TWI324181B - Product and process for transformation of thraustochytriales microorganisms - Google Patents

Description

1324181 五、發明說明（1) 發明簌圊 本發明一般地係關於一種編瑪破囊壺菌目乙醯乳酸合 成酶之分離的核酸分子’其包括可授予破囊壺菌目微生物 對磺醯脲化合物、咪唑啉酮種類抑制劑及/或氧基笨甲酸嘧 啶酯類具有減低的敏感度之乙醯乳酸合成酶類；亦關於一 種包含可用於破囊壺菌目微生物轉形的選擇標記之重組型 核酸分子；及亦關於使用本發明之重組型核酸分子來轉形 此微生物之方法。本發明亦關於一種在破囊壺菌目表現系 統中有用的基因啟動子。本發明之重組型核酸分子可使用 作為破囊壺菌目微生物中外源核酸的表現型，及用於破囊 壺菌目微生物中基因的刪除、突變或失活化。 發明背景 破囊壺菌類的分類已隨著發展而產 生修正。分類理論學家將破囊壺菌類故置在藻類或藻類似 的原生生物中。但是，因為分類上的不確定，對本發明之 標的來說，在本發明中描述為破囊蠢菌類之菌株較佳地視 為（目：破囊壺菌目：科：破囊壺菌科 {Thraustochytriaceae):屬 ：破囊 壺菌屬 (Thraustochytrium)、裂壺第雇（Schizochytrium) ' 鯓網蛰風 (laAyW/iiAwWi/ei)或日本壺菌屬分類的 改變則總整理在下列。 於本文中所揭示及主張的某些單細胞微生物之菌株為 破囊壺菌目成員。破囊壺菌類為一種具有分類歷史問題之 海洋真核生物類。破囊壺菌類的分類位置問題已由摩斯 -4- '五、發明說明（2) (Moss)(1986)、班韋柏（Bahnweb)及傑寇（Jackle)(1986)及錢 伯蘭（Chamberlain)及摩斯（1988)所評論。 為了方便起見，破囊壺菌類首先由分類學者分配在藤 菌綱（/^少⑺历少^/以八似真菌的藻類女中之其它無色游動孢 子真核生物類。但是，藻菌綱的名稱最後則從分類狀態去 除’而破囊壺菌類則保留在印菌綱（(?〇m少creiei)(雙鞭毛游動 孢子真菌）中。最初假定卵菌綱與不等鞭毛藻類有關，最後 在廣泛範圍的超微結構及生化研究下（由巴爾（Barr)( 1983) 總整理）支持此假設。卵菌綱事實上由李大耳 (Leedale)(1974)及其它藻類學家接受為不等鞭毛藻類部 分。但是，由於其方便的異養本質情形，卵菌綱及破囊壺 菌類已大部分由真菌學者（研究真菌的科學家）研究，而非 由藻類學家（研究藻類的科學家）。 從另一個分類觀點來看，進化生物學家已發展出二種 思考真核生物類如何發展的共通學派。理論之一提出由薄 膜包圍的胞器為經由一系列内共生現象的外生源（馬爾估 里斯（Margulis)1970);例如，粒腺體起源於細菌的内共生 體、葉綠體起源於藍藻類及鞭毛起源於螺旋體。另一個理 論則建議由薄膜包圍的胞器乃經由自體過程從無薄膜包圍 的原核生物原型系統中逐漸發展形成（卡伐里爾（Cavalier)_ 史密斯（Smith) 1975)»但是，此二組進化生物學家已將卵菌 綱與破囊壺菌類移出真菌，而將其與雜色藻頰 (chromophyte algae)放置在雜色藻界（〇尸办⑷（卡伐 里爾-史密斯1981)(此界更近已擴大至包括其它原生生 1324181 五、發明說明（3) I 物’且此界的成員現在稱為真菌界（Stramenopiles));或與 全部的藻類放置在原生生物界（馬爾估里斯及沙根 (Sagan)(1985)。 隨著電子顯微鏡的發展，在二種破囊壺菌類的游動孢 子之超顯微結構上的研究，破囊壺菌屬及裂壺菌屬（博金斯 (Perkins)1976 ;卡日瑪（Kazama)1980 ;巴爾 1981)已提供破 囊壺菌科僅略微地與卵菌綱相關的好證據。額外地，可顯 示5S核醣體RNA序列的相依分析（一種多元統計資料形式） 之基因資料指出破囊壺菌目明顯地為一種獨特的真核生物 群，其可完全地從卵菌綱成員的真菌中分出，而最緊密地 與红及褐藻類相關（門内拉（Mannella)等人1987)。大部分的 分類學者已同意將破囊壺菌類移出卵菌綱（巴克尼吉-蓋西 亞（Bartnicki-Garcia)1988)。 總而言之’使用卡伐里爾-史密斯的分類系統（1981， 1983)，破囊壺菌類與雜色藻類乃分類在雜色藻界（真菌 界）。此將其放置在與真菌完全不同的界，其全部放置在狹 義的真菌界（Eufungi)中。因此，將破囊壺菌類的分類位置 總整理在下列： 界：雜色藻界（真菌界） P1 :不等鞭毛門 目：破囊壺菌目 科：破囊壺菌科 屬：破囊壺菌屬、裂壺菌屬、類網菌屬或曰本壺菌屬 某些早期的分類學者將破囊壺菌屬的少數原始成員 -6- 五、發明說明（4) (具有變形蟲生命階段的那些）分離成個別的屬稱嗓優肯菌 。但是，現在已熟知大部分（若非全部）的破囊壺 菌類（包括破囊壺菌屬及裂壺菌屬）具有變形蟲階段，如此 某些人不將優肯菌屬視為有用的屬。如於本文中所使用， 破囊壺菌屬將包括優肯菌屬。 雖然在較高的門及界分類中處於不確定的分類位置， 破囊壺菌類仍然為一種特殊及有特徵的群集，其成員仍然 可分類在破囊壺菌目中。 裂壺菌屬及其它破囊壺菌目微生物具有實質上存在及 潛在的商業價值，因為其具有可產生大量脂質樣化合物的 能力，包括高不飽和脂肪酸類（HUFAs)及不同的類胡蘿蔔 素類（例如，瑕青素）。歐美加（Omega)-3高不飽和脂肪酸類 具有明顯的商業利益，它們最近已鑑定出可作為重要的飲 食化合物，而可用來防止動脈硬化及冠狀動脈心臟疾病、 用來緩和炎性症狀及用來阻礙腫瘤細胞生長》這些有益的 效應為從歐美加-6脂肪酸製造的會造成競爭性抑制之歐美 加-3 HUFAs化合物類，與從歐美加·3 HUFAs它們本身直接 製造的有益化合物類二者之結果（辛摩炮洛斯（Simopoulos) 等人，1986)。歐美加·6脂肪酸類為在植物類及動物類中發 現的主要HUFAs。因此，對商業製造生物的破囊壺菌目微 生物來說，其進一步的發展將可經由重組DNA技術對該生 物製出特定的基因改變之能力而明顯地獲利，其包括提高 此生物對高價值HUFAs及類胡蘿蔔素類之產量。此外，獲 得對此具差的特徵之生物族群其生物化學及分子生物學能 五、發明說明（5) 力之較佳了解將可提供指導未來菌株發展有用的訊息。但 是’在本發明之前，無法獲得合適用於破囊壺菌類（包括裂 壺菌屬.及破囊壺菌屬等該些屬的成員）轉形之方法及重組 架構。重要地，在本發明之前無法獲得對轉形破囊壺菌目 微生物特別有用之選擇標記及鑑定破囊壺菌目特定啟動子 序列的發展® 先前的研究者已描述可使用在不同微生物（包括非為 破囊壺菌目成員的微藻類）的轉形方法及試劑。美國專利案 號6,027,900(由阿爾納特（Allnutt)等人）揭示使用在真核藻 類（.特別地，三角褐指藻irfcor/iMiMw))基因 工程中之基因融合，其使用一從光合成海藻光採集基因來 之啟動子及從印度斯坦键異壁菌 來的Sh6/e基因作為選擇標記。該些細胞可在 高鹽濃度（例如，10-35克/升）及肉辛（Zeocin)TM(用來選擇轉 化株）中生長。合適於使用此方法轉形的微藻類細胞有可在 高鹽條件下生長之光合成微藻類》美國專利案號 5,661，〇17(由唐納黑（Dunahay)等人）揭示出一種含葉綠素 C的藻類（例如，矽藻類）之轉形方法，其使用的重組架構包 括一種操作地連結至調節控制序列（其合適於該標記在含 葉綠素C的藻類中表現）之選擇性標記。該選擇標記已揭示 可為任何合適的標記，包括從細菌及真菌來源分離出的標 記’較佳地為新黴素磷轉移酶。該調節控制序列可包括任 何起源於含葉綠素C的藻類之調節序列，較佳地，來自隱 小環藻（C>c/〇re//a cry/mcfl)(例如，隱小環藻（C. crypizcfl) -8· 1324181 五、發明說明（6) 乙醢基-CoA脫羧酶調節序列）》 但是，此方法無法容易地轉移至破囊壺菌目微生物的 轉形，因為，在本發明之前，微生物（諸如破囊壺菌目，例 如’微藻類）之轉形並非例行的程序。已良好發展可用於細 菌及酵母菌之標記及轉形系統並不容易地合適於其它微生 物。更確切地，美國專利案號5,661，017提及“在真核微藻 類的轉形系統發展上已有些微的成功，，（第1欄，第49_51 行）’其部分地由於難以將外源DNA引進此微生物，部分地 由於缺乏合適用於此轉形的標記及載體。在美國專利案號 5,661，017中描述的系統特別地發展用於含葉綠素(：的藻 類，因為那些發明家相信其經得起基因轉形，特別是與其 它藻類比較。類似地，美國專利案號6,〇27,900(其教導一種 對光合成微藻類專一的轉形方法）談及其相信大部分藻類 對任何型式的基因操作具耐熱性（第1欄，第39-47行）。合 適於細菌、酵母菌、昆蟲及動物細胞的系統並不容易地適 應於微藻類。因此，在本發明之前，在技藝中仍然需要一 種對微藻類專一的有效轉形系統及方法。 額外地，雖然破囊壺菌目現在與雜色藻類歸納在真菌 界，在技藝中仍然有某些人主張這些微生物與大部分的微 藻類相當地不同，且某些熟知此技藝之人士已主張囊壺菌 目成員根本不合適地分類為微藻類。視為微藻類的微生物 在進化期間已在至少四個各別的時期進化，而致使“微藻 類”型式的微生物被放置在不同界中（例如紅藻類、綠藻類 及金黃藻類（雜色藻界），全部在不同的界中結果，已說

-9- 五、發明說明（7) 明可在其它微藻;顧中有用的轉形系統不預期對破囊壺菌目 有用。因此，雖然破囊壺菌目微生物具有商業價值，使用 基a工程來發揮此微生物的最大潛力之能力迄今為止尚未 獲得。在本發明之前’本發明家尚未察覺有任何啟動子、 選擇標記或載體可用於破囊壺菌目微生物之轉形，或有任 何知識考慮到所選擇的系統可使用或適應於破囊壺菌目。 總而言之，在技藝中已需要發展一種可用於破囊壺菌 目微生物轉形之方法，因此提供一種可創造具提高的商業 價值之菌株的方法。此外，在技藝中已需要發展一種可利 用同源或非同源重組來突變或失活化破囊壺菌目微生物中 特疋基因的方法，以提供一種可改變細胞新陳代謝及鑑定 破囊菌目中特定基因的功能之新額的方法。 發明概述 本發明的一個具體實施例係關於一種分離的核酸分 子，其包含一種選自於由下列所組成之群的核酸序列：（a) 種核酸序列，其編瑪具有選自於由下列所組成之群的胺 基酸序列之蛋白質：序列辨識編號：15、序列辨識編號： 19、序列辨識編號：22及序列辨識編號：24，其中該蛋白 質為一種乙醞乳酸合成酶：（b)一種核酸序列，其编碼具有 與（a)之胺基酸序列至少約75%相同的胺基酸序列之蛋白 質，其中該蛋白質為一種乙醖乳酸合成酶；及，（c)一種核 酸序列，其與（a)或（b)的核酸序列完全互補◊在一個觀點 t，此一核酸序列編碼一種具有與（a)之胺基酸序列至少約 85〇/。相同的胺基酸序列之蛋白質，及其中該蛋白質為一種 1324181 五、發明說明（8) 乙醯乳酸合成酶。在另一個觀點中，此一核酸序列編碼一 種具有與（a)的胺基酸序列至少約95%相同的胺基酸序列之 蛋台質’其中該蛋白質為一種乙醖乳酸合成酶。在更另一 個觀點中，此一核酸序列編碼一種具有胺基酸序列不同於 序列辨識編號：15之蛋白質，其可在選自於由下列所組成 之群的胺基酸位置處刪除、嵌入或取代一胺基酸：116G、 117A、192P、200A、251JC、358M、383D、592V、595W 及599F。在一個觀點中，該核酸序列編碼一種具有選自於 由下列所組成之群的胺基酸序列之蛋白質：序列辨識編 號：15、序列辨識編號：19、序列辨識編號：22及序列辨 識編號：24’及其中該蛋白質為一種乙醒乳酸合成酶。在 更另一個觀點中，該核酸序列選自於由下列所組成之群： 序列辨識編號：14之核苷酸1260-3314、序列辨識編號：18 之核苷酸1260-3314、序列辨識編號：21之核苷酸1260-3314 及序列辨識編號：23之核苷酸1260-3314。 較佳地，由上述鑑別的核酸序列所編碼之蛋白質的表 現性可授予以此核酸分子轉形的破囊壺菌目微生物對選自 於由下列所組成之群的化合物具有減低的敏感度：磺醖脲 化合物類、咪唑啉酮種類抑制劑及氧基苯甲酸嘴啶酯類。 在此具體實施例的一個觀點中，該核酸序列編碼一種具有 選自於由下列所組成之群的胺基酸序列之蛋白質：序列辨 識編號：19、序列辨識編號：22及序列辨識编號：24。在 此具體實施例的另一個觀點中，該核酸序列選自於由下列 所組成之群：序列辨識编號：14之核苷酸1260-33 14、序列 •11- 1324181 五、發明說明（〇 辨識編號.18之核苷酸1260-33 14、序列辨識編號：21之核 苷酸1260-3314及序列辨識編號：23之核苷酸1260-3314。 在本發明的一個具體實施例中’上述描述的核酸序列 編碼一種裂壺菌屬乙酿乳酸合成酶。在一個觀點中，該裂 壺菌屬乙醯乳酸合成酶的表現性為可授予該以核酸分子轉 形的破囊壺菌目微生物對選自於由下列所組成之群的化合 物具有減低的敏感度：續醯脈化合物類、D米唾琳_種類抑 制劑及氧基笨曱酸嘧啶酯類。 鲁 本發明的另一個具體實施例係關於一種包含任何上述 描述之分離的核酸分子之重組型核酸分子，其被可操作地 連結至一轉錄控制序列。本發明的另一個具體實施例係關 於一種被此重組型核酸分子所轉形的破囊壺菌類重組型微 生物。 本發明的更另一個具體實施例係關於一種破囊壺菌目 微生物轉形用之重組型載體。該載體包括一種編碼乙醯乳 酸合成酶的核酸序列，而該合成酶可授予該破囊壺菌目微 · 生物對選自於由下列所組成之群的化合物具有減低的敏感 度：磺醯脲化合物類、咪唑啉酮種類抑制劑及氧基苯曱酸 嘧啶酯類。該乙醯乳酸合成酶具有選自於由下列所組成之 群的胺基酸序列：（a)—種胺基酸序列，其選自於由下列所 組成之群：序列辨識編號：19、序列辨識編號：22及序列 辨識編號：24 ;及（b)—種胺基酸序列，其與（a)的胺基酸序 列至少約75%相同。該可譯成乙醯乳酸合成酶的核酸序列 操作地連結至一轉錄控制序列。在一個觀點中，該重組型 -12· 1324181 革、發明說明（10) 載體為一種表現載體。在另一個觀點中，該重組型載體為 一種致標載體。在其它觀點中，在載體中的該核酸序列可 譯成一種具有胺基酸序列與（a)之胺基酸序列至少約85%相 同的乙醯乳酸合成酶’在另一個觀點中，至少約95〇/〇相同。 在一個觀點中，該核酸序列編碼_種具有胺基酸序列與序 列辨識編號：15不同的蛋白質，其可藉由在選自於由下列 所組成之群的胺基酸位置處刪除、嵌入或取代_胺基酸： 116G、117A、192P、200A、251K、358M、383D、592V、 595 W及599F。在一個較佳的觀點中，該乙醯乳酸合成酶具 有選自於由下列所組成之群的胺基酸序列：序列辨識編 號：19、序列辨識編號：22及序列辨識編號：24。在另一 個觀點中，該核酸序列可選自於由下列所組成之群：序列 辨識編號：18之核苷酸1260-3314、序列辨識編號：21之核 苷酸1260-3314及序列辨識編號：23之核苷酸1260-3314。 在該重組型載體中的轉錄控制序列可包括（但是非為限制） 破囊壺菌目α-微管蛋白啟動子、破囊壺菌目乙醯乳酸合成 酶啟動子、從破囊壺菌目聚乙醯合成酶（PKS)系統來的啟動 子或破囊壺菌目脂肪酸去飽和酶啟動子。在一個觀點中， 該載體包含一種選自於由下列所組成之群的核酸序列：序 列辨識編號：18、序列辨識編號：21及序列辨識編號：23。 本發明的更另一個具體實施例係關於一種破囊壺菌目 微生物細胞之轉形方法。該方法包括第一步驟（a)將一包含 編碼乙醯乳酸合成酶之核酸序列的重組型核酸分子引進破 囊壺菌目微生物細胞，該合成酶可授予該些細胞對選自於 1324181 五、發明說明（Η) 由下列所組成之群的化合物具有減低的敏感度：續醯脲化 合物類、咪唑啉酮種類抑制劑及氧基苯甲酸嘧啶酯類，其 中該乙醯乳酸合成酶具有選自於由下列所組成之群的胺基 酸序列：⑴一種胺基酸序列，其選自於由下列所組成之 群：序列辨識編號：19、序列辨識編號：22及序列辨識編 號：24 ;及，（ii) 一種胺基酸序列’其與⑴的胺基酸序列至 少約75%相同。該方法包括第二步驟（b)選擇已成功地以重 組型核酸分子轉形的細胞’其藉由將（a)的細胞培養在包含 至少一種會抑制未轉形的細胞之化合物的培養基中，該化 合物可選自於由下列所組成之群：磺醯脲化合物、咪唑啉 酮種類抑制劑及氧基苯甲酸嘧啶酯類。在一個觀點中，該 核酸序列可譯成具有胺基酸序列與⑴的胺基酸序列至少 約85%相同之乙醯乳酸合成酶，更佳地至少約95%相同。 在一個觀點中，該核酸序列可譯成一種具有胺基酸序列與 序列辨識編號：15不同的蛋白質，其可藉由在選自於由下 列所組成之群的胺基酸位置處刪除、嵌入或取代一胺基 酸：116G、117A、192P、200A、251K、358M、383D、592V、 595W及599F。在另一個觀點中，該乙醯乳酸合成酶具有選 自於由下列所組成之群的胺基酸序列：序列辨識編號：19、 序列辨識編號：22及序列辨識編號：24。較佳地，該核酸 序列選自於由下列所組成之群：序列辨識編號：18之核苷 酸1260-3314、序列辨識編號：21之核苷酸1260-3314及序 列辨識編號：23之核苷酸1260-3314。在更另一個觀點中， 該核酸序列可操作地連結至一選自於由下列所組成之群的

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吞、發明說明（l2) 轉錄控制序列：破囊壺菌目jx-微管蛋白啟動子、破囊壺菌 目乙醯乳酸合成酶啟動子、從破囊壺菌目聚乙醯合成酶 (PKS)系統來之啟動子及破囊壺菌目脂肪酸去飽和酶啟動 子。 在一個觀點中，該重組型核酸分子進一步包含一種可 譯成欲由細胞製造的蛋白質之核酸序列，其中該可譯成蛋 白質的核酸序列操作地連結至一轉錄控制序列。在此具體 實施例的一個觀點中’該蛋白質與合成選自於由下列所組 成之群的脂肪酸有關：廿二碳六稀酸（DHA)、廿二碳五烯 酸（DPA)、廿十碳五烯酸（EPA)及花生四烯酸（ARA)。在此 具體實施例的另一個觀點中，該蛋白質選自於由下列所組 成之群：脂肪酸合成酶、脂肪酸去飽和酶、脂肪酸鍵加長 酶（elongase)、與聚乙醯合成酶複合體有關的蛋白質及與將 脂肪酸併入填脂類或甘油三酯分子有關的蛋白質。在一個 觀點中’該蛋白質為一種ω-3脂肪酸去飽和酶，其可由核酸 序列序列辨識編號：29編碼。在另一個觀點中，該蛋白質 為一種多烯脂肪酸異構酶。在更另一個觀點中，該蛋白質 選自於由下列所組成之群：HMG-CoA合成酶、HMG-CoA 還原酶 '鯊烯合成酶、八氫番茄紅素合成酶、八氫番茄紅 素去飽和酶、類胡蘿葡素環化酶 '類胡蘿蔔素羥化酶、類 胡蘿蔔素_酶、維他命E及硫辛酸》 在本方法的另一個觀點中，在步驟（a)中的重組型核酸 分子進一步包含一可與微生物中之標的核酸序列雜交的核 酸序列’如此包含該標的核酸序列的基因可利用同源重組 1324181 五、發明說明（13) 以第二核酸序列突變或举活化。在此觀點t，該標的核酸 序列編碼一種選自於由下列所組成之群的蛋白質：脂肪分 解酶類、脂肪酸氧化酶類、與碳水化合物類合成有關的蛋 白質、與異戍二烯途徑產物的合成有關之蛋白質、與細胞 壁組分之合成有關的蛋白質、與飽和脂肪酸合成途徑有關 之蛋白質、與多不飽和脂肪酸合成途徑有關之蛋白質、與 聚乙醢合成酶複合體有關之蛋白質及與將脂肪酸併入碟脂 類或甘油三酯分子有關之蛋白質。 本方法可進一步包括將至少一種含編碼欲表現的蛋白 質之核酸序列的額外重組型核酸分子引進細胞之步驟，其 中該核酸序列操作地連結至一轉錄控制序列。在另一個觀 點中，該方法進一步包含的步驟有將至少一種包含可與微 生物中之標的核酸序列雜交的第二核酸序列之額外的重組 型核酸分子引進細胞，如此包含該標的核酸序列的基因可 利用同源重組與第二核酸序列突變或失活化。在另一個觀 點中，該方法進一步包括的步驟有將具有編碼博菜黴素_ 結合蛋白質的核酸序列之重組型核酸分子引進細胞。在此 觀點中，該包含編碼博菜黴素-結合蛋白質的核酸序列之重 組型核酸分子進一步包括一編碼欲由細胞表現的第二蛋白 質之核酸序列’其中該編碼第二蛋白質的核酸序列操作地 連結至一轉錄控制序列。此一轉錄控制序列可包括（但是非 為限制）破囊壺菌目α-微管蛋白啟動子、破囊壺菌目乙酿乳 酸合成酶啟動子、從破囊壺菌目聚乙醯合成酶（PKS)系統來 的啟動子及破囊壺菌目脂肪酸去飽和酶啟動子。在此具體 -16

吞、發明說明（Μ) 實施例的進一步觀點中，該包含編碼博菜黴素-結合蛋白質 的核酸序列之重組型核酸分子進一步包含一可與微生物中 之標的核酸序列雜交的第二核酸序列，如此包含該標的核 酸序列的基因可利用同源重組與第二核酸序列突變或失活 化。在一個具體實施例中，該重組型核酸分子包含核酸序 列序列辨識編號：9。 在本發明之方法中，該微生物可為一種屬，其包括（但 是非為限制）破囊壺菌屬、類.縛磨肩、曰本壺菌屬及裂壺菌 屬。在一個觀點中，該微生物可為一物種，其包括（但是非 為限制）裂壺菌?/?.)、叢狀裂壺菌 aggregaiwm)、軟體裂壺菌 //macz_«wm)、破囊壺菌ί/j.)、紋狀破囊壺 菌(Thraustochytrium striatum)、黃金破囊壺菌 {Thraustochytrium aureum)、粉紅破囊壺菌 {Thraustochytrium rosewm)及曰本壺菌(Japonochytrium 5，）° 在本方法的一個具體實施例中，該引進步驟可利用一 種選自於由下列所組成之群的方法來進行：粒子轟擊、電 穿孔法、顯微注射法、微脂粒感染、吸附、感染及原生質 體融合。 本發明的另一個具體實施例係關於一種破囊壺菌目重 組型微生物，其可以包含能編碼乙醯乳酸合成酶之核酸序 列的重組型核酸分子轉形，該合成酶可授予該微生物對選 自於由下列所組成之群的化合物具有減低的敏感度：磺醯 1324181

五、發明說明（l5) 脲化合物類、咪唑啉酮種類抑制劑及氧暮苯曱酸嘧咬醋 類。該乙醯乳酸合成酶具有一種選自於由下列所組成之群 的胺基酸序列：（a)—種胺基酸序列，其選自於由下列所組 成之群：序列辨識編號：19、序列辨識編號：22及序列辨 識編號：24 ;及’（b) —種胺基酸序列，其與（a)的胺基酸序 列至少約75%相同。在一個觀點中，該核酸序列編碼具有 與（a)的胺基酸序列至少約85%相同之胺基酸序列的乙醯乳 酸合成酶。在另一個觀點中’該核酸序列編碼具有與（a)的 胺基酸序列至少約95%相同之胺基酸序列的乙醯乳酸合成 酶。在另一個觀點中，乙醯乳酸合成酶具有選自於由下列 所組成之群的胺基酸序列：序列辨識編號：19、序列辨識 編號：22及序列辨識編號：24。在更另一個觀點中，該核 酸序列可選自於由下列所組成之群：序列辨識編號：18之 核苷酸1260-3314、序列辨識編號：21之核苷酸1260-3314 及序列辨識編號：23之核苷酸1260-3314。在更另一個觀點 中’該重組型核酸分子包含選自於由下列所組成之群的核 酸序列：序列辨識編號：18、序列辨識編號：21及序列辨 識編號：23。較佳地，該編碼乙酿乳酸合成酶的核酸序列 操作地連結至一可在破囊壺菌目微生物中作用的啟動子。 在一個觀點中，該可譯碼成乙醯乳酸合成酶的核酸序列操 作地連結至選自於由下列所組成之群的轉錄控制序列：破 囊壺菌目α-微管蛋白啟動子、破囊壺菌目乙醯乳酸合成晦 啟動子、從破囊壺菌目聚乙醯合成酶（PKS)系統來之啟動子 及破囊壺菌目脂肪酸去飽和酶啟動子。在一個具體實施例

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五、發明說明（16)

中，該重組型核酸分子進一步包含一種編碼由微生物製造 的第一蛋白質之核酸序列’其中該編碼第一蛋白質的核酸 序列操作地連結至一轉錄控制序列。在另一個具體實施例 中’該重組細胞進一步以包含編碼博菜黴素_結合蛋白質的 核酸序列之重組型核酸分子轉形。較佳地，該重組型核酸 分子包含核酸序列序列辨識編號：9。在一個具體實施例 中，該包含編碼博菜黴素-結合蛋白質核酸序列的重組型核 酸分子進一步包含一編碼由細胞製造之第二蛋白質的核酸 序列，其中該編碼第二蛋白質的核酸序列操作地連結至一 轉錄控制序列。在一個具體實施例中，該微生物亦包括至 少一種包含編瑪由細胞製造的蛋白質之核酸序列的其它重 組型核酸分子。 本發明的更另一個具體實施例係關於一種分離的核酸 分子’其包含一種選自於由下列所組成之群的核酸序列： (a)序列辨識編號：9之核苷酸441 -894 ; (b) —種核酸序列， 其在序列辨識編號：9之核苷酸441-894的全長上與序列辨 識編號：9之核苷酸441-894至少約95%相同，其中該核酸 序列具有至少基本的α-微管蛋白啟動子轉錄活性；及（c)_ 種分離的多核苷酸，其包含一與（a)或（b)之多核苷酸完全互 補的核酸序列。較佳地，該分離的核酸分子包含一種選自 於由下列所組成之群的核酸序列：序列辨識編號：4及序列 辨識編號：9之核苷酸441-894。 本發明的更另一個具體實施例係關於一種破囊壺菌目 微生物轉形用之重組型載體，其包含一種編碼博菜黴素結 1324181

五、發明說明（π)

合蛋白質之核酸序列而操作地連結至選自於由下列所組成 之群的啟動子：破囊壺菌目α-微管蛋白啟動子、破囊壺菌 目乙醯乳酸合成酶啟動子、從破囊壺菌目聚乙醯合成酶 (PKS)系統來之啟動子及破囊壺菌目脂肪酸去飽和酶啟動 子。在一個觀點中，該破囊壺菌目乙醯乳酸合成酶啟動子 包含序列辨識編號：14之核苷酸1-1259。在一個觀點中， 該α-微管蛋白啟動子包含一選自於由下列所組成之群的核 酸序列：序列辨識編號：9之核苷酸類441-894 ;及一核酸 序列’其在序列辨識編號：9之核苷酸441-894的全長上與 序列辨識編號：9之核苷酸441-894至少約95%相同，其中 該核酸序列具有至少基本的α-微管蛋白啟動子轉錄活性。 在另一個觀點中’該從破囊壺菌目PKS系統來的啟動子包 括序列辨識編號：34或一包含在序列辨識編號：34中的核 酸序列’其中該啟動子具有至少基本的PKS啟動子轉錄活 性。在另一個觀點中’該重組型載體包含一選自於由下列 所組成之群的核酸序列：序列辨識編號：8及序列辨識編 號：9。 阓形簡述 第1圖闡明重組質體pTUBZEO-ΙΙ的架構。 第2圖闡明重組質體pTUBZEOll-2的架構。 第3A圖闡明重組質體pMON50200。 第3B圖闡明重組質體pMON50201。 第3C圖闡明重組質體pMON50202。 第3D圖闡明重組質體pMON50203。 -20- 五、發明說明（！8) 發明之詳細說明 ；： 本發明包括基因地轉形破囊壺菌目微生物之方法及其 相關的物質。於本文中所揭示的使用作為本發明之重組架 構的轉化株之單細胞微生物ϋ株（其亦可通常指為破囊I 菌類）全部為破囊壺菌目成員。根據本發明，措辭“破囊壺 菌”、“破囊壺菌目微生物，，及“破囊壺菌目的微生物，，可交替 著使用。本發明家在任何先前的報導巾並無察覺到有播述 可用於裂壺菌屬或任何其它破囊壺菌目微生物之轉形系 統。於本文中描述的轉形系統可使用來將外源基因引進破 囊亞菌目微生物，因此提供__種可以產生具提高的商業價 值之菌株的方法。此外，本發明能夠利用同源或非同源重 組來突變或失活化特定的基因’以提供一種改變細胞新陳 代謝及鑑定破囊壺菌目微生物中的特定基因之功能的新方 法0 更特別地，本發明家已藉由使用二種型式的轉形載體 來說明破囊壺菌目裂壺菌屬微生物（目：破囊壺菌目；科： 破囊壺菌科；屬：裂壺菌屬）之基因轉形。這些載體可利用 標準方法來引進細胞，接著根據其於選擇性化合物存在下 的生長此力來鑑別及分離該重組細胞。本發明家已說明利 用粒子轟擊來引進這些載體的功效，但是亦可使用在技藝 中熟知的其它方法來引進載體（例如，電穿孔法），且其意 欲包含在本發明中。 對一種於本文中例示的轉形載體（由pTUBzE〇 11 -2表 示的重組型載體）來說，可產生一種將從印度斯坦鏈異壁菌 1324181 五、發明說明（！9) 來之Me基因{其編碼一種《博菜黴素-結合蛋白質”)放置在 裂壺菌屬微管蛋白基因啟動子下游之嵌合基因。SV40終止 子則放置在此構造中6/e基因的下游。此載體能夠在裂壺菌 屬中表現6/e基.因，因此可授予對肉辛TM及相關化合物（當 其包含在生長培養基中於適當的程度下時對野生型細胞有 毒）之抵抗姓。在此構造中的We基因及SV40終止子來源為 一種可商業上購得的載體，名稱為pSV40/Zeo，其可從因 維戳郡股份（有限）公司（Invitrogen Corporation)(卡爾斯貝 德（Carlsbad)，CA)(工藝手冊（Technical Manual) 180202，版 本B，“曰歐卡謝（ZeoCassette)載體”；因維戳郡股份（有限） 公司’ 1600法拉第大道（Faraday Ave.)，卡爾斯貝德， CA92008)購得。微管蛋白基因啟動子可經由聚合酶連鎖反 應而分離；使用於此反應的引子之一乃以透過隨機裂壺菌 屬cDNA定序計劃獲得的序列資料為基礎。pTUBZE011-2 的基因圖顯示在第2圖，且pTUBZEO 11 -2的核苷酸序列可 由序列辨識編號：9表示。含此載體的裂壺菌屬之轉形可藉 由使用聚合酶連鎖反應及南方墨點分析來偵測併入裂壺菌 屬基因組的載體序列之存在而確定。 該We基因已由先前的研究者使用作為一種選擇標記 而用於不同生物的基因轉形，包括細菌、非破囊壺菌微藻 類、真菌、原生生物、植物及動物細胞（參見，例如，美國 專利案號6,027,900 ;蘭布雷拉斯（Lumbreras)等人，1998， 植物期刊（尸 ία”ί·/.)14 : 441-447 ;羅黑（Rohe)等人，1996， Ge”ei. 29 : 587-590 ;美辛納（Messina)等人，1995，

-22. 1324181 五、發明說明（2〇) 基因（Ge”e)165 : 213-217 ;古耶雷羅（Guerrero)等人，1(992， Jpp/. MicroZn'o/. _Sz.oiec/mo/. 36: 759-762;裝瑞兹（Perez) 等人’1989，/>/仙？_^/〇/.5/〇/.13.365-373;蓋帝格諾（〇&1^11〇) 等人，1990 ’基因91 : 35-41)。該6/e基因編碼一種“博菜黴 素-結合蛋白質”’其可授予對數種抗生素（包括博菜徽素、 腐草黴素及肉辛1^卓客特（Drocourt)等人，1990，iVMc/eic Jc此18 : 4009))之抵抗性。此基因可從因維戮郡股份 (有限）公司商業地購得，其為本發明家使用來產生裂壺菌 屬轉形載體pTUBZEOll-2的基因來源。但是，本發明家相 信首先要製造一該基因附著至破囊壺菌啟動子的轉形 載體，以使該基因可在破囊壺菌類中表現。 第二組轉形載體則利用乙醯轧發合成酶基因（β/ί)(其 為本發明家從裂壺菌基因庫中分離出來的）的活體外定點 突變而製造。這些突變可改變該已譯碼的酵素（ALS)之胺 基酸序列’如此其對嘧續隆甲基及其玄亨醯服化合物類、 咪唑琳酮種類抑制劑及氧基苯甲酸嘧啶酯類（其對破囊壺 菌目微生物敏感）更不敏感。續醯服化合物類（諸如痛續隆 甲基（SMM))經常對細胞有毒，因為它們能夠結合至不同生 物的乙醯乳酸合成酶（ALS)而使之失活化4LS可催化在該 些胺基酸（綠胺酸、白胺酸及異白胺酸）之生物合成中的第 一步驟。咪唑啉酮類、三唑嘧啶類及其它化合物類亦已顯 示出可結合至某些生物且使ALS失活化。可從其它生物編 碼乙醯乳酸合成酶（亦熟知為乙醯羥酸合成酶）的基因之突 變形式已先前地使用作為選擇標記，而用於酵母菌及植物 -23 五、發明說明（21) 约轉形㈠卿 /?ev. ρ/ι_οί ΜΟ;ϋ 40: 441-470，1989)。但是，在本發明之前尚未有報導描述從 裂壺菌屬或任何其它破囊壺菌目成員來之α/ί基因的序列 或性質，或使用突變型破囊壺菌目基因來授予抗磺醯 脲、咪唑啉酮或氧基苯曱酸嘧啶酯化合物性。事實上對 本發明家的知識來說，甚至尚未有任何已公告出的報導考 慮到破囊壺菌目微生物對這些選擇性試劑（包括嘧磺隆甲 基）的敏感度，因此，在本發明之前甚至不熟知此一選擇性 標記是否可使用在破囊壺菌轉形系統。值得注意的是該些 與熟知的α/ί基因實質上同源之基因會在不同的生物中發 生，但是不會編碼能夠催化乙醯乳酸合成的酵素 (A.oc/nmicfl ei 扪1385 ·· 4〇1_419、1998)。因 此，尚未明瞭的是該選殖的同源化合物事實上會編碼 ALS。為了最後地測定該經選殖的裂壺菌屬基因是否為真 實的α/ί基因，本發明家透過轉形實驗來說明抗嘧磺隆甲基 性與已推斷突變的裂壺菌屬β &基因之表現性具正關聯性。 本案發明人已製造出三種包含突變型a/j基因的不同 轉形載體：一突變型基因編碼一種在位置595處的色胺 酸由纈胺酸取代之酵素（質體pM〇N5〇2〇1，或ALSmutl 7)，· 另一種編碼在位置192處的脯胺酸以麩醯胺酸取代（質體 PMON50202，或ALSmut2-2)及第三種形式則包含此二突 變物（質體PMON50203，或ALSmuT3-5)。在這些載體中， 重組突變型α/ί基因的表現性可由天然的α/ί基因啟動子及 終止子所控制。這些載體的基因圖與包含野生型裂壺菌屬 I、發明說明（22) «心基因（質體PMON50200，或AE-5)的載體一起顯示在第 3A-3D圖中。含這些突變型ALS-譯碼載體的裂壺菌屬之轉 形可藉由聚合酶連鎖反應及南方墨點分析來债測併人裂壺 菌屬基因組之載體序列的存在而確定。如下列詳細地描 述，本發明家現在已鑑別出aAs基因的完整序列，其它突變 (在下列詳細指明）亦可製得。因此，所摇述的突變型“化基 因意指為典型的實例，而非包含全部可能的突變。 本發明之轉形系統已用來將外源基因經由共轉形而引 進破囊壺菌目細胞。在這些情況中，該些外來的基因放置 在不同的裂壺菌屬啟動子和適當的終止子之間（例如， SV40或裂壺菌屬基因終止子區域）。例如，本發明家已製 造及引進一種編碼從線蟲類泥蟲（Cae⑽山沿e/eg⑽〇 來的ω-3脂肪酸去飽和酶之合成基因（於本文由序列辨識編 號：29表示），以增加廿二碳六烯酸在裂壺菌屬中的程度。 序列辨識編號：30顯示出由序列辨識編號：29編碼的去飽 和酶之胺基酸序列。包含外源基因的表現匣亦可利用在含 選擇性標記之轉形載體中的直接内含物而引進破囊壺菌目 細胞。 再者，本發明家亦己說明在裂壺菌屬中發生的同源重 組之突變型ALS-譯碼載體，其指出使用重組工具來失活化 或突變特定的天然裂壺菌屬基因之可行性。 關於在本文申描述的破囊壺菌目啟動子序列，所報導 的破囊壺菌目成員之全部的核苷酸及蛋白質序列之序列資 料庫搜尋（基因銀行（GenBank))說明，在本發明之時間中並 1324181 五、發明說明（23) 無報導從裂壺菌屬或任何其它破囊壺菌目成員來的啟動子 序列。已報導的從任何裂壺菌屬物種來之唯一基因為叢狀 裂壺菌（S. aggregaiwm)之5S核醣體RNA(基因銀行編號 X06104及M13616)〇5S及18S核醣體RNA序列曾報導用於破 囊壺菌目成夤，種··優f菌及屬：類網菌屬及破囊壺菌屬， 但是此與本發明無關。從黃金破囊壺菌來之“推斷的T3/T7 似的RNA聚合酶”基因之部分編碼區域已描述（核酸研究 : 648-654，1996)，但是尚無報 導用於此基因之啟動子序列。 本發明可用來將有興趣的任何基因或其它核苷酸序列 引進破囊壺菌目微生物。此核苷酸序列包括（但是非為限制） 與編碼合成脂肪酸（例如，脂肪酸類：廿二碳六烯酸 (DHA)、廿二碳五烯酸（DPA)、廿十碳五烯酸（EPA)及花生 四稀酸（ARA))有關的蛋白質（例如，酵素類）之核酸。此些 蛋白質包括（但是非為限制）：脂肪酸合成酶類、脂肪酸去 飽和酶類、脂肪酸鏈加長酶類和與聚乙醯合成酶複合體有 關的蛋白質及/或與將此脂肪酸併入磷脂類或甘油三酯分 子有關的蛋白質。例如，本發明已使用來將編碼不同ω-3 脂肪酸去飽和酶的基因引進裂壺菌屬，以企圖經由廿二碳 五烯酸（DPA)的ω-3去飽和反應來增加細胞中的廿二碳六 烯酸（DHA)程度。至於另一個實例，亦已說明源自於裂壺 菌屬的紅藻，必洛塔（Ptilota)，之推定多烯脂肪酸異構酶之 表現性。編碼裂壺菌屬聚乙醯合成酶複合體的基因（即，聚 乙醯合成酶系統）已存放為基因銀行編號

-26- 1324181 異、發明說明（2〇 AF378329(ORFA)、AF378328(ORFB)及 A?378329(〇RFC)。 本發明亦可有用地用來將基因及其它核答酸序列（其 編碼與類異戊二烯生物合成途徑有關的蛋白質）引進破囊 壺菌目微生物。此類蛋白質包括（但是非為限制）hmgc〇a 合成酶及HMG-CoA還原酶。其它合適的蛋白質包括與源自 類異戊二烯次單元之分子合成有關的蛋白質，該次單元包 括（但是非為限制）不同的類固醇化合物和不同的類胡蘿蔔 素化合物。與不同的類胡蘿菌素化合物之合成有關的蛋白 質包括（但是非為限制）鯊烯合成酶、八氫養茄紅素合成 酶、八氫番茄紅素去飽和酶及不同的類胡蘿蔔素環化酵素 類、羥化酶類及酮酶類。 本發明亦可有用地用來將一種或多種核酸序列引進破 囊32菌目，其中該序列編碼與抗氧化劑化合物（包括（但是 非為限制）維他命E及硫辛酸）之合成有關的蛋白質。 此外，本發明可使用來將任何基因或其它核苷酸序列 載體引進破囊壺菌目微生物以使基因失活化或刪除（即， “剔除’’或“目標基因破壞”）。基因失活化或刪除典型的目的 使用來提高微生物的商業價值。例如，可想要移除能編碼 飽和及多元不飽和脂肪酸合成途徑之酵素（或可調節此些 基因表現之核酸類）的基因。在另一個觀點中，可想要抑制 或剔除能編碼與其它由破囊壺菌目微生物所產生之有用的 化合物之降解有關或會減少想要的化合物之值的蛋白質之 基因。例如，想要由本發明剔除之標的有會編碼脂肪分解 酶類、脂肪酸氧化酶類及具有會令人不愉快的風味或氣味 •27 1324181

<蛋白質的基因。在更另—個觀點中’可想要剔除能編碼 與其合成會與其它有興趣的分子競爭之化合物的合成有關 之蛋白質的基因。例如’此些基因包括（但是非為限制）編 碼與碳水化合物生物合成有關的蛋白質之基因、編碼與類 異戊二烯途徑的不同產物之合成有關的蛋白質（例如，甾醇 類或特定的類胡蘿蔔素化合物類）之基因 '及編碼與細胞壁 組分之合成有關的蛋白質之基因。以實例說明之，該些基 因已利用本發明引進裂壺菌屬細胞，以企圖使與從許旺尼 拉（说來之聚乙醯合成酶基因同源的基因失活 化，以評估其在高不飽和脂肪酸類（HUFA)的製造中之角 色。如由實例6所例証，本發明亦可使用來失活化、刪除或 突變天然基因（其與脂肪酸類、類胡蘿蔔素類、留醇類、維 他命類或其它化合物類之製造有關），以改善與這些化合物 有關的產品之經濟性或容許性。應注意的是在某些具體實 施例中（如上述討論），想要提高所獲得的蛋白質之產量， 然而在其它具體實施例中，可想要抑制相同蛋白質之生 產。此決定以欲從該特定微生物獲得的用途及製造目標為 準。本發明亦可有用地用來決定在裂壺菌屬中的基因重組 之方法。 其它可有用地引進破囊壺菌目之基因及核酸分子將由 熟知此技藝之人士所明瞭，此些基因及分子全部意欲包含 在本發明中。 本發明的不同具體實施例將初始地在下列描述，而與 本發明之破囊壺菌目基因及/或ALS蛋白質有關。但是，

-28 1324181 26 吞、發明說明（ 需了解的是此些共通的項目及方法之觀念意欲應用至在下止I. 列描述的其它基因、核酸類及蛋白質之討論上。 本發明部分基於編碼選擇標記的核酸序列之鑑別、分 離及製其合適使用於破囊壺菌微生物轉形的重組構 造。此選擇標記可選擇出已成功地以本發明之重組構造轉 形之微生物。根據本發明，可有用地用於破囊壺菌目轉形 的選擇標記為一種破囊壺菌目乙醯乳酸合成酶（即，

ALS)。較佳地，該乙醯乳酸合成酶已經改性' 突變或選擇， 而可抵抗由磺醯脲化合物類、咪唑啉酮種類抑制劑及/或氧 基苯曱酸嘧啶酯類之抑制（即，此ALS為天然發生的乙醯乳 酸合成酶之同源化合物）。 根據本發明，乙醯乳酸合成酶為一種具有乙醯乳酸合 成酶的生物活性之蛋白質，其包括天然發生的乙醯乳酸合 成酶之全長蛋白質、融合蛋白質或任何同源化合物。乙醯 乳酸合成酶的同源化合物包括與天然發生的乙醯乳酸合成 酶不同之蛋白質，其有至少一個或數個（但是不限制為一個 或數個）胺基酸已删除（例如，截斷形式的蛋白質，諸如胜 狀或片段）、巍入、轉化、取代及/或衍生（例如，利用糖化 作用、磷酸化作用 '乙醯化作用、肉豆蔻醯化作用、異戊 烯化作用、棕櫊酸化作用、醯胺化作用及/或糖基磷脂醯基 肌醇的加成作用）。天然發生的乙醯乳酸合成酶之較佳同源 化合物則詳細地描述在下列。 根據本發明’分離的蛋白質（諸如分離的乙醯乳酸合成 酶）為一種已從其天然環境移出（即，其已接受人類操作）之 -29 1324181 五、發明說明（π)

蛋白質，可例如包括經純化的蛋白質'部分純化的蛋白質、 重組製造的蛋白質及合成製造的蛋白質。就其本身而論， “分離的，’並非反映出該蛋白質已純化的輕度。較佳地，本 發明之分離的乙醯乳酸合成酶經重組地製造。“破囊壺菌目 乙酿乳酸合成崎，，指為-種從破囊壺菌目微生物來的乙酿 乳酸合成_(包括天然發生的乙醯乳酸合成酶之同源化合 物），或其已從破囊壺菌目微生物的天然發生之乙酿乳酸: 成酶的結構（例如，序列）之知識而製造。換句話說，破囊 壺菌目乙酿乳酸合成梅包括任何具有從破囊壺菌目微生物 來之天然發生的乙酿乳酸合成蜂之結構及功能的乙酿乳酸 合成酶，或其為一種從破囊壺菌目微生物來之天然發生的 乙醯乳酸合成酶之可生物活化（即，具有生物活性）的同源 化合物（如詳細地描述於本文）。就其本身而論，破囊壺菌 目乙醯乳酸合成酶可包括純化、部分純化、重組、突變/ 改性及合成的蛋白質。

通常地，蛋白質的生物活性或生物作用指為任何可歸 因於天然發生形式之蛋白質的蛋白質所展示或進行的功 能，如可在活體内（即在蛋白質的天然生理環境中）或活體 外（即，在實驗室條件下）測量或觀察到。例如，乙醯乳酸 合成酶的生物活性包括乙醯乳酸合成酶的酵素活性。蛋白 質之改性（諸如同源化合物或模倣物（在下列討論可產生 具有與天然發生的蛋白質相同之生物活性的蛋白質，戋具 有比天然發生的蛋白質減少或增加的生物活性之蛋白質。' 可造成蛋白質表現性減少或蛋白質活性減少之改性可指為 ^30-, 1324181 五、發明說明（28 蛋白質的失活化（完全或部分)Γ向下調節或減少作用。類 似地，可造成蛋白質表現性增加或蛋白質活性增加之改性 可指為蛋白質的放大、過度產生、活化、提高、向上調節 或增加作用。

關於本發明之乙醯乳酸合成酶，較佳地為存在於乙醯 乳酸合成酶同源化合物中之改性（如與天然發生的乙醯乳 酸合成酶比較），實質上不改變或至少實質上不減少該合成 酶的基本生物活性（如與天然發生的蛋白質比較）。但是， 此類同源化合物可在蛋白質的功能性或酵素活性外具有與 天然發生的形式不同之特徵，諸如與天然發生的蛋白質比 較，其可減少對某些抑制化合物的敏感度。較佳地，天然 發生的乙醯乳酸合成酶之同源化合物具有降低（即，減低、 減少）對結合至及使天然發生的乙醯乳酸合成酶失活化之 化合物的敏感度，如與同源化合物所衍生之天然發生的乙 醯乳酸合成酶比較。例如’續醯脈化合物類（諸如嘲續隆甲 基（SMM))經常對細胞有毒，因為它們能夠結合至及使乙醯 乳酸合成酶（ALS)失活化。咪喷琳_類、三峻嘴咬類及其 它類似的化合物類（於本文通常指為咪唑淋酮種類抑制劑） 亦已顯示出可結合至及使ALS失活化。因此，天然發生的 乙醯乳酸合成酶之同源化合物較佳地對磺醯脲化合物類、 咪唑啉酮種類抑制劑及氧基苯曱酸嘧啶酯類具有減低的敏 感度（例如，藉由中斷此類抑制劑的結合場址或減低結合場 址對此抑制劑之親和力），同時維持乙醯乳酸合成酶的酵素 活性。 -31 1324181

•32 1324181 弄、發明說明（3〇) 基酸，其中該蛋白質具有乙醯乳酸合成酶生物鴣性。 在另一個具體實施例中，本發明之乙醯乳酸合成酶具 有與選自於由下列所組成之群的胺基酸序列至少約75%相 同的胺基酸序列：序列辨識編號：15、序列辨識編號：19、 序列辨識編號：22、序列辨識编號：24，且超過此些序列

的任何一種至少95個胺基酸，其中該蛋白質為一種乙醯乳 酸合成酶（即’具有乙醯乳酸合成酶生物活性）。更佳地， 本發明之乙酿乳酸合成酶具有與序列辨識編號：15、序列 辨識編號：19、序列辨識編號：22或序列辨識編號：24任 何一種至少約80%相同的胺基酸序列，甚至更佳地至少約 85%相同，甚至更佳地至少約9〇%相同、甚至更佳地至少 約95%相同，甚至更佳地至少約96%相同，甚至更佳地至 少約97%相同’甚至更佳地至少約98%相同及甚至更佳地 至少約99%相同，且超過序列辨識編號：丨5、序列辨識編 號：19、序列辨識編號：22或序列辨識編號：24的任何一 種至少95個胺基酸，其中該蛋白質具有乙醯乳酸合成酶生 物活丨生甚至更佳地，本發明之乙酿乳酸合成酶與序列辨 識編號：15、序列辨識編號：19、序列辨識編號：22或序 列辨識編號：24任何一種之胺基酸序列，具有任何上述所 提出的相同百分比，且超過序列辨識編號：15、序列辨識 編號M9'序列辨識編號：22或序列辨識編號：24任何一 種至少1〇〇個胺基酸，更佳地125,更佳地15〇，更佳地175， 更佳地200 ’更佳地225，更佳地25〇，更佳地275，更佳地 更佳地325,更佳地350,更佳地375,更佳地4〇〇,更

-33 - 1324181 五、發明說明（Μ) 佳地425，更佳地450，更佳地475，更佳地500，更佳地525， 更佳地550及更佳地575個胺基酸，其中該蛋白質具有乙醯 乳酸合成酶生物活性。 如於本文中所使用（除非另有指定），所參考的相同百 分比（％)指為同源體的評估，其可使用下列方法來進行： (l)BLAST 2.0基本BLAST同源搜尋，使用標準預設參數以 blastp做胺基酸搜尋及以blastn做核酸搜尋，其中該查詢序 列可利用預設值過濾出低複雜性區域（描述在阿斯苦 (Altschul)，S.F.，瑪登（Madden)，T.L·，史卡弗（SchWffer)， A.A.，張（Zhang)，J·，張，Ζ·，米勒（Miller)，W.&里普曼 (Lipman)，D.J.(1997) “ 有間隔的（Gapped) BLAST 及 PSI-BLAST :新一代蛋白質資料庫搜尋程式。”Nucleic Acids Res. 25 : 3389-3402，其全文以參考之方式併於本 文）；（2)BLAST 2排比（使用下列描述的參數）；（3)及/或具 標準預設參數的PSI-BLAST(位置特定的重複 (Position-Specific Iterated) BLAST)。應注意的是由於在 BLAST 2.0基本BLAST及BLAST 2間的標準參數上之某些 差異，二種特定的序列其可使用BLAST 2程式認定為具有 明顯的同源性，然而在BLAST 2.0基本BLAST中進行的搜 尋（使用一序列作為查詢序列）可能在上部配對中不為相同 的第二序列。此外，PSI-BLAST提供一種自動的、容易使 用的“曲線(profile)”搜尋版本，其為一種敏感的搜尋序列同 源化合物之方法。該程式首先進行具間隔的BLAST資料庫 搜尋。PSI-BLAST程式使用任何有意義的排比資訊回饋來

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i、發明說明（32) 構造一種位置特定的計分矩陣，其取代了下一輪資料庫搜 尋用之查詢序列。因此，可了解的是該相同百分比可使用 這些程式的任何一種來測量。 二種特定的序列可使用BLAST 2序列來彼此排比，如 描述在塔土梭伐（Tatusova)及瑪登，（1999)，“BLAST 2序列 -一種新型的比較蛋白質及核苷酸序列用之工具”，F五ΛΛ5 Microho/174 : 247-250，其全文以參考之方式併於本 文。BLAST 2序列排比以blastp或blastn使用BLAST 2.0演算 法進行，以在二種序列間進行具間隔的BLAST搜尋（BLAST 2.0)，以在產生的排比中引進間隔（刪除及嵌入）。於此，為 了清楚目的，可使用如下的標準預設參數來進行BLAST 2 序列排比。 對blastn來說，使用OBLOSUM62矩陣： 配對的獎勵（reward)= 1 錯誤配對的罰分（penalty)=-2 開放間距（open gap)(5)及延伸間距（extension gap)(2) 罰分 間距 x_ 下降（dropoff)(50)ULi^E^ll(10)字形大小 (word size)(ll)過遽（filter)(開） 對blastp來說，使用OBLOSUM62矩陣. 開放間距（11)及延伸間距（1)罰分 間距x_T降（50)預期（10)字形大小（3)過滤（開)。 本發明之乙醯乳酸合成酶亦可包括具有序列辨識編 號：15、序列辨識編號：19、序列辨識编號：22或序列辨 -35 1324181

五、發明說明（33)

識編號：24任何一種的至少30個連續胺基酸殘基之胺基酸 序列的蛋白質（即，有30個連續的胺基酸殘基1〇〇%與序列 辨4編號_ 15、序列辨識編號：19、序列辨識編號：22或 序列辨識編號：24任何一種的30個連續胺基酸相同）^在一 個較佳的具體實施例中，本發明之乙醯乳酸合成酶包括具 有序列辨識編號·· 15、序列辨識編號：19、序列辨識編號： 22或序列辨識編號：24任何一種的至少5〇個連續胺基酸殘 基之胺基酸序列的蛋白質，更佳地至少75 ,更佳地至少 100，更佳地至少115 ’更佳地至少13〇，更佳地至少15〇， 更佳地至少200 ’更佳地’至少250，更佳地至少300，更佳 地至少350，更佳地至少400，更佳地至少450，更佳地至少 500’更佳地至少550,更佳地至少600及更佳地至少650個。 此一蛋白質具有乙醯乳酸合成酶生物活性。

根據本發明，與於本文描述的核酸或胺基酸序列有關 之名稱“連續的”或“連貫的”意謂著以完整的序列連接。例 如，對包含第二序列的30個連續（或連貫的）胺基酸之第一 序列來說，意謂著該第一序列包括一完整的30個胺基酸殘 基序列’其與在第二序列中的30個胺基酸殘基之完整序列 100%相同。類似地，對具有與第二序列“100%相同”之第— 序列來說，此意謂著第一序列精確地與第二序列相符合而 在核苷酸或胺基酸間並無間隔》 在另一個具體實施例中，本發明之乙醯乳酸合成酶（包 括乙醯乳酸合成酶同源化合物）包括一種蛋白質，其與天然 發生的乙醯乳酸合成酶胺基酸序列具有足夠類似的胺基酸 •36-… 1324181

i、發明說明（3〇 序列，編碼能在中度、高度或非常高度嚴苛的條件（描述在 下列）下，與編碼天然發生的乙醯乳酸合成酶核酸分子 (即，與編碼天然發生的乙醯乳酸合成酶胺基酸序列之核酸 股的補體）雜交之同源化合物的核酸序列。較佳地，乙醯乳 酸合成酶可由能在中度、高度或非常高度嚴苛的條件下與 一核酸序列（其編碼包含由序列辨識編號：15、序列辨識編 號：19、序列辨識編號：22或序列辨識編號：24表示之胺 基酸序列的蛋白質）的補體雜交之核酸序列所編碼。甚至更 佳地，本發明之乙醯乳酸合成酶可由能在中度、高度或非 常高度嚴苛的條件下與序列辨識編號：15之核苷酸 1260-3314、序列辨識編號：18之核苷酸1260-33 14、序列 辨識編號：21之核苷酸1260-3314或序列辨識編號：23之核 苷酸1260-3314的補體雜交之核酸序列所編碼。此雜交條件 詳細地描述在下列。編碼本發明之乙醯乳酸合成酶的核酸 序列之核酸序列補體指為與編碼乙醯乳酸合成酶的股互補 之核酸股的核酸序列。需了解的是編碼提供的胺基酸序列 之雙股DNA包含一單股DNA和具有與該單股DNA互補的 序列之補體股。就其本身而論，本發明之核酸分子可為雙 股或單股，且包括那些可在嚴苛的雜交條件下與編碼胺基 酸序列序列辨識編號：15、序列辨識編號：19、序列辨識 編號：22或序列辨識編號：24之核酸序列及/或與可譯碼成 任何此胺基酸序列的互補核酸序列形成穩定混雜體的核酸 分子。推論出互補序列的方法已由熟知此技藝之人士所熟 知。應注意的是因為胺基酸定序及核酸定序技術並非全部 •37· 1324181 五、發明說明（μ) 無誤差’於本文顯現的序列充其；量僅代表本發明之乙酿乳 酸合成酶的明顯序列。 乙醯乳酸合成酶同源化合物可為天然對等基因變異或 天然突變的結果。本發明之乙醯乳酸合成酶同源化合物亦 可使用於技藝中熟知的技術來製造，包括（但是非為限制） 使用例如傳統或重组DNA技術對蛋白質直接改質，或對編 碼蛋白質的基因改質，以達成隨機或有目標的致突變。編 碼乙醯乳酸合成酶的核酸之天然發生的對等基因變異為一 · 種基本上發生在基因組中的相同位址（l〇cus)(或位址（l〇d)) 處之基因’而為編碼胺基酸序列序列辨識編號：15的基因， 但是其由於由例如突變或重組所造成的天然變異而具有類 似但是不相同的序列。天然的對等基因變異編碼的蛋白質 典型地與比較用的基因所編碼之蛋白質具有類似的活性。 同種類的對等基因變異編碼相同蛋白質，但是由於基因密 碼的降解而具有不同的核酸序列。對等基因變異亦可包含 在基因的5’或3,之未轉化區域的改變（例如，在調節控制區 鲁 域中）。對等基因變異已由熟知此技藝之人士所熟知。 本發明之乙醯乳酸合成酶蛋白質亦包括基因融合（例 如，使用來過度表現重組蛋白質的可溶性、活性形式）、致 突變基因（諸如具有密碼子改性以提高基因轉錄及轉化之 基因）及截斷基因（諸如具有薄膜結合區域已移除，以產生 可溶形式的薄膜蛋白質之基因；或具有信號序列已移除， 而在特別重組的宿主中具差的容忍度之基因）的表現產物。 本發明之蛋白質及/或同源化合物的最小尺寸為足以

1324181 乒、發明說明（％)

具有乙醯乳酸合成酶生物活性之尺寸。較佳地，本發嗎之 蛋白質長度至少有30個胺基酸，更佳地至少約5〇 ,更佳地 至少75 ’更佳地至少1 〇〇，更佳地至少丨15，更佳地至少1， 更佳地至少150,更佳地至少200,更佳地至少25〇,更佳地 至少300，更佳地至少35〇 ’更佳地至少4〇〇，更佳地至少 450，更佳地至少500，更佳地至少55〇，更佳地至少6〇〇， 更佳地至少650，更佳地至少684個胺基酸長。除了實際限 制外’此蛋白質的最大尺寸並無限制，其中該蛋白質可包 括乙醯乳酸合成酶蛋白質的部分或乙醯乳酸合成酶的全 長，若必要時可加上額外的序列（諸如融合蛋白質序列）。 本發明亦包括一種融合蛋白質，其包括一種附著至一 個或多個融合部分之乙醯乳酸合成酶區域（即，根據本發明 之乙醯乳酸合成酶的胺基酸序列）。合適使用於本發明之融 合部分包括（但是非為限制）具有下列功能的部分：其可提 咼蛋白質的穩疋性，可提供其它想要的生物活性；及/或可 輔助乙酿乳酸合成酶純化（例如，利用親和色譜法）。合適 的融合部分可為具有想要的功能之任何尺寸的區段（例 如，可授予增加的穩定性、溶解度、作用或生物活性；及/ 或蛋白質的簡單純化）。融合部分可連結至蛋白質之含乙醯 乳酸合成酶區段的胺基及/或羧基終端，且可易地切割以能 夠直接獲得乙醮乳酸合成酶。融合蛋白質較佳地藉由培養 經融合核酸分子（其可譯碼出包括附著至含乙醯乳酸合成 酶區段的叛基及/或胺基終端融合部分之蛋白質）轉移的重 組細胞而製造。 -39 1324181 五、發明說明（37) 本發明亦包括一種乙醯乳酸合成酶模倣物。如於本文 中所使用’名稱“模倣物”習慣上指為任何能夠模仿天然發 生的胜肽之生物作用的胜肽或非胜肽化合物，經常因為該 模傲物具有模仿天然發生的胜肽之基本結構的基本結構， 及/或具有天然發生的胜肽之顯著的生物性質，該些模倣物 可包括（但是非為限制）：實質上從原型改性的胜肽，諸如 與天然發生的胜肽類似之無側鏈胜肽（例如，此改性可減少 其對降解的敏感性）；抗遺傳及/或催化的抗體，或其片段； 分離的蛋白質之非蛋白質部分（例如，碳水化合物結構）； 或合成或天然的有機分子，例如包括經由組合化學認定的 核酸類及藥物類。 此模倣物可使用技藝中所熟知的不同方法來設計、選 擇及/或鑑別》不同的藥物設計方法（可有用地設計在本發 明有用的模傲物或其它治療化合物中）則揭示在毛里克 (Maulik)等人，1997，分子生物科技（A/0/ecMiar Biotechnology) ·治療應用反策略（几打叩⑽… 沿rakgia)，威利-里斯有限公司（wiiey_Liss，Inc.)中， 其全文以參考之方式併於本文。乙醯乳酸合成酶模倣物可 例如從分子多樣性策略（讓大的、化學多樣性的分子基因庫 (libraries)快速建構之相關策略的組合）；天然或合成的化 合物基因庫，特別是從化學或組合的基因庫（即，序列或尺 寸不同’但是具有類似的構造嵌段之化合物的基因庫）；或 利用合理、直接或隨機的藥物設計而獲得。參見例如前述 的毛里克等人。 -40- 五、發明說明（38) 在分子多樣性對策申，大化合物基因庫可例如從胜 肽、募核苷酸類、碳水化合物類及/或合成的有機分子中， 使用生物、酵素及/或化學方法來合成。在發展分子多樣性 對策中的關鍵參數包括次單元多樣性、分子尺寸及基因庫 多樣性。篩選此基因庫的共同目標為使用組合選擇的序列 應用以獲得對想要的標的具高親和力之配位基，然後利用 隨機或直接設計策略來最佳化引導分子。分子多樣性的方 法則由毛里克等人詳細地描述，同前所述。 例如’毛里克等人亦揭示出直接設計的方法，其為使 用者可直接從適當選擇的片段之片段基因庫來創造新穎分 子的方法：隨機設計的方法，其為使用者可使用基因或其 它演算法來隨意地突變片段及其組合，同時應用選擇標準 來評估候選配位基的適合性；及以網栅為基礎的方法，其 為使用者可計算在三維接受器結構及小片段探針間之交互 作用的能量，接著將適合的探針場址連結在一起。 根據本發明，乙醖乳酸合成酶可源自於任何破囊壺菌 目微生物’特別地，源自於任何裂壺菌屬微生物。在一個 具體實施例中’本發明之較佳的乙醯乳酸合成酶具有選自 於序列辨識編號：15、序列辨識編號：19、序列辨識編號： 22 '序列辨識編號：24群組之胺基酸序列。該具有由序列 辨識編號：15表示之胺基酸序列的蛋白質為一種從破囊壺 菌目微生物來之天然發生（即野生型）的乙醯乳酸合成酶， 特別地，為一種裂壺菌屬乙醯乳酸合成酶。由序列辨識編 號：19、序列辨識編號：22、序列辨識編號：24表示之胺 •41- 1324181

五、發明說明（39) 基酸序列為己改性之体列（如與天然發生的由胺基酸序列 序列辨識编號：15表示之蛋白質比較），如此產生的酵素已 減抵對磺醯脲化合物類、咪唑啉酮種類抑制劑及氧基笨甲 酸嘧啶酯類的敏感度。應注意的是由序列辨識編號：19' 序列辨識編號：22及序列辨識编號：24表示之蛋白質具有 乙醞乳酸合成酶生物活性〃對磺醯脲化合物類、咪唑啉酮 種類抑制劑及氧基笨曱酸嘧啶酯類具有減低敏感度的乙醯 乳酸合成酶為本發明較佳的乙醯乳酸合成酶，因為編碼此 合成酶的核酸序列可使用在本發明之重組型載體中作為選 擇標記。 因此，本發明的一個具體實施例係關於一種改性的乙 醯乳酸合成酶，其包括任何序列辨識編號：15、序列辨識 編號：19、序列辨識編號：22及序列辨識編號：24之任何 同源化合物，其中該同源化合物具有乙醯乳酸合成酶生物 活性’特別地，其中該同源化合物對磺醯脲化合物類、咪 唑啉酮種類抑制劑及氧基苯甲酸嘧啶酯類具有減低的敏感 度’如與天然發生的由胺基酸序列序列辨識編號：15表示 之蛋白質比較。在一個觀點中，此乙醯乳酸合成酶同源化 合物包括具有胺基酸序列不同於序列辨識編號：15之蛋白 質，其可藉由在下列一個或多個位置處刪除、嵌入或取代 一胺基酸：116G、117A、192P、200A、251K、358M、383D,、 592V、595W或599F。這些位置與在酵母菌乙醯乳酸合成 酶中熟知的ALS突變場址相符合（即，各別地為U6G、 117A、192P、200A·、251K、354M、379D、583V、586W •42· '五、發明說明（40) 及 590F)(參見馬日爾（Mazur)及法扣（Falcoj)，1989，d/iww. ^ev•朽PAyiz·。/. Pfflwi Λ/ο/. 5ζ·οΛ 40 : 441-470，其全文 以參考.之方式併於本文）。其它可能的突變場址已在技藝中 熟知’而為根據從其它生物在ALS中成功地胺基酸突變的 那些。將此些場址應用在破囊壺菌目ALS中相符合的場址 則亦包含在本發明中。 如上述所討論，本發明部分基於破囊壺菌微生物轉形 用之重組架構體的發現與製造。因此，本發明的一個具體 實施例係關於一種分離的核酸分子，其包含一種編碼破囊 壺菌目乙酿乳酸合成酵的核酸序列及其完全互補的核酸序 列。編碼本發明之乙醢乳酸合成酶的核酸分子包括一種編 碼任何上述討論之乙醯乳酸合成酶蛋白質（包括同源化合 物）的核酸分子。更特別地是’本發明的一個具體實施例係 關於一種包含編碼一蛋白質的核酸序列之分離的核酸分 子，其中該蛋白質具有的胺基酸序列與選自於序列辨識編 號：15、序列辨識編號：19、序列辨識編號：22、序列辨 識編號：24群組之胺基酸序列有至少約65〇/〇相同，且超過 此些序列的任何一種至少約600個胺基酸，其中該蛋白質為 一種乙醯乳酸合成酶（即，具有乙醯乳酸合成酶生物活 性）。更佳地，本發明之分離的核酸分子具有編碼與序列辨 識編號：15、序列辨識編號：19、序列辨識編號·· 22或序 列辨識編號：24任何一種至少約70%相同的胺基酸序列之 核酸序列’更佳地至少約75%相同，甚至更佳地至少約80〇/〇 相同，甚至更佳地至少約85%相同，甚至更佳地至少約9〇% 1324181

五、發明說明（W) 相同，甚至更佳地至少約95%相同，甚至更佳地至少約96% 相同’甚至更佳地至少約97%相同，甚至更佳地至少約98% 相同及甚至更佳地至少約99%相同，且超過序列辨識編 號：15、序列辨識編號：19、序列辨識編號：22或序列辨 識編號：24任何一種至少約600個胺基酸，其中該蛋白質具 有乙醖乳酸合成酶生物活性。

在另一個具體實施例中，本發明之分離的核酸分子具 有編碼與選自於序列辨識編號：15、序列辨識編號：19、 序列辨識編號：22、序列辨識編號：24群組之胺基酸序列 至少約75%相同的胺基酸序列之核酸序列，且超過此些序 列任何一種至少95個胺基酸，其中該蛋白質為一種乙醯乳 酸合成酶（即，具有乙醯乳酸合成酶生物活性更佳地， 本發明之分離的校酸分子具有編碼與序列辨識編號：i 5、 序列辨識編號：19、序列辨識編號：22或序列辨識編號： 24任何一種至少約80%相同的胺基酸序列之核酸序列，甚 至更佳地至少约85%相同，甚至更佳地至少約90%相同， 甚至更佳地至少約95%相同，甚至更佳地至少約96%相 同’甚至更佳地至少約97%相同，甚至更佳地至少約98% 相同及甚至更佳地至少約99%相同，且超過序列辨識編 號：15、序列辨識編號：19 '序列辨識編號：22或序列辨 識編號：24任何一種至少95個胺基酸，其中該蛋白質具有 乙醯乳酸合成酶生物活性》 在更另一個具體實施例中，本發明之分離的核酸分子 具有編碼與序列辨識編號：15 '序列辨識編號：19、序列 •44· 1324181 ο

辨識編號：23或序列辨識編號·· 24任何一種具有任何上述 參考的百分比相同性之胺基酸序列的核酸序列，且超過序 列辨識編號：15、序列辨識編號：19、序列辨識編號：22 或序列辨識編號：24任何一種至少1 〇〇個胺基酸，更佳地 125 ’更佳地150，更佳地175，更佳地200，更佳地225，更 佳地250,更佳地275 ’更佳地300,更佳地325，更佳地350， 更佳地375 ’更佳地400，更佳地425，更佳地450，更佳地 475’更佳地500,更佳地525,更佳地550,更佳地575個胺 基酸’其中該蛋白質具有乙醯乳酸合成酶生物活性·相同 百分比可使用如上所述之BLAST 2.0基本BLAST預設參數 來測量》 在一個具逋實施例中，編碼本發明之乙醞乳酸合成酶 的核酸分子包括可在中度嚴苛的條件下與編碼天然發生p 乙醖乳酸合成酶之核酸序列補體雜交之分離的核酸分子， 甚至更佳地在高度嚴苛的條件下，甚至更佳地在非常高度 嚴苛的條件下。較佳地，編碼本發明的乙醯乳酸合成酶之 分離的核酸分子包含一核酸序列，其可在中度或高度嚴苛 的條件下與編碼包含由序列辨識編號：15、序列辨識編號： 19、序列辨識編號：22或序列辨識編號：24表示之胺基酸 序列的蛋白質核酸序列補體雜交。在一個具體實施例中， 該分離的核酸分子包含一核酸序列，其可在中度、高度或 非常高度嚴苛的條件下與由序列辨識編號：14之核苷酸 1260-3314、序列辨識編號：18之核苷酸1260-3314、序列 辨識編號：21之核苷酸1260-3314或序列辨識編號：23之核 -45- 1324181 五、發明說明（43) 苷酸1260-3314表示之核酸序列補體雜交。 如於本文中所使用，雜交條件指為一種標準的雜交條 件在此之下核酸分子可使用來鑑別類似的核酸分子◊此 標準條件例如揭示在山姆布魯克（Sambrook)等人，分子選 殖（Mo/ecw/ar C/o;n’ng):實驗室手冊（Ιαάοηιίο/*;; A/fl/ma/)， 冷泉哈伯實驗室出版社（Cold Spring Harbor Labs Press)， 1989’山姆布魯克等人，同前所述，其全文以參考之方式 併入本文（特別地參見第9.31-9.62頁）。此外，計算適當的 雜交及清洗條件以獲得核苷酸的錯誤配對之變化程度在准 許範圍的雜交之式子則揭示在，例如，門寇斯（Meinkoth) 等人，1984，5/oc/ie/n. 138，267-284 ;門寇斯等人， 同前所述，其全文以參考之方式併入本文。 更特別地是，中度嚴苛的雜交及洗滌條件（如於本文指 出）指為可分離出具有與在雜交反應中使用來探測的核酸 分子之核酸序列至少約70%相同的核酸分子之條件（即，該 條件准許約30%或較少的核苷酸錯誤配對）。高度嚴苛的雜 交及洗滌條件（如於本文指出）指為可分離具有與在雜交反 應中使用來探測的核酸分子之核酸序列至少約8〇〇/0相同的 核酸分子之條件（即，該條件可准許約20%或較少的核苷酸 錯誤配對）。非常高度嚴苛的雜交及洗滌條件（如於本文指 出）指為可分離具有與在雜交反應中使用來探測的核酸分 子之核酸序列至少約90%相同的核酸分子之條件（即，該條 件准許約10%或較少的核苷酸錯誤配對）。如上述所討論， 熟知技藝之人士可使用在門寇斯等人（同前所述）中的式子 -46- 1324181

五、發明說明（44) 來計算適當的雜交及清洗條件，以獲得這些特別的核苷， 錯誤配對程度。此些條件將依欲形成的DNA : RNA或 DNA : DNA混雜體（hybrids)而變化。經計算的DNA : DNA 混雜體之熔化溫度比DNA : RNA混雜體少10EC。在特別的 具體實施例中，DNA : DNA混雜體的嚴苛雜交條件包括在 6XSSC(0.9MNa+)的離子強度下，在約20EC至約35EC間之 溫度（較不嚴苛）中雜交，更佳地，在約28EC至約40EC間（更 嚴苛），甚至更佳地，在約35EC至約45EC間（甚至更嚴苛）， 且具適當的清洗條件。在特別的具體實施例中，DNA:RNA 混雜體的嚴苛雜交條件包括在6X SSC(0.9M Na+)的離子強 度下，在約30EC至約45EC間之溫度中雜交，更佳地，在:約 38EC至約50EC間，甚至更佳地在約45EC至約55EC間，以 類似嚴苛的清洗條件。這些值根據大於約1〇〇個核苷酸之分 子、0%甲醯胺及約40%的G+C含量的熔化溫度來計算。此 外，Tm可如山姆布魯克等人（前述，第9.31至9.62頁）所提經 驗地計算。通常地，清洗條件應該儘可能地嚴苛，且應該 適當地選擇雜交條件。例如，雜交條件可包括鹽與溫度條 件（其低於特別的混雜體經計算的Tm約20-25EC)之組合；及 清洗條件典型地包括鹽與溫度條件（其低於特別的混雜體 經計算的丁„>約12-20EC)之組合。合適使用於DNA : DNA混 雜體的雜交條件實例包括在6X SSC(50%甲醯胺）中，在:約 42EC下雜交2-24小時；接著為洗滌步驟，其包括在室溫下 於約2X SSC中洗滌一次或多次；接著為在較高的溫度及較 低的離子強度下額外的洗滌（例如，在約0.1X-0.5X SSC -47- 1324181 五、發明說明（45) 中，於約37EC下清洗至少一次，接著在約0.1X-0.5X SSC 中，於約68EC下清洗至少一次）。 在另一個具體實施例中，編碼本發明之乙醯乳酸合成 晦的核酸分子包括一分離的核酸分子，其具有編瑪含一胺 基酸序列之蛋白質的核酸序列，其中該胺基酸序列包含序 列辨識編號：15、序列辨識編號：19、序列辨識編號：22 或序列辨識編號：24任何一種至少30個連續的胺基酸殘基 (即，30個連續胺基酸與序列辨識編號：15、序列辨識編號： 19、序列辨識編號：22或序列辨識編號：24任何一種的30 個連續胺基酸殘基具有100%相同）。在一個較佳的具體實 施例中，該分離的核酸分子包含一編碼具有一胺基酸序列 之蛋白質的核酸序列，該胺基酸序列包含序列辨識编號： 1.5、序列辨識編號：19、序列辨識編號：22或序列辨識編 號：24任何一種的至少50個連續胺基酸殘基，更佳地至少 75，更佳地至少100，更佳地至少115，更佳地至少130，更 佳地至少150,更佳地至少200,更佳地至少250,更佳地至 少300,更佳地至少350,更佳地至少400,更佳地至少450， 更佳地至少500,更佳地至少550,更佳地至少600及更佳地 至少650。此蛋白質具有乙醖乳酸合成酶生物活性》在一個 具體實施例中，該編碼乙醖乳酸合成酶之分離的核酸.分子 包含一核酸序列，其具有序列辨識編號：15之核苷酸 1260-3314、序列辨識編號：18之核苷酸1260-3314、序列 辨識編號：21之核奋酸1260-3314或序列辨識編號：23之核 苷酸1260-3314的連續核苷酸至少60個連續的核苷酸，更佳

48- 1324181 •五、發明說明（46) 地至少150，更佳地至少225，更佳地至少300，更佳地至少 345，更佳地至少390，更佳地至少450，更佳地至少525， 更佳地至少600，更佳地至少750，更佳地至少900，更佳地 至少1050，更佳地至少1200，更佳地至少1350，更佳地至 少1500，更佳地至少1650，更佳地至少1800及甚至更佳地 至少1950。 本發明之特別佳的核酸分子包含序列辨識編號：14之 核苷酸類1260-3314(其編碼序列辨識編號：15)、序列辨識 編號：18之核苷酸類1260-3314(其編码序列辨識編號.： 19)、序列辨識編號：21之核苷酸1260-3314(其編瑪序列辨 識編號：22)或序列辨識編號：23之核苷酸1260-3314(其編 碼序列辨識編號：24)、序列辨識編號：14、序列辨識編號： 1.8、序列辨識編號：21或序列辨識編號：23。 根據本發明’該分離的核酸分子為一種已從其天然環 境移出（即，其已接受人類操作）的核酸分子，該天然環境 為發現該天然核酸分子的基因組或染色體。就其本身而 論’“分離的’’不必反映出該核酸分子已純化的程度，而是 顯示出該分子不包括全部的基因組或全部的染色趙（於此 發現天然核酸分子）。分離的核酸分子可包含一基因，諸如 於本文描述的乙酿乳酸合成酶基因。包含一基因之分離的 核酸分子不為包含此基因的染色艘片段，而是包括與基因 有關的譯瑪區域及調節區域，但是在相同的染色趙上並無 天然發現的其它基因。分離的核酸分子亦可包括一位於旁 側之額外核酸（即，.在序列的5,及/或3’末端）之特定核酸序 -49- 1324181 五、發明說明（47) 列（即，為異種序列），〗 : '其中該額外的核酸在天然中正常地 不會位於該特定核酸序列之旁側。分離的核酸分子可包括 DN'A、RNA(例如》mRNA)、或DNA或RNA之衍生物（例如’， cDNA)。雖然措辭“核酸分子’’主要指為生理的核酸分子及 措辭“核酸序列”主要指為在核酸分子上的核苷酸序列，二 措辭可交替地使用，特別是關於能編碼一蛋白質的核酸分 子或核酸序列。 較佳地，本發明之分離的核酸分子可使用重組DNA技 術（例如，聚合酶連鎖反應（PCR)放大、選殖）或化學合成來 製造。分離的核酸分子包括天然的核酸分子及其同源化合 物，包括（但是非為限制）天然的對等基因變異及核苷酸已 以此方法嵌入、刪除、取代及/或轉化之經改性的核酸分 子，此改性可在蛋白質生物活性上提供想要的效應。對等 基因變異及蛋白質同源化合物（例如，可由核酸同源化合物 編碼的蛋白質）已在上述詳細地討論。 核酸分子同源化合物可由熟知此技藝之人士使用一些 方法來製造（參見，例如，山姆布魯克等人，同前所述）。 例如，核酸分子可使用多種技術來改性包括（但是非為限制） 傳統的致突變技術及重組DNA技術，諸如定點突變、核酸 分子的化學處理以引發突變、核酸片段的限制酵素切.割、 核酸片段的連接、核酸序列的選擇區域之PCR放大及/或致 突變、寡核苷酸混合物之合成及連接混合物群組以“建立核 酸分子之”混合物及其組合。核酸分子同源化合物可藉由該 核酸及/或藉由與野生型基因雜交而編碼的蛋白質之功能 1324181 五、發明說明（48) 來篩選，而選自於一經改性的核酸之混合物。 類似地，本發明之核酸分子的最小尺寸為足以編碼具 有想要的生物活性之蛋白質的尺寸，或足以形成探針或能 與編碼天然蛋白質的核酸分子之補體序列形成穩定的混雜 體之募核莶酸引子（例如，在中度、高度或非常高度嚴苛的 條件下）。就其本身而論，編碼此蛋白質之核酸分子尺寸可 視在核酸分子與補體序列間之核酸組合物及百分比同源或 相同性，和本身的雜交條件（例如，溫度、鹽濃度及甲醯胺 濃度）而定。使用作為寡核苷酸引子或作為探針的核酸分子 之最小尺寸典型地長度至少約12至約15個核苷酸（若該核 酸分子富含GC)，及長度至少约15至約18個鹼基（若它們富 含AT)。除了實際的限制外，在本發明之核酸分子的最大 尺寸上並無限制，該核酸分子可包含部分能編碼蛋白質的 序列（例如，編碼乙醖乳酸合成酶的序列）或編碼全長蛋白 質的核酸序列。 本發明的一個具體實施例包括一種使用來轉形破囊壺 菌目微生物之重組型載體》根據本發明，重組型載體為一 種經設計的（即’人工製造）核酸分子，其可使用作為一種 用來操作核酸序列之選擇及用來將此核酸序列引進宿主細 胞的工具。因此，該重組型載體合適使用於選殖、定序及/ 或操作核酸序列之選擇，諸如可藉由將該選擇的核酸序列 表現及/或傳遞進入佰主細胞以形成一重組細胞。此一載趙 典型地包括異種核酸序列’其經發現不天然地毗連至欲傳 送的核酸序列的核酸序列，雖然該載體亦可包括控制的核

•51- 1324181 五、發明說明（将）

酸序列（例如’啟動子、未轉化的區域），其經發現天然地 毗連至本發明的核酸分子（詳細地在下列討論）。該載體可 為RNA或DNA(原核生物的或真核生物的），典型地為質 體。該载體可維持為染色體外的元素（例如，質體）或其可 併入重組型微生物的染色體。全部的載體可適當地保持在 宿主細胞中，或在某些條件下，該質體DNA可刪除、留下 本發明的核酸分子β經合併的核酸分子可由染色體啟動子 控制、由天然或質體啟動子控制或由數種啟動子控制之組 合。核酸分子的單一或多重複製可併入染色體。本發明之 重組型載體包括至少一種可用於根據本發明之破囊壺菌目 微生物的選擇標記，諸如編碼破囊壺菌目乙醯乳酸合成酶 (天然蛋白質或同源化合物）之核酸序列或編碼6心基因的核 酸序列（描述在下列）。如於本文中所使用，措辭‘‘重組型核 酸分子”主要用來指為一種重組型載體，其已連接至欲選 殖、操作、轉形進入宿主細胞（即，澈入）的核酸序列。

典型地’重組型載體（因此重組型核酸分子）包括至少 一種本發明之核酸分子，其操作地連結至一種或多種轉錄 控制序列。如於本文中所使用，措辭“重組分子，，或“重組型 核酸分子，，主要地指為一種操作地連結至一轉錄控制序列 的核酸分子或核酸序列，但是可與措辭“核酸分子”交替地 使用，當此核酸分子為一種如於本文討論的重組分子時。 根據本發明，措辭“操作地連結，，指為以一種將該核酸分子 連結至一轉錄控制序列上之方法，如此當分子轉移（即，轉 形、轉導（transduced)、轉移、結合或導入）進入宿主細胞 -52 1324181

五、發明說明（5〇) 時能夠表現。轉錄控制序列為可控制轉錄的起始、延長或 終止之序列。特別重要的轉錄控制序列為可控制轉錄起始 的那些，諸如啟動子'增強子'操作子及抑制子序列。合 適的轉錄控制序列包括任何可在破囊壺菌目微生物中作用 的轉錄控制序列。本發明家相信首先要分離及鑑別至少三 種此類啟動子，其詳細地描述於本文別處。

較佳的啟動子包括（但是非為限制）破囊壺菌目乙醢乳 酸合成酶啟動子（於本文由序列辨識編號：之核苷酸 1-1259表示）、破囊壺菌目α-微管蛋白啟動子（於本文由序列 辨識編號：9之核苷酸441-894表示）、從破囊壺菌目聚乙醯 合成酶（PKS)系統來之啟動子（包含在序列辨識編號：34中） 及破囊壺菌目脂肪酸去飽和酶啟動子（包括在序列辨識編 號：31中；應注意的是脂肪酸去飽和酶啟動子在美國臨時 專利申請系列案號60/284，116中（前述）指為去飽和酶啟動 子）。α-微管蛋白啟動子、乙醯乳酸合成酶啟動子及脂肪酸 去飽和酶啟動子之選殖及定序則描述在實例部分。在一個 較佳的具體實施例中，該α-微管蛋白啟動子包含天然發生 的破囊壺菌目α-微管蛋白啟動子序列（序列辨識編號：9之 核苷酸類441-894)，或一與序列辨識編號：9之核苷酸 441-894至少95%相同的核酸序列，其中該啟動子具有至少 基本的α-微管蛋白啟動子轉錄活性。類似地，較佳的乙醯 乳酸合成酶啟動子包含一天然發生的破囊壺菌目乙醯乳酸 合成酶啟動子之核酸序列（表現在序列辨識編號：14之核苷 酸1-1259中），或一與序列辨識編號：14之核苷酸1-1259至 -53· 1324181 五、發明說明（51) 少75%相同:的核酸序列，更佳地80%，更佳地85%，更佳地 90%及更佳地95%，其中該啟動子具至少基本的乙醯乳酸 合成酶啟動子轉錄活性。較佳的PKS啟動子包含一天然發 生的破囊壺菌目PKS啟動子之核酸序列（表現在序列辨識 編號：34中）’或一與序列辨識編號：34至少75〇/〇相同的核 酸序列’更佳地80%，更佳地85%，更佳地90%及更佳地 95%，其中該啟動子具至少基本的Pks啟動子轉錄活性。 最後地，較佳的脂肪酸去飽和酶啟動子包含一天然發生的 破囊壺菌目脂肪酸去飽和酶啟動子之核酸序列（表現在序 列辨識編號：31中），或包含在與序列辨識編號·· 3丨至少75% 相同的核酸序列中，更佳地80%，更佳地85%，更佳地9〇〇/0 及更佳地95%，其中該啟動子具至少基本的脂肪酸去飽和 酶啟動子轉錄活性。用來測定相同百分比的方法已先前地 描述於本文的乙酿乳酸合成酶序列，且包含於本文。 在一個具體實施例中’本發明之重组型載體為—種表 現載體。如於本文中使用，措辭“表現載體，，習慣上指為一 種合適用來製造編碼產物（例如，有興趣的蛋白質）之載 體。在此具體實施例中，編碼欲製造的產物之核酸序列嵌 入該重組型載體以產生一重組型核酸分子。該編碼欲製造 的蛋白質之核酸序列以操作地連結該核酸序列至載體（例 如，本發明之破囊壺菌目啟動子）中的控制序列之方法欲入 載體’其可在重組型微生物中轉錄及轉譯該核酸序列。本 發明之選擇標記可選擇一已成功地引進本發明之重組型核 酸分子的重組型微生物。 -54 1324181

五、發明說明（52) 在另一個具體實施例中，本發明之重組型載體為一種 致標載體。如於本文中使用，措辭“致標載體，，習慣上指為 一種使用來將特別的核酸分子傳送進入重組細胞之載體， 其中該核酸分子使用來刪除或失活化在宿主細胞中的内生 基因（即，使用於標的基因分裂或剔除的技術）^此載體亦 可在技藝中熟知為“剔除’，載體。在此具體實施例的一個觀 點中’部分載體（但是更典型地，核酸分子嵌入載體（即， 截入））具有一與宿主細胞中之標的基因的核酸序列同源之 核酸序列（即，其目標為刪除或失活化之基因）。該載體嵌 入之核酸序列可設計成結合至該標的基因，如此該標的基 因及該嵌入進行同源重組’藉此該内生標的基因會刪除、 失活化或減弱（即，至少部分内生標的基因會突變或刪除）。 在一個具體實施例中，本發明的較佳重組型載體為一 種合適用於破囊壺菌目微生物之重組型載體，及其包括一 種編碼本發明之乙醯乳酸合成酶分子的核酸序列。較佳 地’該乙醯乳酸合成酶與天然發生形式（序列辨識編號：15) 比較地改性’如此該合成酶可授予已以重組型載體轉移的 破囊壺菌目微生物對續醢服化合物類、味》坐琳_種類抑制 劑及/或氧基苯曱酸嘧啶酯類具有減低的敏感度。較佳地， 此重組型載體包含一編碼包含不同於序列辨識編號：15胺 基酸序列的乙醯乳酸合成酶蛋白質之核酸序列，其可藉由 在下列一個或多個位置處刪除、敌入或取代一胺基酸： 116G、117A、192P、200A、251K、358M、383D、592V、 595 W或599F。在一個具體實施例中，此乙醯乳酸合成酶蛋 五、發明說明（53) 白質具有一胺基酸序列，其包括（但是非為限制）：序列辨 識編號：19、序列辨識編號：22及序列辨識編號：24。較 佳地，此重組型載體包含一選自於下列之核酸序列：序列 辨識編號：18之核苷酸1260-33 14、序列辨識編號：21之核 普酸1260-3314及序列辨識編號：23之核苷酸1260-3314。 在一個特別佳的具體實施例中，包含ALS-譯碼核酸序列 (其可授予想要的抵抗）之重組型載體包括序列辨識編號·· 18、序列辨識編號：21及序列辨識編號：23。 在一個具體實施例中，合適用來授予已以重組型載體 轉移的破囊壺菌目微生物對磺醯脲化合物類、咪唑啉酮種 類抑制劑及/或氧基苯曱酸嘧啶酯類具有減低的敏感度之 重組型載體包含序列辨識編號：15，其為天然發生的裂壺 菌屬乙酿乳酸合成酶序列。在此具體實施例中，該重組型 載體设計成可過度表現天然發生的合成酶，藉此過度表現 性授予微生物具有抵抗特定化合物之效應。在此具體實施 例中’需由熟知此技藝之人士了解的是使用重組DNA技術 可改善該經轉形的核酸分子之表現性控制，例如可藉由操 作在宿主細胞中的核酸分子之複製數目、那些核酸分子的 轉錄效率、所產生的轉錄之轉譯效率及後轉譯改性效率。 額外地’啟動子序列可基因地設計以改善可與天然啟動子 比較的表現程度。可有用地用來控制核酸分子表現性的重 組技術包括（但是非為限制）將核酸分子接合進入一個或多 個宿主細胞的染色體、將載體穩定序列加入至質體、轉錄 控制訊號的取代或改性（例如，啟動子、操作子、增強子）、 -56- 1324181 耳、發明說明（μ) 轉譯控制訊號的取代或改性（例如，核糖體結合場址閃 達卡諾（Shine-Dalgarno)序列）、改性該核酸分子以與宿主 細胞使用的密碼子相符合、及刪除使轉錄不安定化的序列。 在本發明的一個具體實施例中，合適使用於破囊壺菌 目微生物轉形的重組型載體包括將從印度斯坦鏈異壁菌來 的Sh 6/e基因（其編碼“博菜黴素-結合蛋白質，，)作為選擇標 記，而與先前於本文描述之破囊壺菌目啟動子組合。一包 含仏基因及破囊壺菌目啟動子的較佳重組型載體包括^ 如，由序列辨識編號：8或9表示之載體序列。印度斯坦鏈 異壁菌博菜黴素結合蛋白質之胺基酸序列於本文可表示為 序列辨識編號：10 » 本發明之重組型核酸分子（其可為DNA或RNA)亦可包 括額外的控制序列，諸如轉譯控制序列、複製起始點及其 匕可與重組細胞相容的控制序列。在一個具體實施例中， 本發明的重組分子（包括接合至宿主細胞染色體的那些）亦 包括分泌訊號（即，訊號部分核酸序列），以使表現的蛋白 質能夠從產生蛋白質的細胞中分泌出。合適的訊號部分包 括天然地與欲表現的蛋白質聯結之訊號部分，或任何能引 導分泌根據本發明之蛋白質的異種訊號部分。在另一個具 體實施例中，本發明之重組分子包含一領導序列（leadei_ seqUence)以使表現的蛋白質能夠傳送至及嵌入宿主細胞 薄膜。合適的領導序列包括天然地與蛋白質聯結的領導序 列’或任何能引導蛋白質傳遞及嵌入至細胞薄膜的異種領 導序列。 -57.- 1324181 五、發明說明（《) 可有用地用於破囊壺菌目微生物轉形之不同工具已描 述，本發明之一個具體實施例係關於一種破囊壺菌目微生 物細胞的轉形方法。該方法包括第一步驟：（a)將先前於本 文描述的重組型核酸分子引進破囊壺菌目微生物細胞。該 重組型核酸分子包含一編碼乙醯乳酸合成酶的核酸序列， 其可授予該些細胞對選自於由下列所組成之群的化合物具 有減低的敏感度：續醯眼化合物類、咪嗅琳§同種類抑制劑 及氧基苯甲酸嘧啶酯類。此乙醯乳酸合成酶已在上述詳細 地描述’且包括具有由序列辨識編號·· 19 '序列辨識編號： 22及序列辨識編號：24表示之胺基酸序列的乙酿乳酸合成 酶和此些序列的任何一種，或如上述討論的序列辨識編 號：15之同源化合物。該方法包括第二步驟：（b)選擇已成 功地經重組型核酸分子轉形的細胞，其可藉由將（a)的細胞 培養在包含至少一種可抑制未轉形的細胞之化合物的培養 基中，該化合物可選自於由下列所組成之群：磺醯脲化合 物、味吐啉銅種類抑制劑及氧基苯甲酸嘧啶酯類。可於此 類化合物存在下生長之細胞已成功地轉形。 可使用在本方法之重組型核酸分子包含任何先前描述 於本文之本發明的重組型載體，及典型地包括至少一種編 碼欲由重組細胞製造之蛋白質的核酸序列（即，包含一重組 表現載體），或對重組細胞中内生基因之標的刪除或失活化 有用的核酸序列（即，包含一重組的致標載體）。 在一個具體實施例中，該重組型核酸分子進一步包含 一種編碼欲由細胞製造的蛋白質之核酸序列，其令該編碼

-58 1324181 吞、發明說明（56)

蛋白質之核酸序列操作地連結至一轉錄控制序列。想要在 破囊壺菌目中製造的蛋白質已由熟知此技藝之人士所熟 知，及全部意欲包含在本發明中。特別佳的蛋白質包括（但 是非為限制）與選自於由下列所組成之群的脂肪酸之合成 有關的蛋白質：廿二碳六烯酸（DHA)、廿二碳五稀酸 (DPA)、廿十碳五婦酸(EPA)及arachadonic酸(ARA)。此類 蛋白質包括，例如’脂肪酸合成酶、脂肪酸去飽和酶、脂 肪酸鏈加長酶、與聚乙醯合成酶複合體有關的蛋白質及與 將脂肪酸併入磷脂類或甘油三酯分子有關之蛋白質。在一 個觀點中，該蛋白質為一種ω_3脂肪酸去飽和酶，其可由核 酸序列序列辨識編號：29編碼。序列辨識編號：3〇代表去 飽和酶的胺基酸序列。在另一個觀點中，該蛋白質為一多 烯脂肪酸異構酶。在一個具體實施例中，可使用本方法在 破囊壺菌目微生物中製造的蛋白質包含與類異戊二烯生物 合成途徑有關的蛋白質。此類蛋白質包括（但是非為限 制）HMG-CoA合成酶、HMG-C〇A還原酶、鯊烯合成酶、八 氫番茄紅素合成酶、八氫番茄紅素去飽和酶、類胡蘿蔔素 環化酶、類胡蘿葡素羥化酶、類胡蘿蔔素酮酶。在更另一 個具體實施例中，可使用本方法在破囊壺菌目微生物中製 造的蛋白質包括（但是非為限制）維他命E及硫辛酸。 在一個具體實施例中，於本發明之方法中有用的重組 型核酸分子包括一可與微生物中的標的核酸序列雜交之核 酸序列，如此包含該標的核酸序列的基因可藉由同源重組 與第二核酸序列突變或失活化^此_核酸序列可與能編碼 1324181

1324181 發明說明 ~具有編碼博菜黴素-結合蛋白質的核酸㈣之額外的重組 型核酸分子引進細胞的步驟。在此具體實施例中，該額外 的重組型核酸分子較佳地以連續步驟引進，而非共轉形。 較佳地，該包含編碼博菜黴素-結合蛋白質的核酸序列之重 組型核酸分子進-步包含一種編碼欲由細胞表現的第二蛋 白質之核酸序列，其中該編碼第二蛋白質的核酸序列操作 地連結至一轉錄控制序列。再者（或此外），該包含編碼博 • 菜黴素_結合蛋白質的核酸序列之重組型核酸分子進一步 包含一種可與微生物中之標的核酸序列雜交的第二核酸序 列，如此包含該標的核酸序列之基因可利用同源重組與第 二核酸序列突變或失活化。在一個具體實施例中，此重組 型核酸分子包含一核酸序列序列辨識編號：9 ^ 合適於使用本發明之方法來轉形的宿主細胞包括（但 是非為限制）任何破囊壺菌目微生物。該宿主細胞可為未轉 形的細胞或已以至少一種核酸分子轉移的細胞。可使用於 • 本發明的較佳宿主細胞包括下列屬的微生物（但是非為限 制）：破囊壺菌屬、類網菌屬、曰本壺菌屬及裂壺菌屬。在 這些屬中，較佳的物種包括（但是非為限制）：任何裂壺菌 屬物種，包括叢狀裂壺菌、軟體裂壺菌屬、微小裂壺菌屬； 任何破囊壺菌屬物種（包括先前的優肯菌物種諸如tz維斯 兒均、t/.阿米巴•而）、[/薩卡瑞那 、C/·普分達(pro/训如）、[/.輻射狀（“山-如幻、 t/.微小及優肯菌bp-5601)，及包括紋狀破囊壺 菌、黃金破囊壺菌、粉紅破囊壺菌；及任何曰本壺菌屬物 五、發明說明（59) 種。特別佳的破囊壺菌目菌株包括（但是非為限制）：裂壺 菌（S31) (ATCC20888);裂壺菌（S8) (ATCC20889);裂壺菌 (LC-RM) (ATCC18915);裂壺菌（SR21);叢狀裂壺菌 (Goldstein et Belsky) (ATCC28209);軟體裂壺菌屬（Honda et Yokochi) (IF032693);破囊壺菌（23B)(ATCC20891);紋 狀破囊壺菌（Schneider) (ATCC24473);黃金破囊壺菌 (Goldstein) (ATCC34304);粉紅破囊壺菌（Goldstein) (ATCC28210);及日本壺菌（LI) (ATCC28207)。 根據本發明，名稱“轉形”習慣上指為任何將外源核酸 分子（即，重組型核酸分子）嵌入微生物細胞（此破囊壺菌目 微生物細胞）的方法。在微生物系統中，名稱“轉形”使用來 描述一種因微生物取得外源核酸之遺傳改變，而基本上與 名稱“轉移”同義。合適的轉形技術包括（但是非為限制）粒 子轟擊、電穿孔法、顯微注射法、微脂粒感染、吸附、感 染及原生質體融合。 在一個具體實施例中，欲使用本發明之方法製造的蛋 白質可在能有效產生蛋白質之條件下藉由培養能表現該蛋 白質的細胞（即，重組的破囊壺菌目微生物）而製造。在某 些例子中’該蛋白質可回收，及在其他中，該微生物可以 整體或以溶成物形式收集及使用作為“生物量”。在另一個 具體實施例中，標的基因可藉由在能有效地於細胞中重組 之條件下培養且已以包含本發明之致標載體的重組分子轉 形之細胞來刪除或失活化，而造成標的基因的刪除或失活 化。較佳的培養細胞為本發明之重組細胞。有效的培養條 1324181

五、發明說明（6〇) 件包括（但是非為限制）有效的培養基、生物反應器、溫度喝 pH及讓蛋白質製造及/或重組的氧狀態。有效的培養基指為 任何破囊壺菌目細胞典型地培養在其中的培養基。此培養 基典型地包含一具有可同化的碳、氮及磷酸鹽來源之水性 培養基，及適當的鹽類、礦物質、金屬及其它營養品（諸如 維他命）。合適的培養基及培養條件之實例則在實例部分詳 細地討論。合適於破囊壺菌目微生物之培養條件亦描述在 美國專利案號5,340,742(1994年8月23日由巴克雷（Barclay) 發佈），其全文以參考之方式併於本文。本發明之細胞可培 養在習知的發酵生物反應器、搖動燒瓶、試管、微滴盤及 平淺培養皿中。該培養可在適合於重組細胞的溫度、pH及 氧含量下進行。此些培養條件為熟知技藝之人士的專門技 術。 依使用來製造的載體及宿主系統而定，本發明所產生 的蛋白質可保持在重組細胞中、分泌進入發酵培養基中、 分泌至二個細胞膜間之空間、或保留在細胞膜的外表面。 措辭“回收蛋白質”指為收集含蛋白質的全部發酵培養基且 不需額外的分離或純化步驟。由本發明之方法製造的蛋白 質可使用多種標準蛋白質純化技術來純化，諸如（但是非為 限制）親和色譜法、離子交換層析法、過滤法、電泳法、厭 水交互層析法、凝膠過滤層析法、逆相層析法、刀豆素A 層析法（concanavalin A chromatography)、色層焦集法 (chromatofocusing)及差分增溶作用（differential solubilization)。由本發明之方法製造的蛋白質較佳地以 -63·' 1324181

1324181 五、發明說明（ό2) 質）中的基因表現減少之基蜂改性，可指為基因的失活化 (完全或部分）、删除、中斷、妨礙或向下^卜例如，在 會造成由此基因編碼的蛋白質之功能減少的基因中之基因 改性可為基因完全刪除（即’基因不存在因此蛋白質不存 在）；基因突變，其造成蛋白質不完整或無轉譯（例如，蛋 白質不表現广或基因突變，其會減少或徹底破壞蛋白質的 天然功能（例如，蛋白質的表現減少或無酵素活性或作用） 的結果。可造成基a表現或魏增加的基因改性指為基因 放大、過度產s、過度表ί見、活化、提高、加入或向上調 節。 根據本發明，重組的破囊壺菌目微生物可使用任何破 囊壺菌目微生物來製造。較佳的破囊壺菌目屬包括（但是非 為限制）：破囊壺菌屬、類網菌屬、曰本壺菌屬及裂壺菌屬。 在這些屬中，較佳的物種包括（但是非為限制）：任何裂壺 菌屬物種，包括叢狀裂壺菌、軟體裂壺菌屬；任何破囊壺 菌屬物種（包括任何先前的優肯菌物種，諸如υ維斯兒 均、U· ·阿米巴、U.薩卡瑞那、U.普分達、U.輻射狀、 U.微小及優肯菌Sp. ΒΡ_5601)、紋狀破囊壺菌、黃金破囊 壺菌、粉紅破囊壺菌；及任何日本壺菌屬物種。特別佳的 破囊：s菌目菌株包括（但是非為限制）：裂壺菌（S31) (ATCC20888);裂壺菌（S8) (ATCC2〇889);裂壺菌（LC RM) (ATCC18915);裂壺菌（SR21);叢狀裂壺菌（Goldstein et Belsky) (ATCC28209);軟體裂壺菌屬（Honda et Yokochi) (IFO. 32693);破囊壺菌（23B) (ATCC20891);紋狀破囊壺 1324181 五、發明說明（《) 菌（Schneider) (ATCC24473);黃金破囊壺菌（Goldstein) (ATCC34304);粉紅破囊壺菌（Goldstein) (ATCC28210);及 曰本壺菌（11) (ATCC28207)。 下列實例僅提供闡明目的而不意欲限制本發明之範 圍。 實例 實例1 此實例說明重組質體pTUBZEOll-2之製造。 重組質體pTUBZEOll-2的架構闡明在第1及2圖。此質 體包括從印度斯坦鏈異壁菌來的6/e基因其官能地耦合至 分離自裂壺菌的α-微管蛋白基因啟動子。此質體可如下產 生。將cDNA選殖物（CGNE0002-001-b6)從裂壺菌的cDNA 基因庫分離，且部分定序（序列辨識編號：1)，而作為大規 模裂壺菌屬cDNA定序計劃的部分◊核苷酸序列利用 BLASTX同源搜尋而決定以譯碼α-微管蛋白（季許（Gish)， W.及D. States. 1993，Gewei. 3 : 266-272)。從鹼基 116 至550推衍來的胺基酸序列則93%相同於從帚狀沛維特菌 (Pe/veiica 基因銀行編號U58642)來的α-微管蛋 白之第一 145個胺基酸。 為了分離與此基因有關的啟動子，將基因組DNA從裂 壺菌細胞分離，且使用“基因組瓦克（Genome Walker)TM ”工 具箱（kit)(克隆科技實驗室有限公司（Clontech Laboratories， Inc·)，帕羅阿脫（Palo Alto)，CA)加工，其包括將基因組DNA 以限制核酸内切酶酵素地消化以產生平整末端（blunt

-66. 芩、發明說明（64) end)，接著將該經消化的DNA連接至在工具箱中提供的特 弋雙索DNA連接分子⑽叩如则⑹心十然後在…微管 蛋白譯碼序列的Dna上游使用於工具箱t提供的外部連 接引子（API)及微管蛋白特定的引子pGR2〇(序列辨識編 號：2),利用聚合酶連鎖反應（PCR)放大。該基因可使用在 工具箱中提供的巢狀連接引子（AP2)及巢狀α-微管蛋白特 弋的引子PGR19(序列辨識編號：3)來進行進一步的放大。 所產生的PCR產物次選殖進入質體pCR2 因維戳

郡公司，卡爾斯貝德，CA)。將所選殖的片段之一定序； 立即地進行α-微管蛋白基因起始密碼子的725bp序列則提 供為序列辨識編號：4 » 使用根據以此方法獲得的DNA序列之寡核苷酸引 子’使用叫DNA聚合酶（博精（perkin_Elrner)公司，諾沃克 (Norwalk) ’ CT)的PCR可使用來產生一經改性的α_微管蛋 白啟動子區域’其中A/"coI限制場址已併入DNA片段的3，末 端；此ATcoI場址包含一起始密碼子，其在α_微管蛋白譯碼 區域中的相同位置處。在此反應中所使用的引子為 pGR33(序列辨識編號：5)及PGR34(序列辨識編號：6)，及 該模板則分離自裂壺菌細胞的基因組DNA。使用下列反應 條件：94EC 4分鐘；（94EC 1 分鐘、54EC 45秒、72EC 2分 鐘）x30 ; 72EC 7分鐘。將此片段選殖進入質體 PCR2.1-T0P0，以形成質體p7TUB(序列辨識編號：7)。以 #c〇I消化質體P7TUB，且所產生的含裂壺菌屬ot-微管蛋白 啟動子區域之463-bp片段可利用瓊脂糖凝膠纯化來分離》 •67· 1324181 五、發明說明（65) 包含從印度斯坦鏈異壁菌來的、有SV40啟動子及終止子位 於旁侧之i/e基因的質體pSV4〇/Zeo(因維戳郡公司，卡爾斯 貝德，CA)亦以ArcoI消化，以產生32〇1_bp&314_bp片段。 3201 -bp片段經瓊脂糖凝膠純化且連接至從p7TUB來的 463-bp #coI片段’以產生pTuBZEO-ll(序列辨識編號：8)， 描述在第1圖。 其次，質體pTUBZEO-ΙΙ以知Μ消化，且將所產生的包 含有裂壺菌屬α-微管蛋白啟動子及SV40終止子位於旁側 之ά/e基因的1122-bp片段以瓊脂糖凝膠純化，並連接至質 體pUC19(美新（Messing)，J. 1983. Afei/i. 101 : 20)，其已利用以办消化而線性化。所產生的質體命名為 pTUBZE011-2(序列辨識編號：9)，而描述在第2及4圖。質 體pTUBZEOll-2亦指為pMON50000。在序列辨識編號：9 中，裂壺菌屬α-微管蛋白啟動子包括在核苷酸441-894中； 厶/e基因譯碼區域包含在核苷酸895-1269中；及SV40終止子 包括在核苷酸1270-1524中。 實例2 此實例說明重組質體ρΜΟΝ50200、pMON50201、 PMON50202 及pMON50203之製造。 從裂壺菌來的天然乙醯乳酸合成酶-譯碼基因（ALS)可 以下列方法分離。將cDNA選殖物（LIB81-028-Q1-E1-D9) 從裂壺菌屬cDNA基因庫分離，且部分定序（序列辨識編 號：11)，以作為大規模裂壺菌cDNA定序計劃的部分。該 核苷酸序列可利用BLASTX同源物決定以編碼乙醯乳酸合 -68 1324181

五、發明說明（66)

成酶；例如，從鹼基154至378推衍出的胺基酸序列與從裂 殖酵母菌基因銀行編號 P36620)來的ALS之胺基酸313至387有68%的相同度。然後 可獲得此選殖的cDNA之全長序列，其指出該cDNA選疽物 不包括全部的ALS譯碼區域。為了獲得全長的ab基因’使 用標準規則以372-bp洋地黃素（digoxygenin)(DIG)-標定的 DNA探針（指為ALS2探針）來探測裂壺菌屬基因組λ基因庫 (參見例如山姆布魯克等人，分子選殖：實驗室手冊。冷泉 哈伯實驗室出版社，1989)。ALS2探針可經由PCR使用核 苷酸混合物（其包括DIG-11-UTP(波新爵-曼漢生物化學 (Boehringer Mannheim Bio.chemica/s) GmbH，德國））、使用 前置引子PGR38(序列辨識編號：12)及反置引子PGR39(序 列辨識編號：13)而產生，其以cDNA選殖物 LIB81-028-Q-E1-D9序列為基準。可分離出一種以ALS2探 針（標示為ALS-4A)鑑別的基因組選殖物，且進一步使用 DIG-標定的ALS2探針利用南方雜交墨點法來標出特徵。從 經消化的ALS-4A λ DNA來之4.9-kbp片段經發現可與 ALS2探針雜交。此片段可利用瓊脂糖凝膠純化法來分離， 以T4 DNA聚合酶處理以產生平整末端，然後連接至經 Smal-消化的 pBluescriptll KS+(史崔塔基因公司（Stratagene Coi*p·)，La Jolla，CA)，以形成質體pMON50200(描述在第 3-A圖）。pMON50200序列提供為序列辨識編號：14。由裂 壺菌屬α/·?基因編碼的乙醯乳酸合成酶酵素之序列則提供 為序列辨識編號：15。 五、發明說明（67) 質體pMON50201、pMON50202及pMON50203(各別地 C 描述在第3-B、3-C及3-D圖）可利用定點突變從質體 PMON50200製造，如此已編碼的乙醢乳酸合成酶酵素不再 由某些化合物抑制，包括嘧磺隆甲基（SMM)»這些質體如 下建構。使用“轉型a”(Transformera)定點突變工具箱（克隆 實驗室有限公司，帕羅阿脫，CA)來將下列突變引進質體 pMON502000，根據製造者的說明書。寡核苷酸選擇引子 (DM19(序列辨識編號：16))則使用在全部三種架構中；此 引子可使在PMON50200的多重選殖區中獨特的五coRV場 址轉換成場址。當同時引進基因序列中的Jc/I場址 時，引子DM14(序列辨識編號：17)可使用來將在已譯碼的 ALS酵素中之胺基醆殘基號碼595的色胺酸改變成纈胺 酸；所產生的質體指為pM〇N50201(序列辨識编號：18)。 同樣地’引子DM15(序列辨識編號·· 2〇)使用來將在已譯碼 的ALS酵素中之胺基睃殘基號碼192的脯胺酸改變成麩醯 胺酸’且引進在ah基因中的仏以場址（site)，可產生質體 pMON50202(序列辨識編號：21)。為了架搆出質體 pMON50203(序列辨識編號：23)，使用DM1^DM15引子 二者’以產生一種包含上述描述的二胺基酸殘基取代物之 已譯碼的ALS酵素。由質體pM〇N5〇2〇1、pM〇N5〇2〇2及 pMON50203编碼的突變的乙醯乳酸合成酶酵素之序列各 別地提供為序列辨識編號：19 '序列辨識編號：22，及序 列辨識編號：24。 管例3 . •70- 1324181

五、發明說明（68) 此實例說明裂壺菌以在實例1及2中描述的重組分子之 基因轉形》 二在此實例中使用的菌株為裂壺菌N230D，一種美國型 式培養收集（American Type Culture. Collection)菌株20888 (ATCC，馬拉薩斯（Manassas)，VA)的衍生物。對液趙培養 物來說，細胞在M50-3培養基中，於30EC下’在200-300rpm 之振動下純種地生長。Μ50·3培養基包括下列組分：NaCl， 12.5克；MgS〇4 · 7H20，2.5克；Κα，0.5克；CaCl2，0.05 克；葡萄糖，30克；麩胺酸Na，3克；KH2P〇4，0.4克；酵 母菌萃取物，1克；NaHC03，0.4克；Na2EDTA，30毫克： FeCl3 . 6H20，1.2毫克；H3B〇3，34.2毫克；ZnS04 · 7H20， 0.67毫克；CoCl2 . 6H20，0.13毫克；NaMo04 · 2H20，25 克；CuS04 . 5H2〇，l〇克；NiS04 · 6H20，0.26毫克；硫 胺素· HC1，100克；維生素Η，0.5克；氱鈷胺，0.5克；及 去離子水（至1升）；最後將pH調整至7.0。對在固態培養基 上生長來說，細胞在30EC下，於藉由加入1.5%(w/v)的瓊 脂而固化的M50-3培養基或M1E-3培養基上生長。M1E-3垮 養基包括下列組分：葡萄糖，4克：（NH4)2S04，0.75克； Na2S04，5克；MgS04.7H20，2克；ΚΗ2Ρ04，0.5克；Κα ’ 0.5克；CaCl2· 2Η20,0.1 克；MOPS緩衝劑，20.9克；FeS04 · 4H20，0.3 毫克；MnCl2 · 4H20，0.1毫克；ZnS04 · 7H20 ’ 80克；CoCl2 · 6H20，2克；NaMo04 · 2H20 ’ 1克；CuS〇4 . 5H2〇，60克；NiS04.6H20，80克；硫胺素· Ha，320克； CA·泛酸鹽，320克；氰鈷胺’ 8克；及去離子水（至1升）； --β - -71- 五、發明說明（69) 最後pH調整至7.0。 ， 裂壺菌對肉辛頂及SMM的敏感度可利用下列方法來 測量，藉由將這些抑制劑以不同的濃度包含在已固化的 Ml E-3培養基中，且將該些細胞以類似於在製程期間使用 於重組細胞選擇所顯現的那些密度分佈在板上。 裂壺菌屬細胞的基因轉形可利用粒子轟擊來進行（山 福特（Sanford)，J.C.，F.D.史密斯，及 J.A. RusseH，1993， MeM· 217 : 483-509)，使用生物-雷德（Bio-Rad) 基因鎗（Biolistic)PDS-1000/He粒子傳遞系統（生物·雷德實 驗室，赫庫勒斯（Hercules)，CA) »裂壺菌屬sp. N230D細胞 在液體M50-3培養基中生長，至在680奈米（ODmo)之光學密 度為0.4-0.8(10毫米的光學路徑長度）。將與1.001>68〇相符 的細胞之液份簡單地離心，移除上層溶液，且將小球化的 細胞再懸浮於100: 1的無菌水中。然後，將該再懸浮的細 胞分佈在4至6公分包含瓊脂·固化的培養基（例如，M50-3 或M1E-3培養基）的圓形平淺培養皿上，且擱置3〇至6〇分 鐘，所以過量的水可吸入固體培養基中；此指為標的板。 將1.5毫克的黃金微載體（0.6 :額定直徑，可從生物· 雷德實驗室有限公司，赫庫勒斯，CA購得）液份以2.5克的 轉形質體DNA(即，質體pTUBZEOl卜2、pMON50201、 PMON50202或pMON50203)塗佈，如每個製造者的說明書 (基因鎗®PDS-1000/He粒子傳遞系統說明手冊；生物·雷德 實驗室，赫庫勒斯，CA)。細胞以塗佈DNA的黃金微載體 使用下列條件來轟擊：1100磅/平方英寸轟擊盤、艙中真空 •72· 1324181 戶·、發明說明（70) 度25"Hg ;微載體發射組合地放置在頂板上且標的麵放置 在中間板上’以提供1.5-2公分的轟擊盤停止遮擋距離及約 7公分的停止遮擋標的距離。在轟擊後，將該些細胞在3〇EC 下於標的板上回收4-6小時。然後以1.5毫升的無菌水將細 胞沖洗出標的板，收集在微量離心管中，簡單地離心，再 懸浮於400 : 1的無菌水中。將1〇〇微升的懸浮液分佈到四個 包含150-200克/毫升的肉辛TM(因維戳郡公司，卡爾貝德 (Carlbad) ’ CA)或25克/毫升的SMM之M1E-3板的每個上。 含肉辛1^的板子使用來選擇已以質體pTUBZEOll-2轉形 的細胞’然而含SMM的板子可使用來選擇已以質體 pMON502(H、pMON50202、orpMON50203轉形的細胞•然 後將該些板子培養在30EC下7-10日。然後，將已顯示出可 抵抗選擇性試劑的菌落貼到上新鮮的含相同選擇性試劑的 M1E-3板子上以確認其抵抗性。此方法典型地可於每次轟 擊中產生100-1000抗肉辛1^或抗SMM菌株的世代❶ 實例4 下列實例說明經轉形的裂壺菌屬細胞之PCR分析。 PCR使用來確認質體序列存在於推定的可抵抗選擇性 試劑肉辛1^或SMM之經轉形的菌株中。從推定的轉化株及 非重組裂壺菌屬N230D細胞來的模板DNA可使用單一用 途、成形的1 : 1接種環而獲得，以從已貼到瓊脂板上之抵 抗菌落（如描述在實例3)移除小量細胞（1-2立方毫米）。然後 將該些細胞再懸浮於具15-20 : 1之1% Triton Χ·1 〇〇的微量 離心管中’放置在沸水浴中1〇分鐘，然後在14,〇〇〇xg下離 -73- 1324181

五、發明說明Ο) * 心、5分鐘。將這些萃取物（1·3 : L)的部分使用來提:供作為使 用DNA聚合酶的25 : L PCR反應之模板DNA。為了偵 測pTUBZEO ll-2序列是否存在於裂壺菌屬DNA中’可使用 引子DM20(序列辨識編號：25)及DM21(序列辨識編號： 26);這些引子可融合至質體PTUBZE011-2中的厶/e基因且 放大346-bp DNA片段。使用如下的加熱曲線：94EC 4分 鐘；（94EC 45秒、52EC 45秒、72EC 2分鐘）x30 ; 72EC 7 分鐘。為 了偵測PMON50201、pMON50202或pMONs0203 序列是否存在於裂壺菌屬DNA中，可使用引子BLA1(序列 辨識編號：27)及BLA2(序列辨識編號：28);這些引子可融 合至在載體骨架中發現的(抗氨比西林性）基因，且放大 1229-bp DNA片段。使用如下的加熱曲線：94EC 4分鐘； (94EC 45秒、55EC 45秒、72EC 2分鐘）χ30 ; 72EC 7分鐘》 PC’R產物可利用標準瓊脂糖凝膠電泳，接著以溴化乙錠染 色而分析。 這些分析結果確認大多數在這些條件下選擇的菌株確 實為包含質體DNA的轉化株》當使用從控制裂壺菌N23〇D 細胞來的不以轉形質韹轟擊的棋板DNA時，並無產生具正 確尺寸的PCR產物。 實例5 ' 下列實例說明經轉形的裂壺菌屬細胞之南方墨點分 析。 南方雜交墨點可使用從親代裂壺菌屬N230D細胞分離 的DNA及數種推定的轉化株來進行，以確認轉形載想DNA 1324181

X、發明說明（72) 序列存在於該轉形細胞申。南方墨點可使用由熟知此技藝 之人士所熟知的技術而進行（參見例如山姆布魯克等人，分 子選殖：實驗室手冊。冷泉哈伯實驗室出版社，1989)。 DNA則使用“QIAamp” DNA純化工具箱（奎阿金有限公司 (Qiagen Inc.)，伐倫西亞（Valencia)，CA)分離，以不同的限 制酵素消化，藉由電泳經過瓊脂糖凝膠（〇.8%-1.2%w/v)分 離，然後利用鹼性毛細管搬移法搬移至耐綸薄膜。 在以pTUBZEOl 1 -2轉形的細胞中之載體DNA的偵測 可使用“吉納斯（Genius)”DIG-基礎系統（波新爵-曼漢生物 化學GmbH，德國）來進行，其使用經由PCR以引子DM20(序 列辨識編號：25)及DM21(序列辨識編號：26)產生之346-bp DIG-標定的ά/e基因片段，及包含DIG-11-UTP之核苷酸混 合物作為雜交探針。在68EC下，於在吉納斯工具箱中供應 的雜交緩衝劑中，進行薄膜的預雜交1小時。在68EC下， 於含ά/e基因探針（其已在94°C下加熱變性5分鐘）的雜交緩 衝劑中進行雜交18小時。然後以50毫升的2X SSC/0.1% ' SDS清洗該薄膜5分鐘兩次及以50毫升的 0.1XSSC/0.1%SDS15分鐘兩次。雜交DNA的化學發光則以 如在吉納斯工具箱說明書中所描述般進行偵測。 從非轉形的裂壺菌屬N230D細胞來之DNA不與6/e基 因探針雜交。相反地，從轉形細胞來的DNA可與如下之探 針雜交： Sphl：從包含與6/e基因探針雜交的〜1100-bp DNA片段之 轉形的裂壺菌屬細胞來之知AI-消化的DNA ;此片段（其亦可 -75- 1324181 五、發明說明（73) 在办ΛΙ-消化的pTUSZEOll-2 DNA中觀察到）顯示出全部的 办/e基因表現匣（包括微管蛋白基因啟動子及SV40終止子）。 -Xhol ：對每個試驗的轉化株來說，DNA的义ΑοΙ消化可 產生大於15-20 kbp的雜交片段。ΖΛσΙ不在pTUBZE011-2中 切割，因此這些結果指示出pTUBZEOll-2在轉形細胞中似 乎不存在為染色體外的元素，而是變成併入裂壺菌屬染色 體中。 Ncol^k. Hindlll ：此二酵素皆在 pTUBZEOl 1-2 中切割一 次。以這些酵素任一種消化的轉化株DNA典型地導致一種 顯著的雜交片段，其會與線性化的pTUBZEOl 1-2載體（即， 〜3.8kbp)共泳動。此建議該載體可以銜接重覆形式併入染 色體中。 實例6 此實例說明裂壺菌屬中的同源重組。 進行下列實驗以說明同源重組可發生在裂壺菌屬中之 内生天然DNA序列與顯現在引進細胞的重組DNA分子中 之同源DNA序列間。此型式的同源重組對製造具有想要的 性質之重組菌株非常有益。例如，同源重組可藉由目標地 嵌入外源基因序列而使内生基因失活化。額外地，同源重 組可用來以一改變.的基因形式取代一内生基因或其部分， 如此該重組細胞具有新的性質。 同源重組顯示出發生在以質體PMON50202轉形的裂 壺菌屬細胞中，其包括在裂壺菌屬fl/j基因中的突變。此突 變在α/·?譯碼區域的bp位置571處引進場址。在α/ί譯碼 -76- 1324181

五、發明說明（74) w 區域的bp位置1324處己天然地發生5<sgl場牡。因此，此容I-消化的裂壺菌屬DNA之南方墨點可使用來分辨天然的α/ί 基因與重组突變的ah基因。對這些實驗來說，fl/s-特定的 雜交探針可經由PCR使用包含DIG-11UTP(波新爵-曼漢生 物化學GmbH，德國）、前置引子PGR28(序列辨識編號： 32)、反置引子PGR30(序列辨識編號：33)的核苷酸混合物 及小量的pMON50200(作為模板）而製造。所產生的323-bp DIG-標定之雜交探針指為ALS1。 從非重組裂壺菌屬N230D細胞來的DNA分別地以 及乂WI消化，接受瓊脂糖凝膠電泳，搬移至耐綸薄膜，然 後使用基本上與在實例5中所描述的那些相同程序以ALfl 探針探測。該ALS1探針可標定出消化的DNA之 1.76-kbp片段及消化的DNA之4.9-kbp片段。 從不同的已以PMON50202轉形的重組菌株來之 及dWI-消化的DNA之南方墨點亦以ALS1探針探測。在某 些情況中，1.76-kbp的片段並不會顯現，反而會標定 出0.75-kbp片段，而與顯現在pMON50202中的753-bp 片段相符合。在這些重組菌株中會標定出4.9-kbp 片 段，但是，此指出該重組、突變的基因已以天然的 基因經由雙交叉同源重組法來重組。 單交叉同源重組亦觀察會發生在以pMON50202轉形 的重組菌株中。在這些情況中，1.76-kbp及0.75-kbp 片段二者會在從重组菌株來的DNA之南方墨點中標定 出，但是4.9-kbpd/u/I片段則由較大的標定片段取代，其指 -77- 1324181 五、發明說明（75) 示出全部的PMON50202載體已嵌入天然的α/s基因，而為單 一複製或為銜接重覆。 :同源重組在裂壺菌屬中的其它證據可藉由引進含一載 斷、突變的fl/i基因之重組DNA分子而獲得，如此由截斷基 因編碼的不完整ALS酵素不具有功能_性。此載斷基因可利 用CMI及所《dill消化pMON50202以產生2.8-kbp片段而製 造，因此移除沿著fl/s终止子區域之α/ί譯碼序列的最後 388bp。此2.8-kbp片段連接至已以C/fll及所/iifIII消化的 pBluescriptll KS+(史崔塔基因公司，La Jolla，CA)，而產 生質體pAR2。質體PAR2預計將僅授予轉形的裂壺菌屬細 胞具抗SMM性，若具功能的突變β/ί基因在轉形的菌株中經 由同源重組在天然的基因與顯現於pAR2中的載斷突變 基因之間復原。此構造可藉由粒子轟擊引進裂壺菌屬 N230D細胞，且可如在實例3中描述般分離該抗SMM性菌 株。從轉化株來之5igl-消化的DNA之南方墨點分析（如在 » 此實例中較早的描述般進行）指出同源重組已明顯地發生 在這些菌株中；即，1.76-kbp 片段已與在非重組細胞 中的ALS1探針雜交，但是此可由已以PAR2轉形的細胞中 之0.75-kbp雜交片段取代。 實例7 此實例說明使用轉形載體pTUBZEOll-2或 pMON50202經由共轉形來產生含其它外源DNA分子（其不 與選擇性標記基因連結）的菌株。 共轉形可藉由同時引進pTUBZE011-2及額外的含數 -78· 1324181

五、發明說明（76) 種基因的任何一種之質體而達成。質體可如在實例3中描述坷 般使用每個質體2.5克共沉澱在黃金粒子上。在以塗佈質體 的黃金粒子轟擊標的細胞後，如在實例1中描述般於含肉辛 "^瓊脂板上選擇重組菌株。然後，利用PCR分析或南方墨 點雜交法証實該第二、非選擇的質體之存在。典型地可達 成非常高的共轉形頻率（例如，50-90%)。例如，質體 pTR202(其包括連結至裂壺菌屬微管蛋白基因啟動子及終 止子的線蟲類泥蟲/加-1基因（斯拜恰拉（Spychalla)等人， 1997. Proc. 7Wzi/· Sci·. 94，1142-1147))經由在 此實例中所提供的方法引進，由PCR顯示出所產生的抗肉. 辛1^菌株約68%包含/扣-1基因（參見表1)。類似的結果可觀 察到，當共引進PMON50202及額外的質體，接著在含SMM 的固體培養基上選擇轉形細胞。此共轉形方法可使用來引 進任何外來想要的DNA » 表1.使用選擇標記質想pTUBZEOll-2及含不同基因的質體 之共轉形效率。抗肉辛11的轉化株經由PCR篩選/aJDNA序列》 引進的/αί/基因 #包含yiu/基因 #試驗的肉P菌株 共轉形效率 synfatl 17/25 68% nat_fatl 24/25 96% * mut_fatl 21/25 84% desB 20/25 80% 在這些實例中描述的轉形系統顯示出在基因操縱裂壺 菌屬（其熟知為發酵性製造脂質系化合物之最多產的有機 •79· 1324181 五、發明說明（77) 體）的能力上之明顯發展。二種各自獨立的轉形系統之可利 用性（與發生的高共轉形效率一起）應該可讓多重特性在設 計的菌株中累積。再者，在此微藻類中同源重組的明顯存 在應該可發展基因剔除程序，以鑑別在所製造·的菌株-未 知基因的功能及消除不想要的特性。本發明家現在使用這 些系統來改變裂壺菌屬中的脂肪酸新陳代謝，且探測到使 用此物種及相關的微藻類（例如，破囊壺菌屬）來製造類胡 蘿蔔素類、甾醇類及其它脂質樣的化I物可能-性。 同時本發明的不同具體實施例已詳細地描述，明顯的 是將可由熟知此技藝之人士對那些具體實施例進行改質及 調整。但是，需明顯了解的是此改質及調整皆包含在本發 明如於下列申請專利範圍所提出之範圍中。

-80· 1324181

五、發明說明（）序列表 <110> Roess1er, Paul Matthews» T. Dave Rams e i e r, Tom Metz， James <120> 供破囊壺菌微生物之轉形用的產物與方法 <130> 2997-23-PCT <150> 60/284,116 <151> 2001-04-16 <160> 35 <170> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> 551 <212> DNA <213> 裂壺菌 <220> <221> misc_feature <222> (520)..(520) <223> n = a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (541 ). .(541 ) <223> n = a，c，g , or t <400> 1 g t eg t gcc t a acaacacgcc gt t c t acccc gcc 11 c 11 eg cgcccc t t eg cgtccaagca 60 t cc 11 caag t 11 a t c t c t c t ag 11 caac t t caagaagaac aacaccacca acaaga t geg 120 t gagg t ca t c tccatccaca tcggccaggc cggtgt tcag g t egg t aacg cctgctggga 180 gctctactgc ctcgagcatg gca t ccagcc ggacggccag a tgccc t egg acaagacca t 240 tggeggegge gatgatgcct t caacacc 11 c 11 c t c egag actggcgccg gcaagcacgt 300 gccccgcgcc g t gc t eg t eg a t c t egagee caceg t c t g t gacgaggtcc gcaccggcac 360 c t accgcgc t c 111 a c c a c c ccgagcaga t ca t caccggc aaggaggacg ctgccaacaa 420 c t aege t eg t ggccac t aca cca t eggeaa ggaga t eg t c gacctcgtcc t cgaccgca t 480 ccgcaage t c gccgacaact gcactggtct teaggget tn c t c t gc 11 ca acgccgtcgg 540 nggtggtacc g 551 <210> 2 <21 1> 27 <212> DNA <213> 裂壺菌 <400> 2 gcgccagtct cggagaagaa ggtgttg 27 <210〉3 <2 丨 1> 27 <212> DNA <213> 裂壺菌 <400> 3 age tcccagc aggegt tacc gacc tga 27 <210> 4 <21 1> 725 <212> DNA <213> 裂壺菌 <400〉4

1 1324181 五、發明說明（） gagacgtgct t cgcaagacc gctgtgctcg cgccgcacgc tCt£tgtgt t aca 11 aa 111 60 1111 g t aga t gaag 111 c t c t a 11 c t c t eg aaat tctgta gaa t g 11 a t a g t c t c 11 cac 120 • t cccg t ga 11 ggagaggat t c 11 gc 11 g 11 ccc t cccgcc cgggtagcgc xtggagcaac 180 get tgagege gege t egaaa geggaeggeg caacgagccg 111 cacgccg ege tgt ccaa 240 g t ccca t 111 t c t cc 11 acc cca t ggccg t tgcatgccaa 1111 aggccc cccac tgacc 300 w gaggtctgtc ga t a a t ccac 1111 cca 11 g a t c 11 ccagg 111 eg 11aac t ca t gccac t 360 • gagcaaaac t t eggt c 111 c ctaacaaaag c t c t cc t cac aaagea tgge gcggcaacgg 420 aeg t g t cc t c a t ac t ccac t gccacacaag g t ega t aaac t a age t c c t c acaaatagag 480 - gagaa 11 cca ctgacaactg aaaacaatgt atgagagacg atcaccactg gageggegeg 540 A gegg t tgggc geggaggteg gcagcaaaaa caagcgac t c gccgagcaaa cccgaa t cag 600 cc 11 cagacg g t eg t gee t a acaacacgcc g t t c t acccc gee t tc t teg ege ccc 11 eg 660 cgtccaagca t cc 11 caag t 11 a t c t c t c t ag 11 c a a c 11 caagaagaac aacaccacca 720 acaag 725 t m <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> 裂壺菌 <400> 5 lW cacccatggt gt tggtggtg t tgt 24 <210> 6 <211〉24 <212〉DNA <2丨3> 裂壺菌 <400> 6 aaac t egaga cgtgct tege aaga 24 <210> 7 <211> 4646 <212> DNA <213> 裂壺菌 <400> 7 aaac t egaga eg tgc 11 ege aagacege t g tgc tcgcgcc gcacgc t c t g tgtgt tacat 60 taat 111111 gtagatgaag 111 c t c t a 11 c t c t egaaa t t c t g t agaa t gt ta tagtet 120 c 11 c a c t c c c gtgat tggag aggat tet tg c 11g11 ccc t cccgcccggg t agege 11 gg 180 agcaacgc 11 gagcgcgcgc tegaaagegg acggcgcaac gageegt ttc acgccgcgct 240 iSl 2 1324181 五、發明說明（） g t c c a ag t c c c a 11 t t t c t c c t t acccca t ggccg t t gca t gc c a a 11 t t aggcccccca 300 c t gaccgagg t c t g t ega t a a t c c a c 11 t t cca 11 ga t c t t ccagg t 11 c g 11 a a c t c a t 360 gccac tgagc aaaac 11 egg t c 111 cc t a a caaaagc t c t cctcacaaag catggcgcgg 420 caacggacg t g t c c t c a t a c tccactgcca cacaagg t eg a t aaac t aag c t cc t cacaa 480 a t agaggaga at tccactga caac t gaaaa caa tg t a tga gagaega t ca ccactggagc 540 ggcgcggcgg t tgggcgcgg agg t eggeag caaaaacaag egae t egeeg agcaaacccg 600 aa t cagcc t t cagacggtcg tgcctaacaa cacgccg 11 c taccccgcct t c 11 eg egee 660 cc 11 cgcg t c c a ag c a t c c t t caag t 11 a t c t c t c t a g 11 caac t t caag aagaacaaca 720 ccaccaacac ca tggg tgaa gggcgaa t t c t gc aga t a t c ca t cacac t g gcggccgc t c 780 gagcatgcat c t agagggee caa 11 cgccc t a t ag t g ag t eg t a 11 acaa 11 cac t ggee 840 g t cg 1111 ac aacgtcgtga c t gggaaaac cc t ggcg 11 a cccaac 11 aa tcgcct tgea 900 gcacatcccc c 111 cgccag c t ggcg t aa t agegaag agg cccgcaccga tcgccc 11 cc 960 caacagt tgc gcagcc tgaa tggcgaatgg gacgcgccc t gtageggege a 11 aagcgcg 1020 gcgggtgtgg tggt t aegeg cagcgtgacc gc t acac 11 g ccagcgccc t agcgcccgct 1080 cc 111 cgc 11 t c 11 ccc 11 c c 111 c t egee aeg 11 egeeg gc 111 ccccg t caagc t c t a 1140 aa t cgggggc t ccc 111 agg gt teegat 11 agaget t tac ggcacc t ega ccgcaaaaaa 1200 c 11 ga 111 gg gtgatggt tc acgtagtggg cca t cgccc t gat agaegg t 1111 cgccc t 1260 11 gacg 11 gg ag t c c a eg t t c t t t aa t ag t ggac t c t tg t t ccaaac tgg aacaacac t c 1320 aaccc t a t eg egg t c t a t t c 1111 ga t t t a t aaggga 111 t gc ega t 11 c ggee t a 11 gg 1380 11 aaaaaa t g age t ga 111 a acaaattcag ggcgcaaggg c t gc t a a agg aaccggaaca 1440 eg t agaaage cagt ccgcag aaacggtgc t gaccccgga t gaa t g t cage tact ggge t a 1500

Γ· τ 3 1324181

五、發明說明（） t c t ggacaag ggaaaacgca agcgcaaaga gaaagcagg t aget tgcagt ggget tacat 1560 ggcgatagct agactgggcg g t 111 a tgga cagcaagcga accggaat tg ccagctgggg 1620 cgccc t c t gg t aaggt tggg aagccc tgea aagtaaactg gat ggc111 c t tgccgccaa 1680 ggatctgatg gcgcagggga t caaga t c t g a t caagagac aggatgagga tegt t tegea 1740 tgat tgaaca agatggat tg cacgcagg 11 c t ccggccgc t tgggtggag agge t a t t eg 1800 gctatgactg ggcacaacag acaa t cggc t gctctgatgc cgccgtgt tc cggctgtcag 1860 cgcaggggcg cccggt tet t 111 g t c aaga ccgacctgtc cggtgccctg aa tgaac tgc 1920 aggacgaggc agegegge t a t eg t ggc t gg ccacgacggg cgt tee t tgc gc age t g t gc 1980 tcgacgt tgt cac tgaagcg ggaagggac t ggctgctat t gggcgaagtg ccggggcagg 2040 a t c t c c t g t c a t c t egec 11 gc t cc t gccg agaaag t aτ c ca t ca t ggc t ga t gcaa t gc 2100 ggcggctgca t aege 11 ga t ccggc t acc t gccca 11 ega ccaccaagcg aaaca t egea 2160 t cgagcgagc aeg t ac t egg a t ggaagccg g t c 11 g t ega tcaggatgat ctggacgaag 2220 agcatcaggg gc t cgcgcca gccgaac t g t t egec agge t caaggcgcgc atgcccgacg 2280 gcgagga t c t cgtcgtgatc ca t ggega t g cc t gc 11 gee gaatatcatg gtggaaaatg 2340 gccgc 1111 c tggat tcaac gac tgtggcc ggctgggtgt ggcggaccgc t a t caggaca 2400 tagcgt tgga t acccg t ga t a11gctgaag age 11 ggegg cgaatgggct gaccgct tee 2460 t egt gc 111 a cggtatcgcc gctcccgat t cgcagcgcat egee 11 ctat egee 11 c 11 g 2520 aegag 11 c 11 c t gaa 11 gaa aaaggaagag t a t gag t a 11 caaca11 tee g t g t egeec t 2580 t a 11 ccc 111 111 geggea t 111 gee 11 cc t g 11111 gc t cacccagaaa cgctggtgaa 2640 ag t aaaaga t gc t gaaga t c agt tgggtgc acgagtgggt tacatcgaac t gga t c t caa 2700 cagegg t aag a t cc 11 gaga gt 11 tcgccc egaagaaeg t 111 ccaa t ga t gageae 111 2760 t aaagt t c tg c t a t g t ca t a cac t a11a t c ccgtat tgac gccgggcaag agcaac t egg 2820 is ] 4 1324181 五、發明說明（） t cgccgggcg c gg t a 11 c t c aga a t gac t t ggt tgagtac tcaccagtca cagaaaagca 2880 t c 11 acgga t ggea tgacag t aagagaa 11 atgeagtget gcca t aacca t gag t ga t aa 2940 cac t gcggcc aac 11 ac 11 c tgacaacga t cggaggaccg aaggagctaa ccgc t t t t t t 3000 gcacaacatg ggggatcatg t aac t egee t tgatcgt tgg gaaccggagc tgaa tgaage 3060 ca t accaaac gaegagagtg acaccacga t gc c t g t agea atgccaacaa eg 11 gcgcaa 3120 ac t a 11 aac t ggcgaac t ac 11 ac t c t age 11 cccggcaa caat taatag actggatgga 3180 ggcgga t aaa gt tgeaggae c a c 11 c t g c g c t cggccct t ccggctggct ggt t tat tgc 3240 t g a t aaa t c t ggagccggtg agcgtgggtc t egegg t a t c a 11 gcagcac tggggccaga 3300 t gg t a age c c t cceg t a t eg t ag t t a t c t a cacgacgggg ag t caggcaa c t a t gga t ga 3360 acgaaat aga caga t ege t g aga t agg t gc c t cac t ga 11 aagea 11 gg t aactgt caga 3420 cc aag 111 ac t c a t a t a t a c 111 aga 11 ga t t t aaaac 11 ca 11111 aa t 11 aaaagga t 3480 ctaggtgaag a t c c t t 11 t g a t a a t c t c a t gaccaaaa t c c c t t a a c g t g ag t 111 eg 11 3540 ccac t gageg t cagaccccg t agaaaaga t caaagga t c t t c t t gaga t c c 1111111 c t 3600 gegegtaate t gc t gc 11 gc aaacaaaaaa accaccgc t a ccagcgg tgg 111 g 111 gee 3660 gga t caagag c t accaac t c 11111 ccgaa gg t aac t ggc 11 cagcagag egeaga t acc 3720 a a a t ac t g t c c t t c t ag t g t age eg t ag 11 aggccaccac 11 caagaac t c t g t agcacc 3780 gee t aca t ac c t ege t c t gc t a a t c c t g 11 accag t ggc t gctgccagtg gegataagte 3840 g t g t c 11 acc ggg t t ggac t caagacga t a g t t accgga t aaggcgcagc ggtcgggctg 3900 aacgggggg t t eg t gcacac agcccagc 11 ggagcgaacg acc t acaccg aactgagata 3960 cc t acagcg t gagea 11 gag aaagcgccac get tcccgaa gggagaaagg cggacagg t a 4020 t c egg t a age ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gage 11 ccag ggggaaacgc 4080

5 1324181

五、發明說明（） c t gg t a t c 11 tatagtcctg tcgggt t teg ccacctctga ct t gagegt c gat 111 tgtg 4140 a t gc t eg t ca ggggggcgga gee t a t ggaa aaacgccagc aacgcggcc t 1111 aeggt t 4200 cc t ggee 111 tgctggcct t t tgctcacat g 11 c 111 cc t geg 11 a t ccc c t ga 11 c t gt 4260 gga t aaccg t a t t accgcc t t tgagtgagc t ga t accgc t cgccgcagcc gaacgaccga 4320 gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagegga agagcgccca atacgcaaac egee t c t ccc 4380 egegegt tgg ccga 11 ca 11 aatgcagctg gcacgacagg 111 cccgac t ggaaagcggg 4440 cag t gagege aacgcaa 11 a atgtgagt ta gc t cac t ca t taggcacccc agge 111 aca 4500 c 111 a tgc 11 ccggc t eg t a tgt tgtgtgg aat tgtgagc gga t aacaa t 11 cacacagg 4560 aaacagc t a t gacca t ga 11 acgccaagc t t gg t accgag ctcgga tcca etagtaaegg 4620 ccgccagtgt gc tggaa 11 c gccct t 4646 <210> 8 <21 1> 3664 <212〉 DNA <213> 裂壺菌 <400〉8 cca tggccgt tgea tgccaa t t t t aggccc cccactgacc gagg t c t gt c gataatccac 60 t t t t cca 11 g a t c t t ccagg t 11 eg t t aac t c a t gc c a c t gagcaaaac t t egg t c 111 c 120 c t aacaaaag ctctcctcac aaagcatggc gcggcaacgg aeg t g t cc t c a t ac t ccac t 180 gccacacaag gtcgataaac t aage t cc t c acaaa t agag gagaat tcca ctgacaactg 240 aaaacaatgt a t gagagacg atcaccactg gageggegeg geggt tgggc geggaggteg 300 gcagcaaaaa caagcgac t c gccgagcaaa cccgaatcag cct t cagacg gtcgtgccta 360 acaacacgcc g 11 c t acccc gee 11 c 11 eg cgcccc 11 eg cgt ccaagca t cc 11 caag t 420 11 a t c t c t c t ag 11 c a ac t t caagaagaac aacaccacca acacca t ggc caag 11 gacc 480 ag t geeg 11 c cggtgctcac cgcgcgcgac gtegeeggag eggt egagt t c tggaccgac 540 egge t eggg t t c t cccggga c t t eg t ggag gaegae t teg ccgg t g t ggt ccgggacgac 600 g t gaccc t g t tcatcagcgc gg t ccaggac caggtggtgc cggacaacac cc t ggee t gg 660 m 6 1324181 五、發明說明（） gtgtgggtgc gcggcctgga egage t g t ac gccgagtggt eggagg t eg t gtccacgaac 720 t t ccgggacg cc t ccgggcc ggcca t gacc gagateggeg ageageegtg ggggcgggag 780 t t cgc cc t gc gcgacccggc egge a a c t gc gtgcact teg tggccgagga gcaggactga 840 cacgtgctac gaga t t tega 11 ccaccgcc gcc 11 c t a t g aaaggt tggg c 11 eggaa t c 900 gt 11 tccggg aege egge t g gatgatcctc cagcgcgggg a t c t ca t gc t ggagt tet tc 960 gcccacccca ac 11 g t 11 a t tgeage 11 a t a a t gg t t a c a aataaagcaa t agea t caca 1020 a a 111 ca c aa a t a a agea 11 11111 cac t g ca 11 c t ag 11 gtggt t tgtc caaactcatc 1080 a a t g t a t c 11 a t ca t g t c t g aa 11 cccggg ga t cc t c t ag agtcgacctg caggca t gca 1140 age t tggeae tggccgtcgt 111 ac a aeg t cgtgactggg aaaaccc tgg eg 11 acccaa 1200 c 11 aa t egee t tgcagcaca t ccccc 111 c gccagc tgge gtaatagega agaggcccgc 1260 accgatcgcc ct tcccaaca gt tgcgcagc ctgaatggcg aa t ggegee t gatgeggtat 1320 11 t c t c c 11 a egea t c tg t g egg t a 111 ca caccgca t a t atggtgcact c t cag t acaa 1380 t c t gc t c t ga tgccgcatag 11 aagccagc cccgacaccc gccaacaccc gc tgaegege 1440 cc t gaeggge 11 g t c t gc t c ccggca t ccg c 11 acagaca age t g t gacc g t c t ccggga 1500 gctgcatgtg t cagagg 11 t t c ac eg t c a t caccgaaacg egegagaega aagggcc t eg 1560 t ga t aegee t a 11111 a t ag g 11 a a t g t c a t ga t aa t aa t ggt t tc t tag acgtcaggtg 1620 gcac 1111 eg gggaaatgtg cgcggaaccc c t a 111 g 111 a 11111 c t a a a t ac a 11 c aa 1680 atatgtatcc gctcatgaga caa t aaccc t ga t a a a t gc t t c aa t aa t a t tgaaaaagga 1740 agag t a t gag t a 11 caaca t 11 ccg t g t eg ccc 11 a 11 cc c t t t 11 t geg gcat 11 tgee 1800 11 cc t gt 111 t gc t caccca gaaacgc t gg tgaaagtaaa aga t gc t gaa gatcagt tgg 1860 gtgcacgagt gggt tacatc ga ac t gga t c t caacagcgg taagatcct t gagagt11 tc 1920

7 1324181 五、發明說明（） Λ gccccgaaga aeg 1111 cca a t ga t gage a c 1111 aaag t t c t gc t a t g t ggegegg t a t 1980 t a t c c eg t a t tgacgccggg caagagcaac t egg t egeeg ca t acac t a t t c t c aga a t g 2040 ac t tggt tga gtactcacca g t c a c aga a a age a t c t t ac ggatggcatg acagtaagag 2100 aa 11 a tgcag t gc t gcca t a acc a t gag t g ataacactgc ggee aac 11 a c 11 c t gacaa 2160 egat eggagg accgaaggag c t aaccgc t ΐ 111 tgcacaa catgggggat catgtaactc 2220 geettgateg 11 gggaaccg gagctgaatg aagcca t acc aaaegaegag cgtgacacca 2280 cgatgcctgt agcaa t ggea acaacgt tgc gcaaac t a 11 aac t ggcgaa c t ac 11 ac t c 2340 t age 11 cccg gcaacaa 11 a atagactgga tggaggcgga taaagt tgea ggaccac 11 c 2400 t gege t egge cc 11 ccggc t ggctggt t ta 11gc tga t aa a t c t ggagec gg t gageg t g 2460 ggtetegegg tatcat tgea gcac tggggc cagatggtaa gccctcccgt a t c g t ag 11 a 2520 t c t acacgac ggggagtcag gcaac t a t gg atgaaegaaa t agacaga t c gc tgaga t ag 2580 gtgcctcact gat t aagea t tggtaactgt cagaccaagt 11 ac t c a ta t a t ac 111 aga 2640 11 ga 111 aaa ac 11 ca 1111 taat t taaaa ggatctaggt gaaga t cct t 11 t ga t aa t c 2700 tcatgaccaa a a t c c c 11 aa cgtgagt t t t eg 11 ccac t g agog t cagac cccgtagaaa 2760 aga t caaagg a t c t t c t t ga ga t c c 111 t t t tctgcgcgt aa t c t gc tgc t tgcaaacaa 2820 aaaaaccacc gctaccagcg gtggt t tgt t t geegga t ca agage t acca ac t c 11111 c 2880 cgaaggtaac t ggc 11 cage agagcgcaga t accaaa t ac t g t cc 11 c t a gtgtagccgt 2940 ag 11 aggcca ccac 11 caag aac t c tgt ag caccgcc t ac a t acc t ege t c t gc t aa t cc 3000 tgt taccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gac t caagac 3060 ga t ag11 acc ggataaggcg cagcggtcgg gc tgaacggg gggt tcgtgc acacagccca 3120 get tggagcg aacgacc t ac accgaac t ga ga t acc t aca gegtgageat tgagaaagcg 3180 ccacgc 11 cc egaagggaga aaggcggaca gg t a t ccgg t aageggeagg g t cggaacag 3240

8 1324181 五、發明說明（） gagagcgcac gagggage 11 ccagggggaa acgcctggta t c 111a t ag t cctgtcgggt 3300 t t cgccacc t c t gac t t gag eg t ega 1111 t g t ga t gc t c gtcagggggg eggagec t a t 3360 ggaaaaacgc cagcaacgcg gee 11111 ac gg 11 cc t ggc c 1111gc tgg cc 1111 gc t c 3420 acatgtgtgc tgggcccagc cggccagatc tgagctcgcg geegega t a t cgc t age t eg 3480 aggcaggcag aagt a t gcaa agea t gca t c t c a a 11 a g t c agcaaccagg tgtggaaagt 3540 ccccaggc t c cccagcaggc agaag t a t gc aaagea t gca t c t caa 11 ag t cagcaacca 3600 t ag t cccgcc cctaactccg coca t cccgc ccctaactcc gcccag t tee gccca t t c t c 3660 cgcc 3664 <210> 9 <211> 3808 <212> DNA <213> Artificia ] Sequence <220> <223〉裂 壺菌及印度斯坦鍵異壁菌（Streptoai2oteiciius hindustanus) <220> <221> promoter <222> (441)..(894) <223> <22〇> <221> CDS <222〉 （895).. ¢1269) <223> <220> <221> terminator <222> (1270) ..( 1 524) <223> <400> 9 t cgcgcg t 11 cggtgatgac ggtgaaaacc t c t ga c ac a t gcagct cccg gagaeggtea 60 c age t t g t c t gtaageggat geegggagea gacaagcccg t cagggcgcg tcagcgggtg 120 t tggcgggtg t cggggc t gg c 11 aac t a t g eggea t caga gcaga t t gt a ctgagagtgc 180 accatatgcg g t g t gaaa t a ccgcacaga t gegtaaggag aaaa taccgc a t caggegee 240 a 11 cgcc a 11 caggc tgege aac t g 11 ggg aagggcga t c gg t gegggee t c t t cgc t a t 300 t acgccagc t ggcgaaaggg gga t g t gc t g caaggcga 11 aagt tgggta acgccagggt 360 111 cccag t c aegaegt tgt aaaacgacgg cc ag t gaa t t egagc t cgg t acccgggga t 420 cc t c t agag t cgacc t gcag gca tgccaa t 111 aggcccc ccactgaccg agg t c t g t eg 480

9 1324181

五、發明說明（） a t aa t ccac t 11 tccat tga 111 tccaggt 11 eg11 aac t catgccactg agcaaaac 11 540 egg t c 111 cc t aacaaaagc t c t cc t caca aagea t ggcg cggcaacgga cgtgtcctca 600 t ac t ccac t g ccacacaagg t ega t aaac t aage t cc t ca caaa t agagg agaa 11 ccac 660 tgacaactga aaacaatgta tgagagaega tcaccactgg ageggegegg eggt tgggcg 720 eggaggtegg cagcaaaaac aagegae t eg ccgagcaaac ccgaatcagc c 11 cagacgg 780 t eg t gee t aa caacacgccg 11 c t accccg cc 11 c 11 ege gcccct tege g t c c a age a t 840 cct tcaagt t tateteteta gttcaacttc aagaagaaca acaccaccaa c a c c a t g 897 Met 1 gee a ag t tg a c c agt gee gt t ccg gtg etc acc geg ege gac g t c gee 945 Ala Ly s Leu Thr Se r Ala Val Pro Val Leu Thr Ala Arg Asp Val A1 a 5 10 15 gga geg g t c gag t t c tgg acc gac egg etc ggg 11 c tee egg gac t t c 993 Gly Ala Val Glu Phe Trp Thr Asp Arg Leu Gly Phe Se r Arg Asp Phe 20 25 30 gtg gag gac gac t c gee ggt gtg g c egg gac gac gtg acc ctg 11 c 1041 Val Glu Asp Asp Phe Ala Gly Val Val Arg Asp Asp Val Thr Leu Phe 35 40 45 ate age geg gt c cag gac cag gtg gtg ccg gac aac acc ctg gee tgg 1089 lie S e r Ala Val Gin Asp Gin Val Val Pro Asp Asn Thr Leu Ala Trp 50 55 60 65 gtg tgg gtg ege ggc c tg gac gag c tg t ac gee gag tgg teg gag g t c 1137 Val Trp Val Arg Gly Leu Asp Glu Leu Tyr Ala Glu Trp Se r Glu Val 70 75 80 gtg tee a eg aac t c egg gac gee tee ggg ccg gee a g acc gag ate 1185 Val S e r Thr Asn Phe Arg Asp Ala Se r Gly Pro Ala Me t Thr Glu lie 85 90 95 ggc gag cag ccg tgg ggg egg gag t tc gee ctg ege gac ccg gee ggc 1233 Gly Glu Gin Pro Trp Gly Arg Glu Phe Ala Leu Arg Asp Pro A1 a Gly iS 1 10 1324181 五、發明說明（） 100 105 110 aac tgc gtg cac ttc gtg gcc gag Asn Cys Val His Phe Val Ala Glu 115 120 gag cag gac Glu Gin Asp tga cacgtgctac 1279 gaga t 11 cga 11 ccaccgcc £cc t t c t a t g aaaggt tggg c t t eggaa t c gt 11 teeggg 1339 acgccggctg ga tga t cc t c cagcgcgggg a t c t ca t gc t ggag t t c 11 c gcccacccca 1399 ac 11 g 111 a t t gcagc 11 a t aatggt taca aa t aaagcaa t agea t caca aa 111 cacaa 1459 a t aaagca 11 11111 cac t g cat tetagt t gtggt t tgtc caaactcatc aatgtatc 11 1519 a t ca t g t c t g aa 11 cccggg ga t cc t c t ag agtcgacctg caggca tgea age t tggcgt 1579 aa t ca t gg t c a t age t g 111 cc t g t g t gaa a 11 g 11 a t cc gc t cacaa 11 ccacacaaca 1639 t acgagccgg aagcataaag tg t aaagee t ggggtgccta a t gag t gage t aac t cac a t 1699 t aa t t gcg t t gcgctcactg cccgc t 11 cc ag t cgggaaa cctgtcgtgc cagctgcat t 1759 aa t gaa t egg ccaacgcgcg gggagaggcg gt t tgegtat tgggcgctct teeget tcct 1819 cgctcactga c t ege tgege tcggtcgt tc ggc tgcggcg agegg t a t ca gctcactcaa 1879 aggcggtaat aeggt tatcc acagaatcag gggat aaege aggaaagaac a t g t gagcaa 1939 aaggccagca aaaggccagg aaccg t aaaa aggeegegt t get ggcg 111 11 ccat agge 1999 t ccgcccccc t gaegagea t cacaaaaa t c gaege t caag tcagaggtgg cgaaacccga 2059 caggac t a t a aaga t accag gcg 111 cccc c t gga age t c cctcgtgcgc t c t cc tg 11 c 2119 cgaccc t gcc gc 11 accgga tacctgtccg cc 111 c t ccc 11 egggaage gtggcgc 111 2179 ctcaatgctc acgctgtagg t a t c t cag 11 cggtgtaggt cgt tege tee aage t ggge t 2239 gtgtgcacga accccccg 11 cagcccgacc gctgcgcct t a t ccgg t aac tategtet tg 2299 ag t ccaaccc ggtaagacac gac 11 a t ege cac tggeage agccactggt aacagga 11 a 2359 gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag ag 11 c 11 gaa gtggtggcct aactacggct 2419

11 1324181

五、發明說明（） acac t agaag gacag t a 111 ggtatctgcg c t c t gc t gaa gccag t t acc 11 cggaaaaa 2479 gag 11 gg t ag c t c 11 ga t cc ggcaaacaaa ccaccgctgg t agegg t gg t 11111 tgt 11 2539 gcaagcagca ga 11 aegege agaaaaaaag ga t c t c a aga aga t cc 111 g a t c t 111 c t a 2599 cgggg t c t ga cgctcagtgg aacgaaaac t cacgt taagg gat 11 tggtc a tgaga 11 a t 2659 caaaaaggat c t t c ac c t ag a t c c t t 11 a a at t aaa a a t g aagt 111 aaa t caa t c t aaa 2719 gtatatatga g t aaac t t gg t c t gacag 11 ac c aa t gc 11 aatcagtgag gc ac c t a t c t 2779 cagcgatctg t c t a 111 eg t tcatccatag 11 gee t gac t ccccgtcgtg t aga t a a c t a 2839 cga t acggga ggge 11 acca tctggcccca gtgctgcaat gat accgcga gacccacgc t 2899 caccggc t cc aga t 11 a t ca gcaa t aaacc agccagccgg aagggccgag ege agaag t g 2959 gtcctgcaac 111 a t ccgcc t cca t ccag t c t a 11 aa t tg t tgccgggaa gc t agag t aa 3019 gtagt tcgcc ag 11 aa t ag t t tgcgcaacg 11 g 11 gcca t tgc t acaggc atcgtggtgt 3079 cacgctcgtc g 111 gg t a t g gc 11 c a 11 c a gctccggt tc ccaacga tea aggegagt ta 3139 catgatcccc catgt tgtgc aaaaaagcgg 11 age t cc 11 cggtcctccg a t eg 11 g t ca 3199 gaag t aag 11 ggccgcagtg 11 a t cac t ca tggt tatgge agcactgcat aa 11 c t c t ta 3259 ctgtcatgcc atccgtaaga tget 11 tetg tgactggtga gtac tcaacc aagt ca 11 c t 3319 gagaatagtg tatgeggega ccgag 11 gc t c t tgcccggc g t caa t aegg ga t aa t accg 3379 cgccacat ag cagaac 111 a a a ag t gc t ca t ca 11 ggaaa aeg 11 c t teg gggcgaaaac 3439 t c t caagga t c 11 accgc t g 11 gaga t cca g 11 cga t g t a acccac t eg t gcacccaact 3499 ga t c 11 c age atet 11 tact t tcaccagcg 11 tctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa 3559 a t gc ege a a a aaagggaa t a agggcgacac gga a a t g 11 g aa t ac t c a t a c t c t t c c t t t 3619 11 caa t a 11 a t tgaageat t t a t caggg t t a 11 g t c t ca t gagegga tac a t a t t t gaa t 3679 IS] 12 1324181 五、發明說明（） gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcaca 11 tccccgaaaa gtgccacctg 3739 acgtctaaga aaccattatt a t c a t gac a t taacctataa aaa t aggcg t at cacgaggc 3799 cc 111 eg t c 3808 <210> 10 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 裂 壺菌及印度斯坦鏈異壁菌（Streptoailoteichus hindustanus) <400> 10

Met Ala Ly s Leu Thr Ser Ala Val Pro Val Leu Thr Ala Arg Asp Val 1 5 10 15 Ala Gly Ala Val Glu Phe Trp Thr Asp Arg Leu Gly Phe Ser Arg Asp 20 25 30

Phe Val Glu Asp Asp Phe Ala Gly Val Val Arg Asp Asp Val Thr Leu 35 40 45

Phe lie Ser Ala Val Gin Asp Gin Val Val Pro Asp Asn Thr Leu Ala 50 55 60

Trp Val Trp Val Arg Gly Leu Asp Glu Leu Tyr Ala Glu Trp Ser Glu 65 70 75 80

Val Val Ser Thr Asn Phe Arg Asp Ala Ser Gly Pro Ala Met Thr Glu 85 90 95

He Gly Glu Gin Pro Trp Gly Arg Glu Phe Ala Leu Arg Asp Pro Ala 100 105 110

Gly Asn Cys Val His Phe Val Ala Glu Glu Gin Asp 115 120 13 1324181

五、發明說明（） <210> 11 <211> 1416 <212> DNA <2丨3> 裂壺菌 <400> 11 gcaaaaggtc gage 1111 cc acaaggagcg ca t t ggege t cctggcacgg ccgacttcaa 60 gctcat tgcc gagatgatca accgtgcgga gcgacccgtc ate tatgetg gccagggtgt 120 catgcagagc ccgt tgaatg gcccggctgt gc t caaggag 11 egeggaga aggccaacat 180 t cceg t gacc accaccatgc agggtctcgg egget t tgac gagegtagte ccc t c t ccc t 240 caaga tgc t c ggea t gcacg gctctgccta cgccaac t ac tegatgeaga acgccgatct 300 t a t cc tggcg ctcggtgccc get t tgatga tcgtgtgacg ggccgcgttg aegee 11 tgc 360 t ccggaggc t cgccgtgccg agegegaggg ccgcggtggc a t eg 11 cac t 11 gaga 111 c 420 ccccaagaac c t c c a c a agg t eg t ccagcc caccg t egeg gtcctcggcg aeg t gg t ega 480 gaacctcgcc aacg t cacgc cccacgtgca gcgccaggag cgcgagccgt ggt t tgegea 540 gategeegat tggaaggaga agcaccc 111 t c t gc t egag t c t g 11 gat t cggacgacaa 600 gg 11 c t caag ccgcagcagg tcctcacgga gc 11 aacaag caga 11 c teg aga 11 cagga 660 gaaggaegee gaccaggagg t c t aca t c ac cacgggcgtc ggaagccacc aga t gcaggc 720 agcgcag 11 c c 11 acc t gga ccaagccgcg ccagtggatc tee t cgggtg gcgccggcac 780 tatgggctac ggee 11 ccc t cggcca 11 gg cgccaaga 11 gccaagcccg a t gc t a 11 g t 840 t a 11 gaca t c gatggtgatg c 11 c 11 a 11 c gatgaccggt atggaat tga t cacagcagc 900 egaa t t caag gt tggcgtga aga 11 c 11 c t t t t gcagaac aac 111 cagg gca t gg t caa 960 gaac t ggcag ga t c t c 1111 acgacaagcg ctactcgggc accgccatgt tcaacccgcg 1020 c 11 cgacaag gtcgccgatg cgatgcgtgc caaggg t c t c t ac t gegega aacag t egga 1080 gc t caaggac aaga t caagg ag 111 c t ega gt aega tgag ggtcccgtcc t cc t egagg t 1140 11 teg tggac aaggacacgc tegtet tgcc ca t gg t cccc gc t ggc 111 c ege t ccacga 1200 gatggtcctc gagee tecta agcccaagga cgcctaagt t c 111111 cca tggcgggcga 1260 IS! 14 1324181 五、發明說明（） gcgagcgagc gcgcgagcgc gcaagtgcgc aagegee t tg cc 11 gc 111 g c 11 ege 11 eg 1320 ct t tgct t tg c 11 cacacaa cc t aag t a t g aa 11 caag 11 11 c 11 gc 11 g t cggcgaaaa 1380 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1416 <210> 12 gga t c t c 111 <211> 20 <212> DNA <213> 裂壺菌 t acgacaagc <400> 12 20 <210> 13 ggt tgtgtga <21 1> 18 <212> DNA <213〉裂壺菌 agcaaagc <400> 13 18 <210> 14 pr i m_ t rans <21 1> 7847 cript <222> <212> DNA <213> 裂壺菌 <220> (1 ) . .( 1259) <223> <221> <220> <221> CDS <222> (1260). (3314) <223> <220> <221> prim_transcript <222〉 (3315). .(4887) <223> <400> 14 t tgtcgacag caact tgcaa g 11 a t aegeg accaccaggc aatctcagca cgcccagcga 60 gcacggagc t tgegaagagg g 111 acaag t eg t eg 11 ca t t ege t c t caa gc 11 tgee t c 120 aacgcaac t a ggcccaggcc t ac 111 cac t g t g t c 11 g t c 11 gcc t 11 ca caccgaccga 180 gtgtgcacaa ccgtgt 11 tg cacaaagcgc aagatgetea c t egae t g t g aagaaaggt t 240 gcgcgcaagc gactgcgact gegaggatga ggatgactgg cagcc t g 11 c aaaaac t gaa 300 aatccgcgat gggtcagtgc cat t egegea tgacgcctgc gagagacaag 11 aac t eg tg 360 t cac t ggca t g t cc t agea t c 111 aegega gcaaaa 11 ca a t ege t 11 a t 11111 cag 11 420 t eg t aacc t t c t cgcaaccg egaa t egeeg 111 cagcc t g ac t aa t c t gc agctgcgtgg 480 cac t g t cag t cagtcagtca gtcgtgcgcg ctgt tccagc accgaggtcg cgcgtcgccg 540 cgcctggacc gctgctgcta ctgctagtgg cacggcagg t aggage t tgt tgccggaaca 600

15 1324181

五、發明說明（） ccagcagccg ccag t cgacg ccagccaggg gaaagt ccgg cgt cgaaggg agaggaaggc ggc g t g t gc a aactaacgtt gaccactggc gcccgccgac acgagcagga agcaggcagc tgcagagcgc agcgcgcaag tgcagaat gc gcgaaagatc cac t tgcgcg cggcgggcgc gcacttgcgg gcgcggcgcg gaacagtgcg gaaaggagcg gtgcagacgg cgcgcagtga cagtgggcgc aaagccgcgc agtaagcagc ggcggggaac ggtatacgca gtgccgcggg ccgccgcaca cagaagtat a cgcgggccga agtggggcgt cgcgcgcggg aagtgcggaa tggcgggcaa ggaaaggagg agacggaaag agggcgggaa agagagagag agagagtgaa aaaagaaaga aagaaagaaa gaaagaaaga aagc t cggag ccacgccgcg gggagagaga gaaatgaaag cacggcacgg caaagcaaag caaagcagac ccagccagac ccagccgagg gaggagcgcg cgcaggaccc gcgcggcgag cgagcgagca cggcgcgcga gcgagcgagc gagcgagcgc gcgagcgagc aaggc t t gc t gcgagcga t c gagcgagcga gcgggaagg a t g age geg acc c gc geg gc g aeg agg ac a geg geg geg c t g tee teg Met Ser Ala Thr Arg Ala Ala Thr Arg Thr Ala Ala Ala Leu Ser Ser 15 10 15 geg ctg aeg aeg cct g t a aag cag cag cag cag cag cag ctg ege gt a Ala Leu Thr Thr Pro Val Lys Gin Gin Gin Gin Gin Gin Leu Arg Val 20 25 30 ggc geg geg teg gca egg ctg geg gee geg geg ttc teg tee ggc aeg Gly Ala Ala Ser Ala Arg Leu Ala Ala Ala Ala Phe Ser Ser Gly Thr 35 40 45 ggc gga gac geg gee aag aag geg gee geg geg agg geg ttc tee aeg Gly Gly Asp Ala Ala Lys Lys Ala Ala Ala Ala Arg Ala Phe Ser Thr 50 55 60 gga ege ggc ccc aac ecg aca ege gag aag age teg ctg gee aeg gtc Gly Arg Gly Pro Asn Ala Thr Arg Glu Lys Ser Ser Leu Ala Thr Val 65 70 75 80 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1259 1307 1355 1403 1451 1499 i 16 1324181

五、發明說明 ( ) cag geg geg aeg gac gat geg ege t t c gtc ggc ctg acc ggc gee caa 1547 Gin Ala Ala Thr Asp Asp Ala Arg Phe Val Gly Leu Thr Gly Ala Gin 85 90 95 ate 111 cat gag etc a t g ege gag cac cag gtg gac acc ate 11 t ggc 1595 lie Phe His Glu Leu Met Arg G1 u His Gin Val Asp Thr lie Phe Gly 100 105 110 t ac c c t ggc ggc gee a 11 c t g ccc gt ΐ 111 gat gee a 11 111 aag agt 1643 Tyr Pro Gly Gly Ala Me Leu Pro Val Phe Asp Ala lie Phe Glu Se r 115 120 125 gac gee t c aag 11 c a t etc get ege cac gag cag ggc gee ggc cac 1691 Asp Ala Phe Ly s Phe lie Leu Ala Arg Hi s Glu Gin Gly A1 a Gly His 130 135 140 a t g gee gag ggc t ac geg ege gee aeg ggc aag ccc ggc gt t gtc etc 1739 Met Ala Glu Gly Tyr. Ala Arg Ala Thr Gly Ly s Pro Gly Val Val Leu 145 150 155 160 g t c acc t eg ggc c c t gga gee acc a a c acc ate acc ccg ate atg gat 1787 Val Thr Se r Gly Pro Gly Ala Thr Asn Thr lie Thr Pro lie Met Asp 165 170 175 get t ac a tg gac ggt aeg ccg ctg etc gtg t c acc ggc cag gtg ccc 1835 Ala Tyr Met Asp Gly Thr Pro Leu Leu Val Phe Thr Gly Gin Val Pro 180 185 190 acc t c t get gtc ggc aeg gac get t c cag gag tgt gac a t gt t ggc 1883 Thr Se r Ala Val Gly Thr Asp Ala Phe Gin Glu Cys Asp lie Val Gly 195 200 205 ate age ege geg t gc acc aag tgg aac gtc atg gtc aag gac gtg aag 1931 lie Se r Arg Ala Cys Thr Ly s Trp Asn Val Met Val Ly s Asp Val Ly s 210 215 220 gag etc ccg ege ege ate aa t gag gee 111 gag a 11 gee atg age ggc 1979 Glu Leu Pro Arg Arg lie Asn Glu Ala Phe Glu lie Ala Met Se r Gly 225 230 235 240 ege ccg ggt ccc gtg etc gtc gat c 11 cc t aag gat gtg acc gee gt t 2027 Arg Pro Gly Pro Val Leu Val Asp Leu Pro Ly s Asp Val Thr Ala Val 245 250 255 17 1324181

五、發明說明 ( ) gag etc aag gaa atg ccc gac age tee ccc cag £tt get gtg ege cag 2075 Glu Leu Lys Glu Met Pro Asp Se r Se r Pro Gin Val Ala Val Arg Gin 260 265 270 aag caa aag g t c gag c 11 11 c cac aag gag ege a 11 ggc get cc t ggc 2123 Ly s Gin Lys Val Glu Leu Phe Hi s Lys Glu Arg lie Gly Ala Pro Gly 275 280 285 acg gee gac 11 c aag etc a 11 gee gag atg ate aac cgt geg gag ega 2171 Thr Ala Asp Phe Lys Leu Me Ala Glu Met lie Asn Arg Ala Glu Arg 290 295 300 c c c g c ate tat get fige cag ggt gtc atg cag age ccg t tg aa t ggc 2219 Pro Val lie Tyr Ala Gly Gin Gly Val Met Gin Se r Pro Leu Asn Gly 305 310 315 320 ccg get gtg etc aag gag t c geg gag aag gee aac a 11 ccc gtg acc 2267 Pro Ala Val Leu Lys Glu Phe Ala Glu Lys Ala Asn lie Pro Val Thr 325 330 335 acc acc atg cag ggt etc ggc ggc t t gac gag cgt agt ccc etc tee 2315 Thr Thr Met Gin Gly Leu Gly Gly Phe Asp Glu Arg Se r Pro Leu Se r 340 345 350 etc aag atg etc ggc atg cac ggc t c t gee t ac gee aac t ac teg atg 2363 Leu Ly s Met Leu Gly Met His Gly Se r Ala Tyr Ala Asn Tyr Se r Met 355 360 365 cag aac gee gat c 11 ate ctg geg etc sgt gee ege t t gat gat cgt 2411 Gin Asn Ala Asp Leu Me Leu Ala Leu Gly Ala Arg Phe Asp Asp Arg 370 375 380 gtg acg ggc ege gt t gac gee 111 get ccg gag get ege eg t gee gag 2459 Val Thr Gly Arg Val Asp Ala Phe Ala Pro Glu Ala Arg Arg Ala Glu 385 390 395 400 ege gag ggc ege ggt ggc ate gt t cac 111 gag at t tee ccc aag aac 2507 Arg Glu Gly Arg Gly Gly lie Val Hi s Phe Glu lie Se r Pro Lys Asn 405 410 415 etc cac aag gtc gtc cag ccc acc gtc geg gtc etc ggc gac gtg gtc 2555 Leu His Lys Val Val Gin Pro Thr Val Ala Val Leu Gly Asp Val Val

iS I 18 1324181 五、發明說明（） 420 425 430 gag aac etc gee aac gt c aeg ccc cac gtg cag ege cag gag ege gag 2603 Glu Asn Leu Ala Asn Val Thr Pro His Val Gin Arg Gin Glu Arg Glu 435 440 445 ccg tgg t 11 geg cag ate gee gat tgg aag gag aag cac c c t t t t c tg 265 1 Pro Trp Phe Ala Gin lie Ala Asp Trp Lys Glu Lys Hi s Pro Phe Leu 450 455 460 etc gag t c t gt t gat t eg gac gac aag gt t etc aag ccg cag cag g t c 2699 Leu Glu Se r Val Asp Se r Asp Asp Ly s Val Leu Lys Pro Gin Gin Val 465 470 475 480 etc aeg gag c 11 aac aag cag a 11 etc gag a 11 cag gag aag gac gee 2747 Leu Thr Glu Leu Asn Ly s Gin lie Leu Glu lie Gin Glu Lys Asp Ala 485 490 495 gac cag gag g t c t ac ate acc aeg ggc g t c gga age cac cag atg cag 2795 Asp Gin Glu Val Tyr lie Thr Thr Gly Val Gly Se r His Gin Met Gin 500 505 510 gca geg cag t t c c t t acc tgg acc aag ccg ege cag tgg ate tee t eg 2843 Λ1 a Ala Gin Phe Leu Thr Trp Thr Lys Pro Arg Gin Trp lie Se r Se r 515 520 525 ggt ggc gee ggc act atg ggc t a c ggc c 11 ccc teg gee a 11 ggc gee 2891 Gly Gly Ala Gly Thr Met Gly Tyr Gly Leu Pro Se r Ala lie Gly Ala 530 535 540 a ag a 11 gee aag ccc gat get a 11 gt t a t t gac ate gat ggt gat get 2939 Ly s lie Ala Ly s Pro Asp Ala lie Val lie Asp lie Asp Gly Asp Ala 545 550 555 560 t c t tat teg a t g acc ggt atg gaa t tg ate aca gca gee gaa 11 c aag 2987 Se r Tyr Se r Met Thr Gly Met Glu Leu lie Thr Ala Ala Glu Phe Lys 565 570 575 gt t ggc gtg aag a 11 c 11 c 11 t tg cag aac aac 111 cag ggc atg g t c 3035 Val Gly Val Ly s lie Leu Leu Leu Gin Asn Asn Phe Gin Gly Met Val 580 585 590 aag aac tgg cag gat etc 111 t ac gac aag ege t ac t eg ggc acc gee 3083

19 1324181

五、發明說明（） Lys Asn Trp 595 Gin Asp Leu Phe Tyr 600 Asp Lys Arg Tyr Se r Gly 605 Thr Ala a t g 11 c aac c eg ege 11 c gac aag gtc gee gat geg atg eg t gee aag 3131 Me t Phe Asn 610 Pro Arg Phe Asp Lys 615 Val Ala Asp Ala Met Arg 620 Ala Lys gg t etc t ac t gc geg a a a cag t eg gag etc aag gac aag ate aag gag 3179 G1y Leu Tyr 625 Cys Ala Lys Gin Se r 630 Glu Leu Lys 635 Asp Lys lie Lys Glu 640 t t t etc gag t ac gat gag ggt ccc gtc etc etc gag gt t 11 c gtg gac 3227 Phe Leu G1u Tyr Asp Glu Gly Pro 645 Val Leu Leu 650 Glu Val Phe Val Asp 655 aag gac aeg etc gtc ttg ccc atg gtc ccc get ggc 111 ccg etc cac 3275 Lys Asp Thr Leu Val Leu Pro Met 660 Val Pro A1a 665 Gly Phe Pro 670 Leu His gag atg gtc G1 u Met Va1 675 etc gag cct cct aag Leu Glu Pro Pro Lys 680 ccc aag gac Pro Lys Asp gee taa gttctttttt Ala 3324 ccatggcggg egagegageg agegegegag cgcgcaagtg cgcaagcgcc t tgcct tget 3384 11 gc 11 ege t t ege 111 gc t ttgcttcaca caacctaagt a t gaa 11 caa g 1111 c 11 gc 3444 t tgteggega t gee t gee t g ccaaccagcc agcca t ccgg ccggccg tee t tgaegee 11 3504 ege 11 ccggc gcggccatcg at tcaat tea ccca t ccga t aeg 11 ccgcc ccctcacgtc 3564 cgtctgcgca cgacccctgc acgaccacgc caaggccaac gcgccgc tea gc t cage 11 g 3624 tegaegagte gcacgtcaca tatctcagat gcat t tggac tgtgagtgt t at t a tgccac 3684 t agcacgcaa ega t c 11 egg gg t cc t ege t ca t tgea t cc g 11 cgggccc tgcaggcgtg 3744 gaegegag t c gccgccgaga ege tgeagea ggeege t ccg aegegaggge t egage t ege 3804 cgcgcccgcg cgatgtctgc ctggcgccga c t ga t c t c t g gagcgcaagg aagacacggc 3864 gaegegagga ggaccgaaga gagacgctgg ggtatgeagg a t a t a c c egg ggcgggaca t 3924 IS 3 20 1324181 五、發明說明（） tcgt tccgca tacac tcccc cat t cgagc t t gc t eg t cc t tggeagagee gagcgcgaac 3984 ggt tccgaac gcggcaagga 1111 ggc t c t ggtgggtgga c t ccga t ega ggcgcaggt t 4044 c t ccgcagg t t c t cgcaggc cggcagtggt eg 11 agaaa t agggagtgcc ggagtc t tga 4104 cgcgcc t t ag c t c a c t c t c c gc c c a c gc gc gcatcgccgc catgccgccg tcccgtctgt 4164 cgctgcgctg gccgcgaccg gc t gcgcc ag ag t acgacag tgggacagag c t egaggega 4224 cgcgaat cgc t cggg t tg t a agggt t tcaa gggtcgggcg tegtegegtg ccaaagtgaa 4284 aatagtaggg gggggggggg gt acccaccc cgggcaggt t ctcctcgcca gee t aag t gc 4344 c t aagggagc g t agggg 111 cgttgaccag agaageggag aacctgccgc ggegeggaga 4404 acc t a t cggc ggagaact tg ccaggcgcga ggcag 11 c t c caa t 11 gegg acagcggcgc 4464 gcccacgcga ggcggccgcg tggcgataca gegaggegae cgcgcggggc egeg t ggega 4524 cacagctgcg cgcggagtcg gctgcgagaa ggc 11 c t cgc tgge 11 gg t t ggggtcgcgg 4584 gtggcagggg a t gga t gccc agg t acg t eg gcg tgegege gcccagggag aaaaggacag 4644 acgcgcgggc ctgcgatgcg ageaegega t gcgagcacgc gatgegagea egega t gega 4704 gcacgcgagc gagcgcccga gcaaa t gcca cggaacacgc gttttttgtt tggtgat t tc 4764 t a t g t a t gcg gggagact t c ga t ggccgaa aggggtgcaa ggccaaaaga tgctgacagc 4824 t tcgatcggt c t acggcgcg ageaggaaag ggagcaaggg geggaat tet t c tgee t tga 4884 cccggggga t ccac t ag 11 c t agageggee gccaccgcgg tggagctcca a 11 cgccc t a 4944 tagtgagtcg t a 11 acgcgc gc t cac t ggc eg t eg 1111 a caacgtcgtg ac t gggaaaa 5004 ccc t ggcg 11 acccaac t t a a t cgcc 11 gc agcacatccc cct t tcgcca gctggcgtaa 5064 t agcgaagag gcccgcaccg a t cgccc 11 c ccaacag 11 g cgcagcc t ga atggcgaatg 5124 ggacgcgccc t g t agcggcg ca 11 aagege ggcgggtgtg gtggt taege gcagcgtgac 5184 cgc t acac t t gccagcgccc t agcgcccgc t cc 111 cgc t 11 c 11 c c c 11 cc t t t c t cgc 5244

21 1324181

五、發明說明（） cacgt tcgcc ggc 111 cccc g t caagc t c t aaatcggggg c t ccc 11 tag gg 11 ccga 11 5304 t ag tgc 111 a cggcacc t eg accccaaaaa ac 11 ga 11 ag ggtgatggt t cacgtagtgg 5364 gccatcgccc tgatagaegg 11111 cgccc 11 tgacgt tg gagtccacgt t c 111 aa t ag 5424 t ggac t c t t g 11 ccaaac t g gaacaacac t caaccctatc t egg t c t a11 c 111 tga 111 5484 a t aaggga 11 11 gc ega t t t eggee t a 11 g g 11 aa a aaa t gage t ga 111 aacaaaaatt 5544 t aacgcgaa t 111 aacaaaa t a t t aaege t t acaa 11 t ag g t ggcac 111 tcggggaaat 5604 g t gcgcggaa c c c c t a 11 t g 11 t a t 111 t c t a aa t aca 11 c aa a t a t gt a tccgctcatg 5664 agacaat aac c c t ga t a aa t get t c aa t aa t a 11 ga a aa a ggaagagtat gag t a 11 caa 5724 ca 111 ceg t g t cgccc 11 a t t c c c 1111 11 geggeat 111 gee t t cc tgt 1111 gc t c ac 5784 ccagaaacgc tggtgaaagt a a a ag a t gc t gaaga t cag t tgggtgcacg ag t ggg 11 ac 5844 a t cgaac t gg atctcaacag egg t aaga t c ct tgagagt t 11 cgccccga agaacg t 111 5904 ccaa t ga t ga gcac 1111 aa ag 11 c t gc t a tgtggcgcgg t a t t a t cccg tat tgaegee 5964 gggcaagagc aac t eggt eg ccgca t acac tat tctcaga atgact tggt tgagtac tea 6024 ccagtcacag aaaagcatct taeggatgge a t gacag t aa gagaat tatg cagtgctgcc 6084 ataaccatga gtgataacac tgcggccaac 11 ac 11 c tga caacga t egg aggaccgaag 6144 gage t aaccg c 111111 gc a caaca t gggg gatcatgtaa c t egee 11ga tegt tgggaa 6204 ccggagc tga a t ga age c a t accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc t g t agcaa t g 6264 gcaacaacgt t gcgcaaac t at t aac tggc gaac t ac 11 a c t c t age 11 c ccggcaacaa 6324 11 aa t agac t gga t ggagge gga t aaag 11 gcaggaccac 11 c t gege t c ggccc 11 ccg 6384 gctggctggt 11 a 11 gc t ga t aaa t c t gga gccggtgagc gtgggtctcg egg t a t ca 11 6444 gcagcac t gg ggccagatgg taagccctcc egtategtag 11 a t c t acac gacggggag t 6504 m 22 1324181 五、發明說明（） caggcaac t a tggatgaacg aaatagacag a t ege t gaga taggtgcctc actgat taag 6564 ca 11 gg t aac tgtcagacca ag t t t ac t ca t a t a t ac 111 aga 11 ga 111 aaaac t t ca t 6624 1111 aa 111 a a a agga t c t a ggtgaagatc c 11111 g a t a a t c t ca t gac caaaatccct 6684 taacgtgagt 11 tegt tcca ctgagegtea gaccccg t ag aaaaga t caa aggatet tet 6744 tgagatcc 11 11111 c tgcg cgtaatctgc tget tgcaaa caaaaaaacc accgc t acca 6804 gcggtggt 11 g 111 geegga t caagagc t a ccaac t c 111 t teegaaggt aac t ggc 11 c 6864 age agagcgc agat accaaa t ac t g t cc 11 c t ag t g t age eg t ag t t agg ccaccacttc 6924 aagaac t c t g t agcaccgcc t aca t acc t c gctctgctaa t cc t g 11 acc agtggc tget 6984 gccagtggcg ataagtegtg t c 11 accggg 11 ggac t caa gaega t agt t accgga t aag 7044 gcgcagcggt eggge tgaac ggggggt teg tgcacacagc ccagc 11 gga gcgaacgacc 7104 t acaccgaac t gaga t acc t acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgc t tcccgaaggg 7164 agaaaggegg acaggtatcc ggtaagegge agggtcggaa caggagagcg cacgagggag 7224 ct tccagggg gaaacgcc tg gt a t c 111 a t agtcctgtcg ggt t tcgcca cc tctgact t 7284 gagegtegat 111 tgtgatg c t eg t caggg gggeggagee t a t ggaa aaa cgccagcaac 7344 geggee 1111 t aegg 11 cc t ggee 1111 gc t ggee 1111 g c t caca t g 11 c t 11cc tgcg 7404 11 a t c c c c t g at tctgtgga t aaceg t a 11 acegee t 11 g ag t gage tga taccgc t ege 7464 cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagegagg aageggaaga gcgcccaata 7524 cgcaaaccgc c t c t ccccgc gegt tggccg a 11 ca 11 aa t gcagctggca cgacaggt 11 7584 cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gc a a 11 a a t g t gag 11 age t cac t ca 11 ag 7644 gcaccccagg c 111 acac 11 t a t gc t ΐ ceg getegtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga 7704 t aacaa 111 c acacaggaaa cage t a tgac ca t ga 11 aeg ccaagcgcgc a a t t a a c c c t 7764 cac t aaaggg aacaaaagc t ggg t accggg ccccccc t eg aggtegaegg t a t ega t aag 7824

Γ η ·> 23 1324181

五、發明說明 ( ) c 11 ga t a teg a a 11 :c tgea gcc 7S47 <210> 15 <211〉 684 <212> PRT <213> 裂壺 菌 <400> 15 Met Se r Ala Thr Arg Ala Ala Thr Arg Thr Ala Ala Ala Leu Se r Se r 1 5 10 15 Ala Leu Thr Thr Pro Val Ly s Gin Gin Gin Gin Gin Gin Leu Arg Val 20 25 30 Gly Ala Ala Se r Ala Arg Leu Ala Ala Ala Ala Phe Se r Se r Gly Thr 35 40 45 Gly Gly Asp Ala Ala Ly s Ly s Ala Ala Ala Ala Arg Ala Phe Se r Thr 50 55 60 Gly Arg Gly Pro Asn Ala Thr Arg Glu Ly s Se r Se r Leu Ala Thr Val 65 70 75 80 Gin Ala Ala Thr Asp Asp Ala Arg Phe Val Gly Leu Thr Gly Ala Gin 85 90 95 lie Phe His Glu Leu Met Arg Glu Hi s Gin Val Asp Thr lie Phe Gly 100 105 110 Tyr Pro Gly Gly Ala lie Leu Pro Val Phe Asp Ala lie Phe Glu Se r 115 120 125 Asp Ala Phe Ly s Phe He Leu AI a Arg His Glu Gin Gly Ala Gly His 130 135 140 Met Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ala Thr Gly Ly s Pro Gly Val Val Leu m 24 1324181 五、發明說明 ( ) 145 150 155 160 Val Thr Se r Gly Pro Gly Ala Thr Asn Thr lie Thr Pro lie Met Asp 165 170 175 Ala Tyr Met Asp Gly Thr Pro Leu Leu Val Phe Thr Gly Gin Val Pro 180 185 190 Thr Se r Ala Val Gly Thr Asp Ala Phe Gin Glu Cy s Asp lie Val Gly 195 200 205 lie Se r Arg Ala Cy s Thr Ly s Trp Asn Val Met Val Ly s Asp Val Ly s 210 215 220 Glu Leu Pro Arg Arg lie A s n Glu Ala Phe Glu lie A a Met Se r Gly 225 230 235 240 Arg Pro Gly Pro Val Leu Val Asp Leu Pro Ly s Asp Val Thr Ala Val 245 250 255 Glu Leu Ly s Glu Met Pro Asp Se r Se r Pro Gin Val Ala Val Arg Gin 260 265 270 Ly s Gin Ly s Val Glu Leu Phe His Ly s Glu Arg lie Gly Ala Pro Gly 275 280 285 Thr Ala Asp Phe Ly s Leu lie Ala Glu Met lie Asn Arg Ala Glu Arg 290 295 300 Pro Val lie Tyr Ala Gly Gin Gly Val Met Gin Se r Pro Leu Asn Gly 305 310 315 320

25 1324181

五、發明說明 ( ) Pro Ala Val Leu Ly s Glu Phe Ala Glu Ly s Ala Asn lie Pro Val Thr 325 330 335 Thr Thr Met Gin Gly Leu Gly Gly Phe Asp Glu Arg Se r Pro Leu Se r 340 345 350 Leu Ly s Met Leu Gly Met His Gly Se r Ala Tyr Ala Asn Tyr Se r Met 355 360 365 Gin A s n Ala Asp Leu lie Leu Ala Leu Gly Ala Arg Phe Asp Asp Arg 370 375 380 Val Thr Gly Arg Val Asp Ala Phe Ala Pro Glu Ala Arg Arg Ala Glu 385 390 395 400 Arg Glu Gly Arg Gly Gly lie Val His Phe Glu lie Se r Pro Ly s Asn 405 410 415 Leu His Ly s Val Val Gin Pro Thr Val Ala Val Leu Gly Asp Val Val 420 425 430 Glu Asn Leu Ala Asn Val Thr Pro His Val Gin Arg Gin Glu Arg Glu 435 440 445 Pro Trp Phe Ala Gin lie Ala Asp Trp Ly s Glu Ly s His Pro Phe Leu 450 455 460 Leu Glu S e r Val Asp Se r Asp Asp Ly s Val Leu Ly s Pro Gin Gin Val 465 470 475 480 Leu Thr Glu Leu Asn Ly s Gin lie Leu Glu lie Gin Glu Ly s Asp Ala 485 490 495 m 26 1324181

五、發明說明 ( ) Asp Gin GIu Val Tyr lie Thr Thr Gly Val Gly Se r His Gin Met Gin 500 505 510 Ala Ala Gin Phe Leu Thr Trp Thr Ly s Pro Arg Gin Trp lie Ser Ser 515 520 525 Gly Gly Ala Gly Thr Met Gly Tyr Gly Leu Pro Ser Ala He Gly Ala 530 535 540 Ly s lie A \ a Ly s Pro Asp Ala lie Val lie Asp lie Asp Gly Asp Ala 545 550 555 560 Se r Tyr Se r Met Thr Gly Met Glu Leu lie Thr Ala Ala Glu Phe Ly s 565 570 575 Val Gly Val Ly s lie Leu Leu Leu G-ln Asn Asn Phe Gin Gly Met Val 580 585 590 Ly s Asn Trp Gin Asp Leu Phe Tyr Asp Ly s Arg Tyr Ser Gly Thr Ala 595 600 605 Met Phe Asn Pro Arg Phe Asp Ly s Val Ala Asp Ala Met Arg A a Ly s 610 615 620 Gly Leu Tyr Cy s Ala Ly s Gin Se r Glu Leu Ly s Asp Ly s lie Ly s Glu 625 630 635 640 Phe Leu Glu Tyr Asp Glu Gly Pro Val Leu Leu Glu Val Phe Val Asp 645 650 655 Ly s Asp Thr Leu Val Leu Pro Met Val Pro Ala Gly Phe Pro Leu His 660 665 670 27 1324181

五、發明說明（） Glu Met Val Leu Glu Pro Pro Lys 675 680 Pro Lys Asp Ala <210> 16 t a t cga t aag <21 1> 30 <212> DNA <213〉裂壺菌 ct tgaegteg aattcctgca <400> 16 30 <210> 17 catggtcaag <211〉 32 <212〉 DNA <213> 裂壺菌 aacgt tcagg atctctttta eg <400> 17 32 <210> 18 pr i m_t rans <211> 7847 c r i p t <222> <212> DNA <213> 裂壺菌 <220> (1 ) . . ( 1 259) <223> <221> <220> <221> CDS <222> ( 1260). .(3314) <223> <220> <221> prim_transcript <222> (3315). .(4887) <223> <220> <221> mutation <222> (3042)..(3044) <223> <400> 18 11 g t cgac ag caact tgcaa gt tataegeg accaccaggc aa t c t cagea cgcccagcga 60 gcacggagc t t gegaagagg gt t tacaagt cgtcgt teat t ege t c t caa gc t t t gcc t c 120 aacgcaacta ggcccaggcc t ac 11 t cac t g t g t c 11 g t c t tgcct t tea caccgaccga 180 gtgtgcacaa ccgtgt 11 tg cacaaagcgc aagatgc tea ctcgactgtg aagaaagg 11 240 gcgcgcaagc gac tgegae t gegaggatga ggatgactgg cagcc t g 11 c aaaaac t gaa 300 aa t ccgcga t gggtcagtgc ca 11 egegea tgacgcctgc gagagacaag 11 aac t eg tg 360 tcactggcat g t cc t agea t c 111 aegega gcaaaat tea ateget t tat 1111 tcagt t 420 t eg t aacc 11 c t cgcaaccg egaa t egeeg 11 tcagcctg ac t aa t c tgc age t geg t gg 480 cactgtcagt cagtcagtca gtcgtgcgcg c t g 11 ccagc accgagg teg egeg t egeeg 540 egee t ggacc gc t gc t gc t a ctgctagtgg cacggcaggt aggaget tgt tgccggaaca 600 m 28 1324181 五、發明說明（） ccagcagccg ccagt cgacg figcg t g t gc a a ac t a a eg t t tgeagagege agcgcgcaag gcact tgegg gcgcggcgcg ccagccaggg gaaagtccgg cgtcgaaggg agaggaagge gaccac tgge gcccgccgac aegageagga ageaggeage tgcagaatgc gegaaaga t c cacttgcgcg cggcgggcgc gaacagtgcg gaaaggagcg gtgeagaegg cgcgcagtga 660 720 780 840 cagtgggcgc aaagccgcgc agt aageage ggcggggaac ggtataegea gtgccgcggg 900 ccgccgcaca cagaagtata cgcgggccga agtggggcgt cgcgcgcggg aagtgcggaa 960 tggcgggcaa ggaaaggagg aaaagaaaga aagaaagaaa gaaatgaaag cacggcacgg gaggagegeg cgcaggaccc agaeggaaag agggcgggaa agagagagag agagagtgaa gaaagaaaga aage t eggag ccacgccgcg gggagagaga caaagcaaag caaagcagac ccagccagac ccagccgagg gegeggegag egagegagea cggcgcgcga gegagegage 1020 1080 1140 1200 gagegagege gegagegage aagge 11 gc t gegagegate gagegagega gegggaagg 1259 a t g age geg a c c ege geg geg aeg agg aca geg geg geg ctg tee teg 1307 Met Se r Ala Thr Arg Ala Ala Thr Arg Thr Ala Ala Ala Leu Se r Se r 1 5 10 15 geg c t g aeg aeg c c t g t a aag cag cag cag cag cag cag ctg ege g t a 1355 Ala Leu Thr Thr Pro Val Ly s Gin Gin Gin Gin Gin Gin Leu Arg Val 20 25 30 ggc geg geg t eg gca egg c t g geg gee geg geg 11 c teg tee ggc aeg 1403 Gly Ala Ala Se r Ala Arg Leu Ala Ala Ala Ala Phe Se r Se r Gly Thr 35 40 45 ggc gga gac geg gee aag aag geg gee geg geg agg geg 11 c tee aeg 1451 Gly Gly Asp Ala Ala Ly s Ly s Ala Ala Ala Ala Arg Ala Phe Se r Thr 50 55 60 gga ege ggc ccc aac geg aca ege gag aag age teg c t g gee aeg g t c 1499 Gly Arg Gly Pro Asn Ala Thr Arg G1 u Ly s Se r Se r Leu Ala Thr Val 65 70 75 80

29 五、發明說明（） c ag geg geg aeg gac gat geg ege 11 c gtc ggc ctg acc ggc gee caa 1547 Gin Ala Ala Thr Asp Asp Ala Arg Phe Val Gly Leu Thr Gly Ala Gin 85 90 95 ate 111 cat gag etc atg ege gag cac cag gtg gac acc ate 111 ggc 1595 lie Phe His Glu Leu Met Arg Glu Hi s Gin Val Asp Thr lie Phe Gly 100 105 110 t ac cc t ggc ggc gee a 11 ctg ccc gt t 111 gat gee a 11 111 gag ag t 1643 Tyr Pro Gly Gly Ala lie Leu Pro Val Phe Asp Ala lie Phe Glu Se r 115 120 125 gac gee 11 c aag 11 c a 11 etc get ege cac gag cag ggc gee ggc cac 1691 Asp Ala Phe Ly s Phe lie Leu A] a Arg His Glu Gin Gly Ala Gly His 130 135 140 a t g gee gag ggc t ac geg ege gee aeg ggc aag ccc ggc gt t gtc etc 1739 Me t Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ala Thr Gly Ly s Pro Gly Val Val Leu 145 150 155 160 gtc acc teg ggc c c t gga gee acc aac acc ate acc ccg ate atg gat 1787 Val Thr Se r Gly Pro Gly Ala Thr Asn Thr lie Thr Pro lie Met Asp 165 170 175 get t ac a t g gac ggt aeg ccg ctg etc gtg 11 c acc ggc cag gtg ccc 1835 Ala Tyr Met Asp Gly Thr Pro Leu Leu Val Phe Thr Gly Gin Val Pro 180 185 190 acc t c t get gtc ggc aeg gac get 11 c cag gag tgt gac a 11 gt t ggc 1883 Thr Se r Ala Val Gly Thr Asp Ala Phe Gin Glu Cy s Asp lie Val Gly 195 200 205 ate age ege geg tgc acc aag tgg aac gtc atg gtc aag gac gtg aag 1931 lie Se r Arg Ala Cy s Thr Ly s Trp Asn Val Met Val Ly s Asp Val Ly s 210 215 220 gag etc ccg ege ege ate aa t gag gee 111 gag a 11 gee atg age ggc 1979 G1 u Leu Pro Arg Arg lie Asn Glu Ala Phe Glu lie Ala Met Se r Gly 225 230 235 240 ege ccg ggt ccc gtg etc gtc gat c 11 cc t aag gat gtg acc gee gt t 2027 Arg Pro Gly Pro Val Leu Val Asp Leu Pro Ly s Asp Val Thr Ala Val 245 250 255 30 1324181 五、發明說明 ( ) gag etc aag gaa atg ccc gac age tee ccc cag gt t get gtg ege cag 2075 Glu Leu Ly s Glu Met Pro Asp Se r Se r Pro Gin Val Ala Val Arg Gin 260 265 270 aag c aa aag gtc gag c 11 11 c cac aag gag ege a 11 ggc get cc t ggc 2123 Ly s Gin Ly s Val Glu Leu Phe His Lys Glu Arg lie Gly Ala Pro Gly 275 280 285 acg gee gac 11 c aag etc a 11 gee gag atg ate aac eg t geg gag ega 2171 Thr Ala Asp Phe Lys Leu lie Ala Glu Met lie Asn Arg Ala Glu Arg 290 295 300 c c c g t c ate tat get ggc cag ggt g t c atg cag age ccg t tg aa t ggc 2219 Pro Val lie Tyr Ala Gly Gin Gly Val Met Gin Se r Pro Leu Asn Gly 305 310 315 320 ccg get gtg etc aag gag t c geg gag aag gee aac a t ccc gtg acc 2267 Pro Ala Val Leu Lys Glu Phe Ala Glu Lys Ala Asn lie Pro Val Thr 325 330 335 acc acc a tg cag ggt etc ggc ggc 11 t gac gag eg t ag t ccc etc tee 2315 Thr Thr Met Gin Gly Leu Gly Gly Phe Asp Glu Arg Se r Pro Leu Se r 340 345 350 etc aag a tg etc ggc atg cac ggc t c t gee t a c gee aac t ac teg atg 2363 Leu Ly s Met Leu Gly Met His Gly Se r Ala Tyr Ala Asn Tyr Se r Met 355 360 365 cag aac gee gat c t ate c tg geg etc ggt gee ege t t gat gat cgt 2411 Gin Asn Ala Asp Leu lie Leu Ala Leu Gly Ala Arg Phe Asp Asp Arg 370 375 380 gtg acg ggc ege gt t gac gee 111 get ccg gag get ege cgt gee gag 2459 Val Thr Gly Arg Val Asp Ala Phe Ala Pro Glu Ala Arg Arg Ala Glu 385 390 395 400 ege gag esc ege ggt ggc ate gt t cac 11 t gag a 11 tee ccc aag aac 2507 Arg Glu Gly Arg Gly Gly lie Val His Phe Glu lie Se r Pro Lys Asn 405 410 415 etc cac aag gtc gtc cag ccc acc gtc geg gtc etc ggc gac gtg gtc 2555 Leu His Lys Val Val Gin Pro Thr Val Ala Val Leu Gly Asp Val Val

31 1324181

五、發明說明 ( ) 420 425 430 gag aac etc gee aac gtc aeg ccc cac gtg cag ege cag gag ege gag 2603 Glu Asn Leu Ala Asn Val Thr Pro His Val Gin Arg Gin Glu Arg Glu 435 440 445 ccg tgg 111 geg cag ate gee gat tgg aag gag aag cac cc t 111 c t g 265 1 Pro Trp Phe Ala Gin lie A1 a Asp Trp Ly s Glu Lys His Pro Phe Leu 450 455 460 etc gag t c t gtt gat teg gac gac aag gt t etc aag ccg cag cag gtc 2699 Leu Glu Se r Val Asp Se r Asp Asp Ly s Val Leu Lys Pro Gin Gin Val 465 470 475 480 etc aeg gag c 11 aac aag cag a 11 etc gag at t cag gag aag gac gee 2747 Leu Thr Glu Leu Asn Ly s Gin lie Leu Glu lie Gin Glu Lys Asp Ala 485 490 495 gac cag gag gtc t ac ate acc aeg ggc gtc gga age cac cag atg cag 2795 Asp Gin Glu Val Tyr lie Thr Thr Gly Val Gly Se r His Gin Met Gin 500 505 510 gca geg cag t c c 11 acc tgg acc aag ccg ege cag tgg ate tee teg 2843 Λ1 a Ala Gin Phe Leu Thr Trp Thr ly s Pro Arg Gin Trp lie Se r Se r 515 520 525 ggt ggc gee ggc act a g ggc t ac ggc c t ccc teg gee at t ggc gee 2891 G1 y Gly Ala Gly Thr Met Gly Tyr Gly Leu Pro Se r Ala lie Gly Ala 530 535 540 aag a 11 gee aag c c c gat get a 11 gtt at t gac ate gat ggt gat get 2939 Ly s lie Ala Ly s Pro Asp Ala lie Val lie Asp lie Asp Gly Asp A1 a 545 550 555 560 t c t tat teg a t g acc ggt a t g gaa t tg ate aca gca gee gaa 11 c aag 2987 Se r Tyr Se r Met Thr Gly Met Glu Leu lie Thr Ala Ala Glu Phe Lys 565 570 575 gt t ggc gtg aag a 11 c 11 c 11 t tg cag aac aac 111 cag ggc atg gtc 3035 Val Gly Val Ly s He Leu Leu Leu Gin Asn Asn Phe Gin Gly Met Val 580 585 590 aag aac gtt cag gat etc 111 t ac gac aag ege t ac teg ggc acc gee 3083 IS 1 32 1324181 五、發明說明（）

Lys Asn Val 595 a t g t t c aac Mel Phe Asn 610 gg t etc t ac Gly Leu Tyr 625 111 etc gag Phe Leu Glu

Gin Asp Leu ccg ege ttc Pro Arg Phe aag gac aeg Lys Asp Thr tgc geg aaa Cys Ala Lys 630 tac gat gag Tyr Asp Glu 645 etc g t c t t g Leu Val Leu 660

Phe Tyr Asp 600 gac aag gtc Asp Lys Val 615 cag teg gag Gin Se r Glu

Lys Arg Tyr ggt ccc gtc G1y Pro Val ccc atg gtc Pro Met Val 665 gee gat geg Ala Asp Ala 620 etc aag gac Leu Lys Asp 635 etc etc gag Leu Leu Glu 650 ccc get ggc Pro Ala Gly

Se r Gly Thr 605 atg egt gee Met Arg A1 a aag ate aag Lys lie Lys gt t ttc gtg Val Phe Val 655 111 ccg etc Phe Pro Leu 670

Ala aag 3131 Lys gag 3179 Glu 640 gac 3227 Asp cac 3275 His gag atg gtc Glu Met Val 675 :ctc gag cct cct aag Leu Glu Pro Pro Lys 680 ccc aag gac Pro Lys Asp gee taa g 11 c 11111 t Ala 3324 cca t ggcggg egagegageg agegegegag cecgcaagtg cgcaagcgcc t t gcc t t gc t 3384 11 gc 11 ege t teget t tget 11 gc 11 caca caacctaagt atgaat tcaa g t t 11 c t t gc 3444 11 g t eggega t gee t gee t g ccaaccagcc agcca t ccgg ccggccgtcc 11 gaegee 11 3504 ege 11 ccggc gcggccatcg a 11 caa 11 ca cccatccgat aegt tccgcc ccctcacgtc 3564 eg t c t gegea cgacccc t gc acgaccacgc caaggccaac gcgccgctca gc t cage 11 g 3624 tegaegagte gcacgt caca t a t c t caga t gca 111 ggac tgtgagtgt t at t a tgccac 3684 t agcacgcaa ega t c 11 egg ggtcctcgct cat tgcatcc gt tcgggccc tgcaggcgtg 3744 gaegegag t c gccgccgaga ege t gcagca ggeege t ccg aegegaggge t egage t ege 3804 cgcgcccgcg ega t g t c t gc c t ggegeega c t ga t c t c t g gagege aagg aagacacggc 3864 gaegegagga ggaccgaaga gaga ege t gg gg t a t gcagg a t a t acccgg ggcgggacat 3924

33 1324181

五、發明說明（） tcgt tccgca tacactcccc cat tegage t tgctcgtcct tggeagagee gagcgcgaac 3984 gg 11 ccgaac gcggcaagga 1111ggc t c t ggtgggtgga ctccgatcga ggcgcaggt t 4044 c t ccgcagg t t c t egeagge cggcagtggt eg 11 agaaa t agggag tgee ggagtet tga 4104 cgcgcct tag c t ca c t c t cc gcccacgcgc gca t cgccgc ca t gccgccg t cccg t c t g t 4164 cgc t gcgc t g gccgcgaccg gc tgcgccag ag t acgacag tgggacagag c t egaggega 4224 cgcgaatcgc tcgggt tgta agggt t tcaa gggtcgggcg tegtegegtg ccaaagtgaa 4284 aa t agtaggg gggggggggg gtacccaccc cgggcaggt t c t cc t cgcca gee t aag t gc 4344 c t aagggagc gtaggggt 11 cgt tgaccag agaageggag aacctgccgc ggegeggaga 4404 acctatcggc ggagaac t tg ccaggcgcga ggcagt tctc caa 111 gegg acagcggcgc 4464 gcccacgcga ggcggccgcg t ggega t aca gegaggegae cgcgcggggc cgcgtggcga 4524 cacagctgcg egeggagteg gc t gegagaa gget tetege t ggc 11 ggt t ggggtcgcgg 4584 g t ggcagggg atggatgccc aggtaegteg gcgtgcgcgc gcccagggag aaaaggacag 4644 acgcgcgggc ctgcgatgcg ageaegega t gcgagcacgc ga tgegagea egega t gega 4704 gcacgcgagc gagcgcccga gcaaatgcca cggaacacgc gt 1111 tgt t tggtgat t tc 4764 tatgtatgcg gggagact tc gatggccgaa aggggtgcaa ggccaaaaga t gc t ga cage 4824 t tcgatcggt c taeggegeg ageaggaaag ggagcaaggg geggaat tct tc tgee 11 ga 48S4 cccggggga t ccactagttc t agageggee gccaccgcgg tggagctcca at t cgc cc t a 4944 t agtgag t eg t a 11 aegege gctcactggc cgtcgt 11 ta caacgtcgtg ac t gggaaaa 5004 ccctggcgt t acccaac 11 a a t egee 11 gc agcaca t ccc cc 11 t cgcca gc tggcgtaa 5064 tagegaagag gcccgcaccg a t cgccc 11 c ccaacagt tg cgcagcc tga atggcgaatg 5124 ggacgcgccc tgtagcggcg cat taagege ggcgggtgtg gtggt taege gcagcgtgac 5184 cgc t acac 11 gccagcgccc t agcgcccgc t cc 111 cgc t 11 c t t ccc 11 cc 111 c t cgc 5244 m 34 1324181 五、發明說明（） cacg 11 cgcc ggc t t tcccc g t c a age t c t aaa t cggggg c t c cc t 11 ag gg t t ccga 11 5304 t ag t gc 111 a cggcacc t eg accccaaaaa ac 11 ga 11 ag ggtgat ggt t cacgtagtgg 5364 gcca t cgccc tgatagaegg 11111 c g c c c t t t gacg 11 g gagtccacgt t c t t t a a t ag 5424 t ggac t c t t g 11 cc aaac t g gaacaacact caaccctatc t egg t c t a t t c t t t t ga t 11 5484 a t aaggga 11 11gcega111 egge c t a t t g g t t aaaaaa t gagetgat 11 aacaaaaa t t 5544 t aacgcgaa t 111 aacaaaa t a 11 aaege t t acaa 111 ag g t ggc a c 111 tcggggaaat 5604 gtgcgcggaa c c c c t a 111 g 111 a 11111 c t a aa t a c a 11 caaa t a t g t a t cege t ca t g 5664 agacaataac cctgataaat gc 11 caa t aa t a t tgaaaaa ggaagagtat gag t a 11 caa 5724 cat t tccgtg t cgccc 11 a t t c c c 111111 geggea 1111 gcc 11 cc Ig t 1111 gc t cac 5784 ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaaga t cag t tgggtgcacg agtgggt tac 5844 atcgaactgg a t c t caacag eggt aagatc ct tgagagt t 11 cgccccga agaacg 1111 5904 ccaa t ga t ga gcac 1111 aa ag 11 c t gc t a tgtggcgcgg t a 11 a t c ccg t a 11 gaegee 5964 gggcaagagc aac t egg t eg ccgca t acac t a 11 c t caga atgact tggt tgagtac tea 6024 ccagtcacag aaaagca t c t taeggatgge a t gacag t aa gagaat t atg cag t gc t gee 6084 a t aacca t ga g t ga t aacac tgcggccaac 11 ac 11 c t ga caacga t egg aggaccgaag 6144 gage t aaccg c t 111 t tgea caaca tgggg ga t ca t g t aa c t cgcc 11 ga teg 11gggaa 6204 ccggagc tga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacga t gee tgtagcaatg 6264 gcaacaacgt t gege aaac t at taactggc gaac t ac 11 a c t c t age 11 c ccggcaacaa 6324 11 aa t agac t ggatggaggc gga t aaag 11 gcaggaccac t tc tgcgctc ggccc 11 ccg 6384 gctggctggt t tat tgctga t a aa t c t gga geegg tgage gtgggt c teg egg t a t ca 11 6444 gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc egtategtag 11a t c t acac gacggggagt 6504

35 1324181 五、發明說明（）

caggcaac t a tggatgaacg aaatagacag cattggtaac tgtcagacca agtttactca ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc t aacg t gag t tttcgttcca c t gagcgt ca tgagatcctt tttttctgcg egt aa t ct gc gcggtggt 11 gtttgccgga t caagagc t a ageagagege agataccaaa tactgt cc 11 aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gccagtggcg ataagtegtg tcttaccggg gcgcagcggt eggge tgaac gggggg 11 eg tacaccgaac t gaga t ac c t acagcg tgag agaaaggegg acaggtatcc gg t aagegge c 11 c c agggg gaaacgcc t g gtatctttat gagegtegat ttttgtgatg c t eg t c aggg gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc ttatcccctg attctgtgga taaccgtat t cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca cgcaaaccgc c t c t ccccgc gegt tggccg cccgac tgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaccccagg ctttacactt t a t gc 11 c eg taacaatttc acacaggaaa cagctatgac cac t aaaggg aacaaaagc t gggtaccggg a t ege t gaga taggtgcctc actgattaag tatataettt agattgattt aaaact teat ctttttgata atctcatgac caaaatccct gaccccg t ag aaaagatcaa aggatettet tgcttgcaaa caaaaaaacc accgc t acca ccaactcttt t teegaaggt aac tgge t tc c t ag t g t age cgtagttagg ccaccac t tc gc t c t gc t aa tcctgttacc ag tgge t gc t ttggactcaa gaegatagt t accggataag tgcacacagc ccagct tgga gcgaacgacc ctatgagaaa gcgccacgc t tcccgaaggg aggg t eggaa caggagageg cacgagggag ag t cc t g t eg ggtttcgcca cctctgactt gggeggagee t a t ggaaaaa cgccagcaac t ggee 1111 g ctcacatgt t ctttcctgcg accgcc 11 tg agtgagc tga taccgc tege g t gagegagg aagcgeaaga gcgcccaata attcattaat gcagc tggea cgacagg 111 gcaat taatg tgagt taget cac t ca t tag getegtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga catgattacg ccaagcgcgc aattaaccct ccccccc t eg aggt egaegg tategataag 6564 6624 6684 6744 6804 6864 6924 6984 7044 7104 7164 7224 7284 7344 7404 7464 7524 7584 7644 7704 7764 7824 IS 3 36 1324181 五、發明說明（） 7847 c 11 gacg t eg aa 11 cc tgea gee <21〇> 19 <21 1> 684 <212> PRT <213> 裂壺菌 <400> 19

Met Ser Ala Thr Arg Ala Ala Thr Arg Thr Ala Ala Ala Leu Ser Ser I 5 10 15

Ala Leu Thr Thr Pro Val Lys Gin Gin Gin Gin Gin Gin Leu Arg Val 20 25 30

Gly Ala Ala Ser Ala Arg Leu Ala Ala Ala Ala Phe Ser Ser Gly Thr 35 40 45

Gly Gly Asp Ala Ala Lys Lys Ala Ala Ala Ala Arg Ala Phe Ser Thr 50 55 60

Gly Arg Gly Pro Asn Ala Thr Arg Glu Lys Ser Ser Leu Ala Thr Val 70 75 8〇

Gin Ala Ala Thr Asp Asp Ala Arg Phe Val Gly Leu Thr Gly Ala Gin 85 90 95 lie Phe His Glu Leu Met Arg Glu His Gin Val Asp Thr lie Phe Gly 100 105 iio

Tyr Pro Gly Gly Ala lie Leu Pro Val Phe Asp Ala lie Phe Glu Ser !15 120 125

Asp Ala Phe Lys Phe lie Leu Ala Arg His Glu Gin Gly Ala Gly His 130 135 HO

Met Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ala Thr Gly Lys Pro Gly Val Val Leu 37 1324181

五、發明說明 ( ) 145 150 155 160 Val Thr Se r Gly Pro Gly Ala Thr Asn Thr lie Thr Pro lie Met Asp 165 170 175 Ala Tyr Met Asp Gly Thr Pro Leu Leu Val Phe Thr Gly Gin Val Pro 180 185 190 Thr Se r Ala Val Gly Thr Asp Ala Phe Gin Glu Cys Asp lie Val Gly 195 200 205 lie Se r Arg Ala Cys Thr Ly s Trp Asn Val Met Val Ly s Asp Val Ly s 210 215 220 Glu Leu Pro Arg Arg He Asn Glu Ala Phe Glu lie Ala Met Se r G1 y 225 230 235 240 Arg Pro Gly Pro Val Leu Val Asp Leu Pro Ly s Asp Val Thr Ala Val 245 250 255 Glu Leu Ly s Glu Met Pro Asp Se r Se r Pro Gin Val Ala Val Arg Gin 260 265 270 Ly s Gin Ly s Val Glu Leu Phe Hi s Ly s Glu Arg lie Gly Ala Pro Gly 275 280 285 Thr Ala Asp Phe Ly s Leu lie Ala Glu Met lie Asn Arg Ala Glu Arg 290 295 300 Pro Val lie Tyr Ala Gly Gin Gly Val Met Gin Se r Pro Leu Asn Gly 305 310 315 320 IS 1 38 1324181 五、發明說明 ( ) Pro Ala Val Leu Lys Glu Phe Ala Glu Lys Ala Asn lie Pro Val Thr 325 330 335 Thr Thr Met Gin Gly Leu Gly Gly Phe Asp Glu Arg Se r Pro Leu Se r 340 345 350 Leu Ly s Met Leu Gly Met His Gly Se r Ala Tyr Ala Asn Tyr Se r Met 355 360 365 Gin Asn Ala Asp Leu lie Leu Ala Leu Gly Ala Arg Phe Asp Asp Arg 370 375 380 Val Thr Gly Arg Val Asp Ala Phe Ala Pro Glu Ala Arg Arg Ala Glu 385 390 395 400 Arg Glu Gly Arg Gly Gly lie Val His Phe Glu lie Se r Pro Lys Asn 405 410 415 Leu His Ly s Val Val Gin Pro Thr Val Ala Val Leu Gly Asp Val Val 420 425 430 Glu Asn Leu Ala Asn Val Thr Pro His Val Gin Arg Gin Glu Arg Glu 435 440 445 Pro Trp Phe A a Gin lie Ala Asp Trp Lys Glu Lys His Pro Phe Leu 450 455 460 Leu Glu Se r Val Asp Se r Asp Asp Lys Val Leu Lys Pro Gin Gin Val 465 470 475 480 Leu Thr Glu Leu Asn Lys Gin lie Leu Glu lie Gin Glu Lys Asp Ala 485 490 495

39 1324181 五、發明說明（）

Asp Gin Glu Val Tyr lie Thr Thr Gly Val Gly Ser His Gin Met Gin 500 505 510

Ala Ala Gin Phe Leu Thr Trp Thr Lys Pro Arg Gin Trp lie Ser Ser 515 520 525

Gly Gly Ala Gly Thr Met Gly Tyr Gly Leu Pro Ser Ala lie Gly Ala 530 535 540

Lys lie Ala Lys Pro Asp Ala lie Val lie Asp lie Asp Gly Asp Ala 545 550 555 560

Ser Tyr Ser Met Thr Gly Met Glu Leu lie Thr Ala Ala Glu Phe Lys 565 570 575

Val Gly Val Lys lie Leu Leu Leu Gin Asn Asn Phe Gin Gly Met Val 580 585 590

Lys Asn Val Gin Asp Leu Phe Tyr Asp Lys Arg Tyr Ser Gly Thr Ala 595 600 605

Met Phe Asn Pro Arg Phe Asp Lys Val Ala Asp Ala Met Arg Ala Lys 610 615 620

Gly Leu Tyr Cys Ala Lys Gin Ser Glu Leu Lys Asp Lys lie Lys Glu 625 630 635 640

Phe Leu Glu Tyr Asp Glu Gly Pro Val Leu Leu Glu Val Phe Val Asp 645 650 655

Lys Asp Thr Leu Val Leu Pro Met Val Pro Ala Gly Phe Pro Leu His 660 665 670 40 1324181 五、發明說明（） Glu Met Val Leu Glu Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ala 675 680 <210> 20 <21 ]> 26 <212> DNA <213> 裂壺菌 <400> 20 ccggccaggt gcagacctct gctgtc 26 <210> 21 <211> 7847 <212> DNA <213> 裂壺菌 <220> <221> prim一transcript <222> (1)..(1259) <223> <220> <221> mutation <222> (1834)..(1835) <223> <220〉 <221〉 CDS <222> (1260). .(3314) <223> <220> <221> prim_transcript <222> (3315). .(4887) <223> <400> 21 t t g t c ga c a g c aac 11 gcaa gt tataegeg accaccaggc aatctcagca cgcccagcga 60 gcacggagc t t gegaagagg g 111 ac aag t eg t eg 11 ca t t ege t c t caa gc 111 gee t c 120 aacgcaact a ggcccaggcc t ac 111 cac t gtgtct tgtc t tgcct t tea caccgaccga 180 gtgtgcacaa ccgtgt t t tg cacaaagcgc aagatgc tea ctcgactgtg aagaaagg 11 240 gcgcgcaagc gac t gegae t gegaggatga ggatgactgg cagcctet tc aaaaactgaa 300 aa t ccgcga t ggg t cagt gc ca 11 egegea tgaegee tgc gagagacaag 11 aac t egtg 360 t cac t ggca t g t cc t agea t c 111 aegega gcaaaat tea a t ege 111 a t 1111 tcagt t 420 t eg t aacc 11 c t cgcaaccg egaa t egeeg 11 tcagcctg actaatctgc agctgcgtgg 480 cac t g t cag t cag t cag t ca gtcgtgcgcg ctgt tccagc accgaggtcg cgcgtcgccg 540 egee t ggacc gc t gc t gc i a ctgctagtgg cacggcagg t aggaget tgt t gccggaaca 600 ccagcagccg ccagtcgacg ccagccaggg gaaag t ccgg eg t egaaggg agaggaagge 660 ggcgtgtgca a ac t aa eg 11 gaccactggc gcccgccgac aegageagga ageaggeage 720

41 五、發明說明（） tgcagagcgc agcgcgcaag tgcagaatgc gcgaaaga t c cacttgcgcg cggcgggcgc 780 gcacttgcgg gcgcggcgcg gaacagtgcg gaaaggagcg gtgcagacgg cgcgcagtga 840 cagtgggcgc aaagccgcgc agtaagcagc ggcggggaac ggtatacgca gtgccgcggg 900 ccgccgcaca cagaagtata cgcgggccga agtggggcgt cgcgcgcggg aagtgcggaa 960 tggcgggcaa ggaaaggagg agacggaaag agggcgggaa agagagagag agagagtgaa 1020 aaaagaaaga aagaaagaaa gaaagaaaga aagctcggag ccacgccgcg gggagagaga 1080 gaaatgaaag cacggcacgg caaagcaaag caaagcagac ccagccagac ccagccgagg 1140 gaggagcgcg cgcaggaccc gcgcggcgag cgagcgagca cggcgcgcga gcgagcgagc 1200 gagcgagcgc gcgagcgagc aaggct tgct gcgagcgatc gagcgagcga gcgggaagg 1259 a t g age geg acc ege geg geg aeg agg aca geg geg geg c tg tee teg 1307 Met Se r Ala Thr Arg Ala Ala Thr Arg Thr Ala Ala Ala Leu Ser Ser 1 5 10 15 gcg c tg aeg aeg c c t gta aag cag cag cag cag cag cag c t g ege gta 1355 Ala Leu Thr Thr Pro Val Ly s Gin Gin Gin Gin Gin Gin Leu Arg Val 20 25 30 ggc geg geg teg gca egg c t g geg gee geg geg 11 c teg tee ggc aeg 1403 Gly Ala Ala Se r Ala Arg Leu Ala A1 a A1 a Ala Phe Ser Ser Gly Thr 35 40 45 ggc gga gac geg gee aag aag geg gee geg geg agg geg 11 c tee aeg 1451 Gly Gly Asp Ala Ala Ly s Ly s Ala A1 a Ala Ala Arg Ala Phe Ser Thr 50 55 60 gga ege ggc c c c aac geg aca ege gag aag age teg ctg gee aeg gtc 1499 Gly Arg Gly Pro Asn Ala Thr Arg Glu Ly s Se r Ser Leu Ala Thr Val 65 70 75 80 cag fieg geg aeg gac gat geg ege 11 c gtc ggc c t g acc ggc gee caa 1547 Gin Ala Ala Thr Asp Asp Ala Arg Phe Va] Gly Leu Thr Gly Ala Gin 85 90 95 五、發明說明（） ate 111 cat gag etc atg ege gag cac cag gtg gac acc ate 111 ggc 1595 lie Phe His Glu Leu Met Arg Glu His Gin Val Asp Thr lie Phe Gly 100 105 110 tac cc t ggc fige gee a 11 ctg ccc gt t 111 gat gee at t t t t gag agt 1643 Tyr Pro Gly Gly Ala lie Leu Pro Val Phe Asp Ala lie Phe Glu Se r 115 120 125 gac gee 11 c aag 11 c a 11 etc get ege cac gag cag ggc gee ggc cac 1691 Asp A1 a Phe Ly s Phe lie Leu A1 a Arg Hi s Glu Gin Gly Ala Gly His 130 135 140 a t g gee gag ggc tac geg ege gee aeg ggc aag ccc ggc gt t gtc etc 1739 Met Ala Glu Gly Tyr A1 a Arg Ala Thr Gly Ly s Pro Gly Val Val Leu 145 150 155 160 gt c acc teg ggc cc t gga gee acc aac acc ate acc ccg ate atg gat 1787 Val Thr Se r Gly Pro Gly Ala Thr Asn Thr lie Thr Pro lie Met Asp 165 170 175 get tac atg gac ggt aeg ccg ctg etc Stg 11 c acc ggc cag gtg cag 1835 Ala Tyr Met Asp Gly Thr Pro Leu Leu Val Phe Thr Gly Gin Val Gin 180 185 190 acc t c t get gtc ggc aeg gac get 11 c cag gag tgt gac a 11 gt t ggc 1883 Thr Se r Ala Val Gly Thr Asp Ala Phe Gin Glu Cys Asp lie Val Gly 195 200 205 ate age ege geg tgc acc aag tgg aac gtc atg gtc aag gac gtg aag 1931 lie Se r Arg Ala Cys Thr Ly s Trp Asn Val Met Val Ly s Asp Val Ly s 210 215 220 gag etc ccg ege ege ate a a t gag gee 111 gag a 11 gee atg age ggc 1979 Glu Leu Pro Arg Arg lie Asn Glu Ala Phe Glu lie Ala Met Se r Gly 225 230 235 240 ege ccg ggt ccc gtg etc gtc gat c 11 cc t aag gat gtg acc gee gt t 2027 Arg Pro Gly Pro Val Leu Val Asp Leu Pro Ly s Asp Val Thr Ala Val 245 250 255 gag etc aag gaa atg ccc gac age tee ccc cag gt t get gtg ege cag 2075 Glu Leu Ly s Glu Met Pro Asp Se r Se r Pro Gin Val Ala Val Arg Gin 260 265 270 43 1324181

五、發明說明 ( ) aag caa aag g c gag ct t t tc cac aag gag ege a 11 ggc get cc t ggc 2123 Ly s Gin Ly s Val Glu Leu Phe His Ly s Glu Arg lie Gly Ala Pro Gly 275 280 285 acg gee gac 11 c aag etc a 11 gee gag atg ate aac cgt geg gag ega 2171 Thr Ala Asp Phe Ly s Leu lie Ala Glu Met lie Asn Arg Ala Glu Arg 290 295 300 c c c g t c ate tat get ggc cag ggt gtc atg cag age ccg t tg a a t ggc 2219 Pro Val lie Tyr Ala Gly Gin Gly Val Met Gin Se r Pro Leu Asn Gly 305 310 315 320 ccg get gtg etc aag gag 11 c geg gag aag gee aac at t ccc gtg acc 2267 Pro Ala Val Leu Ly s Glu Phe Ala Glu Ly s Ala Asn lie Pro Val Thr 325 330 335 a c c a c c a t g cag ggt etc ggc ggc 11 t gac gag cgt ag t ccc etc tee 2315 Thr Thr Met Gin Gly Leu Gly Gly Phe Asp Glu Arg Se r Pro Leu Se r 340 345 350 etc aag atg etc ggc atg cac gee t c t gee t ac gee aac t ac teg atg 2363 Leu Ly s Met Leu Gly Met His Gly Se r Ala Tyr Ala Asn Tyr Se r Met 355 360 365 cag aac gee gat c 11 ate c g geg etc ggt gee ege t t gat gat cgt 241 1 Gin Asn Ala Asp Leu lie Leu Ala Leu Gly Ala Arg Phe Asp Asp Arg 370 375 380 gtg acg ggc ege gt t gac gee t t get ccg gag get ege cgt gee gag 2459 Val Thr Gly Arg Val Asp Ala Phe Ala Pro Glu Ala Arg Arg A a Glu 385 390 395 400 ege gag ggc ege ggt ggc ate gt t cac t t gag a t tee ccc aag aac 2507 Arg Glu Gly Arg Gly Gly lie Val His Phe Glu lie Se r Pro Lys Asn 405 410 415 etc cac aag g c gtc cag ccc acc gtc geg gtc etc ggc gac gtg gtc 2555 Leu His Ly s Val Val Gin Pro Thr Val Ala Val Leu Gly Asp Val Val 420 425 430 gag aac etc gee aac gtc acg ccc cac gtg cag ege cag gag ege gag 2603 Glu Asn Leu Ala Asn Val Thr Pro His Val Gin Arg Gin Glu Arg Glu m 44 1324181 五、 發明說明 ( ) 435 440 445 ccg tgg 111 geg cag ate gee gat tgg aag gag aag cac cc t t t t c t g 265 1 Pro Trp Phe Ala Gin lie Ala Asp Trp Ly s Glu Lys His Pro Phe Leu 450 455 460 etc gag t c t gt t gat teg gac gac aag £t t etc aag ccg cag cag gtc 2699 Leu Glu Se r Val Asp Se r Asp Asp Lys Val Leu Lys Pro Gin Gin Val 465 470 475 480 etc a eg gag c 11 aac aag cag a 11 etc gag a 11 cag gag aag gac gee 2747 Leu Thr Glu Leu Asn Lys Gin lie Leu Glu lie Gin Glu Lys Asp Ala 485 490 495 gac cag gag g t c t ac ate acc aeg ggc gtc gga age cac cag atg cag 2795 Asp Gin Glu Val Tyr He Thr Thr Gly Val Gly Se r His Gin Met Gin 500 505 510 gca geg cag t c c t acc tgg acc aag ccg ege cag tgg ate tee teg 2843 Ala Ala Gin Phe Leu Thr Trp Thr Lys Pro Arg Gin Trp lie Ser Ser 515 520 525 ggt ggc gee ggc act atg ggc t ac ggc c t ccc teg gee a t ggc gee 2891 Gly Gly Ala Gly Thr Met Gly Tyr Gly Leu Pro Se r Ala lie Gly Ala 530 535 540 aag a t gee aag ccc gat get a t gt t a 11 gac ate gat ggt gat get 2939 Ly s lie Ala Lys Pro Asp Ala lie Val lie Asp lie Asp Gly Asp Ala 545 550 555 560 t c t tat teg atg acc ggt atg gaa t tg ate aca gca gee gaa t tc aag 2987 Se r Tyr Se r Met Thr Gly Met Glu Leu lie Thr Ala Ala Glu Phe Lys 565 570 575 gt t ggc gtg aag a t t c 11 c 11 t tg cag aac aac 111 cag ggc atg gtc 3035 Val Gly Val Lys lie Leu Leu Leu Gin Asn Asn Phe Gin Gly Met Val 580 585 590 aag aac tgg cag gat etc 111 t ac gac aag ege t ac teg ggc acc gee 3083 Lys Asn Trp Gin Asp Leu Phe Tyr Asp Lys Arg Tyr Se r Gly Thr Ala 595 600 605 a t g t c aac ccg ege 11 c gac aag gtc gee gat geg atg eg t gee aag 3131

45 1324181

五、發明說明（） Met Phe Asn 610 Pro Arg Phe Asp Lys 615 Va1 Ala Asp Ala Met Arg 620 Ala Lys gg t etc t ac tgc geg aaa cag teg gag etc aag gac aag at c aag gag 3179 G 1 y Leu Tyr 625 Cys Ala Lys Gin Se r 630 G1u Leu Lys 635 Asp Lys lie Lys Glu 640 111 etc gag t ac gat gag gg t ccc gtc etc etc gag gt t t tc gtg gac 3227 Phe Leu Glu Tyr Asp Glu Gly Pro 645 Val Leu Leu 650 Glu Val Phe Val Asp 655 aag gac aeg etc gtc ttg ccc a t g gtc ccc get ggc 11 t ccg etc cac 3275 Lys Asp Thr Leu Va1 Leu Pro Met 660 Val Pro A1a 665 Gly Phe Pro 670 Leu His gag a tg gtc Glu Met Va1 675 etc gag cc t cc t aag Leu Glu Pro Pro Lys 680 ccc aag gac Pro Lys Asp gee t a a g 11 Ala c t 11 11 t 3324 ccatggcggg egagegageg agegegegag cgcgcaagtg cgcaagcgcc 11 gc c 11 gc t 3384 t t gc t t ege t t ege 111 gc t t tget tcaca caacctaagt atgaat tcaa g 1111 c 11 gc 3444 t tgteggega tgcctgcctg ccaaccagcc agcca t ccgg ccggccgtcc t tgacgcct t 3504 ege 11 ccggc gcggccat eg a 11 caa 11 ca cccatccgat aeg 11 ccgcc ccctcacgtc 3564 eg t c t gegea cgacccctgc acgaccacgc caaggccaac gcgccgctca gctcagct tg 3624 tegaegagte gcacgtcaca tatctcagat gcat t tggac tgtgagtgt t at tatgccac 3684 t agcacgcaa egatettegg ggtcctcgct cat tgeatcc gt t cgggccc tgcaggcgtg 3744 gaegegag t c gccgccgaga ege t gc age a ggeege t ccg aegegaggge t egage t ege 3804 cgcgcccgcg cgatgtctgc ctggcgccga c t ga t c t c t g gagcgcaagg aagacacggc 3864 gaegegagga ggaccgaaga gagacgctgg ggtatgeagg a t a t accegg ggcgggaca t 3924 t eg 11 c ege a t acac t cccc ca 11 egage t t gc t eg t cc t tggeagagee gagcgcgaac 3984 ggt t ccgaac gcggcaagga 111 tggetet ggtgggtgga c t cega t ega ggcgcaggt t 4044 (S 1 46 1324181 五、發明說明（） ctccgcaggt t c t cgcaggc cggcagtggt eg 11 agaaa t agggagtgcc ggag t c 11 ga 4104 cgcgcct t ag ctcactctcc gcccacgcgc gca tcgccgc catgccgccg t cccg t c t g t 4164 cgctgcgctg gccgcgaccg gctgcgccag ag t acgacag tgggacagag c t egaggega 4224 cgcgaatcgc t eggg 11 g t a agggt t tcaa gggtcgggcg tegtegegtg ccaaag t gaa 4284 aatagtaggg gggggggggg gtacccaccc cgggcaggt t ctcctcgcca gee t aag t gc 4344 c t aagggagc gtaggggt 11 cgt tgaccag agaageggag aacc t geege ggegeggaga 4404 acc t a t cggc ggagaact tg ccaggcgcga ggcagt tctc caat t tgegg acagcggcgc 4464 gcccacgcga ggcggccgcg tggcgataca gegaggegae cgcgcggggc egeg t ggega 4524 cacagctgcg egeggagteg gctgcgagaa gget tc tege tgget tggt t gggg t egegg 4584 gtggcagggg a t gga t gccc agg t a eg t eg geg tgegege gcccagggag aaaaggacag 4644 acgcgcgggc ctgcgatgcg ageaegega t gcgagcacgc gatgegagea egegatgega 4704 gcacgcgagc gagcgcccga gcaaatgcca cggaacacgc gt t 111 tg 11 t gg t ga 111 c 4764 tatgtatgcg gggag ac 11 c gatggccgaa agggg t gcaa ggccaaaaga t gc t gacagc 4824 t tcgatcggt ctacggcgcg ageaggaaag ggagcaaggg geggaa 11 c t t c t gcc t t ga 4884 cccggggga t c c ac t ag t t c t agageggee gccaccgcgg t ggage t cca a 11 egeec t a 4944 t ag t gag t eg t a 11 aegege gctcactggc eg t eg 1111 a caaeg t eg t g ac t gggaaaa 5004 ccctggcgt t acccaact t a a t egee 11 gc agcaca t ccc c c 111 egee a gctggcgtaa 5064 tagegaagag gcccgcaccg a t egecc 11 c ccaacag t tg ege age c t ga atggcgaatg 5124 ggacgcgccc tgtagcggcg ca 11 aagege ggcgggtgtg gtggt t aege gcagcgtgac 5184 ege t acac 11 gccagcgccc tagcgcccgc t cc 111 ege t 11 c 11 ccc 11 cc 111 c t ege 5244 cacgt tegee gget 11 cccc gtcaagctct aaa t cggggg c t ccc t 11 ag gg 11 ccga 11 5304 t ag t gc 111 a cggcacctcg accccaaaaa ac 11 ga 11 ag ggtgatggt t cacg t ag t gg 5364

47 1324181 五、發明說明（） gcca tcgccc tgatagacgg 11 11 t cgccc t 11 ga eg t t g gagtccacgt tetttaatag 5424 t ggac t c 11 g ttccaaactg gaacaacact caaccctatc teggtetatt cttttgattt 5484 ataagggatt t tgeegat 11 cggcctattg gttaaaaaat gagetgat 11 aacaaaaa 1 1 5544 taacgcgaat 111 aacaaaa t a 11 aaege t tacaatttag gtggcact 11 t cggggaaa t 5604 gtgegeggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg 5664 agacaa t aac cctgataaat gcttcaataa t a 11 gaaaaa ggaagagtat gag t a 11 caa 5724

catttccgtg t cgccc 11 a t tccc 111111 gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac 5784 ccagaaacgc tggtgaaagt aaa aga t gc t gaaga t cagt tgggtgcacg agtgggttac 5844 atcgaactgg atctcaacag egg t aaga t c c t tgagagt t 11 cgccccga agaacgtttt 5904 ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta t g t ggegegg tat tatcccg t a 11 gaegee 5964 gggcaagagc aac t egg t eg ccgcatacac tattctcaga atgact tggt tgagtactca 6024 ccag t cacag aaaagca t c t t a egg a t ggc atgacagtaa gaga a t t a t g cagtgctgcc 6084 a t aacca tga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacga t egg aggaccgaag 6144

gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa c t egee t tga tegt tgggaa 6204 ccggagc tga atgaagccat accaaacgac gagegtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg 6264 gcaacaacgt tgcgcaaact a 11 aac t ggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa 6324 11 aa t agac t gga t ggagge ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggccct teeg 6384 gctggctggt t tat tgctga t aaa t c tgga gccggtgagc gtgggtc teg cggtatcatt 6444 gcagcac tgg ggccaga t gg taagccctcc eg t a t eg t ag 11 a t c t acac gacggggagt 6504 caggcaac t a tggatgaacg aaa t agacag a t ege t gaga taggtgcctc actgattaag 6564 ca t tggt aac tgtcagacca agtttactca tatataettt agattgattt aaaacttcat 6624 m 48 1324181 五、發明說明（） 111 taat t ta aaagga t c t a ggtgaagatc c t t 11 t g a t a a t c t ca t gac caaaatccct 6684 t aacg tgag t t t t eg t t cca ctgagcgtca gaccccgtag aaaaga tcaa agga t c 11 c t 6744 tgagatcct t 11 11 t c t geg eg t a a t c t gc t gc 11 gc a aa caaaaaaacc accgctacca 6804 gcggtggt 11 gt t tgccgga tcaagagcta ccaac t c 111 t teegaaggt aac t ggc 11 c 6864 agcagagcgc agat accaaa t ac t g t cc t t c t ag t g t age eg t ag11 agg ccaccact tc 6924 aagaactctg t agcaccgcc t aca t acc t c gc t c t gc t aa tcctgt tacc agtggctgct 6984 gccagtggcg ataagtegtg t c 11 accggg 11 ggac t caa gaega t ag 11 accgga t aag 7044 gcgcagcggt eggge t gaac ggggggt teg tgcacacagc ccagc11gga gcgaacgacc 7104 t acaccgaac t gaga t acc t acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgc t tcccgaaggg 7164 agaaaggcgg acagg t a t cc ggtaagegge agggt eggaa caggagagcg cacgagggag 7224 c 11 ccagggg gaaacgcctg g t a t c 111 a t agtcctgtcg ggt t tcgcca cc t c t gac 11 7284 gagcgtcgat 1111 g t ga t g c t eg t caggg gggeggagee tatggaaaaa cgccagcaac 7344 gcggcc 11 11 t a egg 11 c c t ggee 111 tgc tggee 111 tg c t c a ca t g t t c 11 t c c t geg 7404 11 a t cccc t g a 11 c t g t gga taaccgtat t accgcc 111 g ag t gage t ga t accgc t ege 7464 cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagegagg aageggaaga gcgcccaa ta 7524 cgcaaaccgc c t c t ccccgc gegt tggccg a t t ca t t aa t gcagc t ggea egae agg t 11 7584 cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gc a a 11 a a t g tgagt taget cac t ca 11 ag 7644 gcaccccagg c 111 acac 11 tatgc t tcce getegtatgt tgtgtggaat tg t gagegga 7704 t aacaa 11 t c acacaggaaa cage t a tgac ca t ga 11 aeg ccaagcgcgc aa 11 aaccc t 7764 cac t aaaggg aacaaaagct gggtaccggg ccccccc teg agg t egaegg t a t ega t aag 7824 ct tgacgtcg aa 11 cc tgea gee 7847

49 1324181

五、發明說明 ( ) <210> 22 <211> 684 <212> PRT <213> 裂壺 菌 <400> 22 Met Se r Ala Thr Arg Ala Ala Thr Arg Thr Ala Ala Ala Leu Se r Se r 1 5 10 15 A1 a Leu Thr Thr Pro Val Ly s Gin Gin Gin Gin Gin Gin Leu Arg Val 20 25 30 Gly Ala Ala Se r Ala Arg Leu Ala Ala Ala Ala Phe Se r Se r Gly Thr 35 40 45 Gly Gly Asp Ala Ala Ly s Ly s Ala Ala Ala Ala Arg Ala Phe Se r Thr 50 55 60 Gly Arg Gly Pro Asn Ala Thr Arg Glu Ly s Se r Se r Leu Ala Thr Val 65 70 75 80 Gin Ala Ala Thr Asp Asp Ala Arg Phe Val Gly Leu Thr Gly Ala Gin 85 90 95 lie Phe His Glu Leu Met Arg Glu His Gin Val Asp Thr lie Phe Gly 100 105 110 Tyr Pro Gly Gly Ala lie Leu Pro Val Phe Asp A a lie Phe Glu Se r 115 120 125 Asp Ala Phe Ly s Phe lie Leu Ala Arg His Glu Gin Gly Ala Gly His 130 135 140 Met Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ala Thr Gly Ly s Pro Gly Val Val Leu 145 150 155 160 Val Thr Se r Gly Pro Gly Ala Thr Asn Thr lie Thr Pro lie Met Asp 50 1324181 五、發明說明 ( ) 165 170 175 Ala Tyr Met Asp Gly Thr Pro Leu Leu Val Phe Thr Gly Gin Val Gin 180 185 190 Thr Se r Ala Val Gly Thr Asp Ala Phe Gin Glu Cy s Asp lie Val Gly 195 200 205 lie Se r Arg Ala Cy s Thr Ly s Trp Asn Val Met Val Ly s Asp Val Ly s 210 215 220 Glu Leu Pro Arg Arg lie Asn Glu Ala Phe Glu lie Ala Met Se r Gly 225 230 235 240 Arg Pro Gly Pro Val Leu Val Asp Leu Pro Ly s Asp Val Thr Ala Val 245 250 255 Glu Leu Ly s Glu Met Pro Asp Se r Se r Pro Gin Val Ala Val Arg Gin 260 265 270 Ly s Gin Ly s Val Glu Leu Phe His Ly s Glu Arg lie Gly Ala Pro Gly 275 280 285 Thr Ala Asp Phe Ly s Leu lie Ala Glu Met lie Asn Arg Ala Glu Arg 290 295 300 Pro Val lie Tyr Ala Gly Gin Gly Val Met Gin Se r Pro Leu Asn Gly 305 310 315 320 Pro Ala Val Leu Ly s Glu Phe Ala Glu Ly s A1 a Asn lie Pro Val Thr 325 330 335 51 1324181

五、發明說明 ( ) Thr Thr Met Gin Gly Leu Gly Gly Phe Asp Glu Arg Se r Pro Leu Se r 340 345 350 Leu Ly s Met Leu Gly Met His Gly Se r Ala Tyr Ala Asn Tyr Se r Met 355 360 365 Gin Asn Ala Asp Leu lie Leu Ala Leu Gly Ala Arg Phe Asp Asp Arg 370 375 380 Val Thr Gly Arg Val Asp Ala Phe Ala Pro Glu Ala Arg Arg Ala Glu 385 390 395 400 Arg Glu Gly Arg Gly Gly lie Val Hi s Phe Glu lie Se r Pro Ly s Asn 405 410 415 Leu His Ly s Val Val Gin Pro Thr Val Ala Val Leu Gly Asp Val Val 420 425 430 Glu Asn Leu Ala Asn Val Thr Pro His Val Gin Arg Gin Glu Arg Glu 435 440 445 Pro Trp Phe Ala Gin lie Ala Asp Trp Ly s Glu Ly s His Pro Phe Leu 450 455 460 Leu Glu Se r Val Asp Se r Asp Asp Ly s Val Leu Ly s Pro Gin Gin Val 465 470 475 480 Leu Thr Glu Leu Asn Ly s Gin lie Leu Glu lie Gin Glu Ly s Asp Ala 485 490 495 Asp Gin Glu Val Tyr lie Thr Thr Gly Val Gly Se r His Gin Met Gin 500 505 510 IS 1 52 1324181 五、發明說明（）

Ala Ala Gin Phe Leu Thr Trp Thr Lys Pro Arg Gin Trp lie Ser Ser 515 520 525

Gly Gly Ala Gly Thr Met Gly Tyr Gly Leu Pro Ser Ala lie Gly Ala 530 535 540

Lys lie Ala Lys Pro Asp Ala lie Val lie Asp lie Asp Gly Asp Ala 545 550 555 560

Ser Tyr Ser Met Thr Gly Met Glu Leu lie Thr Ala Ala Glu Phe Lys 565 570 575

Val Gly Val Lys lie Leu Leu Leu Gin Asn Asn Phe Gin Gly Met Val 580 585 590

Lys Asn Trp Gin Asp Leu Phe Tyr Asp Lys Arg Tyr Ser Gly Thr Ala 595 600 605

Met Phe Asn Pro Arg Phe Asp Lys Val Ala Asp Ala Met Arg Ala Lys 610 615 620 Gly Leu Tyr Cy s Ala Lys Gin Ser Glu Leu Lys Asp Lys lie Lys Glu 625 630 635 640 Phe Leu Glu Tyr Asp Glu Gly Pro Val Leu Leu Glu Val Phe Val Asp 645 650 655 Lys Asp Thr Leu Val Leu Pro Met Val Pro Ala Gly Phe Pro Leu His 660 665 670 Glu Met Val Leu Glu Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ala 675 680 53 1324181

五、發明說明（） <210> 23 prim_t rans <211> 7847 c r i p t <222> <212> DNA <2丨3> 裂壺菌 <220> ( 1 ). .( 1 259) <223〉 <221> <220> <221> CDS <222> (1260). .(3314) <223> <220> <221> prim_transcript <222> (3315) ..(4887) <223> <220> <221> mutation <222> (1834)..(1835) <223> <220> <221> mutation <222> (3042)..(3044) <223> <400> 23 t tgtcgacag caac t tgcaa g 11 a t aegeg accaccaggc aa t c t cagea cgcccagcga 60 gcacggagc t t gegaagagg gt t tacaagt eg t eg 11 ca t t ege t c t caa gc 11 t gee t c 120 aacgcaac t a ggcccaggcc t ac 111 cac t gtgtct tgtc t tgcct t tea caccgaccga 180 gtgtgcacaa ceg t g 1111 g cacaaagcgc aagatgetea c t egae tgt g aagaaaggt t 240 gcgcgcaagc gac t gegac t gegagga t ga gga t gac t gg cag c c t g 11 c aaaaac tgaa 300 aa t ccgcga t gggtcagtgc ca 11 egegea tgaegee tgc gagagac aag 11 a a c t eg t g 360 t cac t ggca t g t cc t agea t c 111 aegega gcaaaat tea a t egc 111 a t 1111 tcagt t 420 t eg t aacc 11 ctcgcaaccg egaa t egeeg 111 cagcc t g ac t aa t c tgc agctgcgtgg 480 c a c t g t c ag t cagtcagtca gt eg t gegeg c t g 11 ccage accgagg teg egeg t egeeg 540 cgcctggacc gc t gc t gc t a c t gc t ag t gg cacggcaggt aggaget tgt tgccggaaca 600 ccagcagccg ccag t egaeg ccagccaggg gaaag t cegg eg t egaaggg agaggaagge 660 ggcgtgtgca a ac t a a eg t t gaccac tgge gcccgccgac aegageagga ageaggeage 720 tgeagagege agcgcgcaag tgcagaatgc gegaaagate cact tgcgcg cggcgggcgc 7S0 gcact tgegg gcgcggcgcg gaacagtgcg gaaaggagcg gtgeagaegg cgcgcag t ga 840 cagtgggcgc aaagccgcgc ag t aageage ggcggggaac gg t a t aegea gtgccgcggg 900 IS! 54 1324181 五、發明說明（） ccgccgcaca cagaag t a t a cgcgggccga agtggggcgt cgcgcgcggg aagtgcggaa 960 tggcgggcaa ggaaaggagg agaeggaaag agggcgggaa agagagagag agagagtgaa 1020 aaaagaaaga aagaaagaaa gaaagaaaga aageteggag ccacgccgcg gggagagaga 1080 gaaa t gaaag cacggcacgg caaagcaaag caaagcagac ccagccagac ccagccgagg 1140 gaggagcgcg cgcaggaccc gegeggegag egagegagea cggcgcgcga gegagegage 1200 gagcgagcgc gegagegage aagge 11 gc t gegagega t c gagegagega gegggaagg 1259 atg age geg acc ege geg geg aeg agg aca geg geg geg ctg tee teg 1307 Met Se r Ala Thr Arg Ala AI a Thr Arg Thr Ala Ala Ala Leu Ser Ser 1 5 10 15 gcg c t g aeg aeg cc t gta aag cag cag cag cag cag cag ctg ege gta 1355 A t a Leu Thr Thr Pro Val Ly s Gin Gin Gin Gin Gin Gin Leu Arg Val 20 25 30 SSC geg geg teg gca egg c t g geg gee geg geg t c teg tee ggc aeg 1403 Gly Ala Ala Se r Ala Arg Leu Ala Ala Ala Ala Phe Ser Ser Gly Thr 35 40 45 ggc gga gac geg gee aag aag geg gee geg geg agg geg t t c tee aeg 1451 Gly Gly Asp Ala Ala Ly s Ly s Ala Ala Ala Ala Arg Ala Phe Ser Thr 50 55 60 gga ege ggc ccc aac geg aca ege gag aag age teg ctg gee aeg gtc 1499 Gly Arg Gly Pro Asn Ala Thr Arg Glu Ly s Se r Ser Leu Ala Thr Val 65 70 75 80 cag geg geg aeg gac gat geg ege 11 c g c ggc ctg acc ggc gee caa 1547 Gin Ala Ala Thr Asp Asp Ala Arg Phe Val Gly Leu Thr Gly Ala Gin 85 90 95 ate t t cat gag etc a tg ege gag cac cag gtg gac acc ate 111 ggc 1595 lie Phe His Glu Leu Met Arg Glu His Gin Val Asp Thr lie Phe Gly 100 105 110 t ac cc t ggc ggc gee a 11 c t g ccc gt t 111 gat gee a 11 111 gag agt 1643 Tyr Pro Gly Gly Ala lie Leu Pro Val Phe Asp Ala lie Phe Glu Ser

55 1324181

五、發明說明 ( ) 115 120 125 gac gee 11 c aag t tc a 11 etc get ege cac gag cag ggc gee ggc cac 1691 Asp Ala Phe Lys Phe lie Leu Ala Are His Glu Gin Gly Ala Gly His 130 135 140 atg gee gag ggc t ac geg ege gee aeg ggc aag ccc ggc gt t gtc etc 1739 Met Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ala Thr Gly Lys Pro Gly Val Val Leu 145 150 155 160 gtc acc teg ggc cc t gga gee acc aac acc ate acc ccg ate atg gat 1787 Val Thr Se r Gly Pro Gly Ala Thr Asn Thr lie Thr Pro lie Met Asp 165 170 175 get t ac atg gac ggt aeg ccg c t g etc gtg 11 c acc ggc cag gtg cag 1835 Ala Tyr Met Asp Gly Thr Pro Leu Leu Val Phe Thr Gly Gin Val Gin ISO 185 190 acc t c t get gtc ggc aeg gac get t c cag gag tgt gac a 11 gt t ggc 1883 Thr Se r Ala Val Gly Thr Asp Ala Phe Gin Glu Cy s Asp lie Val Gly 195 200 205 ate age ege geg t gc acc aag tgg aac gtc atg gtc aag gac gtg aag 1931 lie Se r Arg Ala Cy s Thr Lys Trp Asn Val Met Val Lys Asp Val Lys 210 215 220 gag etc ccg ege ege a c aa t gag gee 111 gag a 11 gee atg age ggc 1979 Glu Leu Pro Arg Arg lie A s n Glu Ala Phe Glu lie Ala Met Se r Gly 225 230 235 240 ege ccg ggt c c c gtg etc gtc gat c 11 cc t aag gat gtg acc gee gt t 2027 A rg Pro Gly Pro Val Leu Val Asp Leu Pro Lys Asp Val Thr Ala Val 245 250 255 gag etc aag gaa atg ccc gac age tee ccc cag gt t get gtg ege cag 2075 Glu Leu Ly s Glu Me t Pro Asp Se r Se r Pro Gin Val Ala Val Arg Gin 260 265 270 aag caa aag gtc gag c 11 11 c cac aag gag ege a 11 ggc get cc t ggc 2123 Ly s Gin Lys Val Glu Leu Phe Hi s Lys Glu Arg lie Gly Ala Pro Gly 275 280 285 aeg gee gac 11 c aag etc at t gee gag atg ate aac eg t geg gag ega 2171 [si 56 五、發明說明 ( ) Thr Ala Asp Phe Lys Leu lie Ala Glu Me t lie Asn Arg Ala Glu Arg 290 295 300 CCC gtc ate tat get ggc cag ggt gtc a t g cag age ccg t tg aa t ggc 2219 Pro Val lie Tyr Ala Gly Gin Gly Val Met Gin Se r Pro Leu Asn Gly 305 310 315 320 ccg get gtg etc aag gag 11 c geg gag aag gee aac a t t CCC gtg acc 2267 Pro Ala Val Leu Lys Glu Phe Ala Glu Lys Ala Asn lie Pro Val Thr 325 330 335 acc acc a tg cag ggt etc ggc ggc t t gac gag cgt ag t CCC etc tee 2315 Thr Thr Met Gin Gly Leu Gly Gly Phe Asp Glu Arg Se r Pro Leu Se r 340 345 350 etc aag a tg etc ggc a t g cac ggc t c t gee t ac gee aac t ac teg atg 2363 Leu Lys Met Leu Gly Met His Gly Se r Ala Tyr Ala Asn Tyr Se r Met 355 360 365 cag aac gee gat c t ate c tg geg etc ggt gee ege t t gat gat cgt 2411 Gin A s n Ala Asp Leu lie Leu A a Leu Gly Ala Arg Phe Asp Asp Arg 370 375 380 gtg aeg ggc ege gt t gac gee 111 get ccg gag get ege cgt gee gag 2459 Val Thr Gly Arg Val Asp Ala Phe Ala Pro Glu Ala Arg Arg Ala Glu 385 390 395 400 ege gag ggc ege ggt ggc ate gt t cac 111 gag a t tee CCC aag aac 2507 Arg Glu Gly Arg Gly Gly lie Val His Phe Glu lie Se r Pro Lys Asn 405 410 415 etc cac aag gtc gtc cag CCC acc gtc geg gtc etc ggc gac gtg gtc 2555 Leu His Lys Val Val Gin Pro Thr Val Ala Val Leu Gly Asp Val Val 420 425 430 gag aac etc gee aac gtc aeg CCC cac gtg cag ege cag gag ege gag 2603 Glu Asn Leu Ala Asn Val Thr Pro His Val Gin Arg Gin Glu Arg Glu 435 440 445 ccg tgg 111 geg cag ate gee gat tgg aag gag aag cac cc t 11 t c t g 265 1 Pro Trp Phe A a Gin lie Ala Asp Trp Lys Glu Lys His Pro Phe Leu 450 455 460 57 1324181 9 五、發明說明（） etc gag tet g 11 gat teg gac gac aag gtt etc aag ccg cag cag gtc 2699 Leu Glu Ser Val Asp Ser Asp Asp Lys Val Leu Lys Pro Gin Gin Val 465 470 475 480 etc aeg gag ett aac aag cag a 11 etc gag att cag gag aag gac gee 2747 Leu Thr Glu Leu Asn Lys Gin lie Leu Glu He Gin Glu Lys Asp Ala 485 490 495 gac cag gag gtc tac ate acc aeg ggc gtc gga age cac cag atg cag 2795 Asp Gin Glu Val Tyr lie Thr Thr Gly Val Gly Ser His Gin Met Gin 500 505 510 gca geg cag t t c ett acc tgg acc aag ccg ege cag tgg ate tee teg 2843 Ala Ala Gin Phe Leu Thr Trp Thr Lys Pro Arg Gin Trp lie Ser Ser 515 520 525 gg t ggc gee ggc act atg ggc tac ggc ett ccc teg gee a 11 ggc gee 2891 Gly Gly Ala Gly Thr Met Gly Tyr Gly Leu Pro Ser Ala lie Gly Ala 530 535 540 aag att gee aag ccc gat get at t gt t att gac ate gat gg t gat get 2939 Lys lie Ala Lys Pro Asp Ala lie Val 丨le Asp lie Asp Gly Asp Ala 545 550 555 560 tet tat teg atg acc ggt atg gaa ttg ate aca gca gee gaa ttc aag 2987 Ser Tyr Ser Met Thr Gly Met Glu Leu lie Thr Ala Ala Glu Phe Lys 565 570 575 gtt ggc gtg aag att ett ett ttg cag aac aac ttt cag ggc atg gtc 303 5 Val Gly Val Lys lie Leu Leu Leu Gin Asn Asn Phe Gin Gly Met Val 580 585 590 aag aac gtt cag gat etc ttt tac gac aag ege tac teg ggc acc gee 3083 Lys Asn Val Gin Asp Leu Phe Tyr Asp Lys Arg Tyr Ser Gly Thr Ala 595 600 605 atg ttc aac ccg ege ttc gac aag gtc gee gat geg atg cgt gee aag 3131 Met Phe Asn Pro Arg Phe Asp Lys Val Ala Asp Ala Met Arg Ala Lys 610 615 620 ggt etc tac tgc geg aaa cag teg gag etc aag gac aag ate aag gag 3179 Gly Leu Tyr Cys Ala Lys Gin Ser Glu Leu Lys Asp Lys lie Lys Glu 625 630 635 640 m 58 1324181 五、發明說明（） 11 t etc gag Phe Leu Glu t ac gat gag ggt ccc Tyr Asp Glu Gly Pro 645 gtc etc etc Val Leu Leu 650 gag g t t t t c gt g gac Glu Val Phe Val Asp 655 3227 - aag gac aeg Lys Asp Thr etc gtc t tg ccc atg Leu Val Leu Pro Met 660 gtc ccc get Val Pro AU 665 ggc 11 t ccg etc cac Gly Phe Pro Leu Hi s 670 3275 gag atg gtc Glu Met V a 1 675 etc gag cct cct aag Leu Glu Pro Pro Lys 680 ccc aag gac Pro Lys Asp gee t a a gttctttttt Ala 3324 • ccatggcggg egagegageg agegegegag cgcgcaagtg cgcaagcgcc t tgcct tget 3384 # t tgc 11 ege t t ege 111 gc t 11 gc 11 caca caacc t aagt a t gaa 11 caa g1111 c 11gc 3444 t tgteggega t gee t gc c t g ccaaccagcc agcca t ccgg ccggccgtcc t tgaegee 11 3504 ege 11 ccggc gcggcca t eg a t t caa 11 ca ccca t ccga t aegt tccgcc ccc t cacg t c 3564 • cgtctgcgca cgacccc t gc acgaccacgc caaggccaac gcgccgc tea gctcagct tg 3624 t egaegag t c gcacgtcaca t a t c t caga t gca 111 ggac tgt gag t g11 a 11 a tgccac 3684 t agcacgcaa ega t c 11 egg gg t cc t ege t cat tgeatcc gt tegggccc tgcaggcgtg 3744 gaegegag t c gccgccgaga cgctgcagca ggeege t ccg aegegaggge t egage t ege 3804 % cgcgcccgcg ega t g t c t gc c t ggegeega c t ga t c t c t g gagegea agg aagacacggc 3864 gaegegagga ggaccgaaga gagacgctgg gg t a t gcagg a t a t acc egg ggcgggaca t 3924 tegt teegea t acac t cccc cat tegage t t gc t eg t cc t tggeagagee gagcgcgaac 3984 ggt tccgaac gcggcaagga 1111 ggc t c t ggtgggtgga ctccgat ega ggcgcagg 11 4044 ctccgcaggt t c t egeagge cggcagtggt eg 11 aga a a t agggag t gee ggagtet tga 4104 cgcgcct tag c t cac t c t cc gcccacgcgc gca t cgccgc catgccgccg t cccg t c t g t 4164 ege t gege t g gccgcgaccg gctgcgccag agtacgacag tgggacagag c t egaggega 4224 59 1324181

五、發明說明（） cgcgaa t cgc tcgggt tgta aggg t 11 caa gggtcgggcg tegtegegtg ccaaag t gaa 4284 aa t ag t aggg gggggggggg gtacccaccc egggeagg 11 ctcctcgcca gee t aag t gc 4344 c t aagggagc S t agggg t t t cgt tgaccag agaageggag aacc tgeege ggegeggaga 4404 acc t a t cggc ggagaact tg ccaggcgcga ggcagt tctc caa 11 tgegg acagcggcgc 4464 gcccacgcga ggcggccgcg tggcgataca gegaggegae cgcgcggggc cgcgtggcga 4524 cacagctgcg egeggagt eg gctgcgagaa ggc 11 c t cgc tgget tggt t ggggtcgcgg 4584 gtggcagggg atggatgccc agg t aeg t eg geg t gegege gcccagggag aaaaggacag 4644 acgcgcgggc ctgcgatgcg ageaegega t gcgagcacgc gatgegagea egega t gega 4704 gcacgcgagc gagcgcccga gcaaatgcca cggaacacgc gt 1111 tgt t t gg t ga 111 c 4764 t a t g t a t gcg gggagac 11 c ga t ggccgaa aggggtgcaa ggccaaaaga tgctgacagc 4824 t tcgatcggt c t aeggegeg ageaggaaag ggagcaaggg geggaat tet tctgcct tga 4884 cccggggga t ccactagt tc t agageggee gccaccgcgg tggage t cca at t cgccc ta 4944 t ag t gag t eg t a 11 aegege gc t cac tgge eg t eg 1111 a caacgtcgtg ac t gggaaaa 5004 ccctggcgt t acccaact ta a tegee 11 gc agcaca t ccc cc 111 cgcca gctggcgtaa 5064 tagegaagag gcccgcaccg a t cgccc t t c ccaacagttg cgcagcc tga a t ggcg a a t g 5124 ggacgcgccc tgtagcggcg ca 11 aagege ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac 5184 cgc t acac 11 gccagcgccc t agcgcccgc t cc 111 cgc t 11 c 11 ccc t t cc 111 c t cgc 5244 cacgt tegee ggc 111 cccc g t caagc t c t aaa t cggggg c t ccc 111 ag gg 11 ccga 11 5304 \agt gc 111 a cggcacct eg accccaaaaa act tgat tag ggtgatggt t cacgtagtgg 5364 gcca t cgccc t ga t agaegg 11111 cgccc 11 tgacgt tg gag t ccacg t t c 111 a a t ag 5424 tggactct tg 11 ccaaac t g gaacaacac t caaccctatc teggtetat t ct 11 tgat 11 5484 ataagggatt 11geega 111 cggcctat tg g 11 aaaaaa t gagctgattt aacaaaaa 11 5544 60 1324181 五、發明說明（） t aacgcgaa t t t t aacaaaa t a t t aaege t t acaa t t t ag gtggcact t t tcggggaaat 5604 gtgcgcggaa cccc t a t t t g 11 t a t t t 11 c t a a a t a c a 11 ca a a t a t g t a t cege t c a t g 5664 agacaataac cc t ga t aaa t gc 11 caa t aa t a 11 ga a aaa ggaagagtat gag t a 11 caa 5724 ca 111 ccg t g t cgccc 11 a t t c c c 11 11 11 geggea t 11 t gc c 11 c c t g t t 11 t gc t cac 5784 ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg ag t ggg 11 ac 5844 a t cgaac t gg a t c t caacag egg t aaga t c c t tgagagt t 11 cgccccga agaaegt t 11 5904 c c a a t ga t ga gcac 1111 aa ag 11 c t gc t a tgtggcgcgg t a 11 a t c ceg t a 11 gaegee 5964 gggcaagagc aac t cgg t eg ccgcatacac t a 11 c t caga atgact tggt t gag t ac t ca 6024 ccag t cacag aaaagca t c t taeggatgge atgacagtaa gagaa 11 a tg cag t gc t gee 6084 ataaccatga gtgataacac tgcggccaac t tact tctga caacga t egg aggaccgaag 6144 gage t aaccg ct 1111 tgea caacatgggg gatcatgtaa c t egee 11 ga tegt tgggaa 6204 ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacga t gee tgtagcaatg 6264 gcaacaacgt t gege aaac t a 11 aac t ggc gaac t ac 11 a c t c t age 11c ccggcaacaa 6324 11 aa t agac t gga t ggagge gga t aaag 11 gcaggaccac 11 c t gege t c ggccc 11 ccg 6384 gctggctggt 11 a t tgc t ga t aaa t c t gga gccggtgagc gtgggtctcg egg t a t c a 11 6444 gcagcac tgg ggccagatgg t aagccc t cc eg t a t eg t ag 11 a t c t acac gacggggagt 6504 caggcaac t a tggatgaacg aaa t agacag a t ege t gaga t agg tgee t c ac t ga 11 aag 6564 cat t gg t aac tgtcagacca ag 111 ac t ca t a t atac t it aga 11 ga 111 aaaact teat 6624 t 111 aa111a aaagga t c t a gg t gaaga t c c 11111 ga t a a t c t ca t gac caaaatccct 6684 taacgtgagt 11 tegt tcca c t gageg t ca gaccccg t ag aaaaga t caa agga tc 11 ct 6744 t gaga t cc 11 11111 c tgeg eg t aa t c t gc t gc 11 gcaaa caaaaaaacc accgc t acca 6804

•Ο 61 1324181

五、發明說明（） gcggtggt 11 gt t tgccgga t caagagc t a ccaac t c 111 t teegaaggt aac t ggc 11 c 6864 agcagagcgc agat accaaa t ac t g t cc 11 c t ag t g t age cgtagt tagg ccaccact tc 6924 aagaactctg t age accgcc t ac a t ac c t c gc t c t gc t aa t cc t gt t acc agtggctgct 6984 gccag t ggcg ataagtegtg tcttaccggg t tggactcaa gaegatagtt accgga t aag 7044 gcgcagcgg t eggge t gaac ggggggt t eg t gcacacagc ccagc 11 gga gcgaacgacc 7104 t acaccgaac tgagatacct acagcgtgag c t a t gagaaa gcgccacgc t tcccgaaggg 7164 agaaaggcgg acagg t a t cc ggtaagegge agggtcggaa caggagagcg caegagggag 7224 c 11 ccagggg gaaacgcc tg g t a t c 111 a t ag t cc t g t eg ggt 11 cgcca cc t c t gac 11 7284 gagcgtcgat 111 tgtgatg ctcgtcaggg gggeggagee t a t ggaaaaa cgccagcaac 7344 gcggcc 1111 t acgg 11 cc t ggee 1111 gc t ggee 1111 g c t caca t gt t c 111 cc t geg 7404 11 a t ccc c t g at tctgtgga taaccgtat t accgcct t tg agtgagctga t accgc t cgc 7464 cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagt ca gtgagegagg aageggaaga gege ccaa t a 7524 cgcaaaccgc ctctccccgc geg 11 ggccg a 11 ca 11 aa t gcagctggca egacaggt 11 7584 cccgac t gga aagcgggcag tgagcgcaac gcaat taatg tgagt taget cac t ca 11 ag 7644 gcaccccagg c 111 acact t t a t gc 11 ccg gc t eg t a t g t tgtgtggaat t g t gagegga 7704 t aacaa 111 c acacaggaaa cage t a tgac catgat tacg ccaagcgcgc aa 11 aaccc t 7764 cactaaaggg aacaaaagc t gggtaccggg ccccccctcg aggtegaegg t a t ega t a ag 7824 cttgacgtcg aattcctgca gcc <210> 24 <211> 684 <212> PRT <213> 裂壺菌 <400> 24 7847 Met Ser Ala Thr Arg Ala Ala Thr Arg Thr Ala A1a. A1 a Leu Ser Ser 1 5 10 15 m 62 1324181 五、發明說明 ( ) Ala Leu Thr Thr Pro Val Ly s Gin Gin Gin Gin Gin Gin Leu Arg Val 20 25 30 Gly Ala Ala Se r Ala Arg Leu Ala Ala Ala A] a Phe Se r Se r Gly Thr 35 40 45 Gly Gly Asp Ala Ala Ly s Ly s Ala Ala Ala Ala Arg Ala Phe Se r Thr 50 55 60 Gly A rg Gly Pro Asn Ala Thr Arg Glu Ly s Se r Se r Leu Ala Thr Val 65 70 75 80 Gin Ala Ala Thr Asp Asp Ala Arg Phe Val Gly Leu Thr Gly Ala Gin 85 90 95 lie Phe His Glu Leu Met Arg Glu Hi s Gin Val Asp Thr lie Phe Gly 100 105 110 Ty r Pro Gly Gly Ala lie Leu Pro Val Phe Asp Ala lie Phe Glu Se r 115 120 125 Asp Ala Phe Ly s Phe lie Leu Ala Arg His Glu Gin Gly Ala Gly His 130 135 140 Met Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ala Thr Gly Lys Pro Gly Val Val Leu 145 150 155 160 Val Thr Se r Gly Pro Gly Ala Thr Asn Thr lie Thr Pro lie Met Asp 165 170 175 Ala Tyr Met Asp Gly Thr Pro Leu Leu Val Phe Thr Gly Gin Val Gin 180 185 190 63 1324181

五、發明說明（）

Thr Ser Ala Val Gly Thr Asp Ala Phe Gin Glu Cys Asp lie Val Gly 195 200 205 lie Ser Arg Ala Cys Thr Lys Trp Asn Val Met Val Lys Asp Val Lys 210 215 220

Glu Leu Pro Arg Arg lie Asn Glu Ala Phe Glu lie Ala Met Ser Gly 225 230 235 240

Arg Pro Gly Pro Val Leu Val Asp Leu Pro Lys Asp Val Thr Ala Val 245 250 255

Glu Leu Lys Glu Met Pro Asp Ser Ser Pro Gin Val Ala Val Arg Gin 260 265 270

Lys Gin Lys Val Glu Leu Phe His Lys Glu Arg lie Gly Ala Pro Gly 275 280 285

Thr Ala Asp Phe Lys Leu lie Ala Glu Met lie Asn Arg Ala Glu Arg 290 295 300

Pro Val He Tyr Ala Gly Gin Gly Val Met Gin Ser Pro Leu Asn Gly 305 310 315 320

Pro Ala Val Leu Lys Glu Phe Ala Glu Lys Ala Asn lie Pro Val Thr 325 330 335

Thr Thr Met Gin Gly Leu Gly Gly Phe Asp Glu Arg Ser Pro Leu Ser 340 345 350

Leu Lys Met Leu Gly Met His Gly Ser Ala Tyr Ala Asn Tyr Ser Met 355 360 365 m 64 1324181 五、發明說明 c ) Gin Asn Ala Asp Leu lie Leu Ala Leu Gly Ala Arg Phe Asp Asp Arg 370 375 380 Val Thr Gly Arg Val Asp Ala Phe Ala Pro Glu Ala Arg Arg Ala Glu 385 390 395 400 Arg Glu Gly Arg Gly Gly Me Val His Phe Glu lie Se r Pro Ly s Asn 405 410 415 Leu His Ly s Val Val Gin Pro Thr Val Ala Val Leu Gly Asp Val Val 420 425 430 Glu Asn Leu Ala Asn Val Thr Pro His Val Gin Arg Gin Glu Arg Glu 435 440 445 Pro Trp Phe Ala Gin lie Ala Asp Trp Ly s Glu Ly s His Pro Phe Leu 450 455 460 Leu Glu Se r Val Asp Se r Asp Asp Ly s Val Leu Ly s Pro Gin Gin Val 465 470 475 480 Leu Thr Glu Leu Asn Ly s Gin lie Leu Glu lie Gin Glu Ly s Asp Ala 485 490 495 Asp Gin Glu Val Tyr lie Thr Thr Gly Val Gly Se r His Gin Met Gin 500 505 510 Ala Ala Gin Phe Leu Thr Trp Thr Ly s Pro Arg Gin Trp lie Se r Se r 515 520 525 Gly Gly Ala Gly Thr Met Gly Tyr Gly Leu Pro Se r Ala lie Gly Ala 65 1324181 五、發明說明（） 530 535 540

Lys lie Ala Lys Pro Asp Ala lie Val 丨le Asp lie Asp Gly Asp Ala 545 550 555 560

Ser Tyr Ser Met Thr Gly Met Glu Leu lie Thr Ala Ala Glu Phe Lys 565 570 575

Val Gly Val Lys lie Leu Leu Leu Gin Asn Asn Phe Gin Gly Met Val 580 585 590

Lys Asn Val Gin Asp Leu Phe Tyr Asp Lys Arg Tyr Ser Gly Thr Ala 595 600 605 $ Met Phe Asn Pro Arg Phe Asp Lys Val Ala Asp Ala Met Arg Ala Lys 610 615 620

Gly Leu Tyr Cys Ala Lys Gin Ser Glu Leu Lys Asp Lys lie Lys Glu 625 630 635 640

Phe Leu Glu Tyr Asp Glu Gly Pro Val Leu Leu Glu Val Phe Val Asp 645 650 655

Lys Asp Thr Leu Val Leu Pro Met Val Pro Ala Gly Phe Pro Leu His 660 665 670

Glu Met Val Leu Glu Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ala 675 680 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> 裂壺菌 <400> 25 18 gttgaccagt gccgttcc 66 1324181 五、 發明說明（） <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> 裂壺菌 <400> 26 cgaag t gcac gcagt tgc 18 <210> 27 <211> 31 <212> DNA <2i3> 裂壺菌 <400> 27 gcgccca t gg gaegteaggt ggcacttttc g 31 <210> 28 <211> 36 <212> DNA <213> 裂壺菌 <400> 28 gcgcccatgg ccgcggcaag cagcaga 11 a egegea 36 <210> 29 <211> 1263 <212> DNA <213> Caenorhabd i t i s e 1 egans <220> <221> CDS <222> (23). .(1228) <223> <400> 29 gcggccgcga attcagatct cc a t g g t c get cac teg teg gag gg c t c teg 52 Met Val Ala Hi s Se r Ser Glu Gly Leu Ser 1 5 10 gcc acc gcc ccg gtc acc Sgc ggc gac gtc etc gtc gac gcc ege gcc 100 Ala Thr Ala Pro Val Thr Gly Gly Asp Val Leu Val Asp Ala Arg Ala 15 20 25 teg etc gag gag aag gag gcc ccg ege gac gtc aac gcc aac acc aag 148 Se r Leu Glu Glu Ly s Glu Ala Pro Arg Asp Val Asn Ala Asn Thr Ly s 30 35 40 cag gcc acc acc gag gag ccc ege ate cag ctg ccc acc gtc gac gcc 196 Gin Ala Thr Thr Glu Glu Pro Arg lie Gin Leu Pro Thr Val Asp Ala 45 50 55 11 c ege ege gcc ate ccc gcc cac tgc t c gag ege gac etc gtc aag 244 Phe A rg Arg Ala lie Pro Ala His Cy s Phe Glu Arg Asp Leu Val Ly s 60 65 70 teg ate ege t ac etc gtc cag gac t c gcc gcc etc acc ate etc tac 292 Se r lie Arg Tyr Leu Val Gin Asp Phe Ala Ala Leu Thr lie Leu Tyr 75 80 85 90 11 c gcc etc ccc gcc t c gag tac t tc ggc etc t tc fige tac etc gtc 340 Phe Ala Leu Pro Ala Phe Glu Tyr Phe Gly Leu Phe Gly Tyr Leu Val 95 100 105 67 1324181

五、發明說明（） tgg aac ate t c atg ggc gtc t c ggc t c gee etc 11 c gtc gtc ggc 388 Trp Asn lie Phe Met Gly Val Phe Gly Phe Ala Leu Phe Val Val Gly 110 115 120 cac gac tgc etc cac gga age t c teg gac aac cag aac etc aac gac 436 His Asp Cy s Leu His Gly Se r Phe Se r Asp Asn Gin Asn Leu Asn Asp 125 130 135 11 c ate ggc cac ate gee t c teg ccc etc 11 c teg ccc t ac 11 c ccc 484 Phe lie Gly His lie Ala Phe Se r Pro Leu Phe Se r Pro Tyr Phe Pro 140 145 150 tgg cag aag teg cac aag etc cac cac gee tie acc aac cac ate gac 532 Trp Gin Ly s Se r His Ly s Leu His His Ala Phe Thr Asn His lie Asp 155 160 165 no aag gac cac ggc cac gtc tgg ate cag gac aag gac tgg gag gee atg 580 Ly s Asp His Gly His Val Trp lie Gin Asp Ly s Asp Trp Glu Ala Met 175 180 185 ccc teg tgg aag ege tgg 11 c aac ccc ate ccc 11 c teg g£C tgg etc 628 Pro Se r Trp Ly s Arg Trp Phe Asn Pro lie Pro Phe Se r Gly Trp Leu 190 195 200 aag tgg t c ccc gtc t ac acc etc t c ggc t c tgc gac ggc teg cac 676 Ly s Trp Phe Pro Val Tyr Thr Leu Phe Gly Phe Cy s Asp Gly Se r His 205 210 215 11 c tgg ccc t ac teg t eg etc t c gtc ege aac teg gac ege gtc cag 724 Phe Trp Pro Tyr Se r Se r Leu Phe Val Arg Asn Se r Asp Arg Val Gin 220 225 230 tgc gtg ate age ggc ate tgc tgc tgc gtc tgc gee t ac ate gee etc 772 Cy s Val lie Se r Gly He Cy s Cy s Cy s Val Cy s Ala Tyr lie Ala Leu 235 240 245 250 acc ate gee ggc teg t ac teg aac tgg t c tgg t ac t ac tgg gtc ccg 820 Thr lie Ala Gly Se r Tyr Se r Asn Trp Phe Trp Tyr Tyr Trp Val Pro 255 260 265 etc teg t c t c ggc etc atg etc gtc ate gtc acc t ac ctg cag cac 868 Leu Se r Phe Phe Gly Leu Met Leu Val lie Val Thr Tyr Leu Gin His IS } 68 1324181 五、發明說明 ( ) 270 275 280 g t c gac gac gtc gee gag gtc t a c gag gee gac gag tgg teg t t c gtc 916 Val Asp Asp Val Ala Glu Val Tyr Glu Ala Asp Glu Trp Se r Phe Val 285 290 295 cgc ggc cag acc cag acc ate gac cgc t ac t a c ggc etc ggc etc gac 964 Arg Gly Gin Thr Gin Thr lie Asp Arg Tyr Tyr Gly Leu Gly Leu Asp 300 305 310 acc acc a t g cac cac ate acc gac ggc cac gtg gee cac cac 11 c 11 c 1012 Thr Thr Met His His lie Thr Asp Gly His Val Ala Hi s His Phe Phe 315 320 325 330 aac aag ate ccg cac t ac cac etc ate gag gee acc gag ggc gtc aag 1060 Asn Ly s lie Pro Hi s Tyr His Leu lie Glu Ala Thr Glu Gly Val Lys 335 340 345 aag gtc etc gag ccc etc teg gac acc cag t ac ggc tac aag teg cag 1108 Ly s Val Leu Glu Pro Leu Se r Asp Thr Gin Tyr Gly Tyr Lys Se r Gin 350 355 360 g t c aac t a c gac t t c t t c gee cgc t c etc tgg t c aac tac aag etc 1156 Val Asn Tyr Asp Phe Phe Ala Arg Phe Leu Trp Phe Asn Tyr Lys Leu 365 370 375 g a c t ac etc gtg cac aag acc gee ggc ate atg cag 11 c cgc acc acc 1204 Asp Tyr Leu Val His Lys Thr Ala Gly lie Met Gin Phe Arg Thr Thr 380 385 390 etc gag gag aag gee aag gee aag t aacccgggg gtacccttaa ggcatgcgcg 1258 Leu G 1 u Glu Lys Ala Lys Ala Lys 395 400 geege 1263 <210> 30 <211> 402 <212> PRT <213> Caenorhabdi ti s e I egan s <400> 30 Met Val Ala His Se r Se r Glu Gly Leu Se r Ala Thr Ala Pro Val Thr 1 5 10 15 69 1324181

五、發明說明（）

Gly Gly Asp Val Leu Val Asp Ala Arg Ala Ser Leu Glu Glu Lys Glu 20 25 30

Ala Pro Arg Asp Val Asn Ala Asn Thr Lys Gin Ala Thr Thr Glu Glu 35 40 45

Pro Arg lie Gin Leu Pro Thr Val Asp Ala Phe Arg Arg Ala lie Pro 50 55 60

Ala His Cys Phe Glu Arg Asp Leu Val Lys Ser lie Arg Tyr Leu Val

Gin Asp Phe Ala Ala Leu Thr lie Leu Tyr Phe Ala Leu Pro Ala Phe 85 90 95

Glu Tyr Phe Gly Leu Phe Gly Tyr Leu Val Trp Asn lie Phe Met Gly 100 105 110

Val Phe Gly Phe Ala Leu Phe Val Val Gly His Asp Cys Leu His Gly 115 120 125

Ser Phe Ser Asp Asn Gin Asn Leu Asn Asp Phe lie Gly His lie Ala 130 135 140

Phe Ser Pro Leu Phe Ser Pro Tyr Phe Pro Trp Gin Lys Ser His Lys 145 150 155 160

Leu His His Ala Phe Thr Asn His lie Asp Lys Asp His Gly His Val 165 170 175

Trp lie Gin Asp Lys Asp Trp Glu Ala Met Pro Ser Trp Lys Arg Trp 180 185 190 70 1324181 五、發明說明 ( ) Phe Asn Pro lie Pro Phe Se r Gly Trp Leu Ly s Trp Phe Pro Val Tyr 195 200 205 Thr Leu Phe G1 y Phe Cy s Asp Gly Se r His Phe Trp Pro Tyr Se r Se r 210 215 220 Leu Phe Val Arg Asn Se r Asp Arg Val Gin Cys Val lie Se r Gly lie 225 230 235 240 Cy s Cy s Cy s Val Cy s Ala Tyr lie Ala Leu Thr lie Ala Gly Se r Tyr 245 250 255 Se r Asn Trp Phe Trp Tyr Tyr Trp Val Pro Leu Se r Phe Phe Gly Leu 260 265 270 Met Leu Val lie Val Thr Tyr Leu Gin His Val Asp Asp Val Ala Glu 275 280 285 Val Tyr Glu Ala Asp Glu Trp Se r Phe Val Arg Gly Gin Thr Gin Thr 290 295 300 He Asp Arg Tyr Tyr Gly Leu Gly Leu Asp Thr Thr Met His His lie 305 310 315 320 Thr Asp G1 y His Val Ala His Hi s Phe Phe Asn Ly s lie Pro His Tyr 325 330 335 His Leu lie Glu Ala Thr Glu Gly Val Ly s Ly s Val Leu Glu Pro Leu 340 345 350 Se r Asp Thr Gin Tyr Gly Tyr Ly s Se r Gin Val Asn Tyr Asp Phe Phe 355 360 365

71 1324181

五、發明說明（） Ala Arg Phe Leu Trp Phe Asn Tyr Lys Leu Asp Tyr Leu Va His Ly s 370 375 380 Thr Ala Gly lie Met Gin Phe Arg Thr Thr Leu G1u G1u Lys A1 a Lys 385 390 395 400 Ala Lys <210> 31 <21 1> 570 <212> DNA <213> Caenorhabditis elegans <400> 31 agcagcagat tgcccgaggc cggcggaagg gacgaggccc aggcggc teg tgaaagcgca 60 111 ccgaagg cgggctcggc gacgacgccg gcgcggcgac gacggccctg ccggaccggg 120 cc t gggg t gg acggcgaggc t aac t aggac t tggggaagc egage t gage gac t tgagcg 180 ggt tgaggge acgaac t g 11 taggcgcggc cgagtcgtca gagccagcc t gtggagaaag 240 aggcgccgcc gagtgcgacg gggaacgc t g cgccgacc t c gca t tgcacc gca t egeawt 300 cgcaccgcaw t cgcaccgca ccgcatcgca ccgcatcgca t cgagacccg acgcagcgag 360 acgcgacgc t gggcc 11 ccc ggcgaaaaaa agtgatctgg c 11 acaaa t c ccgagacgag 420 acagacgtcg gcagcagaaa cgaatcagtc gagcagcagc tgeageagea gcagcagcag 480 cagcagccca t cgcgagcaa gggc t cagcc agcagaacac caa t caggcc aagaa t egea 540 cggaagcaag cc 11 gaca t c ct t tgccaac 570 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> 裂壺菌 <400> 32 gacccgt ca t ctatgctg 18 <210〉 33 <21 1> 18 <212> DNA <213> 裂壺菌 <400> 33 c t caaag t ga acga tgcc 18 IS 1 72 1324181 五、發明說明（） <210> 34 <211> 4244 <212> DNA <213> 裂壺菌 <400> 34 t t t C t C t C t C t egage tg 11 gctgctgctg c t gc t gc tgc t gc 11 cc 11 g c t gg 11 c t ca 60 cgtccgt teg a t caagcgc t ege t ege t eg accgatcggt gcgtgcgtgc gtgcgtgagt 120 c t t g t t gcca ggcagccgca ggc t g t c t g t c t g 111 g t g t agt t t t accc t cgggg 11 eg 180 gggtctgcct gee t cccgc t cccgcccgcc gccgcccgta t ccaccccgc t egee t ccgc 240 cca t egggee t egee t cc t c gcgccgcacg ca t cgcgcgc atcgcatgca t ca t gc t gee 300 acgcacgggg ggacgcgcgc cccgcgtccc ccgccgccgc eg t eg t eg t c t ggega t gee 360 gtcgccgccc t cc t t cc t t c cc t egee t cc t c t t cc t ccc gagcccccc t g t c t t c c 11 c 420 gcccccgcag cggcgcgcag gaagcgagga gagcggggag gagagaagaa aagaaaagaa 480 aagaaaagaa aataacagcg ccgtctcgcg cagacgcgcg cggccgcgtg egaggeggeg 540 t ga t ggggc t tctcgtggcg egge t gegge ctggcccggc c t egee 111 g aggtgcaggc 600 111 gggagag aagagtggga egeggagaag a t aaga t gg t gccaiggcgc aggaeggaga 660 ggt tgctgaa ac 11 c 11 ega gcggcacagg ega t ggegag agaccgacag ctgccggcgc 720 ggagggga t g gatacctccc gaggctggca tggaegaget ggccgcgcgg atctggctgg 780 ccgcgcggcg gtgggtccgg aggegegagg 11 gg 1111 c t tcatacctga t acca t aegg 840 t a t t c a t t c t t c c t c t cc ag gaaggaagea ag t caca t ag agtatcacta gee t aa t ga t 900 ggactctatg 1111 agggea eg t eggagea gaaggegega gega 11 egaa tgegagegat 960 aga t acagca cagagacc t t gccggcgacg egga t gcagg cgagcacgca cgcaccgcac 1020 gcacggcagc ggtgcacgcg c t cc t eggea gatgeaeggt t c t gcgccgc gee 111 acat 1080 t t 11 t ga t t t t agg t gg t g t gee t gccac t 11 gaaca t ca t ccacaag t c aacgcagcat 1140 caagaggcaa gcaag t aca t aca t cca 11 c gaat tcaagt t caagagacg cagcaacagc 1200 cgccgc t ccg ctcaagctgc age t age t gg ctgacagggc t ege t ggc t g t ag t gga a aa 1260

73 rI324181

五、發明說明（） 11 cca 11 cac 1111 c t gca t ccgcggccag caggcccgt a egeaeg t tc t c t eg t t 1 g t t 1320 tgt tcgt teg tgcgtgcgtg cgtgcgtccc agctgcctgt c t aa t c t gcc gegega t cca 1380 acgaccc t eg gtcgtcgccg caagcgaaac ccgacgccga cc t ggc caa t gccgcaagaa 1440 t gc t aagege gcagcaa tgc tgagagtaat c 11 cagccca ccaagt cat t a t ege t gccc 1500 aag t c t cca t cgcagccaca 11 caggc 111 c t c t c t c t c t ccc t ccc tc t c 111 c t geeg 1560 ggagagaagg aaagacccgc cgccgccgcc tctgcgcctg tgacgggctg t ccg 11g t aa 1620 gccc t c 11 ag acag11 cc ta ggtgccgggc gccgccgcgc c t ccg t egea ggcacacg t a 1680 ggcggccacg gg 11 cccccc gcacct tcca c acc 11 c 11 c ccccgcagcc ggaccgcgcg 1740 ceg t c t gc 11 acgcac 11 eg cgcggccgcc gcccgcgaac ccgagcgcg t gctgtgggcg 1800 c c g t c t t c eg gccgcgtcgg agg t eg t ccc cgcgccgcgc t ac t ccggg t cctgtgcggt 1860 a eg t ac 11 a a t a 11 aacag t gggacc t ege acaggacctg acggcagcac agacg t egee 1920 gee t egea t c gc tggggacg caggcgaggc a t cccggcgc ggccccgcac cggggaggct 1980 gcggggcggc c t c 11 c egge cggcggccgc a t caggcgga tgacgcaaga gccc t egeag 2040 t ege t ege t c gegggagege agcgcggcgc cagcgtggcc aage t cccgc c c c 11 c t ggc 2100 t ggc t gca t g cctgcctgcc t gee t gee t g cgtgcgtgcg tgcgtgcgtg cc 11 eg t geg 2160 t gcc t gcc 11 cgtgcgtgcg tgcgtgagtg eggeggaaga ggga t ca tgc gagga t caa t 2220 cacccgccgc acc t egae t t 11 gaagaage egegatgega tgega tgega tgegatgega 2280 egega t accg t gegagge t a egaagegag t c tggccggcc g t c a t ac aac gcacgt 11 tc 2340 gagaaggagg gc tggeggag gcgtgcatgc cggcgacca i tgcgaacgcg gegtetegtg 2400 gc tggegaag gtgcctggag ga t c t aaega t ege t gc t a t ga t gc t a t ag ctgtgctgat 2460 ccccggtcca 11 ccaccacg tctgtgcctg ccgcctgacc tgege t tgge 111 cc t t caa 2520 IS 1 74 1324181 五、發明說明（） g11 c tCCtCC gccgggcc t t caggaccgae acgagacctg cage tgeage t agac t egeg 2580 c t cgc tcgcg gagga t tege cggccgccgg geeggaeggg ac t egegagg tcacacggcc 2640 gccggcga t c gcgatggctg tgctgacgta ctcgtgcgtg gcagccgtac gtcagcgacg 2700 ccgcc t ccg t at tgtggat t cgt tagt tgg t tgt tggt tg at t tgt tgat taat 111111 2760 gt tcgtaggc t tggt tatag ctaatagt 11 ag 111 a t ac t ggtgctcttc ggtgctgatt 2820 t age t egae t t ggg t ccaca ccac t gcccc t c t ac t g t ga atggatcaat ggacgcacga 2880 cgggccgacg aaag t gegeg agtgaggtaa cctaagcaac ggeggt c 11 c agaggggacg 2940 cacgccc t cc gtcgcagtca gt ccagacag gcagaaaagc g t c 11 aggga ccacgcacgc 3000 aege acgcac gcacgcacgc ccgcacgcac gc t ccc t ccc tcgcgtgcct a 1111111 ag 3060 gc 11 cc 11 cc gcacgggcc t acctctcgct ccctcgcctc gccgcaccag geggeageag 3120 cgatacctgc eggt gccgcc t ccg t cacgc gc t cagccgc age t cagccc agccgcgagc 3180 t aggg 111 g t t eg t c c t ga a 11 g 111 ga t t t ga 111 ga 11 t ga 111 ga t c ega t ccga t c 3240 ega t c t ga t c t ga t t t gc t t tgc 11 tgc t t tgtctccctc ccggcgcgga ccaagcg t cc 3300 g t c t gegege egeage 11 cc ct tet tctcc cagccc t cct t c t gc t cccg cc t c t egege 3360 aagcacgcag c t tcgccgcc gca t ccgg t c gg t egg t egg t ega t cgacc egee tgeege 3420 tgctgctgtg geeggget 11 t c t cca t egg egae t c 111 c 11 c t cc a t ac g t c c t ac t ac 3480 g t aca t aca t ac tgeegge t t cc t cc t c 11 ccagcgcggc gaeggeggea ggc tgcgacg 3540 t eg t cgccgc cgcgggcgcc gcgcgcgccg ccgccgccgc ccgcgt egea gggee t eg t c 3600 gccgccgccg ctccgctccg c t ccgaggcc gegagaggge cgcggcggcg cgatggatgg 3660 atggatggat ggatggatgg atgga 111 tg t tgatcgatg gcggcgcatg ggeggaga tg 3720 agegaggaeg agegegegag cgcggcagcc gga 11 egeag ggcctcgctc gee t cgcgcc 3780 cgc t gcegeg cccgccttgc gagee t gege egegagegag egagegageg agcggggc 11 3840

75 1324181

五、發明說明（） tct t tgtctc gcgcgccgc t tggcctcgtg tgtet tgtgc t tgcg t ageg ggcgccgcgg 3900 t ggaaga t gg c t ca 11 caa t cgaccca 11 c acgcacgcac tccggcgcgc agagaaggee 3960 gaggaggagc agcaagcaaa ccaaaagc t c t egege t ege ggtctcgggc tcgagcggtc 4020 t cggagagag ag t c 11 gegg cgaccaccgg cagcagcagc ageageagea gcgctgtcga 4080 gcacgagcac gageaegage aegageaega gca 11 egage aagaggacag a c a egg t t g t 4140 cagcgcc t ag c t ege t ega t acagaaagag gcgggt tggg cgt aaaaaaa aaggagcacg 4200 caagccgcca gccagccagc tagctagcca gcctgcctgc caaa 4244 <210> 35 <211> 4244 <212> DNA <213> 裂壺菌 <4O0> 35 111 c t c t c t c t egage t g 11 gctgctgctg c t gc t gc t gc t gc t t c c 11 g c t gg 11 c t ca 60 eg t c eg t teg a t caagege t ege t ege t eg accga t egg t geg t geg tgc gtgcgtgagt 120 c 11 g 11 gee a ggcagccgca ggc t g t c tg t ctgt t tgtgt agt 11 taccc tcggggt teg 180 ggg t c t gee t gee t cccgc t cccgcccgcc gccgcccg t a tccaccccgc t egee t ccgc 240 cca t egggee t ege c t cc t c gcgccgcacg ca t cgcgcgc a t egea t gca t ca t gc t gee 300 acgcacgggg ggacgcgcgc cccgcgtccc ccgccgccgc eg t eg tcgt c tggega t gee 360 g t cgccgccc t cc t t cc 11 c cctcgcctcc t c 11 cc t ccc gagcccccct gtet tcct tc 420 gcccccgcag cggcgcgcag gaagcgagga gagcggggag gagagaagaa aagaaaagaa 480 aagaaaagaa aa t aacagcg ccgtctcgcg cagacgcgcg cggccgcgtg egaggeggeg 540 t ga t ggggc t tctcgtggcg egge t gegge c t ggcccggc ctcgcct t tg aggt gcaggc 600 111gggagag aagagtggga egeggagaag a t aaga t gg t gcca tggege aggaeggaga 660 gg 11 gc t ga a a c 11 c t t eg a gcggcacagg ega t ggegag agaccgacag c t gc eggege 720 ggaggggatg gatacctccc gagge tggea tggaegage t ggccgcgcgg atctggctgg 780 IS 1 76 1324181 五、發明說明（） ccgcgcggcg gtgggtccgg aggegegagg 11 gg 1111 c t t ca t ac c t ga t acca t aegg 840 t a 11 c a 11 c t t cc t c t ccag gaaggaagea ag t c ac a t ag ag t a t cac t a gc c t a a t ga t 900 ggac t c t a t g t 111 agggea eg t eggagea gaaggegega gega t t egaa t gegagega t 960 aga t acagca cagagacc t t gccggcgacg eggatgeagg cgagcacgca cgcaccgcac 1020 gcacggcagc ggtgcacgcg electeggea ga t gcaegg t t c t gcgccgc gc c 111 a c a t 1080 1111 t ga t 11 taggtggtgt gcctgccact 11 gaaca t ca tccacaagtc aacgcagcat 1140 caagaggcaa gcaagtacat a c a t c c a t t c gaa 11 c aag t t caagagacg cagcaacagc 1200 cgccgc t ccg c t caagc t gc age t age t gg ctgacagggc tcgctggctg tagtggaaaa 1260 11 cca 11 cac 1111 c t gc a t ccgcggccag caggcccg t a egeaeg 11 c t c t eg 111 g 11 1320 tgt tcgt teg tgcgtgcgtg cgtgcgtccc age tgee tgt c t aa t c t gcc gegega t cca 1380 acgaccc t eg gtcgtcgccg caagcgaaac ccgacgccga cctggccaat gccgcaagaa 1440 t gc t aagege gcagcaatgc t gagag t aa t c 11 cagccca ccaag t ca 11 atcgctgccc 1500 aag t c t cca t cgcagccaca 11 caggc t 11 c t c t c t c t c t ccc t ccc t c t ct t tctgccg 1560 ggagagaagg aaagacccgc cgccgccgcc t c t gegee t g tgacgggctg teegt tgtaa 1620 gccc t c 11 ag acagt tecta ggtgccgggc gccgccgcgc ctccgtcgca ggcacacgta 1680 ggcggccacg ggttcccccc gcacc 11 cca cacc 11 c 11 c ccccgcagcc ggaccgcgcg 1740 ccgtctgct t acgcac 11 eg cgcggccgcc gcccgcgaac ccgagcgcgt gctgtgggcg 1800 ccg t c 11 ccg gccgcgtcgg aggtcgtccc cgcgccgcgc tactccgggt cctgtgcggt 1860 aeg t ac 11 aa t a 11 aacag t gggacctcgc acaggacc t g acggcagcac agaegt egee 1920 gee t egea t c gc tggggacg caggcgaggc a t cccggcgc ggccccgcac cggggaggct 1980 gcggggcggc c t c 11 ccggc cggcggccgc atcaggcgga tgacgcaaga gccc t egeag 2040 t ege t ege t c gegggagege agcgcggcgc cagcgtggcc aagctcccgc ccc 11 c t ggc 2100

77 1324181

五、發明說明（） t ggc t gca t g cctgcctgcc tgee tgee tg eg t geg t geg tgcgtgcgtg cct tcgtgcg 2160 t gc c t gc c 11 eg t geg t geg tgcgtgagtg eggeggaaga ggga t ca tgc gagga t caa t 2220 cacccgccgc acc t egae 11 t tgaagaage cgcga t gega tgegatgega tgegatgega 2280 cgcga t accg t gegagge t a egaagegagt c t ggceggec g t ca t a caac gc a c g t t t t c 2340 gagaaggagg gc tggeggag gcgtgcatgc cggcgacca t tgcgaacgcg gegtetegtg 2400 gctggcgaag gtgcctggag ga t c t aaega t cgc t gc t a t gatget atag c t g t gc t ga t 2460 ccccggtcca ttccaccacg tctgtgcctg ccgcctgacc tgege t tgge t t t cc 11 caa 2520 g 11 c t cc t cc gccgggcc 11 caggaccgag acgagacctg cagctgcagc t agac t cgcg 2580 c t cgc t cgcg gagga 11 cgc cggccgccgg geeggaeggg ac t egegagg tcacacggcc 2640 gccggcga t c gega t ggc t g t gc t gacg t a ctcgtgcgtg gcagccgtac gtcagcgacg 2700 ccgcc t ceg t at tgtggat t cgt tagt tgg t tgt tggt tg a 111 g 11 ga t t aa t 11 11 11 2760 g 11 eg t agge 11 gg t t a t ag c t aa t ag t t t ag t 11 a t ac t gg t gc t c 11 c gg t gc t ga t t 2820 t age t egae t t ggg t ccaca ccac tgcccc t c t ac t g t ga a t gga t caa t ggacgcacga 2880 cgggccgacg aaagtgcgcg agtgaggtaa cc t aagcaac ggegg t c 11 c agaggggacg 2940 cacgccctcc g t cgc ag t c a gt ccagacag gcagaaaagc g t c t t aggga ccacgcacgc 3000 acgcacgcac gcacgcacgc ccgcacgcac gc t ccc t ccc t cgcg t gee t a 11 t 11 t t ag 3060 gc 11 c c t t cc gcacgggcc t acc t c t cgc t ccctcgcctc gccgcaccag geggeageag 3120 ega t acc t gc cggtgccgcc tccgtcacgc gc t cagccgc age t cagccc agccgcgagc 3180 t aggg 111 gt t eg t cc t gaa 11 g 111 ga 11 t ga 111 ga t t tgat t tgatc ega t ccga t c 3240 ega t c t ga t c t ga 111 gc t t tget t tget t t g t c t ccc t c ccggcgcgga ccaagcgtcc 3300 gtctgcgcgc egeage 11 c c c 11 c 11 c t cc cagccc tee t t c t gc t cccg cc t c t egege 3360 78 五、發明說明（） aagcacgcag c 11 cgccgcc gca t ccgg t c ggtcggtcgg tcgatcgacc egee tgeege 3420 tgctgctgtg geeggge t t t t c t cca t egg egac t c 111 c t t c t c c a t ac g t cc t ac t ac 3480 g t aca t aca t actgccggct t cc t cc t c t t ccagcgcggc gaeggeggea ggc t gegaeg 3540 t eg t cgccgc cgcgggcgcc gcgcgcgccg ccgccgccgc ccgcgt egea gggeet eg t c 3600 gccgccgccg ctccgctccg c t cegaggee gegagaggge cgcggcggcg cgatggatgg 3660 atggatggat ggatggatgg atggat 11 tg 11 ga t ega t g gcggcgcatg ggeggaga tg 3720 agegaggaeg agegegegag cgcggcagcc gga 11 egeag ggcctcgctc gee t cgcgcc 3780 ege t geegeg cccgcc 11 gc gagee t gege egegagegag egagegageg agcggggc 11 3840 t c 111 g t c t c gcgcgccgc t t ggee t eg t g t g t c 11 g t gc t tgcgt ageg ggcgccgcgg 3900 t ggaaga t gg c t ca 11 caa t cgacccat tc acgcacgcac t ccggcgcgc agagaaggee 3960 gaggaggage agcaagcaaa ccaaaagc t c t egege t ege ggtctcgggc tcgagcggtc 4020 t eggagagag agtet tgegg cgaccaccgg cagcagcagc ageageagea gcgctgtcga 4080 gcacgagcac gageaegage aegageaega gcat tegage aagaggacag acacggt tgt 4140 cagcgcc t ag c t ege t ega t acagaaagag gcgggt tggg cgtaaaaaaa aaggagcacg 4200 caagccgcca gccagccagc tagctagcca gcctgcctgc c a a a 4244 176 79

Claims (1)

1. 第91 107634號專利申請案申請專利範圍修正本 修正日期：98年9月 1 · 一種分離的核酸分子，其包含一核酸序列，其中該核酸 序列選自於由下列所組成之群： a. —種核酸序列，其編碼一種具有選自於由下列所組成 之群的胺基酸序列之蛋白質：序列辨識編號：15、序 列辨識編號：19、序列辨識編號：22及序列辨識編號： 24,其中該蛋白質為一種乙醯乳酸合成酶； b. —種核酸序列，其編碼一種具有與（a)之胺基酸序列 至少約95%相同性的胺基酸序列之蛋白質，其中該蛋 白質為一種乙醯乳酸合成酶；以及 c _ —種核酸序列’其可與該（a)或（b)的核酸序列完全互 補。 2. 如申請專利範圍第1項之分離的核酸分子，其中該核酸 序列編碼一種具有胺基酸序列不同於序列辨識編號：；! 5 的蛋白質，其可藉由在選自於由下列所組成之群的胺基 酸位置處刪除、嵌入或取代一胺基酸：116G、117A、 192P、200A、251K、358M、383D、592V、595W及 599F。 3. 如申請專利範圍第1項之分離的核酸分子，其中該核酸 序列編碼一種具有選自於由下列所組成之群的胺基酸 序列之蛋白質：序列辨識編號：15、序列辨識編號：19、 序列辨識編號：22及序列辨識編號：24,其中該蛋白質 為一種乙醯乳酸合成酶。 4. 如申請專利範圍第1項之分離的核酸分子，其中該核酸 1324181

   序列選自於由下列所組成之群·序列辨識編號：14之核 苗酸1260-3314、序列辨識编號：18之核苷酸 1260-3314、序列辨識編號：21之核苷酸1260-3314及序 列辨識編號：23之核苷酸1260-3314。 5. 如申請專利範圍第1項之分離的核酸分子，其中該蛋白 質（a)或（b)的表現賦予一被該核酸分子所轉形的破囊壺 菌目微生物對選自於由下列所組成之群的化合物具有 減低的敏感度：磺醯脲化合物類、咪唑啉酮種類抑制劑 及氧基苯曱酸癌唆酯類。 6. 如申請專利範圍第5項之分離的核酸分子，其中該核酸 序列編碼一種具有選自於由下列列所組成之群的胺基 酸序之蛋白質：序列辨識編號：丨9、序列辨識編號：22 及序列辨識編號：24。 7. 如申請專利範圍第5項之分離的核酸分子，其中該核酸 序列選自於由下列所組成之群：序列辨識編號：14之核 每酸1260-3314、序列辨識編號：18之核苷酸 1260-3314、序列辨識編號·· 21之核苷酸1260-3314及序 列辨識編號：23之核苷酸1260-3314。 8. 如申請專利範圍第1項之分離的核酸分子，其中該核酸 序列係編碼一裂壺菌屬乙醯乳酸合成酶。 9. 如申請專利範圍第8項之分離的核酸分子，其中該裂壺 菌屬乙醯乳酸合成酶的表現賦予一被該核酸分子所轉 形的破囊壺菌目微生物對選自於由下列所組成之群的 化合物具減低的敏感度：續醯腺化合物類、_ 0坐琳嗣種 類抑制劑及氧基笨曱酸嘴咬酯類。 10. —種重組型核酸分子，其包含申請專利範圍第1項之分 離的核酸分子’該核酸分子被可操作地連結至一轉錄控 制序列。 11. 一種破囊壺菌目的重組型微生物，其被申請專利範圍第 10項之重組型核酸分子轉形。 12. —種供破囊壺菌目微生物轉形用之重組型載體，其包含 一編碼乙醯乳酸合成酶之核酸序列，該合成酶可授予破 囊壺菌目微生物對選自於由下列所組成之群的化合物 具有減低的敏感度：磺醯脲化合物類、咪唑啉酮種類抑 制劑及氧基笨甲酸嘧啶酯類，其中該乙醯乳酸合成酶具 有選自於由下列所組成之群的胺基酸序列： a. —胺基酸序列，其選自於由下列所組成之群：序列辨 識編號：19、序列辨識編號：22及序列辨識編號：24 ; 以及 b. —胺基酸序列，其與（a)之胺基酸序列具有至少約95% 之相同性； 其中該編碼乙醯乳酸合成酶的核酸序列被操作地連結 至一轉錄控制序列。 如申請專利範圍第12項之重組型載體，其中該重組型載 體為一種表現載體。 如申請專利範圍第12項之重組型載體，其中該重組型載 體為一種致標載體。 M·如申請專利範圍第12項之重組型載體，其中該核酸序列 1324181

   編碼一種具有胺基酸序列與序列辨識編號：15不同的蛋 白質，其可藉由在選自於由下列所組成之群的胺基酸位 置處刪除、嵌入或取代一胺基酸：116G、ii7A、192P、 200A、251K、358M、383D、592V、595W及 599F。 16.如申請專利範圍第12項之重組型載體，其中該乙酿乳酸 合成酶具有一種選自於由下列所組成之群的胺基酸序 列：序列辨識編號：19、序列辨識編號：22及序列辨識 編號：24。 17·如申請專利範圍第12項之重組型載體，其中該核酸序列 選自於由下列所組成之群：序列辨識編號：18之核苷酸 1260-3314 '序列辨識編號：21之核苷酸1260-33 14及序 列辨識編號：23之核苷酸1260-3314。 18. 如申請專利範圍第12項之重組型載體，其中該轉錄控制 序列選自於由下列所組成之群：破囊壺菌目α-微管蛋白 啟動子、破囊壺菌目乙醯乳酸合成酶啟動子、從破囊壺 菌目聚乙醯合成酶（PKS)系統來之啟動子及破囊壺菌目 脂肪酸去飽和酶啟動子。 19. 如申請專利範圍第12項之重組型載體，其中該載體包含 一選自於由下列所組成之群的核酸序列：序列辨識編 號：18、序列辨識編號：21及序列辨識編號：23。 20. —種破囊壺菌目微生物細胞轉形用之方法，該方法包 括： a.將一包含編碼乙醯乳酸合成酶的核酸序列之重組型 核酸分子引進破囊壺菌目微生物細胞，該合成酶可授 IS 1 -4 .

   予該細胞對選自於由下列所組成之群的化合物具有 減低的敏感度：磺醯脲化合物類、咪唑啉酮種類抑制 劑及氧基笨甲酸嘧啶酯類，其中該乙醯乳酸合成崎具 有選自於由下列所組成之群胺基酸序列： i· 一種胺基酸序列，其選自於由下列所組成之群：序 列辨識編號：19、序列辨識編號：22及序列辨識編 號：24 ;以及 ii.一種胺基酸序列，其與（i)之胺基酸序列具有至少約 95%相同性；以及 b.選擇已成功地以該重組型核酸分子轉形的細胞，其藉 由將3玄（a)的細胞培養在包含至少一種會抑制未轉形 的細胞之化合物的培養基中，該化合物選自於由下列 所組成之群：績酿服化合物、咪啥嚇鋼種類抑制劑及 氧基苯曱酸嘧啶酯類》 21. 如申請專利範圍第2〇項之方法，其中該核酸序列編碼一 種具有胺基酸序列與序列辨識編號：15不同的蛋白質， 其可藉由在選自於由下列所組成之群的胺基酸位置處 刪除' 嵌入或取代一胺基酸：116G、117A、192P、200A、 251K、358M、383D、592V、595W及 599F。 22. 如申請專利範圍第20項之方法，其中該乙醯乳酸合成酶 具有選自於由下列所組成之群的胺基酸序列：序列辨識 編號：19、序列辨識編號：22及序列辨識編號：24。 23. 如申請專利範圍第20項之方法，其中該核酸序列選自於 由下列所組成之群：序列辨識編號：18之核苷酸 1260-3314、序列辨識編號：21之核苷酸1260-33 14及序 列辨識編號：23之核苷酸1260-3314。 24·如申請專利範圍第2〇項之方法，其中該核酸序列操作地 連結至一選自於由下列所組成之群的轉錄控制序列：破 囊壺菌目α-微管蛋白啟動子、破囊壺菌目乙醯乳酸合成 酶啟動子、從破囊壺菌目聚乙醯合成酶（PKS)系統來之 啟動子及破囊壺菌目脂肪酸去飽和酶啟動子。 25.如申請專利範圍第2〇項之方法，其中該重組型核酸分子 進一步包含一編碼欲由該細胞製造的蛋白質之核酸序 列’其中該編碼該蛋白質的核酸序列被可操作地連結至 一轉錄控制序列。 26·如申请專利範圍第25項之方法，其中該蛋白質與選自於 由下列所組成之群的脂肪酸之合成有關：廿二碳六稀酸 (DHA)、廿二碳五烯酸(DPA)、廿十碳五烯酸(EpA)及花 生四烯酸（ARA)。 27. 如申請專利範圍第乃項之方法，其中該蛋白質選自於由 下列所組成之群：脂肪酸合成酶、脂肪酸去飽和酶、脂 肪酸鏈加長酶、與聚乙醯合成酶複合體有關的蛋白質及 與將脂肪酸類併入磷脂類或甘油三酯分子有關的蛋白 質。 28. 如申請專利範圍第25項之方法，其中該蛋白質為—種0 -3月g肪醆去飽和酶，而可由核酸序列序列辨識編號：μ 所編碼。 29. 如申請專利範圍第25項之方法，其中該蛋白質為—多烯 1324181 脂肪酸異構酶。 30. 如申請專利範圍25項之方法，其中該蛋白質選自於由下 列所組成之群：HMG-CoA合成酶、HMG-CoA還原酶、 鯊稀合成酶、八氫番茄紅素合成酶、八氫.茄紅素去飽 和酶、類胡蘿蔔素環化酵素、類胡蘿蔔素羥化酶、類胡 蘿蔔素酮酶、維他命E及硫辛酸。 31. 如申請專利範圍第20項之方法，其進一步包含下列步 驟：將至少一包含編碼欲表現的蛋白質之核酸序列的其 它重組型核酸分子引進該細胞，該核酸序列被可操作地 連結至一轉錄控制序列。 32. 如申請專利範圍第20項之方法，其進一步包含下列步 驟：將一包含編碼博菜黴素-結合蛋白質的核酸序列之 重組型核酸分子引進該細胞。 33. 如申請專利範圍第32項之方法，其中該重組型核酸分子 包含一為序列辨識編號：9之核酸序列。 34. 如申請專利範圍第20項之方法，其中該微生物為選自於 由下列所組成之屬：破囊壺菌屬、類 網菌屬（上、日本壺菌屬 反裂壺菌屬（Schizochytrium)。 35. 如申請專利範圍第20項之方法，其中該微生物為選自於 由下列所組成之物種：裂壺菌（Sc/^zoc/z少的‘wm叹.）、叢 狀裂壺菌aggrega/wm)、軟體裂壺菌 (Schizochytrium limacinum)、小裂壺菌（*Sc/n.zoc/i少iWwm minutum)、破囊壺菌（Thrausiochytrium sp.)、故狀破囊

   壺菌（Thrausiochytrium striatum^ ' -S· js. -t- 汽a硬曩亞菌 (Thraustochytrium {Thraustochytrium sp·)。 謂）、粉红破囊壺菌 r〇5e⑽〇及日本壺菌（j^〇w〇c/^Wmw 36.如申請專利範圍第20項之方法，其中該引進步驟可利用 選自於由下列所組成之方法來進行：粒子義擊、電穿孔 法、顯微注射法、微脂粒感染、吸附、感染及原生質體 融合。 37.種破囊$菌目重組型微生物，其被包含編碼乙酿乳酸 合成酶的核酸序列之重組型核酸分子所轉形，該合成酶 可授予該微生物對選自於由下列所組成之群的化合物 具有減低的敏感度：續醯服化合物類、咪唾琳嗣種類抑 制劑及氧基苯曱酸嘧啶酯類，其中該乙醯乳酸合成酶具 有選自於由下列所組成之群的胺基酸序列： a·—胺基酸序列，其選自於由下列所組成之群：序列辨 識編號：19、序列辨識編號：22及序列辨識編號：24 ; 以及 b. —胺基酸序列’其與（a)之胺基酸序列具有至少約95% 之相同性。 38·如申請專利範圍第37項之重組型微生物，其中該乙醯乳 酸合成酶具有選自於由下列所組成之群的胺基酸序 列：序列辨識編號：19、序列辨識編號：22及序列辨識 編號：24。 39.如申請專利範圍第37項之重組型微生物，其中該核酸序 1324181 列選自於由下列所組成之群：序列辨識編號：丨8之核穿 酸1260-3314 '序列辨識編號：21之核苷酸1260-3314及 序列辨識編號：23之核苷酸1260-33 14。 40·如申請專利範圍第37項之重組型微生物，其中該重組型 核酸分子包含一選自於由下列所組成之群的核酸序 列：序列辨識編號：18、序列辨識編號：21及序列辨識 編號：23。

   41. 如申請專利範圍第37項之重組型微生物，其中該編碼乙 醯乳酸合成酶的核酸序列被可操作地連結至一能在破 囊壺菌目微生物中作用之啟動子。

   42. 如申請專利範圍第37項之重組型微生物，其中該編碼乙 醯乳酸合成酶的核酸序列操作地連結至一選自於由下 列所組成之群的轉錄控制序列：破囊壺菌目心微管蛋白 啟動子、破囊壺菌目乙醯乳酸合成酶啟動子、從破囊壺 菌目聚乙醯合成酶（PKS)系統來之啟動子及破囊壺菌目 脂肪酸去飽和酶啟動子。 43 ·如申請專利範圍第3 7項之重組型微生物，其中該重組型 核酸分子進一步包含一種編碼由該微生物製造的第一 蛋白質之核酸序列，其中該編碼該第一蛋白質的核酸序 列被可操作地連結至一轉錄控制序列。 44. 如申請專利範圍第37項之重組型微生物，其中該重組細 胞進一步以包含編碼博菜黴素-結合蛋白質的核酸序列 之重組型核酸分子轉形。 45. 如申請專利範圍第44項之重組型微生物其中該重組型

   -9 核酸分子包含一為序列辨識編號：9之核酸序列。 46. 如申請專利範圍第44項之重組型微生物，其中該包含編 碼博菜黴素-結合蛋白質的核酸序列之重組型核酸分子 進一步包含一種編碼由該細胞製造的第二蛋白質之核 酸序列’其中該編碼該第二蛋白質的核酸序列被可操作 地連結至一轉錄控制序列。 47. 如申請專利範圍第37項之重組型微生物，其進一步包含 至少一包含編碼有由該細胞製造的蛋白質之額外核酸 序列的重組型核酸分子。 48. —種分離的核酸分子，其包含一種選自於由下列所組成 之群的核酸序列： a. —序列辨識編號：9之核苷酸441-894 ;及 b. —種分離的多核苷酸，其包含一種與該（a)的多核笞酸 完全互補之核酸序列。 49. 如申請專利範圍第48項之分離的核酸分子，其中該分離 的核酸分子包含一種選自於由下列所組成之群的核酸 序列：序列辨識編號：4及序列辨識編號：9之核苷酸 441-894 °