ES2688953T3 - Producto y proceso para transformación de microorganismos de Thraustochytriales - Google Patents

Abstract

Un método para producción de una proteína, que comprende: cultivar un microorganismo recombinante del Orden Thraustochytriales en un medio, en el que el microorganismo recombinante comprende una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un gen extraño que codifica la proteína, 5 para producir la proteína; y recuperar la proteína.

Description

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DESCRIPCION

Producto y proceso para transformación de microorganismos de Thraustochytriales Campo de la invención

La presente invención generalmente se refiere a un método para producción de una proteína, que comprende: cultivar un microorganismo recombinante del Orden Thraustochytriales en un medio, en el que el microorganismo recombinante comprende una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un gen extraño que codifica la proteína; y recuperar la proteína. La invención también se refiere a un método para producción de una proteína, que comprende: cultivar un microorganismo recombinante del Orden Thraustochytriales en un medio, en el que el microorganismo recombinante comprende una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un gen extraño que codifica la proteína, para producir la proteína; y extraer el microorganismo que comprende la proteína.

Antecedentes de la invención

El desarrollo han dado como resultado la revisión de la taxonomía de los Traustoquítridos. Los teóricos de la taxonomía sitúan a los Traustoquítridos con las algas o los protistas similares a algas. Sin embargo, debido a la incertidumbre taxonómica, en el contexto de la presente invención lo mejor podría ser tener en cuenta las cepas que se describen en la presente invención como Traustoquítridos (Orden: Thraustochytriales; Familia: Thraustochytrium, Schizochytrium Labyrintuloides, o Japonochytrium). A continuación se resumen los cambios taxonómicos.

Las cepas de ciertos microorganismos unicelulares que se desvelan y se reivindican en el presente documento son miembros del orden Thraustochytriales. Los Thraustochytriales son eucariotas marinos con una historia taxonómica problemática. Moss (1986), Bahnweb y Jackle (1986) y Chamberlain y Moss (1988) han revisado los problemas con la colocación taxonómica de los Traustoquítridos.

Por fines de conveniencia, los taxónomos colocaron al principio a los Traustoquítridos con otros eucariotas zoospóricos incoloros en los Ficomicetos (hongos similares a algas). El nombre Ficomicetos, sin embargo, se eliminó con el tiempo del estado taxonómico, y los Traustoquítridos se mantuvieron en los Oomicetos (los hongos zoospóricos biflagelados). Inicialmente se supuso inicialmente que los Oomicetos estaban relacionados con las algas heterocontas, y con el tiempo una amplia gama de estudios ultraestructurales y bioquímicos, resumidos por Barr (1983) apoyaron esta suposición. Los Oomicetos fueron de hecho aceptados por Leedale (1974) y otros ficólogos como parte de las algas heterocontas. Sin embargo, por razones de conveniencia que resultaban de su naturaleza heterotrófica, los Oomicetos y Traustoquítridos han sido estudiados en gran parte por micólogos (científicos que estudian hongos) en vez de por ficólogos (científicos que estudian algas).

Desde otra perspectiva taxonómica, los biólogos evolucionistas han desarrollado dos escuelas de pensamiento generales en cuanto a cómo evolucionaron los eucariotas. Una teoría propone un origen exógeno de los orgánulos unidos a membrana a través de una serie de endosimbiosis (Margulis 1970); por ejemplo, las mitocondrias se obtuvieron a partir de endosimbiontes bacterianos, los cloroplastos de cianofitas y los flagelos de espiroquetas. La otra teoría sugiere una evolución gradual de los orgánulos unidos a membrana a partir de los sistemas no unidos a membrana de la especie primitiva procariota por medio de un proceso autógeno (Cavalier-Smith 1975). Ambos grupos de biólogos evolucionistas, sin embargo, han retirado a los Oomicetos y a los Traustoquítridos de los hongos y los colocan o bien con las algas cromofitas en el reino Chromophyta (Cavalier-Smith 1981) (este reino se ha ampliado más recientemente para incluir otros protistas y en la actualidad los miembros de este reino se denominan Stramenopiles) o bien con todas las algas en el reino Protoctista (Margulis y Sagan (1985).

Con el desarrollo de la microscopía electrónica, los estudios de la ultraestructura de las zoosporas de dos géneros de Traustoquítridos, Thraustochytrium y Schizochytrium, (Perkins 1976; Kazama 1980; Barr 1981) han proporcionado pruebas válidas de que los Thraustochytriaceae están solo relacionados de manera distante con los Oomicetos. Además, los datos genéticos que representan un análisis de correspondencia (una forma de estadística multivariante) de secuencias de ARN ribosómico 5 S indican que los Thraustochytriales son claramente un único grupo de eucariotas, completamente separados de los hongos, y lo más estrechamente relacionados con las algas rojas y marrones, y con miembros de los Oomicetos (Mannella et al., 1987). La mayoría de los taxónomos están de acuerdo con retirar a los Traustoquítridos de los Oomicetos (Bartnicki-Garcia 1988).

En resumen, usando el sistema taxonómico de Cavalier-Smith (1981, 1983), los Traustoquítridos se clasifican con las algas cromofitas en el reino Chromophyta, (Stramenopiles). Esto los sitúa en un reino completamente diferente de los hongos, que se colocan todos en el reino Eufungi. La colocación taxonómica de los traustoquítridos se resume por tanto a continuación:

Reino: Chromophyta (Stramenopiles)

Filo: Heterokonta Orden: Thraustochytriales Familia: Thraustochytriaceae

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Género: Thraustochytrium, Schizochytrium, Labyrinthuloides, o Japonochytrium

Algunos taxónomos pioneros separaron unos pocos miembros originales del género Thraustochytrium (aquellos con una fase de vida ameboide) en un género separado denominado Ulkenia. Sin embargo, en la actualidad se sabe que la mayoría, si no todos, los Traustoquítridos (incluyendo Thraustochytrium y Schizoclaytrium) presentan fases ameboides y, como tal, algunos no consideran que Ulkenia sea un género válido. Tal como se utiliza en el presente documento, el género Thraustochytrium incluirá Ulkenia.

A pesar de la incertidumbre de la colocación taxonómica dentro de clasificaciones superiores de Filo y Reino, los Traustoquítridos siguen siendo una agrupación distintiva y característica cuyos miembros siguen pudiéndose clasificar dentro del orden Thraustochytriales.

Los Schizochytrium y otros microorganismos de Thraustochytriales presentan un valor comercial actual y potencial sustancial debido a su capacidad para producir grandes cantidades de compuestos lipídicos, incluyendo ácidos grasos altamente insaturados (HUFA) y diversos carotenoides (por ejemplo, astaxantina). Los ácidos grasos altamente insaturados omega-3 son de interés comercial significativo porque se han reconocido recientemente como compuestos dietéticos importantes para prevenir arteriosclerosis y cardiopatía coronaria, para aliviar afecciones inflamatorias y para retrasar el crecimiento de células tumorales. Estos efectos beneficiosos son un resultado tanto de los HUFA omega-3 que provocan inhibición competitiva de compuestos producidos a partir de ácidos grasos omega-6, como de los compuestos beneficiosos producidos directamente a partir de los propios HUFA omega-3 (Simopoulos et al., 1986). Los ácidos grasos omega-6 son los HUFA predominantes que se encuentran en plantas y animales. Por tanto, el desarrollo adicional de microorganismos de Thraustochytriales como organismos de producción comercial se beneficiará significativamente de la capacidad para producir cambios genéticos específicos en los organismos por medio de tecnología de ADN recombinante, incluyendo la potenciación de la producción de HUFA y carotenoides y altamente valiosos por tales organismos. Además, la capacidad para lograr una mejor comprensión de la bioquímica y biología molecular de este grupo escasamente caracterizado de organismos proporcionará una información valiosa que se puede usar para guiar los futuros esfuerzos de desarrollo de cepas. Antes de la presente invención, sin embargo, los métodos y construcciones recombinantes adecuados para transformar Traustoquítridos, incluyendo miembros de los géneros Schizochytrium y Thraustochytrium, no estaban disponibles. De manera importante, antes de la presente invención no se disponía del desarrollo de marcadores seleccionables que son particularmente útiles para transformar microorganismos de Thraustochytriales y de la identificación de secuencias de promotor específicas de Thraustochytriales.

Los investigadores anteriores han descrito métodos y reactivos de transformación para uso en diversos microorganismos, incluyendo en microalgas que no son miembros del orden Thraustochytriales. El documento de Patente de Estados Unidos N.° 6.027.900 concedida a Allnutt et al., desvela fusiones genéticas para uso en modificación por ingeniería genética de algas eucariotas, y en particular, Phaeodactylum tricornutum, usando un promotor para un gen de captación de luz de algas fotosintéticas y el gen Sh ble de Streptoalloteichus hindustanus como marcador seleccionable. Las células se hacen crecer en altas concentraciones de sal (por ejemplo, 10-35 g/l) y Zeocin™ para selección de transformantes. Las células de microalgas adecuadas para su transformación usando un método de este tipo son microalgas fotosintéticas que se pueden hacer crecer en condiciones de alta concentración de sal. El documento de Patente de Estados Unidos N.° 5.661.017 concedida a Dunahay et al., desvela un método para transformar algas que contienen clorofila C (por ejemplo, Diatomeas) usando una construcción recombinante que comprende un marcador seleccionable unido de forma operativa a una secuencia de control reguladora adecuada para la expresión del marcador en las algas que contienen clorofila C. Se desvela que el marcador seleccionable es cualquier marcador adecuado, incluyendo los marcadores aislados de fuentes bacterianas y fúngicas, y es preferentemente neomicina fosfotransferasa. La secuencia de control reguladora puede incluir cualquier secuencia reguladora obtenida a partir de un alga que contiene clorofila C y, preferentemente, de Cyclotella cryptica (por ejemplo, una secuencia reguladora de acetil-CoA carboxilasa de C. cryptica). Ti Zhou-Chou et al., 1995 (Journal of Biotechnology, 38 (2): 137-139) describe la expresión, purificación y caracterización de una proteína recombinante en Dictyostelium discoideum. Sin embargo, los métodos de ese tipo no son fácilmente transferibles para la transformación de microorganismos de Thraustochytriales, porque, antes de la presente invención, la transformación de microorganismos tales como Thraustochytriales (por ejemplo, microalgas) estaba lejos de ser rutinaria. Los marcadores y sistemas de transformación que han alcanzado un gran desarrollo para bacterias y levaduras no son necesariamente adaptables fácilmente a otros microorganismos. De hecho, el documento de Patente de Estados Unidos N.° 5.661.017 indica que "ha habido poco éxito en el desarrollo de sistemas de transformación para microalgas eucariotas" (col. 1, líneas 49-51), lo que se debe en parte a la dificultad de introducción de ADN extraño en tales microorganismos, y se debe en parte a una falta de marcadores y vectores adecuados para su usó en una transformación de ese tipo. El sistema que se describe en el documento de Patente de Estados Unidos N.° 5.661.017 se desarrolló de forma específica para las algas que contienen clorofila C porque los inventores creían que eran más susceptibles de transformación genética, en particular en comparación con otras algas. De forma análoga, el documento de Patente de Estados Unidos N.° 6.027.900, que enseña un método de transformación que es específico para microalgas fotosintéticas, habla de la creencia de que la mayoría de las algas son resistentes a cualquier tipo de manipulación genética (col. 1, líneas 39-47). Los sistemas adaptados para bacterias, levaduras, células de insecto y animales no se han adaptado fácilmente a microalgas. Por lo tanto, antes

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de la presente invención, existía una necesidad en la técnica de sistemas y métodos de transformación eficaces que fueran específicos para microalgas.

Adicionalmente, aunque en la actualidad el orden Thraustochytriales se agrupa con las algas cromofitas en los Stramenopiles, algunos sostienen todavía en la técnica que estos microorganismos son bastante diferentes de la mayoría de las microalgas, y algunos de esos expertos en la materia tienen la opinión de que los miembros de Thraustochytriales pueden no estar apropiadamente clasificados como microalgas en absoluto. Los microorganismos que se considera que son microalgas han evolucionado por lo menos cuatro veces separadas durante la evolución, lo que conduce a que los microorganismos de tipo "microalga" sean ubicados en diferentes reinos (por ejemplo algas rojas, algas verdes y algas doradas (Chromophyta) están todas en reinos separados). Como resultado, no se espera que los sistemas de transformación que se ha demostrado que son útiles en otras microalgas sean útiles para Thraustochytriales. Por lo tanto, a pesar del valor comercial de microorganismos de Thraustochytriales, la capacidad para usar el potencial completo de tales microorganismos mediante ingeniería genética no se ha reconocido hasta el momento. Antes de la presente invención, los presentes inventores no eran conscientes de ningún promotor, marcador seleccionable o vector útil para la transformación de microorganismos de Thraustochytriales, ni había ningún conocimiento con respecto a qué sistemas de selección se podrían usar en o adaptar para Thraustochytriales.

En resumen, existe una necesidad en la técnica de desarrollar métodos para transformar microorganismos de Thraustochytriales, proporcionando de ese modo un medio para crear cepas con un aumento del valor comercial. Además, existe una necesidad en la técnica de desarrollar métodos para mutación o inactivación de genes específicos mediante recombinación homóloga o no homóloga en microorganismos de Thraustochytriales, proporcionando un nuevo modo para alterar el metabolismo celular y para identificar las funciones de genes específicos en Thraustochytriales.

Sumario de la Invención

La invención proporciona un método para producción de una proteína, que comprende: cultivar un microorganismo recombinante del Orden Thraustochytriales en un medio, en el que el microorganismo recombinante comprende una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un gen extraño que codifica la proteína; y recuperar la proteína. La invención también proporciona un método para producción de una proteína, que comprende: cultivar un microorganismo recombinante del Orden Thraustochytriales en un medio, en el que el microorganismo recombinante comprende una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un gen extraño que codifica la proteína, para producir la proteína; y extraer el microorganismo que comprende la proteína. La invención se define mediante las reivindicaciones. La materia objeto fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona solamente para información.

Breve descripción de las figuras

FIG.1 ilustra la construcción del plásmido recombinante pTUBZEO-11.

FIG.2 ilustra la construcción del plásmido recombinante pTUBZEO11-2.

FIG. 3A ilustra el plásmido o recombinante pMON50200.

FIG. 3B ilustra el plásmido o recombinante pMON50201.

FIG. 3C ilustra el plásmido o recombinante pMON50202.

FIG. 3D ilustra el plásmido o recombinante pMON50203.

Descripción detallada de la invención

Los métodos de la presente invención usan métodos y materiales relacionados para transformar por vía genética microorganismos del orden Thraustochytriales. Todas las cepas de microorganismos unicelulares que se desvelan en el presente documento para uso como un transformante de las construcciones recombinantes de la presente invención, que generalmente también se pueden denominar Traustoquítridos, son miembros del orden Thraustochytriales. De acuerdo con la presente invención, las expresiones "Traustoquítrido", "microorganismo de Thraustochytriales" y "microorganismo del orden Thraustochytriales" se pueden usar indistintamente. Los presentes inventores no son conscientes de ningún informe anterior que describa un sistema de transformación para Schizochytrium o cualquier otro microorganismo de Thraustochytriales. Los sistemas de transformación que se describen en el presente documento se pueden usar para introducir genes extraños en microorganismos del orden Thraustochytriales, proporcionando de ese modo un medio para crear cepas con un aumento del valor comercial. Además, la presente descripción permite la mutación o inactivación de genes específicos mediante recombinación homóloga o no homóloga, proporcionando un nuevo modo para alterar el metabolismo celular y para identificar las funciones de genes específicos en microorganismos de Thraustochytriales.

De forma más específica, los presentes inventores han demostrado la transformación genética de un microorganismo de Thraustochytriales del género, Schizochytrium (Orden: Thraustochytriales; Familia; Thraustochytriaceae; Género: Schizochytrium), mediante el uso de dos tipos de vectores de transformación. Estos vectores se pueden introducir en células mediante métodos convencionales, seguido por identificación y aislamiento

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de células recombinantes basándose en su capacidad para crecer en presencia de compuestos selectivos. Los presentes inventores han demostrado la eficacia de estos vectores introduciéndolos mediante bombardeo de partículas, pero también se pueden usar otros medios para introducir los vectores (por ejemplo, electroporación) y se conocen en la técnica.

Para un vector de transformación, ejemplificado en el presente documento mediante el vector recombinante denominado pTUBZEO11-2, se creó un gen quimérico en el que el gen ble (que codifica para una "proteína de unión a bleomicina") de Streptoalloteichus hindustanus se colocó en el sentido cadena abajo de un promotor de un gen de tubulina de Schizochytrium. Un terminador de SV40 Se colocó en el sentido cadena abajo del gen ble en esta construcción. Este vector permite la expresión del gen ble en Schizochytrium, confiriendo de ese modo resistencia a Zeocin™ y compuestos relacionados, que son tóxicos para células de tipo silvestre cuando se incluyen en el medio de crecimiento a niveles apropiados. La fuente del gen ble y el terminador de SV40 en esta construcción era un vector disponible en el mercado, denominado pSV40/Zeo, que se adquirió en Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA) (Manual Técnico 180202, versión B, "ZeoCassette Vectors"; Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA 92008). El promotor del gen de tubulina se aisló mediante la reacción en cadena de la polimerasa; uno de los cebadores usados para la reacción se basaba en los datos de secuencia obtenidos a través de un proyecto de secuenciación de ADNc de Schizochytrium de forma aleatoria. El mapa de pTUBZEO11-2 se muestra en la Fig. 2, y la secuencia de nucleótidos de pTUBZEO11-2 se representa mediante la SEQ ID NO: 9. La transformación de Schizochytrium con este vector se confirmó mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa y análisis de transferencia de tipo Southern para detectar la presencia de secuencias de vector integradas en el genoma de Schizochytrium.

Los investigadores anteriores han usado el gen ble como un marcador seleccionable para transformación genética de una Diversidad de organismos, incluyendo bacterias, microalgas distintas de Traustoquítridos, hongos, protozoos, plantas y células animales (Véase, por ejemplo, el documento de Patente de Estados Unidos N.° 6.027.900; Lumbreras et al., 1998, Plant J. 14: 441-447; Rohe et al., 1996, Curr. Genet. 29: 587-590; Messina et al., 1995, Gene 165: 213-217; Guerrero et al., 1992, Appl. Microbiol. Biotechnol. 36: 759-762; Perez et al., 1989, Plant Mol. Biol. 13: 365-373; Gatigno et al., 1990 Gene 91: 35-41). El gen ble codifica una "proteína de unión a bleomicina" que confiere resistencia a varios antibióticos, incluyendo bleomicina, fleomicina y Zeocin™ (Drocourt et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 4009). Este gen está disponible en el mercado en Invitrogen Corporation, que era la fuente del gen que los presentes inventores utilizaron usaron para crear el vector de transformación de Schizochytrium, pTUBZBO11-2. Sin embargo, se cree que los presentes inventores son los primeros en producir un vector de transformación en el que el gen ble está unido a un promotor de Traustoquítridos de una manera que permite la expresión del gen en Traustoquítridos.

Un segundo conjunto de vectores de transformación se creó mediante mutagénesis dirigida al sitio in vitro de un gen de acetolactato sintasa (als) que los presentes inventores aislaron a partir de una biblioteca genómica de Schizochytrium. Estas mutaciones cambian la secuencia de aminoácidos de la enzima codificada (ALS) de tal modo que es mucho menos sensible a sulfometurón metilo y otros compuestos de sulfonilurea, así como inhibidores de la clase de imidazolinona y oxibenzoatos de pirimidinilo, a los que los microorganismos del orden Thraustochytriales son sensibles. Los compuestos de sulfonilurea tales como sulfometurón metilo (SMM) a menudo tóxicos son para las células porque son capaces de unirse a e inactivar la enzima acetolactato sintasa (ALS) de una diversidad de organismos. La ALS cataliza la primera etapa de la biosíntesis de los aminoácidos valina, leucina e isoleucina. Se ha mostrado que las imidazolinonas, triazolopirimidinas y otros compuestos se unen a e inactivan la ALS de ciertos organismos. Las formas mutantes de genes que codifican la acetolactato sintasa (también conocida como ácido acetohidroxi sintasa) de otros organismos se han usado previamente como marcadores seleccionables para la transformación de levaduras y plantas (Annu. Rev. Plant Physiol Plant Mol. Biol. 40: 441-470, 1989). Sin embargo, no existen informes anteriores a la presente invención que describan la secuencia o las propiedades del gen als de de Schizochytrium o cualquier otro miembro de Thraustochytriales, o el uso de genes als de Thraustochytriales mutantes que confieran resistencia a compuestos de sulfonilurea imidazolinona u oxibenzoato de pirimidinilo. De hecho, según el conocimiento de los presentes inventores, no se ha publicado ningún informe con respecto a la sensibilidad de microorganismos de Thraustochytriales a estos agentes selectivos, incluyendo sulfometurón metilo y, por tanto, antes de la presente invención no se sabía si un marcador seleccionable de este tipo podría ser incluso viable para uso en un sistema de transformación de Traustoquítridos. Se debe observar que en diversos organismos se producen genes con una homología sustancial con respecto a genes als conocidos, pero no codifican Enzimas que sean capaces de catalizar la síntesis de acetolactato (Biochimica et Biophysica Acta 1385: 401-419, 1998). Por lo tanto, no podría haber sido evidente que un homólogo de als clonado de hecho codifique ALS. Con el fin de determinar definitivamente si el gen de Schizochytrium clonado era un gen als verdadero, los presentes inventores demostraron, a través de experimentos de transformación, una correlación positiva de la resistencia a sulfometurón metil con la expresión del gen als de Schizochytrium supuesto mutado.

Los presentes inventores han producido tres vectores de transformación diferentes que contienen genes de als mutantes: un gen als mutante codifica una enzima con una valina en la posición 595 en lugar de un triptófano (plásmido pMON50201, o ALSmut1-7), otro codifica una glutamina en la posición 192 en lugar de a prolina (plásmido pMON50202, o ALSmut2-2), y una tercera forma contiene ambas de estas mutaciones (plásmido pMON50203, o ALSmut3-5). En estos vectores, la expresión de los genes als mutantes está bajo el control del promotor y el

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terminador del gen als nativo. Los mapas de estos vectores, junto con un vector que contiene el gen als de Schizochytrium de tipo silvestre (plásmido pMON50200, o AE-5), se muestran en las Figs 3A-3D. La transformación de Schizochytrium con estos vectores que codifican ALS mutante se confirmó mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa y análisis de transferencia de tipo Southern para detectar la presencia de secuencias de vector integradas en el genoma de Schizochytrium. Tal como se describe en detalle a continuación, ahora que los presentes inventores han identificado la secuencia completa del gen als, también se pueden hacer otras mutaciones, que se especifican a continuación. Por lo tanto, los genes als mutantes que se describen pretenden ser a modo de ejemplo, y no incluyen todas las posibles mutaciones.

Los sistemas de transformación de la presente invención se han usado para introducir genes extraños en células de Thraustochytriales por medio de cotransformación. En estos casos, los genes extraños se colocaron entre diversos promotores de Schizochytrium y un terminador apropiados (por ejemplo, SV40 o una región terminadora genética de Schizochytrium). Por ejemplo, los presentes inventores han producido e introducido un gen sintético que codifica una ácido graso w-3 desaturasa del nemátodo Caenorhabditis elegans, representado en el presente documento por la SEQ ID NO: 29, para aumentar los niveles de ácido docosahexaenoico en Schizochytrium. La SEQ ID NO: 30 representa la secuencia de aminoácidos de la desaturasa codificada por la SEQ ID NO: 29. En células de Thraustochytriales también se pueden introducir casetes de expresión que contienen genes extraños mediante inclusión directa dentro del vector de transformación que contiene el marcador seleccionable.

Además, los presentes inventores también han demostrado con los vectores que codifican ALS mutante que se produce recombinación homóloga en Schizochytrium, lo que indica la viabilidad del uso de medios recombinantes para inactivar o mutar genes de Schizochytrium nativos específicos.

Con respecto a las secuencias de promotor de Thraustochytriales que se describen en el presente documento, una búsqueda en base de datos de secuencias (GenBank) para todas las secuencias de nucleótidos y proteínas informadas para miembros del orden Thraustochytriales indica que, en el momento de la presente invención, no se Había informado de ninguna secuencia promotora de Schizochytrium o cualquier otro miembro de Thraustochytriales. El único gen que se ha informado de cualquier especie de Schizochytrium es para el ARN ribosómico 5S de S. aggregatum (números de registro en GenBank X06104 y M13616). Se han informado secuencias de ARN ribosómico 5S y 18S para los miembros de Thraustochytriales, especie Ulkenia, y géneros Labyrinthuloides y Thraustochytrium, pero esto no presenta relación con la presente invención. Se ha descrito una región codificante parcial de un gen de "ARN polimerasa de tipo T3/T7 supuesta" de Thraustochytrium aureum (Nucleic Acids Research 15: 648-654, 1996), pero no se informó de una secuencia promotora para este gen.

Los métodos de la presente invención se pueden usar para introducir cualquier gen u otras secuencias de nucleótidos que son de interés en un microorganismo del orden Thraustochytriales. Tales secuencias de nucleótidos incluyen, pero no se limitan a, ácidos nucleicos que codifican proteínas (por ejemplo, enzimas) asociadas con la síntesis de ácidos grasos (por ejemplo, los ácidos grasos: ácido docosahexaenoico (DHA), ácido docosapetaenoico (DPA), ácido eicosapentaenoico (EPA) y ácido araquidónico (ARA)). Tales proteínas comprenden, pero no se limitan a,: ácido graso sintasas, ácido graso desaturasas y ácido graso elongasas, así como proteínas asociadas con un complejo de policétido sintasa y/o proteínas asociadas con la incorporación de tales ácidos grasos en fosfolípidos o en moléculas de triacilglicerol. Por ejemplo, la invención se ha usado para introducir genes que codifican diversas ácido graso w-3 desaturasas en Schizochytrium en un intento para aumentar el nivel de ácido docosahexaenoico (DHA) en las células a través de desaturación de w-3 de ácido docosapentaenoico (DPA). Como otro ejemplo, también se ha demostrado la expresión de una ácido graso polienoico isomerasa supuesta del alga roja, Ptilota, en Schizochytrium. Los genes que codifican un complejo de policétido sintasa de Schizochytrium (es decir, un sistema de policétido sintasa) se han depositado como Números de Registro en GenBank, AF378329 (ORFA), AF378328 (ORFB) y AF378329 (ORFC).

Los métodos de la presente invención también son útiles para introducir, en microorganismos de Thraustochytriales, genes y otras secuencias de nucleótidos que codifican proteínas asociadas con la ruta biosintética de isoprenoides. Tales proteínas comprenden, pero no se limitan a, HMG-CoA sintasa y HMG-CoA reductasa. Otras proteínas adecuadas incluyen proteínas asociadas con la síntesis de moléculas derivadas de subunidades de isoprenoides que incluyen, pero no se limitan a, diversos compuestos esteroides y diversos compuestos carotenoides. Las proteínas asociadas con la síntesis de diversos compuestos carotenoides incluyen, pero no se limitan a, escualeno sintasa, fitoeno sintasa, fitoeno desaturasa y diversas carotenoide ciclasas, hidroxilasas y cetolasas.

Los métodos de la presente invención también son útiles para introducir, en Thraustochytriales, una o más secuencias de ácidos nucleicos que codifican proteínas asociadas con la síntesis de compuestos antioxidantes que incluyen, pero no se limitan a, vitamina E y ácido lipoico.

Además, los métodos de la presente invención se pueden usar para introducir cualquier gen u otros vectores de secuencias de nucleótidos en microorganismos de Thraustochytriales con el fin de inactivar o producir deleción de genes (es decir, "desactivación" o " alteración genética dirigida"). La inactivación o deleción de genes se usa generalmente con el fin de potenciar el valor comercial del microorganismo. Por ejemplo, puede ser deseable eliminar genes que codifican enzimas (o ácidos nucleicos que regulan la expresión de tales genes) de las rutas de

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síntesis de ácidos grasos saturados y poliinsaturados. Por ejemplo, puede ser deseable inhibir o desactivar genes que codifican proteínas que están implicadas en la degradación de otros compuestos valiosos producidos por el microorganismo de Thraustochytriales o que de otra manera disminuyen el valor del compuesto deseado. Por ejemplo, los genes que codifican lipasas, enzimas de oxidación de ácidos grasos y proteínas que presentan olores o sabores desagradables pueden ser dianas de desactivación deseables. Además, puede ser deseable desactivar genes que codifican proteínas que están asociadas con la síntesis de compuestos cuya síntesis está en competición con otras moléculas de interés. Por ejemplo, tales genes incluyen, pero no se limitan a, genes que codifican proteínas implicadas en la biosíntesis de hidratos de carbono, genes que codifican proteínas implicadas en la síntesis de diversos productos de rutas de isoprenoides (por ejemplo, esteroles o compuestos carotenoides específicos), y genes que codifican proteínas implicadas en la síntesis de componentes de la pared celular. A modo de ejemplo, se han introducido genes en células de Schizochytrium mediante el uso de la presente invención en un intento de inactivar genes que son homólogos a los genes de la policétido sintasa de Shewanella con el fin de evaluar su papel en la producción de ácidos grasos altamente insaturados (HUFA). Tal como se muestra a modo de ejemplo con el Ejemplo 6, la presente descripción también se pueden usar para inactivar, producir deleción o mutar genes nativos que están implicados en la producción de ácidos grasos, carotenoides, esteroles, vitaminas u otros compuestos con el fin de mejorar la rentabilidad o aceptabilidad de productos que están relacionados con estos compuestos. Se indica que en algunas realizaciones, tal como se ha discutido anteriormente, puede ser deseable potenciar la producción de una proteína dada, mientras que en otras formas de realización, puede ser deseable a aumentar la producción de una proteína dada.

Los métodos que se describen en el presente documento también son útiles para determinar el proceso de recombinación genética en Schizochytrium.

Otros genes y moléculas de ácido nucleico útiles para su introducción en Thraustochytriales resultarán evidentes para los expertos en la materia.

A continuación se describen diversas realizaciones de los métodos de la presente invención inicialmente con respecto a un gen als y/o proteína ALS de Thraustochytriales. Sin embargo, se debe entender que las definiciones generales de términos y métodos se pretenden aplicar a la discusión de otros genes, ácidos nucleicos y proteínas que se describen a continuación.

Los métodos de la presente invención se basan en parte en la identificación, aislamiento y producción de secuencias de ácidos nucleicos que codifican marcadores seleccionables que son adecuados para uso en construcciones recombinantes para la transformación de microorganismos Traustoquítridos. Los marcadores seleccionables de ese tipo permiten la selección de microorganismos que se han transformado de forma satisfactoria con las construcciones recombinantes que se describen en el presente documento. Un marcador seleccionable útil para la transformación de Thraustochytriales adecuado para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención es una acetolactato sintasa de Thraustochytriales (es decir, ALS). Preferentemente, la acetolactato sintasa se ha modificado, mutado o seleccionado de otro modo, para que sea resistente a la inhibición por compuestos de sulfonilurea, inhibidores de la clase de imidazolinona y/u oxibenzoatos de pirimidinilo (es decir, una ALS de ese tipo es un homólogo de una acetolactato sintasa que se produce de manera natural).

Una acetolactato sintasa adecuada para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención es una proteína que presenta actividad biológica de acetolactato sintasa, incluyendo proteínas de longitud completa, proteínas de fusión, o cualquier homólogo de una acetolactato sintasa que se produce de manera natural. Un homólogo de una acetolactato sintasa incluye proteínas que difieren de una acetolactato sintasa que se produce de manera natural porque al menos uno o unos pocos, pero sin limitarse a uno o unos pocos, aminoácidos han sufrido deleción (por ejemplo, una versión truncada de la proteína, tal como un péptido o fragmento), insertado, invertido, sustituido y/o derivatizado (por ejemplo, mediante glicosilación, fosforilación, acetilación, miristoilación, prenilación, palmitación, amidación y/o adición de glicosilfosfatidil inositol). A continuación se describen con detalle los homólogos preferentes de una acetolactato sintasa que se produce de manera natural.

Una proteína aislada, tal como una acetolactato sintasa aislada, de acuerdo con los métodos de la presente invención, es una proteína que se ha retirado de su medio natural (es decir, que se ha sometido a manipulación humana) y puede incluir proteínas purificadas, proteínas parcialmente purificadas, proteínas producidas de manera recombinante y proteínas producidas de manera sintética, por ejemplo. Como tal, "aislado" no refleja el grado hasta el que la proteína se ha purificado. Una "acetolactato sintasa de Thraustochytriales" se refiere a una acetolactato sintasa (incluyendo un homólogo de una acetolactato sintasa que se produce de manera natural) de un microorganismo de Thraustochytriales o que se ha producido de otra manera a partir del conocimiento de la estructura (por ejemplo, secuencia) de una acetolactato sintasa que se produce de manera natural de un microorganismo de Thraustochytriales. En otras palabras, una acetolactato sintasa de Thraustochytriales incluye cualquier acetolactato sintasa que tiene la estructura y la función de una acetolactato sintasa que se produce de manera natural a partir de un microorganismo de Thraustochytriales o que es un homólogo biológicamente activo (es decir, presenta actividad biológica) de una acetolactato sintasa que se produce de manera natural a partir de un microorganismo de Thraustochytriales tal como se describe en detalle en el presente documento. Como tal, una

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acetolactato sintasa de Thraustochytriales puede incluir proteínas purificadas, parcialmente purificadas, recombinantes, mutadas/modificadas y sintéticas.

En general, la actividad biológica o acción biológica de una proteína se refiere a cualquier función o funciones presentadas o realizadas por la proteína que se atribuye a la forma que se produce que se produce de manera

natural de la proteína tal como se mide u observa in vivo (es decir, en el entorno fisiológico natural de la proteína) o

in vitro (es decir, en condiciones de laboratorio). Por ejemplo, una actividad biológica de una acetolactato sintasa incluye actividad enzimática de acetolactato sintasa. Las modificaciones de una proteína, tal como en un homólogo o mimético (que se discute a continuación), pueden dar como resultado proteínas que presentan la misma actividad biológica que la proteína que se produce de manera natural, o en proteínas que presentan un aumento o disminución de la actividad biológica en comparación con la proteína que se produce de manera natural. Las modificaciones que dan como resultado una disminución en la expresión de la proteína o una disminución en la actividad de la proteína se pueden denominar inactivación (completa o parcial), regulación por disminución o disminución de la acción de una proteína. De forma análoga, las modificaciones que dan como resultado un

aumento en la expresión de la proteína o un aumento en la actividad de la proteína se pueden denominar

amplificación, sobreproducción, activación, potenciación, regulación por incremento o aumento de la acción de una proteína.

Con respecto a la acetolactato sintasa adecuada para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención, es preferente que las modificaciones presentes en homólogos de acetolactato sintasa, en comparación con una acetolactato sintasa que se produce de manera natural, no cambien sustancialmente, o al menos no disminuyan sustancialmente, la actividad biológica básica de la sintasa en comparación con la proteína que se produce de manera natural. Sin embargo, tales homólogos pueden presentar diferencias en características distintas de la actividad funcional o enzimática de la proteína en comparación con la forma que se produce de manera natural, tal como una disminución de la sensibilidad a la inhibición mediante ciertos compuestos en comparación con la proteína que se produce de manera natural. Preferentemente, un homólogo de una acetolactato sintasa que se produce de manera natural presenta reducción de la sensibilidad (es decir, disminuida, reducida) con respecto a compuestos que se unen a e inactivan acetolactato sintasas que se produce de manera natural en comparación con la acetolactato sintasa que se produce de manera natural a partir de la que se obtuvo el homólogo. Por ejemplo, los compuestos de sulfonilurea, tales como sulfometurón metilo (SMM), a menudo son tóxicos para las células porque se pueden unir a e inactivar la acetolactato sintasa (ALS). También se ha mostrado que las imidazolinonas, triazolopirimidinas y otros compuestos similares (denominados generalmente inhibidores de la clase de imidazolinona en el presente documento) se unen a e inactivan ALS. Por tanto, un homólogo de una acetolactato sintasa que se produce de manera natural presenta preferentemente una reducción de la sensibilidad a compuestos de sulfonilurea, así como a inhibidores de la clase de imidazolinona (por ejemplo, al presentar sitios de unión alterados para tales inhibidores o sitios de unión con afinidad reducida por el inhibidor) y a oxibenzoatos de pirimidinilo, mientras que mantiene la actividad enzimática de acetolactato sintasa.

Como se usa en el presente documento, una proteína que presenta "actividad biológica de acetolactato sintasa" o que se denomina "acetolactato sintasa" se refiere a una proteína que cataliza la primera etapa en la biosíntesis de los aminoácidos valina, leucina e isoleucina. De forma más específica, una acetolactato sintasa aislada adecuada para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención, incluyendo proteínas de longitud completa, proteínas truncadas, proteínas de fusión y homólogos, se puede identificar de una manera clara mediante la capacidad de las proteínas para catalizar la síntesis de acetolactato a partir de piruvato. La actividad biológica de la acetolactato sintasa se puede evaluar por alguien con experiencia en la materia mediante cualquier ensayo in vitro o in vivo adecuado para actividad enzimática.

En una realización, una acetolactato sintasa adecuada para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos aproximadamente un 65 % con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, sobre al menos aproximadamente 600 aminoácidos de cualquiera de tales secuencias, en la que la proteína es una acetolactato sintasa (es decir, tiene actividad biológica de acetolactato sintasa). Más

preferentemente, una acetolactato sintasa adecuada para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos aproximadamente un 70 %, y más

preferentemente, idéntica en al menos aproximadamente un 75 %, e incluso más preferentemente idéntica en al menos aproximadamente un 80 %, e incluso más preferentemente idéntica en al menos aproximadamente un 85 %, e incluso más preferentemente idéntica en al menos aproximadamente un 90 % e incluso más preferentemente idéntica en al menos aproximadamente un 95 %, e incluso más preferentemente idéntica en al menos aproximadamente un 96 %, e incluso más preferentemente idéntica en al menos aproximadamente un 97 %, e incluso más preferentemente idéntica en al menos aproximadamente un 98 %, e incluso más preferentemente idéntica en al menos aproximadamente un 99 % a cualquiera de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO: 24, sobre al menos aproximadamente 600 aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO: 24, en la que la proteína tiene actividad biológica de acetolactato sintasa.

En otra realización, una acetolactato sintasa adecuada para uso de acuerdo con los métodos de la presente

invención tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos aproximadamente un 75 % con respecto

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a una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, sobre al menos 95 aminoácidos de cualquiera de tales secuencias, en la que la proteína es una acetolactato sintasa (es decir, tiene actividad biológica de acetolactato sintasa). Más preferentemente, una acetolactato sintasa adecuada para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos aproximadamente un 80 %, e incluso más preferentemente idéntica en al menos aproximadamente un 85 %, e incluso más preferentemente idéntica en al menos aproximadamente un 90 % e incluso más preferentemente idéntica en al menos aproximadamente un 95 %, e incluso más preferentemente idéntica en al menos aproximadamente un 96 %, e incluso más preferentemente idéntica en al menos aproximadamente un 97 %, e incluso más preferentemente idéntica en al menos aproximadamente un 98 %, e incluso más preferentemente idéntica en al menos aproximadamente un 99 % a cualquiera de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, sobre al menos 95 aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, en la que la proteína tiene actividad biológica de acetolactato sintasa. Incluso más preferentemente, una acetolactato sintasa adecuada para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención tiene una secuencia de aminoácidos que tiene cualquiera de los porcentajes de identidad que se han mencionado anteriormente con respecto a cualquiera de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 sobre al menos 100 aminoácidos, y más preferentemente 125, y más preferentemente 150, y más preferentemente 175, y más preferentemente 200, y más preferentemente 225, y más preferentemente 250, y más

preferentemente 275, y más preferentemente 300, y más preferentemente 325, y más preferentemente 350, y más

preferentemente 375, y más preferentemente 400, y más preferentemente 425, y más preferentemente 450, y más

preferentemente 475, y más preferentemente 500, y más preferentemente 525, y más preferentemente 550, y más

preferentemente 575 aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22, sEq ID NO: 24, en la que la proteína tiene actividad biológica de acetolactato sintasa.

Como se usa en el presente documento, a menos que se indique de otro modo, la referencia a un porcentaje (%) de identidad se refiere a una evaluación de homología que se realiza usando: (1) una búsqueda de homología BLAST 2.0 Basic BLAST usando blastp para búsquedas de aminoácido y blastn para búsquedas de aminoácido con parámetros por defecto convencionales, en el que la secuencia de consulta se filtra para regiones de baja complejidad por defecto (se describe en Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. Y Lipman, D.J. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs". Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402; (2) un alineamiento BLAST 2 (usando los parámetros que se describen a continuación); (3) y/o PSI-BLAST con los parámetros por defecto convencionales (BLAST Iterado Específico de Posición). Se indica que debido a algunas diferencias en los parámetros convencionales entre BLAST 2.0 Basic BLAST y BLAST 2, se podría reconocer que dos secuencias específicas presentan homología significativa usando el programa BLAST 2, mientras que una búsqueda realizada en BLAST 2.0 Basic BLAST usando una de las secuencias como secuencia de consulta puede no identificar la segunda secuencia en las coincidencias máximas. Además, PSI-BLAST proporciona una versión automatizada, fácil de usar de una búsqueda de "perfil", que es un modo sensible para buscar homólogos de secuencia. El primer programa realiza una búsqueda en la base de datos BLAST con huecos. El programa PSI-BLAST usa la información a partir de cualquier alineamiento significativo devuelto para construir una matriz de puntuación específica de posición, que reemplaza a la secuencia de consulta para la siguiente ronda de búsqueda en la base de datos. Por lo tanto, se debe entender que el porcentaje de identidad se puede determinar usando uno cualquiera de estos programas.

Dos secuencias específicas se pueden alinear entre sí utilizando un alineamiento de secuencias BLAST 2 tal como se describe en Tatusova y Madden, (1999), "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174: 247-250. El alineamiento de secuencias BLAST 2 se realiza en blastp o blastn usando el algoritmo de BLAST 2.0 para realizar una búsqueda de BLAST con huecos (BLAST 2.0) entre las dos secuencias que permite la introducción de huecos (deleciones e inserciones) en El alineamiento resultante. Para fines de claridad en el presente documento, el alineamiento de secuencias con BLAST 2 se realiza usando los parámetros por defecto convencionales tal como sigue a continuación.

Para blastn, usando una matriz 0 de BLOSUM62:

Recompensa para coincidencia = 1

Penalización por falta de coincidencia = -2

Penalizaciones por apertura de huecos (5) y extensión de huecos (2)

Caída de alineamiento de hueco (gap x_dropoff) (50) esperado (10) tamaño de palabra (11) filtro (activado)

Para blastp, usando matriz 0 de BLOSUM62:

Penalizaciones por apertura de huecos (11) y extensión de huecos (1)

Caída de alineamiento de hueco (gap x_dropoff) (50) esperado (10) tamaño de palabra (3) filtro (activado).

Una acetolactato sintasa adecuada para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención también puede incluir proteína que tenga una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 30 restos de aminoácido contiguos de cualquiera de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO: 24, (es decir, 30 restos de aminoácido contiguos que tienen una identidad de un 100 % con 30 aminoácidos contiguos de cualquiera de

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SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO: 24). En una realización preferente, una acetolactato sintasa adecuada para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención incluye proteínas que tienen secuencias de aminoácidos que comprenden al menos 50, y más preferentemente al menos 75, y más preferentemente al menos 100, y más preferentemente al menos 115, y más preferentemente al menos 130, y más preferentemente al menos 150, y más preferentemente al menos 200, y más preferentemente, al menos 250, y más preferentemente, al menos 300, y más preferentemente, al menos 350, y más preferentemente, al menos 400, y más preferentemente, al menos 450, y más preferentemente, al menos 500, y más preferentemente, al menos 550, y más preferentemente, al menos 600, y más preferentemente, al menos 650, restos de aminoácidos contiguos de cualquiera de SEQ ID NO: 15, SeQ ID nO: 19, SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO: 24. Una proteína de ese tipo tiene actividad biológica de acetolactato sintasa.

Como se usa en el presente documento, el término "contiguo" o "consecutivo", con respecto a las secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos que se describen en el presente documento, se refiere a que están conectados en una secuencia ininterrumpida. Por ejemplo, para una primera secuencia, comprender 30 aminoácidos contiguos (o consecutivos) de una segunda secuencia, se refiere a que la primera secuencia incluye una secuencia ininterrumpida de 30 restos de aminoácido que es idéntica en un 100 % con respecto a una secuencia ininterrumpida de 30 restos de aminoácido en la segunda secuencia. De forma análoga, que una primera secuencia presente una "identidad de un 100 %" con una segunda secuencia se refiere a que la primera secuencia coincide exactamente con la segunda secuencia sin huecos entre nucleótidos o aminoácidos.

En otra realización, una acetolactato sintasa adecuada para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención, incluyendo un homólogo de acetolactato sintasa, incluye una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que es lo suficientemente similar con respecto a una secuencia de aminoácidos de acetolactato sintasa que se produce de manera natural que una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el homólogo es capaz hibridarse en condiciones de rigurosidad moderada, elevada, o muy elevada (que se describen a continuación) a (es decir, con) una molécula de ácido nucleico que codifica la acetolactato sintasa que se produce de manera natural (es decir, al complemento de la hebra de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la acetolactato sintasa que se produce de manera natural). Preferentemente, una acetolactato sintasa adecuada para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención está codificada por una secuencia de aminoácidos que se hibrida en condiciones de rigurosidad moderada, elevada o muy elevada al complemento de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SeQ ID NO: 22 o SeQ ID NO: 24. Incluso más preferentemente, una acetolactato sintasa adecuada para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención está codificada por una secuencia de ácidos nucleicos que se hibrida en condiciones de rigurosidad moderada, elevada o muy elevada al complemento de los nucleótidos 1260-3314 de la SEQ ID NO: 15, nucleótidos 1260-3314 de la SEQ ID NO: 18, nucleótidos 12603314 de la SEQ ID NO: 21, o nucleótidos 1260-3314 de la SEQ ID NO: 23. Las condiciones de hibridación de ese tipo se describen con detalle a continuación. Un complemento de secuencia de ácidos nucleicos de secuencia de ácidos nucleicos que codifica una acetolactato sintasa adecuada para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención se refiere a la secuencia de ácidos nucleicos de la hebra de ácido nucleico que es complementaria a la hebra que codifica la acetolactato sintasa. Se observará que un ADN bicatenario que codifica una secuencia de aminoácidos dada comprende un ADN monocatenario y su hebra complementaria que tiene una secuencia que es un complemento al ADN monocatenario. Como tal, las moléculas de ácido nucleico adecuadas para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención pueden ser bicatenarias o monocatenarias, e incluyen las moléculas de ácido nucleico que forman híbridos estables en condiciones de hibridación rigurosas con una secuencia de ácidos nucleicos que codifican las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO: 24, y/o con el complemento de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica cualquiera de tales secuencias de aminoácidos. Los expertos en la materia conocen métodos para deducir una secuencia complementaria. Se debería indicar que dado que las tecnologías de secuenciación de aminoácidos y de secuenciación de ácidos nucleicos no están completamente libres de errores, las secuencias que se presentan en el presente documento, en el mejor de los casos, representan secuencias evidentes de una acetolactato sintasa adecuada para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención.

Los homólogos de acetolactato sintasa pueden ser el resultado de variación alélica natural o mutación natural. También se pueden producir homólogos de acetolactato sintasa adecuados para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención usando técnicas conocidas en la materia que incluyen, pero no se limitan a, modificaciones directas en la proteína o modificaciones en el gen que codifica para la proteína usando, por ejemplo, técnicas de ADN clásicas o recombinantes para efectuar mutagénesis aleatoria o dirigida. Una variante alélica que se produce de manera natural de un ácido nucleico que codifica una acetolactato sintasa es un gen que se encuentra esencialmente en el mismo o los mismos locus en el genoma que el gen que codifica una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, pero que, debido a variaciones naturales causadas por, por ejemplo, mutación o recombinación, presenta una secuencia similar pero no idéntica. Las variantes alélicas naturales generalmente codifican proteínas que presentan actividad similar a la de la proteína codificada por el gen con el que se están comparando. Una clase de variantes alélicas puede codificar la misma proteína pero puede presentar diferentes secuencias de ácido nucleico debido a la degeneración del código genético. Las variantes alélicas también pueden comprender alteraciones en las regiones no traducidas en las posiciones 5' o 3' del gen (por ejemplo, en regiones de control reguladoras). Los expertos en la materia conocen bien las variantes alélicas.

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Las proteínas de acetolactato sintasa adecuadas para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención también incluyen productos de expresión de fusiones genéticas (por ejemplo, usadas para sobreexpresar formas activas, solubles de la proteína recombinante), de genes sometidos a mutagénesis (tales como genes que presentan modificaciones de codones para potenciar la transcripción y traducción genéticas), y de genes truncados (tales como genes que presentan dominios de unión a membrana eliminados para generar formas solubles de una proteína de membrana, o genes que presentan secuencias señal eliminadas que se toleran escasamente en un hospedador recombinante en particular).

El tamaño mínimo de una proteína acetolactato sintasa y/u homólogo adecuado para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención es un tamaño suficiente para tener actividad biológica de acetolactato sintasa. Preferentemente, una proteína acetolactato sintasa adecuada para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención tiene una longitud de al menos al menos 30 aminoácidos, y más preferentemente, una longitud de al menos aproximadamente 50, y más preferentemente al menos 75, y más preferentemente al menos 100, y más preferentemente al menos 115, y más preferentemente al menos 130, y más preferentemente al menos 150, y más preferentemente al menos 200, y más preferentemente, al menos 250, y más preferentemente, al menos 300, y más preferentemente, al menos 350, y más preferentemente, al menos 400, y más preferentemente, al menos 450, y más preferentemente, al menos 500, y más preferentemente, al menos 550, y más preferentemente, al menos 600, y más preferentemente, al menos 650, y más preferentemente, al menos 684 aminoácidos. No existe ningún límite, distinto de un límite práctico, con respecto al tamaño máximo de una proteína de ese tipo porque la proteína puede incluir una parte de una proteína de acetolactato sintasa o una acetolactato sintasa de longitud completa, además de una secuencia adicional (por ejemplo, una secuencia de proteína de fusión), si se desea.

En el presente documento se describe una proteína de fusión que incluye un dominio que contiene acetolactato sintasa (es decir, una secuencia de aminoácidos para una acetolactato sintasa adecuada para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención) unida a uno o más segmentos de fusión. Los segmentos de fusión adecuados para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención incluyen, pero no se limitan, segmentos que pueden: potenciar la estabilidad de una proteína; proporcionar otra actividad biológica deseable; y/o ayudar con la purificación de una acetolactato sintasa (por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad). Un segmento de fusión adecuado puede ser un dominio de cualquier tamaño que presente la función deseada (por ejemplo, confiere un aumento de estabilidad, solubilidad, acción o actividad biológica; y/o simplifica la purificación de una proteína). Los segmentos de fusión se pueden unir a extremos amino y/o carboxilo terminales del dominio que contiene acetolactato sintasa de la proteína y pueden ser susceptibles de escisión con el fin de permitir la recuperación sencilla de una acetolactato sintasa. Las proteínas de fusión se producen preferentemente cultivando una célula recombinante transfectada con una molécula de ácido nucleico de fusión que codifica una proteína que incluye el segmento de fusión unido al extremo o bien carboxilo y/o bien amino terminales de un domino que contiene acetolactato sintasa.

Un mimético de una acetolactato sintasa también es adecuado para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención. Como se usa en el presente documento el término "mimético" se usa para hacer referencia a cualquier compuesto peptídico o no peptídico que es capaz de imitar la acción biológica de un péptido que se produce de manera natural, a menudo porque el mimético presenta una estructura básica que imita la estructura básica del péptido que se produce de manera natural y/o presenta las propiedades biológicas destacadas del péptido que se produce de manera natural. Los miméticos pueden incluir, pero no se limitan a: péptidos que presentan modificaciones sustanciales con respecto al prototipo de manera que no presentan similitud de cadenas laterales con el péptido que se produce de manera natural (tales modificaciones, por ejemplo, pueden disminuir su susceptibilidad a la degradación); anticuerpos anti-idiotípicos y/o catalíticos, o fragmentos de los mismos; partes no proteicas de una proteína aislada (por ejemplo, estructuras de hidratos de carbono); o moléculas orgánicas sintéticas o naturales, incluyendo ácidos nucleicos y fármacos identificados a través de química combinatoria, por ejemplo.

Tales miméticos pueden se diseñar, seleccionar y/o identificar de otro modo usando una diversidad de métodos conocidos en la técnica. Diversos métodos de diseño de fármacos, útiles para diseñar miméticos u otros compuestos terapéuticos útiles en los métodos de la presente invención se desvelan en Maulik et al., 1997, Molecular Biotechnology: Therapeutic Un mimético de acetolactato sintasa se puede obtener, por ejemplo, a partir de estrategias de diversidad molecular (una combinación de estrategias relacionadas que permiten la construcción rápida de bibliotecas de moléculas grandes, químicamente diversas), bibliotecas de compuestos naturales o sintéticos, en particular a partir de bibliotecas químicas o combinatorias (es decir, bibliotecas de compuestos que se diferencian en secuencia o tamaño pero que presentan elementos estructurales similares) o mediante diseño de fármacos racional, dirigido o aleatorio. Véase por ejemplo, Maulik et al., mencionado anteriormente.

En una estrategia de diversidad molecular, se sintetizan bibliotecas de compuestos grandes, por ejemplo, a partir de péptidos, oligonucleótidos, carbohidratos y/o moléculas orgánicas sintéticas, usando enfoques biológicos, enzimáticos y/o químicos. Los parámetros críticos en el desarrollo de una estrategia de diversidad molecular incluyen diversidad de subunidades, tamaño molecular y diversidad de bibliotecas. El objetivo general de la identificación sistemática de tales bibliotecas es usar la aplicación secuencial de la selección combinatoria para obtener ligandos de alta afinidad para una diana deseada, y a continuación optimizar las moléculas líder mediante

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estrategias de diseño aleatorias o bien dirigidas. En Maulik, et al., se describen métodos de diversidad molecular con detalle, igual que la referencia mencionada anteriormente.

Maulik et al., también desvelan, por ejemplo, métodos de diseño dirigido, en los que el usuario dirige el proceso de creación de nuevas moléculas a partir de una biblioteca de fragmentos de fragmentos seleccionados de forma apropiada; diseño aleatorio, en el que el usuario usa un algoritmo genético o de otro tipo para mutar de forma aleatoria fragmentos y sus combinaciones mientras que se aplica simultáneamente un criterio de selección para evaluar la idoneidad de los ligandos candidatos; y un enfoque basado en rejilla en el que el usuario calcula la energía de interacción entre estructuras de receptores tridimensionales y sondas de fragmentos pequeños, seguido por unión entre sí de sitios de sondas favorables.

Las acetolactato sintasas adecuadas para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención se pueden obtener a partir de cualquier microorganismo de Thraustochytriales, y en particular, a partir de cualquier microorganismo de Schizochytrium. En una realización, una acetolactato sintasa preferente adecuada para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo de la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24. La proteína que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 15 es una acetolactato sintasa que se produce de manera natural (es decir, de tipo silvestre) de un microorganismo de Thraustochytriales, y de forma específica, es una acetolactato sintasa de Schizochytrium. Las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 son secuencias que se han modificado, de manera que las enzimas resultantes presentan una reducción de la sensibilidad a compuestos de sulfonilurea, así como a inhibidores de la clase de imidazolinona y oxibenzoatos de pirimidinilo, en comparación con la proteína que se produce de manera natural representada por la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 15. Se indica que las proteínas representadas por las SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 24 tienen actividad biológica de acetolactato sintasa. Las acetolactato sintasas con reducción de la sensibilidad a compuestos de sulfonilurea, así como a inhibidores de la clase de imidazolinona y oxibenzoatos de pirimidinilo son acetolactato sintasas preferentes adecuadas para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención, porque las secuencias de ácidos nucleicos que codifican tales sintasas se pueden usar en vectores recombinantes adecuados para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención como marcadores seleccionables.

Por lo tanto, en una realización se presenta una acetolactato sintasa modificada adecuada para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención, incluyendo cualquier homólogo de cualquiera de las SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 24, en la que el homólogo tiene actividad biológica de acetolactato sintasa, y en particular, en la que el homólogo tiene una reducción de la sensibilidad a compuestos de sulfonilurea, así como a inhibidores de la clase de imidazolinona y oxibenzoatos de pirimidinilo, en comparación con la proteína que se produce de manera natural representada por la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 15. En un aspecto, tales homólogos de acetolactato sintasa incluyen proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos que difiere de la SEQ ID NO: 15 en una sustitución, inserción o deleción de aminoácido en una o más de las siguientes posiciones: 116G, 117A, 192P, 200A, 251K, 358M, 383D, 592V, 595W, o 599F. Estas posiciones corresponden a sitios de mutación de ALS conocidos en una acetolactato sintasa de levadura (es decir, 116G, 117A, 192P, 200A, 251K, 354M, 379D, 583V, 586W, y 590F, respectivamente) (Véase Mazur y Falco, 1989, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 40: 441-470, que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad). Los expertos en la materia conocerán otros posibles sitios de mutación basándose en mutaciones de aminoácidos satisfactorias en ALS de otros organismos. La aplicación de tales sitios a los sitios correspondientes en la ALS de Thraustochytriales puede producir una proteína adecuada para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención.

Como se ha analizado anteriormente, los métodos de la presente invención se basan en parte en el descubrimiento y producción de construcciones recombinantes para la transformación de microorganismos de Traustoquítridos. Por lo tanto, en una realización una molécula de ácido nucleico aislada adecuada para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una de acetolactato sintasa de Traustoquítridos, y secuencia de ácidos nucleicos totalmente complementaria a la misma. Una molécula de ácido nucleico adecuada para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención que codifica una acetolactato sintasa adecuada para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención incluye una molécula de ácido nucleico que codifica cualquiera de las proteínas de acetolactato sintasa, incluyendo homólogos, que sea discutido anteriormente. Más particularmente, en una realización una molécula de ácido nucleico aislada adecuada para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención comprende la secuencia de ácidos nucleicos decodifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos aproximadamente un 65 % con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, sobre al menos aproximadamente 600 aminoácidos de cualquiera de las secuencias de ese tipo; en las que la proteína es una acetolactato sintasa (es decir, tiene actividad biológica de acetolactato sintasa). Más preferentemente, una molécula de ácido nucleico aislada adecuada para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención tiene una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos aproximadamente un 70 %, y más preferentemente, idéntica en al menos aproximadamente un 75 %, e incluso más preferentemente idéntica en al menos aproximadamente un 80 %, e incluso más preferentemente idéntica en al menos aproximadamente un 85 %, e incluso más preferentemente idéntica en al menos aproximadamente un 90 % e incluso más preferentemente idéntica en al menos aproximadamente un 95 %,

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e incluso más preferentemente idéntica en al menos aproximadamente un 96 %, e incluso más preferentemente idéntica en al menos aproximadamente un 97 %, e incluso más preferentemente idéntica en al menos aproximadamente un 98 %, e incluso más preferentemente idéntica en al menos aproximadamente un 99 % a cualquiera de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO: 24, sobre al menos aproximadamente 600 aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO: 24, en la que la proteína tiene actividad biológica de acetolactato sintasa.

En otra realización, una molécula de ácido nucleico aislada adecuada para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención tiene una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos aproximadamente un 75 % con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo de SEQ ID nO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID nO: 22, SEQ ID NO: 24, sobre al menos 95 aminoácidos de cualquiera de tales secuencias, en la que la proteína es una acetolactato sintasa (es decir, tiene actividad biológica de acetolactato sintasa). Más preferentemente, una molécula de ácido nucleico aislada adecuada para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención tiene una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos aproximadamente un 80 %, e incluso más preferentemente idéntica en al menos aproximadamente un 85 %, e incluso más preferentemente idéntica en al menos aproximadamente un 90 % e incluso más preferentemente idéntica en al menos aproximadamente un 95 %, e incluso más preferentemente idéntica en al menos aproximadamente un 96 %, e incluso más preferentemente idéntica en al menos aproximadamente un 97 %, e incluso más preferentemente idéntica en al menos aproximadamente un 98 %, e incluso más preferentemente idéntica en al menos aproximadamente un 99 % a cualquiera de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO: 24, sobre al menos 95 aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO: 24, en la que la proteína tiene actividad biológica de acetolactato sintasa.

En otra realización más, una molécula de ácido nucleico aislada adecuada para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención tiene una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene cualquiera de los porcentajes de identidad que se han mencionado anteriormente con respecto a cualquiera de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO: 24 sobre al menos 100 aminoácidos, y más preferentemente 125, y más preferentemente 150, y más preferentemente 175, y más preferentemente 200, y más

preferentemente 225, y más preferentemente 250, y más preferentemente 275, y más preferentemente 300, y más

preferentemente 325, y más preferentemente 350, y más preferentemente 375, y más preferentemente 400, y más

preferentemente 425, y más preferentemente 450, y más preferentemente 475, y más preferentemente 500, y más

preferentemente 525, y más preferentemente 550, y más preferentemente 575 aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22 o SeQ ID NO: 24, en la que la proteína tiene actividad biológica de acetolactato sintasa. El porcentaje de identidad se determina usando parámetros por defecto de BLAST 2.0 Basic BLAST, como se ha descrito anteriormente.

En una realización, las moléculas de ácido nucleico adecuadas para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención que codifican una acetolactato sintasa adecuada para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención incluyen moléculas de ácido nucleico aisladas que se hibridan en condiciones de rigurosidad moderada, e incluso más preferentemente en condiciones de alta rigurosidad, e incluso más preferentemente en condiciones de rigurosidad muy elevada con el complemento de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una acetolactato sintasa que se produce de manera natural. Preferentemente, una molécula de ácido nucleico aislada adecuada para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención que codifica una acetolactato sintasa adecuada para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención comprende una secuencia de ácidos nucleicos que se hibrida en condiciones de rigurosidad moderada o elevada al complemento de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22 o SeQ ID NO: 24. En una realización, una molécula de ácido nucleico aislada adecuada para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención comprende una secuencia de ácidos nucleicos que se hibrida en condiciones de rigurosidad moderada, elevada o muy elevada al complemento de una secuencia de ácidos nucleicos representada por los nucleótidos 1260-3314 de la SEQ ID NO: 14, nucleótidos 1260-3314 de la SEQ ID NO: 18, nucleótidos 1260-3314 de la SEQ ID NO: 21, o nucleótidos 1260-3314 de la SEQ ID NO: 23.

Como se usa en el presente documento, las condiciones de hibridación se refieren a las condiciones de hibridación convencionales en las que se usan moléculas de ácido nucleico para identificar moléculas de ácido nucleico similares. Tales condiciones convencionales se desvelan, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1989. Sambrook et al., igual que la referencia mencionada anteriormente, se incorpora como referencia en el presente documento en su totalidad (véanse específicamente las páginas 9.31-9.62). Además, se desvelan fórmulas para calcular las condiciones de hibridación y lavado apropiadas para conseguir una hibridación que permita grados variables de faltas de coincidencias de nucleótidos, por ejemplo, en Meinkoth et al., 1984, Anal. Biochem. 138, 267-284; Meinkoth et al., igual que la referencia mencionada anteriormente, que se incorpora como referencia en el presente documento en su totalidad.

Más particularmente, las condiciones de hibridación y lavado de rigurosidad moderada, tal como se les hace referencia en el presente documento, se refieren a condiciones que permiten el aislamiento de moléculas de ácido nucleico que presentan una identidad de secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente un 70 % de

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identidad con la secuencia de ácido nucleico con la molécula de ácido nucleico que se está usando para estudiar con sonda en la reacción de hibridación (es decir, condiciones que permiten una falta de coincidencia de nucleótidos de aproximadamente un 30 % o inferior). Las condiciones de hibridación y lavado de alta rigurosidad, tal como se les hace referencia en el presente documento, se refieren a condiciones que permiten el aislamiento de moléculas de ácido nucleico que tienen una identidad de secuencia de ácidos nucleicos de al menos aproximadamente un 80 % con la molécula de ácido nucleico que se está usando para estudiar con sonda en la reacción de hibridación (es decir, condiciones que permiten una falta de coincidencia de nucleótidos de aproximadamente un 20 % o inferior).

Las condiciones de hibridación y lavado de rigurosidad muy alta, tal como se les hace referencia en el presente documento, se refieren a condiciones que permiten el aislamiento de moléculas de ácido nucleico que presentan una identidad de secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente un 90 % con la molécula de ácido nucleico que se está usando para estudiar con sonda en la reacción de hibridación (es decir, condiciones permiten una falta de coincidencia de nucleótidos de aproximadamente un 10 % o inferior). Tal como se ha analizado anteriormente, un experto en la materia puede usar las fórmulas en Meinkoth et al., igual que la referencia mencionada anteriormente, para calcular las condiciones de hibridación y lavado apropiadas para conseguir estos niveles particulares de falta de coincidencia de nucleótidos. Tales condiciones variarán dependiendo de si se están formando híbridos de ADN:ARN o ADN:ADN. Las temperaturas de fusión calculadas para híbridos de ADN:ADN son 10 °C menores que para híbridos de ADN:ARN. En realizaciones en particular, las condiciones de hibridación rigurosa para híbridos de ADN:ADN incluyen hibridación a una fuerza iónica de 6X SSC (Na+ 0,9 M) a una temperatura entre aproximadamente 20 °C y aproximadamente 35 °C (rigurosidad más baja), más preferentemente, entre aproximadamente 28 °C y aproximadamente 40 °C (más rigurosa), e incluso más preferentemente, entre aproximadamente 35 °C y aproximadamente 45 °C (incluso más rigurosa), con condiciones de lavado apropiadas.

En realizaciones en particular, las condiciones y liquidación rigurosas para híbridos de ADN:ARN incluyen una fuerza iónica de 6X SSC (Na+ 0,9 M) a una temperatura entre 30 °C y aproximadamente 45 °C, más preferentemente entre aproximadamente 38 °C y aproximadamente 50 °C, e incluso más preferentemente, entre aproximadamente 45 °C y aproximadamente 55 °C, con condiciones de lavado igualmente rigurosas. Estos valores se basan en cálculos de una temperatura de fusión para moléculas mayores de aproximadamente 100 nucleótidos, formamida al 0 % y un contenido de G + C de aproximadamente un 40 %. Como alternativa, la Tm se puede calcular de forma empírica tal como se establece en Sambrook et al., mencionado anteriormente, páginas 9.31 a 9.62. En general, las condiciones de lavado deberían ser tan rigurosas como fuera posible, y deberían ser apropiadas para las condiciones de hibridación elegidas. Por ejemplo, las condiciones de hibridación pueden incluir una combinación de condiciones de sal y temperatura que están aproximadamente 20-25 °C por debajo de la Tm calculada de un híbrido en particular, y las condiciones de lavado incluyen normalmente una combinación de condiciones de sal y temperatura que están aproximadamente 12-20 °C por debajo de la Tm del híbrido en particular. Un ejemplo de condiciones de hibridación adecuadas para su uso con híbridos de ADN:ADN incluye una hibridación de 2-24 horas en 6X SSC (formamida al 50 %) a aproximadamente 42 °C, seguido de etapas de lavado que incluyen uno o más lavados a temperatura ambiente en SSC a aproximadamente 2X, seguido de lavados adicionales a temperaturas más elevadas y fuerza iónica inferior (por ejemplo, al menos un lavado a aproximadamente 37 °C en aproximadamente 0,1X-0,5X SSC, seguido por al menos un lavado a aproximadamente 68 °C en aproximadamente 0,1X-0,5X SSC).

En otra realización, las moléculas de ácido nucleico adecuadas para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención que codifican una acetolactato sintasa adecuada para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención incluyen moléculas de ácido nucleico aisladas que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 30 restos de aminoácidos contiguos de cualquiera de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID nO: 22 o SEQ ID NO: 24, (es decir, 30 restos de aminoácidos contiguos que tiene una identidad de un 100 % con 30 aminoácidos contiguos de cualquiera de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO: 24). En una realización preferente, una molécula de ácido nucleico aislada adecuada para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 50, y más preferentemente al menos 75, y más preferentemente al menos 100, y más preferentemente al menos 115, y

más preferentemente al menos 130, y más preferentemente al menos 150, y más preferentemente al menos 200, y

más preferentemente, al menos 250, y más preferentemente, al menos 300, y más preferentemente, al menos 350, y

más preferentemente, al menos 400, y más preferentemente, al menos 450, y más preferentemente, al menos 500, y

más preferentemente, al menos 550, y más preferentemente, al menos 600, y más preferentemente, al menos 650, restos de aminoácidos contiguos de cualquiera de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO: 24. Una proteína de ese tipo tiene actividad biológica de acetolactato sintasa. En una realización, una molécula de ácido nucleico aislada adecuada para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención que codifica una acetolactato sintasa comprende una secuencia de ácidos nucleicos que tiene al menos 60 nucleótidos contiguos, y más preferentemente al menos 150, y más preferentemente al menos 225, y más preferentemente al menos 300, y

más preferentemente al menos 345, y más preferentemente al menos 390, y más preferentemente al menos 450, y

más preferentemente al menos 525, y más preferentemente al menos 600, y más preferentemente al menos 750, y

más preferentemente al menos 900, y más preferentemente al menos 1050, y más preferentemente al menos 1200,

y más preferentemente al menos 1350, y más preferentemente al menos 1500, y más preferentemente al menos 1650, y más preferentemente al menos 1800, e incluso más preferentemente al menos 1950, nucleótidos contiguos

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de los nucleótidos 1260-3314 de la SEQ ID NO: 15, nucleótidos 1260-3314 de la SEQ ID NO: 18, nucleótidos 12603314 de la SEQ ID NO: 21, o nucleótidos 1260-3314 de la SEQ ID NO: 23.

Las moléculas de ácido nucleico particularmente preferentes adecuadas para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención incluyen los nucleótidos 1260-3314 de la SEQ ID NO: 14 (codifica la SEQ ID NO: 15), nucleótidos 1260-3314 de la SEQ ID NO: 18 (codifica la SEQ ID NO: 19), nucleótidos 1260-3314 de la SEQ ID NO: 21 (codifica la SEQ ID NO: 22), o nucleótidos 1260-3314 de la SEQ ID NO: 23 (codifica la SEQ ID NO: 24), SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.

De acuerdo con los métodos de la presente invención, una molécula de ácido nucleico aislada es una molécula de ácido nucleico que se ha retirado de su medio natural (es decir, que se ha sometido a manipulación humana), siendo su medio natural el genoma o cromosoma en el que la molécula de ácido nucleico se encuentra en la naturaleza. Como tal, "aislado" no refleja necesariamente el grado hasta el que la molécula de ácido nucleico se ha purificado, sino que indica que la molécula no incluye un genoma completo o un cromosoma completo en el que la molécula de ácido nucleico se encuentra en la naturaleza. Una molécula de ácido nucleico aislada puede incluir un gen, tal como un gen de acetolactato sintasa que se describe en el presente documento. Una molécula de ácido nucleico aislada que incluye un gen no es un fragmento de un cromosoma que incluya tal gen, sino que más bien incluye la región codificante y las regiones reguladoras asociadas con el gen, sin genes adicionales que se encuentran de manera natural en el mismo cromosoma. Una molécula de ácido nucleico aislada también puede incluir una secuencia de ácidos nucleicos especificada flanqueada por (es decir, en el extremo en la posición 5' y/o 3' terminales de la secuencia) ácidos nucleicos adicionales que no flanquean normalmente la secuencia de ácidos nucleicos especificada en la naturaleza (es decir, son secuencias heterólogas). La molécula de ácido nucleico aislada puede incluir ADN, ARN (por ejemplo, ARNm), o derivados de ADN o ARN (por ejemplo, ADNc). Aunque la expresión "molécula de ácido nucleico" se refiere principalmente a la molécula de ácido nucleico física y la expresión "secuencia de ácidos nucleicos" se refiere principalmente a la secuencia de nucleótidos en la molécula de ácido nucleico, las dos frases se pueden usar de manera intercambiable, especialmente con respecto a una molécula de ácido nucleico, o una secuencia de ácidos nucleicos, que puede codificar para una proteína.

Preferentemente, una molécula de ácido nucleico aislada adecuada para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención se produce usando tecnología de ADN recombinante (por ejemplo, amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), clonación) o síntesis química. Las moléculas de ácido nucleico aisladas incluyen moléculas de ácido nucleico naturales y homólogos de las mismas, que comprenden de manera no limitante variantes alélicas naturales y moléculas de ácido nucleico modificadas en las que se han insertado, sometido a deleción, sustituido y/o invertido nucleótidos de una manera tal que tales modificaciones proporcionan el efecto deseado con respecto a la actividad biológica de la proteína. Anteriormente se ha expuesto con detalle variantes alélicas y homólogos de proteína (por ejemplo, proteínas codificadas por homólogos de ácido nucleico).

Un homólogo de molécula de ácido nucleico se puede producir usando una serie de métodos conocidos por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Sambrook et al., igual que la referencia mencionada anteriormente.) Por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico se pueden modificar usando una diversidad de técnicas que incluyen, pero no se limitan, técnicas de mutagénesis clásicas y técnicas de ADN recombinante, tales como mutagénesis dirigida al sitio, tratamiento químico de una molécula de ácido nucleico para inducir mutaciones, escisión con enzimas de restricción de un fragmento de ácido nucleico, ligación de fragmentos de ácido nucleico, amplificación por PCR y/o mutagénesis de regiones seleccionadas de una secuencia de ácidos nucleicos, síntesis de mezclas de oligonucleótidos y ligación de grupos de mezcla para "construir" una mezcla de moléculas de ácido nucleico y combinaciones de las mismas. Los homólogos de moléculas de ácido nucleico se pueden seleccionar a partir de una mezcla de ácidos nucleicos modificados mediante identificación sistemática de la función de la proteína codificada por el ácido nucleico y/o mediante hibridación con un gen de tipo silvestre.

De forma análoga, el tamaño mínimo de una molécula de ácido nucleico adecuada para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención es un tamaño suficiente para codificar una proteína que presenta la actividad biológica deseada, o suficiente para formar una sonda o cebador de oligonucleótido que puede formar un híbrido estable con la secuencia complementaria de una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína natural (por ejemplo, en condiciones de rigurosidad moderada, elevada o muy elevada). Como tal, el tamaño de la molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de este tipo puede depender de la composición de ácido nucleico y el porcentaje de homología o identidad entre la molécula de ácido nucleico y la secuencia complementaria así como de las condiciones de hibridación per se (por ejemplo, temperatura, concentración de sal y concentración de formamida). El tamaño mínimo de una molécula de ácido nucleico que se usa como cebador de oligonucleótido o como sonda es normalmente de al menos aproximadamente 12 a aproximadamente 15 nucleótidos de longitud si las moléculas de ácido nucleico son ricas en GC y de al menos aproximadamente 15 a aproximadamente 18 bases de longitud si son ricas en AT. No existe ningún límite, distinto de un límite práctico, en el tamaño máximo de una molécula de ácido nucleico adecuada para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención, porque la molécula de ácido nucleico puede incluir una parte de una secuencia que codifica una proteína (por ejemplo, una secuencia que codifica acetolactato sintasa) o una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína de longitud completa.

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Una realización de los métodos de la presente invención incluye un vector recombinante que se va a usar para la transformación de un microorganismo de Thraustochytriales. De acuerdo con los métodos de la presente invención, un vector recombinante es una molécula de ácido nucleico diseñada por ingeniería genética (es decir, producida artificialmente) que se usa como herramienta para manipular una secuencia de ácido nucleico de elección y para introducir una secuencia de ácidos nucleicos de este tipo en una célula hospedadora. Por lo tanto el vector recombinante es apropiado para su uso en clonación, secuenciación y/o de otro modo manipulación de la secuencia de ácidos nucleicos de elección, tal como mediante expresión y/o administración de la secuencia de ácidos nucleicos de elección a una célula hospedadora para formar una célula recombinante. Un vector de este tipo contiene normalmente secuencias de ácidos nucleicos heterólogas, es decir, secuencias de ácidos nucleicos que no se encuentran de manera natural adyacentes a una secuencia de ácidos nucleicos que se va a administrar, aunque el vector también puede contener secuencias de ácidos nucleicos reguladoras (por ejemplo, promotores, regiones no traducidas) que se encuentran de manera natural adyacentes a moléculas de ácido nucleico de la presente invención (tratado en detalle a continuación). El vector puede ser ARN o ADN, ya sea procariota o eucariota, y normalmente es un plásmido. El vector se puede mantener como un elemento extracromosómico (por ejemplo, un plásmido) o se puede integrar en el cromosoma del microorganismo recombinante. Todo el vector puede permanecer en su sitio dentro de una célula hospedadora o, en ciertas condiciones, el ADN de plásmido se puede someter a deleción, dejando atrás la molécula de ácido nucleico de la presente invención. La molécula de ácido nucleico integrada puede estar bajo el control de un promotor cromosómico, bajo el control de un promotor de plásmido o nativo, o bajo una combinación de varios controles de promotores. En el cromosoma se pueden integrar copias únicas o múltiples de la molécula de ácido nucleico. Un vector recombinante adecuado para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención contiene al menos un marcador seleccionable para microorganismos de Thraustochytriales adecuado para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención, tal como una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una acetolactato sintasa de Thraustochytriales (homólogo o proteína natural) o una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el gen ble (que se describe a continuación). Como se usa en el presente documento, la expresión "molécula de ácido nucleico recombinante" se usa principalmente para hacer referencia a un vector recombinante en el que se ha ligado la secuencia de ácidos nucleicos que se va a clonar, manipular, transformar en la célula hospedadora (es decir, la inserción).

Normalmente, un vector recombinante, y por lo tanto una molécula de ácido nucleico recombinante, incluye al menos una molécula de ácido nucleico adecuada para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención unida de forma operativa a una o más secuencias de control de la transcripción. Como se usa en el presente documento, la expresión "molécula recombinante" o "molécula de ácido nucleico recombinante" se refiere principalmente a una molécula de ácido nucleico o secuencia de ácidos nucleicos unida de forma operativa a una secuencia de control de la transcripción, pero puede se puede usar de manera intercambiable con la expresión "molécula de ácido nucleico", cuando tal molécula de ácido nucleico es una molécula recombinante como se discute en el presente documento. De acuerdo con los métodos de la presente invención, la expresión "unido de forma operativa" se refiere a la unión de una molécula de ácido nucleico a una secuencia de control de transcripción de una manera tal que la molécula se puede expresar cuando se transfecta (es decir, se transforma, transduce, transfecta, conjuga o conduce) a una célula hospedadora. Las secuencias de control de la transcripción son secuencias que controlan el inicio, elongación o terminación de la transcripción. Las secuencias de control de la transcripción particularmente importantes son las que controlan el inicio de la transcripción, tales como secuencias promotoras, potenciadoras, de operador o represoras. Las secuencias de control de la transcripción adecuadas incluyen cualquier secuencia de control de la transcripción que puede funcionar en un microorganismo del orden Thraustochytriales. Se cree que los presentes inventores son los primeros en aislar e identificar al menos tres de tales promotores, que se describen con detalle en cualquier parte en el presente documento.

Los promotores precedentes incluyen, pero no se limitan a, un promotor de acetolactato sintasa de Thraustochytriales (representado en el presente documento por los nucleótidos 1-1259 de la SEQ ID NO: 14), un promotor de a-tubulina de Thraustochytriales (representado en el presente documento por los nucleótidos 441-894 de la SEQ ID NO: 9, un promotor de un sistema de policétido sintasa de Thraustochytriales (PKS) (contenido dentro de la SEQ ID NO: 34), y un promotor de ácido graso desaturasa de Thraustochytriales (contenido dentro de la SEQ ID NO: 31; se indica que el promotor de la ácido graso desaturasa se denomina promotor de desaturasa en la Solicitud Provisional U.S. con N.° de Serie 60/284.116, mencionada anteriormente). La clonación y secuenciación del promotor de a-tubulina, el promotor de acetolactato sintasa, y el promotor de ácido graso desaturasa se describen en la sección de Ejemplos. En una realización preferente, el promotor de a-tubulina comprende la secuencia de promotor de a-tubulina de Thraustochytriales que se produce de manera natural (nucleótidos 441-894 de la SEQ ID NO: 9), o una secuencia de ácidos nucleicos que es idéntica en al menos un 95 % a los nucleótidos 441-894 de la SEQ ID NO: 9, en la que el promotor tiene al menos actividad de transcripción de promotor de a-tubulina basal. De forma análoga, un promotor de acetolactato sintasa preferente comprende una secuencia de ácidos nucleicos del promotor de acetolactato sintasa de Thraustochytriales que se produce de manera natural (representado dentro de los nucleótidos 1-1259 de la SEQ ID NO: 14), o una secuencia de ácidos nucleicos que es idéntica en al menos un 75 %, y más preferentemente un 80 %, y más preferentemente un 85 %, y más preferentemente un 90 %, y más preferentemente un 95 % a los nucleótidos 1-1259 de la SEQ ID NO: 14, en la que el promotor tiene una actividad de transcripción de promotor de acetolactato sintasa al menos basal. Un promotor de PKS preferente comprende una secuencia de ácidos nucleicos de un promotor de PKS de Thraustochytriales que se produce de manera natural (Representado dentro de la SEQ ID NO: 34), o una secuencia de nucleótidos que es idéntica en al menos un 75 %, y

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más preferentemente un 80 %, y más preferentemente un 85 %, y más preferentemente un 90 %, y más preferentemente un 95 % a la SEQ ID NO: 34, en la que el promotor tiene actividad de transcripción de promotor de PKS al menos basal. Por último, un promotor de ácido graso desaturasa preferente comprende una secuencia de ácidos nucleicos del promotor de ácido graso desaturasa de Thraustochytriales que se produce de manera natural (Representado dentro de la SEQ ID NO: 31), o está contenido dentro de una secuencia de ácidos nucleicos que es idéntica en al menos un 75 %, y más preferentemente un 80 %, y más preferentemente un 85 %, y más preferentemente un 90 %, y más preferentemente un 95 % a la SEQ ID NO: 31, en la que el promotor tiene actividad de transcripción de promotor de ácido graso desaturasa al menos basal. En el presente documento se han descrito anteriormente métodos para determinar el porcentaje de identidad para las secuencias de acetolactato sintasa, y se incluyen en el presente documento.

En una realización, un vector recombinante adecuado para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención es un vector de expresión. Como se usa en el presente documento, la expresión "vector de expresión" se usa para hacer referencia a un vector y es adecuado para producción de un producto codificado (por ejemplo, una proteína de interés). En esta realización, una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el producto a producirse se inserta en el vector recombinante para producir una molécula de ácido nucleico recombinante. La secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína a producir se inserta en el vector de un modo tal que une de forma operativa a la secuencia de ácidos nucleicos a las secuencias reguladoras en el vector (por ejemplo, un promotor de Thraustochytriales de la presente invención) que emite la transcripción y traducción de la secuencia de ácidos nucleicos dentro del microorganismo recombinante. Los marcadores seleccionables que se describen en el presente documento permiten la selección de un microorganismo recombinante en el que una molécula de ácido nucleico recombinante adecuada para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención se ha introducido de forma satisfactoria.

Como se describe en el presente documento, un vector recombinante de la presente descripción es un vector de direccionamiento. Como se usa en el presente documento, la expresión "vector de direccionamiento" se usa para hacer referencia a un vector que se usa para suministrar una molécula de ácido nucleico en particular en una célula recombinante, en el que la molécula de ácido nucleico se usa para hacer deleción o inactivar un gen endógeno dentro de la célula hospedadora (es decir, se usa para tecnología de alteración o desactivación genética dirigida). Un vector de este tipo también se puede conocer en la técnica como vector de "desactivación genética". Como se describe en el presente documento, una parte del vector, pero más normalmente, la molécula de ácido nucleico insertada en el vector (es decir, la inserción), presenta una secuencia de ácidos nucleicos que es homóloga a una secuencia de ácido nucleico de un gen diana en la célula hospedadora (es decir, un gen que se selecciona como diana para su deleción o inactivación). La secuencia de ácidos nucleicos de la inserción del vector se diseñó para que se unan al gen diana de manera que el gen diana y la inserción experimentan recombinación homóloga, mediante lo cual el gen diana endógeno sufre deleción, inactivación o atenuación (es decir, en al menos una parte del gen diana endógeno que se está mutando o sometiendo a deleción).

En una realización, un vector recombinante preferente adecuado para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención es un vector recombinante que es adecuado para uso en un microorganismo de Thraustochytriales, y que incluye una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una molécula de acetolactato Sintasa adecuada para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención. Preferentemente, la acetolactato sintasa se modifica en comparación con la forma que se produce de manera natural (SEQ ID NO: 15), de modo que la sintasa confiere a un microorganismo de Thraustochytriales que se ha transfectado con un vector recombinante, una reducción de la sensibilidad a compuestos de sulfonilurea, inhibidores de la clase de imidazolinona y/u oxibenzoatos de pirimidinilo. Preferentemente, un vector recombinante de este tipo comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína de acetolactato sintasa que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la SEQ ID NO: 15 en una sustitución, inserción o deleción de aminoácido en una o más de las siguientes posiciones: 116G, 117A, 192P, 200A, 251K, 358M, 383D, 592V, 595W, o 599F. En una realización, tales proteínas de acetolactato sintasa presentan una secuencia de aminoácidos que incluye, pero no se limita a: SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 24. Preferentemente, un vector recombinante de este tipo comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada entre: nucleótidos 1260-3314 de la SEQ ID NO: 18, nucleótidos 12603314 de la SEQ ID NO: 21, y nucleótidos 1260-3314 de la SEQ ID NO: 23. En una realización particularmente preferente, los vectores recombinantes que contienen secuencias de ácidos nucleicos que codifican ALS que confieren la resistencia deseada incluyen SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 23.

En una forma de realización, un vector recombinante que es adecuado para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención porque confiere a un microorganismo de a Thraustochytriales S.A. transfectar no con el vector recombinante una reducción de la sensibilidad a compuestos de sulfonilurea, inhibidores de la clase de imidazolinona y/u oxibenzoatos de pirimidinilo, comprende la SEQ ID NO: 15, que es la secuencia de acetolactato sintasa Schizochytrium que se produce de manera natural. En esta realización, el vector recombinante se diseña para sobreexpresar la sintasa que se produce de manera natural, mediante lo cual tal sobreexpresión presenta el efecto de conferir resistencia a los compuestos especificados en el microorganismo. En esta realización, un experto en la materia observará que el uso de tecnología de ADN recombinante puede mejorar el control de la expresión de moléculas de ácido nucleico transformadas manipulando, por ejemplo, el número de copias de las moléculas de ácido nucleico dentro de la célula hospedadora, la eficacia con la que esas moléculas de ácido nucleico se

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transcriben, la eficacia con la que las transcripciones resultantes se traducen, y la eficacia de las modificaciones posteriores a la traducción. Adicionalmente, la secuencia promotora se podría modificar por ingeniería genética para mejorar el nivel de expresión en comparación con el promotor nativo. Las técnicas recombinantes útiles para controlar la expresión de moléculas de ácido nucleico comprenden incluyen, pero no se limitan a, integración de las moléculas de ácido nucleico en uno o más cromosomas celulares, adición de secuencias de estabilidad de vector a plásmidos, sustituciones o modificaciones de señales de control de la transcripción (por ejemplo, promotores, operadores, potenciadores), sustituciones o modificaciones de señales de control de la traducción (por ejemplo, sitios de unión a ribosomas, secuencias de Shine-Dalgarno), modificación de moléculas de ácido nucleico para que correspondan al uso de codones de la célula hospedadora, y deleción de secuencias que desestabilizan transcripciones.

En una realización, un vector recombinante adecuado para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención en la transformación de microorganismos de Thraustochytriales contiene el gen Sh ble de Streptoalloteichus hindustanus como marcador seleccionable (que codifica una "proteína de unión a bleomicina"), en combinación con un promotor de Thraustochytriales como se ha descrito anteriormente en el presente documento. Un vector recombinante preferente que comprende el gen ble y un promotor de Thraustochytriales incluye, por ejemplo, la secuencia de vector representada por la SEQ ID NO: 8 o 9. La secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a bleomicina de Streptoalloteichus hindustanus se representa en el presente documento como la SEQ ID NO: 10.

Las moléculas de ácido nucleico recombinante adecuadas para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención, que pueden ser cualquiera de ADN o ARN, también deben contener secuencias reguladoras adicionales, tales como secuencias reguladoras de la traducción, orígenes de replicación y otras secuencias reguladoras que son compatibles con la célula recombinante. En una realización, una molécula recombinante de la presente invención, incluyendo las que se integran en el cromosoma de la célula hospedadora, también contiene señales secretoras (es decir, secuencias de ácido nucleico de segmento señal) para permitir que una proteína expresada se secrete de la célula que produce la proteína. Los segmentos de señal adecuados incluyen un segmento de señal que está asociado de manera natural con la proteína que se va a expresar o cualquier segmento de señal heterólogo que puede dirigir la secreción de la proteína de acuerdo con los métodos de la presente invención. En otra realización, una molécula recombinante adecuada para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención comprende una secuencia líder para permitir que una proteína expresada se suministre a y se inserte en la membrana de una célula hospedadora. Las secuencias líder adecuadas incluyen una secuencia líder que está asociada de manera natural con la proteína, o cualquier secuencia líder heteróloga que puede dirigir el suministro y la inserción de la proteína a la membrana de una célula.

Habiendo descrito diversas herramientas que son útiles para transformar microorganismos del orden Thraustochytriales, en una realización, adecuada para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención se presenta un método para la transformación de células de un microorganismo del orden Thraustochytriales. El método incluye una primera etapa de: (a) introducir en células de un microorganismo del orden Thraustochytriales una molécula de ácido nucleico recombinante tal como se ha descrito anteriormente en el presente documento. La molécula de ácido nucleico recombinante comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una acetolactato sintasa que confiere a dichas células una reducción de la sensibilidad a compuestos seleccionados de entre el grupo constituido por: compuestos de sulfonilurea, inhibidores de la clase de imidazolinona y oxibenzoatos de pirimidinilo. Tales acetolactato sintasas se han descrito en detalle anteriormente e incluyen las acetolactato sintasas que presentan una secuencia de aminoácidos representada por las SEQ ID NO: 19, sEq ID NO: 22 y SEQ ID NO: 24, así como homólogos de cualquiera de las secuencias de ese tipo o SEQ ID NO: 15 como se ha discutido anteriormente. El método incluye una segunda etapa que consiste en: (b) seleccionar células que se han transformado satisfactoriamente con la molécula de ácido nucleico recombinante cultivando las células de (a) en un medio que contiene al menos un compuesto que es inhibidor para células no transformadas, seleccionándose el compuesto entre el grupo que consiste en: un compuesto de sulfonilurea, un inhibidor de la clase de imidazolinona y oxibenzoatos de pirimidinilo. Las células que crecen en presencia de tales compuestos se han transformado satisfactoriamente.

La molécula de ácido nucleico recombinante usada en el presente método comprende cualquiera de los vectores recombinantes que se han descrito anteriormente en el presente documento, y normalmente incluye al menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína que va a ser producida por la célula recombinante (es decir, que comprende un vector de expresión recombinante), o una secuencia de ácidos nucleicos útil para la deleción o inactivación dirigida de un gen endógeno en la célula recombinante (es decir, que comprende un vector de direccionamiento recombinante).

En una realización, la molécula de ácido nucleico recombinante adecuada para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención comprende adicionalmente una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína a producir por la célula, en la que la secuencia de ácidos nucleicos que codifica para la proteína está unida de forma operativa a una secuencia de control de la transcripción. Los expertos en la materia conocerán proteínas que puede ser deseables para su producción en Thraustochytriales, y todas pretenden quedar incluidas por los métodos de la presente invención. Las proteínas particularmente preferentes incluyen, pero no se limitan a, proteínas asociadas

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con la síntesis de un ácido graso seleccionado entre el grupo que consiste en ácido docosahexaenoico (DHA), ácido docosapetaenoico (DPA), ácido eicosapentaenoico (EPA) y ácido araquidónico (ARA). Tales proteínas incluyen, por ejemplo, una ácido graso sintasa, una ácido graso desaturasa, una ácido graso elongasa, una proteína asociada con un complejo de policétido sintasa y una proteína asociada con la incorporación de ácidos grasos a fosfolípidos o a moléculas de triacilglicerol. En un aspecto, la proteína es una ácido graso w-3 desaturasa codificada por una secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 29. La SEQ ID NO: 30 representa la secuencia de aminoácidos de la desaturasa. En otro aspecto, la proteína es una ácido graso polienoico isomerasa. En una realización, las proteínas que se pueden producir en microorganismos de Thraustochytriales usando el presente método incluyen proteínas asociadas con las rutas biosintéticas de isoprenoides. Tales proteínas comprenden incluyen, pero no se limitan a HMG-CoA sintasa, HMG-CoA reductasa, escualeno sintasa, fitoeno sintasa, fitoeno desaturasa, una carotenoide ciclasa, una carotenoide hidroxilasa, una carotenoide cetolasa. En otra realización más, las proteínas que se pueden producir en microorganismos de Thraustochytriales usando el presente método incluyen, pero no se limitan a, vitamina E y ácido lipoico.

Como se describe en el presente documento, la molécula de ácido nucleico recombinante útil en el método de la presente descripción incluye una secuencia de ácidos nucleicos que se hibrida con una secuencia de ácidos nucleicos diana en el microorganismo de manera que un gen que comprende la secuencia de ácidos nucleicos diana se muta o inactiva mediante recombinación homóloga con la segunda secuencia de ácidos nucleicos. Una secuencia de ácidos nucleicos de este tipo puede ser homóloga con respecto a genes que codifican enzimas (o ácidos nucleicos que regulan la expresión de tales genes) de las rutas de síntesis de ácidos grasos saturados y poliinsaturados, genes que codifican proteínas que están implicadas en la degradación de otros compuestos valiosos producidos por el microorganismo de Thraustochytriales que de otra manera disminuyen el valor del compuesto deseado, o genes que codifican proteínas que están asociadas con la síntesis de compuestos cuya síntesis está en competición con otras moléculas de interés. Por ejemplo, las secuencias de ácidos nucleicos diana incluyen, pero no se limitan a, secuencias que codifican lipasas, enzimas de oxidación de ácidos grasos, proteínas implicadas en la síntesis de hidratos de carbono, proteínas implicadas en la síntesis de productos de rutas de isoprenoides, proteínas implicadas en la síntesis de componentes de la pared celular, proteínas implicadas en las rutas de síntesis de ácidos grasos saturados, proteínas implicadas en las rutas de síntesis de ácidos grasos poliinsaturados, proteínas asociadas con un complejo de policétido sintasa y proteínas asociadas con la incorporación de ácidos grasos a fosfolípidos o moléculas de triacilglicerol.

En una realización de los métodos de la presente invención, el método para la transformación de microorganismos de Thraustochytriales incluye una etapa que consiste en introducir en la célula al menos una molécula de ácido nucleico recombinante adicional que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína que se va a expresar, estando la secuencia de ácido nucleico unida de forma operativa a una secuencia de control de la transcripción. Como alternativa, la molécula de ácido nucleico recombinante adicional puede incluir una segunda secuencia de ácidos nucleicos que se hibrida con una secuencia de ácidos nucleicos diana en el microorganismo de manera que un gen que comprende la secuencia de ácido nucleico diana se muta o inactiva mediante recombinación homóloga con la segunda secuencia de ácidos nucleicos. De esta manera, se pueden introducir múltiples proteínas en las células, se pueden inactivar múltiples genes, o son posibles combinaciones de los dos. La molécula de ácido nucleico recombinante adicional se puede introducir en el microorganismo de Thraustochytriales de forma simultánea con la primera molécula de ácido nucleico recombinante (es decir, cotransformación), o como una transformación posterior (por ejemplo, con los fines de rasgos de "apilamiento").

En una realización, el método de la presente invención incluye adicionalmente la etapa de introducir en la célula al menos una molécula de ácido nucleico recombinante adicional que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que comprende una proteína de unión a bleomicina. En esta realización, la molécula de ácido nucleico recombinante adicional se introduce preferentemente en una etapa posterior, en vez de como una cotransformación. Preferentemente, la molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína de unión a bleomicina comprende además una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una segunda proteína que se va a expresar por la célula, en la que la secuencia de ácido nucleico que codifica la segunda proteína está unida de forma operativa a una secuencia de control de la transcripción. Como alternativa, o además, la molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína de unión a bleomicina comprende además una segunda secuencia de ácidos nucleicos que se hibrida con una secuencia de ácidos nucleicos diana en el microorganismo de manera que un gen que comprende la secuencia de ácidos nucleicos diana se muta o inactiva mediante recombinación homóloga con la segunda secuencia de ácidos nucleicos. Como se describe en el presente documento, una molécula de ácido nucleico recombinante de este tipo comprende una secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 9.

Las células hospedadoras adecuadas para su transformación para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, cualquier microorganismo del orden Thraustochytriales. Las células hospedadoras pueden ser células no transformadas o células que ya se han transfectado con al menos una molécula de ácido nucleico. Las células hospedadoras preferentes para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención incluyen microorganismos de un género que incluye, pero no se limita a: Thraustochytrium, Labyrinthuloides, Japonochytrium, y Schizochytrium. Las especies preferentes dentro de estos géneros incluyen, pero no se limitan a: cualquier especie de Schizochytrium, incluyendo Schizochytrium aggregatum, Schizochytrium

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limacinum, Schizochytrium minutum; cualquier especie de Thraustochytrium (incluyendo las especies de Ulkenia anteriores tales como U. visurgensis, U. amoebaida, U. sarkariana, U. profunda, U. radiata, U. minuta y Ulkenia sp. BP-5601), e incluyendo Thraustochytrium striatum, Thraustochytrium aureum, Thraustochytrium roseum; y cualquier especie de Japonochytrium. Las cepas particularmente preferentes de Thraustochytriales incluyen, pero no se limitan a: Schizochytrium sp. (S31) (ATCC 20888); Schizochytrium sp. (S8) (ATCC 20889); Schizochytrium sp. (LC- RM) (ATCC 18915); Schizochytrium sp. (SR21); Schizochytrium aggregatum (Goldstein y Belsky) (ATCC 28209); Schizochytrium limacinum (Honda y Yokochi) (IFO 32693); Thraustochytrium sp. (23B) (AtCC 20891); Thraustochytrium striatum (Schneider) (ATCC 24473); Thraustochytrium aureum (Goldstein) (ATCC 34304); Thraustochytrium roseum (Goldstein) (AtCc 28210); y Japonochytrium sp. (L1) (ATCC 28207).

De acuerdo con los métodos de la presente invención, el término "transformación" se usa para hacer referencia a cualquier método mediante el cual una molécula de ácido nucleico exógena (es decir, una molécula de ácido nucleico recombinante) Se puede insertar en células microbianas, tales como células microbianas de Thraustochytriales. En los sistemas microbianos, el término "transformación" se usa para describir un cambio heredado debido a la adquisición de ácidos nucleicos exógenos por el microorganismo y es esencialmente sinónimo al término "transfección". Las técnicas de transformación adecuada se incluyen, pero no se limitan a, bombardeo de partículas, electroporación, microinyección, lipofección, adsorción, infección y fusión de protoplastos.

En una realización, una proteína que se va a producir usando un método de la presente invención se produce cultivando una célula que expresa la proteína (es decir, un microorganismo de Thraustochytriales recombinante) en condiciones eficaces para producir la proteína. En algunos casos, la proteína se puede recuperar, y en otros, el microorganismo se puede recoger como un todo o como un lisado y se puede usar como una "biomasa". Como se describe en el presente documento, un gen diana se somete a deleción o se inactiva cultivando una célula que se ha transformado con una molécula recombinante que comprende un vector de direccionamiento de la presente invención en condiciones eficaces para permitir la recombinación dentro de la célula, dando como resultado la deleción o inactivación de un gen diana. Una célula preferente para cultivar es una célula recombinante que se describe en el presente documento. Las condiciones de cultivo eficaces incluyen, pero no se limitan a, medios eficaces, biorreactor, temperatura, pH y condiciones de oxígeno que permiten la producción y/o la recombinación de proteína. Un medio eficaz se refiere a cualquier medio en el que se cultiva normalmente una célula de Thraustochytriales. Tal medio comprende normalmente un medio acuoso que presenta fuentes de carbono, nitrógeno y fosfato asimilables, y sales, minerales, metales y otros nutrientes apropiados, tales como vitaminas. Los ejemplos de medios y condiciones de cultivo adecuados se discuten con detalle en la sección de Ejemplos. Las condiciones de cultivo adecuadas para microorganismos de Thraustochytriales también se describen en el documento de Patente de Estados Unidos N.° 5.340.742, concedido el 23 de agosto de 1994, a Barclay. Las células adecuadas para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención se pueden cultivar en biorreactores de fermentación convencionales, matraces de agitación, tubos de ensayo, placas de microtitulación y placas de Petri convencionales. El cultivo se puede realizar a una temperatura, un pH y un contenido de oxígeno apropiados para una célula recombinante. Tales condiciones de cultivo están dentro de la experiencia de alguien con una experiencia habitual en la materia.

Dependiendo del vector y sistema de hospedador usados para la producción, las proteínas resultantes de los métodos de la presente invención pueden o bien permanecer dentro de la célula recombinante; se pueden secretar al medio de fermentación; se pueden secretar al espacio entre dos membranas celulares; o se pueden retener en la superficie externa de una membrana celular. La expresión "recuperación de la proteína" se refiere a recoger el medio de fermentación completo que contiene la proteína y no implica necesariamente etapas adicionales de separación o purificación. Las proteínas producidas los métodos de la presente invención se pueden purificar usando una diversidad de técnicas de purificación de proteínas convencionales, tales como, pero que no se limitan a, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, filtración, electroforesis, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de filtración en gel, cromatografía en fase inversa, cromatografía de concanavalina A, cromatoenfoque y solubilización diferencial. Las proteínas producidas con los métodos de la presente invención se recuperan preferentemente en forma "sustancialmente pura". Como se usa en el presente documento, "sustancialmente pura" se refiere a una pureza que permite el uso eficaz de la proteína como producto comercial.

En otra realización más, un microorganismo recombinante del orden Thraustochytriales adecuado para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención, incluye un microorganismo que se ha transformado un microorganismo que se ha transformado con una molécula de ácido nucleico recombinante con una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una acetolactato sintasa que se describe en el presente documento. Preferentemente, la acetolactato sintasa confiere al microorganismo una reducción de la sensibilidad a compuestos seleccionados entre el grupo que consiste en: compuestos de sulfonilurea, inhibidores de la clase de imidazolinona y oxibenzoatos de pirimidinilo. Las secuencias y moléculas de ácido nucleico recombinantes para su usó en la transformación de un microorganismo de este tipo se han descrito con detalle anteriormente. Un microorganismo de este tipo se puede transformar adicionalmente con otras moléculas de ácido nucleico recombinante, incluyendo moléculas de ácido nucleico recombinante que comprenden un marcador seleccionable de gen ble y secuencias de control de transcripción de Thraustochytriales, Como se ha descrito anteriormente en el presente documento. Los microorganismos de Thraustochytriales recombinantes adecuados para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención se describen en la sección

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de Ejemplos. De acuerdo con los métodos de la presente invención, un microorganismo de Thraustochytriales recombinante adecuado para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención se modifica mediante ingeniería genética para expresar una proteína de interés (los ejemplos de tales proteínas se han discutido anteriormente) usando los vectores recombinantes que se describen en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, un microorganismo recombinante presenta un genoma que está modificado (es decir, mutado o cambiado) con respecto a su forma normal (es decir, de tipo silvestre o que se produce de manera natural) usando tecnología recombinante. En el presente documento se describe microorganismo recombinante en el que se han insertado, sometido a deleción o modificado moléculas de ácido nucleico (es decir, mutado; por ejemplo, mediante inserción, deleción, sustitución y/o inversión de nucleótidos), de una manera tal que las modificaciones de ese tipo proporcionan el efecto deseado dentro del microorganismo. Como se usa en el presente documento, las modificaciones genéticas que dan como resultado una disminución de la expresión genética, la función del gen, o la función del producto genético (es decir, la proteína codificada por el gen) se pueden denominar inactivación (completa o parcial), deleción, interrupción, bloqueo o regulación por disminución de un gen. Por ejemplo, una modificación genética en un gen que da como resultado una disminución en la función de la proteína codificada por tal gen puede ser el resultado de una deleción completa del gen (es decir, el gen no existe, y por tanto la proteína no existe), una mutación en el gen que da como resultado una traducción incompleta de la proteína o que no se traduzca en absoluto (por ejemplo, la proteína no se expresa), o una mutación en el gen que disminuye o suprime la función natural de la proteína (por ejemplo, se expresa una proteína que presenta una disminución de la acción o actividad enzimática o falta de la misma). Las modificaciones genéticas que dan como resultado un aumento en la función o expresión genética se pueden denominar pueden amplificación, sobreproducción, sobreexpresión, activación, potenciación, adición o regulación por incremento de un gen.

De acuerdo con los métodos de la presente invención, un microorganismo de Thraustochytriales recombinante se puede producir usando cualquier microorganismo del orden Thraustochytriales. Los géneros preferentes de Thraustochytriales incluyen, pero no se limitan a: Thraustochytrium, Labyrinthuloides, Japonochytrium, y Schizochytrium. Las especies preferentes dentro de estos géneros incluyen, pero no se limitan a: cualquier especie de Schizochytrium, incluyendo Schizochytrium aggregatum, Schizochytrium limacinum; cualquier especie de Thraustochytrium (incluyendo cualquier especie de Ulkenia anterior tal como U. visurgensis, U. amoeboida, U. sarkariana, U. profunda, U. radiata, U. minuta y de Ulkenia sp. BP-5601), Thraustochytrium striatum, Thraustochytrium aureum, Thraustochytrium roseum; y cualquier especie de Japonochytrium. Las cepas particularmente preferentes de Thraustochytriales incluyen, pero no se limitan a: Schizochytrium sp. (S31) (ATCC 20888); Schizochytrium sp. (S8) (ATCC 20889); Schizochytrium sp. (LC-RM) (ATCC 18915); Schizochytrium sp. (SR21); Schizochytrium aggregatum (Goldstein y Belsky) (ATCC 28209); Schizochytrium limacinum (Honda y Yokochi) (IFO 32693); Thraustochytrium sp. (23B) (ATcC 20891); Thraustochytrium striatum (Schneider) (ATcC 24473); Thraustochytrium aureum (Goldstein) (ATCC 34304); Thraustochytrium roseum (Goldstein) (ATCC 28210); y Japonochytrium sp. (L1) (ATCC 28207).

Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo ilustrativo y no pretenden limitar el alcance de los métodos de la presente invención.

Ejemplos

Ejemplo 1

Este ejemplo describe la producción del plásmido recombinante pTUBZE011-2.

La construcción del plásmido recombinante pTUBZEO11-2 se ilustran las FIGS. 1 y 2. Este plásmido contiene el gen ble de Streptoalloteichus hindustanus acoplado de forma funcional a un promotor del gen de a-tubulina aislado de Schizochytrium sp. Este plásmido se produjo como sigue a continuación. Un clon de ADNc (CGNE0002-001-B6) se aisló de una biblioteca de ADNc de Schizochytrium sp. y se secuenció parcialmente (SEQ ID NO: 1) como parte de un proyecto de secuenciación de ADNc de Schizochytrium a gran escala. La secuencia de nucleótidos se determinó para codificar a-tubulina mediante búsqueda de homología BLASTX (Gish, W. y D. States. 1993. Nat. Genet. 3: 266272). La secuencia de aminoácidos deducir a partir de las bases 116 a 550 es idéntica en un 93 % a los primeros 145 aminoácidos de a-tubulina de Pelvetica fastigiata (N.° de Registro en GenBank U58642).

Con el fin de aislar el promotor asociado con este gen, el ADN genómico se aisló de células de Schizochytrium sp. y se procesó mediante el uso de un kit "GenomeWalker™" (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA), que implica digestión enzimática de ADN genómico con endonucleasas de restricción para generar extremos romos, seguido por ligación del ADN digerido a moléculas adaptadoras de ADN bicatenario específicas proporcionadas en el kit. El ADN cadena arriba de la secuencia codificante de a-tubulina a continuación se amplificó mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), usando el cebador adaptador externo (API) que se proporciona en el kit y el cebador PGR20 específico de a-tubulina (SEQ ID NO: 2). La amplificación adicional del gen se realizó usando el cebador adaptador anidado (AP2) proporcionado en el kit y un cebador PGR19 específico de a-tubulina anidado (SEQ ID NO: 3). Los productos de PCR resultantes se subclonaron en el plásmido pCR2.1-TOPO (Invitrogen Corp., Carlsbad,

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CA). Uno de los fragmentos subclonados se secuenció; la secuencia de los 725 pb que preceden inmediatamente al codón de iniciación del gen de a-tubulina se proporcionan como la SEQ ID NO: 4.

Usando los cebadores de oligonucleótido basados en la secuencia de ADN obtenida de esta manera, Se usó PCR usando Taq ADN polimerasa (Perkin-Elmer Corp., Norwalk, CT) para generar una región promotora de a-tubulina modificada en la que un sitio de restricción NcoI se incorporan el extremo en la posición 3' terminal del fragmento de ADN; este sitio NcoI contenía un codón de inicio que estaba en la misma posición que en la región codificante de a- tubulina. Los cebadores usados en esta reacción fueron PGR33 (SEQ ID NO: 5) si PGR34 (SEQ ID NO: 6), y el molde fue ADN genómico aislado a partir de células Schizochytrium sp. Se usaron las siguientes condiciones de reacción: 94 °C durante 4 min; (94 °C durante 1 min, 54 °C durante 45 s, 72 °C durante 2 min) x 30; 72 °C durante 7 min. Este fragmento se clonó en el plásmido pCR2.1-TOPO para formar el plásmido p7TUB (SEQ ID NO: 7). El plásmido p7TUB se digirió con NcoI, un fragmento de 463 pb resultante que contenía la región promotora de a- tubulina de Schizochytrium se aisló mediante purificación en gel de agarosa. El plásmido pSV40/Zeo (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA), que contiene el gen ble de Streptoalloteichus hindustanus flanqueado por un promotor y terminador de SV40, también se digirió con NcoI para producir un fragmento de 3201 pb y un fragmento de 314 pb. El fragmento de 3201 pb se purificó en gel de agarosa y se ligó al fragmento de 463 pb de NcoI de p7TUB para producir pTUBZEO-11 (SEQ ID NO: 8), que se representa en la FIG. 1.

A continuación, el plásmido pTUBZEO-11 se difirió con SphI, y un fragmento de 1122 pb resultante que contenía el gen ble flanqueado por el promotor de a-tubulina de Schizochytrium y el terminador de SV40 se purificó en gel de agarosa y se ligó al plásmido pUC19 (Messing, J. 1983. Meth. Enzymol. 101: 20) que se había linealizado mediante digestión con SphI. El plásmido resultante se denominó pTUBZEO11-2 (SEQ ID NO: 9) y se representa en las FIGS. 2 y 4. El plásmido pTUBZEO11-2 también se denomina pMON50000. En la SEQ ID nO: 9, el promotor de a-tubulina de Schizochytrium está contenido dentro de los nucleótidos 441-894; la región codificante del gen ble está contenida dentro de los nucleótidos 895-1269; y el terminador de SV40 está contenido dentro de los nucleótidos 1270-1524.

Ejemplo 2

Este ejemplo describe la producción de los plásmidos recombinantes pMON50200, pMON50201, pMON50202, y pMON50203.

El gen que codifica la acetolactato sintasa nativa (als) de Schizochytrium sp. se aisló de la siguiente manera. El clon de AdNac (LIB81-028-Q1-E1-D9) se aisló De una biblioteca de ADNc de Schizochytrium y se secuenció parcialmente (SEQ ID NO: 11) como parte de un proyecto de secuenciación de ADNc de Schizochytrium sp. a gran escala. La secuencia de nucleótidos se determinó mediante homología BLASTX que codifica acetolactato sintasa; por ejemplo, la secuencia de aminoácidos a partir de las bases 154 a 378 era idéntica en un 68 % a los aminoácidos 313 a 387 de ALS de Schizosaccharomyces pombe (N.° de Registro en GenBank P36620). La secuencia de longitud completa de este ADNc clonado se obtuvo a continuación, lo que indicó que el clon de ADNc no contenía la región codificante de als de longitud completa, una biblioteca lambda genómica de Schizochytrium se estudió con sonda usando protocolos convencionales (véase por ejemplo Sambrook et. al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) con una sonda de ADN marcada con digoxigenina (DIG) de 372 pb (denominada sonda ALS2). La sonda ALS2 se genera mediante PCR usando una mezcla de nucleótidos que incluía DIG-11-UTP (Boehringer Mannheim Biochemicals GmbH, Alemania), usando el cebador directo PGR38 (SEQ ID NO: 12) y el cebador inverso PGR39 (SEQ ID NO: 13), que se basaban en la secuencia del clon de ADNc LIB81- 028-Q1-E1-D9. Uno de los clones genómicos identificados con la sonda ALS2, denominado ALS-4A, se aisló y caracterizó adicionalmente mediante transferencias de hibridación de tipo Southern usando la sonda ALS2 marcada con DIG. Se encontró que un fragmento de 4,9 kpb de ADN lambda de ALS-4A digerido con AhdI hibridaba con la sonda ALS2. Se aisló este fragmento mediante purificación en gel de agarosa, se trató con ADN polimerasa de T4 con el fin de generar extremos romos y entonces se ligó en pBluescriptII KS+ digerido con SmaI (Stratagene Corp. La Jolla, CA) para formar el plásmido pMON50200 (representado en la FIG. 3-A). La secuencia de pMON50200 se facilita como la SEQ ID NO: 14. La secuencia de la enzima acetolactato sintasa codificada por el gen als de Schizochytrium se proporciona como la SEQ ID NO: 15.

Los plásmidos pMON5020 1, pMON50202, y pMON50203 (representados en las FIGS. 3-B, 3-C, y 3-D, respectivamente) se produjeron a partir del plásmido pMON50200 mediante mutagénesis dirigida al sitio de manera que las enzimas acetolactato sintasa codificadas ya no se inhiben más por ciertos compuestos, incluyendo sulfometurón metilo (SMM). Estos plásmidos se construyeron como sigue a continuación. El kit de mutagénesis dirigida al sitio "Transformera" (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) se usó para introducir las siguientes mutaciones en el plásmido pMON502000 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Un cebador de selección de oligonucleótido, DM19 (SEQ ID NO: 16), se usó en las tres construcciones; este cebador conduce a la conversión de un único sitio EcoRV en el sitio de clonación múltiple de pMON50200 a un sitio AatII. El cebador DM14 (SEQ ID NO: 17) se usó para cambiar el resto de aminoácido con el número 595 en la enzima ALS codificada de triptófano a valina, mientras que al mismo tiempo se introducía un sitio AclI en la secuencia genética; el plásmido resultante se denomina pMON50201 (SEQ ID nO: 18). De forma análoga, el cebador DM15 (SEQ ID NO: 20) se usó para cambiar el resto de aminoácidos con el número 192 en la enzima ALS codificada a partir de una prolina a una glutamina y para introducir un sitio SsgI en el gen als, dando como resultado del plásmido pMON50202 (SEQ ID NO: 21). Para

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construir el plásmido pMON50203 (SEQ ID NO: 23), se usaron los cebadores tanto DM14 como DM15, dando como resultado una enzima ALS codificada que contenía ambos reemplazamientos de restos de aminoácidos que se han descrito anteriormente. Las secuencias de las enzimas acetolactato sintasa mutantes codificadas por los plásmidos pMON50201, pMON50202, y pMON50203 se proporcionan como las SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22, y SEQ ID NO: 24, respectivamente.

Ejemplo 3

Este ejemplo describe la transformación genética de Schizochytrium sp. con las moléculas recombinantes que se han descrito en los Ejemplos 1 y 2.

La cepa usada en este ejemplo es N230D de Schizochytrium sp., un derivado de la cepa 20888 de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, Manassas, VA). Para los cultivos líquidos, se hicieron crecer las células axénicamente en medio M50-3 a 30 °C con agitación a 200-300 rpm. El medio M50-3 contiene los siguientes componentes: NaCl, 12,5 g; MgSO4^7H2O, 2,5 g; KCl, 0,5 g; CaCh, 0,05 g; glucosa, 30 g; Na-glutamato, 3 g; KH2PO4, 0,4 g; extracto de levadura, 1 g; NaHCO3, 0,4 g; Na2EDTA, 30 mg; FeC^6H2O, 1,2 mg; H3BO3, 34,2 mg; ZnSO4^7H2O; 0,67 mg; CoC^6H2O, 0,13 mg; NaMoO4^2H2O, 25 |jg; CuSO4^O5H2O, 10 |jg; NiSO4^6H2O, 0,26 mg; tiamina^HCl, 100 jg; biotina, 0,5 jg; cianocobalamina, 0,5 jg, y agua desionizada (hasta 1 l); el pH final se ajustó a 7,0. Para el crecimiento en medio sólido, las células se hicieron crecer a 30 °C en medio M50-3 o medio M1E-3 solidificado mediante la adición de un 1,5 % (p/v) de agar. El medio M1E-3 contiene los siguientes componentes: glucosa, 4 g; (NH4)2SO4, 0,75 g; Na2SO4, 5 g; MgSO4^O, 2 g; KH2PO4, 0,5 g; KCl, 0,5 g; CaC^2 H2O, 0,1 g; tampón MOPS, 20,9 g; FeSO4^4H2O, 0,3 mg; MnC^4H2O, 0,1 mg; ZnSO4^7H2O; 80 jg; CoC^6H2O, 2 jg; NaMoO4^2H2O, 1 jg; CUSO4^5H2O, 60 jg; NiSO4^6H2O, 80 jg; tiamina^HCl, 320 jg; CA-pantotenato, 320 jg; cianocobalamina, 8 jg, y agua desionizada (hasta 1 l); el pH final se ajustó a 7,0.

La sensibilidad de Schizochytrium sp. a Zeocin™ y SMM se determinó incluyendo estos inhibidores en medio M1E-3 solidificado diversas concentraciones y propagando las células en las placas a densidades similares a las que están presentes durante procedimientos utilizados para la selección de células recombinantes.

La transformación genética de células de Schizochytrium se realizó mediante bombardeo de partículas (Sanford, J.C., F.D. Smith, y J.A, Russell. 1993. Meth. Enzymol. 217: 483-509) usando un sistema de suministro de partículas Biolistic PDS-1000/He de Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Se hicieron crecer células N230D de Schizochytrium sp. en medio líquido M50-3 hasta una densidad óptica a 680 nm (DO680) de 0,4-0,8 (longitud de trayectoria óptica de 10 mm). Una alícuota de células correspondientes a 1,0 de DO680 se centrifugó brevemente, la solución de sobrenadante se retiró, y las células sedimentadas se volverán a suspender en 100 jl de agua estéril. A continuación las células resuspendidas se propagaron en un círculo de 4 a 6 cm sobre una placa de Petri que contenía medio solidificado con agar (por ejemplo, medio M50-3 o M1E-3) y se permitió su reposo de 30 a 60 min, de modo que el agua en exceso se pudiera absorber en el medio sólido; ésta se denomina placa diana.

Una alícuota de 1,5 mg de microvehículos de oro (diámetro nominal de 0,6 j, disponible en Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA) se revistió con 2,5 jg de ADN de plásmido de transformación (es decir, plásmido pTUBZEO11-2, pMON50201, pMON50202, o pMON50203) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (manual de instrucciones del sistema de suministro de partículas Biolistic® PDS-1000/He; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Las células se bombardearon con los microvehículos de oro revestidos con ADN usando las siguientes condiciones: disco de ruptura de 7,6 MPa (1100 psi), vacío de la cámara de 7,6 MPa (25" de Hg), conjunto de lanzamiento de microvehículo colocado en el estante superior y las placas diana colocadas en el estante del medio, proporcionando una distancia desde el disco de ruptura hasta la pantalla de parada de 1,5-2 cm y una distancia desde la pantalla de parada hasta la diana de aproximadamente 7 cm. Después de bombardeo, se dejó que las células se recuperaran en las placas diana durante 4-6 horas a 30 °C. A continuación las células se separaron por enjuagado las células de las placas diana con 1,5 ml de agua estéril, se recogieron en un tubo de microcentrífuga, se centrifugaron brevemente y se resuspendieron en 400 jl de agua estéril. Se propagaron cien microlitros de la suspensión sobre cada una de cuatro placas M1E-3 que contenían o bien 150-200 jg/ml de Zeocin™ (Invitrogen Corp., Carlbad, CA) o bien 25 jg/ml SMM. Las placas que contenían Zeocin™ se usaron para seleccionar células que se habían transformado con el plásmido pTUBZEO11-2, mientras que las placas que contenían SMM se usaron para seleccionar células que se habían transformado con los plásmidos pMON50201, pMON50202, o pMON50203. A continuación las placas se incubaron durante 7-10 días a 30 °C. Las colonias que parecían ser resistentes al agente selectivo se sembraron en parches sobre placas M1E-3 nuevas que contenían el mismo agente selectivo para confirmar la resistencia. Este protocolo generalmente da como resultado la generación de 100-1000 cepas resistentes a Zeocin™ o resistentes a SMM por bombardeo.

Ejemplo 4

El siguiente ejemplo demuestra el análisis de PCR de células de Schizochytrium transformadas.

La PCR se usó para confirmar la presencia de secuencias de plásmido en las cepas supuestamente transformadas que eran resistentes a los agentes selectivos Zeocin™ o SMM. El ADN de molde a partir supuestos transformantes y

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células N230D de Schizochytrium no recombinantes se obtuvo usando un asa de inoculación de 1 |jl de plástico de un solo uso para retirar una pequeña cantidad de células (1-2 mm3) de colonia resistentes que se habían sembrado en parches sobre placas de agar (tal como se describe en el Ejemplo 3). A continuación las células se volvieron a suspender en 15-20 jl de 1 % Triton X-100 en un tubo de microcentrífuga, se colocaron en un baño de agua en ebullición durante 10 minutos, y a continuación se centrifugaron durante 5 minutos a 14,000xg. Se usaron partes de estos extractos (1-3 jl) para proporcionar el ADN de molde para reacciones de PCR de 25 jl usando Taq ADN polimerasa. Para detectar la presencia de secuencias de pTUBZEO11-2 en el ADN de Schizochytrium, se usaron los cebadores DM20 (SEQ ID No: 25) y DM21 (SEQ ID NO: 26); estos cebadores se hibridan con el gen ble en el plásmido pTUBZEO11-2 y amplifican un fragmento de ADN de 346 pb. El perfil térmico usado por el que sigue a continuación: 94 °C durante 4 min; (94 °C durante 45 s, 52 °C durante 45 s, 72 °C durante 2 min) x 30; 72 °C durante 7 min. Para detectar la presencia de secuencias de pMON50201, pMON50202, o pMON50203 en el ADN de Schizochytrium, se usaron los cebadores BLA1 (SEQ ID NO: 27) y BLA2 (SEQ ID NO: 28); estos cebadores se hibridan con el gen bla (resistencia a ampicilina) encontrado en la estructura principal del vector y amplifican un fragmento de ADN de 1229 pb. El perfil técnico usado fue el que sigue a continuación: 94 °C durante 4 min; (94 °C durante 45 s, 55 °C durante 45 s, 72 °C durante 2 min) x 30; 72 °C durante 7 min. Los productos de pCr se analizaron por mediante electroforesis en gel de agarosa convencional, seguido por tinción con bromuro de etidio.

Los resultados de estos análisis confirman que la gran mayoría de las cepas seleccionadas en estas condiciones son transformantes verdaderos que contienen ADN de plásmido. No se generaron productos de PCR del tamaño correcto cuando se usó ADN de molde de células N230D de Schizochytrium sp. que no se habían bombardeado con los plásmidos de transformación.

Ejemplo 5

El siguiente ejemplo describe análisis de transferencia de tipo Southern de células de Schizochytrium transformadas.

Las transferencias de hibridación de tipo Southern se realizaron usando ADN aislado a partir de células N230D de Schizochytrium precursoras y varios supuestos transformantes con el fin de confirmar la presencia de secuencias de ADN de vector de transformación dentro de las células transformadas. La transferencia de tipo Southern se realizó usando técnicas conocidas por los expertos en la materia (véase por ejemplo Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989). El ADN se aisló mediante el uso de un kit de purificación de ADN de "QIAamp" (Qiagen Inc., Valencia, CA), se digirió con diversas enzimas de restricción, se separó mediante electroforesis a través de geles de agarosa (0,8 % - 1,2 % en p/v), y a continuación se transfirió a membranas de nailon mediante transferencia capilar alcalina.

La detección de ADN de vector en células transformadas con pTUBZEO11-2 mediante el uso del sistema basado en DIG "Genius" DIG (Boehringer Mannheim Biochemicals GmbH, Alemania), usando como sonda de hibridación un fragmento de gen ble marcado con DIG de 346 pb generado por medio de PCR con los cebadores DM20 (SEQ ID NO: 25) y DM21 (SEQ ID NO: 26) y una mezcla de nucleótidos que incluía DIG-11-UTP. La hibridación previa de la membrana se realizó a 68 °C durante 1 h en el tampón de hibridación suministrado en el kit Genius. La hibridación se realizó a 68 °C durante 18 h en tampón de hibridación que contenía la sonda de gen ble que se había desnaturalizado térmicamente durante 5 min a 94 °C. A continuación las membranas se lavaron dos veces durante 5 min con 50 ml de 2X SSC/SDS al 0,1 % y dos veces durante 15 min en 50 ml de 0,1X SSC/SDS al 0,1 %. La detección quimioluminiscente del ADN de hibridación se realizó tal como se describe en las instrucciones del kit Genius.

El ADN de células N230D de Schizochytrium no transformadas no se hibridaba con la sonda de gen ble. Por el contrario, el ADN de células transformadas se hibridaba con la sonda tal como sigue a continuación:

SphI: El ADN digerido con SphI de células de Schizochytrium transformadas contenía un fragmento de ADN de ~1100 pb que se hibridaba con la sonda de gen ble; este fragmento, que también se observa en ADN de pTUBZEO11-2 digerido con SphI, representa el casete de expresión del gen ble completo (incluyendo el promotor del gen de tubulina y el terminador de SV40).

XhoI: Para cada uno de los transformantes sometidos a ensayo, la digestión con XhoI del ADN dio como resultado fragmentos de hibridación con un tamaño superior a 15-20 kpb. XhoI no se cortan dentro de pTUBZEO11-2, y por no tanto estos resultados indican que pTUBZEO11-2 no parece existir como un elemento extracromosómico en células transformadas, sino que más bien se integra en el cromosoma de Schizochytrium.

NcoI o HindIII: Estas enzimas se cortan ambas una vez dentro de pTUBZEO11-2. La digestión de ADN transformante con cualquiera de estas enzimas normalmente conducía a un fragmento de hibridación prominente que migraba en conjunto con el vector pTUBZEO11-2 linealizado (es decir, ~3,8 kpb). Esto sugiere que el vector se puede integrar en el cromosoma en forma de repeticiones en tándem.

Ejemplo 6

Este ejemplo demuestra la recombinación homóloga en Schizochytrium.

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Los siguientes experimentos se realizaron para demostrar que la recombinación homóloga se puede producir en Schizochytrium entre secuencias de ADN nativas endógenas y secuencias de ADN homólogas presentes en moléculas de ADN recombinante introducidas en las células. Este tipo de recombinación homóloga puede ser muy beneficiosa para producir cepas recombinantes con propiedades deseables. Por ejemplo, la recombinación homologa se puede usar para inactivar genes endógenos mediante la inserción dirigida de secuencias genéticas extrañas. Adicionalmente, la recombinación homóloga se puede usar para reemplazar un gen endógeno o parte del mismo con una forma alterada del gen de manera que las células recombinantes muestran propiedades nuevas.

Se mostró que la recombinación homóloga se producía en células de Schizochytrium transformadas con el plásmido pMON50202, que contiene una mutación en el gen als de Schizochytrium. Esta mutación introduce un sitio SsgI en la posición de pb 571 de la región codificante de als. Hay un sitio SsgI que se produce de manera natural en la posición de pb 1324 de la región codificante de als. Por tanto, se pueden usar transferencias de tipo Southern de ADN de Schizochytrium digerido con SsgI para discernir el gen als nativo del gen als mutante recombinante. Para estos experimentos, se produjo una sonda de hibridación específica de als por medio de PCR usando una mezcla de nucleótidos que incluía DIG-11-UTP (Boehringer Mannheim Biochemicals GmbH, Alemania), el cebador directo PGR28 (SEC ID n°:32), el cebador inverso PGR30 (SEC ID n°:33) y una pequeña cantidad de pMON50200 como molde. La sonda de hibridación marcada con DIG de 323 pb resultante se denominó ALS1.

El ADN de células N230D de Schizochytrium no recombinantes se digirió con SsgI y AhdI por separado, se sometió a electroforesis en gel de agarosa, se transfirió a una membrana de nailon y a continuación se estudió con sonda con la sonda ALS1 usando procedimientos esencialmente iguales a los que se han descrito en el Ejemplo 5. La sonda ALS 1 marcó un fragmento de 1,76 kpb de ADN digerido con SsgI y un fragmento de 4,9 kpb de ADN digerido con AhdI.

También se estudiaron con sonda las transferencias de tipo Southern de ADN digerido con SsgI y AhdI de diversas cepas recombinantes que se habían transformado con pMON50202 con la sonda ALS1. En algunos casos, el fragmento de SsgI de 1,76 kpb no estaba presente, y en su lugar se marcó un fragmento de 0,75 kpb, correspondiente al fragmento de SsgI de 753 pb presente en pMON50202. Se marcó un fragmento de AhdI de

4.9 kpb en estas cepas recombinantes, sin embargo, lo que indica que el gen als mutante, recombinante se había recombinado con el gen als nativo por medio de recombinación homóloga de entrecruzamiento doble.

También se observó que se producía recombinación homóloga de entrecruzamiento único en cepas recombinantes transformadas con pMON50202. En estos casos, se marcaron los fragmentos de SsgI tanto de 1,76 kpb como de 0,75 kpb en las transferencias de tipo Southern de ADN de las cepas recombinantes, pero el fragmento de AhdI de

4.9 kpb se reemplazó por fragmentos marcados mayores, lo que indica que todo el vector pMON50202 se había insertado en el gen als nativo, o bien como una única copia o bien como repeticiones en tándem.

Las evidencias adicionales de la recombinación homóloga en Schizochytrium se obtuvieron la introducción de moléculas de ADN recombinante que contenían un gen als truncado, mutante de manera que la enzima ALS incompleta codificada por el gen truncado no era funcional. Este gen truncado se produjo mediante digestión de pMON50202 con ClaI y HindIII para producir un fragmento de 2,8 kpb, eliminando de ese modo los últimos 388 pb de la secuencia codificante de als en combinación con la región terminadora de als. Este fragmento de 2,8 kpb se ligó en pBluescriptII KS+ (Stratagene Corp., La Jolla, CA) que se había digerido con ClaI y HindIII, produciendo el plásmido pAR2. Se esperaría que el plásmido pAR2 solo confiriese resistencia a SMM en células de Schizochytrium transformadas si se restauraba un gen als funcional, mutante en cepas transformadas por medio de recombinación homóloga entre el gen als nativo y el gen als truncado mutante presente en pAR2. Esta construcción se introdujo en células N230D de Schizochytrium mediante bombardeo de partículas, y se aislaron cepas resistentes a SMM tal como se describe en el Ejemplo 3. El análisis de transferencia de tipo Southern de ADN digerido con SsgI de los transformantes, llevado a cabo tal como se al escrito anteriormente en este ejemplo, indicó que se había producido claramente recombinación homóloga en estas cepas; es decir, un fragmento de SsgI de 1,76 kpb se hibridó con la sonda ALS 1 en células no recombinantes, pero éste se reemplazó por un fragmento de hibridación de 0,75 kpb en células que se habían transformado con pAR2.

Ejemplo 7

Este ejemplo describe el uso del vector de transformación pTUBZEO11-2 o pMON50202 para producir por medio de cotransformación cepas que contenían moléculas de ADN extraño adicionales que no se unían a un gen marcador seleccionable.

La cotransformación se consiguió mediante la introducción simultánea de pTUBZEO11-2 y un plásmido adicional que contenía cualquiera de varios genes. Los plásmidos se coprecipitaron sobre las partículas de oro tal como se ha descrito en el Ejemplo 3, usando 2,5 |jg de cada plásmido. Después del bombardeo de células diana con las partículas de oro recubiertas con plásmidos, las cepas recombinantes se seleccionaron sobre placas de agar que contenían Zeocin™ como se ha descrito en el Ejemplo 1. La presencia del segundo plásmido, no seleccionado se confirmó a continuación mediante análisis de PCR o mediante hibridación de transferencia de tipo Southern. Normalmente se lograban unas frecuencias de cotransformación muy elevadas (por ejemplo, 50-90 %). Por ejemplo,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

el plásmido pTR202, que contiene el gen fat-1 de Caenorhabditus elegans (Spychalla et al., 1997. Proc. Natl. Acad. Set U. S. A. 94, 1142-1147) unido al promotor y terminador del gen de tubulina de Schizochytrium, se introdujo se introdujo por medio del método que se proporciona en este ejemplo, y mediante PCR se mostró que aproximadamente un 68 % de las cepas resistentes a Zeocin™ resultantes contenían el gen fat-1 (Véase la Tabla 1). Se observan resultados similares cuando se introdujeron conjuntamente pMON50202 y un plásmido adicional, seguido por selección de células transformadas en medio sólido que contenía SMM. Este método de cotransformación se puede usar para introducir cualquier ADN extraño deseado.

Tabla 1. Eficacias de cotransformación usando el plásmido marcador seleccionable pTubZeO11-2 y plásmidos que contienen diversos genes fad. Los transformantes resistentes a ZeocinR se identificaron sistemáticamente para

secuencias de ADN de fad mediante PCR.

Gen fad introducido

N.° de cepas que contienen gen fad gene N.° de cepas de ZeocinR sometidas a ensayo Eficacia de cotransformación

syn_fat1

17/25 68 %

nat_fat1

24/25 96 %

mut_fat1

21/25 84 %

desB

20/25 80 %

Los sistemas de transformación y se describen en estos ejemplos representan un avance significativo en la capacidad para manipular genéticamente Schizochytrium, que es el organismo más productivo conocido para la producción fermentativa de compuestos a base de lípidos. La disponibilidad de dos sistemas de transformación independientes, junto con las altas eficacias de transformación que se producen, deben permitir el apilamiento de múltiples rasgos en cepas modificadas por ingeniería genética. Además, la presencia aparente de recombinación homóloga en esta microalga debe permitir el desarrollo de procedimientos de desactivación génica con el fin de identificar las funciones de genes desconocidos y eliminar rasgos no deseables en cepas de producción. Los presentes inventores están usando en la actualidad estos sistemas para alterar el metabolismo de ácidos grasos en Schizochytrium, y están explorando posibilidades para usa esta especie y microalgas relacionadas (por ejemplo, Thraustochytrium) para la producción de carotenoides, esteroles y otros compuestos lipídicos.

Aunque se han descrito diversas realizaciones de la presente invención en detalle, para los expertos en la materia es evidente que se producirán modificaciones y adaptaciones de dichas realizaciones. De forma expresa se debe entender, sin embargo, que tales modificaciones y adaptaciones están dentro del alcance de la presente invención, tal como se expone en las reivindicaciones que siguen a continuación.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Roessler, Paul Matthews, T. Dave Ramseier, Tom Metz, James

<120> Producto y Proceso para Transformación de Microorganismos de Thraustochytriales

<130> 2997-23-PCT

<150> 60/284.116 <151>

<160> 35

<170> PatentIn versión 3.1

<210> 1 <211> 551 <212> ADN

<213> Schizochytrium sp.

<220>

<221> misc_feature <222> (520)..(520)

<223> n = a, c, g o t

5

10

15

20

25

30

35

40

<220>

<221> misc_feature <222> (541)..(541) <223> n = a, c, g o t

<400> 1

gtcgtgccta tccttcaagt tgaggtcatc gctctactgc tggcggcggc gccccgcgcc ctaccgcgct ctacgctcgt ccgcaagctc nggtggtacc

acaacacgcc

ttatctctct

tccatccaca

ctcgagcatg

gatgatgcct

gtgctcgtcg

ctttaccacc

ggccactaca

gccgacaact

g

gttctacccc

agttcaactt

tcggccaggc

gcatccagcc

tcaacacctt

atctcgagcc

ccgagcagat

ccatcggcaa

gcactggtct

gccttcttcg

caagaagaac

cggfcgttcag

ggacggccag

cttctccgag

caccgtctgt

catcaccggc

ggagatcgtc

tcagggcttn

cgccccttcg

cgtccaagca 60

aacaccacca

acaagatgcg 120

gtcggtaacg

cctgctggga 180

atgccctcgg

acaagaccat 240

actggcgccg

gcaagcacgt 300

gacgaggtcc

gcaccggcac 360

aaggaggacg

ctgccaacaa 420

gacctcgtcc

tcgaccgcat 480

ctctgcttca

acgccgtcgg 540

551

<210> 2 <211> 27 <212> ADN

<213> Schizochytrium sp.

<400>2

gcgccagtct cggagaagaa ggtgttg 27

<210> 3 <211> 27 <212> ADN

<213> Schizochytrium sp.

<400>3

agctcccagc aggcgttacc gacctga 27

<210> 4 <211> 725 <212> ADN

<213> Schizochytrium sp.

<400> 4

acattaattt SO

gtctcttcac 120

ttggagcaac 180

cgctgtccaa 240

cccactgacc 300

tcatgccact 360

gcggcaacgg 420

acaaatagag 480

gagcggcgcg 540

cccgaatcag 600

cgccccttcg 660

aacaccacca 720

725

<400>5

cacccatggt gttggtggtg ttgt 24

gagacgtgct tcgcaagacc gctgtgctcg cgccgcacgc tctgtgtgtt ttttgtagat gaagtttctc tattctctcg aaattctgta gaatgttata tcccgtgatt ggagaggatt cttgcttgtt.ccctcccgcc cgggtagcgc gcttgagcgc gcgctcgaaa gcggacggcg caacgagccg tttcacgccg gtcccatttt tctccttacc ccatggccgt tgcatgccaa ttttaggccc gaggtctgtc gataatccac ttttccattg atcttccagg tttcgttaac gagcaaaact tcggtctttc ctaacaaaag ctctcctcac aaagcatggc acgtgtcctc atactccact gccacacaag gtcgataaac taagctcctc gagaattcca ctgacaactg aaaacaatgt atgagagacg atcaccactg gcggttgggc gcggaggtcg gcagcaaaaa caagcgactc gccgagcaaa ccttcagacg gtcgtgccta acaacacgcc gttctacccc gccttcttcg cgtccaagca tccttcaagt ttatctctct agttcaactt caagaagaac acaag

<210>5 <211> 24 <212> ADN

<213> Schizochytrium sp.

10

15

<210>6

<211> 24

<212> ADN

<213> Schizochytrium sp.

<400>6

aaactcgaga cgtgcttcgc aaga 24

<210>7

<211> 4646

<212> ADN

<213> Schizochytrium sp.

<400>7

aaactcgaga cgtgcttcgc aagaccgctg tgctcgcgcc gcacgctctg taattttttt gtagatgaag tttctctatt ctctcgaaat tctgtagaat cttcactccc gtgattggag aggattcttg cttgttccct cccgcccggg agcaacgctt gagcgcgcgc tcgaaagcgg acggcgcaac gagccgtttc gtccaagtcc catttttctc cttaccccat ggccgttgca tgccaatttt ctgaccgagg tctgtcgata atccactttt ccattgatct tccaggtttc gccactgagc aaaacttcgg tctttcctaa caaaagctct cctcacaaag caacggacgt gtcctcatac tccactgcca cacaaggtcg ataaactaag atagaggaga attccactga caactgaaaa caatgtatga gagacgatca ggcgcggcgg ttgggcgcgg aggtcggcag caaaaacaag cgactcgcqg aatcagcctt cagacggtcg tgcctaacaa cacgccgttc taccccgcct ccttcgcgtc caagcatcct tcaagtttat ctctctagtt caacttcaag ccaccaacac catgggtgaa gggcgaattc tgcagatatc catcacactg gagcatgcat ctagagggcc caattcgccc tatagtgagt cgtattacaa gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac cctggcgtta cccaacttaa gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc

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tagcgcttgg

acgccgcgct

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gttaactcat

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ccactggagc

agcaaacccg

tcttcgcgcc

aagaacaaca

gcggccgctc

ttcactggcc

tcgccttgca

tcgcccttcc

attaagcgcg

60

120

180

240

300

360

420

480

340

600

660

720

780

840

900

960

1020

Claims (9)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   1. Un método para producción de una proteína, que comprende: cultivar un microorganismo recombinante del Orden Thraustochytriales en un medio, en el que el microorganismo recombinante comprende una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un gen extraño que codifica la proteína, para producir la proteína; y recuperar la proteína.
2. 2. El método de la reivindicación 1, en el que la molécula de ácido nucleico aislada comprende adicionalmente una o más secuencias de control de transcripción y el gen extraño está unido de forma operativa a la una o más secuencias de control de transcripción.
3. 3. El método de la reivindicación 2, en el que la una o más secuencias de control de transcripción comprenden una secuencia de control de transcripción de Thraustochytriales seleccionada entre el grupo que consiste en secuencias de promotor de Thraustochytriales, secuencias de amplificación de Thraustochytriales, secuencias de operador de Thraustochytriales, secuencias de represor de Thraustochytriales, y combinaciones de las mismas.
4. 4. El método de la reivindicación 3, en el que al menos una secuencia de control de transcripción de Thraustochytriales es una secuencia de promotor de Thraustochytriales seleccionada entre el grupo que consiste en una secuencia de promotor de acetolactato sintasa de Thraustochytriales, secuencia de promotor de a-tubulina de Thraustochytriales, secuencia de promotor de sistema de policétido sintasa de Thraustochytriales, y secuencia de promotor de ácido graso desaturasa de Thraustochytriales.
5. 5. El método de cualquier reivindicación precedente, en el que la molécula de ácido nucleico aislada comprende adicionalmente una secuencia de segmento de señal de ácido nucleico.
6. 6. El método de cualquier reivindicación precedente, en el que la proteína se secreta en el medio, y en el que la proteína se recupera del medio.
7. 7. El método de cualquier reivindicación precedente, en el que el microorganismo es de un género seleccionado entre el grupo que consiste en Thraustochytrium, Labyrinthuloides, Japonochytrium, y Schizochytrium.
8. 8. Un método para producción de una proteína, que comprende:

   cultivar un microorganismo recombinante del Orden Thraustochytriales en un medio, en el que el microorganismo recombinante comprende una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un gen extraño que codifica la proteína, para producir la proteína; y extraer el microorganismo que comprende la proteína.
9. 9. El método de la reivindicación 8, en el que el microorganismo se extrae como una biomasa.

   O) co

   imagen1

   imagen2

   imagen3

   imagen4

   FfG. 1

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   Digerir con Sph!

   imagen6

   Ncól

   SpU I Sph\

   FIG.2

   imagen7

   F1G. 3A

   imagen8

   imagen9

   imagen10