JPWO2016056610A1 - 7デヒドロコレステロール及びビタミンd3の製造法 - Google Patents
7デヒドロコレステロール及びビタミンd3の製造法 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2016056610A1 JPWO2016056610A1 JP2016553147A JP2016553147A JPWO2016056610A1 JP WO2016056610 A1 JPWO2016056610 A1 JP WO2016056610A1 JP 2016553147 A JP2016553147 A JP 2016553147A JP 2016553147 A JP2016553147 A JP 2016553147A JP WO2016056610 A1 JPWO2016056610 A1 JP WO2016056610A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- labyrinthula
- 7dhc
- parent strain
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 47
- QYSXJUFSXHHAJI-YRZJJWOYSA-N vitamin D3 Chemical compound C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)=C\C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C QYSXJUFSXHHAJI-YRZJJWOYSA-N 0.000 title claims abstract description 25
- QYSXJUFSXHHAJI-XFEUOLMDSA-N Vitamin D3 Natural products C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)=C/C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C QYSXJUFSXHHAJI-XFEUOLMDSA-N 0.000 title claims abstract description 20
- 235000005282 vitamin D3 Nutrition 0.000 title claims abstract description 20
- 239000011647 vitamin D3 Substances 0.000 title claims abstract description 20
- 229940021056 vitamin d3 Drugs 0.000 title claims abstract description 20
- UCTLRSWJYQTBFZ-UHFFFAOYSA-N Dehydrocholesterol Natural products C1C(O)CCC2(C)C(CCC3(C(C(C)CCCC(C)C)CCC33)C)C3=CC=C21 UCTLRSWJYQTBFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 71
- 241001491670 Labyrinthula Species 0.000 claims abstract description 66
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 62
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims abstract description 24
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 claims abstract description 12
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 claims abstract description 12
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 claims abstract description 12
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims abstract description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 123
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 89
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 58
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 43
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 19
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 13
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 13
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 12
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 claims description 10
- 241000233671 Schizochytrium Species 0.000 claims description 8
- 241001306132 Aurantiochytrium Species 0.000 claims description 7
- 241001138695 Parietichytrium Species 0.000 claims description 6
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 6
- 241001306135 Oblongichytrium Species 0.000 claims description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 abstract description 9
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 58
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 29
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 22
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- ZSLUVFAKFWKJRC-IGMARMGPSA-N 232Th Chemical compound [232Th] ZSLUVFAKFWKJRC-IGMARMGPSA-N 0.000 description 18
- 229910052776 Thorium Inorganic materials 0.000 description 18
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 16
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 10
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 9
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 9
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 9
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 9
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000233675 Thraustochytrium Species 0.000 description 8
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 8
- 241000598397 Schizochytrium sp. Species 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 6
- 241000235343 Saccharomycetales Species 0.000 description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 6
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 6
- 101150050623 erg-6 gene Proteins 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- 241000162592 Aurantiochytrium limacinum ATCC MYA-1381 Species 0.000 description 5
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 5
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 5
- OILXMJHPFNGGTO-UHFFFAOYSA-N (22E)-(24xi)-24-methylcholesta-5,22-dien-3beta-ol Natural products C1C=C2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)C=CC(C)C(C)C)C1(C)CC2 OILXMJHPFNGGTO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- RQOCXCFLRBRBCS-UHFFFAOYSA-N (22E)-cholesta-5,7,22-trien-3beta-ol Natural products C1C(O)CCC2(C)C(CCC3(C(C(C)C=CCC(C)C)CCC33)C)C3=CC=C21 RQOCXCFLRBRBCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OQMZNAMGEHIHNN-UHFFFAOYSA-N 7-Dehydrostigmasterol Natural products C1C(O)CCC2(C)C(CCC3(C(C(C)C=CC(CC)C(C)C)CCC33)C)C3=CC=C21 OQMZNAMGEHIHNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DNVPQKQSNYMLRS-NXVQYWJNSA-N Ergosterol Natural products CC(C)[C@@H](C)C=C[C@H](C)[C@H]1CC[C@H]2C3=CC=C4C[C@@H](O)CC[C@]4(C)[C@@H]3CC[C@]12C DNVPQKQSNYMLRS-NXVQYWJNSA-N 0.000 description 4
- 241001467308 Labyrinthuloides Species 0.000 description 4
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 241001491678 Ulkenia Species 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 4
- DNVPQKQSNYMLRS-SOWFXMKYSA-N ergosterol Chemical compound C1[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@H](CC[C@]3([C@H]([C@H](C)/C=C/[C@@H](C)C(C)C)CC[C@H]33)C)C3=CC=C21 DNVPQKQSNYMLRS-SOWFXMKYSA-N 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 3
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 241001138688 Parietichytrium sarkarianum Species 0.000 description 3
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 3
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 3
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- XIIAYQZJNBULGD-XWLABEFZSA-N 5α-cholestane Chemical compound C([C@@H]1CC2)CCC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]2(C)CC1 XIIAYQZJNBULGD-XWLABEFZSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000003610 Aplanochytrium Species 0.000 description 2
- 241001130339 Aurantiochytrium sp. Species 0.000 description 2
- 241001138693 Botryochytrium Species 0.000 description 2
- 241001138694 Botryochytrium radiatum Species 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000003482 Japonochytrium Species 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- 241000394331 Schizochytrium aggregatum ATCC 28209 Species 0.000 description 2
- 241001138689 Sicyoidochytrium Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 108030006420 Sterol 24-C-methyltransferases Proteins 0.000 description 2
- 241000144181 Thraustochytrium aureum Species 0.000 description 2
- 241001298230 Thraustochytrium sp. Species 0.000 description 2
- 241001298226 Ulkenia sp. Species 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UJELMAYUQSGICC-UHFFFAOYSA-N Zymosterol Natural products CC12CCC(O)CC1CCC1=C2CCC2(C)C(C(C)C=CCC(C)C)CCC21 UJELMAYUQSGICC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L disodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC([O-])=O PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- 239000002044 hexane fraction Substances 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- CASUWPDYGGAUQV-UHFFFAOYSA-M potassium;methanol;hydroxide Chemical compound [OH-].[K+].OC CASUWPDYGGAUQV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000007127 saponification reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013535 sea water Substances 0.000 description 2
- 229940073490 sodium glutamate Drugs 0.000 description 2
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 2
- 150000003431 steroids Chemical group 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002268 wool Anatomy 0.000 description 2
- CGSJXLIKVBJVRY-XTGBIJOFSA-N zymosterol Chemical group C([C@@]12C)C[C@H](O)C[C@@H]1CCC1=C2CC[C@]2(C)[C@@H]([C@@H](CCC=C(C)C)C)CC[C@H]21 CGSJXLIKVBJVRY-XTGBIJOFSA-N 0.000 description 2
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010056679 7-dehydrocholesterol reductase Proteins 0.000 description 1
- 102100036512 7-dehydrocholesterol reductase Human genes 0.000 description 1
- RUSSPKPUXDSHNC-DDPQNLDTSA-N 7-dehydrodesmosterol Chemical compound C1[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@H](CCC=C(C)C)C)CC[C@H]33)C)C3=CC=C21 RUSSPKPUXDSHNC-DDPQNLDTSA-N 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100348084 Drosophila melanogaster CDase gene Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000253724 Saccharomyces cerevisiae S288c Species 0.000 description 1
- 235000004905 Saccharomyces cerevisiae S288c Nutrition 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 208000035472 Zoonoses Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940059720 apra Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008686 ergosterol biosynthesis Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000000116 mitigating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000011330 nucleic acid test Methods 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 235000021313 oleic acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 description 1
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000004808 supercritical fluid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- 206010048282 zoonosis Diseases 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C401/00—Irradiation products of cholesterol or its derivatives; Vitamin D derivatives, 9,10-seco cyclopenta[a]phenanthrene or analogues obtained by chemical preparation without irradiation
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J19/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J19/08—Processes employing the direct application of electric or wave energy, or particle radiation; Apparatus therefor
- B01J19/12—Processes employing the direct application of electric or wave energy, or particle radiation; Apparatus therefor employing electromagnetic waves
- B01J19/122—Incoherent waves
- B01J19/123—Ultraviolet light
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
- C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P33/00—Preparation of steroids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/22—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group aromatic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y201/00—Transferases transferring one-carbon groups (2.1)
- C12Y201/01—Methyltransferases (2.1.1)
- C12Y201/01041—Sterol 24-C-methyltransferasee (2.1.1.41)
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/08—Processes employing the direct application of electric or wave energy, or particle radiation; Apparatus therefor
- B01J2219/12—Processes employing electromagnetic waves
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Electromagnetism (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
Description
医薬品又はサプリメントに含まれるビタミンD3は、主に羊毛から得られるコレステロールから化学変換によって生産された7DHCに紫外線を照射することによって生産されている。しかしながら、BSEや人獣共通感染症の問題から、動物由来の原料は医薬品又はサプリメントの原料として敬遠される傾向にあるため、非動物由来のビタミンD3が求められていた。非動物由来のビタミンD3は、非動物由来の7DHCに紫外線を照射することにより生産することができる。
また、コレステロールを生合成するラビリンチュラ類微生物が、SMT活性を有すること、およびSMT活性を低下または喪失させることで、7DHCを生成、蓄積するとの報告はない。
(1)親株に比べSMT活性が低下または喪失しており、かつ7DHCを生産するラビリンチュラ類微生物を培地に培養し、培養物中に7DHCを生成、蓄積させ、該培養物中から7DHCを採取することを特徴とする、7DHCの製造法。
(2)親株に比べSMT活性が低下または喪失したラビリンチュラ類微生物が、親株の染色体DNA上に存在するSMT活性を有する蛋白質をコードする遺伝子に、1以上の塩基が欠失、置換または付加されたことにより、親株に比べSMT活性が低下または喪失したラビリンチュラ類微生物である、上記(1)に記載の製造法。
(3)親株に比べSMT活性が低下または喪失したラビリンチュラ類微生物が、親株の染色体DNA上に存在するSMT活性を有する蛋白質をコードする遺伝子から転写されるメッセンジャーRNAと相補的な配列を有し、該メッセンジャーRNAと複合体を形成するRNAをコードするDNAで、親株を形質転換して得られる、親株に比べSMT活性が低下または喪失したラビリンチュラ類微生物である、上記(1)に記載の製造法。
(4)SMT活性を有する蛋白質をコードする遺伝子が、以下の[1]〜[5]のいずれかのDNAを有する遺伝子である、上記(2)または(3)に記載の製造法。
[1]配列番号2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするDNA
[2]配列番号2で表されるアミノ酸配列と少なくとも95%以上、好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有し、かつ、SMT活性を有する相同蛋白質をコードするDNA
[3]配列番号1で表される塩基配列を有するDNA
[4]配列番号1で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、SMT活性を有する相同蛋白質をコードするDNA
[5]配列番号1で表される塩基配列と少なくとも95%以上、好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有し、かつ、SMT活性を有する相同蛋白質をコードするDNA
(5)ラビリンチュラ類微生物が、シゾキトリウム属、ヤブレツボカビ属、オーランチオキトリウム属、パリエティキトリウム属、ラビリンチュラ属、アルトルニア属、アプラノキトリウム属、イァポノキトリウム属、ラビリンチュロイデス属、ウルケニア属、オブロンギキトリウム属、ボトリオキトリウム属、又はシクヨイドキトリウム属に属するラビリンチュラ類微生物である、上記(1)〜(4)のいずれか1つに記載の製造法。
(6)上記(1)〜(5)のいずれか1つに記載の製造法によって製造された7DHCに、紫外線を照射することを特徴とする、ビタミンD3の製造法。
本発明の製造法に用いられるラビリンチュラ類微生物は、親株に比べSMT活性が低下または喪失しており、かつ7DHCを生産するラビリンチュラ類微生物である。
親株とは、遺伝子改変、および形質転換等の対象となる元株のことをいう。遺伝子導入による形質転換の対象となる元株は宿主株ともいう。
親株に比べSMT活性が低下または喪失したラビリンチュラ類微生物としては、親株の染色体DNA上に存在するSMT活性を有する蛋白質をコードする遺伝子に、1以上の塩基が欠失、置換または付加されたことにより、親株に比べSMT活性が低下または喪失したラビリンチュラ類微生物、または、該遺伝子から転写されるメッセンジャーRNAと相補的な配列を有し、該メッセンジャーRNAと複合体を形成するRNAをコードするDNAで、親株を形質転換して得られる、親株に比べSMT活性が低下または喪失したラビリンチュラ類微生物、を挙げることができる。
[1]配列番号2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
[2]配列番号2で表されるアミノ酸配列と少なくとも95%以上、好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有し、かつ、SMT活性を有する相同蛋白質
相同蛋白質とは、元となる蛋白質と構造および機能が類似することにより、その蛋白質をコードする遺伝子が進化上の起源を元の蛋白質をコードする遺伝子と同一にすると考えられる蛋白質であって、自然界に存在する生物が有する蛋白質をいう。
[3]上記[1]または[2]の蛋白質をコードするDNA
[4]配列番号1で表される塩基配列を有するDNA
[5]配列番号1で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、SMT活性を有する相同蛋白質をコードするDNA
[6]配列番号1で表される塩基配列と少なくとも95%以上、好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有し、かつ、SMT活性を有する相同蛋白質をコードするDNA
遺伝子とは、蛋白質のコーディング領域に加え、転写調節領域、プロモーター領域、及びターミネーター領域などを含んでもよいDNAである。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なDNAとしては、例えば上記したBLASTおよびFASTA等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計算したときに、配列番号1で表される塩基配列と少なくとも95%以上、好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAをあげることができる。
1以上の塩基の付加としては、コーディング領域の5’末端から150番目以内の塩基、好ましくは100番目以内の塩基、より好ましくは50番目以内の塩基、特に好ましくは30番目以内の塩基、最も好ましくは20番目以内の塩基の直後に、1塩基以上、好ましくは50塩基以上、より好ましくは100塩基以上、さらに好ましくは200塩基以上、特に好ましくは500塩基以上、最も好ましくは1kb以上のDNA断片を付加することをあげることができ、最も好ましくはハイグロマイシン耐性遺伝子などの挿入をあげることができる。
該メッセンジャーRNAと相補的に複合体を形成するRNAをコードするDNAは、該DNAがラビリンチュラ類微生物において転写されるためのプロモーターやターミネーターが付加されていてもよい。
親株に比べSMT活性が低下または喪失していることは、上記[3]〜[6]のいずれかのDNAの転写物量をノーザン解析もしくはRT‐PCRで定量し、親株と比較する、上記[1]または[2]の蛋白質の生産量をSDS−PAGEもしくは抗体を用いたアッセイにより定量し、親株と比較する、または、実施例2に記載の方法に従って、本発明のラビリンチュラ類微生物が生成する副生ステロール量を親株のそれと比較する、などにより確認することができる。
2.本発明の製造法に用いられるラビリンチュラ類微生物の造成法
本発明の製造法に用いられるラビリンチュラ類微生物は、親株の染色体DNA上に存在する、上記[3]〜[6]のいずれかのDNAを有する遺伝子に、1以上の塩基の欠失、置換または付加を導入して、SMT活性を親株に比べ低下または喪失させることにより、造成することができる。
親株は、コレステロールを生産する能力を有しており、かつSMT活性を有するラビリンチュラ類微生物であれば、野生株であってもよいし、野生株がコレステロールを生産する能力を有しない場合は、人工的にコレステロールを生産する能力を付与した育種株であってもよい。
(a)コレステロールの生合成を制御する機構の少なくとも1つを緩和又は解除する方法、
(b)コレステロールの生合成に関与する酵素の少なくとも1つを発現強化する方法、
(c)コレステロールの生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも1つのコピー数を増加させる方法、及び
(d)野生型株に比べ、コレステロールのアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法、
などをあげることができ、上記公知の方法は単独又は組み合わせて用いることができる。
組換えDNA技術等による遺伝子置換法としては、インビトロで遺伝子に1以上の塩基の置換、欠失、または付加を導入した組み換え体DNAを作製し、該組み換え体DNAを親株へ導入し、相同組換え等により染色体上に元来存在していた該遺伝子を置換する方法を挙げることができる。
取得できる具体的なDNAとしては、配列番号1で表わされる塩基配列を有するDNAを挙げることができる。
上記[3]のDNAのうち、上記[2]の相同蛋白質をコードするDNA、並びに上記[5]及び[6]の相同蛋白質をコードするDNAは、例えば、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号1で表される塩基配列と95%以上、好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有する塩基配列を検索し、又は、各種の蛋白質配列データベースに対して配列番号2で表されるアミノ酸配列と95%以上、好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列又はアミノ酸配列に基づいて設計することができるプローブDNA又はプライマーDNA、及び当該DNAを有する微生物を用いて、上記のDNAを取得する方法と同様の方法によって取得することができる。
塩基配列を決定した結果、取得されたDNAが部分長であった場合は、該部分長DNAをプローブに用いた、染色体DNAライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長DNAを取得することができる。
以上の方法で、親株の染色体上の遺伝子置換を行うことができるが、上記の方法に限らず、ラビリンチュラ類微生物の染色体上の遺伝子を置換できる方法であれば他の遺伝子置換法も用いることもできる。
また、本発明の製造法に用いられるラビリンチュラ類微生物は、SMT活性を有する蛋白質をコードする遺伝子から転写されるメッセンジャーRNAと相補的な配列を有し、該メッセンジャーRNAと複合体を形成するRNAをコードするDNAで、親株を形質転換することによっても造成することができる。
SMT活性を有する蛋白質をコードする遺伝子から転写されるメッセンジャーRNAと相補的な配列を有し、当該メッセンジャーRNAと複合体を形成するRNAをラビリンチュラ類微生物の細胞内で生成させるために、例えば、実施例1に記載の方法に従って、ピルビン酸キナーゼプロモーター及びアクチンターミネーターを当該DNAに付加することもできる。
上記の方法により造成したラビリンチュラ類微生物を培地に培養したとき、培養物中に7DHCが生成、蓄積していることは、該培養物から分離したラビリンチュラ類微生物を、例えば、超音波やダイノミルなどによって破砕した後、例えば、クロロホルム、ヘキサン、ブタノール等による溶媒抽出を行い、ガスクロマトグラフィーを用いて該抽出物中に存在する7DHCを検出することにより、確認することができる。
3.本発明の7DHCの製造法
本発明の7DHCの製造法は、上記2の方法で造成されたラビリンチュラ類微生物を培地に培養し、培養物中に7DHCを生成、蓄積させ、該培養物中から7DHCを採取することを特徴とする、7DHCの製造法である。
培地としては、公知のものをいずれも使用できる。例えば、炭素源としてはグルコース、フルクトース、ガラクトースなどの炭水化物の他、オレイン酸、大豆油などの油脂類や、グリセロール、酢酸ナトリウムなどが例示できる。これらの炭素源は、例えば、培地1リットル当たり20〜300gの濃度で使用することができる。特に好ましい態様によれば、培地に最初に含有されていた炭素源がすべて消費された後、炭素源をフィードすることにより引き続き培養を行うことができる。このような条件で培養を行うことにより、消費させる炭素源の量を増大させることが可能になり、7DHCの生産量を増大させることができる。
無機塩としては、リン酸カリウム等を適宜組み合わせて使用できる。
ラビリンチュラ類微生物の培養温度は、7DHCを生産しうる培養温度に制御することが好ましい。一般的には10〜45℃であり、好ましくは20〜37℃である。
培養時のpHは一般的には3.5〜9.5であり、好ましくはpH4.5〜9.5、最も好ましくは5.0〜8.0である。
このようにして、培養物中に7DHCを高濃度に蓄積したラビリンチュラ類微生物が、培地1リットル当たり乾燥菌体重量で、一般的には20〜100g程度と、高い濃度で得ることができる。培養物から培養液とラビリンチュラ類微生物とを分離する方法は、当業者に公知の常法により行なうことができ、例えば、遠心分離法や濾過などにより行なうことができる。
羊毛からコレステロールを抽出するために記載されている方法など、他の方法を使用することもできる。当業者は、特に、米国特許2,688,623号若しくは米国特許2,650,929号又は英国特許GB690879号、GB646227号若しくはGB613778号に記載されている方法を参照することができる。
4.本発明のビタミンD3の製造法
本発明のビタミンD3の製造法は、上記3の製造法によって製造された7DHCに、紫外線を照射することを特徴とする、ビタミンD3の製造法である。
得られたビタミンD3を高速液体クロマトグラフィー法あるいは超臨界クロマトグラフィー法などにより濃縮採取することにより高濃度に精製されたビタミンD3を得ることができる。
[参考例1]
コレステロールを著量蓄積するラビリンチュラ類微生物の探索
7DHCはコレステロールの7位の炭素に二重結合が導入された構造を取っているため、代謝改変により7DHCを著量生産するラビリンチュラ類微生物を造成するためには、コレステロールを著量蓄積するラビリンチュラ類微生物を親株とすることが望ましい。
Aurantiochytrium sp. NBRC103268、Aurantiochytrium sp. NBRC103269、Parietichytrium sarkarianum NBRC104108、Schizochytrium sp. ATCC20888、及びAurantiochytrium limacinum ATCC MYA-1381を評価用液体培地(9% グルコース、1% 酵母エキス、1%ペプトン、50%人工海水)にて30℃、72時間培養した。
[ガスクロマトグラフィーの条件]
カラム:HR-52 (信和化工)0.25mm x 30cm, 0.25mm
キャリアーガス:N2 31ml/min
カラム温度:280℃
検出:FID
ラビリンチュラ類微生物のSMT活性を有する蛋白質をコードするDNAの同定
配列番号1で表される塩基配列を有するDNAが、SMT活性を有する蛋白質をコードすることを、当該DNAが出芽酵母のSMT活性を有する蛋白質をコードする遺伝子(erg6)を相補することにより確認した。詳細を以下に記載する。
当該ゲノムDNAを鋳型として、表2の「プライマーセット」で表わされる塩基配列からなるDNAをプライマーセットとしてPCRを行い、各DNA断片を増幅した。
当該DNA断片及び出芽酵母用発現ベクターpYes2CT(ライフテクノロジージャパン社)をHindIII及びXbaIで処理してライゲーションし、大腸菌DH5αに定法により形質転換した。得られたプラスミドをpYes2CT-SMTと命名した。pYes2CT-SMTをBY4742Δerg6株にエレクトロポレーション法で導入した。なお、コントロールとしてpYes2CTも同時に導入した。得られたコロニーを単離し、50mlのSCG-Ura培地(0.67%Yeast Nitrogen base without amino acids、2% ガラクトース、40 mg/lリジン、20 mg/lヒスチジン)に懸濁し、30℃、220rpmにて、2日間培養した。この際、コントロールとして親株のBY4742にpYes2CTを導入した株も培養した。
以下に本願発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
MYA1381株のSMT活性を以下の方法によって喪失させた。
参考例2で調整したMYA1381のゲノムDNAを鋳型として、表3の「プライマーセット」で表わされる塩基配列からなるDNAをプライマーセットとしてPCRを行い、各DNA断片を増幅した。
上記において増幅した3種類のDNA断片を混合して鋳型として用い、配列番号11及び14で表わされる塩基配列からなるDNAをプライマーセットとしてPCRを行った。配列番号12と15、及び 配列番号16と13は、それぞれ5'末端に相補的な配列を有しているため、当該PCRにより、3種類のDNA断片を結合することができる。すなわち、当該PCRにより、MYA1381由来のピルビン酸キナーゼプロモーター及びアクチンターミネーターを有するハイグロマイシン耐性遺伝子の発現カセット断片を調整した。
当該プラスミドをBamHIで処理し、上記で得られたハイグロマイシン耐性遺伝子の発現カセット断片をBamHIで処理してライゲーションし、配列番号1で表わされる塩基配列からなるDNAの上流及び下流領域にハイグロマイシン耐性遺伝子の発現カセットが挿入されたプラスミドを得た。当該プラスミドを、pUCSMT-hygと命名した。
当該DNA断片をエレクトロポレーション法によりMYA1381に導入し、ハイグロマイシン耐性株を取得し、MYA1381ΔSMTと命名した。
MYA1381(親株)及びMYA1381ΔSMTを、液体培地(0.4% グルコース、0.02% 酵母エキス、0.05% グルタミン酸ナトリウム、50% 人工海水(DAIGO))を用いて、参考例1と同様に培養した。
培養後、培養液からBligh & Dyer法(Bligh EG and Dyer WJ, Can.J.Biochem.Physiol. 37 911 (1959))を用いて脂質を抽出し、減圧下で乾燥させた。乾燥させた脂質をさらに、0.1N KOH-Methanolに溶解させ、60℃で30分処理することにより、けん化処理を行った。この処理によって得られたフリーのステロールを抽出するため、等量の水を加え、さらに2倍量のヘキサンで3回抽出した。抽出したヘキサン画分を減圧下で濃縮し、ガスクロマトグラフィーにより分析し、培養液中のステロール量と組成を調べた。定量処理のため、5αコレスタン(シグマ社製)を抽出の初期に加え、内部標準とした。また、コレステロールの同定のために、コレステロール (東京化成製)を外部標準として用いた。ガスクロマトグラフの条件は、参考例1と同じである。
副生ステロールの消失は、精製工程において当該副生ステロールを除去する必要がなくなるなど、7DHCの製造にとって有利に働くと考えられる。
実施例2で製造した7DHCに300nmのUVを照射し、100℃で30分間処理する。当該処理後、参考例に記載の方法にしたがって、ガスクロマトグラフィーで分析する。
配列番号4−人工配列の説明:合成DNA
配列番号5−人工配列の説明:合成DNA
配列番号6−人工配列の説明:合成DNA
配列番号7−人工配列の説明:合成DNA
配列番号8−人工配列の説明:合成DNA
配列番号9−人工配列の説明:合成DNA
配列番号10−人工配列の説明:合成DNA
配列番号11−人工配列の説明:合成DNA
配列番号12−人工配列の説明:合成DNA
配列番号13−人工配列の説明:合成DNA
配列番号14−人工配列の説明:合成DNA
配列番号15−人工配列の説明:合成DNA
配列番号16−人工配列の説明:合成DNA
配列番号17−人工配列の説明:合成DNA
配列番号18−人工配列の説明:合成DNA
配列番号19−人工配列の説明:合成DNA
配列番号20−人工配列の説明:合成DNA
Claims (6)
- 親株に比べステロール24−C−メチル基転移活性(以下、SMT活性という。)が低下または喪失しており、かつ7デヒドロコレステロール(以下、7DHCという。)を生産するラビリンチュラ類微生物を培地に培養し、培養物中に7DHCを生成、蓄積させ、該培養物中から7DHCを採取することを特徴とする、7DHCの製造法。
- 親株に比べSMT活性が低下または喪失したラビリンチュラ類微生物が、親株の染色体DNA上に存在するSMT活性を有する蛋白質をコードする遺伝子に、1以上の塩基が欠失、置換または付加されたことにより、親株に比べSMT活性が低下または喪失したラビリンチュラ類微生物である、請求項1に記載の製造法。
- 親株に比べSMT活性が低下または喪失したラビリンチュラ類微生物が、親株の染色体DNA上に存在するSMT活性を有する蛋白質をコードする遺伝子から転写されるメッセンジャーRNAと相補的な配列を有し、該メッセンジャーRNAと複合体を形成するRNAをコードするDNAで、親株を形質転換して得られる、親株に比べSMT活性が低下または喪失したラビリンチュラ類微生物である、請求項1に記載の製造法。
- SMT活性を有する蛋白質をコードする遺伝子が、以下の[1]〜[5]のいずれかのDNAを有する遺伝子である、請求項2または3に記載の製造法。
[1]配列番号2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするDNA
[2]配列番号2で表されるアミノ酸配列と少なくとも95%以上の同一性を有し、かつ、SMT活性を有する相同蛋白質をコードするDNA
[3]配列番号1で表される塩基配列を有するDNA
[4]配列番号1で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、SMT活性を有する相同蛋白質をコードするDNA
[5]配列番号1で表される塩基配列と少なくとも95%以上の同一性を有し、かつ、SMT活性を有する相同蛋白質をコードするDNA - ラビリンチュラ類微生物が、シゾキトリウム属、ヤブレツボカビ属、オーランチオキトリウム属、パリエティキトリウム属、ラビリンチュラ属、アルトルニア属、アプラノキトリウム属、イァポノキトリウム属、ラビリンチュロイデス属、ウルケニア属、オブロンギキトリウム属、ボトリオキトリウム属、又はシクヨイドキトリウム属に属するラビリンチュラ類微生物である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の製造法。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の製造法によって製造された7DHCに、紫外線を照射することを特徴とする、ビタミンD3の製造法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2014207009 | 2014-10-08 | ||
JP2014207009 | 2014-10-08 | ||
PCT/JP2015/078560 WO2016056610A1 (ja) | 2014-10-08 | 2015-10-08 | 7デヒドロコレステロール及びビタミンd3の製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2016056610A1 true JPWO2016056610A1 (ja) | 2017-07-27 |
JP6633535B2 JP6633535B2 (ja) | 2020-01-22 |
Family
ID=55653216
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016553147A Active JP6633535B2 (ja) | 2014-10-08 | 2015-10-08 | 7デヒドロコレステロール及びビタミンd3の製造法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10329250B2 (ja) |
EP (1) | EP3205728B1 (ja) |
JP (1) | JP6633535B2 (ja) |
ES (1) | ES2772650T3 (ja) |
WO (1) | WO2016056610A1 (ja) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP7205480B2 (ja) * | 2017-10-19 | 2023-01-17 | 味の素株式会社 | ステロールの製造法 |
EA202092781A1 (ru) * | 2018-05-22 | 2021-02-12 | ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. | Оптимизация с-5-десатурации стеролов |
JP7151279B2 (ja) * | 2018-08-29 | 2022-10-12 | 味の素株式会社 | ステロールの製造法 |
CN114213302A (zh) * | 2021-12-29 | 2022-03-22 | 南通励成生物工程有限公司 | 一种在水溶液中转化7-脱氢胆固醇制备维生素d3的方法 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IN188477B (ja) | 1998-06-23 | 2002-09-28 | Hoffmann La Roche | |
DE10203352A1 (de) | 2002-01-29 | 2003-07-31 | Basf Ag | Verfahren zur Herstellung von 7-Dehydrocholesterol und/oder dessen biosynthetischen Zwischen- und/oder Folgeprodukten in transgenen Organismen |
JP2004141125A (ja) * | 2002-08-28 | 2004-05-20 | Mitsubishi Chemicals Corp | 代謝工学的に改変されている真菌類およびそれを用いるステロール類の製造法 |
FR2869914B1 (fr) * | 2004-05-06 | 2012-11-09 | Aventis Pharma Sa | Souches de levure produisant du cholesterol et leurs applications |
US8367395B2 (en) | 2006-09-28 | 2013-02-05 | Dsm Ip Assets B.V. | Production of sterols in oleaginous yeast and fungi |
JP5889200B2 (ja) * | 2009-12-03 | 2016-03-22 | ディーエスエム アイピー アセッツ ビー.ブイ. | 酵母による非酵母ステロールの生成 |
WO2015108058A1 (ja) * | 2014-01-17 | 2015-07-23 | 協和発酵バイオ株式会社 | 7デヒドロコレステロール及びビタミンd3の製造法 |
-
2015
- 2015-10-08 WO PCT/JP2015/078560 patent/WO2016056610A1/ja active Application Filing
- 2015-10-08 JP JP2016553147A patent/JP6633535B2/ja active Active
- 2015-10-08 EP EP15848702.5A patent/EP3205728B1/en active Active
- 2015-10-08 ES ES15848702T patent/ES2772650T3/es active Active
- 2015-10-08 US US15/515,142 patent/US10329250B2/en active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20170204056A1 (en) | 2017-07-20 |
WO2016056610A1 (ja) | 2016-04-14 |
EP3205728A4 (en) | 2018-04-25 |
US10329250B2 (en) | 2019-06-25 |
ES2772650T3 (es) | 2020-07-08 |
JP6633535B2 (ja) | 2020-01-22 |
EP3205728B1 (en) | 2019-11-27 |
EP3205728A1 (en) | 2017-08-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP2468860B1 (en) | Transformant and process for production thereof, and process for production of lactic acid | |
EP2576605B1 (en) | Production of metabolites | |
CN107075551B (zh) | 7-脱氢胆固醇和维生素d3的制造法 | |
JP2015505471A (ja) | 組換え微生物およびその使用方法 | |
JP6633535B2 (ja) | 7デヒドロコレステロール及びビタミンd3の製造法 | |
CN110678541A (zh) | 用于产生感兴趣的分子的经遗传优化的微生物 | |
JP5867586B2 (ja) | 炭化水素合成酵素遺伝子及びその利用 | |
EP3191577B1 (en) | Methods for efficient production of polyunsaturated fatty acids (pufa) in rhodosporidium and rhodotorula species | |
CN110691850A (zh) | 生产折叶苔醇和/或补身醇的方法 | |
US11814663B2 (en) | Microorganisms with improved 1,3-propanediol and butyric acid production | |
JP5649119B2 (ja) | シロ−イノシトール産生細胞および当該細胞を用いたシロ−イノシトール製造方法 | |
CN113265417A (zh) | 有机酸产量提高的菌株及其构建方法和应用 | |
CN109477120B (zh) | 香根草 | |
KR20160111947A (ko) | 재조합 미생물의 생산 방법 | |
JP2010136627A (ja) | 酵母にガラクトースを利用させる方法 | |
JP7443657B2 (ja) | C-5ステロール不飽和化の最適化 | |
JP6392534B2 (ja) | ロイシン酸生産活性を有するタンパク質及びその利用 | |
JP2018510647A (ja) | 芳香性化合物の製造 | |
EP1885848B1 (en) | Microbial conversion of sugar acids and means useful therein | |
JP6723002B2 (ja) | 油脂の製造方法 | |
JP5737650B2 (ja) | アセトイン産生細胞および当該細胞を用いたアセトインの製造方法 | |
JP2011120508A (ja) | コハク酸を製造する方法 | |
JP2002300896A (ja) | プレニルアルコールの製造方法 | |
CN109689871B (zh) | 突变丝状菌和使用其制造c4二羧酸的方法 | |
JP2009254264A (ja) | Issatchenkiaorientalisに属する菌の形質転換系 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20180706 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20190611 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190626 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20191126 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20191212 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6633535 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |