CN109438528A - 一种基于膜分离技术制备猴头菇低聚糖的方法 - Google Patents

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陈思
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Abstract

本发明提供了一种基于膜分离技术制备猴头菇低聚糖的方法，该方法所得低聚糖的分子量可以调控，主要为300‑2000Da的小分子猴头菇低聚糖，本发明将超滤、纳滤技术应用于食用菌低聚糖的分离，可以达到高效提纯低聚糖的目的，使最终所得低聚糖纯度较高，品质较好，且此制备过程耗时短、效率高、无化学污染、能耗低。

Description

一种基于膜分离技术制备猴头菇低聚糖的方法
(一)技术领域
本发明涉及一种食用菌低聚糖的制备方法，尤其涉及一种基于膜分离技术高效制备猴头菇低聚糖的方法。
(二)背景技术
低聚糖，又称寡糖，一般指由2-10个单糖组成的聚合物，由于单糖结合的位置和类型不同，形成了种类丰富的低聚糖，从已知常见的蔗糖、麦芽糖、乳糖等，到低聚木糖、大豆低聚糖、壳寡糖等，都是生物体内重要的功能物质。研究表明，低聚糖在改善脂质，降低胆固醇，降血糖以及促进肠道内双歧杆菌增殖、改善菌群结构等方面有很好的作用。肉质鲜美、营养丰富的食用菌中含有大量的聚糖类物质，吸引了不少学者的研究。如香菇、杏鲍菇，猴头菇等大型真菌都有报道含有不少的低聚糖。本发明以猴头菇为例，研究了制备猴头菇低聚糖的方法。
猴头菇(Hericium erinaceus)，又称猴头菌、猴头、猴菇、猴蘑，属齿菌科，因其形状类似于猴头而得名，是我国珍贵的药食兼用真菌，有“蘑菇之王”美誉。猴头菇营养价值很高，具有多种生物活性，如抗溃疡和炎症，增强免疫力，抗肿瘤，降血糖、血脂等作用。研究表明猴头菇低聚糖可作为促双歧杆菌生长因子，提高人体免疫力，使肠道内pH下降，抑制肠道有害菌生长；产生B族维生素，分解致癌物质；促进肠蠕动及蛋白质吸收。
膜分离技术包括微滤(MF)、超滤(UF)、纳滤(NF)、反渗透(RO)等。膜分离是利用膜孔的选择性筛分作用，以膜的两侧压力差、浓度差、电位差等为推动力，凭借各组分在膜中传质的选择性差异达到分离、提纯的目的。膜分离技术被誉为“二十一世纪最有发展前景的十大高新技术之一”，在现代化工业生产中有着重要的作用。超滤作为一种高效的膜分离方法，在食品领域被广泛使用。UF截留的粒径范围为5nm～0.1μm之间。超滤主要用于物质的分离、提纯和浓缩，当含有大、小分子物质2类溶质的溶液流过被支撑的膜表面时，溶剂和分子溶质将透过膜，作为透过物被收集起来；大分子溶质则被膜截留而作为浓缩液被回收。纳滤是介于超滤与反渗透之间的一种新型的分子级分离技术，可用来分离无机盐和相对分子质量低的有机物。纳滤在食用菌低聚糖领域的应用主要集中在提取液的浓缩或超滤透过液的浓缩中。
有关猴头菌活性物质的研究报道很多，但多数为多糖的研究，对猴头菇低聚糖的研究较少。本发明采用热水提法获得糖类混合物，并通过醇沉去除多糖的方法来得到粗寡糖，然后结合膜分离技术获得分子量为300-2000Da的低聚糖。
目前，关于低聚糖制备工艺的研究不少。例如：
申请公布号为CNIO6832048A的发明专利申请文献公开了一种分子量为2000-3000Da的果胶低聚糖制备方法，包括以下步骤：
(1)用超纯水配置质量浓度为0.5～2％的果胶溶液，至于35～45℃摇床使其充分溶解，测定初始pH，然后用碱液调节pH至9.5～10.5，于85～95℃继续摇床10～30min。
(2)向溶液中按体积加入5～20％的H2O2，于85～95℃摇床反应3～5h，反应结束后用酸液将pH调至略低于初始pH并向反应液中加入2～5倍体积的乙醇沉淀。
(3)离心，分离沉淀并用乙醇洗涤2～3次，置于35～45℃烘箱烘干至恒重，即得。
此发明实现了果胶的可控降解，制备出平均分子量2000-3000Da的果胶低聚糖，从而提高了产品质量。实验证明，该果胶低聚糖比普通化学法制备的产品具有更好的抑菌活性。且此发明工艺简单，生产周期短，产物收率和纯度高，所用的原料、试剂来源广泛、成本低廉，容易实现工业化大规模生产。
申请公布号为CNIO6632528A的发明专利申请文献公开了一种百香果低聚糖的制备方法，属于低聚糖提取技术领域方法，包括以下步骤：
(1)选取果实选取百香果皮棕褐色的百香果，去除腐败、变质的果实。
(2)去皮、剥籽人手剥去百香果外表，保留中间黄色果肉。
(3)打浆将百香果果肉与水按重量份一混合，置于打浆机中打浆20-60s。
(4)超离子液体微波提取低聚糖将嗅化1-己基-2-甲基咪唑作为提取溶液，百香果肉浆与嗅化1-己基-2-甲基咪唑按重量份比为1:1-1:5，室温下提取1-5h。
(5)抽滤分离提取后的百香果浆中加入2-5倍的无水乙醇，在室温下抽滤分离，并于30-40℃下真空旋转蒸发。
(6)冷冻浓缩：蒸发后的渣于-30℃到-10℃下冻干12-24h粉碎后保存即可。
本发明采用离子液体提取低聚糖，可避免高温提取对百香果活动成分的破坏，提取效率高，制备的低聚糖保存活性高，且离子液体可重复使用，大大节约提取成本。
(三)发明内容:
本发明旨在提供一种基于膜分离技术制备猴头菇低聚糖的方法，该方法所得低聚糖的分子量可以调控，主要为300-2000Da的小分子猴头菇低聚糖，且此制备过程耗时短、效率高、无化学污染、能耗低，可以获得纯度较高，品质较好的低聚糖。
本发明的技术方案如下：
一种基于膜分离技术制备猴头菇低聚糖的方法，所述方法为：
(1)将猴头菇粉按料液质量比1：20加入蒸馏水中，在60～80℃下浸提1～3h，抽滤，滤渣重复浸提一次，合并两次浸提所得滤液，减压浓缩后，用体积分数80～95％的乙醇水溶液进行醇沉(以去除多糖及杂质)，收集上清液；
所述猴头菇粉可通过常规途径商购获得；
具体的，所述两次浸提所得滤液合并后，减压浓缩至原体积的1/4，得到浓缩液，将所得浓缩液与体积分数80～95％的乙醇水溶液按体积比1：3混合进行醇沉；
(2)将步骤(1)所得上清液置于高压平板膜机的料液罐中，然后在高压平板膜机中放入1000-2000Da超滤膜，密封隔氧，在压力0.6～1.4MPa、转速300～900r/min下超滤，当原料液经超滤后被浓缩至原体积的1/4时，加水稀释1倍重复超滤操作，重复2～4次后，收集透过液；
所述超滤膜的材质为聚醚砜膜(PES)或聚酰胺(PA)；
(3)以步骤(2)所得透过液为原料，置于高压平板膜机的料液罐中，然后在高压平板膜机中放入100-300Da纳滤膜，密封隔氧，在压力0.6～1.4MPa、转速300～900r/min下纳滤，当原料液经纳滤后被浓缩至原体积的1/4时，加水稀释1倍重复纳滤操作，重复2～5次，收集浓缩液，真空冷冻干燥，得到猴头菇低聚糖；
所述纳滤膜的材质为聚酰胺(PA)。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)该方法所得低聚糖的分子量可以调控，主要为300-2000Da的小分子低聚糖。
(2)超滤膜可以截留蛋白，多糖等大分子，纳滤膜可以透过无机盐，单糖等小分子。本发明将超滤、纳滤技术应用于食用菌低聚糖的分离，可以达到高效提纯低聚糖的目的。使最终所得低聚糖纯度较高，品质较好。
(3)本发明工艺简单，生产周期短，处理条件温和，能耗低且低聚糖分离效果好。所用的原料、试剂来源广泛，成本低廉，容易实现工业化大规模生产。
(四)附图说明
图1为本发明制备猴头菇低聚糖的工艺流程图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐释，本发明根据发明技术方案进行实施，给出了详细的实施方式和操作步骤，但本发明的保护范围并不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
多糖含量测定方法：苯酚硫酸法，取0.5g的冷冻干燥多糖样品，分别溶于100mL容量瓶，然后取1mL定容于50mL容量瓶(或者将纳滤浓缩后的溶液取1mL定容于100mL容量瓶)。精确吸取样品溶液2.0mL，然后加入6％苯酚1mL、浓硫酸5mL，振荡摇匀后沸水浴15min，取出后迅速冷却至室温，测定490nm处的吸光值，以蒸馏水为空白对照。采用葡萄糖标准品建立标准曲线，计算总糖含量。
还原糖含量测定方法：取1.0mL样品于25mL的具塞试管中，然后分别加入3mL DNS试剂，采用振荡器混匀。沸水浴5min后，迅速冷却至室温，定容至25mL，摇匀。于540nm处测定吸光值，以蒸馏水为空白对照。采用葡萄糖标准品建立标准曲线，计算还原糖含量
蛋白质含量测定方法：考马斯亮蓝法(Bradford)法。以牛血清蛋白做标准曲线，取10mg牛血清蛋白(BSA)于容量瓶中，用蒸馏水溶解后定容至100mL，向6支试管中分别加入0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL蛋白质标准溶液，各管用蒸馏水补足1mL。再加入考马斯亮蓝G-250试剂5.0mL，在旋涡振荡器上混匀。10min之后，测定在595nm处的吸光度，蒸馏水作空白，绘制标准曲线。根据标准曲线测定猴头菇多糖中的蛋白质含量。
以下实施例中所述猴头菇粉由北京福尔康生物技术研究所提供。高压平板膜机，厦门福美科技有限公司。
实施例1
(1)将猴头菇粉100g按料液质量比1：20加入蒸馏水中，在70℃下浸提2h，抽滤，滤渣重复浸提一次，合并两次浸提所得滤液，减压浓缩至原体积的1/4，得到浓缩液，将所得浓缩液与体积分数90％的乙醇水溶液按体积比1：3混合进行醇沉，收集上清液；
(2)将步骤(1)所得上清液置于高压平板膜机的料液罐中，然后在高压平板膜机中放入1000Da的PES超滤膜，密封隔氧，在压力1MPa、转速600r/min下超滤，当原料液经超滤后被浓缩至原体积的1/4时，加水稀释1倍重复超滤操作，重复2次后，收集透过液；
(3)以步骤(2)所得透过液为原料，置于高压平板膜机的料液罐中，然后在高压平板膜机中放入300Da纳滤膜，密封隔氧，在压力1MPa、转速600r/min下纳滤，当原料液经纳滤后被浓缩至原体积的1/4时，加水稀释1倍重复纳滤操作，重复2次，收集浓缩液，真空冷冻干燥，得到分子量为300-1000Da的猴头菇低聚糖。
本实例制备的猴头菇低聚糖的得率为1.143％，纯度为77.6％。
实施例2
(1)将猴头菇粉100g按料液质量比1：20加入蒸馏水中，在60℃下浸提3h，抽滤，滤渣重复浸提一次，合并两次浸提所得滤液，减压浓缩至原体积的1/4，得到浓缩液，将所得浓缩液与体积分数80％的乙醇水溶液按体积比1：3混合进行醇沉，收集上清液；
(2)将步骤(1)所得上清液置于高压平板膜机的料液罐中，然后在高压平板膜机中放入1000Da的PA超滤膜，密封隔氧，在压力1MPa、转速600r/min下超滤，当原料液经超滤后被浓缩至原体积的1/4时，加水稀释1倍重复超滤操作，重复2次后，收集透过液；
(3)以步骤(2)所得透过液为原料，置于高压平板膜机的料液罐中，然后在高压平板膜机中放入300Da纳滤膜，密封隔氧，在压力1MPa、转速600r/min下纳滤，当原料液经纳滤后被浓缩至原体积的1/4时，加水稀释1倍重复纳滤操作，重复2次，收集浓缩液，真空冷冻干燥，得到分子量为300-1000Da的猴头菇低聚糖。
本实例制备的猴头菇低聚糖的得率为1.057％，纯度为72.1％。
实施例3
(1)将猴头菇粉100g按料液质量比1：20加入蒸馏水中，在80℃下浸提1h，抽滤，滤渣重复浸提一次，合并两次浸提所得滤液，减压浓缩至原体积的1/4，得到浓缩液，将所得浓缩液与体积分数95％的乙醇水溶液按体积比1：3混合进行醇沉，收集上清液；
(2)将步骤(1)所得上清液置于高压平板膜机的料液罐中，然后在高压平板膜机中放入2000Da的PES超滤膜，密封隔氧，在压力1MPa、转速600r/min下超滤，当原料液经超滤后被浓缩至原体积的1/4时，加水稀释1倍重复超滤操作，重复2次后，收集透过液；
(3)以步骤(2)所得透过液为原料，置于高压平板膜机的料液罐中，然后在高压平板膜机中放入300Da纳滤膜，密封隔氧，在压力1MPa、转速600r/min下纳滤，当原料液经纳滤后被浓缩至原体积的1/4时，加水稀释1倍重复纳滤操作，重复2次，收集浓缩液，真空冷冻干燥，得到分子量为300-2000Da的猴头菇低聚糖。
本实例制备的猴头菇低聚糖的得率为1.557％，纯度为65.2％。
实施例4
(1)将猴头菇粉100g按料液质量比1：20加入蒸馏水中，在70℃下浸提2h，抽滤，滤渣重复浸提一次，合并两次浸提所得滤液，减压浓缩至原体积的1/4，得到浓缩液，将所得浓缩液与体积分数90％的乙醇水溶液按体积比1：3混合进行醇沉，收集上清液；
(2)将步骤(1)所得上清液置于高压平板膜机的料液罐中，然后在高压平板膜机中放入2000Da的PA超滤膜，密封隔氧，在压力1MPa、转速600r/min下超滤，当原料液经超滤后被浓缩至原体积的1/4时，加水稀释1倍重复超滤操作，重复2次后，收集透过液；
(3)以步骤(2)所得透过液为原料，置于高压平板膜机的料液罐中，然后在高压平板膜机中放入300Da纳滤膜，密封隔氧，在压力1MPa、转速600r/min下纳滤，当原料液经纳滤后被浓缩至原体积的1/4时，加水稀释1倍重复纳滤操作，重复2次，收集浓缩液，真空冷冻干燥，得到分子量为300-2000Da的猴头菇低聚糖。
本实例制备的猴头菇低聚糖的得率为1.462％，纯度为61.8％。
实施例5
(1)将猴头菇粉100g按料液质量比1：20加入蒸馏水中，在70℃下浸提2h，抽滤，滤渣重复浸提一次，合并两次浸提所得滤液，减压浓缩至原体积的1/4，得到浓缩液，将所得浓缩液与体积分数90％的乙醇水溶液按体积比1：3混合进行醇沉，收集上清液；
(2)将步骤(1)所得上清液置于高压平板膜机的料液罐中，然后在高压平板膜机中放入1000Da的PES超滤膜，密封隔氧，在压力1MPa、转速600r/min下超滤，当原料液经超滤后被浓缩至原体积的1/4时，加水稀释1倍重复超滤操作，重复3次后，收集透过液；
(3)以步骤(2)所得透过液为原料，置于高压平板膜机的料液罐中，然后在高压平板膜机中放入300Da纳滤膜，密封隔氧，在压力1MPa、转速600r/min下纳滤，当原料液经纳滤后被浓缩至原体积的1/4时，加水稀释1倍重复纳滤操作，重复3次，收集浓缩液，真空冷冻干燥，得到分子量为300-1000Da的猴头菇低聚糖。
本实例制备的猴头菇低聚糖的得率为1.216％，纯度为78.1％。
实施例6
(1)将猴头菇粉100g按料液质量比1：20加入蒸馏水中，在70℃下浸提2h，抽滤，滤渣重复浸提一次，合并两次浸提所得滤液，减压浓缩至原体积的1/4，得到浓缩液，将所得浓缩液与体积分数90％的乙醇水溶液按体积比1：3混合进行醇沉，收集上清液；
(2)将步骤(1)所得上清液置于高压平板膜机的料液罐中，然后在高压平板膜机中放入2000Da的PES超滤膜，密封隔氧，在压力1MPa、转速600r/min下超滤，当原料液经超滤后被浓缩至原体积的1/4时，加水稀释1倍重复超滤操作，重复3次后，收集透过液；
(3)以步骤(2)所得透过液为原料，置于高压平板膜机的料液罐中，然后在高压平板膜机中放入300Da纳滤膜，密封隔氧，在压力1MPa、转速600r/min下纳滤，当原料液经纳滤后被浓缩至原体积的1/4时，加水稀释1倍重复纳滤操作，重复3次，收集浓缩液，真空冷冻干燥，得到分子量为300-2000Da的猴头菇低聚糖。
本实例制备的猴头菇低聚糖得得率为1.663％，纯度为67.4％。
实施例7
(1)将猴头菇粉100g按料液质量比1：20加入蒸馏水中，在70℃下浸提2h，抽滤，滤渣重复浸提一次，合并两次浸提所得滤液，减压浓缩至原体积的1/4，得到浓缩液，将所得浓缩液与体积分数90％的乙醇水溶液按体积比1：3混合进行醇沉，收集上清液；
(2)将步骤(1)所得上清液置于高压平板膜机的料液罐中，然后在高压平板膜机中放入1000Da的PES超滤膜，密封隔氧，在压力1MPa、转速600r/min下超滤，当原料液经超滤后被浓缩至原体积的1/4时，加水稀释1倍重复超滤操作，重复4次后，收集透过液；
(3)以步骤(2)所得透过液为原料，置于高压平板膜机的料液罐中，然后在高压平板膜机中放入300Da纳滤膜，密封隔氧，在压力1MPa、转速600r/min下纳滤，当原料液经纳滤后被浓缩至原体积的1/4时，加水稀释1倍重复纳滤操作，重复4次，收集浓缩液，真空冷冻干燥，得到分子量为300-1000Da的猴头菇低聚糖。
本实例制备的猴头菇低聚糖的得率为1.295％，纯度为80.3％。
实施例8
(1)将猴头菇粉100g按料液质量比1：20加入蒸馏水中，在70℃下浸提2h，抽滤，滤渣重复浸提一次，合并两次浸提所得滤液，减压浓缩至原体积的1/4，得到浓缩液，将所得浓缩液与体积分数90％的乙醇水溶液按体积比1：3混合进行醇沉，收集上清液；
(2)将步骤(1)所得上清液置于高压平板膜机的料液罐中，然后在高压平板膜机中放入2000Da的PES超滤膜，密封隔氧，在压力1MPa、转速600r/min下超滤，当原料液经超滤后被浓缩至原体积的1/4时，加水稀释1倍重复超滤操作，重复4次后，收集透过液；
(3)以步骤(2)所得透过液为原料，置于高压平板膜机的料液罐中，然后在高压平板膜机中放入300Da纳滤膜，密封隔氧，在压力1MPa、转速600r/min下纳滤，当原料液经纳滤后被浓缩至原体积的1/4时，加水稀释1倍重复纳滤操作，重复4次，收集浓缩液，真空冷冻干燥，得到分子量为300-2000Da的猴头菇低聚糖。
本实例制备的猴头菇低聚糖的得率为1.742％，纯度为68.9％。

Claims (4)

1.一种基于膜分离技术制备猴头菇低聚糖的方法，其特征在于，所述方法为：
(1)将猴头菇粉按料液质量比1：20加入蒸馏水中，在60～80℃下浸提1～3h，抽滤，滤渣重复浸提一次，合并两次浸提所得滤液，减压浓缩后，用体积分数80～95％的乙醇水溶液进行醇沉，收集上清液；
(2)将步骤(1)所得上清液置于高压平板膜机的料液罐中，然后在高压平板膜机中放入1000-2000Da超滤膜，密封隔氧，在压力0.6～1.4MPa、转速300～900r/min下超滤，当原料液经超滤后被浓缩至原体积的1/4时，加水稀释1倍重复超滤操作，重复2～4次后，收集透过液；
(3)以步骤(2)所得透过液为原料，置于高压平板膜机的料液罐中，然后在高压平板膜机中放入100-300Da纳滤膜，密封隔氧，在压力0.6～1.4MPa、转速300～900r/min下纳滤，当原料液经纳滤后被浓缩至原体积的1/4时，加水稀释1倍重复纳滤操作，重复2～5次，收集浓缩液，真空冷冻干燥，得到猴头菇低聚糖。
2.如权利要求1所述基于膜分离技术制备猴头菇低聚糖的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述两次浸提所得滤液合并后，减压浓缩至原体积的1/4，得到浓缩液，将所得浓缩液与体积分数80～95％的乙醇水溶液按体积比1：3混合进行醇沉。
3.如权利要求1所述基于膜分离技术制备猴头菇低聚糖的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述超滤膜的材质为聚醚砜膜或聚酰胺。
4.如权利要求1所述基于膜分离技术制备猴头菇低聚糖的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述纳滤膜的材质为聚酰胺。
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