ES2698473T3 - Promotor y procedimiento para la transformación de microorganismos Traustoquitriales - Google Patents

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Abstract

Molécula aislada de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en: a. SEC ID nº 4; b. nucleótidos 441 a 894 de SEC ID nº 9; c. una secuencia de ácidos nucleicos que es por lo menos aproximadamente 95% idéntica a los nucleótidos 441 a 894 de la SEC ID nº 9 a lo largo de la longitud completa de los nucleótidos 441 a 894 de la SEC ID nº 9, en la que dicha secuencia de ácidos nucleicos presenta una actividad transcripcional por lo menos basal del promotor α-tubulina, y d. un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que es totalmente complementaria a dicho polinucleótido de (a), (b) o (c).

Description

DESCRIPCIÓN
Promotor y procedimiento para la transformación de microorganismos T raustoquitriales
Campo de la invención
La presente invención se refiere de manera general a una molécula aislada de ácidos nucleicos codificante de una acetolactato sintasa de Traustoquitriales, incluyendo acetolactato sintasas que proporcionan una sensibilidad reducida a compuestos de sulfonilurea, inhibidores de clase imidazolinona y/o oxibenzoatos de pirmidinilo, en microorganismos del orden Traustoquitriales; a moléculas de ácidos nucleicos que comprenden marcadores seleccionables útiles para la transformación de microorganismos del orden Traustoquitriales y a métodos de transformación de dichos microorganismos utilizando moléculas de ácidos nucleicos recombinantes de la presente invención. La presente invención se refiere además a promotores génicos útiles en los sistemas de expresión de los Traustoquitriales. Las moléculas de ácidos nucleicos recombinantes de la presente invención pueden utilizarse para la expresión de ácidos nucleicos foráneos en un microorganismo Traustoquitriales, así como para la deleción, mutación o inactivación de genes en microorganismos Traustoquitriales.
Antecedentes de la invención
Los desarrollos han resultado en una revisión de la taxonomía de los traustoquitridios. Algunos taxónomos teóricos sitúan los traustoquitridios en el grupo de las algas o de los protistas similares a algas. Sin embargo, debido a la incertidumbre taxonómica, sería mejor para los fines de la presente invención considerar las cepas indicadas en la presente invención como traustoquitridios (Orden: Traustoquitriales; Familia: Thraustochytriaceae; Género: Thraustochytrium, Schizochytrium, Labyrinthuloides, o Japonochytrium). Los cambios de taxonomía se resumen a continuación.
Las cepas de determinados microorganismos unicelulares dados a conocer y reivindicados en la presente memoria son miembros del orden Traustoquitriales. Los traustoquitridios son eucariotas marinos con una historia taxonómica problemática. Se proporciona una revisión de los problemas de posicionamiento taxonómico de los traustoquitridios en Moss (1986), Bahnweb y Jackie (1986) y Chamberlain y Moss (1988).
Por conveniencia, inicialmente los taxónomos situaron a los traustoquitridios junto con otros eucariotas zoospóricos incoloros dentro de los Ficomicetos (hongos similares a algas). Sin embargo, el nombre Ficomicetos eventualmente perdió su estatus taxonómico y los traustoquitridios se incluyeron en los Oomicetos (hongos zoospóricos biflagelados). Inicialmente se supuso que los Oomicetos estaban relacionados con las algas heterocontas y eventualmente un amplio abanico de estudios ultraestructurales y bioquímicos, resumidos por Barr (1983), apoyan esta premisa. De hecho, los Oomicetos han sido aceptados por Leedale (1974) y otros ficólogos como parte de las algas heterocontas. Sin embargo, por razones de conveniencia resultante de su naturaleza heterotrófica, los Oomicetos y los traustoquitridios han sido estudiados en gran parte por micólogos (científicos que estudian los hongos) y no por ficólogos (científicos que estudian las algas).
Desde otra perspectiva taxonómica, los biólogos evolutivos han desarrollado dos escuelas generales de pensamiento sobre cómo han evolucionado los eucariotas. Una teoría propone un origen exógeno de orgánulos unidos a membranas mediante una serie de endosimbiosis (Margulis, 1970); p.ej., las mitocondrias se habrían derivado de endosimbiontes bacterianos; los cloroplastos, de cianofitos, y los flagelos, de espiroquetas. Otra teoría sugiere una evolución gradual de los orgánulos unidos a membranas a partir de sistemas no unidos a membranas del ancestro procariota mediante un proceso autógeno (Cavalier-Smith, 1975). Sin embargo, ambos grupos de biólogos evolutivos han eliminado los Oomicetos y los traustoquitridios de los hongos y los sitúan en las algas cromófitas en el reino de los Chromophyta (Cavalier-Smith, 1981) (este reino recientemente se ha expandido para incluir otros protistas y los miembros de este reino ahora se denominan Stramenopiles) o con todas las algas en el reino Protista (Margulis y Sagan, 1985).
Con el desarrollo de la microscopía electrónica, algunos estudios sobre la ultraestructura de las zoosporas de dos géneros de traustoquitridios, Thrautochytrium y Schizochytrium (Perkins, 1976; Kazama, 1980; Barr, 1981) han proporcionado evidencia firme de que Thraustochytriaceae se relaciona sólo distantemente a los Oomicetos. Además, los datos genéticos de un análisis de correspondencias (una forma de estadística multivariante) de las secuencias de ARN ribosómico 5S indican que los Traustoquitriales son claramente un grupo único de los eucariotas, completamente separado de los hongos, y más estrechamente relacionado con las algas rojas y pardas y con miembros de los Oomicetos (Mannella et al., 1987). La mayoría de taxónomos ha acordado eliminar los traustoquitridios de los Oomicetos (Bartnicki-García, 1988).
En resumen, utilizando el sistema taxonómico de Cavalier-Smith (1981, 1983), los traustoquitridios se clasifican con las algas cromófitas en el reino Chromophyta (Stramenopiles). Esto las sitúa en un reino completamente diferente de los hongos, que están dentro del reino Eufungi. Por lo tanto, la posición taxonómica de los traustoquitridios se resume a continuación:
Reino: Chromophyta (Stramenopiles)
Filo: Heterokonta
Orden: Thraustochytrales
Familia: Thraustochytriaceae
Género: Thraustochytrium, Schizochytrium, Labyrinthuloides, o Japonochytrium
Algunos de los primeros taxónomos separaron unos cuantos miembros originales del género Thraustochytrium (aquellos con un estadio vital ameboide) en un género separado llamado Ulkenia. Sin embargo, ahora se conoce que la mayoría, si no todos, los traustoquitridios (incluyendo Thraustochytrium y Schizochytrium) muestran estadios ameboides y, como tales, Ulkenia no es considerado por algunos un género válido. Tal como se utiliza en la presente memoria, el género Thraustochytrium incluirá Ulkenia.
A pesar de la incertidumbre en las posiciones taxonómicas dentro de las clasificaciones superiores de Filo y Reino, los traustoquitridios siguen siendo un grupo claramente diferenciado y característico cuyos miembros siguen siendo clasificables dentro del orden Traustoquitriales.
Schizochytrium y otros microorganismos traustoquitriales presentan un valor comercial real y potencial sustancial debido a su capacidad de producir grandes cantidades de compuestos lipoides, incluyendo ácidos grasos altamente insaturados (HDEA, por sus siglas en inglés) y diversos carotenoides (p.ej., astaxantina). Los ácidos grasos altamente insaturados omega-3 son de interés comercial significativo en el aspecto de que recientemente se han reconocido como importantes compuestos en la dieta para prevenir la arteriesclerosis y la enfermedad cardiaca coronaria, para aliviar condiciones inflamatorias y para retrasar el crecimiento de las células tumorales. Estos efectos beneficiosos son el resultado tanto de que los HUPA omega-3 causan inhibición competitiva de compuestos producidos a partir de ácidos grasos omega-6 como de los compuestos beneficiosos producidos directamente a partir de los HUFA omega-3 mismos (Simopoulos et al., 1986). Los ácidos grasos omega-6 son los HUFA predominantes observados en plantas y animales. Por lo tanto, el desarrollo ulterior de los microorganismos Traustoquitriales como organismos de producción comerciales se beneficiará significativamente de la capacidad de producir cambios genéticos específicos en los organismos mediante tecnología de DNA recombinante, incluyendo la potenciación de la producción de los altamente valiosos HUFA y carotenoides por dichos organismos. Además, la capacidad de obtener una mejor comprensión de la bioquímica y biología molecular de este poco caracterizado grupo de organismos proporcionará información valiosa que puede utilizarse para guiar futuros esfuerzos de desarrollo de cepas. Sin embargo, anteriormente a la presente invención, no se disponía de métodos y constructos recombinantes adecuados para transformar traustoquitridios, incluyendo miembros de los géneros Schizochytitrium y Thraustochytrium. Resulta importante que el desarrollo de marcadores seleccionables que resultan particularmente útiles para transformar organismos Traustoquitriales y la identificación de secuencias de promotor específicas de Traustoquitriales no se encontraban disponibles antes de la presente invención.
Se propuso Schizochytrium como huésped recombinante en la patente US n° 6.194.167 y en el documento n° WO 98/46763 se describe la identificación de desaturasas en Schizochytrium.
Investigadores anteriores han descrito métodos de transformación y reactivos para la utilización en diversos microorganismos, incluyendo en microalgas que no pertenecen al orden Thranstochytriales. La patente US n° 6.027.900 de Allnutt et al. da a conocer fusiones genéticas para la utilización en ingeniería genética de algas eucarióticas, y particularmente, Phaeodactylum tricornuium, utilizando un promotor para un gen fotosintético algal recolector de luz y el gen Sh ble de Streptoalloteichus hindustanus como marcador seleccionable. Las células se cultivan a altas concentraciones de sal (p.ej., 10 a 35 g/l) y Zeocin™ para la selección de transformantes. Las células microalgales adecuadas para la transformación utilizando dicho método son microalgas fotosintéticas que pueden cultivarse bajo condiciones de alta salinidad. La patente US n° 5.661.017 de Dunahay et al. da a conocer un método para transformar algas que contienen clorofila C (p.ej., diatomeas) utilizando un constructo recombinante que comprende un marcador seleccionable operablemente ligado a una secuencia de control regulador adecuada para la expresión del marcador en las algas que contienen clorofila C. El marcador seleccionable se da a conocer como cualquier marcador adecuado, incluyendo marcadores aislados a partir de fuentes bacterianas y fúngicas, y preferentemente es la neomicina fosfotransferasa. La secuencia de control reguladora puede incluir cualquier secuencia reguladora derivada de un alga que contiene clorofila C y, preferentemente, de Cyclotella cryptica (p.ej., una secuencia reguladora de acetil-CoA carboxilasa de C. cryptica).
Sin embargo, dichos métodos no son fácilmente transferibles a la transformación de microorganismos T raustoquitriales debido a que, antes de la presente invención, la transformación de microorganismos tales como los Traustoquitriales (p.ej., microalgas) distaba de ser rutinaria. Los marcadores y sistemas de transformación que están bien desarrollados para bacterias y levaduras no son necesariamente fáciles de adaptar a otros microorganismos. En efecto, la patente US n° 5.661.017 observa que "se ha tenido poco éxito en el desarrollo de sistemas de transformación para microalgas eucarióticas" (col. 1, líneas 49 a 51), lo que se debe en parte a la dificultad de introducción de ADN foráneo en dichos microorganismos, y en parte debido a la falta de marcadores y vectores adecuados para la utilización en dicha transformación. El sistema descrito en la patente US n° 5.661.017 se desarrolló específicamente para las algas que contienen clorofila C debido a que sus inventores creían que eran susceptibles de transformación genética, en particular en comparación con otras algas. De manera similar, la patente US n° 6.027.900, que enseña un método de transformación que es específico de las microalgas fotosintéticas, apoya que la mayoría de las algas son refractarias a cualquier tipo de manipulación genética (col. 1, líneas 39 a 47). Los sistemas adaptados para bacterias, levaduras, y células de insecto y animales no se han adaptado con facilidad a las microalgas. Por lo tanto, anteriormente a la presente invención, todavía existía una necesidad en la técnica de sistemas de transformación eficaces y métodos que sean específicos para las microalgas.
Además, aunque el orden Traustoquitriales ahora se agrupa con las algas cromófitas en el grupo Stramenopiles, todavía hay autores que defienden la opinión de que estos microorganismos son bastante diferentes a la mayoría de microalgas y algunos de estos expertos en la materia cree que miembros del orden Traustoquitriales podrían no ser clasificables en absoluto como microalgas. Los microorganismos considerados microalgas han evolucionado por lo menos cuatro veces separadas durante la evolución, conduciendo a que los microorganismos de tipo "microalgal" se sitúen en diferentes reinos (p.ej., las algas rojas, las algas verdes y las algas doradas (Chromophyta) se encuentran todas en reinos separados). Como resultado, los sistemas de transformación que se ha demostrado que resultan útiles en otras microalgas no se espera que resulten útiles para los T raustoquitriales. Por lo tanto, a pesar del valor comercial de los microorganismos Traustoquitriales, la capacidad de aprovechar todo el potencial de dichos microorganismos mediante ingeniería genética no se ha alcanzado todavía. Antes de la presente invención, los presentes inventores no conocían ningún promotor, marcador seleccionable o vector útil para la transformación de los microorganismos Traustoquitriales ni se disponía de ningún conocimiento sobre qué sistemas de selección podían utilizarse con, o adaptarse a, los Traustoquitriales.
En resumen, existe una necesidad en la técnica de desarrollar métodos para transformar microorganismos Traustoquitriales, proporcionando de esta manera un medio para crear cepas de valor comercial incrementado. Además, existe una necesidad en la técnica de desarrollar métodos para la mutación o inactivación de genes específicos mediante recombinación homóloga o no homóloga en microorganismos Traustoquitriales, proporcionando una nueva manera de alterar el metabolismo celular y de identificar las funciones de genes específicos en los Traustoquitriales.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona una molécula aislada de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en:
a. SEC ID n° 4:
b. nucleótidos 441 a 894 de SEC ID n° 9;
c. una secuencia de ácidos nucleicos que es por lo menos aproximadamente 95% idéntica a los nucleótidos 441 a 894 de la SEC ID n° 9 a lo largo de la longitud completa de los nucleótidos 441 a 894 de la SEC ID n° 9, en la que dicha secuencia de ácidos nucleicos presenta una actividad transcripcional por lo menos basal del promotor a-tubulina, y
d. un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que es totalmente complementaria a dicho polinucleótido de (a), (b) o (c).
La invención proporciona además un vector recombinante para la transformación de microorganismos del Orden T raustoquitriales, que comprende una secuencia de ácidos nucleicos codificante de una proteína de unión a bleomicina operablemente ligada a un promotor a-tubulina de T raustoquitriales que comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en los nucleótidos 441 a 894 de la SEC ID n° 9, y una secuencia de ácidos nucleicos que es por lo menos aproximadamente 95% idéntica a los nucleótidos 441 a 894 de la SEC ID n° 9 a lo largo de la longitud completa de los nucleótidos 441 a 894 de la SEC ID n° 9, en la que dicha secuencia de ácidos nucleicos presenta una actividad transcripcional por lo menos basal del promotor a-tubulina.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 ilustra la construcción del plásmido recombinante pTUBZEO-11.
La FIG. 2 ilustra la construcción del plásmido recombinante pTUBZEO11-2.
La FIG. 3A ilustra el plásmido recombinante pMON50200.
La FIG. 3B ilustra el plásmido recombinante pMON50201.
La FIG. 3C ilustra el plásmido recombinante pMON50202.
La FIG. 3D ilustra el plásmido recombinante pMON50203.
Descripción detallada de la invención
La presente invención comprende métodos y materiales relacionados para transformar genéticamente microorganismos del orden Traustoquitriales. Específicamente, la invención proporciona una molécula aislada de ácidos nucleicos tal como se define en la reivindicación 1 y un vector recombinante tal como se define en la reivindicación 2. Todas las cepas de microorganismos unicelulares dadas a conocer en la presente memoria para la utilización como transformante de los constructos recombinantes de la presente invención, que también pueden denominarse generalmente traustoquitridios, son miembros del orden Traustoquitriales. Según la presente invención, las expresiones "traustoquitridio", "microorganismo Traustoquitriales" y "microorganismo del orden Traustoquitriales" pueden utilizarse intercambiablemente. Los presentes inventores no conocen ningún informe anterior que describa un sistema de transformación para Schizochytrium o cualquier otro microorganismo Traustoquitriales. Los sistemas de transformación descritos en la presente memoria pueden utilizarse para introducir genes foráneos en microorganismos del orden Traustoquitriales, proporcionando de esta manera un medio para crear cepas con un valor comercial incrementado. Además, la presente invención permite la mutación o inactivación de genes específicos mediante recombinación homóloga o no homóloga, proporcionando una nueva manera de alterar el metabolismo celular y de identificar las funciones de genes específicos en los microorganismos Traustoquitriales.
Más específicamente, los presentes inventores han demostrado la transformación genética de un microorganismo Traustoquitriales del género Schizochytrium {Orden, Traustoquitriales; Familia: Thraustochytriaceae; Género: Schizochytrium), mediante la utilización de dos tipos de vectores de transformación. Estos vectores pueden introducirse en las células mediante métodos estándares, seguido de la identificación y aislamiento de células recombinantes basándose en su capacidad de crecer en presencia de compuestos selectivos. Los presentes inventores han demostrado la eficacia de estos vectores mediante la introducción de los mismos mediante bombardeo de partículas, aunque también pueden utilizarse y se conocen en la técnica otros medios para introducir los vectores (p.ej., electroporación) y se pretende que se encuentren comprendidos en la presente invención.
Para un vector de transformación, ejemplificado en la presente memoria mediante el vector recombinante denominado pTUBZEO11-2, se creó un gen quimérico en el que el gen ble (que codifica una "proteína de unión a bleomicina") de Streptoalloteichus hindustanus se introdujo cadena abajo de un promotor del gen de tubulina de Schizochytrium. Se introdujo un terminador de SV40 cadena abajo del gen ble en este constructo. Este vector permite la expresión del gen ble en Schizochytrium, proporcionando de esta manera resistencia a Zeocin™ y compuestos relacionados, que resultan tóxicos para las células de tipo salvaje al incluirlas en el medio de crecimiento a niveles apropiados. La fuente del gen ble y del terminador de SV40 en este constructo fue un vector disponible comercialmente denominado pSV40/Zeo, que se obtuvo de Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA) (manual técnico 180202, VersionB, "ZeoCassette Vectors", Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA 92008). Se aisló el promotor del gen de tubulina mediante la reacción en cadena de la polimerasa; uno de los cebadores utilizados para la reacción se basaba en los datos de secuencia obtenidos mediante un proyecto aleatorio de secuenciación de ADNc de Schizochytrium. Se muestra el mapa de pTUBZE011-2 en la fig. 2 y la secuencia de nucleótidos de pTUBZEO11-2 se representa mediante SEC ID n° 9. La transformación de Schizochytrium con este vector se confirmó mediante la utilización de la reacción en cadena de la polimerasa y análisis de transferencia southern para detectar la presencia de secuencias de vector integradas en el genoma de Schizochytrium.
El gen ble ha sido utilizado por investigadores anteriores como marcador seleccionable para la transformación genética de una diversidad de organismos, incluyendo bacterias, microalgas no traustoquítridas, hongos, protozoos, plantas y células animales (ver, por ejemplo, la patente US n° 6.027.900; Lumbreras et al., Plant J. 14:441-447, 1998; Rohe et al., Curr. Genet. 29:587-590, 1996; Messina et al., Gene 165:213-217, 1995; Guerrero et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 36:759-762, 1992; Pérez et al., Plant Mol. Biol. 13:365-373, 1989; Gatigno et al., Gene 91:35-41, 1990). El gen ble codifica una "proteína de unión a bleomicina" que proporciona resistencia a varios antibióticos, incluyendo bleomicina, fleomicina y Zeocin™ (Drocourt et al., Nucleic Acids Res. 18:4009, 1990). Este gen se encuentra disponible comercialmente de Invitrogen Corporation, que era la fuente del gen que los presentes inventores utilizaron para crear el vector de transformación de Schizochytrium, pTUBZBO11-2. Sin embargo, los presentes inventores se cree que son los primeros en producir un vector de transformación en el que el gen ble se encuentra unido a un promotor de traustoquitridio de una manera que permite la expresión del gen en los traustoquitridios.
Se creó un segundo juego de vectores de transformación mediante mutagénesis dirigida a sitio in vitro de un gen de acetolactato sintasa (als) que los presentes inventores aislaron a partir de una biblioteca genómica de Schizochytrium. Estas mutaciones cambian la secuencia de aminoácidos del enzima codificado (ALS) de manera que es mucho menos sensible al sulfometurón metilo y otros compuestos sulfonilurea, así como los inhibidores de la clase imidazolinona y los oxibenzoatos de pirimidinilo, a los que son sensibles los microorganismos del orden Traustoquitriales. Los compuestos sulfonilurea, tales como el sulfometurón-metilo (SMM) con frecuencia resultan tóxicos para las células debido a que son capaces de unirse e inactivar el enzima acetolactato sintasa (ALS) de una diversidad de organismos. ALS cataliza la primera etapa en la biosíntesis de los aminoácidos valina, leucina e isoleucina, las imidazolinonas, las triazolopirimidinas y otros compuestos también se ha demostrado que se unen e inactivan ALS de determinados organismos. Anteriormente se han utilizado formas mutantes de genes que codifican la acetolactato sintasa (también conocida como acetohidroxi ácido sintasa) de otros organismos a modo de marcadores seleccionables para la transformación de levadura y plantas (Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 40:441-470, 1989). Sin embargo, no hay informes anteriores a la presente invención que describan la secuencia o propiedades del gen als de Schizochytrium o cualquier otro miembro de los Traustoquitriales, o la utilización de genes als de Traustoquitriales mutantes para proporcionar resistencia a compuestos de sulfonilurea, imidazolinona u oxibenzoato de pirimidinilo. De hecho, según el conocimiento de los presentes inventores, no se ha producido ningún informe publicado con respecto a la sensibilidad de los microorganismos Traustoquitriales a estos agentes selectivos, incluyendo el sulfometurónmetilo y, por lo tanto, no es conocido de antes de la presente invención si resultaría ni siquiera posible utilizar dicho marcador seleccionable en un sistema de transformación de traustoquítridio. Cabe destacar que los genes con homología sustancial a genes als conocidos se observan en diversos organismos, pero no codifican enzimas que son capaces de catalizar la síntesis de acetolactato (Biochimica et Biophysica Acta 1385:401-419, 1998). Por lo tanto, no habría resultado evidente que un homólogo de als clonado de hecho codifica ALS. Con el fin de determinar definitivamente si el gen de Schizochytrium clonado era un gen als verdadero, los presentes inventores demostraron, mediante experimentos de transformación, una correlación positiva entre la resistencia a sulfometurón-metilo y la expresión del gen als putativo de Schizochytrium mutado.
Los presentes inventores han producido tres vectores de transformación diferentes que contienen genes als mutantes: un gen als mutante codifica un enzima con una valina en la posición 595 en lugar de un triptófano (plásmido pMON50201 o ALSmut1-7), otro codifica una glutamina en la posición 192 en lugar de una prolina (plásmido pMON50202, o ALSmut2-2), y una tercera forma contiene ambas mutaciones (plásmido pMON50203, o ALSmut3-5). En estos vectores, la expresión de los genes als mutantes recombinantes se encuentra bajo el control del promotor y terminador del gen als nativo. Los mapas de estos vectores, junto con un vector que contiene el gen als de Schizochytrium de tipo salvaje (plásmido pMON50200, o AE-5) se muestran en las figs. 3A-3D. La transformación de Schizochytrium con estos vectores codificantes de ALS mutantes mediante la utilización de la reacción en cadena de la polimerasa y análisis de transferencia southern para detectar la presencia de secuencias de vector integradas en el genoma de Schizochytrium. Tal como se indica en detalle posteriormente, ahora que los presentes inventores han identificado la secuencia completa del gen als, también pueden generarse otras mutaciones, especificadas posteriormente.
Se han utilizado sistemas de transformación para introducir genes foráneos en las células de los Traustoquitriales mediante cotransformación. Se describen genes foráneos que se sitúan entre diversos promotores de Schizochytrium y un terminador apropiado (p.ej., SV40 o una región de terminador génico de Schizochytrium). Se describe un gen sintético que codifica una ácido-graso w-3 desaturasa del nemátodo Caenorhabditis elegans, representado en la presente memoria mediante SEC ID n° 29, para incrementar los niveles de ácido docosahexanoico en la SEC ID n° 30 de Schizochytrium que representa la secuencia de aminoácidos de la desaturasa codificada por la SEC ID n° 29. También pueden introducirse casetes de expresión que contienen genes foráneos en células de Traustoquitriales mediante inclusión directa dentro del vector de transformación que contiene el marcador seleccionable.
Además, los presentes inventores también han demostrado con los vectores codificantes de ALS mutante que se produce la recombinación homóloga en Schizochytrium, indicando la viabilidad de la utilización de medios recombinantes para inactivar o mutar genes de Schizochytrium nativos específicos.
Con respecto a las secuencias de promotor de los Traustoquitriales descritas en la presente memoria, una búsqueda en una base de datos de secuencias (GenBank) de todas las secuencias de nucleótidos y proteínas informadas de miembros del orden Traustoquitriales, indica que, en el momento de la presente invención, no se han publicado secuencias de promotor de Schizochytrium o de cualquier otro miembro de los Traustoquitriales. El único gen que ha sido informado de cualquier especie de Schizochytrium es del ARN ribosómico 5S de S. aggregatum (GenBank n° de acceso X06104 y M13616). Se ha informado de las secuencias de ARN ribosómico 5S y 18S de los miembros de los Thrastochytriales, especie Ulkenia y géneros Labyrinthuloides y Thraustochytrium, aunque ello no tiene consecuencias sobre la presente invención. Se ha descrito una región codificante parcial de un gen de "ARN polimerasa de tipo T3/T7 putativa" de Thraustochytrium aureum (Nucleic Acids Research 15:648-654, 1996), pero no se ha descrito una secuencia de promotor para este gen.
La presente invención puede utilizarse para introducir cualesquiera genes u otras secuencias de nucleótidos que resultan de interés en un microorganismo del orden Traustoquitriales. Entre tales secuencias de nucleótidos se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, ácidos nucleicos codificantes de proteínas (p.ej., enzimas) asociados a la síntesis de ácidos grasos (p.ej., los ácidos grasos ácido docosahexaenoico (DHA), ácido docosapentaenoico (DFA), ácido eicosapentaenoico (EPA) y ácido araquidónico (ARA). Entre dichas proteínas se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, ácido graso sintasas, ácido graso desaturasas y ácido graso elongasas, así como proteínas asociadas a un complejo de poliquétido sintasa y/o proteínas asociadas a la incorporación de dichos ácidos grasos en fosfolípidos o en moléculas de triacilglicerol. Por ejemplo, la invención se ha utilizado para introducir genes codificantes de diversos ácido-graso u>-3 desaturasas en Schyzotrichium en un esfuerzo por incrementar el nivel de ácido docosahexaenoico (DHA) en las células mediante desaturación u>-3 del ácido docosapentaenoico (DPA). A título de otro ejemplo, también se ha demostrado la expresión de una isomerasa putativa de ácido graso polienoico del alga roja Ptilota en Schizochytrium. Los genes codificantes de un complejo de poliquétido sintasa de Schizochytrium (es decir, un sistema de poliquétido sintasa) se han depositado en GenBank, n° de acceso AF378329 (ORFA), AF378328 (ORFB) y AF378329 (ORFC).
La presente invención también resulta útil para introducir genes de microorganismos Traustoquitriales y otras secuencias de nucleótidos codificantes de proteínas asociadas a la ruta biosintética de isoprenoides. Entre tales proteínas se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, la HMG-CoA sintasa y la HMG-CoA reductasa. Entre otras proteínas adecuadas se incluyen proteínas asociadas a la síntesis de moléculas derivadas de subunidades de isoprenoide, incluyendo, aunque sin limitarse a ellas, diversos compuestos esteroides y diversos compuestos carotenoides. Entre las proteínas asociadas a la síntesis de diversos compuestos carotenoides se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, escualeno sintasa, fitoeno sintasa, fitoeno desaturasa y diversas carotenoide ciclasas, hidroxilasa y quetolasas. La presente invención también resulta útil para introducir en los Traustoquitriales una o más secuencias de ácidos nucleicos codificantes de proteínas asociadas a la síntesis de compuestos antioxidantes, incluyendo, aunque sin limitación, vitamina E y ácido lipoico.
Además, la presente invención puede utilizarse para introducir cualesquiera genes u otros vectores de secuencias de nucleótidos en microorganismos Traustoquitriales con el fin de inactivar o delecionar genes (es decir, "inactivación génica" o "disrupción génica dirigida"). La inactivación o deleción de genes se utiliza típicamente con el fin de potenciar el valor comercial del microorganismo. Por ejemplo, puede resultar deseable eliminar genes que codifican enzimas (o ácidos nucleicos que regulan la expresión de tales genes) de las rutas de síntesis de ácidos grasos saturados y poliinsaturados. En otro aspecto, puede resultar deseable inhibir o inactivar genes codificantes de proteínas que participan en la degradación de otros compuestos valiosos producidos por el microorganismo de los Traustoquitriales o que reducen el valor del compuesto deseado. Por ejemplo, los genes codificantes de lipasas, enzimas de oxidación de los ácidos grasos y proteínas que presentan sabores u olores desagradables pueden ser dianas de inactivación deseables para la presente invención. En todavía otro aspecto, puede resultar deseable inactivar genes codificantes de proteínas que están asociadas a la síntesis de compuestos la síntesis de los cuales compite con otras moléculas de interés. Por ejemplo, entre dichos genes se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, genes codificantes de proteínas que participan en la biosíntesis de carbohidratos, genes codificantes de proteínas participantes en la síntesis de diversos productos de rutas de isoprenoides (p.ej., esteroles o compuestos carotenoides específicos) y genes codificantes de proteínas que participan en la síntesis de componentes de la pared celular. A título de ejemplo, se han introducido genes en células de Schizochytrium mediante la utilización de la presente invención en un esfuerzo por inactivar genes que son homólogos a los genes de poliquétido sintasa de Shewanella con el fin de evaluar su papel en la producción de ácidos grasos altamente insaturados (HUFA). Tal como se ejemplifica en el Ejemplo 6, la presente invención también puede utilizarse para inactivar, delecionar o mutar genes nativos que participan en la producción de ácidos grasos, carotenoides, esteroles, vitaminas u otros compuestos con el fin de mejorar la economía o aceptabilidad de productos que no están relacionados con estos compuestos. Se indica que, en algunas realizaciones, tal como se ha comentado anteriormente, puede resultar deseable potenciar la producción de una proteína dada, mientras que en otras realizaciones puede resultar deseable inhibir la producción de la misma proteína. Tales determinaciones se basan en el uso dado y en los objetivos de producción para el microorganismo específico. La presente invención también resulta útil para determinar el procedimiento de recombinación genética en Schizochytrium.
Se describen posteriormente diversas realizaciones de la presente invención inicialmente con respecto a un gen als y/o proteína ALS de Traustoquitriales. En la presente memoria se dan a conocer la identificación, aislamiento y producción de secuencias de ácidos nucleicos codificantes de marcadores seleccionables que resultan adecuados para la utilización en constructos recombinantes para la transformación de microorganismos traustoquítridos. Tales marcadores seleccionables permiten la selección de microorganismos que han sido transformados con éxito con los constructos recombinantes de la presente invención. Un marcador seleccionable útil para la transformación de Traustoquitriales según la presente descripción es una acetolactato sintasa de Traustoquitriales (es decir, ALS). Preferentemente, la acetolactato sintasa ha sido modificada, mutada o de otro modo seleccionada para ser resistente a la inhibición por compuestos sulfonilurea, inhibidores de clase imidazolinona y/o oxibenzoatos de pirimidinilo (es decir, tal ALS es un homólogo de una acetolactato sintasa natural).
Una acetolactato sintasa es una proteína que presenta actividad biológica de acetolactato sintasa, incluyendo proteínas de longitud completa, proteínas de fusión o cualquier homólogo de una acetolactato sintasa natural. Un homólogo de una acetolactato sintasa incluye proteínas que difieren de una acetolactato sintasa natural en que por lo menos uno o unos cuantos, aunque sin limitarse a uno o unos cuantos, aminoácidos han sido delecionados (p.ej., una versión truncada de la proteína, tal como un péptido o fragmento), insertados, invertidos, sustituidos y/o derivatizados (p.ej., mediante glucosilación, fosforilación, acetilación, miristoilación, prenilación, palmitación, amidación y/o adición de glucosilfosfatidil inositol). Se describen en detalle posteriormente los homólogos preferentes de una acetolactato sintasa natural.
Una proteína aislada, tal como una acetolactato sintasa aislada, es una proteína que ha sido extraída de su medio natural (es decir, que ha sido sometida a manipulación humana) y puede incluir proteínas purificadas, proteínas parcialmente purificadas, proteínas producidas recombinantemente y proteínas producidas sintéticamente, por ejemplo. De esta manera, "aislado" no refleja el grado en que se ha purificado la proteína. Preferentemente, se produce recombinantemente una acetolactato sintasa aislada. Una "acetolactato sintasa de Traustoquitriales" se refiere a una acetolactato sintasa (incluyendo un homólogo de una acetolactato sintasa natural) procedente de un microorganismo T raustoquitriales o que ha sido producida de otro modo a partir de los conocimientos de la estructura (p.ej., secuencia) de una acetolactato sintasa natural a partir de un microorganismo Traustoquitriales. En otras palabras, una acetolactato sintasa de Traustoquitriales incluye cualquier acetolactato sintasa que presente la estructura y función de una acetolactato sintasa natural procedente de un microorganismo Traustoquitriales o que es un homólogo biológicamente activo (es decir, que presenta actividad biológica) de una acetolactato sintasa natural procedente de un microorganismo Traustoquitriales tal como se describe en detalle en la presente memoria. De esta manera, la acetolactato sintasa de Traustoquitriales puede incluir proteínas purificadas, parcialmente purificadas, recombinantes, mutadas/modificadas y sintéticas.
En general, la actividad biológica o la acción biológica de una proteína se refiere a cualquier función o funciones mostradas o realizadas por la proteína que se atribuyen a la forma natural de la proteína según se mide u observa in vivo (es decir, en el medio fisiológico natural de la proteína) o in vitro (es decir, bajo condiciones de laboratorio). Por ejemplo, una actividad biológica de una acetolactato sintasa incluye actividad enzimática de acetolactato sintasa. Las modificaciones de una proteína, tal como en un homólogo o mimético (comentado posteriormente) pueden resultar en proteínas que presentan la misma actividad biológica que la proteína natural, o en proteínas que presentan una actividad biológica reducida o incrementada en comparación con la proteína natural. Las modificaciones que resultan en una reducción de la expresión de la proteína o en una reducción de la actividad de la proteína, puede denominarse inactivación (completa o parcial), regulación negativa o acción reducida de una proteína. De manera similar, las modificaciones que resultan en un incremento de la expresión de proteína o en un incremento de la actividad de la proteína pueden denominarse amplificación, sobreproducción, activación, potenciación, regulación positiva o acción incrementada de una proteína.
Con respecto a la acetolactato sintasa indicada, resulta preferente que las modificaciones presentes en los homólogos de acetolactato sintasa, en comparación con una acetolactato sintasa natural, no modifiquen sustancialmente, o por lo menos no reduzcan sustancialmente, la actividad biológica básica de la sintasa en comparación con la proteína natural. Sin embargo, tales homólogos pueden presentar diferencias en características aparte de la actividad funcional o enzimática de la proteína en comparación con la forma natural, tal como una sensibilidad reducida a la inhibición por determinados compuestos en comparación con la proteína natural. Preferentemente, un homólogo de una acetolactato sintasa natural presenta una sensibilidad reducida (es decir, reducida, disminuida) a compuestos que se unen e inactivan las acetolactato sintasas naturales en comparación con la acetolactato sintasa natural a partir de la que se deriva el homólogo. Por ejemplo, los compuestos sulfonilurea, tales como el sulfometurón-metilo (SMM), con frecuencia resultan tóxicos para las células debido a que son capaces de unirse e inactivar la acetolactato sintasa (ALS). Las imidazolinonas, triazolopirimidinas, y otros compuestos similares (denominados en general en la presente memoria, inhibidores de clase imidazolinona) también se ha demostrado que se unen e inactivan ALS. Por lo tanto, un homólogo de una acetolactato sintasa natural preferentemente presenta una sensibilidad reducida a los compuestos sulfonilurea, así como a los inhibidores de clase imidazolinona (p.ej., al presentar sitios de unión alterados para dichos inhibidores o sitios de unión con afinidad reducida para el inhibidor) y a oxibenzoatos de pirimidinilo, manteniendo simultáneamente la actividad enzimática de acetolactato sintasa.
Tal como se utiliza en la presente memoria, una proteína que presenta "actividad biológica de acetolactato sintasa" o a la que se hace referencia como "acetolactato sintasa", se refiere a una proteína que cataliza la primera etapa en la biosíntesis de los aminoácidos valina, leucina e isoleucina. Más específicamente, una acetolactato sintasa aislada de la presente invención, incluyendo proteínas de longitud completa, proteínas truncadas, proteínas de fusión y homólogos, puede identificarse de una manera sencilla a partir de la capacidad de la proteína de catalizar la síntesis de acetolactato a partir de piruvato. El experto en la materia podrá evaluar a actividad biológica de acetolactato sintasa mediante cualquier ensayo in vitro o in vivo de actividad enzimática.
Se describe una acetolactato sintasa que presenta una secuencia de aminoácidos que es por lo menos aproximadamente 65% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de SEC ID n° 15, SEC ID n° 19, SEC ID n° 22, SEC ID n° 24 a lo largo de por lo menos aproximadamente 600 aminoácidos de cualquiera de dichas secuencias, en donde la proteína es una acetolactato sintasa (es decir, presenta actividad biológica de acetolactato sintasa). Más preferentemente, una acetolactato sintasa tal como se describe presenta una secuencia de aminoácidos que es por lo menos aproximadamente 70% idéntica, y más preferentemente por lo menos aproximadamente 75% idéntica, y todavía más preferentemente por lo menos aproximadamente 80% idéntica y todavía más preferentemente por lo menos aproximadamente 90% idéntica y todavía más preferentemente por lo menos aproximadamente 95% idéntica, y todavía más preferentemente por lo menos aproximadamente 96% idéntica, y todavía más preferentemente por lo menos aproximadamente 97% idéntica, y todavía más preferentemente por lo menos aproximadamente 98% idéntica, y todavía más preferentemente por lo menos aproximadamente 99% idéntica a cualquiera de las secuencias SEC ID n° 15, SEC ID n° 19, SEC ID n° 22 o SEC ID n° 24 a lo largo de por lo menos aproximadamente 600 aminoácidos de cualquiera de las secuencias SEC ID n° 15, SEC ID n° 19, SeC ID n° 22 o SeC ID n° 24, en las que la proteína presenta actividad biológica de acetolactato sintasa.
Se describe además una acetolactato sintasa que presenta una secuencia de aminoácidos que es por lo menos aproximadamente 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de SEC ID n° 15, SEC ID n° 19, SEC ID n° 22, SEC ID n° 24, a lo largo de por lo menos 95 aminoácidos de cualquiera de dichas secuencias, en las que la proteína es una acetolactato sintasa (es decir, presenta actividad biológica de acetolactato sintasa). Más preferentemente, una acetolactato sintasa tal como se describe presenta una secuencia de aminoácidos que es por lo menos aproximadamente 80% idéntica, y todavía más preferentemente por lo menos 85% idéntica, y todavía más preferentemente por lo menos 90% idéntica, y todavía más preferentemente por lo menos 95% idéntica, y todavía más preferentemente por lo menos 96% idéntica, y todavía más preferentemente por lo menos 97% idéntica, y todavía más preferentemente por lo menos 98% idéntica, y todavía más preferentemente por lo menos 99% idéntica, a cualquiera de las secuencias SEC ID n° 15, SEC ID n° 19, SEC ID n° 22 o SEC ID n° 24 a lo largo de por lo menos 95 aminoácidos de cualquiera de las secuencias SEC ID n° 15, SEC ID n° 19, SEC ID n° 22 o SEC ID n° 24, en las que la proteína presenta actividad biológica de acetolactato sintasa. Todavía más preferentemente, una acetolactato sintasa tal como se describe presenta una secuencia de aminoácidos que presenta cualquiera de los porcentajes de identidad anteriormente indicados respecto a cualquiera de las secuencias SEC ID n° 15, SEC ID n° 19, SEC ID n° 22 o SEC ID n° 24 a lo largo de por lo menos 100 aminoácidos, y más preferentemente 125, y más preferentemente 150, y más preferentemente 175, y más preferentemente 200, y más preferentemente 225, y más preferentemente 250, y más preferentemente 275, y más preferentemente 300, y más preferentemente 325, y más preferentemente 350, y más preferentemente 375, y más preferentemente 400, y más preferentemente 425, y más preferentemente 450, y más preferentemente 475, y más preferentemente 500, y más preferentemente 525, y más preferentemente 550, y más preferentemente 575, de cualquiera de las secuencias SEC ID n° 15, SEC ID n° 19, SEC ID n° 22 o SEC ID n° 24, en las que la proteína presenta actividad biológica de acetolactato sintasa.
Tal como se utiliza en la presente memoria, a menos que se indique lo contrario, la referencia a un porcentaje (%) de identidad se refiere a una evaluación de homología que se lleva a cabo utilizando: (1) una búsqueda de homología de BLAST con BLAST 2.0 Basic utilizando blastp para las búsquedas de aminoácidos y blastn para las búsquedas de ácidos nucleicos con parámetros por defecto estándares, en las que la secuencia problema se filtra para regiones de baja complejidad por defecto (descrita en Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D.J., "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997); (2) una alineación de BLAST 2 (utilizando los parámetros indicados posteriormente), (3) y/o PSI-BLAST con los parámetros por defecto estándares (Position-Specific Iterated BLAST) Se indica que debido a algunas diferencias en los parámetros estándares entre BLAST 2.0 Basic BLAST y BLAST 2, dos secuencias específicas podrían reconocerse como con homología significativa utilizando el programa BLAST2, mientas que una búsqueda realizada en BLAST 2.0 Basic BLAST utilizando una de las secuencias como secuencia problema podría no identificar la segunda secuencia dentro de las mejores coincidencias. Además, PSI-BLAST proporciona una versión fácil de utilizar automatizada de una búsqueda "de perfil", que es un modo sensible de buscar homólogos de secuencia. El programa en primer lugar lleva a cabo una búsqueda en la base de datos BLAST con huecos. El programa PSI-BLAST utiliza la información de cualesquiera alineaciones significativas que devuelve para construir una matriz de puntuación específica de posición que sustituye la secuencia problema para la siguiente ronda de búsquedas en la base de datos. Por lo tanto, debe entenderse que el porcentaje de identidad puede determinarse mediante la utilización de cualquiera de estos programas.
Pueden alinearse dos secuencias específicas entre sí utilizando la secuencia de BLAST2 tal como se indica en Tatusova y Madden, "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174: 247-250, 1999). La alineación de secuencias de BLAST2 se lleva a cabo en blastp o blastn utilizando el algoritmo de BLAST 2.0 para llevar a cabo una búsqueda en BLAST con huecos (BLAST 2.0) entre las dos secuencias permitiendo la introducción de huecos (deleciones e inserciones) en la alineación resultante. En aras de la claridad en la presente memoria, se ha llevado a cabo una alineación de secuencias de BLAST2 utilizando los parámetros por defecto estándares siguientes:
Para blastn, utilizando 0 matriz BLOSUM62:
recompensa por coincidencia=1
penalización por no coincidencia=-2
penalizaciones por hueco abierto (5) y por extensión de hueco (2)
hueco x_dropoff (50) expect (10) tamaño de palabra (11) filtro (on)
Para blastp, utilizando 0 matriz BLOSUM62:
penalizaciones por hueco abierto (11) y por extensión de hueco (1)
hueco x_dropoff (50) expect (10) tamaño de palabra (3) filtro (on).
Una acetolactato sintasa tal como se describe también puede incluir proteínas que presentan una secuencia de aminoácidos que comprende por lo menos 30 residuos aminoácidos contiguos de cualquiera de entre SEC ID n° 15, SEC ID n° 19, SEC ID n° 22 o SEC ID n° 24 (es decir, 30 residuos aminoácidos contiguos que presentan una identidad de 100% respecto a 30 aminoácidos contiguos de cualquiera de entre SEC ID n° 15, SEC iD n° 19, SEC ID n° 22 o SEC ID n° 24). Se describe una acetolactato sintasa que incluye proteínas que presentan secuencias de aminoácidos que comprenden por lo menos 50, y más preferentemente por lo menos 75, y más preferentemente por lo menos 100, y más preferentemente por lo menos 115, y más preferentemente por lo menos 130, y más preferentemente por lo menos 150, y más preferentemente por lo menos 200, y más preferentemente por lo menos 250, y más preferentemente por lo menos 300, y más preferentemente por lo menos 350, y más preferentemente por lo menos 400, y más preferentemente por lo menos 450, y más preferentemente por lo menos 500, y más preferentemente por lo menos 550, y más preferentemente por lo menos 600, y más preferentemente por lo menos 650 residuos aminoácidos contiguos de cualquiera de entre SEC ID n° 15, SEC ID n° 19, SEC ID n° 22 o SEC ID n° 24. Dicha proteína presenta actividad biológica de acetolactato sintasa.
El término "contiguo" o "consecutivo" con respecto a las secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos descritas en la presente memoria se refiere a conectarse en una secuencia no interrumpida. Por ejemplo, que una primera secuencia comprenda 30 aminoácidos contiguos (o consecutivos) de una segunda secuencia, se refiere a que la primera secuencia incluye una secuencia no interrumpida de 30 residuos aminoácidos que es 100% idéntica a una secuencia no interrumpida de 30 residuos aminoácidos en la segunda secuencia. De manera similar, que una primera secuencia presente "identidad de 100%" respecto a una segunda secuencia se refiere a que la primera secuencia se corresponde exactamente con la segunda secuencia sin huecos entre nucleótidos o aminoácidos.
En otro ejemplo descrito, un ejemplo de acetolactato sintasa, que incluye un homólogo de acetolactato sintasa, incluye una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos que es suficientemente similar a una secuencia de aminoácidos de acetolactato sintasa natural para que una secuencia de ácidos nucleicos codificante del homólogo sea capaz de hibridarse bajo condiciones de astringencia moderada, elevada o muy elevada (indicadas posteriormente) a (es decir, con) una molécula de ácidos nucleicos codificante de la acetolactato sintasa natural (es decir, al complemento de la cadena de ácidos nucleicos codificante de la secuencia de aminoácidos de la acetolactato sintasa natural). Preferentemente, una acetolactato sintasa descrita está codificada por una secuencia de ácidos nucleicos que se hibrida bajo condiciones de astringencia moderada, elevada o muy elevada con el complemento de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 15, SEC ID n° 19, SEC ID n° 22 o SEC ID n° 24. Todavía más preferentemente, una acetolactato sintasa tal como se describe está codificada por una secuencia de ácidos nucleicos que se hibrida bajo condiciones de astringencia moderada, elevada o muy elevada con el complemento de los nucleótidos 1.260 a 3.314 de SEC ID n° 15, los nucleótidos 1.260 a 3.314 de SEC ID n° 18, 1.260 a 3.314 de SEC ID n° 21 o los nucleótidos 1.260 a 3.314 de SEC ID n° 23. Tales condiciones de hibridación se describen en detalle posteriormente. Un complemento de secuencia de ácidos nucleicos de la secuencia de ácidos nucleicos codificante de una acetolactato sintasa tal como se describe se refiere a la secuencia de ácidos nucleicos de la cadena de ácidos nucleicos que es complementaria a la cadena que codifica la acetolactato sintasa. Se apreciará que un ADN de doble cadena que codifica una secuencia de aminoácidos dada comprende un ADN monocatenario y su cadena complementaria que presenta una secuencia que es un complemento del ADN monocatenario. De esta manera, las moléculas de ácidos nucleicos indicadas pueden ser de bicatenarias o monocatenarias, y entre ellas se incluyen las moléculas de ácidos nucleicos que forman híbridos estables bajo condiciones de hibridación restrictivas con una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 15, SEC ID n° 19, SEC ID n° 22 o SEC ID n° 24, y/o con el complemento de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica cualquiera de dichas secuencias de aminoácidos. Los métodos para deducir una secuencia complementaria son conocidos por el experto en la materia. Debe indicarse que debido a que las tecnologías de secuenciación de aminoácidos y de secuenciación de ácidos nucleicos no están totalmente exentas de errores, las secuencias presentadas en la presente memoria en el mejor de los casos representan secuencias aparentes de una acetolactato sintasa.
Los homólogos de la acetolactato sintasa pueden ser el resultado de variación alélica natural o mutación natural. Los homólogos de acetolactato sintasa descritos también pueden producirse utilizando técnicas conocidas de la técnica, incluyendo, aunque sin limitarse a ellas, modificaciones directas de la proteína o modificaciones del gen codificante de la proteína utilizando, por ejemplo, técnicas de ADN clásicas o recombinantes para llevar a cabo mutagénesis aleatoria o dirigida. Una variante alélica natural de un ácido nucleico codificante de una acetolactato sintasa es un gen que se encuentra en esencialmente el mismo locus (o loci) en el genoma que el gen que codifica una secuencia de aminoácidos SEC ID n° 15 pero que, debido a variaciones naturales causadas por, por ejemplo, mutación o recombinación, presenta una secuencia similar, aunque no idéntica. Las variantes alélicas naturales típicamente codifican proteínas que presentan una actividad similar a la de la proteína codificada por el gen con el que se están comparando Una clase de variantes alélicas puede codificar la misma proteína, pero presentar diferentes secuencias de ácidos nucleicos debido a la degeneración del código genético. Las variantes alélicas pueden comprender además alteraciones en las regiones 5' o 3' no traducidas del gen (p.ej., en regiones de control regulatorio). Las variantes alélicas son bien conocidas por el experto en la materia.
Las proteínas acetolactato sintasa tal como se describen también incluyen productos de expresión de fusiones génicas (por ejemplo, utilizadas para sobreexpresar formas activas solubles de la proteína recombinante), de genes mutagenizados (tales como genes que presentan modificaciones de codones para potenciar la transcripción génica y la traducción) y de genes truncados (tales como genes en los que se han eliminado dominios de unión a membrana para generar formas solubles de una proteína membranal, o genes en los que se han eliminado secuencias de señal que resultan mal tolerados en un huésped recombinante particular).
El tamaño mínimo de una proteína y/o homólogo tal como se describe es un tamaño suficiente para presentar actividad biológica de acetolactato sintasa. Preferentemente, una proteína de la presente invención presenta una longitud de por lo menos 30 aminoácidos, y más preferentemente, por lo menos aproximadamente 50, y más preferentemente por lo menos 75, y más preferentemente por lo menos 100, y más preferentemente por lo menos 115, y más preferentemente por lo menos 130, y más preferentemente por lo menos 150, más preferentemente por lo menos 200, y más preferentemente por lo menos 250, y más preferentemente por lo menos 300, y más preferentemente por lo menos 350, y más preferentemente por lo menos 400, y más preferentemente por lo menos 450, y más preferentemente por lo menos 500, y más preferentemente por lo menos 550, y más preferentemente por lo menos 600, y más preferentemente por lo menos 650, y más preferentemente por lo menos 684 aminoácidos de longitud. No existe un límite, aparte del límite práctico, al tamaño máximo de dicha proteína en el aspecto de que la proteína puede incluir una parte de una proteína acetolactato sintasa o una acetolactato sintasa de longitud completa, más secuencias adicionales (p.ej., una secuencia de proteína de fusión), si se desea.
También se describe una proteína de fusión que incluye un dominio que contiene acetolactato sintasa (es decir, una secuencia de aminoácidos de una acetolactato sintasa según la presente invención) unida a uno o más segmentos de fusión. Entre los segmentos de fusión descritos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, segmentos que pueden: potenciar la estabilidad de la proteína; proporcionar otra actividad biológica deseable y/o ayudar en la purificación de una acetolactato sintasa (p.ej., mediante cromatografía de afinidad). Un segmento de fusión adecuado puede ser un dominio de cualquier tamaño que presenta la función deseada (p.ej., proporciona una estabilidad, solubilidad, acción o actividad biológica incrementadas, y/o simplifica la purificación de la proteína).
Pueden unirse segmentos de fusión a los extremos amino y/o carboxilo del dominio que contiene acetolactato sintasa de la proteína y puede ser susceptible de corte con el fin de permitir la recuperación sencilla de una acetolactato sintasa. Las proteínas de fusión preferentemente se producen mediante el cultivo de una célula recombinante transfectada con una molécula de ácidos nucleicos de fusión que codifica una proteína que incluye el segmento de fusión unido al extremo carboxilo-terminal y/o amino-terminal de un dominio que contiene acetolactato sintasa.
Se describe además un mimético de una acetolactato sintasa. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "mimético" se utiliza para referirse a cualquier compuesto péptido o no peptídico que es capaz de mimetizar la acción biológica de un péptido natural, con frecuencia debido a que el mimético presenta una estructura básica que mimetiza la estructura básica del péptido natural y/o que presenta propiedades biológicas destacadas del péptido natural. Entre los miméticos pueden incluirse, aunque sin limitarse a ellos, péptidos que presentan modificaciones sustanciales respecto del prototipo, tales como la falta de similitud respecto a cadenas laterales con el péptido natural (tales modificaciones, por ejemplo, pueden reducir su susceptibilidad a la degradación), anticuerpos antiidiotípicos y/o catalíticos, o fragmentos de los mismos; partes no proteicas de una proteína aislada (p.ej., estructuras de carbohidrato), o moléculas orgánicas sintéticas o naturales, incluyendo ácidos nucleicos y fármacos identificados mediante química combinatorial, por ejemplo.
Dichos miméticos pueden diseñarse, seleccionarse y/o de otro modo identificarse utilizando una diversidad de métodos conocidos de la técnica. Se dan a conocer diversos métodos de diseño de fármacos, útiles para diseñar miméticos u otros compuestos terapéuticos, en Maulik et al., Molecular Biotechnology: Therapeutic Applications and Strategies, Wiley-Liss, Inc., 1997. Puede obtenerse un mimético de acetolactato sintasa por ejemplo a partir de estrategias de diversidad molecular (una combinación de estrategias relacionadas que permiten la construcción rápida de bibliotecas grandes de moléculas químicamente diversas), bibliotecas de compuestos naturales o sintéticos, en particular de bibliotecas químicas o combinatoriales (es decir, bibliotecas de compuestos que difieren en secuencia o tamaño pero que presentan bloques constructivos similares) o mediante diseño de fármacos racional dirigido o aleatorio. Ver, por ejemplo, Maulik et al., supra.
En una estrategia de diversidad molecular, se sintetizan bibliotecas grandes de compuestos, por ejemplo, a partir de péptidos, oligonucleótidos, carbohidratos y/o moléculas orgánicas sintéticas, utilizando enfoques biológicos, enzimáticos y/o químicos. Entre los parámetros críticos para desarrollar una estrategia de diversidad molecular se incluyen la diversidad de subunidades, el tamaño molecular y la diversidad de la biblioteca. El objetivo general del cribado de tales bibliotecas es utilizar la aplicación secuencial de la selección combinatorial para obtener ligandos de afinidad elevada para una diana deseada y después optimizar las moléculas de cabeza mediante estrategias de diseño aleatorio o dirigido. Los métodos de diversidad molecular se describen en detalle en Maulik et al., ibid.
Maulik et al. Dan a conocer además, por ejemplo, métodos de diseño dirigido en los que el usuario dirige el procedimiento de creación de nuevas moléculas a partir de una biblioteca de fragmentos, de fragmentos apropiadamente seleccionados; el diseño aleatorio, en el que el usuario utiliza un algoritmo genético o de otro tipo para mutar aleatoriamente fragmentos y sus combinaciones, aplicando simultáneamente un criterio de selección para evaluar el ajuste de los ligandos candidatos, y un enfoque basado en una matriz en el que el usuario calcular la energía de interacción entre estructuras receptoras tridimensionales y fragmentos pequeños sonda, seguido de la unión entre si de los sitios de sonda favorables.
Se describen acetolactato sintasas que pueden derivarse de cualquier microorganismo Traustoquitriales y, en particular, de cualquier organismo Schizochytrium. La acetolactato sintasa descrita de la presente invención presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de SEC ID n° 15, SEC ID n° 19, SEC ID n° 22 y SEC ID n° 24. La proteína que presenta una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 15 es una acetolactato sintasa natural (es decir, de tipo salvaje) procedente de un microorganismo Traustoquitriales y, específicamente, es una acetolactato sintasa de Schizochytrium. Las secuencias de aminoácidos representadas por s Ec ID n° 19, SEC ID n° 22 y SEC ID n° 24 son secuencias que han sido modificadas, de manera que los enzimas resultantes presentan una sensibilidad reducida a los compuestos sulfonilurea, así como a inhibidores de clase imidazolinona y oxibenzoatos de pirimidinilo, en comparación con la proteína natural representada por la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 15. Se indica que las proteínas representadas por SEC ID n° 19, SEC ID n° 22 y SEC ID n° 24 presentan actividad biológica de acetolactato sintasa. Las acetolactato sintasas con sensibilidad reducida a los compuestos sulfonilurea, así como a inhibidores de clase imidazolinona y oxibenzoatos de pirimidinilo son acetolactato sintasas descritas, debido a que las secuencias de ácidos nucleicos codificantes de tales sintasas pueden utilizarse en vectores recombinantes de la presente invención a modo de marcadores seleccionables.
Por lo tanto, un ejemplo descrito se refiere a una acetolactato sintasa modificada, incluyendo cualquier homólogo de cualquiera de entre SeC ID n° 15, SEC ID n° 19, SEC ID n° 22 y SEC ID n° 24, en el que el homólogo presenta actividad biológica de acetolactato sintasa, y en particular, en el que el homólogo presenta una sensibilidad reducida a compuestos sulfonilurea, así como a inhibidores de clase imidazolinona y oxibenzoatos de pirimidinilo, en comparación con la proteína natural representada por la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 15. En un ejemplo descrito, entre dichos homólogos de acetolactato sintasa se incluyen proteínas que presentan una secuencia de aminoácidos que difieren de la SEC ID n° 15 por una deleción, inserción o sustitución de aminoácido en una o más de las posiciones siguientes: 116G, 117A, 192P, 200A, 251K, 358M, 383D, 592V, 595W, o 599F. Estas posiciones corresponden a sitios de mutación de ALS conocidos en una acetolactato sintasa de levadura (es decir, 116G, 117A, 192P, 200A, 251K, 354M, 379D, 583V, 586W y 590F, respectivamente) (verMazur y Falco, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 40:441-470, 1989). Otros sitios de mutación posibles son conocidos por el experto en la materia basados en mutaciones de aminoácido con éxito en ALS de otros organismos. La aplicación de dichos sitios a los sitios correspondientes en ALS de Traustoquitriales se encuentra comprendida en la presente invención.
Se describe una molécula aislada de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una acetolactato sintasa de Traustoquitriales y una secuencia de ácidos nucleicos totalmente complementaria a la misma. Una molécula de ácidos nucleicos descrita codificante de una acetolactato sintasa incluye una molécula de ácidos nucleicos codificante de cualquiera de las proteínas acetolactato sintasa, incluyendo homólogos, comentados anteriormente. Más particularmente un ejemplo descrito se refiere a una molécula aislada de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína que presenta una secuencias de aminoácidos que es por lo menos aproximadamente 65% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de entre SeC ID n° 15, SEC ID n° 19, SEC ID n° 22 y SEC ID n° 24, a lo largo de por lo menos aproximadamente 600 aminoácidos de cualquiera de tales secuencias, en el que la proteína es una acetolactato sintasa (es decir, como actividad biológica de acetolactato sintasas). Más preferentemente, una molécula aislada de ácidos nucleico tal como se describe presenta una secuencia de ácidos nucleicos codificante de una secuencia de aminoácidos que es por lo menos aproximadamente 70% idéntica, y más preferentemente por lo menos aproximadamente 75% idéntica, y todavía más preferentemente por lo menos aproximadamente 80% idéntica, y todavía más preferentemente por lo menos aproximadamente 85% idéntica y todavía más preferentemente por lo menos aproximadamente 90% idéntica y todavía más preferentemente por lo menos aproximadamente 95% idéntica, y todavía más preferentemente por lo menos aproximadamente 96% idéntica, y todavía más preferentemente por lo menos aproximadamente 97% idéntica, y todavía más preferentemente por lo menos aproximadamente 98% idéntica, y todavía más preferentemente por lo menos aproximadamente 99% idéntica a cualquiera de las secuencias SEC ID n° 15, SEC ID n° 19, SEC ID n° 22 o SEC ID n° 24 a lo largo de por lo menos aproximadamente 600 aminoácidos de cualquiera de las secuencias SEC ID n° 15, SEC ID n° 19, SEC ID n° 22 o SEC ID n° 24, en las que la proteína presenta actividad biológica de acetolactato sintasa.
En otro ejemplo descrito, una molécula aislada de ácidos nucleicos presenta una secuencia de ácidos nucleicos codificante de una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de SEC ID n° 15, SEC ID n° 19, SEC ID n° 22 y SEC ID n° 24 a lo largo de por lo menos 95 aminoácidos de cualquiera de dichas secuencias, en donde la proteína es una acetolactato sintasa (es decir, presenta actividad biológica de acetolactato sintasa). Más preferentemente, una molécula aislada de ácidos nucleicos de la presente invención presenta una secuencia de ácidos nucleicos codificante de una secuencia de aminoácidos que es por lo menos aproximadamente 80% idéntica, y todavía más preferentemente por lo menos aproximadamente 85% idéntica, y todavía más preferentemente por lo menos aproximadamente 90% idéntica y todavía más preferentemente por lo menos 95% idéntica, y todavía más preferentemente por lo menos 96% idéntica, y todavía más preferentemente por lo menos 97% idéntica, y todavía más preferentemente por lo menos 98% idéntica, y todavía más preferentemente por lo menos 99% idéntica a cualquiera de entre SEC ID n° 15, SEC ID n° 19, SEC ID n° 22 o SEC ID n° 24, a lo largo de por lo menos 95 aminoácidos de cualquiera de SEC ID n° 15, SEC ID n° 19, SEC ID n° 22 o SEC ID n° 24, en donde la proteína presenta actividad biológica de acetolactato sintasa.
En todavía otro ejemplo descrito, una molécula aislada de ácidos nucleicos presenta una secuencia de ácidos nucleicos codificante de una secuencia de aminoácidos que presenta cualquiera de los porcentajes de identidad anteriormente indicados respecto a cualquiera de las secuencias SEC ID n° 15, SEC ID n° 19, SEC ID n° 22 o SEC ID n° 24 a lo largo de por lo menos 100 aminoácidos, y más preferentemente 125, y más preferentemente 150, y más preferentemente 175, y más preferentemente 200, y más preferentemente 225, y más preferentemente 250, y más preferentemente 275, y más preferentemente 300, y más preferentemente 325, y más preferentemente 350, y más preferentemente 375, y más preferentemente 400, y más preferentemente 425, y más preferentemente 450, y más preferentemente 475, y más preferentemente 500, y más preferentemente 525, y más preferentemente 550, y más preferentemente 575 de cualquiera de las secuencias SEC ID n° 15, SEC ID n° 19, SEC ID n° 22 o SEC ID n° 24, en donde la proteína presenta actividad biológica de acetolactato sintasa. Se determinó el porcentaje de identidad utilizando los parámetros por defecto de BLAST 2.0 Basic BLAST, tal como se ha indicado anteriormente.
En un ejemplo descrito, entre las moléculas de ácidos nucleicos codificantes de una acetolactato sintasa se incluyen moléculas aisladas de ácidos nucleicos que se hibridan bajo condiciones de astringencia moderada, y todavía más preferentemente bajo condiciones de astringencia elevada, y todavía más preferentemente bajo condiciones de astringencia muy elevada con el complemento de una secuencia de ácidos nucleicos codificante de una acetolactato sintasa natural. Preferentemente, una molécula aislada de ácidos nucleicos codificante de una acetolactato sintasa tal como se describe comprende una secuencia de ácidos nucleicos que se hibrida bajo condiciones de astringencia moderada o elevada con el complemento de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 15, SEC ID n° 19, SEC ID n° 22 o SEC ID n° 24. En un ejemplo descrito, una molécula aislada de ácidos nucleicos comprende una secuencia de ácidos nucleicos que se hibrida bajo condiciones de astringencia moderada, elevada o muy elevada con el complemento de una secuencia de ácidos nucleicos representada por los nucleótidos 1.260 a 3.314 de SEC ID n° 14, los nucleótidos 1.260 a 3.314 de SEC ID n° 18, los nucleótidos 1.260 a 3.314 de SEC ID n° 21 o los nucleótidos 1.260 a 3.314 de SEC ID n° 23.
Tal como se utiliza en la presente memoria, las condiciones de hibridación se refieren a condiciones de hibridación estándares bajo las que se utilizan las moléculas de ácidos nucleicos para identificar moléculas de ácidos nucleicos similares. Tales condiciones estándares se dan a conocer en, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1989. Sambrook et al., ibid. (ver específicamente las páginas 9.31 a 9.62). Además, las fórmulas para calcular las condiciones apropiadas de hibridación y lavado para conseguir la hibridación permitiendo diversos grados de no correspondencia de los nucleótidos se dan a conocer en, por ejemplo, Meinkoth et al., Anal. Biochem. 138:267-284, 1984; Meinkoth et al., ibid.
Más particularmente, las condiciones de hibridación y lavado de astringencia moderada, tal como se denominan en la presente memoria, se refieren a condiciones que permiten el aislamiento de moléculas de ácidos nucleicos que presentan una identidad de secuencia de ácidos nucleicos de por lo menos aproximadamente 70% respecto a la molécula de ácidos nucleicos que se utiliza para sondear la reacción de hibridación (es decir, condiciones que permiten una no correspondencia de aproximadamente 30% o menos de los nucleótidos). Las condiciones de hibridación y lavado de astringencia elevada, tal como se denominan en la presente memoria, se refieren a condiciones que permiten el aislamiento de moléculas de ácidos nucleicos que presentan una identidad de secuencia de ácidos nucleicos de por lo menos aproximadamente 80% respecto a la molécula de ácidos nucleicos que se utiliza para sondear la reacción de hibridación (es decir, condiciones que permiten una no correspondencia de aproximadamente 20% o menos de los nucleótidos). Las condiciones de hibridación y lavado de astringencia muy elevada, tal como se denominan en la presente memoria, se refieren a condiciones que permiten el aislamiento de moléculas de ácidos nucleicos que presentan una identidad de secuencia de ácidos nucleicos de por lo menos aproximadamente 90% respecto a la molécula de ácidos nucleicos que se utiliza para sondear la reacción de hibridación (es decir, condiciones que permiten una no correspondencia de aproximadamente 10% o menos de los nucleótidos). Tal como se ha comentado anteriormente, el experto en la materia puede utilizar las fórmulas en Meinkoth et al., ibid. Para calcular las condiciones de hibridación y lavado apropiadas para conseguir estos niveles particulares de no correspondencia de nucleótidos. Tales condiciones variarán, dependiendo de si se forman híbridos de ADN:ARN o de ADN:ADN. Las temperaturas de fusión calculadas para los híbridos de ADN:ADN son 10°C inferiores a las de los híbridos de ADN:ADN. En ejemplos particulares, las condiciones de hibridación restrictivas para los híbridos de ADN:ADN incluyen la hibridación a una fuerza iónica de 6X SSC (Na+ 0,9 M) a una temperatura de entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 35°C (astringencia más baja), más preferentemente de entre aproximadamente 28°C y aproximadamente 40°C (mayor astringencia) y todavía más preferentemente, de entre aproximadamente 35°C y aproximadamente 45°C (todavía más astringencia), con condiciones de lavado apropiadas. En ejemplos particulares, entre las condiciones de hibridación restrictivas para los híbridos de ADN:ARN se incluyen la hibridación a una fuerza iónica de 6X SSC (Na+ 0,9 M) a una temperatura de entre aproximadamente 30°c y aproximadamente 45°C, más preferentemente de entre 38°C y aproximadamente 50°C, y todavía más preferentemente, de entre aproximadamente 45°C y aproximadamente 55°C, con condiciones de lavado de astringencia similar. Estos valores se basan en cálculos de una temperatura de fusión para moléculas de más de aproximadamente 100 nucleótidos, 0% de formamida y un contenido de G+C de aproximadamente 40%. Alternativamente, la Tm puede calcularse empíricamente tal como se indica en Sambrook et al., supra, páginas 9.31 a 9.62. En general, las condiciones de lavado deberían ser tan astringentes como resulte posible y deben resultar apropiadas para las condiciones de hibridación seleccionadas. Por ejemplo, las condiciones de hibridación pueden incluir una combinación de condiciones salinas y de temperatura que sean aproximadamente 20-25°C inferiores a la Tm calculada de un híbrido particular, y las condiciones de lavado típicamente incluyen una combinación de condiciones salinas y de temperatura que son aproximadamente 12-20°C inferiores a la Tm calculada del híbrido particular. Un ejemplo de condiciones de hibridación adecuadas para la utilización con híbridos de ADN:ADN incluye una hibridación de 2 a 24 horas en 6X SSC (formamida al 50%) a aproximadamente 42°C, seguido de etapas de lavado que incluyen uno o más lavados a temperatura ambiente en aproximadamente 2X SSC, seguido de lavados adicionales a temperaturas más altas y una fuerza iónica más baja (p.ej., por lo menos un lavado a aproximadamente 37°C en aproximadamente 0,1X-0,5X SSC, seguido de por lo menos un lavado a aproximadamente 68°C en aproximadamente 0,1X-0,5X SSC).
En otro ejemplo descrito, las moléculas de ácidos nucleicos codificantes de una acetolactato sintasa tal como se ha descrito incluyen moléculas de ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos codificante de una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos que comprende por lo menos 30 residuos aminoácidos contiguos de cualquiera de SEC ID n° 15, SEC ID n° 19, SEC ID n° 22 o SEC ID n° 24 (es decir, 30 residuos aminoácidos contiguos que presentan una identidad de 100% respecto a 30 aminoácidos contiguos de cualquiera de SEC ID n° 15, SEC ID n° 19, SEC ID n° 22 o SEC ID n° 24). En un ejemplo descrito, una molécula aislada de ácidos nucleicos comprende una secuencia de ácidos nucleicos codificante de una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos que comprende por lo menos 50, y más preferentemente por lo menos 75, y más preferentemente por lo menos 100, y más preferentemente por lo menos 115, y más preferentemente por lo menos 130, y más preferentemente por lo menos 150, y más preferentemente por lo menos 200, y más preferentemente por lo menos 250, y más preferentemente por lo menos 300, y más preferentemente por lo menos 350, y más preferentemente por lo menos 400, y más preferentemente por lo menos 450, y más preferentemente por lo menos 500, y más preferentemente por lo menos 550, y más preferentemente por lo menos 600, y más preferentemente por lo menos 650 residuos aminoácidos contiguos de cualquiera de SEC ID n° 15, SEC ID n° 19, SeC ID n° 22 o SEC ID n° 24. Dicha proteína presenta actividad biológica de acetolactato sintasa. En un ejemplo descrito, una molécula aislada de ácidos nucleicos codificante de una acetolactato sintasa comprende una secuencia de ácidos nucleicos que presenta por lo menos 60 nucleótidos contiguos, y más preferentemente por lo menos 150, y más preferentemente por lo menos 225, y más preferentemente por lo menos 300, y más preferentemente por lo menos 345, y más preferentemente por lo menos 390, y más preferentemente por lo menos 450, y más preferentemente por lo menos 525, y más preferentemente por lo menos 600, y más preferentemente por lo menos 750, y más preferentemente por lo menos 900, y más preferentemente por lo menos 1.050, y más preferentemente por lo menos 1.200, y más preferentemente por lo menos 1.350, y más preferentemente por lo menos 1.500, y más preferentemente por lo menos 1.650, y más preferentemente por lo menos 1.800, y todavía más preferentemente por lo menos 1.950 nucleótidos contiguos de los nucleótidos 1.260-3.314 de la SEC iD n° 15, de los nucleótidos 1.260-3.314 de la SEC ID n° 18, de los nucleótidos 1.260-3.314 de la SEC ID n° 21 o de los nucleótidos 1.260-3.314 de la SEC ID n° 23.
Entre las moléculas de ácidos nucleicos descritas se incluyen los nucleótidos 1.260-3.314 de la SEC ID n° 14 (codifica la SEC ID n° 15), los nucleótidos 1.260-3.314 de la SEC ID n° 18 (codifica la SEC ID n° 19), los nucleótidos 1.260­ 3.314 de la SEC ID n° 21 (codifica la SEC ID n° 22) o los nucleótidos 1.260-3.314 de la SEC ID n° 23 (codifica la SEC ID n° 24), SEC ID n° 14, SEC ID n° 18, SEC ID n° 21 o SEC ID n° 23. Según la presente invención, una molécula aislada de ácidos nucleicos es una molécula de ácidos nucleicos que ha sido extraída de su medio natural (es decir, que ha sido sometida a manipulación humana), siendo su medio natural el genoma o cromosoma en la que se encuentra naturalmente la molécula de ácidos nucleicos. De esta manera, "aislada" no refleja necesariamente el grado en que se ha purificado la molécula de ácidos nucleicos, sino que indica que la molécula no incluye un genoma entero o un cromosoma entero en el que se encuentra la molécula de ácidos nucleicos en la naturaleza. Una molécula aislada de ácidos nucleicos puede incluir un gen, tal como un gen de acetolactato sintasa descrito en la presente memoria. Una molécula aislada de ácidos nucleicos que incluye un gen no es un fragmento de un cromosoma que incluye dicho gen, sino que por el contrario incluye la región codificante y las regiones reguladoras asociadas con el gen, pero ningún gen adicional naturalmente presente en el mismo cromosoma. Una molécula aislada de ácidos nucleicos puede incluir además una secuencia de ácidos nucleicos especificada, flanqueada (es decir, en el extremo 5' y/o 3' de la secuencia) por ácidos nucleicos adicionales que normalmente no flanquean la secuencia de ácidos nucleicos especificada en la naturaleza (es decir, son secuencias heterólogas). Molécula aislada de ácidos nucleicos puede incluir ADN, ARN (p.ej., ARNm) o derivados de ADN o ARN (p.ej., ADNc). Aunque la expresión "molécula de ácidos nucleicos" principalmente se refiere a la molécula física de ácidos nucleicos y la expresión "secuencia de ácidos nucleicos" se refiere principalmente a la secuencia de nucleótidos en la molécula de ácidos nucleicos, las dos expresiones pueden utilizarse intercambiablemente, especialmente con respecto a que una molécula de ácidos nucleicos, o una secuencia de ácidos nucleicos, es capa de codificar una proteína.
Preferentemente, una molécula aislada de ácidos nucleicos de la presente invención se produce utilizando tecnología de ADN recombinante (p.ej., reacción en cadena de la polimerasa (PCR), amplificación, clonación) o síntesis química. Entre las moléculas aisladas de ácidos nucleicos se incluyen moléculas de ácidos nucleicos naturales y homólogos de las mismas, incluyendo, aunque sin limitarse a ellas, variantes alélicas naturales y moléculas de ácidos nucleicos modificados en las que se han insertado, delecionado, sustituido y/o invertido, nucleótidos de tal manera que dichas modificaciones proporcionan el efecto deseado sobre la actividad biológica de la proteína. Las variantes alélicas y homólogos de proteínas (p.ej., proteínas codificadas por homólogos de ácidos nucleicos) han sido comentadas en detalle anteriormente.
Una molécula de ácidos nucleicos puede producirse utilizando varios métodos conocidos por el experto en la materia (ver, por ejemplo, Sambrook et al., ibid). Por ejemplo, pueden modificarse moléculas de ácidos nucleicos utilizando una diversidad de técnicas, incluyendo, aunque sin limitarse a ellas, técnicas de mutagénesis clásicas y técnicas de ADN recombinante, tales como la mutagénesis dirigida a sitio, el tratamiento químico de una molécula de ácidos nucleicos para inducir mutaciones, el corte con enzimas de restricción de un fragmento de ácidos nucleicos, la ligación de fragmentos de ácidos nucleicos, la amplificación por PCR y/o la mutagénesis de regiones seleccionadas de una secuencia de ácidos nucleicos, la síntesis de mezclas de oligonucleótidos y la ligación de grupos de mezcla para "construir" una mezcla de moléculas de ácidos nucleicos, y combinaciones de los mismos. Los homólogos de molécula de ácidos nucleicos pueden seleccionarse de una mezcla de ácidos nucleicos modificados mediante cribado para la función de la proteína codificada por el ácido nucleico y/o mediante hibridación con un gen de tipo salvaje.
De manera similar, el tamaño mínimo de una molécula de ácidos nucleicos de la presente invención es un tamaño suficiente para codificar una proteína que presenta la actividad biológica deseada, o suficiente para formar una sonda o cebador oligonucleótido que es capaz de formar un híbrido estable con la secuencia complementaria de una molécula de ácidos nucleicos codificante de la proteína natural (p.ej., bajo condiciones de astringencia moderada, elevada o muy elevada). De esta manera, el tamaño de la molécula de ácidos nucleicos codificante de dicha proteína puede depender de la composición de ácidos nucleicos y el porcentaje de homología o identidad entre la molécula de ácidos nucleicos y la secuencia complementaria, así como de las condiciones de hibridación de por sí (p.ej., la temperatura, la concentración salina y la concentración de formamida). El tamaño mínimo de una molécula de ácidos nucleicos que se utiliza como cebador oligonucleótido o como sonda típicamente es de por lo menos aproximadamente 12 a aproximadamente 15 nucleótidos de longitud en el caso de que las moléculas de ácidos nucleicos sean ricas en GC y de por lo menos aproximadamente 15 a aproximadamente 18 bases de longitud en el caso de que sean ricas en AT. No existe ningún límite, aparte del límite práctico, para el tamaño máximo de una molécula de ácidos nucleicos de la presente invención, en el aspecto de que la molécula de ácidos nucleicos puede incluir una parte de una secuencia codificante de proteína (p.ej., una secuencia codificante de acetolactato sintasa) o una secuencia de ácidos nucleicos codificante de una proteína de longitud completa.
Una realización de la presente invención incluye un vector recombinante para la utilización para la transformación de un microorganismo Traustoquitriales. Según la presente invención, un vector recombinante es una molécula de ácidos nucleicos manipulada (es decir, producida artificialmente) que se utiliza como herramienta para manipular una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada y para introducir dicha secuencia de ácidos nucleicos en una célula huésped. Por lo tanto, el vector recombinante resulta adecuado para la utilización en la clonación, secuenciación y/o, de otro modo, manipulación de la secuencia de ácidos nucleicos seleccionada, tal como mediante la expresión y/o introducción de la secuencia de ácidos nucleicos seleccionada en una célula huésped para formar una célula recombinante. Tal vector típicamente contiene secuencias de ácidos nucleicos heterólogos, es decir, secuencias de ácidos nucleicos que naturalmente no se observa que sean contiguas a la secuencia de ácidos nucleicos que debe introducirse, aunque el vector puede contener también secuencias de ácidos nucleicos reguladoras (p.ej., promotores, regiones no traducidas) que son naturalmente contiguas a las moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención (comentadas en detalle posteriormente). El vector puede ser de ARN o ADN, procariótico o eucariótico, y típicamente es un plásmido. El vector puede mantenerse como elemento extracromosómico (p.ej., un plásmido) o puede integrarse en el cromosoma del microorganismo recombinante. El vector entero puede mantenerse en su sitio dentro de una célula huésped o, bajo determinadas condiciones, puede delecionarse el ADN plasmídico, reteniendo la molécula de ácidos nucleicos de la presente invención. La molécula de ácidos nucleicos integrada puede encontrarse bajo el control de un promotor cromosómico, bajo el control de un promotor nativo o plasmídico, o bajo una combinación de varios controles de promotor. Pueden integrarse en el cromosoma una única copia o múltiples copias de la molécula de ácidos nucleicos. Un vector recombinante tal como se ha descrito contiene por lo menos un marcador seleccionable para microorganismos Traustoquitriales según la presente invención, tal como una secuencia de ácidos nucleicos codificante de una acetolactato sintasa de Traustoquitriales (proteína natural u homólogo) o una secuencia de ácidos nucleicos codificante del gen ble (descrito posteriormente). Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "molécula de ácidos nucleicos recombinante" se utiliza principalmente para referirse a un vector recombinante en el que se ha ligado la secuencia de ácidos nucleicos que debe clonarse, manipularse y transformarse en la célula huésped (es decir, el inserto).
La invención proporciona un vector recombinante para la transformación de microorganismos del Orden Traustoquitriales, que comprende una secuencia de ácidos nucleicos codificante de una proteína de unión a bleomicina operablemente ligada a un promotor a-tubulina de T raustoquitriales que comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en los nucleótidos 441 a 894 de la SEC ID n° 9, y una secuencia de ácidos nucleicos que es por lo menos aproximadamente 95% idéntica a los nucleótidos 441 a 894 de la SEC ID n° 9 a lo largo de la longitud completa de los nucleótidos 441 a 894 de la SEC ID n° 9, en la que dicha secuencia de ácidos nucleicos presenta una actividad transcripcional por lo menos basal del promotor a-tubulina, o una molécula de ácidos nucleicos recombinante que comprende la molécula aislada de ácidos nucleicos según la reivindicación 1, operablemente ligada a una secuencia de control transcripcional. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "molécula recombinante" o "molécula de ácidos nucleicos recombinante" principalmente se refiere a una molécula de ácidos nucleicos o secuencia de ácidos nucleicos operablemente ligada a una secuencia de control transcripcional, aunque puede utilizarse intercambiablemente con la expresión "molécula de ácidos nucleicos" en el caso de que dicha molécula de ácidos nucleicos sea una molécula recombinante tal como se comenta en la presente memoria. Según la presente invención, la expresión "operablemente ligada" se refiere a la unión de una molécula de ácidos nucleicos a una secuencia de control transcripcional de manera tal que la molécula sea capaz de expresarse al transfectarse (es decir, transformarse, transducirse, transfectarse, conjugarse o conducirse) dentro de una célula huésped. Las secuencias de control transcripcional son secuencias que controlan el inicio, elongación o terminación de la transcripción. Son secuencias de control de la transcripción particularmente importantes aquellas que controlan el inicio de la transcripción, tales como las secuencias de promotor, intensificador, operador y represor. Entre las secuencias de control transcripcional adecuadas se incluye cualquier secuencia de control transcripcional que pueda funcionar en un microorganismo del orden Traustoquitriales. Los presentes inventores se cree que son los primeros en aislar e identificar por lo menos tres de tales promotores, descritos en detalle en otros sitios de la presente memoria.
El promotor puede ser un promotor de acetolactato sintasa de T raustoquitriales (representado en la presente memoria por los nucleótidos 1 a 1.259 de la SEC ID n° 14), un promotor de a-tubulina de Traustoquitriales (representado en la presente memoria por los nucleótidos 441-894 de la SEC ID n° 9). La clonación y secuenciación del promotor de atubulina se describe en la sección de Ejemplos. El promotor de a-tubulina comprende la secuencia de promotor de atubulina de Traustoquitriales natural (nucleótidos 441-894 de la SEC ID n° 9) o una secuencia de ácidos nucleicos que es por lo menos 95% idéntica a los nucleótidos 441-894 de la SEC ID n° 9, en la que el promotor presenta una actividad transcripcional por lo menos basal del promotor de a-tubulina. Los métodos para determinar el porcentaje de identidad se han descrito anteriormente en la presente memoria para las secuencias de la acetolactato sintasa y se encuentran comprendidas en la presente memoria.
En una realización, un vector recombinante de la presente invención es un vector de expresión. T al como se utiliza en la presente memoria, la expresión "vector de expresión" se utiliza para referirse a un vector que resulta adecuado para la producción de un producto codificado (p.ej., una proteína de interés). En la presente realización, una secuencia de ácidos nucleicos codificante del producto que debe producirse se inserta en el vector recombinante para producir una molécula de ácidos nucleicos recombinante. La secuencia de ácidos nucleicos codificante de la proteína que debe producirse se inserta en el vector de una manera que liga operablemente la secuencia de ácidos nucleicos con secuencias reguladoras en el vector (p.ej., un promotor de Traustoquitriales de la presente invención), permitiendo la transcripción y traducción de la secuencia de ácidos nucleicos dentro del microorganismo recombinante. Los marcadores seleccionables de la presente invención permiten la selección de un microorganismo recombinante en el que se ha introducido con éxito una molécula de ácidos nucleicos recombinante de la presente invención.
En otra realización, un vector recombinante de la presente invención es un vector de localización. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "vector de localización" se utiliza para referirse a un vector que se utiliza para introducir una molécula particular de ácidos nucleicos en una célula recombinante, en la que la molécula de ácidos nucleicos se utiliza para delecionar o inactivar un gen endógeno dentro de la célula huésped (es decir, se utiliza para la tecnología de disrupción génica dirigida o de inactivación génica). Dicho vector también puede conocerse en la técnica como un vector "knock-out". En un aspecto de la presente realización, una parte del vector, aunque más típicamente, la molécula de ácidos nucleicos insertada en el vector (es decir, el inserto), presenta una secuencia de ácidos nucleicos que es homóloga respecto a una secuencia de ácidos nucleicos de un gen diana en la célula huésped (es decir, un gen que es la diana para la deleción o inactivación). La secuencia de ácidos nucleicos del inserto vector se diseña para unirse al gen diana de manera que el gen diana y el inserto experimenten recombinación homóloga, de manera que el gen diana endógeno resulta delecionado, inactivado o atenuado (es decir, por la mutación o deleción de como mínimo una parte del gen diana endógeno).
El vector recombinante de la presente invención es un vector recombinante que resulta adecuado para la utilización en un microorganismo Traustoquitriales.
El experto en la materia apreciará que la utilización de tecnologías de ADN recombinante pueden mejorar el control de la expresión de las moléculas de ácidos nucleicos transformadas mediante la manipulación, por ejemplo, del número de copias de las moléculas de ácidos nucleicos dentro de la célula huésped, la eficiencia con la que se transcriben dichas moléculas de ácidos nucleicos, la eficiencia con la que se traducen los transcritos resultantes y la eficiencia de las modificaciones post-traduccionales. Además, la secuencia de promotor puede manipularse genéticamente para mejorar el nivel de expresión en comparación con el promotor nativo. Entre las técnicas recombinantes útiles para controlar la expresión de moléculas de ácidos nucleicos se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, la integración de las moléculas de ácidos nucleicos en una o más cromosomas de la célula huésped, la adición de secuencias de estabilidad del vector a plásmidos, las sustituciones o modificaciones de señales de control transcripcional (p.ej., promotores, operadores e intensificadores), las sustituciones o modificaciones de señales de control traduccional (p.ej., sitios de unión ribosómica, secuencias de Shine-Dalgarno), la modificación de moléculas de ácidos nucleicos para que se correspondan con el uso de codones de la célula huésped y la deleción de secuencias que desestabilizan los transcritos.
En una realización de la presente invención, un vector recombinante adecuado para la utilización en la transformación de microorganismos Traustoquitriales contiene el gen Ble Sh de Streptoalloteichus hindustanus como marcador seleccionable (que codifica una "proteína de unión a bleomicina") en combinación con un promotor de Traustoquitriales tal como se ha indicado anteriormente en la presente memoria. Un vector recombinante de la invención comprende el gen ble y un promotor de Traustoquitriales incluye, por ejemplo, la secuencia de vector representada por la SEC ID n° 9. La secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a bleomicina de Streptoalloteichus hindustanus se representa en la presente memoria como SEC ID n° 10.
Las moléculas de ácidos nucleicos recombinantes de la presente invención, que pueden ser de ADN o ARN, también pueden contener secuencias reguladoras adicionales, tales como secuencias reguladoras de la traducción, orígenes de replicación y otras secuencias reguladoras que son compatibles con la célula recombinante. En una realización, una molécula recombinante de la presente invención, incluyendo aquellas que están integradas en el cromosoma de la célula huésped, también contienen señales secretorias (es decir, secuencias de ácidos nucleicos de segmento de señal) para permitir que la proteína expresada sea secretada de la célula que produce la proteína. Entre los segmentos de señal adecuados se incluyen un segmento de señal que está asociado naturalmente a la proteína que debe expresarse o a cualquier segmento de señal heterólogo capaz de dirigir la secreción de la proteína según la presente invención. En otra realización, una molécula recombinante de la presente invención comprende una secuencia líder para permitir que una proteína expresada sea transportada e insertada en la membrana de una célula huésped. Entre las secuencias líder adecuadas se incluyen una secuencia líder que está asociada naturalmente a la proteína, o cualquier secuencia líder heteróloga capaz de dirigir el transporte e inserción de la proteína en la membrana de una célula.
En una realización, la molécula de ácidos nucleicos recombinante comprende además una secuencia de ácidos nucleicos codificante de una proteína que debe producir la célula, en la que la secuencia de ácidos nucleicos codificante de la proteína está operablemente ligada a una secuencia de control transcripcional. Las proteínas que pueden resultar deseables para la producción en un Traustoquitriales son conocidas por el experto en la materia y todas pretender estar comprendidas en la presente invención. Entre las proteínas particularmente preferentes se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, proteínas asociadas a la síntesis de un ácido graso seleccionado del grupo que consiste en ácido docosahexaenoico (DHA), ácido docosapentaenoico (DPA), ácido eicosapentaenoico (EPA) y ácido araquidónico (ARA). Entre dichas proteínas se incluyen, por ejemplo, una ácido-graso sintasa, una ácido graso desaturasa, una ácido graso elongasa, una proteína asociada a un complejo de poliquétido sintasa y una proteína asociada a la incorporación de ácidos grasos en fosfolípidos o en moléculas de triacilglicerol. En un aspecto, la proteína es una ácido-graso w-3 desaturasa codificada por la secuencia de ácidos nucleicos SEC ID n° 29. La SEC Id n° 30 representa la secuencia de aminoácidos de la desaturasa. En otro aspecto, la proteína es una isomerasa de ácido graso polienoico. En una realización, entre las proteínas que pueden producirse en microorganismos Traustoquitriales utilizando el presente método se incluyen proteínas asociadas a las rutas biosintéticas de isoprenoide. Entre dichas proteínas se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, HMG-CoA sintasa, HMG-CoA reductasa, escualeno sintasa, fitoeno sintasa, fitoeno desaturasa, una carotenoide ciclasa, una carotenoide hidroxilasa y una carotenoide quetolasa. En todavía otra realización, las proteínas que pueden producirse en los microorganismos Traustoquitriales utilizando el presente método se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, vitamina E y ácido lipoico.
En una realización, la molécula de ácidos nucleicos recombinante útil en el método de la presente invención incluye una secuencia de ácidos nucleicos que se hibrida con una secuencia diana de ácidos nucleicos en el microorganismo, de manera que un gen que comprende la secuencia de ácidos nucleicos diana resulta mutado o inactivado mediante recombinación homóloga con la segunda secuencia de ácidos nucleicos. Dicha secuencia de ácidos nucleicos puede ser homóloga respecto a genes que codifican enzimas (o ácidos nucleicos que regulan la expresión de dichos genes) de las rutas de síntesis de ácido graso saturado y poliinsaturado, genes codificantes de proteínas que participan en la degradación de otros compuestos valiosos producidos por el microorganismo Traustoquitriales o que, de otra manera ,disminuyen el valor del compuesto deseado, o genes codificantes de proteínas que están asociados a la síntesis de compuestos la síntesis de los cuales compite con otras moléculas de interés. Por ejemplo, entre las secuencias de ácidos nucleicos diana se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, secuencias codificantes de lipasas, enzimas de oxidación de ácidos grasos, proteínas que participan en la síntesis de carbohidratos, proteínas que participan en la síntesis de productos de las rutas de isoprenoide, proteínas que participan en la síntesis de componentes de la pared celular, proteínas que participan en las rutas de síntesis de ácidos grasos saturados, proteínas que participan en las rutas de síntesis de ácidos grasos poliinsaturados, proteínas asociadas con un complejo de poliquétido sintasa y proteínas asociadas a la incorporación de ácidos grasos en fosfolípidos o moléculas de trialglicerol.
En una realización de la presente invención, el método para la transformación de microorganismos Traustoquitriales incluye una etapa de introducción en la célula de por lo menos una molécula adicional de ácidos nucleicos recombinante que comprende una secuencia de ácidos nucleicos codificante de una proteína que debe expresarse, estando operablemente ligada a la secuencia de ácidos nucleicos a una secuencia de control transcripcional. Alternativamente, la molécula adicional de ácidos nucleicos recombinante puede incluir una segunda secuencia de ácidos nucleicos que se hibrida con una secuencia de ácidos nucleicos diana en el microorganismo, de manera que un gen que comprende la secuencia de ácidos nucleicos diana resulta mutada o inactivada mediante recombinación homóloga con la segunda secuencia de ácidos nucleicos. De esta manera, pueden introducirse múltiples proteínas en la célula, pueden inactivarse múltiples genes o resultan posibles combinaciones de los dos. La molécula adicional de ácidos nucleicos recombinante puede introducirse en el microorganismo Traustoquitriales simultáneamente con la primera molécula de ácidos nucleicos recombinante (es decir, cotransformarse), o como una transformación posterior (p.ej., a fin de "acumular" características).
En una realización, el método incluye además la etapa de introducir en la célula por lo menos una molécula adicional de ácidos nucleicos recombinante que comprende una secuencia de ácidos nucleicos codificante de una proteína de unión a bleomicina. En esta realización, la molécula adicional de ácidos nucleicos recombinante se introduce preferentemente en una etapa posterior, en lugar de cotransformarse. Preferentemente, la molécula de ácidos nucleicos recombinante que comprende una secuencia de ácidos nucleicos codificante de una proteína de unión a bleomicina que comprende además una secuencia de ácidos nucleicos codificante de una segunda proteína que debe ser expresada por la célula, en la que la secuencia de ácidos nucleicos codificante de la segunda proteína se liga operablemente a una secuencia de control transcripcional. Alternativamente, o adicionalmente, la molécula de ácidos nucleicos recombinante que comprende una secuencia de ácidos nucleicos codificante de una proteína de unión a bleomicina comprende además una segunda secuencia de ácidos nucleicos que se hibrida con una secuencia diana de ácidos nucleicos en el microorganismo, de manera que un gen que comprende la secuencia diana de ácidos nucleicos resulta mutada o inactivada mediante recombinación homóloga con la segunda secuencia de ácidos nucleicos. En una realización, dicha molécula de ácidos nucleicos recombinante comprende una secuencia de ácidos nucleicos SEC ID n° 9.
Entre las células huésped adecuadas para la transformación utilizando el método de la presente invención se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, cualquier microorganismo del orden Traustoquitriales. Las células huésped pueden ser células no transformadas o células que ya se encuentran transfectadas con por lo menos una molécula de ácidos nucleicos. Las células huésped preferentes para la utilización en la presente invención se incluyen microorganismos de un género, incluyendo, aunque sin limitación: Thraustochytrium, Labyrinthuloides, Japonochytriunz y Schizochytrium. Entre las especies preferentes dentro de estos géneros se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, cualquier especie de Schizochytrium, Schizochytrium limacinum, Schizochytrium minutum; cualquier especie de Thraustochytrium species (incluyendo especies de Ulkenia anteriores, tales como U. visurgensis, U. amoebaida, U. sarkariana, U. profunda, U. radiate y U. minuta), e incluyendo Thraustochytrium striatum, Thraustochytriumaureum, Thraustochytrium roseum y cualquier especie de Japonochytrium. Entre las cepas particularmente preferentes de Traustoquitriales se incluyen, aunque sin limitarse a ellas: Schizochytrium sp. (S31)(ATCC 20888); Schizochytrium sp. (S8) (ATCC 20889); Schizochytrium sp. (LC-RM)(ATCC 18915); Schizochytrium sp. (SR21); Schizochytrium aggregatum (Goldstein et Belsky)(ATCC 28209); Schizochytrium limacinum (Honda et Yokochi)(IFO 32693); Thraustochytrium sp.(23B)(ATCC 20891); Thraustochytrium striatum (Schneider)(ATCC 24 473); Thraustochytrium aureum (Goldstein)(ATcC 34304); Thraustochytrium roseum (Goldstein) (At Cc 28210) y Japonochytrium sp. (L1)(ATCC 28207).
Según la presente invención, el término "transformación" se utiliza para referirse a cualquier método por el que una molécula de ácidos nucleicos exógena (es decir, una molécula de ácidos nucleicos recombinante) puede insertarse en las células microbianas, tales como las células microbianas de Traustoquitriales. En sistemas microbianos, el término "transformación" se utiliza para describir un cambio hereditario debido a la adquisición de ácidos nucleicos exógenos por los microorganismos y es esencialmente sinónimo al término "transfección". Entre las técnicas de transformación adecuadas se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, el bombardeo de partículas, la electroporación, la microinyección, la lipofección, la adsorción, la infección y la fusión de protoplastos.
En una realización, una proteína que debe producirse utilizando un método de la presente invención se produce mediante el cultivo de una célula que expresa la proteína (es decir, un microorganismo T raustoquitriales recombinante) bajo condiciones eficaces para producir la proteína. En algunos casos, la proteína puede recuperarse, y en otros, el microorganismo puede recolectarse completo o como lisado y utilizarse como una "biomasa". En otra realización, un gen diana se deleciona o se inactiva mediante el cultivo de una célula que ha sido transformada con una molécula recombinante que comprende un vector de localización de la presente invención bajo condiciones eficaces para permitir la recombinación dentro de la célula, resultando en la deleción o inactivación de un gen diana. Una célula preferente para el cultivo es una célula recombinante de la presente invención. Entre las condiciones de cultivo eficaces se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, medios eficaces, biorreactor, temperatura, pH y condiciones de oxígeno que permiten la producción de proteína y/o la recombinación. Un medio eficaz se refiere a cualquier medio en el que típicamente se cultiva una célula Traustoquitriales. Dicho medio típicamente comprende un medio acuoso que presenta fuentes asimilables de carbono, nitrógeno y fosfato, y sales, minerales, metales y otros nutrientes apropiados, tales como vitaminas. Se comentan en detalle ejemplos de medios y condiciones de cultivo adecuados en la sección de Ejemplos. Las condiciones de cultivo adecuadas para los microorganismos Traustoquitriales también se describen en la patente US n° 5.340.742, publicada el 23 de agosto de 1994, de Barclay. Las células de la presente invención pueden cultivarse en biorreactores de fermentación convencionales, matraces de agitación, probetas, placas de microtitulación y placas Petri. El cultivo puede llevarse a cabo a una temperatura, pH y contenido de oxígeno apropiados para una célula recombinante. Tales condiciones de cultivo se encuentran comprendidas dentro de los conocimientos del experto ordinario en la materia.
Dependiendo del vector y sistema huésped utilizado para la producción, las proteínas resultantes de la presente invención pueden permanecer dentro de la célula recombinante, secretarse al medio de fermentación, secretarse a un espacio entre dos membranas celulares, o retenerse sobre la superficie externa de una membrana celular. La expresión "recuperación de la proteína" se refiere a recolectar el medio de fermentación completa que contiene la proteína y no requiere necesariamente etapas adicionales de separación o purificación. Las proteínas producidas mediante el método de la presente invención pueden purificarse utilizando una diversidad de técnicas estándares de purificación de proteínas, tales como, aunque sin limitarse a ellas, la cromatografía de afinidad, la cromatografía de intercambio iónico, la filtración, la electroforesis, la cromatografía de interacción hidrofóbica, la cromatografía de filtración en gel, la cromatografía de fase inversa, la cromatografía de cancanavalina A, el cromatoenfoque y la solubilización diferencial. Las proteínas producidas mediante el método de la presente invención preferentemente se recuperan en forma "sustancialmente pura". Tal como se utiliza en la presente memoria, "sustancialmente puro" se refiere a una pureza que permite la utilización eficaz de la proteína como producto comercial.
Todavía otra realización de la presente invención se refiere a un microorganismo recombinante del orden Traustoquitriales que ha sido transformado con una molécula de ácidos nucleicos recombinante que comprende una secuencia de ácidos nucleicos codificante de una acetolactato sintasa de la presente invención. Preferentemente, la acetolactato sintasa proporciona al microorganismo una sensibilidad reducida a compuestos seleccionados del grupo que consiste en compuestos sulfonilurea, inhibidores de clase imidazolinona y oxibenzoatos de pirimidinilo. Las moléculas de ácidos nucleicos recombinantes adecuadas y las secuencias para la utilización en la transformación de dicho microorganismo han sido descritas en detalle anteriormente. Dicho microorganismo puede transformarse adicionalmente con otras moléculas de ácidos nucleicos recombinantes, incluyendo moléculas de ácidos nucleicos recombinantes que comprenden un marcador seleccionable gen ble y secuencias de control transcripcional de Traustoquitriales, tal como se ha indicado anteriormente en la presente memoria. Los microorganismos Traustoquitriales recombinantes según la presente invención se describen en la sección de Ejemplos. Según la presente invención, un microorganismo Traustoquitriales recombinante de la presente invención se manipula genéticamente para expresar una proteína de interés (se han comentado anteriormente ejemplos de tales proteínas) utilizando los vectores recombinantes indicados en la presente memoria y/o se manipulan genéticamente para una deleción o inactivación dirigida de un gen diana utilizando los vectores recombinantes indicados en la presente memoria.
Tal como se utiliza en la presente memoria, un microorganismo recombinante presenta un genoma que ha sido modificado (es decir, mutado o modificado) respecto a su forma normal (es decir, de tipo salvaje o natural) utilizando tecnología recombinante. Un microorganismo recombinante según la presente invención puede incluir un microorganismo en el que se han insertado, delecionado o modificado moléculas de ácidos nucleicos (es decir, se han mutado, p.ej., mediante inserción, deleción, sustitución y/o inversión de nucleótidos), de manera que tales modificaciones proporcionen el efecto deseado dentro del microorganismo. Tal como se utiliza en la presente memoria, las modificaciones genéticas que resultan en una reducción de la expresión génica, en la función del gen, o en la función del producto génico (es decir, la proteína codificada por el gen) puede denominarse inactivación (completa o parcial), deleción, interrupción, bloqueo o regulación negativa de un gen. Por ejemplo, una modificación genética en un gen que resulta en una reducción de la función de la proteína codificada por dicho gen puede resultar en una deleción completa del gen (es decir, el gen no existe y, por lo tanto, la proteína no existe), una mutación en el gen que resulta en una traducción incompleta o nula de la proteína (p.ej., la proteína no se expresa) o una mutación en el gen que reduce o anula la función natural de la proteína (p.ej., se expresa una proteína que presenta una actividad o acción enzimática reducida o nula). Puede hacerse referencia a las modificaciones genéticas que resultan en un incremento de la expresión o función génica como amplificación, sobreproducción, sobreexpresión, activación, potenciación, adición o regulación positiva de un gen.
Según la presente invención, puede producirse un microorganismo Traustoquitriales recombinante utilizando cualquier microorganismo del orden Traustoquitriales. Entre los géneros preferentes de Traustoquitriales se incluyen, aunque sin limitarse a ellos: Thraustochytrium, Labyrinthuloides, Japonochytrium, y Schizochytrium. Entre las especies preferentes dentro de dichos géneros se incluyen, aunque sin limitarse a ellas: cualquier especie de Schizochytrium incluyendo Schizochytrium aggregatum y Schizochytrium limacinum; cualquier especie de Thraustochytrium (incluyendo cualquier de las especies anteriores de Ulkenia, tales como U. visurgensis, U. amoeboida, U. sarkariana, U. profunda, U. radiata, U. minuta y Ulkenia sp. BP-5601), Thraustochytrium striatum, Thraustochytrium aureum, Thraustochytrium roseum; y cualquier especie de Japonochytrium. Entre las cepas particularmente preferentes de Traustoquitriales se incluyen, aunque sin limitarse a ellas: Schizochytrium sp. (S31)(ATCC 20888); Schizochytrium sp. (S8) (ATCC 20889); Schizochytrium sp. (LC-RM)(ATCC 18915); Schizochytrium sp. (SR21); Schizochytrium aggregatum (Goldstein et Belsky)(ATCC 28209); Schizochytrium limacinum (Honda et Yokochi)(IFO 32693); Thraustochytrium sp.(23B)(ATCC 20891); Thraustochytrium striatum (Schneider)(ATCC 2424473); Thraustochytrium aureum (Goldstein)(ATCC 34304); Thraustochytrium roseum (Goldstein)(ATCC 28210) y Japonochytrium sp. (L1)(ATCC 28207).
Los ejemplos siguientes se proporcionan con fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la presente invención.
Ejemplos
Ejemplo 1
El presente ejemplo describe la producción del plásmido recombinante pTUBZEO11-2. La construcción del plásmido recombinante pTUBZEO11-2 se ilustra en las figs. 1 y 2. Este plásmido contiene el gen ble de Streptoalloteichus hindustanus funcionalmente acoplado con un promotor de gen de a-tubulina aislado a partir de Schizochytrium sp. Este plásmido se produjo de la manera siguiente: Se aisló un clon de ADNc (CGNE0002-001-B6) a partir de una biblioteca de ADNc de Schizochytrium sp. y se secuenció parcialmente (SEC ID n° 1) como parte de un proyecto de secuenciación de ADNc a gran escala de Schizochytrium. Se determinó que la secuencia de nucleótidos codificaba la a-tubulina mediante búsqueda de homología de BlASTX (Gish W. y D. States, Nat. Genet. 3:266-272, 1993). La secuencia de aminoácidos deducida a partir de las bases 116 a 550 era 93% idéntica a los primeros 145 aminoácidos de la a-tubulina de Pelvetica fastigiata (GenBank n° de acceso U58642).
Con el fin de aislar el promotor asociado a dicho gen, se aisló el ADN genómico a partir de células de Schizochytrium sp. y se procesó mediante la utilización de un kit "GenomeWalker™" (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA), que implica la digestión enzimática de ADN genómico con endonucleasas de restricción para generar extremos romos, seguido de la ligación del ADN digerido a moléculas adaptadoras específicas de ADN bicatenario proporcionadas en el kit. A continuación, se amplificó el ADN cadena arriba de la secuencia codificante de a-tubulina mediante la reacción en cadena de polimerasa (PCR) utilizando el cebador adaptado externo (AP1) proporcionado en el kit y el cebador específico de a-tubulina PGR20 (SEC ID n° 2). Se llevó a cabo una amplificación adicional del gen utilizando el cebador adaptador anidado (AP2) proporcionado en el kit y el cebador anidado específico de a-tubulina PGR19 (SEC ID n° 3). Los productos de PCR resultantes se subclonaron en el plásmido pCR2.1-TOPO (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). Se secuenció uno de los fragmentos subclonados: la secuencia de 725 pb inmediatamente anteriores al codón de inicio del gen de a-tubulina se proporciona como SEC ID n° 4.
Utilizando cebadores oligonucleótidos basándose en la secuencia de ADN obtenida de esta manera, se utilizó la PCR utilizando la ADN polimerasa Taq (Perkin-Elmer Corp., Norwalk, CT) para generar una región de promotor de atubulina modificada en la que se había incorporado un sitio de restricción NcoI en el extremo 3' del fragmento de ADN; este sitio NcoI contenía un codón de inicio que se encontraba en la misma posición que en la región codificante de atubulina. Los cebadores utilizados en esta reacción eran PGR33 (SEC ID n° 5) y Pg R34 (SEC ID n° 6) y el molde era ADN genómico aislado a partir de células de Schizochytrium sp. Se utilizaron las condiciones de reacción siguientes: 94°C durante 4 min; (94°C durante 1 min, 54°C durante 45 s, 72°C durante 2 min) x 30; 72°C durante 7 min. Este fragmento se clonó en el plásmido pCR2.1-TOPO para formar el plásmido p7TUB (SEC ID n° 7). Se digirió el plásmido p7TUB con NcoI y un fragmento de 463 pb resultante que contenía la región de promotor de a-tubulina de Schizochytrium se aisló mediante purificación en gel de agarosa. El plásmido pSV40/Zeo (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA), que contiene el gen ble de Streptoalloteichus hindustanus flanqueado por un promotor de SV40 y terminador, también se digirió con NcoI, rindiendo un fragmento de 3.201 pb y un fragmento de 314 pb. El fragmento de 3.201 pb se purificó en gel de agarosa y se ligó en el fragmento NcoI de 463 pb a partir de p7TUB, rindiendo pTUBZEO-11 (SEC ID n° 8), ilustrado en la fig. 1.
A continuación, el plásmido pTUBZEO-11 se digirió con SphI y un fragmento de 1.122 pb resultante que contenía el gen ble flanqueado por el promotor de a-tubulina de Schizochytrium y el terminador de SV40 se purificó en gel de agarosa y se ligó al plásmido pUC19 (Messing, J., Meth. Enzymol. 101:20, 1983) que había sido linearizado mediante digestión con SphI. El plásmido resultante se denominó pTUBZEO11-2 (SEC ID n° 9) y se ilustra en las figs. 2 y 4. El plásmido pTUBZBO11-2 también se denomina pMON50000. En la SEC ID n° 9, se encuentra contenido el promotor de a-tubulina de Schizochytrium, dentro de los nucleótidos 441-894; la región codificante del gen ble se encuentra contenida dentro de los nucleótidos 895-1.269, y el terminador de SV40 se encuentra contenido dentro de los nucleótidos 1.270-1.524.
Ejemplo 2
El presente ejemplo describe la producción de los plásmidos recombinantes pMON50200, pMON50201, pMON50202 y pMON50203.
Se aisló el gen codificante de acetolactato sintasa nativa (als) de Schizochytrium sp. de la manera siguiente. Se aisló un clon de ADNc (LIB81-028-Q1-E1-D9) a partir de una biblioteca de ADNc de Schizochytrium y se secuenció parcialmente (SEC ID n° 11) como parte de un proyecto de secuenciación de ADNc a gran escala de Schizochytrium sp. Se determinó mediante homología de BLASTX que la secuencia de nucleótidos codificaba acetolactato sintasa, p.ej., la secuencia de aminoácidos deducida de las bases 154 a 378 era 68% idéntica a los aminoácidos 313 a 387 de ALS de Schizosaccharomyces pombe (GenBank, n° de acceso P36620). A continuación, se obtuvo la secuencia de longitud completa de dicho ADNc clonado, que indicaba que el clon de ADNc no contenía la región codificante de als entera. Con el fin de obtener el gen als de longitud completa, se sondeó una biblioteca genómica de lambda de Schizochytrium utilizando protocolos estándares (ver, p.ej., Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) con una sonda de ADN de 372 pb marcada con digoxigenina (DIG, denominada sonda ALS2). Se generó la sonda LAS2 mediante PCR utilizando una mezcla de nucleótidos que incluía DIG-11-UTP (Boehringer Mannheim Biochemicals GmbH, Alemania), utilizando el cebador directo PGR38 (SEC ID n° 12) yy el cebador inverso PGR39 (SEC ID n° 13), que estaban basados en la secuencia de ADNc clon LIB81-028-Q1-E1-D9. Se aisló uno de los clones genómicos identificados con la sonda ALS2, denominado ALS-4A, y se caracterizó adicionalmente mediante transferencias de hibridación southern utilizando la sonda ALS2 marcada con DIG. Se encontró que un fragmento de 4,9 kpb procedente de ADN de lambda ALS-4A digerido con AhdI se hibridaba con la sonda ALS2. Se aisló este fragmento mediante purificación en gel de agarosa, se trató con ADN polimerasa de T4 con el fin de generar extremos romos y después se ligó en pBluescriptII KS+ digerido con SmaI (Stratagene Corp., La Jolla, CA) para formar el plásmido pMON50200 (ilustrado en la fig. 3-A). La secuencia de pMON50200 se proporciona como SEC ID n° 14. La secuencia del enzima acetolactato sintasa codificada por el gen als de Schizochytrium se proporciona como SEC ID n° 15.
Se produjeron los plásmidos pMON50201, pMON50202 y pMON50203 (ilustrados en las figs. 3-B, 3-C y 3-D, respectivamente) a partir del plásmido pMON50200 mediante mutagénesis dirigida a sitio, de manera que los enzimas acetolactato sintasa codificados ya no resultan inhibidos por determinados compuestos, incluyendo sulfometurónmetilo (SMM). Estos plásmidos se construyeron de la manera siguiente. El kit de mutagénesis dirigida a sitio "Transformera" (Clontech Laboratories Inc., Palo Alto, CA) se utilizó para introducir las mutaciones siguientes en el plásmido pMON502000 siguiendo las instrucciones del fabricante. Se utilizó un cebador oligonucleótido de selección, DM19 (SEC ID n° 16) en los tres constructos; este cebador conduce a la conversión de un sitio EcoRV único en el sitio de clonación múltiple de pMON50200 en un sitio AutII. Se utilizó el cebador DM14 (SEC ID n° 17) para modificar el residuo aminoácido número 595 en el enzima ALS codificado de triptófano a valina, introduciendo simultáneamente un sitio AclI en la secuencia génica; el plásmido resultante se denominó pMON50201 (SEC ID n° 18). De manera similar, el cebador DM15 (SEC ID n° 20) se utilizó para modificar el residuo aminoácido número 192 en el enzima ALS codificado de una prolina a una glutamina y para introducir un sitio SsgI en el gen als, resultando en el plásmido pMON50202 (SEC ID n° 21). Para la construcción del plásmido pMON50203 (SEC ID n° 23), se utilizaron ambos cebadores DM14 y DM15, resultando en un enzima ALS codificado que contenía ambas sustituciones de residuos aminoácidos descritos anteriormente. Las secuencias de los enzimas acetolactato sintasa mutante codificados por los plásmidos pMON50201, pMON50202 y pMON50203 se proporcionan como SEC ID n° 19, SEC ID n° 22 y SeC ID n° 24, respectivamente.
Ejemplo 3
El presente ejemplo describe la transformación genética de Schizochytrium sp. con las moléculas recombinantes descritas en los Ejemplos 1 y 2.
La cepa utilizada en el presente ejemplo en Schizochytrium sp. N230D, un derivado de la cepa 20888 de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Para los cultivos líquidos, las células se cultivaron axénicamente en medio M50-3 a 30°C bajo agitación a 200-300 rpm. El medio M50-3 contenía los componentes siguientes: NaCl, 12,5 g; MgSO4^7H2O, 2,5 g; KCl, 0,5 g; CaCl2 , 0,05 g; glucosa, 30 g; Na-glutamato, 3 g; KH2PO4 , 0,4 g; extracto de levadura, 1 g; NaHCOa , 0,4 g; Na2EDTA, 30 mg; FeCla^ O , 1,2 mg; H3BO3 , 34,2 mg; ZnSO4^7H2O; 0,67 mg; CoCb^6H2O, 0,13 mg; NaMoO4^H 2O, 25 |jg; CuSO4^5H2O, 10 |jg; NiSO4^6H2O, 0,26 mg; tiamina^HCl, 100 |jg; biotina, 0,5 |jg; cianocobalamina, 0,5 jig y agua desionizada (enrase a un litro); pH final ajustado a 7,0. Para el crecimiento en medio sólido, las células se cultivaron a 30°C sobre medio M50-3 o medio M1E-3 solidificado mediante la adición de agar al 1,5% (p/v). El medio M1E-3 contiene los componentes siguientes: glucosa, 4 g; (NH4)2SO4 , 0,75 g; Na2SO4 , 5 g; MgSO4^7H2O, 2 g; KH2PO4 , 0,5 g; KCl, 0,5 g; CaCb^2 H2O, 0,1 g; tampón MOPS, 20,9 g; FeSO4^4H2O, 0,3 mg; MnCl2^4H2O, 0,1 mg; ZnSO4^7H2O; 80 jig; CoCb^6H2O, 2 jig; NaMoO4^2H2O, 1 jig; CuSO4^5H2O, 60 jig; NiSO4^6H2O, 80 jig; tiamina^HCl, 320 jig; CA-pantotenato, 320 jig; cianocobalamina, 8 jig, y agua desionizada (enrase a un litro); pH final ajustado a 7,0.
La sensibilidad de Schizochytrium sp. a Zeocin™ y SMM se determinó mediante la inclusión de estos inhibidores en medio M1E-3 solidificado a diversas concentraciones y extendiendo las células sobre las placas a densidades similares a las presentes durante los procedimientos utilizados para la selección de células recombinantes.
Se llevó a cabo la transformación genética de las células de Schizochytrium mediante bombardeo de partículas (Sanford J.C., F.D. Smith y J.A. Russell, Meth. Enzymol. 217:483-509, 1993) utilizando un sistema de inyección de partículas Bio-Rad Biolistic PDS-1000/He (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Ca). Se cultivaron células Schizochytrium sp. N230D en medio M50-3 líquido hasta una densidad óptica de 680 nm (DO680) de 0,4 a 0,8 (longitud del camino óptico: 10 mm). Se centrifugó brevemente una alícuota de células correspondiente a 1,0 DO680, se eliminó la solución sobrenadante y las células peletizadas se resuspendieron en 100 jil de agua estéril. A continuación, las células resuspendidas se extendieron en un círculo de 4 a 6 cm sobre una placa Petri que contenía medio agar solidificado (p.ej., medio M50-3 o M1E-3) y se dejó en reposo durante 30 a 60 min de manera que pudiese absorberse el exceso de agua en el medio sólido; a esto se le denomina placa diana.
Se utilizó una alícuota de 1,5 mg de microportadores de oro (diámetro nominal de 0,6 jim, disponible de Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA) con 2,5 jig de ADN plasmídico de transformación (es decir, plásmido TUBZEO11-2, pMON50201, pMON50202 o pMoN50203) siguiendo las instrucciones del fabricante (manual de instrucciones del sistema de inyección de partículas Biolistic® PDS-1000/He; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Las células se bombardearon con los microportadores de oro recubiertos con ADN utilizando las condiciones siguientes: disco de ruptura de 1.100 psi, cámara de vacío de 25° Hg, ensamblaje de lanzamiento de microportador en el estante superior y placas diana en el estante intermedio, proporcionando una distancia de disco de ruptura a malla de retención de 1,5 a 2 cm y una distancia de malla de retención a diana de aproximadamente 7 cm. Tras el bombardeo, se dejó que las células se recuperasen sobre las placas diana durante 4 a 6 horas a 30°C. A continuación, se desprendieron las células de las placas diana mediante enjuague con 1,5 ml de agua estéril, se recolectaron en un tubo de microcentrífuga, se centrifugaron brevemente y se resuspendieron en 400 |jl de agua estéril. Se extendieron cien microlitros de la suspensión sobre cuatro placas M1E-3 que contenía 150 a 200 jg/m l de Zeocin™ (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) o 25 jg/m l de SMM. Las placas que contenían Zeocin™ se utilizaron para seleccionar las células que habían sido transformadas con plásmido pTUBZEO11-2, mientras que las placas que contenían SMM se utilizaron para seleccionar las células que habían sido transformadas con los plásmidos pMON50201, pMON50202 o pMON50203. A continuación, las placas se incubaron durante 7 a 10 días a 30°c. Las colonias que aparentemente eran resistentes al agente selectivo seguidamente se sembraron sobre placas de M1E-3 fresco que contenía el mismo agente selectivo, a fin de confirmar la resistencia. Este protocolo resulta típicamente en la generación de 100 a 1.000 cepas resistentes a Zeocin™ o a SMM por cada bombardeo.
Ejemplo 4
El ejemplo a continuación demuestra el análisis por PCR de células de Schizochytrium transformadas.
Se utilizó la PCR para confirmar la presencia de secuencias de plásmido en las cepas putativamente transformadas que eran resistentes a los agentes selectivos Zeocin™ o SMM. Se obtuvo ADN molde de transformantes putativos y células de Schizochytrium N230D no recombinantes, mediante la utilización de un asa de inoculación de 1 j l de plástico de un solo uso a fin de extraer una pequeña cantidad de células (1 a 2 mm3) de las colonias resistentes que habían sido sembradas sobre placas de agar (tal como se indica en el Ejemplo 3). Las células se resuspendieron en 15 a 20 j l de Triton X-100 al 1% en un tubo de microcentrífuga, se introdujeron en un baño de agua en ebullición durante 10 minutos y después se centrifugaron durante 5 minutos a 14.000xg. Se utilizaron partes de estos extractos (1 a 3 j l) para proporcionar el ADN molde para reacciones de PCR de 25 j l utilizando a Dn polimerasa Taq. Para detectar la presencia de secuencias de pTUBZEO11-2 en el ADN de Schizochytrium, se utilizaron los cebadores DM20 (SEC ID n° 25) y DM21 (SEC ID n° 26); estos cebadores se hibridan con el gen ble en el plásmido pTUBZEO11-2 y amplifican un fragmento de ADN de 346 pb. El perfil térmico utilizado fue el siguiente: 94°C durante 4 min; (94°C durante 45 s, 52°C durante 45 s, 72°C durante 2 min) x 30; 72°C durante 7 min. Con el fin de detectar la presencia de secuencias de pMON50201, pMON50202 o pMON50203 en el ADN de Schizochytrium, se utilizaron los cebadores BLA1 (SEC ID n° 27) y BLA2 (SEC ID n° 28); estos cebadores se hibridan con el gen bla (resistencia a ampicilina) presente en el esqueleto de vector y amplifican un fragmento de ADN de 1.229 pb. El perfil térmico utilizado fue el siguiente: 94°C durante 4 min (94°C durante 45 s, 55°C durante 45 s, 72°C durante 2 min) x 30; 72°C durante 7 min. Los productos de PCR se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa estándar, seguido de la tinción con bromuro de etidio.
Los resultados de estos análisis confirman que la amplia mayoría de cepas seleccionadas bajo estas condiciones son transformantes verdaderos que contiene ADN plasmídico. No se generaron productos de PCR del tamaño correcto al utilizar ADN molde de las células de Schizochytrium sp. N230D de control que no habían sido bombardeadas con los plásmidos de transformación.
Ejemplo 5
El ejemplo a continuación describe los análisis de transferencia southern de las células de Schizochytrium transformadas.
Se llevaron a cabo transferencias de hibridación southern utilizando ADN aislado a partir de células de Schizochytrium N230D parental y varios transformantes putativos con el fin de confirmar la presencia de secuencias de ADN de vector de transformación dentro de las células transformadas; se llevó a cabo transferencia southern utilizando técnicas conocidas por el experto en la materia (ver, p.ej., Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Se aisló ADN mediante la utilización de un kit de purificación de ADN "QIAamp" (Qiagen Inc., Valencia, CA) digerido con diversos enzimas de restricción, se separaron mediante electroforesis a través de geles de agarosa (0,8%-1,2% p/v) y después se transfirieron a membranas de nilón mediante transferencia capilar alcalina.
La detección del ADN del vector en las células transformadas con pTUBZEO11-2 se llevó a cabo mediante la utilización del sistema a base de DIG "Genius" (Boehringer Mannheim Biochemicals GmbH, Alemania), utilizando como sonda de hibridación, un fragmento de gen ble marcado con DIG de 346 pb generado mediante PCR con los cebadores DM20 (SEC ID n° 25) y DM21 (SEC ID n° 26) y una mezcla de nucleótidos que incluía DIG-11-UTP. La prehibridación de la membrana se llevó a cabo a 68°C durante 1 h en el tampón de hibridación suministrado en el kit Genius. La hibridación se llevó a cabo a 68°C durante 18 h en tampón de hibridación que contenía la sonda del gen ble que había sido desnaturalizada por calor durante 5 min a 94°C. A continuación, las membranas se lavaron dos veces durante 5 min con 50 ml de 2X Ss C/SDS al 0,1% y dos veces durante 15 min en 50 ml de 0,1XSSC/SDS al 0,1%. La detección quimioluminiscente del ADN hibridante se llevó a cabo tal como se indica en las instrucciones del kit Genius.
El ADN procedente de las células de Schizochytrium N230D no transformadas no se hibridó con la sonda de gen ble. A la inversa, el ADN procedente de las células transformadas se hibridó con la sonda, de la manera siguiente: SphI: el ADN digerido con Sphl procedente de células de Schizochytrium transformadas contenía un fragmento de ADN de -1.100 pb que se hibridaba con la sonda génica ble; este fragmento, que también se observó en el ADN de pTUBZEO11-2 digerido con SphI, representa el casete de expresión del gen ble entero (que incluye el promotor del gen de tubulina y el terminador de SV40).
XhoI: para cada uno de los transformantes sometidos a ensayo, la digestión con XhoI del ADN resultó en fragmentos hibridantes de tamaño superior a 15-20 kpb. XhoI no corta dentro de pTUBZBO11-2 y, por lo tanto, estos resultados indican que pTUBZEO11-2 aparentemente no existe en forma de elemento extracromosómico en las células transformadas, sino que por el contrario se integra en el cromosoma de Schizochytrium.
NcoI o HindIII: ambos enzimas cortan una vez dentro de pTUBZEO11-2. La digestión del ADN transformante con cualquiera de estos enzimas típicamente conduce a un fragmento hibridante prominente que comigra con el vector pTUBZEO11-2 linearizado (es decir, -3 ,8 kpb). Ello sugiere que el vector puede integrarse en el cromosoma en forma de repeticiones en tándem.
Ejemplo 6
El presente ejemplo demuestra la recombinación homóloga en Schizochytrium.
Los experimentos siguientes se llevaron a cabo para demostrar que puede producirse la recombinación homóloga en Schizochytrium entre las secuencias de ADN nativo endógenas y las secuencias de ADN homólogas presentes en las moléculas de ADN recombinante introducidas en las células. Este tipo de recombinación homóloga puede resultar muy beneficioso para producir cepas recombinantes con propiedades deseables. Por ejemplo, puede utilizarse la recombinación homóloga para inactivar genes endógenos mediante la inserción dirigida de secuencias genéticas foráneas. Además, puede utilizarse la recombinación homóloga para sustituir un gen endógeno o parte del mismo por una forma alterada del gen de manera que las células recombinantes muestran nuevas propiedades.
Se demostró que la recombinación homóloga se produce en las células de Schizochytrium transformadas con el plásmido pMON50202, que contiene una mutación en el gen als de Schizochytrium. Esta mutación introduce un sitio SsgI en la posición de pb 571 de la región codificante als. Existe un sitio SsgI natural en la posición de pb 1.324 de la región codificante als. Por lo tanto, pueden utilizarse transferencias southern de ADN de Schizochytrium digerido con SsgI para diferenciar el gen als nativo del gen als mutante recombinante. Para estos experimentos, se produjo una sonda de hibridación específica de als mediante PCR utilizando una mezcla de nucleótidos que incluía DIG-11-UTP (Boehringer Mannheim Biochemicals GmbH, Alemania), el cebador directo PGR28 (SEC ID n° 32), el cebador inverso PGR30 (SEC ID n° 33) y una pequeña cantidad de pMON50200 como el molde. La sonda de hibridación marcada con DIG de 323 pb resultante se denominó ALS1.
Se digirió ADN procedente de células de Schizochytrium N230D no recombinantes con SsgI y AhdI separadamente, se sometieron a electroforesis en gel de agarosa, se transfirieron a una membrana de nilón y después se sondearon con la sonda ALS1 utilizando procedimientos esencialmente iguales a los indicados en el Ejemplo 5. La sonda ALS1 marcó un fragmento de 1,76 kpb de ADN digerido con SsgI y un fragmento de 4,9 kpb de a Dn digerido con AhdI.
Las transferencias southern de DHA digerido con SshI y AhdI procedente de diversas cepas recombinantes que habían sido transformadas con pMON50202 también se sondearon con la sonda ALS1. En algunos casos, el fragmento SsgI de 1,76 kpb no se encontraba presente y en su lugar se marcaba un fragmento de 0,75 kpb correspondiente al fragmento SsgI de 753 pb presente en pMON50202. Se marcó un fragmento AgdI de 4,9 kpb en estas cepas recombinantes, sin embargo, indicando que el gen als mutante recombinante se había recombinado con el gen als nativo mediante recombinación homóloga de doble entrecruzamiento.
También se observó que se producía recombinación homóloga de un solo entrecruzamiento en cepas recombinantes transformadas con pMON50202. En estos casos, se marcaron los fragmentos SsgI tanto de 1,76 kpb como de 0,75 kpb en las transferencias southern de ADN procedentes de las cepas recombinantes, pero el fragmento AhdI de 4,9 kpb se sustituyó por fragmentos marcados de mayor tamaño, indicando que el vector pMON50202 completo se había insertado en el gen als nativo, como una copia única o como repeticiones en tándem.
Se obtuvo evidencia adicional de recombinación homóloga en Schizochytrium mediante la introducción de moléculas de ADN recombinantes que contenían un gen als mutante truncado, de manera que el enzima ALS incompleto codificado por el gen truncado no era funcional. Este gen truncado se produjo mediante digestión de pMON50202 con ClaI e HindIII, rindiendo un fragmento de 2,8 kpb, eliminando de esta manera los últimos 388 pb de la secuencia codificante als junto con la región de terminador de als. Este fragmento de 2,8 kpb se ligó en pBluescriptII KS+ (Stratagene Corp., La Jolla, CA) que había sido digerido con ClaI e HindIII, rindiendo el plásmido pAR2. Sólo se esperaría que el plásmido pAR2 proporcionase resistencia a SMM en las células de Schizochytrium transformadas en el caso de que un gen als mutante funcional se restaurase en las cepas transformadas mediante recombinación homóloga entre el gen als nativo y el gen als mutante truncado presente en pAR2. Se introdujo este constructo en las células de Schizochytrium N230D mediante bombardeo de partículas y se aislaron las cepas resistentes a SMM tal como se indica en el Ejemplo 3. El análisis de transferencia western del ADN digerido con SsgI procedente de los

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    Molécula aislada de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en:
    a. SEC ID n° 4;
    b. nucleótidos 441 a 894 de SEC ID n° 9;
    c. una secuencia de ácidos nucleicos que es por lo menos aproximadamente 95% idéntica a los nucleótidos 441 a 894 de la SEC ID n° 9 a lo largo de la longitud completa de los nucleótidos 441 a 894 de la SEC ID n° 9, en la que dicha secuencia de ácidos nucleicos presenta una actividad transcripcional por lo menos basal del promotor a-tubulina, y
    d. un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que es totalmente complementaria a dicho polinucleótido de (a), (b) o (c).
    Vector recombinante para la transformación de microorganismos del Orden T raustoquitriales, que comprende una secuencia de ácidos nucleicos codificante de una proteína de unión a bleomicina operablemente ligada a un promotor a-tubulina de Traustoquitriales que comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en los nucleótidos 441 a 894 de la SEC ID n° 9, y una secuencia de ácidos nucleicos que es por lo menos aproximadamente 95% idéntica a los nucleótidos 441 a 894 de la SEC ID n° 9 a lo largo de la longitud completa de los nucleótidos 441 a 894 de la SEC ID n° 9, en la que dicha secuencia de ácidos nucleicos presenta una actividad transcripcional por lo menos basal del promotor atubulina.
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