KR101420991B1 - 테르펜 합성효소 변이체들을 개발하는 방법들 - Google Patents

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Abstract

본 개시는 조작된 숙주 세포들을 통해 테르펜 합성효소 변이체들을 개발하는 방법들에 관한 것이다. 상세하게, 본 개시는 테르펜 산물들의 상업적인 생산에 유용한 개선된 생체내 성능을 가진 테르펜 합성효소 변이체들을 개발하는 방법들을 제공한다. 또한 본 개시에는 우월한 테르펜 합성효소 변이체들 및 이러한 테르펜 합성효소 변이체들을 포함하는 숙주 세포들이 포함된다.

Description

테르펜 합성효소 변이체들을 개발하는 방법들 {Methods of developing terpene synthase variants}
본 발명은 조작된 숙주 세포들을 통하여 테르펜 합성효소 변이체들을 개발하는 방법들에 관한 것이다. 상세하게, 본 발명은 테르펜 산물들의 상업적인 생산에 유용한 개선된 생체내 성능을 가진 테르펜 합성효소 변이체들을 개발하는 방법들을 제공한다. 또한 본 발명에는 우월한 테르펜 합성효소 변이체들 및 이러한 테르펜 합성효소 변이체들을 포함하는 숙주 세포들이 포함된다.
테르펜들 (terpenes)은 많은 생물들에서 생산되는 탄화수소들의 대분류의 하나이다. 그들은 이소프렌 (C5H8)의 연결 단위들에 의해 유래되고, 존재하는 이소프렌 단위들의 수에 의해 분류된다. 헤미테르펜들 (hemiterpenes)은 단일한 이소프렌 단위로 구성된다. 이소프렌 자체는 헤미테르펜으로만 고려된다. 모노테르펜들은 두 개의 이소프렌 단위들로 만들어지고, 분자식 C10H16을 가진다. 모노테르펜들의 예들로는 게라니올 (geraniol), 리모넨 (limonene), 및 테르피네올 (terpineol)이 있다. 세스퀴테르펜들 (sesquiterpenes)은 세 개의 이소프렌 단위들로 구성되고, 분자식 C15H24을 가진다. 세스퀴테르펜들의 예들로는 파네센 (farnesenes), 파네솔 (farnesol) 및 패추롤 (patchoulol)이 있다. 디테르펜들은 네 개의 이소프렌 단위들로 구성되고, 분자식 C20H32를 가진다. 디테르펜들의 예들로는 카페스톨 (cafestol), 카후올 (kahweol), 켐브렌 (cembrene), 및 택사디엔 (taxadiene)이 있다. 세스터테르펜들 (sesterterpenes)은 다섯 개의 이소프렌 단위들로 구성되고, 분자식 C25H40을 가진다. 세스터테르펜들의 예로는 게라닐파네솔 (geranylfarnesol)이 있다. 트리테르펜들은 여섯 개의 이소프렌 단위들로 구성되고, 분자식 C30H48을 가진다. 테트라테르펜들은 여덟 개의 이소프렌 단위들로 구성되고, 분자식 C40H64를 가진다. 생물학적으로 중요한 테트라테르펜들로는 비고리 라이코펜 (lycopene), 단일고리 감마-카로틴 (gamma-carotene), 및 이중고리 알파- 및 베타-카로틴들을 포함한다. 폴리테르펜들은 많은 이소프렌 단위들의 긴 사슬들로 구성된다. 천연 고무는 이중 결합이 시스 (cis)인 폴리이소프렌으로 구성된다.
테르펜들은 화학적으로 변형될 때 (예로, 산화 또는 탄소 골격의 재배열을 통해), 그 결과 얻은 화합물들은 이소프레노이드류 (isoprenoids)라고도 알려져 있는 테르페노이드류 (terpenoids)라고 일반적으로 말한다. 이소프레노이드들은, 예를 들면 전자 전달 회로들에서 퀴논들 (quinones)로서, 세포하 표적화 및 단백질 프레닐화를 통한 조절에서 막들의 구성성분들로서, 카로티노이드류, 클로로필을 포함하는 광합성 색소들로서, 호르몬들 및 조효소들로서, 또한 다양한 모노테르펜들, 세스퀴테르펜들, 및 디테르펜들을 가진 식물 방어 화합물들로서, 많은 중요한 생물학적 역할들을 한다. 그들은 항생제들, 호르몬들, 항암 약물들, 살충제들, 및 화학물질들로서 산업적으로 유용하다.
테르펜들은 이소펜테닐 피로포스페이트 (이소펜테닐 디포스페이트 또는 IPP) 및 그의 이성질체 디메틸알릴 피로포스페이트 (디메틸알릴 디포스페이트 또는 DMAPP)의 응축들을 통하여 생합성된다. 두 개의 경로들이 IPP 및 DMAPP를 생성하는 것으로 알려져 있고, 즉 진핵생물들의 메발로네이트-의존성 (MEV) 경로, 및 원핵생물들의 메발로네이트-비의존성 데옥시자일루오스-5-포스페이트 (DXP) 경로이다. 식물들은 MEV 경로 및 DXP 경로 둘 다를 사용한다. 다음 순서로 IPP 및 DMAPP가 프레닐 디스포스페이트 합성효소들 (예로, 각각 GPP 합성효소, FPP 합성효소, 및 GGPP 합성효소)의 작용을 통하여 폴리프레닐 디포스페이트들 (예로, 게라닐 디스포스페이트 또는 GPP, 파네실 디포스페이트 또는 FPP, 또한 게라닐게라닐 디포스페이트 또는 GGPP)로 응축된다.
폴리프레닐 디포스페이트 중간물들은 테르펜 합성효소들에 의해 더 복잡한 이소프레노이드 구조들로 전환된다. 테르펜 합성효소들은 복수의 산물들을 형성하는 큰 유전자 패밀리들로 조직화된다. 테르펜 합성효소들의 예들로는 FPP를 세스퀴테르펜들로 전환하는 세스퀴테르펜 합성효소들을 포함한다. 세스퀴테르펜 합성효소의 예로는 FPP를 파네센으로 전환하는 파네센 합성효소를 포함한다. 테르펜 합성효소들의 반응 기작은 광범위하게 연구되어 왔고 잘 이해되어 있다. 전반적으로, 세 개의 단계들이 FPP와 같은 디포스페이트 기질을 그의 이소프레노이드 산물로 전환하는 데 요구된다: a) 효소-기질 복합체 (ES)의 형성, b) 효소-결합 반응성 탄화수소 중간물의 형성, 이어지는 재배열들, 및 산물 (EP)의 형성, 또한 c) 효소-산물 복합체로부터 산물의 방출. 테르펜 합성효소 촉매화된 반응들에 관한 시험관내 역학적 및 전-안정기 역학적 연구들은 반응들을 위한 전반적인 속도-결정 단계가 산물의 방출인 점을 보여주었다 (Cane et al . (1997) Biochemistry , 36(27):8332-9, 및 Mathis et al . (1997) Biochemistry 36(27):8340-8). 테르펜 합성효소들의 회전율들은 낮고, 일반적으로 초당 0.5 이하로 측정된다 (Cane, D. C. (1990) Chem . Rev . 90:1089-1103).
테르펜 합성효소들은 이소프레노이드로의 유동 경로의 조절에서 그들이 대사적 분지 지점들을 작동시키고 종종 프레닐 디포스페이트 풀을 위한 다른 대사적 효소들과 경쟁하기 때문에 중요하다. 예를 들면, FPP는 스쿠알렌 (squalene), 돌리콜들 (dolichols), 및 보조인자 헴을 포함하는 많은 세포성 분자들로 가는 전구체이다. 파네센과 같은 세스퀴테르펜들의 생산이 기대되는 조작된 미생물들에서 테르펜 합성효소들은 이러한 테르펜들의 높은 생산 수율로의 핵심이 된다. 그러나, 그들이 느린 효소들이기 때문에, 테르펜 합성효소들은 종종 대사적 경로들에서 병목 현상을 일으킨다. 또한, 그들은 조작된 미생물 숙주들에서 테르펜들의 효율적인 생산을 위해 요구되는 역학적 능력을 제한하는 기질 저해와 같은 기타 단점들로 겪을 수 있다 (Crock et al . (1997) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 94:12833-12838).
따라서, 테르펜 합성효소들의 촉매적 효율을 이들 효소들이 전반적인 이소프레노이드로의 대사적 흐름을 더 이상 제한하지 않도록 개선하는 것은 잠재적으로 엄청난 유익들이 존재한다. 변경된 산물 특이도를 위해 테르펜 합성효소들을 조작하는 시도들뿐만 아니라 구조적 유도 (guidance) 또는 적응적 진화를 기초로 하는 시도들과 같은 합리적인 접근법들의 사용이 이전에 기술되어 왔다 (Greenhagen et al . (2006) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 103:9826-9831; O'Maille et al . (2008) Nat . Chem . Biol . 4:617-623; Yoshikuni et al . (2006) Nature 440:1078-1082; Yoshikuni et al . (2008) Chem . Biol . 15:607-618). 그러나, 이들 연구들은 테르펜 합성효소들의 산물 특이도도 유지하면서 그들의 역학적 용량을 개선하는 데는 부족하였다. 또한, 유도된 (directed) 진화와 같은 통상적인 단백질 조작 전략들의 적용이, 일차적으로 사용가능하고 효과적인 고처리량 검색 방법들 (high throughput screening method)의 결여 때문에 테르펜 합성효소들을 위해서는 전혀 없었다 (Yoshikuni et al . (2008) (supra)). 따라서 테르펜 합성효소들의 촉매적 효율을 개선하는 신뢰가능하고 고처리량 방법들을 위한, 또한 이러한 개선된 촉매적 효율을 가지는 테르펜 합성효소 변이체들을 위한 필요성이 여전히 존재한다.
본 발명은 조작된 숙주 세포들을 통하여 테르펜 합성효소 변이체들을 개발하는 방법들에 관한 것이다. 상세하게, 본 발명은 개선된 생체내 성능을 가진 테르펜 합성효소 변이체들을 개발하는 방법들을 제공한다. 본 방법들은 이들 효소들의 생체내 성능의 계속된 개선도 역시 허용한다.
한 가지 관점에서, 본 발명은
(a) 대조군 세스퀴테르펜 합성효소를 발현하는 숙주세포를 올라간 수준의 FPP를 포함하도록 조작하고, 상기 올라간 수준의 FPP는 상기 숙주세포의 생존도를 올라간 수준의 FPP를 포함하지 않는 부모 세포와 대비하여 감소시키고;
(b) 상기 숙주세포에서는 상기 대조군 세스퀴테르펜 합성효소 대신에 상기 테스트 세스퀴테르펜 합성효소를 발현시키고, 상기 테스트 세스퀴테르펜 합성효소는 상기 대조군 세스퀴테르펜 합성효소의 변이체이고: 또한
(c) 상기 대조군 세스퀴테르펜 합성효소를 발현하는 상기 숙주세포와 대비하여 상기 테스트 세스퀴테르펜 합성효소를 발현하는 숙주세포의 생존도에서 증가에 의해, 상기 대조군 세스퀴테르펜 합성효소와 대비하여 상기 테스트 세스퀴테르펜 합성효소를 개선된 생체내 성능을 가지는 것으로서 확인하는:
단계들을 포함하는, 개선된 생체내 성능을 가진 세스퀴테르펜 합성효소 변이체의 검색 방법을 제공한다.
일정 구현예들에서, 숙주세포는 한천 배지 상에 도말되고, 개선된 생체내 성능을 가지는 테스트 테르펜 합성효소 변이체를 포함하는 숙주세포는 콜로니 성장에 의해 확인된다. 일정 구현예들에서, 본 방법은 또한 개선된 생체내 성능을 가지는 세스퀴테르펜 합성효소를 선택하고 및/또는 분리하는 것을 포함한다.
일정 구현예들에서, 세스퀴테르펜 합성효소 변이체들의 집합 (collection)은 숙주세포들의 집합에서 발현된다. 일정 구현예들에서, 세스퀴테르펜 합성효소 변이체들의 집합은 2개로부터 5개까지, 5개로부터 10개까지, 10개로부터 50개까지, 50개로부터 100개까지, 100개로부터 500개까지, 500개로부터 1,000개까지, 1,000개로부터 10,000개까지, 10,000개로부터 100,000개까지, 및 100,000개로부터 1,000,000개까지 이상의 세스퀴테르펜 합성효소 변이체들을 포함한다.
일정 구현예들에서, 본 검색 방법은 반복적인 방식으로 사용되고, 반복으로 확인되는 테스트 세스퀴테르펜 합성효소는 다음 번 반복의 대조군 세스퀴테르펜 합성효소로서 사용되고, 반복에서의 숙주세포는 올라간 수준의 FPP를 포함하여 올라간 수준의 FPP를 포함하지 않는 부모 세포들과 대비하여 이전의 반복에서 확인된 테스트 세스퀴테르펜 합성효소의 존재 시 감소된 생존도를 가진다.
또 다른 관점에서, 본 명세서에서는
(a) 첫 번째 소집단 (subpopulation)은 대조군 세스퀴테르펜 합성효소를 포함하고, 올라간 수준의 FPP는 상기 첫 번째 소집단의 세포들의 생존도를 올라간 수준의 FPP를 포함하지 않는 부모 세포의 생존도와 대비하여 감소시키고; 또한
(b) 두 번째 소집단은 테스트 세스퀴테르펜 합성효소를 포함하고, 상기 테스트 세스퀴테르펜 합성효소는 상기 대조군 세스퀴테르펜 합성효소의 변이체인:
올라간 수준의 FPP를 포함하는 숙주 세포들의 공통적인 집단으로부터 유래된 두 개 세포 소집단들을 포함하는 조성물이 제공된다.
일정 구현예들에서, 두 번째 소집단의 세포들의 생존도는 첫 번째 소집단의 세포들의 생존도보다 크다.
또 다른 관점에서, 본 발명은
(a) 대조군 테르펜 합성효소를 발현하고 성장률을 가지는 숙주 세포를 제공하고;
(b) 상기 숙주세포에서 대조군 테르펜 합성효소 대신에 테스트 테르펜 합성효소를 발현시키고, 상기 테스트 테르펜 합성효소는 상기 대조군 테르펜 합성효소의 변이체이고; 또한
(d) 상기 대조군 세스퀴테르펜 합성효소를 발현하는 상기 숙주세포와 대비하여 상기 테스트 세스퀴테르펜 합성효소를 발현하는 숙주세포의 감소된 성장률에 의해, 상기 대조군 세스퀴테르펜 합성효소와 대비하여 상기 테스트 세스퀴테르펜 합성효소를 개선된 생체내 성능을 가지는 것으로서 확인하는:
단계들을 포함하는, 개선된 생체내 성능을 가지는 테르펜 합성효소 변이체들을 확인하는 두 번째 검색 방법을 제공한다.
보다 또 다른 관점에서, 본 발명은
(a) 숙주 세포들의 집단을 대조군 집단 및 테스트 집단으로 분할하고;
(b) 상기 대조군 집단에서 대조군 테르펜 합성효소 및 비교군 테르펜 합성효소를 발현시키고, 상기 대조군 테르펜 합성효소는 폴리프레닐 디포스페이트를 첫 번째 테르펜으로 전환할 수 있고, 상기 비교군 테르펜 합성효소는 상기 폴리프레닐 디포스페이트를 두 번째 테르펜으로 전환할 수 있고;
(c) 상기 테스트 집단에서 비교군 테르펜 합성효소 및 상기 테스트 테르펜 합성효소를 발현시키고, 상기 테스트 테르펜 합성효소는 상기 대조군 테르펜 합성효소의 변이체이고, 상기 비교군 테르펜 합성효소는 상기 테스트 집단에서 및 상기 대조군 집단에서 유사한 수준들로 발현되고; 또한
(d) 상기 테스트 집단 및 상기 대조군 집단 둘 다에서 상기 두 번째 테르펜 대비 상기 첫 번째 테르펜의 비율을 측정하는:
단계들을 포함하는, 테르펜 합성효소 변이체들의 개선된 생체내 성능을 확인하고 및/또는 순위 매기는 경쟁 방법을 제공한다.
별도의 구현예들에서, 본 경쟁 방법은 모노테르펜 합성효소들, 디테르펜 합성효소들, 세스퀴테르펜 합성효소들, 세스터테르펜 합성효소들, 트리테르펜 합성효소들, 테트라테르펜 합성효소들, 및 폴리테르펜 합성효소들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 테르펜 합성효소를 확인하고 및/또는 순위 매기는 데 적용된다.
일정 구현예들에서, 본 경쟁 방법은 대조군 테르펜 합성효소와 대비하여, 개선된 생체내 성능을 가지는 테르펜 합성효소 변이체가 폴리프레닐 디포스페이트로부터 그의 테르펜 산물까지 더 많은 유동 (flux)을 전환시킬 수 있어, 관심있는 테르펜/비교군 테르펜 (예로, 첫 번째 테르펜/두 번째 테르펜)의 더 높은 비율을 주는 점을 기초로 하여 돌연변이 테르펜 합성효소들의 라이브러리를 검색하는 데 사용된다. 이러한 구현예들에서, 테스트 테르펜 합성효소가 대조군 테르펜 합성효소가 대조군 집단에서 발현되는 것과 유사한 수준으로 테스트 집단에서 발현되는 점은 중요하다.
다른 구현예들에서, 본 경쟁 방법은 원하는 강도의 프로모터를 확인하는 데 사용된다. 이러한 구현예들에서, 대조군 테르펜 합성효소 및 테스트 테르펜 합성효소는 일치하고, 대조군 집단 및 테스트 집단은 대조군 테르펜 합성효소의 발현 수준에서 서로 다르다.
또 다른 관점에서, 본 명세서에서는
(a) 첫 번째 소집단은 대조군 테르펜 합성효소 및 비교군 테르펜 합성효소를 포함하고, 상기 대조군 테르펜 합성효소는 폴리프레닐 디포스페이트를 첫 번째 테르펜으로 전환하고, 상기 비교군 세스퀴테르펜 합성효소는 상기 폴리프레닐 디포스페이트를 두 번째 테르펜으로 전환할 수 있고; 또한
(b) 두 번째 소집단은 테스트 테르펜 합성효소 및 비교군 테르펜 합성효소를 포함하고, 상기 대조군 테르펜 합성효소는 폴리프레닐 디포스페이트를 첫 번째 테르펜으로 전환하고, 상기 테스트 테르펜 합성효소는 상기 대조군 테르펜 합성효소의 변이체인:
숙주 세포들의 공통적인 집단으로부터 유래한 두 개 세포 소집단들을 포함하는 조성물이 제공된다.
일정 구현예들에서, 두 번째 테르펜 대비 첫 번째 테르펜의 비율은 상기 첫 번째 소집단에서의 비율과 대비하여 상기 두 번째 집단에서 더 크다.
보다 또 다른 관점에서, 본 명세서에서는 서열번호 111에 주어진 바와 같은 아미노산 서열을 가지지만 서열번호 111의 2, 3, 4, 6, 9, 11, 18, 20, 24, 35, 38, 50, 61, 72, 80, 89, 105, 115, 144, 196, 211, 251, 280, 288, 319, 348, 357, 359, 369, 371, 385, 398, 423, 433, 434, 442, 444, 446, 460, 467, 488, 495, 505, 526, 531, 556, 572, 및 575번 위치들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 위치들에서 하나 이상의 아미노산 치환들을 포함하는, 분리된 β-파네센 합성효소 변이체들, 또한 이러한 β-파네센 합성효소 변이체들을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산들이 제공된다.
보다 또 다른 관점에서, 본 발명은
(a) 서열번호 111에 의해 인코드되는 β-파네센 합성효소의 변이체인 이종유래 β-파네센 합성효소; 및
(b) MEV 경로 또는 DXP 경로 효소:를 포함하고;
상기 숙주세포는 MEV 경로 또는 DXP 경로 효소 및 서열번호 111에 의해 인코드되는 β-파네센 합성효소를 포함하는 부모 세포와 대비하여 적어도 15% 이상의 β-파네센을 만드는, 유전적으로 변형된 숙주세포를 제공한다.
보다 또 다른 관점에서, 본 명세서에서는
(a) (i) 서열번호 111에 의해 인코드되는 β-파네센 합성효소의 변이체를 인코딩하는 첫 번째 이종유래 뉴클레오타이드 서열; 및 (ii) MEV 경로 또는 DXP 경로 효소를 인코딩하는 두 번째 이종유래 뉴클레오타이드 서열:을 포함하는 유전적으로 변형된 다수의 숙주 세포들을 획득하고;
(b) 상기 유전적으로 변형된 숙주 세포들을 β-파네센을 만드는 데 적합한 조건들 하에서 탄소원을 포함하는 배지로 배양하고; 또한
(c) 상기 배지로부터 β-파네센을 회수하는:
단계들을 포함하는 β-파네센을 생산하는 방법이 제공된다.
본 발명은 바람직한 구현예들을 도시하도록 제공된 첨부된 도면들과 연결하여 설명될 때 가장 잘 이해된다. 그러나 본 발명은 도면들에 기재된 특정한 구현예들에 제한되지 않는 것으로 이해된다.
도 1A 내지 Z는 본 발명의 숙주 세포들의 생성에 사용된 여러 염색체 통합 제작물들의 지도들을 나타낸 것이다.
도 2는 FPP 기아-기초 선별을 위해 활성 및 비활성 세스퀴테르펜 합성효소들을 포함하는 대장균 (Escherichia coli) 숙주 세포들이 도말된 여러 개의 한천 배지들의 영상을 나타낸 것이다.
도 3은 FPP 독성-기초 성장 선별을 위해 활성 및 비활성 세스퀴테르펜 합성효소들을 포함하는 대장균 숙주 세포들이 도말된 두 개의 한천 배지들의 영상을 나타낸 것이다.
도 4는 다양한 파네센 합성효소 코딩 서열들을 포함하는 대장균 숙주 세포들의 GC 분석에 의해 획득된 파네센 역가들을 나타낸 것이다.
도 5는 FPP-독성-기초 성장 선별을 위해 활성 및 비활성 세스퀴테르펜 합성효소들을 포함하는 사카로마이세스 세레비시애 숙주 세포들이 도말된 두 개의 한천 배지들의 영상을 나타낸 것이다.
도 6은 염색체로 통합 또는 염색체외 유지되는 파네센 합성효소 코딩 서열들을 포함하는 사카로마이세스 세레비시애 숙주 세포들의 나일 레드 형광 분석에 의해 획득된 파네센 역가들을 나타낸 것이다.
도 7은 세스퀴테르펜 합성효소 경쟁에 의해 순위가 매겨진 사카로마이세스 세레비시애 숙주 세포들의 GC 분석에 의해 획득된 파네센 역가들을 나타낸 것이다.
도 8은 파네센 합성효소 코딩 서열들의 증가하는 사본수들을 포함하는 사카로마이세스 세레비시애 숙주 세포들의 GC 분석에 의해 획득된 파네센/트리코디엔 역가 비율들을 나타낸 것이다.
도 9는 세스퀴테르펜 합성효소 라이브러리의 대장균 숙주 세포들의 GC 분석 대비 나일 레드 형광 분석에 의해 획득된 파네센 역가들의 비교를 나타낸 것이다.
도 10은 나일 레드 형광에 의해 검색된 FS 변이체들의 라이브러리로부터 확인된 대장균 숙주 세포주들의 GC 분석에 의해 획득된 파네센 역가들을 나타낸 것이다.
도 11은 FPP 독성-기초 성장 선별에 의해 검색된 FS 변이체들의 라이브러리로부터 확인된 사카로마이세스 세레비시애 숙주 세포주들의 나일 레드 형광 (A) 및 GC 분석 (B)에 의해 획득된 파네센 역가들을 나타낸 것이다.
도 12는 FPP 독성-기초 성장 선별에 의한 FS 변이체들의 라이브러리로부터 확인된 사카로마이세스 세레비시애 숙주 세포주들의 나일 레드 형광 분석에 의해 획득된 파네센 역가들을 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 숙주 세포들의 생성에 사용되는 다양한 발현 플라스미드들의 지도들을 나타낸 것이다.
도 14는 FS 변이체 코딩 서열들의 단일한 염색체로 통합된 사본들을 포함하는 사카로마이세스 세레비시애 숙주 세포주들의 GC 분석에 의해 획득된 파네센 역가들을 나타낸 것이다.
도 15는 IPP 및 DMAPP의 생산을 위한 MEV 경로의 모식적 재연을 나타낸 것이다.
도 16은 IPP 및 DMAPP의 생산을 위한 DXP 경로의 모식적 재연을 나타낸 것이다.
도 17은 아모파디엔 합성효소 변이체들의 코딩 서열들을 포함하는 사카로마 이세스 세레비시애 숙주 세포들의 GC 분석에 의해 획득된 아모파디엔/트리코디엔 역가 비율들을 나타낸 것이다.
도 18은 리모넨 합성효소 변이체들의 코딩 서열들을 포함하는 사카로마이세스 세레비시애 숙주 세포들의 GC 분석에 의해 획득된 리모넨/마이어센 역가 비율들을 나타낸 것이다.
정의들
본 명세서에서 사용된 다음의 용어들은 하기에 지시된 바와 같은 의미들을 가진다.
본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "테르펜 합성효소 변이체 (terpene synthase variant)"는 선택된 테르펜 합성효소와 대비하여 다른 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열을 가지는 테르펜 합성효소를 말한다. 예를 들면, 선택된 테르펜 합성효소의 야생형 서열과 대비하여, 테르펜 합성효소 변이체는 해당하는 아미노산 서열에 변화들을 유도하거나 유도하지 않을 수 있는 뉴클레오타이드 첨가들, 결실들, 및/또는 치환들을 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드 변화들이 아미노산 서열에 변화들을 유도하지 않는 일정 구현예들에서, 본 변화들은 그럼에도 불구하고, 예를 들면 코돈 최적화를 통해 합성효소의 개선된 활성에 효과를 줄 수 있다. 다른 구현예들에서, 테르펜 합성효소 변이체는 아미노산 첨가들, 결실들, 및/또는 치환들을 포함한다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "세스퀴테르펜 합성효소 변이체 (sesquiterpene synthase variant)"는 선택된 세스퀴테르펜 합성효소와 대비하여 다른 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열을 가지는 세스퀴테르펜 합성효소를 말한다. 예를 들면, 선택된 세스퀴테르펜 합성효소와 대비하여, 세스퀴테르펜 합성효소 변이체는 해당하는 아미노산 서열에 변화들을 유도하거나 유도하지 않을 수 있는 뉴클레오타이드 첨가들, 결실들, 및/또는 치환들을 포함할 수 있다. 다른 구현예들에서, 테르펜 합성효소 변이체는 아미노산 첨가들, 결실들 및/또는 치환들을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "조작된 숙주세포 (engineered host cell)"는 유전공학적 기법들 (예로, 재조합 기술학)을 사용하여 부모 세포를 유전적으로 변형하여 생성되는 숙주세포를 말한다. 조작된 숙주세포는 부모 세포의 게놈에 뉴클레오타이드 서열들의 첨가들, 결실들 및/또는 치환들을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "이종유래 (heterologous)"는 정상적으로 자연에서는 발견되지 못하는 것을 말한다. 용어 "이종유래 뉴클레오타이드 서열"은 정상적으로 자연에서의 주어진 세포에서는 발견되지 못하는 뉴클레오타이드 서열을 말한다. 이와 같이, 이종유래 뉴클레오타이드 서열은: (a) 그의 숙주세포에 대해 외래성 (예로, 세포에 대해 "외인성 (exogenous)")이거나; (b) 숙주세포에서 자연적으로 발견되지만 (예로, "내인성 (endogenous)") 세포에서 비천연의 양으로 존재하거나 (예로, 숙주세포에서 자연적으로 발견되는 것보다 적거나 많음); (c) 숙주세포에서 자연적으로 발견되지만 그의 원래 좌위의 외부에 위치될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "자연적으로 생기는 (naturally occurring)"은 천연에서 발견되는 것을 말한다. 예를 들면, 자연에 있는 출처로부터 분리될 수 있고 연구실에서 인간에 의해 의도적으로 변형되지 않았던 테르펜 합성효소는 자연적으로 생기는 테르펜 합성효소이다. 반대로, 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "자연적으로 생기지 않는 (naturally not occurring)"은 자연에서 발견되지 않지만 인간 개입에 의해 제조될 수 있는 것을 말한다.
본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "생합성적 효소 (biosynthetic enzyme)"는 자연적으로 생기는 분자의 생산을 유도하는 생합성 경로에서 기능하는 효소를 말한다.
본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "생체내 성능 (in vivo performance)"은 숙주세포에서 발현될 때 폴리프레닐 디포스페이트 기질을 테르펜으로 전환하는 테르펜 합성효소의 능력을 말한다. 따라서, 용어 "개선된 생체내 성능 (improved in vivo performance)"은 숙주세포에서 발현될 때 폴리프레닐 디포스페이트 기질을 테르펜으로 전환하는 테르펜 합성효소의 증가된 능력을 말한다.
본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "부모 세포 (parent cell)"는 올라간 세포내 수준의 FPP를 포함하지 않거나 특정한 이종유래 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않는 점을 제외하고, 본 명세서에서 기재된 숙주세포와 일치하는 유전적 배경을 가지고, 상기 올라간 세포내 수준의 FPP 또는 본 명세서에서 기재된 숙주세포의 생성을 유도하는 상기 이종유래 뉴클레오타이드 서열을 도입하는 시작점으로서 작용하는 세포를 말한다.
일반적인 개괄
본 발명은 조작된 숙주 세포들을 통하여 테르펜 합성효소 변이체들을 개발하는 방법들에 관한 것이다. 상세하게, 본 발명은 개선된 생체내 성능을 가진 테르펜 합성효소 변이체들을 개발하는 방법들을 제공한다. 본 방법들은 이들 효소들의 생체내 성능의 계속된 개선도 역시 허용한다.
한 가지 관점에서, 본 발명은 개선된 생체내 성능을 가진 테르펜 합성효소 변이체들의 검색 방법을 제공한다. 일정 구현예들에서, 개선된 생체내 성능을 가진 테르펜 합성효소 변이체들은 조작된 숙주 세포들을 세포 사망으로부터 구출하는 그들의 능력에 의해 확인된다. 조작된 숙주 세포들은 올가간 세포내 수준들의 FPP를 초래하는 유전적 변형들을 포함한다. FPP는 세포들에 대해 독성이 높아서 세포 생존도 (viability)를 감소시키기 때문에 (Withers et al . (2007) Appl . Environ. Microbiol . 73:6277-6283), 올라간 수준의 세포내 FPP를 포함하지 않는 부모 세포의 생존도와 비교가능한 생존도를 달성하기 위하여 조작된 숙주세포들은 FPP의 세포내 수준들을 감소시키도록 충분하게 활성을 가진 세스퀴테르펜 합성효소를 요구한다.
따라서 다음의 단계들을 포함하는 검색 방법이 현재 제공된다:
(a) 대조군 세스퀴테르펜 합성효소를 발현하는 숙주세포를 올라간 수준의 FPP를 포함하도록 조작하고, 상기 올라간 수준의 FPP는 상기 숙주세포의 생존도를 올라간 수준의 FPP를 포함하지 않는 부모 세포와 대비하여 감소시키고;
(b) 상기 숙주세포에서 상기 대조군 세스퀴테르펜 합성효소 대신에 상기 테스트 세스퀴테르펜 합성효소를 발현시키고, 상기 테스트 세스퀴테르펜 합성효소는 상기 대조군 세스퀴테르펜 합성효소의 변이체이고: 또한
(c) 상기 대조군 세스퀴테르펜 합성효소를 발현하는 상기 숙주세포와 대비하여 상기 테스트 세스퀴테르펜 합성효소를 발현하는 숙주세포의 생존도에서 증가에 의해, 상기 대조군 세스퀴테르펜 합성효소와 대비하여 상기 테스트 세스퀴테르펜 합성효소를 개선된 생체내 성능을 가지는 것으로서 확인한다.
일정 구현예들에서, 본 방법은 또한 개선된 생체내 성능을 가지는 상기 테스트 세스퀴테르펜 합성효소를 선별하고 및/또는 분리하는 단계를 포함한다.
숙주세포에서 올라간 수준의 FPP가 유도가능한 경우라면 가장 편리하다. 유도는 유도제 또는, 예를 들면 온도와 같은 특이적 성장 조건들에 반응하여 일어날 수 있다. 숙주세포에서 올라간 수준의 FPP는 약 10%로부터 적어도 1,000배 이상, 부모 세포의 FPP 보다 높은 수준까지의 범위일 수 있다.
부모 세포와 대비하여 대조군 세스퀴테르펜 합성효소를 발현하는 숙주세포의 감소된 생존도는 감소된 세포 성장으로부터 치사까지의 범위일 수 있다. 따라서, 일정 구현예들에서, 대조군 세스퀴테르펜 합성효소를 발현하는 숙주세포는 부모 세포와 대비하여 액체 배양에서 또는 한천 배지 상에서 감소된 수의 자손 세포들을 생산한다. 다른 구현예들에서, 대조군 세스퀴테르펜 합성효소를 발현하는 숙주세포는 부모 세포와 대비하여 액체 배양에서 또는 한천 배지 상에서 자손 세포들을 전혀 생산하지 않는다. 따라서, 대조군 세스퀴테르펜 합성효소 대신에 테스트 세스퀴테르펜 합성효소를 발현하는 숙주세포의 생존도에서 증가는, 대조군 세스퀴테르펜 합성효소를 발현하는 숙주세포에 의해 생산된 자손 세포들의 수 또는 콜로니 크기와 대비하여 액체 배양에서 자손 세포들의 더 많은 수에 의해, 또는 한천 배지 상에서 더 큰 콜로니 크기에 의해 분명해질 수 있다.
숙주세포에서 올라간 수준의 FPP는 숙주세포에서 FPP 또는 그의 전구체들의 생산에 관여하는 효소의 발현 및/또는 활성을 변형하여 효과를 줄 수 있다. 일정 이러한 구현예들에서, MEV 또는 DXP 경로의 효소의 발현 및/또는 활성은 변형된다. 일정 이러한 구현예들에서, HMG-CoA 환원효소 및/또는 메발로네이트 키나제의 발현 및/또는 활성은 변형된다. 임의적으로, 숙주세포에서 올라간 수준의 FPP는 숙주세포에서 FPP 또는 그의 전구체들의 생산에 관여하는 효소의 발현 및/또는 활성을 변형하여 효과를 낼 수 있다. 일정 이러한 구현예들에서, 스쿠알렌 합성효소의 발현 및/또는 활성은 변형된다.
대조군 세스퀴테르펜 합성효소는 자연적으로 생기는 세스퀴테르펜 합성효소 또는 자연적으로 생기지 않는 세스퀴테르펜 합성효소일 수 있다. 테스트 세스퀴테르펜 합성효소는 하나 이상의 아미노산 치환들, 결실들 및/또는 첨가들을 포함하는 것에 의해 대조군 세스퀴테르펜 합성효소와 서로 달라질 수 있다. 추가적으로 또는 임의적으로, 테스트 세스퀴테르펜 합성효소는 대조군 세스퀴테르펜 합성효소와 일치하는 아미노산들을 포함할 수 있지만 이들 아미노산들을 인코딩하는 코돈들은 테스트 세스퀴테르펜 합성효소 및 대조군 세스퀴테르펜 합성효소 간에 서로 달라질 수 있다. 일정 이러한 구현예들에서, 코돈들은 숙주세포에서 사용도를 위해 최적화된다.
일정 구현예들에서, 대조군 세스퀴테르펜 합성효소는 β-파네센 합성효소, α-파네센 합성효소, 트리코디엔 합성효소 (trichodiene synthase), 패추롤 합성효소 (patchoulol synthase), 아모파디엔 합성효소 (amorphadiene synthase), 발렌센 합성효소 (valencene synthase), 파네솔 합성효소 (farnesol synthase), 네로리돌 합성효소 (nerolidol synthase), 및 누트카톤 합성효소 (nootkatone synthase)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일정 이러한 구현예들에서, 대조군 세스퀴테르펜 합성효소는 아르테미시아 애누아 (Artemisia annua)의 β-파네센 합성효소이다. 일정 이러한 구현예들에서, 대조군 세스퀴테르펜 합성효소는 서열번호 111의 아미노산 서열을 가진다.
테스트 세스퀴테르펜 합성효소의 존재 시 숙주세포의 생존도를 대조군 세스퀴테르펜 합성효소의 존재 시 숙주세포의 생존도와 비교할 수 있기 위하여, 숙주세포에서 대조군 세스퀴테르펜 합성효소 및 테스트 세스퀴테르펜 합성효소의 유사한 발현 수준들을 입증하는 것이 필요하다. 이것은 두 개 숙주 세포들에 있는 세스퀴테르펜 합성효소들을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열들을 동일한 조절 요소들의 조절 하에 두어서 달성될 수 있다.
개선된 세스퀴테르펜 합성효소 변이체라기 보다는 성장 촉진 돌연변이를 포함하는 신속하게 성장하는 위양성 숙주 세포들이 숙주세포 배양을 점령하는 경쟁적 성장 환경을 방지하기 위하여, 검색 방법의 한 가지 구현예는 아가-플레이트 기초 선별 시스템이 관여한다. 본 구현예에서, 숙주세포는 한천 배지 상에 도말되고, 개선된 생체내 성능을 가지는 테스트 세스퀴테르펜 합성효소 변이체를 포함하는 숙주세포는 콜로니 성장에 의해 확인된다.
현재까지 기재된 검색 방법의 한 가지 주요한 장점은 반복적 방식으로 좀 더 나은 세스퀴테르펜 합성효소 변이체들을 선택하는 그의 계속된 능력 (capacity)이고, 반복으로 확인된 테스트 세스퀴테르펜 합성효소는 연속적 반복으로 대조군 세스퀴테르펜 합성효소로서 사용된다. 따라서, 본 방법은 특정한 세스퀴테르펜 합성효소가 생합성 경로에서 활성을 가질 수 있는지 여부를 확인하도록 목표로 하고, 대조군 예로 부모 합성효소 대비 개선된 활성을 가지는 합성효소들을 확인하도록 추구하지 않는 당해 기술분야에 알려져 있는 다른 검정법들과는 구별될 수 있다. 일정 구현예들에서, 숙주세포에서 FPP 수준은 검토되고, 각 반복에서 숙주세포가 새로운 세스퀴테르펜 합성효소 (예로, 이전의 반복의 테스트 세스퀴테르펜 합성효소)를 발현할 때 감소된 생존도를 초래하는 수준으로 (예로, 효소들의 발현 수준들을 증가시키거나 감소시키는 것, 효소들을 첨가하거나 차감하는 것, 유전자들의 사본수들을 증가시키거나 감소시키는 것, 효소들의 발현을 조절하는 프로모터들을 대체하는 것, 또는 유전적 돌연변이에 의해 효소들을 변경하는 것에 의해) 잠재적으로 감소된다. 임의적으로, 또는 추가적으로, 각 반복에서 대조군 세스퀴테르펜 합성효소의 발현은 감소된 대조군 세스퀴테르펜 합성효소 활성을 제공하도록 (예로, 대조군 세스퀴테르펜 합성효소 전사체 또는 폴리펩타이드의 발현을 감소시키는 것, 더 약한 프로모터들을 사용하는 것, 또는 이의 안정도를 감소시키는 것에 의해) 감소될 수 있다. 다음 번 반복에서, 이전의 반복의 테스트 세스퀴테르펜 합성효소와 대비하여 여전히 증가된 생체내 성능을 가지는 테스트 세스퀴테르펜 합성효소가 다음으로 확인될 수 있다.
현재까지 기재된 검색 방법의 또 다른 주요한 장점은 고처리량 시행을 위한 그의 단순성 및 용량이다. 조작된 숙주세포에서 세포내 FPP 수준들을 비독성 수준들로 감소시킬 수 있는 세스퀴테르펜 합성효소 변이체들은 세포 생존도를 기초로 하여 확인되고, 기타 비용과 시간을 소비하는 검색 방법들을 실질적으로 불필요하게 만든다. 따라서, 한 가지 구현예에서, 본 방법은 개선된 생체내 성능을 가지는 세스퀴테르펜 합성효소 변이체들을 위한 세스퀴테르펜 합성효소 변이체들의 집합 (예로, 돌연변이 세스퀴테르펜 합성효소들의 라이브러리)을 검색하는 데 사용된다. 이러한 구현예에서, 단일하지 않은 테스트 세스퀴테르펜 합성효소가 숙주세포에서 발현되지만 테스트 세스퀴테르펜 합성효소들의 집합은 숙주 세포들의 집합에서 발현된다. 다음으로 숙주 세포들은 한천 배지들 상에서 성장될 수 있고, 개선된 생체내 성능을 가지는 세스퀴테르펜 합성효소 변이체들을 발현하는 숙주 세포들은 콜로니 성장을 기초로 하여 확인될 수 있다. 일정 구현예들에서, 세스퀴테르펜 합성효소 변이체들은 2개로부터 5개까지, 5개로부터 10개까지, 10개로부터 50개까지, 50개로부터 100개까지, 100개로부터 500개까지, 500개로부터 1,000개까지, 1,000개로부터 10,000개까지, 10,000개로부터 100,000개까지, 및 100,000개로부터 1,000,000개까지 이상의 세스퀴테르펜 합성효소 변이체들을 포함한다.
현재까지 기재된 검색 방법의 또 다른 주요한 장점은 개선된 세스퀴테르펜 합성효소들을 위한 선택이 시험관내라기 보다는 생체내에서 일어나는 것이다. 그 결과로, 세스퀴테르펜 합성효소 변이체의 생체내 성능을 증진하는 복수의 효소 성질들의 개선들이 획득될 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 개선된 생체내 성능을 가지는 테르펜 합성효소 변이체들을 확인하는 두 번째 검색 방법을 제공한다. 두 번째의 검색 방법에서, 개선된 생체내 성능을 가지는 테르펜 합성효소는 숙주 세포들을 폴리프레닐 디포스페이트 (예로, FPP)의 기아로 만드는 그들의 능력에 의해 확인된다. 높은 활성을 가진 테르펜 합성효소 변이체의 존재 시, 숙주세포에서 그의 폴리프레닐 디포스페이트 기질의 세포내 풀은 고갈될 수 있고, 세포가 세포 생존을 위해 요구되는 기본 세포성 과정들을 유지할 수 없도록 초래한다.
따라서 현재 다음의 단계들을 포함하는 두 번째의 검색 방법이 제공된다:
(a) 대조군 테르펜 합성효소를 발현하고 성장률을 가지는 숙주 세포를 제공하고;
(b) 상기 숙주세포에서 대조군 테르펜 합성효소 대신에 테스트 테르펜 합성효소를 발현시키고, 상기 테스트 테르펜 합성효소는 상기 대조군 테르펜 합성효소의 변이체이고; 또한
(d) 상기 대조군 세스퀴테르펜 합성효소를 발현하는 상기 숙주세포와 대비하여 상기 테스트 세스퀴테르펜 합성효소를 발현하는 숙주세포의 감소된 성장률에 의해, 상기 대조군 세스퀴테르펜 합성효소와 대비하여 상기 테스트 세스퀴테르펜 합성효소를 개선된 생체내 성능을 가지는 것으로서 확인한다.
대조군 테르펜 합성효소는 모노테르펜 합성효소, 세스퀴테르펜 합성효소, 디테르펜 합성효소, 세스터테르펜 합성효소, 트리테르펜 합성효소, 테트라테르펜 합성효소, 또는 폴리테르펜 합성효소일 수 있다. 일정 구현예들에서, 대조군 테르펜 합성효소는 세스퀴테르펜 합성효소이다. 일정 이러한 구현예들에서, 대조군 테르펜 합성효소는 β-파네센 합성효소이다. 일정 이러한 구현예들에서, 대조군 테르펜 합성효소는 아르테미시아 애누아 (Artemisia annua)의 β-파네센 합성효소이다. 일정 이러한 구현예들에서, 대조군 세스퀴테르펜 합성효소는 서열번호 111로 주어진 바와 같은 아미노산 서열을 가진다.
테스트 테르펜 합성효소의 존재 시 숙주세포에서 고갈되는 폴리프레닐 디포스페이트 기질은 FPP일 수 있다. 세스퀴테르펜들과는 별도로, 많은 다른 화합물들이 숙주세포의 생존도 및 성장에 필수적인 FPP로부터 합성된다. 이러한 화합물들로는 이에 제한되는 것은 아니지만 스쿠알렌 (squalene), 라노스테롤 (lanosterol), 에르고스테롤 (ergosterol), 고리아르테놀 (cycloartenol), 콜레스테롤 (cholesterol), 스테로이드 호르몬들 (steroid hormones), 및 비타민 D을 포함한다. 따라서 일정 구현예들에서, 테스트 테르펜 합성효소를 발현하는 숙주세포는 그의 세포막에 감소된 양들의 콜레스테롤 또는 에르고스테롤을 포함할 수 있다. 세포들에서 콜레스테롤 또는 에르고스테롤의 정량 방법은 당해 기술분야에 알려져 있다 (예로, Crockett and Hazel (2005) J. Experimental Zoology, 271(3): 190-195; Arthington-Skaggs et al. (1999) J Clin Microbiol. 37(10): 3332-3337; Seitz et al. (1979) Physiol. Biochem. 69: 1202-1203). 일정 구현예들에서, 테스트 테르펜 합성효소의 존재 시 숙주세포에서 유지될 수 없는 세포 생존을 위해 요구되는 기본 세포성 과정은 세포막의 생산 및/또는 유지이다. 다른 구현예들에서, 테스트 테르펜 합성효소의 존재 시 숙주세포에서 고갈되는 폴리프레닐 디포스페이트 기질은 GPP 또는 GGPP이다.
보다 또 다른 관점에서, 본 발명은 테르펜 합성효소 변이체들의 생체내 성능을 확인하고 및/또는 순위 매기는 경쟁 방법을 제공한다. 본 경쟁 방법은 테르펜 합성효소 변이체들이 비교되는 비교군 효소로서 기지의 테르펜 합성효소를 사용한다. 비교군 테르펜 합성효소 및 각 테르펜 합성효소 변이체들 둘 다는 다음으로 그들이 해당하는 테르펜들을 생산하도록 동일한 폴리프레닐 디포스페이트 기질 (예로, GPP, FPP, 또는 GGPP)과 경쟁하는 숙주세포에서 공동-발현된다. 비교군 효소의 성적은 숙주 세포들에서 일정하게 남아있기 때문에, 비교군 테르펜 합성효소 및 테르펜 합성효소 변이체들에 의해 생산되는 테르펜 산물들의 역가들의 비율들에서 변화들이라면 모두는 테르펜 합성효소 변이체들의 활성들의 직접적인 결과이다. 결론적으로, 이러한 비율들은 개선된 생체내 성능을 가지는 테르펜 합성효소 변이체들을 확인하고 및/또는 폴리프레닐 디포스페이트 기질들을 테르펜들의 생산으로 전환하는 단계에서 그들의 생체내 역학적 능력들에 대해 순위를 매기거나 정량적으로 비교하는 데 사용될 수 있다.
따라서 현재 다음의 단계를 포함하는 경쟁 방법이 제공된다:
(a) 숙주 세포들의 집단을 대조군 집단 및 테스트 집단으로 분할하고;
(b) 상기 대조군 집단에서 대조군 테르펜 합성효소 및 비교군 테르펜 합성효소를 발현시키고, 상기 대조군 테르펜 합성효소는 폴리프레닐 디포스페이트를 첫 번째 테르펜으로 전환할 수 있고, 상기 비교군 테르펜 합성효소는 상기 폴리프레닐 디포스페이트를 두 번째 테르펜으로 전환할 수 있고;
(c) 상기 테스트 집단에서 비교군 테르펜 합성효소 및 상기 테스트 테르펜 합성효소를 발현시키고, 상기 테스트 테르펜 합성효소는 상기 대조군 테르펜 합성효소의 변이체이고, 상기 비교군 테르펜 합성효소는 상기 테스트 집단에서 및 상기 대조군 집단에서 유사한 수준들로 발현되고; 또한
(d) 상기 테스트 집단 및 상기 대조군 집단에서 상기 두 번째 테르펜 대비 상기 첫 번째 테르펜의 비율을 측정한다.
명확하게, 현재 기술된 경쟁 방법은 광범위한 테르펜 합성효소들에 적용될 수 있다. 따라서 별도의 구현예들에서, 본 경쟁 방법은 모노테르펜 합성효소들, 디테르펜 합성효소들, 세스퀴테르펜 합성효소들, 세스터테르펜 합성효소들, 트리테르펜 합성효소들, 테트라테르펜 합성효소들, 및 폴리테르펜 합성효소들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 테르펜 합성효소들을 확인하고 및/또는 순위 매기는 데 적용된다. 따라서 별도의 구현예들에서, 첫 번째 테르펜 및 두 번째 테르펜은 모노테르펜들, 세스퀴테르펜들, 디테르펜들, 세스터테르펜들, 트리테르펜들, 테트라테르펜들, 및 폴리테르펜들로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일정 이러한 구현예들에서, 첫 번째 테르펜 및 두 번째 테르펜은 β-파네센, α-파네센, 트리코디엔, 패추롤, 아모파디엔, 발렌센, 파네솔, 네로리돌, 리모넨, 마이어센, 및 누트카톤으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
대조군 테르펜 합성효소는 자연적으로 생기는 테르펜 합성효소 또는 자연적으로 생기지 않는 테르펜 합성효소일 수 있다. 테스트 테르펜 합성효소는 대조군 테르펜 합성효소와 대비하여 아미노산 치환들, 결실들 및/또는 첨가들을 포함하거나, 대조군 테르펜 합성효소 및 테스트 테르펜 합성효소를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열들에서 서로 다른 코돈들에 의해 인코드되는 일치하는 아미노산들을 포함할 수 있다. 일정 구현예들에서, 대조군 테르펜 합성효소는 세스퀴테르펜 합성효소이다. 일정 이러한 구현예들에서, 세스퀴테르펜 합성효소는 β-파네센 합성효소, a-파네센 합성효소, 트리코디엔 합성효소, 패추롤 합성효소, 아모파디엔 합성효소, 발렌센 합성효소, 파네솔 합성효소, 네로리돌 합성효소, 및 누트카톤 합성효소로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일정 이러한 구현예들에서, 대조군 세스퀴테르펜 합성효소는 아르테미시아 애누아 (Artemisia annua)의 β-파네센 합성효소이다. 일정 이러한 구현예들에서, 대조군 세스퀴테르펜 합성효소는 서열번호 111로 주어진 바와 같은 아미노산 서열을 가진다.
대조군 집단 및 테스트 집단의 첫 번째 테르펜/두 번째 테르펜의 비율들을 비교할 수 있기 위하여, 비교군 테르펜 합성효소의 유사한 발현 수준들을 입증하는 것이 필요하다. 이것은 두 개 숙주 세포 집단들에 있는 비교군 테르펜 합성효소들을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열들을 동일한 조절 요소들의 조절 하에 두어서 달성될 수 있다. 경쟁 방법이 테르펜 합성효소 변이체를 확인하는 데 사용되는 구현예들에서, 두 개 세포 집단들에 있는 대조군 테르펜 합성효소 및 테스트 테르펜 합성효소의 발현 수준들도 역시 유사해야 한다. 경쟁 방법이 예를 들면 원하는 발현 수준을 제공하는 조절 요소들 (예로, 프로모터들)을 확인하는데 사용되는 다른 구현예들에서, 테스트 테르펜 합성효소는 대조군 테르펜 합성효소와 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열에서는 아니지만 발현 수준에서는 서로 다르다. 이러한 구현예들에서, 서로 다른 요소들이 대조군 테르펜 합성효소 및 테스트 테르펜 합성효소의 발현에 사용된다.
현재까지 기재된 경쟁 방법을 위한 수많은 유용성들이 존재한다. 일정 구현예들에서, 본 방법은 대조군 테르펜 합성효소와 대비하여, 개선된 생체내 성능을 가진 테르펜 합성효소 변이체가 폴리프레닐 디포스페이트 기질로부터 그의 테르펜 산물까지 더 많은 유동을 전환할 수 있어, 관심있는 테르펜/비교군 테르펜 (예로, 첫 번째 테르펜/두 번째 테르펜)의 더 높은 비율들을 주는 점을 기초로 하여 개선된 생체내 성능을 가진 테르펜 합성효소 변이체들을 (예로, 돌연변이 테르펜 합성효소들의 라이브러리로부터) 검색하는 데 사용된다.
유사한 검정법이 일련의 프로모터들의 강도를 순위 매기는 데 사용될 수 있다 (예를 들면, 이러한 검정법이 본 명세서에서 기재된 첫 번째 검색 방법에서 대조군 세스퀴테르펜 합성효소를 발현하는 용도에 적합한 프로모터들을 확인하는 데 사용되었던 실시예 16을 참조하라.). 이러한 구현예에서, 대조군 테르펜 합성효소 및 테스트 테르펜 합성효소는 실제로 일치하지만, 그들은 서로 다른 프로모터들의 조절적 통제 하에 있어 대조군 집단 및 테스트 집단은 그들이 포함하는 테스트 테르펜 합성효소의 유형에서는 아니지만 테스트 테르펜 합성효소의 발현의 수준에서는 서로 다르다. 이러한 구현예에서, 대조군 집단 및 테스트 집단에서 두 번째 테르펜 대비 첫 번째 테르펜의 비율을 비교하는 것은 테스트 테르펜 합성효소의 활성에 대한 것은 아니지만 테스트 테르펜 합성효소의 발현을 추진하는 프로모터의 강도에 대한 정보를 제공한다.
또한, 본 시스템은 다양한 세포들에 의해 만들어진 둘 이상의 테르펜 산물들의 비율을 조정하는 데 사용될 수 있어, 정의된 비율을 가진 다양한 세포들의 조합된 혼합물은 상업적으로 유용한 산물의 원하는 성질들을 소유한다.
현재까지 기재된 경쟁 방법의 주요한 장점들은 이것이 효소 발현 및 활성에서 세포마다의 다양성들을 제거하고, 이것이 튼튼하고, 또한 이것은 폴리프레닐 디포스페이트 기질로의 전반적인 유동 경로가 숙주세포에서 제한될 때도 심지어 사용될 수 있는 것이다. 후자는 절대적인 테르펜 역가 측정들을 기초로 하는 검정법들이 테르펜 역가들이 폴리프레닐 디포스페이트 기질로의 전반적인 유동 경로에 의해 막혀 있을 때 효소 활성들에서 개선들을 차단할 수 있기 때문에 중요하다.
현재까지 기재된 검색 방법 및/또는 경쟁 방법을 사용하여 개발된 효소들은, 이에 제한되는 것은 아니지만 형광 검색 및/또는 기체 크로마토그래피에 의해 테르펜 산물의 직접적인 정량을 포함하는 선택적인 검색의 추가적인 수단이 될 수 있다. 보다 상세하게, 이것은 파네센과 같은 세스퀴테르펜의 생산을 측정하는 나일 레드-기초 고처리량 형광 검정법, 및 파네센과 같은 세스퀴테르펜의 역가를 측정하는 기체 크로마토그래피 (GC)-기초 직접적인 정량 방법을 포함한다. 개선된 효소들도 역시 유도된 돌연변이들 등과 같은 유전공학적 방법들에 의해 좀 더 개선될 수 있다. 그 결과로, 최종 효소 성능을 증진하는 복수의 효소 성질들의 개선들이 성공적으로 달성될 수 있고, 가장 효과적인 효소 변이체들이 확인된다.
본 발명은 월등한 파네센 합성효소 변이체들, 및 이러한 파네센 합성효소 변이체들을 포함하는 숙주 세포들에도 역시 속한다. 파네센 합성효소 변이체들은 본 명세서에서 기재된 방법들을 사용하여 개발되었고, 생체내 성능에서, 200% 이상의 개선을 보여준다. 파네센 합성효소 변이체들은 촉매적 효율을 개선하였고, 예로 그들은 더 빠른 속도로 그들의 반응을 촉매화할 수 있다. 이와 같이, 그들은 고수율 생산이 주로 중요한, 파네센과 같은 세스퀴테르펜 산물들의 상업적인 생산에 더욱 적합하다.
따라서 보다 또 다른 관점에서, 본 명세서에서는 서열번호 111에 주어진 바와 같은 아미노산 서열들을 가지지만 서열번호 111의 2, 3, 4, 6, 9, 11, 18, 20, 24, 35, 38, 50, 61, 72, 80, 89, 105, 115, 144, 196, 211, 251, 280, 288, 319, 348, 357, 359, 369, 371, 385, 398, 423, 433, 434, 442, 444, 446, 460, 467, 488, 495, 505, 526, 531, 556, 572, 및 575번 위치들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환들을 포함하는, 분리된 β-파네센 합성효소 변이체들 및 이러한 β-파네센 합성효소 변이체들을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산들이 제공된다.
보다 또 다른 관점에서, 본 발명은
(a) 서열번호 111에 의해 인코드되는 β-파네센 합성효소의 변이체인, 이종유래 β-파네센 합성효소; 및
(b) MEV 경로 또는 DXP 경로 효소:
를 포함하는 유전적으로 변형된 숙주세포를 제공하고, 상기 숙주세포는 MEV 경로 또는 DXP 경로 효소 및 서열번호 111에 의해 인코드되는 β-파네센 합성효소를 포함하는 부모 세포와 대비하여 적어도 15% 이상의 β-파네센을 생산한다.
일정 구현예들에서, 이종유래 β-파네센 합성효소는 서열번호 111의 2, 3, 4, 6, 9, 11, 18, 20, 24, 35, 38, 50, 61, 72, 80, 89, 105, 115, 144, 196, 211, 251, 280, 288, 319, 348, 357, 359, 369, 371, 385, 398, 423, 433, 434, 442, 444, 446, 460, 467, 488, 495, 505, 526, 531, 556, 572, 및 575번 위치들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 위치들에서 하나 이상의 아미노산 치환들을 포함한다.
일정 구현예들에서, MEV 경로 효소는 HMG-CoA 환원효소이다. 일정 구현예들에서, MEV 경로 효소는 메발로네이트 키나제이다. 추가적인 MEV 경로의 대표적인 효소들은 하기 섹션 5.4에 제공된다.
보다 또 다른 관점에서, 본 명세서에서는
(a) (i) 서열번호 111에 의해 인코드되는 β-파네센 합성효소의 변이체를 인코딩하는 첫 번째 이종유래 뉴클레오타이드 서열; 및 (ii) MEV 경로 또는 DXP 경로 효소를 인코딩하는 두 번째 이종유래 뉴클레오타이드 서열:을 포함하는 유전적으로 변형된 다수의 숙주 세포들을 획득하고;
(b) 상기 유전적으로 변형된 숙주 세포들을 β-파네센을 만드는 데 적합한 조건들 하에서 탄소원을 포함하는 배지로 배양하고; 또한
(c) 상기 배지로부터 β-파네센을 회수하는:
단계들을 포함하는 β-파네센을 생산하는 방법이 제공된다.
일정 구현예들에서, MEV 경로 효소는 HMG-CoA 환원효소이다. 일정 구현예들에서, MEV 경로 효소는 메발로네이트 키나제이다. 추가적인 MEV 경로의 대표적인 효소들은 하기 섹션 (유전적으로 조작된 숙주 세포들)에서 제공된다.
숙주세포들을 선택하는 단계
본 발명의 관행에서 유용한 숙주세포들은 원시세균 (archae), 원핵세포, 또는 진핵세포들을 포함한다.
적합한 원핵세포 숙주들은 이에 제한되는 것은 아니지만 다양한 그램-양성, 그램-음성, 또는 그램-다양성 박테리아를 포함한다. 예들로는 이에 제한되는 것은 아니지만: Agrobacterium , Alicyclobacillus, Anabaena , Anacystis , Arthrobacter , Azobacter , Bacillus , Brevibacterium , Chromatium, Clostridium , Corynebacterium , Enterobacter , Erwinia , Escherichia , Lactobacillus , Lactococcus , Mesorhizobium , Methylobacterium , Microbacterium , Phormidium , Pseudomonas, Rhodobacter , Rhodopseudomonas , Rhodospirillum , Rhodococcus , Salmonella, Scenedesmun , Serratia , Shigella , Staphlococcus , Strepromyces , Synnecoc cus , 및 Zymomonas 속들에 속하는 세포들을 포함한다. 진핵세포주들의 예들로는 이에 제한되는 것은 아니지만: Bacillus subtilis , Bacillus amyloliquefacines , Brevibacterium ammoniagenes , Brevibacterium immariophilum , Clostridium beigerinckii , Enterobacter sakazakii , Escherichia coli , Lactococcus lactis , Mesorhizobium loti , Pseudomonas aeruginosa , Pseudomonas mevalonii , Pseudomonas pudica , Rhodobacter capsulatus, Rhodobacter sphaeroides , Rhodospirillum rubrum , Salmonella enterica , Salmonella typhi, Salmonella typhimurium , Shigella dysenteriae , Shigella flexneri , Shigella sonnei , 및 Staphylococ cus aureus를 포함한다.
적합한 원시세균 숙주들은 이에 제한되는 것은 아니지만: Aeropyrum , Archaeglobus , Halobacterium , Methanococ cus, Methanobacterium , Pyrococcus , Sulfolobus 및 Thermoplasma 속들에 속하는 세포들을 포함한다. 원시세균 숙주들의 예들로는 이에 제한되는 것은 아니지만: Archaeoglobus fulgidus , Halobacterium sp ., Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum , Thermoplasma acidophilum , Thermoplasma volcanium , Pyrococcus horikoshii , Pyrococcus abyssi, 및 Aeropyrum pernix를 포함한다.
적합한 진핵세포 숙주들은 이에 제한되는 것은 아니지만 곰팡이 세포들, 조류 세포들, 곤충 세포들, 및 식물 세포들을 포함한다. 예들로는 이에 제한되는 것은 아니지만: Aspergillus , Candida , Chrysosporium, Cryotococcus , Fusarium , Kluyveromyces , Neotyphodium , Neurospora, Penicillium , Pichia , Saccharomyces , Trichoderma , Ascomycota , Basidiomycota , Dothideomycetes, 및 Xanthophyllomyces (이전에는 Phaffia) 속들에 속하는 세포들을 포함한다. 진핵세포주들의 예들로는 이에 제한되는 것은 아니지만: Pichia pastoris , Pichia finlandica , Pichia trehalophila , Pichia koc lamae , Pichia membranaefaciens , Pichia opuntiae , Pichia thermotolerans , Pichia salictaria , Pichia quercuum , Pichia pijperi , Pichia stiptis, Pichia methanolica , Pichia sp ., Saccharomyces cerevisiae , Saccharomyces sp ., Schizosaccharomyces pombe , Hansenula polymorpha , Kluyveromyces sp . , Kluyveromyces lactis , Candida albicans , Aspergillus nidulans , Aspergillus niger , Aspergillus oryzae , Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense , Fusarium sp ., Fusarium gramineum , Fusarium venenatum , Neurospora crassa, 및 Chlamydomonas reinhardtii을 포함한다.
특정한 구현예에서, 숙주세포는 대장균 (Escherichia coli) 세포이다. 또 다른 특정한 구현예에서, 숙주세포는 사카로마이세스 세레비시애 (Saccharomyces cerevisiae) 세포이다. 일정 구현예들에서, 숙주세포는 베이커의 효모, CBS 7959, CBS 7960, CBS 7961, CBS 7962, CBS 7963, CBS 7964, IZ-1904, TA, BG-1, CR-1, SA-1, M-26, Y-904, PE-2, PE-5, VR-1, BR-1, BR-2, ME-2, VR-2, MA-3, MA-4, CAT-1, CB-1, NR-1, BT-1, 및 AL-1로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 사카로마이세스 세레비시애 세포이다. 일정 구현예들에서, 숙주세포는 PE-2, CAT-1, VR-1, BG-1, CR-1, 및 SA-1로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 사카로마이세스 세레비시애 세포이다. 특정한 구현예에서, 숙주세포는 균주 PE-2의 사카로마이세스 세레비시애이다. 또 다른 특정한 구현예에서, 숙주세포는 균주 CAT-1의 사카로마이세스 세레비시애이다. 또 다른 특정한 구현예에서, 숙주세포는 사카로마이세스 세레비시애 균주 BG-1이다.
일정 구현예들에서, 숙주세포는 산업적 발효, 예로 바이오에탄올 발효에 적합한 세포이다. 특정한 구현예에서, 숙주세포는 산업적 발효 환경의 인식된 스트레스 조건들이 되는 높은 용매 농도, 높은 온도, 확장된 기질 사용도, 영양분 제한, 삼투압 스트레스, 설파이드 및 박테리아 오염, 또는 그들의 조합들 하에서 살아가도록 조정된다.
올라간 세포내 FPP 수준들을 가진 숙주세포들
일정 구현예들에서, 부모 세포와 대비하여 숙주세포는 올라간 세포내 수준의 FPP를 포함하고, 올라간 세포내 수준의 FPP는 숙주세포의 생존도를 감소시킨다.
일정 구현예들에서, 숙주세포는 세포 배양액의 단위 부피 당을 기초로 하여 부모 세포의 FPP 세포내 수준보다 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 75배, 적어도 약 100배, 적어도 약 200배, 적어도 약 300배, 적어도 약 400배, 적어도 약 500배, 또는 적어도 약 1,000배 이상 높은, FPP의 세포내 수준을 포함한다.
일정 구현예들에서, 숙주세포는 단위 건조 세포 무게 당을 기초로 하여 부모 세포의 FPP 세포내 수준보다 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 75배, 적어도 약 100배, 적어도 약 200배, 적어도 약 300배, 적어도 약 400배, 적어도 약 500배, 또는 적어도 약 1,000배 이상 높은, FPP의 세포내 수준을 포함한다.
일정 구현예들에서, 숙주세포는 단위 시간 당 세포 배양액의 단위 부피 당을 기초로 하여 부모 세포의 FPP 세포내 수준보다 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 75배, 적어도 약 100배, 적어도 약 200배, 적어도 약 300배, 적어도 약 400배, 적어도 약 500배, 또는 적어도 약 1,000배 이상 높은, FPP의 세포내 수준을 포함한다.
일정 구현예들에서, 숙주세포는 단위 시간 당 단위 건조 세포 무게 당을 기초로 하여 부모 세포의 FPP 세포내 수준보다 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 75배, 적어도 약 100배, 적어도 약 200배, 적어도 약 300배, 적어도 약 400배, 적어도 약 500배, 또는 적어도 약 1,000배 이상 높은, FPP의 세포내 수준을 포함한다.
대부분의 구현예들에서, 숙주세포에서 올라간 세포내 수준의 FPP는 유도화 화합물 (inducing compound)에 의해 유도가능하다. 이러한 숙주세포는 유도화 화합물의 부재 시 쉽게 조작될 수 있다. 다음으로 유도화 화합물은 숙주세포에서 올라간 세포내 수준의 FPP를 유도하도록 첨가된다. 다른 구현예들에서, 숙주세포에서 올라간 세포내 수준의 FPP는, 예를 들면 성장 온도와 같은 배양 조건들을 변화시켜서 유도가능하다. 따라서 세포내 FPP 수준의 유도가능한 증가는 숙주세포의 감소된 생존도 표현형을 위한 분자적 온-오프 스위치를 제공한다.
세포내 FPP 수준의 증가는 숙주세포의 표적화된 유전적 조작을 통해 효과를 낼 수 있다. 많은 효소들이 FPP 및 그의 전구체들의 생산 및 사용에서 기능하는 것으로 알려져 있고, 이들 효소들의 하나라면 모두가 숙주세포에서 FPP 수준을 변화하도록 조작될 수 있다.
일정 구현예들에서, 숙주세포에서 FPP의 생산은 숙주세포에 있는 세포성 아세틸-CoA의 생산을 증가시켜서 증가된다.
일정 구현예들에서, 숙주세포에서 FPP의 생산은 숙주세포에 있는 IPP 및/또는 DMAPP 의 생산을 증가시켜서 증가된다. 일정 이러한 구현예들에서, 숙주세포에서 IPP 및/또는 DMAPP 의 생산은 MEV 경로의 하나 이상의 효소들을 증가시켜서 증가된다. MEV 경로의 모식적 재연은 도 15에 도시되어 있다. 일반적으로, 본 경로는 여섯 개의 단계들을 포함한다.
첫 번째 단계에서, 아세틸 조효소 A의 두 개 분자들은 아세토아세틸-CoA를 형성하도록 효소적으로 조합된다. 본 단계를 촉매화하는 것으로 알려진 효소는, 예를 들면 아세틸-CoA 티올라제이다. 뉴클레오타이드 서열들의 도시적 예들로는 이에 제한되는 것은 아니지만 다음의 진뱅크 (GenBank) 기탁번호들 및 서열들이 유래한 생물을 포함한다: (NC_000913 REGION: 2324131. . 2325315; Escherichia coli), (D49362; Paracoccus denitrificans), 및 (L20428; Saccharomyces cerevisiae).
MEV 경로의 두 번째 단계에서, 아세토아세틸-CoA는 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA (HMG-CoA)을 형성하도록 아세틸-CoA의 또 다른 분자와 효소적으로 응축된다. 본 단계를 촉매화하는 것으로 알려진 효소는, 예를 들면 HMG-CoA 합성효소이다. 뉴클레오타이드 서열들의 도시적 예들로는 이에 제한되는 것은 아니지만: (NC_001145. 보완 19061. . 20536; Saccharomyces cerevisiae), (X96617; Saccharomyces cerevisiae), (X83882; Arabidopsis thaliana), (AB037907; Kitasatospora griseola), (BT007302; Homo sapiens), 및 (NC_002758, 좌위 표시 SAV2546, GeneID 1122571; Staphylococcus aureus)을 포함한다.
세 번째 단계에서, HMG-CoA는 메발로네이트로 효소적으로 전환된다. 본 단계를 촉매화하는 것으로 알려진 효소는, 예를 들면 HMG-CoA 환원효소이다. 뉴클레오타이드 서열들의 도시적 예들로는 이에 제한되는 것은 아니지만: (NM_206548; Drosophila melanogaster), (NC_002758, 좌위 표시 SAV2545, GeneID 1122570; Staphylococ cus aureus), (NM_204485; Gallus gallus), (AB015627; Streptomyces sp. KO 3988), (AF542543; Nicotiana attenuata), (AB037907; Kitasatospora griseola), (AX128213, 절단된 HMGR를 인코딩하는 서열을 제공함; Saccharomyces cerevisiae), 및 (NC_001145: 보완 (115734. . 118898; Saccharomyces cerevisiae)를 포함한다.
네 번째 단계에서, 메발로네이트는 메발로네이트 5-포스페이트를 형성하도록 효소적으로 인산화된다. 본 단계를 촉매화하는 것으로 알려진 효소는, 예를 들면 메발로네이트 키나제이다. 뉴클레오타이드 서열들의 도시적 예들로는 이에 제한되는 것은 아니지만: (L77688; Arabidopsis thaliana), 및 (X55875; Saccharomyces cerevisiae)를 포함한다.
다섯 번째 단계에서, 두 번째 포스페이트기는 메발로네이트 5-피로포스페이트를 형성하도록 메발로네이트 5-포스페이트에 효소적으로 첨가된다. 본 단계를 촉매화하는 것으로 알려진 효소는, 예를 들면 포스포메발로네이트 키나제이다. 뉴클레오타이드 서열들의 도시적 예들로는 이에 제한되는 것은 아니지만: (AF429385; Hevea brasiliensis), (NM_006556; Homo sapiens), 및 (NC_001145. 보완 712315. . 713670; Saccharomyces cerevisiae)를 포함한다.
여섯 번째 단계에서, 메발로네이트 5-피로포스페이트는 IPP로 효소적으로 전환된다. 본 단계를 촉매화하는 것으로 알려진 효소는, 예를 들면 메발로네이트 피로포스페이트 탈탄산화효소이다. 뉴클레오타이드 서열들의 도시적 예들로는 이에 제한되는 것은 아니지만: (X97557; Saccharomyces cerevisiae), (AF290095; Enterococcus faecium), 및 (U49260; Homo sapiens)을 포함한다.
다른 이러한 구현예들에서, 숙주세포에서 IPP 및 DMAPP의 생산은 DXP 경로의 하나 이상의 효소들의 활성을 증가시켜서 증가된다. DXP 경로의 모식적 재연은 도 16에 도시되어 있다. 일반적으로 DXP 경로는 일곱 개의 단계들을 포함한다:
첫 번째 단계에서, 피루베이트는 1-데옥시-D-자일루로스-5-포스페이트를 만들도록 D-글리세르알데하이드 3-포스페이트와 응축된다. 본 단계를 촉매화하는 것으로 알려진 효소는, 예를 들면 1-데옥시-D-자일루오스-5-포스페이트 합성효소이다. 뉴클레오타이드 서열들의 도시적 예들로는 이에 제한되는 것은 아니지만: (AF035440; Escherichia coli), (NC_002947, 좌위 표시 PP0527; Pseudomonas putida KT2440), (CP000026, 좌위 표시 SPA2301; Salmonella enterica Paratyphi , ATCC 9150 참조하라), (NC_007493, 좌위 표시 RSP_0254; Rhodobacter sphaeroides 2. 4. 1), (NC_005296, 좌위 표시 RPA0952; Rhodopseudomonas palustris CGA009), (NC_004556, 좌위 표시 PD1293; Xylella fastidiosa Temecula1), 및 (NC_003076, 좌위 표시 AT5G11380; Arabidopsis thaliana)를 포함한다.
두 번째 단계에서, 1-데옥시-D-자일루로스-5-포스페이트는 2C-메틸-D-에리트리톨-4-포스페이트로 전환된다. 본 단계를 촉매화하는 것으로 알려진 효소는, 예를 들면 1-데옥시-D-자일루로스-5-포스페이트 환원이성질화효소이다. 뉴클레오타이드 서열들의 도시적 예들로는 이에 제한되는 것은 아니지만: (AB013300; Escherichia coli), (AF148852; Arabidopsis thaliana), (NC_002947, 좌위 표시 PP1597; Pseudomonas putida KT2440), (AL939124, 좌위 표시 SCO5694; Streptomyces coelicolor A3(2)), (NC_007493, 좌위 표시 RSP_2709; Rhodobacter sphaeroides 2. 4. 1), 및 (NC_007492, 좌위 표시 Pfl_1107; Pseudomonas fluorescens PfO-1)를 포함한다.
세 번째 단계에서, 2C-메틸-D-에리트리톨-4-포스페이트는 4-디포스포사이티딜-2C-메틸-D-에리트리톨로 전환된다. 본 단계를 촉매화하는 것으로 알려진 효소는, 예를 들면 4-디포스포사이티딜-2C-메틸-D-에리트리톨 합성효소이다. 뉴클레오타이드 서열들의 도시적 예들로는 이에 제한되는 것은 아니지만: (AF230736; Escherichia coli), (NC_007493, 좌위_표시 RSP_2835; Rhodobacter sphaeroides 2. 4. 1), (NC_003071, 좌위_표시 AT2G02500; Arabidopsis thaliana ), 및 (NC_002947, 좌위_표시 PP1614; Pseudomonas putida KT2440)를 포함한다.
네 번째 단계에서, 4-디포스포사이티딜-2C-메틸-D-에리트리톨은 4-디포스포사이티딜-2C-메틸-D-에리트리톨-2-포스페이트로 전환된다. 본 단계를 촉매화하는 것으로 알려진 효소는, 예를 들면 4-디포스포사이티딜-2C-메틸-D-에리트리톨 키나제이다. 뉴클레오타이드 서열들의 도시적 예들로는 이에 제한되는 것은 아니지만: (AF216300; Escherichia coli) 및 (NC_007493, 좌위_표시 RSP_1779; Rhodobacter sphaeroides 2. 4. 1)를 포함한다.
다섯 번째 단계에서, 4-디포스포사이티딜-2C-메틸-D-에리트리톨-2포스페이트는 2C-메틸-D-에리트리톨-2,4-고리디포스페이트로 전환된다. 본 단계를 촉매화하는 것으로 알려진 효소는, 예를 들면 2C-메틸-D-에리트리톨 2,4-고리디포스페이트 합성효소이다. 뉴클레오타이드 서열들의 도시적 예들로는 이에 제한되는 것은 아니지만: (AF230738; Escherichia coli), (NC_007493, 좌위_표시 RSP_6071; Rhodobacter sphaeroides 2. 4. 1), 및 (NC_002947, 좌위_표시 PP1618; Pseudomonas putida KT2440)를 포함한다.
여섯 번째 단계에서, 2C-메틸-D-에리트리톨 2,4-고리디포스페이트는 1-하이드록시-2-메틸-2-(E)-부테닐-4-디포스페이트로 전환된다. 본 단계를 촉매화하는 것으로 알려진 효소는, 예를 들면 1-하이드록시-2-메틸-2-(E)-부테닐-4-디포스페이트 합성효소이다. 뉴클레오타이드 서열들의 도시적 예들로는 이에 제한되는 것은 아니지만: (AY033515; Escherichia coli), (NC_002947, 좌위_표시 PP0853; Pseudomonas putida KT2440), 및 (NC_007493, 좌위_표시 RSP_2982; Rhodobacter sphaeroides 2. 4. 1)을 포함한다.
일곱 번째 단계에서, 1-하이드록시-2-메틸-2-(E)-부테닐-4-디포스페이트는 IPP 또는 그의 이성질체, DMAPP 로 전환된다. 본 단계를 촉매화하는 것으로 알려진 효소는, 예를 들면 이소펜틸/디메틸알릴 디포스페이트 합성효소이다. 뉴클레오타이드 서열들의 도시적 예들로는 이에 제한되는 것은 아니지만: (AY062212; Escherichia coli) 및 (NC_002947, 좌위_표시 PP0606; Pseudomonas putida KT2440)를 포함한다.
일정 구현예들에서, 숙주세포에서 FPP의 생산은 IPP의 DMAPP로 이성질화를 증가시켜서 증가된다. 일정 이러한 구현예들에서, IPP의 DMAPP로 이성질화는 IPP 이성질화효소의 활성을 증가시켜서 증가된다. 뉴클레오타이드 서열들의 도시적 예들로는 이에 제한되는 것은 아니지만: (NC_000913, 3031087. . 3031635; Escherichia coli), 및 (AF082326; Haematococ cus pluvialis)를 포함한다.
일정 구현예들에서, 숙주세포에서 FPP의 생산은 FPP와 IPP 및 DMAPP의 응축을 증가시켜서 증가된다. 일정 이러한 구현예들에서, IPP 및 DMAPP의 또는 IPP및 게라닐 피로포스페이트 ("GPP")의 FPP와 응축은 FPP 합성효소의 활성을 증가시켜서 증가된다. FPP 합성효소들을 인코드하는 뉴클레오타이드 서열들의 도시적 예들로는 이에 제한되는 것은 아니지만: (ATU80605; Arabidopsis thaliana), (ATHFPS2R; Arabidopsis thaliana), (AAU36376; Artemisia annua), (AF461050; Bos taurus), (D00694; Escherichia coli K-12), (AE009951, 좌위 AAL95523; Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum ATCC 25586), (GFFPPSGEN; Gibberella fujikuroi), (CP000009, 좌위 AAW60034; Gluconobacter oxydans 621H), (AF019892; Helianthus annuus), (HUMFAPS; Homo sapiens), (KLPFPSQCR; Kluyveromyces lactis), (LAU15777; Lupinus albus), (LAU20771; Lupinus albus), (AF309508; Mus musculus), (NCFPPSGEN; Neurospora crassa), (PAFPS1; Parthenium argentatum), (PAFPS2; Parthenium argentatum), (RATFAPS; Rattus norvegicus), (YSCFPP; Saccharomyces cerevisiae), (D89104; Schizosaccharomyces pombe), (CP000003, 좌위 AAT87386; Streptococcus pyogenes), (CP000017, 좌위 AAZ51849; Streptococcus pyogenes), (NC_008022, 좌위 YP_598856; Streptococ cus pyogenes MGAS10270), (NC_008023, 좌위 YP_600845; Streptococ cus pyogenes MGAS2096), (NC_008024, 좌위 YP_602832; Streptococ cus pyogenes MGAS10750), (MZEFPS; Zea mays), (AE000657, 좌위 AAC06913; Aquifex aeolicus VF5), (NM_202836; Arabidopsis thaliana), (D84432, 좌위 BAA12575; Bacillus subtilis), (U12678, 좌위 AAC28894; Bradyrhizobium japonicum USDA 110), (BACFDPS; Geobacillus stearothermophilus), (NC_002940, 좌위 NP_873754; Haemophilus ducreyi 35000HP), (L42023, 좌위 AAC23087; Haemophilus influenzae Rd KW20), (J05262; Homo sapiens), (YP_395294; Lactobacillus sakei subsp . sakei 23K), (NC_005823, 좌위 YP_000273; Leptospira interrogans serovar Copenhageni str . Fioc ruz L1-130), (AB003187; Micrococcus luteus), (NC_002946, 좌위 YP_208768; Neisseria gonorrhoeae FA 1090), (U00090, 좌위 AAB91752; Rhizobium sp. NGR234), (J05091; Saccharomyces cerevisae), (CP000031, 좌위 AAV93568; Silicibacter pomeroyi DSS-3), (AE008481, 좌위 AAK99890; Streptococcus pneumoniae R6), 및 (NC_004556, 좌위 NP 779706; Xylella fastidiosa Temecula1)를 포함한다.
일정 구현예들에서, 숙주세포에서 FPP의 생산은 생산적 단계들로부터 FPP의 형성으로 중간물들을 전환시키는 반응들을 저해하여 증가된다. 이러한 반응들은 이에 제한되는 것은 아니지만 지방산 생합성을 유도하는 TCA 회로의 부수적 반응들, 알라닌 생합성, 아스파테이트 수퍼경로 (aspartate superpathway), 포도당신합성, 헴 생합성, 글루타메이트 생합성, 및 포스포아세틸전이효소의 작용을 통한 아세틸-CoA의 아세테이트로 전환을 포함한다.
일정 구현예들에서, 올라간 세포내 수준의 FPP를 포함하는 숙주세포는 숙주세포에서 FPP의 소모를 감소시켜서 획득된다. 일정 이러한 구현예들에서, 숙주세포에서 FPP의 소모는 FPP를 스쿠알렌으로 전환할 수 있는 파네실-디포스페이트 파네실 전이효소 또는 스쿠알렌 합성효소의 활성을 감소시켜서 감소된다. 다른 이러한 구현예들에서, 숙주세포에서 FPP의 소모는 세스퀴테르펜 합성효소의 활성을 감소시켜서 감소된다.
올라간 세포내 수준의 FPP를 포함하는 숙주세포는 유전공학적 기법들 (예로, 재조합 기술학), 고전적인 미생물학적 기법들, 또는 이러한 기법들의 조합을 사용하여 부모 세포를 유전적으로 변형시켜서 생성될 수 있다. 숙주세포는 또한 올라간 세포내 수준의 FPP로 인해 소정의 성장 조건들 하에서 비-생존가능한 자연적으로 생기는 유전적 변이체일 수도 있다.
감소된 세포 생존도를 가지는 이러한 올라간 세포내 수준의 FPP를 포함하는 숙주세포는 고체 배지 상에서 숙주세포의 성장을 올라간 세포내 수준의 FPP를 포함하지 않는 부모 세포의 성장과 비교하여 확인될 수 있다. 올라간 수준의 세포내 FPP를 포함하는 숙주세포는 그의 부모 세포와 대비하여 고체 아가 배지 상에서 더 적거나 작은 콜론들을 생산해야 한다. 소정의 성장 조건들 하에서만 올라간 세포내 수준의 FPP를 포함하는 숙주세포는, 제한된 성장 조건들 하에서만 감소된 생존도를 가지고 허용된 성장 조건들 하에서는 감소된 생존도를 가지지 않는 숙주 세포들을 확인하도록, 숙주세포가 올라간 세포내 수준의 FPP를 포함하지 않는 조건, 또한 그의 부모 세포와 동일한 생존도를 가지는 조건들 ("허용된 성장 조건들") 하에서 숙주세포를 먼저 성장시키고, 다음으로 숙주세포를 복제-도말하고 (replica-plating) 이를 숙주세포가 올라간 세포내 수준의 FPP를 포함하지 않는 조건들 ("제한된 성장 조건들") 하에서 성장시켜서 확인될 수 있다. 이러한 제한된 성장 조건들은 이에 제한되는 것은 아니지만 배양 배지에서 특이적 영양분의 존재, 배양 배지에서 특이적 수준으로 특이적 영양분의 존재, 배양 배지에서 유도화 화합물의 존재, 배양 배지에서 억제하는 화합물의 존재, 또한 특이적 성장 온도를 포함할 수 있다.
테르펜 합성효소들
본 명세서에서 제공된 본 발명들은 개선된 생체내 성능을 가진 테르펜 합성효소 변이체들을 개발하는 것에 관해 중점을 두고 있다.
일정 구현예들에서, 테르펜 합성효소 변이체는 자연적으로 생기는 테르펜 합성효소의 변이체이다. 다른 구현예들에서, 테르펜 합성효소 변이체는 자연적으로 생기지 않는 테르펜 합성효소의 변이체이다.
일정 이러한 구현예들에서, 테르펜 합성효소 변이체는 자연적으로 생기는 테르펜 합성효소와 또는 자연적으로 생기지 않는 테르펜 합성효소와 하나 이상의 아미노산 치환들, 결실들 및/또는 첨가들에 의해 서로 달라진다. 일정 구현예들에서, 테르펜 합성효소는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 추가적인 아미노산들을 포함하는 것에 의해 자연적으로 생기는 테르펜 합성효소와 또는 자연적으로 생기지 않는 테르펜 합성효소와 서로 달라진다. 일정 구현예들에서, 테르펜 합성효소는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 아미노산 치환들을 포함하는 것에 의해 자연적으로 생기는 테르펜 합성효소와 또는 자연적으로 생기지 않는 테르펜 합성효소와 서로 달라진다. 일정 구현예들에서, 테르펜 합성효소는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 아미노산 치환들이 결실되는 것에 의해 자연적으로 생기는 테르펜 합성효소와 또는 자연적으로 생기지 않는 테르펜 합성효소와 서로 달라진다.
일정 구현예들에서, 테르펜 합성효소 변이체는 자연적으로 생기는 테르펜 합성효소 또는 자연적으로 생기지 않는 테르펜 합성효소의 아미노산 서열과 약 50%로부터 약 55%까지, 약 55%로부터 약 60%까지, 약 60%로부터 약 65%까지, 약 65%로부터 약 70%까지, 약 70%로부터 약 75%까지, 약 75%로부터 약 80%까지, 약 80%로부터 약 85%까지, 약 85%로부터 약 90%까지, 약 90%로부터 약 95%까지, 또는 약 95%로부터 약 99%까지의 아미노산 서열 일치도를 가진다.
일정 구현예들에서, 테르펜 합성효소 변이체는 공통의 (consensus) 아미노산 서열을 포함한다. 공통의 아미노산 서열은 두 개 이상의 아미노산 서열들을 정렬하고, 적어도 두 개의 서열들에 의해 공유되는 아미노산들을 확인하여 유래된다. 일정 구현예들에서, 테르펜 합성효소 변이체는 둘 이상의 자연적으로 생기는 테르펜 합성효소들로부터 유래한 공통의 서열을 포함한다.
일정 구현예들에서, 테르펜 합성효소 변이체는 하이브리드 테르펜 합성효소이다. 하이브리드 테르펜 합성효소들은 둘 이상의 서로 다른 테르펜 합성효소들로부터 나온 인접한 (contiguous) 아미노산들의 연결들 (streches)을 포함한다. 하이브리드 테르펜 합성효소들은, 이에 제한되는 것은 아니지만 엑손 셔플링, 및 도메인 스워핑 등을 포함하는 기지의 방법이라면 모두를 사용하여 생성될 수 있다 (예로, Nixon et al . (1997) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 94:1069-1073; Fisch et al . (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93(15):7761-7766).
일정 구현예들에서, 테르펜 합성효소 변이체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산은 자연적으로 생기는 테르펜 합성효소를 인코딩하는 핵산과 엄격한 혼성화 조건들 하에서 혼성화한다. 또 다른 구현예들에서, 테르펜 합성효소 변이체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산은 자연적으로 생기는 테르펜 합성효소를 인코딩하는 핵산과 적당한 혼성화 조건들 하에서 혼성화한다. 보다 또 다른 구현예들에서, 테르펜 합성효소 변이체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산은 자연적으로 생기는 테르펜 합성효소를 인코딩하는 핵산과 낮은 혼성화 조건들 하에서 혼성화한다.
일정 구현예들에서, 테르펜 합성효소 변이체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 특정한 숙주세포를 위한 코돈 선호도들을 반영하도록 자연적으로 생기는 테르펜 합성효소를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로부터 변경된다 (예로, 특정한 숙주세포에서 발현을 위해 코돈-최적화됨). 특정한 숙주세포를 위해 선호되는 코돈들의 사용은 일반적으로 뉴클레오타이드 서열의 해독, 이에 따른 발현의 유사성을 증가시킨다. 특이적 생물이 특이적 아미노산을 코딩하는 데 특이적 코돈을 사용하는 시간의 백분율을 정리한 코돈 사용도 표들은 많은 생물들의 경우에 입수가능하고, 적합한 뉴클레오타이드 서열들을 설계하는 데 기준으로서 사용될 수 있다. 일정 구현예들에서, 테르펜 합성효소를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 사카로마이세스 세레비시애의 코돈 선호도를 반영하도록 변경된다 (예로, Bennetzen and Hall (1982) J. Biol . Chem . 257(6): 3026-3031를 참조하라). 일정 구현예들에서, 테르펜 합성효소를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 사카로마이세스 세레비시애의 코돈 선호도를 반영하도록 변경된다 (예로, Gouy and Gautier (1982) Nucleic Acids Res . 10(22):7055-7074; Eyre-Walker (1996) Mol . Biol . Evol . 13(6):864-872; Nakamura et al . (2000) Nucleic Acids Res . 28(1):292를 참조하라).
테르펜 합성효소를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산은 다양한 기지의 재조합 기법들 및 합성적 절차들이라면 모두를 사용하여 획득될 수 있다. 핵산은 게놈 DNA, cDNA, 또는 RNA로부터 제조될 수 있고, 이들 모두는 세포로부터 직접 추출될 수 있거나, 이에 제한되는 것은 아니지만 PCR 및 rt-PCR을 포함하는 다양한 증폭 공정들에 의해 재조합으로 생산될 수 있다. 직접적인 화학적 합성 방법들도 역시 당해 기술분야에 잘 알려져 있다.
테르펜 합성효소 변이체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산은 다양한 기지의 재조합 방법들이라면 모두를 사용하여 획득될 수 있다. 예를 들면, 핵산들은 화학적 돌연변이원들 또는 방사선조사로 처리되었던 세포들로부터, 또는DNA 복구에 결함들을 가지는 세포들로부터 분리될 수 있다. 적합한 화학적 돌연변이원들은, 이에 제한되는 것은 아니지만 에틸 메탄술포네이트 (EMS), 메틸 메탄술포네이트 (MMS), N-니트로소 우레아 (ENU), N-메틸-N-니트로-N'-니트로소구아니딘, 4-니트로퀴놀린 N-옥사이드, 디에틸설페이트, 벤조피렌, 고리포스파아미이드, 블레오마이신, 트리에틸멜라민, 아크릴아마이드 단량체, 질소 머스타드, 빈크리스틴, 디에폭시알칸들 (예를 들면, 디에폭시부탄), ICR-170, 포름알데하이드, 프로카바진 염산, 에틸렌 옥사이드, 디메틸니트로사민, 7,12 디메틸벤즈(사)안트라센, 클로르암부실, 헥사메틸포스포아마이드, 비설판, 및 아크리딘 염색약들을 포함한다 (예를 들면 Thomas D. Brock in Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology , Second Edition (1989) Sinauer Associates, Inc. , Sunderland, Mass., or Deshpande Mukund V., Appl . Biochem . Biotechnol. 36, 227 (1992)를 참조하라). 적합한 방사선 노출들은 이에 제한되는 것은 아니지만 자외선 방사선 조사 (임의적으로, 예를 들면 트리메틸프소라렌과 같은 화학적 제제들에 대한 노출과 조합으로), γ-방사선 조사, X-선들, 및 빠른 중성자 충돌을 포함한다. 세포에서 DNA 복구의 결함들을 도입하는 적합한 방법은 이에 제한되는 것은 아니지만 세포의 게놈에서 높은 빈도의 돌연변이들을 생성하는 (약 1개 돌연변이/100개 유전자들 내지 약 1개 돌연변이/10,000개 유전자들의 빈도) 돌연변이 DNA 복구 효소의 발현을 포함한다. DNA 복구 효소들을 인코딩하는 유전자들의 예들로는 이에 제한되는 것은 아니지만 Mut H, Mut S, Mut L, 및 Mut U, 또한 다른 종들에서 그의 유사체들 (예를 들면, MSH 1-6, PMS 1-2, MLH 1, GTBP, 및 ERCC-1)을 포함한다. 테르펜 합성효소 변이체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 획득하는 다른 방법들은 무세포 시험관내 시스템들의 조작 (예로, 핵산의 증폭을 위해 오류-빈발 PCR를 사용함), 이동성 DNA 요소의 세포 게놈 내 무작위 또는 표적화 삽입 (예로, 이동가능성 (transposable) 요소), 또는 시험관내 DNA 셔플링 (예로, 엑손 셔플링, 및 도메인 스와핑 등; 예를 들면 Ausubel et al., Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York (current edition); and Sambrook et al ., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, 3d. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001)를 참조하라)을 포함한다.
일정 구현예들에서, 테르펜 합성효소 변이체들은 β-파네센 합성효소, a-파네센 합성효소, 트리코디엔 합성효소, 패추롤 합성효소, 아모파디엔 합성효소, 발렌센 합성효소, 파네솔 합성효소, 네로리돌 합성효소, 및 누트카톤 합성효소로 이루어진 그룹으로부터 선택된 세스퀴테르펜 합성효소의 변이체들이다.
일정 구현예들에서, 테르펜 합성효소 변이체는 β-파네센 합성효소 변이체이다. 일정 이러한 구현예들에서, β-파네센 합성효소 변이체는 아르테미시아 애누아 (Artemisia annua)의 β-파네센 합성효소로부터 유래된다. 아르테미시아 애누아의 β-파네센 합성효소의 서열은 이전에 기술되었다 (Picaud, et al., (2005) Phytoc hemistry 66(9): 961-967). 아르테미시아 애누아의 β-파네센 합성효소의 뉴클레오타이드 서열은 진뱅크 기탁번호 제 AY835398호 하에 기탁되어 있고, 본 명세서에서 제공된 바와 같이 서열번호 112이다. 아르테미시아 애누아의 β-파네센 합성효소의 아미노산 서열은 진뱅크 기탁번호 제 AAX39387호 하에 기탁되어 있고, 본 명세서에서 제공된 바와 같이 서열번호 111이다.
일정 구현예들에서, β-파네센 합성효소 변이체는 서열번호 111에 주어진 바와 같지만 2번 위치에서 세린으로부터 아스파테이드로 아미노산 치환 (S2D 돌연변이)을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, β-파네센 합성효소 변이체는 서열번호 111에 주어진 바와 같지만 3번 위치에서 트레오닌으부터 아스파라진으로 아미노산 치환 (T3N 돌연변이)을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, β-파네센 합성효소 변이체는 서열번호 111에 주어진 바와 같지만 4번 위치에서 루이신으로부터 세린으로 아미노산 치환 (L4S 돌연변이)을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, β-파네센 합성효소 변이체는 서열번호 111에 주어진 바와 같지만 6번 위치에서 이소루이신으로부터 트레오닌으로 아미노산 치환 (I6T 돌연변이)을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, β-파네센 합성효소 변이체는 서열번호 111에 주어진 바와 같지만 9번 위치에서 발린으로부터 아스파트산으로 아미노산 치환 (V9D 돌연변이)을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, β-파네센 합성효소 변이체는 서열번호 111에 주어진 바와 같지만 11번 위치에서 페닐알라닌으로부터 세린으로 아미노산 치환 (F11S 돌연변이)을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, β-파네센 합성효소 변이체는 서열번호 111에 주어진 바와 같지만 20번 위치에서 발린으로부터 글루탐산으로 아미노산 치환 (V20E 돌연변이)을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, β-파네센 합성효소 변이체는 서열번호 111에 주어진 바와 같지만 24번 위치에서 발린으로부터 아스파트산으로 아미노산 치환 (V24D 돌연변이)을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, β-파네센 합성효소 변이체는 서열번호 111에 주어진 바와 같지만 35번 위치에서 메티오닌으로부터 트레오닌으로 아미노산 치환 (M35T 돌연변이)을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, β-파네센 합성효소 변이체는 서열번호 111에 주어진 바와 같지만 38번 위치에서 아스파라진으로부터 세린으로 아미노산 치환 (N38S 돌연변이)을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, β-파네센 합성효소 변이체는 서열번호 111에 주어진 바와 같지만 50번 위치에서 아스파트산으로부터 아스파라진으로 아미노산 치환 (D50N 돌연변이)을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, β-파네센 합성효소 변이체는 서열번호 111에 주어진 바와 같지만 61번 위치에서 루이신으로부터 글루타민으로 아미노산 치환 (L61Q 돌연변이)을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, β-파네센 합성효소 변이체는 서열번호 111에 주어진 바와 같지만 72번 위치에서 글루탐산으로부터 라이신으로 아미노산 치환 (E72K 돌연변이)을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, β-파네센 합성효소 변이체는 서열번호 111에 주어진 바와 같지만 80번 위치에서 아스파라진으로부터 아스파트산으로 아미노산 치환 (N80D 돌연변이)을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, β-파네센 합성효소 변이체는 서열번호 111에 주어진 바와 같지만 89번 위치에서 이소루이신으로부터 발린으로 아미노산 치환 (I89V 돌연변이)을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, β-파네센 합성효소 변이체는 서열번호 111에 주어진 바와 같지만 105번 위치에서 글루탐산으로부터 아스파트산으로 아미노산 치환 (E105D 돌연변이)을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, β-파네센 합성효소 변이체는 서열번호 111에 주어진 바와 같지만 115번 위치에서 이소루이신으로부터 메티오닌으로 아미노산 치환 (I115M 돌연변이)을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, β-파네센 합성효소 변이체는 서열번호 111에 주어진 바와 같지만 144번 위치에서 페닐알라닌으로부터 타이로신으로 아미노산 치환 (F114Y 돌연변이)을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, β-파네센 합성효소 변이체는 서열번호 111에 주어진 바와 같지만 196번 위치에서 트레오닌으로부터 세린으로 아미노산 치환 (T196S 돌연변이)을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, β-파네센 합성효소 변이체는 서열번호 111에 주어진 바와 같지만 211번 위치에서 세린으로부터 트레오닌으로 아미노산 치환 (S211T 돌연변이)을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, β-파네센 합성효소 변이체는 서열번호 111에 주어진 바와 같지만 251번 위치에서 루이신으로부터 메티오닌으로 아미노산 치환 (L251M 돌연변이)을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, β-파네센 합성효소 변이체는 서열번호 111에 주어진 바와 같지만 280번 위치에서 루이신으로부터 글루탐산으로 아미노산 치환 (L280Q 돌연변이)을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, β-파네센 합성효소 변이체는 서열번호 111에 주어진 바와 같지만 288번 위치에서 타이로신으로부터 페닐알라닌으로 아미노산 치환 (Y288F 돌연변이)을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, β-파네센 합성효소 변이체는 서열번호 111에 주어진 바와 같지만 319번 위치에서 트레오닌으로부터 세린으로 아미노산 치환 (T319S 돌연변이)을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, β-파네센 합성효소 변이체는 서열번호 111에 주어진 바와 같지만 357번 위치에서 글루탐산으로부터 발린으로 아미노산 치환 (E357V 돌연변이)을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, β-파네센 합성효소 변이체는 서열번호 111에 주어진 바와 같지만 359번 위치에서 글루탐산으로부터 트레오닌으로 아미노산 치환 (E359T 돌연변이)을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, β-파네센 합성효소 변이체는 서열번호 111에 주어진 바와 같지만 369번 위치에서 발린으로부터 루이신으로 아미노산 치환 (V369L 돌연변이)을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, β-파네센 합성효소 변이체는 서열번호 111에 주어진 바와 같지만 371번 위치에서 루이신으로부터 메티오닌으로 아미노산 치환 (L371M 돌연변이)을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, β-파네센 합성효소 변이체는 서열번호 111에 주어진 바와 같지만 385번 위치에서 트레오닌으로부터 알라닌으로 아미노산 치환 (T385A 돌연변이)을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, β-파네센 합성효소 변이체는 서열번호 111에 주어진 바와 같지만 398번 위치에서 이소루이신으로부터 발린으로 아미노산 치환 (I398V 돌연변이)을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, β-파네센 합성효소 변이체는 서열번호 111에 주어진 바와 같지만 423번 위치에서 발린으로부터 이소루이신으로 아미노산 치환 (V423I 돌연변이)을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, β-파네센 합성효소 변이체는 서열번호 111에 주어진 바와 같지만 433번 위치에서 메티오닌으로부터 이소루이신으로 아미노산 치환 (M433I 돌연변이)을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, β-파네센 합성효소 변이체는 서열번호 111에 주어진 바와 같지만 434번 위치에서 이소루이신으로부터 트레오닌으로 아미노산 치환 (I434T 돌연변이)을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, β-파네센 합성효소 변이체는 서열번호 111에 주어진 바와 같지만 442번 위치에서 글리신으로부터 알라닌으로 아미노산 치환 (G442A 돌연변이)을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, β-파네센 합성효소 변이체는 서열번호 111에 주어진 바와 같지만 442번 위치에서 글리신으로부터 아스파트산으로 아미노산 치환 (G442D 돌연변이)을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, β-파네센 합성효소 변이체는 서열번호 111에 주어진 바와 같지만 444번 위치에서 이소루이신으로부터 루이신으로 아미노산 치환 (I444L 돌연변이)을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, β-파네센 합성효소 변이체는 서열번호 111에 주어진 바와 같지만 446번 위치에서 트레오닌으로부터 아스파라진으로 아미노산 치환 (T446N 돌연변이)을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, β-파네센 합성효소 변이체는 서열번호 111에 주어진 바와 같지만 460번 위치에서 이소루이신으로부터 발린으로 아미노산 치환 (I460V 돌연변이)을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, β-파네센 합성효소 변이체는 서열번호 111에 주어진 바와 같지만 467번 위치에서 발린으로부터 이소루이신으로 아미노산 치환 (V467I 돌연변이)을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, β-파네센 합성효소 변이체는 서열번호 111에 주어진 바와 같지만 488번 위치에서 세린으로부터 페닐알라닌으로 아미노산 치환 (S488F 돌연변이)을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, β-파네센 합성효소 변이체는 서열번호 111에 주어진 바와 같지만 495번 위치에서 글루탐산으로부터 글리신으로 아미노산 치환 (E495G 돌연변이)을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, β-파네센 합성효소 변이체는 서열번호 111에 주어진 바와 같지만 505번 위치에서 글루탐산으로부터 발린으로 아미노산 치환 (E505V 돌연변이)을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, β-파네센 합성효소 변이체는 서열번호 111에 주어진 바와 같지만 526번 위치에서 트레오닌으로부터 세린으로 아미노산 치환 (T526S 돌연변이)을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, β-파네센 합성효소 변이체는 서열번호 111에 주어진 바와 같지만 531번 위치에서 프롤린으로부터 세린으로 아미노산 치환 (P531S 돌연변이)을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, β-파네센 합성효소 변이체는 서열번호 111에 주어진 바와 같지만 556번 위치에서 알라닌으로부터 발린으로 아미노산 치환 (A556V 돌연변이)을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, β-파네센 합성효소 변이체는 서열번호 111에 주어진 바와 같지만 572번 위치에서 메티오닌으로부터 라이신으로 아미노산 치환 (M572K 돌연변이)을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, β-파네센 합성효소 변이체는 서열번호 111에 주어진 바와 같지만 575번 위치에서 종결 코돈으로부터 라이신으로 아미노산 치환 (stop575K 돌연변이)을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, β-파네센 합성효소 변이체는 서열번호 111에 주어진 바와 같지만 348번 위치에서 아르기닌으로부터 라이신으로 아미노산 치환 (R348K 돌연변이)을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, β-파네센 합성효소 변이체는 서열번호 111에 주어진 바와 같지만 18번 위치에서 루이신으로부터 이소루이신으로 아미노산 치환 (L18I 돌연변이)을 포함하는 아미노산 서열을 가진다.
유전적으로 조작된 숙주 세포들
본 명세서에서 제공된 방법들은 올라간 세포내 FPP 수준을 포함하도록 또는 테르펜 합성효소 또는 테르펜 합성효소 변이체를 발현하도록 유전적으로 조작된 숙주세포를 획득하는 단계를 포함한다. 이러한 유전적으로 조작된 숙주세포는 FPP의 세포내 수준을 올리거나 테르펜 합성효소 또는 테르펜 합성효소 변이체를 발현하는 원하는 효과를 제공하도록 이러한 방식으로 뉴클레오타이드들의 삽입들, 결실들, 또는 변형들을 포함할 수 있다. 이러한 유전적 변형들은 특이적 효소의 사본수 또는 활성에서 감소 또는 증가 또는 변형들을 가져올 수 있다.
예를 들면, 숙주세포에서 효소의 사본수는 효소를 인코드하는 유전자의 전사를 변형하여 변경될 수 있다. 이것은 예를 들면 효소를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 사본수를 변형하는 것에 의해 (예로, 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 더 높은 또는 더 낮은 사본수 발현 벡터를 사용하는 것에 의해 또는 숙주세포의 게놈 내로 뉴클레오타이드 서열의 추가적인 사본들을 도입하는 것에 의해 또는 숙주세포의 게놈에서 뉴클레오타이드 서열을 결실하거나 파괴하는 것에 의해), 오페론의 폴리시스트론 mRNA 상에서 코딩 서열들의 순서를 변화하거나 각각 그 자신의 조절 요소들을 가진 개별 유전자들 내 오페론을 파괴하는 것에 의해, 또는 뉴클레오타이드 서열이 작동적으로 연결된 프로모터 또는 오퍼레이터의 강도를 증가시키는 것에 의해 달성될 수 있다. 임의적으로 또는 추가적으로, 숙주세포에서 효소의 사본수는 효소를 인코드하는 mRNA 해독의 수준을 변형하여 변경될 수 있다. 이것은, 예를 들면 mRNA의 안정성을 변형하고, 리보좀 결합 부위의 서열을 변형하고, 리보좀 결합 부위 및 효소 코딩 서열 사이의 거리 또는 서열을 변형하고, 효소 코딩 부위의 개시 코돈의 "상류" 또는 5'측면에 인접하여 위치하는 시트트론간 부위 전부를 변형하고, 헤어핀들 및 특수화된 서열들을 사용하여 mRNA 전사체의 3'-말단을 안정화하고, 효소의 코돈 사용도를 변형하고, 효소의 생합성에 사용되는 희귀한 코돈 tRNAs의 발현을 변경하고 및/또는, 예를 들면 그의 코딩 서열의 돌연변이를 통해 효소의 안정도를 증가시키는 것에 의해 달성될 수 있다.
숙주세포에서 효소의 활성은, 이에 제한되는 것은 아니지만 숙주세포에서 증가되거나 감소된 용해도를 나타내는 효소의 변형된 형태를 발현하거나, 효소의 활성이 저해되는 도메인이 결여된 효소의 변형된 형태를 발현하거나, 기질에 대한 더 높거나 더 낮은 Kcat 또는 더 낮거나 더 높은 Km을 가지는 효소의 변형된 형태를 발현하거나, 경로에서 또 다른 분자에 의해 피드백 또는 피드-포워드 조절에 의해 다소간 영향을 받는 효소의 변경된 형태를 발현하는 단계를 포함하는 많은 방식들로 변경될 수 있다.
본 명세서에서 제공된 방법들은 또한 이러한 테르펜 합성효소 또는 테르펜 합성효소 변이체를 자연적으로 발현하지 않는 숙주세포에서 테르펜 합성효소 또는 테르펜 합성효소 변이체를 발현하는 단계들을 포함한다. 숙주세포에서 테르펜 합성효소 또는 테르펜 합성효소 변이체의 발현은 숙주세포 에서 발현을 허용하는 조절 요소들의 통제 하에 테르펜 합성효소 또는 테르펜 합성효소 변이체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 숙주세포 내로 도입하여 달성될 수 있다. 일정 구현예들에서, 핵산은 염색체외 플라스미드이다. 다른 구현예들에서, 핵산은 숙주세포의 염색체 내로 뉴클레오타이드 서열을 통합할 수 있는 염색체 통합 벡터이다.
일정 구현예들에서, 둘 이상의 숙주 세포들에서 테르펜 합성효소들 또는 테르펜 합성효소 변이체들의 발현 수준들은 유사한 것이 필수적이다. 이것은 테르펜 합성효소 또는 테르펜 합성효소 변이체를 동일한 조절 요소들의 통제 하에 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열들을 포함하는 핵산들을 사용하여 달성될 수 있다. 이러한 핵산들은 염색체외 발현 벡터들로서 또는 테르펜 합성효소 또는 테르펜 합성효소 변이체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열들 및 조절 요소들을 숙주세포의 염색체 내로 통합하는 데 사용될 수 있다. 비교가능한 발현 수준들은 테르펜 합성효소 또는 테르펜 합성효소 변이체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열들을 포함하는 핵산들을 둘 이상의 숙주 세포들에서 일치하는 위치들로 표적화하고, 따라서 동일한 내인성 조절 요소들의 통제 하에 뉴클레오타이드 서열들을 두는 것에 의해서도 역시 달성될 수 있다. 유사한 조절 요소들의 사용과 추가하여, 비교가능한 발현 수준들은 둘 이상의 숙주 세포들에서 뉴클레오타이드 서열들의 유사한 사본수에도 역시 의존할 수 있다. 사본수들은 염색체외 발현 벡터들에서 유사하거나 일치하는 복제 원점들의 사용에 의해, 또는 둘 이상의 숙주 세포들의 염색체 내로 뉴클레오타이드 서열들의 통합을 위한 염색체 통합 제작물들의 유사한 유형들의 사용 및 수들에 의해 조절될 수 있다. 핵산들의 추가적인 많은 특징들은 인코드된 테르펜 합성효소들 또는 테르펜 합성효소 변이체들의 발현 수준에 영향을 줄 수 있고 (예로, 단백질 또는 mRNA 안정도, 리보좀 결합 부위의 서열, 리보좀 결합 부위 및 개시 코돈 간의 거리, 및 코돈 사용도), 이들 모두는 제공된 방법들에서 요구될 때 유사한 발현 수준들을 입증하도록 변형될 수 있다.
핵산들은 제한되지 않고도 당업자가 숙지하고 있는 방법이라면 모두에 의해 미생물들 내로 도입될 수 있다 (예를 들면, Hinnen et al . (1978) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 75:1292-3; Cregg et al . (1985) Mol . Cell . Biol . 5:3376-3385; Goeddel et al . , eds, 1990, Methods in Enzymology, vol. 185, Academic Press, Inc. , CA; Krieger, 1990, Gene Transfer and Expression -- A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; Sambrook et al. , 1989, Molecular Cloning -- A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY; 및 Ausubel et al . , eds. , Current Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY를 참조하라). 대표적인 기법들로는 이에 제한되는 것은 아니지만 원형질화 (spheroplasting), 전기천공 (electroporation), PEG 1000 매개성 형질전환, 또한 리튬 아세테이트 또는 리튬 클로라이드 매개성 형질전환을 포함한다.
일정 구현예들에서, 숙주세포를 유전적으로 변형하는 데 사용되는 핵산은 형질전환된 숙주 세포들의 선별을 위해 또한 외래 DNA를 유지하도록 숙주 세포 상에 선택적 압력을 두는 데 유용한 하나 이상의 선택가능한 마커들을 포함한다.
일정 구현예들에서, 선택가능한 마커는 항생제 저항성 마커이다. 항생제 저항성 마커들의 설명적 예들로는 이에 제한되는 것은 아니지만 BLA , NAT1 , PAT , AUR1 -C, PDR4 , SMR1 , CAT, 마우스 dhfr, HPH , DSDA , KAN R , 및 SH BLE 유전자 산물들을 포함한다. 대장균으로부터 나온 BLA 유전자 산물은 베타-락탐 항생제들 (예로, 좁은-스펙트럼의 세팔로스포릴류, 세팔로마이신류, 및 카바페넴류 (에르타페넴), 세파만돌, 및 세포페라존)에 대한 또한 테모실린을 제외한 항-그램-음성-박테리아 모두에 대한 저항성을 부여하고; S. noursei로부터 나온 NAT1 유전자 산물은 나르세오트리신 (nourseothricin)에 대한 저항성을 부여하고; S. viridochromogenes Tu94로부터 나온 PAT 유전자 산물은 비알로포스 (bialophos)에 대한 저항성을 부여하고; 사카로마이세스 세레비시애로부터 나온 AUR1 -C 유전자 산물은 아우에로바시딘 A (Auerobasidin A, AbA)에 대한 저항성을 부여하고; PDR4 유전자 산물은 세룰레닌 (cerulenin)에 대한 저항성을 부여하고; SMR1 유전자 산물은 셀포메투론 메틸 (sulfometuron methyl)에 대한 저항성을 부여하고; Tn9 트랜스포존으로부터 나온 CAT 유전자 산물은 클로르암페니콜에 대한 저항성을 부여하고; 마우스 dhfr 유전자 산물은 메토트렉세이트 (methotrexate)에 대한 저항성을 부여하고; 크렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumonia)의 HPH 유전자 산물은 하이그로마이신 B (Hygromycin B)에 대한 저항성을 부여하고; 대장균의 DSDA 유전자 산물은 단독 질소원으로서 D-세린을 가진 플레이트들 상에서 세포들이 성장하도록 허용하고; Tn903 트랜스포존의 KAN R 유전자는 G418에 대한 저항성을 부여하고; 또한 Streptoalloteichus hindustanus로부터 나온 SH BLE 유전자 산물은 제오신 (블레오마이신)에 대한 저항성을 부여한다. 일정 구현예들에서, 본 항생제 저항성 마커는 본 명세서에서 기재된 유전적으로 변형된 숙주세포가 분리된 이후에 결실된다.
일정 구현예들에서, 선택가능한 마커는 유전적으로 변형된 미생물에서 영양요구성 (예로, 영양적 요구성)을 회복시킨다. 이러한 구현예들에서, 부모 미생물은 아미노산 또는 뉴클레오타이드 생합성 경로에서 기능하고, 비기능성일 때, 부모 세포를 하나 이상의 영양분들로의 보충이 없이는 배지에서 성장할 수 없게 하는 하나 이상의 유전자 산물에서 기능적 파괴를 포함한다. 이러한 유전자 산물들은 효모에서 이에 제한되는 것은 아니지만 HIS3 , LEU2 , LYS1 , LYS2, MET15, TRP1 , ADE2 , 및 URA3 유전자 산물들을 포함한다. 다음으로 영양요구성 표현형은 파괴된 유전자 산물의 기능적 사본을 인코딩하는 발현 벡터 또는 염색체 통합 제작물로 부모 세포를 형질전환하여 회복될 수 있고, 생성된 유전적으로 변형된 숙주세포는 부모 세포의 영양요구성 표현형의 소실을 기초로 하여 선택될 수 있다. 선택가능한 마커로서 URA3 , TRP1, 및 LYS2 유전자들은 양성 및 음성 선별들 둘 다가 가능하기 때문에 현저한 장점을 가진다. 양성 선별은 URA3 , TRP1, 및 LYS2 돌연변이들의 영양요구성 보완에 의해 수행되는 한편, 음성 선별은 원영양성 균주들의 성장은 막지만 URA3 , TRP1, 및 LYS2 돌연변이들의 성장은 각각 허용하는 특이적 저해제들, 예로 5-플루오로-오로트산 (FOA), 5-플루오로안트라닐산, 및 α-아미노아디프산 (aAA)을 각각 기초로 한다.
다른 구현예들에서, 선택가능한 마커들은 기지의 선별 방법에 의해 확인될 수 있는 다른 비치사성 결함들 또는 표현형들을 구출한다.
숙주세포들을 성장시키는 단계
본 발명은 개선된 생체내 성능을 가지는 테르펜 합성효소 변이체들을 개발하는, 또한 테르펜들을 생산하는 방법들을 제공한다. 본 방법들은 일반적으로 탄소원을 포함하는 적합한 배지에서 적합한 조건들 하에 숙주세포를 성장시키는 단계가 관여한다.
미생물들을 성장시키는 적합한 조건들 및 적합한 배지는 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 일정 구현예들에서, 적합한 배지는 예를 들면 유도화 화합물 (예로, 유전자 산물을 인코딩하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열들이 유도가능한 프로모터의 조절 하에 있음), 억제 화합물 (repressing compound) (예로, 유전자 산물을 인코딩하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열들이 억제가능한 프로모터의 조절 하에 있음), 또는 선택 제제 (예로, 유전적 변형들을 포함하는 미생물들을 선별하는 항생제)와 같은 하나 이상의 추가적인 제제들로 보충된다.
일정 구현예들에서, 탄소원은 단당류 (단순한 당), 이당류, 다당류, 비-발효가능한 탄소원, 또는 하나 이상의 그들의 조합들이다. 적합한 단당류들의 비제한적인 예들로는 포도당, 갈락토스, 만노스, 과당, 리보스 및 그의 조합들을 포함한다. 적합한 이당류들의 비제한적인 예들로는 전분, 글리코겐, 셀루로스, 키틴, 및 그의 조합들을 포함한다. 적합한 비-발효가능한 탄소원들의 비제한적인 예들로는 아세테이트 및 글리세롤을 포함한다.
한 가지 관점에서, 본 발명은 테스트 테르펜 합성효소를 포함하는 숙주세포의 성장률을 기초로 하여 개선된 생체내 성능을 가진 테르펜 합성효소를 확인하는 방법을 제공한다. 숙주세포의 성장률은, 예를 들면 정의된 시간의 기간 동안 액체 배지에서 숙주세포를 성장시키고, 다음으로 한천 배지 상에서 배양액의 모두 또는 분량을 도말하고, 최종적으로 한천 배지 상에서 나오는 콜로니들의 수를 점수 매기어 결정될 수 있다. 임의적으로, 숙주세포의 성장율은 정의된 시간의 기간 이후에 배양액의 생물량을 측정하여 결정된다. 생물량은 액체 배양액의 밀도를 결정하여, 예로 UV 분광분석법에 의해 또는 헥소스아민 및 에르고스테롤과 같은 생물량 지표 분자들을 정량하여 측정될 수 있다 (Frey et al. (1992) Biol. Fertil. Soils 13: 229-234; Newell (1992) p. 521-561. In G. C. Carroll and D. T. Wicklow (ed.), The fungal community: its organization and role in the ecosystem, 2nd ed. Marcel Dekker Inc., New York).
테르펜들을 생산하는 단계
본 발명은 테르펜들을 생산하는 방법들을 제공한다.
일정 구현예들에서, 테르펜은 발효 배지 리터 당 약 10 그램 이상의 양으로 생산된다. 일정 이러한 구현예들에서, 테르펜은 세포 배양액 리터 당 약 10으로부터 약 50 그램까지, 약 15 그램 이상, 약 20 그램 이상, 약 25 그램 이상, 또는 약 30 그램 이상의 양으로 생산된다.
일정 구현예들에서, 테르펜은 건조 세포 무게의 그램 당 약 50 밀리그램 이상의 양으로 생산된다. 일정 이러한 구현예들에서, 테르펜은 건조 세포 무게의 그램 당 약 50으로부터 약 1500 밀리그램까지, 약 100 밀리그램 이상, 약 150 밀리그램 이상, 약 200 밀리그램 이상, 약 250 밀리그램 이상, 약 500 밀리그램 이상, 약 750 밀리그램 이상, 또는 약 1000 밀리그램 이상의 양으로 생산된다.
일정 구현예들에서, 테르펜은 세포 배양액의 단위 부피 당을 기초로 하여, 첫 번째 이종유래 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않는 숙주세포에 의해 생산되는 테르펜의 양보다 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 75배, 적어도 약 100배, 적어도 약 200배, 적어도 약 300배, 적어도 약 400배, 적어도 약 500배, 또는 적어도 약 1,000배 이상인 양으로 생산된다.
일정 구현예들에서, 테르펜은 단위 건조세포 무게 당을 기초로 하여, 첫 번째 이종유래 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않는 숙주세포에 의해 생산되는 테르펜의 양보다 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 75배, 적어도 약 100배, 적어도 약 200배, 적어도 약 300배, 적어도 약 400배, 적어도 약 500배, 또는 적어도 약 1,000배 이상인 양으로 생산된다.
일정 구현예들에서, 테르펜은 단위 시간 당 세포 배양액의 단위 부피 당을 기초로 하여, 첫 번째 이종유래 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않는 숙주세포에 의해 생산되는 테르펜의 양보다 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 75배, 적어도 약 100배, 적어도 약 200배, 적어도 약 300배, 적어도 약 400배, 적어도 약 500배, 또는 적어도 약 1,000배 이상인 양으로 생산된다.
일정 구현예들에서, 테르펜은 단위 시간 당 단위 건조세포 무게 당을 기초로 하여, 첫 번째 이종유래 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않는 숙주세포에 의해 생산되는 테르펜의 양보다 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 75배, 적어도 약 100배, 적어도 약 200배, 적어도 약 300배, 적어도 약 400배, 적어도 약 500배, 또는 적어도 약 1,000배 이상인 양으로 생산된다.
테르펜들을 추출하고 정량하는 단계
본 발명의 유전적으로 변형된 숙주세포에 의해 생산된 테르펜은 당해 기술분야에 알려져 있는 적합한 분리 및 정제 방법들이라면 모두를 사용하여 발효로부터 분리될 수 있다.
일정 구현예들에서, 테르펜을 포함하는 유기상은 원심분리에 의해 발효로부터 분리된다. 다른 구현예들에서, 테르펜을 포함하는 유기상은 발효로부터 자발적으로 분리된다. 보다 다른 구현예들에서, 테르펜을 포함하는 유기상은 탈에멀전화제 및/또는 핵형성화 제제 (nucleating agent)를 발효 반응 내로 첨가하여 발효로부터 분리된다. 핵형성화 제제의 도시적 예들로는 테르펜 자체의 소방울들 (droplets) 또한 도데칸, 이소프로필 미리스트레이트, 및 메틸 올레이트와 같은 유기 용매들을 포함한다.
일정 구현예들에서, 테르펜은 유기상에서 존재할 수 있는 다른 산물들로부터 분리된다. 일정 구현예들에서, 분리는 흡착, 증류, 기체-액체 추출 (압출), 액체-액체 추출 (용매 추출), 초여과, 및 표준 크로마토그래피 기법들을 사용하여 달성된다.
일정 구현예들에서, 테르펜은 순수하고, 예로 적어도 40% 순도, 적어도 50% 순도, 적어도 60% 순도, 적어도 70% 순도, 적어도 80% 순도, 적어도 90% 순도, 적어도 95% 순도, 적어도 98% 순도, 또는 98% 이상의 순도이고, 테르펜의 맥락에서 "순수한 (pure)"은 다른 테르펜들 또는 오염물들이 없는 테르펜을 말한다.
테르펜 생산은, 이에 제한되는 것은 아니지만 기체 크로마토그래피 (GC), 기체 크로마토그래피-질량 분광분석법 (GC/MS), 핵자기 공명 (NMR), RAMAN 분광분석법, 광학적 흡착법 (UV/VIS), 자외선 분광분석법 (IR), 고해상도 액체 크로마토그래피 (HPLC), 액체 크로마토그래피-질량 분광분석법 (LC/MS), 이온 크로마토그래피-질량 분광분석법, 박막 크로마토그래피, 간헐적 전류측정 검출법 (pulsed amperometric detection), 및 UV-가시광선 분광분석법을 포함하는 당해 기술분야에 숙지되어 있는 잘 알려진 방법들을 사용하여 바로 정량될 수 있다.
숙주 세포들에 의해 생산된 테르펜들은, 이에 제한되는 것은 아니지만 크로마토그래피, 추출법, 용매 추출법, 막 분리법, 전기투석법, 역삼투압법, 화학적 유도체화, 및 결정화를 포함하는 다양한 방법들이라면 모두를 사용하여 회수될 수 있다.
테르펜 정량 또는 분리를 개선하는 추가적인 가공 단계들은 이에 제한 되는 것은 아니지만 숙주 세포들을 파쇄하여 여는 것을 포함한다. 적합한 방법들은 이에 제한되는 것은 아니지만 볼텍싱, 초음파 파쇄, 유리 비드들의 사용을 포함한다. 다른 가공 단계들은 유해한 세포 잔재물을 상청액으로부터 제거하도록 원심분리를 포함할 수 있다.
실시예들
다음의 특정한 실시예들은 본 발명을 상술하도록 의도되고 청구항들의 범위를 제한하는 것으로서 참작되지 않아야 한다.
실시예 1
본 실시예는 테르펜 합성효소 변이체들의 생성 및 특성분석에 유용한 DNA 제작물들을 만드는 방법들을 기술하고 있다.
발현 플라스미드 pAM36-MevT66는 MevT66 오페론을 벡터 pAM36 내로 삽입하여 생성되었다. 벡터 pAM36는 pACYC184 벡터 (진뱅크 기탁번호 XO6403)로부터 tet 저항성 유전자를 제거하고 AscI-SfiI-AsiSI-XhoI-PacI-FsIl-PmeI 제한효소 부위들을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 카세트를 벡터 내로 첨가하여 생성되었다. MevT66 오페론은 편재하는 전구체 아세틸-CoA를 (R)-메발로네이트로 다함께 변환시키는 한 벌의 MEV 경로 효소들, 즉 아세토아세틸-CoA 티올라제, HMG-CoA 합성효소, 및 HMG-CoA 환원효소를 인코드하였다. MevT66 오페론은 합성적으로 생성되었고 대장균에서 발현을 위해 코돈-최적화된 대장균의 atoB 유전자 (진뱅크 기탁번호 NC_000913 REGION: 2324131..2325315; 아세토아세틸-CoA 티올라제를 인코드함), 대장균에서 발현을 위해 코돈-최적화된 사카로마이세스 세레비시애의 ERG13 유전자의 코딩 서열 (진뱅크 기탁번호 X96617, REGION: 220..1695; HMG-CoA 합성효소를 인코드함), 및 대장균에서 발현을 위해 코돈-최적화된 사카로마이세스 세레비시애의 HGM1 유전자의 절단된 코딩 서열 (진뱅크 기탁번호 M22002, REGION: 1777..3285; 절단된 HMG-CoA 환원효소를 인코드함)을 포함하였다. 합성적으로 생성된 MevT66 오페론은 표준 pUC 또는 pACYC 기원 벡터와 같은 클로닝 벡터 내로 클론되었고, 이것은 다시 끼어있는 SfiI 및 AsiSI 제한효소 부위들을 가지고 PCR 증폭되었고, 증폭된 DNA 단편은 SfiI 및 AsiSI 제한효소들을 사용하여 소화되었고, MevT66 오페론을 포함하는 대략 4.2 kb DNA 단편은 젤 정제되었고, 정제된 DNA 단편은 pAM36 벡터의 SfiI 및 AsiSI 제한효소 부위들 내로 삽입되었고, 발현 플라스미드 pAM36-MevT66를 수득하였다.
발현 플라스미드 pMevB-Cm는 MevB 오페론을 pBBR1MCS-1 벡터 내로 삽입하여 생성되었다. MevB 오페론은 (R)-메발로네이트를 IPP로 다함께 전환하는 한 벌의 효소들, 즉 메발로네이트 키나제, 포스포메발로네이트 키나제, 및 메발로네이트 피로포스페이트 탈탄산화효소를 인코드한다. ERG12 유전자의 코딩 서열 (진뱅크 기탁번호 X55875, REGION: 580..1911; 메발로네이트 키나제를 인코드함), ERG8 유전자의 코딩 서열 (진뱅크 기탁번호 Z49939, REGION: 3363..4718; 포스포메발로네이트 키나제를 인코드함), 및 MVD1 유전자의 코딩 서열 (진뱅크 기탁번호 X97557, REGION: 544..1734; 메발로네이트 피로포스페이트 탈탄산화효소를 인코드함)은 사 카로마이세스 세레비시애 게놈 DNA로부터 PCR 증폭되었다. 적절한 프라이머 서열들을 선택하여, ERG12 및 ERG8 코딩 서열들의 종결 코돈들은 리보좀 결합 부위들을 도입하도록 PCR 증폭 동안 TAA로부터 TAG까지 변화되었다. PCR 산물들은 서열 중복 연장 (SOE; Ho , et al , 1989)에 의해 MevB 오페론 내로 다함께 스프라이싱되었다. 3' A 오버행들의 첨가 이후에, MevB 오페론은 TA 클로닝 벡터 pCR4 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 내로 라이게이션되었다. MevB 오페론은 PstI 제한효소를 사용하여 클로닝 제작물을 소화하는 것에 의해 절단되고 (excised), MevB 오페론을 포함하는 대략 4.2 kb DNA 단편이 젤 정제되었고, 정제된 DNA 단편은 벡터 pBBR1MCS-1의 PstI 제한효소 부위 내로 라이게이션되었고 (Kovach et al ., Gene 166(1): 175-176 (1995)), 발현 플라스미드 pMevB-Cm를 수득하였다.
발현 플라스미드 pMBI는 MBI 오페론을 pBBR1MCS-3 벡터 내로 삽입하여 생성되었다. MBI 오페론은 MevB 오페론과 동일한 효소들, 뿐만 아니라 IPP의 DMAPP로 전환을 촉매화하는 이소펜테닐 피로포스파타제 이성질화효소를 인코드한다. MBI 오페론은 대장균 게놈 DNA로부터 idi 유전자 (진뱅크 기탁번호 AF119715) 의 코딩 서열을 XmaI 제한효소 부위를 그들의 5' 말단들에 포함하는 프라이머들을 사용하여 PCR 증폭하여 생성되었다. PCR 산물은 XmaI 제한효소를 사용하여 소화되었고, idi 코딩 서열을 포함하는 0.5 kb DNA 단편은 젤 정제되었고, 정제된 DNA 단편은 발현 플라스미드 pMevB-Cm의 XmaI 제한효소 부위 내로 삽입되었고 idi는 MevB 오페론의 3'말단에 두었다. 다음으로 MBI 오페론은 벡터 pBBR1MCS-3 (Kovach et al ., Gene 166(1): 175-176 (1995))의 SalI 및 SacI 제한효소 부위 내로 서브클론되었고 발현 플라스미드 pMBI를 수득하였다.
발현 플라스미드 pMBIS은 ispA 유전자를 발현 플라스미드 pMBI 내로 삽입하여 생성되었다. ispA 유전자는 IPP 및 DMAPP의 FPP로 응축을 촉매화하는 파네실 피로포스페이트 합성효소를 인코드한다. ispA 유전자 (진뱅크 기탁번호 D00694, REGION: 484..1383)의 코딩 서열은 SacⅡ 제한효소 부위를 가진 전방향 프라이머 및 SacI 제한효소 부위를 가진 역방향 프라이머를 사용하여 대장균 게놈 DNA로부터 PCR 증폭되었다. 증폭된 PCR 산물은 SacⅡ 및 SacI 제한효소들을 사용하여 소화되었고, ispA 코딩 서열을 포함하는 0.9 kb DNA 단편은 젤 정제되었고, 정제된 DNA 단편은 pMBI의 SacⅡ 및 SacI 제한효소 부위들 내로 라이게이션되었고, ispA 코딩 서열을 idi 및 MevB 오페론의 3'에 두었고 발현 플라스미드 pMBIS를 수득하였다.
발현 플라스미드 pAM25는 MevT66 오페론을 pAM29 벡터 내로 삽입하여 생성되었다. pAM29 벡터는 p15A 복제원점 및 pZS24-MCS1 벡터 (Lutz and Bujard (1997) Nucl Acids Res. 25:1203-1210)로부터 나온 카나마이신 저항성을 부여하는 유전자를 올리고뉴클레오타이드-생성된 lacUV5 프로모터와 조립하여 제작되었다. MevT66 오페론을 포함하는 DNA 합성 제작물 (상기 pAM36-MevT66에 대한 기재를 참조하라)은 EcoRI 및 Hind Ⅲ 제한효소들을 사용하여 소화되었고, MevT66 오페론을 포함하는 대략 4.2 kb DNA 단편은 젤 정제되었고, 정제된 DNA 단편은 pAM29의 EcoRI 및 HindⅢ 제한효소 부위들 내로 라이게이션되었고, 발현 플라스미드 pAM25를 수득하였다.
발현 플라스미드 pAM41는 발현 플라스미드 pAM25 내로 사카로마이세스 세레비시애 HMG-CoA 환원효소의 절단된 버전을 인코드하는 HMG1유전자의 절단된 코딩 서열을 스태필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus ) HMG-CoA 환원효소를 인코드하는 mvaA 유전자 (진뱅크 기탁번호 BA000017, REGION: 2688925..2687648)의 코딩 서열로 대체하여 생성되었다. mvaA 유전자의 코딩 서열은 스태필로코커스 아 우레우스 아종 아우레우스 (ATCC 70069) 게놈 DNA로부터 SpeI 제한효소 부위들을 포함하는 프라이머들을 사용하여 PCR 증폭되었고, PCR 산물은 SpeI 제한효소를 사용하여 소화되었고, mvaA 코딩 서열을 포함하는 대략 1.3 kb DNA 단편은 젤 정제되었다. 발현 플라스미드 pAM25는 HindⅢ 제한효소를 사용하여 소화되었고, 말단의 오버행들은 T4 DNA 중합효소를 사용하여 블런트화되었고, 선형의 벡터 골격은 SpeI 제한효소를 사용하여 부분적으로 소화되었고, 절단된 HMG1 코딩 서열이 결여된 대략 4.8 kb DNA 단편은 젤 정제되었다. 정제된 DNA 단편들은 라이게이션되었고, 발현 플라스미드 pAM41를 수득하였다.
발현 플라스미드 pAM43는 MBIS 오페론을 발현 플라스미드 pAM36-MevT66 내로 삽입하여 생성되었다. MBIS 오페론은 pMBIS로부터 5' XhoI 제한효소 부위 및 3' PacI 제한효소 부위를 포함하는 프라이머들을 사용하여 PCR 증폭되었고, 증폭된 PCR 산물은 XhoI 및 PacI 제한효소들을 사용하여 소화되었고, MBIS 오페론을 포함하는 대략 5.4 kb DNA 단편은 젤 정제되었고, 정제된 DNA 단편은 발현 플라스미드 pAM36-MevT66의 XhoI PacI 제한효소 부위 내로 라이게이션되었고, 발현 플라스미드 pAM43를 수득하였다.
발현 플라스미드 pAM45는 lacUV5 프로모터들을 발현 플라스미드 pAM43의 MBIS 및 MevT66 오페론들 앞에 삽입하여 생성되었다. lacUV5 프로모터를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 단편은 올리고뉴클레오타이드들로부터 합성되었고, pAM43의 AscI SfiI 및 AsiSI XhoI 제한효소 부위들 내로 삽입되었고, 발현 플라스미드 pAM45를 수득하였다.
발현 플라스미드 pAM52는 발현 플라스미드 pAM41 내에 사카로마이세스 세레비시애 HMG-CoA 합성효소를 인코드하는 ERG13 유전자의 코딩 서열을 스태필로코커 스 아우레우스 HMG-CoA 합성효소를 인코드하는 mvaS 유전자 (진뱅크 기탁번호 BA000017, REGION: 2689180..2690346)의 코딩 서열로 대체하여 생성되었다. mvaS 유전자의 코딩 서열은 스태필로코커스 아우레우스 아종 아우레우스 (ATCC 70069) 게놈 DNA로부터 PCR 증폭되었고, 증폭된 DNA 단편은 가이저 등의 방법에 따라 pAM41에서 HMG1 유전자의 코딩 서열을 대체하도록 PCR 프라이머로서 사용되었고 (Geiser et al ., BioTechniques 31:88-92 (2001)), 발현 플라스미드 pAM52를 수득하였다.
발현 플라스미드 pAM97는 발현 플라스미드 pAM45에서 MevT66 오페론을 발현 플라스미드 pAM52의 (atoB(opt):mvaS:mvaA) 오페론으로 대체하여 생성되었다. 발현 플라스미드 pAM45는 AsiSI 및 SfiI 제한효소들을 사용하여 소화되었고, MevT66 오페론이 결여된 대략 8.3 kb DNA 단편이 젤 정제되었다. pAM52의 (atoB(opt):mvaS:mvaA) 오페론은 SfiI 및 AsiSI 제한효소 부위를 포함하는 프라이머들을 사용하여 PCR 증폭되었고, PCR 산물은 SfiI 및 AsiSI 제한효소들을 사용하여 소화되었고, (atoB(opt):mvaS:mvaA) 오페론을 포함하는 대략 3.8 kb DNA 단편은 젤 정제되었다. 정제된 DNA 단편들은 라이게이션되고, 발현 플라스미드 pAM97를 수득하였다.
발현 플라스미드 pAM765는 발현 플라스미드 pAM97에서 사카로마이세스 세레비시애 메발로네이트 키나제를 인코드하는 ERG12 유전자의 코딩 서열을 스태필로코 커스 아우레우스 메발로네이트 키나제를 인코드하는 mvaK1 유전자 (진뱅크 기탁번호 AAG02424)의 코딩 서열로 대체하여 생성되었다. 스태필로코커스 아우레우스 메발로네이트 키나제는 FPP에 의한 피드백 저해에 대해 덜 민감하고 (Voynova et al . (2004) J. Bacteriol . 186:61-67), 따라서 발현 플라스미드 pAM765는 발현 플라스미드 pAM97보다 숙주세포에서 FPP의 더 많은 생산을 유도할 수 있다. mvaK1 유전자의 코딩 서열은 발현 플라스미드로부터 PCR 증폭되었고, 대략 0.9 kb PCR 산물이 젤 전제되었다. PMK-PMD-idi-ispA 오페론은 pAM97로부터 PCR 증폭되었고, 대략 4.1 kb PCR 산물이 젤 정제되었다. 정제된 PCR 산물들이 다함께 연결되었고, 연결된 산물은 젤 정제되었다. 정제된 연결된 산물 및 pAM97는 XhoI 및 SacI 제한효소들을 사용하여 소화되었고, 소화된 DNA 단편들은 젤 정제되었고, 정제된 DNA 단편들은 라이게이션되었고, 발현 플라스미드 pAM765 (서열번호 1)를 수득하였다.
플라스미드 pAM489는 벡터 pAM471의 PGAL10-ERG20_PGAL1-tHMGR 삽입체를 벡터 pAM466 내로 삽입하여 생성되었다. 벡터 pAM471는 사카로마이세스 세레비시애의 ERG20 유전자의 코딩 서열 (ERG20 뉴클레오타이드 위치들 1번 내지 1208번; ATG 개시 코돈의 A가 뉴클레오타이드 1번) (ERG20)을 포함하는 DNA 단편 PGAL10-ERG20_PGAL1-tHMGR, 사카로마이세스 세레비시애의 분지된 (divergent) GAL1 및 GAL10 프로모터를 포함하는 게놈 좌위 (GAL1 뉴클레오타이드 위치 -1번 내지 -668번) (PGAL), 및 사카로마이세스 세레비시애의 HMG1 유전자의 절단된 코딩 서열 (HMG1 뉴클레오타이드 위치들 1586번 내지 3323번) (tHMGR)을 TOPO 제로 블런트 Ⅱ 클로닝 벡터 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 내로 삽입하여 생성되었다. 벡터 pAM466는 뉴클레오타이드 위치 -856번으로부터 위치 548번까지 연장되고 염기들 -226번 및 -225번 사이에 인위적 내부 XmaI 제한효소 부위를 보유하는 사카로마이세스 세레비시애의 야생형 TRP1 좌위의 분절을 포함하는 DNA 단편 TRP1-856 내지 +548을 TOPO TA pCR2.1 클로닝 벡터 (Invitrogen,q Carlsbad, CA) 내에 삽입하여 생성되었다. DNA 단편 PGAL10-ERG20_PGAL1-tHMGR 및 TRP1-856 내지 + 548는 표 1에 개괄된 바와 같이 PCR 증폭에 의해 생성되었다. pAM489의 제작을 위해, 400 ng의 pAM471 및 100 ng의 pAM466가 XmaI 제한효소 (New England Biolabs, Ipswich, MA)을 사용하여 완전하게 소화되었고, PGAL10-ERG20_PGAL1-tHMGR 삽입체 및 선형화된 pAM466 벡터에 해당하는 DNA 단편들은 젤 정제되었고, 정제된 삽입체의 4 몰라 당량들이 정제된 선형화된 벡터의 1 몰라 당량과 라이게이션되었고, pAM489를 수득하였다. 도 1R은 pAM489의 TRP1_PGAL10-ERG20_PGAL1-tHMGR_TRP 삽입체의 지도 및 서열번호 2의 그의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
Figure 112013079359371-pct00001
플라스미드 pAM491는 벡터 pAM472의 PGAL10-ERG13_PGAL1-tHMGR 삽입체를 벡터 pAM467 내로 삽입하여 생성되었다. 벡터 pAM472는 사카로마이세스 세레비시애의 ERG13 유전자의 코딩 서열 (ERG13 뉴클레오타이드 위치들 1번 내지 1626번) (ERG13)을 포함하는 DNA 단편 PGAL10-ERG13_PGAL1-tHMGR, 사카로마이세스 세레비시애의 분지된 GAL1 및 GAL10 프로모터를 포함하는 게놈 좌위 (GAL1 뉴클레오타이드 위치 -1번 내지 -668번) (PGAL), 및 사카로마이세스 세레비시애의 HMG1 유전자의 절단된 ORF (HMG1 뉴클레오타이드 위치 1586번 내지 3323번) (tHMGR)를 TOPO 제로 블런트 Ⅱ 클로닝 벡터 내로 삽입하여 생성되었다. 벡터 pAM467는 뉴클레오타이드 위치 -723번으로부터 위치 -224번까지 연장되고 염기들 -224번 및 -223번 사이에 인위적 내부 XmaI 제한효소 부위를 보유하는 사카로마이세스 세레비시애의 야생형 URA3 좌위의 분절을 포함하는 DNA 단편 URA3-723 내지 701를 TOPO TA pCR2.1 클로닝 벡터 내로 삽입하여 생성되었다. DNA 단편들 PGAL10-ERG13_PGAL1-tHMGR 및 URA3-723 내지 701는 표 2에 개괄된 바와 같이 PCR 증폭에 의해 생성되었다. pAM491의 제작을 위해, 400 ng의 pAM472 및 100 ng의 pAM467가 XmaI 제한효소를 사용하여 완전하게 소화되었고, ERG13-PGAL-tHMGR 삽입체 및 선형화된 pAM467 벡터에 해당하는 DNA 단편들이 젤 정제되었고, 정제된 삽입체의 4 몰라 당량들이 정제된 선형화된 벡터의 1 몰라 당량과 라이게이션되었고, pAM491을 수득하였다. 도 1S는 pAM491의 URA3_PGAL10-ERG13_PGAL1-tHMGR_URA3 삽입체의 지도 및 서열번호 13의 그의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
Figure 112013079359371-pct00002
플라스미드 pAM493는 벡터 pAM473의 PGAL10-IDI1_PGAL1-tHMGR 삽입체를 벡터 pAM468 내로 삽입하여 생성되었다. 벡터 pAM473는 사카로마이세스 세레비시애의 IDI1 유전자의 코딩 서열 (IDI1 뉴클레오타이드 위치 1번 내지 1017번) (IDI1)을 포함하는 DNA 단편 PGAL10-IDI1_PGAL1-tHMGR, 사카로마이세스 세레비시애의 분지된 GAL1 및 GAL10 프로모터를 포함하는 게놈 좌위 (GAL1 뉴클레오타이드 위치 -1번 내지 -668번) (PGAL), 및 사카로마이세스 세레비시애의 HMG1 유전자의 절단된 ORF (HMG1 뉴클레오타이드 위치 1586번 내지 3323번) (tHMGR)를 TOPO 제로 블런트 Ⅱ 클로닝 벡터 내로 삽입하여 생성되었다. 벡터 pAM468은 뉴클레오타이드 위치 -225번으로부터 위치 653번까지 연장되고 염기들 -226번 및 -225번 사이에 인위적 내부 XmaI 제한효소 부위를 보유하는 사카로마이세스 세레비시애의 야생형 ADE1 좌위의 분절을 포함하는 DNA 단편 ADE1-825 내지 653을 TOPO TA pCR2.1 클로닝 벡터 내로 삽입하여 생성되었다. DNA 단편들 PGAL10-IDI1_PGAL1-tHMGR 및 ADE1-825 내지 653는 표 3에 개괄된 바와 같이 PCR 증폭에 의해 생성되었다. pAM493의 제작을 위해, 400 ng의 pAM473 및 100 ng의 pAM468이 XmaI 제한효소를 사용하여 완전하게 소화되었고, PGAL-IDI1-PGAL-tHMGR 삽입체 및 선형화된 pAM468벡터에 해당하는 DNA 단편들이 젤 정제되었고, 정제된 삽입체의 4 몰라 당량들이 정제된 선형화된 벡터의 1 몰라 당량과 라이게이션되었고, pAM493을 수득하였다. 도 1T는 pAM493의 ADE1_PGAL10-IDI1_PGAL1-tHMGR_ADE1 삽입체의 지도 및 서열번호 24의 그의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
Figure 112013079359371-pct00003
플라스미드 pAM495는 pAM474의 PGAL10-ERG10_PGAL1-ERG12 삽입체를 벡터 pAM469 내로 삽입하여 생성되었다. 벡터 pAM474는 사카로마이세스 세레비시애의 ERG10 유전자의 코딩 서열 (ERG10 뉴클레오타이드 위치 1번 내지 1347번) (ERG10)을 포함하는 DNA 단편 PGAL10-ERG10_PGAL1-ERG12, 사카로마이세스 세레비시애의 분지된 GAL1 및 GAL10 프로모터를 포함하는 게놈 좌위 (GAL1 뉴클레오타이드 위치 -1번 내지 -668번) (PGAL), 및 사카로마이세스 세레비시애의 ERG12 유전자의 코딩 서열 (ERG12 뉴클레오타이드 위치 1번 내지 1482번) (ERG12)를 TOPO 제로 블런트 Ⅱ 클로닝 벡터 내로 삽입하여 생성되었다. 벡터 pAM469는 뉴클레오타이드 위치 -32번으로부터 위치 -1000번까지 및 504번으로부터 위치 1103번까지 연장되는 사카로마이세스 세레비시애의 HIS 좌위의 두 개 분절, HISMX 마커, 및 HIS3504 내지 -1103 서열 및 HISMX 마커 사이에 인위적 XmaI 제한효소 부위를 포함하는 DNA 단편 HIS3-32 내지 -1000_HISMX_HIS3504 내지 -1103를 TOPO TA pCR2.1 클로닝 벡터 내로 삽입하여 생성되었다. DNA 단편들 PGAL10-ERG10_PGAL1-ERG12 및 HIS3-32 내지 -1000_HISMX_HIS3504 내지 -1103 는 표 4에 개괄된 바와 같이 PCR 증폭에 의해 생성되었다. pAM495의 제작을 위해, 400 ng의 pAM474 및 100 ng의 pAM469가 XmaI 제한효소를 사용하여 완전하게 소화되었고, PGAL10-ERG10_PGAL1-ERG12삽입체 및 선형화된 pAM469 벡터에 해당하는 DNA 단편들이 젤 정제되었고, 정제된 삽입체의 4 몰라 당량들이 정제된 선형화된 벡터의 1 몰라 당량과 라이게이션되었고, pAM495를 수득하였다. 도 1D는 pAM495의 HIS3_PGAL10-ERG10_PGAL1-ERG12_HIS3 삽입체의 지도 및 서열번호 34의 그의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
Figure 112013079359371-pct00004
플라스미드 pAM497는 pAM475의 PGAL10-ERG8_PGAL1-ERG19 삽입체를 벡터 pAM470 내로 삽입하여 생성되었다. 벡터 pAM475는 사카로마이세스 세레비시애의 ERG8 유전자의 코딩 서열 (ERG8 뉴클레오타이드 위치 1번 내지 1512번) (ERG8)을 포함하는 DNA 단편 PGAL10-ERG8_PGAL1-ERG19, 사카로마이세스 세레비시애의 분지된 GAL1 및 GAL10 프로모터를 포함하는 게놈 좌위 (GAL1 뉴클레오타이드 위치 -1번 내지 -668번) (PGAL), 및 사카로마이세스 세레비시애의 ERG19 유전자의 코딩 서열 (ERG19 뉴클레오타이드 위치 1번 내지 1341번) (ERG19)을 TOPO 제로 블런트 Ⅱ 클로닝 벡터 내로 삽입하여 생성되었다. 벡터 pAM470은 뉴클레오타이드 위치 -100번으로부터 위치 450번까지 및 1096번으로부터 위치 1770번까지 연장되는 사카로마이세스 세레비시애의 LEU2 좌위의 두 개 분절을 포함하는 DNA 단편 LEU2-100 내지 450_HISMX_LEU21096 내지 1770, HISMX 마커, 및 LEU21096 내지 1770 서열 및 HISMX 마커 사이에 인위적 XmaI 제한효소 부위를 포함하는 DNA 단편을 TOPO TA pCR2.1 클로닝 벡터 내로 삽입하여 생성되었다. DNA 단편들 PGAL10-ERG8_PGAL1-ERG19 및 LEU2-100 내지 450_HISMX_LEU21096 내지 1770는 표 5에 개괄된 바와 같이 PCR 증폭에 의해 생성되었다. pAM497의 제작을 위해, 400 ng의 pAM475 및 100 ng의 pAM470이 XmaI 제한효소를 사용하여 완전하게 소화되었고, ERG8_PGAL1-ERG19 삽입체 및 선형화된 pAM470 벡터에 해당하는 DNA 단편들이 젤 정제되었고, 정제된 삽입체의 4 몰라 당량들이 정제된 선형화된 벡터의 1 몰라 당량과 라이게이션되었고, pAM497을 수득하였다. 도 1V는 pAM497의 LEU2_PGAL10-ERG8_PGAL1-ERG19_LEU2 삽입체의 지도 및 서열번호 47의 그의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
Figure 112013079359371-pct00005
벡터 pAM1419는 벡터 pTrc99A (Amman et al ., Gene 40:183-190 (1985))로부터 두 개의 NcoI 제한효소 부위들을 제거하여 생성되었다. 벡터 pTrc99A의 복수의 클로닝 부위에서 NcoI 제한효소 부위는 먼저 제조사의 추천된 프로토콜들에 따라 Quikchange 멀티 부위-유도성 돌연변이화 키트 (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA)를 사용하여 NdeI 제한효소 부위로 변화되었다. 다음으로 복수 클로닝 부위의 외부에 있는 벡터 pTrc99A의 위치 2633번에서 두 번째 NdeI 제한효소 부위도 역시 Quikchange 멀티 부위-유도성 돌연변이화 키트를 사용하여 제거되었고, 벡터 pAM1419 (서열번호 60)를 수득하였다.
발현 플라스미드 pAM1421 (도 13A)는 벡터 pAM1419 내로 FS_S2D-Ec 코딩 서열을 삽입하여 생성되었다. 벡터 pAM1419는 BamHI 및 NdeI 제한효소들을 사용하여 소화되었고, 대략 4.15 kb의 선형화된 벡터 골격이 젤 정제되었고, 정제된 DNA 단편은 5' 포스페이트기들을 제거하도록 송아지 정소 알칼라인 포스파타제 (CIP)로 소화되었다. 세린으로부터 아스파테이트로 (S2D) 위치 2번에서 아미노산 치환을 포함하고 대장군에서 발현을 위해 코돈-최적화된 (FS_S2D_Ec 코딩 서열; 서열번호 61) BamHI 및 NdeI 제한효소 부위들을 가진 아르테미시아 애누아의 β-파네센 합성효소 유전자 (진뱅크 기탁번호 AY835398; Picaud, et al, 2005)는 다른 발현 플라스미드들로부터 PCR 증폭되었고, PCR 산물은 BamHI 및 NdeI 제한효소들을 사용하여 소화되었고, 다음으로 젤 정제되었다. 정제된 선형화된 벡터 및 소화된 PCR 산물은 T4 DNA 리가제를 사용하여 라이게이션되었고, 발현 플라스미드 pAM1421를 수득하였다.
발현 플라스미드 pAM353는 pRS425-Gal1 벡터 (Mumberg et. al. (1994) Nucl. Acids. Res. 22(25): 5767-5768) 내로 사카로마이세스 세레비시애에서 발현을 위해 코돈-최적화된 (FS_Aa_Sc coding 서열; 서열번호 68) 아르테미시아 애누아의 β-파네센 합성효소 유전자의 코딩 서열 (진뱅크 기탁번호 AY835398)을 삽입하여 생성되었다. FS_Aa_Sc 코딩 서열은 합성적으로 생성되었고, 5' BamHI 및 3' XhoI 제한효소 부위들에 의해 끼어있어 표준 pUC 또는 pACYC 기원 벡터와 같은 클로닝 벡터의 적합한 제한효소 부위들 내로 클론될 수 있다. FS_Aa_Sc 코딩 서열은 다시 본 제작물을 BamHI 및 XhoI 제한효소들 사용하여 소화하여 절단되었고, FS_Aa_Sc 코딩 서열을 포함하는 대략 1.7 kb DNA 단편이 젤 정제되었고, 정제된 DNA 단편은 pRS425-Gal1 벡터의 BamHI XhoI 제한효소 부위 내로 라이게이션되었고, 발현 플라스미드 pAM353를 수득하였다.
발현 플라스미드 pAM404 (도 13B)는 벡터 pAM178 (서열번호 69) 내로 FS_Aa_Sc 코딩 서열을 삽입하여 생성되었다. 벡터 pAM178는 BamHI 및 NheI 제한효소들을 사용하여 소화되었고, 대략 7.3 kb의 벡터 골격이 젤 정제되었다. 끼여있는 BamHI 및 NheI 제한효소 부위들을 가진 FS_Aa_Sc 코딩 서열은 pAM353로부터 PCR 증폭되었고, PCR 산물은 BamHI 및 NheI 제한효소들을 사용하여 소화되었고, FS_Aa_Sc 코딩 서열을 포함하는 대략 1.7 kb의 DNA 단편이 젤 정제되었다. 두 개의 젤 정제된 DNA 단편들이 라이게이션되었고, 발현 플라스미드 pAM404를 수득하였다.
표 6 및 도 13B에 나타낸 발현 플라스미드들은 표 6에 발현 플라스미드 pAM404에서 FS_Aa_Sc 코딩 서열을 표시된 코딩 서열들로 대체하여 생성되었다. 벡터 pAM404는 BamHI 및 NheI 제한효소들을 사용하여 소화되었고, FS_Aa_Sc 코딩 서열이 결여된 대략 7.3 kb 선형화된 벡터 골격이 젤 정제되었다. FS_S2D_Ec 코딩 서열은 선형화된 pAM404 벡터 골격의 말단 서열과 중복되는 프라이머들을 사용하여 또 다른 발현 플라스미드로부터 PCR 증폭되었다. IS_Pn_Sc 및 TDS_Pn_Sc 코딩 서열은 다른 발현 벡터들로부터 제한효소 소화에 의해 추출되었다. DNA 단편은 젤 정제되었다. FS_S2D_Ec 코딩 서열은 균주 Y539를 형질전환하고 숙주세포 형질전환체들을 단독 탄소원으로서 2% 포도당을 가진 루이신이 결여된 완전 합성 배지 (CSM) (CSM-L) 상에서 선별하여 상동 재조합을 통해 정제된 선형화된 벡터 내로 삽입되었다. IS_Pn_Sc 및 TDS_Fs_Sc 코딩 서열들은 T4 DNA 리가제를 사용하여 정제된 선형화된 벡터 내로 라이게이션되었다.
Figure 112013079359371-pct00006
발현 플라스미드 pAM1812 (서열번호 72; 도 13C)는 발현 플라스미드 pAM404 내로 TDS_Fs_Sc 코딩 서열을 삽입하여 생성되었다. 발현 플라스미드 pAM404는 NotI 제한효소를 사용하여 소화되었고, 대략 9.0 kb의 선형화된 플라스미드가 젤 정제되었다. TDS_Fs_Sc 코딩 서열은 선형화된 pAM404의 말단 서열과 중복되는 프라이머들을 사용하여 발현 플라스미드 pAM1795로부터 PCR 증폭되었고, TDS_Fs_Sc 코딩 서열을 포함하는 1.2 kb PCR 산물은 젤 정제되었다. 두 개의 젤 정제된 DNA 단편들은 균주 Y539를 정제된 단편들 둘 다로 형질전환하고 숙주세포 형질전환체들을 단독 탄소원으로서 2% 포도당을 가진 CSM-L 상에서 선별하여 상동 재조합을 통해 라이게이션되었다.
표 7 및 도 13C에 나타낸 발현 플라스미드들은 발현 플라스미드 pAM1812 내에서 FS_Aa_Sc 코딩 서열을 표시된 코딩 서열들과 대체하여 생성되었다. 발현 플라스미드 pAM1812는 BamHI 및 NheI 제한효소들을 사용하여 소화되었고, FS_Aa_Sc 코딩 서열이 결여된 대략 7.2 kb의 선형 플라스미드가 젤 정제되었다. 코딩 서열들은 다른 발현 벡터들로부터 BamHI 및 NheI 제한효소 소화에 의해 추출되었고, 코딩 서열을 포함하는 DNA 단편이 젤 정제되었다. 정제된 DNA 단편들은 최종적으로 T4 DNA 리가제를 사용하여 라이게이션되었고, 발현 플라스미드들을 수득하였다.
Figure 112013079359371-pct00007
발현 플라스미드 pAM1813 (도 13D)는 발현 플라스미드 pAM1795내로 FS_Aa_Sc 코딩 서열의 코딩 서열을 삽입하여 생성되었다. 발현 플라스미드 pAM1795는 NotI 제한효소를 사용하여 소화되었고, 대략 8.4 kb의 선형화된 플라스미드가 젤 정제되었다. FS_Aa_Sc 코딩 서열들은 선형화된 pAM404의 말단 서열들과 중복되는 프라이머들을 사용하여 PCR 증폭되었고, FS_Aa_Sc 코딩 서열들을 포함하는 PCR 산물은 젤 정제되었다. 정제된 PCR 산물은 이를 균주 Y539 내로 형질전환하고 숙주세포 형질전환체들을 단독 탄소원으로서 2% 포도당을 가진 CSM-L 상에서 선별하여 상동 재조합을 통해 라이게이션되었다. pAM1812 및 pAM1813이 TDS 및 FS를 위한 프로모터들이 스위치된 것 이외에는 일치하는 점을 주목하라. 서로 다른 강도들의 프로모터들을 사용하는 것은 파네센/트리코디엔 비율들의 다양성을 허용한다.
발현 플라스미드 pAM1653는 벡터 pRS415 내로 IS_Pn_Sc 코딩 서열을 삽입하여 생성되었다. 발현 플라스미드 pAM1549는SapI 제한효소를 사용하여 소화되었고, 생성된 블런트 말단들에는 클레노 단편으로 처리되었고, 다시 NotI 제한효소를 사용하여 소화되었고, IS_Pn_Sc 코딩 서열 및 PGAL 서열을 포함하는 2.8 kb DNA 단편이 젤 정제되었다. 벡터 pRS415는 NotI 및 AleI 제한효소들을 사용하여 소화되었고, 6.0 kb의 선형화된 벡터 골격은 젤 정제되었다. 두 개의 정제된 DNA 단편들은 라이게이션되었고, 발현 플라스미드 pAM1653를 수득하였다.
발현 플라스미드 pAM1734는 발현 플라스미드 pAM1653의 복수의 클로닝 부위로부터 소정의 제한효소 부위들을 제거하여 생성되었다. 발현 플라스미드 pAM1653는 XbaI 및 HindⅢ 제한효소들을 사용하여 소화되었고, 생성된 블런트 말단들에는 클레노 단편으로 처리되었고, 최종적으로 자가-라이게이션되었고, 발현 플라스미드 pAM1734를 수득하였다.
발현 플라스미드 pAM1764 (서열번호 74)는 발현 플라스미드 pAM1734 내로 FS_S2D_Ec 코딩 서열을 삽입하여 생성되었다. 발현 벡터 pAM1734는 BamHI 및 NheI 제한효소들을 사용하여 소화되었고, 대략 6.9 kb의 선형화된 플라스미드가 젤 정제되었다. FS_S2D_Ec 코딩 서열은 선형화된 pAM1734의 말단 서열들과 중복되는 프라이머들을 사용하여 발현 플라스미드 pAM1421로부터 PCR 증폭되었고, FS_S2D-Sc 코딩 서열을 포함하는 1.7 kb PCR 산물이 젤 정제되었다. 두 개의 정제된 DNA 단편들은 균주 Y539를 정제된 DNA 단편들 둘 다로 형질전환하고 숙주세포 형질전환체들을 단독 탄소원으로서 2% 포도당을 가진 CSM-L 상에서 선별하여 상동 재조합을 통해 라이게이션되었다.
발현 플라스미드 pAM1668는 발현 플라스미드 pAM1419로부터 lacI 유전자를 결실시켜서 생성되었다. 발현 플라스미드 pAM1419는 EcoRV 및 SapI 제한효소들을 사용하여 소화되었고, 소화된 플라스미드는 End-It DNA 말단-복구 키트 (Epicentre, Madison, WI)를 제조사의 추천된 프로토콜들에 따라 사용하여 복구되었고, 말단-복구된 벡터는 자가-라이게이션되었고, 벡터 pAM1668를 수득하였다.
표 8 및 도 13E에 나타낸 발현 플라스미드들은 벡터 pAM1668 내로 표시된 코딩 서열들을 삽입하여 생성되었다. 벡터 pAM1668은 BamHI 및 NdeI 제한효소들을 사용하여 소화되었고, 대략 2.9 kb의 선형화된 벡터 골격이 젤 정제되었다. 코딩 서열들은 선형화된 pAM1668의 말단 서열들과 중복되는 프라이머들을 사용하여 PCR 증폭되었고, PCR 산물들은 BamHI 및 NheI 제한효소들을 사용하여 소화되었고, 코딩 서열을 포함하는 소화된 PCR 산물들이 젤 정제되었다. 정제된 선형화된 벡터 및 소화된 PCR 산물들은 최종적으로 라이게이션되었고, 발현 플라스미드들을 수득하였다.
Figure 112013079359371-pct00008
제작물 A는 표 9에 기술된 바와 같이 PCR 증폭에 의해 생성되었다. 본 제작물은 사카로마이세스 세레비시애의 NDT80 유전자의 상류 부위 (NDT80 뉴클레오타이드 positions -175 내지 -952), 사카로마이세스 세레비시애의 LEU2 마커 (LEU2 뉴클레오타이드 위치들 -661번 내지 +1541번), 사카로마이세스 세레비시애의 GAL 1 유전자의 프로모터 (GAL1 뉴클레오타이드 위치들 -1번 내지 -667번), FS_Aa_Sc 코딩 서열, 사카로마이세스 세레비시애의 CYC1 유전자의 종결인자 (CYC1 뉴클레오타이드 위치들 +331번 내지 +521번), 및 사카로마이세스 세레비시애의 NDT80 유전자의 하류 부위 (NDT80 뉴클레오타이드 위치들 +1685번 내지 +2471)를 포함한다. 도 1W는 제작물 A의 지도 및 서열번호 86의 그의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
Figure 112013079359371-pct00009
제작물 B (도 1X)는 PCR 증폭에 의해 생성되었다. 본 제작물은 사카로마이세스 세레비시애의 NDT80 유전자의 상류 부위 (NDT80 뉴클레오타이드 positions -175 내지 -952), 사카로마이세스 세레비시애의 LEU2 마커 (LEU2 뉴클레오타이드 위치들 -661번 내지 +1541번), 사카로마이세스 세레비시애의 GAL 1 유전자의 프로모터 (GAL1 뉴클레오타이드 위치들 -1번 내지 -667번), HISG 마커, 사카로마이세스 세레비시애의 CYC1 유전자의 종결인자 (CYC1 뉴클레오타이드 위치들 +331번 내지 +521번), 및 사카로마이세스 세레비시애의 NDT80 유전자의 하류 부위 (NDT80 뉴클레오타이드 위치들 +1685번 내지 +2471)를 포함한다.
제작물 D는 표 10에 기술된 바와 같이 PCR 증폭에 의해 생성되었다. 본 제작물은 사카로마이세스 세레비시애의 GAL1 유전자의 프로모터 (PGAL1; GAL1 뉴클레오타이드 위치들 -1번 내지 -455번) 및 사카로마이세스 세레비시애의 PGK1 유전자의 종결인자 (TPGK1; PGK1 뉴클레오타이드 위치들 +1159번 내지 +1547번) 에 의해 끼여있는 FS_A_5.3 코딩 서열, 또한 사카로마이세스 세레비시애의 GAL10 유전자의 프로모터 (PGAL10; GAL10 뉴클레오타이드 위치들 -1번 내지 -202번) 및 사카로마이세스 세레비시애의 ADH1 유전자의 종결인자 (TADH1; ADH1 뉴클레오타이드 위치들 -1번 내지 -166번)에 의해 끼여있는 TDS_Fs_Sc 코딩 서열을 포함한다. 도 1Z는 제작물 D의 지도 및 서열번호 116의 그의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
Figure 112013079359371-pct00010
발현 플라스미드 pAM2191는 지수적으로 성장하는 Y 3198 세포들을 FastDigest® BstZ17I 제한효소 (Fisher Scientific Worldwide, Hampton, NH)를 사용하여 소화된 100 ng의 벡터 pAM552 (서열번호 156) 및 300 ng의 제작물 D로 형질전환하여 제작되었다. 숙주세포 형질전환체들은 단독 탄소원으로서 2% 포도당을 포함하는 CSM-L 한천 배지들 상에 도말되었고, 플레이트들은 30℃에서 3일 동안 개별 콜로니들이 반경 ~1 mm가 될 때까지 배양되었다. DNA는 ZymoprepTM 효모 플라스미드 미니프렙 키트 Ⅱ (Zymo Research Corporation, Orange, CA)를 사용하여 이들 콜로니들로부터 수확되었고, 수확된 DNA는 화학적으로 적합한 (competent) XL1Blue 대장균 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) 내로 형질전환되었다. 숙주세포 형질전환체들은 카베니실린이 보충된 라이소제니 (Lysogeny) 액체 아가 배지에 도말되었고, 개별 콜로니들이 가시적이 될 때까지 37℃에서 24시간 동안 배양되었다. 플라스미드 DNA가 QIAprep 스핀 미니프렙 키트 (QIAGEN Inc, Valencia, CA)를 사용하여 이들 콜로니들로부터 수확되었고, 플라스미드 DNA는 발현 플라스미드 pAM2191의 정확한 제작을 검증하도록 서열결정되었다.
실시예 2
본 실시예는 테르펜 합성효소들 변이체들의 생성 및 특성분석에서 유용한 효모 균주들을 만드는 방법들을 기술하고 있다.
균주들 Y93 (MAT A) 및 Y94 (MAT 알파)가 효모 균주들Y002 및 Y003 (CEN.PK2 배경 MAT A 또는 MAT 알파 각각, ura3-52; trp1-289; leu2-3,112; his3D1; MAL2-8C; SUC2; van Dijken et al . (2000) Enzyme Microb. Technol. 26:706-714)의 ERG9 유전자의 프로모터 각각을 사카로마이세스 세레비시애의 MET3 유전자의 프로모터로 대체하여 생성되었다. 본 목적으로, 지수적으로 성장하는 Y002 및 Y003 세포들이 통합 제작물 i8 (서열번호 87)로 형질전환되었고, 이는 Kluyveromyces lactis의 Tef1 유전자의 프로모터 및 종결인자에 의해 끼여있는 카나마이신 저항성 마커 (KanMX), ERG9 코딩 서열, ERG9 프로모터의 절단된 분절 (trune. PERG9), 및 ERG9 상류 및 하류 서열들에 의해 끼여있는 MET3 프로모터 (PMET3)를 포함하였다 (도 1A). 숙주세포 형질전환체들은 0.5 ug/mL 젠타마이신 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)을 포함하는 배지 상에서 선별되었고, 선택된 클론들은 진단적 PCR에 의해 검증되었고, 균주 Y93 및 Y94를 수득하였다.
균주들 Y176 (MAT A) 및 Y177 (MAT 알파)는 균주들 Y93 및 Y94에서 ADE1의 코딩 서열 각각을 Candida glabrata의 LEU2 유전자의 코딩 서열 (CgLEU2)과 대체하여 생성되었다. 본 목적으로, 3.5 kb의 CgLEU2 게놈 좌위가 Candida glabrata 게놈 DNA (ATCC, Manassas, VA)로부터 프라이머들 61-67-CPK066-G (서열번호 88) 및 61-67-CPK067-G (서열번호 89)를 사용하여 PCR 증폭되었고, PCR 산물은 지수적으로 성장하는 Y93 및 Y94 세포들 내로 형질전환되었다. 숙주세포 형질전환체들은 CSM-L 상에서 선별되었고, 선택된 클론들은 진단적 PCR에 의해 검증되었고, 균주들 Y176 및 Y177을 수득하였다.
균주 Y188는 균주Y176 내로 각각 사카로마이세스 세레비시애의 GAL1 또는 GAL10 유전자의 갈락토스 유도가능한 프로모터의 조절적 통제 하에 있는 사카로마이세스 세레비시애의 ERG13, ERG10, 및 ERG12 유전자들의 코딩 서열들, 및 사카로마이세스 세레비시애의 HMG1의 절단된 코딩 서열의 추가적인 사본을 도입하여 생성되었다. 본 목적으로, 지수적으로 성장하는 Y176 세포들은 PmeI 제한효소 (New England Biolabs, Beverly, MA)로 소화된 2 ug의 발현 플라스미드들 pAM491 및 pAM495로 형질전환되었다. 숙주세포 형질전환체들은 우라실 및 히스티딘이 결여된 CSM (CSM-U-H) 상에서 선별되었고, 선택된 클론들은 진단적 PCR에 의해 검증되었고, 균주 Y188를 수득하였다.
균주 Y189는 균주 Y177 내로 각각 사카로마이세스 세레비시애의 GAL1 또는 GAL10 유전자의 갈락토스 유도가능한 프로모터의 조절적 통제 하에 있는 사카로마이세스 세레비시애의 ERG20, ERG8, 및 ERG19 유전자들의 코딩 서열들, 및 사카로마이세스 세레비시애의 HMG1의 절단된 코딩 서열의 추가적인 사본을 도입하여 생성되었다. 본 목적으로, 지수적으로 성장하는 Y188 세포들은 PmeI 제한효소로 소화된 2 ug의 발현 플라스미드들 pAM489 및 pAM497로 형질전환되었다. 숙주세포 형질전환체들은 트립토판 및 히스티딘이 결여된 CSM (CSM-T-H) 상에서 선별되었고, 선택된 클론들은 진단적 PCR에 의해 검증되었고, 균주 Y189를 수득하였다.
균주 Y238은 균주들 Y188 및 Y189를 메이팅하고, 각각 사카로마이세스 세레비시애의 GAL1 또는 GAL10 유전자의 갈락토스 유도가능한 프로모터의 조절적 통제 하에 있는 사카로마이세스 세레비시애의 IDI1 유전자의 코딩 서열, 및 사카로마이세스 세레비시애의 HMG1의 절단된 코딩 서열의 추가적인 사본을 도입하여 생성되었다. 본 목적으로, 균주들 Y188 및 Y189의 대략 1 x 107개 세포들이 YPD 배지 플레이트 상에서 상온으로 6시간 동안 혼합되었고, 이수성 세포들이 PmeI 제한효소로 소화된 2 ug의 발현 플라스미드 pAM493으로 형질전환되었다. 숙주세포 형질전환체들은 아데닌이 결여된 CSM (CSM-A) 상에서 선별되었고, 선택된 클론들은 진단적 PCR에 의해 검증되었고, 균주 Y238을 수득하였다.
균주들 Y210 (MAT A) 및 Y211 (MAT 알파)는 균주 Y238를 포자 형성하여 생성되었다. 이수성 세포들은 2% 포타슘 아세테이트 및 0.02% 라피노스 액체 배지에서 포자 형성되었고, 대략 200개의 유전적 사분체들 (tetrads)이 싱거 MSM300 시리즈 기기들인 미세조작기 (Singer Instrument Co, LTD. Somerset, UK)를 사용하여 분리되었다. 포자들은 CSM-A-H-U-T 상에서 선별되었고, 선택된 클론들은 진단적 PCR에 의해 검증되었고, 균주들 Y210 (MAT A) 및 Y211 (MAT 알파)을 수득하였다.
균주 Y221는 지수적으로 성장하는 Y211 세포들을 벡터 pAM178로 형질전환하여 생성되었다. 숙주세포 형질전환체들은 CSM-L 상에서 선별되었다.
균주 Y290는 균주 Y221의 GAL80 유전자의 코딩 서열을 결실시켜서 생성되었다. 본 목적으로, 지수적으로 성장하는 Y221 세포들은 통합 제작물 i32 (서열번호 90)로 형질전환되었고, 이는 GAL80 상류 및 하류 서열들에 의해 끼여있는 Kluyveromyces lactis의 Tef1 유전자의 프로모터 및 종결인자에 의해 끼여있는 하이그로마이신 B 저항성 마커 (hph)를 포함하였다 (도 1B). 숙주세포 형질전환체들은 하이그로마이신 B를 포함하는 배지 상에서 선별되었고, 선택된 클론들은 진단적 PCR에 의해 검증되었고, 균주 Y290를 수득하였다.
균주 Y318는 루이신-풍부 배지에서의 일련 증식에 의해 균주 Y290로부터 pAM178 벡터를 제거하고, 개별적 콜로니들을 CSM-L 상에서 자라는 그들의 무능력에 대해 테스트하여 생성되었고, 균주 Y318를 수득하였다.
균주 Y409는 β-파네센 합성효소를 인코딩하는 이종유래 뉴클레오타이드 서열을 균주 Y318 내로 도입하여 생성되었다. 본 목적으로, 지수적으로 성장하는 Y318 세포들은 발현 플라스미드 pAM404로 형질전환되었다. 숙주세포 형질전환체들은 CSM-L 상에서 선별되었고, 균주 Y409를 수득하였다.
균주 Y419는 균주 Y409의 GAL 프로모터들을 전신적 활성을 가지도록 만들어 생성되었다. 본 목적으로, 지수적으로 성장하는Y409 세포들은 통합 제작물 i33 (서열번호 91)로 형질전환되었고, 이는 변형된 ERG9 프로모터 및 코딩 서열들의 상류 및 하류 서열들에 의해 끼여있는 그의 원 (native) 프로모터 (PGAL4oc; Griggs & Johnston (1991) PNAS 88(19):8597-8601) 및 GAL4 종결인자 (TGAL4) (도 1C)의 "작동 전신적" 버전의 조절적 통제 하에 Kluyveromyces lactis의 Tef1 유전자의 프로모터 및 종결인자에 의해 끼여있는 스트렙토마이세스 나르세이의 나르세오트리신 저항성 마커 (NatR), 및 사카로마이세스 세레비시애의 GAL4 유전자의 코딩 서열을 포함하 였다. 숙주세포 형질전환체들은 나르세오트리신을 포함하는 배지 상에서 선별되었고, 선택된 클론들은 진단적 PCR에 의해 검증되었고, 균주 Y419를 수득하였다.
균주 Y677는 균주 Y419의 변형된 GAL80 좌위에 사카로마이세스 세레비시애의 GAL1 유전자의 프로모터의 조절적 통제 하에 사카로마이세스 세레비시애의 ERG12의 코딩 부위의 추가적인 사본을 도입하여 생성되었다. 본 목적으로, 지수적으로 성장하는Y677 세포들은 통합 제작물 i37 (서열번호 92)로 형질전환되었고, 이는 Kluyveromyces lactis의 Tef1 유전자의 프로모터 및 종결인자에 의해 끼여있는 스트렙토마이세스 나르세이의 카나마이신 저항성 마커 (KanR), 또한 GAL1 프로모터 (PGAL1) 및 ERG12 종결인자 (TERG12) (도 1D)에 의해 끼여있는 사카로마이세스 세레비시애의 GAL4 유전자의 코딩 및 종결 서열들을 포함하였다. 숙주세포 형질전환체들은 카나마이신을 포함하는 배지 상에서 선택되었고, 선택된 클론들은 진단적 PCR에 의해 검증되었고, 균주 Y677를 수득하였다.
균주 Y1551는 화학적 돌연변이화에 의해 균주 Y677로부터 생성되었다. 변이화된 균주들은 β-파네센의 증가된 생산에 대해 검색되었고, 균주 Y1551를 수득하였다.
균주 Y1778는 화학적 돌연변이화에 의해 균주 Y1551로부터 생성되었다. 변이화된 균주들은 β-파네센의 증가된 생산에 대해 검색되었고, 균주 Y1778을 수득하였다.
균주 Y1816는 균주 Y1778의 HXT3 코딩 서열을 하나는 사카로마이세스 세레비시애로부터 유래되고 다른 하나는 C. butylicum로부터 유래된 두 개 사본들의 아세토아세틸-CoA 티올라제 코딩 서열, 또한 B. juncea의 HMGS 유전자의 코딩 서열의 하나의 사본과 대체하여 생성되었다. 본 목적으로, 지수적으로 성장하는Y1778 세포들은 통합 제작물 i301 (서열번호 93)로 형질전환되었고, 이는 Kluyveromyces lactis의 Tef1 유전자의 프로모터 및 종결인자에 의해 끼여있는 사카로마이세스 세레비시애의 하이그로마이신 B 저항성 마커 (hyg), 절단된 TDH3 프로모터 (tPTDH3) 및 AHP1 종결인자 (TAHP1)에 의해 끼여있는 사카로마이세스 세레비시애의 ERG10 유전자의 코딩 서열, YPD1 프로모터 (PYPD1) 및 CCW12 종결인자 (TCCW12)에 의해 끼여있는 C. butylicum의 아세토아세틸-CoA 티올라제 (thiolase) 또한 TUB2 프로모터 (PTUB2)가 선행되고 사카로마이세스 세레비시애의 HXT3 유전자의 상류 및 하류 서열들에 의해 끼여있는 B. juncea의 HMGS 유전자의 코딩 서열 (HMGS)을 포함하였다 (도 1E). 숙주세포 형질전환체들은 하이그로마이신 B를 포함하는 배지 상에서 선별되었고, 선택된 클론들은 진단적 PCR에 의해 검증되었고, 균주 Y1816를 수득하였다.
균주 Y2055는 화학적 돌연변이화에 의해 균주 Y1778로부터 생성되었다. 변이화된 균주들은 β-파네센의 증가된 생산에 대해 검색되었고, 균주 Y2055를 수득하였다.
균주 Y2295는 화학적 돌연변이화에 의해 균주 Y2055로부터 생성되었다. 변이화된 균주들은 β-파네센의 증가된 생산에 대해 검색되었고, 균주 Y2295를 수득하였다.
균주 Y3111는 MAT A로부터 MAT 알파까지 균주 Y2295의 메이팅 유형을 스위치하여 생성되었다. 본 목적으로, 지수적으로 성장하는Y2295 세포들은 통합 제작물 i476 (서열번호 94)로 형질전환되었고, 이는 MAT 알파 메이팅 좌위 및 하이그로마이신 B 저항성 마커 (hygA) (도 1F)를 포함하였다. 숙주세포 형질전환체들은 하이그로마이신 B를 포함하는 배지 상에서 선별되었고, 선별된 클론들은 진단적 PCR에 의해 검증되었고, 균주 Y3111를 수득하였다.
균주 Y2168는 화학적 돌연변이화에 의해 균주 Y1816으로부터 생성되었다. 변이화된 균주들은 β-파네센의 증가된 생산에 대해 검색되었고, 균주 Y2168을 수득하였다.
균주 Y2446는 화학적 돌연변이화에 의해 균주 Y2168로부터 생성되었다. 변이화된 균주들은 β-파네센의 증가된 생산에 대해 검색되었고, 균주 Y2446을 수득하였다.
균주 Y3118는 균주 Y2446의 원래 URA3 좌위 내로 사카로마이세스 세레비시애의 GAL80 유전자의 코딩 서열, 프로모터, 및 종결인자를 삽입하여 생성되었다. 본 목적으로, 지수적으로 성장하는Y2446 세포들은 통합 제작물 i477 (서열번호 95)로 형질전환되었고, 이는 프로모터, 종결인자, 및 중복되는URA3 서열들 (상동 재조합에 의해 GAL80 유전자의 루프-아웃 절단 및 원래의 URA3 서열의 복구를 가능하게 함)에 의해 끼여있는 사카로마이세스 세레비시애의 GAL80 유전자의 코딩 서열 (GAL80) (도 1G)을 포함하였다. 숙주세포 형질전환체들은 5-FOA를 포함하는 배지 상에서 선별되었고, 균주 Y3118를 수득하였다.
균주 Y3125는 발현 플라스미드 pAM404를 제거하여 균주 Y3118로부터 생성되었다. 본 목적으로, 균주 Y3118는 먼저 40 mg/L 우라실 (YPD+L+U)을 가진 3 mL YPD+0.5% 루이신 배지에서 배양되었다. 세포들은 발현 플라스미드 pAM404를 없애도록 신선한 YPD+L+U로 5일까지 동안 24시간마다 100배 희석되었고, 다음으로 YPD 상에 도말되었고 5일까지 동안 30?에서 배양되었다. 작은 콜로니들은 둘 다의 YPD 및 CSM-L 상에서 복제-도말되었고, YPD 상에서는 자랄 수 있지만 CSM-L 상에서는 자라지 못하는 콜로니들이 확인되었고, 균주 Y3125를 수득하였다.
표 11에 나타낸 균주들은 지수적으로 성장하는 Y3125 세포들을 표시된 코딩 서열들을 포함하는 표시된 발현 플라스미드들로 형질전환하고, 숙주세포 형질전환체들을 CSM-L 상에서 선별하여 생성되었다.
Figure 112013079359371-pct00011
균주 Y227는 발현 플라스미드 pAM426로 균주 Y211를 형질전환하여 생성되었다. 숙주세포 형질전환체들은 CSM-L 상에서 선별되었다.
균주 Y3198는 발현 플라스미드 pAM426를 균주 Y227로부터 제거하여 생성되었다. 본 목적으로, Y227 세포들은 YPD+L으로 4일 동안 배양되었다. 24시간마다, 배양액이 신선한 YPD+L에 0.05의 OD600으로 접종되었다. 4일 이후에, 세포들은 일련으로 희석되었고 YPD 고체 아가 상에 도말되었고, 플레이트들은 30?에서 4일 동안 배양되었다. 더 작은 콜로니들은 둘 다의 YPD 및 CSM-L 상에서 복제-도말되었고, YPD 상에서는 자랄 수 있지만 CSM-L 상에서는 자라지 못하는 콜로니들이 확인되었고, 균주 Y3198을 수득하였다.
균주 Y3215는 균주들 Y3111 및 Y3118을 메이팅하여 생성되었다. 균주들 Y3111 및 Y3118의 대략 1 x 107개 세포들은 메이팅을 허용하도록 YPD 배지 플레이트 상에 상온으로 6시간 동안 혼합되었고, 이어서 단일 콜로니들을 분리하도록 YPD 한천 배지 상에서 도말되었다. 이수체들은 hphA-마커된 MAT 알파 좌위 및 야생형 MAT A 좌위 둘 다의 존재에 대해 콜로니 PCR에 의해 검색되어 확인되었다.
균주 Y3000은 균주 Y3215를 포자 형성하고 GAL80 코딩 서열을 루프 아웃하여 생성되었다. 이수성 세포들은 2% 포타슘 아세테이드 및 0.02% 라피노스 액체 배지에서 포자 형성되었다. 무작위 포자들이 분리되었고, YPD 아가 상에서 도말되었고, 3일 동안 성장되었고, 다음으로 GAL80이 결여된 (예로, 기능적 URA3 유전자를 가지는) 세포들의 성장만을 허용하도록 CSM-U에 복제-도말되었다. 다음으로 포자들은 β-?파네센 생산에 대해 테스트되었고, 최고의 생산자가 확인되었고, 통합 제작물 i301의 존재가 진단적 PCR에 의해 검증되었고, 균주 Y3000를 수득하였다.
균주 Y3284는 균주 Y3000로부터 URA3 마커를 제거하여 생성되었다. 본 목적으로, 지수적으로 성장하는Y3000 세포들은 통합 제작물 i94 (서열번호 96)로 형질전환되었고, 이는 사카로마이세스 세레비시애의 URA3 유전자의 상류 및 하류 서열들에 의해 끼여있는 사카로마이세스 세레비시애의 GAL1 또는 GAL10 유전자의 갈락토스 유도가능한 프로모터의 조절 하에 살모넬라의 hisG 코딩 서열 및 ERG13 유전자의 코딩 서열을 포함하였다 (도 1H). 숙주세포 형질전환체들은 5-FOA를 포함하는 배지 상에서 선별되었고, 선택된 클론들은 진단적 PCR에 의해 검증되었고, 균주 Y3284를 수득하였다.
균주 Y3385는 균주 Y3284의 NDT80 코딩 서열을 사카로마이세스 세레비시애의 아세틸-CoA 합성효소 유전자의 코딩 서열 및 Z. mobilis의 PDC 유전자의 코딩 서열의 추가적인 사본과 대체하여 생성되었다. 본 목적으로, 지수적으로 성장하는Y3385 세포들은 통합 제작물 i467 (서열번호 97)로 형질전환되었고, 이는 URA3 마커, HXT3 프로모터 (PHXT3) 및 PGK1 종결인자 (TPGK1)에 의해 끼여있는 사카로마이세스 세레비시애의 ACS2 유전자의 코딩 서열 (ACS2), 또한 GAL7 프로모터 (PGAL7) 및 NDT80 서열들의 상류 및 하류에 의해 끼여있는 TDH3 종결인자 (TTDH3)에 의해 끼여있는 Z. mobilis의 PDC 유전자의 코딩 서열 (zmPDC)을 포함하였다 (도 1I). 숙주세포 형질전환체들은 CSM-U 상에서 선별되었고, 선택된 클론들은 진단적 PCR에 의해 검증되었고, 균주 Y3385를 수득하였다.
균주 Y3547는 화학적 돌연변이화에 의해 균주 Y3385로부터 생성되었다. 변이화된 균주들은 β-파네센의 증가된 생산에 대해 검색되었고, 균주 Y3547을 수득하였다.
균주 Y3639 는 화학적 돌연변이화에 의해 균주 Y3547로부터 생성되었다. 변이화된 균주들은 β-파네센의 증가된 생산에 대해 검색되었고, 균주 Y3639를 수득하였다.
균주 Y3902는 균주 Y3639의 NDT80 좌위에서 URA3 마커를 사카로마이세스 세레비시애의 GAL80 유전자의 코딩 서열, 프로모터, 및 종결인자로 파괴하여 생성되었다. 본 경우에, GAL80s -2라고 불리는 GAL80의 변이 대립인자가 사용되었다 (Nucleic acids Research (1984) 12(24):9287-9298). 지수적으로 성장하는Y3639 세포들은 통합 제작물 i601 (서열번호 98)로 형질전환되었고, 이는 NDT80 서열들의 상류 및 하류에 의해 끼여있는, 사카로마이세스 세레비시애의 GAL80 유전자의 프로모터, 종결인자, 및 중복되는URA3 서열들 (상동 재조합에 의해 GAL80 유전자의 루프-아웃 절단 및 원래의 URA3 서열의 복구를 가능하게 함)에 의해 끼여있는 코딩 서열 (GAL80, TGAL80, 및 GAL80), HXT3 프로모터 (PHXT3) 및 PGK1 종결인자 (TPGK1)에 의해 끼여있는 사카로마이세스 세레비시애의 ACS2 유전자의 코딩 서열들 (ACS2), 또한 GAL7 프로모터 (PGAL7) 및 TDH3 종결인자 (TTDH3)에 의해 끼여있는 Z. mobilis의 PDC 유전자의 코딩 서열 (zmPDC) (도 1J)을 포함하였다. 숙주세포 형질전환체들은 5-FOA를 포함하는 배지 상에서 선별되었고, 균주 Y3902를 수득하였다.
균주 Y4027는 Y3902로부터 루이신-풍부 배지에서 일련의 증식에 의해 발현 플라스미드 pAM404를 제거하고 개별 콜로니들을 루이신이 결핍된 배지에서 성장하는 무능력을 테스트하여 균주 생성되었다.
균주 Y4909는 균주 Y4027의 ADH5 코딩 서열을 FS_D_3.5 코딩 서열 및 FS_C_7 코딩 서열과 대체하여 생성되었다 (표 17을 참조하라). 본 목적으로, 지수적으로 성장하는Y4909 세포들은 통합 제작물 i2125 (서열번호 99)로 형질전환되었고, 이는 ADH5 서열들의 상류 및 하류에 의해 끼여있는, LEU2 코딩 서열 (LEU2) 또한 GAL1 또는 GAL10 프로모터 (PGAL1 또는 PGAL10) 및 CYC1 또는 ADH1 종결인자 (TCYC1 또는 TADH1)에 의해 각각 끼여있는 파네센 합성효소 변이체 코딩 서열들을 포함하였다 (도 1K). 숙주세포 형질전환체들은 CSM-L 상에서 선별되었고, 선택된 클론들은 진단적 PCR에 의해 검증되었고, 균주 Y4909를 수득하였다.
균주 Y4959는 균주 Y4909로부터 사카로마이세스 세레비시애의 GAL80 유전자의 코딩 서열, 프로모터, 및 종결인자를 제거하여 생성되었다. 본 목적으로, Y4909 세포들은 자발적인 GAL80 "루프 아웃" 재조합 사건들에 대해 선별하도록 CSM-U 상에 도말되었고, 균주 Y4959를 수득하였다.
균주 Y5444는 균주 Y4959의 CAN1 좌위에 TDS_Fs_Sc 코딩 서열을 삽입하여 생성되었다. 본 목적으로, 지수적으로 성장하는Y4959 세포들은 통합 제작물 i2608 (서열번호 100)로 형질전환되었고, 이는 사카로마이세스 세레비시애의 GAL1 프로모터 (PGAL1) 및 사카로마이세스 세레비시애의 CYC1 종결인자 (TCYC1)에 의해 끼여있는 TDS_Fs_Sc 코딩 서열을 포함하였다 (도 1L). 숙주세포 형질전환체들은 카나바닌을 포함하고 아르기닌이 결여된 YNB 배지 상에서 선별되었고, 선택된 클론들은 진단적 PCR에서 의해 검증되었고, 균주 Y5444를 수득하였다.
균주 Y4910는 Y4027의 ADH5 좌위에 FS_A_5.3 코딩 서열, FS_B_5.3 코딩 서열, FS_C_7 코딩 서열, 및 FS_D_3.5 코딩 서열을 삽입하여 생성되었다 (표 17을 참조하라). 본 목적으로, 지수적으로 성장하는Y4909는 통합 제작물 i2127 (서열번호 101)로 형질전환되었고, 이는 ADH5 서열의 상류 및 하류에 의해 끼여있는, LEU2 코딩 서열 (LEU2) 또한 GAL1 또는 GAL10 프로모터 (PGAL1 또는 PGAL10) 및 ADH1 또는 CYC1 종결인자 (TADH1 또는 TCYC1)에 의해 끼여있는 파네센 합성효소 변이체 코딩 서열을 포함하였고 (도 1M), 이는 i2127의 두 개 중복되는 분절들로 공동-형질전환, 이에 의한 두 개 중복되는 플라스미드 삽입체들 간의 상동 재조합의 촉진에 의해 생성되었다. 숙주세포 형질전환체들은 CSM-L 상에서 선별되었고, 선택된 클론들은 진단적 PCR에 의해 검증되었고, 균주 Y4910을 수득하였다.
균주 Y4960는 균주 Y4910로부터 사카로마이세스 세레비시애의 GAL80 유전자의 코딩 서열, 프로모터, 및 종결인자를 제거하여 생성되었다. 본 목적으로, Y4910 세포들은 자발적인 GAL80 "루프-아웃" 재조합 사건들에 대해 선별하도록 CSM-U 상에서 도말되었고, 균주 Y4960를 수득하였다.
균주 Y5445는 균주 Y4960의 CAN1 좌위에 TDS_Fs_Sc 코딩 서열을 삽입하여 생성되었다. 본 목적으로, 지수적으로 성장하는Y4959 세포들은 통합 제작물 i2608 (서열번호 100)로 형질전환되었고, 이는 사카로마이세스 세레비시애의 GAL1 프로모터 (PGAL1) 및 사카로마이세스 세레비시애의 CYC1 종결인자 (TCYC1)에 의해 끼여있는 TDS_Fs_Sc 코딩 서열을 포함하였다 (도 1L). 숙주세포 형질전환체들은 카나바닌을 포함하고 아르기닌이 결여된 YNB 배지 상에서 선별되었고, 선택된 클론들은 진단적 PCR에서 의해 검증되었고, 균주 Y5445를 수득하였다.
균주 Y5064는 균주 Y4960로부터 URA3 마커를 제거하여 생성되었다. 본 목적으로, 지수적으로 성장하는Y4960 세포들은 통합 제작물 i569 (서열번호 102)로 형질전환되었고, 이는 NDT80 서열들의 상류 및 하류에 의해 끼여있는, HXT3 프로모터 (PHXT3) 및 PGK1 종결인자 (TPGK1)에 의해 끼여있는 사카로마이세스 세레비시애의 ACS2 유전자의 코딩 서열들 (ACS2), 또한 GAL7 프로모터 (PGAL7) 및 TDH3 종결인자 (TTDH3)에 의해 끼여있는 Z. mobilis의 PDC 유전자의 코딩 서열 (zmPDC) (도 1N)을 포함하였다. 숙주세포 형질전환체들은 5-FOA를 포함하는 배지 상에서 성장하는 그들의 능력을 기초로 하여 선별되었고, 균주 Y5064를 수득하였다.
균주 Y5065는 균주 Y5064의 BIO4 좌위에 FS_A_5.3 코딩 서열 및 FS_B_5.3 코딩 서열을 삽입하여 생성되었다 (표 17을 참조하라). 본 목적으로, 지수적으로 성장하는Y5064 세포들은 통합 제작물 i2124 (서열번호 103)로 형질전환되었고, 이는 BIO4 서열들의 상류 및 하류에 의해 끼여있는, URA3 코딩 서열 (URA3), 또한 GAL1 또는 GAL10 프로모터 (PGAL1 또는 PGAL10) 및 ADH1 또는 CYC1 종결인자 (TADH1 또는 TCYC1)에 의해 끼여있는 파네센 합성효소 변이체 코딩 서열들을 포함하였다 (도 1O). 숙주세포 형질전환체들은 CSM-L 상에서 선별되었고, 선택된 클론들은 진단적 PCR에 의해 검증되었고, 균주 Y5065를 수득하였다.
균주 Y5066은 균주 Y5064의 BIO4 좌위에 FS_A_5.3 코딩 서열, FS_B_5.3 코딩 서열, FS_C_7 코딩 서열, 및 FS_D_3.5 코딩 서열을 삽입하여 생성되었다 (표 17을 참조하라). 본 목적으로, 지수적으로 성장하는Y5064 세포들은 통합 제작물 i2127 (서열번호 101)로 형질전환되었고, 이는 ADH5 서열들의 상류 및 하류에 의해 끼여있는, LEU2 코딩 서열 (LEU2), 또한 GAL1 또는 GAL10 프로모터 (PGAL1 또는 PGAL10) 및 ADH1 또는 CYC1 종결인자 (TADH1 또는 TCYC1)에 의해 끼여있는 파네센 합성효소 변이체 코딩 서열들을 포함하였고 (도 1M), 이는 i2127의 두 개 중복되는 분절들로 공동-형질전환, 이에 의한 두 개 중복되는 플라스미드 삽입체들 간의 상동 재조합의 촉진에 의해 생성되었다. 숙주세포 형질전환체들은 CSM-L 상에서 선별되었고, 선택된 클론들은 진단적 PCR에 의해 검증되었고, 균주 Y5066를 수득하였다.
균주 Y5446는 균주 Y5065의 CAN1 좌위에 TDS_Fs_Sc 코딩 서열을 삽입하여 생성되었다. 본 목적으로, 지수적으로 성장하는Y4959 세포들은 통합 제작물 i2608 (서열번호 100)로 형질전환되었고, 이는 사카로마이세스 세레비시애의 GAL1 유전자의 프로모터 (PGAL1) 및 사카로마이세스 세레비시애의 CYC1 유전자의 종결인자 (TCYC1)에 의해 끼여있는 TDS_Fs_Sc 코딩 서열을 포함하였다 (도 1L). 숙주세포 형질전환체들은 카나바닌을 포함하고 아르기닌이 결여된 YNB 배지 상에서 선별되었고, 선택된 클론들은 진단적 PCR에서 의해 검증되었고, 균주 Y5446을 수득하였다.
균주 Y5447 는 균주 Y5066의 CAN1 좌위에 TDS_Fs_Sc 코딩 서열을 삽입하여 생성되었다. 본 목적으로, 지수적으로 성장하는Y4959 세포들은 통합 제작물 i2608 (서열번호 100)로 형질전환되었고, 이는 사카로마이세스 세레비시애의 GAL1 프로모터 (PGAL1) 및 사카로마이세스 세레비시애의 CYC1 종결인자 (TCYC1)에 의해 끼여있는 TDS_Fs_Sc 코딩 서열을 포함하였다 (도 1L). 숙주세포 형질전환체들은 카나바닌을 포함하고 아르기닌이 결여된 YNB 배지 상에서 선별되었고, 선택된 클론들은 진단적 PCR에서 의해 검증되었고, 균주 Y5447을 수득하였다.
균주 Y224는 균주 Y211 내로 아모파디엔 합성효소 (ADS), 사이토크롬 P450 모노옥시게나제 (AMO, CYP71AV1), 및 NADP-사이토크롬 P450 산화환원효소 (CPR)를 인코딩하는 발현 플라스미드를 도입하여 생성되었다. 본 목적으로, 지수적으로 성장하는Y211 세포들은 발현 플라스미드 pAM322로 형질전환되었고, 이는 사카로마이세스 세레비시애에서 발현을 위해 코돈-최적화되고 사카로마이세스 세레비시애의 GAL1 또는 GAL10 유전자 프로모터의 조절적 통제 하에 아르테미시아 애누아의 ADS 유전자의 코딩 서열 (ADS), 아르테미시아 애누아의 AMOS 유전자의 코딩 서열, 및 아르테미시아 애누아의 CPR 유전자의 코딩 서열을 포함하였다. 숙주세포 형질전환체들은 CSM-L 상에서 선별되었고, 균주 Y224를 수득하였다.
균주 Y284는 균주 Y224의 GAL1 및 GAL10 유전자들의 분지된 프로모터 및 GAL1 코딩 서열을 하이그로마이신 B 저항성 마커 (hphA)과 대체하여 생성되었다. 본 목적으로, 지수적으로 성장하는Y224 세포들는 통합 제작물 i65 (서열번호 104; 도 1P)로 형질전환되었다. 숙주세포 형질전환체들은 하이그로마이신 B에 대한 그들의 저항성을 기초로 하여 선별되었고, 선택된 클론들은 진단적 PCR에 의해 검증되었고, 균주 Y284를 수득하였다.
균주 Y301는 균주 Y284 의 ERG9 유전자를 사카로마이세스 세레비시애의 CTR3 유전자의 프로모터의 조절적 통제 하에 놓아서 생성되었다. 본 목적으로, 지수적으로 성장하는Y284 세포들은 통합 제작물 i10 (서열번호 105)로 형질전환되었고, 이는 ERG9 유전자의 상류 및 코딩 서열들에 의해 끼여있는 D-세린 탈아미노효소 (dsdA)의 코딩 서열 및 CTR3 프로모터 (PCTR3)를 포함하였다 (도 1Q). 숙주세포 형질전환체들은 D-세린 탈아미노효소 상에서 성장하는 그들의 능력을 기초로 하여 선별되었고, 진단적 PCR에 의해 검증되었고, 균주 Y301를 수득하였다.
균주 Y539는 균주 Y301로부터 발현 플라스미드 pAM322를 제거하여 생성되었다. 본 목적으로, 균주 Y301는 0.5% 루이신 (w/v)을 포함하는 강화된 효모 펩톤 덱스트로스 (YPD) 배지에서 4일 동안 증식되었다. 24시간마다, 배양액은 0.5% 루이신 (w/v)을 포함하는 신선한 YPD에 OD600 0.05로 접종되었다. 4일 이후에, 세포들은 일련 희석되었고 YPD 고체 아가 상 에 도말되었고, 플레이트들은 30℃에서 4일 동안 배양되었다. 두 개의 구별되는 콜로니 크기들이 관찰되었다. 더 작은 콜로니들은 (pAM322의 소실을 가리킴) 루이신이 결여된 최소 배지 상에 복제 도말되었다. YPD 고체 아가 상에서는 자랄 수 있지만 루이신 결핍 배지에서는 자라지 못하는 클론들이 균주 Y539로서 선별되었다.
실시예 3
본 실시예는 개선된 생체내 성능을 가진 테르펜 합성효소들을 검색하도록 대장균에서 FPP 기아 기초 선별을 사용하는 유용성을 기술하고 있다.
DH5α 화학적- 또는 전기적-적합 대장균 세포들 (Invitrogen, Carlsbad, CA)이 발현 플라스미드들 pAM1668 (음성 대조군), pAM1670, pAM2096, pAM2097, pAM2098, pAM2101, 및 pAM2104로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 발현 플라스미드 5 ng으로 형질전환되었다. 숙주세포 형질전환체들은 카베니실린을 포함하는 한천 배지들 상에 도말되었고, 플레이트들은 2 내지 3일 동안 30℃에서 배양되었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 발현 플라스미드 pAM2097 또는 pAM2096로 형질전환된 세포들은 빈 벡터 (pAM1668)로 형질전환된 세포들과 동일한 크기의 콜로니들을 생산하였다. 그러나, 발현 플라스미드 pAM1670, pAM2098로 형질전환된 세포들, 뿐만 아니라 발현 플라스미드들 pAM2104 또는 pAM2101로 형질전환된 세포들 (결과 미도시)은 대조군에 의해 생산된 것들보다 작은 콜로니들을 생산하였다. 더 작은 콜로니 크기는 활성을 가진 세스퀴테르펜 합성효소의 발현에 의해 매개된 숙주세포들에서 FPP의 파네센으로 전환에 의해 촉발된 FPP 기아에 의한 것 같다. 이들 세스퀴테르펜 합성효소들의 생체내 활성들은 72시간에서 진탕 플라스크들에 있는 숙주 세포들의 GC 분석에 의해 입증되었고 (도 4), 대장균에서 FPP 기아 기초 선별이 생체내 효소 활성에 대해 세스퀴테르펜 합성효소들을 검색하는 데 사용될 수 있는 점을 보여주었다.
실시예 4
본 실시예는 개선된 생체내 성능을 가진 세스퀴테르펜 합성효소들을 검색하도록 대장균에서 FPP 기아 기초 선별을 사용하는 유용성을 기술하고 있다.
DH5α 화학적- 또는 전기적-적합 대장균 세포들 (Invitrogen, Carlsbad, CA)이 5 ng의 발현 플라스미드 pAM765 (숙주세포들에서 FPP의 생산을 종합적으로 증가시키는 MEV 경로의 효소들을 인코딩함) 또한 발현 플라스미드들 pAM1668 (음성 대조군) pAM1670, pAM2117, pAM2157, pAM2158, pAM2098, pAM2104, pAM2097, pAM2101, 및 pAM2096로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 5 ng의 발현 플라스미드로 공동-형질전환되었다. 숙주세포 형질전환체들은 클로르암페니콜 및 카베니실린을 포함하는 한천 배지들 상에 도말되었고, 플레이트들은 2 내지 5일 동안 30℃에서 배양되었다.
도 3 및 표 12에 나타난 바와 같이, 빈 벡터 (pAM1668)로 형질전환된 세포들은 아마도 숙주 세포들에서 독성 FPP의 축적에 의해 촉발된 세포 사망으로 인해, 콜로니들을 전혀 생산하지 않았다 (Withers at al. (2007) Appl . Environ . Microbiol. 73:6277-6283). 유사하게, 발현 플라스미드 pAM2158 또는 pAM2117로 형질전환된 세포들은 아마도 이들 플라스미들의 파네센 합성효소 코딩 서열들이 대장균 숙주세포들에서 효율적인 발현을 위해 코돈-최적화되지 않은 점으로 인해, 콜로니들을 형성하지 못하였다. 발현 플라스미드들 pAM2096로 형질전환된 세포들도 역시 콜로니들을 형성하지 못하였고, Citrus junos 파네센 합성효소가 대장균 숙주세포들에서 충분한 활성을 보유하지 못한 점을 제시하였다. 다른 형질전환된 세포들 모두가 아마도 발현 플라스미드들 pAM1670, pAM2157, pAM2098, pAM2104, pAM2097, 및 pAM2101에 의해 인코드되는 활성을 가진 세스퀴테르펜 합성효소들에 의한 덜 독성인 세스퀴테르펜으로의 FPP의 전환으로 인해, 배양 1 내지 3일 이내에 콜로니들을 생산하였다. 여러 이들 세스퀴테르펜 합성효소들의 생체내 활성들은 72시간에서 진탕 플라스크들에 있는 숙주 세포들의 GC 분석에 의해 입증되었고 (도 4), 대장균에서 FPP 독성 기초 성장 선별이 생체내 효소 활성에 대해 세스퀴테르펜 합성효소들을 검색하는 데 사용될 수 있는 점을 보여주었다.
Figure 112013079359371-pct00012
실시예 5
본 실시예는 개선된 생체내 성능을 가진 세스퀴테르펜 합성효소들을 검색하도록 효모에서 FPP 독성 기초 성장 선별을 사용하는 유용성을 기술하고 있다.
균주 Y3198는 500 ng의 제작물 A 또는 제작물 B로 각각 형질전환되었다. 숙주세포 형질전환체들은 5 mL YPD 배지에서 250 rpm으로 진탕하면서 6시간 동안 배양되었고, 5 mL diH2O으로 두 번 세척되었다. 각 세척된 배양액의 절반은 단독 탄소원으로서 2% 갈락토스를 포함하는 CSM-L 한천 배지들에 도말되었다 (갈락토스 상의 성장은 균주 Y3198 내로 조작된 MEV 경로 효소 코딩 서열들의 발현을 유도하여, 세포들에서 증가된 FPP 생산을 가져오는 점을 주목하라). 각 세척된 배양액의 남아있는 절반은 단독 탄소원으로서 2% 포도당을 포함하는 CSM-L 한천 배지들에 도말되었다. 플레이트들은 개별 콜로니들이 대략 1 mm의 반경이 될 때까지 30℃에서 3일 동안 배양되었다.
도 5에서 나타난 바와 같이, 제작물 A로 형질전환된 세포들만이 단독 탄소원으로서 갈락토스를 포함하는 CSM-L 배지 상에서 성장할 수 있었고, 효모에서 생체내 효소 활성에 대해 세스퀴테르펜 합성효소들을 검색하는 데 FPP 독성 기초 성장 선별의 유용성을 보여주었다.
실시예 6
본 실시예는 개선된 생체내 성능을 가진 테르펜 합성효소들을 검색하도록 나일 레드 형광을 사용하는 유용성을 기술하고 있다.
상대적인 파네센 역가들을 결정하기 위하여, 제작물 A로 형질전환된 균주 Y3198의 48개 콜로니들 및 발현 플라스미드 pAM404로 형질전환된 균주 Y3198의 48개 콜로니들이 웰 당 2% 갈락토스를 가진 360 uL의 버드 종자 배지 (BSM)를 포함하는 96-웰 플레이트의 분리된 웰들로 나뉘었다 (전배양). 999 rpm 교반으로 30℃에서 배양 2일 이후에, 각 웰의 16 uL이 2% 갈락토스를 가진 신선한 360 uL의 BSM을 포함하는 새로운 96-웰 플레이트의 웰 내로 접종되었다 (생산 배양). 또 다른 999 rpm 교반으로 30℃에서 배양 2일 이후에, 시료들이 나일 레드 형광에 의한 파네센 역가 결정을 위해 취해졌다.
나일 레드 형광 분석을 위해, 98 uL의 각 배양액이 96-웰 검은색 폴리스티렌 편평 바닥 플레이트 내로 옮겨졌고, DMSO에 넣어 100 ug/mL로 용해된 2 uL의 나일 레드 (Invitrogen, Carlsbad, CA)가 각 웰에 첨가되었다. 형광 수준들이 500 nm에서 여기 및 550 nm에서 방출로 바로 측정되었다.
도 6에서 나타난 바와 같이, 제작물 A로 형질전환된 균주 Y3198에서 FS_Aa_Sc 코딩 서열의 단일한 염색체로 통합된 사본은 고-사본수 발현 플라스미드 pAM404로 형질전환된 균주 Y3198로 획득된 것의 39%가 되는 나일 레드 형광 신호를 생산하였다. 두 개 균주들 간의 파네센 역가들에서 대략 3배의 차이가 GC 분석에 의해 입증되었고 (결과 미도시), 본 시스템의 경우 개선된 생체내 성능을 가진 테르펜 합성효소들을 위해 적합한 검색이 되도록 나일 레드 형광 수준들 (예로, 파네센 수준들)에서 충분한 차이 (델타)가 존재하는 점을 보여주었다.
실시예 7
본 실시예는 세스퀴테르펜 합성효소들을 그들의 생체내 효소 활성 수준들에 따라 순위 매기도록 효모에서 세스퀴테르펜 합성효소 경쟁을 사용하는 유용성을 기술하고 있다.
각각의 효모 균주들 Y3353 및 Y3354을 위해, 발현 플라스미드 pAM1812 또는 pAM1813 각각으로 균주 Y3125의 형질전환의 8개의 단일 콜로니들이 웰 당 2% 슈크로스를 가진 360 uL의 버드 종자 배지 (BSM)를 포함하는 96-웰 플레이트의 분리된 웰들에서 배양되었다 (전배양). 999 rpm 교반으로 30℃에서 배양 2일 이후에, 각 웰의 16 uL이 2% 슈크로스를 가진 신선한 360 uL의 BSM을 포함하는 새로운 96-웰 플레이트의 웰 내로 접종되었다 (생산 배양). 또 다른 999 rpm 교반으로 30℃에서 배양 2일 이후에, 시료들이 취해졌고 기체 크로마토그래피 (GC) 분석에 의해 테르펜 생산에 대해 분석되었다. 각 균주를 위해, 단일 콜로니가 역시 CSM-L-M-U 한천 배지들 상에서 재도말되었고, 각 재도말 (re-streak)로부터 얻은 8개의 단일 콜로니들이 기술된 바와 같이 성장되었고, GC 분석에 의해 테르펜 생산에 대해 분석되었다.
GC 분석을 위해, 시료들이 메탄올-헵탄 (1:1 v/v)으로 추출되었고, 혼합물은 세포성 물질을 제거하도록 원심분리되었다. 메탄올-헵탄 추출물의 분량이 헵탄으로 희석된 다음, 펄스 분리 주입을 사용하여 메틸 실리콘 정지상 상에 주입되었다. 파네센 및 트리코디엔이 점화 이온화 검출 (FID)로 GC를 사용하는 비등점에 의해 분리되었다. 트랜스-β-카리오필렌이 특정된 GC 오븐 프로파일 동안 성공적인 주입 및 용출을 감시하도록 보유 시간 마커로서 사용되었다. 파네센 및 트리코디엔의 역가들이 파네센/트리코디엔 비율들을 계산하는 데 사용되었다.
도 13에서 나타난 바와 같이, 독립적인 원래 형질전환체 중에서 테르펜 역가들은 웰마다 상당하게 다양화되었고, 29%까지의 계수들의 변화 (CVs) 를 가져왔다. CVs는 8개의 복제본들의 경우 감소되었다. 관찰된 CVs는 웰마다 또한 클론마다 변화들이 세스퀴테르펜들을 생산하는 세스퀴테르펜 합성효소들의 활성들에 관해 세스퀴테르펜 역가들로부터 직접 결론들을 내는 것을 불가능하게 하는 점을 보여주고 있다. 그러나, 표 13에서도 역시 나타난 바와 같이, 파네센/트리코디엔 비율들은 시료들 전체를 통해 오히려 일정하였고, 단지 5.7%의 CVs를 생산하였다. 따라서, 대조군 세스퀴테르펜 합성효소와 동일한 플라스미드로부터 테스트 세스퀴테르펜 합성효소를 공동-발현하여, 또한 테스트 및 대조군 세스퀴테르펜 합성효소들의 활성들을 비교하여, 웰마다 및 클론마다 변화들이 크게 감소되었고, 대조군 세스퀴테르펜 합성효소 (예로, TDS)의 효율에 대한 테스트 세스퀴테르펜 합성효소 (예로, 파네센 합성효소)의 생체내 촉매적 효율을 벤치마크하는 것을 가능하게 하였다.
Figure 112013079359371-pct00013
효모에서 세스퀴테르펜 합성효소 활성들을 위한 순위매김 도구로서 세스퀴테르펜 합성효소 경쟁을 좀 더 입증하기 위하여, 효모 균주들 Y3353, Y3394, 및 Y3395가 기술된 바와 같이 평가되었다. 표 14에서 나타난 바와 같이, 절대적인 파네센 역가들은 다시 유의한 변화들을 보여주었던 한편, 파네센/트리코디엔 비율들을 위해 낮은 CVs가 관찰되었다. 관찰된 비율에 의해 판단된 바와 같이, 테스트된 파네센 합성효소들은 다음과 같이 (가장 큰 활성을 가진 것부터 가장 작은 활성을 가진 것까지) 순위가 매겨질 수 있었다: FS_Ad_Sc 코딩 서열 (Y3395) 로부터 발현되는 Actinidia deliciosa 파네센 합성효소 > FS_Aa_Sc 코딩 서열 (Y3353)로부터 발현되는 아르테미시아 애누아 파네센 합성효소 > FS_S2D_Ec 코딩 서열 (Y3394)로부터 발현되는 S2D 변이 아르테미시아 애누아파네센 합성효소. 본 순위매김은 FS_Aa_Sc, FS_S2D_Ec, 또는 FS_Ad_Sc 코딩 서열의 단일 사본을 보유하는 균주들을 사용하는 GC 분석에 의해 검증되었고 (도 7), 따라서 세스퀴테르펜 합성효소를 효모에서 그들의 생체내 효소 활성 수준들에 따라 순위 매기는 수단으로서 세스퀴테르펜 합성효소 경쟁의 유용성을 입증하였다.
Figure 112013079359371-pct00014
효모에서 세스퀴테르펜 합성효소 활성들을 위한 순위매김 도구로서 세스퀴테르펜 합성효소 경쟁을 좀 더 입증하기 위하여, 효모 균주들 Y5444, Y5445, Y5446, 및 Y5447가 다음의 예외들을 가지고 기술된 바와 같이 평가되었다: 각 균주를 위해, 8개의 콜로니들 대신에 4개의 콜로니들이 분석되었고, 배양액들은 30℃에서가 아닌 34℃에서 배양되었으며, 전배양들은 2일이 아닌 3일 동안 지속되었고, 생산 배양액은 전배양액의 10배 희석이었다. 표 15 및 도 8에서 나타난 바와 같이, 선형의 관계성이 통합된 파네센 합성효소 코딩 서열들의 수 및 파네센 대비 트리코디엔 비율들 간에 관찰되었고, 세스퀴테르펜 합성효소를 효모에서 그들의 생체내 효소 활성 수준들에 따라 순위 매기는 수단으로서 세스퀴테르펜 합성효소 경쟁의 유용성을 입증하였다.
Figure 112013079359371-pct00015
실시예 8
본 실시예는 세스퀴테르펜 합성효소들 변이체들의 라이브러리들을 생성하는 방법들을 기술하고 있다.
여러 파네센 합성효소 변이체 라이브러리들이 주형으로서 FS_S2D_Ec 코딩 서열을 사용하여 생성되었다. 각 라이브러리를 위해, 250 내지 500 ng의 pAM1670가 GeneM 또는 ph® Ⅱ 랜덤 돌연변이화 키트 (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA)를 제조사의 제시된 프로토콜들에 따라 사용하고 프라이머들 LX-268-®139-S2D-F (서열번호 106) 및 LX-268-139-S2D-R (서열번호 107)을 25회 증폭 순환들에 사용하여 오류-빈발 PCR이 되었다. PCR 산물들은 젤 정제되었고 FastDigest® NdeI 및 BamHI 제한효소들 (Fermentas Inc., Burlington, Ontario)로 연속하여 소화되었다. 벡터 pAM1668는 동일한 두 개의 제한효소들을 사용하여 완전하게 소화되었고, 선형화된 벡터 DNA 단편은 재원형화를 허용하는 5'포스페이트기들을 제거하도록 송아지 장 알칼라인 포스파타제 (CIP)로 처리되었다. 정제된 PCR 산물들 및 선형화된 pAM1688 벡터는 T4 DNA 리가제를 사용하여 3:1의 삽입체 대비 벡터 비율로 라이게이션되고, 2 uL의 라이게이션 반응 혼합물이 XL1-Blue 전기적-적합 대장균 세포들 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) 내로 제조사의 제시된 프로토콜들에 따라 형질전환되었다. 숙주세포 형질전환체들은 카베니실린을 포함하는 여러 개의 LB 한천 배지들 (100 mm 반경) 상에서 선별되었다. 무작위 돌연변이화 라이브러리의 품질을 평가하기 위하여, 48개 또는 96개 단일 콜로니들이 뽑혔고 카베니실린을 포함하는 LB 배지에서 성장되었고, 플라스미드 DNA각 각 배양액으로부터 QIAprep 96 터보 미니프렙 키트 (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 분리되었고, 플라스미드 DNA가 FastDigest® NdeI 및 BamHI 제한효소들 (Fermentas Inc., Burlington, Ontario)을 사용하여 소화되어 대략 95%의 플라스미드들이 삽입체를 포함하였던 점을 결정하였다. 플라스미드들은 돌연변이 빈도를 결정하도록 역시 서열결정되었고, 이는 추정된 평균이 FS 코딩 서열 당 2 내지 6개 뉴클레오타이드 변화들이 되는 것으로 확인되었다. 남아있는 콜로니들은 한천 배지들로부터 세척되었으며, 플라스미드 DNA는 QIAprep 스핀 미니프렙 키트 (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 분리되었다.
여러 개의 파네센 합성효소 변이체 라이브러리들도 역시 주형으로서 FS_Aa_Sc 코딩 서열을 사용하여 생성되었다. 제작물 C는 최종적 조립 이전에 FS_Aa_Sc PCR 산물이 제조사의 제시된 프로토콜들에 따라 Mutazyme Ⅱ® 키트 (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA) 및 프라이머들 AM-288-90-CPK1618 (서열번호 83) 및 AM-288-90-CPK1619 (서열번호 84)를 사용하여 오류-빈발 PCR에 의해 돌연변화되는 점을 제외하고 제작물 A와 필수적으로 일치하였다. 균주 Y3198는 500 ng의 제작물 C로 형질전환되었고, 숙주세포 형질전환체들은 그들이 2% 갈락토스를 가진 CSM-L 상에서 도말되기 이전에 5 mL YPD 배지에서 250 rpm으로 진탕하면서 6시간 동안 회수되었다.
실시예 9
본 실시예는 대장균에서 FPP 독성 기초 성장 선별에 의해 세스퀴테르펜 합성효소 변이체들의 라이브러리들을 검색하는 방법들을 기술하고 있다.
ElectroMAX DH5-α-E 대장균 세포들 (Invitrogen, Carlsbad, CA)이 5 ng의 발현 플라스미드 pAM765 (MEV 경로의 효소들을 인코딩함) 및 5 ng의 실시예 8의 FS_S2D_Ec 기초 파네센 합성효소 변이체 라이브러리 플라스미드들로 형질전환되었다. 40회 이상의 공동-형질전환 실험들이 ~ 2 x 105개 숙주세포 형질전환체들을 생성하도록 수행되었다. 숙주세포 형질전환체들이 카베니실린 및 클로르암페니콜을 포함하는 LB 한천 배지들 (100 mm 반경) 상에 도말되었고, 30?에서 2시간 동안 배양되었고, 이후에 대략 400개의 큰 콜로니들 및 유사한 수의 작은 콜로니들이 한천 배지들 상에서 관찰되었다. ElectroMAX DH5α-E 대장균 세포들 (Invitrogen, Carlsbad, CA)이 5 ng의 발현 플라스미드 pAM765만으로 형질전환되었고, 카베니실린 및 클로르암페니콜을 포함하는 LB 한천 배지들 상에 도말되었을 때 콜로니들은 전혀 관찰되지 않았다. 이들 콜로니들 모두가 부모 파네센 합성효소와 동등하거나 더 큰 활성을 소유하는 파네센 합성효소 변이체들을 포함하는 것으로 가정하여, 적중율은 대략 1%로 추정되었다.
실시예 10
본 실시예는 나일 레드 형광을 사용하여 테르펜 합성효소 변이체들의 라이브러리들을 검색하는 방법들을 기술하고 있다.
실시예 9의 FPP 기초 성장 선별 검색에서 획득된 거대 콜로니들이 개별적으로 웰 당 5 uL diH2O을 포함하는 96-웰 플레이트들 내로 뽑혔고 98?에서 10분 동안 가열되었다. 생성된 용출물들은 XL1-Blue 화학적-적합 대장균 세포들 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) 내로 형질전환되었고, 숙주세포 형질전환체들은 카베니실린을 포함하는 LB 한천 배지들 상에 도말되었다. 클로르암페니콜이 선택 배지로부터 생략되어 발현 플라스미드 pAM765가 세포들로부터 소실되었던 점을 주목하라. 개별 콜로니들이 뽑혔고 카베니실린을 포함하는 LB 배지에서 성장되었으며, 플라스미드 DNA가 QIAprep 96 터보 미니프렙 키트 (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 분리되었다. 거대 콜로니들이 선택 플레이트들로부터 분리된 이후에, 작은 콜로니들이 플레이트들로부터 세척되었고, 그들의 플라스미드들은 유사한 방식으로 혼합물로서 분리되었다.
XL1-Blue 화학적-적합 대장균 세포들 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA)은 5 ng의 발현 플라스미드 pAM97 (MEV 경로의 효소들을 인코딩함) 및5 ng의 분리된 플라스미드들 (거대 콜로니들로부터 획득됨) 또는 플라스미드 혼합물 (작은 콜로니들로부터 획득됨)으로 공동-형질전환되었다. 숙주세포 형질전환체들은 카베니실린 및 클로르암페니콜을 포함하는 LB 한천 배지들 상에 도말되었고, 37℃에서 24시간 동안 배양되었다. 개별 콜로니들은 카베니실린 및 클로르암페니콜을 포함하는 M9-헤르페스 배지를 포함하는 96-웰 플레이트들 내로 접종되었고, 배양액들은 30℃에서 24시간 동안 배양되었다 (전배양). 다음으로, 50 uL의 각 배양액은 두 번째 배양을 0.05의 초기 OD로 접종하는 데 사용되었다. MEV 경로 및 파네센 합성효소의 발현을 유도하기 위하여, 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드 (IPTG)가 각 배양액에 1 mM 최종 농도로 첨가되었다. 배양액들은 나일 레드 형광에 의해 파네센 역가들이 결정되기 이전에 적어도 20시간 동안 배양되었다 (생산 배양). pAM97 및 pAM1419으로 공동-형질전환된 대장균 균주가 음성 대조군으로서 사용되었고, pAM97 및 pAM1421로 공동-형질전환된 대장균 균주가 양성 대조군으로서 사용되었다. 나일 레드 형광 분석을 입증하기 위하여, 파네센 역가들도 역시 GC 분석에 의해 결정되었다.
도 9에서 나타난 바와 같이, 측정된 나일 레드 형광 신호들은 GC 분석에 의해 결정된 파네센 역가들과 직접적으로 상관되어 있었고, 또한 나일 레드 형광을 파네센 역가들을 측정하는 수단으로서 입증하였다.
나일 레드 형광 및 GC 분석에 의해 결정된 바와 같이 가장 큰 파네센 역가들을 생산하였던 거대 콜로니들로부터 획득된 플라스미드들로 형질전환된 세포들로부터 유래한 탑 70 균주들이 새로운 96-웰 플레이드들 내로 복제-도말되었고, 그들의 생산 수준들은 기술된 바와 같이 재측정되었다. 도 10에 나타난 바와 같이, 이들 균주들의 대략 50개는 부모 FS_S2D_Ec 코딩 서열을 포함하는 대조군 균주보다 높은 파네센 역가들을, 부모 파네센 합성효소보다 65% 이상의 파네센을 생산하는 최고의 파네센 합성효소 변이체로 생산하였다.
대략 400개의 큰 콜로니들로부터 추출된 플라스미드들은 등분자 양들로 조합되었고, FS 코딩 서열들은 프라이머들 LX-268-130-3-S2D-F (서열번호 110) 및 LX-268-130-4-S2D-R (서열번호 109)을 사용하여 PCR 증폭되었고, PCR 산물들은 젤 정제되었다. 벡터 pAM1734는 FastDigest® Bst1101 제한효소 (Fermentas Inc., Burlington, Ontario)를 사용하여 선형화되었고, 선형화된 벡터는 Zymo DNA 세척 & 농축TM 키트 (Zymo Research Corp., Orange, CA)를 사용하여 세척되었다. 정제된 벡터 및 PCR 산물들은 1:3 (벡터:삽입체)의 비율로 혼합되었고, 균주 Y539 또는 균주 Y3198 내로 상동 재조합을 통한 라이게이션을 위해 형질전환되었다. 숙주세포 형질전환체들은 단독 탄소원으로서 2% 포도당 (Y539 숙주) 또는 2% 갈락토스 (Y3198 숙주)을 가진 CSM-L 한천 배지들 상에 도말되었다. 대략 2,500개의 개별 콜로니들이 뽑혔고, 파네센 역가들이 기술된 바와 같이 (Y539 숙주의 경우 2% 포도당을 가진 BSM, 또한 Y3198 숙주의 경우 2% 갈락토스를 가진 BSM을 사용함), 나일 레드 형광에 의해 결정되었다. 부모 대조군 (Y539에서 pAM1764 (CEN.ARS 플라스미드 상의 FS_S2D_Ec))의 경우 획득된 신호보다 3배 표준 편차로 더 큰 형광 신호를 생산하였던 클론들이 단일 콜로니들을 획득하도록 CSM-L 한천 배지들 상에 재도말되었고, 각 재도말의 4개 콜로니들이 나일 레드 형광 및 GC 분석에 의해 다시 테스트되었다. 도 11A 및 11B에 나타난 바와 같이, 파네센 합성효소 변이체로 형질전환된 많은 세포들은 부모 대조군 균주보다 더 높은 파네센 역가들을 생산하였고, 소수가 발현 플라스미드 pAM1765 (고-사본수 플라스미드 상의 FS_Aa_Ec)로 형질전환된 균주 Y539보다 훨씬 더 높은 역가들을 생산하였다.
실시예 11
본 실시예는 효모에서 FPP 독성 기포 성장 선별에 의해 세스퀴테르펜 합성효소 변이체들의 라이브러리들을 검색하는 방법들을 기술하고 있다.
실시예 8의 제작물 C로 형질전환된 균주 Y3198의 세척된 형질전환이 단독 탄소원으로서 2% 갈락토스를 포함하는 CSM-L 한천 배지들에 도말되었다. 플레이트들은 5일 동안 30℃에서 배양되었고, 콜로니들은 뽑혔고 증식되었고 기술된 바와 같이 나일 레드 형광 및 GC 분석에 의해 분석되었다. 도 12에 나타난 바와 같이, 단독 탄소원으로서 갈락토스 상에서 성장된 대략 15%의 클론들이 부모 대조군 (제작물 C로 형질전환된 균주 Y3198)으로 획득된 평균 역가보다 적어도 15% 더 높은 파네센 역가들을 가졌다. 부모 대조군보다 적어도 15% 더 높은 파네센 역가들을 가지는 클론들은 2% 포도당을 포함하는 CSM-L 한천 배지들에 개별 콜로니들을 위해 도말되었다. 각 클론을 위해, 6개의 개별 콜로니들이 뽑혔고 GC 분석에 의해 기술된 바와 같이 다시 테스트되었다. GC 검정법을 통하여 대조군보다 >15% 더 높은 평균 파네센 역가를 유지하였던 클론들은 세스퀴테르펜 경쟁 검정법을 위해 촉진되었다.
실시예 12
본 실시예는 효모에서 세스퀴테르펜 합성효소 경쟁에 의해 세스퀴테르펜 합성효소 변이체들을 검색하는 방법들을 기술하고 있다.
플라스미드들은 탑 파네센을 생산하는 실시예 10의 효모 균주들로부터 ZymoprepTM 효모 플라스미드 미니프렙 키트 (Zymo Research Corp., Orange, CA)를 사용하여 분리되었다. 플라스미드들은 BamHI 및 NheI 제한효소들을 사용하여 소화되었고, 파네센 합성효소 변이체 코딩 서열들이 젤 정제되었고, 동일한 두 개의 제한효소들로 소화된 발현 벡터 pAM1812와 라이게이션되었고, 따라서 pAM1812의 FS_Aa_Sc 코딩 서열을 변이체들 FS_S2D_Ec 또는 FS_Aa_Sc 코딩 서열들과 대체하였다.
임의적으로, 또한 추가적으로, 파네센 합성효소 변이체 코딩 서열들은 분리된 세포들로부터 또는 탑 파네센을 생산하는 실시예 11의 효모 균주들의 세포 용출물들로부터 프라이머들 AM-288-90-CPK1618 (서열번호 83) 및 AM-288-90-CPK1619 (서열번호 84)를 사용하여 PCR 증폭되었고, PCR 산물들은 제조사의 제시된 프로토콜들에 따라 E.Z.N.A.® 젤 추출 키트 (Omega Bio-Tek Inc., Norcross, GA)를 사용하여 젤 정제되었고, FastDigest BamHI 제한효소 (Fermentas Inc., Burlington, Ontario)로 소화된 발현 플라스미드 pAM1948와, 균주 Y3125를 둘 다의 정제된 DNA 단편들로 형질전환하고, 따라서 pAM1948의 IS_Pn_Sc 코딩 서열을 변이체 FS_S2D_Ec 코딩 서열들과 대체하는 것에 의한 상동 재조합을 통해 라이게이션되었다.
숙주세포 형질전환체들은 단독 탄소원으로서 2% 포도당을 가진 CSM-L 한천 배지들에 도말되었고, 다음으로 숙주세포 형질전환체에서 GAL80 코딩 서열을 루프 아웃하도록 CSM-L-U 한천 배지들에 30℃에서 적어도 72시간 동안 복제-도말되었다. 각 클론을 위해, 8개의 콜로니들이 뽑혔고, 증식되었고, 그들의 테르펜 역가들이 GC 분석에 의해 기술된 바와 같이 결정되었다. 부모 파네센 합성효소를 위해 획득된 비율보다 더 높은 파네센/트리코디엔 비율을 생산하였던 파네센 합성효소 변이체들 (pAM1812로 형질전환된 균주 Y3125)은 CSM-L 한천 플레이트들에 재도말되었다. 각 재도말을 위해, 8개의 개별 콜로니들이 기술된 바와 같이 96-웰 플레이트 생산 실험들에서 다시 테스트되었다. 파네센 합성효소 변이체를 포함하는 모두 11개 효모 균주들이 개선된 파네센/트리코디엔 비율들을 보여주었고, 이들 파네센 합성효소 변이체들이 효모에서 개선된 생체내 효소 활성을 소유하는 점을 제시하였다.
실시예 13
본 실시예는 개선된 효소 활성을 가지는 세스퀴테르펜 합성효소 변이체의 특성분석을 기술하고 있다.
가능한 원인적 돌연변이들을 확인하기 위하여, 실시예 12에서 또는 기술된 바와 같이 필수적으로 생성되고 검색된 파네센 합성효소 변이체들의 다른 라이브러리들에서 확인된 개선된 파네센 합성효소 변이체들은 엘림 바이오제약사 (Elim Biopharmeceuticals, Inc., Hayward, CA)에 의해 서열결정되었다. 확인된 돌연변이들은 표 16에 나열되어 있다. 전반적으로, 추정된 300,000개의 클론들 모두가 대장균 및/또는 효모에서 FPP 독성 기초 성장 선별, 나일 레드 형광 및/또는 GC 분석, 및 효모에서 세스퀴테르펜 합성효소 경쟁에 의해 검색되고 평가되었고, 개선된 효소 활성을 가진 51개의 파네센 합성효소 변이체들을 가져왔다. 많은 파네센 합성효소 변이체들이 한 번 이상 (횟수는 표 16에서 변이체의 명칭 다음에 괄호로 표시됨) 확인되었고, 소정의 뉴클레오타이드 및 아미노산 변화들이 복수의 파네센 합성효소 변이체들에서 발견되었고, 돌연변이들 및 증가된 효소 활성 간의 인과 관계들을 제시하였다. 일정의 파네센 합성효소 변이체들에서, 침묵의 돌연변이들이 밝혀졌고, 이들 돌연변이들이 아마도 인코드된 FS의 발현을 개선하는 점을 제시하였다.
Figure 112013079359371-pct00016
Figure 112013079359371-pct00017
Figure 112013079359371-pct00018
실시예 14
본 실시예는 돌연변이들을 조합하고 효모에서 세스퀴테르펜 합성효소 경쟁을 사용하여 개선된 파네센 합성효소 변이체들을 검색하는 방법들을 기술하고 있다.
실시예 13에서 확인된 다양한 아미노산 변화들은 서열 중복 연장 (SOE; Ho, et al , 1989)에 의해 조합되었고, 조합들은 개선된 효소 활성을 가진 FS를 확인하도록 기술된 바와 같이 세스퀴테르펜 합성효소 경쟁에 의해 검색되었다. 표 17에서 나타난 바와 같이, 여러 개의 파네센 합성효소 변이체들은 야생형 A. annua FS 의 것과 대비 그들의 파네센/트리코디엔 비율들에서 실질적인 개선들을 보여주었다. 여러 가지의 이들 파네센 합성효소 변이체들의 증가된 활성은 또한 파네센 합성효소 변이체들 코딩 서열들의 단일한 염색체로 통합된 사본들을 포함하는 효소 균주들의 GC 분석에 의해 검증되었다 (도. 14).
Figure 112013079359371-pct00019
실시예 15
본 실시예는 야생형 파네센 합성효소 및 파네센 합성효소 변이체 단백질들을 발현하고 정제하는 방법들을 기술하고 있다.
대장균 로제타 (DE3) 세포들은 FS_Aa_Ec, FS_B_5.3_Ec (대장균에서 발현을 위해 코돈-최적화된 FS_B_5.3)를 포함하는 발현 플라스미드들 또는 벡터 pAM1490 (서열번호 117)의 BamHI 및 NdeI 부위들 내로 클론된 FS_C_8 코딩 서열로 형질전환되었다. 숙주세포 형질전환체들의 1 L 배양액들에서 FS의 발현은 0.4 mM IPTG을 첨가하여 유도되었고, 각 배양액은 20℃에서 20시간 동안 배양되었다. 세포 용출물들은 Ni 세파로스TM 6 패스트 플로우 레진 (GE Healthcare, Piscataway, NJ)으로 미리 충전된 His GraviTrap 컬럼 상에 로딩되었다. 컬럼들은 10 mL (10 배 컬럼 부피) 결합 완충액 (50 mM 트리스-HCl, pH 8.0, 500 mM NaCl, 5 mM 이미다졸, 5% 글리세롤, 0.5 mM DTT)으로 세척되었고, 분획들은 단계적으로 50 (분획 1), 100 (분획 2), 또는 250 mM (분획 3) 이미다졸을 포함하는 4 ml 용출 완충액 (50 mM 트리스-HCl, pH 8.0, 500 mM NaCl, 5% 글리세롤, 0.5 mM DTT)을 사용하여 용출되었다. 모든 분획들은 결합 완충액에 대해 투석되었고, 분획 2는 또한 투석 카세트에서 단백분해효소 소화 완충액 (20 mM 트리스-HCl, pH 7.5, 200 mM NaCl, 5% 글리세롤, 1 mM DTT)에 대해 투석되었다. His6-태그들을 제거하기 위하여, 120 U의 PreScission 단백분해효소 (GE Healthcare, Piscataway, NJ)가 직접적으로 각 투석 카세트에 첨가되었고, 단백분해효소-소화된 시료들이 저장 완충액 (20 mM 트리스-HCl, pH 7.5, 200 mM NaCl, 20% 글리세롤, 1 mM DTT)에 대해 투석되고 투석 카세트로부터 제거되기 이전에 투석이 밤새 계속되도록 허용되었다. GST-태그된 단백분해효소를 제거하기 위하여, 저장 완충액으로 미리 세척된 글루타치온 세파로스 4B 비드들 (GE Healthcare, Piscataway, NJ)이 단백분해효소-소화된 시료들에 첨가되었고, 비드 혼합물들은 가만히 혼합하면서 한 시간 동안 배양되었다. FS 단백질들은 폴리-프렙 크로마토그래피 컬럼 (Bio-Rad, Hercules, CA)을 통해 혼합물들을 통과시켜서 최종적으로 회수되었고, 정제된 FS 단백질들은 -80℃에서 저장되었다.
분리된 파네센 합성효소 변이체들은 역학적 특성들을 위해 검정되었다. 표 18에서 나타난 바와 같이, 파네센 합성효소 변이체들의 증가된 생체내 활성은 분리된 파네센 합성효소 변이체들의 증가된 kcat에 반영되었다.
Figure 112013079359371-pct00020
실시예 16
본 실시예는 파네센 합성효소 발현을 효모에서 FPP 독성-기초 성장 선별을 가능하게 하는 수준으로 조정하는 데 적합한 프로모터를 선택하도록 세스퀴테르펜 합성효소 경쟁의 사용을 기술하고 있다.
다양한 프로모터들이 표 19에 기술된 바와 같이 PCR 증폭되었다.
Figure 112013079359371-pct00021
pAM2191에서 GAL1 프로모터를 대체하기 위하여, 발현 FastDigest® BamHI 제한효소를 사용하여 소화되었고, 100 ng의 본 선형화된 플라스미드가 300 ng의 각 프로모터들 PCR 산물들로 지수적으로 성장하는Y3198 세포들 내로 공동-형질전환되었다. 숙주세포 형질전환체들은 단독 탄소원으로서 2% 포도당을 가진 CSM-L에 도말되었고, 개별 콜로니들이 반경 ~1 mm가 될 때까지 3일 동안 30℃에서 배양되었다. 각 형질전환으로부터 8개의 콜로니들이 뽑혔고, 기술된 바와 같이 그들의 파네센 및 트리코디엔 역가들이 GC 분석에 의해 결정되기 이전에 기술된 바와 같이 성장되었다 (표 20). FS_Aa_Sc 코딩 서열에 연결된 GAL1 프로모터의 것과 유사한 파네센/트리코디엔 비율들을 주는 프로모터들이 선택되었고, 또한 기술된 바와 같이 Y227에서 FPP-독성 기초 성장 선별에 의해 검색되었다. 테스트된 프로모터들 중에서, PET9 유전자의 프로모터가 부모 주형으로서 FS_A_5.3 코딩 서열을 사용할 때 개선된 FS를 위한 FPP 독성-기초 선별에서 사용에 적합한 것으로 관찰되었다.
Figure 112013079359371-pct00022
실시예 17
본 실시예는 세스퀴테르펜 합성효소 경쟁을 통해 확인된 파네센 합성효소의 유익한 돌연변이들을 관련된 세스퀴테르펜 합성효소 내로 자리잡는 방법들을 기술하고 있다.
실시예 13에서 확인된 FS의 다양한 아미노산 변화들이 포화 돌연변이화를 사용하여 FS 활성에서 개선을 위한 원인으로서 검증되었고, 여러 개의 이들 돌연변이들이 활성에서 유사한 개선이 달성될 수 있는지 여부를 결정하도록 관련 세스퀴테르펜 합성효소, 아르테미시아 애누아의 아모파디엔 합성효소 (ADS) 내에 자리잡았다. 자리잡힘을 위해 선택된 FS의 아미노산 위치들은 Met35, Tyr288, Thr319, Val369, Ile434, Thr446, I460 및 V467이었다. 복수의 서열 정렬들을 기초로 하여, ADS에서 정렬된 해당하는 아미노산들은 Ala13, Cys260, Ala291, Met341, Thr406, Thr418, Phe432 및 Gly439이다. 이들 위치들의 각각은 19개 다른 잔기들로의 치환에 의해 변이화되었고, 각 돌연변이체는 아모파디엔 : 트리코디엔 경쟁 검정법으로 테스트되었다.
ADS 돌연변이체들은 ADS 유전자에 있는 특정한 코돈에서 중복되는 두 개의 DNA 단편들을 증폭하도록 별도의 PCR 반응들을 사용하여 제작되었다. 각 올리고뉴클레오타이드 쌍은 둘 다의 측면 상에 표적 부위를 특이적으로 아닐링하는 뉴클레오타이들에 의해 끼여있는, 올리고뉴클레오타이드의 중간에 오류매칭된 중복 (degenerate) 뉴클레오타이드 서열과 함께 합성되었다 (예를 들면, NNK에서 K는 혼합된 G 및 T 염기들을 나타내고, N은 A, T, G 및 C 혼합된 염기들을 나타냄).
Figure 112013079359371-pct00023
Figure 112013079359371-pct00024
ADS-TDS 경쟁 벡터들을 제조하기 위하여, pAM1948 플라스미드는 IS_Pn_Sc 코딩 서열을 잘라내도록 BamHI 및 NheI로 소화되었고, ZymoClean 젤 정제 키트 (Zymo Research, Irvine CA)를 사용하여 젤 정제되었다. 각 포화 변이체를 포함하는 ADS 오픈 리딩 프레임 (orf)의 증폭은 Ala13 잔기의 돌연변이화를 위해 ADS-A13-F 및 ADS-SM-3'가 orf를 직접적으로 증폭하는 데 사용되는 점을 제외하고는, 표 22에 나열된 PCR 단편 또한 표 21에 나열된 적절한 ADS-SM-5' 및 ADS-SM-3' 올리고들의 동등한 몰량을 혼합하여 수행되었다. 증폭된 PCR 산물들은 선형화된 pAM1948에서 갭-복구되었고 Y3125에 형질전환되었다. 각 부위 포화 돌연변이체를 위해, 배수-개선이 ADS WT의 비율과 변이체의 ADS/TDS 비율을 대비하여 획득되었다.
도 17에 나타난 바와 같이, Ala291의 발린 (A291V; 서열번호 174), 시스테인 (A291C; 서열번호 175) 또는 이소루이신 (A291I; 서열번호 176)로의 치환은 ADS 부모 (WT)와 대비하여 30% 이상까지 ADS/TDS 비율의 개선을 유도하였다.
ADS A291V, A291C 및 A291I의 개선된 활성들을 검증하기 위하여, 아모파디엔 역가들이 각 돌연변이체를 위해 발현 플라스미드들로 형질전환된 세포들에서 결정되었다. A291V, A291C 및 A291I을 각각 포함하는 ADS-TDS 플라스미드는 BamHI 및 NheI로 사용하여 소화되었고, 젤 정제되었다. CEN.ARS 플라스미드 및 2μ Leu2 플라스미드가 동일한 제한효소를 사용하여 선형화되었고 젤 정제되었다. ADS 변이체들을 포함하는 소화된 단편들은 T4 DNA 리가제를 사용하여 선형화된 CEN.ARS 또는 2μ Leu2 플라스미드 내로 16℃에서 라이게이션되었다. 2 μL의 반응액은 Xl1-Blue 세포들 내로 형질전환되었고 LB 플레이트들 상에 도말되었다. 각 ADS 변이체를 CEN.ARS 플라스미드 또는 2μ Leu2 플라스미드 둘 중 하나에 포함하는 콜로니들은 서열이 확인되었다.
Figure 112013079359371-pct00025
생산을 위해, 각 플라스미드는 치료된 Y227 내로 형질전환되었고 CSM-L 플레이트들 상에 도말되었다. 8개의 콜로니들이 각 변이체를 위해 뽑혔고, 4% 갈락토스를 가진 360 uL의 버드 종자 배지 (BSM)를 포함하는 96-웰 플레이트에서 성장되었다. 34℃에서 배양 2일 이후에, 각 웰의 16 uL이 4% 갈락토스를 가진 신선한 버드 종자 배지를 포함하는 새로운 96-웰 플레이트 내로 접종되었다. 30℃에서 배양 2일 이후에, 생산 시료들이 나일 레드 및 GC 분석을 위해 취해졌다.
도 18에서 나타난 바와 같이, ADS A291V, A291C 및 A291I 각각은 2μ 플라스미드 또는 CEN.ARS 플라스미드 둘 중 하나 상에서 발현될 때 부모 ADS와 대비하여 아모파디엔 생산에서 증가를 보여주었다. 최고의 돌연변이체, Ala291Val은 부모의 역가보다 58%까지 아모파디엔 역가에서 개선을 보여주었다.
이들 결과들은 테르펜 합성효소 경쟁 검정법을 사용하여 하나의 테르펜 합성효소에서 확인되는 유익한 돌연변이들이 개선된 합성효소 활성을 영향 주도록 관련 테르펜 합성효소 내에 성공적으로 자리잡을 수 있는 점을 보여주고 있다.
실시예 18
본 실시예는 효모에서 패추롤 합성효소 (PS)를 그들의 생체내 효소 활성 수준들에 따라 순위 매기도록 세스퀴테르펜 합성효소 경쟁을 사용하는 유용성을 기술하고 있다.
효모 균주들 Y9259, Y11136, Y9260가 발현 플라스미드들 pAM2596, pAM2702, 및 pAM2597를 효모 균주 Y9120 (MEV 경로를 포함함) 내로 각각 형질전환하여 만들어졌고, 정확한 플라스미드를 포함하도록 콜론 PCR에 의해 검증되었다. 각 플라스미드는 GAL1 프로모터 상에 서로 다른 PS 이소형 또한 분지된 GAL1 프로모터 상에 트리코디엔 합성효소 (TDS)의 일치하는 버전들을 포함하고 있다. 검증된 콜로니는 단일 콜로니들을 위해 재도말되었고, 8개의 콜로니들이 웰 당 2% 슈크로스를 가진 360 uL의 버드 종자 배지 (BSM)를 포함하는 96-웰 플레이트의 분리된 웰들에서 배양되었다 (전배양). 999 rpm 교반으로 30℃에서 배양 2일 이후에, 각 웰의 6.4 uL이 4% 갈락토스 및 3.33%의 미네랄 오일 을 가진 신선한 150 uL의 BSM및 Brij-56 에멀전을 포함하는 새로운 96-웰 플레이트의 웰 내로 접종되었다 (생산 배양). 또 다른 999 rpm 교반으로 30℃에서 배양 2일 이후에, 시료들이 취해졌고 기체 크로마토그래피 (GC) 분석에 의해 테르펜 생산에 대해 분석되었다.
GC 분석을 위해, 시료들이 메탄올-부톡시에탄올-헵탄 (100 μL: 50 μL: 400 μL v/v)으로 추출되었고, 세포 물질은 중력에 의해 가라앉도록 허용되었다. 헵탄 추출물의 분량이 헵탄 내로 좀 더 희석되었고, 다음으로 펄스 분리 주입을 사용하여 메틸 실리콘 정지상 위에 주입되었다. 패추리 알코올 및 트리코디엔은 점화 이온화 검출 (FID)로 GC를 사용하는 비등점에 의해 분리되었다. 헥사데칸은 특정된 GC 오븐 프로파일 동안 성공적인 주입 및 용출을 감시하도록 보유 시간 마커로서 사용되었다. 패추리 알코올 및 트리코디엔의 역가들이 패추리 오일/트리코디엔 비율들을 계산하는 데 사용되었다 (패추리 오일은 패추리 알코올의 역가의 대략 3배임).
도 24에서 나타난 바와 같이, 패추리 오일/트리코디엔 비율들은 시료들을 거쳐서 매우 일정하게 유지되었고, 단지 5.47%의 CVs를 생산하였다. 따라서, TDS와 동일한 플라스미드로부터 PS를 공동-발현하여, 테스트된 패추롤 합성효소들은 다음과 같이 (가장 큰 활성을 가진 것부터 가장 작은 활성을 가진 것까지) 순위가 매겨질 수 있었음): PS_이소형_3 코딩 서열 (Y9260) > PS_이소형_2 코딩 서열 (Y11136) > PS_이소형_1 코딩 서열 (Y9259).
Figure 112013079359371-pct00026
실시예 19
본 실시예는 모노테르펜 합성효소들을 그들의 생체내 효소 활성에 따라 순위 매기도록 모노테르펜 합성효소 경쟁을 사용하는 유용성을 기술하고 있다.
모노테르펜 리모넨의 합성효소들의 생산성을 결정하기 위하여, 본 명세서에서 대조군 테르펜 합성효소로서 사용되고, pGal10 프로모터에 의해 추진되는 Ocimum basilicum의 마이어센 합성효소를 위한 코딩 서열, 또한 동일한 플라스미드 (pAM2645) 상에서 pGAL1에 의해 추진되는 의문 (query) 리모넨 합성효소 (LS)의 코딩 서열을 포함하는 경쟁 벡터가 제조되었다. 각각 서로 다른 LS 절단 변이체 또는 이소형을 인코딩하는 8개의 경쟁 플라스미드들은 각각 효모 균주 Y8270 (MEV 경로를 포함함) 내로 형질전환되었고, 형질전환된 균주들은 정확한 플라스미드를 포함하도록 콜론 PCR에 의해 검증되었다. 각 균주의 8개 단일 콜로니들이 탄소원으로서 2% 포도당을 포함하는 360 uL의 버드 종자 배지를 포함하는 96-웰 마이크로타이터 플레이트들에서 배양되었다 (전배양). 998 rpm으로 진탕하면서 30℃에서 성장 3일 이후에, 각 배양액의 6 uL의 각 배양액이 웰 당 4% 갈락토스를 포함하는 75 uL의 버드 종자 배지 및 75 uL의 이소프로필 미리스테이트를 포함하는 96-웰 플레이트의 웰 내로 접종되었다. 생산 플레이트들은 Velocity 11 열 밀봉기 (Agilent Technologies)로 밀봉되었고 -20℃에서 2시간 동안 냉동 이전에 998 rpm으로 진탕하면서 30°C에서 성장되었다. 다음으로 산물들은 0.001% 헥사데칸 내부 표준을 포함하는 300 uL의 에틸아세테이트를 신속하게 첨가하고, 열 밀봉하고, 상온에서 2시간 동안 진탕한 이후에 검정되었다. 기체 크로마토그램 점화 이온화 검출 (GC-FID)이 마이어센 및 리모넨의 절대 농도의 표준 곡선들을 사용하여 수행되었다. 자세하게는, 2 uL의 에틸아세테이트 추출물이 메틸 실리콘 정지상 컬럼 상에 분리 비율 1:50으로 주입되었다. 본 주입은 주입 정확도 및 보유 시간 조정을 위한 내부 표준으로서 헥사데칸을 사용하여 분석되었다. 오븐 온도들은 2.5분의 과정 동안 25℃ 내지 250℃ 범위이었고, 이 지점에서 오븐은 다음 시료를 위해 신속하게 식혀졌다. 마이어센 및 리모넨의 역가들은 경쟁 비율을 계산하는 데 사용되었다.
도 18에서 나타난 바와 같이, 테르펜 합성효소 경쟁 검정법은 서로 다른 리모넨 합성효소 절단 변이체들 및 이소형들의 상대적인 성적을 순위 매기는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 다양한 변형들 및 변화들이 본 발명의 범위 및 정신을 벗어나지 않고도 당업자에게라면 자명할 것이다. 본 발명이 특정한 바람직한 구현예들과 연결하여 기술되었더라도, 청구항들은 이러한 특정한 구현예들에 부당하게 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 그리하여, 당업자에게라면 이해되는, 본 발명을 수행하는 기술된 방식들의 다양한 변형들이 청구항들의 범위 내에 속하는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Zhao, Lishan Xu, Lan Westfall, Patrick Main, Andrew <120> Methods of Developing Terpene Synthase Variants <130> 6291-21-PCT <140> not yet assigned <141> 2012-02-01 <150> 61/438,948 <151> 2011-02-02 <160> 176 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11741 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic, Expression plasmid pAM765 <400> 1 gaattccgga tgagcattca tcaggcgggc aagaatgtga ataaaggccg gataaaactt 60 gtgcttattt ttctttacgg tctttaaaaa ggccgtaata tccagctgaa cggtctggtt 120 ataggtacat tgagcaactg actgaaatgc ctcaaaatgt tctttacgat gccattggga 180 tatatcaacg gtggtatatc cagtgatttt tttctccatt ttagcttcct tagctcctga 240 aaatctcgat aactcaaaaa atacgcccgg tagtgatctt atttcattat ggtgaaagtt 300 ggaacctctt acgtgccgat caacgtctca ttttcgccaa aagttggccc agggcttccc 360 ggtatcaaca gggacaccag gatttattta ttctgcgaag tgatcttccg tcacaggtat 420 ttattcggcg caaagtgcgt cgggtgatgc tgccaactta ctgatttagt gtatgatggt 480 gtttttgagg tgctccagtg gcttctgttt ctatcagctg tccctcctgt tcagctactg 540 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caagaagatc atcttattaa tcagataaaa tatttctaga tttcagtgca 1440 atttatctct tcaaatgtag cacctgaagt cagccccata cgatataagt tgtaattctc 1500 atgtttgaca gcttatcatc gataagcttc cgatggcgcg ccgagaggct ttacacttta 1560 tgcttccggc tcgtataatg tgtggaattg tgagcggata acaattgaat tcaaaggagg 1620 ccatcctggc catgaagaac tgtgtgattg tttctgcggt ccgcacggcg atcggcagct 1680 ttaacggctc tttagcgagc acctctgcaa tcgatctggg tgcgacggtc attaaggccg 1740 ccattgaacg cgccaaaatc gacagccagc acgttgatga ggtgatcatg ggcaatgtgt 1800 tacaagccgg cctgggtcaa aacccagcgc gtcaagcact gttaaaatct ggtctggccg 1860 agaccgtgtg tggcttcacc gtcaataagg tttgcggctc tggcctgaag agcgtggccc 1920 tggcagcaca agcgattcaa gccggtcagg cacaaagcat cgttgcgggt ggcatggaga 1980 acatgtctct ggcgccgtac ttattagatg ccaaagcccg cagcggttat cgcctgggcg 2040 atggtcaggt gtacgacgtc atcttacgcg atggcttaat gtgcgcgacc cacggttacc 2100 acatgggtat tacggccgaa aacgtggcga aagaatacgg cattacgcgc gagatgcagg 2160 atgaattagc actgcactct cagcgcaaag cagcagccgc gatcgagtct ggtgcgttta 2220 cggcggaaat cgtgccagtt aacgtggtca cgcgcaagaa gacgttcgtt ttcagccagg 2280 acgagttccc gaaggcaaac agcaccgcgg aggccttagg tgccttacgc ccagcctttg 2340 acaaagcggg cacggtcacc gccggtaatg cgagcggcat caatgatggt gcagcggcac 2400 tggtcatcat ggaagagagc gccgcattag cagcgggtct gaccccatta gcgcgcatta 2460 aatcttatgc cagcggcggc gtcccaccag ccctgatggg catgggtccg gtcccagcca 2520 cgcaaaaagc cctgcaatta gcgggcctgc aactggccga cattgatctg atcgaggcga 2580 acgaggcgtt tgcagcgcag ttcctggcgg tgggtaagaa tctgggcttc gacagcgaga 2640 aagtcaatgt gaacggtggc gcgattgcgt taggccatcc gattggtgca agcggcgcac 2700 gcatcttagt gacgttactg cacgccatgc aggcacgcga caagacctta ggcctggcga 2760 ccttatgtat tggtggcggt caaggtatcg ccatggtgat cgaacgcctg aactgaagat 2820 ctaggaggaa agcaaaatga caataggtat cgacaaaata aacttttacg ttccaaagta 2880 ctatgtagac atggctaaat tagcagaagc acgccaagta gacccaaaca aatttttaat 2940 tggaattggt caaactgaaa tggctgttag tcctgtaaac caagacatcg tttcaatggg 3000 cgctaacgct gctaaggaca ttataacaga cgaagataaa aagaaaattg gtatggtaat 3060 tgtggcaact 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agaaaaatgt tacatatcga attgatctta ttcctttggt 2040 agaccagtct ttgcgtcaat caaagattcg tttgtttctt gtgggcctga accgacttga 2100 gttaaaatca ctctggcaac atccttttgc aactcaagat ccaattcacg tgcagtaaag 2160 ttagatgatt caaattgatg gttgaaagcc tcaagctgct cagtagtaaa tttcttgtcc 2220 catccaggaa cagagccaaa caatttatag ataaatgcaa agagtttcga ctcattttca 2280 gctaagtagt acaacacagc atttggacct gcatcaaacg tgtatgcaac gattgtttct 2340 ccgtaaaact gattaatggt gtggcaccaa ctgatgatac gcttggaagt gtcattcatg 2400 tagaatattg gagggaaaga gtccaaacat gtggcatgga aagagttgga atccatcatt 2460 gtttcctttg caaaggtggc gaaatctttt tcaacaatgg ctttacgcat gacttcaaat 2520 ctctttggta cgacatgttc aattctttct ttaaatagtt cggaggttgc cacggtcaat 2580 tgcataccct gagtggaact cacatccttt ttaatatcgc tgacaactag gacacaagct 2640 ttcatctgag gccagtcaga gctgtctgcg atttgtactg ccatggaatc atgaccatct 2700 tcagcttttc ccatttccca ggccacgtat ccgccaaaca acgatctaca agctgaacca 2760 gacccctttc ttgctattct agatatttct gaagttgact gtggtaattg gtataactta 2820 gcaattgcag agaccaatgc 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ttgtgtggaa 180 ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccaagcttg 240 gtaccgagct cggatccact agtaacggcc gccagtgtgc tggaattcgc ccttctcgag 300 aagttaagat tatatgaata actaaatact aaatagaaat gtaaatacag tgagaacaaa 360 acaaaaaaaa acgaacagag aaactaaatc cacattaatt gagagttcta tctattagaa 420 aatgcaaact ccaactaaat gggaaaacag ataacctctt ttattttttt ttaatgtttg 480 atattcgagt ctttttcttt tgttaggttt atattcatca tttcaatgaa taaaagaagc 540 ttcttatttt ggttgcaaag aatgaaaaaa aaggattttt tcatacttct aaagcttcaa 600 ttataaccaa aaattttata aatgaagaga aaaaatctag tagtatcaag ttaaacttaa 660 cggccttttg ccagatattg attcatctct tcttccggca ccattccacc tcccgtcgcc 720 cacaccagat gagtggtatt acgcagttgt tctgcgctga aaccgtgcat ctgttggtaa 780 cttactgatg cacacacgcg ctgaggtccg gccatacccg ccagtgccga aggttcaaga 840 cgaatacctt cttcctgcgc cagccagcca agcatgtcat acatggtttg atcgctaagg 900 gtatagaagc catccagcag acgctccatt gcccgcccga caaagcctga tgcgcgacca 960 actgcaaggc catccgctgc ggtaaggttg tcgataccaa tatcctgaac agaaatctga 1020 tcgtgtaatc ctgtatggac gcctaacaac atacaagggg agtgcgttgg ttcggcaaaa 1080 aagcagtgaa catgatcgcc aaacgccagt ttaagcccga atgcgacgcc accaggacca 1140 ccgccaacac cacacggcag atagacaaac agagggttat cagcatcgac gatacggcct 1200 tgctgggcaa attgcgcttt aagacgctgg ccagcgacgg aatacccaag gaacaacgtg 1260 cgggaatttt cgtcatcaat aaagaaacag ttcgggtcag actgcgctgc tttacgtcct 1320 tcctcgacgg caacaccata atcttgctca tattccacga ccgtaacgcc atgcgtgcgc 1380 agtttcgctt ttttccatgc ccgggcatca gcagacatat gaactgtcac cttaaagcca 1440 atgcgggcgc tcataatgcc gattgataac cccagatttc cggttgagcc cacagcaatg 1500 ctgtattggc taaagaactg tttaaactcc ggagaaagca gtttgctgta gtcatcatca 1560 agcgtcagca accccgcttc cagagccagt ttttctgcgt gtgccaggac ttcataaatc 1620 ccgccgcgtg cttttatgga gccggaaatg ggcaaatggc tatctttttt cagtaacagt 1680 tgcccgctga tcggttgctg atattctttt tccagccgtt tttgcatagc tcgaatggca 1740 accagttctg attcaataat ccccccagtg gcagcagttt caggaaatgc ttttgccaga 1800 tagggtgcaa aacgggataa gcgcgcatgg gcgtcctgaa catcctgttc ggtcaggcca 1860 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aaagatttcc ctgacgaagc atttggatat ggactacgtt caacagaaat tgagaaacaa 2760 atttaccagg gtcattatgc ctccgaaatt tacaccagta aacattacga gccccaactt 2820 gagtttccag aaacgcaaaa ccagaagaaa gtcggtatct gttgagaagt tgaagcttcc 2880 tgcctcgtcc ggatcttcat catctacctc cgttaacaag acattagatt agtgatcaca 2940 cccaattttt aatttagcaa cccaaaataa ataagtattt actcaacttt tttttaataa 3000 aaaaaaactt aattgaattt tgctcgcgat ctttaggtcc ggggttttcg ttgaaccctt 3060 agacgagcaa attagcgcca taaggatata cgtcagagca cattaattag tgacatatac 3120 ctatataaag agcaaccttc tccgatagac ttgtaattta tcttatttca tttcctaaca 3180 ctttggtcga agaagaggga taaaaacaga cgaaaacaca tttaagggct atacaaagat 3240 gggaaagcta ttacaattgg cattgcatcc ggtcgagatg aaggcagctt tgaagctgaa 3300 gttttgcaga acaccgctat tctccatcta tgatcagtcc acgtctccat atctcttgca 3360 ctgtttcgaa ctgttgaact tgacctccag atcgtttgct gctgtgatca gagagctgca 3420 tccagaattg agaaactgtg ttactctctt ttatttgatt ttaagggctt tggataccat 3480 cgaagacgat atgtccatcg aacacgattt gaaaattgac ttgttgcgtc acttccacga 3540 gaaattgttg ttaactaaat ggagtttcga cggaaatgcc cccgatgtga aggacagagc 3600 cgttttgaca gatttcgaat cgattcttat tgaattccac aaattgaaac cagaatatca 3660 agaagtcatc aaggagatca ccgagaaaat gggtaatggt atggccgact acatcttaga 3720 tgaaaattac aacttgaatg ggttgcaaac cgtccacgac tacgacgtgt actgtcacta 3780 cgtagctggt ttggtcggtg atggtttgac ccgtttgatt gtcattgcca agtttgccaa 3840 cgaatctttg tattctaatg agcaattgta tgaaagcatg ggtcttttcc tacaaaaaac 3900 caacatcatc agagattaca atgaagattt ggtcgatggt agatccttct ggcccaagga 3960 aatctggtca caatacgctc ctcagttgaa ggacttcatg aaacctgaaa acgaacaact 4020 ggggttggac tgtataaacc acctcgtcta agggcgaatt ctgcagatat ccatcacact 4080 ggcggccgct cgagcatgca tctagagggc ccaattcgcc ctatagtgag tcgtattaca 4140 attcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta 4200 atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg 4260 atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg gacgcgccct gtagcggcgc 4320 attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct 4380 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aagaccgacc tgtccggtgc cctgaatgaa ctgcaggacg aggcagcgcg gctatcgtgg 5280 ctggccacga cgggcgttcc ttgcgcagct gtgctcgacg ttgtcactga agcgggaagg 5340 gactggctgc tattgggcga agtgccgggg caggatctcc tgtcatccca ccttgctcct 5400 gccgagaaag tatccatcat ggctgatgca atgcggcggc tgcatacgct tgatccggct 5460 acctgcccat tcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagc gagcacgtac tcggatggaa 5520 gccggtcttg tcgatcagga tgatctggac gaagagcatc aggggctcgc gccagccgaa 5580 ctgttcgcca ggctcaaggc gcgcatgccc gacggcgagg atctcgtcgt gacccatggc 5640 gatgcctgct tgccgaatat catggtggaa aatggccgct tttctggatt catcgactgt 5700 ggccggctgg gtgtggcgga ccgctatcag gacatagcgt tggctacccg tgatattgct 5760 gaagagcttg gcggcgaatg ggctgaccgc ttcctcgtgc tttacggtat cgccgctccc 5820 gattcgcagc gcatcgcctt ctatcgcctt cttgacgagt tcttctgaat tgaaaaagga 5880 agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc 5940 ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg 6000 gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc 6060 gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat 6120 tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg 6180 acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag 6240 aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa 6300 cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat catgtaactc 6360 gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca 6420 cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc 6480 tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc 6540 tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg 6600 ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta 6660 tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag 6720 gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga 6780 ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc 6840 tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa 6900 agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa 6960 aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc 7020 cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt 7080 agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc 7140 tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac 7200 gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca 7260 gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg 7320 ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag 7380 gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt 7440 ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat 7500 ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc 7560 acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt 7620 gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag 7680 cggaag 7686 <210> 106 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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aggatgaaac tatcttagat aacgccttgg agttcagtaa ggttcatctc 600 gatataattg ctaaagatcc aagctgtgat tcatctctac gtacacagat tcatcaggca 660 ttaaagcagc cactcagacg cagactggct cgaatagaag ctcttcacta tatgccaatc 720 tatcaacagg agactagtca tgatgaagtt ttattgaagc tagcgaagct ggatttttct 780 gtgctccaat ctatgcacaa aaaggaattg tcgcatattt gtaagtggtg gaaggacctc 840 gatttgcaga acaaactacc gtttgttcgt gacagagtcg tcgagggata tttttggatt 900 ttgagtattt attatgaacc tcagcatgca cgtactcgta tgtttcttat gaagtcgtgt 960 atgtggctgg tagtcctgga tgatacattt gataactacg gaacatacga ggagttggag 1020 attttcacgc aagctgtcga gaggtggtca atatcatgtc tcgacatgct accagaatac 1080 atgaaattga tctatcaaga gcttgtcaac cttcacgttg aaatggagga gagtcttgag 1140 aaagaaggta aaacttatca aatccactac gttaaggaaa tggccaaaga actggtaaga 1200 aattatctag ttgaagctag atggttaaag gaaggctaca tgcctacttt agaggagtac 1260 atgagcgtta gcatggttac ggggacttac gggcttatga ccgctcggag ttacgttggt 1320 cgtggggaca tcgtcaatga agatacgttt aagtgggtgt cttcgtaccc gcctatcgta 1380 aaagcgtcgt gtgttattat ccgtctgatg gatgatatcg tgtctcataa agaagaacaa 1440 gaacgagggc atgttgcaag ttctatcgaa tgctattcga aagaatctgg ggccagtgaa 1500 gaagaggcct gcgagtacat tagccgtaag gttgaggatg catggaaagt tatcaaccga 1560 gagtcgttgc gtccaactgc cgttccgttt cctttgctta tgcctgccat caatttggct 1620 agaatgtgtg aggttctcta tagtgtaaac gacggattta cacatgcaga aggagatatg 1680 aagtcttaca tgaagtcatt cttcgtccac ccgatggtcg tttga 1725 <210> 109 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic, Primer LX-268-130-4-S2D-R <400> 109 ctttaacgtc aaggagaaaa aaccccggat ccatggacac tctgccgatc tcttcc 56 <210> 110 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic, Primer LX-268-130-3-S2D-F <400> 110 ccttcctttt cggttagagc ggatcttagc tagctcatac gaccataggg tgtacgaag 59 <210> 111 <211> 574 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic, A. annua b-farnesene synthase amino acid sequence <400> 111 Met Ser Thr Leu Pro Ile Ser Ser Val Ser Phe Ser Ser Ser Thr Ser 1 5 10 15 Pro Leu Val Val Asp Asp Lys Val Ser 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ttaattgacg ctgttcaaag gttaggaatt 300 gcatatcatt tcgaagagga gattgaagag gcattgcagc atattcatgt tacttatgga 360 gaacaatggg ttgacaagga gaacttgcaa tcaatctctt tatggtttag gttgttaagg 420 caacagggat tcaacgtctc ttcaggtgtc tttaaagatt tcatggacga aaagggaaag 480 tttaaggagt cattatgcaa cgatgctcaa ggaattttgg cattatatga agctgccttt 540 atgagggtag aggacgagac tatattagac aacgcattgg aattcactaa agtccactta 600 gacatcatcg caaaggatcc ttcatgcgac tcttctttaa gaacacaaat acatcaagca 660 ttgaagcaac ctttgaggag aaggttagca aggatagaag ccttgcacta tatgcctatc 720 tatcagcagg aaacatcaca tgatgaagtt ttgttgaagt tggccaaatt ggacttctct 780 gtattgcagt caatgcataa aaaggaattg tctcatatct gcaaatggtg gaaggatttg 840 gatttgcaga ataagttgcc ttatgttaga gacagagtcg ttgagggata tttctggata 900 ttgtctatct actacgagcc tcagcacgct agaacaagaa tgttcttaat gaagacttgc 960 atgtggttgg tcgttttaga cgacactttt gacaattacg gtacctacga ggaattagag 1020 atcttcactc aagctgtaga gagatggtca atttcatgct tggacatgtt accagagtat 1080 atgaagttga tctaccagga gttagtcaac ttacacgtcg agatggaaga atctttggag 1140 aaagagggta aaacttatca gatccactat gtcaaggaga tggcaaaaga gttggtaaga 1200 aactacttgg tagaagctag atggttgaag gagggttaca tgcctacctt ggaggaatat 1260 atgtctgttt ctatggtcac tggaacctac ggattaatga ttgctagatc ttatgtcggt 1320 agaggagaca ttgtaaccga agacacattc aagtgggtat catcttatcc acctatcata 1380 aaggcctcat gcgttattgt aaggttgatg gatgatattg tatctcacaa agaggaacaa 1440 gagaggggac atgtagcatc atctatcgag tgttattcaa aagaatcagg agcatctgaa 1500 gaagaagcct gtgagtacat ctctagaaaa gtcgaagatg catggaaagt tatcaacaga 1560 gagtcattga ggccaaccgc agtccctttc ccattattaa tgcctgccat aaacttagca 1620 agaatgtgcg aagtcttata ttcagttaat gacggtttca cccacgccga gggtgacatg 1680 aaatcataca tgaagtcatt ctttgttcac cctatggtag tctaa 1725 <210> 120 <211> 1725 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic, FS_C coding sequence <400> 120 atgtcaacct tgcctatttc ttctgtctca ttctcttcat ctacctctcc attggtcgta 60 gacgataagg tctctactaa accagacgtc atcaggcaca ccatgaattt caacgcttct 120 atatggggag accagttttt aacttacgac gaacctgagg atttggtcat gaaaaaacag 180 ttggtcgaag aattgaagga ggaggtcaag aaggagttga ttacaatcaa gggatcaaac 240 gaacctatgc agcacgttaa gttgatcgaa ttaatagatg ctgtccaaag attgggtata 300 gcctaccact tcgaggagga aatcgaggag gctttacaac atatacacgt cacatacggt 360 gaacagtggg tcgataaaga gaatttgcag tctatctcat tgtggttcag gttgttaagg 420 caacaaggtt ttaatgtttc atctggagtt ttcaaggact ttatggacga gaaaggtaaa 480 ttcaaggagt ctttgtgcaa cgatgctcag ggtattttag cattgtatga ggccgcattt 540 atgagggttg aagacgagac tatcttagat aacgcattgg agttcaccaa ggtccactta 600 gacattattg ctaaagaccc atcatgtgac tcttctttga gaactcaaat acaccaggca 660 ttaaagcaac ctttgaggag aaggttggct agaatcgaag cattacacta tatgccaata 720 tatcagcagg aaacctcaca cgacgaagtt ttgttaaagt tagcaaaatt ggacttctct 780 gtcttgcagt caatgcataa gaaggagttg tctcatatct gcaagtggtg gaaggattta 840 gatttacaaa ataagttgcc atacgtcaga gatagggttg tagagggata cttctggatc 900 ttgtctatat actatgagcc tcagcacgcc agaaccagaa tgttcttaat gaagacctgc 960 atgtggttag tagtattaga cgacaccttc gacaattatg gaacatacga ggaattggag 1020 atctttactc aagccgttga gagatggtct atttcttgct tggacatgtt gccagagtat 1080 atgaagttga tctaccagga gttagttaac ttgcacgtcg aaatggagga atctttggag 1140 aaagagggaa agacatacca gattcactat gtcaaggaaa tggccaaaga gttggtaagg 1200 aactatttgg ttgaggccag atggttgaaa gagggttata tgcctacctt ggaggagtac 1260 atgtcagtct caatggttac tggtacctat ggtttgatga ttgccagatc atacgtcgga 1320 agaggtgata tcgtaacaga ggataccttc aagtgggttt cttcataccc tcctatcatt 1380 aaggcctctt gcgtcatagt caggttgatg gatgacattg tttctcataa ggaggaacag 1440 gagaggggtc acgtagcctc atcaatagag tgctattcaa aagagtctgg tgcatcagag 1500 gaagaggcat gtgaatacat ctctagaaaa gtagaggatg cctggaaggt cattaacagg 1560 gagtcattga gacctactgc tgtacctttt cctttgttga tgcctgctat caacttggca 1620 aggatgtgcg aagttttgta ttcagtaaac gatggtttca ctcacgccga aggtgatatg 1680 aaatcatata tgaaatcttt tttcgtacat cctatggtag tataa 1725 <210> 121 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic, Primer AM-288-110-CPK1849 <400> 121 gacacagaag aaataggcaa agttgacat 29 <210> 122 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic, Primer AM-288-110-CPK1903 <400> 122 cggatccatg tcaactttgc ctatttctt 29 <210> 123 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic, Primer AM-288-160-CPK2039 <400> 123 gaagatccga ggcctagctt 20 <210> 124 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic, Primer AM-288-160-CPK2040 <400> 124 ccaccagtag agacatggga gagtcaaacg accataggat gaac 44 <210> 125 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic, Primer AM-288-160-CPK2041 <400> 125 gttcatccta tggtcgtttg actctcccat gtctctactg gtgg 44 <210> 126 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic, Primer AM-288-160-CPK2042 <400> 126 ggcttctaat ccgtactaga tctgctttaa tttggccgg 39 <210> 127 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic, Primer AM-288-160-CPK2043 <400> 127 ccggccaaat taaagcagat ctagtacgga ttagaagcc 39 <210> 128 <211> 33 <212> DNA <213> 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accatatcga ctacgtcgta aggccgtttc tgacagagta aaattcttga gggaactttc 240 accattatgg gaaatgcttc aagaaggtat tgacttaaac tccatcaaat ggtcaggtca 300 ttgagtgttt tttatttgtt gtattttttt ttttttagag aaaatcctcc aatatcaaat 360 taggaatcgt agtttcatga ttttctgtta cacctaactt tttgtgtggt gccctcctcc 420 ttgtcaatat taatgttaaa gtgcaattct ttttccttat cacgttgagc cattagtatc 480 aatttgctta cctgtattcc tttactatcc tcctttttct ccttcttgat aaatgtatgt 540 agattgcgta tatagtttcg tctaccctat gaacatattc cattttgtaa tttcgtgtcg 600 tttctattat gaatttcatt tataaagttt atgtacaaat atcataaaaa aagagaatct 660 ttttaagcaa ggattttctt aacttcttcg gcgacagcat caccgacttc ggtggtactg 720 ttggaaccac ctaaatcacc agttctgata cctgcatcca aaaccttttt aactgcatct 780 tcaatggcct taccttcttc aggcaagttc aatgacaatt tcaacatcat tgcagcagac 840 aagatagtgg cgatagggtc aaccttattc tttggcaaat ctggagcaga accgtggcat 900 ggttcgtaca aaccaaatgc ggtgttcttg tctggcaaag aggccaagga cgcagatggc 960 aacaaaccca aggaacctgg gataacggag gcttcatcgg agatgatatc accaaacatg 1020 ttgctggtga 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ttgaacacac atgaacaagg aagtacagga caattgattt tgaagagaat 1920 gtggattttg atgtaattgt tgggattcca tttttaataa ggcaataata ttaggtatgt 1980 ggatatacta gaagttctcc tcgaccgtcg atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg 2040 taaggagaaa ataccgcatc aggaaattgt aaacgttaat attttgttaa aattcgcgtt 2100 aaatttttgt taaatcagct cattttttaa ccaataggcc gaaatcggca aaatccctta 2160 taaatcaaaa gaatagaccg agatagggtt gagtgttgtt ccagtttgga acaagagtcc 2220 actattaaag aacgtggact ccaacgtcaa agggcgaaaa accgtctatc agggcgatgg 2280 cccactacgt ggaagatccg aggcctagct ttaacgaacg cagaattttc gagttattaa 2340 acttaaaata cgctgaaccc gaacatagaa atatcgaatg ggaaaaaaaa actgcataaa 2400 ggcattaaaa gaggagcgaa ttttttttta ataaaaatct taataatcat taaaagataa 2460 ataatagtct atatatacgt atataaataa aaaatattca aaaaataaaa taaactatta 2520 ttttagcgta aaggatgggg aaagagaaaa gaaaaaaatt gatctatcga tttcaattca 2580 attcaattta tttcttttcg gataagaaag caacacctgg caattcctta ccttccaata 2640 attccaaaga agcaccacca ccagtagaga catgggagac ccgggccatg gttagataga 2700 catagggtaa actagcaatg atttgatcaa atgcttgtat tcatctccca ttctcgtaaa 2760 attgtcttta cctgcatatt ggacctctaa aaattggcaa agatatataa cagccataag 2820 taaaggtctt gggatattct ttgttgttaa atactctctg tttatgtctt tccaaacgtc 2880 ctccacttcc ttataaatca gtgtctgagc atattcttcg ttgacattgt attccttcat 2940 gtaagattct aaagagcttg aactatgttt tctctcctgt tccgctttat gagtcatcag 3000 gtcatttaat ctcctaccca gaataccact gtaacggaat aaaggcggag cagatacagc 3060 ccactcaact gattccttag tgaaaatatc gctcattcct agataacagg tagttgttag 3120 caagtttgca ccaccagtga taataactac gggatcgtgc tcttcagttg tcggtatgtg 3180 tccttcatta gcccatttcg cttctaccat tagattcctt acgaattctt taacgaactc 3240 cttcccacag ttgaataaat cagttctacc ttctttggcc agaaactcct ccatttctgt 3300 gtaggtatcc atgaataatt tgtaaatagg cttcatgtat tccggcaacg tgtctaagca 3360 ggtgatcgac catctttcca cggcttcagt gaaaatcttt aactcctcgt aagttccata 3420 tgcgtcatac gtgtcatcaa taagtgttat cacagcaact gccttagtga aaaaaactct 3480 agctcttgaa tactggggtt cgtaaccaga acctaaaccc caaaaatagc attcaacgat 3540 acgatctctc agacatgggg catttttctt aatatcaaat gccttccacc acttgcatac 3600 gtgactcaac tcttccttat gtaggctctg caatagattg aactccagtt tagctaactt 3660 tagcagagtt ttattatggg agtcttgttg ctgatagaag ggtatgtact gggcggcctc 3720 gatccttggc aatctcttcc acaatggttg ctttaaagct ctctggattt cagtgaataa 3780 agcggggttt gtactaaacg cgtcctttgt cataatcgat agccttgatc ttgtgaatcc 3840 cagggcatct tcaagaatta tttcgcccgg aactctcatg gacgtagcct catataattc 3900 caacaatcct tcaacatcat tcgctaacga ttgtttaaaa gcaccattct tgtctttata 3960 gttattaaac acatcacacg tgacatagta tccttgttta cgcatcagcc taaaccataa 4020 gctagacctg tcgccattcc aattatcacc ataggtctcg taaatacatt gcaatgcatg 4080 atcaatttca cgttcaaaat gatacggaat acctaaacgt tgaatctcgt caatcagctt 4140 caacaaattt gcatgtttca taggaatatc caatgcttcc tttaacaact gtcttacttc 4200 cttctttaga tcgtttacta tttgctccac accctgttca acttgtttct cataaatcaa 4260 aaattgatcg ccccaaatag aaggtgggaa atttgcaatt ggccttatag gtttctcttc 4320 agtcaaggcc attgttttct gcagatccgg ggttttttct ccttgacgtt aaagtataga 4380 ggtatattaa caattttttg ttgatacttt tattacattt gaataagaag taatacaaac 4440 cgaaaatgtt gaaagtatta gttaaagtgg ttatgcagtt tttgcattta tatatctgtt 4500 aatagatcaa aaatcatcgc ttcgctgatt aattacccca gaaataaggc taaaaaacta 4560 atcgcattat catcctatgg ttgttaattt gattcgttca tttgaaggtt tgtggggcca 4620 ggttactgcc aatttttcct cttcataacc ataaaagcta gtattgtaga atctttattg 4680 ttcggagcag tgcggcgcga ggcacatctg cgtttcagga acgcgaccgg tgaagacgag 4740 gacgcacgga ggagagtctt ccttcggagg gctgtcaccc gctcggcggc ttctaatccg 4800 tactaagatc tgctttaatt tggccggcga acgtggcgag aaaggaaggg aagaaagcga 4860 aaggagcggg cgctagggcg ctggcaagtg tagcggtcac gctgcgcgta accaccacac 4920 ccgccgcgct taatgcgccg ctacagggcg cgtcgcgcca ttcgccattc aggctgcgca 4980 actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg aattggagcg 5040 acctcatgct atacctgaga aagcaacctg acctacagga aagagttact caagaataag 5100 aattttcgtt ttaaaaccta agagtcactt taaaatttgt atacacttat tttttttata 5160 acttatttaa taataaaaat cataaatcat aagaaattcg cttatttaga agtgtcaaca 5220 acgtatctac caacgatttg acccttttcc atcttttcgt aaatttctgg caaggtagac 5280 aagccgacaa ccttgattgg agacttgacc aaacctctgg cgaagaattg ttaattaaga 5340 gtcagtcgac ttaaaaacta gggaccaata gcaattctgt tttacgttgc attgttgcac 5400 ctgaactttc cgtcatgtca atttgatcat atgaaactcc attgggcaac ttccagttga 5460 aatgataaag aatgttggct agtggcagtt gaacattggc caaacctaac gcagcgccag 5520 gacacatacg acgtccagcc ccaaatggta aatattcata ttcggcgccc atcactgttg 5580 ccgaagagtt ttcaaatctt tcaggtataa acgcttctgc atccttccag tattcaggat 5640 ctctattgat cgcaaacaca ttaacgatta atttcgtttt gttagggata ttataaccag 5700 ccaagtttac tggctgacga cattctctag gtagcactaa cggcaagggt gggtgtagtc 5760 taagagtctc tttgatgacc atattcaagt aggacaattc ttgtatatct tcttcatgta 5820 ttttttcttt cccattcaag gccttacgta attcagcctg aaccttttcc attgctttcg 5880 gacattttat tagctcgctt atagcccatt ctatggtaga acttgaagtg tcggtccctg 5940 caccgaacat gtccaaaatt attgctttga tattatccga agtcagagga aactcagcag 6000 aatcctttaa tctaagtaat acatctaata gggtttcgtt ggttttggat gacgtattta 6060 cggtatgttc agctaccaaa ttgtcaatta agttatcaat ctttttacgt aggctagtta 6120 atcttgctct cttaccgctc aagtgatgca agaacttttt agatgggaaa atatcggcaa 6180 catcgaaacc gcctgtttgt ctcagtattt ctttaacaat ttcagtaagt tccttttgat 6240 ctttaattcc cttaccaaac gcagcacggg atagtatagt ggcaattagt ttaaaaacgt 6300 tttcacttaa atttactggt ctaccactac ctgaagcctt tatttcctgg actaaattcc 6360 aacattcttc ttccctcaac gattgaaatg acttaacctt ttttacagac aacaattcaa 6420 gagtacaaat cttccttaat tgtctccagt attccccata tggagcaagg acaacatcag 6480 tgttatgata taaaactatt tccccagtta aagtttcggg tctattagcg aaagtaatat 6540 cgtaggttgt aagaatttcc ttagcccact taggactcga cacgactatt gtgggtacct 6600 ctcccaattg aaggtgcatt agcgaaccat attttctcgc taaatccctt acacccctgt 6660 gtggtgtggt tccgatcaaa tggtgcatgt gaccaatgat gggtagcctc caaggttccg 6720 gcaaggactt tttagttgac ttacttctag tggcaaattt gtacacgaac aacaaaatag 6780 ttgctaaagc aattgatgta gttaaagata gtgccatagc ctttaaaatt gacttcattg 6840 ttttcctagg cctttagtga gggttgaatt cgaattttca aaaattctta cttttttttt 6900 ggatggacgc aaagaagttt aataatcata ttacatggca ttaccaccat atacatatcc 6960 atatacatat ccatatctaa tcttacttat atgttgtgga aatgtaaaga gccccattat 7020 cttagcctaa aaaaaccttc tctttggaac tttcagtaat acgcttaact gctcattgct 7080 atattgaagt acggattaga agccgccgag cgggtgacag ccctccgaag gaagactctc 7140 ctccgtgcgt cctcgtcttc accggtcgcg ttcctgaaac gcagatgtgc ctcgcgccgc 7200 actgctccga acaataaaga ttctacaata ctagctttta tggttatgaa gaggaaaaat 7260 tggcagtaac ctggccccac aaaccttcaa atgaacgaat caaattaaca accataggat 7320 gataatgcga ttagtttttt agccttattt ctggggtaat taatcagcga agcgatgatt 7380 tttgatctat taacagatat ataaatgcaa aaactgcata accactttaa ctaatacttt 7440 caacattttc ggtttgtatt acttcttatt caaatgtaat aaaagtatca acaaaaaatt 7500 gttaatatac ctctatactt taacgtcaag gagaaaaaac cccaagctct agctaagatc 7560 cgctctaacc gaaaaggaag gagttagaca acctgaagtc taggtcccta tttatttttt 7620 tatagttatg ttagtattaa gaacgttatt tatatttcaa atttttcttt tttttctgta 7680 cagacgcgtg tacgcatgta acattatact gaaaaccttg cttgagaagg ttttgggacg 7740 ctcgaagatc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 7800 tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg 7860 agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc 7920 aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt 7980 gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag 8040 tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc 8100 cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc 8160 ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt 8220 cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt 8280 atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc 8340 agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa 8400 gtggtggcct aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa 8460 gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg 8520 tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga 8580 agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg 8640 gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg 8700 aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt 8760 aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact 8820 ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat 8880 gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg 8940 aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg 9000 ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat 9060 tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc 9120 ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt 9180 cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc 9240 agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga 9300 gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc 9360 gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa 9420 acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta 9480 acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg 9540 agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg 9600 aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat 9660 gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt 9720 tccccgaaaa gtgccacctg aacgaagcat ctgtgcttca ttttgtagaa caaaaatgca 9780 acgcgagagc gctaattttt caaacaaaga atctgagctg catttttaca gaacagaaat 9840 gcaacgcgaa agcgctattt taccaacgaa gaatctgtgc ttcatttttg taaaacaaaa 9900 atgcaacgcg agagcgctaa tttttcaaac aaagaatctg agctgcattt ttacagaaca 9960 gaaatgcaac gcgagagcgc tattttacca acaaagaatc tatacttctt ttttgttcta 10020 caaaaatgca tcccgagagc gctatttttc taacaaagca tcttagatta ctttttttct 10080 cctttgtgcg ctctataatg cagtctcttg ataacttttt gcactgtagg tccgttaagg 10140 ttagaagaag gctactttgg tgtctatttt ctcttccata aaaaaagcct gactccactt 10200 cccgcgttta ctgattacta gcgaagctgc gggtgcattt tttcaagata aaggcatccc 10260 cgattatatt ctataccgat gtggattgcg catactttgt gaacagaaag tgatagcgtt 10320 gatgattctt cattggtcag aaaattatga acggtttctt ctattttgtc tctatatact 10380 acgtatagga aatgtttaca ttttcgtatt gttttcgatt cactctatga atagttctta 10440 ctacaatttt tttgtctaaa gagtaatact agagataaac ataaaaaatg tagaggtcga 10500 gtttagatgc aagttcaagg agcgaaaggt ggatgggtag gttatatagg gatatagcac 10560 agagatatat agcaaagaga tacttttgag caatgtttgt ggaagcggta ttcgcaatat 10620 tttagtagct cgttacagtc cggtgcgttt ttggtttttt gaaagtgcgt cttcagagcg 10680 cttttggttt tcaaaagcgc tctgaagttc ctatactttc tagagaatag gaacttcgga 10740 ataggaactt caaagcgttt ccgaaaacga gcgcttccga aaatgcaacg cgagctgcgc 10800 acatacagct cactgttcac gtcgcaccta tatctgcgtg ttgcctgtat atatatatac 10860 atgagaagaa cggcatagtg cgtgtttatg cttaaatgcg tacttatatg cgtctattta 10920 tgtaggatga aaggtagtct agtacctcct gtgatattat cccattccat gcggggtatc 10980 gtatgcttcc ttcagcacta ccctttagct gttctatatg ctgccactcc tcaattggat 11040 tagtctcatc cttcaatgct atcatttcct ttgatattgg atcatactaa gaaaccatta 11100 ttatcatgac attaacctat aaaaataggc gtatcacgag gccctttcgt c 11151 <210> 157 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic, Primer ADS-A13-F <220> <221> misc_feature <222> (57)..(58) <223> n is a, c, g, or t <400> 157 ggagaaaaaa ccccggatcc atggccttga ctgaagagaa acctataagg ccaattnnka 60 atttcccacc ttctatttg 79 <210> 158 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic, Primer ADS-C260-F <220> <221> misc_feature <222> (27)..(28) <223> n is a, c, g, or t <400> 158 catttgatat taagaaaaat gccccannkc tgagagatcg tatcgttgaa tgc 53 <210> 159 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic, Primer ADS-C260-R <400> 159 catttttctt aatatcaaat gccttccacc 30 <210> 160 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic, Primer ADS-A291-F <220> <221> misc_feature <222> (27)..(28) <223> n is a, c, g, or t <400> 160 caagagctag agtttttttc actaagnnkg ttgctgtgat aacacttatt g 51 <210> 161 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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aatgagcgat attttcnnka aggaatcagt tgagtgggc 49 <210> 167 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic, Primer ADS-M418-R <400> 167 cgctcattcc tagataacag gtag 24 <210> 168 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic, Primer ADS-F432-F <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> n is a, c, g, or t <400> 168 gggctgtatc tgctccgcct ttannkcgtt acagtggtat tctg 44 <210> 169 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic, Primer ADS-F432-R <400> 169 ggcggagcag atacagccca ctcaac 26 <210> 170 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic, Primer ADS-G439-F <220> <221> misc_feature <222> (27)..(28) <223> n is a, c, g, or t <400> 170 ctttattccg ttacagtggt attctgnnka ggagattaaa tgacctgatg 50 <210> 171 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic, Primer ADS-G439-R <400> 171 gaataccact gtaacggaat aaag 24 <210> 172 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic, Primer 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Glu Met Glu Glu Phe Leu Ala 340 345 350 Lys Glu Gly Arg Thr Asp Leu Phe Asn Cys Gly Lys Glu Phe Val Lys 355 360 365 Glu Phe Val Arg Asn Leu Met Val Glu Ala Lys Trp Ala Asn Glu Gly 370 375 380 His Ile Pro Thr Thr Glu Glu His Asp Pro Val Val Ile Ile Thr Gly 385 390 395 400 Gly Ala Asn Leu Leu Thr Thr Thr Cys Tyr Leu Gly Met Ser Asp Ile 405 410 415 Phe Thr Lys Glu Ser Val Glu Trp Ala Val Ser Ala Pro Pro Leu Phe 420 425 430 Arg Tyr Ser Gly Ile Leu Gly Arg Arg Leu Asn Asp Leu Met Thr His 435 440 445 Lys Ala Glu Gln Glu Arg Lys His Ser Ser Ser Ser Leu Glu Ser Tyr 450 455 460 Met Lys Glu Tyr Asn Val Asn Glu Glu Tyr Ala Gln Thr Leu Ile Tyr 465 470 475 480 Lys Glu Val Glu Asp Val Trp Lys Asp Ile Asn Arg Glu Tyr Leu Thr 485 490 495 Thr Lys Asn Ile Pro Arg Pro Leu Leu Met Ala Val Ile Tyr Leu Cys 500 505 510 Gln Phe Leu Glu Val Gln Tyr Ala Gly Lys Asp Asn Phe Thr Arg Met 515 520 525 Gly Asp Glu Tyr Lys His Leu Ile Lys Ser Leu Leu Val Tyr Pro Met 530 535 540 Ser Ile 545 <210> 175 <211> 585 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic, Artemisia annua Amorpha-4,11-diene Synthase A291C mutant <400> 175 Ala Arg Thr Glu Met Ile Ser Ile Ala Ala Asn Asn Ala Ala Met Arg 1 5 10 15 Pro His Ala Asp Ile Glu Asn Glu Ser Tyr Asn Thr His Ala Ser Glu 20 25 30 Ala Cys Met Thr Ala Asn Thr Met Ala Leu Thr Glu Glu Lys Pro Ile 35 40 45 Arg Pro Ile Ala Asn Phe Pro Pro Ser Ile Trp Gly Asp Gln Phe Leu 50 55 60 Ile Tyr Glu Lys Gln Val Glu Gln Gly Val Glu Gln Ile Val Asn Asp 65 70 75 80 Leu Lys Lys Glu Val Arg Gln Leu Leu Lys Glu Ala Leu Asp Ile Pro 85 90 95 Met Lys His Ala Asn Leu Leu Lys Leu Ile Asp Glu Ile Gln Arg Leu 100 105 110 Gly Ile Pro Tyr His Phe Glu Arg Glu Ile Asp His Ala Leu Gln Cys 115 120 125 Ile Tyr Glu Thr Tyr Gly Asp Asn Trp Asn Gly Asp Arg Ser Ser Leu 130 135 140 Trp Phe Arg Leu Met Arg Lys Gln Gly Tyr Tyr Val Thr Cys Asp Val 145 150 155 160 Phe Asn Asn Tyr Lys Asp Lys Asn Gly Ala Phe Lys Gln Ser Leu Ala 165 170 175 Asn Asp Val Glu Gly Leu Leu Glu Leu Tyr Glu Ala Thr Ser Met Arg 180 185 190 Val Pro Gly Glu Ile Ile Leu Glu Asp Ala Leu Gly Phe Thr Arg Ser 195 200 205 Arg Leu Ser Ile Met Thr Lys Asp Ala Phe Ser Thr Asn Pro Ala Leu 210 215 220 Phe Thr Glu Ile Gln Arg Ala Leu Lys Gln Pro Leu Trp Lys Arg Leu 225 230 235 240 Pro Arg Ile Glu Ala Ala Gln Tyr Ile Pro Phe Tyr Gln Gln Gln Asp 245 250 255 Ser His Asn Lys Thr Leu Leu Lys Leu Ala Lys Leu Glu Phe Asn Leu 260 265 270 Leu Gln Ser Leu His Lys Glu Glu Leu Ser His Val Cys Lys Trp Trp 275 280 285 Lys Ala Phe Asp Ile Lys Lys Asn Ala Pro Cys Leu Arg Asp Arg Ile 290 295 300 Val Glu Cys Tyr Phe Trp Gly Leu Gly Ser Gly Tyr Glu Pro Gln Tyr 305 310 315 320 Ser Arg Ala Arg Val Phe Phe Thr Lys Cys Val Ala Val Ile Thr Leu 325 330 335 Ile Asp Asp Thr Tyr Asp Ala Tyr Gly Thr Tyr Glu Glu Leu Lys Ile 340 345 350 Phe Thr Glu Ala Val Glu Arg Trp Ser Ile Thr Cys Leu Asp Thr Leu 355 360 365 Pro Glu Tyr Met Lys Pro Ile Tyr Lys Leu Phe Met Asp Thr Tyr Thr 370 375 380 Glu Met Glu Glu Phe Leu Ala Lys Glu Gly Arg Thr Asp Leu Phe Asn 385 390 395 400 Cys Gly Lys Glu Phe Val Lys Glu Phe Val Arg Asn Leu Met Val Glu 405 410 415 Ala Lys Trp Ala Asn Glu Gly His Ile Pro Thr Thr Glu Glu His Asp 420 425 430 Pro Val Val Ile Ile Thr Gly Gly Ala Asn Leu Leu Thr Thr Thr Cys 435 440 445 Tyr Leu Gly Met Ser Asp Ile Phe Thr Lys Glu Ser Val Glu Trp Ala 450 455 460 Val Ser Ala Pro Pro Leu Phe Arg Tyr Ser Gly Ile Leu Gly Arg Arg 465 470 475 480 Leu Asn Asp Leu Met Thr His Lys Ala Glu Gln Glu Arg Lys His Ser 485 490 495 Ser Ser Ser Leu Glu Ser Tyr Met Lys Glu Tyr Asn Val Asn Glu Glu 500 505 510 Tyr Ala Gln Thr Leu Ile Tyr Lys Glu Val Glu Asp Val Trp Lys Asp 515 520 525 Ile Asn Arg Glu Tyr Leu Thr Thr Lys Asn Ile Pro Arg Pro Leu Leu 530 535 540 Met Ala Val Ile Tyr Leu Cys Gln Phe Leu Glu Val Gln Tyr Ala Gly 545 550 555 560 Lys Asp Asn Phe Thr Arg Met Gly Asp Glu Tyr Lys His Leu Ile Lys 565 570 575 Ser Leu Leu Val Tyr Pro Met Ser Ile 580 585 <210> 176 <211> 585 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic, Artemisia annua Amorpha-4,11-diene Synthase A291I mutant <400> 176 Ala Arg Thr Glu Met Ile Ser Ile Ala Ala Asn Asn Ala Ala Met Arg 1 5 10 15 Pro His Ala Asp Ile Glu Asn Glu Ser Tyr Asn Thr His Ala Ser Glu 20 25 30 Ala Ile Met Thr Ala Asn Thr Met Ala Leu Thr Glu Glu Lys Pro Ile 35 40 45 Arg Pro Ile Ala Asn Phe Pro Pro Ser Ile Trp Gly Asp Gln Phe Leu 50 55 60 Ile Tyr Glu Lys Gln Val Glu Gln Gly Val Glu Gln Ile Val Asn Asp 65 70 75 80 Leu Lys Lys Glu Val Arg Gln Leu Leu Lys Glu Ala Leu Asp Ile Pro 85 90 95 Met Lys His Ala Asn Leu Leu Lys Leu Ile Asp Glu Ile Gln Arg Leu 100 105 110 Gly Ile Pro Tyr His Phe Glu Arg Glu Ile Asp His Ala Leu Gln Cys 115 120 125 Ile Tyr Glu Thr Tyr Gly Asp Asn Trp Asn Gly Asp Arg Ser Ser Leu 130 135 140 Trp Phe Arg Leu Met Arg Lys Gln Gly Tyr Tyr Val Thr Cys Asp Val 145 150 155 160 Phe Asn Asn Tyr Lys Asp Lys Asn Gly Ala Phe Lys Gln Ser Leu Ala 165 170 175 Asn Asp Val Glu Gly Leu Leu Glu Leu Tyr Glu Ala Thr Ser Met Arg 180 185 190 Val Pro Gly Glu Ile Ile Leu Glu Asp Ala Leu Gly Phe Thr Arg Ser 195 200 205 Arg Leu Ser Ile Met Thr Lys Asp Ala Phe Ser Thr Asn Pro Ala Leu 210 215 220 Phe Thr Glu Ile Gln Arg Ala Leu Lys Gln Pro Leu Trp Lys Arg Leu 225 230 235 240 Pro Arg Ile Glu Ala Ala Gln Tyr Ile Pro Phe Tyr Gln Gln Gln Asp 245 250 255 Ser His Asn Lys Thr Leu Leu Lys Leu Ala Lys Leu Glu Phe Asn Leu 260 265 270 Leu Gln Ser Leu His Lys Glu Glu Leu Ser His Val Cys Lys Trp Trp 275 280 285 Lys Ala Phe Asp Ile Lys Lys Asn Ala Pro Cys Leu Arg Asp Arg Ile 290 295 300 Val Glu Cys Tyr Phe Trp Gly Leu Gly Ser Gly Tyr Glu Pro Gln Tyr 305 310 315 320 Ser Arg Ala Arg Val Phe Phe Thr Lys Ile Val Ala Val Ile Thr Leu 325 330 335 Ile Asp Asp Thr Tyr Asp Ala Tyr Gly Thr Tyr Glu Glu Leu Lys Ile 340 345 350 Phe Thr Glu Ala Val Glu Arg Trp Ser Ile Thr Cys Leu Asp Thr Leu 355 360 365 Pro Glu Tyr Met Lys Pro Ile Tyr Lys Leu Phe Met Asp Thr Tyr Thr 370 375 380 Glu Met Glu Glu Phe Leu Ala Lys Glu Gly Arg Thr Asp Leu Phe Asn 385 390 395 400 Cys Gly Lys Glu Phe Val Lys Glu Phe Val Arg Asn Leu Met Val Glu 405 410 415 Ala Lys Trp Ala Asn Glu Gly His Ile Pro Thr Thr Glu Glu His Asp 420 425 430 Pro Val Val Ile Ile Thr Gly Gly Ala Asn Leu Leu Thr Thr Thr Cys 435 440 445 Tyr Leu Gly Met Ser Asp Ile Phe Thr Lys Glu Ser Val Glu Trp Ala 450 455 460 Val Ser Ala Pro Pro Leu Phe Arg Tyr Ser Gly Ile Leu Gly Arg Arg 465 470 475 480 Leu Asn Asp Leu Met Thr His Lys Ala Glu Gln Glu Arg Lys His Ser 485 490 495 Ser Ser Ser Leu Glu Ser Tyr Met Lys Glu Tyr Asn Val Asn Glu Glu 500 505 510 Tyr Ala Gln Thr Leu Ile Tyr Lys Glu Val Glu Asp Val Trp Lys Asp 515 520 525 Ile Asn Arg Glu Tyr Leu Thr Thr Lys Asn Ile Pro Arg Pro Leu Leu 530 535 540 Met Ala Val Ile Tyr Leu Cys Gln Phe Leu Glu Val Gln Tyr Ala Gly 545 550 555 560 Lys Asp Asn Phe Thr Arg Met Gly Asp Glu Tyr Lys His Leu Ile Lys 565 570 575 Ser Leu Leu Val Tyr Pro Met Ser Ile 580 585

Claims (33)

  1. (a) 숙주세포들의 대조군 집단에서 대조군 테르펜 합성효소 및 비교군 테르펜 합성효소를 발현시키는 단계로서, 상기 대조군 테르펜 합성효소는 폴리프레닐 디포스페이트를 첫 번째 테르펜으로 전환할 수 있고, 상기 비교군 테르펜 합성효소는 상기 폴리프레닐 디포스페이트를 두 번째 테르펜으로 전환할 수 있는 것인 단계;
    (b) 숙주세포들의 테스트 집단에서 테스트 테르펜 합성효소 및 상기 비교군 테르펜 합성효소를 발현시키는 단계로서, 상기 테스트 테르펜 합성효소는 상기 대조군 테르펜 합성효소의 변이체이고, 폴리프레닐 디포스페이트를 첫 번째 테르펜으로 전환할 수 있고,
    상기 비교군 테르펜 합성효소는 상기 테스트 집단 및 상기 대조군 집단에서 유사한 수준들로 발현되는 것인 단계; 및
    (c) 상기 테스트 집단 및 상기 대조군 집단 모두에서 상기 첫 번째 테르펜 및 상기 두 번째 테르펜의 양을 측정하는 단계
    를 포함하는, 테르펜 합성효소 변이체를 개선된 생체내 성능에 대해 테스트하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 테스트 집단은, (i) 상기 대조군 집단에서의 비율과 대비한 상기 테스트 집단에서 상기 두 번째 테르펜의 양 대비 상기 첫 번째 테르펜의 양의 비율의 증가; 또는 (ii) 상기 대조군 집단에서의 비율과 대비한 상기 테스트 집단에서 상기 첫 번째 테르펜의 양 대비 상기 두 번째 테르펜의 양의 비율의 감소에 의해, 상기 대조군 테르펜 합성효소와 대비하여 개선된 생체내 성능을 가지는 테르펜 합성효소 변이체를 포함하는 것으로서 확인되는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 대조군 테르펜 합성효소, 비교군 테르펜 합성효소 및 테스트 테르펜 합성효소는 세스퀴테르펜 합성효소들이고, 상기 폴리프레닐 디포스페이트는 파네실 디포스페이트 (FPP)인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 비교군 테르펜 합성효소는 트리코디엔 합성효소인 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 대조군 및 테스트 테르펜 합성효소는 파네센 합성효소 활성을 가지는 합성효소들인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 대조군 테르펜 합성효소, 비교군 테르펜 합성효소 및 테스트 테르펜 합성효소는 모노테르펜 합성효소들이고, 상기 폴리프레닐 디포스페이트는 게라닐 디포스페이트 (GPP)인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 숙주세포는 메발로네이트 (MEV) 경로의 하나 이상의 이종유래 효소들을 포함하는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 MEV 경로의 하나 이상의 이종유래 효소들은 포스포메발로네이트 키나제(ERG8), 아세틸-조효소 A(CoA) 티올라제(ERG10), 메발로네이트 키나제(ERG12), 3-히드록시-3-메틸글루타릴 조효소 A(HMG-CoA) 합성효소(ERG13), 메발로네이트 피로포스페이트 탈탄산화효소(ERG19) 및 HMG-CoA 환원효소(HMG1)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 테스트 테르펜 합성효소는 상기 대조군 테르펜 합성효소와 1개 내지 10개의 아미노산들에 의해 서로 다른 것인 방법.
  10. 제2항에 있어서, 상기 두 번째 테르펜 대비 상기 첫 번째 테르펜의 비율은 적어도 1.3인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 테스트 테르펜 합성효소는 상기 테스트 집단에서, 상기 대조군 테르펜 합성효소가 상기 대조군 집단에서 발현되는 것과 유사한 수준으로 발현되는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 대조군 집단 및 상기 테스트 집단에서, 상기 대조군 테르펜 합성효소의 코딩서열과 상기 테스트 테르펜 합성효소의 코딩서열은 동일하지만, 상기 대조군 테르펜 합성효소와 상기 테스트 테르펜 합성효소는 서로 다른 프로모터의 조절적 통제하에 있고 서로 다른 수준들로 발현되는 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 숙주 세포들의 집단은 효모 세포들의 집단인 방법.
  14. 숙주세포들의 단일 집단으로부터 유래한 두 개의 세포 소집단들을 포함하는 조성물로서,
    (a) 첫 번째 소집단은 대조군 테르펜 합성효소 및 비교군 테르펜 합성효소를 포함하고, 상기 대조군 테르펜 합성효소는 폴리프레닐 디포스페이트를 첫 번째 테르펜으로 전환하고, 상기 비교군 테르펜 합성효소는 상기 폴리프레닐 디포스페이트를 두 번째 테르펜으로 전환하고;
    (b) 두 번째 소집단은 테스트 테르펜 합성효소 및 상기 비교군 테르펜 합성효소를 포함하고, 상기 테스트 테르펜 합성효소는 폴리프레닐 디포스페이트를 첫 번째 테르펜으로 전환하며, 상기 대조군 테르펜 합성효소의 변이체이고, 상기 비교군 테르펜 합성효소는 상기 첫 번째 소집단 및 상기 두 번째 소집단에서 유사한 수준들로 발현되는 것인,
    조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 두 번째 테르펜 대비 상기 첫 번째 테르펜의 비율이 상기 첫 번째 소집단에서의 비율과 대비하여 상기 두 번째 소집단에서 더 큰 것인 조성물.
  16. 제1항에 있어서, 상기 숙주세포들의 집단은 대장균 세포들의 집단인 방법.
  17. 제8항에 있어서, 상기 숙주세포는 이종유래 이소펜테닐 피로포스페이트 (IPP) 이성질화효소를 포함하는 것인 방법.
  18. 제8항에 있어서, 상기 숙주세포는 이종유래 FPP 합성효소를 포함하는 것인 방법.
  19. 제8항에 있어서, 상기 숙주세포는 이종유래 게라닐게라닐 피로포스페이트 (GGPP) 합성효소를 포함하는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 대조군 테르펜 합성효소, 비교군 테르펜 합성효소 및 테스트 테르펜 합성효소는 디테르펜 합성효소들이고, 상기 폴리프레닐 디포스페이트는 게라닐게라닐 피로포스페이트 (GGPP)인 방법.
  21. 제3항에 있어서, 상기 대조군 테르펜 합성효소, 비교군 테르펜 합성효소 및 테스트 테르펜 합성효소는 각각 β-파네센 합성효소, α-파네센 합성효소, 트리코디엔 합성효소, 패추롤 합성효소, 아모파디엔 합성효소, 발렌센 합성효소, 파네솔 합성효소, 네로리돌 합성효소 및 누트카톤 합성효소로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  22. 제1항에 있어서, 상기 대조군 테르펜 합성효소, 비교군 테르펜 합성효소 및 테스트 테르펜 합성효소는 각각 세스터테르펜 합성효소, 트리테르펜 합성효소, 테트라테르펜 합성효소 또는 폴리테르펜 합성효소인 방법.
  23. 제1항에 있어서, 상기 첫 번째 테르펜 또는 상기 두 번째 테르펜은 β-파네센, α-파네센, 트리코디엔, 패추롤, 아모파디엔, 발렌센, 파네솔, 네로리돌 및 누트카톤으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  24. 제1항에 있어서, 상기 첫 번째 테르펜 또는 상기 두 번째 테르펜은 리모넨 또는 마이어센인 방법.
  25. 제1항에 있어서, (e) (i) 상기 테스트 집단에서의 상기 첫 번째 테르펜의 양 및 상기 테스트 집단에서의 상기 두 번째 테르펜의 양을 (ii) 상기 대조군 집단에서의 상기 첫 번째 테르펜의 양 및 상기 대조군 집단에서의 상기 두 번째 테르펜의 양과 비교하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 비교 단계 (e)는 (i) 상기 테스트 집단에서의 상기 첫 번째 테르펜의 양과 (ii) 상기 테스트 집단에서의 상기 두 번째 테르펜의 양의 비율인 첫 번째 비율을, (i) 상기 대조군 집단에서의 상기 첫 번째 테르펜의 양과 (ii) 상기 대조군 집단에서의 상기 두 번째 테르펜의 양의 비율인 두 번째 비율과 비교하는 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 첫 번째 비율은 (ii) 상기 테스트 집단에서의 상기 두 번째 테르펜의 양 대비 (i) 상기 테스트 집단에서의 상기 첫 번째 테르펜의 양의 비율이고, 상기 두 번째 비율은 (ii) 상기 대조군 집단에서의 상기 두 번째 테르펜의 양 대비 (i) 상기 대조군 집단에서의 상기 첫 번째 테르펜의 양의 비율인 방법.
  28. 제14항에 있어서, 상기 대조군 테르펜 합성효소, 비교군 테르펜 합성효소 및 테스트 테르펜 합성효소는 세스퀴테르펜 합성효소들이고, 상기 폴리프레닐 디포스페이트는 파네실 디포스페이트 (FPP)인 조성물.
  29. 제14항에 있어서, 상기 대조군 및 테스트 테르펜 합성효소는 파네센 합성효소 활성을 가지는 합성효소들인 조성물.
  30. 제14항에 있어서, 상기 비교군 테르펜 합성효소는 트리코디엔 합성효소인 조성물.
  31. 제14항에 있어서, 상기 숙주세포는 메발로네이트 (MEV) 경로의 하나 이상의 이종유래 효소들을 포함하는 것인 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 상기 MEV 경로의 하나 이상의 이종유래 효소들은 포스포메발로네이트 키나제(ERG8), 아세틸-조효소 A(CoA) 티올라제(ERG10), 메발로네이트 키나제(ERG12), 3-히드록시-3-메틸글루타릴 조효소 A(HMG-CoA) 합성효소(ERG13), 메발로네이트 피로포스페이트 탈탄산화효소(ERG19) 및 HMG-CoA 환원효소(HMG1)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 조성물.
  33. 제14항에 있어서, 상기 숙주세포는 이종유래 FPP 합성효소를 포함하는 것인 조성물.
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