ES2377557T3 - Acetolactato sintasa y procedimiento para la transformación de microorganismos de Thraustochytriales - Google Patents

Abstract

Molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada de entre el grupo constituido por: a. una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº :15, SEC ID nº :19, SEC ID nº :22 y SEC ID nº :24, en la que dicha proteína es una acetolactato sintasa;b. una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos de (a), en la que dicha proteína es una acetolactato sintasa; y, c. una secuencia de ácido nucleico que es completamente complementaria a dicha secuencia de ácido nucleico de (a) o (b) .

Description

Acetolactato sintasa y procedimiento para la transformación de microorganismos de Thraustochytriales.

Campo de la invención

La presente invención se refiere generalmente a una molécula de ácido nucleico aislada que codifica para una acetolactato sintasa de Thraustochytriales, incluyendo las acetolactato sintasas que confieren una sensibilidad reducida a compuestos de sulfonilurea, inhibidores de la clase imidazolinona y/o oxibenzoatos de pirimidinilo, sobre microorganismos del orden Thraustochytriales; a moléculas de ácido nucleico recombinantes que comprenden marcadores seleccionables útiles para la transformación de microorganismos del orden Thraustochytriales y a procedimientos de transformación de tales microorganismos utilizando moléculas de ácido nucleico recombinantes de la presente invención. La presente invención también se refiere a promotores génicos útiles en sistemas de expresión de Thraustochytriales. Las moléculas de ácido nucleico recombinantes de la presente invención pueden utilizarse para la expresión de ácidos nucleicos foráneos en un microorganismo de Thraustochytriales así como para la deleción, mutación o inactivación de genes en microorganismos de Thraustochytriales.

Antecedentes de la invención

El desarrollo ha dado como resultado la revisión de la taxonomía de los traustoquítridos. Los teóricos de la taxonomía ubican a los traustoquítridos con las algas o protistas similares a algas. Sin embargo, debido a la incertidumbre taxonómica, sería lo mejor en el contexto de la presente invención considerar las cepas descritas en la presente invención como traustoquítridos (orden: Thraustochytriales; familia: Thraustochytriaceae; género: Thraustochytrium, Schizochytrium, Labyrinthuloides o Japonochytrium). Los cambios taxonómicos se resumen a continuación.

Las cepas de ciertos microorganismos unicelulares dadas a conocer y reivindicadas en la presente memoria son miembros del orden Thraustochytriales. Los traustoquítridos son eucariotas marinos con una historia taxonómica problemática. Los problemas con la colocación taxonómica de los traustoquítridos se han revisado por Moss (1986), Bahnweb y Jackle (1986) y Chamberlain y Moss (1988).

Por fines de conveniencia, los taxonomistas colocaron a los traustoquítridos al principio con otros eucariotas zoospóricos incoloros en los Phycomycetes (hongos similares a algas). El nombre Phycomycetes, sin embargo, se eliminó con el tiempo del estado taxonómico, y los traustoquítridos se mantuvieron en los Oomycetes (los hongos zoospóricos biflagelados). Se supuso inicialmente que los Oomycetes estaban relacionados con las algas heterocontas, y con el tiempo una amplia gama de estudios bioquímicos y ultraestructurales, resumidos por Barr (1983) apoyaron esta suposición. Los Oomycetes fueron de hecho aceptados por Leedale (1974) y otros ficólogos como parte de las algas heterocontas. Sin embargo, por razones de conveniencia que resultaban de su naturaleza heterotrófica, los Oomycetes y traustoquítridos se han estudiado en gran parte por micólogos (científicos que estudian hongos) en vez de ficólogos (científicos que estudian algas).

Desde otra perspectiva taxonómica, los biólogos evolucionistas han desarrollado dos escuelas de pensamiento generales en cuanto a cómo evolucionaron los eucariotas. Una teoría propone un origen exógeno de los orgánulos rodeados por membrana a través de una serie de endosimbiosis (Margulis 1970); por ejemplo, las mitocondrias se derivaron de endosimbiontes bacterianos, los cloroplastos de cianofitas y los flagelos de espiroquetas. La otra teoría sugiere una evolución gradual de los orgánulos rodeados por membrana a partir de los sistemas no rodeados por membrana del ancestro procariota por medio de un proceso autógeno (Cavalier-Smith 1975). Ambos grupos de biólogos evolucionistas, sin embargo, han retirado a los Oomycetes y traustoquítridos de los hongos y los colocan o bien con las algas cromofitas en el reino Chromophyta (Cavalier-Smith 1981) (este reino se ha expandido más recientemente para incluir otros protistas y los miembros de este reino se denominan ahora Stramenopiles) o bien con todas las algas en el reino Protoctista (Margulis y Sagan (1985).

Con el desarrollo de la microscopía electrónica, los estudios de la ultraestructura de las zoosporas de dos géneros de traustoquítridos, Thraustochytrium y Schizochytrium, (Perkins 1976; Kazama 1980; Barr 1981) han proporcionado pruebas válidas de que los Thraustochytriaceae están sólo relacionados de manera distante con los Oomycetes. Adicionalmente, datos genéticos que representan un análisis de correspondencia (una forma de estadística multivariante) de secuencias de ARN ribosómico 5 S indican que Thraustochytriales son claramente un único grupo de eucariotas, completamente separados de los hongos, y lo más estrechamente relacionados con las algas rojas y marrones, y con miembros de los Oomycetes (Mannella et al. 1987). La mayoría de los taxonomistas están de acuerdo con retirar a los traustoquítridos de los Oomycetes (Bartnicki-Garcia 1988).

En resumen, utilizando el sistema taxonómico de Cavalier-Smith (1981, 1983), los traustoquítridos se clasifican con las algas cromofitas en el reino Chromophyta, (Stramenopiles). Esto los ubica en un reino completamente diferente de los hongos, que se colocan todos en el reino Eufungi. La colocación taxonómica de los traustoquítridos se resume por tanto a continuación:

Reino: Chromophyta (Stramenopiles) Phylum: Heterokonta Orden: Thraustochytriales Familia: Thraustochytriaceae Género: Thraustochytrium, Schizochytrium, Labyrinthuloides o Japonochytrium

Algunos taxonomistas pioneros separaron unos pocos miembros originales del género Thraustochytrium (aquellos con una fase de vida ameboide) en un género separado denominado Ulkenia. Sin embargo, es conocido en la actualidad que la mayoría, si no todos, los traustoquítridos (incluyendo Thraustochytrium y Schizoclaytrium) presentan fases ameboides y, como tal, algunos no consideran que Ulkenia sea un género válido. Tal como se utiliza en la presente memoria, el género Thraustochytrium incluirá Ulkenia.

A pesar de la incertidumbre de la colocación taxonómica dentro de clasificaciones superiores de Phylum y Reino, los traustoquítridos siguen siendo una agrupación distintiva y característica cuyos miembros siguen pudiéndose clasificar dentro del orden Thraustochytriales.

Los Schizochytrium y otros microorganismos de Thraustochytriales presentan un valor comercial potencial y actual sustancial debido a su capacidad para producir grandes cantidades de compuestos lipídicos, incluyendo ácidos grasos altamente insaturados (HUFA) y diversos carotenoides (por ejemplo, astaxantina). Los ácidos grasos altamente insaturados omega-3 son de interés comercial significativo porque se han reconocido recientemente como compuestos dietéticos importantes para prevenir arteriosclerosis y cardiopatía coronaria, para aliviar trastornos inflamatorios y para retrasar el crecimiento de células tumorales. Estos efectos beneficiosos son un resultado tanto de los HUFA omega-3 que provocan inhibición competitiva de compuestos producidos a partir de ácidos grasos omega-6, como de los compuestos beneficiosos producidos directamente a partir de los propios HUFA omega-3 (Simopoulos et al., 1986). Los ácidos grasos omega-6 son los HUFA predominantes que se encuentran en plantas y animales. Por tanto, el desarrollo adicional de microorganismos de Thraustochytriales como organismos de producción comercial se beneficiará significativamente de la capacidad para producir cambios genéticos específicos en los organismos por medio de tecnología de ADN recombinante, incluyendo la potenciación de la producción de los carotenoides y HUFA altamente valiosos por tales organismos. Además, la capacidad para lograr una mejor comprensión de la bioquímica y biología molecular de este grupo escasamente caracterizado de organismos proporcionará información valiosa que puede utilizarse para guiar los futuros esfuerzos de desarrollo de cepas. Antes de la presente invención, sin embargo, los procedimientos y constructos recombinantes adecuados para transformar traustoquítridos, incluyendo miembros de los géneros Schizochytrium y Thraustochytrium, no estaban disponibles. De manera importante, no se disponía del desarrollo de marcadores seleccionables que son particularmente útiles para transformar microorganismos de Thraustochytriales y de la identificación de secuencias promotoras específicas de Thraustochytriales antes de la presente invención.

Los investigadores anteriores han descrito reactivos y procedimientos de transformación para su utilización en diversos microorganismos, incluyendo en microalgas que no son miembros del orden Thraustochytriales. La patente US nº 6.027.900 concedida a Allnutt et al. da a conocer fusiones genéticas para su utilización en la modificación por ingeniería genética de algas eucariotas, y particularmente, Phaeodactylum tricornutum, utilizando un promotor para un gen de captación de luz de algas fotosintéticas y el gen Sh ble de Streptoalloteichus hindustanus como marcador seleccionable. Las células se hacen crecer en altas concentraciones de sal (por ejemplo, 10-35 g/l) y Zeocin™ para la selección de transformantes. Las células de microalgas adecuadas para su transformación utilizando un procedimiento de este tipo son microalgas fotosintéticas que pueden hacerse crecer en condiciones de alta concentración de sal. La patente US nº 5.661.017 concedida a Dunahay et al. da a conocer un procedimiento para transformar algas que contienen clorofila C (por ejemplo, diatomeas) utilizando un constructo recombinante que comprende un marcador seleccionable operativamente unido a una secuencia de control reguladora adecuada para la expresión del marcador en las algas que contienen clorofila C. Se da a conocer que el marcador seleccionable es cualquier marcador adecuado, incluyendo los marcadores aislados de fuentes bacterianas y fúngicas, y es preferentemente neomicina fosfotransferasa. La secuencia de control reguladora puede incluir cualquier secuencia reguladora derivada de un alga que contiene clorofila C y, preferentemente, de Cyclotella cryptica (por ejemplo, una secuencia reguladora de acetil-CoA carboxilasa de C. cryptica).

Sin embargo, tales procedimientos no son fácilmente transferibles a la transformación de microorganismos de Thraustochytriales, porque, antes de la presente invención, la transformación de microorganismos tales como Thraustochytriales (por ejemplo, microalgas) estaba lejos de ser rutinaria. Los marcadores y sistemas de transformación que han alcanzado un gran desarrollo para las bacterias y levaduras no son necesariamente adaptables fácilmente a otros microorganismos. De hecho, la patente US nº 5.661.017 indica que “ha habido poco éxito en el desarrollo de sistemas de transformación para microalgas eucariotas” (col. 1, líneas 49-51), lo que se debe en parte a la dificultad de introducción de ADN foráneo en tales microorganismos, y parcialmente debido a una falta de marcadores y vectores adecuados para su utilización en tal transformación. El sistema descrito en la patente US nº 5.661.017 se desarrolló específicamente para las algas que contienen clorofila C porque los inventores creían que eran más susceptibles a la transformación genética, particularmente en comparación con otras algas. De manera similar, la patente US nº 6.027.900, que enseña un procedimiento de transformación que es específico para microalgas fotosintéticas, habla de la creencia de que la mayoría de las algas son resistentes a cualquier tipo de

manipulación genética (col. 1, líneas 39-47). Los sistemas adaptados para bacterias, levaduras, células de insecto y animales no se han adaptado fácilmente a microalgas. Por tanto, antes de la presente invención, existía una necesidad en la técnica de sistemas y procedimientos de transformación eficaces que fueran específicos para microalgas.

Adicionalmente, aunque el orden Thraustochytriales se agrupa actualmente con las algas cromofitas en los Stramenopiles, algunos sostienen todavía en la técnica que estos microorganismos son bastante diferentes de la mayoría de las microalgas, y algunos de esos expertos en la materia presentan la opinión de que los miembros de Thraustochytriales pueden no estar apropiadamente clasificados como microalgas en absoluto. Los microorganismos que se considera que son microalgas han evolucionado por lo menos cuatro veces separadas durante la evolución, lo que conduce a que los microorganismos de tipo “microalga” sean ubicados en diferentes reinos (por ejemplo las algas rojas, las algas verdes y las algas doradas (Chromophyta) están todas en reinos separados). Como resultado, no se espera que los sistemas de transformación que se ha demostrado que son útiles en otras microalgas sean útiles para Thraustochytriales. Por tanto, a pesar del valor comercial de microorganismos de Thraustochytriales, la capacidad para utilizar el potencial completo de tales microorganismos mediante ingeniería genética no se ha reconocido hasta el momento. Antes de la presente invención, los presentes inventores no eran conscientes de ningún promotor, marcador seleccionable o vector útil para la transformación de microorganismos de Thraustochytriales, ni había ningún conocimiento referente a qué sistemas de selección podrían utilizarse en o adaptarse para Thraustochytriales.

En resumen, resulta necesario en la técnica desarrollar procedimientos para transformar los microorganismos de Thraustochytriales, proporcionando así unos medios para crear cepas con valor comercial potenciado. Además, resultando necesario en la técnica desarrollar procedimientos para la mutación o inactivación de genes específicos mediante recombinación homóloga o no homóloga en microorganismos de Thraustochytriales, proporcionando un nuevo modo para alterar el metabolismo celular y para identificar las funciones de genes específicos en Thraustochytriales.

Sumario de la invención

Una forma de realización de la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada de entre el grupo constituido por: (a) una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº:15, SEC ID nº:19, SEC ID nº:22 y SEC ID nº: 24, en la que la proteína es una acetolactato sintasa; (b) una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos de (a), en la que la proteína es una acetolactato sintasa; y, (c) una secuencia de ácido nucleico que es completamente complementaria a la secuencia de ácido nucleico de (a) o (b). En un aspecto, una secuencia de ácido nucleico de este tipo codifica una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 85% idéntica a una secuencia de aminoácidos de (a), y en la que la proteína es una acetolactato sintasa. En otro aspecto, una secuencia de ácido nucleico de este tipo codifica una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de (a), y en la que la proteína es una acetolactato sintasa. Aún en otro aspecto, una secuencia de ácido nucleico de este tipo codifica una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos que difiere de SEC ID nº:15 en una sustitución, inserción o deleción de aminoácido en una posición de aminoácido seleccionada de entre el grupo constituido por: 116G, 117A, 192P, 200A, 251K, 358M, 383D, 592V, 595W y 599F. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico codifica una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº:15, SEC ID nº:19, SEC ID nº:22 y SEC ID nº:24, y en la que la proteína es una acetolactato sintasa. Aún en otro aspecto, la secuencia de ácido nucleico se selecciona de entre el grupo constituido por los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº:14, los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº:18, los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº:21 y los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº:23.

Preferentemente, la expresión de la proteína codificada por las secuencias de ácido nucleico identificadas anteriormente confiere una sensibilidad reducida a compuestos seleccionados de entre el grupo constituido por: compuestos de sulfonilurea, inhibidores de la clase de imidazolinona y oxibenzoatos de pirimidinilo, sobre un microorganismo del orden Thraustochytriales que se transforma con una molécula de ácido nucleico de este tipo. En un aspecto de esta forma de realización, la secuencia de ácido nucleico codifica una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº:19, SEC ID nº:22 y SEC ID nº:24. En otro aspecto de esta forma de realización, la secuencia de ácido nucleico se selecciona de entre el grupo constituido por: los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº: 14, los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº:18, los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº:21 y los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº:23.

En una forma de realización de la presente invención, la secuencia de ácido nucleico descrita anteriormente codifica para una acetolactato sintasa de Schizochytrium. En un aspecto, la expresión de la acetolactato sintasa de Schizochytrium confiere una sensibilidad reducida a compuestos seleccionados de entre el grupo constituido por: compuestos de sulfonilurea, inhibidores de la clase de imidazolinona y oxibenzoatos de pirimidinilo, sobre un microorganismo del orden Thraustochytriales que se transforma con la molécula de ácido nucleico.

Otra forma de realización de la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende cualquiera de las moléculas de ácido nucleico aisladas descritas anteriormente, unidas funcionalmente a una secuencia de control de la transcripción. Otra forma de realización de la presente invención se refiere a un microorganismo recombinante del orden Thraustochytriales que se transforma con una molécula de ácido nucleico recombinante de este tipo.

Aún otra forma de realización de la presente invención se refiere a un vector recombinante para la transformación de microorganismos del orden Thraustochytriales. El vector incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica para una acetolactato sintasa que confiere una sensibilidad reducida a compuestos seleccionados de entre el grupo constituido por: compuestos de sulfonilurea, inhibidores de la clase de imidazolinona y oxibenzoatos de pirimidinilo, sobre un microorganismo del orden Thraustochytriales. La acetolactato sintasa presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por: (a) una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº:19, SEC ID nº:22 y SEC ID nº:24; y, (b) una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos de (a). La secuencia de ácido nucleico que codifica para una acetolactato sintasa está unida funcionalmente a una secuencia de control de la transcripción. En un aspecto, el vector recombinante es un vector de expresión. En otro aspecto, el vector recombinante es un vector de direccionamiento. En otros aspectos, la secuencia de ácido nucleico en el vector codifica para una acetolactato sintasa que presenta una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 85% idéntica, y en otro aspecto, por lo menos 95% idéntica, a una secuencia de aminoácidos de (a). En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico codifica una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos que difiere de SEC ID nº:15 en una sustitución, inserción

o deleción de aminoácido en una posición de aminoácido seleccionada de entre el grupo constituido por: 116G, 117A, 192P, 200A, 251K, 358M, 383D, 592V, 595W y 599F. En un aspecto preferido, la acetolactato sintasa presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº:19, SEC ID nº:22 y SEC ID nº:24. En otro aspecto, la secuencia de ácido nucleico se selecciona de entre el grupo constituido por: los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº:18, los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº:21 y los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº:23. La secuencia de control de la transcripción en el vector recombinante puede incluir, pero sin limitarse a, un promotor de a-tubulina de Thraustochytriales, un promotor de acetolactato sintasa de Thraustochytriales, un promotor de un sistema de policétido sintasa (PKS) de Thraustochytriales o un promotor de ácido graso desaturasa de Thraustochytriales. En un aspecto, el vector comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº:18, SEC ID nº:21 y SEC ID nº:23.

Aún otra forma de realización de la presente invención se refiere a un procedimiento para la transformación de células de un microorganismo del orden Thraustochytriales. El procedimiento incluye una primera etapa de (a) introducir en células de un microorganismo del orden Thraustochytriales una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una acetolactato sintasa que confiere sobre las células sensibilidad reducida a compuestos seleccionados de entre el grupo constituido por: compuestos de sulfonilurea, inhibidores de la clase de imidazolinona y oxibenzoatos de pirimidinilo, en el que la acetolactato sintasa presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por: (i) una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº:19, SEC ID nº:22 y SEC ID nº:24; y, (ii) una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos de (i). El procedimiento incluye una segunda etapa de (b) seleccionar células que se han transformado satisfactoriamente con la molécula de ácido nucleico recombinante cultivando las células de (a) en un medio que contiene al menos un compuesto que es inhibidor para células no transformadas, seleccionándose el compuesto de entre el grupo constituido por: un compuesto de sulfonilurea, un inhibidor de la clase de imidazolinona y oxibenzoatos de pirimidinilo. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico codifica para una acetolactato sintasa que presenta una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 85% idéntica, y más preferentemente por lo menos 95% idéntica, a una secuencia de aminoácidos de (i). En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico codifica una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos que difiere de SEC ID nº:15 en una sustitución, inserción

o deleción de aminoácido en una posición de aminoácido seleccionada de entre el grupo constituido por: 116G, 117A, 192P, 200A, 251K, 358M, 383D, 592V, 595W y 599F. En otro aspecto, la acetolactato sintasa presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº: 19, SEC ID nº:22 y SEC ID nº:24. Preferentemente, la secuencia de ácido nucleico se selecciona de entre el grupo constituido por: los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº:18, los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº:21 y los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº:23. Aún en otro aspecto, la secuencia de ácido nucleico está unida funcionalmente a una secuencia de control de la transcripción seleccionada de entre el grupo constituido por un promotor de a-tubulina de Thraustochytriales, un promotor de acetolactato sintasa de Thraustochytriales, un promotor de un sistema de policétido sintasa (PKS) de Thraustochytriales y un promotor de ácido graso desaturasa de Thraustochytriales.

En un aspecto, la molécula de ácido nucleico recombinante comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que va a producirse por la célula, en la que la secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína está unida funcionalmente a una secuencia de control de la transcripción. En un aspecto de esta forma de realización, la proteína está asociada con la síntesis de un ácido graso seleccionado de entre el grupo constituido por ácido docosahexaenoico (DHA), ácido docosapetaenoico (DPA), ácido eicosapentaenoico (EPA) y ácido araquidónico (ARA). En otro aspecto de esta forma de realización, la proteína se selecciona de entre el grupo constituido por: una ácido graso sintasa, una ácido graso desaturasa, una ácido graso elongasa, una proteína asociada con un complejo de policétido sintasa y una proteína asociada con la incorporación de ácidos grasos a

fosfolípidos o a moléculas de triacilglicerol. En un aspecto, la proteína es una ácido graso w-3 desaturasa codificada por una secuencia de ácido nucleico SEC ID nº:29. En otro aspecto, la proteína es una ácido graso polienoico isomerasa. Aún en otro aspecto, la proteína se selecciona de entre el grupo constituido por HMG-CoA sintasa, HMG-CoA reductasa, escualeno sintasa, fitoeno sintasa, fitoeno desaturasa, una carotenoide ciclasa, una carotenoide hidroxilasa, una carotenoide cetolasa, vitamina E y ácido lipoico.

En otro aspecto del presente procedimiento, la molécula de ácido nucleico recombinante en la etapa (a) comprende además una secuencia de ácido nucleico que hibrida con una secuencia de ácido nucleico diana en el microorganismo de manera que un gen que comprende la secuencia de ácido nucleico diana se muta o inactiva mediante recombinación homóloga con la segunda secuencia de ácido nucleico. En este aspecto, la secuencia de ácido nucleico diana puede codificar para una proteína seleccionada de entre el grupo constituido por lipasas, enzimas de oxidación de ácidos grasos, proteínas implicadas en la síntesis de hidratos de carbono, proteínas implicadas en la síntesis de productos de rutas de isoprenoides, proteínas implicadas en la síntesis de componentes de la pared celular, proteínas implicadas en las rutas de síntesis de ácidos grasos saturados, proteínas implicadas en las rutas de síntesis de ácidos grasos poliinsaturados, proteínas asociadas con un complejo de policétido sintasa y proteínas asociadas con la incorporación de ácidos grasos a fosfolípidos o moléculas de triacilglicerol.

El presente procedimiento puede incluir además la etapa que consiste en introducir en la célula al menos una molécula de ácido nucleico recombinante adicional que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que va a expresarse, estando la secuencia de ácido nucleico unida funcionalmente a una secuencia de control de la transcripción. En otro aspecto, el procedimiento puede incluir además una etapa que consiste en introducir en la célula al menos una molécula de ácido nucleico recombinante adicional que comprende una segunda secuencia de ácido nucleico que hibrida con una secuencia de ácido nucleico diana en el microorganismo de manera que un gen que comprende la secuencia de ácido nucleico diana se muta o inactiva mediante recombinación homóloga con la segunda secuencia de ácido nucleico. En otro aspecto, el procedimiento puede incluir además la etapa de introducir en la célula una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de unión a la bleomicina. En este aspecto, la molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de unión a la bleomicina comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica para una segunda proteína que va a expresarse por la célula, en la que la secuencia de ácido nucleico que codifica para la segunda proteína está unida funcionalmente a una secuencia de control de la transcripción. Una secuencia de control de la transcripción de este tipo puede comprender de manera no limitativa un promotor de a-tubulina de Thraustochytriales, un promotor de acetolactato sintasa de Thraustochytriales, un promotor de un sistema de policétido sintasa (PKS) de Thraustochytriales y un promotor de ácido graso desaturasa de Thraustochytriales. En un aspecto adicional de esta forma de realización, la molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de unión a la bleomicina comprende además una segunda secuencia de ácido nucleico que hibrida con una secuencia de ácido nucleico diana en el microorganismo de manera que un gen que comprende la secuencia de ácido nucleico diana se muta o inactiva mediante recombinación homóloga con la segunda secuencia de ácido nucleico. En una forma de realización, la molécula de ácido nucleico recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico SEC ID nº:9.

En el procedimiento de la presente invención, el microorganismo puede ser de un género que comprende de manera no limitativa Thraustochytrium, Labyrinthuloides, Japonochytrium y Schizochytrium. En un aspecto, el microorganismo es de una especie que comprende de manera no limitativa Schizochytrium sp., Schizochytrium aggregatum, Schizochytrium limacinum, Thraustochytrium sp., Thraustochytrium striatum, Thraustochytrium aureum, Thraustochytrium roseum y Japonochytrium sp.

En una forma de realización del presente procedimiento, la etapa de introducción se realiza mediante un procedimiento seleccionado de entre el grupo constituido por bombardeo de partículas, electroporación, microinyección, lipofección, adsorción, infección y fusión de protoplastos.

Otra forma de realización de la presente invención se refiere a un microorganismo recombinante del orden Thraustochytriales, transformado con una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una acetolactato sintasa que confiere sobre el microorganismo una sensibilidad reducida a compuestos seleccionados de entre el grupo constituido por: compuestos de sulfonilurea, inhibidores de la clase de imidazolinona y oxibenzoatos de pirimidinilo. La acetolactato sintasa presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por: (a) una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº:19, SEC ID nº:22 y SEC ID nº:24; y, (b) una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos de (a). En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico codifica para una acetolactato sintasa que presenta una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 85% idéntica a una secuencia de aminoácidos de (a). En otro aspecto, la secuencia de ácido nucleico codifica para una acetolactato sintasa que presenta una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de (a). En otro aspecto, la acetolactato sintasa presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº:19, SEC ID nº:22 y SEC ID nº:24. Aún en otro aspecto, la secuencia de ácido nucleico se selecciona de entre el grupo constituido por: los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº:18, los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº:21 y los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº:23. Aún en otro

aspecto, la molécula de ácido nucleico recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº:18, SEC ID nº:21 y SEC ID nº:23. Preferentemente, la secuencia de ácido nucleico que codifica para una acetolactato sintasa está unida funcionalmente a un promotor que funciona en un microorganismo de Thraustochytriales. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico que codifica para una acetolactato sintasa está unida funcionalmente a una secuencia de control de la transcripción seleccionada de entre el grupo constituido por un promotor de a-tubulina de Thraustochytriales, un promotor de acetolactato sintasa de Thraustochytriales, un promotor de un sistema de policétido sintasa (PKS) de Thraustochytriales y un promotor de ácido graso desaturasa de Thraustochytriales. En una forma de realización, la molécula de ácido nucleico recombinante comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica para una primera proteína para su producción por el microorganismo, en la que la secuencia de ácido nucleico que codifica para la primera proteína está unida funcionalmente a una secuencia de control de la transcripción. En otra forma de realización, la célula recombinante está transformada adicionalmente con una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de unión a la bleomicina. Preferentemente, la molécula de ácido nucleico recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico SEC ID nº:9. En una forma de realización, la molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de unión a la bleomicina comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica para una segunda proteína para su producción por la célula, en la que la secuencia de ácido nucleico que codifica para la segunda proteína está unida funcionalmente a una secuencia de control de la transcripción. En una forma de realización, el microorganismo también incluye al menos una molécula de ácido nucleico recombinante adicional que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína para su producción por la célula.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 ilustra la construcción del plásmido recombinante pTUBZEO-11. La figura 2 ilustra la construcción del plásmido recombinante pTUBZEO11-2. La figura 3A ilustra el plásmido recombinante pMON50200. La figura 3B ilustra el plásmido recombinante pMON50201. La figura 3C ilustra el plásmido recombinante pMON50202. La figura 3D ilustra el plásmido recombinante pMON50203.

Descripción detallada de la invención

La presente invención comprende los procedimientos y materiales relacionados con microorganismos genéticamente transformados del orden Thraustochytriales. Todas las cepas de los microorganismos unicelulares dadas a conocer en la presente memoria para su utilización como transformante de los constructos recombinantes de la presente invención, que pueden denominarse generalmente traustoquítridos, son miembros del orden Thraustochytriales. Según la presente invención, las frases “traustoquítrido”, “microorganismo de Thraustochytriales” y “microorganismo del orden Thraustochytriales” pueden utilizarse de manera intercambiable. No consta en el contexto de la presente invención ningún informe anterior que describa un sistema de transformación para Schizochytrium o cualquier otro microorganismo de Thraustochytriales. Los sistemas de transformación descritos en la presente memoria pueden utilizarse para introducir genes foráneos en microorganismos del orden Thraustochytriales, proporcionando de ese modo un medio para crear cepas con valor comercial potenciado. Además, esta invención permite la mutación o inactivación de genes específicos mediante recombinación homologa o no homóloga, proporcionando un nuevo modo de alterar el metabolismo celular y de identificar las funciones de genes específicos en microorganismos de Thraustochytriales.

Más específicamente, se ha demostrado la transformación genética de un microorganismo de Thraustochytriales del género, Schizochytrium (orden: Thraustochytriales; familia: Thraustochytriaceae; género: Schizochytrium), mediante la utilización de dos tipos de vectores de transformación. Estos vectores pueden introducirse en células mediante procedimientos convencionales, seguido por la identificación y el aislamiento de células recombinantes basándose en su capacidad para crecer en presencia de compuestos selectivos. Se ha demostrado la eficacia de estos vectores introduciéndolos mediante bombardeo de partículas, pero también pueden utilizarse otros medios para introducir los vectores (por ejemplo, electroporación) y se conocen en la técnica y pretenden estar comprendidos por la presente invención.

Para un vector de transformación, ejemplificado en la presente memoria mediante el vector recombinante denotado pTUBZEO11-2, se creó un gen quimérico en el que el gen ble (que codifica para una “proteína de unión a la bleomicina”) de Streptoalloteichus hindustanus se colocó en el sentido de 3’ de un promotor de un gen de tubulina de Schizochytrium. Se colocó un terminador de SV40 en el sentido de 3’ del gen ble en este constructo. Este vector permite la expresión del gen ble en Schizochytrium, confiriendo de ese modo resistencia a Zeocin™ y compuestos relacionados, que son tóxicos para células de tipo natural cuando se incluyen en el medio de crecimiento a niveles apropiados. La fuente del gen ble y el terminador de SV40 en este constructo era un vector disponible comercialmente, denominado pSV40/Zeo, que se adquirió de Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA) (Manual Técnico 180202, versión B, “vectores ZeoCassette”; Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA 92008). Se aisló el promotor del gen de tubulina mediante la reacción en cadena de la polimerasa; uno de los cebadores utilizados para la reacción se basaba en los datos de secuencia obtenidos a través de un proyecto de secuenciación

de ADNc de Schizochytrium al azar. El mapa de pTUBZEO11-2 se muestra en la figura 2, y la secuencia de nucleótidos de pTUBZEO11-2 se representa mediante SEC ID nº:9. La transformación de Schizochytrium con este vector se confirmó mediante la utilización de la reacción en cadena de la polimerasa y análisis de transferencia de tipo Southern para detectar la presencia de secuencias de vector integradas en el genoma de Schizochytrium.

El gen ble se ha utilizado por investigadores anteriores como un marcador seleccionable para la transformación genética de una variedad de organismos, incluyendo bacterias, microalgas distintas de traustoquítridos, hongos, protozoos, plantas y células animales (véase, por ejemplo, la patente US nº 6.027.900; Lumbreras et al., 1998, Plant

J. 14:441-447; Rohe et al., 1996, Curr. Genet. 29: 587-590; Messina et al., 1995, Gene 165:213-217; Guerrero et al., 1992, Appl. Microbiol. Biotechnol. 36:759-762; Perez et al., 1989, Plant Mol. Biol. 13:365-373; Gatigno et al., 1990 Gene 91:35-41). El gen ble codifica para una “proteína de unión a la bleomicina” que confiere resistencia a varios antibióticos, incluyendo bleomicina, fleomicina y Zeocin™ (Drocourt et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18:4009). Este gen está comercializado por Invitrogen Corporation, que era la fuente del gen que los presentes inventores utilizaron para crear el vector de transformación de Schizochytrium pTUBZEO11-2. Sin embargo, los presentes inventores creen que son los primeros en producir un vector de transformación en el que el gen ble está unido a un promotor de traustoquítridos de una manera que permite la expresión del gen en traustoquítridos.

Se creó un segundo conjunto de vectores de transformación mediante mutagénesis dirigida al sitio in vitro de un gen de acetolactato sintasa (als) que los presentes inventores aislaron de una biblioteca genómica de Schizochytrium. Estas mutaciones cambian la secuencia de aminoácidos de la enzima codificada (ALS) de tal modo que es mucho menos sensible a sulfometuron metil y otros compuestos de sulfonilurea, así como inhibidores de la clase de imidazolinona y oxibenzoatos de pirimidinilo, a los que los microorganismos del orden Thraustochytriales son sensibles. Los compuestos de sulfonilurea tales como sulfometuron metil (SMM) son a menudo tóxicos para las células porque pueden unirse a e inactivar la enzima acetolactato sintasa (ALS) de una variedad de organismos. La ALS cataliza la primera etapa de la biosíntesis de los aminoácidos valina, leucina e isoleucina. Se ha mostrado que las imidazolinonas, triazolopirimidinas y otros compuestos se unen a e inactivan La ALS de ciertos organismos. Las formas mutantes de genes que codifican para acetolactato sintasa (también conocida como ácido acetohidroxi sintasa) de otros organismos se han utilizado previamente como marcadores seleccionables para la transformación de levaduras y plantas (Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 40:441-470, 1989). Sin embargo, no existen informes anteriores a la presente invención que describan la secuencia o las propiedades del gen als de Schizochytrium o cualquier otro miembro de Thraustochytriales, o la utilización de genes als de Thraustochytriales mutantes para conferir resistencia a compuestos de sulfonilurea, imidazolinona u oxibenzoato de pirimidinilo. De hecho, según el conocimiento de los presentes inventores, no se ha publicado ningún informe referente a la sensibilidad de microorganismos de Thraustochytriales a estos agentes selectivos, incluyendo sulfometuron metil y, por tanto, no se sabía antes de la presente invención si un marcador seleccionable de este tipo sería incluso viable para su utilización en un sistema de transformación de traustoquítridos. Debe apreciarse que se encuentran genes con homología sustancial a genes als conocidos en diversos organismos, pero no codifican para enzimas que puedan catalizar la síntesis de acetolactato (Biochimica et Biophysica Acta 1385:401-419, 1998). Por tanto, no habría sido obvio que un homólogo de als clonado codifique de hecho para ALS. Con el fin de determinar definitivamente si el gen de Schizochytrium clonado era un gen als verdadero, los presentes inventores demostraron, a través de experimentos de transformación, una correlación positiva de la resistencia a sulfometuron metil con la expresión del gen als de Schizochytrium supuesto mutado.

Se han producido tres vectores de transformación diferentes que contienen genes als mutantes: un gen als mutante codifica para una enzima con una valina en la posición 595 en lugar de un triptófano (plásmido pMON50201, o ALSmutl-7), otro codifica para una glutamina en la posición 192 en lugar de una prolina (plásmido pMON50202, o ALSmut2-2), y una tercera forma contiene ambas de estas mutaciones (plásmido pMON50203, o ALSmut3-5). En estos vectores, la expresión de los genes als mutantes está bajo el control del promotor y el terminador del gen als nativo. Los mapas de estos vectores, junto con un vector que contiene el gen als de Schizochytrium de tipo natural (plásmido pMON50200, o AE-5), se muestran en las figuras 3A-3D. La transformación de Schizochytrium con estos vectores que codifican para ALS mutante se confirmó mediante la utilización de la reacción en cadena de la polimerasa y análisis de transferencia de tipo Southern para detectar la presencia de secuencias de vector integradas en el genoma de Schizochytrium. Tal como se describe en detalle a continuación, debido a que los presentes inventores han identificado la secuencia completa del gen als, otras mutaciones, especificadas a continuación, pueden hacerse también. Por tanto, los genes als mutantes descritos pretenden ser ejemplificativos, y no incluyen todas las posibles mutaciones.

Los sistemas de transformación de la presente invención se han utilizado para introducir genes foráneos en células de Thraustochytriales por medio de cotransformación. En estos casos, los genes foráneos se colocaron entre diversos promotores de Schizochytrium y un terminador apropiado (por ejemplo, SV40 o una región terminadora génica de Schizochytrium). Por ejemplo, los presentes inventores han producido e introducido un gen sintético que codifica para una ácido graso w-3 desaturasa del nematodo Caenorhabditis elegans, representado en la presente memoria por SEC ID nº:29, para aumentar los niveles de ácido docosahexaenoico en Schizochytrium. SEC ID nº:30 representa la secuencia de aminoácidos de la desaturasa codificada por SEC ID nº: 29. También pueden introducirse casetes de expresión que contienen genes foráneos en células de Thraustochytriales mediante inclusión directa dentro del vector de transformación que contiene el marcador seleccionable.

Además, se ha demostrado con los vectores que codifican para ALS mutante que se produce recombinación homóloga en Schizochytrium, lo que indica la viabilidad de utilizar medios recombinantes para inactivar o mutar genes de Schizochytrium nativos específicos.

Con respecto a las secuencias promotoras de Thraustochytriales descritas en la presente memoria, una búsqueda en base de datos de secuencias (GenBank) para todas las secuencias de proteína y nucleótidos notificadas para miembros del orden Thraustochytriales indica que, en el momento de la presente invención, no se ha notificado ninguna secuencia promotora de Schizochytrium o cualquier otro miembro de Thraustochytriales. El único gen que se ha notificado de cualquier especie de Schizochytrium es para el ARN ribosómico 5S de S. aggregatum (números de registro de GenBank X06104 y M13616). Se han notificado secuencias de ARN ribosómico 5S y 18S para los miembros de Thraustochytriales, especie Ulkenia, y géneros Labyrinthuloides y Thraustochytrium, pero esto no presenta relación con la presente invención. Se ha descrito una región codificante parcial de un gen de “ARN polimerasa de tipo T3/T7 supuesta” de Thraustochytrium aureum (Nucleic Acids Research 15:648-654, 1996), pero no se notificó una secuencia promotora para esta gen.

Esta invención puede utilizarse para introducir cualquier gen u otras secuencias de nucleótidos que son de interés en un microorganismo del orden Thraustochytriales. Tales secuencias de nucleótidos comprenden de manera no limitativa ácidos nucleicos que codifican para proteínas (por ejemplo, enzimas) asociadas con la síntesis de ácidos grasos (por ejemplo, los ácidos grasos: ácido docosahexaenoico (DHA), ácido docosapetaenoico (DPA), ácido eicosapentaenoico (EPA) y ácido araquidónico (ARA). Tales proteínas comprenden de manera no limitativa: ácido graso sintasas, ácido graso desaturasas y ácido graso elongasas, así como proteínas asociadas con un complejo de policétido sintasa y/o proteínas asociadas con la incorporación de tales ácidos grasos a fosfolípidos o a moléculas de triacilglicerol. Por ejemplo, la invención se ha utilizado para introducir genes que codifican para diversas ácido graso w-3 desaturasas en Schizochytrium en un intento de aumentar el nivel de ácido docosahexaenoico (DHA) en las células por medio de w-3 desaturación de ácido docosapetaenoico (DPA). Como otro ejemplo, se ha demostrado también la expresión de una ácido graso polienoico isomerasa supuesta del alga roja Ptilota en Schizochytrium. Los genes que codifican para un complejo de policétido sintasa de Schizochytrium (es decir, un sistema de policétido sintasa) se han depositado como números de registro de GenBank AF378329 (ORFA), AF378328 (ORFB) y AF378329 (ORFC).

La presente invención también es útil para introducir en microorganismos de Thraustochytriales genes y otras secuencias de nucleótidos que codifican para proteínas asociadas con la ruta biosintética de isoprenoides. Tales proteínas comprenden de manera no limitativa HMG-CoA sintasa y HMG-CoA reductasa. Otras proteínas adecuadas incluyen proteínas asociadas con la síntesis de moléculas derivadas de subunidades de isoprenoides que comprenden de manera no limitativa diversos compuestos esteroides y diversos compuestos carotenoides. Las proteínas asociadas con la síntesis de diversos compuestos carotenoides comprenden de manera no limitativa escualeno sintasa, fitoeno sintasa, fitoeno desaturasa y diversas carotenoide ciclasas, hidroxilasas y cetolasas.

La presente invención también es útil para introducir en Thraustochytriales una o más secuencias de ácido nucleico que codifican para proteínas asociadas con la síntesis de compuestos antioxidantes que comprenden de manera no limitativa vitamina E y ácido lipoico.

Además, la presente invención puede utilizarse para introducir cualquier gen u otros vectores de secuencias de nucleótidos en microorganismos de Thraustochytriales con el fin de inactivar o delecionar genes (es decir, “desactivación” o “alteración génica dirigida”). La inactivación o deleción de genes se utiliza normalmente para el fin de potenciar el valor comercial del microorganismo. Por ejemplo, puede ser deseable eliminar genes que codifican para enzimas (o ácidos nucleicos que regulan la expresión de tales genes) de las rutas de síntesis de ácidos grasos saturados y poliinsaturados. En otro aspecto, puede ser deseable inhibir o desactivar genes que codifican para proteínas que están implicadas en la degradación de otros compuestos valiosos producidos por el microorganismo de Thraustochytriales o que de otra manera menguan el valor del compuesto deseado. Por ejemplo, genes que codifican para lipasas, enzimas de oxidación de ácidos grasos y proteínas que presentan olores o sabores desagradables pueden ser dianas de desactivación deseables mediante la presente invención. Aún en otro aspecto, puede ser deseable desactivar genes que codifican para proteínas que están asociadas con la síntesis de compuestos cuya síntesis está en competición con otras moléculas de interés. Por ejemplo, tales genes comprenden de manera no limitativa genes que codifican para proteínas implicadas en la biosíntesis de hidratos de carbono, genes que codifican para proteínas implicadas en la síntesis de diversos productos de rutas de isoprenoides (por ejemplo, esteroles o compuestos carotenoides específicos), y genes que codifican para proteínas implicadas en la síntesis de componentes de la pared celular. A título de ejemplo, se han introducido genes en células de Schizochytrium mediante la utilización de esta invención en un intento de inactivar genes que son homólogos a los genes de policétido sintasa de Shewanella con el fin de evaluar su papel en la producción de ácidos grasos altamente insaturados (HUFA). Tal como se muestra a título de ejemplo mediante el ejemplo 6, la presente invención también puede utilizarse para inactivar, delecionar o mutar genes nativos que están implicados en la producción de ácidos grasos, carotenoides, esteroles, vitaminas u otros compuestos con el fin de mejorar la rentabilidad o aceptabilidad de productos que están relacionados con estos compuestos. Se indica que en algunas formas de realización, tal como se expuso anteriormente, puede ser deseable potenciar la producción de una proteína dada,

mientras que en otras formas de realización, puede ser deseable inhibir la producción de la misma proteína. Tales determinaciones se basan en la utilización dada y los objetivos de producción para un microorganismo específico. La presente invención también es útil para determinar el proceso de recombinación genética en Schizochytrium.

Otros genes y moléculas de ácido nucleico útiles para su introducción en Thraustochytriales resultarán evidentes para los expertos en la materia, y todos los genes y moléculas de este tipo pretenden abarcarse mediante la presente invención.

Se describen a continuación diversas formas de realización de la presente invención inicialmente con respecto a un gen als y/o proteína ALS de Thraustochytriales de la presente invención. Debe apreciarse, sin embargo, que las definiciones generales de términos y procedimientos pretenden aplicarse a la exposición de otros genes, ácidos nucleicos y proteínas descritos a continuación.

La presente invención se basa en parte en la identificación, el aislamiento y la producción de secuencias de ácido nucleico que codifican para marcadores seleccionables que son adecuados para su utilización en constructos recombinantes para la transformación de microorganismos traustoquítridos. Tales marcadores seleccionables permiten la selección de microorganismos que se han transformado satisfactoriamente con los constructos recombinantes de la presente invención. Un marcador seleccionable útil para la transformación de Thraustochytriales según la presente invención es una acetolactato sintasa de Thraustochytriales (es decir, ALS). Preferentemente, la acetolactato sintasa se ha modificado, mutado o seleccionado de otra manera, para que sea resistente a la inhibición por compuestos de sulfonilurea, inhibidores de la clase de imidazolinona y/o oxibenzoatos de pirimidinilo (es decir, una ALS de este tipo es un homólogo de una acetolactato sintasa que se produce de manera natural).

Según la presente invención, una acetolactato sintasa es una proteína que presenta actividad biológica de acetolactato sintasa, incluyendo proteínas de longitud completa, proteínas de fusión o cualquier homólogo de una acetolactato sintasa que se produce de manera natural. Un homólogo de una acetolactato sintasa incluye proteínas que difieren de una acetolactato sintasa que se produce de manera natural porque al menos uno o unos pocos, pero sin limitarse a uno o unos pocos, aminoácidos se han delecionado (por ejemplo, una versión truncada de la proteína, tal como un péptido o fragmento), insertado, invertido, sustituido y/o derivatizado (por ejemplo, mediante glicosilación, fosforilación, acetilación, miristoilación, prenilación, palmitación, amidación y/o adición de glicosilfosfatidilinositol). Se describen en detalle a continuación los homólogos preferidos de una acetolactato sintasa que se produce de manera natural.

Una proteína aislada, tal como una acetolactato sintasa aislada, según la presente invención, es una proteína que se ha retirado de su medio natural (es decir, que se ha sometido a manipulación humana) y puede incluir proteínas purificadas, proteínas parcialmente purificadas, proteínas producidas de manera recombinante y proteínas producidas de manera sintética, por ejemplo. Como tal, “aislado” no refleja el grado hasta el que la proteína se ha purificado. Preferentemente, una acetolactato sintasa aislada de la presente invención se produce de manera recombinante. Una “acetolactato sintasa de Thraustochytriales” se refiere a una acetolactato sintasa (incluyendo un homólogo de una acetolactato sintasa que se produce de manera natural) de un microorganismo de Thraustochytriales o que se ha producido de otra manera a partir del conocimiento de la estructura (por ejemplo, secuencia) de una acetolactato sintasa que se produce de manera natural de un microorganismo de Thraustochytriales. En otras palabras, una acetolactato sintasa de Thraustochytriales incluye cualquier acetolactato sintasa que presenta la estructura y la función de una acetolactato sintasa que se produce de manera natural a partir de un microorganismo de Thraustochytriales o que es un homólogo biológicamente activo (es decir, presenta actividad biológica) de una acetolactato sintasa que se produce de manera natural a partir de un microorganismo de Thraustochytriales tal como se describe en detalle en la presente memoria. Como tal, una acetolactato sintasa de Thraustochytriales puede incluir proteínas purificadas, parcialmente purificadas, recombinantes, mutadas/modificadas y sintéticas.

En general, la actividad biológica o acción biológica de una proteína se refiere a cualquier función que presenta o realiza la proteína que se atribuye a la forma que se produce de manera natural de la proteína tal como se mide u observa in vivo (es decir, en el entorno fisiológico natural de la proteína) o in vitro (es decir, en condiciones de laboratorio). Por ejemplo, una actividad biológica de una acetolactato sintasa incluye actividad enzimática de acetolactato sintasa. Las modificaciones de una proteína, tal como en un homólogo o mimético (tratado a continuación), pueden dar como resultado proteínas que presentan la misma actividad biológica que la proteína que se produce de manera natural, o proteínas que presentan actividad biológica aumentada o disminuida en comparación con la proteína que se produce de manera natural. Las modificaciones que dan como resultado una disminución en la expresión de la proteína o una disminución en la actividad de la proteína pueden denominarse inactivación (completa o parcial), regulación por disminución o disminución de la acción de una proteína. De manera similar, las modificaciones que dan como resultado un aumento en la expresión de la proteína o un aumento en la actividad de la proteína pueden denominarse amplificación, sobreproducción, activación, potenciación, regulación por incremento o aumento de la acción de una proteína.

Con respecto a la acetolactato sintasa de la presente invención, resulta preferido que las modificaciones presentes en homólogos de acetolactato sintasa, en comparación con una acetolactato sintasa que se produce de manera natural, no cambien sustancialmente, o al menos no disminuyan sustancialmente, la actividad biológica básica de la sintasa en comparación con la proteína que se produce de manera natural. Sin embargo, tales homólogos pueden presentar diferencias en características distintas de la actividad funcional o enzimática de la proteína en comparación con la forma que se produce de manera natural, tal como una sensibilidad disminuida a la inhibición mediante ciertos compuestos en comparación con la proteína que se produce de manera natural. Preferentemente, un homólogo de una acetolactato sintasa que se produce de manera natural presenta sensibilidad reducida (es decir, disminuida, menguada) a compuestos que se unen a e inactivan acetolactato sintasas que se producen de manera natural en comparación con la acetolactato sintasa que se produce de manera natural a partir de la que se derivó el homólogo. Por ejemplo, compuestos de sulfonilurea, tales como sulfometuron metil (SMM), son a menudo tóxicos para las células porque pueden unirse a e inactivar acetolactato sintasa (ALS). Se ha demostrado que imidazolinonas, triazolopirimidinas y otros compuestos similares (denominados generalmente en la presente memoria inhibidores de la clase de imidazolinona) se unen a e inactivan ALS. Por tanto, un homólogo de una acetolactato sintasa que se produce de manera natural presenta preferentemente sensibilidad reducida a compuestos de sulfonilurea, así como a inhibidores de la clase de imidazolinona (por ejemplo, al presentar sitios de unión alterados para tales inhibidores o sitios de unión con afinidad reducida por el inhibidor) y a oxibenzoatos de pirimidinilo, mientras que mantienen la actividad acetolactato sintasa.

Tal como se utiliza en la presente memoria, una proteína que presenta “actividad biológica de acetolactato sintasa” o que se denomina “acetolactato sintasa” se refiere a una proteína que cataliza la primera etapa en la biosíntesis de los aminoácidos valina, leucina e isoleucina. Más específicamente, una acetolactato sintasa aislada de la presente invención, incluyendo proteínas de longitud completa, proteínas truncadas, proteínas de fusión y homólogos, puede identificarse de una manera sencilla mediante la capacidad de las proteínas para catalizar la síntesis de acetolactato a partir de piruvato. La actividad biológica de acetolactato sintasa puede evaluarse por un experto en la materia mediante cualquier ensayo in vitro o in vivo adecuado para la actividad enzimática.

En una forma de realización, una acetolactato sintasa de la presente invención presenta una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 65% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de SEC ID nº:15, SEC ID nº:19, SEC ID nº:22, SEC ID nº:24, a lo largo de al menos aproximadamente 600 aminoácidos de cualquiera de tales secuencias, en la que la proteína es una acetolactato sintasa (es decir, presenta actividad biológica de acetolactato sintasa). Más preferentemente, una acetolactato sintasa de la presente invención presenta una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 70% idéntica, y más preferentemente, al menos aproximadamente el 75% idéntica, e incluso más preferentemente al menos aproximadamente el 80% idéntica, e incluso más preferentemente al menos aproximadamente el 85% idéntica, e incluso más preferentemente al menos aproximadamente el 90% idéntica e incluso más preferentemente al menos aproximadamente el 95% idéntica, e incluso más preferentemente al menos aproximadamente el 96% idéntica, e incluso más preferentemente al menos aproximadamente el 97% idéntica, e incluso más preferentemente al menos aproximadamente el 98% idéntica, e incluso más preferentemente al menos aproximadamente el 99% idéntica a cualquiera de SEC ID nº:15, SEC ID nº:19, SEC ID nº:22 o SEC ID nº:24, a lo largo de al menos aproximadamente 600 aminoácidos de cualquiera de SEC ID nº:15, SEC ID nº:19, SEC ID nº:22 o SEC ID nº:24, en la que la proteína presenta actividad biológica de acetolactato sintasa.

En otra forma de realización, una acetolactato sintasa de la presente invención presenta una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de SEC ID nº:15, SEC ID nº:19, SEC ID nº:22, SEC ID nº:24, a lo largo de al menos 95 aminoácidos de cualquiera de tales secuencias, en la que la proteína es una acetolactato sintasa (es decir, presenta actividad biológica de acetolactato sintasa). Más preferentemente, una acetolactato sintasa de la presente invención presenta una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 80% idéntica, e incluso más preferentemente al menos aproximadamente el 85% idéntica, e incluso más preferentemente al menos aproximadamente el 90% idéntica e incluso más preferentemente al menos aproximadamente el 95% idéntica, e incluso más preferentemente al menos aproximadamente el 96% idéntica, e incluso más preferentemente al menos aproximadamente el 97% idéntica, e incluso más preferentemente al menos aproximadamente el 98% idéntica, e incluso más preferentemente al menos aproximadamente el 99% idéntica a cualquiera de SEC ID nº:15, SEC ID nº:19, SEC ID nº:22 o SEC ID nº:24, a lo largo de al menos 95 aminoácidos de cualquiera de SEC ID nº:15, SEC ID nº:19, SEC ID nº:22 o SEC ID nº:24, en la que la proteína presenta actividad biológica de acetolactato sintasa. Incluso más preferentemente, una acetolactato sintasa de la presente invención presenta una secuencia de aminoácidos que presenta cualquiera de los porcentajes de identidad a los que se hizo referencia anteriormente con cualquiera de SEC ID nº: 15, SEC ID nº: 19, SEC ID nº:22 o SEC ID nº: 24 a lo largo de al menos 100 aminoácidos, y más preferentemente 125, y más preferentemente 150, y más preferentemente 175, y más preferentemente 200, y más preferentemente 225, y más preferentemente 250, y más preferentemente 275, y más preferentemente 300, y más preferentemente 325, y más preferentemente 350, y más preferentemente 375, y más preferentemente 400, y más preferentemente 425, y más preferentemente 450, y más preferentemente 475, y más preferentemente 500, y más preferentemente 525, y más preferentemente 550, y más preferentemente 575 aminoácidos de cualquiera de SEC ID nº:15, SEC ID nº:19, SEC ID nº: 22 o SEC ID nº:24, en la que la proteína presenta actividad biológica de acetolactato sintasa.

Tal como se utiliza en la presente memoria, a menos que se especifique lo contrario, la referencia a un porcentaje (%) de identidad se refiere a una evaluación de la homología que se realiza utilizando: (1) una búsqueda de homología de BLAST 2.0 Basic BLAST utilizando blastp para búsquedas de aminoácidos y blastn para búsquedas de ácidos nucleicos con parámetros por defecto convencionales, filtrándose la secuencia de consulta para regiones de baja complejidad por defecto (descrito en Altschul, S.F., Madden, T.L., Schääffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D.J. (1997) “Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generación of protein database search programs”. Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, incorporado a la presente memoria como referencia en su totalidad);

(2) una alineación de BLAST 2 (utilizando los parámetros descritos a continuación); (3) y/o PSI-BLAST con los parámetros por defecto convencionales (BLAST iterado específico de posición). Se indica que debido a algunas diferencias en los parámetros convencionales entre BLAST 2.0 Basic BLAST y BLAST 2, podría reconocerse que dos secuencias específicas presentan homología significativa utilizando el programa BLAST 2, mientras que una búsqueda realizada en BLAST 2.0 Basic BLAST utilizando una de las secuencias como secuencia de consulta puede no identificar la segunda secuencia en las coincidencias máximas. Además, PSI-BLAST proporciona una versión automatizada, fácil de utilizar de una búsqueda de “perfil”, que es un modo sensible para buscar homólogos de secuencia. El primer programa realiza una búsqueda en la base de datos BLAST con huecos. El programa PSI-BLAST utiliza la información de cualquier alineación significativa devuelta para construir una matriz de puntuación específica de posición, que reemplaza a la secuencia de consulta para la siguiente ronda de búsqueda de la base de datos. Por tanto, ha de entenderse que el porcentaje de identidad puede determinarse utilizando uno cualquiera de estos programas.

Dos secuencias específicas pueden alinearse entre sí utilizando una alineación de secuencias BLAST 2 tal como se describe en Tatusova y Madden, (1999), “Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences”, FEMS Microbiol Lett. 174:247-250, incorporado a la presente memoria como referencia en su totalidad. La alineación de secuencias BLAST 2 se realiza en blastp o blastn utilizando el algoritmo de BLAST 2.0 para realizar una búsqueda de Gapped BLAST (BLAST 2.0) entre las dos secuencias que permite la introducción de huecos (deleciones e inserciones) en la alineación resultante. Para fines de claridad en la presente memoria, se realiza una alineación de secuencias BLAST 2 utilizando los parámetros por defecto convencionales tal como sigue.

Para blastn, utilizando una matriz 0 BLOSUM62:

Recompensa para coincidencia = 1

Penalización para apareamiento erróneo = -2

Penalizaciones por apertura de huecos (5) y extensión de huecos (2) (caída de alineación de hueco x (“gap x_dropoff”) (50) esperado (10) tamaño de palabra (11) filtro (activado)

Para blastp, utilizando una matriz 0 BLOSUM62:

penalizaciones por apertura de huecos (11) y extensión de huecos (1)

caída de alineación de hueco x (50) esperado (10) tamaño de palabra (3) filtro (activado).

Una acetolactato sintasa de la presente invención también puede incluir proteínas que presentan una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 30 residuos de aminoácido contiguos de cualquiera de SEC ID nº:15, SEC ID nº:19, SEC ID nº:22 o SEC ID nº:24, (es decir, 30 residuos de aminoácido contiguos que presentan el 100% de identidad con 30 aminoácidos contiguos de cualquiera de SEC ID nº:15, SEC ID nº:19, SEC ID nº:22 o SEC ID nº:24). En una forma de realización preferida, una acetolactato sintasa de la presente invención incluye proteínas que presentan secuencias de aminoácidos que comprenden al menos 50, y más preferentemente al menos 75, y más preferentemente al menos 100, y más preferentemente al menos 115, y más preferentemente al menos 130, y más preferentemente al menos 150, y más preferentemente al menos 200, y más preferentemente, al menos 250, y más preferentemente, al menos 300, y más preferentemente, al menos 350, y más preferentemente, al menos 400, y más preferentemente, al menos 450, y más preferentemente, al menos 500, y más preferentemente, al menos 550, y más preferentemente, al menos 600, y más preferentemente, al menos 650, residuos de aminoácido contiguos de cualquiera de SEC ID nº: 15, SEC ID nº:19, SEC ID nº:22 o SEC ID nº: 24. Una proteína de este tipo presenta actividad biológica de acetolactato sintasa.

Según la presente invención, el término “contiguo” o “consecutivo”, con respecto a las secuencias de aminoácidos o ácido nucleico descritas en la presente memoria, significa que están conectados en una secuencia ininterrumpida. Por ejemplo, que una primera secuencia comprenda 30 aminoácidos contiguos (o consecutivos) de una segunda secuencia, significa que la primera secuencia incluye una secuencia ininterrumpida de 30 residuos de aminoácido que es 100% idéntica a una secuencia ininterrumpida de 30 residuos de aminoácido en la segunda secuencia. De manera similar, que una primera secuencia presente “100% de identidad” con una segunda secuencia significa que la primera secuencia coincide exactamente con la segunda secuencia sin huecos entre los nucleótidos o aminoácidos.

En otra forma de realización, una acetolactato sintasa de la presente invención, incluyendo un homólogo de acetolactato sintasa, incluye una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos que es suficientemente similar a una secuencia de aminoácidos de acetolactato sintasa que se produce de manera natural de modo que una secuencia de ácido nucleico que codifica para el homólogo puede hibridar en condiciones de rigurosidad moderada, alta o muy alta (descritas a continuación) a (es decir, con) una molécula de ácido nucleico que codifica para la acetolactato sintasa que se produce de manera natural (es decir, con el complemento de la hebra de ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de acetolactato sintasa que se produce de manera natural). Preferentemente, una acetolactato sintasa está codificada por una secuencia de ácido nucleico que hibrida en condiciones de rigurosidad moderada, alta o muy alta con el complemento de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº:15, SEC ID nº: 19, SEC ID nº:22 o SEC ID nº:24. Incluso más preferentemente, una acetolactato sintasa de la presente invención está codificada por una secuencia de ácido nucleico que hibrida en condiciones de rigurosidad moderada, alta o muy alta con el complemento de los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº:15, los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº:18, los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº:21, o los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº:23. Tales condiciones de hibridación se describen en detalle a continuación. Un complemento de secuencia de ácido nucleico de la secuencia de ácido nucleico que codifica para una acetolactato sintasa de la presente invención se refiere a la secuencia de ácido nucleico de la hebra de ácido nucleico que es complementaria a la hebra que codifica para la acetolactato sintasa. Se apreciará que un ADN bicatenario que codifica para una secuencia de aminoácidos dada comprende un ADN monocatenario y su hebra complementaria que presenta una secuencia que es un complemento al ADN monocatenario. Como tal, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden ser o bien bicatenarias o bien monocatenarias, e incluyen las moléculas de ácido nucleico que forman híbridos estables en condiciones de hibridación rigurosa con una secuencia de ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 15, SEC ID nº: 19, SEC ID nº:22 o SEC ID nº: 24, y/o con el complemento de la secuencia de ácido nucleico que codifica para cualquiera de tales secuencias de aminoácidos. Los expertos en la materia conocen procedimientos para deducir una secuencia complementaria. Debe indicarse que puesto que las tecnologías de secuenciación de ácidos nucleicos y de secuenciación de aminoácidos no están completamente libres de errores, las secuencias presentadas en la presente memoria, en el mejor caso, representan secuencias evidentes de una acetolactato sintasa de la presente invención.

Los homólogos de acetolactato sintasa pueden ser el resultado de mutación natural o variación alélica natural. También pueden producirse homólogos de acetolactato sintasa de la presente invención utilizando técnicas conocidas en la materia que comprenden de manera no limitativa modificaciones directas en la proteína o modificaciones en el gen que codifica para la proteína utilizando, por ejemplo, técnicas de ADN recombinantes o clásicas para efectuar mutagénesis dirigida o al azar. Una variante alélica que se produce de manera natural de un ácido nucleico que codifica para una acetolactato sintasa es un gen que se encuentra esencialmente en el mismo o mismos locus en el genoma que el gen que codifica para una secuencia aminoácidos SEC ID nº:15, pero que, debido a variaciones naturales provocadas por, por ejemplo, mutación o recombinación, presenta una secuencia similar pero no idéntica. Las variantes alélicas naturales codifican normalmente proteínas que presentan actividad similar a la de la proteína codificada por el gen con el que están comparándose. Una clase de variantes alélicas puede codificar la misma proteína pero presentar diferentes secuencias de ácido nucleico debido a la degeneración del código genético. Las variantes alélicas también pueden comprender alteraciones en las regiones no traducidas en 5’ o 3’ del gen (por ejemplo, en regiones de control reguladoras). Los expertos en la materia conocen bien las variantes alélicas.

Las proteínas de acetolactato sintasa de la presente invención también incluyen productos de expresión de fusiones génicas (por ejemplo, utilizadas para sobreexpresar formas activas, solubles de la proteína recombinante), de genes mutagenizados (tales como genes que presentan modificaciones de codones para potenciar la transcripción y traducción génicas), y de genes truncados (tales como genes que presentan dominios de unión a la membrana eliminados para generar formas solubles de una proteína de membrana, o genes que presentan secuencias señal eliminadas que se toleran escasamente en un huésped recombinante particular).

El tamaño mínimo de una proteína y/u homólogo de la presente invención es un tamaño suficiente para presentar actividad biológica de acetolactato sintasa. Preferentemente, una proteína de la presente invención presenta al menos 30 aminoácidos de largo, y más preferentemente, al menos aproximadamente 50, y más preferentemente al menos 75, y más preferentemente al menos 100, y más preferentemente al menos 115, y más preferentemente al menos 130, y más preferentemente al menos 150, y más preferentemente al menos 200, y más preferentemente, al menos 250, y más preferentemente, al menos 300, y más preferentemente, al menos 350, y más preferentemente, al menos 400, y más preferentemente, al menos 450, y más preferentemente, al menos 500, y más preferentemente, al menos 550, y más preferentemente, al menos 600, y más preferentemente, al menos 650, y más preferentemente, al menos 684 aminoácidos de largo. No existe ningún límite, distinto de un límite práctico, en el tamaño máximo de una proteína de este tipo porque la proteína puede incluir una parte de una proteína de acetolactato sintasa o una acetolactato sintasa de longitud completa, más una secuencia adicional (por ejemplo, una secuencia de proteína de fusión), si se desea.

La presente invención también incluye una proteína de fusión que incluye un dominio que contiene acetolactato sintasa (es decir, una secuencia de aminoácidos para una acetolactato sintasa según la presente invención) unido a

uno o más segmentos de fusión. Los segmentos de fusión adecuados para su utilización con la presente invención comprenden de manera no limitativa segmentos que pueden: potenciar la estabilidad de una proteína; proporcionar otra actividad biológica deseable; y/o ayudar con la purificación de una acetolactato sintasa (por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad). Un segmento de fusión adecuado puede ser un dominio de cualquier tamaño que presenta la función deseada (por ejemplo, confiere un aumento de estabilidad, solubilidad, acción o actividad biológica; y/o simplifica la purificación de una proteína). Pueden unirse segmentos de fusión a extremos amino y/o carboxilo terminales del dominio que contiene acetolactato sintasa de la proteína y pueden ser susceptibles de escisión con el fin de permitir la recuperación sencilla de una acetolactato sintasa. Se producen preferentemente proteínas de fusión cultivando una célula recombinante transfectada con una molécula de ácido nucleico de fusión que codifica una proteína que incluye el segmento de fusión unido al extremo o bien carboxilo y/o bien amino terminal de un domino que contiene acetolactato sintasa.

La presente invención también incluye un mimético de una acetolactato sintasa. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “mimético” se utiliza para referirse a cualquier compuesto peptídico o no peptídico que puede imitar la acción biológica de un péptido que se produce de manera natural, a menudo porque el mimético presenta una estructura básica que imita la estructura básica del péptido que se produce de manera natural y/o presenta las propiedades biológicas destacadas del péptido que se produce de manera natural. Los miméticos pueden comprender de manera no limitativa: péptidos que presentan modificaciones sustanciales con respecto al prototipo de manera que no presentan similitud de cadenas laterales con el péptido que se produce de manera natural (tales modificaciones, por ejemplo, pueden disminuir su susceptibilidad a la degradación); anticuerpos antiidiotípicos y/o catalíticos, o fragmentos de los mismos; partes no proteínicas de una proteína aislada (por ejemplo, estructuras de hidratos de carbono); o moléculas orgánicas sintéticas o naturales, incluyendo ácidos nucleicos y fármacos identificados a través de química combinatoria, por ejemplo.

Tales miméticos pueden diseñarse, seleccionarse y/o identificarse de otra manera utilizando una variedad de procedimientos conocidos en la técnica. Diversos procedimientos de diseño de fármacos, útiles para diseñar miméticos u otros compuestos terapéuticos útiles en la presente invención, se dan a conocer en Maulik et al., 1997, Molecular Biotechnology: Therapeutic Applications and Strategies, Wiley-Liss, Inc., que se incorpora a la presente memoria como referencia en su totalidad. Puede obtenerse un mimético de acetolactato sintasa, por ejemplo, a partir de estrategias de diversidad molecular (una combinación de estrategias relacionadas que permiten la construcción rápida de bibliotecas de moléculas grandes, químicamente diversas), bibliotecas de compuestos naturales o sintéticos, en particular a partir de bibliotecas químicas o combinatorias (es decir, bibliotecas de compuestos que difieren en secuencia o tamaño pero que presentan elementos estructurales similares) o mediante diseño de fármacos racional, dirigido o al azar. Véase por ejemplo, Maulik et al., citado anteriormente.

En una estrategia de diversidad molecular, se sintetizan las bibliotecas de compuestos grandes, por ejemplo, a partir de péptidos, oligonucleótidos, hidratos de carbono y/o moléculas orgánicas sintéticas, utilizando enfoques biológicos, enzimáticos y/o químicos. Los parámetros críticos en el desarrollo de una estrategia de diversidad molecular incluyen diversidad de subunidades, tamaño molecular y diversidad de bibliotecas. El objetivo general del examen de tales bibliotecas es utilizar la aplicación secuencial de la selección combinatoria para obtener ligandos de alta afinidad para una diana deseada, y luego optimizar las moléculas líder mediante estrategias de diseño o bien al azar

o bien dirigidas. Se describen los procedimientos de diversidad molecular en detalle en Maulik, et al., ibid.

Maulik et al. también dan a conocer, por ejemplo, unos procedimientos de diseño dirigido, en los que el usuario dirige el proceso de creación de moléculas novedosas a partir de una biblioteca de fragmentos de fragmentos apropiadamente seleccionados; diseño aleatorio, en el que el usuario utiliza un algoritmo genético u otro para mutar aleatoriamente fragmentos y sus combinaciones mientras que se aplica simultáneamente un criterio de selección para evaluar la idoneidad de ligandos candidatos; y un enfoque basado en rejilla en el que el usuario calcula la energía de interacción entre estructuras de receptores tridimensionales y sondas de fragmentos pequeños, seguido por unión entre sí de sitios de sondas favorables.

Según la presente invención, las acetolactato sintasas pueden derivarse de cualquier microorganismo de Thraustochytriales, y particularmente, de cualquier microorganismo de Schizochytrium. En una forma de realización, una acetolactato sintasa preferida de la presente invención presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de SEC ID nº:15, SEC ID nº:19, SEC ID nº:22, SEC ID nº:24. La proteína que presenta una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº:15 es una acetolactato sintasa que se produce de manera natural (es decir, de tipo natural) de un microorganismo de Thraustochytriales, y específicamente, es una acetolactato sintasa de Schizochytrium. Las secuencias de aminoácidos representadas por SEC ID nº:19, SEC ID nº:22, SEC ID nº:24 son secuencias que se han modificado, de manera que las enzimas resultantes presentan sensibilidad reducida a compuestos de sulfonilurea, así como a inhibidores de la clase de imidazolinona y oxibenzoatos de pirimidinilo, en comparación con la proteína que se produce de manera natural representada por la secuencia de aminoácidos SEC ID nº:15. Se indica que las proteínas representadas por SEC ID nº:19, SEC ID nº:22 y SEC ID nº:24 presentan actividad biológica de acetolactato sintasa. Las acetolactato sintasas con sensibilidad reducida a compuestos de sulfonilurea, así como a inhibidores de la clase de imidazolinona y oxibenzoatos de pirimidinilo son acetolactato sintasas preferidas de la presente invención, porque las secuencias de ácido nucleico que codifican para tales sintasas pueden utilizarse en vectores recombinantes de la presente invención como marcadores seleccionables.

Por tanto, una forma de realización de la presente invención se refiere a una acetolactato sintasa modificada, que incluye cualquier homólogo de cualquiera de SEC ID nº: 15, SEC ID nº:19, SEC ID nº:22 y SEC ID nº:24, en la que el homólogo presenta actividad biológica de acetolactato sintasa, y particularmente, en la que el homólogo presenta sensibilidad reducida a compuestos de sulfonilurea, así como a inhibidores de la clase de imidazolinona y oxibenzoatos de pirimidinilo, en comparación con la proteína que se produce de manera natural representada por la secuencia de aminoácidos SEC ID nº:15. En un aspecto, tales homólogos de acetolactato sintasa incluyen proteínas que presentan una secuencia de aminoácidos que difiere de SEC ID nº: 15 en una sustitución, inserción o deleción de aminoácido en una o más de las siguientes posiciones: 116G, 117A, 192P, 200A, 251K, 358M, 383D, 592V, 595W o 599F. Estas posiciones corresponden a sitios de mutación de ALS conocidos en una acetolactato sintasa de levadura (es decir, 116G, 117A, 192P, 200A, 251K, 354M, 379D, 583V, 586W y 590F, respectivamente) (véase Mazur y Falco, 1989, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 40:441-470, incorporado a la presente memoria como referencia en su totalidad). Los expertos en la materia conocerán otros posibles sitios de mutación basándose en mutaciones de aminoácidos satisfactorias en ALS de otros organismos. La aplicación de tales sitios a los sitios correspondientes en la ALS de Thraustochytriales se abarca por la presente invención.

Tal como se expuso anteriormente, la presente invención se basa en parte en el descubrimiento y la producción de constructos recombinantes para la transformación de microorganismos traustoquítridos. Por tanto, una forma de realización de la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una acetolactato sintasa de Thraustochytriales, y una secuencia de ácido nucleico completamente complementaria a la misma. Una molécula de ácido nucleico que codifica para una acetolactato sintasa de la presente invención incluye una molécula de ácido nucleico que codifica para cualquiera de las proteínas de acetolactato sintasa, incluyendo homólogos, tratados anteriormente. Más particularmente, una forma de realización de la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 65% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de SEC ID nº:15, SEC ID nº:19, SEC ID nº:22, SEC ID nº:24, a lo largo de al menos aproximadamente 600 aminoácidos de cualquiera de tales secuencias, en la que la proteína es una acetolactato sintasa (es decir, presenta actividad biológica de acetolactato sintasa). Más preferentemente, una molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención presenta una secuencia de ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 70% idéntica, y más preferentemente, al menos aproximadamente el 75% idéntica, e incluso más preferentemente al menos aproximadamente el 80% idéntica, e incluso más preferentemente al menos aproximadamente el 85% idéntica, e incluso más preferentemente al menos aproximadamente el 90% idéntica e incluso más preferentemente al menos aproximadamente el 95% idéntica, e incluso más preferentemente al menos aproximadamente el 96% idéntica, e incluso más preferentemente al menos aproximadamente el 97% idéntica, e incluso más preferentemente al menos aproximadamente el 98% idéntica, e incluso más preferentemente al menos aproximadamente el 99% idéntica a cualquiera de SEC ID nº:15, SEC ID nº:19, SEC ID nº:22 o SEC ID nº: 24, a lo largo de al menos aproximadamente 600 aminoácidos de cualquiera de SEC ID nº:5, SEC ID nº:19, SEC ID nº:22 o SEC ID nº:24, en la que la proteína presenta actividad biológica de acetolactato sintasa.

En otra forma de realización, una molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención presenta una secuencia de ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de SEC ID nº:15, SEC ID nº:19, SEC ID nº:22, SEC ID nº:24, a lo largo de al menos 95 aminoácidos de cualquiera de tales secuencias, en la que la proteína es una acetolactato sintasa (es decir, presenta actividad biológica de acetolactato sintasa). Más preferentemente, una molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención presenta una secuencia de ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 80% idéntica, e incluso más preferentemente al menos aproximadamente el 85% idéntica, e incluso más preferentemente al menos aproximadamente el 90% idéntica e incluso más preferentemente al menos aproximadamente el 95% idéntica, e incluso más preferentemente al menos aproximadamente el 96% idéntica, e incluso más preferentemente al menos aproximadamente el 97% idéntica, e incluso más preferentemente al menos aproximadamente el 98% idéntica, e incluso más preferentemente al menos aproximadamente el 99% idéntica a cualquiera de SEC ID nº:15, SEC ID nº:19, SEC ID nº:22 o SEC ID nº:24, a lo largo de al menos 95 aminoácidos de cualquiera de SEC ID nº:15, SEC ID nº:19, SEC ID nº:22 o SEC ID nº:24, en la que la proteína presenta actividad biológica de acetolactato sintasa.

Aún en otra forma de realización, una molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención presenta una secuencia de ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que presenta cualquiera de los porcentajes de identidad a los que se hizo referencia anteriormente con cualquiera de SEC ID nº:15, SEC ID nº:19, SEC ID nº:22 o SEC ID nº:24 a lo largo de al menos 100 aminoácidos, y más preferentemente 125, y más preferentemente 150, y más preferentemente 175, y más preferentemente 200, y más preferentemente 225, y más preferentemente 250, y más preferentemente 275, y más preferentemente 300, y más preferentemente 325, y más preferentemente 350, y más preferentemente 375, y más preferentemente 400, y más preferentemente 425, y más preferentemente 450, y más preferentemente 475, y más preferentemente 500, y más preferentemente 525, y más preferentemente 550, y más preferentemente 575 aminoácidos de cualquiera de SEC ID nº:15, SEC ID nº:19, SEC ID nº:22 o SEC ID nº:24, en la que la proteína presenta actividad biológica de acetolactato sintasa. El porcentaje de

identidad se determina utilizando parámetros por defecto de BLAST 2.0 Basic BLAST, tal como se describió anteriormente.

En una forma de realización, las moléculas de ácido nucleico que codifican para una acetolactato sintasa de la presente invención incluyen moléculas de ácido nucleico aisladas que hibridan en condiciones de rigurosidad moderada, e incluso más preferentemente en condiciones de rigurosidad alta, e incluso más preferentemente en condiciones de rigurosidad muy alta con el complemento de una secuencia de ácido nucleico que codifica para una acetolactato sintasa que se produce de manera natural. Preferentemente, una molécula de ácido nucleico aislada que codifica para una acetolactato sintasa de la presente invención comprende una secuencia de ácido nucleico que hibrida en condiciones de rigurosidad moderada o alta con el complemento de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº:15, SEC ID nº:19, SEC ID nº:22 o SEC ID nº:24. En una forma de realización, una molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de ácido nucleico que hibrida en condiciones de rigurosidad moderada, alta o muy alta con el complemento de una secuencia de ácido nucleico representada por los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº:14, los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº:18, los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº:21 o los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº:23.

Tal como se utiliza en la presente memoria, las condiciones de hibridación se refieren a las condiciones de hibridación convencionales en las que se utilizan moléculas de ácido nucleico para identificar moléculas de ácido nucleico similares. Tales condiciones convencionales se dan a conocer, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1989. Sambrook et al., ibid., se incorpora como referencia a la presente memoria en su totalidad (véanse específicamente las páginas 9.31-9.62). Además, se dan a conocer fórmulas para calcular las condiciones de lavado e hibridación apropiadas para lograr una hibridación que permite grados variables de apareamiento erróneo de nucleótidos, por ejemplo, en Meinkoth et al., 1984, Canal. Biochem. 138, 267-284; Meinkoth et al., ibid., se incorpora como referencia a la presente memoria en su totalidad.

Más particularmente, las condiciones de lavado e hibridación de rigurosidad moderada, tal como se les hace referencia en la presente memoria, se refieren a las condiciones que permiten el aislamiento de moléculas de ácido nucleico que presentan una identidad de secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente el 70% con la molécula de ácido nucleico que está utilizándose para estudiar con sonda en la reacción de hibridación (es decir, condiciones que permiten un apareamiento erróneo de nucleótidos de aproximadamente el 30% o inferior). Las condiciones de lavado e hibridación de rigurosidad alta, tal como se les hace referencia en la presente memoria, se refieren a condiciones que permiten el aislamiento de moléculas de ácido nucleico que presentan una identidad de secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente el 80% con la molécula de ácido nucleico que está utilizándose para estudiar con sonda en la reacción de hibridación (es decir, condiciones que permiten un apareamiento erróneo de nucleótidos de aproximadamente el 20% o inferior). Las condiciones de lavado e hibridación de rigurosidad muy alta, tal como se les hace referencia en la presente memoria, se refieren a condiciones que permiten el aislamiento de moléculas de ácido nucleico que presentan una identidad de secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente el 90% con la molécula de ácido nucleico que está utilizándose para estudiar con sonda en la reacción de hibridación (es decir, condiciones permiten un apareamiento erróneo de nucleótidos de aproximadamente el 10% o inferior). Tal como se expuso anteriormente, un experto en la materia puede utilizar las fórmulas en Meinkoth et al., ibid. para calcular las condiciones de lavado e hibridación apropiadas para lograr estos niveles particulares de apareamiento erróneo de nucleótidos. Tales condiciones variarán, dependiendo de si están formándose híbridos de ADN:ARN o ADN:ADN. Las temperaturas de fusión calculadas para híbridos de ADN:ADN son 10ºC inferiores que para híbridos de ADN:ARN. En formas de realización particulares, las condiciones de hibridación rigurosas para híbridos de ADN:ADN incluyen hibridación a una fuerza iónica de 6X SSC (Na+ 0,9 M) a una temperatura de entre aproximadamente 20ºC y aproximadamente 35ºC (rigurosidad inferior), más preferentemente, entre aproximadamente 28ºC y aproximadamente 40ºC (más rigurosas), e incluso más preferentemente, entre aproximadamente 35ºC y aproximadamente 45ºC (incluso más rigurosas), con condiciones de lavado apropiadas. En las formas de realización particulares, las condiciones de hibridación rigurosas para híbridos de ADN:ARN incluyen hibridación a una fuerza iónica de 6X SSC (Na+ 0,9 M) a una temperatura de entre aproximadamente 30ºC y aproximadamente 45ºC, más preferentemente, entre aproximadamente 38ºC y aproximadamente 50ºC, e incluso más preferentemente, entre aproximadamente 45ºC y aproximadamente 55ºC, con condiciones de lavado rigurosas de manera similar. Estos valores se basan en cálculos de una temperatura de fusión para moléculas mayores de aproximadamente 100 nucleótidos, 0% de formamida y un contenido en G + C de aproximadamente el 40%. Alternativamente, la Tm puede calcularse empíricamente tal como se expone en Sambrook et al., citado anteriormente, páginas 9.31 a 9.62. En general, las condiciones de lavado deben ser tan rigurosas como sea posible, y deben ser apropiadas para las condiciones de hibridación elegidas. Por ejemplo, las condiciones de hibridación pueden incluir una combinación de condiciones de temperatura y sal que están aproximadamente 20-25ºC por debajo de la Tm calculada de un híbrido particular, y las condiciones de lavado incluyen normalmente una combinación de condiciones de temperatura y sal que están aproximadamente 12-20ºC por debajo de la Tm calculada del híbrido particular. Un ejemplo de condiciones de hibridación adecuadas para su utilización con híbridos de ADN:ADN incluye una hibridación de 2-24 horas en 6X SSC (50% de formamida) a aproximadamente 42ºC, seguido por etapas de lavado que incluyen uno o más lavados a temperatura ambiente en aproximadamente 2X SSC, seguido por lavados adicionales a temperaturas superiores y fuerza iónica inferior (por

ejemplo, al menos un lavado a aproximadamente 37ºC en aproximadamente 0,1X-0,5X SSC, seguido por al menos un lavado a aproximadamente 68ºC en aproximadamente 0,1X-0,5X SSC).

En otra forma de realización, las moléculas de ácido nucleico que codifican para una acetolactato sintasa de la presente invención incluyen moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 30 residuos de aminoácido contiguos de cualquiera de SEC ID nº:15, SEC ID nº:19, SEC ID nº: 22 o SEC ID nº:24, (es decir, 30 residuos de aminoácido contiguos que presentan el 100% de identidad con 30 aminoácidos contiguos de cualquiera de SEC ID nº:15, SEC ID nº:19, SEC ID nº:22 o SEC ID nº:24). En una forma de realización preferida, una molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 50, y más preferentemente al menos 75, y más preferentemente al menos 100, y más preferentemente al menos 115, y más preferentemente al menos 130, y más preferentemente al menos 150, y más preferentemente al menos 200, y más preferentemente, al menos 250, y más preferentemente, al menos 300, y más preferentemente, al menos 350, y más preferentemente, al menos 400, y más preferentemente, al menos 450, y más preferentemente, al menos 500, y más preferentemente, al menos 550, y más preferentemente, al menos 600, y más preferentemente, al menos 650, residuos de aminoácido contiguos de cualquiera de SEC ID nº:15, SEC ID nº:19, SEC ID nº:22 o SEC ID nº:24. Una proteína de este tipo presenta actividad biológica de acetolactato sintasa. En una forma de realización, una molécula de ácido nucleico aislada que codifica para una acetolactato sintasa comprende una secuencia de ácido nucleico que presenta al menos 60 nucleótidos contiguos, y más preferentemente al menos 150, y más preferentemente al menos 225, y más preferentemente al menos 300, y más preferentemente al menos 345, y más preferentemente al menos 390, y más preferentemente al menos 450, y más preferentemente al menos 525, y más preferentemente al menos 600, y más preferentemente al menos 750, y más preferentemente al menos 900, y más preferentemente al menos 1050, y más preferentemente al menos 1200, y más preferentemente al menos 1350, y más preferentemente al menos 1500, y más preferentemente al menos 1650, y más preferentemente al menos 1800, e incluso más preferentemente al menos 1950, nucleótidos contiguos de los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº:15, los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº:18, los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº:21 o los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº:23.

Las moléculas de ácido nucleico particularmente preferidas de la presente invención incluyen los nucleótidos 12603314 de SEC ID nº:14 (codifica para SEC ID nº:15), los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº:18 (codifica para SEC ID nº:19), los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº:21 (codifica para SEC ID nº:22) o los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº:23 (codifica para SEC ID nº:24), SEC ID nº:14, SEC ID nº:18, SEC ID nº:21 o SEC ID nº:23.

Según la presente invención, una molécula de ácido nucleico aislada es una molécula de ácido nucleico que se ha retirado de su medio natural (es decir, que se ha sometido a manipulación humana), siendo su medio natural el genoma o cromosoma en el que la molécula de ácido nucleico se encuentra en la naturaleza. Como tal, “aislado” no refleja necesariamente el grado hasta el que la molécula de ácido nucleico se ha purificado, sino que indica que la molécula no incluye un genoma completo o un cromosoma completo en el que la molécula de ácido nucleico se encuentra en la naturaleza. Una molécula de ácido nucleico aislada puede incluir un gen, tal como un gen de acetolactato sintasa descrito en la presente memoria. Una molécula de ácido nucleico aislada que incluye un gen no es un fragmento de un cromosoma que incluya tal gen, sino que más bien incluye la región codificante y las regiones reguladoras asociadas con el gen, sin genes adicionales que se encuentran de manera natural en el mismo cromosoma. Una molécula de ácido nucleico aislada también puede incluir una secuencia de ácido nucleico especificada flanqueada por (es decir, en el extremo 5’ y/o el 3’ de la secuencia) ácidos nucleicos adicionales que no flanquean normalmente la secuencia de ácido nucleico especificada en la naturaleza (es decir, son secuencias heterólogas). La molécula de ácido nucleico aislada puede incluir ADN, ARN (por ejemplo, ARNm), o derivados de o bien ADN o bien ARN (por ejemplo, ADNc). Aunque la frase “molécula de ácido nucleico” se refiere principalmente a la molécula de ácido nucleico física y la frase “secuencia de ácido nucleico” se refiere principalmente a la secuencia de nucleótidos en la molécula de ácido nucleico, las dos frases pueden utilizarse de manera intercambiable, especialmente con respecto a una molécula de ácido nucleico, o una secuencia de ácido nucleico, que puede codificar para una proteína.

Preferentemente, una molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención se produce utilizando tecnología de ADN recombinante (por ejemplo, la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la clonación) o síntesis química. Las moléculas de ácido nucleico aisladas incluyen moléculas de ácido nucleico naturales y homólogos de las mismas, que comprenden de manera no limitativa variantes alélicas naturales y moléculas de ácido nucleico modificadas en las que se han insertado, delecionado, sustituido y/o invertido nucleótidos de una manera tal que tales modificaciones proporcionan el efecto deseado sobre la actividad biológica de la proteína. Se han expuesto en detalle anteriormente las variantes alélicas y homólogos de proteína (por ejemplo, proteínas codificadas por homólogos de ácido nucleico).

Un homólogo de molécula de ácido nucleico puede producirse utilizando varios procedimientos conocidos por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Sambrook et al., ibid.). Por ejemplo, pueden modificarse moléculas de ácido nucleico utilizando una variedad de técnicas que comprenden de manera no limitativa técnicas de mutagénesis clásicas y técnicas de ADN recombinantes, tales como mutagénesis dirigida al sitio, tratamiento químico de una molécula de ácido nucleico para inducir mutaciones, escisión con enzimas de restricción de un fragmento de ácido

nucleico, ligación de fragmentos de ácido nucleico, amplificación por PCR y/o mutagénesis de regiones seleccionadas de una secuencia de ácido nucleico, síntesis de mezclas de oligonucleótidos y ligación de grupos de mezcla para “construir” una mezcla de moléculas de ácido nucleico y combinaciones de las mismas. Pueden seleccionarse homólogos de moléculas de ácido nucleico a partir de una mezcla de ácidos nucleicos modificados examinando la función de la proteína codificada por el ácido nucleico y/o mediante hibridación con un gen de tipo natural.

De manera similar, el tamaño mínimo de una molécula de ácido nucleico de la presente invención es un tamaño suficiente para codificar para una proteína que presenta la actividad biológica deseada, o suficiente para formar una sonda o cebador de oligonucleótido que puede formar un híbrido estable con la secuencia complementaria de una molécula de ácido nucleico que codifica para la proteína natural (por ejemplo, en condiciones de rigurosidad moderada, alta o muy alta). Como tal, el tamaño de la molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de este tipo puede depender de la composición de ácido nucleico y el porcentaje de homología o identidad entre la molécula de ácido nucleico y la secuencia complementaria así como de las condiciones de hibridación en sí (por ejemplo, temperatura, concentración de sal y concentración de formamida). El tamaño mínimo de una molécula de ácido nucleico que se utiliza como cebador de oligonucleótido o como sonda es normalmente de al menos aproximadamente 12 a aproximadamente 15 nucleótidos de longitud si las moléculas de ácido nucleico son ricas en GC y de al menos aproximadamente 15 a aproximadamente 18 bases de longitud si son ricas en AT. No existe ningún límite, distinto de un límite práctico, en el tamaño máximo de una molécula de ácido nucleico de la presente invención, porque la molécula de ácido nucleico puede incluir una parte de una secuencia que codifica una proteína (por ejemplo, una secuencia que codifica para acetolactato sintasa) o una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de longitud completa.

Una forma de realización de la presente invención incluye un vector recombinante que va a utilizarse para la transformación de un microorganismo de Thraustochytriales. Según la presente invención, un vector recombinante es una molécula de ácido nucleico diseñada por ingeniería genética (es decir, producida artificialmente) que se utiliza como herramienta para manipular una secuencia de ácido nucleico de elección y para introducir una secuencia de ácido nucleico de este tipo en una célula huésped. El vector recombinante es por tanto apropiado para su utilización en la clonación, secuenciación y/o manipulación de otra manera de la secuencia de ácido nucleico de elección, tal como mediante expresión y/o administración de la secuencia de ácido nucleico de elección a una célula huésped para formar una célula recombinante. Un vector de este tipo contiene normalmente secuencias de ácido nucleico heterólogas, es decir, secuencias de ácido nucleico que no se encuentran de manera natural adyacentes a una secuencia de ácido nucleico que va a administrarse, aunque el vector también puede contener secuencias de ácido nucleico reguladoras (por ejemplo, promotores, regiones no traducidas) que se encuentran de manera natural adyacentes a moléculas de ácido nucleico de la presente invención (tratado en detalle a continuación). El vector puede ser o bien ARN o bien ADN, o bien procariota o bien eucariota, y normalmente es un plásmido. El vector puede mantenerse como un elemento extracromosómico (por ejemplo, un plásmido) o puede integrarse en el cromosoma del microorganismo recombinante. Todo el vector puede permanecer en su sitio dentro de una célula huésped o, en ciertas condiciones, el ADN de plásmido puede delecionarse, dejando atrás la molécula de ácido nucleico de la presente invención. La molécula de ácido nucleico integrada puede estar bajo el control de un promotor cromosómico, bajo el control de un promotor de plásmido o nativo, o bajo una combinación de varios controles de promotores. Pueden integrarse copias únicas o múltiples de la molécula de ácido nucleico en el cromosoma. Un vector recombinante descrito en la presente memoria contiene al menos un marcador seleccionable para microorganismos de Thraustochytriales según la presente invención, tal como una secuencia de ácido nucleico que codifica para una acetolactato sintasa de Thraustochytriales (homólogo o proteína natural) o una secuencia de ácido nucleico que codifica para el gen ble (descrita a continuación). Tal como se utiliza en la presente memoria, la frase “molécula de ácido nucleico recombinante” se utiliza principalmente para referirse a un vector recombinante en el que se ha ligado la secuencia de ácido nucleico que va a clonarse, manipularse, transformarse en la célula huésped (es decir, el inserto).

Normalmente, un vector recombinante, y por tanto una molécula de ácido nucleico recombinante, incluye al menos una molécula de ácido nucleico de la presente invención unida funcionalmente a una o más secuencias de control de la transcripción. Tal como se utiliza en la presente memoria, la frase “molécula recombinante” o “molécula de ácido nucleico recombinante” se refiere principalmente a una molécula de ácido nucleico o secuencia de ácido nucleico unida funcionalmente a una secuencia de control de la transcripción, pero puede utilizarse de manera intercambiable con la frase “molécula de ácido nucleico”, cuando tal molécula de ácido nucleico es una molécula recombinante tal como se trata en la presente memoria. Según la presente invención, la frase “unida funcionalmente” se refiere a la unión de una molécula de ácido nucleico a una secuencia de control de la transcripción de una manera tal que la molécula puede expresarse cuando se transfecta (es decir, transforma, transduce, transfecta, conjuga o conduce) a una célula huésped. Las secuencias de control de la transcripción son secuencias que controlan la iniciación, elongación o terminación de la transcripción. Las secuencias de control de la transcripción particularmente importantes son las que controlan la iniciación de la transcripción, tales como secuencias promotoras, potenciadoras, de operador o represoras. Las secuencias de control de la transcripción adecuadas incluyen cualquier secuencia de control de la transcripción que puede funcionar en un microorganismo del orden Thraustochytriales. Los presentes inventores creen ser los primeros en aislar e identificar al menos tres de tales promotores, descritos en detalle en otra parte en la presente memoria.

Los promotores preferidos comprenden de manera no limitativa un promotor de acetolactato sintasa de Thraustochytriales (representado en la presente memoria por los nucleótidos 1-1259 de SEC ID nº:14), un promotor de (-tubulina de Thraustochytriales (representado en la presente memoria por los nucleótidos 441-894 de SEC ID nº:9), un promotor de un sistema de policétido sintasa (PKS) de Thraustochytriales (contenido dentro de SEC ID nº:34) y un promotor de ácido graso desaturasa de Thraustochytriales (contenido dentro de SEC ID nº:31; se indica que el promotor de ácido graso desaturasa se denomina promotor de desaturasa en la solicitud provisional US con número de serie 60/284.116, citada anteriormente). La clonación y secuenciación del promotor de (-tubulina, el promotor de acetolactato sintasa y el promotor de ácido graso desaturasa se describen en la sección de ejemplos. En una forma de realización preferida, el promotor de (-tubulina comprende la secuencia promotora de (-tubulina de Thraustochytriales que se produce de manera natural (nucleótidos 441-894 de SEC ID nº:9), o una secuencia de ácido nucleico que es por lo menos 95% idéntica a los nucleótidos 441-894 de SEC ID nº:9, presentando el promotor actividad transcripcional del promotor de (-tubulina al menos basal. De manera similar, un promotor de acetolactato sintasa preferido comprende una secuencia de ácido nucleico del promotor de acetolactato sintasa de Thraustochytriales que se produce de manera natural (representado dentro de los nucleótidos 1-1259 de SEC ID nº:14), o una secuencia de ácido nucleico que es por lo menos 75%, y más preferentemente el 80%, y más preferentemente el 85%, y más preferentemente el 90%, y más preferentemente el 95% idéntica a los nucleótidos 11259 de SEC ID nº:14, presentando el promotor actividad transcripcional del promotor de acetolactato sintasa al menos basal. Un promotor de PKS preferido comprende una secuencia de ácido nucleico de un promotor de PKS de Thraustochytriales que se produce de manera natural (representado dentro de SEC ID nº:34), o una secuencia de ácido nucleico que es por lo menos 75%, y más preferentemente el 80%, y más preferentemente el 85%, y más preferentemente el 90%, y más preferentemente el 95% idéntica a SEC ID nº:34, presentando el promotor actividad transcripcional del promotor de PKS al menos basal. Finalmente, un promotor de ácido graso desaturasa preferido comprende una secuencia de ácido nucleico del promotor de ácido graso desaturasa de Thraustochytriales (representado dentro de SEC ID nº:31), o está contenido dentro de una secuencia de ácido nucleico que es por lo menos 75%, y más preferentemente el 80%, y más preferentemente el 85%, y más preferentemente el 90%, y más preferentemente el 95% idéntica a SEC ID nº:31, presentando el promotor actividad transcripcional del promotor de ácido graso desaturasa al menos basal. Se han descrito anteriormente en la presente memoria unos procedimientos para determinar el porcentaje de identidad para las secuencias de acetolactato sintasa, y están comprendidos en la presente memoria.

En una forma de realización, un vector recombinante de la presente invención es un vector de expresión. Tal como se utiliza en la presente memoria, la frase “vector de expresión” se utiliza para referirse a un vector que es adecuado para la producción de un producto codificado (por ejemplo, una proteína de interés). En esta forma de realización, una secuencia de ácido nucleico que codifica para el producto que va a producirse se inserta en el vector recombinante para producir una molécula de ácido nucleico recombinante. La secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína que va a producirse se inserta en el vector de una manera que une operativamente la secuencia de ácido nucleico a secuencias reguladoras en el vector (por ejemplo, un promotor de Thraustochytriales de la presente invención) que permite la transcripción y traducción de la secuencia de ácido nucleico dentro del microorganismo recombinante. Los marcadores seleccionables de la presente invención permiten la selección de un microorganismo recombinante en el que una molécula de ácido nucleico recombinante de la presente invención se ha introducido satisfactoriamente.

En otra forma de realización, un vector recombinante de la presente invención es un vector de direccionamiento. Tal como se utiliza en la presente memoria, la frase “vector de direccionamiento” se utiliza para referirse a un vector que se utiliza para suministrar una molécula de ácido nucleico particular a una célula recombinante, en el que la molécula de ácido nucleico se utiliza para delecionar o inactivar un gen endógeno dentro de la célula huésped (es decir, utilizada para tecnología de desactivación o alteración genética dirigida). Un vector de este tipo puede conocerse también en la técnica como vector de “desactivación”. En un aspecto de esta forma de realización, una parte del vector, pero más normalmente, la molécula de ácido nucleico insertada en el vector (es decir, el inserto), presenta una secuencia de ácido nucleico que es homóloga a una secuencia de ácido nucleico de un gen diana en la célula huésped (es decir, un gen que se selecciona como diana para delecionarse o inactivarse). La secuencia de ácido nucleico del inserto de vector está diseñada para unirse al gen diana de manera que el gen diana y el inserto experimentan recombinación homóloga, mediante lo cual el gen diana endógeno se deleciona, inactiva o atenúa (es decir, en al menos una parte del gen diana endógeno que está mutándose o delecionándose).

En una forma de realización, un vector recombinante preferido de la presente invención es un vector recombinante que es adecuado para su utilización en un microorganismo de Thraustochytriales, y que incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica para una molécula de acetolactato sintasa de la presente invención. Preferentemente, la acetolactato sintasa está modificada en comparación con la forma que se produce de manera natural (SEC ID nº:15), de manera que la sintasa confiere a un microorganismo de Thraustochytriales que se ha transfectado con el vector recombinante una sensibilidad reducida a compuestos de sulfonilurea, inhibidores de la clase de imidazolinona y/o oxibenzoatos de pirimidinilo. Preferentemente, un vector recombinante de este tipo comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de acetolactato sintasa que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de SEC ID nº:15 en una sustitución, inserción o deleción de aminoácido en una o más de las siguientes posiciones: 116G, 117A, 192P, 200A, 251K, 358M, 383D, 592V, 595W o 599F. En una forma de

realización, tales proteínas de acetolactato sintasa presentan una secuencia de aminoácidos que incluye, pero sin limitarse a: SEC ID nº:19, SEC ID nº:22 y SEC ID nº:24. Preferentemente, un vector recombinante de este tipo comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada de: los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº:18, los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº:21 y los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº:23. En una forma de realización particularmente preferida, los vectores recombinantes que contienen secuencias de ácido nucleico que codifican para ALS que confieren la resistencia deseada incluyen SEC ID nº:18, SEC ID nº:21 y SEC ID nº:23.

En una forma de realización, un vector recombinante que es adecuado para conferir a un microorganismo de Thraustochytriales que se ha transfectado con el vector recombinante una sensibilidad reducida a compuestos de sulfonilurea, inhibidores de la clase de imidazolinona y/o oxibenzoatos de pirimidinilo, comprende SEC ID nº:15, que es la secuencia de acetolactato sintasa de Schizochytrium que se produce de manera natural. En esta forma de realización, el vector recombinante está diseñado para sobreexpresar la sintasa que se produce de manera natural, mediante lo cual tal sobreexpresión presenta el efecto de conferir resistencia a los compuestos especificados en el microorganismo. En esta forma de realización, un experto en la materia apreciará que la utilización de tecnología de ADN recombinante puede mejorar el control de la expresión de moléculas de ácido nucleico transformadas manipulando, por ejemplo, el número de copias de las moléculas de ácido nucleico dentro de la célula huésped, la eficacia con la que esas moléculas de ácido nucleico se transcriben, la eficacia con la que los transcritos resultantes se traducen, y la eficacia de las modificaciones postraduccionales. Adicionalmente, la secuencia promotora podría modificarse por ingeniería genética para mejorar el nivel de expresión en comparación con el promotor nativo. Las técnicas recombinantes útiles para controlar la expresión de moléculas de ácido nucleico comprenden de manera no limitativa integración de las moléculas de ácido nucleico en uno o más cromosomas celulares, adición de secuencias de estabilidad de vector a plásmidos, sustituciones o modificaciones de señales de control de la transcripción (por ejemplo, promotores, operadores, potenciadores), sustituciones o modificaciones de señales de control de la traducción (por ejemplo, sitios de unión a ribosomas, secuencias de Shine-Dalgarno), modificación de moléculas de ácido nucleico para que correspondan a la utilización de codones de la célula huésped, y deleción de secuencias que desestabilizan transcritos.

Tal como se da a conocer en la presente memoria, un vector recombinante adecuado para su utilización en la transformación de microorganismos de Thraustochytriales contiene el gen Sh ble de Streptoalloteichus hindustanus como marcador seleccionable (que codifica para una “proteína de unión a la bleomicina”), en combinación con un promotor de Thraustochytriales tal como se describió anteriormente en la presente memoria. Un vector recombinante preferido que comprende el gen ble y un promotor de Thraustochytriales incluye, por ejemplo, la secuencia de vector representada por SEC ID nº:8 ó 9. La secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a la bleomicina de Streptoalloteichus hindustanus se representa en la presente memoria como SEC ID nº:10.

Las moléculas de ácido nucleico recombinantes de la presente invención, que pueden ser o bien ADN o bien ARN, también pueden contener secuencias reguladoras adicionales, tales como secuencias reguladoras de la traducción, orígenes de replicación y otras secuencias reguladoras que son compatibles con la célula recombinante. En una forma de realización, una molécula recombinante de la presente invención, incluyendo las que se integran en el cromosoma de la célula huésped, también contiene señales secretoras (es decir, secuencias de ácido nucleico de segmento señal) para permitir que una proteína expresada se secrete de la célula que produce la proteína. Los segmentos de señal adecuados incluyen un segmento de señal que está asociado de manera natural con la proteína que va a expresarse o cualquier segmento de señal heterólogo que puede dirigir la secreción de la proteína según la presente invención. En otra forma de realización, una molécula recombinante de la presente invención comprende una secuencia líder para permitir que una proteína expresada se suministre a y se inserte en la membrana de una célula huésped. Las secuencias líder adecuadas incluyen una secuencia líder que está asociada de manera natural con la proteína, o cualquier secuencia líder heteróloga que puede dirigir el suministro y la inserción de la proteína a la membrana de una célula.

Habiendo descrito diversas herramientas que son útiles para transformar microorganismos del orden Thraustochytriales, una forma de realización de la presente invención se refiere a un procedimiento para la transformación de células de un microorganismo del orden Thraustochytriales. El procedimiento incluye una primera etapa de: (a) introducir en células de un microorganismo del orden Thraustochytriales una molécula de ácido nucleico recombinante tal como se describió anteriormente en la presente memoria. La molécula de ácido nucleico recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una acetolactato sintasa que confiere a dichas células sensibilidad reducida a compuestos seleccionados de entre el grupo constituido por: compuestos de sulfonilurea, inhibidores de la clase de imidazolinona y oxibenzoatos de pirimidinilo. Tales acetolactato sintasas se han descrito en detalle anteriormente e incluyen las acetolactato sintasas que presentan una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº:19, SEC ID nº:22 y SEC ID nº:24, así como homólogos de cualquiera de tales secuencias o SEC ID nº:15 tal como se expuso anteriormente. El procedimiento incluye una segunda etapa que consiste en: (b) seleccionar células que se han transformado satisfactoriamente con la molécula de ácido nucleico recombinante cultivando las células de (a) en un medio que contiene al menos un compuesto que es inhibidor para células no transformadas, seleccionándose el compuesto de entre el grupo constituido por: un compuesto de sulfonilurea, un inhibidor de la clase de imidazolinona y oxibenzoatos de pirimidinilo. Las células que crecen en presencia de tales compuestos se han transformado satisfactoriamente.

La molécula de ácido nucleico recombinante utilizada en el presente procedimiento comprende cualquiera de los vectores recombinantes de la presente invención anteriormente descritos en la presente memoria, y normalmente incluye al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que va a producirse por la célula recombinante (es decir, que comprende un vector de expresión recombinante), o una secuencia de ácido nucleico útil para la deleción o inactivación dirigida de un gen endógeno en la célula recombinante (es decir, que comprende un vector de direccionamiento recombinante).

En una forma de realización, la molécula de ácido nucleico recombinante comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que va a producirse por la célula, en la que la secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína está unida funcionalmente a una secuencia de control de la transcripción. Los expertos en la materia conocerán proteínas que puede ser deseables para su producción en Thraustochytriales, y todas pretenden abarcarse por la presente invención. Las proteínas particularmente preferidas comprenden de manera no limitativa proteínas asociadas con la síntesis de un ácido graso seleccionado de entre el grupo constituido por ácido docosahexaenoico (DHA), ácido docosapetaenoico (DPA), ácido eicosapentaenoico (EPA) y ácido araquidónico (ARA). Tales proteínas incluyen, por ejemplo, una ácido graso sintasa, una ácido graso desaturasa, una ácido graso elongasa, una proteína asociada con un complejo de policétido sintasa y una proteína asociada con la incorporación de ácidos grasos a fosfolípidos o a moléculas de triacilglicerol. En un aspecto, la proteína es una ácido graso w-3 desaturasa codificada por una secuencia de ácido nucleico SEC ID nº:29. SEC ID nº:30 representa la secuencia de aminoácidos de la desaturasa. En otro aspecto, la proteína es una ácido graso polienoico isomerasa. En una forma de realización, las proteínas que pueden producirse en microorganismos de Thraustochytriales utilizando el presente procedimiento incluyen proteínas asociadas con las rutas biosintéticas de isoprenoides. Tales proteínas comprenden de manera no limitativa HMG-CoA sintasa, HMG-CoA reductasa, escualeno sintasa, fitoeno sintasa, fitoeno desaturasa, una carotenoide ciclasa, una carotenoide hidroxilasa, una carotenoide cetolasa. Aún en otra forma de realización, las proteínas que pueden producirse en microorganismos de Thraustochytriales utilizando el presente procedimiento comprenden de manera no limitativa vitamina E y ácido lipoico.

En una forma de realización, la molécula de ácido nucleico recombinante útil en el procedimiento de la presente invención incluye una secuencia de ácido nucleico que hibrida con una secuencia de ácido nucleico diana en el microorganismo de manera que un gen que comprende la secuencia de ácido nucleico diana se muta o inactiva mediante recombinación homóloga con la segunda secuencia de ácido nucleico. Una secuencia de ácido nucleico de este tipo puede ser homóloga a genes que codifican para enzimas (o ácidos nucleicos que regulan la expresión de tales genes) de las rutas de síntesis de ácidos grasos saturados y poliinsaturados, genes que codifican para proteínas que están implicadas en la degradación de otros compuestos valiosos producidos por el microorganismo de Thraustochytriales que de otra manera disminuyen el valor del compuesto deseado, o genes que codifican para proteínas que están asociadas con la síntesis de compuestos cuya síntesis está en competición con otras moléculas de interés. Por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico diana comprenden de manera no limitativa secuencias que codifican lipasas, enzimas de oxidación de ácidos grasos, proteínas implicadas en la síntesis de hidratos de carbono, proteínas implicadas en la síntesis de productos de rutas de isoprenoides, proteínas implicadas en la síntesis de componentes de la pared celular, proteínas implicadas en las rutas de síntesis de ácidos grasos saturados, proteínas implicadas en las rutas de síntesis de ácidos grasos poliinsaturados, proteínas asociadas con un complejo de policétido sintasa y proteínas asociadas con la incorporación de ácidos grasos a fosfolípidos o moléculas de triacilglicerol.

En una forma de realización de la presente invención, el procedimiento para la transformación de microorganismos de Thraustochytriales incluye una etapa que consiste en introducir en la célula al menos una molécula de ácido nucleico recombinante adicional que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que va a expresarse, estando la secuencia de ácido nucleico unida funcionalmente a una secuencia de control de la transcripción. Alternativamente, la molécula de ácido nucleico recombinante adicional puede incluir una segunda secuencia de ácido nucleico que hibrida con una secuencia de ácido nucleico diana en el microorganismo de manera que un gen que comprende la secuencia de ácido nucleico diana se muta o inactiva mediante recombinación homóloga con la segunda secuencia de ácido nucleico. De esta manera, pueden introducirse múltiples proteínas en las células, pueden inactivarse múltiples genes, o son posibles combinaciones de los dos. La molécula de ácido nucleico recombinante adicional puede introducirse en el microorganismo de Thraustochytriales simultáneamente con la primera molécula de ácido nucleico recombinante (es decir, cotransformación), o como una transformación posterior (por ejemplo, para los fines de “apilar” rasgos).

En una forma de realización, el procedimiento incluye además la etapa que consiste en introducir en la célula al menos una molécula de ácido nucleico recombinante adicional que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de unión a la bleomicina. En esta forma de realización, la molécula de ácido nucleico recombinante adicional se introduce preferentemente en una etapa posterior, en vez de como una cotransformación. Preferentemente, la molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de unión a la bleomicina comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica para una segunda proteína que va a expresarse por la célula, en la que la secuencia de ácido nucleico que codifica para la segunda proteína está unida funcionalmente a una secuencia de control de la transcripción. Alternativamente, o además, la molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de unión a la bleomicina comprende además una segunda secuencia de ácido

nucleico que hibrida con una secuencia de ácido nucleico diana en el microorganismo de manera que un gen que comprende la secuencia de ácido nucleico diana se muta o inactiva mediante recombinación homóloga con la segunda secuencia de ácido nucleico. En una forma de realización, una molécula de ácido nucleico recombinante de este tipo comprende una secuencia de ácido nucleico SEC ID nº:9.

Las células huésped adecuadas para transformar utilizando el procedimiento de la presente invención comprenden de manera no limitativa cualquier microorganismo del orden Thraustochytriales. Las células huésped pueden ser o bien células no transformadas o bien células que ya están transfectadas con al menos una molécula de ácido nucleico. Las células huésped preferidas para su utilización en la presente invención incluyen microorganismos de un género que comprende de manera no limitativa: Thraustochytrium, Labyrinthuloides, Japonochytrium y Schizochytrium. Las especies preferidas dentro de estos géneros incluyen, pero no se limitan a: cualquier especie de Schizochytrium, incluyendo Schizochytrium aggregatum, Schizochytrium limacinum, Schizochytrium minutum; cualquier especie de Thraustochytrium (incluyendo especies de Ulkenia anteriores tales como U. visurgensis, U. amoeboida, U. sarkariana, U. profunda, U. radiata, U. minuta y Ulkenia sp. BP-5601), e incluyendo Thraustochytrium striatum, Thraustochytrium aureum, Thraustochytrium roseum; y cualquier especie de Japonochytrium. Las cepas particularmente preferidas de Thraustochytriales incluyen, pero no se limitan a: Schizochytrium sp. (S31) (ATCC 20888); Schizochytrium sp. (S8) (ATCC 20889); Schizochytrium sp. (LC-RM) (ATCC 18915); Schizochytrium sp. (SR21); Schizochytrium aggregatum (Goldstein et Belsky) (ATCC 28209); Schizochytrium limacinum (Honda et Yokochi) (IFO 32693); Thraustochytrium sp. (23B) (ATCC 20891); Thraustochytrium striatum (Schneider) (ATCC 24473); Thraustochytrium aureum (Goldstein) (ATCC 34304); Thraustochytrium roseum (Goldstein) (ATCC 28210); y Japonochytrium sp. (L1) (ATCC 28207).

Según la presente invención, el término “transformación” se utiliza para referirse a cualquier procedimiento mediante el cual una molécula de ácido nucleico exógena (es decir, una molécula de ácido nucleico recombinante) puede insertarse en células microbianas, tales como células microbianas de Thraustochytriales. En los sistemas microbianos, el término “transformación” se utiliza para describir un cambio heredado debido a la adquisición de ácidos nucleicos exógenos por el microorganismo y es esencialmente sinónimo al término “transfección”. Las técnicas de transformación adecuadas comprenden de manera no limitativa bombardeo de partículas, electroporación, microinyección, lipofección, adsorción, infección y fusión de protoplastos.

En una forma de realización, una proteína que va a producirse utilizando un procedimiento de la presente invención se produce cultivando una célula que expresa la proteína (es decir, un microorganismo de Thraustochytriales recombinante) en condiciones eficaces para producir la proteína. En algunos casos, la proteína puede recuperarse, y en otros, el microorganismo puede recogerse como un todo o como un lisado y utilizarse como una “biomasa”. En otra forma de realización, un gen diana se deleciona o inactiva cultivando una célula que se ha transformado con una molécula recombinante que comprende un vector de direccionamiento de la presente invención en condiciones eficaces para permitir la recombinación dentro de la célula, dando como resultado la deleción o inactivación de un gen diana. Una célula preferida para cultivar es una célula recombinante de la presente invención. Las condiciones de cultivo eficaces comprenden de manera no limitativa condiciones de oxígeno, pH, temperatura, biorreactor y medios eficaces que permiten la producción de proteína y/o la recombinación. Un medio eficaz se refiere a cualquier medio en el que se cultiva normalmente una célula de Thraustochytriales. Tal medio comprende normalmente un medio acuoso que presenta fuentes de carbono, nitrógeno y fosfato asimilables, y sales, minerales, metales y otros nutrientes apropiados, tales como vitaminas. Se tratan en detalle ejemplos de medios y condiciones de cultivo adecuados en la sección de ejemplos. También se describen las condiciones de cultivo adecuadas para microorganismos de Thraustochytriales en la patente US nº 5.340.742, concedida el 23 de agosto de 1994 a Barclay; incorporada a la presente memoria como referencia en su totalidad. Las células de la presente invención pueden cultivarse en biorreactores de fermentación, matraces de agitación, tubos de ensayo, placas de microtitulación y placas de Petri convencionales. El cultivo puede llevarse a cabo a una temperatura, un pH y un contenido en oxígeno apropiados para una célula recombinante. Tales condiciones de cultivo están dentro de la experiencia de un experto habitual en la materia.

Dependiendo del vector y sistema de huésped utilizados para la producción, las proteínas resultantes de la presente invención pueden o bien permanecer dentro de la célula recombinante; secretarse al medio de fermentación; secretarse al espacio entre dos membranas celulares; o bien retenerse en la superficie externa de una membrana celular. La frase “recuperar la proteína” se refiere a recoger todo el medio de fermentación que contiene la proteína y no implica necesariamente etapas adicionales de separación o purificación. Las proteínas producidas mediante el procedimiento de la presente invención pueden purificarse utilizando una variedad de técnicas de purificación de proteínas convencionales, tales como, pero sin limitarse a, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, filtración, electroforesis, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de filtración en gel, cromatografía en fase inversa, cromatografía de concanavalina A, cromatoenfoque y solubilización diferencial. Las proteínas producidas mediante el procedimiento de la presente invención se recuperan preferentemente en forma “sustancialmente pura”. Tal como se utiliza en la presente memoria, “sustancialmente pura” se refiere a una pureza que permite la utilización eficaz de la proteína como producto comercial.

Aún otra forma de realización de la presente invención se refiere a un microorganismo recombinante del orden Thraustochytriales, que se ha transformado con una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una

secuencia de ácido nucleico que codifica para una acetolactato sintasa de la presente invención. Preferentemente, la acetolactato sintasa confiere al microorganismo sensibilidad reducida a compuestos seleccionados de entre el grupo constituido por: compuestos de sulfonilurea, inhibidores de la clase de imidazolinona y oxibenzoatos de pirimidinilo. Las secuencias y moléculas de ácido nucleico recombinantes para su utilización en la transformación de un microorganismo de este tipo se han descrito en detalle anteriormente. Un microorganismo de este tipo puede transformarse además con otras moléculas de ácido nucleico recombinante, incluyendo moléculas de ácido nucleico recombinante que comprenden un marcador seleccionable de gen ble y secuencias de control de la transcripción de Thraustochytriales, tal como se describió anteriormente en la presente memoria. Microorganismos de Thraustochytriales recombinantes según la presente invención se describen en la sección de ejemplos. Según la presente invención, un microorganismo de Thraustochytriales recombinante de la presente invención está modificado por ingeniería genética para expresar una proteína de interés (ejemplos de tales proteínas se tratan anteriormente) utilizando los vectores recombinantes descritos en la presente memoria, y/o está modificado por ingeniería genética para una inactivación o deleción dirigida de un gen diana utilizando los vectores recombinantes descritos en la presente memoria.

Tal como se utiliza en la presente memoria, un microorganismo recombinante presenta un genoma que está modificado (es decir, mutado o cambiado) con respecto a su forma normal (es decir, de tipo natural o que se produce de manera natural) utilizando tecnología recombinante. Un microorganismo recombinante según la presente invención puede incluir un microorganismo en el que se han insertado, delecionado o modificado moléculas de ácido nucleico (es decir, mutado; por ejemplo, mediante inserción, deleción, sustitución y/o inversión de nucleótidos), de una manera tal que tales modificaciones proporcionan el efecto deseado dentro del microorganismo. Tal como se utiliza en la presente memoria, las modificaciones genéticas que dan como resultado una disminución en la expresión génica, en la función del gen, o en la función del producto génico (es decir, la proteína codificada por el gen) pueden denominarse inactivación (completa o parcial), deleción, interrupción, bloqueo o regulación por disminución de un gen. Por ejemplo, una modificación genética en un gen que da como resultado una disminución en la función de la proteína codificada por tal gen puede ser el resultado de una deleción completa del gen (es decir, el gen no existe, y por tanto la proteína no existe), una mutación en el gen que da como resultado una traducción incompleta de la proteína o que no se traduzca en absoluto (por ejemplo, la proteína no se expresa), o una mutación en el gen que disminuye o suprime la función natural de la proteína (por ejemplo, se expresa una proteína que presenta acción o actividad enzimática disminuida o falta de la misma). Las modificaciones genéticas que dan como resultado un aumento en la función o expresión génica pueden denominarse amplificación, sobreproducción, sobreexpresión, activación, potenciación, adición o regulación por incremento de un gen.

Según la presente invención, puede producirse un microorganismo de Thraustochytriales recombinante utilizando cualquier microorganismo del orden Thraustochytriales. Los géneros preferidos de Thraustochytriales incluyen, pero no se limitan a: Thraustochytrium, Labyrinthuloides, Japonochytrium y Schizochytrium. Las especies preferidas dentro de estos géneros incluyen, pero no se limitan a: cualquier especie de Schizochytrium, incluyendo Schizochytrium aggregatum, Schizochytrium limacinum; cualquier especie de Thraustochytrium (incluyendo cualquier especie de Ulkenia anterior tal como U. visurgensis, U. amoeboida, U. sarkariana, U. profunda, U. radiata,

U. minuta y Ulkenia sp. BP-5601), Thraustochytrium striatum, Thraustochytrium aureum, Thraustochytrium roseum; y cualquier especie de Japonochytrium. Las cepas particularmente preferidas de Thraustochytriales incluyen, pero no se limitan a: Schizochytrium sp. (S31) (ATCC 20888); Schizochytrium sp. (S8) (ATCC 20889); Schizochytrium sp. (LC-RM) (ATCC 18915); Schizochytrium sp. (SR21); Schizochytrium aggregatum (Goldstein et Belsky) (ATCC 28209); Schizochytrium limacinum (Honda et Yokochi) (IFO 32693); Thraustochytrium sp. (23B) (ATCC 20891); Thraustochytrium striatum (Schneider) (ATCC 24473); Thraustochytrium aureum (Goldstein) (ATCC 34304); Thraustochytrium roseum (Goldstein) (ATCC 28210); y Japonochytrium sp. (L1) (ATCC 28207).

Los siguientes ejemplos se proporcionan a título ilustrativo y no limitativo del alcance de la presente invención.

Ejemplos

Ejemplo 1

Este ejemplo describe la producción del plásmido recombinante pTUBZEO11-2.

La construcción del plásmido recombinante pTUBZEO11-2 se ilustra en las figuras 1 y 2. Este plásmido contiene el gen ble de Streptoalloteichus hindustanus funcionalmente acoplado a un promotor del gen de (-tubulina aislado de Schizochytrium sp. Este plásmido se produjo tal como expone a continuación. Se aisló un clon de ADNc (CGNE0002-001-B6) de una biblioteca de ADNc de Schizochytrium sp. y se secuenció parcialmente (SEC ID nº:1) como parte de un proyecto de secuenciación de ADNc de Schizochytrium a gran escala. Se determinó que la secuencia de nucleótidos codificaba para (-tubulina mediante búsqueda de homología BLASTX (Gish, W. y D. States. 1993. Nat. Genet. 3:266-272). La secuencia de aminoácidos deducida a partir de las bases 116 a 550 es el 93% idéntica a los primeros 145 aminoácidos de (-tubulina de Pelvetica fastigiata (nº de registro de GenBank U58642).

Con el fin de aislar el promotor asociado con este gen, se aisló una biblioteca de ADN genómico a partir de células de Schizochytrium sp. y se procesó mediante la utilización de un kit “GenomeWalker™” kit (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA), que implica digestión enzimática de ADN genómico con endonucleasas de restricción para generar extremos romos, seguido por ligación del ADN digerido a moléculas adaptadoras de ADN bicatenario específicas proporcionadas en el kit. Se amplificó entonces el ADN en el sentido de 5’ de la secuencia codificante de (-tubulina mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), utilizando el cebador adaptador externo (AP1) proporcionado en el kit y el cebador específico de (-tubulina PGR20 (SEC ID nº:2). Se llevó a cabo amplificación adicional del gen utilizando el cebador adaptador anidado (AP2) proporcionado en el kit y un cebador específico de (-tubulina anidado PGR19 (SEC ID nº:3). Se subclonaron los productos de PCR resultantes en el plásmido pCR2.1-TOPO (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). Se secuenció uno de los fragmentos subclonados; la secuencia de las 725 pb que preceden inmediatamente al codón de iniciación del gen de (-tubulina se facilita como SEC ID nº:4.

Utilizando los cebadores de oligonucleótido basados en la secuencia de ADN obtenida de esta manera, se utilizó PCR utilizando Taq ADN polimerasa (Perkin-Elmer Corp., Norwalk, CT) para generar una región promotora de (tubulina modificada en la que se incorporó un sitio de restricción NcoI en el extremo 3’ del fragmento de ADN; este sitio NcoI contenía un codón de iniciación que estaba en la misma posición que en la región codificante de (-tubulina. Los cebadores utilizados en esta reacción fueron PGR33 (SEC ID nº: 5) y PGR34 (SEC ID nº:6), y el molde era ADN genómico aislado de células de Schizochytrium sp. Se utilizaron las siguientes condiciones de reacción: 94ºC durante 4 min.; (94ºC durante 1 min., 54ºC durante 45 s, 72ºC durante 2 min.) x 30; 72ºC durante 7 min. Se clonó este fragmento en el plásmido pCR2.1-TOPO para formar el plásmido p7TUB (SEC ID nº:7). Se digirió el plásmido p7TUB con NcoI, y se aisló un fragmento de 463 pb resultante que contenía la región promotora de (-tubulina de Schizochytrium mediante purificación en gel de agarosa. El plásmido pSV40/Zeo (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA), que contiene el gen ble de Streptoalloteichus hindustanus flanqueado por un promotor y terminador de SV40, también se digirió con NcoI para producir un fragmento de 3201 pb y otro de 314 pb. El fragmento de 3201 pb se purificó en gel de agarosa y se ligó al fragmento de Ncol de 463 pb de p7TUB para producir pTUBZEO-11 (SEC ID nº:8), representado en la figura 1.

A continuación, se digirió el plásmido pTUBZEO-11 con SphI, y un fragmento de 1122 pb resultante que contenía el gen ble flanqueado por el promotor de (-tubulina de Schizochytrium y el terminador de SV40 se purificó en gel de agarosa y se ligó al plásmido pUC19 (Messing, J. 1983. Meth. Enzymol. 101:20) que se había linealizado mediante digestión con SphI. Se denominó el plásmido resultante pTUBZEO11-2 (SEC ID nº:9) y se representa en las figuras 2 y 4. El plásmido pTUBZEO11-2 también se denomina pMON50000. En SEC ID nº:9, el promotor de (-tubulina de Schizochytrium está contenido dentro de los nucleótidos 441-894; la región codificante del gen ble está contenida dentro de los nucleótidos 895-1269; y el terminador de SV40 está contenido dentro de los nucleótidos 1270-1524.

Ejemplo 2

Este ejemplo describe la producción de los plásmidos recombinantes pMON50200, pMON50201, pMON50202 y pMON50203.

Se aisló el gen que codifica para acetolactato sintasa nativa (als) de Schizochytrium sp. de la siguiente manera. Se aisló un clon de ADNc (LIB81-028-Q1-E1-D9) de una biblioteca de ADNc de Schizochytrium y se secuenció parcialmente (SEC ID nº:11) como parte de un proyecto de secuenciación de ADNc de Schizochytrium sp. a gran escala. Se determinó mediante homología BLASTX que la secuencia de nucleótidos codificaba para acetolactato sintasa; por ejemplo, la secuencia de aminoácidos a partir de las bases 154 a 378 era el 68% idéntica a los aminoácidos 313 a 387 de ALS de Schizosaccharomyces pombe (nº de registro de GenBank P36620). Se obtuvo entonces la secuencia de longitud completa de este ADNc clonado, lo que indicó que el clon de ADNc no contenía la región codificante de als completa. Con el fin de obtener el gen als de longitud completa, se estudió con sonda una biblioteca lambda genómica de Schizochytrium utilizando protocolos convencionales (véase por ejemplo Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) con una sonda de ADN marcada con digoxigenina (DIG) de 372 pb (denominada sonda ALS2). Se generó la sonda ALS2 mediante PCR utilizando una mezcla de nucleótidos que incluía DIG-11-UTP (Boehringer Mannheim Biochemicals GmbH, Alemania), utilizando el cebador directo PGR38 (SEC ID nº:12) y el cebador inverso PGR39 (SEC ID nº:13), que se basaban en la secuencia del clon de ADNc LIB81-028-Q1-E1-D9. Uno de los clones genómicos identificados con la sonda ALS2, denominado ALS-4A, se aisló y caracterizó adicionalmente mediante transferencias de hibridación de tipo Southern utilizando la sonda ALS2 marcada con DIG. Se encontró que un fragmento de 4,9 kpb de ADN lambda de ALS-4A digerido con AhdI hibridaba con la sonda ALS2. Se aisló este fragmento mediante purificación en gel de agarosa, se trató con ADN polimerasa de T4 con el fin de generar extremos romos y entonces se ligó en pBluescriptII KS+ digerido con SmaI (Stratagene Corp., La Jolla, CA) para formar el plásmido pMON50200 (representado en la figura 3-A). La secuencia de pMON50200 se facilita como SEC ID nº:14. La secuencia de la enzima acetolactato sintasa codificada por el gen als de Schizochytrium se facilita como SEC ID nº:15.

Los plásmidos pMON50201, pMON50202 y pMON50203 (representados en las figuras 3-B, 3-C y 3-D, respectivamente) se produjeron a partir del plásmido pMON50200 mediante mutagénesis dirigida al sitio de manera que las enzimas acetolactato sintasa codificadas ya no se inhiben más por ciertos compuestos, incluyendo

sulfometuron metil (SMM). Se construyeron estos plásmidos tal como sigue. Se utilizó el kit de mutagénesis dirigida al sitio “Transformerä” (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) para introducir las siguientes mutaciones en el plásmido pMON502000 según las instrucciones del fabricante. Se utilizó un cebador de selección de oligonucleótido, DM19 (SEC ID nº:16), en las tres construcciones; este cebador conduce a la conversión de un único sitio EcoRV en el sitio de clonación múltiples de pMON50200 en un sitio AatII. Se utilizó el cebador DM14 (SEC ID nº:17) para cambiar el residuo de aminoácido número 595 en la enzima ALS codificada de triptófano a valina, mientras que al mismo tiempo se introducía un sitio AclI en la secuencia génica; el plásmido resultante se denomina pMON50201 (SEC ID nº:18). Asimismo, se utilizó el cebador DM15 (SEC ID nº:20) para cambiar el residuo de aminoácido número 192 en la enzima ALS codificada de una prolina a una glutamina y para introducir un sitio BsgI en el gen als, dando como resultado el plásmido pMON50202 (SEC ID nº:21). Para construir el plásmido pMON50203 (SEC ID nº:23), se utilizaron los cebadores tanto DM14 como DM 15, dando como resultado una enzima ALS codificada que contenía ambos reemplazamientos de residuos de aminoácidos descritos anteriormente. Las secuencias de las enzimas acetolactato sintasa mutantes codificadas por los plásmidos pMON50201, pMON50202 y pMON50203 se facilitan como SEC ID nº:19, SEC ID nº:22 y SEC ID nº:24, respectivamente.

Ejemplo 3

Este ejemplo describe la transformación genética de Schizochytrium sp. con las moléculas recombinantes descritas en los ejemplos 1 y 2.

La cepa utilizada en este ejemplo es Schizochytrium sp. N230D, un derivado de la cepa 20888 de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, Manassas, VA). Para los cultivos líquidos, se hicieron crecer las células axénicamente en medio M50-3 a 30ºC con agitación a 200-300 rpm. El medio M50-3 contiene los siguientes componentes: NaCl, 12,5 g; MgSO4·7H2O, 2,5 g; KCl, 0,5 g; CaCl2, 0,05 g; glucosa, 30 g; Na-glutamato, 3 g; KH2PO4, 0,4 g; extracto de levaduras, 1 g; NaHCO3, 0,4 g; Na2EDTA, 30 mg; FeCl3·6H2O, 1,2 mg; H3BO3, 34,2 mg; ZnSO4·7H2O; 0,67 mg; CoCl2·6H2O, 0,13 mg; NaMoO4·2H2O, 25 Ig; CuSO4·5H2O, 10 Ig; NiSO4·6H2O, 0,26 mg; tiamina·HCl, 100 Ig; biotina, 0,5 Ig; cianocobalamina, 0,5 Ig y agua desionizada (hasta un litro); pH final ajustado a 7,0. Para el crecimiento en medio sólido, se hicieron crecer las células a 30ºC en medio M50-3 o medio M1E-3 solidificado mediante la adición de agar al 1,5% (p/v). El medio M1E-3 contiene los siguientes componentes: glucosa, 4 g; (NH4)2SO4, 0,75 g; Na2SO4, 5 g; MgSO4·7H2O, 2 g; KH2PO4, 0,5 g; KCl, 0,5 g; CaCl2·2H2O, 0,1 g; tampón MOPS, 20,9 g; FeSO4·4H2O, 0,3 mg; MnCl2·4H2O, 0,1 mg; ZnSO4·7H2O; 80 Ig; CoCh·6H2O, 2 Ig; NaMoO4·2H2O, 1 Ig; CuSO4·5H2O, 60 Ig; NiSO4·6H2O, 80 Ig; tiamina·HCl, 320 Ig; CA-pantotenato, 320 Ig; cianocobalamina, 8 Ig y agua desionizada (hasta un litro); pH final ajustado a 7,0.

Se determinó la sensibilidad de Schizochytrium sp. a Zeocin™ y SMM incluyendo estos inhibidores en medio M1E-3 solidificado a diversas concentraciones y propagando las células en las placas a densidades similares a las que están presentes durante procedimientos utilizados para la selección de células recombinantes.

Se realizó la transformación genética de células de Schizochytrium mediante bombardeo de partículas (Sanford, J.C., F.D. Smith, y J.A. Russell. 1993. Meth. Enzymol. 217:483-509) utilizando un sistema de suministro de partículas Biolistic PDS-1000/He de Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Se hicieron crecer células de Schizochytrium sp. N230D en medio M50-3 líquido hasta una densidad óptica a 680 nm (DO680) de 0,4-0,8 (longitud de trayectoria óptica de 10 mm). Se centrifugó brevemente una alícuota de células correspondiente a 1,0 DO680, se eliminó la disolución de sobrenadante y se resuspendieron las células sedimentadas en 100 Il de agua estéril. Entonces se propagaron las células resuspendidas en un círculo de 4 a 6 cm sobre una placa de Petri que contenía medio solidificado con agar (por ejemplo, medio M50-3 o M1E-3) y se dejó reposar durante de 30 a 60 min. de modo que el agua en exceso pudo absorberse en el medio sólido; ésta se denomina placa diana.

Se recubrió una alícuota de 1,5 mg de microportadores de oro (diámetro nominal de 0,6 Il, disponibles de Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA) con 2,5 Ig de ADN de plásmido de transformación (es decir, plásmido pTUBZEO11-2, pMON50201, pMON50202 o pMON50203) según las instrucciones del fabricante (manual de instrucciones del sistema de suministro de partículas Biolistic® PDS-1000/He; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Se bombardearon las células con los microportadores de oro recubiertos con ADN utilizando las siguientes condiciones: disco de ruptura de 1100 psi, vacío de la cámara de 25” Hg, conjunto de lanzamiento de microportadores colocado en el estante superior y las placas diana colocadas en el estante del medio, proporcionando una distancia desde el disco de ruptura hasta la pantalla de parada de 1,5-2 cm y una distancia desde la pantalla de parada hasta la diana de aproximadamente 7 cm. Tras el bombardeo, se dejó que las células se recuperaran en las placas diana durante 4-6 horas a 30ºC. Entonces se separaron por enjuagado las células de las placas diana con 1,5 ml de agua estéril, se recogieron en un tubo de microcentrífuga, se centrifugaron brevemente y se resuspendieron en 400 Il de agua estéril. Se propagaron cien microlitros de la suspensión sobre cada una de cuatro placas M1E-3 que contenían o bien 150-200 Ig/ml de Zeocin™ (Invitrogen Corp., Carlbad, CA) o 25 Ig/ml de SMM. Se utilizaron las placas que contenían Zeocin™ para seleccionar células que se habían transformado con el plásmido pTUBZEO11-2, mientras que se utilizaron las placas que contenían SMM para seleccionar células que se habían transformado con los plásmidos pMON50201, pMON50202 o pMON50203. Entonces se incubaron las placas durante 7-10 días a 30ºC. Entonces se sembraron en parches colonias que parecían ser resistentes al agente selectivo sobre placas M1E-3 nuevas que contenían el mismo agente selectivo para confirmar la resistencia. Este

protocolo normalmente da como resultado la generación de 100-1000 cepas resistentes a Zeocin™ o resistentes a SMM por bombardeo.

Ejemplo 4

El siguiente ejemplo demuestra el análisis de PCR de células de Schizochytrium transformadas.

Se utilizó PCR para confirmar la presencia de secuencias de plásmido en las cepas supuestamente transformadas que eran resistentes a los agentes selectivos Zeocin™ o SMM. Se obtuvo ADN de molde a partir de supuestos transformantes y células de Schizochytrium N230D no recombinantes utilizando un asa de siembra de 1 Il de plástico, desechable para retirar una pequeña cantidad de células (1-2 mm3) de colonias resistentes que se habían sembrado en parches sobre placas de agar (tal como se describe en el ejemplo 3). Entonces se resuspendieron las células en 15-20 Il de Triton X-100 al 1% en un tubo de microcentrífuga, se colocó en un baño de agua en ebullición durante 10 minutos y entonces se centrifugó durante 5 minutos a 14.000 x g. Se utilizaron partes de estos extractos (1-3 Il) para proporcionar el ADN de molde para reacciones de PCR de 25 Il utilizando Taq ADN polimerasa. Para detectar la presencia de secuencias de pTUBZEO11-2 en el ADN de Schizochytrium, se utilizaron los cebadores DM20 (SEC ID nº:25) y DM21 (SEC ID nº:26); estos cebadores se aparean con el gen ble en el plásmido pTUBZEO11-2 y amplifican un fragmento de ADN de 346 pb. El perfil térmico utilizado fue el siguiente: 94ºC durante 4 min.; (94ºC durante 45 s, 52ºC durante 45 s, 72ºC durante 2 min.) x 30; 72ºC durante 7 min. Para detectar la presencia de secuencias de pMON50201, pMON50202 o pMON50203 en el ADN de Schizochytrium, se utilizaron los cebadores BLA1 (SEC ID nº:27) y BLA2 (SEC ID nº:28); estos cebadores se aparean con el gen bla (resistencia a ampicilina) que se encuentra en la estructura principal de vector y amplifican un fragmento de ADN de 1229 pb. El perfil término utilizado fue el siguiente: 94ºC durante 4 min.; (94ºC durante 45 s, 55ºC durante 45 s, 72ºC durante 2 min.) x 30; 72ºC durante 7 min. Se analizaron los productos de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa convencional, seguido por tinción con bromuro de etidio.

Los resultados de estos análisis confirman que la gran mayoría de las cepas seleccionadas en estas condiciones son transformantes verdaderos que contienen ADN de plásmido. No se generaron productos de PCR del tamaño correcto cuando se utilizó ADN de molde de células de Schizochytrium sp. N230D de control que no se habían bombardeado con los plásmidos de transformación.

Ejemplo 5

El siguiente ejemplo describe análisis de transferencia de tipo Southern de células de Schizochytrium transformadas.

Se realizaron las transferencias de hibridación de tipo Southern utilizando ADN aislado a partir de células de Schizochytrium N230D originales y varios supuestos transformantes con el fin de confirmar la presencia de secuencias de ADN de vector de transformación dentro de las células transformadas. Se realizó la transferencia de tipo Southern utilizando técnicas conocidas por los expertos en la materia (véase por ejemplo Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989). Se aisló el ADN mediante la utilización de un kit de purificación de ADN de “QIAamp” (Qiagen Inc., Valencia, CA), se digirió con diversas enzimas de restricción, se separó mediante electroforesis a través de geles de agarosa (0,8% - 1,2% p/v) y entonces se transfirió a membranas de nailon mediante transferencia capilar alcalina.

Se llevó a cabo la detección de ADN de vector en células transformadas con pTUBZEO11-2 mediante la utilización del sistema basado en DIG “Genius” (Boehringer Mannheim Biochemicals GmbH, Alemania), utilizando como sonda de hibridación un fragmento de gen ble marcado con DIG de 346 pb generado por medio de PCR con los cebadores DM20 (SEC ID nº:25) y DM21 (SEC ID nº:26) y una mezcla de nucleótidos que incluía DIG-11-UTP. Se llevó a cabo la prehibridación de la membrana a 68ºC durante 1 h en el tampón de hibridación suministrado en el kit Genius. Se llevó a cabo la hibridación a 68ºC durante 18 h en tampón de hibridación que contenía la sonda de gen ble que se había desnaturalizado térmicamente durante 5 min. a 94ºC. Entonces se lavaron las membranas dos veces durante 5 min. con 50 ml de 2X SSC/SDS al 0,1% y dos veces durante 15 min. en 50 ml de 0,1X SSC/SDS al 0,1%. Se realizó la detección quimioluminiscente del ADN de hibridación tal como se describe en las instrucciones del kit Genius.

El ADN de células de Schizochytrium N230D no transformadas no hibridaba con la sonda de gen ble. A la inversa, el ADN de células transformadas hibridaba con la sonda tal como sigue:

SphI: El ADN digerido con:SphI de células de Schizochytrium transformadas contenía un fragmento de ADN de ~1100 pb que hibridaba con la sonda de gen ble; este fragmento, que también se observa en ADN de pTUBZEO11-2 digerido con SphI, representa el casete de expresión del gen ble completo (incluyendo el promotor del gen de tubulina y el terminador de SV40).

XhoI: Para cada uno de los transformantes sometidos a prueba, la digestión con XhoI del ADN dio como resultado fragmentos de hibridación mayores de 15-20 kpb. XhoI no corta dentro de pTUBZEO11-2, y por tanto estos

resultados indican que pTUBZEO11-2 no parece existir como un elemento extracromosómico en células transformadas, sino que más bien se integra en el cromosoma de Schizochytrium.

NcoI o HindIII: Estas enzimas cortan ambas una vez dentro de pTUBZEO11-2. La digestión de ARN transformante con cualquiera de estas enzimas condujo normalmente a un fragmento de hibridación prominente que migraba conjuntamente con el vector pTUBZEO11-2 linealizado (es decir, ~3,8 kpb). Esto sugiere que el vector puede integrarse en el cromosoma en forma de repeticiones en tándem.

Ejemplo 6

Este ejemplo demuestra la recombinación homóloga en Schizochytrium.

Los siguientes experimentos se realizaron para demostrar que puede producirse recombinación homóloga en Schizochytrium entre secuencias de ADN nativas endógenas y secuencias de ADN homólogas presentes en moléculas de ADN recombinante introducidas en las células. Este tipo de recombinación homóloga puede ser muy beneficiosa para producir cepas recombinantes con propiedades deseables. Por ejemplo, puede utilizarse recombinación homóloga para inactivar genes endógenos mediante la inserción dirigida de secuencias genéticas foráneas. Adicionalmente, puede utilizarse recombinación homóloga para reemplazar un gen endógeno o parte del mismo con una forma alterada del gen de manera que las células recombinantes muestran propiedades nuevas.

Se mostró que se producía recombinación homóloga en células de Schizochytrium transformadas con el plásmido pMON50202, que contiene una mutación en el gen als de Schizochytrium. Esta mutación introduce un sitio BsgI en la posición de pb 571 de la región codificante de als. Hay un sitio BsgI que se produce de manera natural en la posición de pb 1324 de la región codificante de als. Por tanto, pueden utilizarse transferencias de tipo Southern de ADN de Schizochytrium digerido con BsgI para discernir el gen als nativo del gen als mutante recombinante. Para estos experimentos, se produjo una sonda de hibridación específica de als por medio de PCR utilizando una mezcla de nucleótidos que incluía DIG-11-UTP (Boehringer Mannheim Biochemicals GmbH, Alemania), el cebador directo PGR28 (SEC ID nº:32), el cebador inverso PGR30 (SEC ID nº:33) y una pequeña cantidad de pMON50200 como molde. La sonda de hibridación marcada con DIG de 323 pb resultante se denominó ALS1.

Se digirió el ADN de células de Schizoclaytrium N230D no recombinantes con BsgI y AhdI por separado, se sometió a electroforesis en gel de agarosa, se transfirió a una membrana de nailon y entonces se estudió con sonda con la sonda ALS1 utilizando procedimientos esencialmente iguales a los descritos en el ejemplo 5. La sonda ALS 1 marcó un fragmento de 1,76 kpb de ADN digerido con BsgI y un fragmento de 4,9 kpb de ADN digerido con AhdI.

Las transferencias de tipo Southern de ADN digerido con BsgI y AhdI de diversas cepas recombinantes que se habían transformado con pMON50202 también se estudiaron con sonda con la sonda ALS1. En algunos casos, el fragmento de BsgI de 1,76 kpb no estaba presente, y en su lugar se marcó un fragmento de 0,75 kpb, correspondiente al fragmento de BsgI de 753 pb presente en pMON50202. Se marcó un fragmento de AhdI de 4,9 kpb en estas cepas recombinantes, sin embargo, lo que indica que el gen als mutante, recombinante se había recombinado con el gen als nativo por medio de recombinación homóloga de entrecruzamiento doble.

También se observó que se producía recombinación homóloga de entrecruzamiento único en cepas recombinantes transformadas con pMON50202. En estos casos, se marcaron los fragmentos de BsgI tanto de 1,76 kpb como de 0,75 kpb en las transferencias de tipo Southern de ADN de las cepas recombinantes, pero el fragmento de AhdI de 4,9 kpb se reemplazó por fragmentos marcados mayores, lo que indica que todo el vector pMON50202 se había insertado en el gen als nativo, o bien como una única copia o bien como repeticiones en tándem.

Se obtuvieron unas pruebas adicionales de la recombinación homóloga en Schizochytrium mediante la introducción de moléculas de ADN recombinante que contenían un gen als truncado, mutante de manera que la enzima ALS incompleta codificada por el gen truncado no era funcional. Se produjo este gen truncado mediante digestión de pMON50202 con ClaI y HindIII para producir un fragmento de 2,8 kpb, eliminando de ese modo las últimas 388 pb de la secuencia codificante de als junto con la región terminadora de als. Se ligó este fragmento de 2,8 kpb en pBluescriptII KS+ (Stratagene Corp., La Jolla, CA) que se había digerido con ClaI y HindIII, produciendo el plásmido pAR2. Se esperaría que el plásmido pAR2 sólo confiriese resistencia a SMM en células de Schizochytrium transformadas si se restauraba un gen als funcional, mutante en cepas transformadas por medio de recombinación homóloga entre el gen als nativo y el gen als truncado mutante presente en pAR2. Se introdujo este constructo en células de Schizochytrium N230D mediante bombardeo de partículas, y se aislaron cepas resistentes a SMM tal como se describe en el ejemplo 3. El análisis de transferencia de tipo Southern de ADN digerido con BsgI de los transformantes, llevado a cabo tal como se describió anteriormente en este ejemplo, indicó que se había producido claramente recombinación homóloga en estas cepas; es decir, un fragmento de BsgI de 1,76 kpb hibridó con la sonda ALS 1 en células no recombinantes, pero éste se reemplazó por un fragmento de hibridación de 0,75 kpb en células que se habían transformado con pAR2.

Ejemplo 7

Este ejemplo describe la utilización del vector de transformación pTUBZEO11-2 o pMON50202 para producir por medio de cotransformación cepas que contenían moléculas de ADN foráneo adicionales que no estaban unidas a un gen marcador seleccionable.

Se logró la cotransformación mediante la introducción simultánea de pTUBZEO11-2 y un plásmido adicional que contenía cualquiera de varios genes. Se coprecipitaron los plásmidos sobre las partículas de oro tal como se describe en el ejemplo 3, utilizando 2,5 Ig de cada plásmido. Tras el bombardeo de células diana con las partículas de oro recubiertas con plásmidos, se seleccionaron las cepas recombinantes sobre placas de agar que contenían Zeocin™ tal como se describe en el ejemplo 1. Entonces se confirmó la presencia del segundo plásmido no seleccionado mediante análisis de PCR o mediante hibridación de transferencia de tipo Southern. Normalmente se lograban unas frecuencias de cotransformación muy altas (por ejemplo, del 50-90%). Por ejemplo, el plásmido pTR202, que contiene el gen fat-1 de Caenorhabditus elegans (Spychalla et al., 1997. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 1142-1147) unido al promotor y terminador del gen de tubulina de Schizochytrium, se introdujo por medio del procedimiento proporcionado en este ejemplo, y se mostró mediante PCR que aproximadamente el 68% de las cepas resistentes a Zeocin™ resultantes contenían el gen fat-1 (véase la tabla 1). Se observaron resultados similares cuando se introdujeron conjuntamente pMON50202 y un plásmido adicional, seguido por selección de células transformadas en medio sólido que contenía SMM. Este procedimiento de cotransformación puede utilizarse para introducir cualquier ADN foráneo deseado.

Tabla 1 Eficacias de cotransformación utilizando el plásmido marcador seleccionable pTubZeO11-2 y plásmidos que contienen diversos genes fad. Se examinaron transformantes resistentes a ZeocinaR para detectar secuencias de ADN de fad por medio de PCR.

Gen fad introducido

nº de cepas que contienen gen fad/nº de cepas ZeocinR sometidas a prueba Eficacia de cotransformación

syn_fat1 nat_fat1 mut_fat1 desB

17/25 24/25 21/25 20/25 68% 96% 84% 80%

Los sistemas de transformación descritos en estos ejemplos representan un avance significativo en la capacidad para manipular genéticamente Schizochytrium, que es el organismo más productivo conocido para la producción fermentativa de compuestos a base de lípidos. La disponibilidad de dos sistemas de transformación independientes, junto con las altas eficacias de transformación que se producen, deben permitir el apilamiento de múltiples rasgos en cepas modificadas por ingeniería genética. Además, la presencia aparente de recombinación homóloga en esta microalga debe permitir el desarrollo de procedimientos de desactivación génica con el fin de identificar las funciones de genes desconocidos y eliminar rasgos no deseables en cepas de producción. Los presentes inventores están utilizando actualmente estos sistemas para alterar el metabolismo de ácidos grasos en Schizochytrium, y están explorando posibilidades para utilizar esta especie y microalgas relacionadas (por ejemplo, Thraustochytrium) para la producción de carotenoides, esteroles y otros compuestos lipídicos.

Aunque se han descrito diversas formas de realización de la presente invención en detalle, resultarán evidentes para los expertos en la materia modificaciones y adaptaciones de dichas formas de realización. Debe apreciarse expresamente, sin embargo, que tales modificaciones y adaptaciones están comprendidas en el alcance de la presente invención, tal como se expone en las reivindicaciones siguientes.

Listado de secuencias

<110> Roessler, Paul Matthews, T. Dave Ramseier, Tom Metz, James

<120> Producto y procedimiento para la transformación de microorganismos de Thraustochytriales

<130> 2997-23-PCT

<150> 60/284.116

<151>

<160> 35

<170> PatentIn versión 3.1

<210> 1

<211> 551

<212> ADN

<213> Schizochytrium sp.

5

<220>

<221> misc feature

<222> (520)..(520)

<223> n = a, c, g, o t

10

<220>

<221> misc feature

<222> (541)..(541)

<223> n = a, c, g, o t

15

<400> 1

20 <210> 2

<211> 27

<212> ADN

<213> Schizochytrium sp.

25 <400> 2

gcgccagtct cggagaagaa ggtgttg 27

<210> 3 30 <211> 27

<212> ADN

<213> Schizochytrium sp.

<400> 3

35 agctcccagc aggcgttacc gacctga 27

<210> 4

<211>

725 40 <212> ADN

<213> Schizochytrium sp.

<400> 4

<210> 8

<211> 3664

<212> ADN

<213> Schizochytrium sp.

<400> 8

<210> 9

<211>

3808 5 <212> ADN

5

<210> 5 <211> 24 <212> ADN <213> Schizochytrium sp.

<400> 5

10

cacccatggt gttggtggtg ttgt 24

15

<210> 6 <211> 24 <212> ADN <213> Schizochytrium sp.

<400> 6

20 25

aaactcgaga cgtgcttcgc aaga 24 <210> 7 <211> 4646 <212> ADN <213> Schizochytrium sp. <400> 7

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

Schizochytrium sp. y Streptoalloteichus hindustanus 10

<220>

<221> promotor

<222> (441)..(894)

<223>

15

<220>

<221> CDS

<222> (895)..(1269)

<223>

20

<220>

<221> terminador

<222> (1270)..(1524)

<223>

25

<400> 9

<210> 10

<211> 124

<212> PRT 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Schizochytrium sp. y Streptoalloteichus hindustanus

<400> 10 10

5

<210> 12 <211> 20 <212> ADN <213> Schizochytrium sp.

<400> 12

10

ggatctcttt tacgacaagc 20

15

<210> 13 <211> 18 <212> ADN <213> Schizochytrium sp.

<400> 13

20 25 30 35 40

ggttgtgtga agcaaagc 18 <210> 14 <211> 7847 <212> ADN <213> Schizochytrium sp. <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(1259) <223> <220> <221> CDS <222> (1260)..(3314) <223> <220> <221> prim_transcript <222> (3315)..(4887) <223> <400> 14

<210> 15

<211> 684

<212> PRT

<213> Schizochytrium sp.

<400> 15

<210> 16

<211> 30

<212> ADN

<213> Schizochytrium sp.

<400> 16

5

tatcgataag cttgacgtcg aattcctgca 30

10

<210> 17 <211> 32 <212> ADN <213> Schizochytrium sp.

<400> 17

15 20 25 30 35 40

catggtcaag aacgttcagg atctctttta cg 32 <210> 18 <211> 7847 <212> ADN <213> Schizochytrium sp. <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(1259) <223> <220> <221> CDS <222> (1260)..(3314) <223> <220> <221> prim_transcript <222> (3315)..(4887) <223> <220> <221> mutación <222> (3042)..(3044) <223> <400> 18

<210> 19

<211> 684

<212> PRT

<213> Schizochytrium sp.

<400> 19

<210> 20

<211>

26 5 <212> ADN

<213> Schizochytrium sp.

<400> 20

10 ccggccaggt gcagacctct gctgtc 26

<210> 21

<211> 7847

<212> ADN 15 <213> Schizochytrium sp.

<220>

<221> prim_transcript

<222> (1)..(1259)

<223>

5 <220>

<221> mutación

<222> (1834)..(1835)

<223>

10 <220>

<221> CDS

<222> (1260)..(3314)

<223>

15 <220>

<221> prim_transcript

<222> (3315)..(4887)

<223>

20 <400> 21

<210> 22

<211> 684

<212> PRT

<213> Schizochytrium sp.

<400> 22

<210> 23

<211> 7847 5 <212> ADN

<213> Schizochytrium sp.

<220>

<221>

prim_transcript 10 <222> (1)..(1259)

<223>

<220>

<221>

CDS 15 <222> (1260)..(3314)

<223>

<220>

<221>

prim_transcript 20 <222> (3315)..(4887)

<223>

<220>

<221>

mutación 25 <222> (1834)..(1835)

<223>

<220>

<221>

mutación 30 <222> (3042)..(3044)

<223>

<400> 23

<210> 24

<211> 684

<212> PRT

<213> Schizochytrium sp.

<400> 24

<210> 25

<211> 18

<212> ADN

<213> Schizochytrium sp.

<400> 25

gttgaccagt gccgttcc 18

<210> 26

<211> 18

<212> ADN

<213> Schizochytrium sp.

<400> 26

cgaagtgcac gcagttgc 18

<210> 27

<211> 31

<212> ADN

<213> Schizochytrium sp.

<400> 27

gcgcccatgg gacgtcaggt ggcacttttc g 31

<210> 28

<211> 36

<212> ADN

<213> Schizochytrium sp.

<400> 28

gcgcccatgg ccgcggcaag cagcagatta cgcgca 36

<210> 29

<211> 1263

<212> ADN

<213> Caenorhabditis elegans

<220>

<221> CDS

<222> (23)..(1228)

<223>

<400> 29

<210> 30

<211> 402

<212> PRT

<213> Caenorhabditis elegans

<400> 30

<210> 31

<211> 570

<212> ADN

<213> Caenorhabditis elegans

<400> 31

<210> 32

<211> 18

<212> ADN 15 <213> Schizochytrium sp.

<400> 32 18 gacccgtcat ctatgctg 18

<210> 33

<211> 18 5 <212> ADN

<213> Schizochytrium sp.

<400> 33

10 ctcaaagtga acgatgcc 18

<210> 34

<211> 4244

<212> ADN 15 <213> Schizochytrium sp.

<400> 34

<210> 35

<211> 4244

<212> ADN

<213> Schizochytrium sp.

<400> 35

Claims (49)

1. REIVINDICACIONES

   1. Molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada de entre el grupo constituido por:

   a.

   una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº:15, SEC ID nº:19, SEC ID nº:22 y SEC ID nº:24, en la que dicha proteína es una acetolactato sintasa;

   b.

   una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos de (a), en la que dicha proteína es una acetolactato sintasa; y,

   c.

   una secuencia de ácido nucleico que es completamente complementaria a dicha secuencia de ácido nucleico de

   (a) o (b).

2. 2.

   Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de ácido nucleico codifica una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 85% idéntica a una secuencia de aminoácidos de (a), y en la que dicha proteína es una acetolactato sintasa.

3. 3.

   Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de ácido nucleico codifica una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de (a), y en la que dicha proteína es una acetolactato sintasa.

4. 4.

   Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de ácido nucleico codifica una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos que difiere de SEC ID nº:15 en una sustitución, inserción o deleción de aminoácido en una posición de aminoácido seleccionada de entre el grupo constituido por: 116G, 117A, 192P, 200A, 251K, 358M, 383D, 592V, 595W y 599F.

5. 5.

   Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de ácido nucleico codifica una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº:15, SEC ID nº:19, SEC ID nº:22 y SEC ID nº:24, y en la que dicha proteína es una acetolactato sintasa.

6. 6.

   Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de ácido nucleico se selecciona de entre el grupo constituido por los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº:14, los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº:18, los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº:21 y los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº:23.

7. 7.

   Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1, en la que la expresión de dicha proteína de (a) o (b) confiere una sensibilidad reducida a los compuestos seleccionados de entre el grupo constituido por: compuestos de sulfonilurea, inhibidores de la clase de imidazolinona y oxibenzoatos de pirimidinilo, sobre un microorganismo del orden Thraustochytriales que se transforma con dicha molécula de ácido nucleico.

8. 8.

   Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 7, en la que dicha secuencia de ácido nucleico codifica una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº:19, SEC ID nº:22 y SEC ID nº:24.

9. 9.

   Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 7, en la que dicha secuencia de ácido nucleico se selecciona de entre el grupo constituido por: los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº:18, los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº:21 y los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº:23.

10. 10.

    Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de ácido nucleico codifica una acetolactato sintasa de Schizochytrium.

11. 11.

    Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 10, en la que la expresión de dicha acetolactato sintasa de Schizochytrium confiere una sensibilidad reducida a los compuestos seleccionados de entre el grupo constituido por: compuestos de sulfonilurea, inhibidores de la clase de imidazolinona y oxibenzoatos de pirimidinilo, sobre un microorganismo del orden Thraustochytriales que se transforma con dicha molécula de ácido nucleico.

12. 12.

    Molécula de ácido nucleico recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, unida funcionalmente a una secuencia de control de la transcripción.

13. 13.

    Microorganismo recombinante del orden Thraustochytriales que se transforma con un vector de expresión o un vector de direccionamiento que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante según la reivindicación 12.

14. 14.

    Vector recombinante para la transformación de los microorganismos del orden Thraustochytriales, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una acetolactato sintasa que confiere una sensibilidad

    reducida a los compuestos seleccionados de entre el grupo constituido por: compuestos de sulfonilurea, inhibidores de la clase de imidazolinona y oxibenzoatos de pirimidinilo, sobre un microorganismo del orden Thraustochytriales, en el que dicha acetolactato sintasa presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por:

    a.

    una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº:19, SEC ID nº:22 y SEC ID nº:24; y

    b.

    una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos de (a);

    en el que dicha secuencia de ácido nucleico que codifica una acetolactato sintasa está unida funcionalmente a una secuencia de control de la transcripción.

15. 15.

    Vector recombinante según la reivindicación 14, en el que dicho vector recombinante es un vector de expresión.

16. 16.

    Vector recombinante según la reivindicación 14, en el que dicho vector recombinante es un vector de direccionamiento.

17. 17.

    Vector recombinante según la reivindicación 14, en el que dicha secuencia de ácido nucleico codifica una acetolactato sintasa que presenta una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 85% idéntica a una secuencia de aminoácidos de (a).

18. 18.

    Vector recombinante según la reivindicación 14, en el que dicha secuencia de ácido nucleico codifica una acetolactato sintasa que presenta una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de (a).

19. 19.

    Vector recombinante según la reivindicación 14, en el que dicha secuencia de ácido nucleico codifica una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos que difiere de SEC ID nº:15 en una sustitución, inserción o deleción de aminoácido en una posición de aminoácido seleccionada de entre el grupo constituido por: 116G, 117A, 192P, 200A, 251K, 358M, 383D, 592V, 595W y 599F.

20. 20.

    Vector recombinante según la reivindicación 14, en el que dicha acetolactato sintasa presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº:19, SEC ID nº:22 y SEC ID nº:24.

21. 21.

    Vector recombinante según la reivindicación 14, en el que dicha secuencia de ácido nucleico se selecciona de entre el grupo constituido por: los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº:18, los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº:21 y los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº:23.

22. 22.

    Vector recombinante según la reivindicación 14, en el que dicha secuencia de control de la transcripción se selecciona de entre el grupo constituido por un promotor de a-tubulina de Thraustochytriales, un promotor de acetolactato sintasa de Thraustochytriales, un promotor de un sistema de policétido sintasa (PKS) de Thraustochytriales y un promotor de ácido graso desaturasa de Thraustochytriales.

23. 23.

    Vector recombinante según la reivindicación 14, en el que dicho vector comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº:18, SEC ID nº:21 y SEC ID nº:23.

24. 24.

    Procedimiento para la transformación de las células de un microorganismo del orden Thraustochytriales, comprendiendo dicho procedimiento:

    a.

    introducir en las células de un microorganismo del orden Thraustochytriales un vector recombinante tal como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 14 a 23; y

    b.

    seleccionar las células que se han transformado satisfactoriamente con dicho vector recombinante cultivando dichas células de (a) en un medio que contiene por lo menos un compuesto que es inhibidor para las células no transformadas, seleccionándose dicho compuesto de entre el grupo constituido por: un compuesto de sulfonilurea, un inhibidor de la clase de imidazolinona y los oxibenzoatos de pirimidinilo.

25. 25.

    Procedimiento según la reivindicación 24, en el que dicho vector recombinante comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que va a producirse por dicha célula, en el que dicha secuencia de ácido nucleico que codifica para dicha proteína está unida funcionalmente a una secuencia de control de la transcripción.

26. 26.

    Procedimiento según la reivindicación 25, en el que dicha proteína está asociada con la síntesis de un ácido graso seleccionado de entre el grupo constituido por ácido docosahexaenoico (DHA), ácido docosapetaenoico (DPA), ácido eicosapentaenoico (EPA) y ácido araquidónico (ARA).

27. 27.

    Procedimiento según la reivindicación 25, en el que dicha proteína se selecciona de entre el grupo constituido por: una ácido graso sintasa, una ácido graso desaturasa, una ácido graso elongasa, una proteína asociada con un complejo de policétido sintasa y una proteína asociada con la incorporación de ácidos grasos a fosfolípidos o a moléculas de triacilglicerol.

28. 28.

    Procedimiento según la reivindicación 25, en el que dicha proteína es una ácido graso desaturasa T-3 codificada por una secuencia de ácido nucleico SEC ID nº:29.

29. 29.

    Procedimiento según la reivindicación 25, en el que dicha proteína es una ácido graso polienoico isomerasa.

30. 30.

    Procedimiento según la reivindicación 25, en el que dicha proteína se selecciona de entre el grupo constituido por HMG-CoA sintasa, HMG-CoA reductasa, escualeno sintasa, fitoeno sintasa, fitoeno desaturasa, una carotenoide ciclasa, una carotenoide hidroxilasa, una carotenoide cetolasa, vitamina E y ácido lipoico.

31. 31.

    Procedimiento según la reivindicación 24, en el que dicho vector recombinante en la etapa (a) comprende además una secuencia de ácido nucleico que hibrida con una secuencia de ácido nucleico diana en dicho microorganismo de manera que un gen que comprende dicha secuencia de ácido nucleico diana se muta o inactiva mediante la recombinación homóloga con dicha segunda secuencia de ácido nucleico.

32. 32.

    Procedimiento según la reivindicación 31, en el que dicha secuencia de ácido nucleico diana codifica una proteína seleccionada de entre el grupo constituido por lipasas, enzimas de oxidación de ácidos grasos, proteínas implicadas en la síntesis de hidratos de carbono, proteínas implicadas en la síntesis de productos de rutas de isoprenoides, proteínas implicadas en la síntesis de componentes de la pared celular, proteínas implicadas en las rutas de síntesis de ácidos grasos saturados, proteínas implicadas en las rutas de síntesis de ácidos grasos poliinsaturados, proteínas asociadas con un complejo de policétido sintasa y proteínas asociadas con la incorporación de ácidos grasos a fosfolípidos o moléculas de triacilglicerol.

33. 33.

    Procedimiento según la reivindicación 24, que comprende además la etapa que consiste en introducir en dicha célula por lo menos una molécula de ácido nucleico recombinante adicional que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que va a expresarse, estando dicha secuencia de ácido nucleico unida funcionalmente a una secuencia de control de la transcripción.

34. 34.

    Procedimiento según la reivindicación 24, que comprende además la etapa que consiste en introducir en dicha célula por lo menos una molécula de ácido nucleico recombinante adicional que comprende una segunda secuencia de ácido nucleico que hibrida con una secuencia de ácido nucleico diana en dicho microorganismo de manera que un gen que comprende dicha secuencia de ácido nucleico diana se muta o inactiva mediante la recombinación homóloga con dicha segunda secuencia de ácido nucleico.

35. 35.

    Procedimiento según la reivindicación 24, que comprende además la etapa que consiste en introducir en dicha célula una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de unión a la bleomicina.

36. 36.

    Procedimiento según la reivindicación 35, en el que dicha molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de unión a la bleomicina comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una segunda proteína que va a expresarse por dicha célula, en el que dicha secuencia de ácido nucleico que codifica dicha segunda proteína está unida funcionalmente a una secuencia de control de la transcripción.

37. 37.

    Procedimiento según la reivindicación 36, en el que dicha secuencia de control de la transcripción se selecciona de entre el grupo constituido por un promotor de a-tubulina de Thraustochytriales, un promotor de acetolactato sintasa de Thraustochytriales, un promotor de un sistema de policétido sintasa (PKS) de Thraustochytriales y un promotor de la ácido graso desaturasa de Thraustochytriales.

38. 38.

    Procedimiento según la reivindicación 35, en el que dicha molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de unión a la bleomicina comprende además una segunda secuencia de ácido nucleico que hibrida con una secuencia de ácido nucleico diana en dicho microorganismo de manera que un gen que comprende dicha secuencia de ácido nucleico diana se muta o inactiva mediante la recombinación homóloga con dicha segunda secuencia de ácido nucleico.

39. 39.

    Procedimiento según la reivindicación 35, en el que dicha molécula de ácido nucleico recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico SEC ID nº:9.

40. 40.

    Procedimiento según la reivindicación 24, en el que dicho microorganismo es de un género seleccionado de entre el grupo constituido por Thraustochytrium, Labyrinthuloides, Japonochytrium y Schizochytrium.

41. 41.

    Procedimiento según la reivindicación 24, en el que dicho microorganismo es de una especie seleccionada de entre el grupo constituido por Schizochytrium sp., Schizochytrium aggregatum, Schizochytrium limacinum, Schizochytrium minutum, Thraustochytrium sp., Thraustochytrium striatum, Thraustochytrium aureum, Thraustochytrium roseum y Japonochytrium sp.

42. 42.

    Procedimiento según la reivindicación 24, en el que dicha etapa de introducción se realiza mediante un procedimiento seleccionado de entre el grupo constituido por bombardeo de partículas, electroporación, microinyección, lipofección, adsorción, infección y fusión de protoplastos.

43. 43.

    Microorganismo recombinante del orden Thraustochytriales, transformado con un vector recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 23, en el que el microorganismo recombinante comprende un vector de expresión.

44. 44.

    Microorganismo recombinante según la reivindicación 43, en el que dicha secuencia de control de la transcripción es un promotor que funciona en un microorganismo de Thraustochytriales.

45. 45.

    Microorganismo recombinante según la reivindicación 44, en el que dicho vector recombinante comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una primera proteína para su producción por dicho microorganismo, en el que dicha secuencia de ácido nucleico que codifica dicha primera proteína está unida funcionalmente a una secuencia de control de la transcripción.

46. 46.

    Microorganismo recombinante según la reivindicación 44, en el que dicha célula recombinante se transforma además con una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de unión a la bleomicina.

47. 47.

    Microorganismo recombinante según la reivindicación 46, en el que dicha molécula de ácido nucleico recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico SEC ID nº:9.

48. 48.

    Microorganismo recombinante según la reivindicación 47, en el que dicha molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de unión a la bleomicina comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una segunda proteína para su producción por dicha célula, en el que dicha secuencia de ácido nucleico que codifica dicha segunda proteína está unida funcionalmente a una secuencia de control de la transcripción.

49. 49.

    Microorganismo recombinante según la reivindicación 43, que comprende además por lo menos una molécula de ácido nucleico recombinante adicional que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína para su producción por dicha célula.