JP2016086707A - 連続培養によるエタノールの製造方法及び連続培養装置 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は以下を包含する。
培養液中のキシロース濃度を測定し、測定したキシロース濃度に基づいて、リグノセルロース由来の糖を含む添加培地の上記培養液に対する添加制御を行うことを特徴とするエタノールの製造方法。
(2) 上記キシロース濃度が予め設定した閾値以下となるように、上記添加培地の上記培養液に対する添加制御を行うことを特徴とする(1)記載のエタノールの製造方法。
(3) 上記閾値は、上記培養液に含まれる培養開始前のキシロース濃度の1/3以下の濃度とすることを特徴とする(2)記載のエタノールの製造方法。
(4) 上記閾値は、10g/L以下の濃度とすることを特徴とする(2)記載のエタノールの製造方法。
(5) 上記培地を用いた回分培養における単位時間及び単位液量あたりの菌体生成量と比較して菌体生成量が高くなるように、上記添加培地の上記培養液に対する供給速度を制御することを特徴とする(1)記載のエタノールの製造方法。
(6) 上記添加培地の供給速度は、下記式
F=V×(xmax−x0)/xs×T/(tbatch×(T−ti))
(ここで、Fは添加培地の供給速度、Vは上記培養液の液量、xmaxは上記培地を用いた回分培養における最大到達菌濃度、x0は上記培地を用いた回分培養における培養開始時の菌濃度、xsは上記培地を用いた連続培養における定常状態での菌濃度、Tは上記培養液で定常状態が持続する時間、tbatchは上記培地を用いた回分培養に必要な全時間、tiは上記培地を用いた連続培養における定常状態が確立するまでの培養に要する全時間を意味する。)
で求められるFを超える速度とすることを特徴とする(5)記載のエタノールの製造方法。
(7) 上記添加培地の上記培養液に対する供給速度は、上記培地を用いた回分培養における培養終了時のキシロース濃度の10倍以下の濃度となるように制御することを特徴とする(5)記載のエタノールの製造方法。
(8)上記リグノセルロース由来の糖を含む培地は、希酸を用いた蒸煮処理後のリグノセルロースを糖化処理することで得られた糖化液を含むものか、当該蒸煮処理を行わないリグノセルロースを糖化処理することで得られ、且つ、糖化反応における糖過分解物の濃度が400ppm以上、1500ppm以下である糖化液を含むものであることを特徴とする(1)記載のエタノールの製造方法。
(9) リグノセルロース由来の糖を含む培地にてキシロース資化性を有する微生物を連続培養する培養槽と、
上記培養槽に対して、リグノセルロース由来の糖を含む添加培地を供給する培地供給部と、
上記培養槽内の培養液に含まれるキシロース濃度を測定するキシロース濃度測定部と、
上記キシロース濃度に基づいて、上記培地供給部による添加培地の供給制御を行う制御部とを備える連続培養装置。
(10) 上記制御部は、上記キシロース濃度測定部で測定したキシロース濃度が予め設定した閾値以下となるように、上記添加培地の上記培養液に対する添加制御を行うことを特徴とする(9)記載の連続培養装置。
(11) 上記閾値は、上記培養液に含まれる培養開始前のキシロース濃度の1/3以下の濃度とすることを特徴とする(10)記載の連続培養装置。
(12) 上記閾値は、10g/L以下の濃度とすることを特徴とする(10)記載の連続培養装置。
(13) 上記制御部は、上記培地を用いた回分培養における単位時間及び単位液量あたりの菌体生成量と比較して菌体生成量が高くなるように、上記添加培地の上記培養液に対する供給速度を制御することを特徴とする(9)記載の連続培養装置。
(14) 上記添加培地の供給速度は、下記式
F=V×(xmax−x0)/xs×T/(tbatch×(T−ti))
(ここで、Fは添加培地の供給速度、Vは上記培養液の液量、xmaxは上記培地を用いた回分培養における最大到達菌濃度、x0は上記培地を用いた回分培養における培養開始時の菌濃度、xsは上記培地を用いた連続培養における定常状態での菌濃度、Tは上記培養液で定常状態が持続する時間、tbatchは上記培地を用いた回分培養に必要な全時間、tiは上記培地を用いた連続培養における定常状態が確立するまでの培養に要する全時間を意味する。)
で求められるFを超える速度とすることを特徴とする(13)記載の連続培養装置。
(15) 上記添加培地の上記培養液に対する供給速度は、上記培地を用いた回分培養における培養終了時のキシロース濃度の10倍以下の濃度となるように制御することを特徴とする(13)記載の連続培養装置。
(16)上記リグノセルロース由来の糖を含む培地は、希酸を用いた蒸煮処理後のリグノセルロースを糖化処理することで得られた糖化液を含むものか、当該蒸煮処理を行わないリグノセルロースを糖化処理することで得られ、且つ、糖化反応における糖過分解物の濃度が400ppm以上、1500ppm以下である糖化液を含むものであることを特徴とする(9)記載の連続培養装置。
本発明に係るエタノールの製造方法は、リグノセルロース由来の糖を含む培地にてキシロース資化性を有する微生物を連続培養することでエタノールを製造するものである。特に、本発明に係るエタノールの製造方法では、リグノセルロース由来の糖を含む添加培地を培養液に連続的に添加する際に、添加量の調節、添加速度の調節及び添加タイミングの調節といった添加培地の添加制御を培養液中のキシロース濃度に基づいて判断する。
Rcont=D×xs×(1−ti/T)[ここでDは希釈率であり、D=F/V]
キシロース資化性を有する微生物とは、キシロース代謝能を本来的に有する微生物、キシロース代謝能を本来的に有する微生物若しくはキシロース代謝能を有しない微生物に対してキシロース代謝関連遺伝子を導入した組換え微生物のいずれも含む意味である。ここで、キシロース代謝関連遺伝子とは、キシロースイソメラーゼ遺伝子、キシロースをキシリトールに変換するキシロースリダクターゼをコードするキシロースリダクターゼ遺伝子、キシリトールをキシルロースに変換するキシリトールデヒドロゲナーゼをコードするキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子及びキシルロースをリン酸化してキシルロース5-リン酸を生成するキシルロキナーゼをコードするキシルロキナーゼ遺伝子を含む意味である。なお、キシルロキナーゼにより生成されたキシルロース5-リン酸は、ペントースリン酸経路に入り代謝されることとなる。
リグノセルロース由来の糖を含む培地とは、リグノセルロースを含むセルロース系バイオマスを糖化処理することで得られる糖を含む糖化液を含む組成物を意味する。セルロース系バイオマスを糖化処理する際には、従来公知の前処理を施してもよい。前処理としては、特に限定されないが、例えば、リグニンを微生物によって分解する処理や、セルロース系バイオマスの粉砕処理等を挙げることができる。また、前処理としては、例えば、粉砕したセルロース系バイオマスを希硫酸溶液やアルカリ溶液、イオン液体に浸漬する処理、水熱処理、微粉砕処理、希酸を用いた蒸煮処理といった処理を適用しても良い。これら前処理により、バイオマスの糖化率を向上させることができる。
本実施例では、キシロース資化酵母(Saccharomyces cerevisiae)を用いて連続培養を行い、添加培地(リグノセルロース由来の糖を含む糖化液)の添加速度と、エタノール濃度、グルコース濃度及びキシロース濃度との関係を検討した。
[糖化液の作製]
希硫酸を使用して水蒸気爆砕処理(ネピアグラス乾燥重量の2%重量となるように硫酸を添加した上で、ネピアグラスの水分含量約70%に調整した後、190℃、9分蒸煮処理後、爆砕処理(高温高圧条件から瞬時に圧力を開放し、大気圧にする物理的粉砕方法))したネピアグラスを含む培地(ネピアグラス処理物15%(w/w(乾燥重量基準))、セルラーゼ1.2%(w/w)及び水83.8%)を4980g仕込んだロッキングミキサー(愛知電機(株)製RM-10-3)で糖化反応を実施した。糖化条件は50℃、72時間、回転数80rpmとした。ついで、本反応液を回収し、以下の連続発酵試験に使用する糖化液とした。
上記で作製したネピアグラス由来の糖を含む培地477.3g入りの1L発酵槽に、YPD培地で増殖させたキシロース資化酵母を含む培養液を22.7g植菌し、発酵(32℃、250rpm、pH5.5)を開始した。発酵開始48時間目から上記で作製した糖化液の連続添加を開始し、同時に排出口を開くことで発酵液の排出を開始した。ここで糖化液の添加速度は、97g/h(48〜383h)、181g/h(383〜623h)、139g/h(623〜815h)とした。
本実施例では、リグノセルロース由来の糖を含む培養液の調整方法と雑菌汚染との関係及び当該培養液に含まれる糖過分解物の濃度と雑菌汚染との関係を検証した。
ネピアグラスを各種条件(表1)で蒸煮処理した後、乾燥重量換算で6%の割合で水に懸濁した。なお、表1において、処理時間0分は、温度が規定に達した後、すぐに温度を下げる処理を意味する。
Claims (16)
- リグノセルロース由来の糖を含む培地にてキシロース資化性を有する微生物を連続培養するに際して、
培養液のキシロース濃度を測定し、測定したキシロース濃度に基づいて、リグノセルロース由来の糖を含む添加培地の上記培養液に対する添加制御を行うことを特徴とするエタノールの製造方法。 - 上記キシロース濃度が予め設定した閾値以下となるように、上記添加培地の上記培養液に対する添加制御を行うことを特徴とする請求項1記載のエタノールの製造方法。
- 上記閾値は、上記培養液に含まれる培養開始前のキシロース濃度の1/3以下の濃度とすることを特徴とする請求項2記載のエタノールの製造方法。
- 上記閾値は、10g/L以下の濃度とすることを特徴とする請求項2記載のエタノールの製造方法。
- 上記培地を用いた回分培養における単位時間及び単位液量あたりの菌体生成量と比較して菌体生成量が高くなるように、上記添加培地の上記培養液に対する供給速度を制御することを特徴とする請求項1記載のエタノールの製造方法。
- 上記添加培地の上記培養液に対する供給速度は、下記式
F=V×(xmax−x0)/xs×T/(tbatch×(T−ti))
(ここで、Fは添加培地の供給速度、Vは上記培養液の液量、xmaxは上記培地を用いた回分培養における最大到達菌濃度、x0は上記培地を用いた回分培養における培養開始時の菌濃度、xsは上記培地を用いた連続培養における定常状態での菌濃度、Tは上記培養液で定常状態が持続する時間、tbatchは上記培地を用いた回分培養に必要な全時間、tiは上記培地を用いた連続培養における定常状態が確立するまでの培養に要する全時間を意味する。)
で求められるFを超える速度とすることを特徴とする請求項5記載のエタノールの製造方法。 - 上記添加培地の上記培養液に対する供給速度は、上記培地を用いた回分培養における培養終了時のキシロース濃度の10倍以下の濃度となるように制御することを特徴とする請求項5記載のエタノールの製造方法。
- 上記リグノセルロース由来の糖を含む培地は、希酸を用いた蒸煮処理後のリグノセルロースを糖化処理することで得られた糖化液を含むものか、当該蒸煮処理を行わないリグノセルロースを糖化処理することで得られ、且つ、糖化反応における糖過分解物の濃度が400ppm以上、1500ppm以下である糖化液を含むものであることを特徴とする請求項1記載のエタノールの製造方法。
- リグノセルロース由来の糖を含む培地にてキシロース資化性を有する微生物を連続培養する培養槽と、
上記培養槽に対して、リグノセルロース由来の糖を含む添加培地を供給する培地供給部と、
上記培養槽内の培養液に含まれるキシロース濃度を測定するキシロース濃度測定部と、
上記キシロース濃度に基づいて、上記培地供給部による添加培地の供給制御を行う制御部とを備える連続培養装置。 - 上記制御部は、上記キシロース濃度測定部で測定したキシロース濃度が予め設定した閾値以下となるように、上記添加培地の上記培養液に対する添加制御を行うことを特徴とする請求項9記載の連続培養装置。
- 上記閾値は、上記培養液に含まれる培養開始前のキシロース濃度の1/3以下の濃度とすることを特徴とする請求項10記載の連続培養装置。
- 上記閾値は、10g/L以下の濃度とすることを特徴とする請求項10記載の連続培養装置。
- 上記制御部は、上記培地を用いた回分培養における単位時間及び単位液量あたりの菌体生成量と比較して菌体生成量が高くなるように、上記添加培地の上記培養液に対する供給速度を制御することを特徴とする請求項9記載の連続培養装置。
- 上記添加培地の上記培養液に対する供給速度は、下記式
F=V×(xmax−x0)/xs×T/(tbatch×(T−ti))
(ここで、Fは添加培地の供給速度、Vは上記培養液の液量、xmaxは上記培地を用いた回分培養における最大到達菌濃度、x0は上記培地を用いた回分培養における培養開始時の菌濃度、xsは上記培地を用いた連続培養における定常状態での菌濃度、Tは上記培養液で定常状態が持続する時間、tbatchは上記培地を用いた回分培養に必要な全時間、tiは上記培地を用いた連続培養における定常状態が確立するまでの培養に要する全時間を意味する。)
で求められるFを超える速度とすることを特徴とする請求項13記載の連続培養装置。 - 上記添加培地の上記培養液に対する供給速度は、上記培地を用いた回分培養における培養終了時のキシロース濃度の10倍以下の濃度となるように制御することを特徴とする請求項13記載の連続培養装置。
- 上記リグノセルロース由来の糖を含む培地は、希酸を用いた蒸煮処理後のリグノセルロースを糖化処理することで得られた糖化液を含むものか、当該蒸煮処理を行わないリグノセルロースを糖化処理することで得られ、且つ、糖化反応における糖過分解物の濃度が400ppm以上、1500ppm以下である糖化液を含むものであることを特徴とする請求項9記載の連続培養装置。
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