JP2003250552A - 微生物の生育を増強させる方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】従来の醗酵技術および増殖培地処方では生育困
難な微生物の生育を増強させる方法、ならびに該方法に
おいて生育が増強された微生物の利用。 【解決手段】以下の段階を含む、生育困難な受容微生物
に生育旺盛な微生物の遺伝子を導入することにより、生
育が増強された受容微生物を得る方法を提供する。 （Ａ）生育旺盛な微生物からＤＮＡを抽出する段階 （Ｂ）該抽出ＤＮＡから断片化されたＤＮＡを作製する
段階 （Ｃ）該ＤＮＡを含む遺伝子発現ライブラリーを作製す
る段階 （Ｄ）該遺伝子発現ライブラリーを生育困難な受容微生
物に導入する段階 （Ｅ）該遺伝子導入操作により、生育が増強された受容
微生物を得る段階

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、微生物代謝産物の
利用、醗酵などに有用な微生物の生育増強方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】微生物は生物の持つ高度な機能や生理活
性物質が得られるという産業上に利用するうえで有用で
あり、古くは醸造・醗酵工業から抗生物質や薬理活性物
質にいたるまで、これまでにも様々な有用物質がもたら
されてきた。その代謝あるいは醗酵産物から得られる物
質の構造は人類の想像を上回るものであり、今後もユニ
ークな新規有用物質の探索源として利用価値は高い。ま
た近年、医薬品の研究開発では、薬理活性に対して数万
〜数十万の薬物候補を短期間にスクリーニングすること
が可能となっている。そこで、広範なスクリーニングを
より効率的に行うために、探索源となる薬物候補には様
々な最適化が試みられている。ごく少量であっても、自
然界より取得した試料中には多種多様な微生物が存在し
ている。しかしながら、これらの試料を新たな薬物候補
として利用する際の制約としては、自然界で発見される
微生物の１％未満しか現行の醗酵技術および増殖培地を
使用して培養できないことである。このような背景か
ら、最近では、残り９９％以上の生育困難な微生物から
新規な薬物候補を得る方法として、そこからのＤＮＡ回
収について考案されている。具体的には、次の２法が例
示される。

【０００３】１つの報告では、自然界より得た微生物を
プロトプラスト化または核酸をリポソームに挿入するこ
とで、ドナープロトプラストまたはドナーリポソームを
作製している。これらをプロトプラスト融合またはリポ
フェクション法によって生育が容易な宿主細胞に導入
し、組換え微生物を作製している。この手法により得た
組換え微生物は、外来の生合成遺伝子の導入により、新
たな薬物候補を生産する可能性がある。この報告では、
生育困難な微生物の遺伝子を培養の容易な細胞に導入
し、そこから得た組換え微生物から薬物候補を同定、単
離または生産する方法を提供している。（ＷＯ９７／２
１８０６）さらに別の報告では、微生物の核酸を含む様
々な遺伝子を用いてコンビナトリアル遺伝子発現ライブ
ラリーを作製している。これら生合成に関わる遺伝子を
培養の容易な宿主微生物内に導入し発現させることによ
って、新規な代謝経路および新規な薬物候補を生成させ
る方法を提供している。(ＷＯ９６／３４１１２)

【０００４】これらの方法を行うためには、宿主微生物
が培養培地上で容易に生育していることが前提となる。
また、自然界より生育困難な微生物の遺伝子を入手し宿
主微生物に導入する操作の過程において、意図の有無に
関わらずその遺伝子は断片化されてしまう。したがっ
て、これらの方法では生育困難な微生物のもつ遺伝情報
の一部のみを利用することになり、生育困難な微生物が
持つ薬物候補の生産能力を完全に引き出すことは難し
い。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、従来
の醗酵技術および増殖培地上で生育が困難なために産業
上利用できない微生物に対して、その原因を解決する遺
伝子を導入し、生育を増強させる方法を提供することで
ある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、生育困難
な微生物の生育を増強させる方法を鋭意検討した結果、
増殖培地上で生育が旺盛な微生物の遺伝子の一部（挿入
する遺伝子断片の大きさは好ましくは０．５〜８ｋｂｐ
程度）を生育の悪い微生物に導入すると、生育困難であ
った微生物の生育が増強されることを見出し、本発明を
完成した。

【０００７】即ち、本発明は、増殖培地上で微生物の生
育を増強させる方法において、生育困難な微生物に対し
て生育旺盛な微生物の遺伝子を導入することを特徴とす
る、微生物の生育増強方法に関するものである。

【０００８】すなわち、本発明は以下の（１）〜（６）
のように要約される。 （１）以下の段階を含む、生育困難な受容微生物に生育
旺盛な微生物の遺伝子を導入することにより、生育が増
強された受容微生物を得る方法。 （Ａ）生育旺盛な微生物からＤＮＡを抽出する段階 （Ｂ）該抽出ＤＮＡから断片化されたＤＮＡを作製する
段階 （Ｃ）該ＤＮＡを含む遺伝子発現ライブラリーを作製す
る段階 （Ｄ）該遺伝子発現ライブラリーを生育困難な受容微生
物に導入する段階 （Ｅ） 該遺伝子導入操作により、生育が増強された受
容微生物を得る段階

【０００９】（２）遺伝子が対象の受容微生物と同じ属
の微生物より取得される、（１）記載の方法。 （３）遺伝子の大きさが、０．５ｋｂｐ以上８ｋｂｐ未
満である、（１）記載の方法。 （４）該遺伝子発現ライブラリーがプラスミドまたはベ
クターの形態である、（１）記載の方法。 （５）対象となる受容微生物が放線菌である（１）〜
（４）のいずれかに記載の方法。 （６）前記（１）記載の方法により得られた生育が増強
された受容微生物。

【００１０】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明における生育困難な微生物とは、従来の技術では
生育が困難であり産業上に利用することが不可能な微生
物のことである。例えば、ある微生物の生育が困難な理
由はいくつか考えられる。第１に、生育条件が不適当な
場合がある。 ・ 例えば、温度、湿度、光、酸素濃度等、培養条件が
適当でない場合。 ・ 増殖の速い他の微生物によりコロニー形成が妨げら
れ、分離できない場合。 ・ 他の微生物や生物と共存してのみ増殖可能である場
合。 ・ 高温、高圧、高塩濃度、高酸性条件、高アルカリ条
件等の特殊環境下でのみ生育可能であり、安価、簡便に
培養することが出来ない場合。 このように、微生物の培養条件により代謝機能や遺伝子
の発現機構に障害が生じている場合、その経路を回避す
るような遺伝子を導入し、その代替機能を発現させて生
育を増強させる。あるいは、微生物がその生育の途上で
必須な物質を菌体外から得ている場合、これを生産可能
とする遺伝子を導入、その生育を補強することでより安
価で簡便な増殖培地が使用可能となる。

【００１１】第２に、微生物の能力が変化する場合があ
る。 ・ 例えば、自然界には存在し得ない栄養豊富な条件下
で急激に増殖させるため、生育または継代能力が低下す
る場合。 ・ 生産物内に存在する目的の薬理活性物質の比率を増
加させる等の理由で遺伝子変異処理を行った結果、生育
能力の低下を招く場合。 このように、微生物の生育、保存および変異処理によっ
て、生育に関係する遺伝子に変異または欠損が生じた場
合、これを相補し、その生育を回復させる。第３に、微
生物の生育が遅い場合がある。 ・ 例えば、増殖が遅いために数週間程度では目に見え
るコロニーを形成できず、分離が困難な場合。 このような場合、微生物の増殖や生活環の調節、活性化
に関する遺伝子を導入、その生育速度を増大させる。

【００１２】本発明に用いる生育旺盛な微生物とは、炭
素源、窒素源、リン、イオウ、その他無機塩類、金属
類、ビタミン類などを適当量含む増殖培地において、産
業上利用するに足る菌体量を確保することができる微生
物をいう。例えば産業上利用可能な菌体量を確保できる
微生物とは、以下に述べる微生物を指す。新たに自然界
より微生物を分離する際、対象となる試料を適当な条件
で処理した後増殖培地上に塗沫するが、そこから微生物
を分離する段階において、通常３週間程度の培養でコロ
ニーを目視でき、その後の分離および利用が可能となる
微生物をいう。また、他の例として、産業上利用するに
足る生産物を取得可能な菌体量を確保することの出来る
微生物、および微生物の保存や生産力価改善に必要とさ
れる胞子形成能力など、微生物を産業上取り扱う上で有
用な生育能力を十分に備えた微生物をいう。

【００１３】本発明に用いる産業上利用価値の有る微生
物とは、特に限定されるものではないが、細菌、真菌、
藻類等を挙げることができ、例えば放線菌、真性細菌、
シュードモナス、マイコプラズマ、粘液細菌、変形菌
類、藻菌類、子嚢菌類、担子菌類、不完全菌類、酵母な
どの、陸生微生物、または水生微生物、または海洋微生
物、またはそれらの混合物である。好ましい受容微生物
としては、放線菌が挙げられ、その中で特にストレプト
マイセス属に属す微生物がより好ましい。

【００１４】本発明においては、生育困難な微生物に対
して生育旺盛な微生物の遺伝子を導入する。その際、遺
伝子抽出の対象となる生育旺盛な微生物は、特には限定
されないが、遺伝子を導入する生育困難な受容微生物の
種類に応じて適宜選択されることでよい。より好ましく
は例えば、生育を回復させたい生育困難な微生物と同属
に属する生育旺盛な微生物の遺伝子を選択して使用でき
る。この場合、以下のようないくつかの利点が考えられ
る。同属の微生物同士であれば互いの微生物のコドンの
使用法が類似しており、ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳
が中断されにくい。プロモーターや転写因子結合部位が
類似であり、構造遺伝子の発現においてプロモーター活
性を発揮しやすい。生態メカニズムが類似しており、分
化の過程で変化・欠損した機能を相補できる可能性がよ
り高い。または、真核生物を用いる場合、ｍＲＮＡを適
切にプロセシングする可能性が高い、などが挙げられ
る。さらには、異なる属に由来する遺伝子を導入する場
合であっても、生育困難な微生物でその遺伝子が機能す
るようなプロモーター配列を付加するなど、上記利点を
人為的に補うことで利用性を高めることができる。

【００１５】本発明における生育旺盛な微生物からの染
色体ＤＮＡの調製は、Ｄａｖｉｄ Ａ．Ｈｏｐｗｏｏｄ
らの方法（ＧＥＮＥＴＩＣ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ
ＯＦＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＥＳ Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲ
Ｙ ＭＡＮＵＡＬ （１９８５））など、通常の染色体Ｄ
ＮＡの抽出法に準じて、染色体ＤＮＡを調製し、得られ
た染色体ＤＮＡをＣｌａＩ、Ｓａｕ３ＡＩなどの適当な
制限酵素で処理し、部分消化を行った後アガロースゲル
電気泳動を行い、泳動後のゲルよりＤＮＡを抽出、また
はショ糖密度勾配遠心法などで分画してＤＮＡ断片を得
る。DNA断片と同じ付着末端を生じさせる制限酵素で処
理したベクターに上記で得られたＤＮＡ断片を挿入し、
遺伝子発現ライブラリーを作製する。挿入するＤＮＡ断
片の大きさは、ベクターサイズの制限や、ベクターへの
ＤＮＡの挿入効率などから、好ましくは０．５〜８ｋｂ
ｐ程度であり、さらに好ましくは、２〜６ｋｂｐ程度で
ある。

【００１６】ベクターは、独自に作製したものに加え、
市販されるか、文献記載の公知のものが使用できる（例
えば、市販のものとしてはｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ Ｉ
Ｉ ＫＳ（−）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）等を、文
献記載の公知のものとしてはｐＩＪ７０２（Ｅｄｗａｒ
ｄ Ｋａｔｚら Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９８３），１２９，２７
０３−２７１４）等を使用できる。）。また、本発明の
実施例で用いられているシャトルベクターとは、2種類
の宿主において複製可能で、相互に往復的な利用が出来
るベクターのことである。１つの例として、大腸菌と放
線菌の両方で複製する能力を備えたベクターは、大腸菌
でDNAを調製し放線菌で発現させることができる。

【００１７】本発明における遺伝子発現ライブラリーと
は、生育増強に関する遺伝子を含むライブラリーであっ
て、好ましくは、挿入した遺伝子の発現調節を可能とす
るような遺伝子配列（プロモーター等）を加える。ま
た、さらに好ましくは、対象の微生物で複製可能なベク
ターを用いて作製される。導入後のライブラリー遺伝子
は受容微生物内においてベクターあるいは染色体内に組
み込まれた形として存在する。その結果、ある培地上で
必要な増殖能力を獲得した微生物が作製される。ここ
で、「発現調節」とは、プロモーター配列またはプロモ
ーター領域等を含む、構造遺伝子の転写を調節する機能
を有するものである。また、「発現調節を可能とする」
とは、宿主内でプロモーターの作用下で上記遺伝子のｍ
ＲＮＡへの転写が起こることを意味する。目的のポリペ
プチドをコードする遺伝子は、プロモーター配列を含む
ＤＮＡ断片の下流に結合され、プロモーターの作動によ
りｍＲＮＡに転写される。

【００１８】本発明は、上記定義のＤＮＡ断片または組
換えＤＮＡを含むベクター若しくはプラスミドを提供す
る。ベクターの種類は特に限定されないが、このベクタ
ーによって形質転換される受容微生物の種類に応じて選
択される。ベクターとしては、原核または真核受容微生
物において自立複製可能または染色体中に相同組換え可
能なベクターを使用することが出来る。プラスミド、フ
ァージを含むウイルス、コスミドなどである。ベクター
は、選択マーカー、複製開始点、ターミネーター、ポリ
リンカー、エンハンサー、リボソーム結合部位などを適
宜含むことができる。細菌、真菌、酵母などの原核およ
び真核生物用の、市販、または文献等に記載されている
種々のベクターを利用して（例えば、原核生物用のもの
としてはｐＵＣ１８（東洋紡績社製）やｐＢｌｕｅＳｃ
ｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（−）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社
製）等を、真核生物用のものとしてはｐＥＳＣ（ＳＴＲ
ＡＴＡＧＥＮＥ社製）等を使用できる。）、本発明のＤ
ＮＡ断片をベクターに挿入することが出来る。

【００１９】本発明は、上記に規定するベクターによっ
て形質転換された受容微生物を提供する。ここで受容微
生物は前記したように原核生物（例えば細菌）、真核生
物（例えば菌類）等から選択され、構造遺伝子の発現に
おいてプロモーター活性を発揮できるなら何れの微生物
細胞も使用可能である。特に本発明において好ましい受
容微生物は、放線菌ストレプトマイセス属に属す微生物
である。形質転換法としては、塩化カルシウム法、リン
酸カルシウム法、酢酸リチウム法、エレクトロポレーシ
ョン法、プロトプラスト／PEG法、スフェロプラスト
法、リポフェクション法等を例示できるが、これらに限
定されない。受容微生物は形質転換を行うことが可能な
状態であれば、単一種の微生物でも、複数種の微生物の
混合物でも良い。例えば、人工的に培養が困難な微生物
は、遠心や濾過などによって微生物の濃縮操作を行った
後に形質転換法を行うなど、形質転換効率を高めた状態
で使用することが出来る。

【００２０】本発明は、上記の形質転換した受容微生物
を増殖培地にて培養し、生成した微生物二次代謝産物ま
たは醗酵生産物を回収することを含む。生育が増強され
た微生物の培養過程において生産された物質は、菌体ま
たは培養液またはその混合物より、超音波処理、ホモゲ
ナイジング等で抽出される。この抽出液から、目的の生
産物を単離することができる。単離、精製は、溶媒抽
出、塩析、脱塩、有機溶媒沈殿、限外濾過、イオン交
換、疎水性相互作用、ＨＰＬＣ、ゲル濾過およびアフィ
ニティークロマトグラフィー、電気泳動、クロマトフォ
ーカシングなどの方法を単独または組み合わせて行うこ
とができる。

【００２１】上述したように、本発明によって、従来生
育が困難なため産業利用できなかった微生物に遺伝子を
導入することで、微生物の生育を増強させる方法を提供
する。本発明のこの生育増強方法は、従来培養困難であ
った微生物を、増殖培地上で安価・簡便に増殖させるこ
とが可能であり、そこから得られる生産物は新たな薬物
候補を、醗酵過程は新たな製造法を提供することが可能
である。

【００２２】

【実施例】以下、本発明を実施例によって具体的に説明
するが、本発明はこれらのみによって限定されるもので
はない。 実施例１ 放線菌由来ｔｓｒ遺伝子プロモーターを含む放線菌−大
腸菌シャトルベクターの構築放線菌由来のベクターｐＩ
Ｊ７０２（Ｅｄｗａｒｄ Ｋａｔｚら Ｊｏｕｒｎａｌｏ
ｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｉｇｙ（１９８
３），１２９，２７０３−２７１４：図１に示した）と
大腸菌由来のベクターｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ Ｋ
Ｓ（−）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製：図２に示した）
を用いて以下のようにしてシャトルベクターを構築し
た。ｐＩＪ７０２を制限酵素ＳａｃＩＩで切断し、ｒｅ
ｐ遺伝子を含む２３１１ｂｐの断片をｐＢｌｕｅＳｃｒ
ｉｐｔＩＩ ＫＳ（−）の制限酵素ＳａｃＩＩ切断部位
に挿入しｐＢＳ／２３１１を得た。ｐＩＪ７０２を制限
酵素ＢａｍＨＩで切断したＤＮＡを鋳型とし、プライマ
ー１及びプライマー２を用い、ＰＣＲ法で増幅した断
片、すなわちｔｓｒ遺伝子プロモーターとｔｓｒ遺伝子
の１〜１０アミノ酸残基及び終止コドンを含む２４９ｂ
ｐの断片を得た。

【００２３】このＤＮＡ断片を制限酵素ＫｐｎＩ及び制
限酵素ＣｌａＩで両端を切断し、制限酵素ＫｐｎＩ及び
制限酵素ＣｌａＩで切断したｐＢＳ／２３１１に挿入
し、ｐＬｉｖ１／−Ｓｔａｂｉｌｉｔｙを得た。ｐＩＪ
７０２を制限酵素ＢａｍＨＩで切断したＤＮＡを鋳型と
し、プライマー３及びプライマー４を用い、ＰＣＲ法で
増幅した断片、すなわちプラスミドの安定性に関わる領
域（Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）とターミネーター配列を含む
４８４ｂｐの断片を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素Ｓ
ｐｅＩ及び制限酵素ＸｂａＩで両端を切断し、制限酵素
ＳｐｅＩ及び制限酵素ＸｂａＩで切断したｐＬｉｖ１／
−Ｓｔａｂｉｌｉｔｙに挿入し、ｐＬｉｖ１を得た。ｐ
ＩＪ７０２を制限酵素ＢａｍＨＩで切断したＤＮＡを鋳
型とし、プライマー５及びプライマー６を用い、ＰＣＲ
法で増幅した断片、すなわちｔｓｒ遺伝子プロモーター
とｔｓｒ遺伝子を含む１０８３ｂｐの断片を得た。この
ＤＮＡ断片を制限酵素ＳａｃＩで両端を切断し、制限酵
素ＳａｃＩで切断したｐＬｉｖ１に挿入し、ｐＬｉｖ１
ｔｈｉｏ（図３に示した）を得た。

【００２４】プライマー１ ＴＴＡＡＣＴＴＧＡＡ ＴＴＣＧＧＴＡＣＣＡ ＡＧＧ
ＣＧＡＡＴＡＣ ＴＴＣＡＴＡＴＧＣＧ（配列番号：
１） プライマー２ ＡＴＡＴＣＧＡＴＣＡ ＣＧＧＡＴＴＴＧＣＧ ＡＴＧ
ＧＴＧＴＣＣ（配列番号：２） プライマー３ ＡＴＡＣＴＡＧＴＧＣ ＧＧＣＣＧＣＴＧＡＡ ＧＡＧ
ＣＣＣＣＧＴＣ ＧＧＧＣＧＧＴＧＣＣ ＴＧＡＣＧＧ
ＧＧＣＴ ＴＣＴＣＡＴＧＣＡＧ ＣＣＧＧＧＧＧＴＣ
Ｃ Ｇ（配列番号：３）

【００２５】プライマー４ ＡＴＴＣＴＡＧＡＣＣ ＧＣＧＧＧＡＧＴＡＡ ＴＣＣ
ＴＧＧＧ（配列番号：４） プライマー５ ＡＴＡＡＴＡＴＴＧＡ ＧＣＴＣＡＡＧＧＣＧ ＡＡＴ
ＡＣＴＴＣＡＴ ＡＴＧＣＧ（配列番号：５） プライマー６ ＡＴＡＡＴＡＴＴＧＡ ＧＣＴＣＴＣＡＴＣＡ ＣＴＧ
ＡＣＧＡＡＴＣ ＧＡＧＧ（配列番号：６）

【００２６】実施例２ 放線菌の染色体ＤＮＡ調製 ストレプトマイセス属放線菌（ＮＡ３４８９６株；工業
技術院生命工学工業技術研究所に、ＦＥＲＭ Ｐ−１７
９８４として寄託されている。）の平板寒天培養から白
金耳にて胞子を５ｍｍ程度かき取り、１００ｍｌのＹＥ
ＭＥ培地（グルコース１％、シュークロース３４％、麦
芽エキス０．３％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．
３％、pH７．０、滅菌後２．５ Mの塩化マグネシウム六
水和物を培地１Ｌあたり２ｍｌ添加）を５００ｍｌ容の
へそ付き三角フラスコに分注し滅菌したものに植菌し
た。２７℃で２日間回転振盪培養を行った。菌体を集菌
後、湿菌体２ｇ程度を１０ｍｌのＴＥ（１０ｍＭトリス
（塩酸、ｐＨ８．０）、５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．
０））で２回洗浄し、使用時まで−２０℃で凍結した。
トリスとは、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
のことを指す。

【００２７】この凍結菌体２ｇを融解し、１０ｍｌのＴ
Ｅに溶解、さらにリゾチームを２ｍｇ／ｍｌとなるよう
に添加、３７℃で１時間インキュベートした。この溶液
に、５０ｍｌの１０ｍＭトリス（塩酸、ｐＨ８．０）−
１０％ＳＤＳ溶液を加え、ゆっくりと混合した。粘稠性
の増したこの溶液と等量（約６０ｍｌ）のフェノール溶
液（１０ｍＭトリス（塩酸、ｐＨ８．０）で飽和）を加
え、室温で３０分振盪した。１２０００ｒｐｍ×２０ｍ
ｉｎ、２０℃で遠心した後、上層を別の遠心管に移し
て、その液体に２．５倍量のエタノールを添加し混合、
−２０℃で３０分静置した。１２０００ｒｐｍ×２０ｍ
ｉｎ、４℃で遠心し、沈殿を７０％エタノールで洗浄、
１０分間室温に放置して風乾を行った。

【００２８】乾燥させた試料を３．６ｍｌのＴＥに溶解
し、そこに３．７８ｇの塩化カルシウムを添加、さらに
１０ｍｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド１８０μｌを加
え、溶液が均一になるように混ぜた。この溶液を超遠心
チューブ（ＯｐｔｉＳｅａｌ４．７ｍｌ、ＢＥＣＫＭＡ
Ｎ社製）に移し、超遠心（Ｏｐｔｉｍａ ＴＬ、ＢＥＣ
ＫＭＡＮ社製）を、１０００００ｒｐｍ×１０ｈｒ、２
３℃の条件で行った。超遠心チューブ内の閉環プラスミ
ドＤＮＡのバンドを注射針で回収し、等量の飽和イソプ
ロパノール溶液（ＴＥに５Ｍの塩化ナトリウムを溶解し
たもので飽和）を加え、混合、３０００ｒｐｍ×５ｍｉ
ｎで遠心、上層を除いた。この作業を、エチジウムブロ
マイドの色が完全に抜けるまで（３〜４回）行った。残
った下層に２倍量の滅菌水を加え、さらにその３倍量の
エタノールを加え混合、−２０℃で３０分静置してＤＮ
Ａを析出させた。その後１２０００ｒｐｍ×１５ｍｉ
ｎ、４℃でＤＮＡを沈殿させ、７０％エタノールで洗浄
した。

【００２９】実施例３ ｐＬｉｖ１ｔｈｉｏベクターとストレプトマイセス属放
線菌ＮＡ３４８９６株より抽出したＤＮＡを用いた遺伝
子発現ライブラリーの構築 下記（ａ）および（ｂ）の操作を行い、下記（ｃ）によ
り、遺伝子発現ライブラリーを得た。 （ａ）部分消化ＤＮＡの調製 実施例２より得たストレプトマイセス属放線菌ＮＡ３４
８９６株の染色体ＤＮＡ１０μｇに対して５ユニットの
制限酵素ＴａｑＩを用い、６５℃、１０ｍｉｎ、２０ｍ
ｉｎ、３０ｍｉｎの条件でそれぞれ部分消化した。反応
によって得られた試料に等量のＴＥ飽和フェノール：ク
ロロホルム(１：１)を加え、混合して遠心（１２０００
ｒｐｍ×５ｍｉｎ）を行った。水層を新しいチューブに
移し、その１０分の１量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐH
５．２）を添加、さらに２．５倍量のエタノールを添
加、混合して−２０℃で３０ｍｉｎ放置した。その後遠
心（１２０００ｒｐｍ×５ｍｉｎ）を行い、ＤＮＡを沈
殿させた。７０％エタノール にて洗浄を行い、１０分
間室温に放置して風乾を行った。その後、ＴＥに溶解さ
せた。

【００３０】部分消化ＤＮＡ断片の回収 ０．８％アガロースゲルを用いて上記ＤＮＡ溶液を電気
泳動した。その際、ＤＮＡ断片のサイズマーカーにはλ
ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断した断片を用い
た。泳動後のゲルから、２〜６ｋｂｐの領域内に存在す
る制限酵素ＴａｑＩ部分消化断片を切りだし、ゲルエク
ストラクションキット（ＱＩＡＥＸＩＩＧｅｌ Ｅｘｔ
ｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、キアゲン社製）を用いてＤＮ
Ａの抽出、回収を行った。

【００３１】（ｂ）ベクターの調製 実施例１より得た放線菌―大腸菌シャトルベクター（ｐ
Ｌｉｖ１ｔｈｉｏ）１００μｇに対して５ユニットの制
限酵素ＣｌａＩを用いて切断を行った。液量に対して１
０分の１量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）と、さ
らにその２．５倍量のエタノールを添加し、上記と同様
にＤＮＡの回収、洗浄を行った。

【００３２】（ｃ）遺伝子発現ライブラリーの構築 （ａ）より得た制限酵素ＴａｑＩ部分消化断片（２〜６
ｋｂｐ）と、（ｂ）より得た制限酵素ＣｌａＩにより切
断されたｐＬｉｖ１ｔｈｉｏを、モル比で８：１（重量
比３２：７、部分消化断片は平均４ｋｂｐと見積もっ
た）となるように混合し、１４０ｎｇのベクターに対し
て等量（２０μｌ）となるようライゲーション溶液（Ｄ
ＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２、宝酒造
社製）を加えてライゲーションを行った。このサンプル
中の挿入断片の有無を、大腸菌に遺伝子導入することで
確認すると、挿入断片を含むベクターの割合は約３０％
であった（図４に示した）。この操作により、遺伝子発
現ライブラリーを得た。

【００３３】遺伝子発現ライブラリーの増幅 上記で得た遺伝子発現ライブラリーを放線菌に導入する
前段階として、大腸菌での増幅を行った。遺伝子発現ラ
イブラリー１μｇを８ｍｌの大腸菌コンピテント細胞に
導入（野島 博：遺伝子工学ハンドブック、実験医学、
羊土社、ｐｐ．４６−５１、（１９９１））し、約６万
個の形質転換コロニーを得た。これらは遺伝子導入操作
後、３７℃で３６時間程度培養し、十分にコロニーを生
育させた。その後、スクレーパー（ＣＥＬＬ ＳＣＲＡ
ＰＥＲ、住友ベークライト社製）と生理食塩水（塩化ナ
トリウム０．８５％）を用いてコロニーを回収、プラス
ミドを調製した。得たプラスミド試料を超遠心により精
製し、１．４ｍｇの遺伝子発現ライブラリーを得た。

【００３４】実施例４ 放線菌の形質転換法 下記（ａ）〜（ｅ）の操作を行い、下記（ｆ）により、
形質転換体を得た。 （ａ）生育困難放線菌ＮＡ３４８９６メチオニン要求性
株の取得 ストレプトマイセス属放線菌野生株であるＮＡ３４８９
６株（工業技術院生命工学工業技術研究所に、ＦＥＲＭ
Ｐ−１７９８４として寄託されている。）の胞子懸濁
液に紫外線を照射（距離５０ｃｍ、時間１ｍｉｎ）し、
その懸濁液の一部を完全培地（ＹＳ；可溶性でんぷん１
％、酵母エキス０．２％、寒天１．５％、ｐＨ７．０）
と最少培地（ツァぺック・寒天培地、Ｄｉｆｃｏ社製）
及びメチオニン含有最少培地に塗抹し、メチオニン要求
性株を取得した。

【００３５】（ｂ）ＮＡ３４８９６メチオニン要求性株
胞子懸濁液の作製 １６×１５０ｍｍのねじ付試験管（旭テクノグラス社
製）に、滅菌後完全に寒天を溶解させた完全培地５．５
ｍｌを分注し、ねじ付試験管を傾けて、中に長径７ｃｍ
前後の斜面を形成させた。保存スラントより少量の胞子
を白金耳にてかき取り、斜面上に一様に植菌した。２〜
３週間２７℃で培養し、十分に胞子を形成させた。その
中にＹＥＭＥ培地を２ｍｌ加え、寒天表面を白金耳でか
き取り、その後よく懸濁して胞子懸濁液を作製した。

【００３６】（ｃ）ＮＡ３４８９６メチオニン要求性株
の培養 直径２．５ｃｍの大試験管（旭テクノグラス社製）にＹ
ＥＭＥ培地１０ｍｌを分注して滅菌後、ＮＡ３４８９６
メチオニン要求性株の胞子懸濁液２００μｌを植菌し
た。２７℃、２８時間前後振盪培養して濁度計（吸光度
６００ナノメートル）の値が０．１となった時点で培養
を停止した。５００ｍｌ容のへそ付き三角フラスコにあ
らかじめ分注、滅菌しておいた０．５％グリシンを含む
ＹＧ培地（グルコース１％、酵母エキス１％）１００ｍ
ｌに、上記で培養した菌体液２ｍｌを植菌し、２７℃で
１６時間回転振盪培養を行った。

【００３７】（ｄ）プロトプラストの調製 （ｃ）より得た培養液の一部（５０ｍｌ）をクリーンベ
ンチ内で遠沈管（５０ｍｌ容）に移し、遠心（３０００
ｒｐｍ×１０ｍｉｎ、４℃）した。回収した菌体を４０
〜５０ ｍｌの１０．３％ショ糖水溶液（氷冷）で2回洗
浄した。洗浄後、遠心し上清を取り除いた菌体に、１０
ｍｌのリゾチーム溶液（リゾチーム濃度が２ｍｇ／ｍｌ
となるようにＰバッファー（後述）に溶解後、０．２２
μｍのフィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）で濾過滅
菌）を添加し、３０℃で４５分程度振盪した。

【００３８】以下にＰバッファーの組成を示す ショ糖１０．３％、硫酸カリウム０．０２５％、塩化マ
グネシウム六水和物０．２０２％、微量金属塩溶液０．
２％、蒸留水を最終液量の８０％加えて滅菌した。その
後、個別に滅菌しておいた０．５％リン酸二水素カリウ
ム水溶液を最終液量の１％、３．６８％塩化カルシウム
二水和物水溶液を１０％、５．７３％ＴＥＳバッファー
（ｐＨ７．２）を１０％、それぞれ加えた。

【００３９】以下に微量金属塩溶液の組成を示す １Ｌあたりの組成：塩化亜鉛４０ｍｇ、塩化第二鉄六水
和物２００ｍｇ、塩化銅二水和物１０ｍｇ、塩化第一マ
ンガン四水和物１０ｍｇ、ホウ砂１０ｍｇ、モリブデン
酸アンモニウム四水和物１０ｍｇ

【００４０】（ｅ）プロトプラストの精製 その後、濾過用注射筒（５０ｍｌ注射筒に０．４ｇの脱
脂綿を詰め、滅菌）にて菌糸を取り除き、等量のＰバッ
ファーを加えて遠心（３０００ｒｐｍ×７ｍｉｎ、４
℃）した。更に２回、１０ｍｌ程度のＰバッファーを用
いて洗浄した。血球計算板を用い、直接検鏡にて形成さ
れたプロトプラストの個数を確認した。プロトプラスト
は、Ｐバッファーを用いて最終的に４０億個／ｍｌと
し、氷中で保存した。プロトプラストは、遺伝子導入効
率を考え、保存せずに要時調製した。

【００４１】（ｆ）形質転換 氷冷中のプロトプラスト溶液１００μｌ（４億個）に対
し、実施例３で得た遺伝子発現ライブラリー１μｇを添
加した。次に、４００μｌのＴバッファー（Ａ液：１
０．３％ショ糖２５ｍｌ、蒸留水７５ｍｌ、微量金属塩
溶液０．２ｍｌ、２．５％硫酸カリウム水溶液１ｍｌを
混合し、滅菌。Ｂ液：Ａ液９．３ｍｌに５Ｍの塩化カル
シウム二水和物０．２ｍｌおよびトリスマレイン酸（１
Ｍのトリスをマレイン酸でｐＨ８．０に調製）０．５ｍ
ｌを添加。Ｂ液と溶解させたＰＥＧ１０００が３：１の
割合となるように混合して使用。要時調製）を添加し、
ピペットマン（１０００μｌ、ギルソン社製）を用い
て、４回吸引、排出を繰り返した。さらに、その後すぐ
に１０倍量のＰバッファーを添加し、遠心（３０００ｒ
ｐｍ×７ｍｉｎ、４℃）した。上層を除いた沈殿にＰバ
ッファー２５０μｌを添加し、Ｒ１Ｍ培地（１Ｌの組
成：ショ糖１０３ｇ、グルコース１０ｇ、カザミノ酸
０．１ｇ、微量金属塩溶液２ｍｌ、硫酸カリウム０．２
５ｇ、Ｌ−アスパラギン２ｇ、ポリペプトン５ｇ、酵母
エキス８ｇ、塩化マグネシウム六水和物４．０７ｇ、寒
天２２．２ｇ、蒸留水８００ｍｌを加えて滅菌、滅菌
後、あらかじめ個別に滅菌しておいた０．５％リン酸二
水素カリウム水溶液１０ｍｌ、５．７３％ＴＥＳバッフ
ァー１００ｍｌ、７．３７％塩化カルシウム二水和物水
溶液１００ｍｌを添加）５０ｍｌを入れた角プレート
（滅菌２号角シャーレ、栄研器材社製）に全量撒いた。
２７℃で培養を開始した。培養開始２４時間後、重層培
地（ニュートリエントブロス（Ｄｉｆｃｏ社製）０．０
８％、寒天０．０３％、滅菌後５０℃前後まで冷まし、
チオペプチン溶液（５０ｍｇ／ｍｌとなるようにＤＭＳ
Ｏで溶解）を３３３μｇ／ｍｌとなるように添加）７．
５ｍｌをプレート表面に添加した。重層後５日間培養を
行った。その結果、１００μｇの遺伝子発現ライブラリ
ーを用いて、約３２５００個の形質転換コロニーを得
た。

【００４２】実施例５ 生育増強株の取得 培養後、角プレート表面に出現した形質転換体を重層培
地ごとスクレーパーでかき取り、生理食塩水（塩化ナト
リウム０．８５％）１０ｍｌを添加して５ｍｌ容の駒込
ピペットで大試験管（直径２．５ｃｍ、６ｇのガラスビ
ーズを入れて滅菌したもの）に移した。３分間ＬＡＢＯ
−ＭＩＸＥＲ（井内盛栄堂社製）を用いて攪拌を行い、
形質転換体のコロニーおよび重層培地を破砕した。破砕
後の試料を濾過用注射筒（５０ｍｌ注射筒に０．４ｇの
脱脂綿を詰め、滅菌）で濾過、その濾液を遠沈管（５０
ｍｌ容）に移し、遠心（３０００ｒｐｍ×１０ｍｉ
ｎ）、さらに生理食塩水による洗浄を２回行った。洗浄
後の菌体に１０ｍｌの生理食塩水を加え、微生物培養検
定箱（２４０×３２０ｍｍ、いわしやエーディーエム社
製）にツァペック寒天培地（Ｄｉｆｃｏ社製、チオペプ
チン５０μｇ／ｍｌを含む）を作製したものに１ｍｌを
撒いた。一週間培養させることにより、生育増強株を取
得した（図５、図６、図７に各々、植菌当日、植菌３日
目、植菌６日目の寒天培地上の増殖過程を示した。）。
取得した生育増強株は、非生育増強株に比べてコロニー
の生育が速く、短期間で容易に培養することが可能とな
った。

【００４３】図６に示した植菌３日目の寒天培地上の生
育増強株のコロニーの長径と短径を測定し、そのコロニ
ーの面積を算出し、同様にして、周囲の非生育増強株の
なかからランダムに５コロニー選択し、その長径と短径
を測定してコロニーの面積を算出した。その結果を表１
に示す。

【００４４】 表１ コロニーの直径 コロニーの短系 楕円の面積 （ｍｍ） （ｍｍ） （平方ｍｍ） 生育増強株 ５．５ ５．０ ８６．４ 非生育増強株１ ２．０ ２．０ １２．６ 非生育増強株２ ２．５ ２．０ １５．７ 非生育増強株３ ３．５ ２．０ ２２．０ 非生育増強株４ ２．０ ２．０ １２．６ 非生育増強株５ ３．０ ２．０ １８．８

【００４５】次いで、図７に示した植菌６日目の寒天培
地上の生育増強株のコロニーの長径と短径を測定し、そ
のコロニーの面積を算出し、同様にして、培養３日目で
ランダムに選択した非生育増強株５コロニーについて
も、培養６日目の長径と短径を測定し、そのコロニーの
面積を算出した。その結果を表２に示す。

【００４６】 表２ コロニーの直径 コロニーの短系 楕円の面積 （ｍｍ） （ｍｍ） （平方ｍｍ） 生育増強株 ９．０ ８．５ ２４０．２ 非生育増強株１ ３．５ ３．５ ３８．５ 非生育増強株２ ４．０ ３．５ ４４．０ 非生育増強株３ ５．５ ３．５ ６０．４ 非生育増強株４ ３．５ ３．５ ５０．０ 非生育増強株５ ４．０ ３．５ ４４．０ 更に、図８に、表１、表２で数値化したコロニーの面積
をもとに、グラフ化して示した。グラフに示されたよう
に生育増強されたコロニーが得られたことが明らかであ
る。

【００４７】

【発明の効果】本発明は、従来の技術では増殖培地上で
生育困難であった微生物の生育を増強させる方法を提供
し、産業利用が困難であった微生物の醗酵への利用、ま
たは微生物生産物の薬物候補への利用に関して有用であ
る。本発明を用いれば、従来の技術では培養困難であっ
た微生物を培養することが可能となり、生産性の向上
や、産業上有効利用していく上で必要なさらなる遺伝的
改変が容易となる。また、自然界から新たに微生物の取
得を試みる際、増殖の速い他の微生物に生育を阻害され
る、あるいは生育が遅く一定期間内にコロニーを目視で
きないなどの理由で分離困難であった微生物群を容易に
分離することが可能となる。また、特殊な条件下でのみ
旺盛に生育可能である微生物群を、より簡便または安価
な培地で安定的に生育可能とすることができる。

【００４８】

【配列表フリテキスト】配列表の配列番号：１、２、
３、４、５及び６の塩基配列はＰＣＲプライマーを示
す。

【００４９】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> NIPPON KAYAKU KABUSHIKI KAISHA <120> A method for enhancing a growth of microorganism <130> NKM1874 <160> 6 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 1 ttaacttgaa ttcggtacca aggcgaatac ttcatatgcg 40 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 2 atatcgatca cggatttgcg atggtgtcc 29 <210> 3 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 3 atactagtgc ggccgctgaa gagccccgtc gggcggtgcc tgacggggct tctcatgcag 60 ccgggggtcc g 71 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 4 attctagacc gcgggagtaa tcctggg 27 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 5 ataatattga gctcaaggcg aatacttcat atgcg 35 <210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 6 ataatattga gctctcatca ctgacgaatc gagg 34

【図面の簡単な説明】

【図1】プラスミドベクターｐＩＪ７０２の制限地図を
図1に示す。

【図2】プラスミドベクターｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ Ｉ
Ｉ ＫＳ（−）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）の制限地
図を図２に示す。

【図３】放線菌由来のベクターｐＩＪ７０２（図１に示
した。）と大腸菌由来のベクターｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐ
ｔＩＩ ＫＳ（−）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製：図２
に示した。）を用いて構築した、放線菌―大腸菌シャト
ルベクター（ｐＬｉｖ１ｔｈｉｏ）の制限地図を図３に
示す。

【図４】ストレプトマイセス属放線菌ＮＡ３４８９６株
の染色体ＤＮＡを制限酵素ＴａｑＩを用いて部分消化
し、そこから回収した２〜６ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断
片の混合物を、放線菌―大腸菌シャトルベクター（ｐＬ
ｉｖ１ｔｈｉｏ）を制限酵素ＣｌａＩを用いて切断した
ものにライゲーションし、遺伝子発現ライブラリーを構
築した。この時、挿入断片を含むベクターの割合を大腸
菌に遺伝子導入することで確認した。大腸菌に遺伝子導
入したベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断して挿入断
片の有無を確認したところ、挿入断片を含むベクターの
割合は約３０％であった。その結果を図４に示す。ＤＮ
Ａ断片のサイズマーカーにはλＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎ
ｄＩＩＩで切断したものを用いた。図中、Ｍはマーカー
（λ／ＨｉｎｄＩＩＩ）を、＊は挿入断片を含むベクタ
ーを示す。

【図５】ＮＡ３４８９６メチオニン要求性株を、実施例
３で作製した遺伝子発現ライブラリーを用いて形質転換
した。植菌当日の寒天培地を図５に示す。

【図６】ＮＡ３４８９６メチオニン要求性株を、実施例
３で作製した遺伝子発現ライブラリーを用いて形質転換
した。植菌３日目の寒天培地上の増殖過程を図６に示
す。矢印で示しているのが取得した生育増強株である。

【図7】ＮＡ３４８９６メチオニン要求性株を、実施例
３で作製した遺伝子発現ライブラリーを用いて形質転換
し、生育増強株を取得した。植菌６日目の寒天培地上の
増殖過程を図７に示す。矢印で示しているのが取得した
生育増強株である。

【図８】コロニーの大きさを楕円の面積として数値化し
た表１、表２の結果をグラフ化し、図８に示す。縦軸の
値はコロニーの面積（平方ミリメートル）を示し、横軸
の値は寒天培地での培養日数を示す。生育増強株のコロ
ニーの増殖速度は、非生育増強株に比べて５倍程度速
い。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA05 CA05 DA08 EA04 4B065 AA01 AA50 AB01 BA02 CA42 CA44

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の段階を含む、生育困難な受容微生物
   に生育旺盛な微生物の遺伝子を導入することにより、生
   育が増強された受容微生物を得る方法。 （Ａ）生育旺盛な微生物からＤＮＡを抽出する段階 （Ｂ）該抽出ＤＮＡから断片化されたＤＮＡを作製する
   段階 （Ｃ）該ＤＮＡを含む遺伝子発現ライブラリーを作製す
   る段階 （Ｄ）該遺伝子発現ライブラリーを生育困難な受容微生
   物に導入する段階 （Ｅ）該遺伝子導入操作により、生育が増強された受容
   微生物を得る段階
2. 【請求項２】遺伝子が対象の受容微生物と同じ属の微生
   物より取得される、請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】遺伝子の大きさが、０．５ｋｂｐ以上８ｋ
   ｂｐ未満である、請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】該遺伝子発現ライブラリーがプラスミドま
   たはベクターの形態である、請求項１記載の方法。
5. 【請求項５】対象となる受容微生物が放線菌である請求
   項１〜４のいずれかに記載の方法。
6. 【請求項６】請求項１記載の方法により得られた生育が
   増強された受容微生物。