CN109837266B

CN109837266B - 一种小萼苔倍半萜合成酶MTc及其基因序列

Info

Publication number: CN109837266B
Application number: CN201910068903.6A
Authority: CN
Inventors: 乔建军; 闫晓光; 李伟国; 梁冬梅
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2019-01-24
Filing date: 2019-01-24
Publication date: 2021-12-31
Anticipated expiration: 2039-01-24
Also published as: CN109837266A

Abstract

本发明公开了一种小萼苔倍半萜合成酶MTc及其基因序列,该基因全长1032bp，编码343个氨基酸，酶蛋白分子量大小为39.5KDa，以pESC‑LEU酵母蛋白表达质粒为载体，以酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae WQ011为宿主，实现了小萼苔倍半萜合成酶MTc的异源表达，重组菌WQ011/pESC‑LEU‑MTc可以同时生成法尼醇(Farnesol)和橙花叔醇(Nerolidol)两种倍半萜醇。50mL摇瓶产量为橙花叔醇19.88mg/L和法尼醇4.81mg/L。该基因的获得对苔藓植株倍半萜化合物的研究具有深远的意义。

Description

一种小萼苔倍半萜合成酶MTc及其基因序列

技术领域

本发明属于酶基因工程及酶工程领域，具体涉及一种来源于小萼苔(Myliataylori)的倍半萜合成酶MTc以及基因序列MT-48190。

背景技术

萜类化合物是化学结构和构象最为复杂的天然产物，目前发现的萜类化合物有80000种左右，占据天然产物的三分之一，广泛分布于植物和微生物中。萜类化合物的生物合成需要的最基本的结构单元是二甲基烯丙基焦磷酸Dimethylallyl diphosphate，DMAPP和异戊烯基焦磷酸Isopentenyl diphosphate，IPP来自于甲羟戊酸途径和脱氧木酮糖磷酸酯途径。不同数量的DMAPP和IPP首尾聚合再经过特殊的萜合酶的催化形成单萜(C₁₀)倍半萜(C₁₅)和二萜(C₂₀)等天然产物。倍半萜类化合物是萜类化合物中结构和种类最多的一种，已经被广泛应用于生物制药、天然绿色农药杀虫和杀菌剂、燃料替代品和食品级香料和调味剂等行业开发使用。

法尼醇(Farnesol)和橙花叔醇(Nerolidol)等倍半萜类化合物具有显著的抗氧化、抑制真菌、和抑制肿瘤等作用，含有此类倍半萜类化合物的植物精油常被作为抗衰老药剂或者杀虫抑菌药剂添加使用。此外富含橙花叔醇的活性精油因具有独特的香味，常用于化妆品等化工领域，制作香水等日化产品。

苔藓植物是介于藻类和蕨类植物之间的一个非常重要的植物类群。苔类植物中的化合物种类繁多结构多样，其中生长于高海拔峭壁上的小萼苔富含萜类化合物具有多种多样的生物活性，例如抗氧化、抑菌和昆虫拒食等。由于小萼苔生长环境特殊，所属叶苔科植株十分稀有，因此目前对此类苔藓植株研究很少，目前没有对小萼苔中倍半萜合成酶的相关文献。因此研究小萼苔萜合酶的功能及其序列特征对萜类化合物的分布具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于弥补现有技术的不足，提供一种小萼苔倍半萜合成酶MTc及其基因序列，还提供了包含本发明基因的质粒及包含该表达质粒的宿主细胞，并利用宿主细胞(重组菌)诱导表达该倍半萜合成酶MTc生成倍半萜类化合物。

本发明的技术方案是：

一种小萼苔倍半萜合成酶，记为MTc，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

编码权利要求1所述小萼苔倍半萜合成酶MTc的基因，记为MT-48190，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种重组质粒，记为pESC-LEU-MTc，含有权利要求2所述基因，半乳糖诱导型启动子PGal1,10，亮氨酸营养缺陷筛选标签。

一种重组菌，记为WQ011/pESC-LEU-MTc，含有权利要求3所述重组质粒。

本发明的有益效果是：本发明的一种小萼苔倍半萜合成酶MTc及其基因序列,该基因全长1032bp，编码343个氨基酸，酶蛋白分子量大小为39.5KDa，以pESC-LEU酵母蛋白表达质粒为载体，以酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae WQ011为宿主，实现了小萼苔倍半萜合成酶MTc的异源表达，重组菌WQ011/pESC-LEU-MTc可以同时生成法尼醇(Farnesol)和橙花叔醇(Nerolidol)两种倍半萜醇。对倍半萜的生产及运用具有重要意义，同时该基因的获得对苔藓植株倍半萜化合物的形成机制和生物胁迫机理研究奠定基础。

附图说明

图1为WQ011/pESC-LEU-MTc重组酵母菌株验证DNA琼脂糖凝胶图谱(目的条带大小为1032bp)；

M：标准DNA分子尺；泳道1为MT-48190基因DNA样品；

图2为外标法标准曲线；

图3为WQ011/pESC-LEU-MTc重组酵母菌株产物GC-MS图谱；

A为发酵产物的GC图谱；B为保留时间11.31min峰的质谱图和NIST14谱库中橙花叔醇质谱图比较；C为保留时间13.09min峰的质谱图和NIST14谱库中法尼醇质谱图比较。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。

本发明倍半萜合成酶基因来源于小萼苔植株，植物在2017年8月25日采集于云南省大理市国家级自然风景保护区苍山风雨亭至洗马潭路段，海拔3630cm，标本保存于昆明植物所，标本号：17-9180。

选用新鲜采集的小萼苔植株进行RNA提取，并通过反转录PCR获得其cDNA序列，构建cDNA文库。使用PacBio ISO-Seq平台进行测序，通过在Interpro(http://www.ebi.ac.uk/interpro)中进行BLAST比对获得具有PF_03936Terpene synthase family结构域的目的基因。以cDNA序列为模板，设计引物扩增MT-48190基因序列，并通过酶切连接到WQ011/pESC-LEU-MTc质粒上获得pESC-LEU-MTc酵母宿主表达质粒。采用醋酸锂酵母化学转化法，将重组质粒pESC-LEU-MTc转化如酿酒酵母宿主WQ011，通过Leu缺陷型筛选平板，筛选获得WQ011/pESC-LEU-MTc重组酵母菌株，实现小萼苔的倍半萜合成酶MTc的高效表达。

实施例1.所述的WQ011/pESC-LEU-MTc菌株小萼苔倍半萜合成酶基因MT-48190的克隆及表达

采用RNAprep pure Plant Kit提取小萼苔总RNA。采用Clontech SMARTer PCRcDNA Synthesis Kit合成第一链cDNA，第一链cDNA经过PCR扩增合成第二链cDNA，然后双链DNA经过二次PCR扩增后，用于SMRTbell建库，并采用PacBio ISO-Seq平台进行测序。

根据测序获得的MT-48190基因序列SEQ ID NO.2，设计引物扩增目的基因，引物序列如下：

引物MT-48190-F:5'CGCGGATCCATGCCATCGCAATATATTAT 3'(SEQ ID NO.3)

引物MT-48190-R：5'CCGCTCGAGTCATGCAATGCTAACTTGGA 3'(SEQ ID NO.4)

以反转录获得的cDNA序列为模板，采用上述引物，PCR扩增MT-48190基因序列。反应体系为50ul，包括ddH₂O 18ul，dNTP mixture 1ul,MT-48190-F引物1ul，MT-48190-R引物1ul，DNA模板1ul，2×Phanta Max 25ul，Fidelity DNA polymerase 1ul。扩增过程为：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火60s，72℃延伸1.5min，35个循环；72℃终延伸5min。

PCR产物经1.5％的琼脂糖凝胶检测条带大小，用Universal DNA PurificationKit回收目的片段。

用BamHI和XhoI酶切纯化的DNA片段和pESC-LEU质粒，酶切后的产物经过Universal DNA Purification Kit回收得到酶切片段，经过T4DNA ligase连接酶进行连接，得到重组质粒。酶切体系为：BamHI1.5μL，XhoI 1.5μL，DNA片段或质粒42μL，cut smartbuffer 5μL。37℃水浴2h。连接体系为：目的酶切基因片段7μL与酶切质粒1μL，T4连接酶1μL，10×T4ligase buffer1μL。16℃过夜连接。

采用醋酸锂转化法，进行酵母转化，操作步骤如下：

(1)酿酒酵母菌株WQ011划线YPD平板，30℃培养，至长出单菌落约1-3mm。从YPD平板挑取一环酵母菌接种于含有5mL YPD液体培养基中，180r/min，30℃，摇床培养14～16h。

(2)按照1％接种量，将菌液接入50mL YEPD液体培养基中，180r/min，30℃培养至OD₆₀₀＝0.5(约3-5h)。

(3)5000r/min，4℃冷冻离心6min，收集菌体。

(4)加入25mL无菌去离子水悬浮菌体，5000r/min，4℃冷冻离心6min。

(5)重复上一步操作一次。

(6)用1mL浓度为0.1mol/L的LiAc缓冲液重悬菌体，静置5min。5000r/min，4℃冷冻离心5min后，弃去上清。

(7)用500μL 0.1mol/L的LiAc缓冲液重悬菌体，每100μL分装到一个离心管中，制成酵母感受态细胞。

(8)ssDNA经过煮沸12min后冰上迅速冷却。

(9)在分装好的酵母感受态细胞中，加入100-500ng的载体或线性DNA。之后旋转加入如下混合物中。转化混合物的成分如下：1)PEG-4000 50％(w/v)，620μl；2)LiAc1.0mol/L，90μl；3)SS-DNA(10mg/ml)，40μl。

(10)30℃培养箱中孵育30min。

(12)42℃水浴热激20min。

(15)6000r/min离心1min，弃掉部分上清液，重悬菌体，取100μL涂板，30℃培养2-3天，长出转化子。

(16)挑取少许单菌落，加入50μl除菌的20mM NaOH溶液混匀。

(17)置于PCR仪中，按照程序：99℃，5min；4℃，1min循环3次。

(18)取出菌液，8000r/min离心5min，取上清作为PCR模板。

(19)反应体系为10ul，包括MT-48190-F引物1ul，MT-48190-R引物1ul，DNA模板3ul，2×Taq Master Mix 5ul。扩增过程为：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火60s，72℃延伸1.5min，35个循环；72℃终延伸5min。

(20)PCR产物经1.5％的琼脂糖凝胶检测条带大小是否正确。

结果表明(如图1所示)：挑选的转化子在1000bp附近有单一条带，证明转化子为阳性克隆子。

实施例2.诱导发酵

(1)将转化子WQ011/pESC-LEU-MTc转接至50mL合成培养基(with out Leu)中，180r/min，30℃，摇床培养30h。

(2)在30h时添加终浓度10g/L半乳糖诱导表达至90-120h，在36h和72h时添加终浓度10g/L乙醇作为补充碳源。

(3)发酵液采用3mL正己烷萃取发酵产物15min进行GC-MS检测。

实施例3.GC-MS检测发酵产物

(1)GC-MS检测方法

色谱柱：TG-5MS；离子源；EI，70eV；进样量：1uL；进样温度：200℃；检测器温度：280℃；柱温：240℃；程序升温：初始温度70℃，10℃/min升温到280℃，维持5min。

(2)采用外标法计算产量。分别准确配制0.02，0.04，0.06，0.08和1.0mg/L标准品，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线(如图2所示)。

结果表明(如图3所示)：GC-MS谱图中的目标峰，经过与NIST14数据库中的参考质谱数据比较发现，WQ011/pESC-LEU-MTc菌株发酵液正己烷萃取物在保留时间11.31min的色谱峰为橙花叔醇，50mL摇瓶产量为19.88mg/L。在保留时间13.09min的色谱峰为法尼醇，50mL摇瓶产量为4.81mg/L。

以上所述仅为本发明的优选实施方式，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的若干改进或变形，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，也应视为在本发明的专利保护范围内。

<110> 天津大学

<120> 一种小萼苔倍半萜合成酶MTc及其基因序列

<130>

<160> 4

<170>

<210> 1

<211> 343

<212> PRT

<213> 小萼苔

<400> 1

Met Pro Ser Gln Tyr Ile Ile Pro Asp Leu Leu Ile Thr Trp Pro Trp

1 5 10 15

Pro Arg Val Ala Asn His Gly Leu Arg Asp Ile Glu Asp Glu Ala Asn

20 25 30

Ala Trp Val Gln Ser Phe Gly Leu Phe Glu Pro Glu Lys Phe Glu Lys

35 40 45

Phe Lys Ala Cys Asn Phe Asn Leu Leu Ala Ser Leu Val Gly Pro Leu

50 55 60

Glu Ser Arg Asp His Leu Arg Ile Ser Cys Asp Leu Met Asn Phe Tyr

65 70 75 80

Phe Ala Phe Asp Glu Tyr Thr Asp Leu Ala Thr Lys Asp Glu Ala Lys

85 90 95

Lys Ile Ala Arg Asp Val Met Asp Thr Phe Arg Asn Thr Glu Thr Pro

100 105 110

Ser Asn Asn Lys Ile Thr Glu Met Ala Arg Gln Phe Phe Lys Arg Thr

115 120 125

Val Asp Val Val Gly Glu Asp Leu Pro Gly Ile Glu Arg Phe Ile Ala

130 135 140

Asp Phe Asp Ala Tyr Thr Gly Ser Val Ile Gln Glu Ala Asp Asp Arg

145 150 155 160

Val Glu Gly His Ile Arg Asn Val Glu Asp Tyr Phe Ile Leu Arg Arg

165 170 175

Asp Thr Cys Gly Ala Lys Pro Ser Phe Ser Phe Phe Gly Leu Gly Leu

180 185 190

Asn Ile Pro Thr Glu Val Phe Glu Asn Ser Leu Val Ile Ser Met Val

195 200 205

Glu Ser Ala Thr Asp Leu Ile Ala Val Thr Asn Asp Met His Ser Tyr

210 215 220

Gly Leu Glu His Ser Arg Gly Leu Asp Gly His Asn Val Ile Thr Ala

225 230 235 240

Ile Met Gln Glu Tyr His Leu Asn Leu Gln Gly Ala Leu Tyr Trp Leu

245 250 255

Ser Gly Tyr Ala Thr Lys Thr Ile Ser Lys Phe Leu Ser Asp Arg Lys

260 265 270

Lys Leu Pro Ser Trp Gly Pro Thr Val Asp Lys Ala Leu Asn Glu Tyr

275 280 285

Phe Asp Arg Val Gly Arg Cys Val Arg Gly Tyr Asp Ala Trp Ser Tyr

290 295 300

Glu Thr Arg Arg Tyr Tyr Gly Lys Asn Gly Leu Lys Ile Gln Lys Thr

305 310 315 320

Arg Arg Ile Thr Leu Arg Pro Arg Asp Pro Ala Tyr Leu Thr Arg Asp

325 330 335

Gln Leu Gln Val Ser Ile Ala

340 343

<210> 2

<211> 1032

<212> DNA

<213> 小萼苔

<400> 2

atgccatcgc aatatattat tccagacctc ctgattacat ggccctggcc acgagtcgca 60

aaccatggac tccgggatat tgaagacgag gcgaacgcat gggtgcaatc attcggttta 120

ttcgagcccg agaaattcga gaaattcaaa gcctgtaatt tcaatcttct agcctctctc 180

gtgggccctc tagaaagcag agaccatctc cgcatatcct gcgatttgat gaacttttac 240

tttgccttcg acgagtacac cgacctggct actaaagatg aggccaagaa gatcgcaaga 300

gatgtcatgg atactttcag aaacaccgaa actccgtcaa ataataagat aaccgagatg 360

gctcgtcagt tcttcaagag aacagtcgac gttgttggag aagatttacc tggaatcgag 420

aggttcatcg ccgattttga tgcctatacc ggatcagtaa ttcaggaggc agacgaccgt 480

gtcgaaggac acatcaggaa cgtcgaagac tactttattc ttcgacgcga tacatgcgga 540

gcgaaaccca gtttctcatt tttcggattg ggcctaaata tcccgaccga ggttttcgag 600

aactcccttg tcatttccat ggtcgaaagt gcgacagacc tcattgccgt cacaaatgac 660

atgcactcat acggtctgga gcactcacgc gggctggacg gccacaacgt tattacggcc 720

atcatgcaag aataccactt aaacctacaa ggagcgctgt actggctctc cggatacgcc 780

acgaaaacca tttccaagtt cctctccgat cgtaagaagc ttccttcgtg gggtcctaca 840

gtggacaagg ctctcaacga atactttgat cgagtcggtc gatgcgttcg tggctatgac 900

gcctggagct atgaaacaag aaggtactac gggaaaaatg gcctcaaaat acagaagact 960

cgaagaatta ctttgcggcc acgcgatcca gcatacctaa cgagggatca actccaagtt 1020

agcattgcat ga 1032

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgcggatcca tgccatcgca atatattat 29

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccgctcgagt catgcaatgc taacttgga 29

Claims

1.一种小萼苔倍半萜合成酶，记为MTc，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述小萼苔倍半萜合成酶MTc的基因，记为MT-48190，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种重组质粒，记为pESC-LEU-MTc，其特征在于，含有权利要求2所述基因，半乳糖诱导型启动子PGal1和PGal10，亮氨酸营养缺陷筛选标签。

4.一种重组菌，记为WQ011/pESC-LEU-MTc，其特征在于，含有权利要求3所述重组质粒。