente 1 mg/ml de polvo de acetona de caracol, proteasa IX, proteasa XIV, o combinaciones de los mismos. En algunos métodos descritos, la célula hospedadora se trata con aproximadamente 0,05 mg/ml a aproximadamente 1 mg/ml, aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 1 mg/ml, aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 0,5 mg/ml, o aproximadamente 0,05 mg/ml a aproximadamente 0,5 mg/ml de polvo de acetona de caracol, proteasa IX, proteasa XIV, o una combinación de los mismos. En algunos métodos descritos, la célula hospedadora se trata con 0,05X, 0,1X, 0,2X, 0,3X, 0,4X, 0,5X, 0,6X, 0,7X, 0,8X, 0,9X o 1X de sulfatasa, βglucuronidasa, o una combinación de las mismas. En algunos métodos descritos, la célula hospedadora se trata con aproximadamente 0,05X a aproximadamente 1X, aproximadamente 0,1X a aproximadamente 1X, aproximadamente 0,1X a aproximadamente 0,5X, o aproximadamente 0,05X a aproximadamente 0,5X de sulfatasa, β-glucuronidasa, o una combinación de las mismas. En algunos métodos descritos, el pretratamiento con proteasa comprende pretratamiento con proteasa IX, proteasa XIV, polvo de acetona de caracol, sulfatasa, β-glucuronidasa, o una combinación de los mismos, a cualquiera de las concentraciones anteriormente descritas. En algunos métodos descritos, se produce electroporación a una tensión de aproximadamente 100 V a aproximadamente 500 V para una distancia de hueco de cubeta de 0,1 cm o 0,2 cm. En algunas realizaciones, la electroporación se produce a una tensión de aproximadamente 100 V, 150 V, 200 V, 250 V, 300 V, 350 V, 400 V, 450 V o 500 V para una distancia de hueco de cubeta de 0,1 cm o 0,2 cm.
En algunas realizaciones de la invención, una célula hospedadora se modifica genéticamente para introducir o delecionar genes implicados en vías biosintéticas asociadas al transporte y/o la síntesis de hidratos de carbono, que incluyen aquellos implicados en la glucosilación. Por ejemplo, la célula hospedadora puede modificarse delecionando genes de glucosilación endógenos y/o insertando genes de glucosilación humanos o animales para permitir que los patrones de glucosilación se parezcan más estrechamente a aquellos de seres humanos. La modificación de la glucosilación en levadura puede encontrarse, por ejemplo, en la patente de EE.UU. N.º 7.029.872 y publicaciones de EE.UU. N.º 2004/0171826, 2004/0230042, 2006/0257399, 2006/0029604 y 2006/0040353. Una célula hospedadora de la presente invención también incluye una célula en la que se emplea un elemento de ARN viral para aumentar o regular la expresión génica.
Sistemas de expresión
En algunas realizaciones, el sistema de expresión de la invención usado para la expresión de una proteína en una célula hospedadora comprende elementos de control reguladores que son activos en células de alga. En algunas realizaciones, el sistema de expresión de la invención comprende elementos de control reguladores que son activos en células de Labyrinthulomycota. En algunas realizaciones, el sistema de expresión de la invención comprende elementos de control reguladores que son activos en traustoquitridios. En algunas realizaciones, el sistema de expresión de la invención comprende elementos de control reguladores que son activos en Schizochytrium o Thraustochytrium. Muchos elementos de control reguladores de algas, que incluye diversos promotores, son activos en varias especies diversas. Por tanto, las novedosas secuencias reguladoras desveladas como aspectos de la invención pueden utilizarse en un tipo de célula que es idéntico a la célula de la que se aislaron o pueden utilizarse en un tipo de célula que es diferente de la célula de la que se aislaron. El diseño y construcción de tales casetes de expresión usan técnicas de biología molecular estándar conocidas para el experto en la materia. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª edición.
En algunas realizaciones, el sistema de expresión usado para la producción de proteínas en células de Labyrinthulomycota comprende elementos reguladores que se derivan de secuencias de Labyrinthulomycota. En algunas realizaciones, el sistema de expresión usado para producir proteínas en células de Labyrinthulomycota comprende elementos reguladores que se derivan de secuencias no de Labyrinthulomycota, que incluyen secuencias derivadas de secuencias de alga no de Labyrinthulomycota. En algunas realizaciones, el sistema de expresión de la invención comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica una proteína, en la que la secuencia de polinucleótidos está asociada a cualquier secuencia de promotor, cualquier secuencia de terminador
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y/o cualquier otra secuencia reguladora que es funcional en una célula hospedadora de Labyrinthulomycota. Pueden usarse secuencias inducibles o constitutivamente activas. Elementos de control reguladores adecuados también incluyen cualquiera de los elementos de control reguladores asociados a las moléculas de ácidos nucleicos descritas en el presente documento.
La presente invención también se refiere a un casete de expresión para la expresión de una proteína en una célula hospedadora. La presente invención también se refiere a cualquiera de las células hospedadoras anteriormente descritas que comprende un casete de expresión para la expresión de una proteína en la célula hospedadora. En algunas realizaciones, el sistema de expresión comprende un casete de expresión que contiene elementos genéticos, tales como al menos un promotor, una secuencia codificante y una región de terminador operativamente unida de tal forma que sean funcionales en una célula hospedadora. En algunas realizaciones, el casete de expresión comprende al menos una de las moléculas de ácido nucleico aisladas de la invención como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, todos los elementos genéticos del casete de expresión son secuencias asociadas a moléculas de ácido nucleico aisladas. En algunas realizaciones, las secuencias de control son secuencias inducibles. En algunas realizaciones, la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína está integrada en el genoma de la célula hospedadora. En algunas realizaciones, la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína está establemente integrada en el genoma de la célula hospedadora.
En algunas realizaciones, una secuencia de ácidos nucleicos aislada que codifica una proteína que va a expresarse está operativamente unida a una secuencia de promotor y/o una secuencia de terminador, ambas de las cuales son funcionales en la célula hospedadora. La secuencia de promotor y/o terminador a la que la secuencia de ácidos nucleicos aislada que codifica una proteína que va expresarse está operativamente unida puede incluir cualquier secuencia de promotor y/o terminador, que incluye, pero no se limita a, las novedosas secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención, las secuencias reguladoras desveladas en la patente de EE.UU. N.º concedida 7.001.772, las secuencias reguladoras desveladas en las publicaciones de EE.UU. N.º 2006/0275904 y 2006/0286650, u otras secuencias reguladoras funcionales en la célula hospedadora en la que se transforman que están operativamente unidas a la secuencia de polinucleótidos aislada que codifica una proteína. En algunas realizaciones, la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína es de codón optimizado para la célula hospedadora de Labyrinthulomycota específica para maximizar la eficiencia de traducción.
La presente invención también se refiere a vectores recombinantes que comprenden un casete de expresión de la presente invención. Vectores recombinantes incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, fagos y virus. En algunas realizaciones, el vector recombinante es un vector linealizado. En algunas realizaciones, el vector recombinante es un vector de expresión. Como se usa en el presente documento, la expresión "vector de expresión" se refiere a un vector que es adecuado para la producción de un producto codificado (por ejemplo, una proteína de interés). En algunas realizaciones, una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el producto que va a producirse se inserta en el vector recombinante para producir una molécula de ácido nucleico recombinante. La secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína que va a producirse se inserta en el vector de un modo que una operativamente la secuencia de ácidos nucleicos con secuencias reguladoras en el vector (por ejemplo, un promotor de Thraustochytriales), que permite la transcripción y traducción de la secuencia de ácidos nucleicos dentro del microorganismo recombinante. En algunas realizaciones, un marcador de selección, que incluye cualquiera de los marcadores de selección descritos en el presente documento, permite la selección de un microorganismo recombinante en el que una molécula de ácido nucleico recombinante de la presente invención ha sido satisfactoriamente introducida.
En algunas realizaciones, proteínas producidas por una célula hospedadora recombinante de la invención incluyen, pero no se limitan a, proteínas terapéuticas. Una "proteína terapéutica", como se usa en el presente documento, incluye proteínas que son útiles para el tratamiento o la prevención de enfermedades, afecciones o trastornos en animales y seres humanos. Los términos "tratar" y "tratamiento" se refieren a tanto tratamiento terapéutico y profiláctico como medidas preventivas, en el que el objetivo es prevenir o ralentizar (reducir) una condición fisiológica no deseada, enfermedad, o trastorno, o para obtener resultados clínicos beneficiosos o deseados. Para los fines de la presente invención, resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, alivio de los síntomas o signos asociados a una afección, enfermedad o trastorno; disminución del grado de una afección, enfermedad o trastorno; estabilización de una afección, enfermedad o trastorno (es decir, donde la afección, enfermedad o trastorno no está empeorando); retraso en la aparición o progresión de la afección, enfermedad o trastorno; mejora de la afección, enfermedad o trastorno; remisión (tanto parcial o total como detectable o indetectable) de la afección, enfermedad o trastorno; o potenciamiento o mejora de una afección, enfermedad o trastorno. Tratamiento incluye provocar una respuesta clínicamente significativa sin excesivos efectos secundarios. Tratamiento también incluye prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento.
En ciertas realizaciones, proteínas terapéuticas incluyen, pero no se limitan a, proteínas biológicamente activas, por ejemplo, enzimas, anticuerpos o proteínas antigénicas. En ciertas realizaciones, las proteínas terapéuticas incluyen, pero no se limitan a: proteína A, hormona de crecimiento humana, un interferón, aprotinina, alfa-antitripsina humana, proteínas lipófilas, albúmina de suero humano, ácido glutámico descarboxilasa, lipasas gástricas, lactoferrina/lisozima, invertasa, anticuerpos (que incluyen, pero no se limitan a, anticuerpo monoclonal contra VEGF
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(AVASTIN®) y anticuerpo monoclonal contra HER2 (HERCEPTIN®)), una vacuna humana, una vacuna animal y un animal terapéutico. En algunas realizaciones, las proteínas producidas por una célula hospedadora recombinante de la invención incluyen, pero no se limitan a, enzimas industriales. Las enzimas industriales incluyen, pero no se limitan a, enzimas que se usan en la fabricación, preparación, preservación, movilización de nutrientes o procesamiento de productos, que incluyen alimentos, productos médicos, químicos, mecánicos, y otros productos industriales. Las enzimas industriales incluyen, pero no se limitan a: alfa amilasa, alfa-galactosidasa, beta-amilasa, celulosa, beta-glucanasa, dextranasa, dextrinasa, glucoamilasa, hemicelulasa/pentosanasa, xilanasa, invertasa, lactasa, naringinasa, pectinasa, pululanasa, proteinasa ácida, proteasa alcalina, bromelaína, papaína, pepsina, aminopeptidasa, endopeptidasas (tripsina, quimiotripsina, pepina, elastasa), cuajo/renina/quimosina, subtilis, termolisina, aminoacilasa, glutaminasa, lisozima, penicilina acilasa, trigliceridasas, fosfolipasas, esterasas pregástricas, fitasa, amidasas, isomerasas, alcohol deshidrogenasa, aminoácido oxidasa, catalasa, cloroperoxidasa, peroxidasa, acetolactato descarboxilasa, beta-descarboxilasa aspártica, histidasa, ciclodextrina glucosiltransferasa, fromasa, fitasa y quimosina.
En algunas realizaciones, las proteínas producidas por una célula hospedadora recombinante de la invención incluyen un marcador auxotrófico, un marcador de selección dominante (tal como, por ejemplo, una enzima que degrada la actividad antibiótica), u otra proteína implicada en la selección de transformación, una proteína que actúa como un indicador, una enzima implicada en la glucosilación de proteínas, y una enzima implicada en el metabolismo celular.
En cualquiera de las realizaciones de la invención, una proteína producida por una célula hospedadora de la invención puede ser una "proteína de salida" o una "proteína de salida heteróloga". Una "proteína de salida" o "proteína de salida heteróloga", como se usa en el presente documento, se refiere a una proteína recombinante heteróloga que no participa en modificar el metabolismo de la célula hospedadora que produce la proteína y que se produce por la célula hospedadora para el posterior aislamiento. "Proteína de salida", como se define en el presente documento, no incluye proteínas codificadas por genes indicadores.
Las proteínas de salida heterólogas producidas por una célula hospedadora recombinante de la invención no incluyen marcadores de selección tales como un gen de resistencia a zeocina (por ejemplo, el gen ble de Steptoalloteichus hindustanus) y neomicina fosfotransferasa (npt) de E. coli, y Tn5 de transposón, blasticidina desaminasa (bsdR) de Aspergillus terreus, sintasa ORFA de PUFA de Thraustochytrium T23B, sintasa ORFB de PUFA de Thraustochytrium T23B, sintasa ORFC de PUFA de Thraustochytrium T23B, eGFP sintética derivada de Aequorea victoria, genes nativos que codifican proteínas asociadas a la síntesis de un ácido graso seleccionado del grupo que consiste en ácido docosahexaenoico (DHA), ácido docosapentaenoico (DPA), ácido eicosapentaenoico (EPA) y ácido araquidónico (ARA), una sintasa de ácido graso, una desaturasa de ácido graso, una elongasa de ácido graso, una proteína asociada a complejo de policétido-sintasa y una proteína asociada a incorporación de ácidos grasos en fosfolípidos o en moléculas de triacilglicerol, una omega-3 desaturasa de ácido graso, una isomerasa de ácido graso polienoico, HMG-CoA sintasa, HMG-CoA reductasa, escualeno sintasa, fitoeno sintasa, fitoeno desaturasa, una carotenoide ciclasa, una carotenoide hidroxilasa, una carotenoide cetolasa, vitamina E y ácido lipoico, proteínas asociadas a la vía biosintética de isoprenoide, y enzimas implicadas en la producción de célula hospedadora de ácidos grasos poliinsaturados o carotenoides.
En algunas realizaciones, una proteína producida por una célula hospedadora de la invención se produce a escala comercial. Escala comercial incluye la producción de proteína de un microorganismo cultivado en una fermentador aireado de un tamaño ≥ 100 l, ≥ 1.000 l, ≥ 10.000 l, o ≥ 100.000 l. En algunas realizaciones, la producción a escala comercial se hace en un fermentador aireado con agitación.
En algunas realizaciones, una proteína producida por una célula hospedadora de la invención puede acumularse dentro de la célula o puede secretarse de la célula, por ejemplo, en el medio de cultivo como una proteína soluble.
En algunas realizaciones, una proteína producida por la invención se recupera de la célula, del medio de cultivo, o medio de fermentación en el que la célula se cultiva. En algunas realizaciones, la proteína es una proteína secretada que se recupera de los medios de cultivo como una proteína soluble. En algunas realizaciones, la proteína es una proteína secretada que comprende un péptido señal.
En algunas realizaciones, una proteína producida por la invención comprende una señal de direccionamiento que dirige su retención en el retículo endoplásmico, que dirige su secreción extracelular, o que se dirige a otros orgánulos o compartimentos celulares. En algunas realizaciones, la proteína comprende un péptido señal. En algunas realizaciones, la proteína comprende un péptido señal transportador de Na/Pi-IIb2 o proteína de transporte de Secl. En algunas realizaciones, el péptido señal comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:37. En algunas realizaciones, la proteína que comprende un péptido señal que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:37 es secretada en el medio de cultivo. En algunas realizaciones, el péptido señal se escinde de la proteína durante el proceso de secreción, produciendo una forma madura de la proteína.
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expresiones se usan indistintamente, especialmente con respecto a una molécula de ácido nucleico, secuencia de polinucleótidos, o una secuencia de ácidos nucleicos que es capaz de codificar una proteína. En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención se produce usando tecnología de ADN recombinante (por ejemplo, amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), clonación) o síntesis química. Las moléculas de ácido nucleico aisladas incluyen moléculas de ácidos nucleicos naturales y homólogos de las mismas, que incluyen, pero no se limitan a, variantes alélicas naturales y moléculas de ácidos nucleicos modificadas en las que los nucleótidos han sido insertados, delecionados, sustituidos y/o invertidos de tal manera que tales modificaciones proporcionan el efecto deseado en la secuencia, función y/o la actividad biológica del péptido o proteína codificado.
Un complemento de secuencia de ácidos nucleicos de una secuencia de promotor, secuencia de terminador, secuencia de péptidos señal, o cualquier otra secuencia de la invención, se refiere a la secuencia de ácidos nucleicos de la hebra de ácido nucleico que es complementaria a la hebra con la secuencia de promotor, secuencia de terminador, secuencia de péptidos señal, o cualquier otra secuencia de la invención. Se apreciará que un ADN bicatenario que contiene una secuencia de la invención comprende un ADN monocatenario y su hebra complementaria que tiene una secuencia que es un complemento para el ADN monocatenario. Como tal, las moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención pueden ser tanto bicatenarias como monocatenarias, e incluir aquellas moléculas de ácidos nucleicos que forman híbridos estables bajo condiciones de hibridación "rigurosas" con una secuencia de la invención, y/o con un complemento de una secuencia de la invención. Métodos para deducir una secuencia complementaria son conocidos para aquellos expertos en la materia.
El término "proteína" incluye moléculas de polipéptido monocatenarias, además de complejos de múltiples polipéptido donde polipéptidos constituyentes individuales están unidos por medios covalentes o no covalentes. El término "polipéptido" incluye péptidos de dos o más aminoácidos de longitud, normalmente que tienen más de 5, 10
o 20 aminoácidos.
Las novedosas moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención pueden utilizarse en cualquier microorganismo en el que sean funcionales. En algunas realizaciones, las moléculas de ácidos nucleicos se utilizan en microorganismos recombinantes del filo Labyrinthulomycota. En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico recombinantes se utilizan en microorganismos recombinantes del orden Thraustochytriales. En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico recombinantes se utilizan en microorganismos de Schizochytrium o Thraustochytrium. Como se usa en el presente documento, un microorganismo recombinante tiene un genoma que se modifica (es decir, muta o cambia) de su forma normal (es decir, no mutante o que existe de forma natural) usando tecnología recombinante. Un microorganismo recombinante según la presente invención puede incluir un microorganismo en el que moléculas de ácidos nucleicos han sido insertadas, delecionadas o modificadas (es decir, mutadas, por ejemplo, por inserción, deleción, sustitución y/o inversión de nucleótidos), de tal manera que tal modificación o modificaciones proporcionen el efecto deseado dentro del microorganismo. Como se usa en el presente documento, modificaciones genéticas que producen una disminución en la expresión génica, en la función del gen, o en la función del producto génico (es decir, la proteína codificada por el gen) pueden denominarse inactivación (complete o parcial), deleción, interrupción, bloqueo o regulación por disminución de un gen. Por ejemplo, una modificación genética en un gen que produce una disminución en la función de la proteína codificada por tal gen puede ser el resultado de una deleción completa del gen (es decir, el gen no existe en el microorganismo recombinante, y por tanto la proteína no existe en el microorganismo recombinante), una mutación en el gen que produce traducción incompleta o ninguna de la proteína (por ejemplo, la proteína no se expresa), o una mutación en el gen que disminuye o suprime la función natural de la proteína (por ejemplo, se expresa una proteína que tiene actividad reducida o ninguna (por ejemplo, actividad o acción enzimática). Modificaciones genéticas que producen un aumento en la expresión génica o función pueden denominarse amplificación, sobreproducción, expresión en exceso, activación, potenciamiento, adición, o regulación por incremento de un gen.
Promotores
También se describen novedosos elementos de control reguladores que son promotores. Un promotor es una región de ADN que dirige la transcripción de una región codificante asociada.
En algunas realizaciones, el promotor es de un microorganismo del filo Labyrinthulomycota. En algunas realizaciones, el promotor es de un traustoquitridio que incluye, pero no se limita a: el microorganismo depositado como SAM2179 (llamado "Ulkenia SAM2179" por el depositante), un microorganismo del género Ulkenia o Thraustochytrium, o un Schizochytrium. Schizochytrium incluyen, pero no se limitan a, Schizochytrium aggregatum, Schizochytrium limacinum, Schizochytrium sp. (S31) (ATCC 20888), Schizochytrium sp. (S8) (ATCC 20889), Schizochytrium sp. (LC-RM) (ATCC 18915), Schizochytrium sp. (SR 21), cepa de Schizochytrium depositada ATCC 28209, y cepa de Schizochytrium depositada IFO 32693.
Un promotor puede tener actividad de promotor al menos en un traustoquitridio, e incluye secuencias de promotor de longitud completa y fragmentos funcionales de las mismas, secuencias de fusión y homólogos de un promotor que existe de forma natural. Pueden usarse enzimas de restricción para digerir las moléculas de ácidos nucleicos, seguido del ensayo apropiado para determinar la secuencia mínima requerida para la actividad de promotor. Un
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homólogo de un promotor se diferencia de un promotor que existe de forma natural en que al menos uno, dos, tres,
o varios, nucleótidos han sido delecionados, insertados, invertidos, sustituidos y/o derivatizados. Un homólogo de un promotor puede retener actividad como un promotor, al menos en un traustoquitridio, aunque la actividad puede aumentarse, disminuirse, o hacerse dependiente de ciertos estímulos. Los promotores pueden comprender uno o más elementos de secuencia que confieren control regulador del desarrollo y específico de tejido o expresión.
Se describe una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un promotor PKS OrfC de PUFA ("promotor PKS OrfC"). Un promotor de PKS OrfC es una región de ADN que está naturalmente localizada en la dirección 5' (hacia la región 5') de la región codificante OrfC y que dirige la transcripción de OrfC. Se describe un promotor de PKS OrfC que tiene una secuencia de polinucleótidos representada por SEQ ID NO:3. Se describe una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de polinucleótidos que es al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 % idéntica a SEQ ID NO:3, en la que la secuencia de polinucleótidos tiene actividad de promotor (es decir, tiene actividad transcripcional de promotor basal, al menos para un secuencia de PKS OrfC de PUFA), al menos en un traustoquitridio. La homología (o % de identidad) puede encontrarse a lo largo de una secuencia de al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 100, al menos 200, al menos 300, al menos 400, al menos 500, al menos 1000, al menos 1500 nucleótidos, o más de la secuencia entera.
También se describe una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de polinucleótidos que se hibrida con SEQ ID NO:3 o que se hibrida con una secuencia de polinucleótidos que es al menos el 95 % idéntica a SEQ ID NO:3. La molécula de ácido nucleico aislada puede comprender una secuencia de polinucleótidos que es completamente complementaria a SEQ ID NO:3 o a una secuencia de polinucleótidos que es al menos el 95 % idéntica a SEQ ID NO:3. Un promotor de PKS OrfC puede incluir un homólogo de promotor de PKS OrfC que es suficientemente similar a una secuencia de promotor de PKS OrfC que existe de forma natural tal que la secuencia de ácidos nucleicos del homólogo sea capaz de hibridarse bajo condiciones de rigurosidad moderada, alta o muy alta (descritas a continuación) con el complemento de la secuencia de ácidos nucleicos del promotor de PKS OrfC que existe de forma natural. Una secuencia de promotor de PKS OrfC de PUFA puede hibridarse bajo condiciones de rigurosidad moderada, alta o muy alta con el complemento de SEQ ID NO:3.
Un promotor descrito puede comprender el promotor de OrfC de pCL0001 como se depositó en N.º de acceso de ATCC PTA-9615.
Una molécula de ácido nucleico aislada descrita comprende un promotor EF1 corto ("EF1 corto" o promotor "EF1-S")
o promotor EF1 largo ("EF1 largo" o promotor "EF1-L"). Un promotor EF1 corto o largo de la invención es una región de ADN que está naturalmente localizada en la dirección 5' (hacia la región 5') de la región codificante de EF1 y que dirige la transcripción de EF1. El promotor EF1 corto puede tener una secuencia de polinucleótidos representada por SEQ ID NO:42. El promotor EF1 largo puede tener una secuencia de polinucleótidos representada por SEQ ID NO:43. Algunas moléculas de ácido nucleico aisladas descritas comprenden una secuencia de polinucleótidos que es al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 % idéntica a SEQ ID NO:42 o SEQ ID NO:43, en la que la secuencia de polinucleótidos tiene actividad de promotor (es decir, tiene actividad transcripcional de promotor basal, al menos para una secuencia de promotor EF1 corto o largo, respectivamente), al menos en un traustoquitridio. La homología (o % de identidad) puede encontrarse a lo largo de una secuencia de al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 100, al menos 200, al menos 300, al menos 400, o al menos 500 nucleótidos, o más de la secuencia entera.
También se describe una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de polinucleótidos que se hibrida con SEQ ID NO:42 y/o SEQ ID NO:43 o que se hibrida con una secuencia de polinucleótidos que es al menos el 95 % idéntica a SEQ ID NO:42 y/o SEQ ID NO:43. En algunas moléculas de ácido nucleico aisladas, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de polinucleótidos que es completamente complementaria a SEQ ID NO:42 o SEQ ID NO:43 o a una secuencia de polinucleótidos que es al menos el 95 % idéntica a SEQ ID NO:42 o SEQ ID NO:43. Un promotor EF1 corto o EF1 largo puede incluir un homólogo de promotor EF1 corto o largo que es suficientemente similar a una secuencia de promotor EF1 corto y/o largo que existe de forma natural, respectivamente, cuya secuencia de ácidos nucleicos del homólogo es capaz de hibridarse bajo condiciones de rigurosidad moderada, alta o muy alta (descritas más adelante) con el complemento de la secuencia de ácidos nucleicos del promotor EF1 corto y/o largo que existe de forma natural, respectivamente. Una secuencia de promotor EF1 corto y/o largo puede hibridarse bajo condiciones de rigurosidad moderada, alta o muy alta con el complemento de SEQ ID NO:42 y/o SEQ ID NO:43, respectivamente.
El promotor descrito puede comprender el promotor EF1 largo de pAB0018 como se depositó en N.º de acceso de ATCC PTA-9616.
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Una molécula de ácido nucleico aislada descrita puede comprender un promotor 60S corto ("60S corto " o promotor "60S-S") o promotor 60S largo ("60S largo" o promotor "60S-L"). Un promotor 60S corto o largo es una región de ADN que está naturalmente localizada en la dirección 5' (hacia la región 5') de la región codificante de 60S y que dirige la transcripción de 60S. En algunos ácidos nucleicos aislados descritos, el promotor 60S corto tiene una secuencia de polinucleótidos representada por SEQ ID NO:44. El promotor 60S largo puede tener una secuencia de polinucleótidos representada por SEQ ID NO:45. Algunas moléculas de ácido nucleico aisladas descritas comprenden una secuencia de polinucleótidos que es al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 % idéntica a SEQ ID NO:44 o SEQ ID NO:45, en la que la secuencia de polinucleótidos tiene actividad de promotor (es decir, tiene actividad transcripcional de promotor basal, al menos para una secuencia de promotor 60S corto o largo, respectivamente), al menos en un traustoquitridio. La homología (o % de identidad) puede encontrarse a lo largo de una secuencia de al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 100, al menos 200, al menos 300, al menos 400, o al menos 500 nucleótidos, o más de la secuencia entera.
También se describe una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de polinucleótidos que se hibrida con SEQ ID NO:44 y/o SEQ ID NO:45 o que se hibrida con una secuencia de polinucleótidos que es al menos el 95 % idéntica a SEQ ID NO:44 y/o SEQ ID NO:45. La molécula de ácido nucleico aislada puede comprender una secuencia de polinucleótidos que es completamente complementaria a SEQ ID NO:44 y/o SEQ ID NO:45 o a una secuencia de polinucleótidos que es al menos el 95 % idéntica a SEQ ID NO:44 y/o SEQ ID NO:45. Un promotor 60S corto o 60S largo puede incluir un homólogo de promotor 60S corto o 60S largo que es suficientemente similar a una secuencia de promotor 60S corto o 60S largo que existe de forma natural, respectivamente, tal que la secuencia de ácidos nucleicos del homólogo sea capaz de hibridarse bajo condiciones de rigurosidad moderada, alta o muy alta (descritas más adelante) con el complemento de la secuencia de ácidos nucleicos del promotor 60S corto y/o 60S largo que existe de forma natural, respectivamente. Una secuencia de promotor 60S corto y/o 60S largo puede hibridarse bajo condiciones de rigurosidad moderada, alta o muy alta con el complemento de SEQ ID NO:44 y/o SEQ ID NO:45, respectivamente.
Algunos promotores descritos comprenden el promotor 60S largo de pAB0011 como se depositó en N.º de acceso de ATCC PTA-9614.
Algunas moléculas de ácido nucleico aisladas descritas comprenden un promotor Secl ("promotor Secl"). Un promotor Secl es una región de ADN que está naturalmente localizada en la dirección 5' (hacia la región 5') de la región codificante de Secl y que dirige la transcripción de Secl. El promotor Secl puede tener una secuencia de polinucleótidos representada por SEQ ID NO:46. Algunas moléculas de ácido nucleico aisladas descritas comprenden una secuencia de polinucleótidos que es al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 % idéntica a SEQ ID NO:46, en la que la secuencia de polinucleótidos tiene actividad de promotor (es decir, tiene actividad transcripcional de promotor basal, al menos para una secuencia de Secl), al menos en un traustoquitridio. La homología (o % de identidad) puede encontrarse a lo largo de una secuencia de al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 100, al menos 200, al menos 300, al menos 400, o al menos 500 nucleótidos, o más de la secuencia entera.
También se describe una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de polinucleótidos que se hibrida con SEQ ID NO:46 o que se hibrida con o una secuencia de polinucleótidos que es al menos el 95 % idéntica a SEQ ID NO: 46. La molécula de ácido nucleico aislada descrita puede comprender una secuencia de polinucleótidos que es completamente complementaria a SEQ ID NO:46 o a una secuencia de polinucleótidos que es al menos el 95 % idéntica a SEQ ID NO:46. Un promotor Secl descrito puede incluir un homólogo de promotor Secl que es suficientemente similar a una secuencia de promotor Secl que existe de forma natural tal que la secuencia de ácidos nucleicos del homólogo sea capaz de hibridarse bajo condiciones de rigurosidad moderada, alta o muy alta (descritas más adelante) con el complemento de la secuencia de ácidos nucleicos del promotor Secl que existe de forma natural. Una secuencia de promotor Secl puede hibridarse bajo condiciones de rigurosidad moderada, alta o muy alta con el complemento de SEQ ID NO:46.
El promotor descrito puede comprender el promotor Secl de pAB0022 como se depositó en N.º de acceso de ATCC PTA-9613.
Terminadores
También se describen novedosos elementos de control reguladores que son terminadores de la transcripción. Una región de terminador de la invención es una sección de secuencia genética que marca el fin de una secuencia de gen en el ADN genómico para la transcripción.
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La región de terminador puede ser de un microorganismo del filo Labyrinthulomycota. La región de terminador puede ser de un traustoquitridio. La región de terminador puede ser de un Schizochytrium o un Thraustochytrium. Schizochytrium incluyen, pero no se limitan a, Schizochytrium aggregatum, Schizochytrium limacinum, Schizochytrium sp. (S31) (ATCC 20888), Schizochytrium sp. (S8) (ATCC 20889), Schizochytrium sp. (LC-RM) (ATCC 18915), Schizochytrium sp. (SR 21), cepa ATCC 28209 depositada y cepa IFO 32693 depositada.
Una región de terminador puede tener actividad de terminador al menos en un traustoquitridio e incluye secuencias de terminador de longitud completa y fragmentos funcionales de las mismas, secuencias de fusión, y homólogos de una región de terminador que existe de forma natural. Un homólogo de un terminador se diferencia de un terminador que existe de forma natural en que al menos uno o algunos, pero no se limitan a uno o algunos, nucleótidos han sido delecionados, insertados, invertidos, sustituidos y/o derivatizados. Homólogos de un terminador pueden retener actividad como una región de terminador al menos en un traustoquitridio, aunque la actividad puede aumentarse, disminuirse, o hacerse dependiente de ciertos estímulos.
También se describe una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una región de terminador de un gen PKS OrfC de PUFA ("región de terminador de PKS OrfC"). Una región de terminador de PKS OrfC de la invención es una sección de secuencia genética que marca del fin de la secuencia de genes OrfC en ADN genómico para la transcripción. La región de terminador puede tener una secuencia de polinucleótidos representada por SEQ ID NO:4. La región de terminador desvelada en SEQ ID NO:4 es una secuencia de terminador que existe de forma natural (no mutante) de un microorganismo de traustoquitridio, y, específicamente, es una región de terminador de PKS OrfC de Schizochytrium y se llama "elemento 1 terminador de OrfC". Una molécula de ácido nucleico aislada descrita puede comprender una secuencia de polinucleótidos que es al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 % idéntica a SEQ ID NO:4, y que funciona al menos como una región de terminador de PKS OrfC de PUFA al menos en un traustoquitridio. La homología (o % de identidad) puede encontrarse a lo largo de una secuencia de al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 100, al menos 150, o al menos 200 nucleótidos, o más de la secuencia entera.
También se describe una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de polinucleótidos que se hibrida con SEQ ID NO:4 o que se hibrida con una secuencia de polinucleótidos que es al menos el 95 % idéntica a SEQ ID NO:4. La molécula de ácido nucleico aislada descrita puede comprender una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de polinucleótidos que es completamente complementaria a SEQ ID NO:4 o a una secuencia de polinucleótidos que es al menos el 95 % idéntica a SEQ ID NO:4. La región de terminador de PKS OrfC puede incluir un homólogo de región de terminador de PKS OrfC que es suficientemente similar a una región de terminador de PKS OrfC de PUFA que existe de forma natural tal que la secuencia de ácidos nucleicos de un homólogo sea capaz de hibridarse bajo condiciones de rigurosidad moderada, alta o muy alta (descritas más adelante) con el complemento de la secuencia de ácidos nucleicos de la región de terminador de PKS OrfC que existe de forma natural. Una secuencia de región de terminador de PKS OrfC puede hibridarse bajo condiciones de rigurosidad moderada, alta o muy alta con el complemento de SEQ ID NO:4.
Un terminador descrito comprende la región de terminador OrfC de pAB0011 como se depositó en N.º de acceso de ATCC PTA-9614.
Péptidos señal
La presente invención también se refiere a novedosas moléculas de ácidos nucleicos que codifican péptidos señal.
En algunas realizaciones, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un péptido señal de una proteína secretada de un microorganismo del filo Labyrinthulomycota. En algunas realizaciones, el microorganismo es un traustoquitridio. En algunas realizaciones, el microorganismo es un Schizochytrium o un Thraustochytrium.
Un péptido señal de la invención puede tener actividad de señal de secreción en un traustoquitridio, e incluye péptidos de longitud completa y fragmentos funcionales de los mismos, péptidos de fusión y homólogos de un péptido señal que existe de forma natural. Un homólogo de un péptido señal se diferencia de un péptido señal que existe de forma natural en que al menos uno o algunos, pero no se limitan a uno o algunos, aminoácidos han sido delecionados (por ejemplo, una versión truncada de la proteína, tal como un péptido o fragmento), insertados, invertidos, sustituidos y/o derivatizados (por ejemplo, por glucosilación, fosforilación, acetilación, miristoilación, prenilación, palmitación, amidación, y/o adición de glucosilfosfatidil inositol). En algunas realizaciones, los homólogos de un péptido señal retienen la actividad como una señal al menos en un traustoquitridio, aunque la actividad puede aumentarse, disminuirse o hacerse dependiente de ciertos estímulos.
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aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 % idéntica a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica SEQ ID NO:61. La molécula de ácido nucleico aislada descrita puede comprender una secuencia de polinucleótidos que es completamente complementaria a cualquiera de: (i) SEQ ID NO:62, (ii) una secuencia de polinucleótidos que es al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 % idéntica a SEQ ID NO:62, y (iii) una secuencia de polinucleótidos que es al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 % idéntica a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica SEQ ID NO:61.
También se describe un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos de péptido señal de BiP. El polipéptido aislado descrito puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (i) SEQ ID NO:61 y (ii) una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 % idéntica a SEQ ID NO:61 que actúa como una secuencia señal, al menos para una proteína BiP, al menos en un traustoquitridio. El polipéptido aislado descrito puede comprender los primeros 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o 31 restos de aminoácidos de SEQ ID NO:61. El péptido señal de BiP aislado puede producirse recombinantemente.
Algunas moléculas de ácido nucleico aisladas descritas comprenden una secuencia de polinucleótidos que codifica un péptido señal de alfa-1,3-glucosidasa (GLS2). Un péptido señal de GLS2 puede tener actividad de direccionamiento de señal al menos para una proteína GLS2, al menos en un traustoquitridio, e incluye péptidos de longitud completa y fragmentos funcionales de los mismos, péptidos de fusión y homólogos de un péptido señal de GLS2 que existe de forma natural. El péptido señal de GLS2 puede tener una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO:63. Una molécula de ácido nucleico aislada descrita puede comprender una secuencia de polinucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 % idéntica a SEQ ID NO:63, en la que la secuencia de polinucleótidos codifica una secuencia de aminoácidos que actúa como péptido señal, al menos para una proteína GLS2, al menos en un traustoquitridio. La molécula de ácido nucleico aislada descrita puede comprender una secuencia de polinucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos aislada que comprende un fragmento funcional de SEQ ID NO:63 que actúa como péptido señal al menos para una proteína GLS2, al menos en un traustoquitridio. La molécula de ácido nucleico aislada descrita puede comprender SEQ ID NO:64. La molécula de ácido nucleico aislada descrita puede comprender una secuencia de polinucleótidos que se hibrida con cualquiera de: (i) SEQ ID NO:64; (ii) una secuencia de polinucleótidos que es al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 % idéntica a SEQ ID NO:64; y (iii) una secuencia de polinucleótidos que es al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 % idéntica a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica SEQ ID NO:63. La molécula de ácido nucleico aislada descrita comprende una secuencia de polinucleótidos que es completamente complementaria a cualquiera de: (i) SEQ ID NO:64, (ii) una secuencia de polinucleótidos que es al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 % idéntica a SEQ ID NO:64, y (iii) una secuencia de polinucleótidos que es al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 % idéntica a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica SEQ ID NO:63.
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manosidasa, al menos en un traustoquitridio, e incluye péptidos de longitud completa y fragmentos funcionales de los mismos, péptidos de fusión y homólogos de un péptido señal N.º 1 de tipo alfa-1,3-1,6-manosidasa que existen de forma natural. El péptido señal N.º 1 de tipo alfa-1,3-1,6-manosidasa puede tener una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO:67. Algunas moléculas de ácido nucleico aisladas descritas comprenden una secuencia de polinucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 % idéntica a SEQ ID NO:67, en la que la secuencia de polinucleótidos codifica una secuencia de aminoácidos que actúa como péptido señal, al menos para un polipéptido N.º 1 de tipo alfa-1,3-1,6-manosidasa; al menos en un traustoquitridio. La molécula de ácido nucleico aislada descrita puede comprender una secuencia de polinucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos aislada que comprende un fragmento funcional de SEQ ID NO:67 que actúa como péptido señal al menos para una proteína N.º 1 de tipo alfa-1,3-1,6-manosidasa, al menos en un traustoquitridio. La molécula de ácido nucleico aislada puede comprender SEQ ID NO:68. La molécula de ácido nucleico aislada descrita puede comprender una secuencia de polinucleótidos que se hibrida con cualquiera de: (i) SEQ ID NO:68; (ii) una secuencia de polinucleótidos que es al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 % idéntica a SEQ ID NO:68; y (iii) una secuencia de polinucleótidos que es al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 % idéntica a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica SEQ ID NO:67. La molécula de ácido nucleico aislada descrita puede comprender una secuencia de polinucleótidos que es completamente complementaria a cualquiera de: (i) SEQ ID NO:68, (ii) una secuencia de polinucleótidos que es al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 % idéntica a SEQ ID NO:68, y (iii) una secuencia de polinucleótidos que es al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 % idéntica a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica SEQ ID NO:67.
También se describe un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos de péptido señal N.º 1 de tipo alfa-1,3-1,6-manosidasa. El polipéptido aislado descrito puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (i) SEQ ID NO:67 y (ii) una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 % idéntica a SEQ ID NO:67 que actúa como una secuencia señal, al menos para una proteína N.º 1 de tipo alfa-1,3-1,6manosidasa, al menos en un traustoquitridio. El polipéptido aislado descrito puede comprender los primeros 23, 24, 25, 26, 27, 28 o 29 restos de aminoácidos de SEQ ID NO:67. Un péptido N.º 1 de tipo alfa-1,3-1,6-manosidasa aislado puede producirse recombinantemente.
Algunas moléculas de ácido nucleico aisladas descritas comprenden una secuencia de polinucleótidos que codifica un péptido señal de tipo alfa-1,2-manosidasa. Un péptido señal de tipo alfa-1,2-manosidasa puede tener actividad de direccionamiento de señal al menos para una proteína de tipo alfa-1,2-manosidasa, al menos en un traustoquitridio, e incluye péptidos de longitud completa y fragmentos funcionales de los mismos, péptidos de fusión y homólogos de un péptido señal de tipo alfa-1,2-manosidasa que existe de forma natural. El péptido señal de tipo alfa-1,2manosidasa puede tener una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO:69. La molécula de ácido nucleico aislada puede comprender una secuencia de polinucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 % idéntica a SEQ ID NO:69, en la que la secuencia de polinucleótidos codifica una secuencia de aminoácidos que actúa como péptido señal, al menos para una proteína de tipo alfa-1,2-manosidasa; al menos en un traustoquitridio. La molécula de ácido nucleico aislada descrita puede comprender una secuencia de polinucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos aislada que comprende un fragmento funcional de SEQ ID NO:69 que actúa como péptido señal al menos para una proteína de tipo alfa-1,2-manosidasa, al menos en un traustoquitridio.
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Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107858297A (zh) 2009-12-28 2018-03-30 Dsm Ip资产公司 在蔗糖上生长的重组破囊壶菌和其组合物、制备方法及用途
CA2785867C (en) * 2009-12-28 2018-03-27 Dsm Ip Assets B.V. Production of hemagglutinin-neuraminidase protein in microalgae
CA3028175C (en) 2009-12-28 2022-05-24 Sanofi Vaccine Technologies, S.A.S. Methods of producing heterologous viral neuraminidase proteins in microalgae
CN102906270B (zh) * 2009-12-28 2016-06-22 Dsmip资产公司 在木糖上生长的重组破囊壶菌和其组合物、制备方法及用途
RU2575599C2 (ru) 2010-03-12 2016-02-20 Мериал Лимитед Рекомбинантные вакцины против вируса "синего языка", их применение
CN105764916B (zh) 2013-06-05 2021-05-18 博士医疗爱尔兰有限公司 鸟苷酸环化酶c的超纯激动剂、制备和使用所述激动剂的方法
US20220000141A1 (en) * 2014-07-25 2022-01-06 Smallfood Inc. Protein rich food ingredient from biomass and methods of production
US11213048B2 (en) 2014-07-25 2022-01-04 Smallfood, Inc. Protein rich food ingredient from biomass and methods of preparation
US11122817B2 (en) * 2014-07-25 2021-09-21 Smallfood Inc. Protein rich food ingredient from biomass and methods of production
WO2016140925A1 (en) 2015-03-02 2016-09-09 Synthetic Genomics, Inc. Regulatory elements from labyrinthulomycetes microorganisms
US10584347B2 (en) * 2016-03-16 2020-03-10 Conagen Inc. Production of proteins in labyrinthulomycetes
BR112018073164A2 (pt) 2016-05-12 2019-04-30 Dsm Ip Assets Bv método de aumento de produção de ácidos graxos poli-insaturados ômega-3 em microalgas
CN109689856A (zh) * 2016-07-13 2019-04-26 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 用于海藻宿主细胞的CRISPR-Cas系统
US10633454B2 (en) 2016-11-01 2020-04-28 Conagen Inc. Expression of modified glycoproteins and glycopeptides
WO2018085273A1 (en) * 2016-11-01 2018-05-11 Synthetic Genomics, Inc. Expression of modified glycoproteins and glycopeptides
WO2019173226A1 (en) * 2018-03-05 2019-09-12 Synthetic Genomics, Inc. Organisms and methods for producing glycomolecules with low sulfation
WO2019213095A1 (en) * 2018-05-01 2019-11-07 Conagen Inc. Recombinant organisms and methods for producing glycomolecules with high glycan occupancy
CN109777815B (zh) * 2019-03-28 2021-10-29 昆明理工大学 HMG-CoA合成酶基因RKHMGCS及其应用
WO2022232213A1 (en) * 2021-04-28 2022-11-03 Conagen Inc. Methods of producing sars-cov-2 spike protein
WO2023144707A1 (en) 2022-01-25 2023-08-03 Dsm Ip Assets B.V. Media refinement and nutrient feeding approaches to increase polyunsaturated fatty acid production

Family Cites Families (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
LU35839A1 (es)
BE545283A (es)
US3223456A (en) * 1963-11-14 1965-12-14 Siemens Ag Conveying apparatus for fine-granular material
US4381897A (en) * 1980-10-06 1983-05-03 Krupp Polysius Ag Installation for transporting fine-grained material
US4626505A (en) * 1984-02-24 1986-12-02 E. I. Du Pont De Nemours And Company Selectable markers for yeast transformation
US5605011A (en) * 1986-08-26 1997-02-25 E. I. Du Pont De Nemours And Company Nucleic acid fragment encoding herbicide resistant plant acetolactate synthase
IL83348A (en) 1986-08-26 1995-12-08 Du Pont Nucleic acid fragment encoding herbicide resistant plant acetolactate synthase
GB8716899D0 (en) * 1987-07-17 1987-08-26 Unilever Plc Detergent compositions
US5130242A (en) * 1988-09-07 1992-07-14 Phycotech, Inc. Process for the heterotrophic production of microbial products with high concentrations of omega-3 highly unsaturated fatty acids
US5340742A (en) 1988-09-07 1994-08-23 Omegatech Inc. Process for growing thraustochytrium and schizochytrium using non-chloride salts to produce a microfloral biomass having omega-3-highly unsaturated fatty acids
US5426040A (en) * 1989-08-17 1995-06-20 Northeastern University Methods for producing improved strains of seaweed by fusion of spore-protoplasts, and resultant seaweeds and phycocolloids
IL100908A0 (en) * 1991-02-22 1992-11-15 Salk Inst Biotech Ind Invertase genes and their use
US5804408A (en) * 1991-03-13 1998-09-08 Yoshihide Hagiwara Expression of human SOD in blue green algae
US5661017A (en) * 1993-09-14 1997-08-26 Dunahay; Terri Goodman Method to transform algae, materials therefor, and products produced thereby
US5853973A (en) * 1995-04-20 1998-12-29 American Cyanamid Company Structure based designed herbicide resistant products
DE19529475A1 (de) 1995-08-11 1997-02-13 Marcus Weis Siebkonstruktion zum Abtrennen des Faseranteils aus der Shredderleichtfraktion
US5824309A (en) * 1995-12-05 1998-10-20 University Of Massachusetts Recombinant gas vesicles and uses thereof
US6027900A (en) * 1996-04-12 2000-02-22 Carnegie Institution Of Washington Methods and tools for transformation of eukaryotic algae
CN1190673A (zh) 1996-04-29 1998-08-19 中国科学院微生物研究所 丝状真菌中独立复制的表达载体及表达系统
AU727570B2 (en) 1997-02-20 2000-12-14 Bayer Cropscience Nv Improved transformation method for plants
ES2125195B1 (es) 1997-04-18 1999-10-01 Antibioticos Sa Procedimiento de inactivacion de genes que codifican para enzimas del catabolismo del fenilacetato, plasmidos que intervienen y cepas transformadas con los mismos.
US7247461B2 (en) * 1999-01-14 2007-07-24 Martek Biosciences Corporation Nucleic acid molecule encoding ORFA of a PUFA polyketide synthase system and uses thereof
US8003772B2 (en) * 1999-01-14 2011-08-23 Martek Biosciences Corporation Chimeric PUFA polyketide synthase systems and uses thereof
US7217856B2 (en) 1999-01-14 2007-05-15 Martek Biosciences Corporation PUFA polyketide synthase systems and uses thereof
US7211418B2 (en) 1999-01-14 2007-05-01 Martek Biosciences Corporation PUFA polyketide synthase systems and uses thereof
FR2791699B1 (fr) 1999-03-29 2004-10-29 Meristem Therapeutics Promoteurs chimeriques d'expression, cassettes d'expression, vecteurs, plantes et semences transgeniques les contenant, et methodes de leur obtention
KR20000075076A (ko) 1999-05-28 2000-12-15 최태진 형질전환된 미세조류를 이용하여 외래 단백질을 생산하는 방법
MXPA03000105A (es) * 2000-06-28 2004-09-13 Glycofi Inc Metodo para producir glicoproteinas modificadas.
US7795002B2 (en) * 2000-06-28 2010-09-14 Glycofi, Inc. Production of galactosylated glycoproteins in lower eukaryotes
US7625756B2 (en) 2000-06-28 2009-12-01 GycoFi, Inc. Expression of class 2 mannosidase and class III mannosidase in lower eukaryotic cells
US20060257399A1 (en) 2000-06-28 2006-11-16 Glycofi, Inc. Immunoglobulins comprising predominantly a Man5GIcNAc2 glycoform
US20060029604A1 (en) 2000-06-28 2006-02-09 Gerngross Tillman U Immunoglobulins comprising predominantly a GlcNAc2Man3GlcNAc2 glycoform
ES2343106T3 (es) * 2000-09-28 2010-07-23 BIORIGINAL FOOD & SCIENCE CORP. Fad4, fad5, fad5-2 y fad6, miembros de la familia de desaturasas de acidos grasos y usos de los mismos.
US6419425B1 (en) * 2001-02-28 2002-07-16 Neu Transf'air Granular material distributing apparatus comprising at least two transfer vessels that operate in alternation
TWI324181B (en) * 2001-04-16 2010-05-01 Martek Biosciences Corp Product and process for transformation of thraustochytriales microorganisms
US7332299B2 (en) 2003-02-20 2008-02-19 Glycofi, Inc. Endomannosidases in the modification of glycoproteins in eukaryotes
AU2004225485B2 (en) * 2003-03-26 2008-08-21 Dsm Ip Assets B.V. PUFA polyketide synthase systems and uses thereof
BRPI0411099A (pt) * 2003-06-05 2006-07-18 Wyeth Corp composições imunogênicas que compreendem os vetores de replicon do vìrus da encefalite eqüina venezuelana e antìgenos de proteìnas de paramixovìrus
JP4796786B2 (ja) * 2005-04-28 2011-10-19 富士フイルム株式会社 ラビリンチュラ類を形質転換可能なベクター
JP4796787B2 (ja) 2005-04-28 2011-10-19 富士フイルム株式会社 ラビリンチュラ類への遺伝子導入法
PT103331A (pt) * 2005-08-05 2007-02-28 Fundacao Da Faculdade De Cienc Expressão dum transportador activo de xilose em saccharomyces cerevisiae modificada geneticamente
EP2653557A1 (en) * 2006-03-15 2013-10-23 DSM IP Assets B.V. Plant seed oils containing polyunsaturated fatty acids
US8477593B2 (en) 2006-07-28 2013-07-02 Qualcomm Incorporated Method and apparatus for sending signaling for data transmission in a wireless communication system
CA2659603C (en) 2006-08-01 2017-03-07 Ocean Nutrition Canada Limited Oil producing microbes and methods of modification thereof
CA2615372A1 (en) 2007-07-13 2009-01-13 Marc-Andre D'aoust Influenza virus-like particles (vlps) comprising hemagglutinin
NZ598199A (en) * 2007-09-12 2013-12-20 Martek Biosciences Corp Biological oils and production and uses thereof
EP2090648A1 (en) 2008-02-12 2009-08-19 Institut Francais de Recherche pour l'Exploitation de la Mere(Ifremer) Production of glycosylated polypeptides in microalgae
BRPI0910914A2 (pt) 2008-04-09 2015-10-13 Solazyme Inc método para modificar quimicamente biomassa microbiana contendo lipídeo, composição, e, método para fabricar um sabão.
CN102906270B (zh) * 2009-12-28 2016-06-22 Dsmip资产公司 在木糖上生长的重组破囊壶菌和其组合物、制备方法及用途
CA3028175C (en) * 2009-12-28 2022-05-24 Sanofi Vaccine Technologies, S.A.S. Methods of producing heterologous viral neuraminidase proteins in microalgae
CN107858297A (zh) * 2009-12-28 2018-03-30 Dsm Ip资产公司 在蔗糖上生长的重组破囊壶菌和其组合物、制备方法及用途
CA2785867C (en) * 2009-12-28 2018-03-27 Dsm Ip Assets B.V. Production of hemagglutinin-neuraminidase protein in microalgae

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