CN111954713A - 用于产生具有低硫酸化的糖分子的生物体和方法 - Google Patents

用于产生具有低硫酸化的糖分子的生物体和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111954713A
CN111954713A CN201980017455.5A CN201980017455A CN111954713A CN 111954713 A CN111954713 A CN 111954713A CN 201980017455 A CN201980017455 A CN 201980017455A CN 111954713 A CN111954713 A CN 111954713A
Authority
CN
China
Prior art keywords
leu
ser
ala
arg
glu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201980017455.5A
Other languages
English (en)
Inventor
N·C·卡瓦扎
J·尤拉诺
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Conagen Inc
Viridos Inc
Original Assignee
Conagen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Conagen Inc filed Critical Conagen Inc
Publication of CN111954713A publication Critical patent/CN111954713A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
    • C12N15/8258—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon for the production of oral vaccines (antigens) or immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/13—Transferases (2.) transferring sulfur containing groups (2.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y208/00—Transferases transferring sulfur-containing groups (2.8)
    • C12Y208/02—Sulfotransferases (2.8.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/13—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production isolated from plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了含有编码异源糖分子的核酸的重组生物体，所述异源糖分子具有低硫酸化谱或未被硫酸化。在一个实施方案中，异源糖分子为免疫球蛋白分子。重组生物体对至少一种磺基转移酶基因具有遗传修饰，诸如缺失、破坏或其他遗传修饰。所述细胞有利地产生并任选地分泌所述异源糖分子。因此，本发明提供重组生物体，所述重组生物体提供糖基化谱与哺乳动物细胞中产生的糖基化谱更相似的糖分子，并因此可更安全地且更有效地用作人类或动物中的治疗剂。所述糖分子可为糖蛋白、糖肽或糖脂。

Description

用于产生具有低硫酸化的糖分子的生物体和方法
相关申请的交叉引用
本申请按照美国法典第35卷第119条(e)款的规定要求于2018年3月5日提交的美国序列号62/638,796的优先权权益，该申请的全部内容全文以引用方式并入本文。
序列表的并入
随附序列表中的材料据此以引用方式并入本申请中。名为SGI2150_1WO_Sequence_Listing.txt的随附序列表文本文件创建于2019年3月1日，并且为111kb。可在使用Windows OS的计算机上使用Microsoft Word访问该文件。
技术领域
本发明涉及用于产生不具有硫酸化或具有降低的硫酸化谱的重组糖分子的生物体和方法。
序列表的并入
随附序列表中的材料据此以引用方式并入本申请中。名为SGI2150_Sequence_Listing.txt的随附序列表文本文件创建于2018年3月5日，并且为111kb。可在使用WindowsOS的计算机上使用Microsoft Word访问该文件。
背景技术
糖基化的蛋白质和肽药物是治疗多种疾病和障碍的重要治疗来源。这类药物还包括单克隆抗体，其在许多应用中都非常有用。许多糖蛋白或糖肽药物需要糖基化才能在人和动物中发挥最佳功效。然而，不同的宿主细胞(例如，哺乳动物、植物、昆虫、真菌等)产生不同的糖基化谱。因此，这带来了安全性问题，因为在非哺乳动物宿主细胞中产生的糖蛋白或糖肽治疗剂上产生的糖基化谱可在用该治疗剂治疗的人或动物患者中引起免疫原性应答。因此，如果非哺乳动物宿主细胞在治疗分子上产生的糖基化谱与哺乳动物细胞产生的糖基化谱相匹配，则是有利的。此外，许多宿主细胞系统产生具有硫酸化聚糖部分的多肽，这对于待在人或动物中使用的一些糖蛋白或糖肽治疗剂而言是不期望的。
治疗性糖分子在酵母和真菌中产生。虽然已对这些细胞类型进行了一些工程改造以使得这些生物体产生更类似哺乳动物的糖基化谱，但这些生物体生长缓慢。虽然可获得生长更快的宿主细胞系统，但这些宿主细胞系统产生硫酸化聚糖，这并不总是期望的，因为一些糖蛋白或糖肽在未硫酸化或低硫酸化形式下是最安全或最有效的。因此，具有快速生长的宿主细胞系统是非常有利的，该宿主细胞系统能够产生具有与哺乳动物细胞产生的N-连接糖基化谱相似的N-连接糖基化谱的治疗性糖分子，并且能够产生具有较少硫酸化聚糖或没有硫酸化聚糖的治疗性糖分子。
发明内容
本发明提供含有编码异源糖分子的核酸的重组宿主细胞或生物体，该异源糖分子由该细胞或生物体产生。该糖分子可包括具有低硫酸化谱的聚糖或未硫酸化的聚糖。在一个实施方案中，异源糖分子为免疫球蛋白分子。重组宿主细胞在一种或多种磺基转移酶基因中具有遗传修饰。该遗传修饰可以是缺失，也可以是降低或消除一种或多种磺基转移酶基因的表达或活性的另一种遗传修饰。细胞可有利地产生并任选地分泌异源糖分子，该异源糖分子可具有的糖基化谱不具有硫酸化聚糖，或者具有比由不包含该遗传修饰的对应细胞产生的相同异源糖分子少的硫酸化聚糖。因此，所产生的糖分子可具有与哺乳动物细胞中产生的糖基化谱更相似的糖基化谱，并因此更安全地用作人类或动物中的治疗剂。在各种实施方案中，糖分子可为糖蛋白、糖肽或糖脂。
在第一方面，本发明提供了破囊壶菌科(Thraustochytriaceae)的重组细胞或生物体，其具有编码异源糖分子的核酸并且在一种或多种磺基转移酶基因中具有遗传修饰。在各种实施方案中，该遗传修饰可为缺失、突变、破坏、插入、失活、衰减或倒置。在一个实施方案中，磺基转移酶是碳水化合物磺基转移酶，例如磺基转移酶_2家族(PF03567)的成员或SFT-12、SFT-15或SFT-16。在一个实施方案中，细胞在编码碳水化合物磺基转移酶的单个基因中具有遗传修饰，该碳水化合物磺基转移酶可为本文所述的任何磺基转移酶。在一些实施方案中，细胞产生并分泌异源多肽分子或其功能部分。
在本发明的各种实施方案中，异源糖蛋白是免疫球蛋白。相对于不包含该遗传修饰的对应细胞，异源糖分子可具有较少的硫酸化N-聚糖。在各种实施方案中，异源糖分子包含至少30％或至少35％或至少40％的未硫酸化N-聚糖。在一个实施方案中，异源糖分子中未硫酸化N-聚糖与硫酸化N-聚糖的比率为至少1:2。N-聚糖可含有Man3-5GlcNAc2。在一些实施方案中，异源糖分子是抗体分子或其部分。重组细胞可来自分类学的破囊壶菌科，并且在一些实施方案中来自日本壶菌属(Japanochytrium)、椭圆壶菌属(Oblongichytrium)、破囊壶菌属(Thraustochytrium)、橙壶菌属(Aurantiochytrium)或裂殖壶菌属(Schizochytrium)中的任一种。
在各种实施方案中，重组细胞或生物体还可对编码甘露糖基转移酶的基因进行遗传修饰，在一个实施方案中，该基因在alg3基因中。
在各种实施方案中，异源糖蛋白可为以下中的任一种：曲妥珠单抗、依库珠单抗、那他珠单抗、西妥昔单抗、奥马珠单抗、优特克单抗、帕尼单抗和阿达木单抗、或它们中任一种的功能性片段。在各种实施方案中，与在不包含对所述一种或多种磺基转移酶基因的遗传修饰的对应细胞中产生的相同免疫球蛋白相比，该免疫球蛋白具有低硫酸化谱，该低硫酸化谱具有少于25％的硫酸化N-聚糖。
在另一方面，本发明提供了产生具有低硫酸化的糖基化谱的糖分子的方法。该方法涉及对破囊壶菌科的细胞或生物体中的一种或多种磺基转移酶基因进行遗传修饰，培养该细胞或生物体，从而产生具有低硫酸化的糖基化谱的糖分子，其中该生物体包含编码异源糖分子或其功能部分的重组核酸。该方法还可涉及提供本文所述的任何重组细胞或生物体的步骤。糖分子对于细胞或生物体可以是异源的，并且可以是本文所述的任何糖分子。
在另一方面，本发明提供了一种治疗性蛋白质，其包含0.60或更小的S-Man(3-5)/(S-Man(3-5)+Man(3-5)的比率。在各种实施方案中，治疗性蛋白质可为本文所述的任何免疫球蛋白或抗体。治疗性蛋白质可由本文所述的细胞或生物体产生。
在另一方面，本发明提供了由本文所述的任何重组细胞或生物体产生的治疗性蛋白质或肽。在各种实施方案中，治疗性蛋白质或肽可为本文所述的糖蛋白或肽。在一些实施方案中，治疗性蛋白质或肽是本文所述的免疫球蛋白或抗体。
上述发明内容不是限制性的，并且根据本发明的以下具体实施方式和权利要求书，本发明的其他特征和优点将显而易见。
附图说明
图1提供了从具有所示磺基转移酶(SFT)缺失的生物体回收的那他珠单抗抗体上的硫酸化聚糖与非硫酸化聚糖的量的图解说明。硫酸化Man(3-5)GlcNAc2(ManS)的总量和非硫酸化Man(3-5)GlcNAc2(Man)的总量占观察到的所有聚糖的百分比以柱状图形式示出。
图2提供了S-Man(3-5)/(S-Man(3-5)+Man(3-5))的比率或者硫酸化聚糖占总聚糖的百分比的图解说明。磺基转移酶的缺失导致较低的比率，即聚糖的硫酸化较少。
图3A至图3B：图3A提供了pCAB-097的质粒图谱。图3B提供了pCAB-098的质粒图谱。
图4A至图4B，图4A提供了示出甘露糖3结构的示例的图。图4B提供了示出甘露糖5结构的示例的图。
具体实施方式
本发明提供含有编码异源糖分子的核酸分子的重组细胞或生物体。生物体还可在编码磺基转移酶的至少一个基因中具有缺失或其他遗传修饰。与由在编码磺基转移酶的至少一个基因中不含有缺失或其他遗传修饰并在相同条件下培养的对应生物体或宿主细胞产生的相同糖分子相比，该生物体产生具有含有较少硫酸化聚糖的糖基化谱的异源糖分子。本发明人意外地发现，一种或多种磺基转移酶基因的缺失或其他遗传修饰导致产生具有显著较少硫酸化聚糖部分的异源糖分子的重组宿主细胞。因此，该发现允许产生具有低硫酸化或无硫酸化聚糖的聚糖(或糖基化)谱的糖分子。因此，糖分子可以更安全地用作治疗分子，和/或不太可能在人或其他哺乳动物中引发免疫应答。糖分子在相关治疗应用中也可具有更高的功效。在本文所公开的任何实施方案中，糖分子可为糖蛋白、糖肽或糖脂。
在各种实施方案中，由本发明的重组生物体或宿主细胞产生的异源糖分子的低硫酸化谱是具有65％或更少、或60％或更少、或55％或更少、或50％或更少、或40％或更少、或30％或更少、或25％或更少、或15％或更少、或10％或更少的硫酸化聚糖(相对于非硫酸化聚糖)的低硫酸化谱(图1)。在另一个实施方案中，异源糖分子的低硫酸化谱可表示为具有0.65或更小、或0.50或更小、或0.40或更小、或0.30或更小、或0.25或更小、或0.15或更小、或0.10或更小的硫酸化Man(3-5)与总的硫酸化和未硫酸化Man(3-5)(其可表示为S-Man(3-5)/S-Man(3-5)+Man(3-5))的比率(图2)。在另一个实施方案中，异源糖分子的低硫酸化谱是具有30％或更多，或32％或更多，或35％或更多，或40％或更多的未硫酸化聚糖(相对于硫酸化聚糖)的硫酸化谱。在N-聚糖硫酸化谱的任一种中，聚糖可为甘露糖(3-5)。硫酸化谱可描述与N-聚糖谱、O-聚糖谱、C-连接的聚糖谱、糖分子的磷酸糖基化谱或它们的任何组合或子组合相关的硫酸化。
由活生物体产生的许多蛋白质或肽通过糖基化进行修饰。糖蛋白和糖肽是具有共价连接到其多肽链上的碳水化合物基团的蛋白质或肽；糖脂是具有通过糖苷键连接的碳水化合物的脂质分子。在各种实施方案中，糖蛋白或糖肽可具有至少一个连接到多肽链的碳水化合物部分，或者至少两个或至少三个或至少四个或至少五个或至少六个或至少七个或至少八个或至少十个连接到糖蛋白、糖肽或糖脂的至少一个多肽链的碳水化合物部分。聚糖谱可指示存在的聚糖的类型、它们的组成和结构，以及它们是硫酸化的还是未硫酸化的。糖分子的聚糖(或糖基化)谱可出于以下各种原因而为重要的，诸如细胞识别信号，防止针对蛋白质或肽的免疫应答，蛋白质折叠，以及稳定性。可发生糖基化以产生以下中的任一者或多者：N-连接的聚糖、O-连接的聚糖、C-连接的聚糖或磷酸糖基化、或它们的任何组合或子组合。N-连接糖基化是指糖分子(或称为聚糖的低聚糖)在蛋白质或肽的序列中与氮原子(例如，天冬酰胺的酰胺氮)连接。N-连接的聚糖(或N-聚糖)谱是指存在于特定糖分子上或者糖蛋白组或糖肽组上的氮原子处的特定糖基化(单糖或低聚糖)模式。糖分子的N-聚糖谱可以是与特定糖分子相关联的N-连接的单糖或低聚糖的数量和结构的描述。O-连接的糖基化是指糖分子与蛋白质或肽的氨基酸(例如，丝氨酸或苏氨酸)中的氧原子的连接。当甘露糖与色氨酸的吲哚环结合时，可发生C-连接的糖基化。当聚糖经由磷酸二酯键与丝氨酸结合时，发生磷酸糖基化。
N-聚糖和/或O-聚糖也可被硫酸化(或未被硫酸化)，意指它们包含硫酸根部分(例如，SO3)，并且硫酸化的量、程度或位置可为N-聚糖谱或O-聚糖谱的一部分。对于人和动物中的某些类型的分子，N-聚糖谱不包括硫酸化的N-聚糖。因此，可能期望宿主细胞中产生的某些治疗性糖蛋白和糖肽分子不含有硫酸化聚糖或含有较少的硫酸化聚糖，或具有低聚糖(或N-聚糖)谱。单克隆抗体和其他免疫球蛋白仅是本发明可应用的许多类别的糖蛋白中的两种。因此，在一些实施方案中，糖分子的共有肽序列Asn-X-Thr/Ser是糖基化的(但未硫酸化的)，其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸，并且Thr/Ser是苏氨酸或丝氨酸。
宿主细胞
在一些实施方案中，本发明的重组细胞或生物体来自网粘菌纲(Labyrinthulomycetes)。网粘菌纲是单细胞海洋分解者，通常消耗非活体的植物、藻类和动物物质。它们无处不在，数量丰富，尤其是在死亡的植被上，以及在盐沼和红树林沼泽中。虽然破囊壶菌(Thraustochytrid)和网粘菌(Labyrinthulid)的分类多年来一直在演变，但出于本申请的目的，“网粘菌纲”是包括破囊壶菌目和网粘菌目的微生物的综合术语，并且包括(但不限于)：Althornia、不动壶菌属(Aplanochytrium)、橙壶菌属(Aurantiochytrium)、Botyrochytrium、珊瑚壶菌属(Corallochytrium)、Diplophryids、两孔壳虫属(Diplophrys)、玲眼蝶属(Elina)、日本壶菌属、网粘菌属(Labyrinthula)、类网粘菌属(Labryinthuloides)、椭圆壶菌属、多孢堆菌属(Pyrhosorus)、裂殖壶菌属、破囊壶菌属和吾肯氏壶菌属(Ulkenia)。本发明的重组宿主细胞也可以是网粘菌目(Labyrinthulales)的成员。
在一些实施方案中，本发明的宿主细胞或生物体可以是网粘菌纲和分类学的破囊壶菌科的生物体，破囊壶菌科包括但不限于以下中的任一种或多种：破囊壶菌属、日本壶菌属、橙壶菌属、不动壶菌属、Sycyoidochytrium、Botryochytrium、Parietichytrium、椭圆壶菌属、裂殖壶菌属、吾肯氏壶菌属和玲眼蝶属或它们的任何组合或子组合，其公开时如在本文中以所有可能的组合充分阐述。另选地，宿主网粘菌纲微生物可来自以下属，包括但不限于橙壶菌属、椭圆壶菌属和吾肯氏壶菌属。属内的本发明的合适微生物物种的示例包括但不限于：任何裂殖壶菌属物种，包括但不限于聚合裂殖壶菌(Schizochytriumaggregatum)、裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum)、微小裂殖壶菌(Schizochytriummintum)、红树林裂殖壶菌(Schizochytrium mangrovei)、Schizochytrium marinum、Schizochytrium octosporum、和任何橙壶菌属物种(Aurantiochytrium sp.)、任何破囊壶菌属(Thraustochytrium)物种(包括以前的吾肯氏壶菌属(Ulkenia)物种，诸如威瑟吾肯氏壶菌(U.visurgensis)、阿姆氏吾肯氏壶菌(U.amoeboida)、萨迦氏吾肯氏壶菌(U.Sarkariana)、普氏吾肯氏壶菌(U.profunda)、雷迪安吾肯氏壶菌(U.radiata)、米钮塔吾肯氏壶菌(U.Minuta)和吾肯氏壶菌物种BP-5601)，并且包括纹状破囊壶菌(Thraustochytrium striatum)、金黄色破囊壶菌(Thraustochytrium aureum)、蔷薇色破囊壶菌(Thraustochytrium roseum)；以及任何日本壶菌属物种。可特别适用于本文公开的本发明的破囊壶菌目(Thraustochytriales)菌株包括但不限于：裂殖壶菌属物种(S31)(ATCC20888)；裂殖壶菌属物种(S8)(ATCC 20889)；裂殖壶菌属物种(LC-RM)(ATCC 18915)；裂殖壶菌属物种(SR21)；聚合裂殖壶菌(ATCC 28209)；裂殖壶菌(IFO 32693)；破囊壶菌属物种(23B ATCC20891)；纹状破囊壶菌(ATCC 24473)；金黄色破囊壶菌(ATCC34304)；蔷薇色破囊壶菌(ATCC 28210)；和日本壶菌属物种(LI ATCC28207)。在一些实施方案中，本发明的重组宿主细胞可选自橙壶菌属或裂殖壶菌属或破囊壶菌属，或者所有三组一起或它们的任何组合或子组合。本发明的重组宿主细胞也可以是酵母细胞，诸如选自酵母属(Saccharomyces)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)或阿氏酵母属(Arxula)中的任一种或多种的酵母。本发明的重组宿主细胞可选自上述分类学组的任何组合，它们据此以每种可能的组合或子组合公开，如同在本文中完整阐述一样。
本发明的细胞或生物体可为重组的，其为含有重组核酸的细胞或生物体。重组核酸可编码在重组细胞中表达并任选地从重组细胞分泌的功能性糖分子。如本文所用，术语“重组”核酸分子是指已通过人为干预被改变的核酸分子。作为非限制性示例，cDNA是重组DNA分子，也可以是通过体外聚合酶反应产生的任何核酸分子，或者接头已连接到其上的任何核酸分子，或者已整合到载体(诸如克隆载体或表达载体)中的任何核酸分子。作为非限制性示例，重组核酸分子可包括以下中的任一种：1)已例如使用化学或酶技术(例如，通过使用化学核酸合成，或通过使用酶进行核酸分子的复制、聚合、外切酶消化、核酸内切酶消化、连接、逆转录、转录、碱基修饰(包括例如甲基化)或重组(包括同源和位点特异性重组))在体外合成或修饰的核酸分子；2)包括在自然界中不结合的结合的核苷酸序列，3)已使用分子克隆技术进行了工程改造，使得其相对于天然存在的核酸分子序列缺少一个或多个核苷酸，和/或4)已使用分子克隆技术进行操纵，使得其关于天然存在的核酸序列具有一个或多个序列改变或重排。作为非限制性示例，cDNA是重组DNA分子，也可以是通过体外聚合酶反应产生的任何核酸分子，或者接头已连接到其上的任何核酸分子，或者已整合到载体(诸如克隆载体或表达载体)中的任何核酸分子。重组细胞含有重组核酸。
如本文所用，关于核酸或基因的“外源”表示该核酸或基因已通过人为干预被引入(“转化”)到生物体、微生物或细胞中。通常，这种外源核酸经由重组核酸构建体引入细胞或生物体中。外源核酸可以是从一个物种引入另一物种的序列，即异源核酸。异源核酸也可以是在引入异源核酸的物种中不存在的外源合成序列。外源核酸也可以是与生物体同源的序列(即，核酸序列在该物种中天然存在或编码在宿主物种中天然存在的多肽)，该序列已被分离并随后重新引入该生物体的细胞中。包含同源序列的外源核酸通常可通过与外源核酸连接的非天然序列(例如重组核酸构建体中的侧接同源基因序列的非天然调控序列)的存在而与天然存在的序列区分开。另选地或除此之外，稳定转化的外源核酸可通过其与已整合到的基因组中的序列并置来检测和/或区别于天然基因。此外，如果核酸已被引入所考虑的细胞、生物体或菌株的祖细胞中，则该核酸被认为是外源的。
当应用于生物体时，术语“转基因的”、“转化的”或“重组的”或“工程改造的”或“遗传工程改造的”是指已通过将外源或重组核酸序列引入生物体中或通过操纵天然序列进行操纵的生物体，因此天然序列是重组的(例如，通过序列的突变、缺失、插入、置换和下文所述的其他操纵)。在一些实施方案中，外源或重组核酸可表达异源蛋白质产物。此类操纵的非限制性示例包括基因敲除、靶向突变和基因置换、基因置换、启动子置换、缺失或插入、基因或调控序列中的破坏、以及将转基因引入生物体中。例如，转基因微生物可包括可操作地连接至转基因微生物的内源基因的引入的外源调控序列。重组的或遗传工程改造的生物体也可以是其中已引入了用于基因“敲除”、缺失或破坏的构建体的生物体。此类构建体包括但不限于RNAi构建体、微RNA构建体、shRNA构建体、反义构建体和核酶构建体。还包括基因组已被大范围核酸酶或锌指核酸酶的活性改变的生物体。异源或重组核酸分子可被整合到遗传工程改造的/重组的生物体的基因组中，或者在其他情况下，不整合到重组的/遗传工程改造的生物体的基因组中，或者整合到载体或其他核酸构建体上。如本文所用，“重组微生物”或“重组宿主细胞”包括本公开的重组微生物的子代或衍生物。由于突变或环境影响可在后代中出现某些修饰，因此这种子代或衍生物实际上可与亲本细胞不同，但仍包括在本文所用的术语的范围内。
遗传修饰
在各种实施方案中，本发明的宿主细胞或生物体包含编码异源糖分子的核酸，以及一种或多种磺基转移酶基因中的遗传修饰，并且其中该宿主细胞产生并任选地分泌所编码的异源糖分子，该异源糖分子与由不包含遗传修饰或换句话讲具有低硫酸化谱的对应宿主细胞或生物体产生的相同糖分子相比具有较少硫酸化聚糖部分。在各种实施方案中，可对细胞或生物体的一种或多种、或两种或更多种、或三种或更多种、或四种或更多种、或五种或更多种、或六种或更多种磺基转移酶基因或所有磺基转移酶基因进行遗传修饰。异源糖分子上的聚糖部分可为N-聚糖部分或O-聚糖部分或两者。因此，在一些实施方案中，对所述一种或多种磺基转移酶基因的遗传修饰导致糖分子具有较少的硫酸化N-聚糖部分，或具有较少的硫酸化O-聚糖部分，或两者兼有，或换句话讲具有低硫酸化谱。在一些实施方案中，硫酸化被消除，或被还原成零硫酸化N-聚糖或硫酸化O-聚糖部分，或两者兼有。遗传修饰表示缺失、突变、破坏、插入、失活、衰减、重排、倒置中的任一种或多种，该遗传修饰导致基因或调控序列发生物理变化，并减少或消除一种或多种磺基转移酶基因产物的表达。天然存在于生物体中的未修饰核酸序列表示天然或野生型序列。在各种实施方案中，遗传修饰可为缺失。如本文所用，缺失可意指核酸序列的至少一部分丢失，但缺失也可通过例如插入另一序列(例如，选择标记)或缺失和插入的组合以破坏基因来实现，但缺失也可通过其他遗传修饰来进行。缺失可意指基因不再产生其基因产物，或者在各种实施方案中，相对于在标准培养条件下无缺失的产生，基因产生小于20％或小于10％或小于5％或小于1％的其基因产物。术语缺失盒和破坏盒可互换使用。在一些实施方案中，N-聚糖可由于遗传修饰而具有减少的硫酸化、低硫酸化或不具有硫酸化，该N-聚糖可包括但不限于Man3GlcNAc2、Man4GlcNAc2和Man5GlcNAc2，或它们的任何组合或子组合，它们公开时如在本文中以所有可能的组合充分阐述。这些聚糖可存在于如本文所公开的糖分子上。
本文所述的任何遗传修饰可为功能性遗传修饰，意指其使经修饰的基因或调控序列将基因产物(例如，酶或编码的多肽)的产量或活性降低至少15％或至少25％或至少50％或至少60％或至少70％或至少80％或至少90％，或者可消除基因产物(例如，编码的蛋白质或多肽)的产生。因此，缺失或破坏或任何遗传修饰也可以是功能性缺失或破坏。在基因破坏中，将功能性基因置换为不具有活性或活性降低的基因，以便产生功能性遗传修饰。功能性遗传修饰可通过本文所述的任何类型的遗传修饰来实现。因此，突变、缺失、插入、衰减、破坏或本文所述的任何其他类型的遗传修饰均可为如本文所用的功能性遗传修饰。
在其他实施方案中，本发明的宿主细胞的生物体可具有一种或多种磺基转移酶基因的功能降低，这可通过下调基因或其他核酸序列来实现，或通过下调所表达的蛋白质或酶的活性来实现。在这些实施方案中，可能存在或可能不存在遗传修饰，但功能降低通过下调磺基转移酶基因导致该基因转录较少的任何机制来实现，或者通过利用结合到磺基转移酶并降低或消除其活性的分子来实现。因此，在这些实施方案中，通过降低基因产物的活性来实现基因或酶活性的功能性降低。
磺基转移酶
磺基转移酶催化磺酰基从活化的硫酸盐供体转移到受体分子的羟基(或氨基)上。在一些实施方案中，磺基转移酶是碳水化合物磺基转移酶，其将磺基(SO3H)转移到糖分子中的碳水化合物基团以产生硫酸化的碳水化合物基团。在一个实施方案中，碳水化合物中的受体基团为醇(-OH)。可硫酸化的碳水化合物的示例包括但不限于以下中的任一种或多种：甘露糖、N-乙酰基葡糖胺、唾液酸、半乳糖、木糖和岩藻糖、或它们的任何组合。酶的作用可生成碳水化合物硫酸酯。在一些实施方案中，碳水化合物磺基转移酶是高尔基体中的跨膜酶，该跨膜酶例如在糖蛋白或糖肽沿着分泌途径移动时将硫酸盐转移到糖蛋白或糖肽上。它们的结构可包含短的细胞质N端、一个跨膜结构域和大的C端高尔基体腔结构域。
所述一种或多种磺基转移酶可由细胞或生物体的基因组编码。存在碳水化合物磺基转移酶的若干示例，一般表示为“CHST”。在一些实施方案中，碳水化合物磺基转移酶可为半乳糖-3-O-磺基转移酶，其可在O-聚糖和N-聚糖两者的N-乙酰乳糖胺的3'-硫酸化中起作用。在各种实施方案中，磺基转移酶可为磺基转移酶_2家族(PFAM PF03567)或其任何组合或子组合的成员，或者可以是碳水化合物磺基转移酶6(CHST6)、CHST8或CHST9或CHST10或CHST11或CHST12或CHST13或D4ST1，其将硫酸盐转移至硫酸皮肤素的GalNAc残基的第4位，或这些启动子的任何组合或子组合。一种或多种磺基转移酶可来自磺基转移酶_2家族，其包括但不限于软骨素6-磺基转移酶、硫酸乙酰肝素2-O-磺基转移酶(HS2ST)、硫酸乙酰肝素6-磺基转移酶(HS6ST)。本文所述的磺基转移酶的任何组合或子组合可在本发明的细胞或生物体中含有遗传修饰，如本文所述。本发明的重组细胞或生物体可在细胞或生物体的一个或两个或三个或四个或五个或六个或多于六个或所有磺基转移酶基因中具有遗传修饰。所述一种或多种磺基转移酶基因可作为不止一个拷贝存在，并且在一个实施方案中，本发明的细胞和方法可涉及对基因的不止一个拷贝或所有拷贝进行遗传修饰。
在本发明中可有利地缺失、破坏或经受另一遗传修饰的磺基转移酶包括PFAM家族PF03567(磺基转移酶_2)的那些。在一些实施方案中，有利地经受根据本发明的遗传修饰的磺基转移酶与PFAM家族PF03567的成员或磺基转移酶_2家族的成员具有同源性。同源性可为与所述家族的所述成员具有至少20％或至少30％或至少40％或至少50％或至少60％或至少70％或至少80％或至少90％或至少95％或至少96％或至少97％或至少98％或至少99％的序列同一性。在一些实施方案中，PFAM结构域也可为具有1×10-4或更小的E值的分子。在其他实施方案中，经受或具有遗传修饰的磺基转移酶是SEQ ID NO:1-41的磺基转移酶，或与SEQ ID NO:1-41的磺基转移酶或与SEQ ID NO:1-41中的任何两种或更多种、或三种或更多种、或四种或更多种、或五种或更多种磺基转移酶、或与它们的任何组合或子组合具有至少20％或至少30％或至少40％或至少50％或至少60％或至少70％或至少80％或至少90％或至少95％或至少96％或至少97％或至少98％或至少99％的序列同一性的磺基转移酶，其据此以每种可能的子组合公开，如同在本文中完整阐述一样。磺基转移酶也可以是本文所述的来自本文所述的任何宿主细胞生物体或细胞的任一种。在另外的实施方案中，磺基转移酶可以是磺基转移酶CHST6(EC 2.8.2)、CHST8或CHST9或CHST10或CHST11或CHST12或CHST13或D4ST1中的任一种，或者可与它们中的任一种或与它们的任何组合或子组合具有至少20％或至少30％或至少40％或至少50％或至少60％或至少70％或至少80％或至少90％或至少95％或至少96％或至少97％或至少98％或至少99％的序列同一性，其据此以每种可能的子组合公开，如同在本文中完整阐述一样。
已发现，本文所述的在网粘菌纲(例如，破囊壶菌科的生物体)中的一种或多种磺基转移酶基因的缺失、破坏或其他遗传修饰导致产生具有聚糖谱(例如，N-聚糖谱或O-聚糖谱)的异源糖分子，与由在相同条件下生长的不具有遗传修饰或换句话讲具有低聚糖谱的对应生物体产生的相同异源糖分子相比，该异源糖分子不含有硫酸化聚糖或含有较少硫酸化聚糖。在各种实施方案中，遗传修饰可以是磺基转移酶的缺失、敲除或破坏。
异源糖分子
在一些实施方案中，由本发明的细胞或生物体产生的异源糖分子可以是治疗分子，诸如糖蛋白、糖肽或糖脂，例如酶、Ig-Fc-融合蛋白或抗体。抗体可以是功能性抗体或抗体的功能性片段。在各种实施方案中，抗体可以是阿仑单抗、地诺单抗、依库珠单抗、那他珠单抗、西妥昔单抗、奥马珠单抗、优特克单抗、帕尼单抗、曲妥珠单抗、贝利单抗、帕利珠单抗、那他珠单抗、阿昔单抗、巴利昔单抗、达利珠单抗、阿达木单抗(抗TNF-α抗体)、托西莫单抗-Il31、莫罗单抗-CD3、卡那单抗、英夫利昔单抗、达克珠单抗、托珠单抗、胸腺细胞球蛋白、抗胸腺细胞球蛋白或它们中任一者的功能性片段。糖蛋白也可以是阿法西普、利纳西普、依那西普、贝拉西普、阿巴西普、促卵泡素-β或它们中任一者的功能性片段。抗体也可以是任何抗TNF-α抗体或抗HER2抗体，或它们中任一者的功能性片段。糖蛋白可为酶，例如艾杜硫酶、阿替普酶、拉罗尼酶、伊米苷酶、阿糖苷酶-β、透明质酸酶、阿葡糖苷酶-α、GalNAc4-硫酸酯酶、胰脂肪酶或脱氧核糖核酸酶。这些蛋白质中的每一种均为抗体和/或治疗性蛋白质，并且也可为单克隆抗体。功能性抗体(或免疫球蛋白)或抗体的片段与靶表位结合，从而产生应答，例如生物学应答或作用，或终止应答或作用。该应答可与对天然抗体的应答相同，但该应答也可模拟或破坏与配体-受体相互作用相关联的天然生物效应。
当蛋白质为抗体的功能性片段时，其可包含重链可变区的至少一部分，或者可包含抗体的整个抗原识别单元，但仍然包含完全抗体的足够部分，以执行与完全抗体的性质和亲和力相似或相同的抗原结合特性。在各种实施方案中，糖蛋白、糖肽、糖脂、抗体或免疫球蛋白的功能性片段可包含至少10％或至少20％或至少30％或至少50％或至少60％或至少70％或至少80％或至少90％或至少95％的天然序列，并且任选地还可与天然序列的指示部分具有至少70％或至少80％或至少90％或至少95％的序列同一性；例如，功能性片段可包含至少85％的天然抗体序列，并且与天然抗体序列的该部分具有至少90％的序列同一性。本文所公开的任何重组细胞可包含编码本文所述的功能性和/或组装的抗体分子或其功能性片段的核酸。
在各种实施方案中，糖分子可为激素，例如人生长激素、促黄体生成激素、促甲状腺素-α、干扰素、达贝泊汀、促红细胞生成素、依泊汀-α、依泊汀-β、FS因子VIII、因子VIIa、因子IX、抗凝血酶/ATII细胞因子、凝血因子、胰岛素、促红细胞生成素(EPO)、胰高血糖素、葡萄糖依赖性促胰岛素肽(GIP)、胆囊收缩素B、脑啡肽，以及胰高血糖素样肽(GLP-2)PYY、瘦蛋白和抗微生物肽。在任一实施方案中，糖分子可被编码在细胞外源的DNA上，例如质粒、人工染色体、其他核外DNA或另一类型的载体DNA。它也可存在于插入细胞基因组中的外源序列上。
如本文所用，关于核酸或多肽序列的术语“同一性百分比”或“同源性”定义为在将序列比对最大同一性百分比并引入空位(如有必要)以实现最大同源性百分比后，候选序列中与已知多肽相同的核苷酸或氨基酸残基的百分比。N端或C端插入或缺失不应理解为影响同源性，并且多肽序列中小于约30个、小于约20个或小于约10个氨基酸残基的内部缺失和/或插入不应理解为影响同源性。核苷酸或氨基酸序列水平上的同源性或同一性可通过BLAST(基本局部比对搜索工具)分析并使用程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx所采用的算法来确定(Altschul(1997)，Nucleic Acids Res.，第25卷，第3389-3402页，以及Karlin(1990)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第87卷，第2264-2268页)，其被定制用于序列相似性搜索。BLAST程序所用的方法是，首先考虑查询序列和数据库序列之间具有和不具有空位的相似段，然后评估所有已鉴定匹配的统计显著性，最后只总结那些满足预先选择的显著性阈值的匹配。对于序列数据库的相似性搜索中的基本问题的讨论，参见Altschul(1994)，Nature Genetics，第6卷，第119-129页。用于直方图、描述、比对、期望值(即，用于报告与数据库序列的匹配的统计显著性阈值)、截止值、矩阵和过滤器(低复杂度)的搜索参数可处于默认设置。由blastp、blastx、tblastn和tblastx使用的默认评分矩阵为BLOSUM62矩阵(Henikoff(1992)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第89卷，第10915-10919页)，推荐用于长度超过85个(核苷酸碱基或氨基酸)的查询序列。
对于设计用于比较核苷酸序列的blastn，评分矩阵由M(即，一对匹配残基的奖励分数)与N(即，错配残基的惩罚分数)的比率设定，其中M和N的默认值可分别为+5和-4。可如下调节四个blastn参数：Q＝10(空位形成罚分)；R＝10(空位延伸罚分)；wink＝1(沿着查询在每隔wink个位置处生成字词命中)；并且gapw＝16(设置在其中生成空位比对的窗口宽度)。用于比较氨基酸序列的等效Blastp参数设置可为：Q＝9；R＝2；wink＝1；并且gapw＝32。在GCG软件包10.0版中提供的
Figure BDA0002666180630000141
序列间比较可使用DNA参数GAP＝50(空位形成罚分)和LEN＝3(空位延伸罚分)，并且蛋白质比较中的等效设置可为GAP＝8和LEN＝2。
当提及本公开的异源糖分子或核酸序列时，包括在本公开中的是被认为源自初始序列的序列，该序列与全长多肽或核酸序列具有至少40％、至少45％、至少50％、至少55％的序列同一性、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％或至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或约100％、或85％-99％、或85％-95％、或90％-99％、或95％-99％、或97％-99％、或98％-99％的序列同一性。序列片段可具有整个蛋白质的至少30、至少50、至少75、至少100、至少125、150或更多、或30-50或30-75或30-100个氨基酸残基的连续序列，或者至少100或至少200或至少300或至少400或至少500或至少600或至少700或至少800或至少900或至少1000或100-200或100-500或100-1000或500-1000或这些量中的任一者，但少于500或少于1000或少于2000个连续核苷酸。本发明还公开了此类序列的变体，例如，其中至少一个氨基酸残基已在所公开的含有插入和置换的序列的N端和/或C端和/或内部插入。除此之外或另选地，设想的变体可包括含有通过例如同源重组或定点或PCR诱变进行的预定突变的那些变体，以及其他物种的对应多肽或核酸，包括但不限于本文所述的那些变体，含有插入和置换的多肽或核酸家族的等位基因或其他天然存在的变体；和/或衍生物，其中多肽已通过置换、化学、酶促或其他适当的手段用含有插入和置换的天然存在的氨基酸之外的部分(例如，可检测的部分诸如酶)共价修饰。
启动子和终止子
本发明的重组细胞或生物体可以是任何合适的生物体，但在一些实施方案中，是网粘菌纲细胞或破囊壶菌科细胞或本文所述的其他细胞。启动子和终止子可用于本发明的表达盒或其他核酸构建体上，并且启动子(和终止子)可为任何合适的启动子和/或终止子。本文所公开的启动子和/或终止子可以任何组合或子组合使用。例如，本文所述的任何启动子(或可从宿主细胞或生物体分离或在宿主细胞或生物体中起作用的其他启动子)或来源于此类序列的任何启动子可与本文所述的任何终止子或在重组细胞或生物体中起作用的或来源于此类序列的其他终止子组合使用。例如，终止子序列可来源于生物体，包括但不限于长短鞭毛体(包括网粘菌纲)、真菌、微藻类、藻类和其他真核生物体。在各种实施方案中，启动子和/或终止子是在细胞或生物体中可操作的任一种，该细胞或生物体是网粘菌纲细胞，包括其任何科或属。任何构建体还可视情况含有一个或多个选择标记。大量的启动子和终止子可与本发明的宿主细胞一起使用。本文所述的那些是示例，并且借助本公开的普通技术人员将认识到或能够鉴定可用于本发明的其他启动子。可用于本发明的启动子的示例包括α微管蛋白启动子，TEF、TEF1、hsp60、hsp60-788启动子、hsp70、RPL11、Tsp-749启动子，Tubu738启动子、Tubu-997启动子、来自聚酮合酶系统的启动子、以及脂肪酸去饱和酶启动子。可用的终止子的示例包括pgkl、CYCl和eno2。启动子和终止子可以任何有利的组合使用，并且公开了这些启动子和终止子的所有可能的组合，如同在本文中完整阐述一样。
在一些实施方案中，本发明中利用的表达盒包含以下中的任一者或多者：1)一种或多种信号序列；2)一种或多种启动子；3)一种或多种终止子；以及4)编码一种或多种蛋白质的外源序列，所述一种或多种蛋白质可以是异源蛋白质；5)任选地，用于在培养基或一系列媒介上筛选的一种或多种选择性标记。表达盒的这些组分可以任何组合存在，并且公开了每个可能的子组合，如同在本文中完整阐述一样。在具体实施方案中，信号序列可以是本文所述的任何信号序列，但也可以是其他信号序列。多种宿主细胞的各种信号序列是本领域已知的，并且其他信号序列可参考本公开进行鉴定并且在宿主细胞中也起作用。在示例性的具体实施方案中，启动子可以是α-微管蛋白启动子或TEFp，其中α-微管蛋白启动子是这两者中较弱的启动子。启动子可与任何合适的终止子配对，但在具体实施方案中，tub-alpha-p可与pgk1配对。在另一个实施方案中，TEFp启动子可与eno2终止子配对，两种终止子均来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)并且也在网粘菌纲中起作用。选择性标记可为任何合适的一个或多个选择性标记，但在具体实施方案中，其可为nptII或hph。在一个实施方案中，nptII可连接至重链构建体，并且hph可连接至轻链构建体。
本发明还提供了核酸构建体，该核酸构建体是用于在编码磺基转移酶的基因中进行缺失、敲除、破坏或其他遗传修饰的缺失或破坏盒。核酸构建体可通过启动子序列以及任选地在宿主细胞中起作用的末端序列进行调控。宿主细胞可包含如本文所公开的表达盒以及缺失、敲除或破坏盒，其也可为可缺失如本文所公开的靶基因中的任一个或多个靶基因的CRISPR/Cas 9盒。在任一实施方案中，宿主细胞可以是网粘菌纲细胞或生物体，例如破囊壶菌科的细胞或生物体，诸如橙壶菌属、裂殖壶菌属或破囊壶菌属中的任一种的细胞或生物体。构建体或盒还可具有编码与编码磺基转移酶的基因具有5'和3'同源臂的序列，该磺基转移酶在一些实施方案中可为1,3-磺基转移酶。该构建体还可具有选择标记，其在一个实施方案中可为nat，但可使用任何合适的选择标记。
另外的修饰
在一些实施方案中，本发明的重组细胞或生物体还含有除了对编码磺基转移酶的一个或多个基因的遗传修饰之外的遗传修饰，如本文所述。在一个实施方案中，另外的遗传修饰可以是编码甘露糖基转移酶的一个或多个基因中的缺失、破坏或本文所述的其他遗传修饰。由于另外的修饰，细胞产生具有更人源化的或类似人的或简化的N连接聚糖谱的糖分子。在一些实施方案中，该糖分子比由对应细胞产生的对所述一种或多种甘露糖基转移酶基因不具有修饰的相同分子少至少25％或至少35％或至少45％或至少55％或至少70％或至少80％的高甘露糖N-聚糖结构。该糖分子也可具有低硫酸化谱，如本文所述。该遗传修饰可在alg3基因的任一个或多个中，或者在甘露糖基转移酶基因家族中的任一个或多个基因中，或者在影响基因表达的调控序列中(例如，在启动子中)，但也可在非调控序列中。该家族的成员包括但不限于alg1、alg2、alg3、alg6、alg8、alg9、alg10、alg11、alg13和alg14。缺失或敲除或其他遗传修饰可存在于甘露糖基转移酶基因家族中的任一个或多个基因中，或者存在于它们的任何组合或子组合中。宿主细胞可以是本文所述的本发明的细胞。因此，所产生的蛋白质避免了与使用具有非人物种的糖基化模式的糖蛋白、糖肽或糖脂相关的许多问题。当与对如本文所述的编码磺基转移酶的一个或多个基因的修饰组合时，通过减少或去除N-聚糖结构上的硫酸根部分来进一步人源化糖分子来实现进一步的有益效果。
方法
本发明还提供在本文所述的宿主细胞中产生具有聚糖谱的糖分子的方法，该聚糖谱具有如本文所述的N-聚糖或O-聚糖或两者的低硫酸化。该方法可涉及以下中的任一个或多个步骤：用表达载体或编码异源糖分子的其他外源核酸转化或获得宿主细胞，以便从载体中表达或通过整合到细胞染色体中来表达，对如本文所述的一种或多种磺基转移酶基因进行遗传修饰(例如通过用缺失或破坏构建体进行转化)、培养细胞以及收获具有如本文所述的低硫酸化的聚糖谱的异源糖分子的步骤。任选地，该方法还可具有对如本文所述的一个或多个甘露糖基转移酶基因进行缺失或其他遗传修饰的步骤。
在一个实施方案中，该方法涉及用缺失盒、敲除盒或破坏盒或其他盒转化宿主细胞，从而对编码如本文所公开的磺基转移酶的一个或多个基因进行遗传修饰、培养细胞以及收获具有如本文所述的低硫酸化聚糖谱的糖分子。
本发明还提供了产生本文所述的糖分子的方法。该方法涉及提供产生异源糖分子并产生或具有磺基转移酶的重组网粘菌纲细胞，以及使该重组细胞与降低细胞中磺基转移酶活性的分子接触，从而产生具有低硫酸化聚糖谱的糖分子，该低硫酸化聚糖谱可以是如本文所述的任一种。
本发明还提供了产生具有如本文所公开的聚糖谱的糖分子的方法。该方法涉及提供产生异源糖分子的重组网粘菌纲细胞，修饰该网粘菌纲细胞以降低该细胞的至少一种磺基转移酶的活性或使该细胞的至少一种磺基转移酶失活，以及产生该糖分子。该细胞还可具有如本文所述的对一种或多种甘露糖基转移酶基因的遗传修饰。修饰该细胞可涉及破坏或缺失或以其他方式遗传修饰编码一种或多种磺基转移酶的基因，如本文所述。在各种实施方案中，通过使编码一种或多种磺基转移酶的基因的转录或翻译失活或通过使网粘菌纲细胞与磺基转移酶的抑制剂接触来修饰细胞。在另一个实施方案中，可通过使细胞与反义RNA、RNAi或核酶接触来使磺基转移酶失活。所述一种或多种磺基转移酶也可通过转录调控因子失活。抑制剂可通过包含在细胞中的一种或多种核酸分子或通过本文所述的任何方法产生。并且抑制剂可为本文所述的任何抑制剂。
酶抑制
在一些实施方案中，可通过使用RNA干扰(RNAi)来抑制编码磺基转移酶的一个或多个基因的表达，从而抑制、降低或消除磺基转移酶的活性。受抑制的磺基转移酶可以是如本文所述的任何磺基转移酶。该抑制可涉及使磺基转移酶基因突变，或者可以是在表达时结合该酶或者以其他方式引起该酶活性降低的单独基因。基因的RNAi抑制可通过本领域已知的方法来实现，包括但不限于使用反义RNA、核酶、小干扰RNA(siRNA)或微RNA(miRNA)。siRNA或miRNA可从插入细胞基因组中的核酸转录，或者可从转化到细胞中的质粒或其他载体转录，或者可在其中包含细胞的生长培养基中提供。
在其他实施方案中，可通过使用酶抑制剂来抑制磺基转移酶的活性。抑制剂可以是硫酸化抑制剂，并且可以是磺基转移酶的抑制剂。在各种实施方案中，抑制剂可以是氯酸盐、布雷菲德菌素A或半乳糖胺化合物或另一种磺基转移酶抑制剂。酶抑制剂可由插入细胞基因组中的核酸产生，或者可由存在于转化到细胞中的质粒或其他载体上的核酸产生，或者可包括在细胞在其中生长的生长培养基中。抑制剂还可以是针对酶上或酶底物上的一个或多个表位的抗体。
组合物
本发明还提供了具有由本文所述的重组细胞或生物体产生的糖分子的组合物，其中该糖分子具有不含硫酸化聚糖或具有低硫酸化谱的聚糖谱，即，糖分子相对于非硫酸化聚糖具有65％或更少、或50％或更少、或40％或更少、或30％或更少、或25％或更少、或15％或更少、或10％或更少的硫酸化聚糖。在另一个实施方案中，该糖分子具有聚糖谱，该聚糖谱具有0.65或更小、或0.50或更小、或0.40或更小、或0.30或更小、或0.25或更小、或0.15或更小、或0.10或更小的硫酸化Man(3-5)与总的硫酸化和未硫酸化Man(3-5)(或者S-Man(3-5)/S-Man(3-5)+Man(3-5))的比率。
聚糖谱可以是N-聚糖谱、O-聚糖谱或两者。组合物可由本文所述的重组网粘菌纲细胞或生物体产生，并来源于本文所述的重组网粘菌纲细胞或生物体。来源于细胞意指该糖分子由细胞合成。在一些实施方案中，整个糖分子由细胞合成，包括聚糖部分。该细胞可在编码磺基转移酶的一个或多个基因中，以及任选地在一个或多个甘露糖基转移酶基因中包含遗传修饰，如本文所述。组合物可以是如本文所述的来源于宿主细胞的任何组合物。
本发明还提供了含有由本文所述的本发明的细胞或生物体产生的治疗性糖分子的组合物。治疗性糖分子可以是可用于治疗人类或动物患者的糖分子。组合物中所含的治疗性糖分子可以是本文所述的任何糖分子，例如本文所述的抗体、免疫球蛋白、单结构域抗体或任何治疗性蛋白质。治疗性糖分子可在药学上可接受的载体中提供。
糖基化和分析
可进行聚糖分析以确定糖分子上存在的碳水化合物的种类、结构和/或量以及修饰位点。聚糖分析允许确定聚糖的存在和/或其相对量。在各种实施方案中，可存在(例如，当糖蛋白是抗体时)并且可根据本发明硫酸化或未硫酸化的聚糖包括但不限于Man3GlcNAc2、Man4GlcNAc2和Man5GlcNAc2。
普通技术人员理解从糖分子释放聚糖的方法，其可包括酶促释放。酶促释放的一个示例包括使用肽-N-葡糖苷酶F(PNGaseF)或内切糖苷酶H，其通常释放大多数聚糖。PNGaseA可用于释放含有连接到还原末端GlcNAc的α1-3岩藻糖的聚糖。O-聚糖可使用化学方法(例如β-消除)释放。
具有无衍生化的脉冲安培检测的高效阴离子交换色谱(HPAE-PAD)是本领域普通技术人员已知的用于分离和分析聚糖的方法。在该技术中，基于各种标准(包括大小和结构)分离聚糖，并且可生成聚糖谱。质谱和HPLC是用于分析聚糖和生成聚糖谱的其他技术。
本发明的宿主细胞或生物体产生如本文所公开的具有低硫酸化谱的糖分子，或者与没有该遗传修饰并在相同条件下生长的对应生物体产生的相同产物相比，产生的糖蛋白、糖肽或糖脂具有50％或更少、或35％或更少、或25％或更少、或15％或更少的硫酸化聚糖部分。低硫酸化谱还可意指在本发明的宿主细胞或生物体中产生的糖蛋白或糖肽具有至少1％或至少10％的硫酸化聚糖部分。
生物体
本领域的普通技术人员能够在多个近岸海域栖息地诸如盐沼和红树林沼泽(例如，存在于热带地区)中分离本文所述的网粘菌纲生物体。对于本发明，使用浮游生物拖网(10μm)从得自红树林泻湖的样本中分离出分类学的破囊壶菌科(橙壶菌属物种(Aurantiochytrium sp.))的细胞。将收获的生物体在含有海水、葡萄糖、酵母提取物和蛋白胨的培养基上培养，并在同一媒介上进行标准富集步骤。选择单个菌落分离物，发现该分离物适于产生和分泌蛋白质并用作基础菌株(命名为#6267)。
实施例1
用于产生异源糖分子的构建体的合成
那他珠单抗是可用于治疗多发性硬化症和克罗恩氏病的人源化IgG4k单克隆抗体。那他珠单抗表达构建体pCAB097和098(图3a和图3b)如下进行合成。构建体pCAB097是具有驱动那他珠单抗轻链(SEQ ID NO:3)表达的TEF启动子(SEQ ID NO:1)的表达盒，其中分泌由信号肽#579(SEQ ID NO:2)介导。该盒携带用于选择的hph标记。
构建体pCAB098是具有驱动那他珠单抗重链(SEQ ID NO:4)表达的TEF启动子的表达盒，其中分泌由信号肽#579(SEQ ID NO:2)介导。该盒携带用于选择的nptII标记。
构建体 启动子 信号肽 基因 标记
pCAB097 TEF SP579(SEQ ID NO:2) 那他珠单抗轻链 hph
pCAB098 TEF SP579(SEQ ID NO:2) 那他珠单抗重链 nptII
表1那他珠单抗表达构建体的描述。
菌株表
#6267-基础橙壶菌属物种(Aurantiochytrium sp.)菌株
#6602-产生那他珠单抗的菌株
#6920-产生那他珠单抗并携带Cas9
#7087-产生那他珠单抗，携带Cas9，alg3缺失，nat*标记
#0394(也称为7534)-产生那他珠单抗，Cas9、alg3缺失，bsr标记
#9156-与#0394相同，ku70缺失
*诺尔丝菌素抗性基因
实施例2
产生那他珠单抗的菌株#6602的构建
表达那他珠单抗的菌株通过用上述已通过BsaI消化线性化的pCAB097和098共转化橙壶菌属物种(Aurantiochytrium sp.)基础菌株#6267而产生。五个转化体(克隆#3、14、15、20和31)对潮霉素B和巴龙霉素均具有抗性，并且通过ELISA筛选抗体的产生。将每个克隆在24孔板中的3mL FM002(17g/L Instant
Figure BDA0002666180630000211
10g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、20g/L右旋糖)中培养过夜。然后将它们在新鲜的FM002(2.5mL)中稀释1000倍并温育约24小时。通过离心(2000g×5分钟)沉淀细胞，并通过HC捕获/LC检测夹心ELISA测定上清液中抗体的存在。所有五个克隆都产生了可检测的抗体。如所述再次培养这些克隆，并且使用可商购获得的人IgG亚类谱试剂盒获得准确的滴度。这些滴度示于表2中。克隆#31被命名为ID#6602，并用作那他珠单抗菌株以用于进一步工作。
表2：用pCAB097和098转化的克隆中那他珠单抗滴度的汇总。
菌株 滴度(mg/L)
那他珠单抗#03 44
那他珠单抗#14 54
那他珠单抗#15 49
那他珠单抗#20 30
那他珠单抗#31 95
HC捕获/LC检测夹心ELISA
使用夹心ELISA测量单克隆抗体(mAb)。使用吸附在NuncTMMaxiSorpTM板上的小鼠抗人IgG Fc抗体捕获mAb。将包被有捕获抗体的板用洗涤缓冲液(1xPBS，0.05％Tween20)洗涤5次。加入样品(200μL)并在37℃温育1小时。还应用了人IgG1 k稀释系列，以生成标准曲线。将板再次用洗涤缓冲液洗涤5次，并加入在稀释缓冲液(1xPBS，0.1％Tween20，5％小牛血清(BCS))中稀释20,000倍的检测抗体(山羊抗人κ-HRP)。在37℃温育1小时后，将板用洗涤缓冲液洗涤5次。使用1-StepTMUltra TMB-ELISA底物溶液检测HRP。
随时间推移，在650nm读取板。另选地，施加终止溶液(2N H2SO4)，并且在450nm读取板。当用于筛选时，使用测量的吸光度。当用于评估滴度时，基于标准人IgG1κ抗体的稀释系列生成标准曲线，并用于内插未知样品的滴度。
Cas9表达构建体：pAM-001
构建体pAM001(SEQ ID NO:5)是Cas9的表达盒。该盒携带用于在hsp60启动子(SEQID NO:6)的控制下组成型表达来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9的序列。该构建体还携带TurboGFP报告基因和ble标记。
实施例3
携带CAS9的产生那他珠单抗的菌株#6920的构建
通过用AhdI消化线性化的pAM-001盒转化该菌株，将Cas9引入那他珠单抗基础菌株。在TyphoonTMFLA 9000激光扫描仪上通过GFP荧光检查了ZeocinTM抗性菌落中盒的存在。使用引物oSGI-JU-1360和PF640(SEQ ID NO:7和41)，通过PCR扩增适当大小的产物，筛选这些产生GFP的那他珠单抗+Cas9转化体中Cas9表达盒的存在。这些引物将从hsp60启动子的3'端至sv40终止子的5'端扩增Cas9表达盒。通过ELISA检查十个阳性克隆的那他珠单抗产量。将克隆在24孔板中的3mL FM002(17g/L Instant
Figure BDA0002666180630000231
10g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、20g/L右旋糖)中培养过夜。将10μL该培养物用于接种新鲜的FM002(3mL)并温育约24小时。通过离心(2000g×5分钟)沉淀细胞，并通过HC捕获/LC检测夹心ELISA测定上清液中抗体的存在。结果示于表3中。选择克隆3作为那他珠单抗Cas9克隆用于进一步开发，并被命名为ID#6920。
表3：由用Cas9转化的克隆产生的那他珠单抗滴度。
样品 那他珠单抗滴度(mg/L)
#6602+Cas9克隆1 0
#6602+Cas9克隆2 44.54
那他珠单抗+Cas9克隆3 61.05
那他珠单抗+Cas9克隆4 47.75
那他珠单抗+Cas9克隆5 41.11
那他珠单抗+Cas9克隆6 15.80
那他珠单抗+Cas9克隆7 26.99
那他珠单抗+Cas9克隆8 0
那他珠单抗+Cas9克隆9 57.95
那他珠单抗+Cas9克隆10 28.71
那他珠单抗基础菌株#6602 84.52
那他珠单抗基础菌株#6602 84.62
实施例4
ALG3缺失盒的构建
所利用的破坏盒是DNA的线性片段，具有从5'到3'的三个部分：1)5'同源臂，2)选择标记和3)3'同源臂。5'同源臂可为存在于靶向缺失的序列的基因组上游的500bp-1000bp的区域。选择标记通常含有编码基因(即，抗生素抗性基因)表达的序列，该基因允许选择成功的转化体。3'同源臂可为存在于靶向缺失的序列的基因组下游的500bp-1000bp的区域。
该实施例描述了橙壶菌属物种(Aurantiochytrium sp.)中alg3基因的破坏盒的构建。三个翻译ID(SG4EUKT579099、SG4EUKT579102和SG4EUKT561246)(分别为SEQ ID NO:11-13)存在于橙壶菌属物种(Aurantiochytrium sp.)基础菌株(#6267)的基因组组件中。所有三个序列编码434氨基酸蛋白(甘露糖基转移酶)(SEQ ID NO:8-10)。SG4EUKT579099和SG4EUKT579102在氨基酸水平和核苷酸水平上都是相同的。SG4EUKT561246与其他序列在氨基酸水平和核苷酸水平上具有大于99％的同一性。这种高水平的同一性允许使用Cas9和单个向导RNA(gRNA)序列(SEQ ID NO:14)以及由选择性标记(nat)构成的单个破坏盒(alg3::nat)来靶向所有三个序列，该选择性标记提供对诺尔丝菌素的抗性并且侧接5'和3'alg3同源臂(500bp至约1000bp)。
通过从基础菌株(#6267)基因组DNA扩增5'和3'alg3同源臂来生成alg3::nat破坏盒，同时从含有质粒DNA(pSGI-JU-97)的nat扩增选择性标记(nat)。使用引物oSGI-JU-0017(SEQ ID NO:33)和oSGI-JU-0001(SEQ ID NO:34)扩增nat标记。使用引物oCAB-0294(SEQID NO:35)和oCAB-0295(SEQ ID NO:36)扩增5'同源臂，后者具有与oSGI-JU-017互补的5'延伸。使用引物oCAB-0296(SEQ ID NO:37)和oCAB-0297(SEQ ID NO:38)扩增3'同源臂，前者具有与oSGI-JU-0001互补的5'延伸。也通过使用引物oCAB-0294和pCAB-0297的PCR组装这三个片段。将纯化的PCR产物用于转化。
使用可商购获得的MEGAshortscriptTMT7试剂盒生成gRNA，但将RNA酶抑制剂添加到反应混合物中。通过将寡核苷酸oCAB-0341和oCAB-0342(分别为SEQ ID NO:15-16)一起退火来生成模板。
实施例5
ALG3基因的缺失
用于缺失基因的基因组编辑可通过用靶向基因组中的特定位点的gRNA和使用侧接该位点的同源臂生成的破坏盒转化表达Cas9的宿主菌株来进行。同源臂被设计成从基因组序列缺失数百个碱基。
通过用线性alg3::nat破坏盒和gRNA转化该菌株来进行那他珠单抗Cas9克隆#6920中的alg3的缺失。使用引物oCAB-0298和oCAB-0299(分别为SEQ ID NO:39-40)，通过定量PCR(qPCR)筛选诺尔丝菌素抗性菌落中alg3的缺失。所得的alg3缺失菌株被命名为菌株ID#7087。
实施例6
ALG3::NAT到ALG3::BSR标记改变的构建
利用基因组编辑技术将位于alg3基因中的nat标记替换为bsr标记。筛选转化体中杀稻瘟菌素抗性的获得和诺尔丝菌素抗性的丧失。先前基因组编辑的存在经由对连接的抗生素抗性标记(对于那他珠单抗重链而言为巴龙霉素，对于那他珠单抗轻链而言为潮霉素，并且对于Cas9而言为ZeocinTM)的抗性来确认。通过蛋白质印迹分析确认那他珠单抗的产生。所得菌株为#0394)]。
实施例7
移除了NAT标记并且通过BSR使KU70缺失的菌株#9156的构建
利用基因组编辑技术使菌株#7087中缺失ku70(SG4EUKT582572、SG4EUKT582583和SG4EUKT561347)。菌株#7087用靶向ku70的单个向导RNA(gRNA)序列和破坏盒(ku70::bsr)转化，该破坏盒由提供对杀稻瘟菌素的抗性并且侧接5'和3'ku70同源臂的选择性标记(bsr)构成，并且用靶向nat的单个gRNA序列以及由5'和3'alg3同源臂构成的破坏盒(alg3Δ)转化。Ku70的缺失减少了非同源末端连接，因此偏向于通过同源重组进行DNA修复。最初筛选转化体中诺尔丝菌素(nat)抗性的丧失，这表明nat标记的丢失。然后使用靶向缺失区域的引物，通过qPCR筛选对诺尔丝菌素敏感的克隆中ku70的缺失。通过蛋白质印迹分析确认那他珠单抗的产生。所得菌株被命名为菌株#9156。
实施例8
磺基转移酶的缺失
将十六个磺基转移酶鉴定为在本发明中有利地靶向缺失或遗传修饰的有潜力的磺基转移酶。靶向的磺基转移酶被编号为1-16和SEQ ID NO:17-32。
使用表达那他珠单抗的alg3缺失菌株(#0394或#9156)中的每个靶磺基转移酶基因的破坏盒和gRNA进行了基因组编辑实验，以缺失有潜力的磺基转移酶(SEQ ID NO:17-32)中的每一种。用靶向每个磺基转移酶的单个向导RNA(gRNA)序列和破坏盒转化生物体，该破坏盒由提供对诺尔丝菌素的抗性的选择性标记(nat)构成，该选择性标记侧接5'和3'同源臂以靶向相应的磺基转移酶。通过使用靶向缺失区域的引物的qPCR筛选转化体。通过ELISA确认那他珠单抗的产生。获得了SFT 1-4、6-7和11-16(分别为SEQ ID NO:17-20、22-23和27-32)的成功缺失。
使用具有不同磺基转移酶缺失的生物体产生那他珠单抗。使用蛋白质A纯化最终产物并用释放的N-连接聚糖方法分析以确定硫酸化程度。
聚糖测定
有多种方法可用于测定蛋白质或肽中硫酸化聚糖与未硫酸化聚糖的百分比。释放的N-连接聚糖可通过利用NHS氨基甲酸酯快速标记基团、有效的喹啉荧光团和用于增强质谱电离的高碱性叔胺来测定。NHS氨基甲酸酯水解生成二氧化碳和对应的胺。便利的商用试剂盒可用于实施该方案，诸如购自
Figure BDA0002666180630000261
Corporation的Glyco
Figure BDA0002666180630000262
Figure BDA0002666180630000263
N-聚糖试剂盒。
测定聚糖的一般程序利用以下步骤：用阴离子表面活性剂(
Figure BDA0002666180630000264
SF)进行蛋白质变性；酶促蛋白质去糖基化(PNGase F)；用质谱敏感性衍生化试剂对释放的聚糖氨基基团进行小分子标记，该质谱敏感性衍生化试剂利用也具有强荧光团(例如，
Figure BDA0002666180630000265
)的NHS氨基甲酸酯标记基团；基于固相萃取标记的聚糖清理以除去过量试剂和污染物分子；经由亲水相互作用液相色谱(HILIC)和超高效液相色谱(UHPLC)进行衍生化的聚糖分离；以及通过解读MS数据进行聚糖鉴定并通过整合荧光信号来定量聚糖丰度。
使用
Figure BDA0002666180630000266
1290UHPLC系统以及使用四极杆-飞行时间技术(即，
Figure BDA0002666180630000267
6520QTof质谱仪)联接到LC/MS系统的HILIC色谱通过色谱法纯化N-聚糖，并且用荧光检测器(即，
Figure BDA0002666180630000268
1260infinity II荧光检测器)检测。通过解释QTof准确质量数据来完成从头聚糖鉴定。一旦基于MS数据进行了最终鉴定，则基于其相应荧光信号的手动积分来定量对应于感兴趣分子的峰。
该分析通过色谱法分离了Man3GlcNAc2、Man4GlcNAc2和Man5GlcNAc2的硫酸化形式与未硫酸化形式，其占生物体#0394中产生的那他珠单抗上存在的聚糖的80％以上。单独表达的硫酸化Man(3-5)GlcNAc2(ManS)的总量和非硫酸化Man(3-5)GlcNAc2(Man)的总量占观察到的所有聚糖的百分比在图1中以图形形式示出。不具有磺基转移酶缺失的生物体#0394产生具有69％ManS和29％Man的抗体，而SFT15(SEQ ID NO:31)的缺失显著减少了ManS(48％)并增加了Man(45％)。在缺失SFT12(SEQ ID NO:28)和SFT16(SEQ ID NO:32)的情况下也观察到ManS的显著减少和Man的增加。
本文说明性地描述的本发明可在不存在本文未具体公开的任一个或多个元素、一个或多个限制的情况下适当地实施。因此，例如，在本文的每种情况下，术语“包含”、“基本上由…组成”和“由…组成”中的任一个均可被替换为其他两个术语中的任一个。已采用的术语和表达用作描述术语，并且不旨在使用此类术语和表达排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同形式，但是应当认识到，在受权利要求书保护的本发明的范围内的各种修改是可能的。此外，在根据马库什群组描述本发明的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，由此本发明也根据马库什群组的任何单个成员或成员子群组来描述。例如，如果X被描述为选自溴、氯和碘，则X为溴的权利要求和X为溴和氯的权利要求被完整描述，如同在本文中单独阐述一样。子标题仅用于组织目的并用于辅助读者，不应理解为限制本公开。其他实施方案在以下权利要求书的范围内。
尽管已参考以上实施例描述了本发明，但应当理解，修改形式和变型形式涵盖在本发明的实质和范围内。因此，本发明仅受以下权利要求书的限制。
序列表
<110> SYNTHETIC GENOMICS, INC.
CAIAZZA, Nicky C.
URANO, Jun
<120> 用于产生具有低硫酸化的糖分子的生物体和
方法
<130> SGI2150-1WO
<150> US 62/638,796
<151> 2018-03-05
<160> 41
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 3017
<212> DNA
<213> 橙壶菌属物种（Aurantiochytrium sp.）
<220>
<221> misc_feature
<223> TEF启动子
<400> 1
agcaggagtg gattcggaag gccccaaatg gatggcacga gcgagctcct tccttcctct 60
cgcgccgcac tctctccctc cctccctcct ctctctcgcg cgcgagtctc gctcactctc 120
ctttgcaaga gcaacaagca gcctcggcag cgaatgaatg agagtcctcc ttcgcttctt 180
tctcgattca actcgaagaa tgaatgattt tcattgctca aataaataaa taaataaata 240
aataaataaa taattattgt tccattcatg gattggcaat tacttggtta gctagctagc 300
tagctagtga gtgagttagt gggttttagt agtgctaacg gatggcggca aagacctcgt 360
caaaaaaaaa tcaagaaagc aagatgaaga agggcctgtg attcaagacc cgcgttctgt 420
ctcgcttact gcgtggagtg cggagctccg acacgcttga aattggccaa aagctgcact 480
tcgcgccacc ctctgcgccc cgaaggtggc tttgggccgg agcaccaagt ttagcgcact 540
gtaaaaaggc gcgaaacttt gttggagaag ccaattaatt aattaattaa ttaattaatc 600
ctttcgacga aaactaaaga agaagaaaga aatcaagttt ccgccctata aaatatccct 660
tcttcacact tccttcattt tgtagttaga tgataggcag cgaaaggact aaaggtgaaa 720
ggcgtaggga ccacataggc gcgctagggc ggagggaaag atacaaatgg cctcagaaag 780
gaagaagaag aggcctcgcg gaggaaggat gctgaagcag gaaagataca gcgaaagaga 840
aatcctgtat cttccacagt ggatggacac cttcgaggcc tgcataagtc cacatcactc 900
gctattcaat cattgaattg gtcatttaat tcaagcattt aattcaatca tgtcttcatg 960
caatccaccg tccaacaaca gagcgcatag aagatgttat ccaggtaagg ctgcaataat 1020
acgcagtttg agttttctat tttaaaagta agtttaaaac ttaaaaattt catacttatg 1080
catgctattc aaaataagat tgtatcatcc taaagtattc ttcttctcgt tcttcttcta 1140
atcggaacag agacaacttt ggtgggtttg cgggcctttg agagaaagaa aaaaaactct 1200
caaaagaaac caggcttccg aggccgactt gcgcagctct ggattgaggt tccttcgatc 1260
gctcgcttca ccttcctggc ccgcgcatgc ctcgctctgg gtacacagct gagtgagtga 1320
gcgaaagatg agcgaatgaa tgcaatattt ttctattttc tattcattta actgtactta 1380
attaattgat tattgattga ttgattgatt gattgattga ttgattaatg actctcgctt 1440
ctgagaatac atctgttctc atcttcatcg tcacgtcaga atggaaggat gagaaatgaa 1500
aagaattcga tcactttccc gccttcttgc tagctcatgc tcctttcccg ccaaaaagaa 1560
agaagaggaa agcaccccga agaaaagaaa gaaatcaccc aaacaccctc ctccttcctc 1620
gtccacagac agctcagaat aatgaaagct atctttccat cgctcttgac ctaactctct 1680
ttctgctcct gtaaattcat ccaacaaatg tttagtctca gaaacccatc tgcctcatac 1740
tactacttac taccttcctt acttgaaagc aggcaggctc acggccagct tggcagatag 1800
gatagttctc atatctattg ctgatcgttc ccgtttcttt ctcaaagcaa agtcttttct 1860
cttcattcct tttctttttc ttttcttttc aggctctcca cgttttcagg agtagtacat 1920
ttgctactta gtaattagaa agcttagtac tttttgcttt tctggattct gaagacttgg 1980
aaatagaaag aaattaaaaa tctttttctt ctttctttca gcctttgctg gactccctcg 2040
cacgcctcct tcttccccag ccatccatca gcgggcactc cacccgcgct tcaacgctcg 2100
ctcgagtgcg tgcttatttg ccttcaacgc ggcgcggcgg ttaatatagt cccagcactc 2160
cttaaggggg gcatcgcagg gattatcttt ttaaaacctg tcacggagtt acattttccc 2220
tcgcatcaaa gtgttcccgg ccgcgtcgca catctaagtt ttataaccta cacccctcgt 2280
ggggtagggg cgaattctat gtacacagca cctcagaact tgcgcgcgtt ccgtgacaaa 2340
tgaggggtgt ggcggcgcat tcggccgcat cgccacattc agatatctaa catacccccc 2400
cttcgcgatg agtggcaggc gaggcggatt cgctcgcgag aggcgaggtg ccacagcaga 2460
ccagtaacga ggagccaagg taggtgacca ccgacgacta cgaccacgac cacgaccaca 2520
gccacggcgg ctgcagccac gggacgcctc gcatggcagc gcatcagcac cagcaacgac 2580
agctgcgagg agcgcagggc cgatctggac gcgccggagc cgcacgacca atgccgacgc 2640
aacgctgatt cttctggatt acctctacac atgcatatat gtgtagaggt gcggatgaaa 2700
tgccctgcga ataaatgaat ggcttcgagt ttgcctgccg tatgctcgaa agtgcgtgtg 2760
cagacacagg cacgaccgag aggacaacag tctgtgctta cctcaccagc acattcttgc 2820
aacgccatac gaagcacgcg aaatcttgtg gctcagagag gaaggcattc gtgtacggga 2880
acgtggggaa cgctatcaat ttggaattca aaatgagtga accagacaac taactgtgac 2940
ttgaactgtt gctccacgca tcaaaaccaa acccttaaca gaagtagacc agttcgaagc 3000
tactagcacc aaacaaa 3017
<210> 2
<211> 81
<212> DNA
<213> 蛙壶菌（Batrachochytrium dendrobatidis）
<220>
<221> misc_feature
<223> SP579_核甘酸_序列
<400> 2
atgcccttta accgcctttc tcttccttgc cttcttcttg ctctcattgc tagcctcttc 60
attcatgctg ctcaagctgg t 81
<210> 3
<211> 642
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<221> misc_feature
<223> 那他珠单抗_轻链_核甘酸_序列
<400> 3
gacatccaaa tgacacaaag cccttctagc cttagcgctt ctgttggtga tcgtgtgacc 60
attacatgta agacatctca ggacatcaac aagtacatgg cctggtacca gcagacacct 120
ggtaaagctc ctcgtcttct catccactac acctctgctc ttcaacctgg cattccttct 180
cgcttttctg gttctggttc tggtcgcgat tacaccttca ccattagctc tcttcagcct 240
gaggacattg ccacatacta ctgccttcag tacgacaacc tctggacatt tggtcaaggc 300
acaaaggtgg agatcaagcg tacagttgct gctcctagcg tgttcatttt tcctccttct 360
gatgagcagc tcaagtctgg tacagcttct gttgtttgcc tcctcaacaa cttctaccct 420
agagaagcta aggtgcagtg gaaggttgat aacgctcttc aatctggcaa ctctcaggag 480
tctgttacag agcaagacag caaggatagc acctactctc tttctagcac ccttaccctt 540
agcaaggctg attacgagaa gcacaaggtt tacgcttgcg aggttacaca tcagggtctt 600
tcttctcctg tgaccaagag ctttaaccgt ggtgaatgtt aa 642
<210> 4
<211> 1353
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<221> misc_feature
<223> 那他珠单抗_重链_核甘酸_序列
<400> 4
caggttcaac tcgttcagtc aggtgctgag gtgaaaaaac ctggtgcttc tgtgaaggtg 60
agctgtaaag ctagcggctt caacatcaag gacacctaca ttcactgggt tcgccaagct 120
cctggtcaaa gattagagtg gatgggtcgc attgaccctg ctaatggtta caccaagtac 180
gaccccaagt ttcaaggtcg cgtgacaatt accgcagaca catctgcttc taccgcctat 240
atggagctta gctctcttcg ttctgaggat acagccgtgt actattgtgc tcgtgagggt 300
tactacggca actatggtgt ttacgccatg gactattggg gccaaggtac acttgtgact 360
gtgtcttctg ctagcacaaa gggtcctagc gtgtttcctt tagctccttg ttctcgctct 420
acctctgagt ctacagctgc tttaggctgc cttgtgaagg actactttcc tgaacctgtg 480
accgtgtctt ggaactctgg tgctcttaca tctggcgttc acacctttcc tgctgttctt 540
cagtcttctg gcctctactc tcttagctct gtggttacag tgcctagctc ttctcttggc 600
acaaagacat acacctgcaa cgtggatcac aagcctagca acacaaaggt ggataagcgc 660
gttgagagca agtatggtcc tccttgtcct tcttgtcctg ctcctgagtt tcttggtggt 720
ccttctgtgt tcctcttccc tcctaaacct aaggacaccc tcatgatttc tcgcacacct 780
gaggttactt gcgtggttgt tgacgtttct caggaggatc ctgaggtgca gtttaactgg 840
tacgttgatg gcgttgaggt gcataacgct aagacaaaac ctcgtgagga gcagttcaac 900
agcacatatc gcgttgtgag cgtgcttaca gtgcttcatc aggattggct taacggcaag 960
gagtacaagt gcaaggtgag caataagggc cttcctagca gcattgagaa gaccattagc 1020
aaggctaagg gccaacctag agagcctcaa gtttacacac tccctccttc tcaagaggag 1080
atgaccaaga accaggtgtc tcttacctgc cttgttaagg gcttctaccc tagcgacatt 1140
gctgttgaat gggagtctaa cggccaacct gagaacaact acaagacaac accccctgtg 1200
cttgactctg atggcagctt tttcctctac tctcgcctta cagtggacaa gtctcgttgg 1260
caagagggta acgtgtttag ctgctctgtg atgcatgagg ctctccataa ccactacacc 1320
cagaagtctc ttagcctttc tctcggcaag tag 1353
<210> 5
<211> 4251
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<223> NLS-标记-Cas9（pAM-001）
<400> 5
atgcccaaga aaaagcggaa ggtcggcgac tacaaggatg acgatgacaa gttggagcct 60
ggagagaagc cctacaaatg ccctgagtgc ggaaagagct tcagccaatc tggagccttg 120
acccggcatc aacgaacgca tacacgagac aagaagtact ccatcgggct ggacatcggg 180
acgaactccg tgggatgggc cgtgatcaca gacgaataca aggtgccttc caagaagttc 240
aaggtgctgg ggaacacgga cagacactcc atcaagaaga acctcatcgg ggccttgctc 300
ttcgactccg gagaaaccgc cgaagcaacg cgattgaaaa gaaccgccag aagacgatac 360
acacgacgga agaaccgcat ctgctacctc caggagatct tcagcaacga gatggccaag 420
gtggacgact cgttctttca tcgcctggag gagagcttcc tggtggagga agacaagaaa 480
catgagcgcc acccgatctt cgggaacatc gtggacgaag tggcctacca cgagaaatac 540
cccacgatct accacttgcg caagaaactc gtggactcca cggacaaagc ggacttgcgg 600
ttgatctact tggccttggc ccacatgatc aaatttcggg gccacttcct gatcgagggc 660
gacttgaatc ccgacaattc cgacgtggac aagctcttca tccagctggt gcagacctac 720
aaccagctct tcgaggagaa ccccatcaat gcctccggag tggacgccaa agccatcttg 780
tccgcccgat tgtccaaatc cagacgcttg gagaacttga tcgcacaact tcctggcgag 840
aagaagaacg gcctcttcgg caacttgatc gcgctgtcgc tgggattgac gcctaacttc 900
aagtccaact tcgacttggc cgaggacgcc aagttgcaac tgtccaagga cacctacgac 960
gacgacctcg acaacctgct ggcccaaatt ggcgaccaat acgcggactt gtttttggcg 1020
gccaagaact tgagcgacgc catcttgttg agcgacatct tgcgcgtgaa tacggagatc 1080
accaaagccc ctttgtccgc ctctatgatc aagcggtacg acgagcacca ccaagacttg 1140
accctgttga aagccctcgt gcggcaacaa ttgcccgaga agtacaagga gatcttcttc 1200
gaccagtcca agaacgggta cgccggctac atcgacggag gagcctccca agaagagttc 1260
tacaagttca tcaagcccat cctggagaag atggacggca ccgaggagtt gctcgtgaag 1320
ctgaaccgcg aagacttgtt gcgaaaacag cggacgttcg acaatggcag catcccccac 1380
caaatccatt tgggagagtt gcacgccatc ttgcgacggc aagaggactt ctacccgttc 1440
ctgaaggaca accgcgagaa aatcgagaag atcctgacgt tcagaatccc ctactacgtg 1500
ggacccttgg cccgaggcaa ttcccggttt gcatggatga cgcgcaaaag cgaagagacg 1560
atcaccccct ggaacttcga agaagtggtc gacaaaggag catccgcaca gagcttcatc 1620
gagcgaatga cgaacttcga caagaacctg cccaacgaga aggtgttgcc caagcattcg 1680
ctgctgtacg agtacttcac ggtgtacaac gagctgacca aggtgaagta cgtgaccgag 1740
ggcatgcgca aacccgcgtt cctgtcggga gagcaaaaga aggccattgt ggacctgctg 1800
ttcaagacca accggaaggt gaccgtgaaa cagctgaaag aggactactt caagaagatc 1860
gagtgcttcg actccgtgga gatctccggc gtggaggacc gattcaatgc ctccttggga 1920
acctaccatg acctcctgaa gatcatcaag gacaaggact tcctggacaa cgaggagaac 1980
gaggacatcc tggaggacat cgtgctgacc ctgaccctgt tcgaggaccg agagatgatc 2040
gaggaacggt tgaaaacgta cgcccacttg ttcgacgaca aggtgatgaa gcagctgaaa 2100
cgccgccgct acaccggatg gggacgattg agccgcaaac tgattaatgg aattcgcgac 2160
aagcaatccg gaaagaccat cctggacttc ctgaagtccg acgggttcgc caaccgcaac 2220
ttcatgcagc tcatccacga cgactccttg accttcaagg aggacatcca gaaggcccaa 2280
gtgtccggac aaggagactc cttgcacgag cacatcgcca atttggccgg atcccccgca 2340
atcaaaaaag gcatcttgca aaccgtgaaa gtggtcgacg aactggtgaa ggtgatggga 2400
cggcacaagc ccgagaacat cgtgatcgaa atggcccgcg agaaccaaac cacccaaaaa 2460
ggacagaaga actcccgaga gcgcatgaag cggatcgaag agggcatcaa ggagttgggc 2520
tcccagatcc tgaaggagca tcccgtggag aatacccaat tgcaaaacga gaagctctac 2580
ctctactacc tccagaacgg gcgggacatg tacgtcgacc aagagctgga catcaaccgc 2640
ctctccgact acgatgtgga tcatattgtg ccccagagct tcctcaagga cgacagcatc 2700
gacaacaagg tcctgacgcg cagcgacaag aaccggggca agtctgacaa tgtgccttcc 2760
gaagaagtcg tgaagaagat gaagaactac tggcggcagc tgctcaacgc caagctcatc 2820
acccaacgga agttcgacaa cctgaccaag gccgagagag gaggattgtc cgagttggac 2880
aaagccggct tcattaaacg ccaactcgtg gagacccgcc agatcacgaa gcacgtggcc 2940
caaatcttgg actcccggat gaacacgaaa tacgacgaga atgacaagct gatccgcgag 3000
gtgaaggtga tcacgctgaa gtccaagctg gtgagcgact tccggaagga cttccagttc 3060
tacaaggtgc gggagatcaa caactaccat cacgcccatg acgcctacct gaacgccgtg 3120
gtcggaaccg ccctgatcaa gaaatacccc aagctggagt ccgaattcgt gtacggagat 3180
tacaaggtct acgacgtgcg gaagatgatc gcgaagtccg agcaggagat cggcaaagcc 3240
accgccaagt acttctttta ctccaacatc atgaacttct tcaagaccga gatcacgctc 3300
gccaacggcg agatccgcaa gcgccccctg atcgagacca acggcgagac gggagagatt 3360
gtgtgggaca aaggaagaga ttttgccaca gtgcgcaagg tgctgtccat gcctcaggtg 3420
aacatcgtga agaagaccga ggtgcaaaca ggagggtttt ccaaagagtc cattttgcct 3480
aagaggaatt ccgacaagct catcgcccgc aagaaggact gggaccccaa gaagtacggg 3540
ggcttcgact cccccacggt ggcctactcc gtgttggtgg tggccaaagt ggagaaaggg 3600
aagagcaaga agctgaaatc cgtgaaggag ttgctcggaa tcacgatcat ggaacgatcg 3660
tcgttcgaga aaaaccccat cgacttcctc gaagccaaag ggtacaaaga ggtgaagaag 3720
gacctgatca tcaagctgcc caagtactcc ctgttcgagc tggagaacgg ccgcaagcgg 3780
atgctggcct ccgccgggga actgcagaaa gggaacgaat tggccttgcc ctccaaatac 3840
gtgaacttcc tctacttggc ctcccattac gaaaagctca aaggatcccc tgaggacaat 3900
gagcagaagc aactcttcgt ggaacaacac aagcactacc tggacgagat catcgagcag 3960
atcagcgagt tctccaagcg cgtgatcctc gccgacgcca acctggacaa ggtgctctcc 4020
gcctacaaca agcaccgcga caagcctatc cgcgagcaag ccgagaatat cattcacctg 4080
tttaccctga cgaatttggg agcccctgcc gcctttaaat actttgacac caccatcgac 4140
cgcaaaagat acacctccac caaggaagtc ttggacgcca ccctcatcca ccagtccatc 4200
acgggcctct acgagacgcg catcgacctc tcccaattgg gcggcgacta a 4251
<210> 6
<211> 788
<212> DNA
<213> 酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）
<220>
<221> misc_feature
<223> hsp60启动子
<400> 6
acgttcttcg cgaagtcaat ccattccccg cgttccccaa atgagggttc gcggtcgaac 60
ccgggggctg agaagggcct taaaagcgcg ggtttaaaga gggatcggga gcggcgggag 120
acaagggatt aaggtggaag tggacccttt tccagaaggg agaaaagcac gagcgggaga 180
ttgactggtg cagcagatcc cgaacgacgt cttcgacagg tacgtgcctc agattgaggt 240
gccgctcatg cggcactgta ttcaagcgct ctagctggcc gccatgttgc tgccactctg 300
tttgccgctc gcggccacac ggctgccgcc aggaccaccc accacccgct ccagctgccg 360
tgagctgagc ttacctatgg acgcatgagc ggctccaagc cacacgtcct gtctggtgaa 420
tatccaactt gacgtcgcgg ctttgtctcc atcattctag ctgcgaatct ggattgctga 480
ggagatcatc gcttctgcgc ggtgtgacgc cggcttcagc cgcgatagat tgatttggat 540
ggaagcgacc aagcagagcg tcgcatctcc ttaccgggta ttagggttct gtagatccaa 600
aagacctagt ttatgtattg agtggcagag acgaaaaatt ggctcaggct aatttgaatg 660
gctgtggcta agtccttaaa tgcttggtgg acaatcgatg gaagaagagc aaagtgaaca 720
aaaaagactg acctttcaag tttaatttat ttgcaatcca caggcgacaa aacaaaacac 780
aaataaaa 788
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物oSGI-JU-1360
<400> 7
cttaaatgct tggtggacaa t 21
<210> 8
<211> 434
<212> PRT
<213> 橙壶菌属物种（Aurantiochytrium sp.）
<220>
<221> misc_feature
<223> 甘露糖基转移酶（alg3）SG4EUKT579099
<400> 8
Met Ser Leu Arg Ala Ser Lys Asp Ala Leu Val Arg Leu Arg Gly Ala
1 5 10 15
Leu Asp Asn Ala Ser Thr Gln Trp Trp Trp Trp Ala Met Ala Ala Thr
20 25 30
Ala Asp Leu Ala Leu Ser Leu Leu Ile Val Lys Leu Val Pro Tyr Thr
35 40 45
Glu Ile Asp Phe Lys Ala Tyr Met Gln Glu Val Glu Gly Pro Leu Leu
50 55 60
His Asp Glu Trp Asp Tyr Thr Lys Leu Arg Gly Asp Thr Gly Pro Leu
65 70 75 80
Val Tyr Pro Ala Gly Phe Val Tyr Ile Tyr Met Gly Ile Arg Trp Leu
85 90 95
Thr Glu Asp Gly Thr Asn Leu Trp Arg Gly Gln Ile Leu Phe Ala Ser
100 105 110
Leu His Ala Ile Leu Val Tyr Leu Val Leu Gly Ser Ile Tyr Tyr Gln
115 120 125
Pro Asp Ala Ser Lys Asp Pro Arg Arg Val Pro Phe Trp Val Gly Pro
130 135 140
Leu Ala Val Leu Ser Arg Arg Val His Ser Ile Phe Val Leu Arg Leu
145 150 155 160
Phe Asn Asp Gly Ile Ala Met Val Phe Met Tyr Ala Ala Val Tyr Met
165 170 175
Tyr Val Arg Arg Arg Trp Thr Leu Gly Thr Ala Phe Phe Ser Ala Ala
180 185 190
Leu Ser Val Lys Met Asn Ile Leu Leu Phe Ala Pro Gly Leu Ala Val
195 200 205
Leu Met Leu Glu Ala Thr Gly Leu Ala Ser Ser Ile Leu Gln Ala Val
210 215 220
Ile Cys Val Ala Ser Gln Ile Ala Leu Ala Leu Pro Phe Leu Gln Val
225 230 235 240
Asn Ala Ala Gly Tyr Leu Asn Arg Ala Phe Glu Leu Gly Arg Val Phe
245 250 255
Thr Tyr Lys Trp Thr Val Asn Phe Lys Phe Leu Ser Pro Glu Ala Phe
260 265 270
Val Ser Lys Ala Leu Ala Gln Gly Leu Leu Ser Ala Thr Leu Leu Thr
275 280 285
Trp Val Gly Phe Gly Ser Arg His Phe Ala Ser Ser His Thr Gly Gly
290 295 300
Leu Arg Gly Leu Val Tyr Thr Ser Ile Val Arg Pro Leu Lys Ala Pro
305 310 315 320
Leu Glu Asp Thr Ile Ser Thr Val Gln Met His Asp Trp Lys Leu His
325 330 335
Val Leu Thr Leu Leu Phe Thr Ser Asn Phe Ile Gly Ile Val Phe Ala
340 345 350
Arg Ser Ile His Tyr Gln Phe Tyr Thr Trp Tyr Phe His Thr Val Ser
355 360 365
Phe Leu Val Tyr Ala Ser Gly Gly Asn Phe Ala Leu Ser Leu Leu Ile
370 375 380
Cys Val Ser Leu Glu Val Cys Phe Asn Val Tyr Pro Ser Thr Ala Glu
385 390 395 400
Ser Ser Ala Ile Leu Gln Ala Thr His Leu Val Leu Leu Leu Arg Leu
405 410 415
Ala Thr Arg Lys Pro Cys Pro Leu Thr Ala Gln Ser Lys Arg Pro Lys
420 425 430
Gln Ala
<210> 9
<211> 434
<212> PRT
<213> 橙壶菌属物种（Aurantiochytrium sp.）
<220>
<221> misc_feature
<223> 甘露糖基转移酶（alg3）SG4EUKT579102
<400> 9
Met Ser Leu Arg Ala Ser Lys Asp Ala Leu Val Arg Leu Arg Gly Ala
1 5 10 15
Leu Asp Asn Ala Ser Thr Gln Trp Trp Trp Trp Ala Met Ala Ala Thr
20 25 30
Ala Asp Leu Ala Leu Ser Leu Leu Ile Val Lys Leu Val Pro Tyr Thr
35 40 45
Glu Ile Asp Phe Lys Ala Tyr Met Gln Glu Val Glu Gly Pro Leu Leu
50 55 60
His Asp Glu Trp Asp Tyr Thr Lys Leu Arg Gly Asp Thr Gly Pro Leu
65 70 75 80
Val Tyr Pro Ala Gly Phe Val Tyr Ile Tyr Met Gly Ile Arg Trp Leu
85 90 95
Thr Glu Asp Gly Thr Asn Leu Trp Arg Gly Gln Ile Leu Phe Ala Ser
100 105 110
Leu His Ala Ile Leu Val Tyr Leu Val Leu Gly Ser Ile Tyr Tyr Gln
115 120 125
Pro Asp Ala Ser Lys Asp Pro Arg Arg Val Pro Phe Trp Val Gly Pro
130 135 140
Leu Ala Val Leu Ser Arg Arg Val His Ser Ile Phe Val Leu Arg Leu
145 150 155 160
Phe Asn Asp Gly Ile Ala Met Val Phe Met Tyr Ala Ala Val Tyr Met
165 170 175
Tyr Val Arg Arg Arg Trp Thr Leu Gly Thr Ala Phe Phe Ser Ala Ala
180 185 190
Leu Ser Val Lys Met Asn Ile Leu Leu Phe Ala Pro Gly Leu Ala Val
195 200 205
Leu Met Leu Glu Ala Thr Gly Leu Ala Ser Ser Ile Leu Gln Ala Val
210 215 220
Ile Cys Val Ala Ser Gln Ile Ala Leu Ala Leu Pro Phe Leu Gln Val
225 230 235 240
Asn Ala Ala Gly Tyr Leu Asn Arg Ala Phe Glu Leu Gly Arg Val Phe
245 250 255
Thr Tyr Lys Trp Thr Val Asn Phe Lys Phe Leu Ser Pro Glu Ala Phe
260 265 270
Val Ser Lys Ala Leu Ala Gln Gly Leu Leu Ser Ala Thr Leu Leu Thr
275 280 285
Trp Val Gly Phe Gly Ser Arg His Phe Ala Ser Ser His Thr Gly Gly
290 295 300
Leu Arg Gly Leu Val Tyr Thr Ser Ile Val Arg Pro Leu Lys Ala Pro
305 310 315 320
Leu Glu Asp Thr Ile Ser Thr Val Gln Met His Asp Trp Lys Leu His
325 330 335
Val Leu Thr Leu Leu Phe Thr Ser Asn Phe Ile Gly Ile Val Phe Ala
340 345 350
Arg Ser Ile His Tyr Gln Phe Tyr Thr Trp Tyr Phe His Thr Val Ser
355 360 365
Phe Leu Val Tyr Ala Ser Gly Gly Asn Phe Ala Leu Ser Leu Leu Ile
370 375 380
Cys Val Ser Leu Glu Val Cys Phe Asn Val Tyr Pro Ser Thr Ala Glu
385 390 395 400
Ser Ser Ala Ile Leu Gln Ala Thr His Leu Val Leu Leu Leu Arg Leu
405 410 415
Ala Thr Arg Lys Pro Cys Pro Leu Thr Ala Gln Ser Lys Arg Pro Lys
420 425 430
Gln Ala
<210> 10
<211> 434
<212> PRT
<213> 橙壶菌属物种（Aurantiochytrium sp.）
<220>
<221> misc_feature
<223> 甘露糖基转移酶（alg3）SG4EUKT561246
<400> 10
Met Ser Phe Arg Ala Ser Lys Asp Ala Leu Val Arg Leu Arg Gly Ala
1 5 10 15
Leu Asp Asn Ala Ser Thr Gln Trp Trp Trp Trp Ala Met Ala Ala Thr
20 25 30
Ala Asp Leu Ala Leu Ser Leu Leu Ile Val Lys Leu Val Pro Tyr Thr
35 40 45
Glu Ile Asp Phe Lys Ala Tyr Met Gln Glu Val Glu Gly Pro Leu Leu
50 55 60
His Asp Glu Trp Asp Tyr Thr Lys Leu Arg Gly Asp Thr Gly Pro Leu
65 70 75 80
Val Tyr Pro Ala Gly Phe Val Tyr Ile Tyr Met Gly Ile Arg Trp Leu
85 90 95
Thr Glu Asp Gly Thr Asn Leu Trp Arg Gly Gln Ile Leu Phe Ala Ser
100 105 110
Leu His Ala Ile Leu Val Tyr Leu Val Leu Gly Ser Ile Tyr Tyr Gln
115 120 125
Pro Asp Ala Ser Lys Asp Pro Arg Arg Val Pro Phe Trp Val Gly Pro
130 135 140
Leu Ala Val Leu Ser Arg Arg Val His Ser Ile Phe Val Leu Arg Leu
145 150 155 160
Phe Asn Asp Gly Ile Ala Met Val Phe Met Tyr Ala Ala Val Tyr Met
165 170 175
Tyr Val Arg Arg Arg Trp Thr Leu Gly Thr Ala Phe Phe Ser Ala Ala
180 185 190
Leu Ser Val Lys Met Asn Ile Leu Leu Phe Ala Pro Gly Leu Ala Val
195 200 205
Leu Met Leu Glu Ala Thr Gly Leu Ala Ser Ser Ile Leu Gln Ala Val
210 215 220
Ile Cys Val Ala Ser Gln Ile Ala Leu Ala Leu Pro Phe Leu Gln Val
225 230 235 240
Asn Ala Ala Gly Tyr Leu Asn Arg Ala Phe Glu Leu Gly Arg Val Phe
245 250 255
Thr Tyr Lys Trp Thr Val Asn Phe Lys Phe Leu Ser Pro Glu Ala Phe
260 265 270
Val Ser Lys Ala Leu Ala Gln Gly Leu Leu Ser Ala Thr Leu Leu Thr
275 280 285
Trp Val Gly Phe Gly Ser Arg His Phe Ala Ser Ser His Thr Gly Gly
290 295 300
Leu Arg Gly Leu Val Tyr Thr Ser Ile Val Arg Pro Leu Lys Ala Pro
305 310 315 320
Leu Glu Asp Thr Ile Ser Thr Val Gln Met His Asp Trp Lys Leu His
325 330 335
Val Leu Thr Leu Leu Phe Thr Ser Asn Phe Ile Gly Ile Val Phe Ala
340 345 350
Arg Ser Ile His Tyr Gln Phe Tyr Thr Trp Tyr Phe His Thr Val Ser
355 360 365
Phe Leu Val Tyr Ala Ser Gly Gly Asn Phe Ala Leu Ser Leu Leu Ile
370 375 380
Cys Val Ser Leu Glu Val Cys Phe Asn Val Tyr Pro Ser Thr Ala Glu
385 390 395 400
Ser Ser Ala Ile Leu Gln Ala Thr His Leu Val Leu Leu Leu Arg Leu
405 410 415
Ala Thr Arg Lys Pro Cys Pro Leu Thr Ala Gln Ser Lys Arg Pro Lys
420 425 430
Gln Ala
<210> 11
<211> 1305
<212> DNA
<213> 橙壶菌属物种（Aurantiochytrium sp.）
<220>
<221> misc_feature
<223> 甘露糖基转移酶 SG4EUKT579099
<400> 11
atgtctttgc gtgcgagtaa ggatgccctc gtacgtcttc gaggggccct cgacaatgca 60
agcactcagt ggtggtggtg ggccatggca gccacggcag acttggcact tagcctgctt 120
attgtgaaac tcgtgcctta tacggagatc gactttaaag cgtacatgca agaggttgaa 180
ggccccctat tgcatgatga atgggactat acaaagctca ggggcgacac aggcccgctg 240
gtttatcctg ccggttttgt gtatatttat atgggcatcc gctggctcac tgaagacggc 300
acgaacctgt ggcgaggcca gatacttttt gcaagtctgc atgcaattct tgtttacctt 360
gtacttggat ccatatatta ccagccagat gcatcaaaag atcctcgcag agtgccgttc 420
tgggtaggac ctctagcagt attatcgaga cgtgtgcatt caatctttgt tctgaggctc 480
ttcaacgacg gcattgctat ggtgtttatg tatgcagcag tatatatgta tgtgcggagg 540
cgttggacgc taggtacggc tttcttcagc gcagcactta gcgtgaaaat gaatatactc 600
ctatttgcgc caggattagc cgtgttgatg ctcgaggcta cgggtttggc gtcgagcata 660
ctgcaggcag tgatctgcgt agcatcacag attgccttag ctttgccgtt cctccaagtc 720
aacgcagccg ggtatctaaa tcgggctttt gagctaggtc gtgtctttac gtacaaatgg 780
acagtaaact tcaagtttct cagccctgaa gcttttgtga gtaaggcact tgcccaaggc 840
ctgctgtctg ccactttact tacatgggtc ggctttgggt ctcgccactt tgcttcctct 900
cacacaggtg gtcttcgcgg ccttgtgtac acgagcattg ttcgaccact gaaagctccg 960
cttgaagaca caatttcaac cgtccaaatg catgactgga aacttcacgt tttgacgctc 1020
ctattcacaa gcaactttat tggcatcgtt tttgcgcgaa gcatccatta ccaattctac 1080
acttggtact ttcacactgt ctcattctta gtgtacgcca gtggtggaaa cttcgcgttg 1140
tctcttctta tttgcgtttc tctagaagta tgctttaacg tgtatccttc aacagcagaa 1200
tcgagtgcta tcttgcaggc aactcatctt gttttgttat tgagacttgc tacacgaaaa 1260
ccttgcccac ttacagcaca gagcaagcgc cctaaacaag catga 1305
<210> 12
<211> 1305
<212> DNA
<213> 橙壶菌属物种（Aurantiochytrium sp.）
<220>
<221> misc_feature
<223> 甘露糖基转移酶（alg3）SG4EUKT579102
<400> 12
atgtctttgc gtgcgagtaa ggatgccctc gtacgtcttc gaggggccct cgacaatgca 60
agcactcagt ggtggtggtg ggccatggca gccacggcag acttggcact tagcctgctt 120
attgtgaaac tcgtgcctta tacggagatc gactttaaag cgtacatgca agaggttgaa 180
ggccccctat tgcatgatga atgggactat acaaagctca ggggcgacac aggcccgctg 240
gtttatcctg ccggttttgt gtatatttat atgggcatcc gctggctcac tgaagacggc 300
acgaacctgt ggcgaggcca gatacttttt gcaagtctgc atgcaattct tgtttacctt 360
gtacttggat ccatatatta ccagccagat gcatcaaaag atcctcgcag agtgccgttc 420
tgggtaggac ctctagcagt attatcgaga cgtgtgcatt caatctttgt tctgaggctc 480
ttcaacgacg gcattgctat ggtgtttatg tatgcagcag tatatatgta tgtgcggagg 540
cgttggacgc taggtacggc tttcttcagc gcagcactta gcgtgaaaat gaatatactc 600
ctatttgcgc caggattagc cgtgttgatg ctcgaggcta cgggtttggc gtcgagcata 660
ctgcaggcag tgatctgcgt agcatcacag attgccttag ctttgccgtt cctccaagtc 720
aacgcagccg ggtatctaaa tcgggctttt gagctaggtc gtgtctttac gtacaaatgg 780
acagtaaact tcaagtttct cagccctgaa gcttttgtga gtaaggcact tgcccaaggc 840
ctgctgtctg ccactttact tacatgggtc ggctttgggt ctcgccactt tgcttcctct 900
cacacaggtg gtcttcgcgg ccttgtgtac acgagcattg ttcgaccact gaaagctccg 960
cttgaagaca caatttcaac cgtccaaatg catgactgga aacttcacgt tttgacgctc 1020
ctattcacaa gcaactttat tggcatcgtt tttgcgcgaa gcatccatta ccaattctac 1080
acttggtact ttcacactgt ctcattctta gtgtacgcca gtggtggaaa cttcgcgttg 1140
tctcttctta tttgcgtttc tctagaagta tgctttaacg tgtatccttc aacagcagaa 1200
tcgagtgcta tcttgcaggc aactcatctt gttttgttat tgagacttgc tacacgaaaa 1260
ccttgcccac ttacagcaca gagcaagcgc cctaaacaag catga 1305
<210> 13
<211> 1305
<212> DNA
<213> 橙壶菌属物种（Aurantiochytrium sp.）
<220>
<221> misc_feature
<223> 甘露糖基转移酶（alg3）SG4EUKT561246
<400> 13
atgtctttcc gtgcgagtaa ggatgccctc gtacgtcttc gaggggccct cgacaatgca 60
agcactcagt ggtggtggtg ggccatggca gccacggcag acttggcact tagcctgctt 120
attgtgaaac tcgtgcctta tacggagatc gactttaaag cgtacatgca agaggttgaa 180
ggccccctac tgcatgatga atgggactat acaaagctca ggggcgacac aggcccgctg 240
gtttatcctg ctggttttgt gtatatttat atgggcatcc gctggctcac tgaagacggc 300
acaaacctgt ggcgaggcca gatacttttt gcaagtctgc atgcaattct tgtttacctt 360
gtacttggat ccatatacta ccagccagat gcatcaaaag atcctcgcag agtgccgttc 420
tgggtaggac ctctagcagt attatcgaga cgtgtgcatt caatctttgt tctgaggctc 480
ttcaacgacg gcattgctat ggtgtttatg tatgcagcag tatatatgta tgtgcggagg 540
cgttggacgc taggtacggc tttcttcagc gcagcactta gcgtgaaaat gaatatactc 600
ctatttgcgc caggattagc cgtgttgatg ctcgaggcta cgggtttggc gtcgagcata 660
ctgcaggcag tgatctgcgt agcatcacag attgccttag ctttgccgtt cctccaagtc 720
aatgcagcag ggtatctaaa tcgggctttt gagctaggtc gtgtctttac gtacaagtgg 780
acagtaaact tcaagtttct cagccctgaa gcttttgtaa gtaaggcact tgcccaaggc 840
ctgctgtctg ccactttact tacatgggtc ggctttgggt ctcgccattt tgcttcctct 900
cacacaggtg gccttcgcgg ccttgtgtac acgagcattg ttcgaccact gaaagctccg 960
cttgaagaca caatttcaac cgtccaaatg catgactgga aacttcacgt tttgacgctc 1020
ctattcacaa gcaactttat tggcatcgtt tttgcgcgaa gcatccatta ccaattctac 1080
acttggtact ttcacactgt ctcattctta gtgtacgcca gtggtggaaa cttcgcgttg 1140
tctcttctta tttgcgtttc tctagaagta tgctttaacg tgtatccttc aacagcagaa 1200
tcgagtgcta tcttgcaggc aactcatctt gttttgttat tgagacttgc tacacgaaaa 1260
ccttgcccac ttacagcaca gagcaagcgc cctaaacaag catga 1305
<210> 14
<211> 103
<212> DNA
<213> 橙壶菌属物种（Aurantiochytrium sp.
<220>
<221> misc_feature
<223> alg3_gRNA
<400> 14
gcguacaugc aagagguuga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 103
<210> 15
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物oCAB-0341
<400> 15
taatacgact cactatagcg tacatgcaag aggttgagtt ttagagctag aaatagcaag 60
ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttt 120
<210> 16
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物oCAB-0342
<400> 16
aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60
cttgctattt ctagctctaa aactcaacct cttgcatgta cgctatagtg agtcgtatta 120
<210> 17
<211> 426
<212> PRT
<213> 橙壶菌属物种（Aurantiochytrium sp.）
<220>
<221> misc_feature
<223> SFT1，硫酸肝素2-O-磺基转移酶
<400> 17
Met Ser Ser Ala Lys Glu Asn Asn Gly Ser Thr Leu Thr Gln Arg Pro
1 5 10 15
Ala Ala Lys Lys Ala Asn Glu Thr Lys Glu Thr Lys Val Glu Gly Glu
20 25 30
Ala Ala Val Lys Ala Asp Asn Ala Thr Pro Thr Asn Ala Pro Lys Pro
35 40 45
Arg Val Ala Arg Lys Lys Arg Asp Lys Thr Met Asp Tyr Leu Lys Leu
50 55 60
Ala Gly Ala Leu Leu Leu Met Ala Phe Thr Met Val Val Asn Pro Met
65 70 75 80
Thr Leu Gly His Phe Gly Tyr Phe Val Gln Asp Cys Glu Gly Lys Cys
85 90 95
Phe Val Thr Ala Glu Glu Asp Asn Arg Arg Cys Gly Pro Thr Asp Thr
100 105 110
Thr Arg Leu Ile Tyr Thr Arg Ile Pro Lys Thr Gly Ser Thr Thr Val
115 120 125
Tyr Asp Ile Leu His Ser Leu Asn Arg Arg Lys Asn Phe Asn Thr Val
130 135 140
Lys Leu Gly Glu Phe Asp Leu Ala Val Gln Thr Val Asp Ser Lys Thr
145 150 155 160
Asn Ala Gly Thr Ala Gly Tyr Asn Asp Pro Asn Ile Gln Arg Ala Thr
165 170 175
Ala Asn Arg Phe Lys Phe Leu Lys Asp Asn Gly Glu Ala Val Val Phe
180 185 190
Pro Pro Tyr Ala Gly Arg Asn Arg Thr Phe Phe Glu Gly His Val Phe
195 200 205
His Leu Asn Trp Pro Met Ala Leu Leu Met Pro Pro Pro Phe Trp Tyr
210 215 220
Lys Leu Val Pro Glu Pro Ile Leu Glu Tyr Leu His Leu Glu Lys Pro
225 230 235 240
Ser Lys Lys Val Met Glu Asn Thr Ile Glu Phe Ser Val Val Arg Lys
245 250 255
Pro Gln Asp Arg Leu Arg Ser Met Tyr Tyr Tyr Ala Arg Leu His Ala
260 265 270
Arg Ser Glu Thr Trp Arg Gln Ala Tyr Arg Glu Gln Phe Gly Glu Leu
275 280 285
Glu Phe Asp Glu Cys Val Leu Asp Pro Val Cys Ala Glu Lys Asn Glu
290 295 300
Leu Arg Arg Trp Cys Ser Leu Gln Thr Gln Phe Leu Cys Gly Tyr Asp
305 310 315 320
Lys Glu Cys Glu Ser Pro Ser Asp Ala Met Leu Glu Thr Ala Leu Lys
325 330 335
Asn Leu Asn Asp Asn Ile Phe Ile Val Gly Thr Thr Glu Arg Leu Thr
340 345 350
Asp Phe Ile Glu Leu Met Glu Lys Leu Leu Pro Thr Tyr Phe Glu Gly
355 360 365
Ala Thr Glu Leu Ala Lys Val Thr Asn Ser Lys Gln Tyr Thr Asp Thr
370 375 380
Arg Arg Glu Leu Lys Phe Ser Ser Glu Val Gln Ala Val Leu Asp Asp
385 390 395 400
Val Cys Glu Leu Asp Asn Lys Leu Tyr Ala Ala Val Asp Lys Leu Phe
405 410 415
Ser Glu Arg Phe Asp Glu Cys Met Ser Pro
420 425
<210> 18
<211> 524
<212> PRT
<213> 橙壶菌属物种（Aurantiochytrium sp.）
<220>
<221> misc_feature
<223> SFT2，磺基转移酶
<400> 18
Met Pro Trp Leu Val Lys Glu Glu Glu Ser Lys Glu Glu Lys Leu Leu
1 5 10 15
Phe Ile His Val Pro Arg Cys Gly Gly Thr Ser Leu Ile Lys Leu Tyr
20 25 30
Asn Val Glu Ala Lys Cys Arg Arg Val Ser Asn Leu Tyr His Lys Ile
35 40 45
Gly Gln Leu Tyr Phe Phe Tyr Arg Tyr Arg Leu Leu Glu Gln Ser Asn
50 55 60
Phe Pro Ile Lys Ser Phe Glu Asn Leu Tyr Ala Leu Thr Val Phe Ile
65 70 75 80
Thr Ala Thr Ile Val Tyr Phe Ala Val Pro Asp Trp Gly Ile Ala Ala
85 90 95
Cys Ser Trp Asp Arg Trp Cys Pro Pro Pro Ile Ser Ile Ser Phe Trp
100 105 110
Val Cys Gly Phe Ala Thr Phe Phe Met Ser Thr Phe Val Met Ala Ala
115 120 125
Asn Val Met Gly Arg Arg Asp Ile Val Arg Arg Leu Cys Met Trp Ala
130 135 140
Phe Gly Lys Ile Met Phe Gly Phe Gly Gly Ala Pro Gln Tyr Leu His
145 150 155 160
Gly Val Asn Tyr Asp Gly Tyr Leu Met His Tyr Thr Ala Glu Lys Leu
165 170 175
Ile Ser His Lys Phe Ile Lys Pro Ala Asp Leu Gln Asp Ser Phe Ala
180 185 190
Ile Val Arg Asn Pro Phe Ser Arg Met Val Ser Val Tyr Arg Tyr Asn
195 200 205
Gln Ala His Ser Cys Glu Ser Phe Ala His Phe Val Lys Glu Trp Arg
210 215 220
Lys Lys Phe Thr Val Phe Glu Met Thr Gly Ser Thr Glu Glu Trp Asp
225 230 235 240
Val Tyr Cys His Val Leu Pro Met His Ser Phe Thr His Phe Arg Gly
245 250 255
Gln Gln Leu Val Pro Tyr Ile Ile Arg Gln Glu Asp Leu Lys Ile Ile
260 265 270
Lys Arg Arg Asp Gly Gln Glu Thr Asp Leu Tyr Gln Ser Arg Tyr Ala
275 280 285
Asp Leu Pro Glu Lys Val Ile Tyr Ala Leu Thr Asn Met Pro His Ala
290 295 300
Asn Lys Arg Ala Ser Lys Gly Pro Ala Trp Tyr Asp Leu Tyr Asp Gln
305 310 315 320
Glu Thr Met Asp Val Val Leu Glu Met Phe Ala Gln Asp Phe Val Thr
325 330 335
Tyr Gly Tyr Glu Thr Thr Met Pro Lys Arg Asp Asp Leu Lys Pro Lys
340 345 350
Tyr Thr Leu Ala Gln Leu Thr Ala Lys Leu His Pro Ala Asn Val Asn
355 360 365
Lys Pro Ala Lys Lys Asn Thr Ala Ser Ala Ala Thr Met Lys Arg Asn
370 375 380
Lys Thr Val Pro Glu Asp Phe Asp Pro Glu Arg Ile Ile Val Asn Phe
385 390 395 400
Asp Asp Asp Asp Asp His Cys Asp Thr Gly Ser Ser Val Ser Ser Leu
405 410 415
Ser Ala Ser Ser Ala Ser Ser Ser Ser Arg Pro Val Glu Asp Asp Glu
420 425 430
Glu Asp Asp Asp Ala His Asp Arg Ile Ser Ser Glu Asp Ser Ala Gln
435 440 445
Leu Glu Ala His Ile Arg Pro Ala Ser Glu Glu Ile Tyr Val Asn Val
450 455 460
Arg Pro Ala Asp Ala Ser Ser Ala Ser Ala Ser Ala Leu Pro Pro Val
465 470 475 480
Ala Ser Ala Pro Ala Thr Thr Gly Arg Arg Gly Arg Val Gln Asn Glu
485 490 495
Ser Pro Gln Pro Ala Ser Thr Ser Gly Ile Lys Val Ala Ser Ser Phe
500 505 510
Arg Asp Asn Ser Asp Pro Asp Val Ile Thr His Val
515 520
<210> 19
<211> 449
<212> PRT
<213> 橙壶菌属物种（Aurantiochytrium sp.）
<220>
<221> misc_feature
<223> SFT2，磺基转移酶
<400> 19
Met Ser Val Val Glu Arg Arg Leu Arg Asp Glu Ala Glu Ala Lys Ser
1 5 10 15
Leu Glu Gln Gln Gln Arg Leu Arg Gln Cys Thr Val Phe Phe Gly Phe
20 25 30
Phe Ile Leu Phe Leu Ile Ile Tyr Thr Ser Arg Tyr Ala Asp Ser Ile
35 40 45
Thr Glu Gly Val Gly Gly Leu Pro Val Leu Leu Arg Asp Ser Gly Phe
50 55 60
Thr Asn Asn Ser Gln Thr Ser Asp Leu Asp Arg Gly Asp Asp Asn Ser
65 70 75 80
Tyr Gly Thr Ser Ser Asp Ser Asn Glu Gln Pro Glu Asp Thr Thr Thr
85 90 95
Asp Lys Ala Glu Ala Glu Met Leu Thr Ser Lys Leu Ser Ser Phe Gly
100 105 110
Leu Ala Glu Leu Gly Thr Phe Phe Asp Glu Asp Glu Val Lys Arg Asn
115 120 125
Arg Ala Leu Ala Glu Gln Glu Leu Val Ala Leu Ala Ala Glu Asp Ala
130 135 140
Glu Phe Asp Leu Phe Lys Thr Thr Gly Asn Arg Asn Leu Ile Phe Ile
145 150 155 160
Lys Leu His Lys Thr Gly Ser Thr Ser Val Ala Ala Ser Leu Leu Arg
165 170 175
Val Ala Thr Glu Tyr Lys Lys Lys Val Leu Thr Ser His Ser Cys Ser
180 185 190
Asp Ser Lys Asp Tyr Glu Met Tyr Phe Met His Ala Pro Arg Ser Glu
195 200 205
Trp Met Asn Gln Cys Ile Gln Asn Pro Val Tyr Val Thr Val Leu Arg
210 215 220
Glu Pro Met Ser Arg His Val Ser Trp Asn Thr Trp Arg Leu Asn Arg
225 230 235 240
Asn Tyr Phe Ile Asn Leu Pro Ser Arg Gln Cys Asn Tyr Glu Gly Ala
245 250 255
Asn Pro Asp Val Ala Pro Leu Arg Lys Pro Phe Gln Cys Arg Asp Asp
260 265 270
Ala Ala Arg Lys Lys Met Thr Leu Arg Arg Tyr Leu Lys Lys Leu Glu
275 280 285
Leu Thr Asn Pro Ala Ser Arg Pro Cys Glu Ser Cys Asn Trp Leu Asn
290 295 300
Pro Ser Asn Glu Val Ala His Pro Gly Asn Pro Ala Glu Glu Val Ala
305 310 315 320
Arg Ala Glu Gln Val Tyr Ser Met Val Gly Ile Thr Ser Asn Leu Asp
325 330 335
Asp Phe Leu Leu Leu Leu Ala Leu Arg Phe Gly Trp Ser Leu Glu Ser
340 345 350
Ile Leu Tyr Glu Lys Cys Lys Gln Gln Gly Lys Ala Gly Ile Ser Leu
355 360 365
Arg Asp Val Lys Lys Tyr Pro Asp Met Tyr Ala Lys Leu Glu Asn Ile
370 375 380
Thr Thr Arg Glu Ser Ala Val Tyr Asn Pro Phe Glu Ala Lys Phe Lys
385 390 395 400
Ala Tyr Leu Gly Arg Leu Gly Pro Gly Phe Ala Arg Leu Leu Glu Asn
405 410 415
Phe Lys Arg Gly Leu Asn Asn Tyr His Ser Lys Ile Asp Glu Ala Lys
420 425 430
Gly Glu Asn Lys Asp Arg Trp Ile Pro Ala Gly Lys Asn Ser Phe Tyr
435 440 445
Cys
<210> 20
<211> 510
<212> PRT
<213> 橙壶菌属物种（Aurantiochytrium sp.）
<220>
<221> misc_feature
<223> SFT4，磺基转移酶
<400> 20
Met Pro Trp Leu Val Met Asp Glu Val Leu Phe Phe His Val Pro Arg
1 5 10 15
Cys Gly Gly Thr Ser Ile Thr Lys His His Arg Val Gly Tyr Lys Ala
20 25 30
Arg Gln Gly Met Asn Pro Tyr Phe Lys Phe Gly Leu Val Tyr Tyr Tyr
35 40 45
Tyr Arg Tyr Trp Leu Leu Glu Gln Ser Asn Phe Pro Ile Phe Thr Trp
50 55 60
Glu Asn Leu Leu Ala Met Thr Gln Ile Thr Ile Ala Ile Phe Ile Tyr
65 70 75 80
Phe Phe Met Thr Pro Ile Pro Pro Ala Pro Tyr Val Met Trp Thr Met
85 90 95
Ala Ser Leu Thr Phe Thr Met Ser Thr Phe Ile Trp Thr Ala Pro Ile
100 105 110
Thr Met Arg Asn Asn Thr Leu Arg Trp Leu Leu Met Leu Phe Gln Ser
115 120 125
Lys Val Leu Cys Gly Phe Gly Gly Glu Thr Arg Tyr Met Thr Gly Thr
130 135 140
Asn Asp Lys Gly Tyr Leu Phe His Phe Thr Ala Asn Arg Ala Ile Lys
145 150 155 160
Tyr Asn Tyr Val Thr Pro Glu Gln Val Arg Arg Cys Ser Phe Ser Ile
165 170 175
Val Arg Asn Pro Tyr Ser Arg Met Val Ser Met Tyr Glu Tyr Asn Lys
180 185 190
Arg Pro Phe Glu Ser Phe Ser His Phe Val Arg Ala Phe His His Glu
195 200 205
Tyr Trp His Thr Tyr Ile Gly Arg Asn Thr Thr Glu Cys Lys Tyr Val
210 215 220
Tyr Cys His Val Leu Pro Met Phe Glu Tyr Thr His Lys Asn Gly Glu
225 230 235 240
Gln Ile Val Ser Cys Val Ile Lys Gln Glu His Leu Lys Asn Leu Val
245 250 255
Ala Thr Asp Trp Glu Gly Ser Asn Val Pro Glu Pro Ile Gln Arg Ala
260 265 270
Met Thr Gly Ile Pro His Ala Asn Lys Arg Ser Arg Lys Val Ala Trp
275 280 285
Gln Arg Tyr Phe Thr Gln Glu Thr Met Asp Leu Thr Tyr Glu Met Tyr
290 295 300
His Lys Asp Phe Glu Ile Phe Gly Tyr Asp Ile Asp Ile Pro Gly Arg
305 310 315 320
Pro Asp Ile Ser Val Ser Arg Ser Val Leu Glu Ser Ile Arg Gln Asp
325 330 335
Pro Ser Gly Ala Met Arg Gln Gly Ser Asp Val Asp Val Cys Ser Pro
340 345 350
Asn Ala Ser Ser Gly Tyr Ala Arg Val Asp Ala Gly Gly Glu Ser Ser
355 360 365
Arg Arg Val Ala Ile Glu Val Asp Tyr Gln Asp Asp Asp Leu Ser Ala
370 375 380
Pro Val Leu Asn Gly Asp Arg Gln His Gly Glu Ala Asn Gly Ala Ile
385 390 395 400
Pro Thr Val Val Val Met Asn Asp Asp Ala Glu Ala Ile Lys Asp Lys
405 410 415
Gly Ala Thr Ser Thr Gln Lys Glu Asn Glu Glu Asp Glu Gly Glu Glu
420 425 430
Val Glu Ser Lys Glu Ile His Arg Ala Thr Ser Phe Lys Arg Lys Gly
435 440 445
Ser Leu Asp Ile Ala Asn Asn Pro Pro Leu Asp Asn Thr Thr Lys Asn
450 455 460
Gly Ser Asn Glu Asn Gly Ser Ser Arg Ser Phe Gly Arg Ser Ser Leu
465 470 475 480
Arg Ile Met Pro Ala Pro Val Val Ser Glu Ser Glu Leu Ala Ala Arg
485 490 495
Arg Glu Ala Ser Val Phe Val Leu Ser Pro Thr Arg Gln Asn
500 505 510
<210> 21
<211> 462
<212> PRT
<213> 橙壶菌属物种（Aurantiochytrium sp.）
<220>
<221> misc_feature
<223> SFT5，磺基转移酶
<400> 21
Met Asn Val Lys Ser Thr Lys Glu His Gln Lys Ser Pro Gln Ala Arg
1 5 10 15
Ile Arg Glu Ile Leu Val Asn Tyr Arg Ala Leu Ile Ile Gly Ala Trp
20 25 30
Phe Gly Leu Val Ile Tyr Val Ile Met Met Leu Asn Ser Ser Ser Ser
35 40 45
Ser Ile Gln Asn Ile Thr Leu Leu Ile Thr Ser Asn Ser Asp Pro Ala
50 55 60
Leu Ala Asn Ser Ala Glu Ala Glu Glu Ser Phe Tyr Asn Glu Glu Leu
65 70 75 80
Lys Asp Asp Met Leu Glu Glu Gly Ile Ser Ile Thr Pro Ser Lys Thr
85 90 95
Ala Ile Ser Lys Asp Glu Pro Ile Gly Ala Arg Gln Arg Asp Lys Leu
100 105 110
Ala Val Phe Leu His Ile His Lys Gly Gly Gly Ser Thr Met Cys Tyr
115 120 125
Leu Ala Arg Leu Asn Asn Glu Lys Ser Phe Gly Gly Asn Cys Asn Ala
130 135 140
Lys Ser Arg Thr Thr Arg Leu Lys Leu Ala Ser Gly Ser Lys Asp Val
145 150 155 160
Val Glu Asn Thr Tyr Gly Asn Phe Lys Ser Gln Asn Leu Thr Phe Val
165 170 175
Ala Asn Glu Trp Met Leu Val Glu Ser Thr Pro Met Ser Asp Asp Leu
180 185 190
Val Tyr Ile Thr Met Leu Arg Asn Pro Leu Ala Arg Met Glu Ser His
195 200 205
Phe Asp Met Ala Met Asp Gln Gly Leu Gln Arg Leu Met Arg Asn Glu
210 215 220
Glu Leu Tyr Ser Cys Arg Tyr Ala Asp Gly Ile Pro Ser Ala Lys Glu
225 230 235 240
Leu Lys Val Arg Asn Gln Asp Leu Glu Val Ala Ser Arg Ala Arg Thr
245 250 255
Tyr Phe Ala Leu Ser Thr Pro Asp Asn Trp Gln Thr Arg Ala Val Cys
260 265 270
Gly Pro Ala Cys Ala Gln Val Pro Phe Gly Lys Leu Thr Asp Glu His
275 280 285
Leu Asp Ile Ala Lys Arg Arg Leu Glu Ser Thr Phe Ala Val Val Gly
290 295 300
Ile Leu Glu His Phe Val Glu Thr Ile Thr Leu Ile His Asp His Leu
305 310 315 320
Gln Trp Lys Met Lys Pro Glu Lys Asn Phe Met Gln His Lys Gly Thr
325 330 335
Ser His Gly Gly Met Ser Val Leu Glu Arg Val Glu Lys Glu Ser Ala
340 345 350
Lys Arg Pro Glu Leu Leu Ser Phe Ala Arg Trp Phe His Ala Thr Asn
355 360 365
Gln Phe Asp Ile Glu Leu Tyr Asn Phe Ala Arg Tyr Leu Phe Lys Gln
370 375 380
Gln Ala Asp Ala Arg Asn Ile Pro Leu Asp Leu Gly Pro Asp Val Glu
385 390 395 400
Leu Asp Phe Val Ser Pro Asn Gln Lys Thr Thr Lys Ser Ser Lys Leu
405 410 415
Arg Lys Met Leu Ser Asp Tyr Ser Asp Asn Lys Asn Cys Thr Thr Gln
420 425 430
Cys Cys Gly Lys Arg Cys Gly Pro Ile Gly Phe Tyr Trp Tyr Ser Thr
435 440 445
Ala Val Ser Leu Asn Met Val Pro Arg Lys Leu Gly His Cys
450 455 460
<210> 22
<211> 739
<212> PRT
<213> 橙壶菌属物种（Aurantiochytrium sp.）
<220>
<221> misc_feature
<223> SFT6，磺基转移酶
<400> 22
Met Ser Tyr Pro Asn Asn Leu Ser Val Ser Pro Cys Asn Thr Ser Ala
1 5 10 15
Leu Leu Asp Pro Lys Tyr Lys Ala Ala Arg Leu Ile Tyr Gln Gln His
20 25 30
His Pro Lys Arg Arg Ile Thr Leu Tyr Lys Val Ala Phe Tyr Cys Ser
35 40 45
Phe Gly Ala Ile Ile Ala Leu Ile Leu Asn Ala Ser Gln Met Ile Lys
50 55 60
Ile Thr Pro His Glu Ser Ser Ile Asp Ile Thr Leu Tyr Gly Thr Val
65 70 75 80
Met Arg Pro Pro Phe Ser Asp Gly Lys Ser Thr Pro Ser His Thr Lys
85 90 95
Lys Asn Tyr Leu His Lys Ser Ser Asp Val Phe Gln Ser Thr Lys His
100 105 110
Lys Arg Glu Asn Glu Gly Glu Ser Thr Asn Pro Thr Gln Ser Asn Gly
115 120 125
His Ser Glu Ser His Leu Pro Asp Ser Arg Leu Thr Ser Glu Ser Ser
130 135 140
Ser Thr Leu Ile Glu Asp Val Glu Glu Ile Ser Asp Arg Pro Thr Val
145 150 155 160
Ala Pro Asp Asn Met Gly Phe Gln Gln Gln Arg Ser Glu Asn Lys Ile
165 170 175
Gln Thr Ala Asn Thr Lys Val Ser His Ser Asn Ser Glu Arg Val Glu
180 185 190
Phe Ser Ile Ser Asp Asp Asp Val Ser Lys Arg Ile Ala Thr Thr Arg
195 200 205
Gln Val Asp Arg Arg Asn Val Asp Arg Thr Ala Lys Gln Pro Ile Lys
210 215 220
Thr Ser Phe Lys Pro Ala Leu Pro Gln Lys Asp Thr Ser Lys Ile Pro
225 230 235 240
Leu Ala Ser Val Lys Ser Pro Val Ser Pro Ile Lys Thr Ser Ser Leu
245 250 255
Lys Asp Ser Ser Arg Pro Arg Asn Ser Met Val Met Gln Ser Leu Pro
260 265 270
Pro Val Gln Ser Ala Thr Ala Leu Ala Thr Ser Ser Gln Ile Gln Glu
275 280 285
Gln Val Asp Ala Gln Pro Ile Asp Glu Ser Leu Leu Gly Ile Gly Glu
290 295 300
Leu Phe Ala Asp Thr Asp Glu Asn Asp Ser Asp Phe Val Leu Val Leu
305 310 315 320
Pro Lys Glu Glu Glu Arg Glu Asp Ala Tyr Ser Ser Gly Tyr His Arg
325 330 335
Arg Gln Glu Ile Ala Phe Ala Gly Asp Ser Ala Lys Arg Gly Pro Glu
340 345 350
Asn Phe Ser Leu Ala Val Ser Gly Gly Thr Ser Leu Glu Lys Lys Ser
355 360 365
Pro Lys Leu Arg Gly Lys Leu Ala Ile Phe Leu His Ile His Lys Ala
370 375 380
Gly Gly Thr Thr Met Cys Val Met Ala His Tyr Asn Asn Glu Lys Ser
385 390 395 400
Leu Arg Lys Ser Asn Cys Asn Val Asn Asp His Val Asp Arg Arg Glu
405 410 415
Leu Ile Gln Gly Asn Ile Thr Thr Val Asp Arg Ile Leu Glu Lys Tyr
420 425 430
Arg Val Gln Glu Asn Tyr Thr Phe Leu Ala Asn Glu Trp Met Leu Pro
435 440 445
Ala Glu Ile Pro Ala Arg Lys Glu His Met Tyr Leu Thr Met Leu Arg
450 455 460
Asn Pro Leu Ala Arg Met Glu Ser His Phe Phe Met Ala Met Ser Gln
465 470 475 480
Leu Lys Gln Gly Tyr Lys Arg Ser Ile Ser Lys Met Gln Cys Leu Phe
485 490 495
Thr Arg Gly Met Arg Gly Ala Pro Ile Pro Ser Ile Leu Asp Leu Gln
500 505 510
Arg Leu Glu Thr Asn Leu Lys Val Ala Ala Ser Ala Arg Gln Tyr Phe
515 520 525
Ala Met Asn Thr Pro Asp Asn Trp Gln Thr Arg Ser Leu Cys Gly Pro
530 535 540
Ala Cys Ala Glu Val Pro Phe Gly Met Leu Thr Glu Glu His Leu Glu
545 550 555 560
Leu Ala Lys Tyr Arg Leu Ala Ser His Phe Thr Ala Val Gly Ile Leu
565 570 575
Glu His Phe Lys Asp Ser Ile Thr Leu Phe His His Ile Leu His Trp
580 585 590
Arg Arg Asp Val Ser Lys Leu Phe Asn Ser His His Gly Thr His His
595 600 605
Lys Gly Leu Thr Val Leu Glu Thr Ile Glu Lys Ala Ser Met Lys Arg
610 615 620
Pro Lys Leu Leu Thr Phe Ala Lys Trp Phe His Ala Val Asn Ile Tyr
625 630 635 640
Asp Ile Gln Leu Tyr Asn Phe Gly Arg Thr Leu Phe Gln Lys Gln Ala
645 650 655
Ala Leu Ala Gly Ile Glu Val Thr Leu Gly Pro Asn Leu Pro Leu Asp
660 665 670
Tyr Ile Ala Pro Asn Gly Glu Ile Thr Ser Val Lys Asp Leu Thr Gln
675 680 685
Met Leu Thr Asn Ser Val Arg Phe Arg Lys Cys His Thr Gln Cys Cys
690 695 700
Arg Ser Leu Cys Ala Pro Ile Gly Arg Phe Trp Val Ser Thr Ala Leu
705 710 715 720
Lys Leu Asn Leu Val Pro Pro Arg Pro Leu Cys Ser Met Gly Ser Gly
725 730 735
Asn Lys Lys
<210> 23
<211> 496
<212> PRT
<213> 橙壶菌属物种（Aurantiochytrium sp.）
<220>
<221> misc_feature
<223> SFT7，推定的磺基转移酶
<400> 23
Met Pro Trp Leu Ile Lys Ser Leu Ala Arg Arg Leu Ala Asp Gly Glu
1 5 10 15
Ile Ser Ala Gln Glu Leu Ser Thr Lys Asp Arg Glu Pro Asp Ala Val
20 25 30
Ala Ala Val His His Gly Pro Asp Leu Glu Ala Ala Ile Glu Leu Glu
35 40 45
Asp Asp Arg Asp Leu Leu Phe Ile His Val Pro Arg Cys Gly Gly Thr
50 55 60
Ser Leu Thr Lys Leu Tyr Lys Val Pro Tyr Lys Ala Ala Ala His Arg
65 70 75 80
Gly Phe Tyr His Lys Phe Gly Met Lys Tyr Phe Phe Tyr Arg Tyr Gly
85 90 95
Leu Leu Glu Lys Ala Asn Phe Pro Phe Phe Thr Ile Glu Asn Leu Leu
100 105 110
Val Cys Val Ser Leu Gly Ile Ser Thr Ala Leu Trp Tyr Ser Gly Trp
115 120 125
Ile Lys Ser Ile Ser Ala Leu Cys Val Asn Glu Pro Gly Ile Asn Gly
130 135 140
Phe Ser Cys Pro Pro Ser Leu Leu Thr Ile Val Met Tyr Ala Cys Ala
145 150 155 160
Cys Leu Thr Phe Leu Ser Ser Thr Phe Leu Phe Thr Ala Pro Phe Ser
165 170 175
Gly Arg Thr Asp Ile Val Arg Arg Ala Tyr Ala Ile Ile Val Gly Gln
180 185 190
Leu Leu Cys Asn Leu Thr Glu Ala Glu Lys Trp Leu Thr Gly Val Ser
195 200 205
Arg Lys Gly Tyr Val Val His Phe Thr Leu Ala Lys Cys Ile Lys Tyr
210 215 220
Gly Phe Val Gln Arg Asn Glu Leu Ala Thr Leu Glu Ser Phe Ser Val
225 230 235 240
Ile Arg Asn Pro Tyr Ser Arg Met Val Ser Ile Tyr Met Tyr Asn Arg
245 250 255
Phe Gly Pro Leu Glu Ser Phe Glu His Phe Val Glu Cys Trp Phe Lys
260 265 270
Lys Trp Lys Leu Tyr Lys Glu Thr Gly Asp Thr Glu Glu Trp Asn Ile
275 280 285
Tyr Cys His Val Leu Pro Met Phe Glu Phe Thr His Glu Lys Gln Lys
290 295 300
Gln Ile Ile Gly Cys Val Val Lys Gln Glu Ser Leu Arg Asp Ile Thr
305 310 315 320
Asn Gly Ala Leu Asn Glu Cys Phe Arg Asn Asp Arg Ile Ser Thr Ile
325 330 335
Pro Pro Arg Val Leu Gln Ala Leu Lys Asp Met Pro His Ser Asn Arg
340 345 350
Arg Lys Arg Ser Lys Pro Trp Gln Asp Tyr Tyr Asn Arg Arg Thr Val
355 360 365
Arg Leu Val Tyr Glu Met Tyr Lys Glu Asp Phe Arg Ile Phe Gly Tyr
370 375 380
Asp Lys His Val Pro Gly Arg Ala Asp Leu Asp Glu Ala Leu Gly Lys
385 390 395 400
Asp Asn Phe Asp Val Asn Ser Asp Phe Ile Asp Asp Leu Pro Pro Gln
405 410 415
Thr Glu Ala Glu Met Tyr Ala Ser Gly Arg His Ile Arg Gly Pro Asp
420 425 430
Pro Val Ser Arg Ser Ser Arg Ser Ile Met Pro His Asp Asn Leu Val
435 440 445
His Ala Gly Met Leu Pro Ala Ser Ala Ser Ala Val Ser Thr Ser Ser
450 455 460
Thr Ser Ser Ala Ser Thr Ala Ser Thr Glu Pro Pro Ala Arg Ser Phe
465 470 475 480
Gly Gly Arg Arg Asn Arg Arg Ser Thr Gly Ser Val Thr Pro Ser Leu
485 490 495
<210> 24
<211> 546
<212> PRT
<213> 橙壶菌属物种（Aurantiochytrium sp.）
<220>
<221> misc_feature
<223> SFT8，推定的磺基转移酶
<400> 24
Met Ser Ile Glu Ile Leu Ala Met Glu Thr Asn Glu Leu Arg Gly Thr
1 5 10 15
Asp Ser Thr Pro Asp Lys Asp Gly Ile Arg Glu Leu Lys Lys Asp Ala
20 25 30
Glu Gln Ala Ile Gly Asp Ala Glu Glu Gly Leu Gly Arg His Ala Lys
35 40 45
Lys Leu Gln Gly Arg Pro Gln Gln Trp Arg Met Glu Ala Phe Ser Lys
50 55 60
Val Ala Gly Gly Val Arg Val Ala Ala Arg Asp Glu Ala Cys Leu Cys
65 70 75 80
Gly Met Glu Ser Pro Pro Arg Ser Gly Ser Ser Ser Tyr Glu Ala Trp
85 90 95
Thr Asp Glu Asp Asp Lys Glu Lys Lys Pro Arg Gln Asn Leu Leu Lys
100 105 110
Ser Arg Glu Thr Trp Phe Leu Ala Ala Leu Leu Val Val Ala Thr Val
115 120 125
Ile Ile Val Trp Leu Met Gly Pro Phe Thr Ser Met Asp Ser Ile Thr
130 135 140
Pro Ser Thr Arg Gly Tyr Leu Ser Ser Val Lys Ile Val Thr Glu Ser
145 150 155 160
Lys Glu Asn Thr Gly Tyr Thr Glu Asp Thr Glu Glu Ala Gly Thr Ala
165 170 175
Thr Asn Ile Lys Ser Asp Ser Leu Thr Leu Gln Lys Leu Ser Ser Val
180 185 190
Arg Asp Gly Ile Lys Asn Arg Cys Pro Lys Gly Ser Ile Ile His Phe
195 200 205
Leu Phe Pro His Val Asn Lys Ala Gly Gly Arg Ser Met Glu Ala Thr
210 215 220
Phe Gly Ser Asp Ala Arg Ser Arg Val Phe Pro Arg Glu Arg Tyr Leu
225 230 235 240
Tyr His Gly Pro Arg Ser Arg Thr His Lys Phe Arg Leu Thr Asp Ser
245 250 255
His Arg Ser Tyr Thr Gln Leu Ala Phe Asn Phe Gly Trp Asn Asp Ser
260 265 270
Val Lys Glu Leu Asp Ala Asn Ser Leu Glu Phe Thr Ser His Lys Asn
275 280 285
Cys Leu Arg Trp Met Phe Gly Met Arg Asp Pro Val Ser Arg Met Val
290 295 300
Ser Ala Phe Tyr Ala Ile Thr Gly Arg Thr Ile Ser Ser Pro Lys Tyr
305 310 315 320
Gly Lys Lys Pro Gly Pro His Gly Ala Arg His Phe Glu His Phe Ser
325 330 335
Cys Tyr Asp Lys Ser Val Gly Ser Lys Arg Leu Leu Asp Pro Asp Phe
340 345 350
Thr Ile Glu Glu Trp Ala Arg Leu Pro Leu Glu Glu Arg Glu Arg Cys
355 360 365
Ser Pro Ser Phe Asn Leu His Val Arg Tyr Leu Ala Pro Glu Tyr Pro
370 375 380
Asp Asp Thr Pro Glu Gln Leu Glu Val Ala Lys Ala Arg Leu Ala Ser
385 390 395 400
Ile Ser Trp Phe Tyr Ile Ile Glu Arg Met Gln Glu Ser Trp Gln Leu
405 410 415
Phe Ser Tyr Val Tyr Gly Thr Asp Phe Val Thr Tyr Thr Pro Thr Phe
420 425 430
Asn Leu Asn Glu Tyr Ser Lys Glu Leu Ser Asp Thr Ala Arg Arg Ala
435 440 445
Leu Glu Glu His Asn Lys Tyr Asp Ile Glu Leu Tyr Gln Tyr Ala Val
450 455 460
Gln Leu Phe Glu Glu Arg Ile Gln Ile Met Asn Arg Asp Pro Thr Asp
465 470 475 480
Pro Phe Phe Lys Pro Tyr Ser Phe Glu Cys Asp Thr Glu Gln Ile Cys
485 490 495
Trp Ser Lys Asn Asp Ala Arg Thr Phe Trp Pro Val Ser Glu Ala Ser
500 505 510
Trp Glu Lys His Tyr Ala Thr Pro Ala Ala Ala Lys Phe Leu Gln Leu
515 520 525
Cys Thr Ala Thr Arg Gly Cys Trp Arg Asn Asp Ala Lys Asp Lys Pro
530 535 540
Phe Pro
545
<210> 25
<211> 611
<212> PRT
<213> 橙壶菌属物种（Aurantiochytrium sp.）
<220>
<221> misc_feature
<223> SFT9，推定的磺基转移酶
<400> 25
Met Phe Arg Asn Gln Ser Asp Thr Ser Arg Ser Met Ser Gln Ala Asp
1 5 10 15
Gly Asp Ser Gln Glu Asp Val Arg Leu Val Pro Asn Gly Glu Glu Lys
20 25 30
Pro Arg Thr Pro Leu Gly Ser Val Gly Ile Ser Ser Arg Ser Ser Ser
35 40 45
Pro Arg Ala Leu Thr Pro Ser Gly Gly Ser Thr Leu Ala Ser Gln Ser
50 55 60
Asn His Val Asp Arg Ser Pro Arg Arg Ser Gln Leu Ile Asp Asp Gly
65 70 75 80
His Gly Ser Pro His Ala Met Ser Gln Gln Arg Ala Gln Gln Gln Leu
85 90 95
Asn Gly Ser Ala Gly Leu Trp Ser Phe Arg Val Phe Ala Ile Gly Leu
100 105 110
Leu Val Val Ser Gly Ile Ala Leu Phe Gly Met Ser Ser Ser Met Ser
115 120 125
Met Asp Lys Thr Val Asp Glu Asn Glu Val Asp Ala Ile Arg Gly Ile
130 135 140
Pro Ser Ser Ser Trp Thr Ala Leu Gly Gly Ser Leu Ser Ala His Ser
145 150 155 160
Lys Asn Glu Val Pro Thr Leu His Asp Ser Val Lys Lys Asp Glu Phe
165 170 175
Asp Asn Thr Asn Ile Lys Lys Ala Asp Asn Glu Val Asp Glu Lys Glu
180 185 190
Ser Ser Asn Asp Gly Asn Gly Asp Arg Gly Gly His Ser Gly Pro Ile
195 200 205
Gly Asn Ser Glu Leu His His Asp Glu Lys Lys Asn Asn Asp Asn Tyr
210 215 220
Tyr Ser Ser Asp Glu Asn Thr Arg Ala Arg Lys Ser Gly Lys Glu His
225 230 235 240
His Val Asp His Asp Lys Ser Asn Ser Glu Ile Gly Asp Leu Thr Glu
245 250 255
His Gly Ser Ala Gln Ile Asp Ala Lys Asp Ala Pro Gly Val Ser Arg
260 265 270
Ile Arg Tyr Gly Pro Lys Thr Ile Ala Lys Cys Lys Ala Gly Leu Arg
275 280 285
His Gly Phe Ser Val Arg Glu Asp Pro Cys Leu Lys Thr Gly Phe Ser
290 295 300
Lys Lys Cys Gly Cys Gly Ser Lys Phe Thr Tyr Gln Ile Pro Glu Ala
305 310 315 320
Pro Asp Ser Ser Lys Ala Leu Thr Ala Lys Asp Phe Arg Glu Asn Val
325 330 335
Val Tyr Ser Tyr Val His Val Asn Lys Ala Gly Gly Gln Thr Met Lys
340 345 350
Ser Ile Leu Met Asp Ala Ile Glu Ile Gly Glu Trp Ser Ala Ala Gly
355 360 365
Ile Gly Thr Phe Pro Gly Trp Gln Ala Val Phe Lys Pro Asp Asp Glu
370 375 380
Asp Arg Lys Ser Ala Pro Val Tyr Val Cys Gly Gly Leu His Ser Arg
385 390 395 400
Glu Val Leu Pro Asp Pro Thr Gln Ile Gly Glu Cys Pro Thr Arg Ala
405 410 415
Val Trp Gly Ser Leu Ser Met Gly Leu Cys Glu Leu Phe Pro Asp Arg
420 425 430
Pro Cys Ile Tyr Phe Thr Thr Val Arg Asp Pro Ile Lys Arg Ala Ile
435 440 445
Ser Glu Tyr Asn Tyr Phe Cys Val Leu Gly Glu Glu Gly Arg Lys Lys
450 455 460
Trp Leu Pro Glu Trp Lys Arg Asp Gly Glu Cys Pro Val Asn Ile Tyr
465 470 475 480
Glu Tyr Phe Met Met Gly Arg Thr Pro Ala Asn Phe Leu Lys Leu Arg
485 490 495
Leu Thr Arg Gly Cys Asp Glu Lys Cys Gly Ile Asp Val Ala Lys Ala
500 505 510
Asn Leu Ala His Pro Cys Leu Arg Tyr Ile Val Leu Glu Asp Phe Lys
515 520 525
Asn Asp Ile Lys Arg Phe Ala Asp Gln Val Pro Gly Ala Leu Ser Lys
530 535 540
Ala Leu Gln Lys Ala Tyr Asp Glu Glu Thr His Met Asn Lys Ser Glu
545 550 555 560
Leu His Pro Arg Val Glu Glu Gln Ile Gln Asp Lys Glu Leu Met Ala
565 570 575
Lys Leu Ala Ser Leu Phe Glu Asp Asp Ile Val Ile Tyr Asn Tyr Ala
580 585 590
Leu Ser Ile Arg Asn Lys Lys Trp Ser Thr Pro Ile Gln Ala Cys Pro
595 600 605
Ala Pro Pro
610
<210> 26
<211> 554
<212> PRT
<213> 橙壶菌属物种（Aurantiochytrium sp.）
<220>
<221> misc_feature
<223> SFT10，推定的磺基转移酶
<400> 26
Met Pro Trp Leu Val His Asp Glu Glu Lys Pro Glu Asp Asp Leu Leu
1 5 10 15
Phe Val His Val Pro Arg Cys Gly Gly Thr Ser Leu Thr Lys His Phe
20 25 30
Glu Val Ala Lys Lys Ser Arg Lys Gly Leu Gly Pro Trp Arg Lys Phe
35 40 45
Gly Met Leu Tyr Trp Trp Tyr Arg Tyr Arg Leu Leu Glu Asn Ala Asn
50 55 60
Phe Pro Leu Val Thr Ile Glu Asn Gly Ile Phe Ile Leu Gln Tyr Val
65 70 75 80
Ile Ala Ile Ile Leu Phe Thr Thr Ile Pro Ala Tyr His Asn Asp Glu
85 90 95
Asp Cys Asp Pro Ser Thr Glu Asn Cys Gly Asn Gly Ile Ala Ala Tyr
100 105 110
Thr Leu Phe Ser Ser Gly Ala Met Met Phe Leu Thr Ser Thr Phe Leu
115 120 125
Ala Thr Ala Pro Ile Ile Gly Arg Gln Thr Phe Trp Arg Arg Ala Tyr
130 135 140
Ala Leu Phe Ile Thr Tyr Val Leu Cys Asn Trp Thr Gly Cys Glu Lys
145 150 155 160
Trp Leu Val Gly Cys Asn Ile Lys Gly Trp Phe Val His Phe Thr Ala
165 170 175
Ala Lys Met Leu Lys His Gly Ser Ile Lys Glu Ser Asp Leu Glu Asn
180 185 190
Ser Phe Ala Ile Val Arg Asn Pro Tyr Ser Arg Met Val Ser Val Tyr
195 200 205
Met Tyr Asn Arg Phe Gly Pro Leu Glu Ser Phe Lys Ser Phe Thr Lys
210 215 220
Arg Trp Cys Lys His Lys Leu Lys Lys Tyr His Glu Thr Gly Ser Thr
225 230 235 240
Ser Glu Trp Asp Val Tyr Cys His Ala Leu Pro Met Phe Glu Phe Thr
245 250 255
His Leu Asp Gly Glu Gln Ile Val Lys Cys Ile Ile Lys Gln Glu Glu
260 265 270
Leu Arg Thr Leu Trp Tyr Pro Gly Leu Thr Ile Arg Ser Arg Arg His
275 280 285
Gln Lys Arg Leu Ala Glu Ile Pro Pro Lys Val Ala Glu Ala Leu Gln
290 295 300
Gly Met Pro His Ala Asn Ser Arg Lys Arg Ser Lys Pro Trp His Asp
305 310 315 320
Tyr Tyr Asp Gln Glu Leu Val Asp Leu Val Ala Thr Thr Tyr Ala Leu
325 330 335
Asp Phe Phe Tyr Phe Gly Tyr Asp Ile Asn Val Pro Asn Arg Pro Asp
340 345 350
Leu Lys Pro Pro Pro Ile Glu Pro Pro His Asp Val His Pro Phe Ser
355 360 365
Ser Asn Leu Asp Phe Ser Ile Tyr Lys Asp Gln Asp Leu Thr Ala Leu
370 375 380
Ala Arg Arg Pro Ser Ser Gln Phe Ser Val Ser Ser Ser Pro Tyr Asp
385 390 395 400
Ser Arg Arg Asp Ser Val Ser Ser Asp Phe Ser Thr Lys Lys Ser Pro
405 410 415
His Gly Pro Ser Thr Ala Thr Arg Asn Arg Gln Gly Ser Ser Phe Ser
420 425 430
Arg Asp His Asp Ile Ser Glu Asp His Val Cys Val Glu Val Pro Gln
435 440 445
Gln Gln Leu Gln Gln His Thr Ser Ser Lys Val Leu Met Glu Glu Glu
450 455 460
Glu Gly Val Ser Arg Glu Pro Ser Leu Ser Ser Lys Ser Thr Ser Ala
465 470 475 480
Glu Leu Thr Glu His Val Val Pro Val Pro Glu Asn Leu Leu Cys Gly
485 490 495
Ser Asp Glu Ser Pro Ser Ser Gly Ser Ser Gly Gln Pro Gly Gln His
500 505 510
Ile Ser Pro Ile Ala Gln Gln Glu Lys Ser Pro Pro Val Gln Thr Ser
515 520 525
Ala Ala Ala Arg Leu Glu Asn Asp Ala Glu Gly Lys Glu Thr Glu Gln
530 535 540
Asn Gly Thr Gly Ala Ser Leu Thr Glu Thr
545 550
<210> 27
<211> 806
<212> PRT
<213> 橙壶菌属物种（Aurantiochytrium sp.）
<220>
<221> misc_feature
<223> SFT11，推定的磺基转移酶
<400> 27
Met Met Ile Val Ser Ser Thr Gly Arg Ala Leu Leu Ala Leu Ala Leu
1 5 10 15
Leu Cys Val Leu Val Val Val Leu Asn Leu Ser Met Thr Val Met Glu
20 25 30
Pro Lys Leu Asp Glu Glu Val Leu Lys Val Asn Glu Ala Ala Trp Leu
35 40 45
Asn Arg Phe Gln Leu Thr Val Pro Glu Pro Ser Val Lys Pro Arg Glu
50 55 60
Thr Gly Ser Gly Thr Asn Val Lys Ala Pro Ile Val Leu Val Leu Gly
65 70 75 80
Ile Gly His Gln Leu Cys Glu Ala Val Ala Gly Ser Phe Thr Ala Asn
85 90 95
Arg Glu Asn Leu Arg Gln Val Ile Arg Glu Asp Glu Ile Ser Ala Ser
100 105 110
Lys Tyr Thr Leu Glu Ala Val His Thr Ile Ala Lys Tyr Leu Gly Ser
115 120 125
Gln Ala Gln Thr Ile Leu Pro Arg Pro Ala Asp Leu Pro Gln Glu Val
130 135 140
Ala Glu Ser Ala Thr Val Ala Ile Thr Arg Leu Leu Asp Glu Leu Ala
145 150 155 160
Ser Ser Gln Met Thr Val Val Ala Val Ile Pro His Leu Val Phe Leu
165 170 175
Trp Pro Ile Val Glu Gln Gln Leu Arg Leu Arg Lys Leu Glu His Val
180 185 190
His Pro Ile Ile Val Val Glu Asp Gly Leu Ala Ser Ser Leu Arg Asp
195 200 205
Asn Ser His Phe Ile Asp Ala Val Gly His Ala Met Val Asn Glu Arg
210 215 220
Ile Leu Asp Thr Leu Cys Leu Met Arg Val Arg Pro Phe Asp Ile Glu
225 230 235 240
Gly Gly Thr Ala Ser Asn Leu Arg Ser Ala Val Met Gln Asp Arg Ile
245 250 255
Arg Leu Ala Pro Thr Val Asn His Asn Asn Val Glu Lys Ser Pro Cys
260 265 270
Gln Val Thr Glu Leu Ala Ser Met Arg Asn Ala Ile Ile Trp Ser Lys
275 280 285
Leu Met Arg Ser Leu Ala Leu Leu Ser Leu Asp Ser Met Asn Gln Ile
290 295 300
Pro Leu Leu Arg Ile Pro Thr Glu Asn Val Cys Gly Phe Leu Lys Glu
305 310 315 320
Asn Ile Val Phe Val Ser Ser Gly Thr Ser Ser Pro Leu Glu Ser Pro
325 330 335
Ser Ser Thr Ile Asn Glu Asp Gln Arg Lys Lys Asn Asp Arg Lys Arg
340 345 350
Arg Lys Arg Ala Asp Arg Ser Pro Glu Glu Gly Glu Ala Lys Ser Ala
355 360 365
Cys Glu Phe Leu Gly Gln Asp Val Asp Glu Ser Lys Thr Leu Ser Lys
370 375 380
Ala Phe Leu Gln Asp Leu Asp Leu Leu Leu Asp Pro Glu Val Met Ser
385 390 395 400
Ser Phe Lys Phe Glu Thr Pro Val Ser Ser Arg Arg Val Leu Pro Asn
405 410 415
Pro Val Leu Glu Ser Leu Ser Asn Asp Arg Ile Asp Ala Gly Tyr Cys
420 425 430
Val Glu Gln Ala Asn Leu Lys Lys Leu Ser Met Glu Lys Arg Thr Ser
435 440 445
Leu Val Phe Pro Val Ala His Cys Leu Pro Ser Phe Leu Leu Ile Gly
450 455 460
Ala Gln Lys Ala Gly Thr Asp Glu Leu Ala Val Trp Leu Asn Gln Leu
465 470 475 480
Phe Tyr Ala Arg Arg Leu Asp Gly Gly Val Glu Ile His Phe Phe Asp
485 490 495
Cys Leu Gly Arg Gly Lys Gly Trp Asn Arg Ser Pro Cys Ser Arg Ala
500 505 510
Arg Arg Pro Lys Met Leu Tyr Asp Ser His Ala Gly Met Glu Asn Leu
515 520 525
Thr Ile Ala Arg Glu Asn Gly Gln Lys Leu Ala Phe Ala Trp Asn Asp
530 535 540
Leu Arg Lys Glu Ser Asn Tyr Val Ser Ser Trp Trp Glu Lys Tyr Leu
545 550 555 560
Glu Leu Gly Asn Met Phe Tyr Thr Gly Tyr Lys Arg His Ala Met Thr
565 570 575
Phe Glu Lys Thr Pro Ala Tyr Met Asp Leu Gly His Pro Met Asp Met
580 585 590
Met Arg Met Leu Pro Ser Ala Lys Leu Ile Phe Met Leu Arg Asp Pro
595 600 605
Val Gln Arg Phe Ile Ser Ser Tyr Phe Gln Met Cys Ser Gly Met Tyr
610 615 620
Gln Thr Val His Asn Cys Thr Tyr Pro Asp Met Gln Gln Arg Phe Glu
625 630 635 640
Thr Leu Ser Ala Asp Phe Asp Pro Thr Ala Thr Asp Arg Phe Asp Gln
645 650 655
Asn Ser Val Asp Phe Phe Val His Arg Gly Ile Ala His Ser Leu Tyr
660 665 670
Ser Tyr Trp Leu Met Lys Trp Arg Ala Ala Phe Pro Asp Gln Gln Ile
675 680 685
Met Ile Val Phe Ser Glu His Phe Arg Val Phe Pro Gln Gly Val Ile
690 695 700
Phe Ala Ile Glu Ser Phe Leu Gly Leu Thr Glu Ser Arg Gln His His
705 710 715 720
Gln Phe His Pro Ile Lys Thr Asn Lys Gly Tyr Tyr Val Leu Gly Gly
725 730 735
Tyr Ser Lys Ala Asn Asn Pro Ser His Lys Glu Ala Pro Pro Ala Asp
740 745 750
Leu Leu Gln Gln Leu Gln Ala Phe Phe Asn Pro Tyr Ser Val Gln Leu
755 760 765
Arg Asn Leu Ile Glu Asn Ser Asp Ile Val Tyr Lys Pro Gln Gln Gln
770 775 780
Val Pro Gly Lys Tyr Asn Ser Asp Phe Ser Phe Pro Glu Trp Leu Val
785 790 795 800
Pro Ala Ser Ser Thr Leu
805
<210> 28
<211> 415
<212> PRT
<213> 橙壶菌属物种（Aurantiochytrium sp.）
<220>
<221> misc_feature
<223> SFT12，推定的磺基转移酶
<400> 28
Met Ser Phe Val Glu His Asn Ser Pro Val Glu Pro Phe Thr Asn Asp
1 5 10 15
Arg Glu Gln Leu Leu Ser Asp Lys Thr Ile Ser Val Leu Val Asp Thr
20 25 30
Asn Ser Ser Ala Thr Arg Asp Ile Pro Gln Asn Leu Thr Arg Arg Leu
35 40 45
Gly Tyr Phe Leu His Ile His Lys Gly Gly Gly Thr Ser Val Cys Lys
50 55 60
Ser Met Lys Ala Tyr Gly Glu Asn Thr Tyr Lys Gly Asn Cys Asn Met
65 70 75 80
Gly Glu Pro His Ser Arg Ala Asn Leu Ala Ser Gly Ser Leu Ala Thr
85 90 95
Gln Lys Lys Leu Phe Asp Arg Met Leu Gly Ile Gly Arg Thr Phe Val
100 105 110
Ala Asn Glu Trp Met Leu Pro Ser Gln Ile Leu Lys Gln Pro Gly Leu
115 120 125
Val Tyr Ile Thr Leu Leu Arg Asn Pro Leu Ala Arg Thr Glu Ser His
130 135 140
Tyr Ala Met Ala Met Lys Gln Ala Ile Ser Lys Ile Glu Ser Asp Ser
145 150 155 160
Leu Tyr Ala Ser Cys Leu Trp Gly Pro Gln Leu Pro Asp Tyr Lys Thr
165 170 175
Ile Ser Ser Lys Arg Pro Arg Glu Ser Ser Arg Asn Arg Ile Tyr Phe
180 185 190
Ala Arg Asn Ser Pro Asp Asn Trp Gln Thr Arg Ala Leu Cys Gly Thr
195 200 205
Pro Cys Ala Ala Val Pro Phe Gly Ala Leu Arg Lys Lys His Leu Thr
210 215 220
Ile Ala Lys Lys Asn Leu Val Arg Val Phe Asp Ala Val Gly Ile Leu
225 230 235 240
Glu Gln Tyr Ser Glu Ser Met Asn Leu Phe Arg Asn Val Leu Gln Ile
245 250 255
Glu Val Asn Asn Thr Glu Asp Leu His Leu Gly Thr His His Ser Gly
260 265 270
Glu Ser Phe Val Asp Ala Ala Ile Gly Lys Ala Val Asn Ser Thr Ser
275 280 285
Val Val Asn Phe Leu Gln Trp Phe Tyr Ala Val Asn Leu Leu Asp Ile
290 295 300
Gln Leu Tyr Asn Phe Gly Arg Ile Leu Phe Lys Gln Gln Met Met Tyr
305 310 315 320
Tyr Leu Asn Thr Asp Val Asp Thr Gly Pro Ser Leu Ser Ser Asn Leu
325 330 335
Thr Leu Pro Asn Gly Val Thr Tyr Ser Asn Gln Phe Leu Ser Arg Leu
340 345 350
Leu Gln Asn Tyr Val Lys Lys Ser Lys Cys Thr Thr Thr Cys Cys Gly
355 360 365
Leu Cys Ala Pro Ile Gly His Phe Trp Arg Gly Val Ala Tyr Arg Ile
370 375 380
Asp Met Ile Pro Thr Pro Pro Glu Cys Tyr Pro Thr Thr Glu Pro Pro
385 390 395 400
Val Met Asp Pro Glu Asp Pro Glu Pro His Val Ser Ser Phe Val
405 410 415
<210> 29
<211> 386
<212> PRT
<213> 橙壶菌属物种（Aurantiochytrium sp.）
<220>
<221> misc_feature
<223> SFT13，推定的磺基转移酶
<400> 29
Met Glu Arg Tyr Ser Leu Ala Ser Leu Val Gly Ala Leu His Ser Pro
1 5 10 15
Thr Asp Glu Thr Ile Arg Pro Leu Asp Glu Asn Arg Glu Lys Ile Phe
20 25 30
Phe Val Arg Ile Gln Lys Thr Gly Ser Lys Ser Leu Glu Tyr Ser Leu
35 40 45
Arg Arg Asn Val Gln Phe Leu Ser Gly Val Cys Gly Ser Lys Phe Asn
50 55 60
Asn Lys His Lys Trp Leu Gly Ala Asn Pro Asp Thr Cys Val Glu Arg
65 70 75 80
Gly Leu Glu Val Val Arg Ser Asp Val Arg Cys Leu Thr Ala His His
85 90 95
Cys Asp Phe Val Ser Ala Lys Thr Thr Ser Met Glu Ser Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Arg Tyr Val Ser Leu Ile Arg His Pro Val Val Arg Thr Leu Ser
115 120 125
Glu Ala Arg Val Gly Cys Ala Ser Val Tyr His Lys Gly Ala Arg Lys
130 135 140
Arg Lys Gly Pro Thr Ser Gly Thr Asn Asn Ser Pro Arg Ala Trp Asp
145 150 155 160
Tyr Ala Tyr Asp Arg Leu Ser Val Val Gln Pro Val Phe Asp Cys Thr
165 170 175
Asp Asp Ser Phe Met Val His Phe Ile Thr Arg Pro Glu His Ser Lys
180 185 190
Gly Met Val Met Arg Gln Thr Lys Met Leu Thr Gly Trp Asn Leu Pro
195 200 205
Gly Asn Met Glu Gln Ser Ile Asp Asn Tyr Thr Phe His Ala Met Lys
210 215 220
Ser Leu Asp Ser Gly Glu Arg Asn Asn Ala Ala Asn Ile Ala Ile Gly
225 230 235 240
Val Ile Asp Ala Glu Leu Asp Ile Val Met Val Thr Glu Leu Tyr Gln
245 250 255
Leu Ser Ile Ala Val Leu His Arg Arg Leu Gly Tyr Asp Ile Pro Ser
260 265 270
Tyr Tyr Glu Glu Val Arg Glu Arg Asn Glu Glu Gly Ser Ile Arg Phe
275 280 285
Gly Lys Glu Ser Lys Ser Trp Lys Val Ala Glu Tyr Met His Arg Glu
290 295 300
Glu Leu Leu Val Tyr Lys Ala Ala Ile Ile Arg Leu Ile Ser Asp Ala
305 310 315 320
Ile Gln Leu Lys Leu Thr Pro Ser Pro Asp Glu Val Lys Tyr Ile Leu
325 330 335
Ser Gln Val Pro Ser Arg Leu Val Pro Asp Glu Trp Thr Gly Arg Arg
340 345 350
Leu Pro Ser Tyr Arg Tyr Met Cys Arg Ile His Thr Lys Arg Pro Tyr
355 360 365
Asn Arg Leu Gly Tyr Tyr Val Asp Arg Ile Cys Thr Leu His Thr Pro
370 375 380
Val Val
385
<210> 30
<211> 472
<212> PRT
<213> 橙壶菌属物种（Aurantiochytrium sp.）
<220>
<221> misc_feature
<223> SFT14，推定的磺基转移酶
<400> 30
Met Ser Glu Tyr Asn Asp Ala Arg Asn Ala His Arg Pro Pro Trp Arg
1 5 10 15
Ser Pro Ala Arg Thr Pro Leu Leu Val Leu Ser Leu Leu Cys Ile Leu
20 25 30
Ala Ile Val Ala Thr Gln Thr Leu Thr Met Asp Ala Ser Ala Leu Ala
35 40 45
Thr Leu Gly Glu Pro Leu Gln Ser Glu Ser Ala Ile His Leu Asn Val
50 55 60
Gln Lys Ile Ile Asn Thr Leu Asp Thr Ile Asp Ala Thr Cys Lys Glu
65 70 75 80
Thr Ser Lys Ile Ser Glu Val Asp Gln Asp Pro Cys Tyr Ser Pro Ala
85 90 95
Leu Arg Thr Glu Ile Arg Arg Cys Asn Cys Arg Ser Ser Met Leu Glu
100 105 110
Ala Asn Ser Val Thr Tyr Met Ile Asp Val Lys Thr Pro Gln Phe Ser
115 120 125
Ser Val Glu Arg Val Ser Leu Asp Glu Glu Thr Ile Ala Asn Arg Leu
130 135 140
Met Ile Ser Phe Ile His Ile Asn Lys Ala Gly Gly Ser Thr Ile Lys
145 150 155 160
Lys Asp Val Ile Phe Pro Ser Leu Ala Glu His Lys Trp Asp Gly Ala
165 170 175
Gly Leu Gly Thr Phe Arg Gly Trp Gln Ser Leu Gly Asn Pro Trp Asn
180 185 190
Ser Arg Arg Thr Leu Ser Tyr Met Asn Ser Ile Ile Ala Thr Ala Gly
195 200 205
Asn Glu Lys Gly Met Thr Ile Glu Glu Gln Gly Leu Gly Gly Arg Arg
210 215 220
Ser Leu Val Ser Gly His Asp Thr Ser Gly Phe Gly Gly Asn Glu Phe
225 230 235 240
Phe Gly Asp Gly Gly Ser Glu Pro Leu Tyr Ile Arg Cys Gly Lys Leu
245 250 255
Gln Pro Asn Pro Lys Asn Ser Phe Glu Ala Glu Asn Arg Glu Ser Gly
260 265 270
Cys Pro Leu Arg Ala Ile Trp Gly Ser Met Thr Met Gly Leu Cys Asp
275 280 285
His Phe Pro Gly Arg Pro Cys Ser Tyr Leu Val Ile Leu Arg Asp Pro
290 295 300
Leu Glu Arg Ala Ile Ser Asn Tyr Asn Tyr Val Cys Ile Gln Gly Ala
305 310 315 320
Glu Gly Arg Lys Lys Trp Arg Pro Asp Trp Arg Lys Gln Gly Phe Cys
325 330 335
Pro Leu Asp Ile Arg Glu Phe Phe Glu Val Gly Leu Gly Glu Pro Asn
340 345 350
Phe Leu Leu Trp Arg Leu Thr Arg Gly Cys Asp Thr Gly Cys Gly Ala
355 360 365
Gln Ala Ala Ile Lys Asn Leu Ala His Pro Cys Thr Arg Phe Leu Leu
370 375 380
Leu Glu Glu Leu Gln Asp Gly Leu Leu His Leu Glu Gln Glu Leu Gly
385 390 395 400
Ser Ala Tyr Gly Thr Ala Leu Arg Thr Val Arg Glu Thr His Ala Thr
405 410 415
Ala Asn Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Arg Ile Glu Thr Gln Leu Ala Asn
420 425 430
Glu Thr Leu Met Glu Tyr Leu Arg Glu Arg Leu Lys Asp Asp Ile Ile
435 440 445
Ile Tyr Glu Ala Ala Lys Lys Leu Tyr Lys Glu Gln Trp Asn Gln Pro
450 455 460
Leu Gln Ser Cys Asn Ser Phe Met
465 470
<210> 31
<211> 870
<212> PRT
<213> 橙壶菌属物种（Aurantiochytrium sp.）
<220>
<221> misc_feature
<223> SFT15，推定的磺基转移酶
<400> 31
Met Gln Arg Arg Arg His Gly Asp Leu Asp Thr Asn Asn Gly Asp Asp
1 5 10 15
Ala Gly Asp Val Val Val Met Asp Ser Ile Ser Ala Ser Thr Thr Pro
20 25 30
Gln Glu Pro Asn Glu Ser Ala Pro Leu Met Asn Ala Ser Ser Leu Met
35 40 45
Ser Gly Val Phe Ser His Asn Arg Arg Met Ser Gly Arg Asn His Pro
50 55 60
Gly Ser Gly Val Ala Lys Arg Lys Ile Phe Phe Trp Ala Ala Met Val
65 70 75 80
Ile Ala Gly Val Ile Leu Met Leu Ile Val Asn His Gly Val Gln Arg
85 90 95
Glu Ala Pro Ile Met Ser Ile Leu Asp Ser Met Glu Ser Val Pro Asn
100 105 110
Gly Gly Leu Gly Arg Pro Gly Ser Asp Thr Glu Asn Thr Leu Lys Ser
115 120 125
Ile Glu Asp Lys Glu Glu Thr Asn Ala Val Asn Ser Phe Glu Phe Gln
130 135 140
Asn Glu Asn Gly Asn Ala Ala Lys Thr Phe Glu Asp Val Glu Ser Asn
145 150 155 160
Asp Ala Ser Glu Asp Leu Glu Ile Thr Gln Asp Pro Glu Asp Ile Arg
165 170 175
Arg Arg Cys Pro Ala Gly Ser Lys Ile Glu Leu Tyr Tyr Pro His Leu
180 185 190
Asn Lys Gly Gly Gly Arg Thr Val Asp Ala Thr Phe Phe Asp Leu Asp
195 200 205
Asp Ile Gly Lys Asp Pro Arg Tyr Arg His Val Ser Ala Glu Pro Arg
210 215 220
Ser Lys Thr His Lys Phe Ser Met Tyr Ser Tyr His Arg Thr Tyr Pro
225 230 235 240
Ala Leu Ala Arg Ala Lys His Cys Leu Pro Val Pro Gln Gly Leu Ala
245 250 255
Ser Ser Cys Glu Lys Thr Thr Pro Glu Leu Cys Val Arg Trp Ile Tyr
260 265 270
Thr Leu Arg Glu Pro Ile Ser Arg Val Leu Ser Ala Phe Tyr Thr Met
275 280 285
Thr Gly Arg Lys Gly Asn Thr Val Ser Gly Arg Arg Pro Val Gln Lys
290 295 300
Arg Ser Ala Ile Leu Gly Gly Thr Gly Ala Gln Gly Asp Ser His Phe
305 310 315 320
Phe Cys Arg Pro Gly Ser Ala Ala Ser Gln Ala Met Gln Gln Val Asp
325 330 335
Phe Thr Ile Glu Asp Trp Ala Arg Leu Pro Asp Asp Glu Arg Gln Asn
340 345 350
Cys Asp Leu Ala Phe Asn Ile Met Thr Lys Tyr Leu Ala Pro Thr Thr
355 360 365
Lys Asn Asn Ser Arg Glu Gln Leu Ala Leu Ala Lys Lys Arg Leu Glu
370 375 380
Asp Met Ala Trp Phe Gly Val Leu Glu Gln Trp Thr Glu Ser Leu Gln
385 390 395 400
Leu Phe Ser Tyr Val Leu Gly Thr Asp Leu Val His Tyr Val Pro Thr
405 410 415
Phe Asn Leu Asn Glu Tyr Asp Lys Asn Leu Ser Pro Tyr Ala Lys Ala
420 425 430
Val Leu Glu Lys His Asn Asn Leu Asp Ile Glu Leu Tyr Lys Tyr Ala
435 440 445
Glu Glu Leu Phe Arg Ser Arg Val Ala Lys Met Arg Leu Asn Gln Arg
450 455 460
Asp Pro Phe Tyr Lys Pro Phe Ser Phe Val Cys Asp Glu Glu Lys Ile
465 470 475 480
Cys Trp Asn Lys Asn Ser Thr Glu Lys Ala Trp Pro Leu Thr Asn Asp
485 490 495
Pro Leu Ala His Phe Lys Ser Glu Gly Glu Ala Lys Glu Met Gln Leu
500 505 510
Cys Ser Pro Lys Gln Gly Cys Trp Arg Thr Asp Val Arg Ala Pro Phe
515 520 525
Gln Lys Asn Glu Thr Glu Val Glu Thr Lys Ala Gln Lys Asn Ile Lys
530 535 540
Gly Ala Ser Leu Ala Thr Lys Leu Lys Leu Pro Phe Lys Ala Arg Thr
545 550 555 560
Ala Leu Gln Ser Leu Glu Thr Cys Leu Pro Ser Val Phe Ile Leu Gly
565 570 575
Ala Arg Lys Gly Gly Thr Thr Ser Leu Tyr Glu Tyr Ile Ser Ala His
580 585 590
Pro Arg Phe Tyr Gly Val Leu Leu Asp Lys Lys Ser Gln Ser Gly Glu
595 600 605
Leu Leu Tyr Ala His Leu Leu Asp Leu Lys Arg Thr Met Ser Ser Lys
610 615 620
Thr Phe Arg Lys Lys Tyr Asn His Arg Phe Ala Glu Glu Leu Gln Val
625 630 635 640
Ser Phe Gly Ser Gln Glu Gly Asp Asp Ser Asn Trp Met Asp Asp Ile
645 650 655
Ile Arg Gly Ala Ala Arg Thr Gly Glu Ser Thr Val Ala Tyr Gly Pro
660 665 670
Ala Cys Gln Leu Pro Ala Gln Ile Ala Ala Ala Cys Gly Val Asn Pro
675 680 685
Arg Ile Lys Phe Ile Tyr Leu Val Arg Asn Pro Ile Glu Arg Ile Ile
690 695 700
Ser Asn Tyr Lys Met Arg Asp Arg Leu Gln Lys Ala Val Lys Gly Phe
705 710 715 720
Thr Ile Gln Glu Ser Ile Arg His Asp Leu Thr Ser Ile Arg Glu Ala
725 730 735
Ile Pro Thr Asp Pro Gln Trp Trp Thr Lys Glu Asp Ser Glu Gly Asn
740 745 750
Ile Pro Cys Leu Tyr Glu Gln Asp Tyr Phe Asn Gly Val Trp Ser Gly
755 760 765
Met Tyr Ile Val His Leu Thr Arg Trp Met Lys His Tyr Pro Ala Ser
770 775 780
Gln Ile Leu Val Leu Lys Ser Glu Asp Phe Leu Ala Asp Pro Ala Ala
785 790 795 800
Thr Leu Arg Lys Ser Leu Ile Phe Ile Gly Leu Asp Pro Ser Val Met
805 810 815
Asp Val Glu Ser Thr Val Ala Arg Asn Tyr Asn Ala Ala Pro Glu Ser
820 825 830
Ala Ala Ser Arg Ser Pro Ile Pro Asp Glu Leu Arg Ala Asp Leu Gln
835 840 845
Ser Phe Tyr Ile Pro Tyr Asn Glu Ala Leu Gln Thr Thr Phe Gly Ile
850 855 860
Asp Val Ser Asn Trp Asn
865 870
<210> 32
<211> 677
<212> PRT
<213> 橙壶菌属物种（Aurantiochytrium sp.）
<220>
<221> misc_feature
<223> SFT16，推定的磺基转移酶
<400> 32
Asn Ser Ala Thr Ile Gly Leu Ala Lys Phe Glu Ala Pro Val Met Gly
1 5 10 15
Lys Ala Phe Asp Arg Gly Pro Met Pro Arg His Thr Gly Arg Cys Arg
20 25 30
Gln Val Met Val Val Leu Leu Val Ser Leu Leu Ser Ile Leu Val Thr
35 40 45
Arg Ser Ile Glu Pro Tyr Leu Arg Gly Gly Leu Thr Glu Trp Phe Glu
50 55 60
Val Glu Ser Ile Thr Gly Asp Leu Gly Pro Asp Ala Lys Pro Cys Arg
65 70 75 80
Glu Ser Trp Ala Cys Gly Arg Gly Glu Ser Thr Ser Ser Glu Thr Glu
85 90 95
Pro Leu His Lys Val Asp Val Glu Val Arg Glu Val Asp Pro Ser Asn
100 105 110
Thr Ser Met Glu Ala Trp Lys Pro Asp Arg Asn Tyr Gly Glu Thr Ala
115 120 125
Thr Lys Lys Leu Asn Asp Gly Gly Asp Ser Glu His Gln Tyr Gly Gln
130 135 140
Ile Gln Glu Arg Ala Lys Glu Ser Val Phe Val Lys Thr Thr Asn Val
145 150 155 160
Ser Ser Phe Val Ser Lys Asn Ala Ser Lys Lys Ile Ser Gly Thr Glu
165 170 175
Asp Ser Glu Val Asp Asn Val Leu Thr Leu Ala Leu Ala Ser Asp Asp
180 185 190
Leu Glu Ser Asp Ile Gly Glu Ser His Leu Ser Asn Asp Thr Asp Tyr
195 200 205
Pro Ser Ile Ser Ala Asn Ser Thr Thr Glu Asn Ile Gly Lys Glu Ser
210 215 220
Thr Glu Phe Val Leu Arg Glu Ala Val Gly Ser Val Ala Thr Ala Glu
225 230 235 240
Met Gly Asp Glu Asn Asn Tyr Ser Ser Glu Gly Ser Glu Asn Lys Thr
245 250 255
Ser Ser Ile Ala Ser Arg Arg Asp Glu Ser Ala Lys Leu Ala Ser Pro
260 265 270
Leu Leu Ser Asn Ser Gln Gly Pro Ser Asn Lys Ser Leu Ile Asp Ser
275 280 285
His Gly Val Ser Ile Ala Glu Asp Asp Asn Ala Thr Val Ser Leu Ser
290 295 300
Thr Glu Ile Lys Asn Ser Ala Asn Thr Thr His Glu Val Glu Gly Leu
305 310 315 320
Glu Gly Thr Lys Glu Pro Thr Gly Val Arg Phe Glu Leu Asn Thr Gly
325 330 335
Glu Ser Lys Leu Thr Thr Asn Lys Val Leu Ser Pro Leu His Val Val
340 345 350
Thr Glu Leu Leu Glu Lys Lys Ser Thr Tyr Gly Ala Glu Lys Ala Leu
355 360 365
Gln Ala Pro Val Leu Val Glu Gln Ile Ala Pro Leu Lys Leu Tyr Asn
370 375 380
Val Pro Lys Arg Asn Tyr Ser Phe Ile Pro Glu Ser Val Lys Glu Ser
385 390 395 400
Met Lys Lys Phe Glu Ser Pro Ala Cys Arg Ala Ile Arg Tyr Gly Pro
405 410 415
Ser Gly Ser Ala Leu Glu Gly Thr Val Gly Ile Ser Ser Arg Ala Lys
420 425 430
Cys Ser Ser Ser Met Glu Gly Thr Glu Glu Ala Leu Val Glu Arg Gly
435 440 445
Ser Gln Ile Leu Ile Ser Glu Ala Tyr Lys Leu Ile Tyr Val Ser Asn
450 455 460
Met Lys Ala Ala Ser Gln Thr Leu Ser Ile Val Met Arg Glu Arg Leu
465 470 475 480
Lys Ala Ile Thr Ile Gly Ser His Lys Ile Asn Thr Tyr Ile Glu Gln
485 490 495
Arg Arg Ala Val Glu Pro Phe Val Lys Leu Glu Asp Tyr Phe Val Phe
500 505 510
Thr Phe Val Arg Asp Pro Leu Ser Met Phe Tyr Ser Ala Tyr Ala Glu
515 520 525
Ile Asp Arg Arg Met Asp Arg Phe Leu Lys Lys Arg Thr Ser Phe Gln
530 535 540
Leu Ile Asn Arg Thr Met Lys Asn Glu Pro Asn Arg Ile Leu Asn Cys
545 550 555 560
Leu Asp Met Val Arg Thr Gly Ser His Leu Arg Ser Asp Leu Thr Pro
565 570 575
Ala His Met Tyr Ser Gln Val Trp Lys Thr Gln Arg Cys Pro Gly Gly
580 585 590
Val Gly Ser Phe Leu Glu Phe Asp Phe Ile Gly Lys Leu Glu Asn Ile
595 600 605
Arg Glu Asp Tyr Tyr Ala Leu Glu Ser Ile Ile Gly Ala Lys His Arg
610 615 620
Pro Leu Arg Ile Phe Asn Gly Asn Lys Gln Ser Ile Tyr Lys Lys His
625 630 635 640
Leu Tyr Asn Leu Arg Thr Ala Ala Phe Glu Asn Leu Glu Lys Lys Ala
645 650 655
Cys Ala Tyr Ser Glu Ala Asp Tyr Thr Cys Phe Thr Tyr Gln Lys Pro
660 665 670
Thr Thr Cys Gln Ala
675
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物oJU-0017
<400> 33
cacgacgttg taaaacgacg 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物oJU-0001
<400> 34
gttgtgtgga attgtgagcg 20
<210> 35
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物oCAB-0294
<400> 35
tactgctcta ggattattta ttactaggtc 30
<210> 36
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物oCAB-0295
<400> 36
cgtcgtttta caacgtcgtg attgcagaat tgacgacgtg 40
<210> 37
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物oCAB-0296
<400> 37
cgctcacaat tccacacaac tttatatggg catccgctgg 40
<210> 38
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物oCAB-0297
<400> 38
tacacgttaa agcatacttc tagagaa 27
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物oCAB-0298
<400> 39
gcttattgtg aaactcgtgc c 21
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物oCAB-0299
<400> 40
gcccctgagc tttgtatagt c 21
<210> 41
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物PF640
<400> 41
tgtggtatgg ctgattatga tctag 25

Claims (41)

1.破囊壶菌科(Thraustochytriaceae)的重组细胞，所述重组细胞包含编码异源糖分子的核酸，并且在一种或多种磺基转移酶基因中还包含遗传修饰。
2.根据权利要求1所述的重组细胞，其中所述遗传修饰选自：缺失、突变、破坏、插入、失活、衰减和倒置。
3.根据权利要求2所述的重组细胞，其中所述遗传修饰为缺失。
4.根据权利要求2所述的重组细胞，其中所述糖分子为糖蛋白或糖肽。
5.根据权利要求1所述的重组细胞，其中所述磺基转移酶为碳水化合物磺基转移酶。
6.根据权利要求1所述的重组细胞，其中所述一种或多种磺基转移酶基因是磺基转移酶_2家族(PF03567)的成员。
7.根据权利要求1所述的重组细胞，其中所述一种或多种磺基转移酶基因包含与选自SEQ ID NO:28、31和32的序列具有至少80％序列同一性的序列。
8.根据权利要求4所述的重组细胞，其中所述细胞在编码碳水化合物磺基转移酶的单个基因中包含所述遗传修饰。
9.根据权利要求8所述的重组细胞，其中编码所述碳水化合物转移酶的所述单个基因包含与选自SEQ ID NO:28、31和32的序列具有至少80％序列同一性的序列。
10.根据权利要求4所述的重组细胞，其中所述细胞产生并分泌异源多肽分子或其功能部分。
11.根据权利要求1所述的重组细胞，其中所述糖分子是免疫球蛋白。
12.根据权利要求11所述的重组细胞，其中相对于不包含所述遗传修饰的对应细胞，所述异源免疫球蛋白包含较少的硫酸化N-聚糖。
13.根据权利要求12所述的重组细胞，其中所述异源免疫球蛋白包含至少30％的未硫酸化N-聚糖。
14.根据权利要求13所述的重组细胞，其中所述异源免疫球蛋白包含至少40％的未硫酸化N-聚糖。
15.根据权利要求12所述的重组细胞，其中所述异源免疫球蛋白中未硫酸化N-聚糖与硫酸化N-聚糖的比率为至少1:2。
16.根据权利要求12所述的重组细胞，其中所述N-聚糖包含Man3-5GlcNAc2。
17.根据权利要求1所述的重组细胞，其中所述糖分子是抗体分子或其部分。
18.根据权利要求9所述的重组细胞，其中所述异源糖分子为抗体分子或其部分。
19.根据权利要求4所述的重组细胞，其中所述破囊壶菌科(Thraustochytriaceae)细胞是选自以下的属：日本壶菌属(Japanochytrium)、椭圆壶菌属(Oblongichytrium)、破囊壶菌属(Thraustochytrium)、橙壶菌属(Aurantiochytrium)和裂殖壶菌属(Schizochytrium)。
20.根据权利要求4所述的重组细胞，其中所述破囊壶菌科(Thraustochytriaceae)细胞是橙壶菌属(Aurantiochytrium)或裂殖壶菌属(Schizochytrium)。
21.根据权利要求4所述的重组细胞，还包含对编码甘露糖基转移酶的基因的遗传修饰。
22.根据权利要求21所述的重组细胞，其中所述遗传修饰包含在alg3基因中。
23.根据权利要求22所述的重组细胞，其中所述遗传修饰选自：缺失、突变、破坏、插入、失活、置换、衰减和倒置。
24.根据权利要求1所述的重组细胞，其中所述异源糖蛋白或糖肽选自：曲妥珠单抗、依库珠单抗、那他珠单抗、西妥昔单抗、奥马珠单抗、优特克单抗、帕尼单抗和阿达木单抗、或它们中任一种的功能性片段。
25.根据权利要求11所述的重组细胞，其中与在不包含对所述一种或多种磺基转移酶基因的所述遗传修饰的对应细胞中产生的相同免疫球蛋白相比，所述免疫球蛋白具有低硫酸化谱，所述低硫酸化谱具有少于25％的硫酸化N-聚糖。
26.根据权利要求4所述的重组细胞，其中所述异源糖蛋白或糖肽从所述细胞分泌并且具有低硫酸化谱，所述低硫酸化谱具有至少30％的未硫酸化N-聚糖。
27.一种产生具有低硫酸化的糖基化谱的糖分子的方法，包括：
对破囊壶菌科(Thraustochytriales)的生物体中的一种或多种磺基转移酶基因进行遗传修饰，其中所述生物体包含编码异源糖分子或其功能部分的重组核酸；
培养所述生物体；以及
从而产生具有低硫酸化的糖基化谱的所述糖分子。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述遗传修饰选自：缺失、突变、破坏、插入、失活、衰减和倒置。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述遗传修饰为缺失。
30.根据权利要求27所述的方法，其中所述糖分子为糖蛋白或糖肽。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述遗传修饰包含在编码所述碳水化合物磺基转移酶的单个基因中，并且所述碳水化合物磺基转移酶是SFT-12、SFT-15或SFT-16中的任一种。
32.根据权利要求30所述的方法，其中所述生物体分泌所述异源糖蛋白或糖肽分子或其功能部分。
33.根据权利要求31所述的方法，其中相对于在不包含所述遗传修饰的对应细胞中产生的所述异源糖蛋白或糖肽，所述异源糖蛋白或糖肽分子包含较少的硫酸化N-聚糖。
34.根据权利要求32所述的方法，其中所述异源糖蛋白或糖肽包含至少30％的未硫酸化N-聚糖。
35.根据权利要求32所述的方法，其中所述异源糖蛋白或糖肽包含至少40％的未硫酸化N-聚糖。
36.根据权利要求32所述的方法，其中所述异源糖蛋白或糖肽中未硫酸化N-聚糖与硫酸化N-聚糖的比率为至少1:2。
37.根据权利要求32所述的方法，其中所述N-聚糖包含Man3-5GlcNAc2。
38.根据权利要求32所述的方法，其中所述异源糖蛋白或糖肽分子是抗体分子或其部分。
39.一种治疗性蛋白质，包含0.60或更小的S-Man(3-5)/(S-Man(3-5)+Man(3-5))的比率。
40.根据权利要求39所述的治疗性蛋白质，其包含免疫球蛋白。
41.根据权利要求39所述的治疗性蛋白质，其中所述免疫球蛋白为抗体。
CN201980017455.5A 2018-03-05 2019-03-04 用于产生具有低硫酸化的糖分子的生物体和方法 Pending CN111954713A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862638796P 2018-03-05 2018-03-05
US62/638,796 2018-03-05
PCT/US2019/020566 WO2019173226A1 (en) 2018-03-05 2019-03-04 Organisms and methods for producing glycomolecules with low sulfation

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111954713A true CN111954713A (zh) 2020-11-17

Family

ID=67846295

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980017455.5A Pending CN111954713A (zh) 2018-03-05 2019-03-04 用于产生具有低硫酸化的糖分子的生物体和方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20200399649A1 (zh)
EP (1) EP3762485A4 (zh)
CN (1) CN111954713A (zh)
WO (1) WO2019173226A1 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016140925A1 (en) 2015-03-02 2016-09-09 Synthetic Genomics, Inc. Regulatory elements from labyrinthulomycetes microorganisms
US10633454B2 (en) 2016-11-01 2020-04-28 Conagen Inc. Expression of modified glycoproteins and glycopeptides
CN114891760B (zh) * 2022-05-25 2023-06-23 中国水产科学研究院黄海水产研究所 一种半滑舌鳎chst12蛋白及其在抗菌中的应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101679955A (zh) * 2007-04-24 2010-03-24 生化学工业株式会社 生产软骨素的细菌及生产软骨素的方法
US20100233760A1 (en) * 2009-03-16 2010-09-16 Apt Kirk E Protein Production in Microorganisms of the Phylum Labyrinthulomycota
TW201036554A (en) * 2009-03-19 2010-10-16 Martek Biosciences Corp Thraustochytrids, fatty acid compositions, and methods of making and uses thereof
US20110189228A1 (en) * 2009-12-28 2011-08-04 Bayne Anne-Cecile V Production of Heterologous Polypeptides in Microalgae, Microalgal Extracellular Bodies, Compositions, and Methods of Making and Uses Thereof
CN102220270A (zh) * 2011-05-18 2011-10-19 江南大学 一种产硫酸软骨素菌株的筛选方法及用该菌株发酵法生产硫酸软骨素
US20110306075A1 (en) * 2008-12-19 2011-12-15 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods related to modified glycans

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI324181B (en) * 2001-04-16 2010-05-01 Martek Biosciences Corp Product and process for transformation of thraustochytriales microorganisms
EP3360556B1 (en) * 2007-12-27 2020-04-08 Stelic Institute Of Regenerative Medicine, Stelic Institute & Co. Sugar chain-related gene and use thereof
US9650433B2 (en) * 2011-05-20 2017-05-16 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Modified glycoproteins
CN105189740B (zh) * 2013-03-13 2019-01-15 帝斯曼营养品股份公司 工程化微生物
US20190330601A1 (en) * 2016-05-13 2019-10-31 University Of Copenhagen A cell-based array platform

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101679955A (zh) * 2007-04-24 2010-03-24 生化学工业株式会社 生产软骨素的细菌及生产软骨素的方法
US20110306075A1 (en) * 2008-12-19 2011-12-15 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods related to modified glycans
US20100233760A1 (en) * 2009-03-16 2010-09-16 Apt Kirk E Protein Production in Microorganisms of the Phylum Labyrinthulomycota
TW201036554A (en) * 2009-03-19 2010-10-16 Martek Biosciences Corp Thraustochytrids, fatty acid compositions, and methods of making and uses thereof
US20110189228A1 (en) * 2009-12-28 2011-08-04 Bayne Anne-Cecile V Production of Heterologous Polypeptides in Microalgae, Microalgal Extracellular Bodies, Compositions, and Methods of Making and Uses Thereof
CN102220270A (zh) * 2011-05-18 2011-10-19 江南大学 一种产硫酸软骨素菌株的筛选方法及用该菌株发酵法生产硫酸软骨素

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
李晶晶 等: "破囊壶菌生产DHA的应用前景", 《食品工业科技》, vol. 34, no. 16, pages 367 - 371 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2019173226A1 (en) 2019-09-12
US20200399649A1 (en) 2020-12-24
EP3762485A1 (en) 2021-01-13
EP3762485A4 (en) 2021-12-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11548937B2 (en) DNA-binding domain of CRISPR system, non-fucosylated and partially fucosylated proteins, and methods thereof
JP6482546B2 (ja) 二重対立遺伝子ノックアウトを生成するための方法および組成物
US20200399649A1 (en) Organisms and methods for producing glycomolecules with low sulfation
EP3172333B1 (en) Production of glycoproteins with mammalian-like n-glycans in filamentous fungi
EP1505149B1 (en) Methylotroph yeast producing mammalian type sugar chain
WO2021244255A1 (zh) 一种冠状病毒s蛋白rbd糖蛋白的制备方法及其应用
CN115820587A (zh) 一种由基因组被编辑的cho宿主细胞产生的具有独特糖谱的重组抗体及其制备方法
Kainz et al. N-glycan modification in Aspergillus species
EP3265475B1 (en) Constitutive yeast llp promoter-based expression system
KR20090106481A (ko) 알파-1,6-푸코실 전이효소 발현의 ｓｈｒｎａ-조절된 억제
US20210087540A1 (en) Recombinant organisms and methods for producing glycomolecules with low sulfation
US20210189002A1 (en) Recombinant organisms and methods for producing glycomolecules with high glycan occupancy
WO2021254054A1 (zh) 一种预防冠状病毒引起疾病的疫苗
EP2791164B1 (en) Non-fucosylated glycoprotein comprising the Fc domain of an antibody
KR102134936B1 (ko) Crz1 돌연변이체 진균 세포
US10633454B2 (en) Expression of modified glycoproteins and glycopeptides
US10457970B2 (en) Expression of modified glycoproteins and glycopeptides
WO2012105699A1 (ja) 補体依存性生物活性の高い抗体の産生法
JPH0673458B2 (ja) 小麦胚芽凝集素蛋白質の微生物学的製造法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination