CN108779478A - 化学品的制造方法和微生物的培养方法 - Google Patents

化学品的制造方法和微生物的培养方法 Download PDF

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Abstract

化学品的制造方法，是对微生物用包含甘蔗糖蜜作为主成分的发酵原料进行培养，将培养液用分离膜进行过滤，回收通过上述过滤而与微生物分离开的包含化学品的滤液，进一步将包含微生物的未滤液保持在或回流至培养液中，并且在培养液中补加发酵原料，从而进行连续发酵的化学品的制造方法，其中，对使所述培养液的离心上清中含有平均粒径为100nm以上的颗粒的微生物进行培养。

Description

化学品的制造方法和微生物的培养方法
技术领域
本发明涉及使用含有甘蔗糖蜜作为主成分的发酵原料通过连续培养进行的化学品的制造方法。
背景技术
随着二氧化碳在大气中的排出问题、能源问题的显现，以乳酸等生物降解性聚合物原料、乙醇等生物燃料为代表的来自生物质的化学品作为持续性(可持续性)和生命周期评估(LCA)对应型制品受到强烈瞩目。作为这些生物降解性聚合物原料、生物燃料的制造方法，通常是以由玉米等可食用性生物质纯化的属于六碳糖的葡萄糖、在由甘蔗纯化砂糖的过程中生成的糖蜜(甘蔗糖蜜)作为原料，利用微生物以发酵产物形式制得。甘蔗糖蜜在巴西、泰国等砂糖生产国中作为乙醇发酵原料大量被消耗，成为重要的发酵原料。
通常来说，作为利用微生物培养的化学品的制造方法，使用分批培养法、补料分批培养法或连续培养法等，在专利文献1中公开了通过利用分离膜的连续培养方法，提高作为发酵产物的化学品的生产速度、收率。另一方面，在该专利文献中，没有关于使用含有甘蔗糖蜜的原料的记载。此外，在专利文献2中公开了在对前处理生物质进行酶糖化后添加甘蔗糖蜜，由此利用膜回收糖化酶的回收率提高；以及以获得的糖液作为原料，利用微生物发酵的乙醇生产方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:WO2007/097260
专利文献2:WO2012/118171
发明内容
发明所要解决的课题
本发明者对于使用含有甘蔗糖蜜作为主成分的发酵原料的利用分离膜的连续培养进行了研究，其结果新发现了如下课题：即使以在利用不含有甘蔗糖蜜的发酵原料时不发生膜堵塞的过滤速度(通量)进行过滤，也会发生膜堵塞。于是，本发明的目的在于，提供在使用含有甘蔗糖蜜作为主成分的发酵原料的情况下，也能够实现与使用不含有甘蔗糖蜜的发酵原料的情况同样的利用分离膜的连续培养的方法。
用于解决课题的方法
本发明者进行了深入研究，结果发现，在使用含有甘蔗糖蜜作为主成分的发酵原料的利用分离膜的连续发酵中，通过对使培养液的离心上清中含有平均粒径为100nm以上的来自微生物的颗粒的微生物进行培养，能够解决上述课题，从而完成了本发明。
即，本发明如以下(1)～(5)。
(1)化学品的制造方法，是对微生物用包含甘蔗糖蜜作为主成分的发酵原料进行培养，将培养液用分离膜进行过滤，回收通过上述过滤而与微生物分离开的包含化学品的滤液，进一步将包含微生物的未滤液保持在或回流至培养液中，并且在培养液中补加发酵原料，从而进行连续发酵的化学品的制造方法，其中，
对使所述培养液的离心上清中含有平均粒径为100nm以上的颗粒的微生物进行培养。
(2)根据(1)所述的化学品的制造方法，其中，所述颗粒的平均粒径为300nm以上。
(3)根据(1)或(2)所述的化学品的制造方法，其中，所述发酵原料包含甘蔗糖蜜和来自含纤维素的生物质的糖液的混合物。
(4)根据权(1)～(3)中任一项所述的化学品的制造方法，其中，所述微生物是属于裂殖酵母(Schizosaccharomyces)属的酵母。
(5)微生物的培养方法，是对微生物用包含甘蔗糖蜜作为主成分的发酵原料进行培养，将培养液用分离膜进行过滤，将包含微生物的未滤液保持在或回流至培养液中，并且在培养液中补加发酵原料，从而进行连续培养的微生物的培养方法，其中，
对使所述培养液的离心上清中含有平均粒径为100nm以上的颗粒的微生物进行培养。
发明的效果
根据本发明，即使使用含有甘蔗糖蜜的发酵原料进行利用分离膜的连续发酵，也能够防止分离膜的膜堵塞，从而效率良好地制造化学品。
附图说明
图1是表示使用含有甘蔗糖蜜的原料，通过粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)NBRC1628株进行利用分离膜的连续发酵时的过滤通量和膜间压差变化的图。
图2是表示使用含有甘蔗糖蜜的原料，通过酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)NBRC2260株进行利用分离膜的连续发酵时的过滤通量和膜间压差变化的图。
图3是表示使用含有甘蔗糖蜜的原料进行连续过滤时的过滤通量和膜间压差变化的图。
图4是表示使用含有甘蔗糖蜜的原料，通过日本裂殖酵母(Schizosaccharomycesjaponicus)NBRC1609株进行利用分离膜的连续发酵时的过滤通量和膜间压差变化的图。
图5是表示使用不含有甘蔗糖蜜的原料，通过酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)NBRC2260株进行利用分离膜的连续发酵时的过滤通量和膜间压差变化的图。
具体实施方式
本发明涉及化学品的制造方法和微生物的培养方法，所述化学品的制造方法是对微生物用以甘蔗糖蜜作为主成分的发酵原料进行培养，将培养液用分离膜进行过滤，回收通过上述过滤而与微生物分离开的包含化学品的滤液，进一步将包含微生物的未滤液保持在或回流至培养液中，并且在培养液中补加发酵原料，从而进行连续发酵的化学品的制造方法，其特征在于，对使所述培养液的离心上清中含有平均粒径为100nm以上的颗粒的微生物进行培养。
本发明中使用的微生物是具有生产化学品的能力的微生物，并且只要是在对该微生物用含有甘蔗糖蜜作为主成分的发酵原料进行培养时，使在培养液的离心上清中含有平均粒径为100nm以上的颗粒的微生物，就没有特别限制。作为这样的微生物的优选具体例，可以举出属于裂殖酵母(Shizosaccharomyces)属的酵母。作为属于裂殖酵母(Shizosaccharomyces)属的酵母，可以优选使用粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、日本裂殖酵母(Schizosaccharomyces japonicus)、八孢裂殖酵母(Shizosaccharomyces octosporus)或嗜冷裂殖酵母(Shizosaccharomyces cryophilus)。
本发明中的颗粒，是指培养液中包含的除微生物以外的不溶性粒状物质。在培养液中存在的颗粒的平均粒径的测定采用动态光散射法(DLS，光子相关法)进行。具体而言，由通过根据动态光散射法的测定而得的散射强度的波动，通过累积量(Cumulant)分析求得自相关函数，转换成相对于散射强度的粒度分布，然后使分析范围最小值为1nm、最大值为5000nm而换算成平均粒径。测定使用大塚电子株式会社的ELS-Z2。此外，在培养液中微生物也以颗粒形式存在，因此通过对室温的培养液以1000×G、10分钟的条件进行离心，从而使微生物沉淀，测定其离心上清包含的颗粒的平均粒径。
所述颗粒的平均粒径为100nm以上，优选为300nm以上，更优选为300～1500nm。通过利用使培养液中含有这种平均粒径为100nm以上的颗粒的微生物，虽然详细作用机制不明确，但如后述实施例、比较例中所示，能够显著地抑制分离膜的膜堵塞。另外，对于颗粒平均粒径的上限，在不由于发生膜堵塞而降低过滤通量的范围内没有特别限制，但即使通过所述离心也不会与微生物一起沉淀这样的颗粒的平均粒径成为上限，作为优选的上限值，是1500nm。
甘蔗糖蜜是由甘蔗的榨汁或粗糖进行制糖的过程中生成的副产物。即，是指包含在制糖过程中的结晶化工序中进行结晶化后残余的糖成分的结晶析出母液。一般来说，结晶化工序通常进行多次，像作为进行第1次结晶化而得的结晶成分的1号糖、作为进一步进行1号糖的残留液(1号糖蜜)的结晶化而得的结晶成分的2号糖、进一步进行2号糖的残留液(2号糖蜜)的结晶化而得的3号糖这样反复进行结晶化，将此时作为残余的结晶析出母液获得的最终阶段的糖蜜称为甘蔗糖蜜。伴随着结晶化的次数增多，除糖成分以外的无机盐在甘蔗糖蜜中浓缩。作为本发明中使用的甘蔗糖蜜，优选经过多次结晶化后的甘蔗糖蜜，优选是在进行至少2次以上、进一步优选3次以上结晶化后残余的甘蔗糖蜜。作为甘蔗糖蜜包含的糖成分，包含蔗糖、葡萄糖、果糖作为主成分，有时也包含一些木糖、半乳糖等其它糖成分。甘蔗糖蜜中的糖浓度通常是200～800g/L左右。甘蔗糖蜜中的糖浓度可以通过HPLC等公知的测定方法进行定量。
发酵原料是包含微生物增殖所需的全部营养的原料。在本发明中使用的发酵原料中，只要包含甘蔗糖蜜作为主成分即可，除此之外也可以适当添加碳源、氮源、无机盐类、以及根据需要的氨基酸、维生素等有机微量营养素。另外，在本发明中，所谓包含甘蔗糖蜜作为主成分的发酵原料，是指发酵原料包含的物质(除水以外)之中50重量％以上为甘蔗糖蜜。
作为碳源，除了葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、乳糖等糖类、含有这些糖类的淀粉糖化液、甘薯糖蜜、甜菜糖蜜、高级糖蜜、以及乙酸等有机酸、乙醇等醇类、甘油等以外，还优选使用来自含纤维素的生物质的糖液。
作为含纤维素的生物质，可以举出甘蔗渣、柳枝稷、玉米秸秆、稻秸、麦秸等草本系生物质、和树木、废弃建筑材料等木质系生物质等作为例子。含纤维素的生物质含有作为糖脱水缩合而成的多糖的纤维素或半纤维素，通过将这样的多糖水解，制造可作为发酵原料利用的糖液。
对来自含有纤维素的生物质的糖液的制备方法没有特别限制，作为这样的糖的制造方法，公开了使用浓硫酸将生物质进行酸水解来制造糖液的方法(日本特表平11-506934号公报、日本特开2005-229821号公报)、在将生物质用稀硫酸进行水解处理后进一步通过纤维素酶等进行酶处理来制造糖液的方法(A.Aden等，“Lignocellulosic Biomass toEthanol Process Design and Economics Utilizing Co-Current Dilute AcidPrehydrolysis and Enzymatic Hydrolysis for Corn Stover”NREL Technical Report(2002))。此外，作为不使用酸的方法，公开了使用250～500℃左右的亚临界水将生物质水解来制造糖液的方法(日本特开2003-212888号公报)；另外在对生物质进行亚临界水处理后，进一步通过酶处理来制造糖液的方法(日本特开2001-95597号公报)；在对生物质用240～280℃的加压热水进行水解处理后，进一步通过酶处理来制造糖液的方法(日本特许3041380号公报)。像以上这样处理后，可以将得到的糖液与甘蔗糖蜜混合进行纯化。其方法例如公开在WO2012/118171中。
作为氮源，使用氨气、氨水、铵盐类、尿素、硝酸盐类、其它辅助使用的有机氮源例如油渣类、大豆水解液、酪蛋白分解物、其它氨基酸、维生素类、玉米浆、酵母或酵母提取物、肉提取物、胨等肽类、各种发酵菌体及其水解物等。
作为无机盐类，可以适当添加磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐、锰盐等。
此外，在本发明中使用的微生物为了生长繁殖而需要特定的营养素的情况下，可以将该营养物以标准品或含有该营养物的天然物形式添加而使用。
对于本发明中使用的分离膜，只要具有将由培养微生物而得的培养液从微生物中分离过滤的功能，就没有特别限制，作为材质，例如可以使用多孔陶瓷膜、多孔玻璃膜、多孔有机高分子膜、金属纤维编织物、无纺布等，这些之中特别优选多孔有机高分子膜或陶瓷膜。
本发明中作为分离膜的构成，例如从耐污性方面考虑，优选包含多孔树脂层作为功能层的分离膜。
包含多孔树脂层的分离膜优选在多孔基材的表面上具有以分离功能层形式起作用的多孔树脂层。多孔基材支撑多孔树脂层而为分离膜提供强度。此外，在多孔基材的表面上具有多孔树脂层的情况下，可以在多孔基材中渗透多孔树脂层，也可以不在多孔基材中渗透多孔树脂层，任一种均可。
多孔基材的平均厚度优选为50～3000μm。
多孔基材的材质包含有机材料和/或无机材料等，期望使用有机纤维。优选的多孔基材是由纤维素纤维、三乙酸纤维素纤维、聚酯纤维、聚丙烯纤维和聚乙烯纤维等有机纤维形成的织布、无纺布，更优选使用比较易于控制密度、也易于制造且廉价的无纺布。
多孔树脂层可以优选使用有机高分子膜。作为有机高分子膜的材质，例如可以举出聚乙烯系树脂、聚丙烯系树脂、聚氯乙烯系树脂、聚-1,1-二氟乙烯系树脂、聚砜系树脂、聚醚砜系树脂、聚丙烯腈系树脂、纤维素系树脂和三醋酸纤维素系树脂等。有机高分子膜可以是以这些树脂为主成分的树脂混合物。在此，所谓主成分，是指含有该成分50重量％以上、优选60重量％以上。有机高分子膜的材质优选易于通过溶液制膜、且物理耐久性、耐药品性均优异的聚氯乙烯系树脂、聚-1,1-二氟乙烯系树脂、聚砜系树脂、聚醚砜系树脂以及聚丙烯腈系树脂，最优选使用聚-1,1-二氟乙烯系树脂或以其为主成分的树脂。
在此，作为聚-1,1-二氟乙烯系树脂，优选使用1,1-二氟乙烯的均聚物。并且，聚-1,1-二氟乙烯系树脂也优选使用与可以和1,1-二氟乙烯共聚的乙烯系单体的共聚物。作为可以和1,1-二氟乙烯共聚的乙烯系单体可以例示四氟乙烯、六氟丙烯以及三氯氟代乙烯等。
本发明中使用的分离膜只要具有发酵使用的微生物不能通过的细孔径即可，期望是不易引起由发酵使用的微生物的分泌物、发酵原料中的微粒而导致的堵塞、并且过滤性能长时间稳定地持续的范围。所以，多孔性分离膜的平均细孔径优选为0.01～5μm。另外，进一步优选分离膜的平均细孔径为0.01～1μm，则能够兼顾没有微生物泄露的高排除率与高透水性，能够长时间保持透水性。
如果分离膜的平均细孔径接近微生物的大小，则有时这些微生物会直接堵塞孔，因此优选分离膜的平均细孔径为1μm以下。为了防止微生物的漏出、即排除率降低的不良情况的发生，分离膜的平均细孔径优选与微生物的大小相比不要过大。微生物之中，在使用细胞小的细菌等的情况下，作为平均细孔径，优选0.4μm以下，更优选0.2μm以下，进一步优选0.1μm以下。如果平均细孔径过小，则分离膜的透水性能降低，即使膜没有污染，也不能有效运转，因此本发明中分离膜的平均细孔径优选为0.01μm以上，更优选为0.02μm以上，进一步优选为0.04μm以上。
在此，平均细孔径可以通过测定在倍率10,000倍的扫描型电子显微镜观察时可在9.2μm×10.4μm的范围内观察到的全部细孔的直径，进行平均而求得。平均细孔径或者也可以利用扫描型电子显微镜以10,000倍的倍率对膜表面拍摄照片，随机选择10个以上、优选20个以上的细孔，测定这些细孔的直径，进行数平均，从而求得。在细孔不是圆形的情况下，通过利用图像处理装置等求得具有与细孔所具有的面积相等的面积的圆(等价圆)、以等价圆直径为细孔直径的方法求得。
本发明中使用的分离膜的平均细孔径的标准偏差σ优选为0.1μm以下。期望平均细孔径的标准偏差σ越小越好。对于平均细孔径的标准偏差σ，使可在上述9.2μm×10.4μm的范围内观察到的细孔数为N，测定的各个直径为Xk，细孔直径的平均为X(ave)，通过下述(式1)计算出。
对于本发明中使用的分离膜，发酵培养液的透过性是重要性能之一。作为分离膜的透过性的指标，可以采用使用前的分离膜的纯水透过系数。在本发明中，对于分离膜的纯水透过系数，在利用反渗透膜，使用温度为25℃的纯化水，以1m的头高度测定透水量并计算时，优选为5.6×10-10m3/m2/s/pa以上，如果纯水透过系数为5.6×10-10m3/m2/s/pa～6×10- 7m3/m2/s/pa，则会获得实用上足够的透过水量。
在本发明中使用的分离膜中，所谓表面粗糙度，是相对于表面垂直的方向的高度的平均值。膜表面粗糙度是用于附着于分离膜表面的微生物易于通过由利用搅拌、循环泵的液流而带来的膜面洗涤效果剥离的因子之一。对分离膜的表面粗糙度没有特别限制，只要是附着于膜的微生物、以及其它固体物能剥离的范围即可，优选为0.1μm以下。如果表面粗糙度为0.1μm以下，则附着于膜的微生物、以及其它固体物变得容易剥离。
可知进一步优选使用分离膜的膜表面粗糙度为0.1μm以下、平均细孔径为0.01～1μm、分离膜的纯水透过系数为2×10-9m3/m2/s/pa以上的分离膜，由此可以更容易进行不过度需要膜面洗涤所必需的动力的运转。通过使分离膜的表面粗糙度为0.1μm以下，能够在过滤微生物时使在膜表面产生的剪切力降低，从而抑制微生物的破坏，也抑制分离膜的堵塞，由此更容易进行长时间稳定的过滤。此外，通过使分离膜的表面粗糙度为0.1μm以下，可以以更低的膜间压差实施连续发酵，与即使在分离膜堵塞的情况下，与以高膜间压差运转的情况相比，洗涤恢复性也更良好。通过抑制分离膜的堵塞，可以进行稳定的连续发酵，因此分离膜的表面粗糙度越小越优选。
在此，分离膜的膜表面粗糙度是使用下述原子力显微镜装置(AFM)以下述条件测定而得的。
.装置：原子力显微镜装置(Digital Instruments(株)制造“Nanoscope IIIa”)
.条件：探针SiN悬臂梁(Digital Instruments(株)制造)
扫描模式接触模式(气体中测定)水中轻敲模式(水中测定)
扫描范围10μm、25μm四方(气体中测定)5μm、10μm四方(水中测定)
扫描分辨率512×512
.试样制备：在测定时，膜样品在常温下乙醇中浸渍15分钟后，在RO水中浸渍24小时洗涤后，风干使用。所谓RO水，是指使用作为过滤膜的一种的反渗透膜(RO膜)过滤，排除离子、盐类等杂质后的水。RO膜的孔的大小大概是2nm以下。
对于膜表面粗糙度drough，利用上述原子力显微镜装置(AFM)，由各点的Z轴方向的高度，由下述(式2)计算出。
drough：表面粗糙度(μm)
Zn：Z轴方向的高度(μm)
扫描范围的平均高度(μm)
N：测定样品的数量
对本发明中使用的分离膜的形状没有特限定，可以使用平膜、中空丝膜等，但优选为中空丝膜。在分离膜为中空丝膜的情况下，中空丝的内径优选为200～5000μm，膜厚优选为20～2000μm。此外，可以在中空丝的内部包含使有机纤维或无机纤维为筒状的纺织物、编织物。
另外，前述的分离膜例如可以通过在WO2007/097260中记载的制造方法来制造。
本发明中的连续发酵的特征在于，是将微生物的培养液用分离膜进行过滤，回收通过上述过滤而与微生物分离开的包含化学品的滤液，进一步将包含微生物的未滤液保持或回流至培养液中，并且在培养液中补加发酵原料，从滤液中回收生产物的连续发酵。
在本发明的化学品的制造方法中，对过滤时膜间压差没有特别限制，只要可以过滤发酵培养液即可。但是，为了过滤培养液，如果在有机高分子膜上以高于150kPa的膜间压差进行过滤处理，则有时很可能会破坏有机高分子膜的结构，从而生产化学品的能力降低。此外，如果是低于0.1kPa的膜间压差，则多数情况无法获得充分的发酵培养液的透过水量，存在制造化学品时生产性降低的倾向。所以，本发明的化学品的制造方法中，对于有机高分子膜，通过使作为过滤压力的膜间压差为优选0.1～150kPa的范围，从而发酵培养液的透过水量多，也不会发生由膜结构破坏导致的化学品制造能力降低，因此可以高度维持生产化学品的能力。膜间压差对于有机高分子膜优选为0.1～50kPa的范围，进一步优选为0.1～20kPa的范围。
酵母发酵中的温度可以设定成适于所使用的酵母的温度，只要是微生物生长繁殖的范围，就没有特别限定，以温度为20～75℃的范围进行。
本发明的化学品的制造方法中，也可以在培养初期进行分批培养或补料分批培养使微生物浓度提高后，开始连续发酵(培养液的过滤)。此外，也可以接种高浓度的菌体，在开始培养的同时进行连续发酵。本发明的化学品的制造方法中，可以从适当的时间起进行发酵原料的提供和培养液的过滤。提供发酵原料与过滤培养液的开始时间未必相同。此外，提供培养基与过滤培养液可以是连续的，也可以是间歇的。
在提供的发酵原料中，可以添加菌体增殖所需的营养素，连续地进行菌体增殖。对于培养液中微生物的浓度，为了获得效率良好的生产性，优选以较高状态维持化学品的生产性。作为一例，通过将培养液中微生物的浓度以干重计维持在5g/L以上，可以获得良好的生产效率。
本发明的化学品的制造方法中，可以在连续发酵中途根据需要从发酵槽内除去一部分包含微生物的培养液，提供发酵原料进行稀释，由此调整培养槽内的微生物浓度。例如如果发酵槽内的微生物浓度过高，则易于发生分离膜的堵塞，因此通过除去一部分包含微生物的培养液，提供发酵原料进行稀释，有时可以回避堵塞。本发明的化学品的制造方法中，发酵槽的数量可以是任意的。
本发明中使用的连续发酵装置只要是将酵母的培养液用分离膜进行过滤，从滤液中回收生产物，同时将包含微生物的未滤液保持或回流至所述培养液中，并且在所述培养液中补加发酵原料，回收滤液中的生产物的利用连续发酵的化学品的制造装置，就没有特别限制，如果列举具体例，则可以使用WO2007/097260、WO2010/038613中记载的装置。
作为通过本发明制造的化学品，可以举出醇、有机酸等在发酵工业中大量生产的物质。例如，作为醇，可以举出乙醇、1,3-丙二醇、1,3-丁二醇、2,3-丁二醇、1,4-丁二醇、甘油、丁醇、异丁醇、2-丁醇、异丙醇等，作为有机酸，可以举出乙酸、乳酸、己二酸、丙酮酸、琥珀酸、苹果酸、衣康酸、柠檬酸。此外，本发明也可以应用于生产酶、抗生素、重组蛋白质这样的物质。这些化学品根据周知的方法(膜分离、浓缩、蒸馏、结晶析出、提取等)从滤液中回收。
此外，本发明不限定于前述这样的化学品的制造方法，也可以是基于前述方法的以微生物的增殖为目的的培养方法。作为这样的具体例，可以举出以微生物为制造目标物的培养。
实施例
下面，举出实施例对本发明具体进行说明。但是，本发明不限定于此。
(参考例1)糖类、乙醇的分析方法
原料中糖类、乙醇浓度在下述所示的HPLC条件下通过与标准品的比较进行定量。
柱：Shodex SH1011(昭和電工株式会社制造)
流动相：5mM硫酸(流速0.6mL/分钟)
反应液：无
检测方法：RI(差示折射率)
温度：65℃。
(参考例2)含有甘蔗糖蜜的原料的制备
将对甘蔗渣进行水热处理而得的固体成分(C6馏分)和水混合，在固体成分投料浓度为10％的混合液中添加糖化酶20mg/g-干燥甘蔗渣，进行48小时糖化反应。另外，糖化反应在50℃下进行，不进行pH控制。在48小时后添加甘蔗糖蜜并使其最终为表1中所示的比例后，通过压滤进行糖化残渣与糖化液的固液分离，其后，通过微滤膜、超滤膜，获得含有甘蔗糖蜜的原料。将基于参考例1所示的方法进行的含有甘蔗糖蜜的原料的分析结果示于表2。
表1
发酵原料 投料量(wt％)
水热处理C6馏分 7.7
甘蔗糖蜜 23.1
表2
(实施例1)使用粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)NBRC1628株的利用分离膜的连续发酵
作为培养微生物，使用乙醇生产酵母粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)NBRC1628株，作为培养基，使用表2所示的含有甘蔗糖蜜的原料，进行利用分离膜的连续培养。作为分离膜元件，采用日本特开2010-22321中记载的中空丝的形态。将粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)NBRC1628株接种在投入有5ml表2所示的原料的试管中振荡培养一夜(预预预培养)。将得到的培养液接种在投入有45ml新鲜的表2所示的原料的三角烧瓶中，以30℃、120rpm振荡培养8小时(预预培养)。从预预培养液50mL中分取出35mL，接种在投入有700mL表2所示的含有甘蔗糖蜜的原料的连续发酵装置中，对发酵反应槽通过附带的搅拌机以300rpm进行搅拌，进行24小时培养(预培养)。另外，接种后直接使发酵液循环泵运转，进行分离膜模块与发酵槽间的液体循环。预培养终止后，使过滤泵运转，开始用分离膜模块提取发酵液。过滤开始后边进行发酵原料添加控制使连续发酵装置的发酵液量为700mL，边在以下连续发酵条件下进行约300小时的连续培养。将连续培养中膜间压差和过滤速度的变化示于图1。
[连续发酵条件]
发酵反应槽容量：2(L)
使用分离膜：聚-1,1-二氟乙烯制过滤膜
膜分离元件有效过滤面积：218(cm2)
温度调整：30(℃)
发酵反应槽通气量：无通气
发酵反应槽搅拌速度：300(rpm)
pH调整：无调整
过滤通量设定值：0.1(m3/m2/天)
灭菌：包含分离膜元件的培养槽通过121℃、20min的高压釜进行高压蒸汽灭菌
平均细孔径：0.1μm
平均细孔径的标准偏差：0.035μm
膜表面粗糙度：0.06μm
纯水透过系数：50×10-9m3/m2/s/pa。
其结果如图1所示，约300小时的连续培养中膜间压差几乎是一定的，也没有引起膜堵塞，过滤通量也稳定地以一定值变化。此外，连续培养终止时间点的乙醇浓度为64g/L。
(比较例1)使用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NBRC2260株的利用分离膜的连续发酵1
作为培养微生物，使用乙醇生产酵母的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NBRC2260株，除此之外，采用与实施例1同样的方法进行连续培养。将连续培养中的膜间压差和过滤通量的变化示于图2。如图2所示可知，300小时的连续培养中，从经过100小时后开始，膜间压差发生急剧上升，引起膜堵塞，因此过滤通量也比设定值降低。此外，连续培养终止时间点的乙醇浓度为65g/L。
(参考例3)使用含有甘蔗糖蜜的原料的连续过滤试验
接着，仅使用表2所示的含有甘蔗糖蜜的原料进行连续过滤试验。过滤中的温度、搅拌速度、pH等条件采用与实施例1中记载的方法同样的方法进行。将600小时连续过滤试验中的膜间压差和过滤通量的变化示于图3。如图3所示，膜间压差几乎是一定的，也没有引起膜堵塞，过滤通量也稳定地以一定值变化。
(实施例2)使用日本裂殖酵母(Schizosaccharomyces japonicus)NBRC1609株的利用分离膜的连续发酵
作为培养微生物，使用日本裂殖酵母(Schizosaccharomyces japonicus)NBRC1609株，除此之外，采用与实施例1同样的方法进行连续培养。将连续培养中膜间压差和过滤通量的变化示于图4。如图4所示，约300小时的连续培养中，膜间压差几乎是一定的，也没有引起膜堵塞，过滤通量也稳定地以一定值变化。
(参考例4)使用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NBRC2260株的利用分离膜的连续发酵试验2
作为培养微生物，使用乙醇生产酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NBRC2260株，作为发酵原料，使用表3所示的不含有甘蔗糖蜜的原料，采用与实施例1同样的方法进行连续培养。但是设定过滤通量以0.2(m3/m2/天)实施。将连续培养中膜间压差和过滤速度的变化示于图5。
其结果是，尽管设定过滤通量是比较例2的2倍，但是约300小时的连续培养中，膜间压差几乎是一定的，也没有引起膜堵塞，过滤通量也稳定地以一定值变化。此外，连续培养终止时间点的乙醇浓度为47g/L。
可知膜堵塞根据使用的发酵原料、酵母的组合而发生、或不发生。
表3
(实施例3)培养液上清中的平均粒径测定结果
将实施例1、实施例2、比较例1、参考例3各自的培养液、以及含有甘蔗糖蜜的原料离心分离，实施得到的上清的平均粒径测定。具体而言，在加入有5mL参考例2的含有甘蔗糖蜜的原料的试管中接种粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)NBRC1628株、NBRC1609株或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NBRC2260株，以30℃、120rpm培养72小时。将各酵母培养液和参考例3的含有甘蔗糖蜜的原料以1000×G离心10分钟，回收各自的上清3mL。在pH5的柠檬酸缓冲液970μL加入回收到的上清30μL并稀释，将稀释的各溶液加入到1mL容量的一次性测定池中，通过动态光散射测定平均粒径。
[测定条件]
.光源的针孔尺寸：100μm
.测定波长：660nm
.测定角度：165°
.测定累积次数：70次
.溶剂折射率：1.3313
.溶剂粘度：0.8852cp。
接着，在以下条件下分析测定结果。
[分析条件]
对于粒径分析，使用大塚电子株式会社的Zeta电位.颗粒测定系统ELS-Z2，在25℃的条件下大气中进行测定。由动态光散射得到的散射强度的波动，通过累积量分析求得自相关函数，转换成相对于散射强度的粒度分布。对于粒度分布的直方图分析范围，最小值为1nm，最大值为5000nm。将得到的平均粒径示于表4。
表4
其结果如表4所示，在通过含有甘蔗糖蜜的原料利用分离膜的连续培养中没有引起膜堵塞、没有发生过滤速度降低的粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)NBRC1628株和日本裂殖酵母(Schizosaccharomyces japonicus)NBRC1609株的培养液上清中，包含平均粒径为300nm以上的颗粒。另一方面，在连续培养中引起膜堵塞、发生过滤速度降低的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NBRC2260株的培养液上清中，没有包含平均粒径为300nm以上的颗粒。另外，含有甘蔗糖蜜的原料中也没有确认颗粒的存在。即可知，在使用含有甘蔗糖蜜的培养基的利用分离膜的连续发酵中，如果在发酵中使用使培养液的离心上清中含有平均粒径为100nm以上的颗粒的微生物，则不会发生膜堵塞。

Claims (5)

1.化学品的制造方法，是对微生物用包含甘蔗糖蜜作为主成分的发酵原料进行培养，将培养液用分离膜进行过滤，回收通过上述过滤而与微生物分离开的包含化学品的滤液，进一步将包含微生物的未过滤液保持在或回流至培养液中，并且在培养液中补加发酵原料，从而进行连续发酵的化学品的制造方法，其中，
对使所述培养液的离心上清中含有平均粒径为100nm以上的颗粒的微生物进行培养。
2.根据权利要求1所述的化学品的制造方法，其中，所述颗粒的平均粒径为300nm以上。
3.根据权利要求1或2所述的化学品的制造方法，其中，所述发酵原料包含甘蔗糖蜜和来自含纤维素的生物质的糖液的混合物。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的化学品的制造方法，其中，所述微生物是属于裂殖酵母(Schizosaccharomyces)属的酵母。
5.微生物的培养方法，是对微生物用包含甘蔗糖蜜作为主成分的发酵原料进行培养，将培养液用分离膜进行过滤，将包含微生物的未过滤液保持在或回流至培养液中，并且在培养液中补加发酵原料，从而进行连续培养的微生物的培养方法，其中，
对使所述培养液的离心上清中含有平均粒径为100nm以上的颗粒的微生物进行培养。
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