JP6403188B2 - 糖液の製造方法及び多糖類系バイオマス由来化合物の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、セルロース含有バイオマス等の多糖類系バイオマスから糖液を製造する方法と、前記方法で得られた糖液を用いて多糖類系バイオマス由来化合物を製造する方法とに関する。

バイオエタノールの製造において、農産物の非可食部に多く含まれるセルロース含有バイオマスの利用が望まれている。例えばイネ科穀類の農業残渣である稲わらは、産出量が多いため、セルロース含有バイオマスの候補の一つとして挙げられる。

稲わら等のセルロース含有バイオマスは、主に、セルロース、ヘミセルロース及びリグニンから構成されている。セルロース含有バイオマスを原料としてバイオエタノールを製造する際には、通常、原料を前処理して糖液を作製し、得られた糖液を発酵処理する。

前処理では、例えば、セルロース及びヘミセルロースをリグニンから分離して加水分解し、単糖及び／又はオリゴ糖に分解する。これにさらに糖化処理が施される場合もある。加水分解の方法としては、例えば、酸処理、アルカリ処理及び水熱処理等が挙げられる。この前処理では糖の分解（糖の過分解）も進むため、フルフラール及び５−ヒドロキシメチルフルフラール（５−ＨＭＦ）等のフラン化合物や、酢酸及びギ酸等の有機酸も生成される。これらの化合物は、後の発酵工程において微生物による発酵を阻害し、発酵産物の収量が低減する要因となる。したがって、これらの化合物は発酵阻害物質と呼ばれ、セルロース含有バイオマスから作製された糖液を発酵原料として利用する際に大きな課題となっていた。

従来、上記のような発酵阻害物質を糖液の製造過程で除去するための様々な方法が提案されているが、それらの中でより簡便に高い除去効果が得られる方法として、分離膜を利用して糖液から発酵阻害物質を取り除く方法が提案されている（特許文献１及び２）。

特許文献１には、多糖類系バイオマスを加水分解処理して得られる生成物を糖化処理することによって単糖及び／又はオリゴ糖を含む糖液を作製し、この糖液から、ある特定のパラメータを満たす分離膜を用いて発酵阻害物質を除去する方法が記されている。この方法で用いられる分離膜が満たすべきパラメータとは、特定の条件下でのグルコース除去率が８０％以上であり、且つ、グルコース除去率とイソプロピルアルコール除去率との差が２０％以上であることである。

特許文献２には、セルロース含有バイオマスを原料として糖液を製造する方法において、セルロース含有バイオマスを加水分解して得られた糖水溶液をナノろ過膜でろ過して、非透過側の精製糖液を回収し、透過側の発酵阻害物質を除去することが記載されている。また、特許文献２には、ナノろ過膜を用いた処理でのファウリングの要因となる微粒子や水溶性高分子を糖水溶液から除去するために、ナノろ過膜に透過させる前に、ナノろ過膜よりも大きい孔径の細孔を有する精密ろ過膜及び／又は限外ろ過膜に糖液を透過させることも記載されている。

国際公開第２００９／１１０３７４号 国際公開第２０１０／０６７７８５号

特許文献１及び２に記載された方法によれば、フルフラール、５−ＨＭＦ、酢酸及びギ酸等の発酵阻害物質が低減された糖液を得ることができる。したがって、そのような糖液を発酵処理に使用することにより、発酵の阻害が低減されて発酵産物の収量を増加させることが可能となる。

しかし、発酵産物の収量は、発酵原料の糖液において、従来除去すべきものと認識されていた上記発酵阻害物質の存在だけでなく、単糖の濃度や純度等の他の様々な要因が複雑に関係していると考えられる。したがって、特許文献１及び２に記載されているような、分離膜を利用して発酵阻害物質を除去して糖液を作製する方法についても、発酵産物の収量をさらに増加させるために、さらなる改善の余地があった。また、原料である多糖類系バイオマスから発酵産物（多糖類系バイオマス由来化合物）への変換効率を高める、すなわち、多糖類系バイオマスから糖類を効率良く取り出し、その糖を効率良く発酵させて発酵産物の生産性を高める、という観点からも、従来の方法には更なる改善の余地があると考えられる。

そこで、本発明は、多糖類系バイオマスを原料とする糖液の製造に関し、発酵原料として用いられた場合に発酵産物の収量増加を実現できる糖液を製造する方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、そのような方法で製造された糖液を発酵原料として用いて発酵処理を行うことで、多糖類系バイオマス由来化合物を高生産性で得る方法を提供することも目的とする。

本発明者らは、発酵原料として用いられた場合に発酵産物の収量増加を実現できる糖液について鋭意研究を行った。その結果、本発明者らは、多糖類系バイオマスを原料として製造された糖液には、発酵阻害物質として従来認識されていたフルフラール、５−ＨＭＦ、酢酸及びギ酸等の低分子化合物（以下、低分子発酵阻害物質ということがある。）以外にも、発酵を阻害する要因となり得る、より分子量の大きい高分子化合物（以下、高分子発酵阻害物質ということがある。）が存在することを見出した。このような知見に基づき、本発明者らは、多糖類系バイオマスからの糖類の収量を低下させることなく、新たに発酵阻害物質として認識された高分子化合物の含有量が低減された糖液を得るための新規な方法として、以下の本発明の糖液の製造方法に到達した。

本発明は、多糖類系バイオマスを原料として糖液を製造する方法であって、
（Ｉ）前記多糖類系バイオマスを分解処理することによって得られた、少なくともオリゴ糖を含む第１溶液を準備する工程と、
（II）前記第１溶液を第１分離膜に透過させて、非透過側から第２溶液を回収する工程と、
（III）前記第２溶液に対し、オリゴ糖を単糖に分解する糖化処理を施して、第３溶液を得る工程と、
（IV）前記第３溶液を第２分離膜に透過させて、透過側から第４溶液を回収して糖液を得る工程と、
を含み、
前記第１分離膜は、２０００ｐｐｍのＮａＣｌ水溶液を、液温２５℃、１．０ＭＰａ、ｐＨ６．５で評価したときのＮａＣｌ阻止率が５％以上の分離膜であり、
前記第２分離膜は、前記第１分離膜の前記ＮａＣｌ阻止率よりも低い阻止率を有する、
糖液の製造方法を提供する。

また、本発明は、
（ｉ）上記本発明の糖液の製造方法を用いて糖液を準備する工程と、
（ii）前記糖液を発酵原料として用い、前記糖液を発酵処理する工程と、
を含む、多糖類系バイオマス由来化合物の製造方法も提供する。

本発明の糖液の製造方法では、多糖類系バイオマスを分解処理して得られた第１溶液を、まず第１分離膜で処理する。この第１分離膜はＮａＣｌ阻止率が５％以上の分離膜であるので、従来発酵阻害物質として認識されていた低分子発酵阻害物質は第１分離膜を透過し、一方、第１分離膜の非透過側には、第１溶液中の糖類が精製濃縮された第２溶液が残る。次に、第２溶液に含まれるオリゴ糖を単糖に分解して第３溶液を得る。したがって、第３溶液に含まれる糖類は、ほぼ単糖となる。この第３溶液を第２分離膜に透過させて、透過側から第４溶液を回収する。第２分離膜は、第１分離膜のＮａＣｌ阻止率よりも低い阻止率を有する分離膜であるので、第３溶液に含まれる糖類（単糖）は第２分離膜を透過し、第３溶液に含まれる高分子発酵阻害物質は第２分離膜に阻止されて非透過側に残る。この工程を経て第２分離膜の透過側から得られた第４溶液は、低分子発酵阻害物質に加えて高分子発酵阻害物質も低減された、単糖の精製濃縮液である。さらに、本発明の製造方法では、低分子から高分子までの幅広い分子量の発酵阻害物質を除去するために、第１分離膜での処理→糖化処理→第２分離膜での処理、の順番で各工程を実施するので、糖類を、原料である多糖類系バイオマスから可能な限り無駄にすることなく効率良く回収することができる。したがって、本発明の糖類の製造方法によれば、発酵原料となる単糖の収量、濃度及び純度が共に向上し、且つ、低分子から高分子までの幅広い分子量の発酵阻害物質が十分に低減された糖液を得ることができるので、この糖液を発酵原料として用いた場合に発酵産物の収量増加を実現できる。

本発明の多糖類系バイオマス由来化合物の製造方法は、上記の効果を奏する糖液を発酵原料として用いて発酵処理を行うので、多糖類系バイオマス由来化合物の生産性を高めることができる。

本発明の糖液の製造方法及び本発明の多糖類系バイオマス由来化合物の製造方法の概略を示すフロー図である。 実施例及び比較例で実施した膜分離に用いられた装置を示す概略図である。 実施例１のエタノール発酵液中のグルコース、キシロース、フルクトース、エタノール、グリセロール及びキシリトールの濃度の発酵時間に対する変化を示すグラフである。 比較例１のエタノール発酵液中のグルコース、キシロース、フルクトース、エタノール、グリセロール及びキシリトールの濃度の発酵時間に対する変化を示すグラフである。 実施例２のエタノール発酵液中のグルコース、キシロース、フルクトース、エタノール、グリセロール及びキシリトールの濃度の発酵時間に対する変化を示すグラフである。 比較例２のエタノール発酵液中のグルコース、キシロース、フルクトース、エタノール、グリセロール及びキシリトールの濃度の発酵時間に対する変化を示すグラフである。 比較例３のエタノール発酵液中のグルコース、キシロース、フルクトース、エタノール、グリセロール及びキシリトールの濃度の発酵時間に対する変化を示すグラフである。

以下、本発明の実施形態について説明する。なお、以下の記載は本発明を限定するものではない。

本実施形態の糖液の製造方法は、多糖類系バイオマスを原料として糖液を製造する方法であって、
（Ｉ）前記多糖類系バイオマスを分解処理することによって得られた、少なくともオリゴ糖を含む第１溶液を準備する工程と、
（II）前記第１溶液を第１分離膜に透過させて、非透過側から第２溶液を回収する工程と、
（III）前記第２溶液に対し、オリゴ糖を単糖に分解する糖化処理を施して、第３溶液を得る工程と、
（IV）前記第３溶液を第２分離膜に透過させて、透過側から第４溶液を回収して糖液を得る工程と、
を含む。

ここで、本発明における多糖類系バイオマスとは、セルロース、ヘミセルロース及びリグニンを主に含むものであり、例えば、針葉樹、広葉樹、建築廃材、林地残材、林産物資源、稲藁、籾殻、麦藁、木材チップ、木材繊維、化学パルプ、古紙、合板等の農林産物資源、農林産物廃棄物及び農林産物加工品である。なお、ショ糖含有資源、とうもろこし及びサツマイモ等のデンプン含有資源等の糖の過分解物に代表される発酵阻害物質を含有または精製するものであれば、本発明の製造方法で処理対象として構わない。これらの多糖類系バイオマスは単独であってもよく、混合物であってもよい。

また、本発明における単糖とは、キシロース及びアラビノースを例とする５つの炭素を構成単位とする五炭糖と呼ばれるものや、グルコース、フルクトース及びマンノースを例とする６つの炭素を構成単位とする六炭糖と呼ばれるものを含む。オリゴ糖とは、単糖が二個以上連結された糖の事を意味し、具合的な例としては、各単糖の二量体、三量体及び多量体が挙げられ、さらに、グルコースとフルクトースが結合したスクロース等もオリゴ糖に分類される。また、同一の単糖が連結されたものでも、異種の単糖が連結されたものでも、オリゴ糖と定義される。

以下、図１のフロー図を参照しながら、各工程について具体的に説明する。

まず工程（Ｉ）の例について説明する。

工程（Ｉ）では、多糖類系バイオマスを分解処理することによって得られた第１溶液を準備する。

多糖類系バイオマスは、上記のとおり、セルロース及びヘミセルロースに加えてリグニンも含んでおり、多糖類系バイオマスの分解処理では、セルロース及びヘミセルロースをリグニンから分離して糖に分解する。多糖類系バイオマスの分解処理には、公知の前処理技術を適宜選択することが可能である。一般的には、酸処理、アルカリ処理又は水熱処理によって、多糖類系バイオマスを加水分解する。この加水分解処理の前に、粉砕、すりつぶし及び爆砕等の処理を施してもよい。本実施形態では、第１溶液が単糖よりもオリゴ糖を多く含むことが好ましく、より好ましくは第１溶液に含まれる糖がオリゴ糖を主成分とすることである。なお、ここで、第１溶液に含まれる糖がオリゴ糖を主成分とするとは、第１溶液に溶解している糖類の総量に対し、オリゴ糖が６０質量％以上、さらに望ましくは７０％以上、最も望ましくは８０％以上含まれていることである。第１溶液が単糖よりもオリゴ糖を多く含むことにより、後の工程（II）で第１溶液を第１分離膜を用いて膜分離する際に、オリゴ糖に加えて全ての単糖までをも膜上に阻止できる分離膜を選択する必要がなくなるので、第１分離膜の選択の幅が広がる。さらに、工程（II）の膜分離は、第１溶液の糖と低分子発酵阻害物質とを互いに分離するために実施されるので、糖と低分子発酵阻害物質との分子の大きさの差が大きい方が分離性能が高くなるので望ましい。したがって、糖としてオリゴ糖が単糖よりも多く含まれる溶液の方が、単糖がオリゴ糖よりも多く含まれる（糖がほぼ単糖で構成されている）溶液よりも、より効率よく低分子発酵阻害物質を除去することができる。

上記の理由から、多糖類系バイオマスの分解処理としては、得られる第１溶液が単糖よりもオリゴ糖を多く含むような方法が選択されることが好ましい。このような方法として水熱処理が挙げられる。水熱処理は、１００℃以上の加熱熱水を用いた加水分解により、セルロース及びヘミセルロースをリグニンから分離する方法である。加圧した熱水は酸と同様の作用をし、ヘミセルロースは１５０℃前後、セルロースは２３０℃前後で加水分解される。水熱処理は、有機溶媒や酸・塩基触媒を必要とする方法よりも安価であるという利点も有する。

多糖類系バイオマスを加水分解した後、固形画分と液体画分とを互いに分離し、得られた液体画分を第１溶液として次の工程（II）に用いることができる。なお、このときの固形画分と液体画分との分離には、遠心分離法及び膜分離法等の公知の方法を用いることができる。

次に、工程（II）が実施される。工程（II）では、工程（Ｉ）で準備された第１溶液を第１分離膜に透過させて、非透過側から第２溶液を回収する。第１溶液中の低分子発酵阻害物質は第１分離膜を透過するので、非透過側の第２溶液は、糖が精製濃縮された溶液となる。

発酵阻害物質とは、微生物による発酵を阻害する物質のことであり、それが発酵原料に含まれている場合に、含まれていない場合と比較して発酵産物の収量を低下させる物質のことである。ここでいう低分子発酵阻害物質とは、従来発酵阻害物質として認識されていた、糖の過分解物であるフラン化合物（フルフラール及び５−ヒドロキシメチルフルフラール（５−ＨＭＦ）等）及び有機酸（酢酸及びギ酸等）や、リグニンの分解物（バニリン及びシリンガアルデヒド等）等の化合物を指しており、発酵阻害物質の中でも分子量が２００以下の低分子化合物を指す。

前記第１分離膜は、２０００ｐｐｍのＮａＣｌ水溶液を、液温２５℃、１．０ＭＰａ、ｐＨ６．５で評価したときのＮａＣｌ阻止率が５％以上である分離膜である。好ましくは、第１分離膜のＮａＣｌ阻止率は２０％以上が好ましく、５０％以上がより好ましい。このような分離膜として、例えば、ナノろ過膜（ＮＦ膜）及び逆浸透膜（ＲＯ膜）を用いることができる。第１分離膜は、少なくとも第１溶液に含まれるオリゴ糖を膜上に阻止できる分離膜であればよい。第１溶液に単糖が比較的多く含まれる場合は、第１分離膜は、第１溶液に含まれる単糖も高い阻止率で膜上に阻止できる分離膜であることが好ましい。この場合は、第１分離膜における単糖（グルコース）の阻止率（２０００ｐｐｍのグルコース水溶液を、液温２５℃、１．０ＭＰａで評価したときのグルコース阻止率）は、８０％以上であることが望ましい。一方、第１溶液に単糖がほとんど含まれない場合（オリゴ糖が主成分の場合）は、糖と低分子発酵阻害物質との分離性能を高めるために、第１分離膜は、オリゴ糖をより高い阻止率で膜上に阻止でき、且つ、低分子発酵阻害物質をより高い透過率で透過させることができる分離膜であることが好ましい。この場合は、第１分離膜における単糖（グルコース）の阻止率は、８０％未満であることが望ましい。

ここで、ＲＯ膜とはイオンや塩類を透過しない膜であり、例えば、１．０ＭＰａの圧力で溶質（塩化ナトリウム）２０００ｍｇ／Ｌの溶液を２５℃の温度で評価した際、塩阻止率が８０％以上を示す半透膜のことをいう。塩阻止率は、ＮａＣｌ濃度と水溶液電導度との相関(検量線)を事前に作成し、それを用いて求められたＮａＣｌ濃度を用いて、下式により算出することができる。
塩阻止率（％）＝{１−（透過液中のＮａＣｌ濃度［ｍｇ／Ｌ］）／（供給液中のＮａＣｌ濃度［ｍｇ／Ｌ］）}×１００

ＮＦ膜とは一般的にＲＯ膜よりも阻止性能が低く、２価のイオン類を除去する性能に優れるという特性を持っているが、有機物や脱色などにも使われる半透膜である。例えば、ＲＯ膜の特定に用いた上記の塩化ナトリウムの阻止性能の評価において、阻止率が１０％以上ある膜はＮＦ膜の部類に入る。

第１分離膜の材質は、特には限定されず、例えば酢酸セルロース等のセルロースエステル系ポリマー、ポリアミド、ポリエステル、ポリイミド、ビニルポリマー、ポリエーテルスルホン、スルホン化ポリエーテルスルホン、ポリアミド等の高分子材料を使用できる。複数の材料が使用されてもよい。これらの中でも、高い阻止性能の実績があることから、ＲＯ膜にはポリアミドが好適に用いられる。また、ＮＦ膜には、分離対象により適宜選択されるが、ポリアミドやポリエーテルスルホン、ポリビニルアルコールやそれらの混合物などが好適に用いられる。

第１分離膜の形状は、特には限定されず、平膜状、中空糸膜状、プリーツ膜状及びチューブラー膜状等から選択して使用することができる。特に、平膜を封筒状に加工し、当該膜をネット等の支持体と共に渦巻状に巻いて作られる、いわゆるスパイラル型エレメント膜が、膜面積を大きくできるため好ましい。

第１分離膜を用いた膜分離の方法は、特には限定されず、公知の膜分離方法を用いることができる。例えば、膜分離によって得られた第２溶液を水で希釈し、得られた希釈溶液を再度第１溶液として供給して第１分離膜を透過させることによって、工程（II）を連続して複数回繰り返してもよい。すなわち、第１分離膜による膜分離を多段で行うことが可能である。この場合に使用される第１分離膜は、上記で特定したＮａＣｌ阻止率（ＮａＣｌ阻止率：５％以上）を満たす限り特には限定されず、全ての段で同じ種類の分離膜を用いてもよいし、各段で異なる種類の分離膜を用いてもよい。第１分離膜による膜分離を多段で行うことにより、低分子発酵阻害物質の濃度がより低減された第２溶液を得ることができるので、最終的に得られる糖液の糖純度を上げることができる。なお、図１に示したフロー図には、第１分離膜による膜分離を２回行う例が示されている。膜分離回数は、低分子発酵阻害物の濃度が微生物の発酵を阻害しないレベル（原液程度以下）になる回数とすることが好ましい。

次に、工程（III）が実施される。工程（III）では、工程（II）で回収された第２溶液に対して糖化処理を行い、オリゴ糖を単糖に分解する。糖化処理としては、薬品やエネルギーを使用しない酵素糖化処理を用いることが好ましい。この酵素糖化処理に用いられる糖化酵素は、特には限定されず、公知の酵素を使用することができる。酵素糖化処理は、糖化酵素を第２溶液に添加することによって実施できる。

次に、工程（IV）が実施される。工程（IV）では、工程（III）で得られた第３溶液を第２分離膜に透過させる。第３溶液中の高分子発酵阻害物質は第２分離膜に阻止されて非透過側に残るので、透過側の第４溶液は、高分子発酵阻害物質が低減され、且つ、糖がさらに精製濃縮された溶液となる。この第４溶液を、糖液として回収する。

ここでいう高分子発酵阻害物質とは、従来、発酵を阻害する要因としては認識されていなかった物質であり、例えばリグニン及びリグニンの分解物等の、分子量が１０００以上である高分子化合物であると考えられる。

第２分離膜は、第１分離膜のＮａＣｌ阻止率よりも低い阻止率を有する分離膜である。第２分離膜は、塩分離性能を発現しないことが好ましい。したがって、第２分離膜は、単糖を透過させ、且つ、高分子発酵阻害物質を膜上に阻止できる。

例えば、精密ろ過膜（ＭＦ膜）及び限外ろ過膜（ＵＦ膜）を、第２分離膜として用いることができる。第２分離膜が、高分子阻害物質の中でも比較的低分子量成分までを除去できるように、ＵＦ膜を第２分離膜として用いることが好ましい。第２分離膜は、単糖を透過でき、かつ透過液中で微生物によるエタノール発酵を阻害するような物質を可能な限り阻止できるものであることが好ましい。そのような観点から、ＮＦ膜を第２分離膜として使用することも可能である。

より確実に単糖を透過させて高分子発酵阻害物質を膜上に阻止するために、第２分離膜として、２０００ｐｐｍのグルコース水溶液を、液温２５℃、１．０ＭＰａで評価したときのグルコース阻止率が５％以下の分離膜を用いることが好ましい。

ＭＦ膜とは、平均細孔径が０．０１μｍ〜１０μｍ程度である膜のことである。また、ＵＦ膜とは、平均細孔径が０．００１μｍ〜０．０１μｍ程度である膜のことである。

第２分離膜の材質は、特には限定されず、例えば酢酸セルロース等のセルロースエステル系ポリマー、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスルフォン、ポリフッ化ビニリデン、ポリエーテルスルホン等の高分子材料を使用できる。耐久性や洗浄性の観点からポリフッ化ビニリデンやポリエーテルスルホンが好ましい。

第２分離膜の形状は、特には限定されず、平膜状、中空糸膜状、プリーツ膜状及びチュプラー膜状等から選択して使用することができる。特に、平膜を封筒状に加工し、当該膜をネット等の支持体と共に渦巻状に巻いて作られる、いわゆるスパイラル型エレメント膜が、膜面積を大きくできるため好ましい。

第２分離膜を用いた膜分離の方法は、特には限定されず、公知の膜分離方法を用いることができる。

第４溶液として回収された糖液は、発酵によって多糖類系バイオマス由来化合物を得るための発酵原料として用いられる。すなわち、本実施形態の多糖類系バイオマス由来化合物の製造方法は、
（ｉ）本実施形態の糖液の製造方法を用いて糖液を準備する工程と、
（ii）前記糖液を発酵原料として用い、前記糖液を発酵処理する工程と、
を含む。

ここでいう多糖類系バイオマス由来化合物とは、多糖類系バイオマスを原料として製造される糖液（本実施形態の糖液の製造方法で製造された糖液）を発酵原料とし、これを発酵処理して得られる全ての化合物を意味しており、例えば、エタノール及びブタノール等のアルコール、バイオプラスチック原料である乳酸、及び、コハク酸等が挙げられる。

本実施形態の糖液の製造方法で得られた糖液を発酵原料とする多糖類系バイオマス由来化合物の製造方法では、発酵方法として公知の方法を使用でき、発酵に使用される微生物としても公知の酵母等を使用できる。使用される微生物は、自然環境から単離されたものでもよく、また、突然変異や遺伝子組み換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。多糖類系バイオマスを原料として製造された糖液には、キシロースといった五炭糖が含まれる。そのため、発酵に使用される微生物として、五炭糖を発酵できる微生物が選択されることが好ましい。また、発酵原料として用いられる糖液には、低分子発酵阻害物質である酢酸等の酸が残存している場合があるので、発酵には耐酸性を有する微生物を用いることが好ましい。

本実施形態の多糖類系バイオマス由来化合物の製造方法で用いられる糖液は、低分子から高分子までの幅広い分子量の発酵阻害物質が低減され、且つ、糖液が高度に精製濃縮されたものである。したがって、本実施形態の製造方法の工程（ii）の糖液の発酵処理によれば、高い発酵収率が得られて、発酵産物の収量が増加する。これにより、本実施形態の製造方法によれば、多糖類系バイオマスから多糖類系バイオマス由来化合物を高い生産性で製造できる。

次に、本発明の糖類の製造方法及び多糖類系バイオマス由来化合物の製造方法について、実施例を用いて具体的に説明する。

（実施例１）
＜糖液の製造＞
［第１溶液の準備］
多糖類系バイオマスとしての稲わらを、１０ＭＰａ以下の圧力下で、２００℃前後で水熱処理することによって得られた生成物をろ過して、固体画分と液体画分とに分離した。この液体画分のｐＨは４．４であり、第１溶液とした。

［第１分離膜を用いた第１溶液の膜分離］
第１分離膜として、ＮＦ膜（「ＥＳＮＡ３」、日東電工株式会社製）を用いた。第１溶液の膜分離には、このＮＦ膜を直径７．５ｍｍにカットしたものを、バッチ式平膜テストセル（「メンブレンマスター Ｃ４０−Ｂ」、日東電工株式会社製）（直径：１０４ｍｍ、高さ１４７ｍｍ）に設置して実施した。このテストセルの最大容量は３８０ｍＬであった。具体的には、図２に示すように、テストセル２１をマグネチックスターラー（「ＩＳ−１０Ｐ」、株式会社池田理科製）２２上に設置して、テストセル２１中の第１溶液２３を攪拌子２４で４００ｒｐｍで攪拌した。膜分離は、窒素ガスによりテストセル２１内に２．８ＭＰａの圧力を掛けて、室温２５℃で行った。この膜分離により、第１分離膜２５の非透過側に、第１溶液中の糖類が１０．２倍に濃縮された濃縮液を得た（第２溶液）（膜分離１回目）。この濃縮液をＭｉｌｌｉ−Ｑ水で４倍に希釈したものを第１溶液として、再度、同じ方法で膜分離を行った（膜分離２回目）。すなわち、本実施例では、第１分離膜による膜分離を２回連続して行った。最終的に第１分離膜の非透過側で濃縮された濃縮液（第２溶液）の濃縮度は、１０．２倍であった。

［糖化処理］
濃縮液（第２溶液）に、１０ｇ／Ｌヘミセルラーゼ（「Ｇ−Ａｍａｎｏ」、株式会社天野エンザイム製）を添加して３７℃、２４時間の酵素糖化処理を行い、第３溶液を得た。

［第２分離膜を用いた第３溶液の膜分離］
第２分離膜として、ＵＦ膜（「ＲＳ５０」、日東電工株式会社製）を用いた。このＵＦ膜を膜分離に使用した点以外は、第１分離膜による第１溶液の膜分離と同じ方法で、第３溶液の膜分離を行った。第３分離膜の透過側から透過液（第４溶液）を糖液として回収した。

＜糖液のエタノール発酵＞
上記方法で得られた糖液のエタノール発酵を行った。まず、サッカロマイセス・セレビシエのＭＮ８１４０Ｘ／ＴＦ−ＴＦ株を準備した。ＹＰＸ培地（１０ｇ／Ｌ酵母エキス、２０ｇ／Ｌポリペプトン、２０ｇ／Ｌキシロース）中にて３０℃、１５０ｒｐｍで９６ｈ前培養したものを回収して、ＭＮ８１４０Ｘ／ＴＦ−ＴＦ株として使用した。糖液（第４溶液）に、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、２０ｇ／Ｌポリペプトン、５０ｗｅｔ−ｇ／Ｌ（乾燥状態の１０ｇ／Ｌに相当）酵母ＭＮ８１４０Ｘ／ＴＦ−ＴＦ株を添加して（この際、糖液は０．８倍に希釈されたことになった。）、３０℃で４８時間のエタノール発酵を行った。発酵は、ＣＯ₂ガスを逃がす排気口を備えた５０ｍＬボトル中にて、発酵液を回転させながら行った。

＜分析・評価方法＞
［エタノール発酵液中の各成分濃度測定］
エタノール発酵液中のグルコース、キシロース、フルクトース、エタノール、グリセロール及びキシリトールの濃度は、高速液体クロマトグラフィー（「Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ」、株式会社島津製作所製）で分析した。なお、エタノール発酵液中の各成分濃度は、発酵開始からの経過時間が０、３、６、９、２４、４８時間の時に実施した。結果は、図３及び表１に示されている。なお、表１において、エタノール収量とは、発酵開始から４８時間後の発酵液中のエタノール濃度であり、エタノール収率とは、エタノール収量（ｇ）／消費糖の量（ｇ）で求められた値である。

（比較例１）
第２分離膜（ＵＦ膜）を用いた膜分離工程を実施しなかった点以外は、実施例１と同じ方法で糖液を作製した。また、実施例１と同じ方法で、糖液のエタノール発酵及び発酵液中の各成分濃度測定を行った。結果は、図４及び表１に示されている。

図３及び図４からわかるように、実施例１の糖液と比較例１の糖液とは糖濃度がほぼ同じであった。しかし、それにもかかわらず、表１に示すとおり、エタノール収量は実施例１の方が比較例１よりも多かった。これは、実施例１の糖液では、ＵＦ膜を用いた膜分離が行われたことにより、高分子発酵阻害物質が低減したためであると考えられる。すなわち、実施例１の糖液は、比較例１の糖液と比較して、高分子発酵阻害物質が少なく、単糖の純度が高かったと考えられる。したがって、実施例１の糖液を用いたエタノール発酵では、比較例１の場合よりも、キシロース利用速度が高く、実施例１では０．６４±０．０４ｇ／Ｌ／時間（６〜４８時間目）であり、比較例１では０．４２±０．０１ｇ／Ｌ／時間（９〜４８時間目）であった。その結果、実施例１でのエタノール収量も多くなったと考えられる。エタノール収率については差がないものと考えられる。

（実施例２）
多糖類系バイオマスとしての稲わらを、１０ＭＰａ以下の圧力下で、２００℃前後で水熱処理することによって得られた生成物をろ過して、固体画分と液体画分とに分離した。この液体画分のｐＨは４．４であり、第１溶液とした。なお、実施例２で準備した第１溶液は、実施例１の第１溶液よりも糖類の濃度が高いものであった。第１分離膜を用いた第１溶液の膜分離は、図２に示す装置を用い、窒素ガスによりテストセル２１内に２．８ＭＰａの圧力を掛けて、室温２５℃で行った。この膜分離により、第１分離膜２５の非透過側に、第１溶液中の糖類が５．１倍に濃縮された濃縮液を得た（第２溶液）（膜分離１回目）。この濃縮液をＭｉｌｌｉ−Ｑ水で５倍に希釈したものを第１溶液として、再度、同じ方法で膜分離を行った（膜分離２回目）。膜分離２回目で得られた濃縮液をＭｉｌｌｉ−Ｑ水で５倍に希釈したものを第１溶液として、再度、同じ方法で膜分離を行った（膜分離３回目）。すなわち、本実施例では、第１分離膜による膜分離を３回連続して行った。最終的に第１分離膜の非透過側で濃縮された濃縮液（第２溶液）の濃縮度は、５．３倍であった。その後、糖化処理、及び、第２分離膜を用いた第３溶液の膜分離を、実施例１と同じ方法で行った。さらに、実施例１と同じ方法で、糖液のエタノール発酵及び発酵液中の各成分濃度測定を行った。結果は、図５及び表２に示されている。

（比較例２）
第１分離膜を用いた第１溶液の膜分離を１回のみ実施し、且つ、第２分離膜（ＵＦ膜）を用いた膜分離工程を実施しなかった点以外は、実施例２と同じ方法で糖液を作製した。また、実施例１と同じ方法で、糖液のエタノール発酵及び発酵液中の各成分濃度測定を行った。結果は、図６及び表２に示されている。

（比較例３）
第１溶液には、実施例２の第１溶液と同じものを使用した。この第１溶液をＵＦ膜（「ＲＳ５０」、日東電工株式会社製）に透過させて、透過液を回収した。具体的な方法は、実施例２で実施した第２分離膜による第３溶液の膜分離と同じであったが、テストセル内の圧力は０．４ＭＰａであった。その後は、比較例２と同様に、第１分離膜を用いた膜分離及び酵素糖化処理を実施して糖液を作製し、さらにその糖液を用いてエタノール発酵及び発酵液中の各成分濃度測定を行った。結果は、図７及び表２に示されている。

実施例２と比較例２及び３とは、同じ第１溶液を用いたにも関わらず、実施例２で作製された糖液を用いたエタノール発酵では、比較例２及び３よりも高いエタノール収量及びエタノール収率が得られた。これは、実施例２では、まずＮＦ膜を用いた膜分離を行い、次に酵素糖化処理を行い、最後にＵＦ膜を用いた膜分離を行ったためであると考えられる。水熱処理で前処理された第１溶液には、糖類として、単糖だけでなくオリゴ糖も高い割合で含まれている。このような第１溶液をまずＮＦ膜を用いて膜分離することで、低分子発酵阻害物質を透過させて、ＮＦ膜の非透過側に単糖及びオリゴ糖が濃縮された第２溶液が得られる。次に、この第２溶液に酵素糖化処理を施すことで、オリゴ糖が単糖に分解された第３溶液が得られる。すなわち、第３溶液は、含まれる糖類がほぼ単糖で構成されているといえる。最後に、ＵＦ膜を用いた膜分離を実施することにより、第３溶液から分子量が大きい物質が除去されて、発酵原料となる単糖の収量、濃度及び純度が共に向上し、且つ、高分子発酵阻害物質が十分に低減された糖液が得られたと考えられる。実施例２では、このような糖液を発酵原料として用いたため、エタノール収量の増加を実現できた。

比較例２の方法で作製された糖液は、ＮＦ膜を用いた膜分離が実施されたため低分子発酵阻害物質はある程度除去されているものの、高分子発酵阻害物質は除去されていない。さらにＮＦ膜での分離が１回であるために低分子発酵阻害物が完全には除去されていない。一方、比較例３では、ＵＦ膜を用いた膜分離の工程が含まれているので、その工程の実施がＮＦ膜を用いた膜分離及び酵素糖化処理よりも前であるのでオリゴ糖のロスはありつつも、高分子発酵阻害物質の除去により比較例２よりも高い収量及び収率でエタノールが回収されている。比較例２及び比較例３の結果は、高分子発酵阻害物質の存在を示唆する結果である。なお、以下の表３に、比較例３のようにＵＦ膜を用いた膜分離をＮＦ膜を用いた膜分離よりも前に実施すると、第１溶液中のオリゴ糖が除去されていまい、最終的に得られる糖液中の糖の量が低下することを示す。表３には、比較例２及び３で作製された糖液中の単糖の濃度が示されている。比較例３の糖液は、比較例２の糖液よりも糖濃度が低くなっている。これは、比較例３では第１溶液をまずＵＦ膜で処理してしまったため、第１溶液中のオリゴ糖が除去されて、最終的に得られる糖の量が減ってしまったと考えられる。

本発明によれば、発酵原料として用いられた場合に発酵産物の収量増加を実現できる糖液を製造することができるので、本発明は、糖類を発酵により化学品に変換する幅広い用途に利用できる。

２１ テストセル
２２ マグネチックスターラー
２３ 第１溶液
２４ 攪拌子
２５ 第１分離膜

Claims (10)

1. 多糖類系バイオマスを原料として糖液を製造する方法であって、
   （Ｉ）前記多糖類系バイオマスを分解処理することによって得られた、少なくともオリゴ糖を含む第１溶液を準備する工程と、
   （II）前記第１溶液を第１分離膜に透過させて、非透過側から第２溶液を回収する工程と、
   （III）前記第２溶液に対し、オリゴ糖を単糖に分解する糖化処理を施して、第３溶液を得る工程と、
   （IV）前記第３溶液を第２分離膜に透過させて、透過側から第４溶液を回収して糖液を得る工程と、
   を含み、
   前記第１分離膜は、２０００ｐｐｍのＮａＣｌ水溶液を、液温２５℃、１．０ＭＰａ、ｐＨ６．５で評価したときのＮａＣｌ阻止率が５％以上の分離膜であり、
   前記第２分離膜は、前記第１分離膜の前記ＮａＣｌ阻止率よりも低い阻止率を有する、
   糖液の製造方法。
2. 前記第１分離膜が、ナノろ過膜又は逆浸透膜である、
   請求項１に記載の糖液の製造方法。
3. 前記第２分離膜が、ナノろ過膜、精密ろ過膜又は限外ろ過膜である、
   請求項１又は２に記載の糖液の製造方法。
4. 前記第２分離膜は、２０００ｐｐｍのグルコース水溶液を、液温２５℃、１．０ＭＰａで評価したときのグルコース阻止率が５％以下の分離膜である、
   請求項３に記載の糖液の製造方法。
5. 前記工程（III）の前記糖化処理が、酵素糖化処理である、
   請求項１〜４のいずれか１項に記載の糖液の製造方法。
6. 前記工程（Ｉ）において準備される前記第１溶液は、単糖よりもオリゴ糖を多く含む、
   請求項１〜５のいずれか１項に記載の糖液の製造方法。
7. 前記工程（Ｉ）における前記多糖類系バイオマスの分解処理が、水熱処理である、
   請求項１〜６のいずれか１項に記載の糖液の製造方法。
8. 前記第２溶液を水で希釈し、得られた希釈溶液を再度前記第１溶液として供給することによって、前記工程（II）を連続して複数回繰り返す、
   請求項１〜７のいずれか１項に記載の糖液の製造方法。
9. （ｉ）請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法を用いて糖液を準備する工程と、
   （ii）前記糖液を発酵原料として用い、前記糖液を発酵処理する工程と、
   を含む、多糖類系バイオマス由来化合物の製造方法。
10. 前記多糖類系バイオマス由来化合物がエタノールである、
    請求項９に記載の多糖類系バイオマス由来化合物の製造方法。

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