PT103780A - Sequência de dna que codifica um transportador específico para l- arabinose, molécula de cdna, plasmideo compreendendo a referida sequência de dna, célula hospedeira transformada com esse plamídeo e sua aplicação. - Google Patents

Abstract

A PRESENTE INVENÇÂO DIZ RESPEITA A CÉLULAS HOSPEDEIRAS DE MICRORGANISMOS GENETICAMENTE MODIFICADAS POR INTRODUÇÃO DUMA SEQUÊNCIA DE ÁCIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICA UM TRANSPORTADOR ESPECÍFICO DE L-ARABINOSE PROVENIENTE DE UMA LEVEDURA. AS CÉLULAS HOSPEDEIRAS SÃO DE PREFERÊNCIA AS DE UM MICRORGANISMO EUCARIÔNTICO TAL COMO LEVEDURAS OU FUNGOS FILAMENTOSOS. A INVENÇÂO É ÚTIL PARA A UTILIZAÇÃO COMPLETA DOS AÇÚCARES OBTIDOS A PARTIR DA BIOMASSA VEGETAL E DE OUTROS MATERIAIS LENHO-CELULÓSICOS, DE IMPORTÂNCIA BIOTECNOLÓGICA NA PRODUÇÃO DE BIOETANOL OU DE OUTROS COMPOSTOS, UTILIZANDO MICRORGANISMOS MODIFICADOS GENETICAMENTE PARA CONSUMIR E FERMENTAR L-ARABINOSE NA MISTURA DE HEXOSES E PENTOSES RESULTANTES DE MATÉRIAS- PRIMAS DE INTERESSE INDUSTRIAL.

Description

DESCRIÇÃO "SEQUÊNCIA DE DNA QUE CODIFICA UM TRANSPORTADOR ESPECÍFICO PARA L-ARABINOSE, MOLÉCULA DE cDNA, PLASMIDEO COMPREENDENDO A REFERIDA SEQUÊNCIA DE DNAf CÉLULA HOSPEDEIRA TRANSFORMADA COM ESSE PLASMÍDEO E SUA APLICAÇÃO"

OBJECTO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a uma sequência de DNA que contém a reqião codificante de um novo qene correspondente a um transportador especifico para L-arabinose com elevada capacidade de transporte o qual uma vez inserido numa levedura, preferencialmente Saccharomyces cerevisiae, a modifica no que respeita à capacidade para utilizar L-arabinose com maior eficiência. 0 objectivo da presente invenção é dotar a área das biorefinarias e da produção de bioetanol com uma levedura geneticamente modificada capaz de consumir L-arabinose mais rapidamente e com maior especificidade em misturas com D-glucose e D-xilose e de fermentar L-arabinose com produtividade mais elevada.

ESTADO DA TÉCNICA A grande dependência de petróleo e de outros combustíveis fósseis, em conjunto com a grande preocupação na redução das emissões de gases com efeito de estufa e nas consequentes alterações climáticas, colocaram no centro das atenções as energias renováveis e, em particular, a produção de biocombustíveis integrados no conceito amplo de 1/13 biorefinaria. As biorefinarias visam a utilização de microrganismos na conversão de biomassa em compostos de valor acrescentado. Os principais produtos destas biorefinarias são biocombustíveis, nomeadamente o bioetanol. Actualmente, são utilizados cereais ou outros substratos de origem agrícola (à base de amido ou sacarose), ricos em hexoses, para a produção industrial de etanol pela levedura Saccharomyces cerevisiae. No entanto, os materiais lenho-celulósicos são os mais abundantes no universo da biomassa vegetal. Constituem o principal produto florestal e uma fracção considerável dos desperdícios da exploração agrícola. 0 desenvolvimento de processos para a bioconversão desta biomassa em produtos de valor acrescentado, nomeadamente em etanol, é potencialmente muito importante e fortemente estimulado. A componente celulósica dos materiais lenho-celulósicos é exclusivamente formada por polímeros de glucose, enquanto a fracção hemicelulósica é composta por polímeros que contêm uma mistura de hexoses (D-glucose, D-galactose, D-manose) e de pentoses (D-xilose, L-arabinose). A D-xilose é a principal pentose presente nas hemiceluloses, podendo chegar até cerca de 40% da fracção de hidratos de carbono. A L-arabinose também está presente e com frequência em quantidades significativas, principalmente em resíduos agrícolas, podendo atingir 20% da fracção de hidratos de carbono. Grande parte destas pentoses (D-xilose e L-arabinose) é passível de ser recuperada como açúcares fermentáveis nos hidrolisados de hemicelulose. A utilização de materiais lenho-celulósicos para uma produção economicamente rentável de etanol por S. cerevisiae requer que as pentoses sejam totalmente fermentadas. No entanto, esta levedura não tem capacidade natural para utilizar D-xilose e L-arabinose. Existem outras leveduras e 2/13 diferentes grupos de microrganismos com esta capacidade, mas não são necessariamente adequados para produzir etanol e para utilização industrial. S. cerevisiae é claramente a melhor levedura adaptada a este ambiente agressivo, mantendo, em muitos casos boa capacidade fermentativa. Têm sido utilizadas diferentes estratégias para produzir estirpes recombinantes de S. cerevisiae com capacidade de utilizar D-xilose e L-arabinose. Por utlizar entende-se que a D-xilose ou a L-arabinose pode ser usada como fonte de carbono e de energia e convertida em biomassa, etanol ou outros compostos com utilidade.

Para que S. cerevisiae passasse a utilizar D-xilose foram usadas duas estratégias distintas: a expressão de dois genes de Pichia stipitis, correspondentes à xilose redutase (XR) , que reduz D-xilose a xilitol, e à xilitol desidrogenase (XDH), que oxida xilitol a D-xilulose; e a expressão do gene correspondente à xilose isomerase (XI), de Thermus thermophilus ou de Piromyces sp., que converte directamente D-xilose em D-xilulose. Esta já é naturalmente metabolizada por S. cerevisiae, através da via das pentoses fosfato e da via glicolitica.

Para que S. cerevisiae passasse a utilizar L-arabinose foram usadas duas estratégias distintas. Uma envolveu a introdução da via metabólica presente em bactérias e que correspondeu à expressão do gene correspondente à L-arabinose isomerase (AI) de Bacillus subtilis, em conjunto com os genes correspondentes à L-ribulose cinase (RK) e à L-ribulose-5-fosfato-4-epimerase (RPE) de Escherichia coli (W02003095627). Outra abordagem envolveu a expressão de dois genes heterólogos numa estirpe de S. cerevisiae já modificada com XR e XDH: um gene de Trichoderma reesei, correspondente à enzima L-arabitol-4-desidrogenase (LAD), que oxida L-arabitol a L-xilulose, e 3/13 a expressão do gene da L-xilulose redutase (LXR) de T. reesei ou de Ambrosíozyma monospora, que reduz L-xilulose a xilitol (W02002066616 e W02005026339). A enzima XR é inespecifica podendo converter L-arabinose em L-arabitol, enquanto que a enzima XDH converte o xilitol, produzido através da LAD e LXR, em D-xilulose.

Conjugando estratégias, foi construída uma estirpe de S. cerevisiae capaz de utilizar D-xilose e L-arabinose, obtida por combinação da expressão heteróloga dos conjuntos XR/XDH e AI/RK/RPE (W02006096130).

Embora as melhores estirpes de S. cerevisiae produzidas para a fermentação de D-xilose já originem bons rendimentos em etanol, mas com produtividades que ficam ainda muito aquém das obtidas quando a levedura fermenta glucose, no que respeita à fermentação de L-arabinose não existem ainda estirpes de S. cerevisiae com bons rendimentos e produtividades em etanol. O transporte dos açúcares do meio ambiente para dentro da célula pode ser um obstáculo para a fermentação eficiente de pentoses por S. cerevisiae. Nesta levedura, a L-arabinose é um substrato fraco da GAL2, um transportador inespecífico capaz de transportar D-galactose, D-glucose D-xilose e L-arabinose. No entanto, a sobre-expressão do gene correspondente a GAL2 melhorou a capacidade fermentativa de L-arabinose na estirpe de S. cerevisiae modificada com o conjunto AI/RK/RPE. Apesar disso, esta estirpe apresenta valores de rendimento em etanol e produtividade muito baixos. O rendimento em etanol e a produtividade serão beneficiados quando forem obtidas estirpes de S. cerevisiae com uma eficiente capacidade fermentativa de pentoses. São 4/13 necessários transportadores específicos de pentoses para aumentar o fluxo metabólico e a consequente produção de etanol, pela via fermentativa, ou de outros compostos obtidos a partir dos açúcares presentes nos hidrolisados hemicelulósicos provenientes do tratamento de biomassa vegetal. A expressão no microrganismo, preferencialmente na levedura S. cerevisiae, de um transportador específico de L-arabinose com elevada capacidade de transporte será uma mais-valia para a utilização eficiente desta pentose.

Entre as leveduras capazes de utilizarem naturalmente L-arabinose, Candida arabinofermentans PYCC 5603T, Pichía guilliermondii PYCC 3012 e Ambrosíozyma monospora PYCC 4390T destacaram-se pela elevada taxa específica de crescimento. Foi demonstrado que as duas primeiras possuíam dois tipos de sistemas de transporte para L-arabinose, um do tipo difusão facilitada, com elevada capacidade de transporte e com grande especificidade (incapaz de transportar D-xilose e D-glucose), e outro do tipo simporte L-arabinose/protão, com maior afinidade para L-arabinose mas com muito menor capacidade de transporte e especificidade. C. arabinofermentans PYCC 5603T foi considerada adequada para isolar o gene do transportador de elevada capacidade e específico para L-arabinose (ART1) a ser expresso em S. cerevisiae.

Apesar dos avanços já verificados, as leveduras recombinantes até agora desenvolvidas não demonstram eficiência suficiente na produção de etanol a partir de L-arabinose. Há necessidade de melhorar o estado da técnica para utilizar materiais lenho-celulósicos em biorefinarias, 5/13 nomeadamente para a produção de bioetanol à escala industrial.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção disponibiliza um meio para que o processo de utilização de materiais lenho-celulósicos seja mais eficiente e economicamente mais rentável, nomeadamente na produção de bioetanol. A solução deste problema baseia-se no facto dos presentes inventores terem identificado e isolado um gene que codifica um transportador de C. arabinofermentans com uma surpreendente capacidade de transporte e especificidade para a L-arabinose, quando comparado com transportadores de açúcares que ocorrem naturalmente em leveduras fermentativas por excelência. As sequências de aminoácidos e os genes codificantes não são conhecidos para um transportador especifico e de alta capacidade de L-arabinose. Um destes genes é agora revelado. Uma vez que o transportador é específico para L-arabinose, não utilizando D-xilose ou D-glucose como substratos, quando o gene correspondente é inserido numa célula hospedeira, este gene torna-a potencialmente mais eficiente a consumir e fermentar a L-arabinose presente na mistura de hexoses e pentoses resultante de biomassa (ou material lenho-celulósico), uma das matérias-primas de interesse industrial, nomeadamente para a produção de bioetanol.

Assim, um primeiro aspecto da invenção refere-se a um fragmento de DNA isolado que codifica um transportador de elevada capacidade de transporte e especificidade para L-arabinose, caracterizado por compreender: 6/13 a) uma sequência nucleotídica SEQ ID No. 1; ou b) uma variante funcionalmente equivalente da sequência nucleotídica SEQ ID No. 1, ou as suas sequências complementares.

Num segundo aspecto, a invenção diz respeito a uma molécula de cDNA caracterizada por compreender: a) uma sequência nucleotídica SEQ ID No. 1; ou b) uma variante funcionalmente equivalente da sequência nucleotídica SEQ ID No. 1, ou as suas sequências complementares.

Num terceiro aspecto, a invenção diz respeito a plasmídeos caracterizados por compreender um fragmento de DNA de acordo com a reivindicação 1.

Num quarto aspecto, a invenção refere-se a uma célula hospedeira caracterizada por ser transformada com o fragmento de DNA de acordo com a reivindicação 1, de forma a permitir que a célula hospedeira expresse o referido transportador de L-arabinose.

Num último aspecto, a invenção diz respeito a um processo para a utilização de biomassa vegetal ou de outros materiais lenho-celulósicos na produção de etanol ou de outros compostos, caracterizado por compreender a utilização de L-arabinose a partir de um meio incluindo uma fonte de L-arabinose com uma célula hospedeira transformada de acordo com as reivindicações 4 a 6, em que a célula hospedeira utilize L-arabinose, originando compostos de valor acrescentado, como o etanol. 7/13

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1: Electroforese em gel de poliacrilamida desnaturante (10% T) de 20 pg de proteína total de membranas plasmáticas e mitocondriais isoladas a partir de células de C. arabinofermentans cultivadas em 0,5% L-arabinose (Ara) ou 0.5% D-glucose (Glu). O gel foi corado com Azul de Coomassie. M - Marcador Sigma (Wide Range), MW - peso molecular; pm - membranas plasmáticas; mm membranas mitocondriais.

Figura 2: Sequência de aminoácidos da região N-terminal da proteína Artlp e primers degenerados desenhados a partir desta região.

Figura 3: Análise por Northern blot da expressão do gene ART1. 0 RNA total foi isolado a partir de culturas de C. arabinofermentans PYCC 5603T em meio mineral contendo 0,5% L-arabinose (L-Ara) ou 0.5% D-glucose (D-Glu) como única fonte de carbono e energia. Cada amostra contém 10 pg de RNA total, separado num gel desnaturante de agarose 1,2% e transferido em seguida para uma membrana de nylon (Hybond-N) . Um fragmento de 810 pb, amplificado do DNA genómico de C. arabinofermentans PYCC 5603T com os primers ATCA05_FOR (5'-ACAATGGTCAATTGAATGGGGTAT-3') e ATCA06_REV (5'-GCAGCAGCT GACATACCTTTTGAT-3'), foi usado como sonda específica para o gene ART1. A sonda foi marcada com [oí-32P]-ATP (Amersham Biosciences) usando Prime-a-Gene Labelling System (Promega). A hibridação e lavagem foram feitas tal como descrito por Griffioen et al. (1996).

Figura 4: a) Sequência nucleotídica do gene ART1 (SEQ ID No. 1), do primeiro (ATG) ao último codão (TAA); b) Sequência de aminoácidos da proteína Artlp. 8/13

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, foi desenvolvido um processo para expressar em Saccharomyces cerevisiae um transportador especifico de L-arabinose. Este processo inclui a introdução de DNA heterólogo em leveduras que passam a integrar um gene para o transporte de L-arabinose, com elevada especificidade e capacidade de transporte.

Um processo foi seguido para o isolamento, clonagem e expressão do gene a que se refere esta invenção. No entanto, processos alternativos podem ser usados pelos conhecedores da arte.

Identificação do transportador especifico de L-arabinose por SDS-PAGE 0 transportador especifico de L-arabinose de C. arabinofermentans foi identificado por comparação da abundância relativa das proteínas presentes em membranas plasmáticas isoladas de células de C. arabinofermentans cultivadas em condições de indução e de repressão. Com este objectivo, membranas plasmáticas e membranas mitocondriais foram isoladas de células cultivadas em meio mínimo (Verduyn et al., 1992) contendo, alternativamente, 0,5% de L-arabinose ou 0,5% de D-glucose como única fonte de carbono e energia. As células foram recolhidas na fase exponencial de crescimento (DOô4o =0,8-2,0) e lavadas duas vezes com água destilada gelada e uma vez com tampão A (0,1 M glicina, 0,3 M KC1, pH 7,0). Dez a quinze gramas de células foram depois ressuspendidos em 15 ml de tampão A contendo 0,1 mM PMSF. O isolamento das membranas decorreu a partir deste passo tal como foi descrito por Van Leeuwen et al. (1991). Com alíquotas (20 pg) das amostras obtidas foi 9/13 feita uma electroforese em gel de poliacrilamida desnaturante na presença de tricina (Tricine SDS-PAGE; Schágger, 1994). As concentrações de acrilamida e bisacrilamida usadas no gel foram de 10%T e 3%C (%T=concentração total de acrilamida+bisacrilamida e %C=percentagem de bisacrilamida relativamente ao total). As amostras de membranas plasmáticas apresentaram um padrão de bandas claramente diferente do apresentado pelas amostras correspondentes de membranas mitocondriais (Figura 1), o que indica que ocorreu uma separação eficiente dos dois tipos de membranas. Concluiu-se, consequentemente, que as diferenças observadas entre os padrões de bandas das amostras de membranas plasmáticas correspondentes às diferentes fontes de carbono não são consequência de contaminação por proteínas mitocondriais. A diferença mais notória entre as três amostras de membranas plasmáticas está indicada pela seta na Figura 1. Corresponde a uma proteína de cerca de 40 kDa de peso molecular que está presente apenas em membranas plasmáticas de células cultivadas em 0,5% de L-arabinose. Como o peso molecular desta proteína está na gama esperada para um transportador de açúcares, considerou-se que a banda corresponderia, ao transportador de L-arabinose de C. arabinofermentans.

Clonagem do cDNA que codifica o transportador especifico de L-arabinose A proteína de membrana identificada como descrito foi isolada a partir dum gel preparativo carregado com 250 pg de proteína de membrana total de células de C. arabinofermentans cultivadas em 0,5% de L-arabinose. Após electroforese, as proteínas foram transferidas para uma membrana de PVDF (sequi-blot da BIO-RAD) . A electroforese e a transferência foram feitas de acordo com 10/13 as instruções do fabricante. As partes, quer do gel quer da membrana, contendo a proteína de interesse foram excisadas e utilizadas para sequenciação da extremidade N-terminal da proteína (Protein Core Facility, Columbia University, EUA). A sequência de 15 aminoácidos obtida está indicada na Figura 2. A partir desta sequência foram desenhados primers degenerados (Figura 2) . Estes primers foram usados para amplificar o cDNA através da técnica de RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) a partir de RNA total de células cultivadas em 0,5% de L-arabinose. Utilizou-se para este fim o First Choice RLM-RACE kit (Ambion) , de acordo com as instruções do fabricante. O RNA foi extraído tal como descrito por Griffioen et al. (1996) e depois purificado usando o RNA cleanup protocol (RNeasy kit, Quiagen) . Esta amostra de RNA foi usada como molde para o protocolo de 3'-RACE, em combinação com os primers ATCAO1D_F0R e ATCA02D_FOR (5'-TTYGGIAAYMGICARATGCC-3' e 5'-AARTTYTAYAAYCCITAYATG-3', respectivamente; I=inosina, Y=C/T, R=A/G, M=A/C). Como o desenho dos primers se baseou na sequência dos primeiros aminoácidos da proteína, era de esperar que a reacção de 3'-RACE produzisse o cDNA praticamente completo. De facto, obteve-se nesta reacção um produto de cerca de 1,7 kb que foi clonado no vector pMOSBlue (Amersham Biosciences) e sequenciado usando um sequenciador automático ALF Express (Amersham Pharmacia Biotech) e primers marcados com Cy5 específicos para sequências do vector. A proteína codificada por esta molécula apresentava as propriedades características dum transportador de açúcar. Seguiu-se uma análise por Northern blot, que demonstrou que o respectivo mRNA era muito abundante em células cultivadas em 0,5% de L-arabinose mas não era detectável em células cultivadas em 0.5% de glucose (Figura 3). 11/13 A extremidade 5' do cDNA foi obtida através de 5'-RACE, usando o primer ATCA03_REV (5' -CTGAACCAATAATCCAAAATCCAC-3' ) . 0 fragmento obtido foi clonado e sequenciado tal como descrito no parágrafo anterior, ficando demonstrado que o cDNA codifica um aminoácido adicional (a metionina de iniciação) e uma sequência 5' não traduzida de 29 aminoácidos. 0 novo gene foi designado ART1 {ARabinose Transporter 1). A respectiva sequência nucleotidica (SEQ ID No. 1) é apresentada na Figura 4.

Expressão em S. cerevisiae

Foram construídos diversos plasmídeos contendo o gene ART1 que permitem a expressão do cDNA em S. cerevisiae.

Foi construído um novo vector, usando o plasmídeo YEplacl95 (multi-copy) (Gietz et al., 1988), o promotor truncado do gene HXT7 de S. cerevisiae, o gene ART1 e o terminador do gene PGK de S. cerevisiae. Um fragmento de DNA compreendendo os nucleótidos -392 a -1 do promotor de HXT7 foi amplificado por PCR usando os primers HXT7prom_F0R (5'— AACCTGCAGCTCGTAGGAACAATTTCGG-3’) e HXT7prom_REV (5' -GGACGGGACATATGCTGATTAAAATTAAAAAAACTT-3') e o plasmídeo YEpkHXT7 (Krampe et al. , 1998) como molde. Estes primers

contêm, na extremidade 5' , o local de restrição PstI e NdeI, respectivamente. A região codificante do gene ART1 foi amplificada usando os primers ART1_F0R2 (5'-ATAGCAGATCTCATATGGTTTTCGGTAACAGGCAAAT-3') e ART1_REV2 (5'-ATAGCAGAT C T T C TAGATTAACTATCTAAAGACCGAACG-3') e DNA genómico de C. arabinofermentans PYCC 5603T como molde. Na extremidade 5', estes primers contêm o local de restrição NdeI e XbaI, respectivamente. 0 fragmento contendo o promotor de HXT7 foi digerido com as enzimas PstI e NdeI, o fragmento contendo o gene ART1 foi digerido com NdeI e Xbal e o plasmídeo YEplacl95 foi digerido com PstI e Xbal. Estes três elementos de DNA foram ligados, formando o plasmídeo 12/13 pHXT7p-ARTl. Em seguida, um fragmento de 0,3 kb, contendo a região terminadora do gene PGK, foi amplificado, a partir do plasmideo pMA91, com os primers PGKT_FOR2 (51 — ACCGTGTCTAGATAAATTGAATTGAATTGAAATCGATAG-3') e PGKT_REV (5'-TAATTAGAGCTCTCGAAAGCTTTAACGAACGCAGAA-3' ) que, nas extremidades 5' , contêm locais de reconhecimento para as enzimas Xbal e Saci, respectivamente. O fragmento contendo a região terminadora do gene PGK foi em seguida digerido com estas enzimas e ligado entre os locais Xbal e Saci do plasmideo pHXT7p-ARTl, dando origem ao plasmideo pHXT7p-ARTl-PGKt.

Homologia com outros transportadores O gene ART1 é traduzido numa proteína de 521 aminoácidos (Artlp; Fig. 4) . A análise de semelhanças de sequências de aminoácidos em base de dados disponíveis na Internet permitiu verificar que se trata de uma proteína de membrana (com domínios transmembranares) e com as características de transportador de açúcares. Esta proteína tem homologia com transportadores de açúcares de outras leveduras e fungos filamentosos. Para as sequências de proteína mais próximas não existe registo de estudo funcional (estão registadas nas bases de dados como possíveis transportadores de açúcares ou como proteínas de função desconhecida). A proteína tem ainda uma região de homologia com uma família de transportadores de L-arabinose em bactérias identificada como AraJ (um gene que codifica uma permease de L-arabinose de Escherichia coli).

Lisboa, 30 de Julho de 2007 13/13

Claims (7)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Um fragmento de DNA isolado que codifica um transportador especifico de L-arabinose com elevada capacidade, caracterizado por compreender: a) uma sequência nucleotidica SEQ ID No. 1; ou b) uma variante funcionalmente equivalente da sequência nucleotidica SEQ ID No. 1, ou suas sequências complementares.
2. 2. Uma molécula de cDNA caracterizada por compreender: a) uma sequência nucleotidica SEQ ID No. 1/ ou a) uma variante funcionalmente equivalente da sequência nucleotidica SEQ ID No. 1, ou suas sequências complementares.
3. 3. Um plasmideo caracterizado por compreender um fragmento de DNA de acordo com a reivindicação 1.
4. 4. Uma célula hospedeira caracterizada por ser transformada com o fragmento de DNA de acordo com a reivindicação 1, de forma a permitir que a célula hospedeira expresse o mRNA correspondente.
5. 5. A célula hospedeira de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por ser uma levedura.
6. 6. A célula hospedeira de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por a levedura ser Saccharomyces cerevislae.
7. 7. Processo para a utilização de biomassa vegetal ou outros compostos lenho-celulósicos, na produção de etanol ou outros compostos, caracterizado por compreender a 1/2 utilização de L-arabinose a partir de um meio compreendendo uma fonte de L-arabinose com uma célula hospedeira 6, em que originando transformada de acordo com as reivindicações 4 a célula hospedeira utilize L-arabinose, compostos de valor acrescentado, como o etanol. Lisboa, 30 de Julho de 2007 2/2 FIG. 4 a) 1 atggttttcg gtaacaggca aatgccaaaa ttttataatc catatatgtc agcagctgtt 60 61 gctgctattg gtggttcctt atttggtttt gatgtttcat caatttctgc cattttaggt 120 121 actgatcaat ataatactta ttttggtcaa ccatcttcaa ttatgcaagg tggtataaca 180 181 gcagcaatgt caggtggttc attaattgga tcattattat caggtcaagt ttgtgatatt 240 241 ttaggtagaa aaaaaacaat tatttattca tgtggatttt ggattattgg ttcagtttta 300 301 tgttgtgctt ctcaaaatgt tgcaatgtta attgttggac gtgtttttaa tggattatgt 360 361 gttggtttta catcatctca agttcctgtt tatatctctg aattatcaag aaaagatgtt 420 421 agaggtaaga tggttggtat tcaacaatgg tcaattgaat ggggtatttt aattatgtat 480 481 tacattggat atggttgttc atataataag agtaattcat cttttagaat tccatggggt 540 541 ttacaaatga ttcctgctgt tttattagtt gttttattac caatgttccc agaatctcca 600 601 agatggcttg gatcaaaagg tagatgggaa gaagttcatg atactttagc taagattcat 660 661 gctggtggta atagagaaga tccaattgtt ttagctgaaa taatggaaat tagagaagct 720 721 gttgaaattg aacaaaattc aaatgcttct tatttagcat tatttagtag aaaaaatatt 780 781 tacagaactc atgttggtat tatggctcaa gtttatcaac aattagctgg tggtaatgtt 840 841 atgatgtatt atgttgttta tgttttccaa atggctggtt taacaggttc aattaattta 900 901 attgcatcat caattcaata tgttgtgttt ttaattttca cattccctgt tttattcttt 960 961 attgataaag ttggtcgtag atggttaatg attggtggtt ctatttcaat gggtacttgt 1020 1021 atttggattg ttggtggtgt tttatgtaat tatggtgaat atgttgatga agttggtggt 1080 1081 aataaaaaca ttcatattac tttaaaagat tcacatcatg catcagttgc tgttttattc 1140 1141 ttttcatatt tattcacaat gttttattct ttaacttggg caccaacagc ttgggtttat 1200 1201 gctcctgaag ttttcccatt atatattaga tcaaaaggta tgtcagctgc tgcagctggt 1260 1261 aattggtcaa tgaattttgc attatcattt tatgttcccc ccgcatttga tcaaattggt 1320 1321 tggaaaacat ttgctatttt tggagttttc aatttctttt cagcaattca tatctacttt 1380 1381 ggattccctg aaactggtaa taaatcatta gaagaaattg atgaattatt ctctaaaggt 1440 1441 ggtccaagac catggaagac taaagttggt cattctcact ttgatgaaaa agttgaagaa 1500 1501 ttggttcatg aagatgaaaa accatctgct gatcatgttg aatccgttcg gtctttagat 1560 1561 agttaa 1566 2/3 b) 1 MVFGNRQMPKFYNPYMSAAVAAIGGSLFGFDVSSISAILGTDQYNTYFGQPSSIMQGGIT 61 AAMSGGSLIGSLLSGQVCDILGRKKTIIYSCGFWIIGSVLCCASQNVAMLIVGRVFNGLC 121 VGFTSSQVPVYISELSRKDVRGKMVGIQQWSIEWGILIMYYIGYGCSYIKSNSSFRIPWG 181 LQMIPAVLLVVLLPMFPESPRWLGSKGRWEEVHDTLAKIHAGGNREDPIVLAEIMEIREA 241 VEIEQNSNASYLALFSRKNIYRTHVGIMAQVYQQLAGGNVMMYYVVYVFQMAGLTGSINL 301 IASSIQYVVFLIFTFPVLFFIDKVGRRWLMIGGSISMGTCIWIVGGVLCNYGEYVDEVGG 361 NKNIHITLKDSHHASVAVLFFSYLFTMFYSLTWAPTAWVYAPEVFPLYIRSKGMSAAAAG 421 NWSMNFALSFYVPPAFDQIGWKTFAIFGVFNFFSAIHIYFGFPETGNKSLEEIDELFSKG 481 GPRPWKTKVGHSHFDEKVEELVHEDEKPSADHVESVRSLDS 521 3/3