CN105980552A - 多种蛋白酶缺陷的丝状真菌细胞及其使用方法 - Google Patents

多种蛋白酶缺陷的丝状真菌细胞及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本公开涉及用于在丝状真菌细胞中生产异源蛋白的组合物和方法。

Description

多种蛋白酶缺陷的丝状真菌细胞及其使用方法
技术领域
本公开涉及用于在丝状真菌细胞中生产异源蛋白的组合物和方法。
背景技术
真核蛋白，尤其是治疗性蛋白(例如免疫球蛋白)的翻译后修饰通常是正确的蛋白折叠和功能必需的。因为标准的原核表达系统缺乏这种修饰所需的合适机构，在生产这些治疗性蛋白时必须使用替代的表达系统。即使在真核蛋白不具有翻译后修饰的情况下，原核表达系统通常缺乏正确折叠所需的必要伴侣蛋白。酵母和真菌是用于表达蛋白的具有吸引力的选择，因为它们容易在简单培养基中大规模生长，这允许低生产成本，并且酵母和真菌具有翻译后修饰机构和如在哺乳动物细胞中发现的执行类似功能的伴侣蛋白。此外，可用工具来操作相对简单的酵母和真菌细胞的遗传组成，以及较复杂的真核细胞例如哺乳动物细胞或昆虫细胞(De Pourcq等,Appl Microbiol Biotechnol,87(5):1617-31)。尽管具有这些优势，很多治疗性蛋白仍然在哺乳动物细胞中产生，所述哺乳动物细胞产生的治疗性蛋白具有与天然人蛋白最相似的翻译后修饰，而由酵母和真菌天然产生的翻译后修饰则通常与在哺乳动物细胞中发现的不同。
为了解决这种缺陷，正在开发产生的翻译后修饰与在天然人蛋白中发现的那些更加接近的酵母和真菌的新菌株。因此，对使用酵母和真菌细胞来表达更复杂的蛋白质重新燃起兴趣。然而，由于工业上长时期地关注哺乳动物细胞培养技术，真菌细胞表达系统例如木霉(Trichoderma)并不如哺乳动物细胞培养建立得好，因此当表达哺乳动物蛋白时产生很多缺点。
因此，本领域仍然需要能够稳定地，优选以高表达水平生产异源蛋白，例如免疫球蛋白的改良丝状真菌细胞，例如木霉真菌细胞。
发明简述
本文所述的是包括丝状真菌细胞，例如木霉真菌细胞的组合物，所述丝状真菌细胞具有活性降低或不可检测的至少三种蛋白酶，并且具有编码以增加水平表达的异源多肽的重组多核苷酸。本文进一步描述了改进异源多肽稳定性的方法和制备其中蛋白酶活性确实降低的异源多肽的方法。本文进一步描述了包括丝状真菌细胞，例如木霉真菌细胞的组合物，所述丝状真菌细胞具有活性降低或不可检测的一种或多种以下蛋白酶：pep9、amp1、amp2和sep1。
因此，一方面包括丝状真菌细胞，其包含蛋白酶活性降低或没有的至少一种内源蛋白酶和编码异源多肽的重组多核苷酸，其中所述细胞具有蛋白酶活性降低或没有的一种或多种以下蛋白酶：pep9、amp1、amp2和sep1。在一个具体的实施方案中，多肽的生产水平比蛋白酶活性没有降低的相应丝状真菌细胞中产生的相同多肽的生产水平至少高两倍。
在可以与之前的实施方案组合的另一个方面，它包括活性降低或不可检测的至少三种蛋白酶的丝状真菌细胞，其中所述细胞进一步包含编码异源多肽的重组多核苷酸，所述异源多肽的生产水平比蛋白酶活性没有降低的相应亲本丝状真菌细胞中多肽的生产水平至少高两倍。在某些实施方案中，当细胞是曲霉(Aspergillus)细胞时，其总蛋白酶活性降低至蛋白酶活性没有降低的相应亲本曲霉细胞的总蛋白酶活性的50％或更少。
在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，丝状真菌细胞的总蛋白酶活性降低至蛋白酶活性没有降低的相应亲本丝状真菌细胞的总蛋白酶活性的49％或更少、40％或更少、31％或更少、6％或更少。
在某些实施方案中，至少三种蛋白酶的表达水平降低或消除。在某些实施方案中，编码所述三种蛋白酶的基因各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，三个蛋白酶编码基因是pep1、tsp1和slp1。在其他实施方案中，三个蛋白酶编码基因是gap1、slp1和pep1。
在某些实施方案中，真菌细胞具有活性降低或不可检测的四种内源蛋白酶；编码所述四种蛋白酶的基因各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，四个蛋白酶编码基因是pep1、tsp1、slp1和gap1。
在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，三个或四个蛋白酶编码基因选自pep1、pep2、pep3、pep4、pep5、pep8、pep11,pep12、tsp1、slp1、slp2、slp3、slp7、gap1和gap2。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，三个或四个蛋白酶编码基因选自pep1、pep3、pep4、tsp1、slp1、slp2、gap1和gap2。在某些实施方案中，三个或四个蛋白酶编码基因选自pep1、pep2、pep3、pep4、pep5、gap1、gap2、slp1、slp2和tsp1。
在其他实施方案中，真菌细胞具有活性降低或不可检测的五种内源蛋白酶；编码所述五种蛋白酶的基因各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，五个蛋白酶编码基因是pep1、tsp1、slp1、gap1和pep4。在其他实施方案中，五个蛋白酶编码基因是pep1、tsp1、slp1、gap1和gap2。
在某些实施方案中，真菌细胞具有活性降低或不可检测的六种内源蛋白酶；编码所述六种蛋白酶的基因各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变。在某些实施方案中，细胞具有六个蛋白酶编码基因，其各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，并且六个蛋白酶编码基因是pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2和pep4。
在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，真菌细胞具有活性降低或不可检测的3-6种蛋白酶，所述3-6种蛋白酶各自选自pep1、pep2、pep3、pep4、pep5、tsp1、slp1、slp2、slp3、gap1和gap2。
在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，细胞具有七个蛋白酶编码基因，其各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，并且七个蛋白酶编码基因是pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4和pep3。
在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，细胞具有八个蛋白酶编码基因，其各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，并且八个蛋白酶编码基因是pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3和pep5。
在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，真菌细胞具有活性降低的其他蛋白酶，编码所述其他蛋白酶的基因包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，并且所述其他蛋白酶选自pep7、pep8、pep11,pep12、tpp1、gap2、slp3、slp5、slp6、slp7和slp8。
在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，细胞具有八个蛋白酶编码基因，其各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，并且八个蛋白酶编码基因是：
a)pep1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、amp1，
b)pep1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、amp2，
c)pep1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、sep1，
d)pep1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep9，或
e)pep1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2。
任选地，在可以与之前的实施方案组合的一个具体实施方案中，细胞进一步包含降低或消除tsp1蛋白酶活性的突变。
在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，细胞具有九个蛋白酶编码基因，其各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，并且九个蛋白酶编码基因是pep1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2和sep1。任选地，在可以与之前的实施方案组合的一个具体实施方案中，细胞进一步包含降低或消除tsp1蛋白酶活性的突变。
在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，细胞具有十个蛋白酶编码基因，其各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，并且十个蛋白酶编码基因是pep1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1和slp8。任选地，在可以与之前的实施方案组合的一个具体实施方案中，细胞进一步包含降低或消除tsp1蛋白酶活性的突变。
在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，细胞具有11个蛋白酶编码基因，其各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，并且11个蛋白酶编码基因是pep1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8和amp2。任选地，在可以与之前的实施方案组合的一个具体实施方案中，细胞进一步包含降低或消除tsp1蛋白酶活性的突变。
在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，细胞具有12个蛋白酶编码基因，其各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，并且12个蛋白酶编码基因是pep1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2和slp7。
在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，细胞具有至少13种蛋白酶活性降低或没有的蛋白酶，编码所述13种蛋白酶的基因各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，并且13种蛋白酶是
-pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、pep9；
-pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、slp7；
-pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、slp3。
在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，细胞具有至少14种蛋白酶活性降低或没有的蛋白酶，编码所述14种蛋白酶的基因各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，并且14种蛋白酶是pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、pep9、slp2；
在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，细胞具有至少15种蛋白酶活性降低或没有的蛋白酶，编码所述15种蛋白酶的基因各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，并且15种蛋白酶是
-pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、pep9、slp2、mp1；或
-pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、pep9、slp2、mp5。
在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，细胞具有至少16种、至少17种、至少18中、至少19种、或至少20种或更多种蛋白酶活性降低或没有的蛋白酶，并且所述细胞包含至少一个降低或消除选自以下的相应蛋白酶活性的突变：
-天冬氨酸蛋白酶pep6、pep10、pep13、pep14或pep16；
-slp样蛋白酶slp57433、slp35276、slp60791或slp109276；
-gap样蛋白酶gap3或gap4；
-sedolisin样蛋白酶sed2、sed3或sed5；
-选自蛋白酶65735、蛋白酶77577、蛋白酶81087、蛋白酶56920、蛋白酶122083、蛋白酶79485、蛋白酶120998或蛋白酶61127的A组蛋白酶；
-选自蛋白酶21659、蛋白酶58387、蛋白酶75159、蛋白酶56853、或蛋白酶64193的B组蛋白酶；
-选自蛋白酶82452、蛋白酶80762、蛋白酶21668、蛋白酶81115、蛋白酶812141、或蛋白酶23475的C组蛋白酶；
-选自蛋白酶121890、蛋白酶22718、蛋白酶47127、蛋白酶61912、蛋白酶80843、蛋白酶66608、蛋白酶72612或蛋白酶40199的D组蛋白酶；或
-选自蛋白酶22210、蛋白酶111694、蛋白酶82577的E组蛋白酶。
在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，异源多肽是哺乳动物多肽。在某些实施方案中，哺乳动物多肽是糖基化的。
在某些实施方案中，哺乳动物多肽选自免疫球蛋白、抗体及其抗原结合片段、生长因子、干扰素、细胞因子和白细胞介素。在某些实施方案中，哺乳动物多肽是免疫球蛋白或抗体，或其Fc片段。在某些实施方案中，哺乳动物多肽选自胰岛素样生长因子1(IGF1)、人生长激素(hGH)和干扰素α2b(IFNα2b)。
在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，异源多肽是非哺乳动物多肽。在某些实施方案中，非哺乳动物多肽是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、葡聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、谷氨酰胺转胺酶或木聚糖酶。
在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，真菌细胞进一步包含活性降低或不可检测的甘露糖基转移酶ALG3。在某些实施方案中，编码ALG3的基因包含降低或消除相应活性的突变。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，真菌细胞进一步包含编码α-1,2-甘露糖苷酶的多核苷酸。
在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，真菌细胞包含使活性需要降低的蛋白酶表达降低的突变。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，突变是编码蛋白酶的基因内的缺失。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，突变是编码蛋白酶催化结构域的基因部分的缺失。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，真菌细胞在编码蛋白酶催化结构域的基因部分具有点突变。
在其他实施方案中，一种或多种蛋白酶的蛋白酶活性降低或消除由对以下具有特异性的RNAi构建体造成：i)一种蛋白酶或ii)选自pep型蛋白酶、胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶、gap型蛋白酶、sedolisin蛋白酶和slp型蛋白酶的两种或多种蛋白酶。在某些实施方案中，RNAi构建体对slp2、slp3、slp5和/或slp6具有特异性。
在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，真菌细胞进一步包含N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域和N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域。在某些实施方案中，N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域和N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域由多核苷酸编码。在某些实施方案中，N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域由第一多核苷酸编码，和N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域由第二多核苷酸编码。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，真菌细胞进一步包含编码甘露糖苷酶II和/或半乳糖基转移酶的多核苷酸。在某些实施方案中，真菌细胞包含选自以下的酶：α-1,2-甘露糖苷酶、N-乙酰葡糖胺基转移酶I、N-乙酰葡糖胺基转移酶II、甘露糖苷酶II和/或半乳糖基转移酶，所述酶进一步包含靶向肽，例如用于正确定位相应酶的异源靶向肽。在某些实施方案中，靶向肽选自SEQ ID NO：589-594。
在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，真菌细胞是木霉真菌细胞、毁丝霉(Myceliophthora)真菌细胞、曲霉(Aspergillus)真菌细胞、链孢霉(Neurospora)真菌细胞、镰刀菌(Fusarium)或青霉(Penicillium)真菌细胞，或金孢霉(Chrysosporium)真菌细胞。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，真菌细胞里氏木霉(Trichodermareesei)。
在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，真菌细胞对于pep4蛋白酶是野生型。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，真菌细胞对于tsp1蛋白酶是野生型。
另一个方面包括通过以下改进异源多肽稳定性的方法：a)提供任何之前的实施方案的丝状真菌细胞；和b)培养所述细胞以表达异源多肽，其中所述异源多肽与其中蛋白酶活性没有降低(例如，不包含编码蛋白酶的基因的突变)的相应亲本丝状真菌细胞中产生的异源多肽相比稳定性增加。另一个方面包括通过以下制备异源多肽的方法：a)提供任何之前的实施方案的丝状真菌细胞；b)培养所述宿主细胞以表达异源多肽；和c)纯化异源多肽。
在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，丝状真菌细胞进一步包含载体蛋白。在某些实施方案中，载体蛋白是CBH1。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，在包含蛋白酶抑制剂的培养基中培养。在某些实施方案中，在具有一种或两种选自SBTI和糜蛋白酶抑制剂的蛋白酶抑制剂的培养基中培养。在某些实施方案中，蛋白酶活性根据本发明进一步用共表达或共培养例如SBTI或BBI(例如，如WO2005047302所描述)、或slp抑制剂，如WO2009071530所描述的pepc抑制剂来降低或消除。
在某些实施方案中，根据所述方法产生的异源多肽是糖基化的哺乳动物多肽，优选抗体或其Fc糖基化片段，并且多肽的总N-聚糖的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％(摩尔％)由Man3GlcNAc2N-聚糖或Man5GlcNAc2N-聚糖组成。在其他实施方案中，根据所述方法产生的异源多肽是糖基化的哺乳动物多肽，优选抗体或其Fc糖基化片段，并且多肽的总N-聚糖的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％(摩尔％)由复合型N-聚糖，例如G0、G1或G2糖型或其岩藻糖基化形式FG0、FG1和FG2组成。在某些实施方案中，根据所述方法产生的异源多肽是糖基化的哺乳动物多肽，优选抗体或其Fc糖基化片段，并且多肽的总N-聚糖的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％(摩尔％)由杂合型N-聚糖组成。在某些实施方案中，根据所述方法产生的异源多肽是糖基化的哺乳动物多肽，优选抗体或其Fc糖基化片段，并且多肽的总N-聚糖的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％(摩尔％)由G1或G2N-聚糖组成。另一个方面包括通过如上所述的方法可获得的异源多肽，优选抗体或其Fc糖基化片段。
另一个方面包括木霉真菌细胞或密切相关的属，包括毁丝霉真菌细胞、曲霉真菌细胞、链孢霉真菌细胞、青霉真菌细胞、镰刀菌真菌细胞或金孢霉真菌细胞，所述真菌细胞具有活性降低或不可检测的选自pep1、pep2、pep3、pep4、pep5、tsp1、slp1、slp2、gap1和gap2的至少三种蛋白酶，其中所述细胞进一步包含编码哺乳动物多肽的重组多核苷酸，所述哺乳动物多肽以比相应亲本真菌细胞中多肽的生产水平高至少2倍的水平产生。
在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，木霉细胞或密切相关的属的真菌细胞进一步包含活性降低或不可检测的一种或多种选自以下的蛋白酶：pep9、amp1、amp2和sep1。
在某些实施方案中，至少三种蛋白酶的表达水平在木霉或密切相关的属的真菌细胞中降低或消除。在某些实施方案中，编码至少三种蛋白酶的基因各自包含在木霉或密切相关的属的细胞中降低或消除相应蛋白酶活性的突变。在某些实施方案中，木霉或密切相关的属的真菌细胞包括三个蛋白酶编码基因，所述基因具有降低或消除蛋白酶活性的突变，其选自gap1、slp1和pep1。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，木霉或密切相关的属的真菌细胞中的哺乳动物多肽是抗体或其抗原结合片段、或免疫球蛋白，且至少三种蛋白酶选自pep1、pep3、pep4、tsp1、slp1、slp2、gap1和gap2。在某些实施方案中，木霉或密切相关的属的真菌细胞包含四个蛋白酶编码基因，其各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，具有这种突变的四个蛋白酶编码基因是pep1、tsp1、slp1和gap1。在某些实施方案中，木霉或密切相关的属的真菌细胞包含五个蛋白酶编码基因，其各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，具有这种突变的五个蛋白酶编码基因是pep1、tsp1、slp1、gap1和pep4。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，木霉真菌细胞中的哺乳动物多肽是生长因子、干扰素、细胞因子或白细胞介素，活性降低的三种蛋白酶选自pep1、pep2、pep3、pep4、pep5、pep8、pep11,pep12、gap1、gap2、slp1、slp2、slp7和任选的tsp1。在某些实施方案中，木霉或密切相关的属的真菌细胞包含五个蛋白酶编码基因，其各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，具有这种突变的五个蛋白酶编码基因是pep1、tsp1、slp1、gap1和gap2。在某些实施方案中，木霉或密切相关的属的真菌细胞包含六个蛋白酶编码基因，其各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，具有这种突变的六个蛋白酶编码基因是pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2和pep4。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，木霉或密切相关的属的真菌细胞包含七个蛋白酶编码基因，其各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，具有这种突变的七个蛋白酶编码基因是pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4和pep3。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，木霉或密切相关的属的真菌细胞包含八个蛋白酶编码基因，其各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，具有这种突变的八个蛋白酶编码基因是pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3和pep5。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，木霉或密切相关的属的真菌细胞包含八个蛋白酶编码基因，其各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，具有这种突变的八个蛋白酶编码基因选自
(i)pep1、slp1、gap1、gap2、pep3、pep4、pep5、amp1，
(ii)pep1、slp1、gap1、gap2、pep3、pep4、pep5、amp2，
(iii)pep1、slp1、gap1、gap2、pep3、pep4、pep5、sep1，
(iv)pep1、slp1、gap1、gap2、pep3、pep4、pep5、pep9，或
(v)pep1、slp1、gap1、gap2、pep3、pep4、pep5、pep2。
在这种实施方案中，细胞可以进一步包含降低或消除tsp1蛋白酶活性的其他突变。
在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，木霉或密切相关的属的真菌细胞包含九个蛋白酶编码基因，其各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，具有这种突变的九个蛋白酶编码基因是pep1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1。在这种实施方案中，细胞可以进一步包含降低或消除tsp1蛋白酶活性的其他突变。
在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，木霉或密切相关的属的真菌细胞包含十个蛋白酶编码基因，其各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，具有这种突变的十个蛋白酶编码基因是pep1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8。在这种实施方案中，细胞可以进一步包含降低或消除tsp1蛋白酶活性的其他突变。
在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，木霉或密切相关的属的真菌细胞包含11个蛋白酶编码基因，其各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，具有这种突变的11个蛋白酶编码基因是pep1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2。在这种实施方案中，细胞可以进一步包含降低或消除tsp1蛋白酶活性的其他突变。
在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，木霉或密切相关的属的真菌细胞包含12个蛋白酶编码基因，其各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，具有这种突变的12个蛋白酶编码基因是pep1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、slp7。
在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，木霉或密切相关的属的真菌细胞具有至少13种蛋白酶活性降低或没有的蛋白酶，编码所述13种蛋白酶的基因各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，且所述13种蛋白酶是
-pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、pep9；
-pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、slp7；
-pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、slp3。
在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，木霉或密切相关的属的真菌细胞具有至少14种蛋白酶活性降低或没有的蛋白酶，编码所述14种蛋白酶的基因各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，且所述14种蛋白酶是pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、pep9、slp2；
在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，木霉或密切相关的属的真菌细胞具有至少15种蛋白酶活性降低或没有的蛋白酶，编码所述15种蛋白酶的基因各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，并且15种蛋白酶是
-pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、pep9、slp2、mp1；或
-pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、pep9、slp2、mp5。
在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，木霉或密切相关的属的真菌细胞进一步包含活性降低或不可检测的一种或多种其他蛋白酶。在某些实施方案中，木霉或密切相关的属的真菌细胞中一种或多种其他蛋白酶的表达水平降低或消除。在某些实施方案中，编码木霉或密切相关的属的真菌细胞中一种或多种其他蛋白酶的基因具有降低或消除相应蛋白酶活性的突变。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，编码一种或多种其他蛋白酶的基因选自pep7、pep8、pep11、pep12、tpp1、gap2、slp3、slp5、slp6、slp7和slp8。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，一种或多种其他蛋白酶编码基因选自
-天冬氨酸蛋白酶pep6、pep10、pep13、pep14或pep16；
-slp样蛋白酶slp57433、slp35276、slp60791或slp109276；
-gap样蛋白酶gap3或gap4；
-sedolisin样蛋白酶sed2、sed3或sed5；
-选自蛋白酶65735、蛋白酶77577、蛋白酶81087、蛋白酶56920、蛋白酶122083、蛋白酶79485、蛋白酶120998或蛋白酶61127的A组蛋白酶；
-选自蛋白酶21659、蛋白酶58387、蛋白酶75159、蛋白酶56853、或蛋白酶64193的B组蛋白酶；
-选自蛋白酶82452、蛋白酶80762、蛋白酶21668、蛋白酶81115、蛋白酶812141、或蛋白酶23475的C组蛋白酶；
-选自蛋白酶121890、蛋白酶22718、蛋白酶47127、蛋白酶61912、蛋白酶80843、蛋白酶66608、蛋白酶72612或蛋白酶40199的D组蛋白酶；或
-选自蛋白酶22210、蛋白酶111694、蛋白酶82577的E组蛋白酶。
在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，木霉或密切相关的属的真菌细胞进一步包含活性降低或不可检测的ALG3。在某些实施方案中，编码木霉或密切相关的属的真菌细胞中ALG3的基因包含降低或消除相应活性的突变。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，木霉或密切相关的属的真菌细胞进一步包含编码α-1,2-甘露糖苷酶的多核苷酸。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，突变降低或消除木霉或密切相关的属的真菌细胞中的基因的表达。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，突变是木霉或密切相关的属的真菌细胞中的基因缺失。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，突变是木霉或密切相关的属的真菌细胞中编码蛋白酶的催化结构域的基因部分的缺失。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，突变是木霉或密切相关的属的真菌细胞中编码蛋白酶的催化结构域的基因部分的点突变。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，木霉或密切相关的属的真菌细胞进一步包含N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域和N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域。在某些实施方案中，N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域和N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域由木霉或密切相关的属的真菌细胞的多核苷酸编码。在某些实施方案中，N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域由第一多核苷酸编码，和N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域由木霉或密切相关的属的真菌细胞的第二多核苷酸编码。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，木霉真菌细胞进一步包含编码甘露糖苷酶II的多核苷酸。在某些实施方案中，蛋白酶各自与选自SEQ ID NO：1、17、37、58、66、82、98、118、129、166和182的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性。在某些实施方案中，木霉真菌细胞的总蛋白酶活性降低至蛋白酶活性没有降低的相应的木霉亲本细胞的总蛋白酶活性的49％或更少、40％或更少、31％或更少、6％或更少。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，所述细胞进一步包含编码哺乳动物多肽的重组多核苷酸，所述哺乳动物多肽以比相应的亲本木霉真菌细胞中多肽的生产水平高至少2倍的水平产生。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，哺乳动物多肽以相应的亲本木霉真菌细胞中全长形式多肽的生产水平更高的水平，以全长形式产生。
另一个方面包括通过以下改进异源多肽稳定性的方法：a)提供任何之前的实施方案的木霉真菌细胞；和b)培养所述细胞以表达异源多肽，其中所述异源多肽与不包含编码蛋白酶的基因突变的宿主细胞相比稳定性增加。另一个方面包括通过以下制备异源多肽，例如免疫球蛋白或抗体或其糖基化的Fc片段的方法：a)提供任何之前的实施方案的木霉或密切相关的属的真菌细胞；b)培养所述宿主细胞以表达异源多肽；和c)纯化异源多肽。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，丝状真菌细胞进一步包含载体蛋白。在某些实施方案中，载体蛋白是CBH1。
附图说明
图1是描述显示制备10倍蛋白酶缺失菌株M633(48-70C；M659是重新纯化的M633)的Southern印迹分析。图A描绘期望的sep1ORF信号：来自M124(Δ0)和M574(Δ9)的7.5kb，没有来自转化体的信号。图B描绘期望的sep1 5’侧翼信号：来自M124的7.5kb，来自转化体的3.1kb，来自pTTv225的3.9kb。图C描绘期望的sep1 3’侧翼信号：来自M124的7.5kb，来自转化体的3.9kb，来自pTTv225的3.9kb。
图2是描述显示制备11倍蛋白酶缺失菌株M750(54-131-2)的Southern印迹分析。图A描绘期望的slp8ORF信号：来自M124(Δ0)和M659(Δ10)的5.6kb，没有来自转化体的信号。在所有样品中看见的微弱信号模式是非特异性背景。图B描绘期望的slp8 5’侧翼信号：来自M659的5.6kb，来自转化体的2.9kb，来自pTTv330的6.7kb。图C描绘期望的slp8 3’侧翼信号：来自M659的5.6kb，来自转化体的4.2kb，来自pTTv330的6.7kb。菌株M751(54-159-1)用两个探针显示多个信号，表明数个缺失盒被整合入基因组，以及还推测有基因组重排。
图3是描述显示制备12倍蛋白酶缺失菌株M893(59-6A)的Southern印迹分析。图A描绘期望的amp2ORF信号：来自M124(Δ0)和M750(Δ11)的5.5kb，没有来自转化体的信号。图B描绘期望的amp2 5’侧翼信号：来自M124和M750的5.5kb，来自转化体的3.6kb，来自pTTv327的6.6kb。在所有样品中看见的约7kb的信号是非特异性背景。图C描绘期望的amp23’侧翼信号：来自M124和M750的5.5kb，来自转化体的4.5kb，来自pTTv327的6.6kb。
图4描述9倍蛋白酶缺失菌株的24孔培养。在不含硫酸铵但含有柠檬酸二铵、100mMPIPPS、20g/L麦糟提取物、40g/L乳糖，pH4.5的TrMM中于28℃振摇生长培养物。从0.5μl培养物上清液中免疫印迹干扰素α2b的表达。
图5描述表达干扰素的9种蛋白酶缺失菌株的发酵罐培养。在添加有20g/L酵母提取物、40g/L纤维素、80g/L纤维二糖、40g/L山梨糖，pH4.5的TrMM中生长菌株。免疫印迹从0.1μl上清液中检测干扰素α2b。用标准量的50、100和200ng干扰素生成标准曲线。
图6是描述显示在Triab125和Triab126发酵罐中培养的M674的上清液中干扰素α2b生产水平的免疫印迹。
图7描述slp2沉默菌株和对照M577菌株的24孔培养。在不含硫酸铵但含有柠檬酸二铵、100mM PIPPS、20g/L麦糟提取物、40g/L乳糖，pH4.5的TrMM中于28℃振摇生长培养物。从0.5μl培养物上清液中免疫印迹干扰素α2b的表达。
图8描述在使用20g/L酵母提取物、40g/L纤维素、80g/L纤维二糖、40g/L山梨糖，pH4.5的TrMM的发酵罐中菌株M960和M961的培养，其中温度在48h从28℃变为22℃。免疫印迹从0.5μl上清液中检测干扰素α2b。干扰素标准是400、200、100、50和25ng。
图9描述选择的丝状真菌细胞的amp1和amp2的系统发生树。
图10描述选择的丝状真菌细胞的sep1的系统发生树。
图11描述选择的丝状真菌细胞的pep9的系统发生树。
图12用蛋白酶抑制剂处理的24孔培养中的FGF21生产。用FGF21标准曲线通过免疫印迹分析第6天的上清液样品。第一抗体和参考材料由Novartis提供。使用前将第一抗体在TBST中稀释至2μg/ml。将山羊抗兔第二抗体(Biorad山羊抗兔AP#170-6518)在TBST中以1:10000稀释。
图13从第4-6天的M393对照菌株和新FGF21转化体检测FGF21和CBHI表达的免疫印迹。新转化体来自M1076转化。在约60kD检测到CBHI载体，且FGF21游离产物在10kD。
图14使用抗FGF21抗体从含有和不含抑制剂的菌株M1200和M1205的培养物的发酵样品检测FGF21表达的免疫印迹。在各印迹中包括标准量的FGF21用于定量。将上清液稀释使在每条泳道上样0.1μl。
图15从含有和不含蛋白酶抑制剂处理的24孔培养中生长的M1200菌株检测FGF21表达的免疫印迹。使用的胃酶抑素、糜蛋白酶抑制剂、1,10-邻菲咯啉的最终浓度是10μM，且使用的SBTI是0.1mg/ml。每个孔中上样带有橙色LSB的2μl培养物上清液。一般使用抗FGF21全抗体来检测所产生的FGF21的全部形式，但在右下的印迹中，使用N末端抗体来检测包含N末端的形式。在右下的印迹中，还使用抗CBHI抗体来检测。
图16从含有和不含蛋白酶抑制剂处理的24孔培养中生长的M1200菌株检测FGF21表达的免疫印迹。使用的胃酶抑素、糜蛋白酶抑制剂、1,10-邻菲咯啉的最终浓度是10μM，且使用的SBTI是0.1mg/ml。每个孔中上样带有橙色LSB的2μl培养物上清液。使用抗FGF21全抗体和C末端抗体来特异性检测FGF21蛋白的C末端和全部形式。在左边的印迹中，使用抗CBHI抗体来检测。
图17显示在24孔培养中表达的MAB01重链的免疫印迹。将0.5μl的各上清液上样至4-15％凝胶。用TBST中以1:10000稀释的抗IgG重链AP偶联物(Sigma#A3188)来检测。用Promega AP底物来显色。
图18显示MAB01重链的免疫印迹。将0.5μl的各上清液上样至4-15％凝胶。用TBST中以1:30000稀释的抗人Fc抗体IRDye 700DX偶联物(Rockland#609-130-003)来检测重链。用Odyssey CLx近红外热像仪(Li-Cor)来检测700nm的荧光。
图19显示适合缺失的蛋白酶亚组的系统发生树。
图20图示描绘来自各蛋白酶缺失上清液和亲本菌株M124的培养物上清液的归一化的蛋白酶活性数据。前5个菌株在pH5.5测量蛋白酶活性，后3个缺失菌株在pH4.5测量蛋白酶活性。将蛋白酶活性比对绿色荧光酪蛋白。6倍蛋白酶缺失菌株仅有野生型亲本菌株的6％，7倍蛋白酶缺失菌株的蛋白酶活性比6倍蛋白酶缺失菌株的活性少约40％。
发明详述
本发明涉及在具有活性降低或没有的至少三种蛋白酶的丝状真菌细胞中生成重组异源多肽的改进的方法。本发明进一步涉及具有活性降低或没有的一种或多种选自以下蛋白酶的丝状真菌细胞中生成重组异源多肽的改进的方法：pep9、amp1、amp2和sep1。本发明部分基于以下出乎意料的发现：在丝状真菌细胞中降低特定内源蛋白酶组合的活性增加各种重组表达的异源蛋白，例如免疫球蛋白和生长因子的表达和稳定性。当其他人已经创建具有一种或多种蛋白酶失活的木霉真菌细胞时，它们没有提供哪种蛋白酶与增加特定蛋白类型，例如哺乳动物蛋白的表达和稳定性最相关的指导。例如，WO2011/075677公开了在木霉中可以敲除的某些蛋白酶，甚至公开了多种蛋白酶缺陷的木霉真菌细胞。
然而，WO2011/075677没有提供关于以下的任何指导：哪种蛋白酶对哺乳动物蛋白，例如免疫球蛋白或生长因子的表达和稳定性具有不利影响，因为它没有描述任何哺乳动物蛋白表达的实施例。此外，WO2011/075677仅仅公开了在单个蛋白酶缺陷的三种不同真菌菌株的每一个中单个真菌蛋白的异源表达。因此，本领域技术人员可能认为WO2011/075677教导了各单个蛋白酶的失活足以生产异源蛋白。Yoon等(2009,Appl.MicrobiolBiotechnol 82:691-701,2010:Appl.Microbiol Biotechnol DOI 10.1007/s00253-010-2937-0)报道了构建五倍和十倍蛋白酶基因破坏体用于在米曲霉(Aspergillus oryzae)中生产异源蛋白。尽管破坏的蛋白酶基因数量多，10倍蛋白酶破坏细胞仅仅将凝乳酶的产量提高了3.8倍。Van den Hombergh等报道了黑曲霉(Aspergillus niger)的三倍蛋白酶基因破坏体。尽管数据表达蛋白酶活性降低，它没有描述任何产生哺乳动物蛋白的实施例。WO2002068623进一步报道了黑曲霉的amp1、sep1和pep9蛋白酶，WO2012048334报道了嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)的amp2、sep1和pep9蛋白酶。其他报道描述了丝状真菌菌株中sep1蛋白酶的克隆和表征(WO2011077359,WO2009144269,WO200762936andWO2002045524)。Pep9的克隆和表征还描述于WO2012032472和WO2006110677。
申请人出乎意料地表明，在丝状真菌细胞，例如木霉真菌细胞中，多种蛋白酶与总蛋白酶活性的降低、异源蛋白生产的增加和表达后异源蛋白的稳定有关。特别地，发明人已经通过纯化这些蛋白酶并测定哪种具有与降解异源蛋白例如哺乳动物蛋白最相关的活性鉴定了在木霉真菌细胞中实际表达的蛋白酶(与仅在基因组中编码相反)。此外，发明人证实，缺失负责特定蛋白酶活性的基因实现了总蛋白酶活性的明显降低，这与在包含这种缺失的丝状真菌细胞中产生的蛋白质的数量和质量上蛋白稳定性的增加有关，造成细胞中全长异源蛋白的生产增加。还发现，工程化以降低至少三种蛋白酶基因的活性的木霉真菌细胞引起全长哺乳动物蛋白，例如抗体、治疗性蛋白或抗体变体如Fab或单域抗体生产的出乎意料的协同性增加。换言之，产生的全长哺乳动物蛋白的量比仅包含一个或两个蛋白酶基因缺失的木霉真菌细胞中产生的量的总和更多。因此，与WO2011/075677相反，发明人表明，丝状真菌细胞，例如木霉真菌细胞中完整异源蛋白的生产可以通过降低或消除细胞中至少三种蛋白酶的活性来获得。
因此，本公开的某些方面提供通过具有活性降低或没有的至少三种蛋白酶来生产增加水平的异源蛋白的丝状真菌细胞，其中细胞进一步包含编码异源多肽的重组多核苷酸，所述异源多肽的生产水平比蛋白酶活性没有降低的相应亲本丝状真菌细胞中多肽的生产水平至少高两倍。换言之，通过比较具有活性降低的至少三种蛋白酶的丝状真菌细胞中异源蛋白的生产水平和不具有这种活性降低的丝状真菌细胞中异源蛋白的生产水平可以确定期望的异源蛋白生产水平的增加，否则与表现出增加水平的细胞相同。
本公开的其他方面提供通过以下改进异源多肽稳定性的方法：a)提供本公开的具有活性降低或没有的至少三种蛋白酶的丝状真菌细胞，其中所述细胞进一步包含编码异源多肽的重组多核苷酸；和b)培养所述细胞以表达异源多肽，其中所述异源多肽与不包含编码蛋白酶的基因突变的宿主细胞相比稳定性增加。
本公开的其他方面还提供通过以下制备异源多肽的方法：a)提供本公开的具有活性降低或没有的至少三种蛋白酶的丝状真菌细胞，其中所述细胞进一步包含编码异源多肽的重组多核苷酸；b)培养所述宿主细胞以表达异源多肽；和c)纯化异源多肽。
本公开的某些方面还提供通过具有活性降低或没有的至少三种选自pep1、pep2、pep3、pep4、pep5、pep8、pep11、pep12、tsp1、slp1、slp2、gap1和gap2的蛋白酶来生产哺乳动物多肽水平增加的木霉真菌细胞，其中所述细胞进一步包含编码哺乳动物多肽的重组多核苷酸，所述哺乳动物多肽的生产水平比蛋白酶活性没有降低的相应亲本木霉真菌细胞中多肽的生产水平至少高两倍。换言之，通过比较具有活性降低的至少三种蛋白酶的木霉真菌细胞中异源蛋白的生产水平和不具有这种活性降低的木霉真菌细胞中异源蛋白的生产水平可以确定期望的异源蛋白生产水平的增加，否则与表现出增加水平的细胞相同。
本公开的某些方面还提供通过具有活性降低或没有的至少一种或多种选自pep9、amp1、amp2、mp1、mp2、mp3、mp4、mp5和sep1的蛋白酶来生产哺乳动物多肽水平增加的木霉真菌细胞。
本公开的其他方面提供通过以下改进哺乳动物多肽稳定性的方法：a)提供本公开的具有活性降低或没有的至少三种蛋白酶的木霉真菌细胞，其中所述细胞进一步包含编码哺乳动物多肽的重组多核苷酸；和b)培养所述细胞以表达哺乳动物多肽，其中所述哺乳动物多肽与不包含编码蛋白酶的基因突变的宿主细胞相比稳定性增加。
本公开的其他方面提供通过以下改进哺乳动物多肽稳定性的方法：a)提供本公开的具有活性降低或没有的至少一种或多种选自pep9、amp1、amp2、mp1、mp2、mp3、mp4、mp5和sep1的蛋白酶的木霉真菌细胞，其中所述细胞进一步包含编码哺乳动物多肽的重组多核苷酸；和b)培养所述细胞以表达哺乳动物多肽，其中所述哺乳动物多肽与不包含编码蛋白酶的基因突变的宿主细胞相比稳定性增加。
本公开的其他方面还提供通过以下制备哺乳动物多肽的方法：a)提供本公开的具有活性降低或没有的至少三种蛋白酶的木霉真菌细胞，其中所述细胞进一步包含编码哺乳动物多肽的重组多核苷酸；b)培养所述宿主细胞以表达哺乳动物多肽；和c)纯化哺乳动物多肽。
定义
如本文所使用，“免疫球蛋白”是指包含共价偶联在一起的重链和轻链，且能够特异性结合抗原的多聚体蛋白质。免疫球蛋白分子是大分子家族，其包括几种类型的分子，例如IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。
如本文所使用，“抗体”是指完整的免疫球蛋白分子及其能够结合抗原的片段。这些包括杂合(嵌合)抗体分子(参见例如Winter等Nature 349:293-99225,1991；和U.S.PatNo.4,816,567 226)；F(ab’)2和F(ab)片段和Fv分子、非共价的异源二聚体[227,228]；单链Fv分子(scFv)(参见例如Huston等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:5897-83,1988)；二聚体和三聚体的抗体片段构建体；微抗体(minibody)(参见例如Pack等Biochem 31,1579-84,1992；和Cumber等J.Immunology 149B,120-26,1992)；人源化的抗体分子(参见例如Riechmann等Nature 332,323-27,1988；Verhoeyan等Science 239,1534-36,1988；和GB 2,276,169)和从这些分子获得的任何功能性片段；以及通过非常规方法例如噬菌体展示获得的抗体。优选的，抗体是单克隆抗体。获得单克隆抗体的方法是本领域公知的。
如本文所使用，“肽”或“多肽”是包括多个连续聚合的氨基酸残基的氨基酸序列。为本发明的目的，肽通常是包括最多50个氨基酸残基的那些分子，多肽包括超过50个氨基酸残基。肽或多肽可以包括修饰的氨基酸残基、不是由密码子编码的天然存在的氨基酸残基和非天然存在的氨基酸残基。如本文所使用，“蛋白质”可以是指任何大小的肽或多肽。
本发明的蛋白酶
在此所述的发明涉及通过在细胞中发现的具有活性降低或不可检测的至少三种蛋白酶来产生增加水平的异源多肽，例如哺乳动物多肽的丝状真菌细胞，例如木霉真菌细胞。在表达异源蛋白的丝状真菌细胞中发现的这种蛋白酶通常催化所表达的重组蛋白的明显降解。因此，通过降低或消除表达异源蛋白的丝状真菌细胞中的蛋白酶活性，增加了所表达蛋白的稳定性，从而增加多肽的生产水平，在某些情况下，还改进所产生蛋白的质量(例如全长而不是降解的)。
蛋白酶包括但不限于天冬氨酸蛋白酶、胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、金属蛋白酶和sedolisin蛋白酶。可以从丝状真菌细胞鉴定、分离并测试这些蛋白酶以确定其活性降低是否会影响丝状真菌细胞中重组多肽的生产。鉴定和分离蛋白酶的方法是本领域公知的，包括但不限于亲和层析、酶谱分析和凝胶电泳。然后可以通过以下来测试所鉴定的蛋白酶：从表达重组多肽，例如异源或哺乳动物多肽的丝状真菌细胞中删除编码所鉴定的蛋白酶的基因，并测定所述删除是否造成细胞总蛋白酶活性的降低(例如降低至相应亲本丝状真菌细胞总蛋白酶活性的49％或更少、或31％或更少)，以及所表达的重组多肽的生产水平增加(例如比在相应亲本丝状真菌细胞中的生产水平高两倍)。删除基因、测量总蛋白酶活性以及测量所产生蛋白的水平的方法是本领域公知的，包括在本文中所述的方法。“相应亲本丝状真菌细胞”是指其中蛋白酶活性没有降低或消除的相应细胞。
天冬氨酸蛋白酶
天冬氨酸蛋白酶是利用天冬氨酸残基来水解多肽和蛋白质中的肽键的酶。通常，天冬氨酸蛋白酶在其活性位点包含两种高度保守的天冬氨酸残基，其在酸性pH下活性最佳。来自真核生物(例如木霉真菌)的天冬氨酸蛋白酶包括胃蛋白酶、组织蛋白酶和肾素。这些天冬氨酸蛋白酶具有两个结构域的结构，其被认为来自祖先基因复制。与这种复制事件一致的是，尽管这两个结构域的序列已经开始变得不同，各个结构域的总体折叠是相似的。各个结构域提供一个催化的天冬氨酸残基。活性位点位于由天冬氨酸蛋白酶的两个结构域形成的裂缝内。真核天冬氨酸蛋白酶进一步包括保守的二硫键，其可有助于将多肽鉴定为天冬氨酸蛋白酶。
在木霉真菌细胞中已经鉴定了15种天冬氨酸蛋白酶：pep1(tre74156)、pep2(tre53961)、pep3(tre121133)、pep4(tre77579)、pep5(tre81004)、pep6(tre68662)、pep7(tre58669)、pep8(tre122076)、pep9(tre79807)、pep10(tre78639)、pep 11(121306)、pep12(tre119876)、pep13(tre76887)、pep14(trel08686)和pep16(tre110490)。
Pep1
合适的pep1蛋白酶的实例包括但不限于，里氏木霉pep1(SEQ ID NO:1)、哈茨木霉有性型(Hypocrea lixii)gill1558498(SEQ ID NO:2)、棘孢木霉(Trichodermaasperellum)gil47027997(SEQ ID NO:3)、深绿木霉(Trichoderma atroviride)jgilTriat2l297887(SEQ ID NO:4)、绿木霉(Trichoderma virens)jgilTriviGv29_8_2l81777(SEQ ID NO:5)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)jgilTrire2lafm:Afu5gl3300(SEQ ID NO:6)、米曲霉gil94730408(SEQ ID NO:7)、金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)gil322712783(SEQ ID NO:8)、小麦赤霉菌(Gibberella zeae)gil46126795(SEQ ID NO:9)、镰孢霉(Fusarium venenatum)gill8448713(SEQ ID NO:10)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)gil342879173(SEQ ID NO:11)、蓝菌属真菌(Grosmanniaclavigera)gil320591399(SEQ ID NO:12)、黄萎病病原菌(Verticillium alboatrum)gil302422750(SEQ ID NO:13)、球毛壳菌(Chaetomium globosum)gill16182964(SEQ IDNO:14)、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)gil85110723(SEQ ID NO:15)、四孢链孢菌(Neurospora tetrasperma)gil336463990(SEQ ID NO:16)、嗜热毁丝霉gi367030924(SEQID NO:491),产黄青霉(Penicillium chrysogenum)gi255953325(SEQ ID NO:492)、黑曲霉gi350639535(SEQ ID NO:493)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)gi67541436(SEQ IDNO:494)及其同源物。
因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是pep1蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：1-16、SEQ ID NO：491-494的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQ ID NO：1-16、SEQ ID NO：491-494的氨基酸序列具有100％一致性。
在一些实施方案中，pep1是里氏木霉pep1。由里氏木霉pep1编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。在其他实施方中，本公开的蛋白酶的氨基酸序列与SEQ ID NO：1具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在进一步的实施方案中，蛋白酶与SEQ IDNO：1具有100％一致性。
Pep2
合适的pep2蛋白酶的实例包括但不限于，里氏木霉pep2(SEQ ID NO:182)、深绿木霉jgilTriat2H42040(SEQ ID NO:183)、绿木霉jgilTriviGv29_8_2l53481(SEQ ID NO:184)、蛹虫草(Cordyceps militaris)CM01gil346326575(SEQ ID NO:185)、粗糙链孢霉gi85111370(SEQ ID NO:495)及其同源物。
因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是pep2蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：182-185、SEQ ID NO：495的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQ ID NO：182-185、SEQ ID NO：495的氨基酸序列具有100％一致性。
在一些实施方案中，pep2是里氏木霉pep2。由里氏木霉pep2编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：182所示。在其他实施方中，本公开的蛋白酶的氨基酸序列与SEQ ID NO：182具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在进一步的实施方案中，蛋白酶与SEQID NO：182具有100％一致性。
Pep3
合适的pep3蛋白酶的实例包括但不限于，里氏木霉pep3(SEQ ID NO:17)、深绿木霉jgilTriat2(SEQ ID NO:18)、绿木霉jgilTriviGv29_8_2(SEQ ID NO:19)、哈茨木霉有性型gill45583125(SEQ ID NO:20)、棘孢木霉gil51860175(SEQ ID NO:21)、黑曲霉gil317025164(SEQ ID NO:22)、烟曲霉gill59122534(SEQ ID NO:23)、黑曲霉gill34054572(SEQ ID NO:24)、蛹虫草gil346318620(SEQ ID NO:25)、苹果炭疽菌(Glomerella graminicola)gil310800156(SEQ ID NO:26)、尖孢镰刀菌gil342871221(SEQID NO:27)、蓝菌属真菌gil320591121(SEQ ID NO:28)、灰霉病菌(Botryotiniafuckeliana)gil12002205(SEQ ID NO:29)、太瑞斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris)gil346997107(SEQ ID NO:30)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)gill56055954(SEQ ID NO:31)、球毛壳菌gill 16197829(SEQ ID NO:32)、四孢链孢菌gil336472132(SEQID NO:33)、粗糙链孢霉gil85102020(SEQ ID NO:34)、费氏新萨托菌(Neosartoryafischeri)gil 119467426(SEQ ID NO:35)、马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)gil212534792(SEQ ID NO:36)、嗜热毁丝霉gi367025909(SEQ ID NO:496)、产黄青霉gi255947264(SEQ ID NO:497)、米曲霉391870123(SEQ ID NO:498)及其同源物。
因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是pep3蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：17-36、SEQ ID NO：496-498的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQ ID NO：17-36、SEQ ID NO：496-498的氨基酸序列具有100％一致性。
在一些实施方案中，pep3是里氏木霉pep3。由里氏木霉pep3编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示。在其他实施方中，本公开的蛋白酶的氨基酸序列与SEQ ID NO：17具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在进一步的实施方案中，蛋白酶与SEQ IDNO：17具有100％一致性。
Pep4
合适的pep4蛋白酶的实例包括但不限于，里氏木霉pep4(SEQ ID NO:37)、绿木霉jgilTriviGv29_8_2(SEQ ID NO:38)、深绿木霉jgilTriat2(SEQ ID NO:39)、黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)gill93735605(SEQ ID NO:40)、黑曲霉gil 145232965(SEQID NO:41)、烟曲霉gil70999520(SEQ ID NO:42)、棒曲霉(Aspergillus clavatus)gil121705756(SEQ ID NO:43)、鞭毛藻丛赤壳菌(Nectria haematococca)gil302899226(SEQID NO:44)、苹果炭疽菌gil310796316(SEQ ID NO:45)、蛹虫草gil346322842(SEQ ID NO:46)、小麦赤霉菌gil46138535(SEQ ID NO:47)、金龟子绿僵菌gil322708430(SEQ ID NO:48)、尖孢镰刀菌gil342882947(SEQ ID NO:49)、黑僵菌(Metarhizium acridum)gil322700747(SEQ ID NO:50)、棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)gil346973691(SEQID NO:51)、灰霉病菌gill54309857(SEQ ID NO:52)、球毛壳菌gill 16203505(SEQ ID NO:53)、太瑞斯梭孢壳霉gil347001590(SEQ ID NO:54)、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)gil39973863(SEQ ID NO:55)、黑孢块菌(Tuber melanosporum)gil296417651(SEQ ID NO:56)、粗糙链孢霉gil85094599(SEQ ID NO:57)、嗜热毁丝霉gi367031892gi255947264(SEQID NO:499)、产黄青霉gi255936729gi255947264(SEQ ID NO:500)、米曲霉gil69770745gi255947264(SEQ ID NO:501)、构巢曲霉gi67524891gi255947264(SEQ IDNO:502)及其同源物。
因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是pep4蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：37-57、SEQ ID NO：499-502的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQ ID NO：37-57、SEQ ID NO：499-502的氨基酸序列具有100％一致性。
在一些实施方案中，pep4是里氏木霉pep4。由里氏木霉pep4编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：37所示。在其他实施方中，本公开的蛋白酶的氨基酸序列与SEQ ID NO：37具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在进一步的实施方案中，蛋白酶与SEQ IDNO：37具有100％一致性。
Pep5
合适的pep5蛋白酶的实例包括但不限于，里氏木霉pep5(SEQ ID NO:58)、绿木霉jgilTriviGv29_8_2(SEQ ID NO:59)、深绿木霉jgilTriat2l277859(SEQ ID NO:60)、黑僵菌gil322695806(SEQ ID NO:61)、尖孢镰刀菌gill56071418(SEQ ID NO:62)、蛹虫草gil346324830(SEQ ID NO:63)、小麦赤霉菌gil46124247(SEQ ID NO:64)、棉花黄萎病菌gil346978752(SEQ ID NO:65)、嗜热毁丝霉gi367019798(SEQ ID NO:503)及其同源物。
因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是pep5蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：58-65、SEQ ID NO：503的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQ ID NO：58-65、SEQ ID NO：503的氨基酸序列具有100％一致性。
在一些实施方案中，pep5是里氏木霉pep5。由里氏木霉pep5编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：58所示。在其他实施方中，本公开的蛋白酶的氨基酸序列与SEQ ID NO：58具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在进一步的实施方案中，蛋白酶与SEQ IDNO：58具有100％一致性。
Pep7
合适的pep7蛋白酶的实例包括但不限于，里氏木霉pep7(SEQ ID NO:186)、深绿木霉jgilTriat2(SEQ ID NO:187)、绿木霉jgilTriviGv29_8_2(SEQ ID NO:188)、苹果炭疽菌gil310800487(SEQ ID NO:189)、黑僵菌gil322700577(SEQ ID NO:190)、太瑞斯梭孢壳霉gil347003264(SEQ ID NO:191)、鹅掌柄孢壳(Podospora anserine)gil 171680938(SEQID NO:192),嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)gil340905460(SEQ ID NO:193)、棉花黄萎病菌gil346975960(SEQ ID NO:194)、嗜热毁丝霉gil347009870gi367026634(SEQID NO:195)、粗糙链孢霉gil85090078(SEQ ID NO:196)、稻瘟病菌gil39948622(SEQ IDNO:197)、球毛壳菌gill 16191517(SEQ ID NO:198)、稻瘟病菌gil39970765(SEQ ID NO:199)、构巢曲霉gi67522232(SEQ ID NO:504)、黑曲霉gi350630464(SEQ ID NO:505),米曲霉gi317138074及其同源物。
因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是pep7蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：186-199、SEQ ID NO：504-506的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQ ID NO：186-199、SEQ ID NO：504-506的氨基酸序列具有100％一致性。
在一些实施方案中，pep7是里氏木霉pep7。由里氏木霉pep7编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：186所示。在其他实施方中，本公开的蛋白酶的氨基酸序列与SEQ ID NO：186具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在进一步的实施方案中，蛋白酶与SEQID NO：186具有100％一致性。
Pep8
合适的pep8蛋白酶的实例包括但不限于，里氏木霉pep8EGR48424(SEQ ID NO:507)、绿木霉EHK19238(SEQ ID NO:508)、深绿木霉EHK40047(SEQ ID NO:509)、四孢链孢菌EG053367(SEQ ID NO:510)、嗜热毁丝霉XP_003658897(SEQ ID NO:511)、粗糙链孢霉XP_965343(SEQ ID NO:512)、金龟子绿僵菌EFZ03501(SEQ ID NO:513)、太瑞斯梭孢壳霉XP_003656869(SEQ ID NO:514)、尖孢镰刀菌EGU79769(SEQ ID NO:515),和小麦赤霉菌XP_381566(SEQ ID NO:516)、稻瘟病菌XP_°°3714540.1(SEQ ID NO:517)、产黄青霉XP_002557331(SEQ ID NO:518)、米曲霉XP_001822899.1(SEQ ID NO:519)、构巢曲霉XP_664091.1(SEQ ID NO:520)、黑曲霉EHA24387.1(SEQ ID NO:521)及其同源物。
因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是pep8蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：507-521的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQ ID NO：507-521的氨基酸序列具有100％一致性。
在一些实施方案中，pep8是里氏木霉pep8。由里氏木霉pep8编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：507所示。在其他实施方中，本公开的蛋白酶的氨基酸序列与SEQ ID NO：507具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在进一步的实施方案中，蛋白酶与SEQID NO：507具有100％一致性。
Pep9
合适的pep9蛋白酶的实例包括但不限于，里氏木霉pep9 79807(SEQ ID NO:750)、绿木霉158334(SEQ ID NO:751)、深绿木霉90832(SEQ ID NO:752)、苹果炭疽菌XP_384573.1(SEQ ID NO:753)、粗糙链孢霉XP_001727974.1(SEQ ID NO:754)、嗜热毁丝霉XP_003667167.1(SEQ ID NO:528)、米曲霉XP_001821372.2(SEQ ID NO:529)、黑曲霉ABM05950.1(SEQ ID NO:755)、烟曲霉XP_752122.1(SEQ ID NO:756)、构巢曲霉XP_662026.1(SEQ ID NO:757)、威斯康星青霉(Penicillium Wisconsin)XP_002565726.1(SEQID NO:758)及其同源物。
因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是pep9蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：750-758的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQ ID NO：750-758的氨基酸序列具有100％一致性。
在一些实施方案中，pep9是里氏木霉pep9。由里氏木霉pep9编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：750所示。在其他实施方中，本公开的蛋白酶的氨基酸序列与SEQ ID NO：750具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在进一步的实施方案中，蛋白酶与SEQID NO：750具有100％一致性。
Pep11
合适的pep11蛋白酶的实例包括但不限于，里氏木霉pep11EGR49498(SEQ ID NO:522)、绿木霉EHK26120(SEQ ID NO:523)、深绿木霉EHK41756(SEQ ID NO:524)、假禾谷镰刀 菌(Fusarium pseudograminearum)EKJ74550(SEQ ID NO:525)、黑僵菌EFY91821(SEQ IDNO:526)和小麦赤霉菌XP_384151(SEQ ID NO:527)、嗜热毁丝霉XP_003667387.1(SEQ IDNO:528)、粗糙链孢霉XP_960328.1(SEQ ID NO:529)及其同源物。
因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是pep11蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：522-529的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQ ID NO：522-529的氨基酸序列具有100％一致性。
在一些实施方案中，pep11是里氏木霉pep11。由里氏木霉pep11编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：522所示。在其他实施方中，本公开的蛋白酶的氨基酸序列与SEQ ID NO：522具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在进一步的实施方案中，蛋白酶与SEQID NO：522具有100％一致性。
Pep12
合适的pep12蛋白酶的实例包括但不限于，里氏木霉pep12EGR52517(SEQ ID NO:530)、绿木霉pep12EHK18859(SEQ ID NO:531)、深绿木霉pep12EHK45753(SEQ ID NO:532)、假禾谷镰刀菌pep12EKJ73392(SEQ ID NO:533)、小麦赤霉菌pep12XP_388759(SEQ ID NO:534)和金龟子绿僵菌pep12EFY95489(SEQ ID NO:535)、粗糙链孢霉XP_964574.1(SEQ IDNO:536、嗜热毁丝霉XP_003659978.1(SEQ ID NO:537)及其同源物。
因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是pep12蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：530-537的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQ ID NO：530-537的氨基酸序列具有100％一致性。
在一些实施方案中，pep12是里氏木霉pep12。由里氏木霉pep12编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：530所示。在其他实施方中，本公开的蛋白酶的氨基酸序列与SEQ ID NO：530具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在进一步的实施方案中，蛋白酶与SEQID NO：530具有100％一致性。
Pep6、pep10、pep13、pep14和pep16
其他天冬氨酸蛋白酶包括但不限于，里氏木霉pep6_(Tre68662,SEQ ID NO:880)、pep10_(Tre78639,SEQ ID NO:881)、pep13_(Tre76887,SEQ ID NO:882)、pep14_(Trel08686,SEQ ID NO:883)或pep16_(Trel 10490,SEQ ID NO:884)及其同源物。
因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是pep6、pep10、pep13、pep14、pep16蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：880-884的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在某些实施方案中，蛋白酶与选自SEQ ID NO：880-884的氨基酸序列具有100％一致性。
胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶
胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶是底物特异性与胰蛋白酶相似的酶。胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶利用丝氨酸残基来水解多肽和蛋白质中的肽键。通常，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶切割带正电的氨基酸残基后面的肽键。来自真核生物(例如木霉真菌)的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶包括胰蛋白酶1、胰蛋白酶2和消旋胰蛋白酶(mesotrypsin)。这些胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶通常包含形成电荷接替的三种氨基酸残基(例如组氨酸、天冬氨酸和丝氨酸)的催化三元组，所述电荷接替使活性位点丝氨酸亲核。真核胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶进一步包括由甘氨酸和丝氨酸的主链酰胺氢原子形成的“氧离子洞”，其可有助于将多肽鉴定为胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶。
在木霉真菌细胞中已经鉴定的一种胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶是tsp1(tre73897)。如下所讨论，已经证实tsp1对重组多肽，例如免疫球蛋白的表达具有显著影响。
如在WO2013/102674的实施例3所述，从木霉中纯化丝氨酸蛋白酶，其显示具有降解哺乳动物蛋白质的多种蛋白酶活性。在这些活性中，tsp1被鉴定为胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶。然后从木霉真菌细胞中删除tsp1蛋白酶基因，显示删除tsp1实现了总蛋白酶活性的显著降低，从而造成细胞产生的哺乳动物蛋白质的稳定性增加。
合适的tsp1蛋白酶的实例包括但不限于，里氏木霉tsp1(SEQ ID NO:66)、深绿木霉jgilTriat2l298187(SEQ ID NO:67)、jgilTriviGv29_8_2(SEQ ID NO:68)、哈茨木霉有性型gil 145583579(SEQ ID NO:69)、哈茨木霉有性型gil63025000(SEQ ID NO:70)、油菜菌核病菌gil 156052735(SEQ ID NO:71)、灰霉病菌gill54314937(SEQ ID NO:72)、小麦颖枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)gill69605891(SEQ ID NO:73)、油菜茎基溃疡病菌(Leptosphaeria maculans)gil312219044(SEQ ID NO:74)、棉花黄萎病菌gil37992773(SEQ ID NO:75)、玉米圆斑病菌(Cochliobolus carbonum)gill072114(SEQ ID NO:76)、黑僵菌gil322695345(SEQ ID NO:77)、金龟子绿僵菌gil4768909(SEQ ID NO:78)、gil464963(SEQ ID NO:79)、小麦赤霉菌gil46139299(SEQ ID NO:80),金龟子绿僵菌(SEQ ID NO:81)、构巢曲霉gi67523821(SEQ ID NO:538)及其同源物。
因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是tsp1蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：66-81、SEQ ID NO：538的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQ ID NO：66-81、SEQ ID NO：538的氨基酸序列具有100％一致性。
在一些实施方案中，tsp1是里氏木霉tsp1。由里氏木霉tsp1编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：66所示。在其他实施方中，本公开的蛋白酶的氨基酸序列与SEQ ID NO：66具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在进一步的实施方案中，蛋白酶与SEQ IDNO：66具有100％一致性。
枯草杆菌蛋白酶
枯草杆菌蛋白酶是底物特异性与枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)相似的酶。枯草杆菌蛋白酶利用丝氨酸残基来水解多肽和蛋白质中的肽键。通常，枯草杆菌蛋白酶是包含三种氨基酸天冬氨酸、组氨酸和丝氨酸的催化三元组的丝氨酸蛋白酶。这些催化残基排列与来自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的原型枯草杆菌蛋白酶共有。来自真核生物(例如木霉真菌)的枯草杆菌蛋白酶包括弗林蛋白酶、MBTPS1和TPP2。真核胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶在氧阳离子洞中进一步包括天冬氨酸残基。枯草杆菌蛋白酶slp7也与sedolisin蛋白酶tpp1相似。
在木霉真菌细胞中已经鉴定了7种枯草杆菌蛋白酶：slp1(tre51365)、slp2(tre123244)、slp3(tre123234)、slp5(tre64719)、slp6(tre121495)、slp7(tre123865)和slp8(tre58698)。
Slp1
合适的slp1蛋白酶的实例包括但不限于，里氏木霉slp1(SEQ ID NO:82)、深绿木霉jgilTriat2(SEQ ID NO:83)、深绿木霉jgilTriat2(SEQ ID NO:84)、绿木霉jgilTriviGv29_8_2(SEQ ID NO:85)、哈茨木霉有性型gil 145583581(SEQ ID NO:86)、黑僵菌gil322694632(SEQ ID NO:87)、尖孢镰刀菌gil342877080(SEQ ID NO:88)、小麦赤霉菌gil46139915(SEQ ID NO:89)、羊茅香柱菌(Epichloe festucae)gil170674476(SEQ IDNO:90)、鞭毛藻丛赤壳菌(gil302893164(SEQ ID NO:91)、孢子粪壳菌(Sordariamacrospore)gil336266150(SEQ ID NO:92)、苹果炭疽菌gil310797947(SEQ ID NO:93)、四孢链孢菌gil336469805(SEQ ID NO:94)、粗糙链孢霉gil85086707(SEQ ID NO:95)、稻瘟病菌gil 145608997(SEQ ID NO:96)、球毛壳菌gil 116208730(SEQ ID NO:97)、嗜热毁丝霉gi367029081(SEQ ID NO:539)及其同源物。
因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是slp1蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：82-97、SEQ ID NO：539的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQ ID NO：82-97、SEQ ID NO：539的氨基酸序列具有100％一致性。
在一些实施方案中，slp1是里氏木霉slp1。由里氏木霉slp1编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：82所示。在其他实施方中，本公开的蛋白酶的氨基酸序列与SEQ ID NO：82具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在进一步的实施方案中，蛋白酶与SEQ IDNO：82具有100％一致性。
Slp2
合适的slp2蛋白酶的实例包括但不限于，里氏木霉slp2(SEQ ID NO:98)、深绿木霉jgilTriat2(SEQ ID NO:99)、绿木霉jgilTriviGv29_8_2(SEQ ID NO:100)、哈茨木霉有性型gill 15111226(SEQ ID NO:101)、烟曲霉gil70997972(SEQ ID NO:102)、鞭毛藻丛赤壳菌gil302915240(SEQ ID NO:103)、小麦赤霉菌gil46105128(SEQ ID NO:104)、粉棒束孢(Isaria farinose)gil68165000(SEQ ID NO:105)、苹果炭疽菌gil310797854(SEQ ID NO:106)、羊茅香柱菌gill70674491(SEQ ID NO:107)、黑僵菌gil322697754(SEQ ID NO:108)、枝顶孢霉属(Acremonium sp.)F11177gill47225254(SEQ ID NO:109)、有毛长喙壳霉(Ophiostoma piliferum)gill5808807(SEQ ID NO:110)、四孢链孢菌gil336463649(SEQID NO:111)、嗜热毛壳菌gil340992600(SEQ ID NO:112)、黄绿绿僵菌(Metarhiziumflavoviride)gil254351265(SEQ ID NO:113)、鹅掌柄孢壳gill71680111(SEQ ID NO:114)、稻瘟病菌gil39943180(SEQ ID NO:115)、油菜菌核病菌gill56058540(SEQ ID NO:116)、柄篮状菌(Talaromyces stipitatus)gil242790441(SEQ ID NO:117)、嗜热毁丝霉gi367021472(SEQ ID NO:540)、黑曲霉gil45237646(SEQ ID NO:541)、米曲霉gil69780712(SEQ ID NO:542)、产黄青霉gi255955889(SEQ ID NO:543)、构巢曲霉gi259489544(SEQ IDNO:544)、粗糙链孢霉gi85084841(SEQ ID NO:545)及其同源物。
因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是slp2蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：98-117、SEQ ID NO：540-545的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQ ID NO：98-117、SEQ ID NO：540-545的氨基酸序列具有100％一致性。
在一些实施方案中，slp2是里氏木霉slp2。由里氏木霉slp2编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：98所示。在其他实施方中，本公开的蛋白酶的氨基酸序列与SEQ ID NO：98具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在进一步的实施方案中，蛋白酶与SEQ IDNO：98具有100％一致性。
Slp3
合适的slp3蛋白酶的实例包括但不限于，里氏木霉slp3(SEQ ID NO:166)、深绿木霉jgilTriat2(SEQ ID NO:167)、绿木霉jgilTriviGv29_8_2(SEQ ID NO:168)、康氏肉座菌(Hypocrea koningii)gil 124295071(SEQ ID NO:169)、Purpureocillium lilacinumgill30750164(SEQ ID NO:170)、金龟子绿僵菌gill6215677(SEQ ID NO:171)、洛斯里被毛孢(Hirsutella rhossiliensis)gil90655148(SEQ ID NO:172)、膨胀弯颈霉(Tolypocladium inflation)gil 18542429(SEQ ID NO:173)、厚垣普奇尼亚菌有性型(Metacordyceps chlamydosporia)gil 19171215(SEQ ID NO:174)、蛹虫草gil346321368(SEQ ID NO:175)、镰刀菌属gil628051(SEQ ID NO:176)、四孢链孢菌gil336471881(SEQID NO:177)、球毛壳菌gill 16197403(SEQ ID NO:178)、粗糙链孢霉gil85084841(SEQ IDNO:179)、尖孢镰刀菌gil56201265(SEQ ID NO:180)、小麦赤霉菌gil46114268(SEQ ID NO:181)、嗜热毁丝霉gi367026259(SEQ ID NO:546)、构巢曲霉gi67538776(SEQ ID NO:547)、米曲霉gil69771349(SEQ ID NO:222)、黑曲霉gi470729(SEQ ID NO:223)及其同源物。
因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是slp3蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：166-181、SEQ ID NO：546-547、SEQ ID NO：222-223的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQ ID NO：166-181、SEQ ID NO：546-547、SEQ ID NO：222-223的氨基酸序列具有100％一致性。
在一些实施方案中，slp3是里氏木霉slp3。由里氏木霉slp3编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：166所示。在其他实施方中，本公开的蛋白酶的氨基酸序列与SEQ ID NO：166具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在进一步的实施方案中，蛋白酶与SEQID NO：166具有100％一致性。
Slp5
合适的slp5蛋白酶的实例包括但不限于，里氏木霉slp5(SEQ ID NO:200)、深绿木霉jgilTriat2(SEQ ID NO:201)、绿木霉jgilTriviGv29_8_2(SEQ ID NO:202)、哈茨木霉有性型gill 18161442(SEQ ID NO:203)、尖孢镰刀菌gil342883549(SEQ ID NO:204)、小麦赤霉菌gil46135733(SEQ ID NO:205)、苹果炭疽菌gil310796396(SEQ ID NO:206)、鞭毛藻丛赤壳菌gil302927954(SEQ ID NO:207)、蛹虫草gil346319783(SEQ ID NO:208)、粗糙链孢霉gil85094084(SEQ ID NO:209)、四孢链孢菌gil336467281(SEQ ID NO:210)、棉花黄萎病菌gil346971706(SEQ ID NO:211)、太瑞斯梭孢壳霉gil347001418(SEQ ID NO:212)、稻瘟病菌gill45605493(SEQ ID NO:213)、嗜热毁丝霉gi367032200(SEQ ID NO:548)、产黄青霉gi62816282(SEQ ID NO:549)及其同源物。
因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是slp5蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：200-213、SEQ ID NO：548-549的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQ ID NO：200-213、SEQ ID NO：548-549的氨基酸序列具有100％一致性。
在一些实施方案中，slp5是里氏木霉slp5。由里氏木霉slp5编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：200所示。在其他实施方中，本公开的蛋白酶的氨基酸序列与SEQ ID NO：200具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在进一步的实施方案中，蛋白酶与SEQID NO：200具有100％一致性。
Slp6
合适的slp6蛋白酶的实例包括但不限于，里氏木霉slp6(SEQ ID NO:214)、深绿木霉jgilTriat2(SEQ ID NO:215)、绿木霉jgilTriviGv29_8_2(SEQ ID NO:216)、绿色肉座菌(Hypocrea virens)gil29421423(SEQ ID NO:217)、哈茨木霉有性型gil 145583127(SEQID NO:218)、哈氏木霉(Trichoderma hamatum)gil30144643(SEQ ID NO:219)、烟曲霉gil2295(SEQ ID NO:220)、土曲霉(Aspergillus terreus)gill 15391147(SEQ ID NO:221)、米曲霉gil 169771349(SEQ ID NO:222)、黑曲霉gil470729(SEQ ID NO:223)、苹果炭疽菌gil310794714(SEQ ID NO:224)、小麦赤霉菌gil46114946(SEQ ID NO:225)、尖孢镰刀菌gil342873942(SEQ ID NO:226)、鞭毛藻丛赤壳菌gil302884541(SEQ ID NO:227)、费氏新萨托菌gill 19500190(SEQ ID NO:228)、黄萎病病原菌gil302413161(SEQ ID NO:229)、苹果炭疽菌gil310790144(SEQ ID NO:230)、粗糙链孢霉gi85090020(SEQ ID NO:550)及其同源物。
因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是slp6蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：214-230、SEQ ID NO：550的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQ ID NO：214-230、SEQ ID NO：550的氨基酸序列具有100％一致性。
在一些实施方案中，slp6是里氏木霉slp6。由里氏木霉slp6编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：214所示。在其他实施方中，本公开的蛋白酶的氨基酸序列与SEQ ID NO：214具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在进一步的实施方案中，蛋白酶与SEQID NO：214具有100％一致性。
Slp7
合适的slp7蛋白酶的实例包括但不限于，里氏木霉slp7(SEQ ID NO:231)、深绿木霉jgilTriat2(SEQ ID NO:232)、绿木霉jgilTriviGv29_8_2(SEQ ID NO:233)、金龟子绿僵菌gil322710320(SEQ ID NO:234)、鞭毛藻丛赤壳菌gil302915000(SEQ ID NO:235)、嗜热毁丝霉gil347009020、gi367024935(SEQ ID NO:236)、小麦赤霉菌gil46137655(SEQ IDNO:237)、太瑞斯梭孢壳霉gil346996549(SEQ ID NO:238)、稻瘟病菌gil 145610733(SEQID NO:239)、构巢曲霉gi67541991(SEQ ID NO:551)、产黄青霉gi255933786(SEQ ID NO:552)、黑曲霉gi317036543(SEQ ID NO:553)、米曲霉gil69782882(SEQ ID NO:554)、粗糙链孢霉gi85109979(SEQ ID NO:555)及其同源物。
因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是slp7蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：231-239、SEQ ID NO：551-555的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQ ID NO：231-239、SEQ ID NO：551-555的氨基酸序列具有100％一致性。
在一些实施方案中，slp7是里氏木霉slp7。由里氏木霉slp7编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：231所示。在其他实施方中，本公开的蛋白酶的氨基酸序列与SEQ ID NO：231具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在进一步的实施方案中，蛋白酶与SEQID NO：231具有100％一致性。
Slp8
合适的slp8蛋白酶的实例包括但不限于，里氏木霉slp8(SEQ ID NO:240)、深绿木霉jgilTriat2H98568(SEQ ID NO:241)、绿木霉jgilTriviGv29_8_2l33902(SEQ ID NO:242)及其同源物。
因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是slp7蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：240-242的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQ ID NO：240-242的氨基酸序列具有100％一致性。
在一些实施方案中，slp8是里氏木霉slp8。由里氏木霉slp8编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：240所示。在其他实施方中，本公开的蛋白酶的氨基酸序列与SEQ ID NO：240具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在进一步的实施方案中，蛋白酶与SEQID NO：240具有100％一致性。
Slp样蛋白酶
其他slp样蛋白酶包括但不限于，slp57433(Tre57433SEQ ID NO:885)、slp35726_(Tre35726SEQ ID NO:886)、slp60791_(Tre60791SEQ ID NO:887)或slpl09276_(Trel09276SEQ ID NO:888)及其同源物。
因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是slp57433、slp35726、slp60791或slpl09276蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：885-888的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在某些实施方案中，蛋白酶与选自SEQ ID NO：885-888的氨基酸序列具有100％一致性。
谷氨酸蛋白酶
谷氨酸蛋白酶是水解多肽和蛋白质中的肽键的酶。谷氨酸蛋白酶对胃蛋白酶抑制剂A不敏感，因此有时也称为胃蛋白酶抑制剂不敏感的酸性蛋白酶。尽管之前将谷氨酸蛋白酶与天冬氨酸蛋白酶分为一组并通常合称为酸性蛋白酶，最近发现谷氨酸蛋白酶与天冬氨酸蛋白酶的活性位点残基非常不同。
在木霉真菌细胞中已经鉴定了两种谷氨酸蛋白酶：gap1(tre69555)和gap2(tre106661)。
Gap1
合适的gap1蛋白酶的实例包括但不限于，里氏木霉gap1(SEQ ID NO:118)、深绿木霉jgilTriat2l40863(SEQ ID NO:119)、绿木霉jgilTriviGv29_8_2l 192684(SEQ ID NO:120)、黄曲霉(Aspergillus flavus)gil238499183(SEQ ID NO:121)、黑曲霉gill45251555(SEQ ID NO:122),土曲霉gill 15491521(SEQ ID NO:123)、gil37154543(SEQ ID NO:124)、gil48425531(SEQ ID NO:125)、gil351873(SEQ ID NO:126)、太瑞斯梭孢壳霉gil346997245(SEQ ID NO:127)、产黄青霉gil255940586(SEQ ID NO:128)、嗜热毁丝霉gi367026504(SEQ ID NO:574)、米曲霉gi317150886(SEQ ID NO:575)、粗糙链孢霉gi85097968(SEQ ID NO:576)、黑曲霉gil31056(SEQ ID NO:577)、产黄青霉gi255930123(SEQ ID NO:578)、黑曲霉gil45236956(SEQ ID NO:579)、米曲霉gil69772955(SEQ ID NO:580)、黑曲霉gil45249222(SEQ ID NO:581)、构巢曲霉gi67525839(SEQ ID NO:582)、米曲霉gil69785367(SEQ ID NO:583)、产黄青霉gi255955319(SEQ ID NO:584)、嗜热毁丝霉gi367019352(SEQ ID NO:585)、米曲霉gi391863974(SEQ ID NO:586)、嗜热毁丝霉gi367024513(SEQ ID NO:587)及其同源物。
因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是gap1蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：118-128、SEQ ID NO：574-587的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQ ID NO：118-128、SEQ ID NO：574-587的氨基酸序列具有100％一致性。
在一些实施方案中，gap1是里氏木霉gap1。由里氏木霉gap1编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：118所示。在其他实施方中，本公开的蛋白酶的氨基酸序列与SEQ ID NO：118具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在进一步的实施方案中，蛋白酶与SEQID NO：118具有100％一致性。
Gap2
合适的gap2蛋白酶的实例包括但不限于，里氏木霉gap2(SEQ ID NO:129)、深绿木霉jgilTriat2l298116(SEQ ID NO:130)、绿木霉jgilTriviGv29_8_2l30331(SEQ ID NO:131)、jgilTriviGv29_8_2l225131(SEQ ID NO:132)、黄曲霉gil238499183(SEQ ID NO:133)、黑曲霉gill45251555(SEQ ID NO:134)、构巢曲霉gil67901056(SEQ ID NO:135)、棒曲霉gill21711990(SEQ ID NO:136)、烟曲霉gil70986250(SEQ ID NO:137)、马尔尼菲青霉菌gil212534108(SEQ ID NO:138)、柄篮状菌gil242789335(SEQ ID NO:139)、蓝菌属真菌gil320591529(SEQ ID NO:140)、费氏新萨托菌gill 19474281(SEQ ID NO:141)、马尔尼菲青霉菌gil212527274(SEQ ID NO:142)、产黄青霉gil255940586(SEQ ID NO:143)、gill31056(SEQ ID NO:144)、嗜热毁丝霉gi367030275(SEQ ID NO:588)及其同源物。
因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是gap2蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：129-144、SEQ ID NO：588的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQ ID NO：129-144、SEQ ID NO：588的氨基酸序列具有100％一致性。
在一些实施方案中，gap2是里氏木霉gap2。由里氏木霉gap2编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：129所示。在其他实施方中，本公开的蛋白酶的氨基酸序列与SEQ ID NO：129具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在进一步的实施方案中，蛋白酶与SEQID NO：129具有100％一致性。
其他gap样蛋白酶包括但不限于，gap3(Tre70927SEQ ID NO:889)、或gap4_(Tre57575SEQ ID NO:890)及其同源物。
因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶，通常是gap3或gap4蛋白酶的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：889或SEQ ID NO：890的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQ ID NO：889-889的氨基酸序列具有100％一致性。
Sedolisin蛋白酶
Sedolisin蛋白酶是利用丝氨酸残基来水解多肽和蛋白质中的肽键的酶。Sedolisin蛋白酶通常包含独特的丝氨酸、谷氨酸和天冬氨酸催化三元组。Sedolisin蛋白酶也在氧离子洞中包含天冬氨酸残基。来自真核生物(例如木霉真菌)的sedolisin蛋白酶包括三肽基肽酶。
合适的tpp1蛋白酶的实例包括但不限于，里氏木霉tpp1(SEQ ID NO:145)、深绿木霉jgilTriat2l 188756(SEQ ID NO:146)、绿木霉jgilTriviGv29_8_2l217176(SEQ ID NO:147)、烟曲霉gil70993168(SEQ ID NO:148)、米曲霉gill69776800(SEQ ID NO:149)、黑曲霉gill45236399(SEQ ID NO:150)、棒曲霉gill21708799(SEQ ID NO:151)、黑曲霉gill45239871(SEQ ID NO:152)、棒曲霉gill21714541(SEQ ID NO:153)、土曲霉gill15387645(SEQ ID NO:154)、烟曲霉gil70982015(SEQ ID NO:155)、油菜菌核病菌gill56045898(SEQ ID NO:156)、灰霉病菌(Botryotinia fuckeliana)gill54321758(SEQID NO:157)、费氏新萨托菌gilll9499774(SEQ ID NO:158)、柄篮状菌gil242798348(SEQID NO:159)、马尔尼菲青霉菌gil212541546(SEQ ID NO:160)、小麦赤霉菌gil46114460(SEQ ID NO:161)、尖孢镰刀菌gil342890694(SEQ ID NO:162)、蓝菌属真菌gil320592937(SEQ ID NO:163)、黄萎病病原菌gil302406186(SEQ ID NO:164)、棉花黄萎病菌gil346971444(SEQ ID NO:165)、烟曲霉CAE51075.1(SEQ ID NO:556)、米曲霉XP_001820835.1(SEQ ID NO:557)、产黄青霉XP_002564029.1(SEQ ID NO:558)、构巢曲霉XP_664805.1(SEQ ID NO:559)、产黄青霉XP_002565814.1(SEQ ID NO:560)、嗜热毁丝霉XP_003663689.1(SEQ ID NO:561)、粗糙链孢霉XP_958412.1(SEQ ID NO:562)、黑曲霉XP_001394118.1(SEQ ID NO:563)、烟曲霉CAE17674.1(SEQ ID NO:564)、黑曲霉XP_001400873.1(SEQ ID NO:565)、烟曲霉CAE46473.1(SEQ ID NO:566)、米曲霉XP_002373530.1(SEQ ID NO:567)、构巢曲霉XP_660624.1(SEQ ID NO:568)、产黄青霉XP_002562943.1(SEQ ID NO:569)、烟曲霉CAE17675.1(SEQ ID NO:570)、烟曲霉EAL86850.2(SEQ ID NO:571)、粗糙链孢霉XP_961957.1(SEQ ID NO:572)、米曲霉BAB97387.1(SEQ IDNO:573)及其同源物。
因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是tpp1蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：556-573的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQ ID NO：556-573的氨基酸序列具有100％一致性。
在一些实施方案中，tpp1是里氏木霉tpp1。由里氏木霉tpp1编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：145所示。在其他实施方中，本公开的蛋白酶的氨基酸序列与SEQ ID NO：145具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在进一步的实施方案中，蛋白酶与SEQID NO：145具有100％一致性。
其他sedolisin样蛋白酶包括但不限于，sed2(Tre70962,SEQ ID NO:891)、sed3_(Tre81517SEQ ID NO:892)或sed5_(Trel 11838SEQ ID NO:893)及其同源物。
因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是sed2、sed3或sed5蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：891-893的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQ ID NO：891-893的氨基酸序列具有100％一致性。
氨肽酶蛋白酶
氨肽酶催化氨基酸从蛋白质或肽底物的氨基末端的切割。它们在动物和植物界广泛分布，并且在很多亚细胞器、细胞质以及膜成分中发现。这些肽酶中的很多，但不是所有，是锌金属酶。Amp2是双功能性酶。它是具有氨肽酶活性的白三烯A4水解酶(EC3.3.2.6)。
在木霉真菌细胞中已经鉴定了两种氨肽酶：ampl(tre81070)和amp2(trel08592)。
Amp1
合适的amp1蛋白酶的实例包括但不限于，里氏木霉amp1 81070(SEQ ID NO:759)、绿木霉74747(SEQ ID NO:760)、深绿木霉(SEQ ID NO:761)、禾谷镰刀菌(F.graminicola)XP_386703.1(SEQ ID NO:762)、构巢曲霉CBF75094.1(SEQ ID NO:763)、黑曲霉EHA21022.1(SEQ ID NO:764)、米曲霉XP_001727175.1(SEQ ID NO:765)、烟曲霉XP_749158.1(SEQ IDNO:766)、嗜热毁丝霉XP_003667354.1(SEQ ID NO:767)、禾谷镰刀菌XP_385112.1(SEQ IDNO:768)、产黄青霉XP_002567159.1(SEQ ID NO:769)、烟曲霉XP_748386.2(SEQ ID NO:770)、米曲霉XP_001819545.1(SEQ ID NO:771)、构巢曲霉XP_681714.1(SEQ ID NO:772)、粗糙链孢霉(SEQ ID NO:773)、嗜热毁丝霉XP_003665703.1(SEQ ID NO:774)及其同源物。
因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是amp1蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：759-774的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQ ID NO：759-774的氨基酸序列具有100％一致性。
在一些实施方案中，amp1是里氏木霉amp1。由里氏木霉amp1编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：759所示。在其他实施方中，本公开的蛋白酶的氨基酸序列与SEQ ID NO：759具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在进一步的实施方案中，蛋白酶与SEQID NO：759具有100％一致性。
Amp2
合适的amp2蛋白酶的实例包括但不限于，里氏木霉amp2 108592(SEQ ID NO:775)、绿木霉73611(SEQ ID NO:776)、深绿木霉284076(SEQ ID NO:777)、禾谷镰刀菌XP_390364.1(SEQ ID NO:778)、粗糙链孢霉XP_960660.1(SEQ ID NO:779)、嗜热毁丝霉XP_003662184.1(SEQ ID NO:780)、米曲霉(XP_001826499.2(SEQ ID NO:781)、黑曲霉XP_001390581.1(SEQ ID NO:782)、构巢曲霉XP_663416.1(SEQ ID NO:783)、烟曲霉XP_755088.1(SEQ ID NO:784)、产黄青霉XP_002558974.1(SEQ ID NO:785)及其同源物。
因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是amp2蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：775-785的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQ ID NO：775-785的氨基酸序列具有100％一致性。
在一些实施方案中，amp2是里氏木霉amp2。由里氏木霉amp2编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：775所示。在其他实施方中，本公开的蛋白酶的氨基酸序列与SEQ ID NO：775具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在进一步的实施方案中，蛋白酶与SEQID NO：775具有100％一致性。
Sep蛋白酶
Sep蛋白酶是属于S28亚型的丝氨酸蛋白酶。它们具有丝氨酸、天冬氨酸和组氨酸的催化三元组：丝氨酸作为亲核剂、天冬氨酸作为亲电剂，和组氨酸作为基础。这些丝氨酸蛋白酶包括几种真核酶，例如溶酶体Pro-X羧肽酶、二肽基-肽酶II和胸腺特异性的丝氨酸蛋白酶。
合适的sep1蛋白酶的实例包括但不限于，里氏木霉sep1 124051(SEQ ID NO:786)、绿木霉39211(SEQ ID NO:787)、深绿木霉296922(SEQ ID NO:788)、黑曲霉CAK45422.1(SEQ ID NO:789)、烟曲霉EDP53789.1(SEQ ID NO:790)、粗糙链孢霉XP.958301.1(SEQ ID NO:791)、嗜热毁丝霉XP_003664601.1(SEQ ID NO:792)、禾生球腔菌(M.graminicola)XP_384993.1(SEQ ID NO:793)、嗜热毁丝霉XP_003658945.1(SEQ ID NO:794)、禾谷镰刀菌XP_382380.1(SEQ ID NO:795)、黑曲霉XP_001395660.1(SEQ ID NO:796)、嗜热毁丝霉XP_003659734.1(SEQ ID NO:797)、粗糙链孢霉XP_964374.1(SEQ ID NO:798)、烟曲霉XP_756068.1(SEQ ID NO:799)、米曲霉EIT77098.1(SEQ ID NO:800)、产黄青霉XP_002560028.1(SEQ ID NO:801)、米曲霉EIT71569.1(SEQ ID NO:802)、构巢曲霉CBF79006.1(SEQ ID NO:803)、黑曲霉XP_001400740.2(SEQ ID NO:804)、米曲霉BAE57999.1(SEQ ID NO:805)及其同源物。
因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是sep1蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：786-805的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQ ID NO：786-805的氨基酸序列具有100％一致性。
在一些实施方案中，sep1是里氏木霉sep1。由里氏木霉sep1编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：786所示。在其他实施方中，本公开的蛋白酶的氨基酸序列与SEQ ID NO：786具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在进一步的实施方案中，蛋白酶与SEQID NO：786具有100％一致性。
锌金属酶
锌金属酶是催化活性需要锌的蛋白酶。
在木霉真菌细胞中已经鉴定了五种锌金属酶：mpl(tre122703)、mp2(tre122576)、mp3(tre4308)、mp4(tre53343)、mp5(tre73809)。
mpl、mp2、mp3、mp4和mp5
合适的mpl、mp2、mp3、mp4和mp5蛋白酶的实例包括但不限于，里氏木霉mpl(SEQ IDNO:875)、里氏木霉mp2(SEQ ID NO:876)、里氏木霉mp3(SEQ ID NO:877)、里氏木霉mp4(SEQID NO:878)、里氏木霉mp5(SEQ ID NO:879)。
因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是mpl、mp2、mp3、mp4或mp5蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：875-879的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQ ID NO：875-879的氨基酸序列具有100％一致性。
其他蛋白酶
其他合适的蛋白酶的实例包括但不限于，
-里氏木霉A组蛋白酶，选自：蛋白酶65735(SEQ ID NO:894)、蛋白酶77577(SEQ IDNO:895)、蛋白酶81087(SEQ ID NO:896)、蛋白酶56920(SEQ ID NO:900)、蛋白酶l22083(SEQ ID NO:911)、蛋白酶79485(SEQ ID NO:910)、蛋白酶120998(SEQ ID NO:901)或蛋白酶61127(SEQ ID NO:912)；
-里氏木霉B组蛋白酶，选自：蛋白酶21659(SEQ ID NO:905)、蛋白酶58387(SEQ IDNO:921)、蛋白酶75159(SEQ ID NO:918)、蛋白酶56853(SEQ ID NO:914)或蛋白酶64193(SEQ ID NO:908)；
-里氏木霉C组蛋白酶，选自：蛋白酶82452(SEQ ID NO:906),蛋白酶80762(SEQ IDNO:913)、蛋白酶21668(SEQ ID NO:919)、蛋白酶81115(SEQ ID NO:907)、蛋白酶82141(SEQID NO:902)、蛋白酶23475(SEQ ID NO:909)；
-里氏木霉D组蛋白酶，选自：蛋白酶121890(903)、蛋白酶22718(SEQ ID NO:904)、蛋白酶47127(SEQ ID NO:899)、蛋白酶61912(SEQ ID NO:920)、蛋白酶80843(SEQ ID NO:897)、蛋白酶66608(SEQ ID NO:923)、蛋白酶72612(SEQ ID NO:898)、蛋白酶40199(SEQ IDNO:917)；或
-里氏木霉E组蛋白酶，选自：蛋白酶22210(SEQ ID NO:915)、蛋白酶111694(SEQID NO:916)、蛋白酶82577(SEQ ID NO:922)，
及其同源物。
因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：894-923的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在某些实施方案中，蛋白酶与选自SEQ ID NO：894-923的氨基酸序列具有100％一致性。
同源蛋白酶
本公开的其他实施方案涉及降低与本公开的蛋白酶同源的蛋白酶的活性。如本文所使用，“同源性”是指参考序列和至少第二序列的片段之间的序列相似性。可以通过本领域已知的任何方法，通过使用BLAST工具将参考序列与单个第二序列或序列片段或与序列数据库相比较来鉴定同源性。如下所述，BLAST将基于百分比一致性和相似性来比较序列。
如本文所使用，在两个或更多个核苷酸或氨基酸序列的情况下，术语“相同”或百分比“一致性”是指相同的两个或更多个序列或子序列。当用以下序列比较算法之一或通过人工比对和目视检查在比较窗口或指定区域上进行最大对应的比较和比对时，如果两个序列具有特定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(例如在指定区域上或当没有指定时在整个序列上29％一致性，任选地30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％一致性)，两个序列“基本上相同”。任选地，一致性在长度至少为约50个核苷酸(或10个氨基酸)的区域，或更优选在长度为100-500或1000或更多个核苷酸(或20、50、200或更多个氨基酸)的区域内存在。
对于序列比较，通常一个序列作为参考序列，测试序列与其比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，如有必要指定子序列坐标，并指定序列对比程序的参数。可以使用默认的程序参数，或可以指定其他参数。然后序列比较算法根据程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列一致性。当比较两个序列的一致性时，序列不需要是连续的，但任何空位将会遭受罚分，降低总的百分比一致性。对于blastn，默认参数是空位开放罚分＝5，空位延伸罚分＝2。对于blastp，默认参数是空位开放罚分＝11，空位延伸罚分＝1。
如本文所使用，“比较窗口”包括具有包含但不限于20-600个，通常约50至约200个，更通常约100至约150个连续位置数任意之一的片段，其中在两个序列最佳比对后将序列与具有相同数目的连续位置的参照序列相比较。用于比较的序列的比对方法是本领域公知的。用于比较的序列的最佳比对可以通过例如以下来进行：Smith和Waterman的局部同源性算法(1981)、Needleman和Wunsch(1970)J Mol Biol 48(3):443-453的同源性比对算法、Pearson和Lipman(1988)Proc Natl Acad Sci USA 85(8):2444-2448的相似性检索方法、这些算法的计算机实现(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics ComputerGroup,575Science Dr.,Madison,Wl的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或人工比对和目视检查[参见例如Brent等,(2003)Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.(Ringbou Ed)]。
适于测定百分比序列一致性和序列相似性的算法的两个实例是BLAST和BLAST2.0算法，其分别描述于Altschul等(1997)Nucleic Acids Res 25(17):3389-3402和Altschul等(1990)J.Mol Biol 215(3)-403-410。公众可从国家生物技术信息中心获得进行BLAST分析的软件。这种算法涉及首先通过鉴定查询序列中的短字长W来鉴定高得分序列对(HSP)，当与数据库序列中的相同字长比对时，所述高得分序列对符合或满足某些正值阈值T。T是指邻域字得分阈值(Altschul等，以上)。这些初始邻域字点击是开始检索以寻找包含它们的更长HSP的种子。字点击沿着各序列以累积比对得分可以增加到的地方向两个方向延伸。
对于核酸序列，累积得分利用参数M(配对残基对的奖励得分；总是>0)和N(不配对残基的罚分；总是<0)来计算。对于氨基酸序列，利用评分矩阵类计算累积得分。当累积得分从它的最大所得值下降数量X时，当累积得分由于一个或多个负分残基比对的累积变成0或以下时，或当到达任一序列的末端时，字点击在各方向上的延伸停止。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏性和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认使用的字长(W)是11，期望值(E)是10，M＝5，N＝-4，且比较两条链。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用的字长(W)是3，期望值(E)是10，以及BLOSUM62评分矩阵[参见Henikoff和Henikoff,(1992)Proc NatlAcad Sci USA 89(22):10915-10919]比对(B)是50，期望值(E)是10，M＝5，N＝-4，且比较两条链。
BLAST算法还进行两个序列之间相似性的统计学分析(参见例如Karlin和Altschul,(1993)Proc Natl Acad Sci USA 90(12):5873-5877)。BLAST算法提供的相似性的一个度量是最小和概率(P(N))，其提供两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生配对的可能性的指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中，最小和概率小于约0.2，更优选小于约0.01，最优选小于约0.001，则认为该核酸与参考序列相似。
除以上所述的序列一致性百分比之外，两个核酸序列或多肽基本上相同的另一个指示是由第一个核酸编码的多肽与针对由第二个核酸编码的多肽的抗体具有免疫交叉反应，如下所述。因此，例如当两个肽的差别仅在于保守性替换时，多肽通常与第二个多肽基本上相同。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是两个分子或其补体在严格条件下彼此杂交，如下所述。两个核酸序列基本上相同的再一个指示是可用相同引物来扩增序列。
如在本文所公开，本公开的蛋白酶还可以包括由上述蛋白酶基因编码的蛋白酶的保守性修饰变体。如本文所使用，“保守性修饰变体”包括编码氨基酸序列的单个替换、缺失或添加，其结果是用化学相似的氨基酸替换一个氨基酸。提供功能相似的氨基酸的保守性替换表是本领域公知的。这种保守性修饰变体是本公开之外的多态性变体、种间同源物和等位基因且不排除本公开的多态性变体、种间同源物和等位基因。以下八组包含彼此是保守性替换的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L),蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)(参见例如Creighton,Proteins(1984))。
选择的丝状真菌的天冬氨酸、枯草杆菌、谷氨酸和sedolisin蛋白酶的系统发生树描述于WO2013/102674。
用于降低本发明蛋白酶活性的方法
本公开的进一步方面涉及降低表达异源多肽，例如哺乳动物多肽的丝状真菌细胞中发现的蛋白酶的活性。
可以通过本领域技术人员已知的任何方法来降低丝状真菌细胞中发现的蛋白酶的活性。
在一些实施方案中，通过降低蛋白酶的表达，例如通过启动子修饰或RNAi来实现蛋白酶活性的降低。
在其他实施方案中，通过修饰编码蛋白酶的基因来实现蛋白酶活性的降低。这种修饰的实例包括但不限于敲除突变、截断突变、点突变、错义突变、替换突变、移码突变、插入突变、重复突变、扩增突变、易位突变或反转突变和引起相应蛋白酶活性降低的那些。在编码蛋白酶的目标基因中产生至少一个突变的方法是本领域公知的，包括但不限于随机诱变和筛选、定点诱变、PCR诱变、插入诱变、化学诱变和辐射。
在某些实施方案中，修饰蛋白酶编码基因的一部分，例如编码催化结构域的区域、编码区或表达编码区所需的控制序列。这种基因的控制序列可以是启动子序列或其功能性部分，即足以影响基因表达的部分。例如，启动子序列可以失活，造成启动子不表达，或可以用弱启动子替换天然启动子序列以降低编码序列的表达。用于可能修饰的其他控制序列包括但不限于前导序列、前肽序列、信号序列、转录终止子和转录激活因子。
还可以利用基因删除技术来修饰表达重组多肽的丝状真菌细胞中存在的本公开的蛋白酶编码基因以消除或降低基因表达。基因删除技术能够部分或完全去除基因，从而消除它们的表达。在这些方法中，可以通过使用构建成连续包含基因侧翼的5’和3’区的质粒的同源重组完成基因删除。
还可以通过在基因或基因的转录或翻译所需的其控制序列中引入、替换和/或去除一个或多个核苷酸来修饰表达重组多肽的丝状真菌细胞中存在的本公开的蛋白酶编码基因。例如，可以插入或去除核苷酸以引入终止密码子、去除起始密码子或使开放阅读框移位。这些修饰可以通过本领域已知的方法完成，包括但不限于定点诱变和peR产生的诱变(参见例如Botstein和Shortie,1985,Science 229:4719；Lo等,1985,Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 81:2285；Higuchi等,1988,Nucleic AcidsResearch 16:7351；Shimada,1996,Meth.Mol.Bioi.57:157；Ho et al.,1989,Gene 77:61；Horton等,1989,Gene 77:61；以及Sarkar和Sommer,1990,BioTechniques 8:404)。
此外，可以通过基因破坏技术在基因中插入破坏性核酸构建体来修饰表达重组多肽的丝状真菌细胞中存在的本公开的蛋白酶编码基因，所述构建体包含与该基因同源的核酸片段，该片段将产生重复的同源区域并将构建体DNA整合到重复区域之间。如果插入的构建体将基因的启动子和编码区隔开或打断编码序列，从而产生无功能的基因产物，则这种基因破坏可以消除基因表达。破坏性构建体可以是简单的伴随有与基因同源的5’和3’区的可选择标记基因。可选择标记能够鉴定包含被破坏的基因的转化体。
还可以通过基因转化方法来修饰表达重组多肽的丝状真菌细胞中存在的本公开的蛋白酶编码基因(参见例如Iglesias和Trautner,1983,Molecular General Genetics189:5 73-76)。例如，在基因转化中，体外诱变对应于该基因的核酸序列以产生缺陷的核酸序列，然后将其转化进木霉菌株以产生缺陷基因。通过同源重组，缺陷的核酸序列替代内源基因。也可以期望缺陷的核酸序列还包含用于选择包含缺陷基因的转化体的标记。
还可以通过已建立的反义技术来修饰表达重组多肽的丝状真菌细胞中存在的本公开的蛋白酶编码基因，所述反义技术使用与基因的核酸序列互补的核酸序列(参见例如Parish和Stoker,1997,FEMS Microbiology Letters 154:151-157)。具体地，可以通过引入与基因的核酸序列互补的可以在菌株中转录并能够与细胞产生的mRNA杂交的核酸序列来降低或灭活丝状真菌细胞的基因表达。在允许互补反义核酸序列与mRNA杂交的条件下，翻译蛋白的量由此降低或消除。
此外，还可以通过已建立的RNA干扰(RNAi)技术来修饰表达重组多肽的丝状真菌细胞中存在的本公开的蛋白酶编码基因(参见例如WO 2005/056772和WO 2008/080017)。
还可以使用本领域公知的方法通过随机或特异性诱变来修饰表达重组多肽的丝状真菌细胞中存在的本公开的蛋白酶编码基因，所述方法包括但不限于化学诱变(参见例如Hopwood,The Isolation of Mutants in Methods in Microbiology(J.R.Norris andD.W.Ribbons,eds.)pp.363-433,Academic Press,New York,25 1970)。基因修饰可以通过以下进行：将丝状真菌细胞进行诱变，筛选其中基因表达降低或失活的突变细胞。特异性或随机诱变可以例如通过以下进行：使用合适的物理或化学诱变剂、使用合适的寡核苷酸、使DNA序列进行peR产生的诱变或它们的任意组合。物理和化学诱变剂的实例包括但不限于紫外线(UV)辐射、羟胺、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、N-甲基-N’-亚硝基胍(NTG)、O-甲基羟胺、亚硝酸、甲基磺酸乙酯(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸和核苷酸类似物。当使用这些试剂时，一般通过以下进行诱变：在合适条件下在选择的诱变剂存在下孵育待诱变的木霉细胞，然后选择基因表达降低或没有基因表达的突变体。
在某些实施方案中，本公开的蛋白酶编码基因中的至少一个突变或修饰造成改性蛋白酶的蛋白酶活性不可检测。在其他实施方案中，本公开的蛋白酶编码基因中的至少一个突变或修饰造成改性蛋白酶的蛋白酶活性比相应的未改性蛋白酶少至少25％、至少50％、至少75％、至少90％、至少95％、至少95％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％、至少600％、至少700％、至少800％、至少900％、至少1000％或更高百分比。
例如，在某些实施方案中，在木霉细胞中，本公开的蛋白酶编码基因中的至少一个突变或修饰造成总蛋白酶活性降低至相应的亲本木霉细胞的总蛋白酶活性的49％或更少，通常在至少2个不同蛋白酶基因中具有突变，或31％或更少，通常在至少3个不同蛋白酶基因中具有突变，或13％或更少，通常在至少4个不同蛋白酶基因中具有突变，或10％或更少，通常在至少5个不同蛋白酶基因中具有突变，或6.3％或更少，通常在至少6个不同蛋白酶基因中具有突变，或5.5％或更少，通常在至少7个不同蛋白酶基因中具有突变。
本发明的异源蛋白
本发明进一步涉及通过降低细胞中的蛋白酶活性增加表达异源多肽的丝状真菌细胞中这种异源多肽的生产。
如本文所用，“异源多肽”是指在本公开的丝状真菌细胞中不是天然存在(即内源)的多肽，或与内源型多肽相比在丝状真菌细胞中以升高的水平表达的多肽。在某些实施方案中，异源多肽是哺乳动物多肽。在其他实施方案中，异源多肽是非哺乳动物多肽。
哺乳动物多肽
本公开的哺乳动物多肽可以是具有目标生物活性的任何哺乳动物多肽。如本文所用，“哺乳动物多肽”是在哺乳动物中天然表达的多肽，从在哺乳动物中天然表达的多肽衍生的多肽或其片段。哺乳动物多肽还包括保留生物活性的肽和寡肽。本公开的哺乳动物多肽还可以包括组合以形成编码产物的两种或更多种多肽。本公开的哺乳动物多肽还可以进一步包括融合多肽，其包含来自至少两种不同多肽的部分或完整氨基酸序列的组合。哺乳动物多肽还可以包括任何公开的哺乳动物多肽的天然存在的等位基因和工程化变体和杂合哺乳动物多肽。
哺乳动物动态可以是天然糖基化的多肽或天然非糖基化的多肽。
合适的哺乳动物多肽的实例包括但不限于免疫球蛋白、抗体、抗原、抗菌肽、酶、生长因子、激素、干扰素、细胞因子、白细胞介素、免疫调节剂、神经递质、报告基因、报告蛋白、结构蛋白和转录因子。
合适的哺乳动物多肽的具体实例包括但不限于免疫球蛋白、免疫球蛋白重链、免疫球蛋白轻链、单克隆抗体、杂合抗体、F(ab')2抗体片段、F(ab)抗体片段、Fv分子、单链Fv抗体、二聚抗体片段、三聚抗体片段、功能性抗体片段、免疫粘附素、胰岛素样生长因子1、生长激素、胰岛素、干扰素α2b、成纤维细胞生长因子21、人血清白蛋白、骆驼抗体和/或抗体片段、单域抗体、多聚单域抗体和促红细胞生成素。
合适的哺乳动物蛋白的其他实例包括但不限于氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、连接酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、葡糖醛酸酯酶、卤素过氧化物酶、转化酶、脂肪酶、氧化酶、磷脂酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、尿激酶、白蛋白、胶原蛋白、原弹性蛋白和弹性蛋白。
非哺乳动物多肽
本公开的非哺乳动物多肽可以是具有目标生物活性的任何非哺乳动物多肽。如本文所用，“非哺乳动物多肽”是在非哺乳动物的生物，例如真菌细胞中天然表达的多肽，从在非哺乳动物的生物中天然表达的多肽衍生的多肽或其片段。非哺乳动物多肽还包括保留生物活性的肽和寡肽。本公开的非哺乳动物多肽还可以包括组合以形成编码产物的两种或更多种多肽。本公开的非哺乳动物多肽还可以进一步包括融合多肽，其包含来自至少两种不同多肽的部分或完整氨基酸序列的组合。非哺乳动物多肽还可以包括任何公开的非哺乳动物多肽的天然存在的等位基因和工程化变体和杂合非哺乳动物多肽。
合适的非哺乳动物多肽的实例包括但不限于氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质蛋白酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、葡聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶和木聚糖酶。
异源多肽生产
用包含具有降低活性的至少三种蛋白酶的本公开的丝状真菌细胞，使用本领域已知的方法通过在用于生产异源多肽的营养培养基中培养细胞来生产目标异源多肽。例如，可以在合适的培养基中，在允许多肽表达和/或分离的条件下，在实验室或工业发酵罐中通过摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的程序，在包含碳源和氮源和无机盐的合适的营养培养基中进行培养。可以从商业供货商获得或根据发表的组合物(例如在美国模式培养物保藏中心的目录中)制备合适的培养基。可以从培养基中直接回收分泌的多肽。如果多肽不是分泌的，可以从细胞裂解物中获得多肽。
可以用本领域已知的对异源多肽具有特异性的方法检测包含具有降低活性的至少三种蛋白酶的本公开的丝状真菌细胞产生的目标异源多肽。这些检测方法可以包括但不限于使用特异性抗体、高效液相色谱、毛细管色谱、酶产物的形成、酶底物的消失和SDS-PAGE。例如，可以使用酶分析来测定酶的活性。对于很多酶，用于测定酶活性的程序是本领域已知的(参见例如O.Schomburg和M.Salzmann(eds.),Enzyme Handbook,Springer-Verlag,New York,1990)。
可以通过本领域已知的方法分离所得异源多肽。例如，可以通过常规程序从培养基中分离目标异源多肽，所述常规程序包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发和沉淀。然后通过本领域已知的各种程序进一步纯化分离的异源多肽，所述程序包括但不限于色谱(例如离子交换、亲和性、疏水性、色谱聚焦和尺寸排阻)、电泳方法(例如准备的等电位焦距(IEF))、不同溶解度(例如硫酸铵沉淀)或提取(参见例如Protein Purification,J.-C.Janson and Lars Ryden,editors,VCH Publishers,New York,1989)。
制备编码异源多肽的多核苷酸
用本领域已知的合适方法制备本公开的异源多核苷酸序列，包括但不限于直接化学合成或克隆。对于直接化学合成，形成核苷酸聚合物通常涉及将3'-封闭和5'-封闭的核苷酸单体添加至延伸核苷酸链的末端5'-羟基，其中所述添加通过延伸链的末端5'-羟基的亲核性攻击添加单体(通常是磷酸衍生物，例如磷酸三酯、亚磷酰胺等)的3'-位来实现。这种方法是本领域普通技术人员已知的，且描述于相关文本和文献(例如Matteucci等,(1980)Tetrahedron Lett 21:719-722；美国专利号4,500,707；5,436,327；和5,700,637)。此外，可以通过以下从天然来源中分离所需序列：使用合适的限制性酶分裂DNA，用凝胶电泳分离片段，然后用本领域普通技术人员已知的技术(例如使用聚合酶链式反应，PCR；例如美国专利号4,683,195)从凝胶回收所需的核酸序列。
可以将本公开的各异源多核苷酸整合入表达载体。“表达载体”或“载体”是指转导、转化或感染宿主细胞，从而造成细胞表达除细胞中天然的之外的核酸和/或蛋白质(或以不是细胞天然的方式表达)的化合物和/或组合物。“表达载体”包含待通过宿主细胞表达的核酸序列(通常是RNA或DNA)。任选地，表达载体还包括有助于实现核酸进入宿主细胞的物质，例如病毒、脂质体、蛋白包被等。考虑用于本公开的表达载体包括其中可以插入核酸序列(与任何优选或所需的操作元件一起)的那些。此外，表达载体必须能够转移入细胞并在其中复制。优选的表达载体是质粒，尤其是具有完整记录的限制性位点且包含核酸序列转录优选或所需的操作元件的那些。这种质粒以及其他表达载体是本领域公知的。
单个多核苷酸的整合可以通过已知的方法完成，其包括例如使用限制性酶(例如BamHI、EcoRI、HhaI、XhoI、XmaI等)来切割表达载体如质粒中的特异性位点。限制性酶产生可以退火为多核苷酸的单链末端，所述多核苷酸具有或合成以具有与切割的表达载体的末端互补的序列。使用合适的酶，例如DNA连接酶进行退火。本领域普通技术人员将理解，表达载体和所需的多核苷酸通常用相同的限制性酶切割，从而确保表达载体的末端和多核苷酸的末端彼此互补。此外，可以使用DNA接头以促进核酸序列连接至表达载体。
还可以通过使用本领域已知的方法组合一系列的单个多核苷酸(例如美国专利号4,683,195)。
例如，初始可以在单独的PCR中制备各所需多核苷酸。然后，设计特异性引物使PCR产物末端包含互补序列。当将PCR产物混合、变性并再退火时，在3’端具有配对序列的链重叠并互相作为引物。用DNA聚合酶延伸该重叠，产生其中原始序列被“拼接”在一起的分子。以这种方式，可以将一系列单个多核苷酸“拼接”在一起并随后同时转导入宿主细胞。因此，多个多核苷酸中的每一个的表达均受影响。
然后将单个多核苷酸或“拼接的”多核苷酸整合入表达载体。本公开不限制将多核苷酸整合入表达载体的方法。本领域普通技术人员熟知将多核苷酸整合入表达载体所需的步骤。典型的表达载体包含所需的多核苷酸，前面是一个或多个调节区，和核糖体结合位点，例如大肠杆菌(E.coli)中长度为3-9个核苷酸且位于起始密码子上游3-11个核苷酸的核苷酸序列。参见Shine和Dalgarno(1975)Nature254(5495):34-38和Steitz(1979)Biological Regulation and Development(ed.Goldberger,R.R),1:349-399(Plenum,NewYork)。
如本文所用，术语“可操作连接”是指其中控制序列相对于DNA序列或多核苷酸的编码区位于合适位置，使得控制序列指引多肽表达的构型。
调节区包括例如包含启动子和操作子的那些区域。启动子可操作连接至所需多核苷酸，从而通过RNA聚合酶启动多核苷酸的转录。操作子是与启动子相邻的核酸序列，其包含阻遏蛋白可以结合的蛋白结合结构域。在缺乏阻遏蛋白的情况下，转录通过启动子启动。当存在时，对操作子的蛋白结合结构域具有特异性的阻遏蛋白结合操作子，从而抑制转录。以这种方式，基于所用的特定调节区和相应阻遏蛋白的存在或缺乏来完成转录控制。实例包括乳糖启动子(当与乳糖接触时，Lad阻遏蛋白改变构型，从而阻止Lad阻遏蛋白结合操作子)和色氨酸启动子(当与色氨酸复合时，TrpR阻遏蛋白具有结合操作子的构型；当缺乏色氨酸时，TrpR阻遏蛋白具有不结合操作子的构型)。另一个实例是tac启动子(参见de Boer等,(1983)Proc Natl Acad Sci USA 80(l):21-25)。本领域普通技术人员将理解，在本公开中可以使用这些和其他表达载体，且本公开在这方面没有限制。
尽管可以使用任何合适的表达载体来整合所需序列，容易获得的表达载体包括但不限于：质粒，例如pSC1O1、pBR322、pBBR1MCS-3、pUR、pEX、pMR100、pCR4、pBAD24、pUC19、pRS426；噬菌体，例如MI3噬菌体和λ噬菌体。当然，这种表达载体仅适于特定的宿主细胞。然而，本领域普通技术人员通过常规实验容易地确定任何具体的表达载体是否适合任何给定的宿主细胞。例如，可以将表达载体引入宿主细胞，然后监测其活性和载体中包含的序列的表达。此外，可以参考描述表达载体及其对任何特定宿主细胞的适用性的相关的文本和文献。
为本发明的目的，包括本文所述的所需异源多肽、酶和一种或多种催化结构域的表达的合适的表达载体包括以下表达载体：其包含编码所需异源多肽、酶、或与组成型或诱导型启动子可操作连接的催化结构域的多核苷酸。用于与这种多核苷酸可操作连接的特别合适的启动子的实例包括来自以下基因的启动子：gpdA、cbh1、米曲霉TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定α-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)glaA、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、米曲霉乙酰胺酶、尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶、真菌内源α-L-阿拉伯糖酶(abnA)、真菌α-L-阿拉伯呋喃糖酶A(abfA)、真菌α-L-阿拉伯呋喃糖酶B(abfB)、真菌木聚糖酶(xlnA)、真菌植酸酶、真菌ATP合成酶、真菌亚单元9(oliC)、真菌磷酸丙糖异构酶(tpi)、真菌乙醇脱氢酶(adhA)、真菌α-淀粉酶(amy)、真菌淀粉葡萄糖苷酶(glaA)、真菌乙酰胺酶(amdS)、真菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gpd)、酵母乙醇脱氢酶、酵母乳糖酶、酵母3-磷酸甘油酸激酶、酵母磷酸丙糖异构酶、细菌α-淀粉酶、细菌Spo2和SSO。这种合适的表达载体和启动子的实例还描述于其全文通过引用并入本文的WO2012/069593。
包含本发明丝状真菌细胞产生的异源多肽的药物组合物
在另一个方面，本发明提供组合物，例如药物组合物，其包含由本公开的丝状真菌细胞产生的一种或多种目标异源多肽，例如哺乳动物多肽，所述丝状真菌细胞具有活性降低的至少三种蛋白酶且进一步包含编码异源多肽的重组多核苷酸，其与药学上可接受的载体一起配制。本发明的药物组合物可以以联合疗法，即与其他试剂组合施用。例如，联合疗法可以包括目标哺乳动物多肽和至少一种其他治疗剂。
如本文所用，“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂等。优选地，载体适于静脉内、肌内、皮下、胃肠外、脊髓或表皮施用(例如通过注射或输注)。取决于施用途径，可以用材料包衣活性物质，例如目标哺乳动物多肽以保护该化合物不受酸和可能使该化合物失活的其他天然条件的作用。
本发明的药物组合物可以包括一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指保留亲本化合物的所需生物活性且不引入任何不良毒理作用的盐(参见例如Berge,S.M.,等(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19)。这种盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括衍生自无毒无机酸(例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等)的那些以及衍生自无毒有机酸(例如脂族单-和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳酸、脂族和芳族磺酸等)的那些。碱加成盐包括衍生自碱土金属(例如钠、钾、镁、钙等)的那些以及衍生至无毒有机胺(例如N,N’-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等)的那些。
本发明的药物组合物还可以包括药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
可以在本发明的药物组合物中使用的合适的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油例如橄榄油和可注射的有机酯例如油酸乙酯。可以例如通过使用包衣材料例如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需的粒径和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。
这些组合物还可以包括辅剂例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过灭菌程序和引入各种抗细菌及和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚山梨酸等来确保预防微生物的存在。还希望在组合物中引入等渗剂，例如糖、氯化钠等。此外，可以通过引入延迟吸收的试剂例如硬脂酸铝和明胶来延长可注射药物形式的吸收。
药学上可接受的载体包括无菌水性溶液或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。这种药学上活性物质的介质和试剂的使用是本领域已知的。除了与活性化合物不相容，预期在本发明的药物组合物中使用任何常规介质或试剂。还可以在组合物中加入补充的活性化合物。
治疗性组合物通常在制备和储存条件下必须无菌和稳定。可以将组合物配制成溶液、微乳剂、脂质体或适于药物高浓度的其他有序结构。载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和它们的合适混合物。可以例如通过使用包衣材料例如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需的粒径和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在很多情况下，优选在组合物中引入等渗剂，例如例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化钠等。可以通过在组合物中引入延迟吸收的试剂例如硬脂酸盐和明胶来延长可注射组合物的吸收。
可以通过以下制备无菌可注射溶液：在合适的溶剂中加入所需量的活性化合物和如有需要，以上所列成分的一种或组合，然后灭菌微滤。通常通过在无菌介质中加入活性化合物来制备分散体，所述无菌介质包括基础的分散介质和来自以上所列的所需的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，某些制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，产生活性成分和来自之前其无菌过滤溶液的任何其他所需成分的粉末。
可以与载体材料组合以产生单剂量形式的活性成分的量将根据治疗的受试者和特定的施用模式变化。可以与载体材料组合以产生单剂量形式的活性成分的量通常是产生治疗效果的组合物的量。通常，在100的百分比中，该量是约0.01％-约99％的活性成分，优选约0.1％-约70％，最优选约1％-约30％的活性成分，其与药学上可接受的载体组合。
调节剂量方案以提供最佳理想反应(例如治疗性反应)。例如，可以施用单次推注，可以在随时间施用几次分开的剂量或剂量可以根据治疗情况的紧急状态所指出按比例减少或增加。将胃肠外组合物配制成剂量单元形式以方便施用和剂量均匀是尤其有利的。本文所用的剂量单元形式是指适于待治疗受试者的单一剂量的物理上离散的单元；各单元包含计算以产生所需的治疗效果的预先确定量的活性化合物和所需的药学载体。本发明的剂量单元形式的规格由以下决定并直接取决于：(a)活性化合物的独特性质和待获得的具体治疗效果；和(b)现有技术中将这种活性化合物复合用于治疗个体敏感性的局限性。
对于施用目标哺乳动物多肽，尤其当哺乳动物多肽是抗体时，剂量为约0.001-100mg/kg，更通常为0.01-5mg/kg宿主体重。例如，剂量可以为0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重、10mg/kg体重或在1-10mg/kg范围内。示范性的治疗方案涉及每周施用一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次或每3-6个月一次。抗体的某些剂量方案可以包括通过静脉内施用1mg/kg体重或3mg/kg体重，其中用以下给药方案之一提供抗体：(i)每四周6次剂量，然后每三个月；(ii)每三周；(iii)一次3mg/kg体重，接着每三周1mg/kg体重。
或者，可以将目标哺乳动物多肽以缓释制剂施用，这种情况下所需的施用频率减少。剂量和频率根据患者中施用物质的半衰期而变化。总体上，人抗体显示最长的半衰期，其次是人源化抗体、嵌合抗体和非人抗体。施用的剂量和频率可以根据治疗是预防性或治疗性而变化。在预防性应用中，在长时间段内以相对频繁的间隔和相对少的剂量施用。一些患者在其余生持续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要相对较高的剂量和相对较短的间隔，直到疾病进展降低或终止，优选直到患者显示疾病症状部分或完全缓解。然后，患者可以施用预防性方案。
本公开的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化以获得对特定患者、组合物和施用模式有效实现所需治疗反应而不会对患者有毒的活性成分的量。所学剂量水平将取决于各种药代动力学因素，包括所用的本发明的具体组合物或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、所用的具体化合物的排泄率、治疗持续时间、与所用的具体组合物一起使用的其他药物、化合物和/或材料、治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康和以前的病史，以及医疗领域公知的类似因素。
优选本公开的免疫球蛋白的“有效治疗剂量”造成疾病症状严重度降低、疾病无症状期的频率和持续时间增加，或预防由患病引起的损伤或残疾。例如，对于肿瘤治疗，与未治疗受试者相比，“有效治疗剂量”优选抑制细胞生长或肿瘤增长至少约20％、更优选至少约40％，甚至更优选至少约60％、还更优选至少约80％。可以在预测人肿瘤疗效的动物模型系统中评估化合物抑制肿瘤生长的能力。或者，可以通过检测化合物抑制能力评估组合物的这种性质，这种抑制可通过技术人员已知的分析体外检测。治疗有效量的治疗性化合物可以降低受试者的肿瘤大小、或缓解症状。本领域普通技术人员能够根据以下因素确定这种量：受试者的大小、受试者症状的严重度，以及选择的具体组合物或施用途径。
可以使用一种或多种本领域已知的各种方法通过一种或多种施用途径施用本公开的组合物。技术人员将理解，施用途径和/或模式将根据所需结果而变化。本发明的结合部分的某些施用途径包括静脉内、肌内、皮内、腹腔内、皮下、脊髓或其他胃肠外施用途径(例如通过注射或输注)。如本文所使用，短语“胃肠外施用”是指除肠内和局部施用之外的其他施用模式，通常通过注射，其包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹腔内、经气管、皮下、表皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下、椎管内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
或者，根据本公开的哺乳动物多肽可以通过非胃肠外途径施用，例如局部、表皮或粘膜施用途径，如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部。
活性化合物可以与保护化合物不被快速释放的载体一起制备，例如控释制剂，其包括植入物、透皮贴剂和微包封的递送系统。可以使用生物可降解的生物相容的聚合物，例如乙烯-醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、多正酯类和聚乳酸。用于制备这种制剂的很多方法已经获得专利或一般是本领域技术人员已知的(参见例如Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978)。
可以使用本领域已知的医疗设备施用治疗性组合物。例如，在一些实施方案中，可以使用无针皮内注射设备，例如在美国专利号5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824或4,596,556中公开的设备施用本发明的治疗性组合物。用于本发明的公知的植入物和分子的实例包括：美国专利号4,487,603，其公开了用于以控制的速率分配用药的可植入微型输注泵；美国专利号4,486,194，其公开了用于通过皮肤施用药物的治疗设备；美国专利号4,447,233，其公开了用于以精确的输注速度递送药物的医疗输注泵；美国专利号4,447,224，其公开了用于连续药物递送的可变流量植入式输注装置；美国专利号4,439,196，其公开了具有多室隔室的渗透性药物递送系统和美国专利号4,475,196，其公开了渗透性药物递送系统。
在某些实施方案中，根据本公开的哺乳动物多肽的用途是用于治疗可用治疗性抗体治疗的任何疾病。
本发明的丝状真菌细胞
本发明还涉及通过以下增加丝状真菌细胞中异源多肽，例如哺乳动物多肽的生产水平：降低或消除表达异源多肽且催化异源多肽降解的细胞中的至少三种蛋白酶活性。降低或消除表达异源多肽的丝状真菌细胞中的蛋白酶活性增加所表达的重组多肽的稳定性，造成异源多肽的生产水平增加。可以通过例如修饰编码蛋白酶的基因来降低丝状真菌细胞中发现的蛋白酶的活性。
“丝状真菌细胞”包括来自真菌亚门(Eumycota)和卵菌亚门(Oomycota)的所有丝状形式的细胞(如Hawksworth等在Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi,8th edition,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK中所定义)。丝状真菌细胞的特征通常在于由甲壳质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其它复合多糖组成的菌丝壁。营养生长是通过菌丝伸长，且碳代谢是专性好氧的。相反，酵母例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的营养生长是通过单细胞菌体出芽，且碳代谢可以是发酵的。
本公开可以使用任何丝状真菌细胞，只要它在用核酸序列转化后和/或修饰或突变以降低蛋白酶活性后仍然存活。优选地，必要核酸序列的转导、随后蛋白(例如哺乳动物蛋白)的表达或所得中间体不会对丝状真菌细胞产生不利影响。
合适的丝状真菌细胞的实例包括但不限于来自枝顶孢霉、曲霉、镰刀菌、腐质霉属(Humicola)、毛霉菌属(Mucor)、毁丝霉属、链孢霉属、青霉属、柱霉属(Scytalidium)、梭孢壳菌属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)或木霉菌株的细胞。在某些实施方案中，丝状真菌细胞来自木霉属、支顶孢霉、曲霉、短梗霉(Aureobasidium)、隐球菌(Cryptococcus)、金孢霉、Chrysosporium lucknowense、黑粉酵母(Filibasidium)、镰刀菌、赤霉菌(Gibberella)、梨孢菌(Magnaporthe)、毛霉菌、毁丝霉、漆斑菌(Myrothecium)、新考玛脂霉(Neocallimastix)、链孢霉、拟青霉(Paecilomyces)、青霉属、瘤胃壶菌(Piromyces)、裂褶菌(Schizophyllum)、踝节菌(Talaromyces)、嗜热子囊菌(Thermoascus)、梭孢壳菌或弯颈霉菌株。
本公开的曲霉属真菌细胞可以包括但不限于棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉、棒曲霉、黄曲霉、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、烟曲霉、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉或土曲霉。
本公开的链孢霉真菌细胞可以包括但不限于粗糙链孢霉。
在某些实施方案中，丝状真菌细胞不是曲霉细胞。
在某些实施方案中，丝状真菌细胞选自木霉(里氏木霉)、链孢霉(粗糙链孢霉)、青霉(产黄青霉)、曲霉(构巢曲霉、黑曲霉和米曲霉)、毁丝霉(嗜热毁丝霉)和金孢霉(C.lucknowense)。
在一个优选的实施方案中，丝状真菌细胞是木霉真菌细胞。本公开的木霉真菌细胞可以来自野生型木霉菌株或其突变体。合适的木霉真菌细胞的实例包括但不限于哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康氏木霉(Trichoderma koningii)、长梗木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉、深绿木霉、绿木霉、绿色木霉(Trichoderma viride)；和它们另外的有性形式(即肉座菌属)。
破坏基因和培养丝状真菌细胞的一般方法，例如对于青霉，描述于Kopke等(2010)Appl Environ Microbiol.76(14):4664-74.doi:10.1128/AEM.00670-10；对于曲霉，描述于Maruyama和Kitamoto(2011),Targeted Gene Disruption in Koji Mold Aspergillusoryzae,in James A.Williams(ed.),Strain Engineering:Methods and Protocols,Methods in Molecular Biology,vol.765,DOI 10.1007/978-1-61779-197-0_27；对于链孢霉，描述于Collopy等(2010)High-throughput construction of gene deletioncassettes for generation of Neurospora crassa knockout strains.Methods MolBiol.2010；638:33-40.doi:10.1007/978-1-60761-611-5_3；和对于毁丝霉和金孢霉，描述于PCT/NL2010/000045和PCT/EP98/06496。
丝状真菌细胞成分
本公开的某些方面涉及具有活性降低或不可检测的至少三种蛋白酶且具有编码异源多肽的重组多核苷酸的丝状真菌细胞，所述异源多肽的生产水平增加，例如水平增加至少2倍。本公开的其他方面涉及具有蛋白酶活性降低或不可检测的至少两种、三种或四种选自pep9、amp1、amp2和sep1的蛋白酶的木霉或密切相关的属的真菌细胞。本公开的其他方面涉及具有蛋白酶活性降低或不可检测的至少一种或多种选自pep9、amp1、amp2、mp1、mp2、mp3、mp4、mp5和sep1的蛋白酶的木霉或密切相关的属的真菌细胞。本公开的其他方面涉及具有蛋白酶活性降低或不可检测的至少两种、三种或四种选自pep1、pep2、pep3、pep4、pep5、pep8、pep11,pep12、tsp1、slp1、slp2、slp3、slp7、gap1和gap2的蛋白酶的木霉或密切相关的属的真菌细胞，其中所述细胞进一步包含编码哺乳动物多肽的重组多核苷酸，所述哺乳动物多肽以比相应亲本木霉真菌细胞中多肽的生产水平高至少2倍的水平产生。在某些实施方案中，丝状真菌细胞或木霉真菌细胞具有活性降低或没有的至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少11种、至少12种或更多种蛋白酶。
降低的蛋白酶表达
本公开的丝状真菌细胞或木霉真菌细胞中至少三种蛋白酶的活性降低可以是蛋白酶表达降低或消除的结果。在一些实施方案中，至少三种蛋白酶表达的降低或消除是对催化结构域、编码区或表达编码各蛋白酶的基因的编码区所需的控制序列的修饰的结果。在其他实施方案中，蛋白酶表达的降低或消除是在基因或编码各蛋白酶的基因的转录或翻译所需的其控制序列中引入、替换和/或去除一个或多个核苷酸的结果。在一些实施方案中，蛋白酶表达的降低或消除是引入、重组、或用异源启动子替换蛋白酶的内源启动子或其部分的结果。本文的“异源启动子”是指可操作连接的启动子DNA序列，其对于蛋白酶不是天然的。在一些实施方案中，与其中蛋白酶通过其内源启动子表达的相应亲本丝状真菌细胞的活性相比，异源启动子降低蛋白酶活性。如果删除蛋白酶影响真菌的生长、产孢或功能，选择异源启动子使得蛋白酶在例如细胞的必要阶段(如产孢期)表达，但与其中蛋白酶通过其内源启动子表达的相应亲本菌株相比，蛋白酶的表达在异源蛋白生产期间降低或消除。
在一些实施方案中，异源启动子是组成型启动子或诱导型启动子。在一些实施方案中，异源启动子选自包含黄素的单加氧酶基因(Tre76230)、RNA聚合酶基因(Tre49048)和slp8蛋白酶基因(Tre58698)。
在一些实施方案中，具有异源启动子的降低或消除的蛋白酶是slp2，例如木霉真菌细胞或密切相关的属中的slp2。在一些具体的实施方案中，用选自以下的异源启动子替换例如木霉或密切相关的属中的slp2的内源启动子：包含黄素的单加氧酶基因(Tre76230)、RNA聚合酶基因(Tre49048)和slp8蛋白酶基因(Tre58698)。更多细节如实施例41所示。
在一些实施方案中，本发明的丝状真菌细胞包含至少一种具有异源启动子且蛋白酶活性降低或没有的内源蛋白酶，和编码异源多肽的重组多核苷酸，其中所述细胞具有蛋白酶活性降低或没有的一种或多种以下蛋白酶：pep9、amp1、amp2、mp1、mp2、mp3、mp4、mp5和sep1，和任选的一种或多种选自以下的其他蛋白酶：pep1、pep2、pep3、pep4、pep5、pep8、pep11,pep12、tsp1、slp1、slp2、slp3、slp7、gap1和gap2。
在进一步的实施方案中，蛋白酶表达的降低或消除是在编码各蛋白酶的基因中插入破坏性核酸构建体的结果，所述构建体各自包含与各基因同源的将在同源区产生重复并在重复区整合构建体DNA的核酸片段。在其他实施方案中，蛋白酶表达的降低或消除是编码各蛋白酶的基因的基因转化的结果。还在其他实施方案中，蛋白酶表达的降低或消除是通过对编码各蛋白酶的各基因具有特异性的反义多核苷酸或RNAi构建体的结果。在一个实施方案中，RNAi构建体对编码天冬氨酸蛋白酶如pep型蛋白酶、胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶如tsp1、谷氨酸蛋白酶如gap型蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶如slp型蛋白酶或sedolisin蛋白酶如tpp1或slp7蛋白酶具有特异性。在一个实施方案中，RNAi构建体对编码slp型蛋白酶的基因具有特异性。在一个实施方案中，RNAi构建体对编码slp2、slp3、slp5或slp6的基因具有特异性。在一个实施方案中，RNAi构建体对两种或更多种蛋白酶具有特异性。在一个实施方案中，所述两种或更多种蛋白酶是任何一种pep型蛋白酶、任何一种胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶、任何一种slp型蛋白酶、任何一种gap型蛋白酶、任何一种金属蛋白酶和/或任何一种sedolisin蛋白酶。在一个实施方案中，所述两种或更多种蛋白酶是slp2、slp3、slp5和/或slp6。在一个实施方案中，RNAi构建体包含表22.2中的任何一个核酸序列。
在一些实施方案中，编码蛋白酶的基因包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变。在其他实施方案中，突变降低或消除各蛋白酶的表达。在进一步的实施方案中，突变是降低或消除相应蛋白酶活性的敲除突变、截断突变、点突变、错义突变、替换突变、移码突变、插入突变、重复突变、扩增突变、易位突变、反转突变。
在一些实施方案中，突变是蛋白酶编码基因的缺失。在其他实施方案中，突变是蛋白酶编码基因中编码蛋白酶催化结构域的部分的缺失。还在其他实施方案中，突变是蛋白酶编码基因中编码蛋白酶催化结构域的部分的点突变。
破坏丝状真菌细胞的蛋白酶基因的另一种方法包括CRISPR-CAS系统，或规律成簇间隔短回文重复。CRISPR-Cas系统是基因剪辑(沉默、增强或改变特定基因)的新技术。通过插入包含cas9基因的质粒和特定设计的CRISPR，可以在任何所需位点切割生物的基因组。Cas9基因来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的II型细菌CRISPR系统。基因产物(即CAS9核酸酶)与靶向CRISPR引导RNA的特定基因组复合，且具有DNA切割活性的高位点特异性。最近已经表明，CAS9在各种异源生物中可以作为RNA-引导的内切核酸酶发挥功能(Mali等2013:Rna guided human genome engineering via Cas9.Science 339:823-826；Cong等2013:Multiplex genome engineering using CRISPR-Cas systems.Science 339:819-823；Jiang等2013:RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cassystems.Nat Biotechnol31:233-239；Jinek等2013:RNA programmed genome editing inhuman cells.eLife 2:e00471；Hwang等2013:Efficient genome editing in zebrafishusing a CRISPR-Cas system.Nat Biotech 31:227-279.DiCarlo等2013:Genomeengineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems.NAR 41:4336-4343)。
通常从RNA聚合酶III转录的启动子(最常用的是酵母的SNR52snoRNA启动子和植物和动物中的U3/U6snoRNA启动子)开始进行引导RNA的合成。认为RNA聚合酶II转录的启动子由于转录后修饰、5'加帽、5'/3'UTR和聚A尾不适于引导RNA的合成。然而，最近发现，如果引导RNA序列两侧有自处理核酶序列，则可以使用RNA聚合酶II型启动子。然后初级转录体进行自催化裂解，产生所需的gRNA序列(Gao和Zhao 2014:Self processing of ribozyme-flanked RNAs into guide RNA's in vitro and in vivo for CRISPR-mediated genomeediting.Journal of Integrative Plant Biology e-publication ahead of print；March 2014)。
实施例21例证了破坏各种蛋白酶编码基因的方法，其影响和/或阻碍里氏木霉中异源蛋白的有效生产。表21.1所示的引导RNA序列及其用于破坏木霉细胞中相应蛋白酶基因的用途也是本发明的一部分。
蛋白酶基因的组合
本公开的丝状真菌细胞或木霉真菌细胞可以包含至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种或更多种天冬氨酸蛋白酶、胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、谷氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。在某些实施方案中，蛋白酶由pep型蛋白酶基因、gap型蛋白酶基因、slp型蛋白酶基因、amp型蛋白酶基因、sep型蛋白酶基因和mp型蛋白酶基因编码。在一些实施方案中，pep型蛋白酶基因选自pep1、pep2、pep3、pep4、pep5、pep6、pep8、pep9、pep10、pep11和pep12、pep13、pep14、pep16。在其他实施方案中，gap型蛋白酶基因选自gap1和gap2。在其他实施方案中，gap型蛋白酶基因选自gap1、gap2、gap3和gap4。在进一步的实施方案中，slp型蛋白酶基因选自slp1、slp2、slp3和slp7；或选自slp1、slp2、slp3、slp5、slp6、slp7和slp8；或选自slp1、slp2、slp3、slp5、slp6、slp7和slp8和slp57433、slp35726、slp60791或slp109276。在某些优选的实施方案中，slp型蛋白酶基因是slp1。在某些实施方案中，amp型蛋白酶选自amp1和amp2。在进一步的实施方案中，sep型蛋白酶选自sep1、sed2、sed3和sed5。在进一步的实施方案中，mp型金属蛋白酶选自mp1、mp2、mp3、mp4和mp5。在其他实施方案中，蛋白酶由选自pep9、amp1、amp2、sep1、pep1、pep2、pep3、pep4、pep5、pep7、pep8、pep11、pep12、tsp1、slp1、slp2、slp3、slp5、slp6、slp7、slp8、gap1、gap2和tpp1的基因编码。在一些实施方案中，丝状真菌细胞，例如木霉细胞具有表达水平降低或没有的至少两种、三种或至少四种选自以下第一组的蛋白酶：pep9、amp1、amp2和sep1，任选地与以下选自第二组蛋白酶编码基因组合：pep1、pep2、pep3、pep4、pep5、pep8、pep11、pep12、tsp1、slp1、slp2、slp3、slp7、gap1和gap2。在一些实施方案中，丝状真菌细胞，例如木霉细胞具有表达水平降低或没有的一种或多种选自以下的蛋白酶：pep9、amp1、amp2、mp1、mp2、mp3、mp4、mp5和sep1，任选地与以下选自第二组蛋白酶编码基因组合：pep1、pep2、pep3、pep4、pep5、pep8、pep11、pep12、tsp1、slp1、slp2、slp3、slp7、gap1和gap2。在某些实施方案中，丝状真菌细胞，例如木霉细胞具有表达水平降低或没有的至少三种选自pep1、tsp1和slp1的蛋白酶编码基因。在其他实施方案中，丝状真菌细胞，例如木霉细胞具有表达水平降低或没有的至少三种选自gap1、slp1和pep1的蛋白酶编码基因。在一些实施方案中，丝状真菌细胞，例如木霉细胞具有表达水平降低或没有的蛋白酶编码基因slp2、pep1和gap1。在一些实施方案中，丝状真菌细胞，例如木霉细胞具有表达水平降低或没有的蛋白酶编码基因slp2、pep1、gap1和pep4。在一些实施方案中，丝状真菌细胞，例如木霉细胞具有表达水平降低或没有的蛋白酶编码基因slp2、pep1、gap1、pep4和slp1。在一些实施方案中，丝状真菌细胞，例如木霉细胞具有表达水平降低或没有的蛋白酶编码基因slp2、pep1、gap1、pep4、slp1和slp3。在一些实施方案中，丝状真菌细胞，例如木霉细胞具有表达水平降低或没有的蛋白酶编码基因slp2、pep1、gap1、pep4、slp1、slp3和pep3。在一些实施方案中，丝状真菌细胞，例如木霉细胞具有表达水平降低或没有的蛋白酶编码基因slp2、pep1、gap1、pep4、slp1、slp3、pep3和pep2。
在一些实施方案中，丝状真菌细胞，例如木霉细胞具有表达水平降低或没有的蛋白酶编码基因slp2、pep1、gap1、pep4、slp1、slp3、pep3、pep2和pep5。在一些实施方案中，丝状真菌细胞，例如木霉细胞具有表达水平降低或没有的蛋白酶编码基因slp2、pep1、gap1、pep4、slp1、slp3、pep3、pep2、pep5和tsp1。在一些实施方案中，丝状真菌细胞，例如木霉细胞具有表达水平降低或没有的蛋白酶编码基因slp2、pep1、gap1、pep4、slp1、slp3、pep3、pep2、pep5、tsp1和slp7。在一些实施方案中，细胞，例如木霉细胞具有蛋白酶活性降低或没有的至少12种蛋白酶，编码所述12种蛋白酶的各基因包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，所述12种蛋白酶是pep1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、slp7。在其他实施方案中，细胞例如木霉细胞具有：
(i)蛋白酶活性降低或没有的至少13种蛋白酶，编码所述13种蛋白酶的各基因包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，所述13种蛋白酶是
-pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、pep9；
-pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、slp7；或
-pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、slp3；
(ii)所述细胞具有蛋白酶活性降低或没有的至少14种蛋白酶，编码所述14种蛋白酶的各基因包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，所述14种蛋白酶是pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、pep9、slp2；
(iii)所述细胞具有蛋白酶活性降低或没有的至少15种蛋白酶，编码所述15种蛋白酶的各基因包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，所述15种蛋白酶是
-pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、pep9、slp2、mp1；或
-pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、pep9、slp2、mp5。
在其他实施方案中，本发明的丝状真菌细胞例如木霉细胞具有蛋白酶活性降低或没有的至少16种、至少17种、至少18种、至少19中或至少20种或更多种蛋白酶，且在以上记载的蛋白酶中具有13个、14个或15个突变，且进一步包含一个或多个其他突变，各其他突变降低或消除相应的其他蛋白酶活性，所述其他蛋白酶选自：
-天冬氨酸蛋白酶pep6、pep10、pep13、pep14或pep16；
-slp样蛋白酶slp57433、slp35276、slp60791或slp109276；
-gap样蛋白酶gap3或gap4；
-sedolisin样蛋白酶sed2、sed3或sed5；
-选自蛋白酶65735、蛋白酶77577、蛋白酶81087、蛋白酶56920、蛋白酶122083、蛋白酶79485、蛋白酶120998或蛋白酶61127的A组蛋白酶；
-选自蛋白酶21659、蛋白酶58387、蛋白酶75159、蛋白酶56853、或蛋白酶64193的B组蛋白酶；
-选自蛋白酶82452、蛋白酶80762、蛋白酶21668、蛋白酶81115、蛋白酶812141、或蛋白酶23475的C组蛋白酶；
-选自蛋白酶121890、蛋白酶22718、蛋白酶47127、蛋白酶61912、蛋白酶80843、蛋白酶66608、蛋白酶72612或蛋白酶40199的D组蛋白酶；或
-选自蛋白酶22210、蛋白酶111694、蛋白酶82577的E组蛋白酶。
在一些实施方案中，丝状真菌细胞，例如木霉细胞具有表达水平降低或没有的蛋白酶编码基因slp2、pep1、gap1、pep4、slp1、slp3、pep3、pep2、pep5、tsp1、slp7和slp8。在一些实施方案中，丝状真菌细胞，例如木霉细胞具有表达水平降低或没有的蛋白酶编码基因slp2、pep1、gap1、pep4、slp1、slp3、pep3、pep2、pep5、tsp1、slp7、slp8和gap2。
在某些实施方案中，丝状真菌细胞具有蛋白酶活性降低的至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种或更多种蛋白酶，其中具有野生型活性的相应蛋白酶的氨基酸序列与选自SEQ ID NO:1-16；17-36；37-57；58-65；66-81；82-97；98-117；118-128；129-144；166-181；182-185；491-588,SEQ ID NO 750-805或SEQID NO：875-923的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致性。在其中丝状真菌细胞是具有蛋白酶活性降低的一种或多种蛋白酶的木霉真菌细胞的实施方案中，其中具有野生型活性的相应蛋白酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1、17、37、58、66、82、98、118、129、166、182、507、522、530、750、759、775、SEQ ID NO:786或SEQ ID NO：875-923的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致性。
同源多肽
本公开的丝状真菌细胞或木霉真菌细胞包含编码异源多肽的重组多核苷酸。在某些实施方案中，异源多肽是哺乳动物多肽。在其他实施方案中，异源多肽是非哺乳动物多肽。
在其中丝状真菌细胞包含编码哺乳动物多肽的重组多核苷酸的实施方案中，所述哺乳动物多肽可以是非糖基化的哺乳动物多肽、糖基化的哺乳动物多肽或其组合，包括但不限于免疫球蛋白、抗体、生长因子和干扰素。在一些实施方案中，哺乳动物多肽是免疫球蛋白或抗体。在其中丝状真菌细胞包含编码免疫球蛋白或抗体的重组多核苷酸的实施方案中，所述丝状真菌细胞例如木霉真菌细胞可以具有表达降低或没有的至少两种、三种或至少四种选自pep9、amp1、amp2和sep1的蛋白酶编码基因，任选地与至少三种或四种选自pep1、pep3、pep4、pep8、pep11、pep12、tsp1、slp1、slp2、slp7、gap1和gap2的蛋白酶组合。在其中丝状真菌细胞包含编码免疫球蛋白或抗体的重组多核苷酸的实施方案中，例如木霉细胞，所述细胞具有表达水平降低或没有的一种或多种选自pep9、amp1、amp2、mp1、mp2、mp3、mp4、mp5和sep1的蛋白酶，任选地与一种或多种选自pep1、pep2、pep3、pep4、pep5、pep8、pep11、pep12、tsp1、slp1、slp2、slp3、slp7、gap1和gap2的其他蛋白酶编码基因组合。在某些优选的实施方案中，细胞例如木霉真菌细胞包含编码免疫球蛋白或抗体的重组多核苷酸，且具有表达降低或没有的蛋白酶编码基因pep1、tsp1、slp1和gap1。在其他实施方案中，细胞包含编码免疫球蛋白或抗体的重组多核苷酸，且具有表达降低的蛋白酶编码基因pep1、tsp1、slp1、gap1和pep4。在其他实施方案中，细胞包含编码免疫球蛋白或抗体的重组多核苷酸，且具有表达降低的蛋白酶编码基因slp1、slp2和slp3。在其他实施方案中，细胞包含编码免疫球蛋白或抗体的重组多核苷酸，且具有表达降低的蛋白酶编码基因slp1、slp2、slp3和tsp1。在其他实施方案中，细胞包含编码免疫球蛋白或抗体的重组多核苷酸，且具有表达降低的蛋白酶编码基因slp1、slp2、slp3、tsp1和pep1。在其他实施方案中，细胞包含编码免疫球蛋白或抗体的重组多核苷酸，且具有表达降低的蛋白酶编码基因slp1、slp2、slp3、tsp 1、pep1和gap1。在其他实施方案中，细胞包含编码免疫球蛋白或抗体的重组多核苷酸，且具有表达降低的蛋白酶编码基因slp1、slp2、slp3、tsp 1、pep1、gap1和pep4。在其他实施方案中，细胞包含编码免疫球蛋白或抗体的重组多核苷酸，且具有表达降低的蛋白酶编码基因slp1、slp2、slp3、tsp 1、pep1、gap1、pep4和pep3。在其他实施方案中，细胞包含编码免疫球蛋白或抗体的重组多核苷酸，且具有表达降低的蛋白酶编码基因slp1、slp2、slp3、tsp 1、pep1、gap1、pep4、pep3和pep2。在其他实施方案中，细胞包含编码免疫球蛋白或抗体的重组多核苷酸，且具有表达降低的蛋白酶编码基因slp1、slp2、slp3、tsp 1、pep1、gap1、pep4、pep3、pep2和pep5。在一些实施方案中，细胞例如木霉细胞包含编码免疫球蛋白或抗体的重组多核苷酸，且具有蛋白酶活性降低或没有的至少12种蛋白酶，编码所述12种蛋白酶的各基因包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，所述12种蛋白酶是pep1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、slp7。在其他实施方案中，细胞例如木霉细胞包含编码免疫球蛋白或抗体的重组多核苷酸，且具有：
(i)蛋白酶活性降低或没有的至少13种蛋白酶，编码所述13种蛋白酶的各基因包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，所述13种蛋白酶是
-pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、pep9；
-pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、slp7；或
-pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、slp3；
(ii)蛋白酶活性降低或没有的至少14种蛋白酶，编码所述14种蛋白酶的各基因包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，所述14种蛋白酶是pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、pep9、slp2；或
(iii)蛋白酶活性降低或没有的至少15种蛋白酶，编码所述15种蛋白酶的各基因包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，所述15种蛋白酶是
-pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、pep9、slp2、mp1；或
-pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、pep9、slp2、mp5。
在其他实施方案中，丝状真菌细胞例如木霉细胞包含编码免疫球蛋白或抗体的重组多核苷酸，且具有蛋白酶活性降低或没有的至少16种、至少17种、至少18种、至少19中或至少20种或更多种蛋白酶，且在以上记载的蛋白酶中具有13个、14个或15个突变，且进一步包含一个或多个其他突变，所述各其他突变降低或消除相应的其他蛋白酶活性，所述其他蛋白酶选自：
-天冬氨酸蛋白酶pep6、pep10、pep13、pep14或pep16；
-slp样蛋白酶slp57433、slp35276、slp60791或slp109276；
-gap样蛋白酶gap3或gap4；
-sedolisin样蛋白酶sed2、sed3或sed5；
-选自蛋白酶65735、蛋白酶77577、蛋白酶81087、蛋白酶56920、蛋白酶122083、蛋白酶79485、蛋白酶120998或蛋白酶61127的A组蛋白酶；
-选自蛋白酶21659、蛋白酶58387、蛋白酶75159、蛋白酶56853、或蛋白酶64193的B组蛋白酶；
-选自蛋白酶82452、蛋白酶80762、蛋白酶21668、蛋白酶81115、蛋白酶812141、或蛋白酶23475的C组蛋白酶；
-选自蛋白酶121890、蛋白酶22718、蛋白酶47127、蛋白酶61912、蛋白酶80843、蛋白酶66608、蛋白酶72612或蛋白酶40199的D组蛋白酶；或
-选自蛋白酶22210、蛋白酶111694、蛋白酶82577的E组蛋白酶。
在其他实施方案中，丝状真菌细胞包含编码生长因子、干扰素、细胞因子或白细胞介素的重组多核苷酸。在其中丝状真菌细胞例如木霉真菌细胞包含编码生长因子、干扰素、细胞因子、人血清白蛋白或白细胞介素的重组多核苷酸的实施方案中，所述丝状真菌细胞可以具有表达降低或没有的至少两种、三种或四种选自pep9、amp1、amp2和sep1的蛋白酶，任选地与至少三种或四种选自pep1、pep3、pep4、pep8、pep11、pep12、tsp1、slp1、slp2、slp7、gap1和gap2，的蛋白酶，或至少三种或至少四种选自pep1、pep2、pep3、pep4、pep5、pep8、gap1、gap2、slp1、slp2、slp7和tsp1的蛋白酶编码基因组合。
在其中丝状真菌细胞包含编码生长因子、干扰素、细胞因子、人血清白蛋白或白细胞介素的重组多核苷酸的实施方案中，例如木霉细胞，所述细胞具有表达水平降低或没有的一种或多种选自pep9、amp1、amp2、mp1、mp2、mp3、mp4、mp5和sep1的蛋白酶，任选地与第二组选自pep1、pep2、pep3、pep4、pep5、pep8、pep11、pep12、tsp1、slp1、slp2、slp3、slp7、gap1和gap2的蛋白酶编码基因组合。在某些实施方案中，细胞包含编码生长因子、干扰素、细胞因子、人血清白蛋白或白细胞介素的重组多核苷酸，且具有表达降低的蛋白酶编码基因pep1、tsp1、slp1、gap1和gap2。
在某些实施方案中，细胞包含编码生长因子、干扰素、细胞因子、人血清白蛋白或白细胞介素的重组多核苷酸，且具有表达降低的蛋白酶编码基因slp1、slp2、pep1、gap1、pep4、slp7、pep2、pep3、pep5、tsp1和gap2。在其他实施方案中，细胞例如木霉真菌细胞包含编码生长因子、干扰素、细胞因子、人血清白蛋白或白细胞介素的重组多核苷酸，且具有表达降低的蛋白酶编码基因pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2和pep4。在进一步的实施方案中，细胞包含编码生长因子的重组多核苷酸，且具有表达降低的选自pep1、pep2、pep3、pep4和pep5的pep型蛋白酶基因。
在某些优选的实施方案中，生长因子是IGF-1或干扰素是干扰素-α2b。在某些实施方案中，细胞包含编码生长因子、干扰素、细胞因子、人血清白蛋白或白细胞介素的重组多核苷酸，且具有表达降低的蛋白酶编码基因pep1、gap1和pep4。在某些实施方案中，细胞包含编码生长因子、干扰素、细胞因子、人血清白蛋白或白细胞介素的重组多核苷酸，且具有表达降低的蛋白酶编码基因pep1、gap1、pep4和slp7。在某些实施方案中，细胞包含编码生长因子、干扰素、细胞因子、人血清白蛋白或白细胞介素的重组多核苷酸，且具有表达降低的蛋白酶编码基因pep1、gap1、pep4、slp7和slp2。在某些实施方案中，细胞包含编码生长因子、干扰素、细胞因子、人血清白蛋白或白细胞介素的重组多核苷酸，且具有表达降低的蛋白酶编码基因pep1、gap1、pep4、slp7、slp2和pep2。
在某些实施方案中，细胞包含编码生长因子、干扰素、细胞因子、人血清白蛋白或白细胞介素的重组多核苷酸，且具有表达降低的蛋白酶编码基因pep1、gap1、pep4、slp7、slp2、pep2和pep3。在某些实施方案中，细胞包含编码生长因子、干扰素、细胞因子、人血清白蛋白或白细胞介素的重组多核苷酸，且具有表达降低的蛋白酶编码基因pep1、gap1、pep4、slp7、slp2、pep2、pep3和pep5。在某些实施方案中，细胞包含编码生长因子、干扰素、细胞因子、人血清白蛋白或白细胞介素的重组多核苷酸，且具有表达降低的蛋白酶编码基因pep1、gap1、pep4、slp7、slp2、pep2、pep3、pep5和slp1。在某些实施方案中，细胞包含编码生长因子、干扰素、细胞因子、人血清白蛋白或白细胞介素的重组多核苷酸，且具有表达降低的蛋白酶编码基因pep1、gap1、pep4、slp7、slp2、pep2、pep3、pep5、slp1和tsp1。
在一些实施方案中，细胞例如木霉细胞包含编码生长因子、干扰素、细胞因子、人血清白蛋白或白细胞介素的重组多核苷酸，且具有蛋白酶活性降低或没有的至少12种蛋白酶，编码所述12种蛋白酶的各基因包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，所述12种蛋白酶是pep1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、slp7。在其他实施方案中，细胞例如木霉细胞包含编码生长因子、干扰素、细胞因子、人血清白蛋白或白细胞介素的重组多核苷酸，且具有：
(i)蛋白酶活性降低或没有的至少13种蛋白酶，编码所述13种蛋白酶的各基因包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，所述13种蛋白酶是
-pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、pep9；
-pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、slp7；或
-pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、slp3；
(ii)蛋白酶活性降低或没有的至少14种蛋白酶，编码所述14种蛋白酶的各基因包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，所述14种蛋白酶是pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、pep9、slp2；或
(iii)蛋白酶活性降低或没有的至少15种蛋白酶，编码所述15种蛋白酶的各基因包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，所述15种蛋白酶是
-pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、pep9、slp2、mp1；或
-pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、pep9、slp2、mp5。
在其他实施方案中，丝状真菌细胞例如木霉细胞包含编码生长因子、干扰素、细胞因子、人血清白蛋白或白细胞介素的重组多核苷酸，且具有蛋白酶活性降低或没有的至少16种、至少17种、至少18种、至少19中或至少20种或更多种蛋白酶，且在以上记载的蛋白酶中具有13个、14个或15个突变，且进一步包含一个或多个其他突变，所述各其他突变降低或消除相应的其他蛋白酶活性，所述其他蛋白酶选自：
-天冬氨酸蛋白酶pep6、pep10、pep13、pep14或pep16；
-slp样蛋白酶slp57433、slp35276、slp60791或slp109276；
-gap样蛋白酶gap3或gap4；
-sedolisin样蛋白酶sed2、sed3或sed5；
-选自蛋白酶65735、蛋白酶77577、蛋白酶81087、蛋白酶56920、蛋白酶122083、蛋白酶79485、蛋白酶120998或蛋白酶61127的A组蛋白酶；
-选自蛋白酶21659、蛋白酶58387、蛋白酶75159、蛋白酶56853、或蛋白酶64193的B组蛋白酶；
-选自蛋白酶82452、蛋白酶80762、蛋白酶21668、蛋白酶81115、蛋白酶812141、或蛋白酶23475的C组蛋白酶；
-选自蛋白酶121890、蛋白酶22718、蛋白酶47127、蛋白酶61912、蛋白酶80843、蛋白酶66608、蛋白酶72612或蛋白酶40199的D组蛋白酶；或
-选自蛋白酶22210、蛋白酶111694、蛋白酶82577的E组蛋白酶。
在某些实施方案中，哺乳动物多肽的生产水平比不含降低的蛋白酶活性的相应亲本丝状真菌细胞中的多肽生产水平高至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少75倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍或更多倍。在其他实施方案中，哺乳动物多肽以全长版生产，且生产水平高于相应亲本丝状真菌细胞中全长版多肽的生产水平。
在其中丝状真菌细胞包含编码非哺乳动物多肽的重组多核苷酸的实施方案中，所述非哺乳动物多肽可以是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、葡聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、谷氨酰胺转胺酶或木聚糖酶。在其中丝状真菌细胞包含编码非哺乳动物多肽的重组多核苷酸的实施方案中，所述丝状真菌细胞可以具有表达降低或不可检测的至少两种、三种或四种选自pep9、amp1、amp2、mp1、mp2、mp3、mp4、mp5和sep1的蛋白酶，任选地与至少三种、至少四种、至少五种或至少六种选自pep1、pep2、pep3、pep4、pep5、pep8、pep11、pep12、tsp1、slp1、slp2、slp3、slp7、gap1和gap2的蛋白酶编码基因组合。在某些实施方案中，非哺乳动物多肽的生产水平比相应亲本丝状真菌细胞中的多肽生产水平高至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少75倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍或更多倍。在其他实施方案中，非哺乳动物多肽以全长版生产，且生产水平高于相应亲本丝状真菌细胞中全长版多肽的生产水平。
降低的其他蛋白酶的活性
在一些实施方案中，本公开的丝状真菌细胞或木霉真菌细胞还具有活性降低的一种或多种其他蛋白酶。在某些实施方案中，一种或多种其他蛋白酶的表达水平降低。在某些优选的实施方案中，编码一种或多种其他蛋白酶的各基因包含降低相应蛋白酶活性的突变。所述一种或多种其他的蛋白酶编码基因可以是pep7、tpp1、gap2、slp3、slp5、slp6、slp7、slp8，或选自以下的编码蛋白酶的基因：
-天冬氨酸蛋白酶pep6、pep10、pep13、pep14或pep16；
-slp样蛋白酶slp57433、slp35276、slp60791或slp109276；
-gap样蛋白酶gap3或gap4；
-sedolisin样蛋白酶sed2、sed3或sed5；
-选自蛋白酶65735、蛋白酶77577、蛋白酶81087、蛋白酶56920、蛋白酶122083、蛋白酶79485、蛋白酶120998或蛋白酶61127的A组蛋白酶；
-选自蛋白酶21659、蛋白酶58387、蛋白酶75159、蛋白酶56853、或蛋白酶64193的B组蛋白酶；
-选自蛋白酶82452、蛋白酶80762、蛋白酶21668、蛋白酶81115、蛋白酶812141、或蛋白酶23475的C组蛋白酶；
-选自蛋白酶121890、蛋白酶22718、蛋白酶47127、蛋白酶61912、蛋白酶80843、蛋白酶66608、蛋白酶72612或蛋白酶40199的D组蛋白酶；或
-选自蛋白酶22210、蛋白酶111694、蛋白酶82577的E组蛋白酶。
在某些实施方案中，当丝状真菌细胞是曲霉细胞时，总蛋白酶活性降低至蛋白酶活性没有降低的相应亲本曲霉细胞的总蛋白酶活性的50％或更少。
在某些实施方案中，本公开的细胞例如木霉细胞中的总蛋白酶活性降低至蛋白酶活性没有降低的相应亲本丝状真菌细胞的总蛋白酶活性的49％或更少、31％或更少、13％或更少、10％或更少、6.3％或更少或5.5％或更少。
其他重组修饰
在某些实施方案中，本公开的丝状真菌细胞或木霉真菌细胞还具有活性降低的长醇-P-Man:Man(5)GlcNAc(2)-PP-长醇甘露糖基转移酶。长醇-P-Man:Man(5)GlcNAc(2)-PP-长醇甘露糖基转移酶(EC2.4.1.130)将α-D-甘露糖残基从长醇磷酸D-甘露糖转移至膜脂连接的寡糖中。通常，长醇-P-Man:Man(5)GlcNAc(2)-PP-长醇甘露糖基转移酶由alg3基因编码。因此，在某些实施方案中，丝状真菌细胞具有活性降低的ALG3，该活性由alg3基因编码。在一些实施方案中，alg3基因包含降低相应ALG3活性的突变。在某些实施方案中，将alg3基因从丝状真菌细胞中删除。
在其他实施方案中，本公开的丝状真菌细胞或木霉真菌细胞进一步包含编码编码α-1,2-甘露糖苷酶的多核苷酸。编码α1,2-甘露糖苷酶的多核苷酸可以是宿主细胞中内源的，或它对于宿主细胞可以是异源的。这些多核苷酸在表达高甘露聚糖的丝状真菌细胞中尤其有用，所述高甘露聚糖从高尔基转移至ER而没有经过有效的外切-α-2-甘露糖苷酶的切割。α-1,2-甘露糖苷酶可以是属于糖苷水解酶家族47(cazy.org/GH47_all.html)的甘露糖苷酶I型酶。在某些实施方案中，α-1,2-甘露糖苷酶是列于cazy.org/GH47_characterized.html的酶。具体地，α-1,2-甘露糖苷酶可以是切割糖蛋白的ER型酶，例如在ERα-甘露糖苷酶EC3.2.1.113酶亚族中的酶。此类酶的实例包括人α-2-甘露糖苷酶1B(AAC26169)、哺乳动物ER甘露糖苷酶的组合或丝状真菌酶，例如α-1,2-甘露糖苷酶(MDS1)(里氏木霉AAF34579；Maras M等J Biotech.77,2000,255,或Trire 45717)。对于ER/高尔基表达，甘露糖苷酶的催化结构域通常与靶向肽，例如HDEL、KDEL，或一部分ER或早期高尔基蛋白融合，或与动物或植物甘露糖苷酶I的内源ER靶向结构一起表达，参见例如Callewaert等2001Use of HDEL-tagged Trichoderma reesei mannosyl oligosaccharide 1,2-a-D-mannosidase for N-glycan engineering in Pichia pastoris.FEBS Lett 503:173-178。
在进一步的实施方案中，本公开的丝状真菌细胞例如木霉真菌细胞还包含N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域和N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域。这种催化结构域有助于在非哺乳动物中表达复合型N-聚糖。N-乙酰葡糖胺基转移酶I(GlcNAc-TI；GnTI；EC2.4.1.101)催化UDP-N-乙酰基-D-氨基葡萄糖+3-(α-D-甘露糖基)-β-D-甘露糖基-R<＝>UDP+3-(2-(N-乙酰基-β-D-葡糖胺基)-α-D-甘露糖基)-β-D-甘露糖基-R的反应，其中R代表聚糖受体中N-连接的寡糖的剩余部分。N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域是能够催化该反应的N-乙酰葡糖胺基转移酶I的任何部分。N-乙酰葡糖胺基转移酶II(GlcNAc-TII；GnTII；EC2.4.1.143)催化UDP-N-乙酰基-D-氨基葡萄糖+6-(α-D-甘露糖基)-β-D-甘露糖基-R<＝>UDP+6-(2-(N-乙酰基-β-D-葡糖胺基)-α-D-甘露糖基)-β-D-甘露糖基-R的反应，其中R代表聚糖受体中N-连接的寡糖的剩余部分。N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域是能够催化该反应的N-乙酰葡糖胺基转移酶II的任何部分。N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域和N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域可在国际专利公布说明书WO2012/069593中发现。N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域和N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域可以由单个多核苷酸编码。在某些实施方案中，所述单个多核苷酸编码包含N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域和N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域的融合蛋白。或者，N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域可以由第一多核苷酸编码，且N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域可以由第二多核苷酸编码。
在其中丝状真菌细胞或木霉真菌细胞包含N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域和N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域的实施方案中，所述细胞还可以包含编码甘露糖苷酶II的多核苷酸。甘露糖苷酶II酶能够切割GlcNAcMan5中的Man5结构以产生GlcNAcMan3，且如果与GnTII催化结构域的作用结合，产生G0；且与半乳糖基转移酶催化结构域的作用结合，产生G1和G2。在某些实施方案中，甘露糖苷酶II型酶属于糖苷水解酶家族38(cazy.org/GH38_all.html)。此类酶的实例包括人酶ACM50302、果蝇(D.melanogaster)酶(Van denElsen J.M.等(2001)EMBO J.20:3008-3017)、具有根据PDB参照1HTY 3D结构的那些、以及参照PDB催化结构域的其他酶。对于ER/高尔基表达，甘露糖苷酶的催化结构域通常与N-末端靶向肽相融合，例如使用国际专利公开号WO2012/069593中所列的靶向肽或SEQ ID NO：589-594。用甘露糖苷酶II型甘露糖苷酶的催化结构域转化后，选择有效产生GlcNac2Man3、GlcNac1Man3或G0的菌株。
在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，丝状真菌细胞进一步包含编码UDP-GlcNAc转运子的多核苷酸。
在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，丝状真菌细胞进一步包含编码β-1,4-半乳糖基转移酶的多核苷酸。通常，β-1,4-半乳糖基转移酶属于CAZy糖基转移酶家族7(cazy.org/GT7_all.html)。有用的β4GalT酶的实例包括β4GalT1，例如牛(Bos taurus)酶AAA30534.1(Shaper N.L.等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83(6),1573-1577(1986))、人酶(Guo S.等Glycobiology 2001,11:813-20)和小家鼠(Mus musculus)酶AAA37297(Shaper,N.L.等1998J.Biol.Chem.263(21),10420-10428)。在其中丝状真菌细胞包含编码半乳糖基转移酶的多核苷酸的本发明的某些实施方案中，丝状真菌细胞还包含编码UDP-Gal4异构酶和/或UDP-Gal转运子的多核苷酸。在其中丝状真菌细胞包含编码半乳糖基转移酶的多核苷酸的本发明的某些实施方式中，在培养宿主细胞时，乳糖可以代替葡萄糖用作碳源。培养基的pH可以为4.5-7.0或5.0-6.5。在其中丝状真菌细胞含有编码半乳糖基转移酶的多核苷酸和任选的编码UDP-Gal4异构酶和/或UDP-Gal转运子的多核苷酸的本发明的某些实施方式中，可以将二价阳离子如Mn2+、Ca2+或Mg2+添加到细胞培养基中。
在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，宿主细胞中α-1,6-甘露糖基转移酶的活性水平与野生型宿主细胞中的活性水平相比降低。在某些实施方案中，丝状真菌的och1基因的表达水平与野生型丝状真菌细胞中的表达水平相比降低。
另一个方面包括在丝状真菌细胞中生产Man3GlcNAc2N-聚糖(例如Manα3[Manα6]Manβ4GlcNAcβ4GlcNAc)的方法，包括以下步骤：提供具有编码异源多肽且与野生型丝状真菌细胞中的活性水平相比活性水平降低的alg3甘露糖基转移酶的重组多核苷酸的丝状真菌细胞，和培养所述丝状真菌细胞以生产Man3GlcNAc2聚糖，其中所述Man3GlcNAc2聚糖占丝状真菌细胞分泌的中性N-聚糖的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％(mol％)。在某些实施方案中，Man3GlcNAc2N-聚糖占异源多肽的总N-聚糖的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％(mol％)。
另一个方面包括在丝状真菌细胞中生产复合型N-聚糖(例如包含末端GlcNAc2Man3结构的N-聚糖)，例如GlcNAc2Man3GlcNAc2{例如G0，即GlcNAcβ2Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Manβ4GlcNAcβ4GlcNAc}聚糖的方法，包括以下步骤：提供具有编码异源多肽、与野生型丝状真菌细胞中的活性水平相比活性水平降低的alg3甘露糖基转移酶的重组多核苷酸，且进一步包含编码N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域的多核苷酸和编码N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域的多核苷酸的丝状真菌细胞，和培养所述丝状真菌细胞以生产复合型N-聚糖，例如GlcNAc2Man3GlcNAc2聚糖，其中GlcNAc2Man3GlcNAc2聚糖占丝状真菌细胞分泌的中性N-聚糖的至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％(mol％)。在某些实施方案中，复合型N-聚糖，例如GlcNAc2Man3GlcNAc2聚糖占多肽的总N-聚糖的至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％(mol％)。在某些实施方案中，所述复合型N-聚糖是GlcNAcMan3和/或GlcNAc2Man3。
另一个方面包括在丝状真菌细胞中生产G1或G2N-聚糖或其混合物，例如GalGlcNAc2Man3GlcNAc2{例如G1,即Galβ4GlcNAcβ2Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Manβ4GlcNAcβ4GlcNAc或GlcNAcβ2Manα3(Galβ4GlcNAcβ2Manα6)Manβ4GlcNAcβ4GlcNAc}和/或Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2{例如G2,即Galβ4GlcNAcβ2Manα3(Galβ4GlcNAcβ2Manα6)Manβ4GlcNAcβ4GlcNAc}聚糖的方法，包括以下步骤：提供具有编码异源多肽且与野生型丝状真菌细胞中的活性水平相比活性水平降低的alg3甘露糖基转移酶的重组多核苷酸，且进一步包含编码N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域的多核苷酸、编码N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域的多核苷酸和编码GalT催化结构域的多核苷酸的丝状真菌细胞，和培养所述丝状真菌细胞以生产G1或G2N-聚糖或其混合物，其中G1聚糖占丝状真菌细胞分泌的中性N-聚糖的至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％(mol％)，或其中G2聚糖占丝状真菌细胞分泌的中性N-聚糖的至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％(mol％)。在某些实施方案中，G1聚糖占多肽的总N-聚糖的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％(mol％)。在某些实施方案中，G2聚糖占多肽的总N-聚糖的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％(mol％)。
在某些实施方案中，用于生产复合型N-聚糖的方法将产生不同聚糖的混合物。复合型N-聚糖或Man3GlcNAc2可以占这种聚糖混合物的至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％或更多。在某些实施方案中，多肽的N-聚糖的至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％或更多由这种聚糖混合物组成。在某些实施方案中，用于生产复合型和G1和/或G2N-聚糖的方法将产生不同聚糖的混合物。复合型N-聚糖、Man3GlcNAc2、G1和/或G2可以占这种聚糖混合物的至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％或更多。在某些实施方案中，多肽的N-聚糖的至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％或更多由这种聚糖混合物组成。
在某些实施方案中，期望生产杂合型N-聚糖的方法。如本文所用，术语“杂合型”是指包含未取代末端甘露糖残基(如在高甘露糖聚糖中存在的)和用N-乙酰葡糖胺连接取代的甘露糖残基两者的聚糖，例如GlcNAcβ2Manα3[Manα3(Manα6)Manα6)]Manβ4GlcNAcβ4GlcNAc。在这种实施方案中，用编码异源多肽的重组核苷酸和编码N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域的多核苷酸转化表达Man5{即Manα3[Manα3(Manα6)Manα6)]Manβ4GlcNAcβ4GlcNAc}的丝状真菌细胞例如里氏木霉菌株，并培养所述丝状真菌细胞以生产杂合型N-聚糖，其中所述杂合型N-聚糖占丝状真菌细胞分泌的中性N-聚糖的至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％(mol％)。在某些实施方案中，多肽的N-聚糖的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％(mol％)由杂合型N-聚糖组成。
Man3GlcNAc2、复合型、杂合型、G1和G2N-聚糖可以与选自氨基酸、肽和多肽的分子相连。在某些实施方案中，Man3GlcNAc2、复合型、杂合型、G1和G2N-聚糖与异源多肽相连。在某些实施方案中，异源多肽是糖基化蛋白。在某些实施方案中，糖基化多肽是哺乳动物多肽。在某些实施方案中，哺乳动物多肽是抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，糖基转移酶，例如GnTI、GnTII或GalT或糖基水解酶如α-1,2-甘露糖苷酶或甘露糖苷酶II包括与催化结构域连接的靶向肽。如本文所使用，术语“连接”是指对于多肽而言的氨基酸残基的两个聚合物或对于多核苷酸而言的核苷酸的两个聚合物彼此直接偶联，或者处于同一多肽或多核苷酸中但通过插入氨基酸残基或核苷酸而分离。如本文所使用，“靶向肽”是指能够将该重组蛋白质定位至丝状真菌细胞内的内质网(ER)或高尔基体(高尔基)的重组蛋白的任意数目的连续氨基酸残基。靶向肽可以在催化结构域的N-末端或C-末端。在某些实施方案中，靶向肽在催化结构域的N-末端。在某些实施方案中，靶向肽提供与ER或高尔基膜的直接结合。靶向肽的成分可以来自通常驻留在ER或高尔基体的任何酶。这样的酶包括甘露糖苷酶、甘露糖基转移酶、糖基转移酶、2型高尔基体蛋白质及MNN2、MNN4、MNN6、MNN9、MNN10、MNS1、KRE2、VAN1和OCH1酶。合适的靶向肽描述于国际专利公开号WO2012/069593。在一个实施方案中，GnTI或GnTII的靶向肽是人GnTII酶。在其他实施方案中，靶向肽衍生自木霉Kre2、Kre2-样、Och1、Anp1和Van1。在一个实施方案中，靶向肽选自SEQ ID NO：589-594。
本发明的丝状真菌细胞的用途
本文的发明进一步涉及使用本公开的任何丝状真菌细胞，例如木霉真菌细胞来改进异源多肽稳定性和制备异源多肽的方法，所述真菌细胞具有蛋白酶活性降低或没有的至少三种蛋白酶且包含编码以升高水平生产的异源多肽，例如哺乳动物多肽的重组多核苷酸。测量蛋白稳定性和制备异源多肽的方法是公知的，包括但不限于在本公开中所述的所有方法和技术。
因此，本公开的某些实施方案涉及通过以下改进异源多肽稳定性的方法：a)提供具有活性降低或没有的至少三种蛋白酶的本公开的丝状真菌细胞，其中所述细胞进一步包含编码异源多肽的重组多核苷酸；和b)培养所述细胞以表达异源多肽，其中所述异源多肽与不包含编码蛋白酶的基因的突变的宿主细胞相比稳定性增加。本公开的其他实施方案涉及通过以下改进哺乳动物多肽稳定性的方法：a)提供具有活性降低或没有的至少三种蛋白酶的本公开的木霉真菌细胞，其中所述细胞进一步包含编码哺乳动物多肽的重组多核苷酸；和b)培养所述细胞以表达哺乳动物多肽，其中所述哺乳动物多肽与不包含编码蛋白酶的基因的突变的宿主细胞相比稳定性增加。丝状真菌细胞或木霉真菌细胞可以是名为“本发明的丝状真菌细胞”章节中所述的任何细胞。测量多肽稳定性和培养丝状真菌和木霉真菌细胞的方法是本领域公知的，包括但不限于本公开中所述的所有方法和技术。
在某些实施方案中，异源多肽或哺乳动物多肽的稳定性比相应亲本丝状真菌或木霉真菌细胞中表达的异源多肽或哺乳动物多肽高至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少75倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍或更多倍。
本公开的其他实施方案涉及通过以下制备异源多肽的方法：a)提供具有活性降低或没有的至少三种蛋白酶的本公开的丝状真菌细胞，其中所述细胞进一步包含编码异源多肽的重组多核苷酸；b)培养所述宿主细胞以表达异源多肽；和c)纯化异源多肽。本公开的进一步的实施方案涉及通过以下制备哺乳动物多肽的方法：a)提供具有活性降低或没有的至少三种蛋白酶的本公开的丝状真菌细胞，其中所述细胞进一步包含编码哺乳动物多肽的重组多核苷酸；b)培养所述宿主细胞以表达哺乳动物多肽；和c)纯化哺乳动物多肽。丝状真菌细胞或木霉真菌细胞可以是名为“本发明的丝状真菌细胞”章节中所述的任何细胞。培养丝状真菌和木霉真菌细胞以及纯化多肽的方法是本领域公知的，包括但不限于本公开中所述的所有方法和技术。
在某些实施方案中，在选自pH3.5-7；pH 3.5-6.5；pH 4-6；pH 4.3-5.7；pH 4.4-5.6；和pH 4.5-5.5的pH范围培养丝状真菌细胞或木霉真菌细胞。在某些实施方案中，为了生产抗体，在选自pH4.7-6.5；pH 4.8-6.0；pH 4.9-5.9；和pH 5.0-5.8的pH范围培养丝状真菌细胞或木霉真菌细胞。
在一些实施方案中，异源多肽是哺乳动物多肽。在其他实施方案中，异源多肽是非哺乳动物多肽。
在某些实施方案中，哺乳动物多肽选自免疫球蛋白、免疫球蛋白重链、免疫球蛋白轻链、单克隆抗体、杂合抗体、F(ab')2抗体片段、F(ab)抗体片段、Fv分子、单链Fv抗体、二聚抗体片段、三聚抗体片段、功能性抗体片段、单域抗体、多聚单域抗体、免疫粘附素、胰岛素样生长因子1、生长激素、胰岛素和促红细胞生成素。在其他实施方案中，哺乳动物蛋白是免疫球蛋白或胰岛素样生长因子1。还在其他实施方案中，哺乳动物蛋白是抗体。在进一步的实施方案中，哺乳动物多肽的产量是至少0.5、至少1、至少2、至少3、至少4或至少5g/L。在某些实施方案中，哺乳动物多肽是抗体，任选的，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在进一步的实施方案中，抗体的产量是至少0.5、至少1、至少2、至少3、至少4或至少5g/L。还在其他实施方案中，哺乳动物多肽是生长因子或细胞因子。在进一步的实施方案中，生长因子或细胞因子的产量是至少0.1、至少0.2、至少0.3、至少0.4、至少0.5、至少1、至少1.5、至少2、至少3、至少4或至少5g/L。在进一步的实施方案中，哺乳动物多肽是抗体，且所述抗体包含不具有额外氨基酸残基的天然抗体C-末端和N-末端的至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％。在其他实施方案中，哺乳动物多肽是抗体，且所述抗体包含不缺少任何C-末端或N-末端氨基酸残基的天然抗体C-末端和N-末端的至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％。
在其中从细胞培养物中纯化哺乳动物多肽的某些实施方案中，包含哺乳动物多肽的培养物包含多肽片段，所述多肽片段的质量百分比占所产生多肽的质量的少于50％、少于40％、少于30％、少于20％或少于10％。在某些优选的实施方案中，哺乳动物多肽是抗体，多肽片段是重链片段和/或轻链片段。在其他实施方案中，当哺乳动物多肽是抗体且从细胞培养物中纯化抗体时，包含抗体的培养物包含游离的重链和/或轻链，其质量百分比占所产生多肽的质量的少于50％、少于40％、少于30％、少于20％或少于10％。用于测定多肽片段的质量百分比的方法是本领域公知的，包括从SDS-凝胶测量信号强度。
在进一步实施方案中，非哺乳动物多肽选自氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质蛋白酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、葡聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶和木聚糖酶。
在任何公开方法的某些实施方案中，所述方法包括提供一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种蛋白酶抑制剂的进一步的步骤。在某些实施方案中，蛋白酶抑制剂是与哺乳动物多肽共表达的肽。在其他实施方案中，抑制剂抑制至少两种、至少三种、或至少四种选自天冬氨酸蛋白酶、胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和谷氨酸蛋白酶的蛋白酶家族的蛋白酶。
在任何公开方法的某些实施方案中，丝状真菌细胞或木霉真菌细胞还包含载体蛋白。如本文所使用，“载体蛋白”是丝状真菌细胞或木霉真菌细胞内源的且通过丝状真菌细胞或木霉真菌细胞高度分泌的蛋白部分。合适的载体蛋白包括但不限于里氏木霉甘露聚糖酶I(Man5A或MAN I)、里氏木霉纤维二糖水解酶II(Cel6A或CBHII)(参见例如Paloheimo等Appl.Environ.Microbiol.2003December；69(12):7073-7082)或里氏木霉纤维二糖水解酶I(CBHI)的那些。在一些实施方案中，载体蛋白是CBHI。在其他实施方案中，载体蛋白是截断的里氏木霉CBHI蛋白，其包括CBHI核心区和一部分CBHI接头区。在一些实施方案中，载体例如纤维二糖水解酶或其片段与抗体轻链和/或抗体重链融合。在一些实施方案中，载体例如纤维二糖水解酶或其片段与胰岛素样生长因子1、生长激素、胰岛素、干扰素α2b、成纤维细胞生长因子21或人血清白蛋白融合。在一些实施方案中，载体-抗体融合多肽包含Kex2切割位点。在一些实施方案中，Kex2或其他载体切割酶是丝状真菌细胞内源的。在某些实施方案中，载体切割蛋白酶是丝状真菌细胞异源的，例如源自酵母或TEV蛋白酶的另一种Kex2蛋白。在某些实施方案中，载体切割酶过表达。在某些实施方案中，载体由里氏木霉CBHI蛋白(GenBank登录号EGR44817.1)N末端部分的约469-478个氨基酸组成。在一个实施方案中，编码异源糖蛋白(例如抗体)的多核苷酸进一步包含编码CBHI催化结构域的多核苷酸和作为载体蛋白的接头、和/或cbh1启动子。在某些实施方案中，本发明的丝状真菌细胞过表达KEX2蛋白酶。在一个实施方案中，异源糖蛋白(例如抗体)作为融合构建体表达，所述融合构建体包含内源的真菌多肽、蛋白酶位点例如Kex2切割位点、和异源蛋白例如抗体重链和/或轻链。在Kex2切割位点之前的有用的2-7个氨基酸的组合已经描述于例如Mikosch等(1996)J.Biotechnol.52:97-106；Goller et al.(1998)Appl Environ Microbiol.64:3202-3208；Spencer等(1998)Eur.J.Biochem.258:107-112；Jalving等(2000)Appl.Environ.Microbiol.66:363-368；Ward等(2004)Appl.Environ.Microbiol.70:2567-2576；Ahn等(2004)Appl.Microbiol.Biotechnol.64:833-839；Paloheimo等(2007)ApplEnviron Microbiol.73:3215-3224；Paloheimo等(2003)Appl Environ Microbiol.69:7073-7082；and Margolles-Clark等(1996)Eur J Biochem.237:553-560。
应当理解，当本发明与其某些具体的实施方案一起描述，以上描述意欲说明而不限制本发明的范围。在本发明范围内的其他方面、优势和修饰是本发明所涉及的领域的技术人员显而易见的。
已经描述了本发明，以下实施例以说明的方式而不是限制的方式来说明本发明。
具体实施方式
在里氏木霉和具有缺陷蛋白酶活性的相应里氏木霉细胞中某些蛋白酶的鉴定已经描述于其内容通过引用并入本文的WO2013/102674的实施例1-23中。
实施例1-制备缺失质粒
基本上如WO2013/102674的实施例1中pep1缺失质粒pTTv41所述构建以下缺失质粒，除了用于选择的标志物是来自pTTv213或pTTv194的pyr4-hgh或pyr4。
amp1缺失质粒
选择958bp的5’侧翼区和994bp的3’侧翼区作为amp1缺失质粒pTTv240的基础。用来自amp1 5’侧翼区末端的367bp延伸作为直接重复片段。使用表1-1所列的引物通过PCR扩增这些片段。侧翼区PCR所用的模板来自里氏木霉野生型菌株QM6a。用琼脂糖凝胶电泳分离产物，使用标准实验室方法用Gel Extraction试剂盒(Qiagen)从凝胶中分离正确片段。用NotI消化从pTTv213(Δpep2-pyr-hph，参见WO2013/102674的实施例14)获得pTTv240所用的pyr4-hph选择标记物。为了能够去除pyr4-hgh标志物盒，在盒的两端引入NotI限制性位点。在amp1 5’直接重复和3’侧翼之间引入AscI位点。载体骨架是EcoRI/XHoI消化的PRS426，并用5’侧翼、3’侧翼、5’直接重复、pyr4-hph标志物和载体骨架使用WO2013/102674的实施例1所述的酵母同源重组方法构建质粒pTTv240。amp1的缺失质粒(pTTv240，表1-1)造成amp1基因座的缺失，并覆盖AMP1的完整编码序列(tre81070)。
表1-1：用于制备amp1缺失质粒的引物
缺失质粒pTTv240(Δamp1-pyr4-hph)，载体骨架pRS426
amp2缺失质粒
选择918bp的5’侧翼区和978bp的3’侧翼区作为amp2缺失质粒pTTv271的基础。使用表1-2所列的引物通过PCR扩增这些片段。侧翼区PCR所用的模板来自里氏木霉野生型菌株QM6a。用琼脂糖凝胶电泳分离产物，使用标准实验室方法用Gel Extraction试剂盒(Qiagen)从凝胶中分离正确片段。用NotI消化从pTTv194(Δpep4-pyr-hph)获得pyr4-hph盒。为了能够去除标志物盒，在盒的两端引入NotI限制性位点。载体骨架是EcoRI/XHoI消化的PRS426，并用5’侧翼、3’侧翼、pyr4-hph标志物和载体骨架使用酵母同源重组方法构建质粒pTTv271。
如下制备另一个amp2缺失质粒(pTTv327)。用来自amp2 5’侧翼末端的311bp延伸作为直接重复片段。使用表1-3所列的引物通过PCR扩增片段。用琼脂糖凝胶电泳分离产物，从凝胶中分离正确片段。用NotI消化从pTTv210(Δsep1-pyr4-hph)获得pyr4-hph盒。为了能够去除标志物盒，在盒的两端引入NotI限制性位点。在amp2 5’直接重复和3’侧翼之间引入AscI位点。载体骨架是EcoRI/XHoI消化的PRS426，如WO2013/102674的实施例1所述构建质粒。
amp2的缺失质粒(pTTv271和pTTv327)造成amp2基因座的2143bp缺失，并覆盖AMP2的完整编码序列(tre08529)。
表1-2：用于制备amp2缺失质粒的引物
缺失质粒pTTv271(Δamp2-pyr4-hph)，载体骨架pRS426
表1-3：用于制备amp2缺失质粒的引物
缺失质粒pTTv327(Δamp2-pyr4-hph)，载体骨架pRS426
sep1缺失质粒
第一个sep1缺失质粒pTTv210包含1099bp的5’侧翼区和806bp的3’侧翼区、作为直接重复片段的来自sep1 5’侧翼末端的300bp延伸、pyr4-hph双选择标志物和里氏木霉天然kex2的表达构建体(tre123561；启动子cDNAI-kex2-终止子cbh2)。使用表1-4所列的引物通过PCR扩增除pyr4之外的所有其他片段。侧翼区、直接重复、kex2和终止子的PCR所用的模板来自里氏木霉野生型菌株QM6a。cDNAI启动子和hph标志物的模板是质粒。用NotI消化从pTTv181获得pyr4标志物(pTTv181描述于WO2013/102674的实施例4中)。为了能够去除pyr4-hph标志物盒，在盒的两端引入NotI限制性位点。在sep1 5’直接重复和3’侧翼之间引入AscI位点。用琼脂糖凝胶电泳分离产物，用Gel Extraction试剂盒(Qiagen)从凝胶中分离正确片段。载体骨架是EcoRI/XHoI消化的PRS426。如上所述，用以上所有八个片段和载体骨架使用如上所述的酵母同源重组方法构建质粒pTTv210。
通过用AscI消化从pTTv210去除KEX2过表达盒构建第二个sep1缺失质粒pTTv247。用琼脂糖凝胶电泳分离片段，用Gel Extraction试剂盒(Qiagen)从凝胶中分离载体部分。用T4DNA连接酶和标准实验室方法通过自连接克隆pTTv247。
如下构建第三个sep1缺失质粒pTTv255。选择1099bp的5’侧翼区和806bp的3’侧翼区作为基础，并用来自sep1 5’侧翼区末端的300bp延伸作为直接重复片段。使用表1-4所列的引物通过PCR扩增这些片段。用NotI消化从pTTv181获得pyr4盒。为了能够去除标志物盒，在盒的两端引入NotI限制性位点。在sep1 5’直接重复和3’侧翼之间引入AscI位点。载体骨架是EcoRI/XHoI消化的PRS426，并用以上酵母同源重组方法构建质粒。
缺失质粒pTTv210、pTTv247和pTTv255造成sep1基因座的2519bp缺失，并覆盖SEP1的完整编码序列(tre124051)。
表1-4：用于制备sep1缺失质粒的引物
缺失质粒pTTv210(Δsep1-pyr4-hph，kex2)，载体骨架pRS426
缺失质粒pTTv247(Δsep1-pyr4-hph)，载体骨架pTTv210
缺失质粒pTTv255(Δsep1-pyr4)，载体骨架pRS426
pep9缺失质粒
选择918bp的5’侧翼区和978bp的3’侧翼区作为pep9缺失质粒pTTv267的基础。使用表1-5所列的引物通过PCR扩增这些片段。侧翼区PCR所用的模板来自里氏木霉野生型菌株QM6a。用琼脂糖凝胶电泳分离产物，用Gel Extraction试剂盒(Qiagen)从凝胶中分离正确片段。用NotI消化从pTTv194(Δpep4-pyr-hph)获得pyr4-hph盒。为了能够去除标志物盒，在盒的两端引入NotI限制性位点。载体骨架是EcoRI/XHoI消化的PRS426，并用5’侧翼、3’侧翼、pyr4-hph标志物和载体骨架使用酵母同源重组方法构建质粒。该pep9的缺失质粒(pTTv267，表1-5)造成pep9基因座的1448bp缺失，并覆盖PEP9编码序列(tre79807)的大部分。
表1-5：用于制备pep9缺失质粒的引物
缺失质粒pTTv267(Δpep9-pyr4-hph)，载体骨架pRS426
用上述质粒pTTv267作为骨架构建第二个pep9缺失质粒pTTv421。用NotI消化从pTTv267去除具有pyr4 5DR的phy4-hph双标志物。用NotI消化从具有egl2缺失的源自pTTv264的质粒获得新标志物phy4-hph。为了能够去除标志物盒，在盒的两端引入NotI限制性位点。在pep9 3’直接重复和5’侧翼之间引入FseI位点。用来自pep9 3’侧翼开始的321bp延伸作为直接重复片段。部分的cbh2终止子用作克隆中的桥。使用表1-6所列的引物通过PCR扩增这两个片段。
用上述质粒pTTv421作为骨架构建第三个pep9缺失质粒pTTv426。用NotI消化从pTTv421去除phy4-hph双标志物。用NotI消化从pTTv181(Δpep4-pyr4)获得pyr4标志物。在室温下用T4DNA连接酶使用快速连接进行质粒pTTv426的克隆。用电穿孔将部分连接混合物转化入大肠杆菌。使用标准实验室方法培养几个克隆，分离并消化质粒DNA以筛选正确连接。通过测序进一步验证标志物的正确连接和方向。这些pep9缺失质粒(pTTv421和pTTv426，表1-6)造成pep9基因座的1448bp缺失，并覆盖PEP9编码序列(tre79807)的大部分。
表1-6：用于制备pep9缺失质粒pTTv421和pTTv426的引物
缺失质粒pTTv421(Δpep9-pyr4-hph)，载体骨架pTTv267
缺失质粒pTTv426(Δpep9-pyr4)，载体骨架pTTv421
slp7缺失质粒
除了表1-7中使用的其他引物，基本上如pTTv269所述构建slp7(tre123865)缺失质粒pTTv329，从pTTv210(Δsep1-pyr4-hph)获得pyr4-hgh盒，并在slp7 5’直接重复和3’侧翼之间引入AscI位点。表1-7：用于制备slp7缺失质粒pTTv329的其他引物
缺失质粒pTTv329(Δslp7-pyr4-hph)，载体骨架pRS426
slp3缺失质粒
slp3(tre123234)缺失质粒pTTv116描述于WO2013/102674的实施例3。该缺失质粒造成slp3基因座的1597bp缺失，并覆盖SLP3的完整编码序列。
用pTTv116作为骨架克隆第二个slp3缺失质粒pTTv420。通过NotI消化从pTTv116去除标志物。用NotI消化从具有egl2缺失的源自pTTv264的质粒获得新标志物phy4-hph。为了能够去除标志物盒，在盒的两端引入NotI限制性位点。在slp3 3’直接重复和5’侧翼之间引入FseI位点。用来自slp3 3’侧翼开始的300bp延伸作为直接重复片段。部分的cbh2终止子用作克隆中的桥。使用表1-8所列的引物通过PCR扩增这两个片段。用琼脂糖凝胶电泳分离产物，用Gel Extraction试剂盒(Qiagen)从凝胶中分离正确片段。如上所述使用酵母同源重组方法构建质粒。
用上述质粒pTTv420作为骨架构建第三个slp3缺失质粒pTTv425。用NotI消化从pTTv420去除phy4-hph双标志物。用NotI消化从pTTv181(Δpep4-pyr4)获得pyr4标志物。在室温下用T4DNA连接酶使用快速连接进行质粒pTTv425的克隆。用电穿孔将部分连接混合物转化入大肠杆菌。使用标准实验室方法培养几个克隆，分离并消化质粒DNA以筛选正确连接。通过测序进一步验证标志物的正确连接和方向。这三个slp3缺失质粒(pTTv116、pTTv420和pTTv425，表1-8)造成slp3基因座的1597bp缺失，并覆盖SLP3的完整编码序列。
表1-8：用于制备slp3缺失质粒pTTv420和pTTv425的引物
缺失质粒pTTv420(Δslp3-pyr4-hph)，载体骨架pTTv116
缺失质粒pTTv425(Δslp3-pyr4)，载体骨架pTTv420
使用slp2RNAi的pep2缺失质粒
将载体pTTv217和pTTv263(两个载体均沉默slp2)的选择标志物换成pyr4-hgh双标志物。用NotI限制性酶消化载体，并从琼脂糖凝胶纯化载体。用NotI消化从pTTv194(Δpep4-pyr4-hgh)获得pyr4-hgh标志物。将新的双标志物与载体连接在一起并转化入DH5α化学感受态大肠杆菌。扩增并纯化所得载体pTTv376和pTTv405。
实施例2-制备具有sep1缺失的10倍蛋白酶缺失菌株(M659)
为了制备10倍蛋白酶缺失菌株，基本上如WO2013/102674实施例3中从菌株M195(Δpep1)除去pyr4blaster盒所述，从9倍缺失菌株M574(WO2013/102674实施例4所述)中除去pyr4标志物。进行连续的5-FOA选择步骤以确保选择的克隆来自单个细胞。
用表25-1所列的引物通过PCR验证最终克隆。在多数克隆中获得与成功去除blaster盒相应的信号。还通过将克隆涂板至含有或不含5mM尿苷的基本培养基板上进一步验证blaster盒的去除。将所得的用于制备10倍蛋白酶缺失菌株的菌株命名为菌株号M597。
为了去除载体序列，用MssI消化质粒pTTv255(Δsep1-pyr4)，用QIAquick GelExtraction试剂盒(Qiagen)从琼脂糖凝胶纯化正确片段。用约5μg的缺失盒转化9倍蛋白酶缺失菌株M597(Δpep1 Δtsp1 Δslp1 Δgap1 Δgap2 Δpep4 Δpep3 Δpep5 Δpep2，pyr4-)。基本上如WO2013/102674中使用pyr4选择的菌株M181和M195所述进行原生质体的制备和转化。
挑选转化体作为第一条划线。通过PCR(使用表2-1所列的引物)筛选正确整合的生长划线。将显示预期信号的克隆纯化为单个细胞克隆，并用表2-1所列的引物再次筛选。使用上述方法通过Southern分析从所选克隆(图1A、B、C)中验证sep1缺失。将克隆48-70C命名为菌株号M633。对菌株M633应用额外的单细胞纯化步骤以获得10倍蛋白酶缺失菌株M569(克隆48-70C-2)。
表2-1：用于筛选来自9倍蛋白酶缺失菌株的pyr4blaster盒的去除和用于筛选pTTv255/Δsep1-pyr4整合和菌株纯度的引物
用于筛选来自M574的pyr4blaster盒的去除和菌株纯度
用于筛选pTTv255(Δsep1-pyr4)的整合
用于筛选sep1ORF的缺失
实施例3-制备具有slp8缺失的11倍蛋白酶缺失菌株(M750)
枯草杆菌样蛋白酶slp8(tre58698)的缺失质粒pTTv330描述于WO2013/102674的实施例12。
为了制备11倍蛋白酶缺失菌株，基本上如上所述，从10倍缺失菌株M633中除去pyr4标志物。进行连续的5-FOA选择步骤以确保选择的克隆来自单个细胞。
用表3-1所列的引物通过PCR验证最终克隆。在多数克隆中获得与成功去除blaster盒相应的信号。还通过将克隆涂板至含有或不含5mM尿苷的基本培养基板上进一步验证blaster盒的去除。将所得的用于制备11倍蛋白酶缺失菌株的菌株命名为菌株号M637(克隆1-G)。
为了去除载体序列，用MssI+SbfI消化质粒pTTv330(Δslp8-pyr4-hph)，用QIAquick Gel Extraction试剂盒(Qiagen)从琼脂糖凝胶纯化正确片段。用约5μg的缺失盒转化10倍蛋白酶缺失菌株M637(Δpep1 Δtsp1 Δslp1 Δgap1 Δgap2 Δpep4 Δpep3Δpep5 Δpep2 Δsep1，pyr4-)。基本上如上所述进行原生质体的制备和转化。
挑选转化体作为第一条划线。通过PCR(使用表3-1所列的引物)筛选正确整合的生长划线，并将显示预期信号的克隆纯化为单个细胞克隆，用表3-1所列的引物再次筛选。使用上述方法通过Southern分析从所选克隆(图2A、B、C)中验证slp8缺失。将克隆54-131-2命名为菌株号M750。
表3-1：用于筛选来自10倍蛋白酶缺失菌株的pyr4blaster盒的去除和用于筛选pTTv330/Δslp8-pyr4-hph整合和菌株纯度的引物
用于筛选来自M633的pyr4blaster盒的去除和菌株纯度
用于筛选pTTv330(Δslp8-pyr4-hph)的整合
用于筛选slp8ORF的缺失
实施例4-制备具有amp2缺失的12倍蛋白酶缺失菌株(M893)
为了制备12倍蛋白酶缺失菌株，基本上如上所述，从11倍缺失菌株M750中除去pyr4-hph双标志物。进行连续的5-FOA选择步骤以确保选择的克隆来自单个细胞。
用表4-1所列的引物通过PCR验证最终克隆。在多数克隆中获得与成功去除blaster盒相应的信号。还通过将克隆涂板至含有或不含5mM尿苷的基本培养基板上进一步验证blaster盒的去除。此外，还在含有或不含5mM尿苷的潮霉素板上测试克隆。在不含尿苷补充的板上或如果板包含潮霉素，则没有观察到生长。将所得的用于制备12倍蛋白酶缺失菌株的不含标志物的菌株命名为菌株号M780(克隆1AH)。
为了去除载体序列，用MssI+SbfI消化质粒pTTv327(Δamp2-pyr4-hph)，并用QIAquick Gel Extraction试剂盒(Qiagen)从琼脂糖凝胶纯化正确片段。用超过6μg的缺失盒转化11倍蛋白酶缺失菌株M780(Δpep1 Δtsp1 Δslp1 Δgap1 Δgap2 Δpep4 Δpep3Δpep5 Δpep2 Δsep1 Δslp8，pyr4-，hph-)。基本上如上所述进行原生质体的制备和转化。
挑选转化体作为第一条划线。通过PCR(使用表4-1所列的引物)筛选正确整合的生长划线，并将显示预期信号的克隆纯化为单个细胞克隆，用表4-1所列的引物再次筛选。通过Southern分析从所选克隆(图3A、B、C)中验证amp2缺失。将克隆59-6A命名为菌株号M893。表4-1：用于筛选来自11倍蛋白酶缺失菌株的pyr4-hph blaster盒的去除和用于筛选pTTv327/Δamp2-pyr4-hph整合和菌株纯度的引物
用于筛选来自M750的pyr4-hph blaster盒的去除和菌株纯度
用于筛选pTTv327(Δamp2-pyr4-hph)的整合
用于筛选amp2ORF的缺失
实施例5-具有Δpep1 Δtsp1 Δslp1 Δgap1 Δgap2 Δpep4 Δpep3 Δpep5Δpep2 Δsep1 Δslp8 Δamp2 Δslp7缺失的13倍蛋白酶缺失菌株
为了制备13倍蛋白酶缺失菌株，基本上如上所述，从12倍缺失菌株M893(59-6A，M780中的pTTv327)中除去pyr4-hph双标志物。进行连续的5-FOA选择步骤以确保选择的克隆来自单个细胞。
用表5-1所列的引物通过PCR验证最终克隆。在多数克隆中获得与成功去除blaster盒相应的信号。还通过将克隆涂板至含有或不含5mM尿苷的基本培养基板上进一步验证blaster盒的去除。此外，还在含有或不含5mM尿苷的潮霉素板上测试克隆。在不含尿苷补充的板上或如果板包含潮霉素，没有观察到生长。将所得的用于制备13倍蛋白酶缺失菌株的不含标志物的菌株命名为菌株号M901(克隆1A2)。
为了去除载体序列，并用MssI+SbfI消化质粒pTTv329(Δslp7-pyr4-hph)，用QIAquick Gel Extraction试剂盒(Qiagen)从琼脂糖凝胶纯化正确片段。用约10μg的缺失盒转化12倍蛋白酶缺失菌株M901(Δpep1 Δtsp1 Δslp1 Δgap1 Δgap2 Δpep4 Δpep3Δpep5 Δpep2 Δsep1 Δslp8 Δamp2，pyr4-，hph-)。如上所述进行原生质体的制备。用修改的原生质体转化方法进行转化。在该方法中，如上所述将DNA引入原生质体，但改变用于涂板的培养基和方法。转化板和第一顶层琼脂是包含用于稳定渗透性的1M山梨醇的马铃薯葡萄糖琼脂培养基。将原生质体添加至第一顶层琼脂，混合，倒至PD琼脂板上，使其在室温下再生几个(2-4)小时。短暂再生后，在第一顶层琼脂上倒入包含10g/l山梨糖、10g/l纤维二糖、10g/l酵母提取物、1M山梨醇、5g/l(NH4)2SO4(+琼脂&盐)和150μg/ml潮霉素B的第二顶层琼脂。
挑选转化体作为第一条划线。通过PCR(使用表5-1所列的引物)筛选正确整合的生长划线。将显示预期信号的克隆纯化为单个细胞克隆，并用表5-1所列的引物再次筛选。
表5-1：用于筛选来自12倍蛋白酶缺失菌株的pyr4-hph blaster盒的去除和用于筛选pTTv329/Δslp7-pyr4-hph整合和菌株纯度的引物
用于筛选来自M893的pyr4-hph blaster盒的去除和菌株纯度
用于筛选pTTv329(Δslp7-pyr4-hph)的整合
用于筛选slp7ORF的缺失
实施例6-用slp3制备13倍蛋白酶缺失菌株
为了制备13倍蛋白酶缺失菌株，基本上如上所述，从12倍缺失菌株M893中除去pyr4-hph双标志物。进行连续的5-FOA选择步骤以确保选择的克隆来自单个细胞。
用表6-1所列的引物通过PCR验证最终克隆。在多数克隆中获得与成功去除blaster盒相应的信号。还通过将克隆涂板至含有或不含5mM尿苷的基本培养基板上进一步验证blaster盒的去除。此外，还在含有或不含5mM尿苷的潮霉素板上测试克隆。将所得的用于制备13倍蛋白酶缺失菌株的不含标志物的菌株命名为菌株号M901(克隆1A2)。
为了去除载体序列，用MssI消化质粒pTTv425(Δslp3-pyr4)，并从琼脂糖凝胶纯化正确片段。用约5μg的缺失盒转化12倍蛋白酶缺失菌株M901(Δpep1 Δtsp1 Δslp1 Δgap1 Δgap2 Δpep4 Δpep3 Δpep5 Δpep2 Δsep1 Δslp8 Δamp2，pyr4-，hph-)。如上所述进行原生质体的制备和转化。挑选转化体作为第一条划线。通过PCR(使用表6-1所列的引物)筛选正确整合的生长划线，将显示预期信号的克隆纯化为单个细胞克隆，并通过PCR用表6-1所列的引物再次筛选。
表6-1：用于筛选来自12倍蛋白酶缺失菌株的pyr4-hph blaster盒的去除和用于筛选pTTv425/Δslp3-pyr4整合和菌株纯度的引物
用于筛选来自M893的pyr4-hph blaster盒的去除和菌株纯度
用于筛选pTTv425(Δslp3-pyr4)的整合
用于筛选slp3ORF的缺失
实施例7-用pep9制备13倍蛋白酶缺失菌株
为了制备13倍蛋白酶缺失菌株，基本上如上所述，从12倍缺失菌株M893中除去pyr4-hph双标志物。进行连续的5-FOA选择步骤以确保选择的克隆来自单个细胞。
用表7-1所列的引物通过PCR验证最终克隆。在多数克隆中获得与成功去除blaster盒相应的信号。通过将克隆涂板至含有或不含5mM尿苷的基本培养基板上进一步验证blaster盒的去除。此外，还在含有或不含5mM尿苷的潮霉素板上测试克隆。将所得的用于制备13倍蛋白酶缺失菌株的不含标志物的菌株命名为菌株号M901(克隆1A2)。
为了去除载体序列，用MssI消化质粒pTTv426，并从琼脂糖凝胶纯化正确片段。用约5μg的缺失盒转化12倍蛋白酶缺失菌株M901(Δpep1 Δtsp1 Δslp1 Δgap1 Δgap2 Δpep4 Δpep3 Δpep5 Δpep2 Δsep1 Δslp8 Δamp2，pyr4-，hph-)。如上所述进行原生质体的制备和转化。挑选转化体作为第一条划线。通过PCR(使用表7-1所列的引物)筛选正确整合的生长划线，将显示预期信号的克隆纯化为单个细胞克隆，并通过PCR用表7-1所列的引物再次筛选。
表7-1：用于筛选来自12倍蛋白酶缺失菌株的pyr4-hph blaster盒的去除和用于筛选pTTv426/Δpep9-pyr4整合和菌株纯度的引物
用于筛选来自M893的pyr4-hph blaster盒的去除和菌株纯度
用于筛选pTTv426(Δpep9-pyr4)的整合
用于筛选pep9ORF的缺失
实施例8-从产生干扰素的菌株M577制备9倍蛋白酶缺失菌株
制备具有amp1缺失的9倍缺失菌株
为了去除缺失盒，用PmeI消化质粒pTTv240(Δamp1-pyr4-hph)，并用QIAquickGel Extraction试剂盒(Qiagen)纯化正确片段。用约5μg的缺失盒转化产生干扰素α2b的8倍蛋白酶缺失菌株M577(Δpep1 Δtsp1 Δslp1 Δgap1 Δgap2 Δpep4 Δpep3 Δpep5；参见WO2013/102674的实施例18)。基本上如上所述使用潮霉素选择进行原生质体的制备和转化。
挑选转化体并在选择板上划线。通过PCR(使用表8-1所列的引物)筛选正确整合的生长划线。将显示预期信号的克隆纯化为单个细胞克隆，并通过PCR用表8-1所列的引物再次筛选。将克隆108A命名为菌株号M669。
表8-1：用于筛选pTTv240/Δamp1-pyr4-hph整合和菌株纯度的引物
用于筛选pTTv240(Δamp1-pyr4-hph)的整合
用于筛选amp1ORF的缺失
制备具有slp7缺失的9倍缺失菌株
丝氨酸蛋白酶slp7(tre123865)的缺失质粒pTTv269描述于WO2013/102674的实施例11。
为了去除缺失盒，用PmeI消化质粒pTTv269(Δslp7-pyr4-hph)，并用QIAquickGel Extraction试剂盒(Qiagen)纯化正确片段。用约5μg的缺失盒转化8倍蛋白酶缺失菌株M577(Δpep1 Δtsp1 Δslp1 Δgap1 Δgap2 Δpep4 Δpep3 Δpep5；参见以上)。基本上如上所述使用潮霉素选择进行原生质体的制备和转化。
挑选转化体并在选择板上划线。通过PCR(使用表8-2所列的引物)筛选正确整合的生长划线。将显示预期信号的克隆纯化为单个细胞克隆，并通过PCR用表8-2所列的引物再次筛选。将克隆5.64命名为菌株号M673。
表8-2：用于筛选pTTv269/Δslp7-pyr4-hgh整合和菌株纯度的引物
用于筛选pTTv269(Δslp7-pyr4-hgh)的整合
用于筛选slp7ORF的缺失
制备具有amp2缺失的9倍缺失菌株
为了去除缺失盒，用PmeI消化质粒pTTv271(Δamp2-pyr4-hgh)，并用QIAquickGel Extraction试剂盒(Qiagen)纯化正确片段。用约5μg的缺失盒转化8倍蛋白酶缺失菌株M577。
挑选转化体并在选择板上划线。通过PCR(使用表8-3所列的引物)筛选正确整合的生长划线。将显示预期信号的克隆纯化为单个细胞克隆，并通过PCR用表8-3所列的引物再次筛选。将克隆24A命名为菌株号M674。
表8-3：用于筛选pTTv271/Δamp2-pyr4-hgh整合和菌株纯度的引物
用于筛选pTTv271(Δamp2-pyr4-hgh)的整合
用于筛选slp7ORF的缺失
制备具有sep1缺失的9倍缺失菌株
为了去除缺失盒，用PmeI消化质粒pTTv247(Δsep1-pyr4-hgh)，并用QIAquickGel Extraction试剂盒(Qiagen)纯化正确片段。用约5μg的缺失盒转化8倍蛋白酶缺失菌株M577。
挑选转化体并在选择板上划线。通过PCR(使用表8-4所列的引物)筛选正确整合的生长划线。将显示预期信号的克隆纯化为单个细胞克隆，并通过PCR用表8-4所列的引物再次筛选。将克隆47.1命名为菌株号M668。
表8-4：用于筛选pTTv247/Δsep1-pyr4-hgh整合和菌株纯度的引物
用于筛选pTTv247(Δsep1-pyr4-hgh)的整合
用于筛选slp7ORF的缺失
制备具有pep9缺失的9倍缺失菌株
为了去除缺失盒，用PmeI消化质粒pTTv267(Δpep9-pyr4-hgh)，并用QIAquickGel Extraction试剂盒(Qiagen)纯化正确片段。用约5μg的缺失盒转化8倍蛋白酶缺失菌株M577。
挑选转化体并在选择板上划线。通过PCR(使用表8-5所列的引物)筛选正确整合的生长划线。将显示预期信号的克隆纯化为单个细胞克隆，并通过PCR用表8-5所列的引物再次筛选。将转化体77命名为菌株号M671。
表8-5：用于筛选pTTv267/Δpep9-pyr4-hgh整合和菌株纯度的引物
用于筛选pTTv267(Δpep9-pyr4-hgh)的整合
用于筛选pep9ORF的缺失
实施例9-在24孔培养中生产干扰素的9倍蛋白酶缺失菌株
在不含硫酸铵但含有柠檬酸二铵、100mM PIPPS、20g/L麦糟提取物、40g/L乳糖，pH4.5的TrMM中于28℃在24孔培养中振摇生长9倍蛋白酶缺失菌株。进行免疫印迹来检测干扰素α2b。用水稀释上清液，将0.5μl各上清液上样至4-20％的标准凝胶(Criterion Gel)。与LSB+BME混合，并于95℃加热5分钟。用Turbo半干印迹纸将蛋白质转移7分钟至硝化纤维素。用TBST中的5％牛奶封闭硝化纤维素膜1小时。用0.5μg/ml在TBST中稀释的小鼠抗干扰素α2b抗体(Abcam#ab9386)检测干扰素蛋白。将第一抗体与膜在室温下振摇孵育1小时。除去第一抗体，用TBST洗涤膜。第二抗体是在TBST中以1:10000稀释的山羊抗-小鼠AP偶联物(BioRad cat#170-6520)。将第二抗体在室温下振摇孵育1小时，除去该抗体，在室温下振摇洗涤膜1小时。用AP底物(Promega)显色印迹。
观察第7天的培养样品，发现对干扰素稳定性有巨大影响。Slp7和amp2缺失菌株继续生产干扰素，而干扰素在M577对照和amp1和sep1缺失菌株中并不稳定。结果如图4所示。
实施例10-在发酵罐培养中生产干扰素的9倍蛋白酶缺失菌株
在发酵罐中分批培养表达干扰素的9倍蛋白酶缺失菌株。将它们在添加有20g/L酵母提取物、40g/L纤维素、80g/L纤维二糖和40g/L山梨糖，pH4.5的TrMM中生长，其中温度在48h从28℃变为22℃。进行这些培养，并将其命名为培养物编号FTR108_R1(M668)、FTR108_R2(M669)、FTR108_R6(M673)和FTR108_R7(M674)。
用水和样品缓冲液稀释上清液，并在每个孔中上样0.1μl。如以上用24孔培养所描述，进行免疫印迹程序以检测干扰素α2b。
发酵罐培养的结果可见于图5。使用表示50、100和200ng干扰素的标准量制作标准曲线。亲本M577对照培养在第3天产生0.84g/L干扰素。具有amp2蛋白酶缺失的M674菌株是总体上改进最大的菌株，在第3天提供2.4g/L。amp2蛋白酶的缺失使干扰素生产提高2.9倍。Slp7蛋白酶缺失菌株M673在第4天达到2.1g/L。这相对于亲本菌株M577提高2.5倍。M668中的Sep1蛋白酶缺失分泌1.38g/L干扰素。菌株M671中的pep9缺失也将干扰素表达水平提高至1.03g/L。具有amp1缺失的M669菌株在这些培养条件下产生0.36g/L(数据未显示)。
还在添加或不添加SBTI抑制剂下培养菌株M674(Δamp2)。培养基是添加有20g/L酵母提取物、40g/L纤维素、80g/L纤维二糖和40g/L山梨糖，pH4.5的TrMM，其中温度在48h从28℃变为22℃。进行不含SBTI抑制剂的Triab125培养，用STBI抑制剂加料(目标浓度是0.4mg/ml)进行Triab126。
SBTI抑制剂改进了干扰素表达水平，参见图6。第4天的基本水平是1.4g/L，但用抑制剂处理，干扰素表达可以在第5天增加至4.5g/L。添加抑制剂将峰表达的天数移至第5天，其表示上清液中干扰素的稳定更高。
用水稀释上清液，使得10μl体积中的0.025μl可以上样至4-20％SDS-PAGE凝胶。用1μg/ml在TBST中稀释的Abcam(#ab9386)抗IFN-α2b抗体进行免疫检测。第二抗体是在TBST中以1:5000稀释的来自Bio-rad(#170-6520)的山羊抗-小鼠IgG AP偶联的第二抗体。将对应200ng、100ng和50ng全长IFN-α2b的蛋白质标准上样至凝胶。
实施例11-从生产干扰素的菌株M788(M577的pyr4-)制备具有pep2缺失和slp2RNAi的9倍蛋白酶缺失菌株M960
生产干扰素的菌株M577在进行最后蛋白酶缺失的pep5基因座具有pyr4标志物。为了去除pyr4环出标志物，将M577置于5FOA板上。通过PCR筛选存活克隆以检查pyr4标志物的存在和整合。在含有和不含尿苷的基本培养基琼脂板上测试通过PCR不具有双标志物的克隆。选择在不含有尿苷的板上不能生长的那些克隆作为标志物环出克隆。选择一个pyr4-阴性克隆成为菌株M788。用于筛选的引物如下表11-1所示。
表11-1
用于筛选pyr4-hgh标志物的整合
用于筛选标志物的缺失
为了去除缺失盒，用PmeI消化质粒，并用QIAquick Gel Extraction试剂盒(Qiagen)纯化正确片段。用约5μg的缺失盒转化生产干扰素α2b的8倍蛋白酶缺失菌株M788(Δpep1 Δtsp1 Δslp1 Δgap1 Δgap2 Δpep4 Δpep3 Δpep5；pyr4-)。基本上如上所述进行原生质体的制备和转化。设计沉默盒以整合入pep2基因座(tre53961)。
挑选转化体并在选择板上划线。通过PCR(使用表11-2所列的引物)筛选正确整合的生长划线。将显示预期信号的克隆纯化为单个细胞克隆，并通过PCR用表11-2所列的引物再次筛选。转化体pTTv376产生名为M960的菌株，且pTTv405产生M961菌株。
表11-2：用于筛选pTTv376和pTTv405/Δpep2-pyr4-hgh整合和菌株纯度的引物
用于筛选pTTv376和pTTv405(Δpep2-pyr4-hgh)的整合
用于筛选pep2ORF的缺失
在24孔板中培养
在24孔培养中生长来自pTTv376和pTTv405转化的两个转化体以将它们的干扰素生产与对照菌株M577相比较。在不含硫酸铵但含有柠檬酸二铵、100mM PIPPS、20g/L麦糟提取物、40g/L乳糖，pH4.5的TrMM中于28℃振摇生长菌株。各转化体使用重复的孔。将第5天从24孔培养取出的样品用于免疫印迹。用水稀释上清液，将0.2μl各上清液上样至4-20％的标准凝胶。与LSB+BME混合，并于95℃加热5分钟。用Turbo半干印迹纸将蛋白质转移7分钟至硝化纤维素。用TBST中的5％牛奶封闭硝化纤维素膜1小时。用0.5μg/ml在TBST中稀释的小鼠抗干扰素α2b抗体(Abcam#ab9386)检测干扰素蛋白。将第一抗体与膜在室温下振摇孵育1小时。除去第一抗体，用TBST洗涤膜。第二抗体是在TBST中以1:30000稀释的山羊抗-小鼠IRDye 680RD偶联物(Li-cor#926-68070)。将第二抗体在室温下振摇孵育1小时，除去第二抗体，在扫描膜之前用TBST洗涤膜1小时。用Odyssey CLx近红外显像系统(Li-cor，Inc.)在700nm扫描膜。
24孔培养的结果可见于图7。具有slp沉默的两个菌株菌产生大量干扰素。最佳pTTv405转化体405b产生427mg/L干扰素，将其命名为菌株号M960。最佳pTTv376转化体376a产生高达534mg/L干扰素，被称为菌株M961。对照菌株(M577)达到200mg/L。与对照菌株相比，M961菌株和M960菌株在该培养中分别产生2.7倍和2.1倍更多的干扰素。
发酵
在1L发酵罐中，在含有20g/L酵母提取物、40g/L纤维素、80g/L纤维二糖和40g/L山梨糖，pH4.5的TrMM中分批培养这两个菌株，其中温度在48h从28℃变为22℃。分别用M960和M961进行Triab152和Triab153培养。用水和上样染料稀释上清液样品，使得在每个孔中上样0.05μl上清液。如以上对于干扰素所描述进行免疫印迹检测。使用表示400、200、100、50和25ng的干扰素的标准量来构建标准曲线以测定表达浓度。
在Triab152培养中，M960菌株在第3天产生1.4g/L(图8)，M577菌株在第3天产生1.2g/L(数据未显示)。菌株M961在第4天达到3.2g/L，比亲本菌株M577的干扰素高2.7倍。
实施例12-将异源蛋白引入蛋白酶缺失菌株
为了在本发明的任何蛋白酶缺失菌株中制备产生MAB01抗体的里氏木霉菌株，用MAB01轻链和重链构建体(pTTv98、pTTv99、pTTv67、pTTv101、pTTv102和/或pTTv223,还参见WO2013/102674的实施例1-3)转化菌株，并如上所述用潮霉素和乙酰胺选择。为了制备利妥昔单抗抗体，将具有协调的与CBHI载体融合的重链和与CBHI载体融合的轻链的构建体转化入如上所述的蛋白酶缺失的里氏木霉菌株。
可以应用实施例23的本发明方法在不同蛋白酶缺失背景中表达不同抗体片段(Fab、多聚单域抗体(sd-Ab)和scFV)。用于该目的的基因表达盒的结构通常基于纤维二糖水解酶I(cbh1)基因的调控元件(启动子和终止子)。修饰CBHI蛋白的催化结构域以去除内含子序列，并将其用作融合伴侣以增强抗体片段的表达和分泌。在融合伴侣之间插入Kex2蛋白酶的识别基序以促进抗体片段从CBHI载体蛋白的共分泌性释放，且同源区在表达盒两侧以允许靶向整合入里氏木霉cbh1基因座。
用如上所述纯化的表达盒转化里氏木霉蛋白酶缺失菌株，并选择合适的选择标志物。分别用以下引物通过PCR筛选在cbh1基因座中同源整合入表达盒的转化体：在构建体的5’侧翼区片段之外的正向引物，和在修饰的CBHI催化结构域(5’整合)之内的反向引物，以及在选择标志物基因之内的正向引物，和在3’侧翼区片段(3’整合)之外的反向引物。用上述相同的引物组合通过PCR再次确认破坏盒的正确整合，并使用靶向cbh1开放阅读框的引物组合验证亲本CBHI基因座的缺失。还对所有克隆应用Southern杂交来验证破坏盒的正确整合。
如之前所述在发酵和摇瓶条件下培养转化的里氏木霉菌株。在培养过程中收集样品，分析生产水平，例如通过上述的亲和液相色谱。通过SDS-PAGE检查纯化样品的质量。
实施例13-蛋白酶缺失菌株的糖工程化
制备产生G0的菌株
WO2013/102674的实施例19描述了alg3缺失质粒pTTg156(人全长GnTI和人全长GnT2)和pTTg173(Kre2N-末端与人GnT1的催化结构域和全长人GnT2融合)的制备。
用pTTg156和pTTg173的PmeI片段转化里氏木霉MAB01表达菌株。将各种量的转化体(取决于构建体为100-170)挑选至选择板上，并基于PCR筛选，选择关于5’-和3’-整合具有阳性结果的克隆用于单孢涂板，用WO2013/102674的实施例19的表19.3所述的引物再次筛选整合和alg3缺失。将PCR筛选的菌株进行摇瓶和发酵培养，在合适的天数获得样品，将样品进行抗体浓度和聚糖分析。
制备产生GlcNacMan5的菌株
WO2013/102674的实施例21描述了靶向肽和人GnT1质粒pTTv274(人GnT2的N-末端部分)、pTTv275(里氏木霉Kre2的N-末端部分)和pTTv278(里氏木霉Och1的N-末端部分)的催化结构域的融合蛋白的质粒的制备。
用PmeI从以上质粒中释放用于转化的片段。将所有片段分别转化入表达MAB01(或抗体例如利妥昔单抗)的菌株，并基本上如上所述进行原生质体转化。
筛选5’-和3’-整合入egl2基因座的在选择划线上生长良好的克隆。额外筛选双重整合-阳性克隆中egl2ORF的缺失。通过单孢涂板纯化提供期望结果的克隆，并通过PCR验证单孢衍生的克隆作为纯的整合菌株。将选择的菌株进行摇瓶和发酵培养，在合适的天数获得样品，将样品进行抗体浓度和聚糖分析。
对于N-聚糖分析，根据制造商的说明用Protein G HP MultiTrap 96孔过滤板(GEHealthcare)从培养上清液中纯化MAB01，通过UV吸收根据MAB01标准曲线测定抗体浓度。用pH7.3的20mM磷酸钠缓冲液中的PNGase F(ProZyme Inc.)于37℃反应过夜从EtOH沉淀和SDS变性的抗体中释放N-聚糖。释放的N-聚糖用Hypersep C-18和Hypersep Hypercarb(Thermo Scientific)纯化，并用MALDI-TOF MS分析。
实施例14-蛋白酶同源物
从其他生物中鉴定里氏木霉sep1、amp1、amp2和pep9同源物
用国家生物技术信息中心(NCBI)非冗余氨基酸数据库，用里氏木霉蛋白酶氨基酸序列作为查询进行BLAST检索。用DOE联合基因组研究所的网址(分别是绿木霉Gv29-8v2.0和深绿木霉v2.0)进行绿木霉和深绿木霉的BLAST检索。用EBI提供的ClustalW2或ClustalOmega比对工具比对来自BLAST检索的序列点击。还使用序列比对产生系统发生树。
图9描绘选择的丝状真菌的amp1和amp2的系统发生树。
图10描绘选择的丝状真菌的sep1的系统发生树。
图11描绘选择的丝状真菌的pep9的系统发生树。
实施例15-蛋白酶缺陷的里氏木霉菌株的蛋白酶活性测量
根据EnzChek蛋白酶分析试剂盒(分子探针#E6638,绿色荧光酪蛋白底物)从第2-7天的1x-7x蛋白酶缺陷菌株的上清液样品中测定蛋白浓度。简言之，用柠檬酸钠缓冲液将上清液稀释至相同的总蛋白浓度，并将等量的稀释上清液添加至黑色的96孔板，每个样品使用3个重复的孔。将在柠檬酸钠缓冲液中制备的酪蛋白FL稀释母液添加至各含有上清液的孔，用塑料袋覆盖于37℃孵育板。在2、3和4小时后测量孔中的荧光。用485nm激发和530nm发射在Varioskan荧光板读数器上读数。一些蛋白酶活性的测量根据制造商的方案用琥珀酰酪蛋白(QuantiCleave蛋白酶分析试剂盒,Pierce#23263)进行。
相比于野生型M124菌株，pep1单缺失将蛋白酶活性降低了1.7倍，pep1/tsp1双缺失将蛋白酶活性降低了2倍，pep1/tsp1/slp1三缺失将蛋白酶活性降低了3.2倍，pep1/tsp1/slp1/gap1四缺失将蛋白酶活性降低了7.8倍，pep1/tsp1/slp1/gap1/gap2五倍缺失将蛋白酶活性降低了10倍，pep1/tsp1/slp1/gap1/gap2/pep4六倍缺失将蛋白酶活性降低了15.9倍，pep1/tsp1/slp1/gap1/gap2/pep4/pep3七倍缺失将蛋白酶活性降低了18.2倍。
图20图示描绘了来自各蛋白酶缺失上清液(从1倍至7倍缺失突变体)和亲本菌株M124的培养物上清液的归一化的蛋白酶活性数据。前5个菌株在pH5.5测量蛋白酶活性，后3个缺失菌株在pH4.5测量蛋白酶活性。将蛋白酶活性比对绿色荧光酪蛋白。6倍蛋白酶缺失菌株仅有野生型亲本菌株的6％，7倍蛋白酶缺失菌株的蛋白酶活性比6倍蛋白酶缺失菌株的活性少约40％。
实施例16-在13倍蛋白酶缺失菌株中生产IGF1
由质粒生成IGF1表达盒以表达不含有任何载体切割位点或纯化标签的IGF1和CBHI载体的融合蛋白，所述质粒包含cbh1启动子、终止子和3’侧翼和amdS标志物。设计构建体以整合入在天然cbh1启动子和终止子控制下的cbh1基因座。用PmeI从载体中将表达构建体切割出来，并通过标准方法纯化。使用AmdS选择标记物在13倍蛋白酶缺失菌株M1076中进行木霉转化(通过缺失pep9(tre79807)从M901制备M1076)。通过PCR筛选缺少cbh1orf且表达盒正确整合入基因座的转化体。
CBHI载体序列：
(SEQ ID NO：924)
表达的IGF1蛋白序列：
(SEQ ID NO：925)
在1L发酵罐中，在含有20g/L酵母提取物、40g/L纤维素、100g/L纤维二糖、40g/L山梨糖，pH4.5的TrMM中，不使用蛋白酶抑制剂在发酵罐培养T189中生长M1140。温度在48小时后从28℃变为22℃。
通过免疫印迹检查表达水平。用橙色LSB稀释样品，使得在4-20％标准凝胶的每个孔中上样0.0125μl上清液。进行免疫印迹双重检测IGF1和CBHI表达。用0.25μg/ml在TBST稀释的兔抗IGF1(Abcam兔多克隆抗体，ab9572)和以1:10000在TBST中稀释的抗CBHI mab261进行检测。第二抗体是以1:30000在TBST中稀释的山羊抗兔IgG(Li-Cor#926-68071，IRDye680RD山羊抗兔IgG)。用以1:30000在TBST中稀释的Li-Cor#926-32210IRDye 800CW山羊抗小鼠IgG检测抗小鼠CBHI抗体。在TBST中洗涤1小时，并用TBS冲洗。用LI-COR Odyssey CLx红外显像系统在700nm和800nm扫描过滤物(filters)。
从44小时-162小时相比于IGF1标准曲线测量IGF1表达。表达的融合蛋白为约70kD。在71小时，表达水平为3.5g/L。测量的最高表达水平是92小时的7.9g/L。在116小时，表达水平降至6.6g/L。在该分批培养中，IGF1表达在116小时后显著降低。CO2峰在约92小时，这与表达峰很一致。在116小时后，IGF1蛋白从载体降解，在样品中仅可见CBHI蛋白。CBHI表达可以从71小时至162小时观察到。在培养中没有使用蛋白酶抑制剂。13蛋白酶缺失改进了IGF1的稳定性。在具有较少蛋白酶缺失的菌株中可能需要蛋白酶抑制剂以达到更高的生产水平。如果在培养中使用更多纤维素，用M1140可能获得更高的生产水平。
在不具有蛋白酶缺失的菌株M124中制备M231生产菌株以产生CBHI-TEV位点-IGF1融合蛋白。在CBHI载体和IGF1之间引入TEV蛋白酶切割位点。在分泌至上清液后，IGF1非常稳定且主要保持融合形式。表达构建体包含CBHI载体-TEV切割位点-IGF1蛋白序列，并将其设计为整合入在天然启动子和终止子控制下的CBHI基因座。转化后，通过PCR筛选缺少cbh1orf且表达盒正确整合入cbh1基因座的转化体。将最终转化体命名为M231。
用于产生M2313的CBHI载体序列与用于以上IGF1的相同，除了在CBHI的C-末端氨基酸“…TTTGSS”之后在TEV切割位点(ENLYFQ)之前引入氨基酸“PGP”。
以与M231相似的方式制备产生IGF1变体的称为BVS857的第二个菌株，但表达构建体在TEV切割位点之前包括strepII标签和间隔基。将表达盒整合入在天然cbh1启动子和终止子控制下的cbh1基因座。用PmeI消化载体，凝胶纯化表达盒，并将其转化入M194菌株，用AmdS选择。通过PCR筛选缺少cbh1orf且表达盒正确整合入cbh1基因座的转化体。所得菌株M236产生CBHI-streptII标签-3x(GGGS)-TEV位点-BVS857融合蛋白。加入strepII标签以允许纯化，其可以在之后方便地用TEV蛋白酶处理除去。
IGF1菌株M231不具有蛋白酶缺失，而BVS857菌株M236具有pep1和tsp1蛋白酶缺失。这两个菌株均在上清液中表达稳定的CBHI-IGF1融合体。在1L发酵罐中，在糜蛋白酶抑制剂(20μM)和胃蛋白酶抑制剂(10μM)存在下培养M231和M236。在含有20g/L酵母提取物、40g/L纤维素、100g/L纤维二糖、40g/L山梨糖，pH4.5的TrMM中培养两个菌株，其中在第3、4和5天添加糜蛋白酶抑制剂和胃蛋白酶抑制剂。温度在48小时后从28℃变为22℃。
通过免疫印迹评估生产水平。用橙色LSB稀释M231培养上清液，使得10μl体积中的0.025μl可以上样至带有IGF1标准的4-20％标准凝胶。稀释M236培养上清液，与BVS857标准一起在4-20％标准凝胶的每个孔中上样0.05μl上清液。用0.25μg/ml TBST中稀释的兔抗IGF1(Abcam兔多克隆抗体，ab9572)和以1:10000在TBST中稀释的抗CBHI mab261检测两个印迹。第二抗体是以1:30000在TBST中稀释的山羊抗兔IgG(Li-Cor#926-68071，IRDye680RD山羊抗兔IgG)。用以1:30000在TBST中稀释的Li-Cor#926-32210IRDye800CW山羊抗小鼠IgG检测抗小鼠CBHI抗体。在TBST中洗涤1小时，并用TBS冲洗。用LI-Cor Odyssey CLx红外显像系统在700nm和800nm扫描过滤物。
菌株M231表明，在118小时，高达19g/L的IGF1可以作为CBHI载体的融合体产生。融合蛋白在免疫印迹中跑在约75kD。CBHI-IGF1融合蛋白的表达水平在72小时为2g/L，在95小时为10g/L，在101小时为16g/L，和在118小时为19g/L。CBHI表达水平在从49小时至118小时的分批培养期间积累。
用菌株M236，在101小时高达7g/L的BVS857变体可以作为CBHI载体融合体产生。融合蛋白在免疫印迹中跑在约75kD。CBHI-BVS857融合蛋白的表达水平在72小时为2.7g/L，在95小时为6.2g/L，在101小时为7.0g/L，在118小时为5.1g/L，和在140小时为2.5g/L。作为CBHI载体的融合体，这两个IGF1蛋白均稳定地在上清液中表达。
进一步在含有和不含糜蛋白酶抑制剂和胃蛋白酶抑制剂的发酵罐中培养M236IGF1-BVS857生产菌株以观察蛋白酶的作用。之前用抑制剂并使用40g/L纤维素培养该菌株。在含有20g/L酵母提取物、80g/L纤维素、100g/L纤维二糖、40g/L山梨糖，pH4.5的TrMM中培养两个菌株，其中在第3、4和5天添加糜蛋白酶抑制剂和胃蛋白酶抑制剂。温度在48小时后从28℃变为22℃。
在菌株M236的71-115小时取出的上清液样品中没有检测到CBHI-BVS857融合蛋白或游离蛋白(没有添加蛋白酶抑制剂)。在该时间期间，仅可检测到在上清液中积累的CBHI载体蛋白。在糜蛋白酶抑制剂和胃蛋白酶抑制剂存在下生长的相同菌株在104小时产生高达9g/L的CBHI-BVS857融合体。在75kD检测到CBHI-BVS857融合蛋白。测定的表达水平在71小时为3.0g/L，在92小时为6.3g/L，在98小时为4.9g/L，在104小时为9.0g/L，和在115小时为7.8g/L。CBHI载体水平在整个培养期间增加，在115小时最高。因此，CBHI-BVS857生产水平的提高很显著，且由蛋白酶抑制引起。
使用40g/L纤维素，BVS857-CBHI的生产水平在101小时达到7.0g/L，用80g/L纤维素，生产水平在104小时为9.0g/L。这表明，通过向培养基添加更多纤维素达到更高的生产水平。
根据制造商的方案通过strep-标签亲和柱(IBA GmbH)从M236纯化CBHI-streptII标签-3x(GGGS)-TEV位点-BVS857。向柱应用培养上清液(600μl)，并用10倍体积的洗涤缓冲液洗涤。用含有2.5mM脱硫生物素的洗脱缓冲液洗脱柱。将级分在4-20％标准凝胶上跑，并用gel code考马斯蓝染料染色。洗脱级分#2和#3包含略小于75kD的浓缩蛋白，BVS857融合蛋白应当跑在75kD。
将洗脱级分#2用于测试TEV蛋白切割效率。将AcTEV蛋白酶(Invitrogen，目录号#12575-015)与不同量的酶于8℃孵育过夜。在免疫印迹上使用标准量的IGF1来定量各反应中存在的IGF1的量。改变TEV的量以评估其效率(0.1μl、5μl、10μl或15μl)。TEV(5μl)加上BVS857对照(4μg)表明，似乎对BVS857没有任何显著的TEV蛋白酶活性。在载体融合样品中IGF1的基础量是687ng。使用1μl(10单位)TEV酶于8℃在16小时后转化了46％的融合体。5μl(50单位)的量转化了约95％的融合体。当使用10μl(100单位)TEV时，在97％达到峰值。TEV酶给出的免疫印迹中的背景染色在25kDa。可以容易地在天然IGF1大小处约10kDa观察到释放的BVS857产物，但在标准曲线范围之下。在反应缓冲液中使用PMSF，但它从载体释放后，似乎没有中和引起BVS857降解的蛋白酶活性。产生该物质的菌株仅具有2个蛋白酶缺失，因此使用蛋白酶抑制剂以试图控制蛋白酶活性。该实验表明，可以使用内部的strepII标签来从上清液亲和纯化CBHI融合蛋白，且有效切割TEV切割位点以释放模型蛋白，例如IGF1。实施例17-在13倍蛋白酶缺失菌株中的FGF21表达菌株
使用具有靶向cbh1基因座且包含潮霉素标志物的FGF21表达盒的载体在M369(Δpep1 Δtsp1 Δslp1 Δgap1 Δgap2，参见WO2013/102674的实施例4)中制备第一个生产FGF21的菌株。该载体用PmeI消化，并加工以转化入M369菌株，用潮霉素选择转化体。表达构建提产生CBHI载体-NVISKR kex2位点-FGF21融合蛋白，因此分泌的蛋白将是游离的FGF21蛋白。通过PCR检查基因座中的正确整合以及cbh1的缺失。
CBHI载体序列与以上用于IGF1的相同，在NVISKR Kex2切割位点和FGF21序列之后：
(SEQ ID NO：926)
在含有和不含蛋白酶抑制剂胃蛋白酶抑制剂A、糜蛋白酶抑制剂或大豆胰蛋白酶抑制剂的情况下生长M393菌株。选择独立的孔用作对照孔，其中不添加抑制剂。在不含硫酸铵但含有柠檬酸二铵、100mM PIPPS、20g/L麦糟提取物、40g/L乳糖，调节为pH4.5的3mlTrMM中生长该菌株。在85％湿度下以800rpm振摇24孔板。用透气膜覆盖板，并生长培养物6天。
第一次在第3天添加抑制剂，然后每天添加直到第6天。从第3天开始从培养孔中取出200μl样品。在13k旋转菌丝体5分钟，收集上清液。从培养物上清液中，将5μl与LSB上样到4-20％SDS PAGE凝胶，用兔抗FGF21(2μg/ml)和以1：:1000稀释的山羊抗兔IgG AP偶联的第二抗体在硝化纤维素上进行免疫印迹。在印迹上包括FGF21标准用于定量。
FGF21对蛋白酶降解非常敏感。在没有处理的第6天，仅产生约2mg/L的总蛋白，其中非常少是全长物质(图12)。在培养中添加10μM胃蛋白酶抑制剂A可以在第6天将生产提高至160mg/L。在抑制剂存在下，检测到约18kD的主要降解产物。除胃蛋白酶抑制剂A之外添加SBTI或糜蛋白酶抑制剂没有产生额外益处。添加SBTI产生更加酸性的培养物样品，因此对生产水平产生负效应。胃蛋白酶抑制剂A和SBTI的组合提供最大益处，因为其允许产生204mg/L的总FGF21。在单个抑制剂存在下，表达水平在1-12mg/L的范围，未处理培养达到约1mg/L。抑制天冬氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶两者以有效产生FGF21是重要的。
在发酵罐中在添加有20％酵母提取物、4％纤维素、8％纤维二糖、4％山梨糖，pH4.5的TrMM中培养M393，其中温度在48小时从28℃变为22℃。当用免疫印迹分析FGF21表达时，在第3天观察到最高表达水平，其中以130mg/L产生10kD的降解产物。没有观察到全长FGF21。当在5倍蛋白酶缺失菌株中生产时，FGF21对蛋白酶非常敏感。需要通过抑制剂处理或蛋白酶缺失更多地降低蛋白酶活性。当在24孔培养中使用抑制剂时，观察到很多蛋白，表明似乎良好地分泌了FGF21，但只是对降解很敏感。
将具有AmdS标志物的FGF21表达载体转化入菌株M1076和M1085(具有pyr4-潮霉素双标志物的slp7缺失)。
通过以下产生pTTv470载体：从pTTv429将AmdS标志物作为NotIce片段取出，并将其添加至之前制备的pTTv174FGF21表达载体。简单的改变选择标志物以产生新载体。pTTv174和pTTv470中的表达盒相同。用PmeI消化pTTv470载体，凝胶纯化表达盒，将具有AmdS标志物的FGF21表达盒转化入两个13倍蛋白酶缺失菌株M1076(pep9缺失)和M1085(具有slp7缺失的M901)。AmdS选择后，将所得转化体通过PCR筛选正确的5’和3’整合和cbh1开放阅读框的存在或缺失。所用引物对如下表17.1所示。
表17.1用于筛选整合入cbh1orf的引物
寻找两个转化菌株的阳性转化体。M1076转化产生13个良好转化体，M1085产生2个良好转化体。在24孔培养中培养这些转化体，并将其与之前的FGF21生产菌株M393比较。在10g/L酵母提取物、20g/L纤维二糖、10g/L山梨糖和PIPPS，pH4.5下生长转化体和对照。在50ml培养基中添加1x107个孢子，并在每个孔中添加3ml带孢子的培养基开始培养(6x105个孢子/孔)。在第4、5和6天收集100μl各培养上清液。将菌丝体旋转下来，向上清液添加橙色LSB，并将样品加热5分钟。在4-20％标准TGX凝胶的每个孔中上样5μl和2μl的上清液+LSB。跑胶，并将蛋白转移至硝化纤维素膜上。
通过免疫印迹检测表达的FGF21。在TBST中将兔抗FGF21抗体稀释至2μg/ml。提供的母液浓度是3600μg/ml(来自Novartis)。在TBST中以1:30000稀释山羊抗兔第二IRDye680。在室温下振摇孵育第一和第二抗体1小时。为了检测载体CBHI水平，在TBST中以1:10000稀释抗CBHI抗体mab261。在TBST中以1:30000稀释山羊抗小鼠IRDye 800第二抗体。用TBST洗涤膜1小时，并用TBS冲洗。在700nm和800nm扫描印迹。
分析第4天、第5天和第6天样品中的FGF21和CBHI表达。M393对照菌株和具有13种蛋白酶缺失的新转化体之间差异巨大。观察到分泌的FGF21主要是10kD的产物。该产物从第4天的M393上清液中仅隐约可见，但在所有的13个新转化体的上清液中均大量表达(图13)。在之后几天，从M393菌株没有检测到FGF21。在所有M393对照样品以及新的FGF21转化体中均表达游离的CBHI载体。这表明，所有菌株均分泌CBHI载体和FGF21蛋白，但在M393菌株中对FGF21有太多蛋白酶活性。在新转化体中8个额外的蛋白酶缺失显著改进了FGF21的稳定性。与9个其他转化体相比，4个转化体#24、36、48和73似乎产生更多量的CBHI和FGF21。在第5和6天，这种差异尤其明显。在Southern分析后，确定这是由FGF21表达盒的多重整合造成。较低的表达水平对应于单拷贝整合。M393菌株具有5种蛋白酶缺失，而所产生的新菌株具有13种蛋白酶缺失。从M1085菌株的转化平行制备转化体。结果与图16中看到的结果相似。基于M1085的菌株也主要产生10kD的FGF21产物，但在第4天可见较弱的17kD产物。
对几个转化体进行Southern印迹分析。通过Southern印迹使用放射性检测分析来自M1076菌株的转化体号#20、24、36、48、55、73和来自M1085的#4和39。用PstI消化基因组DNA以检查整合。将两个PCR片段用作cbh1启动子和cbh13’侧翼的探针。用于产生片段的引物如下所列。
cbh1启动子探针，799bp片段，35ng/μl(标记5’探针的试管)
T173_pcbhl_seq_rl CAAAGGCCGAAGGCCCGAGG(SEQ ID NO:933)
T1679 CAACCTTTGGCGTTTCCCTG(SEQ ID NO:934)
cbh13’侧翼探针，796bp片段，32.2ng/μl(标记3’探针的试管)
T178_cbh13flank_seq_f2 GGCCGCAGGCCCATAACCAG(SEQ ID NO:935)
T1680 TGAGTGGGGGATGACAGACA(SEQ ID NO:936)
如果正确整合入cbh1基因座，PstI消化和用两个探针的检测应当显示在3.9kb和4kb的两条带。有效地，仅在4kb存在一条带。天然cbh1基因座的信号为约6.7kb。转化体号20、55、4和39显示在4kb的期望的整合带。这些看起来是清楚的单个整合入cbh1基因座。从24孔培养研究中可见，这些转化体显示比很多其他转化体低的表达水平。在转化体#24、36、48和73中观察到最高的表达水平，其正好在Southern印迹中显示额外的整合信号。在所有转化体中均有2.3kb的非特异性条带。
将包含多拷贝的转化体#24和#48命名为M1200和M1201。将来自转化体#20和#55的单拷贝菌株命名为M1202和M1203。将基于M1085的菌株转化体#4和#39命名为M1204和M1205，其是单拷贝菌株。
在含有和不含蛋白酶抑制剂的1L发酵罐中培养生产FGF21的菌株。对M1200、M1201、M1204和M1205菌株进行培养。在含有20g/L酵母提取物、40g/L纤维素、100g/L纤维二糖、40g/L山梨糖，pH4.5的TrMM中培养这些菌株。在第3、4和5天向M1200和M1205培养添加胃蛋白酶抑制剂、糜蛋白酶抑制剂和SBTI抑制剂。用橙色样品缓冲液稀释上清液样品，在4-20％标准PAGE凝胶的每个孔中上样0.1μl上清液。
如上所述通过免疫印迹检测表达的FGF21。
M1200培养主要产生10kD产物，但有高达17kD的更高分子量的产物(图14)。全长FGF21为20kD。在第5天，10kD产物为2.0g/L。使用抑制剂增加了分泌的FGF21的稳定性。现在主要产物是17kD，且在第5天以高达2.0g/L产生。使用抑制剂处理，全长版的FGF21能够以0.2g/L产生。这似乎是全长。
M1205培养在第5天产生2.4g/L的10kD条带。抑制剂处理增加了FGF21产物的稳定性，在第4天产生主要的3.5g/L的17kD和0.2g/L的全长产物(图14)。来自M1201培养的样品在发酵系统中有技术问题(分析未显示)。分析M1204菌株，其在第5天给出相似的表达水平，2.5g/L的10kD产物。10kD产物在第2天最低，在第5天最高。
抑制剂处理表明，完全稳定FGF21蛋白是可能的。生产FGF21(不添加蛋白酶抑制剂)的进一步的蛋白酶缺失包括但不限于slp2、pep8和pep11。
对FGF21生产菌株的抑制剂研究
为了研究哪类蛋白酶对FGF21蛋白降解作用最大，我们在24孔培养中测试了单个蛋白酶抑制剂。
已知糜蛋白酶抑制剂和SBTI抑制仍在M1200菌株中表达的SLP2和SLP7枯草杆菌蛋白酶。胃蛋白酶抑制剂抑制已知分泌至上清液的天冬氨酸蛋白酶，例如PEP8、PEP11和PEP12。1,10-邻菲咯啉主要靶向木霉分泌的锌金属蛋白酶。在24孔含有10g/L酵母提取物、20g/L纤维二糖、10g/L山梨糖、用PIPPS缓冲至pH4.5的TrMM中培养M1200菌株。以10μM的最终浓度使用糜蛋白酶抑制剂、邻菲咯啉和胃蛋白酶抑制剂，并以0.1mg/ml使用SBTI。各处理在重复孔中进行，并在4个孔中培养未处理对照。
通过在50ml培养基中添加1x107个孢子，并在每个孔中添加3ml带孢子的培养基开始培养(6x105个孢子/孔)。在第4、5和6天收集100μl各培养上清液。将菌丝体旋转下来以仅除去上清液。添加橙色LSB，并将样品加热5分钟。在4-20％标准TGX凝胶的每个孔中上样2μl的上清液+LSB。跑胶，并将蛋白转移至硝化纤维素膜上。
如上通过免疫印迹检测表达的FGF21。在一些情况中使用商购的来自Abcam的N-末端抗体兔多克隆(#ab66564)和来自Abcam的C-末端兔多克隆抗体(#ab137715)。
没有抑制剂处理，M1200菌株主要产生10kD产物，但在第4天样品中可见一些较大的形式(图15)。糜蛋白酶抑制剂处理改进了蛋白的稳定性，允许17kD的主要产物。糜蛋白酶抑制剂处理后，可见少量的全长形式以及约37kD的二聚体形式。胃蛋白酶抑制剂、SBTI和1,10-邻菲咯啉处理仅增加了10kD形式的表达水平。然而，当组合糜蛋白酶抑制剂和胃蛋白酶抑制剂时，对稳定性存在协同作用。组合处理促进了全长形式的几乎完全稳定，并降低了较低分子量的产物。这在第6天的培养样品中最明显，其中主要可见的是全长FGF21。二聚体的出现在该处理下最强。二聚体的适当形成表明，该分子具有二聚体化所需的C末端半胱氨酸残基。
还用N-和C-末端抗体探测培养样品。用糜蛋白酶抑制剂和胃蛋白酶抑制剂的双重处理产生了与N-末端抗体和FGF21标准反应的全长产物(图15)。当用C-末端抗体检测第5天样品中产生的FGF21时，当用糜蛋白酶抑制剂或糜蛋白酶抑制剂/胃蛋白酶抑制剂处理观察到两种产物(图16)。这些似乎是全长蛋白和最低的10kD形式。糜蛋白酶抑制剂处理足以稳定蛋白的C-末端。为了保留N-末端，糜蛋白酶抑制剂和胃蛋白酶抑制剂均是必要的。
定量第4天免疫印迹数据以比较哪种抑制剂最有效。1,10-邻菲咯啉处理最大地增加了所产生FGF21的总量，因此表明可能涉及锌金属蛋白酶(图17.2)。存在很多候选基因，例如mp1、mp2、mp3、
mp4和mp5。全长形式似乎被枯草杆菌和天冬氨酸蛋白酶降解。SLP2蛋白酶最可能是稳定性的主要问题，可以通过例如删除该基因、沉默该基因，或改变该基因的启动子来解决。删除或沉默天冬氨酸蛋白酶上清液中的PEP8、PEP11和PEP12可进一步增加FGF21的稳定性。在一些实施方案中，产生全长FGF21可能仅需要在菌株M1200中缺失两种蛋白酶，slp2和pep8。
表17.2从图15所示的第4天的免疫印迹中测量的FGF21表达的荧光单位
实施例18-通过替换其启动子降低slp2表达
slp2在某些水平上影响生长和产孢，因此用以较低水平表达的启动子替换slp2启动子(在所有鉴定的蛋白酶中，在最后的实施例所述的条件下，slp2mRNA表达水平最高)。
选择来自产孢诱导的黄素的包含以下的启动子来替换入slp2启动子基因座：单加氧酶基因tre76230、RNA聚合酶基因tre49048和slp8蛋白酶基因tre58698。所有基因似乎以低于slp2中所见的水平适度表达。
通过PCR扩增来自上述3个基因的启动子区域，并将其插入具有slp2侧翼序列的载体，所述侧翼序列将启动子导向正确位置，作为新的slp2启动子。启动子盒在新启动子上游包含潮霉素标志物。用PmeI消化载体，凝胶纯化替换的启动子构建体，并将其在潮霉素选择条件下转化入M507生产MAB01的菌株。从各转化体分离两个转化体，将其分别命名为M773/M774、M775/M776和M777/M778。
用于tre76230启动子替换的启动子序列：
(SEQ ID NO：937)
用于tre49048启动子替换的启动子序列：
(SEQ ID NO：938)
用于tre58698启动子替换的启动子序列：
(SEQ ID NO：939)
在24孔板中用含有1％酵母提取物、2％纤维二糖、1％山梨糖，pH5.5的TrMM培养这些转化体和M507对照菌株。在第5、6和7天取样。用AP偶联抗体进行免疫印迹以检测重链和轻链。稀释培养上清液，使得每个泳道上样0.5μl。用AP底物将检测可视化。
重链明显在M773/M774和M777/M778转化体中更加稳定(图17)。最突出的点是第7天。M507重链几乎全部降解，而M773/774重链很好地存在。其他显著特征是没有37kD的较上的降解产物。仅在约28kD有一些较下的降解产物。M773/M774菌株生长良好，但M777/M778菌株生长没有那么好，在产孢上有问题。因此，优选的菌株是M773或M774。用相关的酪蛋白测量的总蛋白酶活性表明，M773/M774和M777/M778具有低蛋白酶活性。
当通过免疫印迹检测轻链时，M773和M774中的轻链少于对照。在M777和M778菌株中轻链尤其少。M775和M776轻链的量与对照相似。在印迹中可见的轻链的量似乎与检测到的总免疫球蛋白吻合良好。从这些培养中测量总IgG，表明所有的启动子交换的菌株具有较低的抗体表达，除了与对照非常相似的M775和M776(表18.1)。M773/M774菌株的水平少于M507的一半。因此，在这种小培养形式中，可能有什么物质影响一些启动子替换的菌株的生长。
表18.1第7天的24孔培养的总抗体浓度
总mAB
菌株 (结合的蛋白G)
μg/ml
M773 166
M774 225
M775 489
M776 487
M777 68
M778 50
M507对照 503
发酵M774和M775菌株。在添加有20g/l酵母提取物、40g/l纤维素、80g/l纤维二糖和40g/l山梨糖，pH5.5的TrMM中培养两个菌株10天，其中温度在48小时从28℃变为22℃。在相同条件和其中使用120g/l纤维素的相似条件下培养对照菌株M667。取样用于免疫印迹和总免疫球蛋白测定。稀释上清液，使得在4-15％凝胶的每个孔中上样0.05μl。用TBST中以1:10000稀释的AP偶联抗体(A3818)进行免疫印迹检测轻链。用TBST中以1:30000稀释的抗人Fc抗体IRDye 700DX偶联物(Rockland#609-130-003)检测重链。用Odyssey CLx近红外显像仪(Li-Cor)检测700nm的荧光。
由M774产生的MAB01重链看起来非常好(图18)。该结果与在24孔培养中所见的相似。仅在约25kD存在一个主要的降解产物。通常，重链看起来像由M775产生。一般在38kD、28kD和10kD有降解条带。SLP2活性降低可以解释10和38kD产物的消失，因为靠近MAB01重链的N末端存在枯草杆菌切割位点，没有高的slp2表达时，重链在该位置不再被切割。当蛋白酶在铰链区中切割重链时，产生28kD产物。铰链中的切割位点更通常是sedolisin或胰蛋白酶样蛋白酶。这似乎不是由SLP2造成的。当铰链和近N末端位点均被切割时，产生10kD产物。
在M774和M775的轻链量或载体结合百分比之间没有显著差异。从上述24孔培养的数据可见，尽管M775不是最佳的对照菌株，它与M507非常相似。该数据还表明，SLP2似乎没有切割载体-轻链融合体。否则当降低slp2表达水平时，载体结合物质的量会显著增加。
当比较总抗体量时，M774菌株略优于M775(表18.2)。总抗体量还列于重链的免疫印迹。在第7和8天可见最大差异，其中M774在两天均产生5.3g/L。M775在这些天产生4.4和4.6g/L。一旦测量并比较全长抗体的量，观察到最重要的差异。M774产生的重链完整得多。在第7天，M774菌株产生71％的全长，而M775是37％的全长。M774菌株可以保持65％的全长抗体直到第10天，而M775菌株仅产生14％全长物质。在质量上，对照菌株M667(具有slp2基因沉默构建体)与M774相似(表18.2)。然而，M667生产菌株产生的总抗体量略高，在相同培养条件下在第10天达到6.1g/L的水平。用增加的纤维素(120g/L)，M667菌株在第10天产生的总抗体高达7.1g/L(表18.2)。
从这些数据，产生降低SLP2活性的另一种方法。替换SLP2启动子造成较少的SLP2蛋白酶表达，产生显著低的重链降解。还观察到对生长和产孢的一些影响，但与SLP2基因完全缺失的那些相比温和得多。通过给slp2产孢诱导的启动子，可能已经解决该产孢相关的问题。M774中的任何生长缺陷可以用发酵过程中的修饰弥补。
表18.2来自培养菌株M774、M775和M776的发酵罐培养上清液的总抗体和全长抗体定量
在单独的发酵罐培养系列中，将M507亲本菌株与M646slp2缺失菌株和M774slp2启动子变化菌株相比较。它们在添加有20g/l酵母提取物和120g/l纤维素以及50％葡萄糖/12.5％山梨糖进料，pH5.5的TrMM中生长，其中温度在48小时从28℃变为22℃。对第5天和第6天样品用抗重链和抗轻链抗体进行免疫印迹以目视检查所产生的重链和轻链的质量和相对量。
M507开始的生长比M646和M774菌株快，但之后它们在培养中赶上M507。如在免疫印迹中可见，这三个菌株产生的游离轻链的量没有显著差异。M646菌株中，与CBHI载体结合的轻链的量略高。在M646样品中检测到少量的与载体结合的重链，在M774菌株中观察到的甚至更少。这在M507菌株中不能检测到。该观察结果表明，在上清液中或潜在的在细胞内，SLP2可能在一定程度上涉及加工CBHI载体-抗体融合蛋白。
M774菌株显示与slp2缺失菌株M646相似的重链降解模式。两个菌株均缺少在M507亲本菌株中中看到的10和38kD降解产物。在免疫印迹中，M646和M774重链仅显示在50kD的完整大小的产物以及在25kD的主要降解产物。M646和M774菌株中的全长重链的量高于M507。对照M507重链显示在10和38kD的两个额外的降解产物。这表明SLP2蛋白酶确实造成这些产物的产生。M774菌株和M507菌株在第6天这一时间点产生的MAB01抗体的总量相似，在这些培养条件下达到2.8g/L(表18.3)。尽管M774和M507菌株产生的免疫球蛋白总量相同，M774材料的质量好得多，因为缺少重链降解产物。
表18.3来自培养M507、M646、M774的发酵数据。表格中的总抗体滴度以g/L表示。
天数 M507(g/L) M646(g/L) M774(g/L)
3 1.6 1 0.8
4 2.3 1.4 1.5
5 2.7 1.8 2.2
6 2.8 2 2.8
实施例19-14倍蛋白酶缺失菌株-slp2(tre123244)启动子变为tre76230启动子
为了制备具有降低的SLP2活性的14倍蛋白酶缺失菌株，用靶向slp2(tre123244)基因座的质粒的MssI片段转化13倍蛋白酶缺失菌株M1077(M1076的pyr4-)以将slp2启动子替换为产孢诱导基因tre76230的启动子。
使用pyr4选择的标准原生质体转化法进行转化。转化的规模是2x(即使用500μl原生质体)。所用的DNA总量为～14.6μg。在选择性板上挑选在转化板上生长的克隆，并用表19.1所示的引物筛选缺失盒的正确整合。通过单孢纯化法纯化显示整合信号的所选择的克隆，并再次筛选。来自三个转化体的克隆在一轮纯化后似乎是纯的，且具有强整合信号。将来自各转化体的两个纯同族克隆在PD+1M山梨醇上涂板用于孢子悬浮。
表19.1用于筛选基因组缺失盒的正确整合以及用tre76230启动子替换slp2启动子(tre123244)的引物
引物 序列
T1729_slp2_int_check_F GACACTCCCTTGACTGTAGG(SEQ ID NO：940)
T488_pyr4_5utr_rev GGAGTTGCTTTAATGTCGGG(SEQ ID NO：428)
T1584_76230_f2 CATCCCCCAAAGATGATGC(SEQ ID NO：941)
T1585_slp2_3int_orf_r TGTCATCGAGAGCAGAAGCA(SEQ ID NO：942)
T1393-slp2-5utr-F CACAACGTACTCGAAGTACC(SEQ ID NO：943)
T1586_slp2_promch_r AGGTCACTCAGCCTTGTACC(SEQ ID NO：944)
Slp2启动子替换菌株的Southern分析
在24孔板中以两次重复培养slp2启动子替换转化体的三个生物克隆及其亲本菌株M1076用于提取DNA。3天后，通过真空过滤、冷冻和冻干收获菌丝。使用Easy-DNA试剂盒(Invitrogen)从菌丝提取基因组DNA，并用表19.1中的引物通过PCR分析样品。没有一个克隆显示slp2启动子的强信号，但在几个克隆中看见非常少量的对应于预期大小的产物。
用HindIII消化来自M124、M1076和6个Δslp2启动子替换菌株的基因组DNA用于所有分析(Δslp2启动子，5’和3’侧翼)。在侧翼分析中略去菌株M124。用MssI消化对照质粒用于两个侧翼分析。用于制备杂交探针的引物示于表19.2。
表19.2用于制备tre76230克隆中slp2(tre123244)启动子变化的Southern分析的探针的引物。
Southern分析证实，所有克隆均是纯的slp2启动子变化克隆。此外，多数克隆仅提供预期的信号，因为5’和3’侧翼探针验证了基因组中缺失盒的单个整合。一个克隆(78-28B)可能在基因组中整合了一个额外拷贝的盒。储存克隆78-6A用于收集，并将其命名为编号M1162。具有slp2启动子变化的克隆似乎产孢多少有点延迟且能力较低。
发酵罐培养M1162
培养M1162菌株并将其与菌株M1076比较。预培养生长3天，而不是通常的2天。在含有20g/L酵母提取物、40g/L纤维素、80g/L纤维二糖、40g/L山梨糖，pH4.5的TrMM中发酵M1162。M1162菌株的生长略慢于其祖先M1076。M1076的CO2峰在75小时，而M1162在94小时。
测量蛋白酶活性
分析发酵罐培养样品的蛋白酶活性。测量培养样品的总蛋白浓度从而将样品调节至1mg/ml总蛋白。在96孔板中加入100μl所有的稀释上清液。每个样品使用3个重复的孔。在每个孔的上清液中添加100μl在pH4.5的柠檬酸钠缓冲液中制备的酪蛋白FL稀释的母液(10μg/ml)。小瓶中的酪蛋白母液是1000μg/ml，初始悬浮于200μL PBS中。对于各样品，使用背景对照和100μl稀释的上清液以及100μl pH4.5的柠檬酸钠缓冲液。用塑料袋覆盖板，并于37℃孵育。在2、3和4小时后测量板的荧光。用485nm激发和530nm发射在荧光板读数器上读数。
与M1076菌株相比，来自M1162菌株的上清液的蛋白酶活性极低。改变slp2启动子严重影响SLP2蛋白酶活性。所得的对酪蛋白的蛋白酶活性在第3天降低3.6倍，在第4天降低2.5倍(表19.3)。表19.3M1076和M1162发酵上清液对酪蛋白底物的蛋白酶活性测量。稀释样品，使得每个样品使用1mg/ml总蛋白。添加酪蛋白FL底物以测量蛋白酶活性。
天数 M1076-13个缺失(单位) M1162-第14轮(单位)
2 8.8 3.0
3 11.6 3.6
4 10.5 4.2
5 20.2 3.7
实施例20-制备表达IFN-α2b的13倍蛋白酶缺失菌株
在两个步骤中生成表达IFN-α2b的13倍缺失菌株。首先，如上所述用M893制备产生干扰素的菌株，其包含12种蛋白酶缺失Δ(pep1 tsp1 slp1 gap1 gap2 pep4 pep3 pep5pep2 sep1 slp8 amp2)。用pTTv401(来自具有完整cbh1启动子和cbh1终止子但缺少IFN-α2B插入的CBHI编码基因序列GGGGG-NVISKR的质粒)的MssI片段转化M893原生质体。pTTv401盒携带乙酰胺选择标志物，将其靶向cbh1基因座。
在选择板上划线M893转化体，PCR筛选在cbh1基因座中的正确整合。用PhirePlant Direct试剂盒(Thermo Scientific,F-130)进行PCR筛选。筛选引物如表43.1所列。将菌株命名为M1012。
表20.1用于M893转化体中的pTTv401的筛选引物
通过Southern分析确认M1012在cbh1基因座携带一个IFN-α2b表达盒。在5-FOA板上涂板M1012孢子以环出pyr4标志物。挑选克隆，在5-FOA板上划线。对10个克隆进行单细胞涂板，通过PCR筛选亚克隆以确认pyr4环出。筛选引物如表20.2所列。在PD板上划线提供pyr4环出正确信号的克隆，进行+/-尿苷板测试选择克隆。将M1012pyr4阴性克隆1-1命名为M1065，并将pyr4阴性克隆2-1命名为M1066。
表20.2用于筛选从M1012环出pyr4的引物
为了制备具有IFN-α2b表达的13倍蛋白酶缺失菌株，用slp2(tre123244)缺失载体pTTv457(通过引入/改变pyr4-潮霉素选择标志物由pTTv115制备)的MssI片段转化M1065原生质体。如上所述进行原生质体化和转化。在选择板上划线pTTv457M1065转化体，PCR筛选在slp2基因座中的正确整合。PCR筛选引物如表20.3所列。在PD+1M山梨醇的板上划线不提供slp2ORF信号的三个转化体。
表20.3用于筛选slp2缺失盒整合和slp2ORF缺失的引物
将最佳克隆命名为M1106，并将其在含有20g/L酵母提取物、40g/L纤维素、100g/L纤维二糖和40g/L山梨糖，pH4.5的TrMM中，在1L发酵器中与对照菌株M961一起培养。之前纤维二糖的标准量是80g/L，因此也在对照培养基(含有20g/L酵母提取物、40g/L纤维素、80g/L纤维二糖和40g/L山梨糖，pH4.5的TrMM)中培养M961菌株。
通过免疫印迹分析培养样品以定量干扰素的表达。稀释样品，使得在104-20％标准PAGE凝胶中上样10μl中的0.05μl上清液。在同一凝胶上上样对应于400、200、100、50和25ng标准量的干扰素。将干扰素抗体(Abeam#ab9386，在TBST中稀释至1μg/ml)与印迹膜一起孵育1小时，并用TBST洗涤。将第二抗体IRDye 680(Li-Cor#926-68070；在TBST中以1:30000稀释)孵育1小时，并TBST洗涤，并在700nm扫描。
在所有免疫印迹中检测到一条带约17kD的干扰素。在约75kD检测到少量的载体结合的干扰素，但多数是游离形式。M961菌株在95小时达到3.2g/L的干扰素生产水平(表20.2)。在较高浓度的纤维二糖存在下，干扰素生产水平在95小时达到7.9g/L，且从89小时至99小时，表达稳定，其中水平为7.4g/L或更高。为了检查如果缺失更多种蛋白酶最大生产水平是多少，将M961菌株在具有第3-5天添加的糜蛋白酶抑制剂(20μM)和胃蛋白酶抑制剂(10μM)的相同培养基中生长。蛋白酶抑制剂处理将干扰素生产水平在140小时提高至10.7g/L。在M1106培养期间，看见干扰素的表达从90小时直到121小时。测量的最高量为4.3g/L(表20.4)。菌株M1106生长较慢：M1106在121达到4.3g/L，而M961在90小时达到7.4g/L。
表20.4在发酵罐培养中检测的干扰素α2b的表达水平，以g/L表示
时间 M961(g/L) M961(g/L) M1106(g/L)
70.75h 2.3 3.4
89.75h 3.1 7.4
90.4h 1.1
95.1h 3.2 7.9
96.4h 1.7
99h 3.2 7.4
102.6h 2.4
103.75h 2.9 6.3
114h 3.4
121.5h 4.3
纤维二糖 80g/L 100g/L 100g/L
实施例21-使用CRISPR-CAS系统制备里氏木霉的基因缺陷菌株
将具有C末端标签核定位信号(nls)的Cas9核酸酶序列密码子优化以在里氏木霉中表达。使用基本的克隆载体和标准程序在构成型gpdA启动子和trpC终止子序列控制下克隆该序列。用以下成分构建最终的Cas9核酸酶表达载体：pep4蛋白酶(或任何其他合适的蛋白酶)基因座5’侧翼序列+pgpdA-Cas9-nls-ttrpC盒+pyr4-hygR双选择盒和pyr4环出序列+pep4蛋白酶基因座3’侧翼序列。用酵母重组方法将载体构建到PRS426骨架；用PCR引物制备载体成分之间的重叠。用peg-介导的原生质体转化法将Cas9核酸酶表达载体转化至野生型里氏木霉M124菌株或以上制备的或在WO/2013/174927或WO/2013/102674中制备的任何其他里氏木霉菌株，同时制备pep4蛋白酶缺失。然后将所得菌株Cas9_M124作为背景菌株用于转染通过PCR制备的短暂gRNA盒，如Dicarlo等2013所述(Genome engineering inSaccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems；NAR41:4336-4343)。或者，用木霉同源物替换来自酿酒酵母的RNA聚合酶III SNR52启动子和SUP4 3’侧翼区。CAS9核酸酶的精确基因靶向所需的引导RNA位于启动子和3’侧翼区之间。引导RNA由以下组成：与所需基因组靶标互补的20nt长的序列，随后是与NGG互补的3nt PAM(前间区序列邻近基序)序列和CAS9活性所需的恒定3’部分。示例性引导RNA如表21.1所示，用于对于异源蛋白生产有害的各种蛋白酶和糖酶。基因组靶标选自水解酶或来自里氏木霉聚糖生物合成通路的酶。通过电穿孔或其他基础基因转移方法将短暂引导RNA盒(单个或多个)引入Cas9_M124原生质体。基于降低的蛋白酶活性(由所需基因组靶标序列的CAS9产生的点突变引起)选择蛋白酶缺陷克隆。通过聚糖图谱选择具有靶向聚糖生物合成通路的点突变的克隆。单孢纯化后，通过PCR扩增基因组靶基因座和测序PCR产物来表征所选克隆以验证使基因失活的点突变。
产生引导RNA的另一种方式是如Gao和Zhao所述，表达来自RNA聚合酶II转录的启动子的一个或多个序列并将自加工的核酶序列置于引导RNA两侧(Self-processing ofribozyme flanked RNA's into guide RNA's in vitro and in vivo for CRISPRmediated genome editing；Journal of Integrative plant biology,56:343-349)。图19示出适合缺失的蛋白酶亚组的系统发生树。
表21.1靶向里氏木霉蛋白酶和ALG3的引导RNA序列
实施例22-里氏木霉菌株M629和M507的转录组分析
在发酵罐中用标准酵母提取物和麦糟提取物培养基培养里氏木霉菌株M629(MAB01,pcDNAl-(Kre2)huGntl,pgpdA-(nat)huGnt2,Δpep1 tsp1 slp1 gap1 gap2 pep4pep3)(如WO2013/102674的实施例19所述)和M507(MAB01,Δpep1 tsp1 slp1 gap1 gap2pep4 pep3)(如WO2013/102674的实施例6所述)。从第1、3和4天(酵母提取物培养基)以及第1、3和5天(麦糟提取物培养基)收集的样品中用标准方法纯化总RNA。根据试剂盒说明用Machery-Nagel nucleotrap mRNA试剂盒从总RNA样品中纯化mRNA。用IlluminaTruSeqStranded mRNA Sample Prep试剂盒将其转化成cDNA并准备测序。收集250-450碱基对的产物用Illumina hiScanSQ测序仪进行测序(100+8(指数)+100个循环，双末端运行)。
对于统计学分析，如下处理序列读数：清理来自测序的9134个基因读数(即除去所有值为0或在条件下平均所有低于0.1的基因)，其形成8525个基因读数。在8525个基因中，基于与其他鉴定的木霉蛋白酶或其他丝状真菌(曲霉、链孢霉)蛋白酶的序列相似性鉴定潜在的蛋白酶基因。以下蛋白酶在不同时间点和/或培养基条件显示恒定或调节的表达水平(基于FPKM值；片段/kb外显子/定位的1000000个片段)，因此应当被删除：金属蛋白酶mp1(TR122703)、蛋白酶(TR80843)、肽酶(TR72612),蛋白酶(TR47127)、肽酶(TR77577)、pep13(TR76887)、蛋白酶(TR56920)、羧肽酶(TR120998),蛋白酶(TR65735)、肽酶(TR82141)、金属蛋白酶(TR121890)、肽酶(TR22718)、肽酶(TR21659)、mp5(TR73809)、蛋白酶(TR82452)、肽酶(TR81115)、肽酶(TR64193)、蛋白酶(TR23475)、肽酶(TR79485)、mp3(TR4308)、蛋白酶(TR122083)、羧肽酶(TR61127)、肽酶(TR80762)、肽酶(TR56853)、肽酶(TR22210)、蛋白酶(TRl11694)、mp4(TR53343)、mp2(TR122576)、蛋白酶(TR40199)、蛋白酶(TR75159)、amp2(TR108592)、蛋白酶(TR21668)、amp1(TR81070)、蛋白酶(TR61912)、蛋白酶(TR58387)、蛋白酶(TR82577)、蛋白酶(TR81087)、pep10(TR78639)、pep16(TR1 10490)、pep7(TR58669)、pep14(TR108686)、pep6(TR68662)和蛋白酶(TR66608)。
实施例23-制备mp1或mp5缺失菌株
用酵母同源重组构建金属蛋白酶mp1(tre122703)的缺失质粒pTTv468。该质粒具有用于环出pyr4标志物的mp1 3’直接重复。NotI消化的质粒(来自具有源自质粒pTTv194的hygr-pyr4双标志物的质粒)用作骨架。用表23.1所列的寡聚物通过PCR构建mp1 3’直接重复和pyr4标志物。如上所述用酵母同源重组克隆组装pTTv468载体。
表23.1用于克隆mp1(tre122703)缺失载体pTTv468的引物
为了制备15倍蛋白酶缺失菌株，用pTTv468的MssI片段转化14倍蛋白酶缺失菌株M1199(M1162的pyr4-)。用pyr4选择的标准原生质体转化法进行转化。将转化板上生长的克隆在选择板上挑选，并用表23.2所示的引物筛选缺失盒的正确整合。
表23.2用于筛选的引物
T1100_mp1_screen_5flk_fwd GTCTTGGCCATCAATGGAGT(SEQ ID NO：1037)
488_pyr4_5utr_rev GGAGTTGCTTTAATGTCGGG(SEQ ID NO：428)
T061_pyr4_orf_screen_2F TTAGGCGACCTCTTTTTCCA(SEQ ID NO：382)
T1101_mp1_screen_3flk_rev ACGGCTTACGAACAACGAGT(SEQ ID NO：1038)
T1102_mp1_orf_fwd ACATCCTGGCCGATATTCTG(SEQ ID NO：1039)
T1103_mp1_orf_rev GCTGTAGCTGGTGGAGAAGC(SEQ ID NO：1040)
用酵母同源重组构建金属蛋白酶mp5(tre73809)的缺失质粒pTTv469。该质粒具有用于环出pyr4标志物的mp5 3’直接重复。用表23.3所列的引物通过PCR构建mp5 3’直接重复和pyr4标志物。
表23.3用于克隆mp5(tre73809)缺失载体pTTv469的引物
为了制备15倍蛋白酶缺失菌株，用pTTv469的MssI片段转化14倍蛋白酶缺失菌株M1199(M1162的pyr4-)。用pyr4选择的标准原生质体转化法进行转化。将转化板上生长的克隆在选择板上挑选，并用表23.4所示的引物筛选缺失盒的正确整合。
表23.4用于克隆缺失载体pTTv469的引物
实施例47-制备具有slp3缺失的13倍蛋白酶缺失菌株
为了制备具有Δslp3的13倍蛋白酶缺失菌株，用pTTv425的MssI片段转化12倍蛋白酶缺失菌株M901(M893的pyr4-)。如上所述进行转化和筛选克隆。获得一个原始转化体，三轮纯化后，通过PCR再次检查克隆(参见表6-1)。将亚克隆命名为M1075。

Claims (16)

1.一种丝状真菌细胞，其包含蛋白酶活性降低或没有的至少一种内源蛋白酶和编码异源多肽的重组多核苷酸，其中所述细胞具有蛋白酶活性降低或没有的一种或多种以下蛋白酶：amp2、mp1、mp2、mp3、mp4、mp5、pep9、amp1和sep1。
2.如权利要求1所述的丝状真菌细胞，其中所述真菌细胞是木霉真菌细胞、毁丝霉真菌细胞、曲霉真菌细胞、链孢霉真菌细胞、青霉细胞、镰刀菌细胞或金孢霉真菌细胞。
3.如权利要求1-2任一项所述的丝状真菌细胞，其中所述总蛋白酶活性降低至其中蛋白酶活性没有降低的相应亲本丝状真菌细胞的总蛋白酶活性的40％或更少，优选6％或更少。
4.如前述权利要求任一项所述的丝状真菌细胞，其中所述细胞进一步具有蛋白酶活性降低或不可检测的至少三种或四种选自pep1、pep2、pep3、pep4、pep5、pep8、pep11,pep12、tsp1、slp1、slp2、slp3、slp7、gap1和gap2的蛋白酶。
5.如前述权利要求任一项所述的丝状真菌细胞，其中所述细胞具有蛋白酶活性降低或没有的至少八种蛋白酶，编码所述八种蛋白酶的各基因包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，所述八种蛋白酶是：
a.pep1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、amp2，
b.pep1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、amp1，
c.pep1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、sep1，
d.pep1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep9，或
e.pep1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2。
6.如前述权利要求任一项所述的丝状真菌细胞，其中所述细胞具有蛋白酶活性降低或没有的至少九种蛋白酶，编码所述九种蛋白酶的各基因包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，所述九种蛋白酶是pep1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2和sep1。
7.如前述权利要求任一项所述的丝状真菌细胞，其中所述细胞具有蛋白酶活性降低或没有的至少十种蛋白酶，编码所述十种蛋白酶的各基因包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，所述十种蛋白酶是pep1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8。
8.如前述权利要求任一项所述的丝状真菌细胞，其中所述细胞具有蛋白酶活性降低或没有的至少11种蛋白酶，编码所述11种蛋白酶的各基因包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，所述11种蛋白酶是pep1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2。
9.如前述权利要求任一项所述的丝状真菌细胞，其中：
(i)所述细胞具有蛋白酶活性降低或没有的至少12种蛋白酶，编码所述12种蛋白酶的各基因包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，所述12种蛋白酶是pep1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、slp7；
(ii)所述细胞具有蛋白酶活性降低或没有的至少13种蛋白酶，编码所述13种蛋白酶的各基因包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，所述13种蛋白酶是
pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、pep9；
pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、slp7；
pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、slp3；
(iii)所述细胞具有蛋白酶活性降低或没有的至少14种蛋白酶，编码所述14种蛋白酶的各基因包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，所述14种蛋白酶是pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、pep9、slp2；或
(iv)所述细胞具有蛋白酶活性降低或没有的至少15种蛋白酶，编码所述15种蛋白酶的各基因包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，所述15种蛋白酶是
pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、pep9、slp2、mp1；或
pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、pep9、slp2、mp5。
10.如权利要求9所述的丝状真菌细胞，其中所述细胞具有至少16种、至少17种、至少18中、至少19种、或至少20种或更多种蛋白酶活性降低或没有的蛋白酶，且进一步包含至少一个或多个其他突变，各其他突变降低或消除相应的其他蛋白酶活性，且所述至少一个其他蛋白酶选自：
天冬氨酸蛋白酶pep6、pep10、pep13、pep14或pep16；
slp样蛋白酶slp57433、slp35276、slp60791或slp109276；
gap样蛋白酶gap3或gap4；
sedolisin样蛋白酶sed2、sed3或sed5；
选自蛋白酶65735、蛋白酶77577、蛋白酶81087、蛋白酶56920、蛋白酶122083、蛋白酶79485、蛋白酶120998或蛋白酶61127的A组蛋白酶；
选自蛋白酶21659、蛋白酶58387、蛋白酶75159、蛋白酶56853、或蛋白酶64193的B组蛋白酶；
选自蛋白酶82452、蛋白酶80762、蛋白酶21668、蛋白酶81115、蛋白酶812141、或蛋白酶23475的C组蛋白酶；
选自蛋白酶121890、蛋白酶22718、蛋白酶47127、蛋白酶61912、蛋白酶80843、蛋白酶66608、蛋白酶72612或蛋白酶40199的D组蛋白酶；或
选自蛋白酶22210、蛋白酶111694、蛋白酶82577的E组蛋白酶。
11.如前述权利要求任一项所述的丝状真菌细胞，其中所述哺乳动物多肽选自抗体及其抗原结合片段、生长因子、干扰素、细胞因子和白细胞介素。
12.如前述权利要求任一项所述的丝状真菌细胞，其中所述真菌细胞进一步包含具有降低活性的ALG3。
13.如权利要求12所述的丝状真菌细胞，其中编码ALG3的基因包含降低或消除相应活性的突变。
14.如前述权利要求任一项所述的丝状真菌细胞，进一步包含N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域和任选的N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域。
15.一种提高多肽稳定性的方法，包括：
a)提供前述权利要求任一项所述的丝状真菌细胞；和
b)培养所述细胞以表达异源多肽，
其中所述异源多肽与其中蛋白酶活性没有降低的相应亲本丝状真菌细胞中产生的异源多肽相比稳定性增加。
16.一种制备异源多肽的方法，包括：
a)提供权利要求1-14任一项所述的丝状真菌细胞；
b)培养所述细胞以表达异源多肽；和
c)纯化所述异源多肽。
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