JP5881135B2 - 化学品の製造方法および連続培養装置 - Google Patents

Description

本発明は、微生物もしくは培養細胞の培養によって化学品を製造する方法に関するものである。さらに詳しくは、培養を行いながら、培養によって生産された発酵生産物（化学品）を含む液を微生物もしくは培養細胞の培養液から分離膜を通して効率よく濾過して発酵生産物を回収する、所望する化学品を高い生産性で製造することが可能な化学品の製造方法ならびに培養装置に関するものである。

微生物もしくは培養細胞の培養を伴う物質生産方法では、大きく（１）回分培養法（Ｂａｔｃｈ培養法）および流加培養法（Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈ培養法）と、（２）連続培養法に分類することができる。

上記（１）の回分培養法と流加培養法は、設備的には簡素であり短時間で培養が終了し、雑菌汚染による被害が少ないという利点があり、従来から微生物もしくは培養細胞を用いた物質生産方法として用いられてきた。しかしながら、これらの方法は時間の経過とともに培養液中の発酵生産物濃度が高くなり、浸透圧の上昇あるいは生産物自体により発酵が阻害されること等により生産性および収率が低下してくる。そのためこれらの培養法では、長時間にわたり安定して発酵生産物の生産性および収率を高く維持することが困難である。

一方、上記（２）の連続培養法は、培養槽内で発酵生産物が高濃度に蓄積することを回避することによって、長時間にわたって収率および生産性を高く維持できるという特徴がある。

例えば、Ｌ−グルタミン酸（特許文献１参照）やＬ−リジン（非特許文献１参照）の発酵について連続培養法が開示されている。しかしながら、これらの例では、培養液へ栄養素等原料の連続的な供給を行うものの、微生物もしくは培養細胞を含んだ培養液を抜き出すために培養液中の微生物もしくは培養細胞が希釈されることから、生産効率の向上は限定されたものであった。

このことから、連続培養法において、微生物もしくは培養細胞を分離膜で濾過し、透過液から発酵生産物を回収すると同時に濾過された微生物もしくは培養細胞を培養槽内に保持または還流させることにより、培養液中の微生物や細胞濃度を高く維持する方法が提案されている。

例えば、分離膜を用いた連続培養装置により、連続培養する技術が提案されている（特許文献２参照）。本提案では、微生物もしくは培養細胞を培養するための槽と、培養液から、目的とする発酵生産物と微生物、培養細胞との膜分離を行うための槽とを有した連続培養装置をもちいることで、回分培養法、流加培養法に比較して高い生産速度で様々な化学品を生産することが可能となった。

ここで、分離膜を用いた連続培養装置においては、膜分離槽内の培養液流速を向上させ膜の目詰まりを起きにくくすることで、分離膜透過液量を増加させてさらに生産速度を向上させることができると考えられる。しかしながら、特許文献２では、培養槽からの送液量と膜分離槽への流量とを別個に制御することができないため、膜分離槽に供給する培養液の流量は培養槽から送液された培養液の流量に依存する。そのため、膜分離槽内の培養液流速を変化させるためには、培養槽からの送液量を変化させなければならず、その結果、培養槽での液混合状態が変化し、培養条件が大きく変化してしまう。また、時間の経過とともに膜の目詰まりが生じたり微生物もしくは培養細胞の濃度が上昇したりすること等によって膜分離槽内の圧力が上昇した場合、膜分離自体を最適化するためには膜分離槽へ供給する培養液の流量を低下させることが好ましい。しかしながら、膜分離槽へ供給する培養液の流量に変更を加えると、培養槽での培養条件が大きく変化してしまう。そのため、膜分離槽へ供給する培養液の流量を簡単には変えることができない。加えて、仮に、膜分離槽内の圧力を最適に制御するために培養槽から送液する培養液量を少なくすると、送液ライン内の培養液流速が低下し、微生物もしくは培養細胞が送液ライン配管内に沈殿し、生産効率が低下するという問題も発生する。一方、膜分離槽内の圧力が高すぎると、膜分離槽の中から外へと移動した培養液中の微生物が圧力変動により破壊してしまうおそれもある。

特開平１０−１５０９９６号公報 国際公開第０７／０９７２６０号パンフレット

Toshihiko Hirao et. al.（ヒラオ・トシヒコ ら）、 Appl. Microbiol. Biotechnol.（アプライド マイクロバイアル アンド マイクロバイオロジー），３２，２６９−２７３（１９８９）

本発明は、このような状態に鑑み、培養槽内の培養条件に影響を及ぼすことなく膜分離槽内の培養液流速を制御することができ、さらに、微生物もしくは培養細胞の沈殿を抑制し化学品の生産効率を高めることができる化学品の製造方法、ならびにそれに好適に用いることができる培養装置を提供することである。

本発明者らは、分離膜を利用した連続培養装置において、生産速度の向上ならびに発酵培養の安定化を目的として鋭意研究した結果、以下の（１）〜（１４）のいずれかの構成により、膜分離槽内の培養液流速を制御しつつも培養槽内の培養条件（培養液の滞留時間等）を保つことができ、化学品の効率的な製造が可能であることを見いだし、本発明を完成させた。

（１）培養槽において微生物もしくは培養細胞を培養し、培養液を培養槽から膜分離槽へ送液して分離膜で濾過し、透過液から発酵生産物を化学品として回収するとともに、濾過されなかった未濾過培養液を、膜分離槽よりも上流側の培養液へ合流させるように還流する化学品の製造方法であって、培養槽から送液される培養液の一部を、膜分離槽の培養液流入側圧力に応じて、膜分離槽を迂回させる化学品の製造方法。

（２）膜分離槽の培養液流入側のゲージ圧が１ＭＰａ以下となるように、膜分離槽を迂回させる培養液の流量を制御する、前記（１）に記載の化学品の製造方法。

（３）未濾過培養液の一部を、培養槽内の培養液へ合流させるように還流するとともに、未濾過培養液の残部を、培養槽から膜分離槽までの間の培養液へ合流させるように還流する、前記（１）または（２）に記載の化学品の製造方法。

（４）培養槽から膜分離槽までの間の培養液へ合流させるように還流する未濾過培養液の流量と、培養槽内の培養液へ合流させるように還流する未濾過培養液の流量とを、互いに独立して制御する、前記（３）に記載の化学品の製造方法。

（５）培養槽から膜分離槽までの間の培養液へ合流させるように還流する未濾過培養液の流量に対する、培養槽内の培養液へ合流させるように還流する未濾過培養液の流量の比が１以下である、前記（３）または（４）に記載の化学品の製造方法。

（６）培養槽から膜分離槽へ送液される培養液の線流速、膜分離槽から該膜分離槽よりも上流側の培養液へ合流するように還流される未濾過培養液の線流速、ならびに膜分離槽を迂回する培養液の線流速が、いずれも２．５ｃｍ／ｓｅｃ以上である、前記（１）〜（５）のいずれかに記載の化学品の製造方法。

（７）膜分離槽へ流入する培養液量に対する分離膜からの透過液量の回収率が１０．０％以下になるように、膜分離槽へ流入する培養液量および／または分離膜からの透過液量を調節する、前記（１）〜（６）のいずれかに記載の化学品の製造方法。

（８）膜分離槽における培養液体積に対する培養槽における培養液体積の比を４以上１００以下とする、前記（１）〜（７）のいずれかに記載の化学品の製造方法。

（９）微生物もしくは培養細胞を培養するための培養槽と、培養槽から培養液中に生産された発酵生産物を回収するための分離膜を備えた膜分離槽と、培養槽と膜分離槽とを接続し、培養液を前記膜分離槽へ送液するとともに分離膜で濾過されなかった未濾過培養液を膜分離槽よりも上流側の培養液へ合流させるように還流する循環ラインと、循環ラインに設けられた培養液送液手段とを備えた連続培養装置であって、膜分離槽のバイパスラインと、膜分離槽の培養液流入側圧力の検知手段と、バイパスラインに設けられた流量制御手段とを有している連続培養装置。

（１０）流量制御手段が、検知手段の結果に連動して作動するものである、前記（９）に記載の連続培養装置。

（１１）循環ラインの線流速検知手段を備え、流量制御手段および／または記培養液送液手段が該線流速検知手段の結果に応じて作動するものである、前記（９）または（１０）に記載の連続培養装置。

（１２）膜分離槽が、前記培養液送液手段とは別の送液手段を有する、培養槽とは独立している循環回路内に備えられている、前記（９）〜（１１）のいずれかに記載の連続培養装置。

（１３）循環ラインが、培養槽に貯留される培養液に浸漬する位置に開口してなる、前記（９）〜（１２）のいずれかに記載の連続培養装置。

（１４）膜分離槽体積に対する培養槽体積の比が４以上１００以下である、前記（９）〜（１３）のいずれかに記載の連続培養装置。

本発明によれば、培養槽から送液される培養液の一部を、膜分離槽の培養液流入側圧力に応じて膜分離槽を迂回させること、すなわち膜分離槽へと供給する培養液の流量を、培養槽から送り出す培養液の流量とは独立して制御することが可能になる。その結果、培養条件を変更することなく膜分離槽内の培養液流速を適宜変更して膜の目詰まりを起きにくくすることができ、分離膜透過液量を増加して生産速度を向上することが可能となる。また仮に、時間の経過とともに膜の目詰まりが生じたり微生物や培養細胞の濃度が上昇したりして膜分離槽内の圧力が上昇したとしても、培養槽での培養条件を実質的に変化させずに、培養液を膜分離槽へ送液するとともに分離膜で濾過されなかった未濾過培養液を還流する循環ラインにおいて、微生物や培養細胞が沈殿にくい流速を維持しながら、膜分離槽に供給する培養液の流量、さらには膜分離槽内で作用する圧力を制御することができ、その結果、膜分離槽の破損を防止したり培養液中の微生物や培養細胞の圧力変動による破壊を防ぐことが可能となる。更に膜分離槽内で不具合が生じた際には、培養を継続しながらも、培養液の膜分離槽への供給を完全に停止して膜分離槽内の不具合を修正したり膜分離槽の交換または切り替えを行うことができる。

さらに、本発明においては、培養槽から送液される培養液の一部を、膜分離槽の培養液流入側の圧力に応じて膜分離槽を迂回させつつ、該膜分離槽における透過液の回収率を１０％以下に制御することで、さらに膜の目詰まりを防ぐことができ、連続培養時間を長期化することが可能となる。

以上のように、本発明によれば、連続培養による発酵生産物（すなわち所望する化学品）の生産効率および対糖収率を同時に高めることが可能となり、さらに膜分離槽における回収率を１０％以下に制御することで連続培養時間の長期化も可能となる。

本発明にかかる連続培養装置の一つの実施の形態を説明するための概略模式図である。 本発明にかかる連続培養装置の他の実施の形態を説明するための概略模式図である。 本発明で用いられる分離膜エレメントの一つの実施の形態を説明するための概略展開図である。 本発明で用いられる分離膜エレメントの他の実施の形態を説明するための概略斜視図である。 参考例で用いた酵母用発現ベクターｐＴＲＳ１１のフィジカルマップを示す図である。 実施例２で得られた循環ライン内の培養液線流速と当該ライン内に沈殿した菌体積層量を示す図である。 本発明にかかる連続培養装置のさらに別の実施の形態を説明するための概略模式図である。 本発明にかかる連続培養装置のさらに別の実施の形態を説明するための概略模式図である。 比較例で用いた連続培養装置の形態を説明するための概略模式図である。 実施例１で得られた乳酸濃度、酵母濁度を示す図である。 比較例１で得られた乳酸濃度、酵母濁度を示す図である。 比較例１で得られた膜分離槽の培養液流入側の圧力を示す図である。 比較例で用いた連続培養装置の形態を説明するための概略模式図である。 本発明にかかる連続培養装置のさらに別の実施の形態を説明するための概略模式図である。 比較例で用いた連続培養装置の形態を説明するための概略模式図である。 本発明にかかる連続培養装置のさらに別の実施の形態を説明するための概略模式図である。 実施例６〜９で得られた膜間差圧の推移を示す図である。 実施例１０で得られたカダベリン濃度、コリネバクテリア濁度を示す図である。 比較例５で得られたカダベリン濃度、コリネバクテリア濁度を示す図である。 比較例５で得られた膜分離槽の培養液流入側の圧力を示す図である。 実施例１１で得られたＬ−リジン濃度、コリネバクテリア濁度を示す図である。 比較例６で得られたＬ−リジン濃度、コリネバクテリア濁度を示す図である。 比較例６で得られた膜分離槽の培養液流入側の圧力を示す図である。

本発明の方法は、培養槽において微生物もしくは培養細胞を培養し、培養液を培養槽から膜分離槽へ連続的に送液して分離膜で濾過し、透過液から発酵生産物を化学品として回収してするとともに、濾過されなかった未濾過培養液を膜分離槽よりも上流側の培養液へ合流させるように還流する化学品の製造方法であって、このとき培養槽から送液される培養液の一部を、膜分離槽の培養液流入側圧力に応じて、膜分離槽を迂回させるものである。

かかる本発明は、たとえば図１に示す培養装置で行われる。図１は、本発明の一実施形態にかかる培養装置の概略模式図である。

図１に示す培養装置は、微生物もしくは培養細胞の培養を行う培養槽１と、培養液を濾過するための分離膜３を備えた膜分離槽２で構成されている。膜分離槽２は培養反応槽の外部に設けられ、培養槽１とは送液ライン１７および送液ライン１５（循環ライン）で接続されている。

培養槽１は、微生物もしくは培養細胞を連続的に培養できる機能を有し、循環ラインを接続できればいかなるものでもよく、従来から微生物もしく培養細胞を培養するために用いられてきたジャーファーメンター等を用いることができる。

培養槽１は、培地供給ポンプ６に接続されるとともに、攪拌機７を備えており、培地供給ポンプ６によって培地を培養槽１に投入し、必要に応じて、攪拌機７で培養槽１内の培養液を攪拌することができるように構成されている。さらに、気体供給装置８も接続されており、必要に応じて、当該気体供給装置８によって必要とする気体が供給される。このとき、供給した気体を回収・リサイクルして再び気体供給装置８によって供給することができるように、例えば、培養槽１のヘッドスペースと気体供給装置８の間に配管を接続し、ヘッドスペース、配管、気体供給装置８の順で供給気体を流すことで回収・リサイクルすることも好ましい。

また、培養槽１には、必要に応じて、培養液のｐＨを調整することができるように、ｐＨセンサ・制御装置９およびｐＨ調整溶液供給ポンプ１０が設けられている。当然ながら培養時において酸とアルカリの両方を供給することで培養液のｐＨを制御するため、ｐＨ調整溶液供給ポンプは複数あるほうが好ましい。さらに、必要に応じて、培養液の温度を調節して生産性の高い化学品の生産を行うことができるように、温度調節器１１も設けられている。なお、計装・制御装置による培養液の物理化学的条件の調節としては、ｐＨおよび温度の調節を例示しているが、必要に応じて、溶存酸素やＯＲＰの制御を行うこともでき、更にはオンラインケミカルセンサーなどの分析装置により培養液中の微生物の濃度を測定し、それを指標とした物理化学的条件の制御を行ってもよい。また、上記の計装・制御装置による培養液の物理化学的環境の測定値を指標として、培地投入量および速度を適宜調節することができる。

膜分離槽２は、内部に分離膜３を設置することができ、培養槽１同様、循環ラインを接続できれば、その形状等は問わない。分離膜３は、微生物もしくは培養細胞の培養液から微生物もしくは培養細胞のみを濾別することができるのであれば無機、有機の素材を問わずどのような分離膜であってもよいが、被処理液の性状や用途に応じた分離性能と透過性能を有する、後述の多孔性膜が好ましく、さらに滅菌操作（例えば１２０℃で３０分）に耐えうるものであることが好ましい。そして、分離膜３には、当該分離膜の原液側と透過側との間に膜間差圧を生じさせることができるようにポンプ４が接続されている。

そして、膜分離槽２および培養槽１は、膜分離槽における培養液に対する培養槽における培養液の培養液容積比が４以上１００以下となるような容積を有していることが好ましい。すなわち、膜分離槽２および培養槽１それぞれにおいては、一般的にそれらの容積の８０％ぐらいの培養液が貯留されることになるのを加味し、膜分離槽体積に対する培養槽体積の比が４以上１００以下となるように設計することが好ましい。かかる構成により、装置のコンパクト化を実現するとともに、培養液の培養槽滞留時間を長くして適切な培養条件を実現し、さらには動力費の低減、化学品の生産速度の向上、ならびに容易な装置運転管理を可能とする。

循環ライン（送液ライン１７および送液ライン１５）には、膜分離槽２の培養液流入側から膜分離槽を迂回して膜分離槽の培養液流出側へ接続されたバイパスライン２６が設けされており、培養槽１から送液される培養液の一部を、膜分離槽２へ供給せずに、該膜分離槽２を迂回させて、送液ライン１５の未濾過培養液へ合流させることができるように構成されている。なお、本実施形態では、バイパスライン２６の一端を送液ライン１７に、他端を送液ライン１５に接続しているが、バイパスライン２６は、膜分離槽２の培養液流入側から膜分離槽２を迂回して培養槽１または培養槽１と膜分離槽２の培養液流入側との間へ接続してもよい。すなわち膜分離層２を迂回した当該一部の培養液を直接培養槽１に還流するように、バイパスライン２６の一端（上流側）を送液ライン１７に接続し、他端（下流側）を培養槽１に接続してもよい。また、膜分離層２を迂回した当該一部の培養液を培養槽１から供給される送液ライン１７中の培養液へ直接合流させるように、バイパスライン２６の両端を送液ライン１７に接続してもよい。

膜分離槽２のバイパスライン２６内には流量制御手段２５を有している。かかる流量制御手段によって、膜分離槽２へ供給する培養液の流量を制御することが可能となる。この流量制御手段はバルブでもポンプでも良いがコストの面でバルブが好ましい。前記流量制御手段としてバルブを選択した場合、バルブを開放することで膜分離槽２への培養液量を減少させることができる。また、逆にバルブを閉止することで送液ライン１７を流れる培養液の全てを膜分離槽２へ流すことができる。バルブの構造は問わないが、ダイヤフラムバルブ、バタフライバルブを使用することが蒸気滅菌を行う際に構造上培養液等の溜まりが少ないため好ましい。また、流量制御手段２５としてポンプを選択した場合、膜分離槽２に流れる培養液と同方向に培養液が流れるように送液し、ポンプ送液量を多くすることで膜分離槽２への培養液量を減少させることができ、逆にポンプ送液を停止することで送液ライン１７を流れる培養液の全てを膜分離槽２へ流すことが可能となる。

膜分離槽２へ供給する培養液の流量は、基本的に、膜分離槽の培養液流入側圧力に応じて制御する。そのため、図１に示す装置には、圧力計２９が設けられている。膜分離槽の培養液流入側圧力を圧力計２９により測定し、測定値が所望する値より高い場合は、流量制御手段２５を作動させ、培養槽１から送液される培養液の一部を、膜分離槽２を迂回させて循環させる。

また、循環ラインには培養槽から送液する培養液の流量制御を行うポンプ５が設けられている。ポンプは、送液ライン１７内または送液ライン１５（培養槽への戻し）内に設ければ良く、また、その両方に設けても良い。ポンプの方式や形状および接液部材質等は問わないが、循環ラインの蒸気滅菌に耐えうる物が好ましい。

ここで、図６に、循環ライン中の培養液線速度と乳酸生産能力を持つ酵母株の沈殿量との関係を表すが、これから、循環ライン内（送液ライン１７および送液ライン１５）の培養液線速度が２．５ｃｍ／sec以上であれば、配管内に菌体を沈殿することなく培養液を循環することが可能であることがわかる。したがって、培養槽から送液される送液ライン１７中の培養液及び／又は送液ライン１５中の未濾過培養液の線流速を検知し、該線流速が２．５ｃｍ／ｓｅｃ以上となるように、流量制御手段２５およびポンプ５を作動させることが好ましい。さらに、同様の理由から、バイパスライン２６における培養液の線流速も２．５ｃｍ／ｓｅｃ以上になるようにすることが好ましい
なお、上述したように、膜分離槽を迂回した前記一部の培養液を、培養槽中の培養液もしくは培養槽から膜分離槽へ送液される培養液に合流させる場合には、培養槽から送液される培養液の線流速を検知し、該線流速が２．５ｃｍ／ｓｅｃ以上となるように、流量制御手段２５およびポンプ５を作動させればよい。また、後述するように、送液ライン１５の未濾過培養液を、培養槽内の培養液に合流するように環流するとともに、送液ライン１７の培養液の一部に直接合流させるように環流する場合には、そのいずれのラインにおいても培養液の線流速が２．５ｃｍ／ｓｅｃ以上になるようにすることが好ましい。すなわち、本発明においては、培養槽から膜分離槽へ送液される培養液の線流速、膜分離槽から該膜分離槽よりも上流側の培養液へ合流するように還流される未濾過培養液の線流速、ならびに膜分離槽を迂回する培養液の線流速が、いずれも２．５ｃｍ／ｓｅｃ以上となるようにすることが好ましい。

そして、図１に示す装置においては、分離膜３における濾過フラックスおよび培養槽内の培養液量を調節するために、レベルセンサ１２が培養槽１に設けられている。レベルセンサ１２によって培養槽内の培養液量を検知し、培地供給ポンプ６の制御を行う。また濾過フラックスを調節するためには透過液量を制御すればよい。透過液量を制御する方法には制限はないが、例えば水頭差圧を制御することによって濾過流量を変更する水頭差圧制御装置を設けてもよいし、電源動力によりポンプを動かすことで濾過流量を変更してもよい。また、本発明の化学品の製造方法に用いる培養装置には、培養槽１、膜分離槽２、送液ライン１５，１７を滅菌するための蒸気供給ラインを設けることが望ましい。

なお、本発明において使用される種々のポンプとしては、例えば渦巻きポンプ、チューブポンプ、ダイヤフラムポンプなど様々な種類を例示できるが、好ましくは、ポンプの出力設定により循環液量や分離膜からの透過液量が算出できるものであり、具体的にはダイヤフラムポンプやチューブポンプが挙げられる。

以上のような構成の培養装置を用いた化学品の製造方法において、培養は例えば次のように行われる。すなわち、培養槽１において微生物もしくは培養細胞を連続的に培養し、培養液を培養槽１から循環ライン内のポンプ５によって送液ライン１７を経て膜分離槽２へ供給し、ポンプ４等により分離膜３の原液側と透過液側とに圧力差を生じさせることで該培養液を濾過し、微生物や培養細胞の発酵生産物である乳酸等（化学品）を含む透過液回収する。一方、未濾過培養液は送液ライン１５を経て培養槽１に還流される。このとき、ポンプ５の流量は送液ライン１７および送液ライン１５内で微生物もしくは培養細胞が沈殿しない速度（例えば上述したように線流速が２．５ｃｍ／ｓｅｃ以上）で送液する。

しかしながら、培養、膜分離を連続的に続けていると、培養液の粘度上昇や分離膜の目詰まり、および膜分離槽内で微生物もしくは培養細胞が積層し流路を閉塞することなどにより膜分離槽内の圧力が上昇する。膜分離槽内の圧力が上昇すると膜分離槽の破損や微生物もしくは培養細胞への負担が増大する。したがって、膜分離槽内での圧力は１ＭＰａ以下とすることが好ましい。一方、膜分離槽内の圧力上昇を抑えるために、ポンプ５による培養槽１からの培養液送液量を低減すると、培養槽での培養条件が大きく変化してしまい、また微生物や培養細胞が循環ライン内に沈殿し、生産効率が低下してしまう。

そこで、本発明においては、培養槽１から送液される培養液の一部を、膜分離槽２の培養液流入側圧力に応じて膜分離槽２を迂回させて還流する。好ましくは、膜分離槽の培養液流入側の圧力が１ＭＰａ以下となるように、膜分離槽２を迂回させる培養液の流量を制御する。なお、ここでいう圧力とはゲージ圧のことであり、本発明において圧力とは断らない限りゲージ圧を示している。かかる膜分離槽内での圧力変動は培養液供給側に設けた圧力計２９によって測定することが可能であり、かかる測定結果に応じて膜分離槽を迂回させる培養液の流量を制御することで膜分離槽内の圧力上昇を制御することができる。この結果、循環ラインでの微生物や培養細胞の沈殿を防いで安定して培養することができ、また、膜分離槽の破損や微生物、培養細胞への負担増大を低減できるため、高収率かつ高生産性を得ることができる。すなわち、従来の回分発酵と比較して、発酵生産物の生産速度が高くなり、極めて効率のよい発酵生産が可能となるとともに、当該発酵生産物を効率的に回収することができる。なお、連続培養における生産速度は、次の式（１）で計算される。

また、回分培養での発酵生産速度は、原料炭素源をすべて消費した時点の生産物量（ｇ）を、炭素源の消費に要した時間（ｈ）とその時点の培養液量（Ｌ）で除して求められる。

図１に示す装置は、例えば次のように変更することも好ましい。すなわち、例えば図２に示すように、流量制御手段２５を圧力計２９の測定結果に連動して作動するように構成することが好ましい。また、送液ライン１７における、バイパスライン２６の接続点よりも下流側で、かつ、膜分離層２よりも上流側の位置に、膜分離槽開閉バルブ２７を設けたり、送液ライン１５における、バイパスライン２６の接続点よりも上流側で、かつ、膜分離層２よりも下流側の位置に、膜分離槽開閉バルブ２８を設けることが好ましい。膜分離槽開閉バルブ２７および／または膜分離槽開閉バルブ２８を設ける場合、送液ライン１７を流れる培養液の全てを、必要に応じてバイパスライン２６へ流せるようになる。こうすることで、分離膜の目詰まりや膜分離槽内で微生物もしくは培養細胞が積層することにより流路が閉塞した場合などに生じる膜分離槽内での不具合の際に、膜分離槽へ供給する培養液を完全に停止することができ、膜分離槽内の不具合を修正や交換をすることができる。

さらに、図７に示すように、送液ライン１５の未濾過培養液を、培養槽内の培養液に合流するように環流するとともに、送液ライン１７の培養液の一部に直接合流させるように環流することも好ましい。このとき、培養槽内の培養液に合流するように環流される未濾過培養液の流速、流量、さらには培養槽から送液される培養液の流速、流量を制御するポンプ５は、送液ライン１５の分岐点１４Ｂよりも培養槽側の下流に設け、それとは別に、送液ライン１７の合流点１４Ａよりも下流側にもポンプ１６を設ける。このようにすることで、膜分離槽２、送液ライン１７の合流点１４Ａよりも下流側、および送液ライン１５の分岐点１４Ｂよりも上流側で、培養槽１とは独立した循環回路が形成され、ポンプ１６、５それぞれによって、膜分離槽２、送液ライン１７の合流点１４Ａよりも下流側、および送液ライン１５の分岐点１４Ｂよりも上流側で形成される循環回路における流速、流量と、送液ライン１５の分岐点１４Ｂよりも下流側、培養槽１、および送液ライン１７の合流点１４Ａよりも上流側の流速、流量とを、互いに別個に独立して制御することが可能となる。そのため、ポンプ１６を調整して当該循環回路内の培養液流速を増加、すなわち、膜分離槽内の分離膜３の表面を流れる培養液の線速度（線流速）を増加させた場合でも、ポンプ５によって送液ライン１５の分岐点１４Ｂよりも下流側の流速を一定に保って、培養液の培養槽１内に戻る速度を一定に保つことができる。すなわち、培養槽内の培養条件を保ったまま膜分離槽内の培養液流速を向上させることが可能になるため、微生物もしくは培養細胞が沈殿しない速度で送液しつつも、培養槽内は培養に好適な条件を保つことができ、安定して培養することができ、高収率かつ高生産性を維持するができる。

なお、培養液の培養槽１内に戻る未濾過培養液の速度が早くなると液流の乱れの要因となり、酸素移動容量係数ｋＬａに影響を与えることから、培養液の培養槽１内に戻る速度を一定に保つことで発酵効率を安定化することが可能になる。

そして、本発明は、膜分離槽内の分離膜３の表面を流れる流速を増加させ、得られる透過液、すなわち発酵生産物の回収量を多くしつつ、培養効率を保ったまま生産速度を向上させるために、培養槽内の培養液へ合流させるように還流する未濾過培養液の流量、流速（すなわち送液ライン１５の分岐点１４Ｂよりも下流側の流量、流速）αは、培養槽から膜分離槽までの間の培養液へ合流させるように還流する未濾過培養液の流量、流速（すなわち送液ライン１７の分岐点１４Ａよりも下流側の流量、流速）βよりも小さいことが好ましく、それらの比α／βは1以下であることが好ましい。

さらに、図１４に示すように、未濾過培養液を培養槽内の培養液に合流するように環流させる送液ライン１５を、培養槽１に貯留される培養液に浸漬する位置に開口することも好ましい。送液ライン１５の一方の端部を当該位置に開口することで、培養槽１内の酸素移動容量係数ｋＬａが所望する設定値から変動しにくくなり、当該係数の設定値からの減少率を該設定値の３０％以内の範囲に抑制することが可能になる。

また、図８のように膜分離槽２を複数並列に接続することも好ましい。こうすることで、一つの膜分離槽内で不具合が発生した際に、膜分離槽を切り替えて使用することができ、膜分離槽での濾過を止めることなく培養を継続することが可能となる。また、膜分離槽を複数並列に接続する際は、それぞれの膜分離槽に蒸気供給ラインを接続することで、膜分離槽内の滅菌を個別に行うことが可能になる。

本発明においては、発酵生産物の収率を高めるために、分離膜の詰まりを防ぎ、連続培養を安定的に長期間維持することが好ましい。そのため、膜分離槽へ送液される培養液の流量に対する、分離膜３から得られる透過液の流量の割合である回収率（以下、単に回収率と称することがある）が１０．０％以下になるように制御することが好ましい。

回収率とは、単位時間あたりに膜分離槽へ送液された培養液量（循環液量）に対する分離膜３の透過液量の割合であり、下記の（式２）により算出する。ただし、膜分離装置が複数接続されている場合は、それぞれの膜分離装置での透過液量および循環液量から算出する。また透過液量は、膜分離装置に使用している分離膜面積と、運転制御可能である濾過フラックスで置き換えることができ、（式２）は下記の（式３）に変換できる。

回収率を制御するには、膜分離槽へ流入する培養液量および／または分離膜からの透過液量を調節すればよい。すなわち、循環液量、濾過フラックスおよび透過液量から選択される１つ以上を制御することが好ましい。循環液量を制御するためには、前記のような膜分離槽より上流側にあるポンプ５、１６の出力を調節することが好ましい。また、濾過フラックスもしくは透過液量を制御する方法としては、ポンプ４の出力調整が好ましい。

したがって、図１に示す装置においては、例えば送液ライン１７および分離膜３の透過液取り出しラインに流量計を設け、定期的に循環液量および透過液量をモニタリングし、（式２）から回収率を算出し回収率が１０．０％以下になるようにポンプ４、５の出力を制御しながら運転することが好ましい。

なお、濾過フラックスもしくは透過液量を制御する方法としては、ポンプ４の出力調整のほか、水頭差圧の調整、液体や気体等による吸引、あるいは膜分離槽内の加圧なども挙げられる。

これらの方法により、例えば、循環液量を一定に保ちながら、濾過フラックスのみを制御する運転も可能である。また、濾過フラックスを一定に保ちながら、循環液量を制御する運転も可能である。

回収率はより好ましくは５．０％以下になるように制御する。一方、エネルギー効率を高めるという観点からは回収率が高いほうがよい。したがって、回収率の下限は、少なくとも０．０１％以上が好ましい。

次に、濾過フラックスについて説明する。濾過フラックスとは下記の（式４）により算出することができる。

装置に使用している膜面積は任意に設定できるため明らかである。透過液量の体積（m³／ｄａｙ）は１ｄａｙかけて透過液量の体積を測定することが好ましいが、１時間程度の透過液量の体積を測定することで１ｄａｙの透過液量の体積を概算することもできる。本発明においては、濾過フラックスを０．５００ｍ／ｄａｙ以下とすることが好ましく、０．０５０ｍ／ｄａｙ以上０．４００ｍ／ｄａｙ以下とすることがより好ましい。濾過フラックスが０．５００ｍ／ｄａｙを超えると回収率での制御によって連続培養を安定に維持することが難しくなる場合がある。また、濾過フラックスが０．０５０ｍ／ｄａｙ未満であると、分離膜面積が大きすぎるということを意味し、経済的な観点から工業化が難しくなる。

次に、図１に示す装置を用いて行う化学品の製造の一例を以下により具体的に説明する。

まず、微生物と培養原料（培地）を培養槽１に貯留し、適宜中和剤を添加することによってかかる培養槽１の内部をｐＨ４〜８の範囲内に維持するとともに温度２０〜５０℃の範囲に維持する。これによって、微生物の培養が行われ、その際にアルコール、有機酸、アミノ酸および核酸など、所望する発酵生産物（化学品）が生産される。この間、連続的に培養が行われ所望する発酵生産物が得られるように、培養に使用される栄養素を含む培地を、培地供給ポンプ６を介して培養槽１に連続的または間欠的に供給する。

そして、培養を行うと同時に、培養槽１内の培養液を、ポンプ５によって循環ライン内の線流速が２．５ｃｍ／ｓｅｃ以上になるように、連続的に培養槽１と膜分離槽２との間を循環させる。膜分離槽２においては、該培養液を分離膜によって微生物を含む未濾過培養液と発酵生産物を含む透過液とに濾過・分離する。その結果、発酵生産物を含む透過液は装置系から取り出され、該透過液をさらに濃縮、蒸留、晶析することで、純度が高められた発酵生産物を得ることができる。一方濾過・分離された、微生物や培養細胞を含む未濾過培養液は、培養槽１内に留まり、そのため培養槽の微生物濃度を高く維持することができ、化学品の生産性が高い培養を可能としている。

なお、循環ライン内の線流速の算出は、（単位時間当たりの流量）/（配管の断面積）によって算出することが可能である。もしくは配管にコリオリ式デジタル流量センサや電極非接触型２線式電磁流量計などを接続し測定することができる。これらデジタル流量計の出力を感知し、ポンプ５や流量制御手段２５などの制御を行う。

培養槽１における培養液中の微生物もしくは培養細胞の濃度は、微生物もしくは培養細胞の増殖が不適切となって死滅する比率が高くならない範囲で、高い状態で維持することが効率よい生産性を得るのに好ましい。一例として、濃度を、乾燥重量として５ｇ／Ｌ以上に維持することにより良好な生産効率が得られる。

かかる適切な濃度に維持するためには、必要に応じて培養槽内から微生物もしくは培養細胞を引き抜くことも好ましい。培養槽内の微生物もしくは培養細胞濃度が高くなりすぎると、分離膜の閉塞が発生しやすくなる場合もある。引き抜いて適当な濃度に維持することにより、分離膜の閉塞を回避することができる。また、培養槽内の微生物もしくは培養細胞の濃度によって化学品の生産性能が変化することがあるため、生産性能を指標として微生物もしくは培養細胞を引き抜くことで生産性能をある一定範囲に維持することも可能である。

培養原料の供給および培養液の引き抜き（培養液の膜分離槽への送液）は、適当な時期から行えばよい。すなわち、培養原料の供給と培養液の引き抜きの開始時期は必ずしも同じである必要はない。また、培養原料の供給と培養液の引き抜きは連続的であってもよいし、間欠的であってもよい。

また、必要に応じて、レベルセンサ１２によって、培養槽内の培養液量を適当に調節することも好ましい。培養槽内の培養液量の調節には、培養槽内の培養液位ではなく培養液重量を測定し調節することも可能である。

本発明においては、微生物または培養細胞を増殖しつつ化学品を生成することができるのであれば、培養装置の数は問わない。連続培養操作は、培養管理上、通常、単一の培養槽で行うことが好ましいが、培養槽の容量が小さい等の理由から、複数の培養槽を用いることも可能である。この場合、複数の培養槽を配管で並列または直列に接続して連続培養を行っても生産物の高生産性は得られる。

なお、本発明において、培養液とは、培養原料に微生物もしくは培養細胞が増殖した結果得られる液のことを言い、培養原料とは、培養する微生物もしくは培養細胞の生育を促し、目的とする生産物である化学品等を良好に生産させ得る栄養素などをいう。培養原料の組成は、目的とする化学品の生産性が高くなるように、培養開始時の培養原料組成から適宜変更しても良い。

本発明で使用される微生物もしくは培養細胞としては、例えば、工業的によく使用されるパン酵母などの酵母、大腸菌、コリネ型細菌などのバクテリア、糸状菌、放線菌、動物細胞および昆虫細胞などが挙げられる。特に、分離核内圧力差で細胞破壊を起こしやすい酵母などの真核生物が好ましく、その中でも酵母が最も好ましい。使用する微生物や培養細胞は、自然環境から単離されたものでもよく、また、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。これらの微生物もしくは培養細胞のうち、目的とする化学品の生産能力が高いものを選択して用いることが好ましい。なお、本発明においては微生物の培養を「発酵」または「発酵培養」と称することがある。

培養原料としては、培養する微生物または培養細胞の生育を促し、目的とする化学品を良好に生産させうるものであればよい。培養原料の具体例としては、炭素源、窒素源、無機塩類、および必要に応じてアミノ酸、ビタミンなどの有機微量栄養素を適宜含有する通常の液体培地が好ましく用いられる。

炭素源としては、グルコース、シュークロース、フラクトース、ガラクトースおよびラクトース等の糖類、これら糖類を含有する澱粉糖化液、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、ハイテストモラセス、更には酢酸等の有機酸、エタノールなどのアルコール類、およびグリセリンなども使用される。

窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種培養菌体およびその加水分解物などが使用される。

無機塩類としては、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩およびマンガン塩等を適宜添加することができる。微生物が生育のために特定の栄養素を必要とする場合には、その栄養物を標品もしくはそれを含有する天然物として添加することができる。また、消泡剤も必要に応じて使用することができる。

本発明では、培養液中の糖類濃度は５ｇ／ｌ以下に保持されることが好ましい。当該糖類濃度を５ｇ／Ｌ以下に保持することが好ましい理由は、培養液の引き抜きによる糖類の流失を最小限にするためである。

また、微生物もしくは培養細胞の培養は、通常ｐＨ４〜８、温度２０〜５０℃の範囲で行われることが多い。培養液のｐＨは、無機の酸あるいは有機の酸、アルカリ性物質、さらには尿素、炭酸カルシウムおよびアンモニアガスなどによって、上記範囲内のあらかじめ定められた値に調節することができる。さらに、酸素の供給速度を上げる必要があれば、空気に酸素を加えて酸素濃度を２１％以上に保つ、あるいは培養反応槽内を加圧する、攪拌速度を上げる、通気量を上げるなどの手段を用いることができる。

本発明では、培養初期にＢａｔｃｈ培養またはＦｅｄ−Ｂａｔｃｈ培養を行って微生物もしくは培養細胞の濃度を高くした後に連続培養を開始しても良いし、高濃度の菌体をシードし、培養開始とともに連続培養を行っても良い。

本発明により製造される化学品（発酵生産物）としては、前記微生物または培養細胞が培養液中に生産する物質であれば制限はなく、培養する微生物または培養細胞によって適宜選択されうる。具体例としては、アルコール、有機酸、アミノ酸、核酸など発酵工業において大量生産されている物質を挙げることができる。アルコールとしては、エタノール、１，３−プロパンジオール、１,４−ブタンジオール、グリセロールなど、有機酸としては、酢酸、乳酸、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、イタコン酸、クエン酸、核酸であれば、イノシン、グアノシンなどのヌクレオシド、イノシン酸、グアニル酸などのヌクレオチド、またカダベリンなどのジアミン化合物を挙げることができる。また、本発明は、酵素、抗生物質、組換えタンパク質のような物質の生産に適用することも可能である。

次に、所望する化学品を得るための微生物または培養細胞について、具体的な化学品を例示しながら説明する。

本発明により乳酸を生産するにあたって用いることが出来る微生物あるいは培養細胞としては、特に制限はないが、好ましくは乳酸菌を用いることができる。ここでいう乳酸菌とは、消費したグルコースに対して対糖収率として５０％以上の乳酸を産生する原核微生物として定義することができる。好ましい乳酸菌としては、例えば、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属、テトラゲノコッカス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、カルノバクテリウム（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、バゴコッカス（Ｖａｇｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属、オエノコッカス（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、アトポビウム（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属またはバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌が挙げられる。それらの中でも、乳酸の対糖収率が高い乳酸菌を適宜選択して乳酸の生産に好ましく用いることができる。

更に、乳酸の内でもＬ―乳酸の対糖収率の高い乳酸菌を選択することもできる。Ｌ−乳酸とは、乳酸の光学異性体の一種であり、その鏡像体であるＤ−乳酸と明確に区別することができる。Ｌ−乳酸の対糖収率が高い乳酸菌としては、例えば、ラクトバシラス・ヤマナシエンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｙａｍａｎａｓｈｉｅｎｓｉｓ）、ラクトバシラス・アニマリス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｉｍａｌｉｓ）、ラクトバシラス・アジリス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｇｉｌｉｓ）、ラクトバシラス・アビアリエス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｖｉａｒｉｅｓ）、ラクトバシラス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバシラス・デルブレッキ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｋｉｉ）、ラクトバシラス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバシラス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバシラス・ルミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｕｍｉｎｉｓ）、ラクトバシラス・サリバリス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバシラス・シャーピイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｈａｒｐｅａｅ）、ペディオコッカス・デクストリニクス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｄｅｘｔｒｉｎｉｃｕｓ）またはラクトバシラス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓ）などが挙げられ、これらを選択して、Ｌ−乳酸の生産に用いることが可能である。

一方、Ｄ−乳酸の生産に用いることが出来る微生物あるいは培養細胞としては、ラクトバシラス・デルブレッキ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｋｉｉ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、スポロラクトバチルス・ラエボラクティカス（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ）またはスポロラクトバチルス・イヌリナス（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｕｌｉｎｕｓ）などが挙げられる。

また、本発明によりＬ−乳酸またはＤ−乳酸を製造する場合、人為的に乳酸生産能力を付与、あるいは増強した微生物または培養細胞を用いることができる。人為的に乳酸生産能力を付与、あるいは増強する方法は、従来知られている薬剤変異による方法であってもよいが、好ましくは組換え微生物を用いる。組換え微生物としては、Ｌ−乳酸脱水素酵素遺伝子（以下、Ｌ−ＬＤＨと言うことがある）またはＤ−乳酸脱水素酵素遺伝子（以下、Ｄ−ＬＤＨと言うことがある）を導入して、微生物または培養細胞にＬ−乳酸またはＤ−乳酸生産能力を付与、あるいは増強した組換え微生物が好ましい
前記組換え微生物の宿主としては、原核細胞である大腸菌、乳酸菌、および真核細胞である酵母などが好ましく、特に好ましくは酵母である。酵母のうち好ましくはサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母であり、更に好ましくはサッカロマイセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。

Ｌ−ＬＤＨまたはＤ−ＬＤＨとしては、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）とピルビン酸を、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）とＬ−乳酸またはＤ−乳酸に変換する活性を持つタンパク質であるＬ−乳酸脱水素酵素またはＤ−乳酸脱水素酵素をコードしていれば限定されない。このうちＬ−ＬＤＨとしてはホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）由来またはカエル由来のＬ−ＬＤＨを好ましく用いることができる。カエル由来の中でもコモリガエル科（Ｐｉｐｉｄａｅ）に属するカエル由来のＬ−ＬＤＨを用いることが好ましく、コモリガエル科に属するカエルの中でも、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ＬＤＨを好ましく用いることができる。また、Ｄ−ＬＤＨとしては、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、およびペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）またはバシラス・ラエボラクティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ）由来の遺伝子であることが好ましく、より好ましくはバシラス・ラエボラクティカス由来の遺伝子である。

本発明に用いられるＬ−ＬＤＨまたはＤ−ＬＤＨには、遺伝的多型性や、変異誘発などによる変異型の遺伝子も含まれる。遺伝的多型性とは、遺伝子上の自然突然変異により遺伝子の塩基配列が一部変化しているものである。また、変異誘発とは、人工的に遺伝子に変異を導入することをいう。変異誘発は、例えば、部位特異的変異導入用キット（Mutan-K（タカラバイオ社製））を用いる方法や、ランダム変異導入用キット（BD Diversify PCR Random Mutagenesis（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製））を用いる方法などがある。また、本発明で使用するＬ−ＬＤＨまたはＤ−ＬＤＨは、Ｌ−乳酸脱水素酵素またはＤ−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードしているならば、塩基配列の一部に欠失または挿入が存在していても構わない。

そして、Ｌ―乳酸を製造する場合、上述の分離膜３から得られる透過液に含まれるＬ−乳酸の分離・精製は、従来知られている濃縮、蒸留および晶析などの方法を組み合わせて行うことができる。例えば、分離膜３の透過液のｐＨを１以下にしてからジエチルエーテルや酢酸エチル等で抽出する方法、イオン交換樹脂に吸着洗浄した後に溶出する方法、酸触媒の存在下でアルコールと反応させてエステルとし蒸留する方法、およびカルシウム塩やリチウム塩として晶析する方法などが挙げられる。好ましくは、分離膜３の透過液の水分を蒸発させた濃縮Ｌ−乳酸溶液を蒸留操作にかける方法を挙げることができる。ここで、蒸留する際には、蒸留原液の水分濃度が一定になるように水分を供給しながら蒸留することが好ましい。Ｌ−乳酸水溶液の留出後は、水分を加熱蒸発することにより濃縮し、目的とする濃度の精製Ｌ−乳酸を得ることができる。留出液としてエタノールや酢酸等の低沸点成分を含むＬ−乳酸水溶液を得た場合は、低沸点成分をＬ−乳酸濃縮過程で除去することが好ましい態様である。蒸留操作後、留出液について必要に応じて、イオン交換樹脂、活性炭およびクロマト分離等による不純物除去を行い、さらに高純度のＬ−乳酸を得ることもできる。

Ｄ−乳酸を製造する場合も同様に、上述の分離膜３から得られる透過液に含まれるＤ−乳酸の分離・精製は、従来知られている濃縮、蒸留および晶析などの方法を組み合わせて行うことができる。例えば、分離膜３の透過液のｐＨを１以下にしてからジエチルエーテルや酢酸エチル等で抽出する方法、イオン交換樹脂に吸着洗浄した後に溶出する方法、酸触媒の存在下でアルコールと反応させてエステルとし蒸留する方法、およびカルシウム塩やリチウム塩として晶析する方法などが挙げられる。好ましくは、分離膜３の透過液の水分を蒸発させた濃縮Ｄ−乳酸溶液を蒸留操作にかける方法を挙げることができる。ここで、蒸留する際には、蒸留原液の水分濃度が一定になるように水分を供給しながら蒸留することが好ましい。Ｄ−乳酸水溶液の留出後は、水分を加熱蒸発することにより濃縮し、目的とする濃度の精製Ｄ−乳酸を得ることができる。留出液として低沸点成分（エタノール、酢酸等）を含むＤ−乳酸水溶液を得た場合は、低沸点成分をＤ−乳酸濃縮過程で除去することが好ましい態様である。蒸留操作後、留出液について必要に応じて、イオン交換樹脂、活性炭およびクロマト分離等による不純物除去を行い、さらに高純度のＤ−乳酸を得ることもできる。

次に、本発明によりエタノールを製造する場合に用いることが出来る微生物あるいは培養細胞としては、特に制限はないが、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クルベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属またはシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母を用いることができる。このうちサッカロミセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クルベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）を好適に用いることができる。また、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属またはザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属に属する細菌も好ましく用いることができる。このうち、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）またはザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）を好適に用いることができる。

エタノールの生産に用いることができる微生物あるいは培養細胞は人為的にエタノール生産能力を高めた微生物あるいは培養細胞であってもよい。具体的には、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。一部性質が改変されたものの一例としては、リゾパス属に属するカビのグルコアミラーゼ遺伝子を組み込み、生でんぷんの資化能力を獲得した酵母を挙げることができる（微生物、３：５５５−５６４（１９８７））。

なお、上述の分離膜３から得られる透過液に含まれるエタノールの分離・精製は、例えば、蒸留法による精製法や、ＮＦ、ＲＯ膜、あるいはゼオライト製の分離膜を用いた濃縮・精製法を好適に用いることができる。

本発明によりピルビン酸を製造する場合に用いることが出来る微生物あるいは培養細胞としては、特に制限はないが、例えば、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、エシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属またはアシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属に属する細菌を好ましく用いることができる。さらに好ましくは、シュードモナス・フルオレエセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｕｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・アエロギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）などの細菌を用いることができる。

ピルビン酸の生産に用いることができる微生物あるいは培養細胞は、人為的にピルビン酸生産能力を高めた微生物あるいは培養細胞であってもよく、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変したものを用いてもよい。例えば、酸化的リン酸化によるＡＴＰ生産に直接関与するＡＴＰａｓｅ遺伝子を変異、または欠失させた細菌も好ましく用いられる。またカビ、酵母なども好ましく用いることができる。例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、トルロプシス（Ｔｏｌｕｒｏｐｕｓｉｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属またはシゾフィリウム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）属に属するカビまたは酵母を用いることができる。さらに好ましくは、サッカロミセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・コプシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｏｐｓｉｓ）、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・リポリチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、トルロプシス・グラブラータ（Ｔｏｌｕｒｏｐｕｓｉｓ ｇｌａｂｒａｔａ）、シゾフィリウム・コムネ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ）などのカビまたは酵母を用いてピルビン酸を製造することが出来る。

なお、上述の分離膜３から得られる透過液に含まれるピルビン酸の分離・精製は、陰イオン交換カラムを用いた方法により行うことができる。例えば、特開平６−３４５６８３に示される弱塩性イオン交換体を用いた精製法を好適に用いることができる。

本発明によりコハク酸を製造する場合に用いることができる微生物あるいは培養細胞としては、特に制限はないが、具体例としては、アナエロビオスピリラム（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属やアクチノバシラス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌を好適に利用することができる。具体的には、米国特許第５１４３８３３号明細書に記載のアナエロビオスピリラム サクシニシプロデュセンス（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｕｃｃｉｎｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）やJames B. Mckinlay （ジェームズ Ｂ.マッキンリー）らが開示しているアクチノバシラス・サクシノジェネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）を挙げることができる（Appl. Microbiol. Biotechnol.（アプライド マイクロバイアル アンド マイクロバイオロジー）,７１,６６５１−６６５６ （２００５）。また、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属やブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属などのコリネ型細菌および大腸菌なども利用可能である。コリネ型細菌では、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、およびブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）などが好適である。

コハク酸の生産に用いることができる微生物あるいは培養細胞は人為的にエタノール生産能力を高めた微生物あるいは培養細胞であってもよい。具体例として、遺伝子組換えによって、コハク酸の生産能力が改善された微生物を用いることができ、これによりコハク酸の生産性を向上させることも可能である。このような微生物としては、例えば、特開２００５−２７５３３号公報に記載の乳酸脱水素酵素を欠損したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ＡＢ−４１（寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８）や、上述の非特許文献１に記載のコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、米国特許第５７７０４３５号明細書に記載のピルビン酸・ギ酸開裂酵素と乳酸脱水素酵素の欠損株である大腸菌ＡＦＰ１１１株などを使用することができる。

なお、上述の分離膜３から得られる透過液に含まれるコハク酸の分離・精製には、通常のコハク酸の精製法を適用することができる。例えば、特開２００５−３３３８８６号公報に示されている水分解電気透析処理と減圧濃縮・晶析を組み合わせた精製法を好適に用いることができる。

本発明によりイタコン酸を製造する場合に用いることが出来る微生物あるいは培養細胞としては、特に制限はなく、具体例としては、カビあるいは酵母を好ましく用いることができる。更に好ましくは、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、あるいはウスティラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属に属するカビ、およびカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属に属する酵母を用いたイタコン酸の生産が挙げられる。中でも、アスペルギルス テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）、アスペルギルス イタコニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｉｔａｃｏｎｉｃｕｓ）、ウスティラゴ メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ）、ウスティラゴ シノドンティス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｃｙｎｏｄｏｎｔｉｓ）、およびウスティラゴ ラベンホルスティナ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｒａｂｅｎｈｏｒｓｔｉｎａ）のカビ、あるいはカンジダ アンタルクティカ（Ｃａｎｄｉａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）を、イタコン酸の生産に好ましく用いることができる。

なお、上述の分離膜３から得られる透過液に含まれるイタコン酸の分離・精製は、好ましくは、限外濾過や電気透析を用いて行う。例えば、特公昭−５０９５８号公報に示される限外濾過、または塩型カチオン交換樹脂膜を用いた電気透析による精製法を好適に用いることができる。

本発明により１，３−プロパンジオールを製造する場合に用いることが出来る微生物あるいは培養細胞としては、特に制限はないが、具体例としては、野生型株ではグリセロールから１，３−プロパンジオールを合成する能力を有するクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、クロスツリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物が挙げられる。

グリセロールから１，３−プロパンジオールを製造する場合、微生物は、（ａ）グリセロールデヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子；（ｂ）グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子をコードする少なくとも１つの遺伝子；及び （ｃ）３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを１，３−プロパンジオールに転換する非−特異的触媒活性をコードする少なくとも１つの遺伝子を含んでいることが好ましい。

更に好ましくは、グルコースから１，３−プロパンジオールを生産可能な組換え微生物を用いることが好ましい。組換え微生物の宿主としては、好ましくは、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、クロスツリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シトロバクテル（Ｃｙｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エンテロバクテル（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アエロバクテル（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属、ムコル（Ｍｕｃｏｒ）属、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属、メチロバクテル（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アエロバクテル（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、エッシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ）属及びシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属より成る群から選ばれる組換え微生物で、更に好ましくはエッシェリシア コリである。

グルコースから１，３−プロパンジオールを生産可能な組換え微生物は、例えば、（ａ）グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子；及び（ｂ）グリセロール−３−ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子を含んだ組換え微生物であることが好ましい。 更にグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子がｄｈａレギュロンから単離されるｏｒｆＸ及びｏｒｆＺによりコードされる遺伝子を含んだ組換え微生物であることが更に好ましい。更には、組換え微生物は、グリセロールキナーゼ活性および／またはグリセロールデヒドロゲナーゼ活性および／またはトリオースリン酸イソメラーゼ活性を欠失した組換え微生物であることが更に好ましい。

なお、上述の分離膜３から得られる透過液に含まれる１，３−プロパンジオールの分離・精製は、濃縮、晶析により行うことができる。例えば、特開平−３５７８５号公報に示される減圧濃縮・晶析を用いた精製法を好適に用いることができる。

本発明によりカダベリンを製造する場合に用いることが出来る微生物あるいは培養細胞としては、特に制限はないが、具体例としては、微生物が有するリジン脱炭酸酵素および／またはリジン・カダベリンアンチポーターの酵素活性が増強された微生物が好ましい。更に好ましくは、リジン脱炭酸酵素および／またはリジン・カダベリンアンチポーターをコードする遺伝子を組み込んだ組換え微生物が挙げられる。更に好ましくは、リジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子が、１または２種類以上組み込まれている組換え微生物が挙げられる。

組換え微生物でカダベリンを製造する場合、大腸菌またはコリネ型細菌を宿主とする組換え微生物が好ましく、より好ましくは、リジン脱炭酸酵素活性を有し、かつホモセリン栄養要求性またはＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン耐性の少なくともいずれか１つの特徴を有しているコリネ型細菌である。また、コリネ型細菌の中でもコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属から選ばれることがより好ましく、コリネバクテリア・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｕｔｅｒｉｕｍ ｇｕｌｕｔａｍｉｃｕｍ）が更に好ましい。更に微生物はホモセリンデヒドロゲナーゼ活性を欠損していることが好ましく、遺伝子挿入変異生成によりホモセリンデヒドロゲナーゼ活性を欠損していることがより好ましい。

なお、上述の分離膜３から得られる透過液に含まれるカダベリンの分離・精製は、濃縮、蒸留および晶析などの従来知られている方法を組み合わせて行うことができる。例えば、特開２００４−２２２５６９号公報に示される晶析を用いた精製法を好適に用いることができる。本発明では、連続培養の際に用いられる酸によって様々なポリマー原料にすることができ、好純度が求められるポリマー原料用途では晶析による精製方法が好ましく用いられる。塩酸により培養液のｐＨを維持すると、前記透過液の晶析を行うことによりカダベリン二塩酸塩を回収することができる。更に好ましくは、連続培養の際にジカルボン酸により培養液のｐＨを維持し、カダベリン・ジカルボン酸塩を回収することが挙げられる。このときジカルボン酸は、官能基としては２つのカルボキシル基のみを有する脂肪族および／または芳香族のジカルボン酸であることが好ましく、更にはアジピン酸、セバシン酸、１，１２−ドデカンジカルボン酸、コハク酸、イソフタル酸またはテレフタル酸のいずれかであることが好ましい。

本発明により核酸を製造する場合に用いることが出来る微生物あるいは培養細胞としても、特に制限はなく、元来核酸の生産能力が高いものを自然界から分離してもよいし、人為的に生産能力を高めた原核微生物であってもよい。具体的には、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。

ここで、前記一部性質の改変に関して説明する。核酸を効率よく生産するためには、核酸を生合成して蓄積し、生体外に放出する必要がある。そのため、核酸の生合成系路に関与する酵素の増強、核酸の分解路に関与する酵素活性低下、また核酸を生体外放出に関わるタンパク質、あるいは生体膜組成等の改変など、微生物あるいは培養細胞の性質を変えることによって効率的に核酸を生産する微生物あるいは培養細胞を作出することができる。

具体的には、イノシンを生産する場合、微生物や培養細胞は、アデニロコハク酸シンテターゼ活性を持たないか、微弱であることが望ましい。また、イノシン酸デヒドロゲナーゼ活性を持たないか、微弱であることが望ましい。また、ヌクレオシダーゼ活性を持たないか、微弱であることが望ましい。グアノシンを生産する場合には、微生物や培養細胞が、アデニロコハク酸シンテターゼ活性を持たないか、微弱であることが望ましい。また、グアニル酸レダクターゼ活性を持たないか、微弱であることが望ましい。また、ヌクレオシダーゼ活性を持たないか、微弱であることが望ましい。また、ヌクレオチダーゼ活性を持たないか、微弱であることが望ましい。ウリジンを生産する場合には、微生物や培養細胞が、ウリジンホスホリラーゼ活性を持たないか、微弱であることが望ましい。シチジンを生産する場合には、シジチンデアミナーゼ活性を持たないか、微弱であることが望ましく、ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性を持たないか、微弱であることが望ましい。

本発明により核酸を製造する場合に用いることができる微生物あるいは培養細胞としては、コリネ型細菌または枯草菌を好ましく用いることもできる。例えば、イノシンを生産する場合には、コリネ型細菌として、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する細菌が挙げられ、コリネバクテリウム属の中でも、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｕｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・グアノファシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｕａｎｏｆａｃｉｅｎｓ）またはコリネバクテリウム・ペトロフィリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｅｔｒｏｐｈｉｌｉｕｍ）が好ましく用いられる。また、枯草菌として、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌が挙げられ、中でも、バチスル・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチスル・ライケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｑｕｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）またはバチスル・プミラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）が好ましく用いられる。また、グアノシンを生産する場合には、コリネ型細菌として、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する細菌が挙げられ、中でも、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｕｌｕｔａｍｉｃｕｍ）が好ましく、枯草菌としては、例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌が挙げられ、中でも、バチスル・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチスル・ライケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｑｕｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）またはバチスル・プミラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）が好ましく用いられる。また、ウリジンまたはシチジンを生産する場合には、枯草菌として中でもバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌が好ましく用いられ、中でも、バチスル・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が好ましく用いられる。

なお、上述の分離膜３から得られる透過液に含まれる核酸の分離・精製は、好ましくは、イオン交換樹脂処理法、濃縮冷却晶析法、膜分離法およびその他の方法を組み合わせることにより行なわれる。不純物を除くためには、常法の活性炭吸着法および再結法を用いて精製してもよい。

本発明によりアミノ酸を製造する場合、当該アミノ酸としては、好ましくは、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、Ｌ―フェニルアラニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−チロシン、メチオニン、セリン、バリン、ロイシンが挙げられる。

例えばＬ−スレオニンを製造する場合、微生物あるいは培養細胞としては、エシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属またはセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属に属する細菌を用いることができる。そのうちで、特に好ましい細菌は、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、プロビデンシア・レトゲリ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｒｅｔｔｇｅｒｉ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）またはセラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）を挙げることができる。

Ｌ−リジンまたはＬ−グルタミン酸を製造する場合に用いることができる微生物あるいは培養細胞としては、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｕｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）またはブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）が好ましい。

Ｌ−トリプトファンを製造する場合、微生物あるいは培養細胞としては、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｕｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）またはエシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が好ましい。

Ｌ−イソロイシンを製造する場合、微生物あるいは培養細胞としては、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｕｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）またはセラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）が好ましい。

Ｌ−グルタミンを製造する場合、微生物あるいは培養細胞としては、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｕｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）またはフラボバクテリウム・リゲンス（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｉｇｅｎｓｅ）が好ましい。

Ｌ−アルギニンを製造する場合、微生物あるいは培養細胞としては、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｕｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）またはバチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が好ましい。

Ｌ−アラニンを製造する場合、微生物あるいは培養細胞としては、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）またはアルスロバクター・オキシダンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）が好ましい。

Ｌ−ヒスチジンを製造する場合、微生物あるいは培養細胞としては、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｕｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・アモニアジェネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはストレプトマイセス・コエリコラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）が好ましい。

Ｌ−プロリンを製造する場合、微生物あるいは培養細胞としては、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｕｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、カルチア・カテナフォルマ（Ｋｕｒｔｈｉａ ｃａｔｅｎａｆｏｒｍａ）、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）またはエシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が好ましい。

Ｌ−フェニルアラニンまたはＬ−チロシンを製造する場合、微生物あるいは培養細胞としては、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｕｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）またはエシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が好ましい。

Ｌ−アスパラギン酸を製造する場合、微生物あるいは培養細胞としては、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｈｅｒｉｕｍ）、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）またはシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）が好ましい。

メチオニンを製造する場合、微生物あるいは培養細胞としては、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｕｌｕｔａｍｉｃｕｍ）が好ましい。

セリンを製造する場合、微生物あるいは培養細胞としては、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｕｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）またはアルスロバクター・オキシダンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）が好ましい。

バリンを製造する場合、微生物あるいは培養細胞としては、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）またはクレブシェラ・ニューモニア（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が好ましい。

ロイシンを製造する場合、微生物あるいは培養細胞としては、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｕｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）またはセラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）が好ましい。

以上のような、アミノ酸の製造に用いることができる微生物あるいは培養細胞は、元来アミノ酸の生産能力が高いものを自然界から分離してもよいし、例示した微生物あるいは培養細胞に対して、人為的に生産能力を高めた微生物あるいは培養細胞であってもよい。また、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。

当該一部性質が改変された微生物あるいは培養細胞の一例としては、特開平２−２１９５８２に記載されているＬ−スレオニン生産性の向上したプロビデンシア・レトゲリ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｒｅｔｔｇｅｒｉ）や、特表平３−５００４８６に記載されている、Ｌ−アラニン生産性の向上したコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｕｌｕｔａｍｉｃｕｍ）などがある。

次に、本発明において分離膜として好ましく用いられる多孔性膜について説明する。

多孔性膜としては、セラミックスなどの無機材料、樹脂などの有機材料を素材とした多孔性膜を用いることが可能であるが、多孔質樹脂層を含む多孔性の分離膜を用いることがより好ましい。このような多孔性膜は、多孔質基材の表面に、分離機能層として作用とする多孔質樹脂層を有している。多孔質基材は、多孔質樹脂層を支持して分離膜に強度を与えるものである。多孔質樹脂層は多孔質基材に浸透していても浸透していなくてもどちらでも良いが、強度の点で多孔質基材に浸透させた膜が好ましく採用される。

多孔質基材の材質は、有機材料および／または無機材料等からなり、中でも有機繊維が望ましく用いられる。好ましい多孔質基材は、セルロース繊維、セルローストリアセテート繊維、ポリエステル繊維、ポリプロピレン繊維およびポリエチレン繊維などの有機繊維を用いてなる織布や不織布等である。中でも、密度の制御が比較的容易であり製造も容易で安価な不織布が好ましく用いられる。

多孔質樹脂層は、上述したように分離機能層として作用するものであり、有機高分子膜を好適に使用することができる。有機高分子膜の材質としては、例えば、ポリエチレン系樹脂、ポリプロピレン系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂、ポリアクリロニトリル系樹脂、ポリオレフィン系樹脂、セルロース系樹脂およびセルローストリアセテート系樹脂等が挙げられる。有機高分子膜は、これらの樹脂を主成分とする樹脂の混合物からなるものであってもよい。ここで主成分とは、その成分が５０重量％以上、好ましくは６０重量％以上含有することをいう。中でも、多孔質樹脂層を構成する膜素材としては、溶液による製膜が容易で物理的耐久性や耐薬品性にも優れているポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂、ポリアクリロニトリル系樹脂またはポリオレフィン系樹脂が好ましく、ポリフッ化ビニリデン系樹脂またはポリオレフィン系樹脂がより好ましく、ポリフッ化ビニリデン系樹脂またはそれを主成分とする樹脂が最も好ましく用いられる。

ここで、ポリフッ化ビニリデン系樹脂としては、フッ化ビニリデンの単独重合体が好ましいが、フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体との共重合体も好ましく用いられる。フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体としては、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレンおよび三塩化フッ化エチレンなどが例示される。また、ポリオレフィン系樹脂としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、塩素化ポリエチレンまたは塩素化ポリプロピレンが挙げられるが、塩素化ポリエチレンが好ましく用いられる。

以下に多孔性膜の作成法の概要を例示して説明する。

まず、多孔性膜のうち、平膜の作成法の概要について説明する。平膜は、多孔質基材の表面に、多孔質樹脂層を構成する樹脂と溶媒を含む製膜原液の被膜を形成するとともに、その製膜原液を多孔質基材に含浸させ、その後、被膜を有する多孔質基材の被膜側表面のみを、非溶媒を含む凝固浴と接触させて樹脂を凝固させて多孔質基材の表面に多孔質樹脂層を形成することで得られる。このとき、用途に応じて選択されるが、多孔質基材の平均厚みは５０μｍ以上３０００μｍ以下であることが好ましく、また、多孔質樹脂層の平均厚みは２０μｍ以上５０００μｍ以下であることが、さらには５０μｍ以上２０００μｍ以下の範囲であることが好ましい。

次に、中空糸膜の作成法の概要について説明する。中空糸膜は、多孔質樹脂層を構成する樹脂と溶媒からなる製膜原液を二重管式口金の外側の管から吐出するとともに、中空部形成用流体を二重管式口金の内側の管から吐出して、冷却浴中で冷却固化して作製することができる。このとき、中空糸の内径は２００μｍ以上５０００μｍ以下の範囲であることが好ましく、多孔質樹脂層の膜厚は２０μｍ以上２０００μｍ以下の範囲であることが好ましい。また、有機繊維または無機繊維を筒状にした織物や編物を中空糸の内部に含んでいても良い。

得られた中空糸膜の外表面には、別の多孔質樹脂層をコーティング（積層）することもできる。このような多孔質樹脂層の積層は中空糸膜の性質、例えば、親水・疎水性、細孔径等を所望の性質に変化させるために行うことができる。

かかる表面に積層される多孔質樹脂層は、樹脂を溶媒に溶解させた原液を、非溶媒を含む凝固浴と接触させて樹脂を凝固させることによって作製できる。積層される樹脂の材質は、例えば、上述多孔質樹脂層の材質と同様のものが好ましく用いることができる。また、積層の方法は特に限定されず、当該原液に中空糸膜を浸漬してもよいし、中空糸膜の表面に当該原液を塗布してもよく、積層後、付着した当該原液の一部を掻き取ったり、エアナイフを用いて吹き飛ばしすることで積層量を調整することもできる。

本発明で使用される多孔性膜は、平均細孔径が、０.０１μｍ以上１μｍ未満であることが好ましい。多孔性膜の平均細孔径が、０.０１μｍ以上１μｍ未満であると、発酵に使用される微生物による目詰まりが起こりにくく、かつ、濾過性能が長期間安定に継続する性能を有する。また、多孔性膜の平均細孔径が、０.０１μｍ以上１μｍ未満であると、微生物あるいは培養細胞がリークすることのない高い排除率と、高い透水性を、長時間保持することが可能となる。

微生物もしくは培養細胞の大きさに近いと、これらが直接孔を塞いでしまう場合があるので、多孔性膜の平均細孔径は、１μｍ未満であることが好ましい。また、多孔性膜の平均細孔径は、微生物もしくは培養細胞の漏出、すなわち排除率が低下する不具合の発生を防止するため、微生物もしくは培養細胞の大きさと比較して大きすぎないことが好ましい。そのため、微生物もしくは培養細胞のうち、細胞の小さい酵母や細菌などを用いる場合には、平均細孔径として０．４μｍ以下がより好ましく、０．２μｍ以下であることが好ましい。また、微生物もしくは培養細胞が目的とする化学品以外の物質、例えば、タンパク質、多糖類など凝集しやすい物質を生産する場合があり、更に、培養液中の微生物もしくは培養細胞の一部が死滅することで細胞の破砕物が生成する場合がある。これら物質による多孔性膜の閉塞を回避するためには、平均細孔径が０．１μｍ以下であることがさらに好適である。

以上のことから、本発明の多孔性膜の平均細孔径は、多孔性膜の平均細孔径は、０.４μｍ以下がより好ましく、０．２μｍ以下がさらに好ましく、０．１μｍ以下が最も好ましい。

一方、平均細孔径が小さすぎると多孔性膜の透水性能が低下し、膜が汚れていなくても効率的な運転ができなくなるため、本発明における多孔性膜の平均細孔径は、０.０１μｍ以上であることが好ましい。より好ましくは、０．０２μｍ以上であり、０．０４μｍ以上であることが更に好適である。

ここで、平均細孔径は、倍率１０，０００倍の走査型電子顕微鏡観察における、９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔すべての直径を測定し、平均することにより求めることができる。なお、細孔が真円でない場合、画像処理装置等によって、細孔が有する面積と等しい面積を有する円（等価円）を求め、その等価円の直径を細孔の直径とする。

本発明で用いることができる分離膜は、細孔径の標準偏差σが小さいほど、すなわち細孔径の大きさの分布が狭い方が良い。細孔径の大きさの分布を狭くし、標準偏差を０．１μｍ以下とすることが好ましい。細孔径の標準偏差が小さい、すなわち細孔径の大きさが揃っている方が、均一な特性の透過液を得ることができるとともに、装置の運転管理が容易になる。

細孔径の標準偏差σは、上述の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔数をＮとして、測定した各々の直径をＸｋとし、細孔直径の平均をＸ（ａｖｅ）とした下記の（式５）により算出される。

本発明で用いられる分離膜においては、化学品を含む培養液の透過性が重要点の一つであるが、透過性の指標として、使用前の分離膜の純水透過係数を用いることができる。本発明において、分離膜の純水透過係数は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで透水量を測定し算出したとき、１×１０⁻¹⁰ｍ^３／ｍ^２／ｓ／Ｐａ以上であることが好ましい。さらに、実用的に十分な透過液量を得るためには、純水透過係数が２×１０^−９ｍ^３／ｍ^２／ｓ／ｐａ以上６×１０^−７ｍ^３／ｍ^２／ｓ／Ｐａ以下であることが好ましく、２×１０^−９ｍ^３／ｍ^２／ｓ／Ｐａ以上２×１０^−７ｍ^３／ｍ^２／ｓ／Ｐａ以下であることがより好ましい。

本発明で用いられる分離膜の膜表面粗さは、分離膜の目詰まりに影響を与える因子である。分離膜の剥離係数や膜抵抗を好適に低下させ、より低い膜間差圧で化学品の製造をするためには、分離膜の膜表面粗さが０.１μｍ以下であることが好ましい。目詰まりを抑えることにより、安定した化学品の製造を可能とするためには、表面粗さは小さければ小さいほど好ましい。

また、膜表面粗さは、分離膜表面に付着した微生物もしくは培養細胞が、撹拌や循環ポンプによる液流による膜面洗浄効果で剥離しやすくするための因子の一つである。このような観点からも、分離膜の膜表面粗さは小さければ小さいほど好ましく、０．１μｍ以下であることが好ましい。表面粗さが０．１μｍ以下であると、膜に付着した微生物もしくは培養細胞が剥がれやすい。

また、多孔性膜の膜表面粗さを、０．１μｍ以下とすることにより、微生物もしくは培養細胞の濾過において、膜表面で発生する剪断力を低下させることができ、微生物もしくは培養細胞の破壊が抑制される。その結果、分離膜の目詰まりも抑制されることにより、長期間安定な濾過が可能になる。

ここで、膜表面粗さとは、膜面方向に対して垂直な方向における膜表面の変動の平均値であり、下記のとおり、原子間力顕微鏡装置（ＡＦＭ）を使用して測定することができる。
・装置：原子間力顕微鏡装置(Digital Instruments（株）製Nanoscope IIIa)
・条件：探針 SiNカンチレバー(Digital Instruments（株）製)
：走査モード コンタクトモード（気中測定）
水中タッピングモード（水中測定）
：走査範囲 １０μm、２５μm 四方（気中測定）
５μm、１０μm 四方（水中測定）
：走査解像度 ５１２×５１２
・試料調製：測定に際し膜サンプルは、常温でエタノールに１５分浸漬後、ＲＯ水中に２４時間浸漬し洗浄した後、風乾し用いた。ＲＯ水とは、ろ過膜の一種である逆浸透膜（ＲＯ膜）を用いてろ過し、イオンや塩類などの不純物を排除した水を指す。ＲＯ膜の孔の大きさは、概ね２ｎｍ以下である。

膜表面粗さｄ_{ｒｏｕｇｈ}は、上記ＡＦＭにより各ポイントのＺ軸方向の高さから、下記の（式６）により算出する。

上述のような分離膜は、膜分離槽の形状に合わせて形状を適宜加工して用いることができる。例えば、平膜形態の分離膜は、別に用意された支持体と組み合わせることによって図３に示すような分離膜エレメントとすることができる。また、中空糸膜は、樹脂などの部材で中空部を接着・封止することで図４に示す分離膜エレメントとすることができる。なお、本発明においては体積あたりの膜面積の設置が有利であるという観点から中空糸膜を用いることが好ましい。

以下、図面を用いてそれら分離膜エレメントの概略を説明する。

図３は、平膜形態の分離膜を用いた分離膜エレメントの一つの実施の形態を説明するための概略斜視図である。分離膜エレメントは、図３に示すように、剛性を有する支持板１８の両面に、流路材１９と分離膜２０とをこの順序で配し構成されている。支持板１８は、両面に凹部２１を有している。分離膜２０は培養液を濾過する。流路材１９は、分離膜２０で濾過された透過液を効率よく支持板１８に流すためのものである。支持板１８に流れた生産物を含む透過液は、支持板１８の凹部２１を通り、排出手段である集液パイプ２２を経て連続培養装置外部に取り出される。ここで、水頭差圧をはじめとして、ポンプ、液体や気体等による吸引濾過、あるいは装置系内を加圧するなどの方法を、透過液を取り出すための動力として用いることができる。

なお、培養槽に合わせて膜面積を大きくする必要がある場合には、かかる分離膜エレメントを積層させて膜面積を大きくすればよい。

図４は、中空糸形態の分離膜を用いた分離膜エレメントの概略斜視図であって、主に支持板１８と、中空糸形態の分離膜２０と、上部樹脂封止層２３および下部樹脂封止層２４とによって構成される。分離膜２０は、上部樹脂封止層２３および下部樹脂封止層２４よって束状にかつ支持板１８に接着・固定化されている。下部樹脂封止層２４による接着・固定化は、中空糸形態の分離膜２０の中空部を封止しており、培養液の漏出を防ぐ構造になっている。一方、上部樹脂封止層２３は、中空糸形態の分離膜２０の中空部を封止しておらず、中空部と集液パイプ２２とが連通している。この分離膜エレメントは、支持板１８を介して連続培養装置内に設置することが可能である。分離膜２０によって濾過された透過液は、中空糸膜の中空部を通り、集液パイプ２２を介して連続培養装置外部に取り出される。透過液を取り出すための動力としては、水頭差圧、ポンプ、液体や気体等による吸引濾過、あるいは装置系内を加圧するなどの方法を用いることができる。

分離膜を備えた膜分離槽２は、高圧蒸気滅菌可能なことが望ましく、このようにすることにより雑菌からの汚染回避を可能となる。本発明の高圧蒸気滅菌とは、蒸気によって膜分離槽を加熱・加圧することによって槽内に存在する微生物もしくは培養細胞を滅菌させることである。加熱・加圧条件としては例えば１２１．１℃、蒸気圧１気圧の条件で２０分以上加圧・加温することが好ましい。従って、本発明の連続培養装置の膜分離槽１２、および該膜分離槽１２に配設される分離膜、エレメント構成部材には、かかる条件での高圧蒸気滅菌操作に耐性のある部材を用いることが好ましい。これにより分離膜エレメントを含む培養槽内を滅菌可能とすることができる。培養槽内が滅菌可能であれば、連続培養時に好ましくない微生物による汚染の危険を回避でき、安定した連続培養が可能となる。

分離膜エレメントを構成する分離膜ならびに支持板等の部材は、例えば高圧蒸気滅菌操作の条件である１２１．１℃、蒸気圧１気圧の条件で２０分以上という条件に耐性があることが好ましく、そうであれば分離膜ならびにエレメント構成部材の種類は特に限定されない。かかる耐性を有する分離膜の素材としては上述の多孔性膜の素材を用いることが可能である。また、支持板等のエレメント構成部材としては、例えば、ステンレスやアルミニウムなどの金属、あるいはポリアミド系樹脂、フッ素系樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリアセタール系樹脂、ポリブチレンテレフタレート系樹脂、ＰＶＤＦ、変性ポリフェニレンエーテル系樹脂およびポリサルホン系樹脂等を好ましく選定することができる。

以下、本発明について、実施例、比較例を挙げて詳細に説明する。

具体的に、実施例１〜９、比較例１〜４では、化学品としてＬ−乳酸、微生物もしくは培養細胞としてＬ―乳酸生産能力を持つ酵母（参考例１）、分離膜に多孔性膜（参考例２：平膜）を選定し、図２、７、９、１３〜１６のいずれかに示す連続培養装置を用いて行った連続的な化学品の製造について説明する。

また、実施例１０、比較例５では、化学品としてカダベリン（１，５−ペンタンジアミン）、微生物もしくは培養細胞としてカダベリン生産能力を持つ微生物、分離膜に多孔性膜（参考例２：平膜）を選定し、図２に示す連続培養装置を用いて行った連続的な化学品の製造について説明する。

また、実施例１１、比較例６では、化学品としてＬ−リジン、微生物もしくは培養細胞としてＬ−リジン生産能力を持つ微生物、分離膜に多孔性膜（参考例２：平膜）を選定し、図２に示す連続培養装置を用いて行った連続的な化学品の製造について説明する。

なお、いずれの実施例においても、流量制御手段２５にはバタフライバルブを採用し、これにより膜分離槽へ流量する培養液の流量ならびに流入圧を調整した。

また、これら実施例は本発明の一つの態様を説明するものであり、本発明を限定するものではない。

（参考例１）乳酸生産能力を持つ酵母株（ＳＵ０１４株）の作製
本実施例では、乳酸生産能力を有する酵母として、配列番号１に記載の塩基配列を有するゼノプス・レービス由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子がＰＤＣ１プロモーターの下流の導入された酵母を使用した。ゼノプス・レービス由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子のクローニングはＰＣＲ法により行った。ＰＣＲには、ゼノプス・レービスの腎臓由来ｃＤＮＡライブラリー（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）より付属のプロトコールに従い調製したファージミドＤＮＡを鋳型とした。

ＰＣＲ増幅反応には、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用い、反応バッファー、ｄＮＴＰｍｉｘなどは付属のものを使用した。上記のように付属のプロトコールに従い調整したファージミドＤＮＡを５０ｎｇ／サンプル、プライマーを５０ｐｍｏｌ／サンプル、及びＫＯＤ−Ｐｌｕｓ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを１ユニット／サンプルになるように５０μlの反応系に調製した。反応溶液をＰＣＲ増幅装置ｉＣｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）により９４℃の温度で５分熱変成させた後、９４℃（熱変成）：３０秒、５５℃（プライマーのアニール）：３０秒、６８℃（相補鎖の伸張）：１分を１サイクルとして３０サイクル行い、その後４℃の温度に冷却した。なお、遺伝子増幅用プライマー（配列番号２，３）には、５末端側にはＳａｌＩ認識配列、３末端側にはＮｏｔＩ認識配列がそれぞれ付加されるようにして作製した。

ＰＣＲ増幅断片を精製し、末端をＴ４ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（タカラバイオ社製）によりリン酸化後、ｐＵＣ１１８ベクター（制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断し、切断面を脱リン酸化処理したもの）にライゲーションした。ライゲーションは、ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）を用いて行った。ライゲーション溶液を大腸菌ＤＨ５αのコンピテント細胞（タカラバイオ社製）に形質転換し、抗生物質アンピシリンを５０μｇ／ｍＬを含むＬＢプレートに蒔いて一晩培養した。生育したコロニーについて、ミニプレップでプラスミドＤＮＡを回収し、制限酵素ＳａｌＩ及びＮｏｔＩで切断し、ゼノプス・レービス由来のｌｄｈ遺伝子が挿入されているプラスミドを選抜した。これら一連の操作は、全て付属のプロトコールに従った。

上記ゼノプス・レービス由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が挿入されたｐＵＣ１１８ベクターを制限酵素ＳａｌＩ及びＮｏｔＩで切断し、ＤＮＡ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、定法に従いゼノプス・レービス由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子を含む断片を精製した。得られたＬ−ｌｄｈ遺伝子を含む断片を、図５に示す発現ベクターｐＴＲＳ１１のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断部位にライゲーションし、上記と同様な方法でプラスミドＤＮＡを回収し、制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで切断することにより、ゼノプス・レービス由来のｌｄｈ遺伝子が挿入された発現ベクターを選抜した。以後、このようにして作製したゼノプス・レービス由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子を組み込んだ発現ベクターをｐＴＲＳ１０２とする。

このｐＴＲＳ１０２を増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号４，５）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、ゼノプス・レービス由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子及びＴＤＨ３ターミネーター配列を含む１．３ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。ここで、配列番号４は、ＰＤＣ１遺伝子の開始コドンから上流６０ｂｐに相当する配列が付加されるようデザインした。

次に、プラスミドｐＲＳ４２４を増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号６，７）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、酵母選択マーカーであるＴＲＰ１遺伝子を含む１．２ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。ここで、配列番号７は、ＰＤＣ１遺伝子の終始コドンから下流６０ｂｐに相当する配列が付加されるようデザインした。

それぞれのＤＮＡ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製した。ここで得られた各１．３ｋｂ断片、１．２ｋｂ断片を混合したものを増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号４，７）をプライマーセットとしたＰＣＲ法によって、５末端・３末端にそれぞれＰＤＣ１遺伝子の上流・下流６０ｂｐに相当する配列が付加された、ゼノプス・レービス由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子、ＴＤＨ３ターミネーター及びＴＲＰ１遺伝子が連結された約２．５ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。

上記のＰＣＲ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製後、酵母サッカロミセス・セレビセＮＢＲＣ１０５０５株に形質転換し、トリプトファン非添加培地で培養することにより、ゼノプス・レービス由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が染色体上のＰＤＣ１遺伝子プロモーターの下流に導入されている形質転換株を選択した。

上記のようにして得られた形質転換株が、ゼノプス・レービス由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が染色体上のＰＤＣ１遺伝子プロモーターの下流に導入されている酵母であることの確認は下記のように行った。まず、形質転換株のゲノムＤＮＡをゲノムＤＮＡ抽出キット「Ｇｅｎとるくん」（登録商標）（タカラバイオ社製）により調製し、これを増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号８，９）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、約２．８ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られることで確認した。なお、非形質転換株では、上記ＰＣＲによって約２．１ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られる。以下、上記ゼノプス・レービス由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が染色体上のＰＤＣ１遺伝子プロモーターの下流に導入された形質転換株を、Ｂ２株とする。なお、ＰＤＣ１遺伝子の上流及び下流配列は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（URL:http://www.yeastgenome.org/）より取得することができる。

次に、国際公開ＷＯ２００７／０９７２６０号パンフレットに記載されている、ｐｄｃ１遺伝子がＴＲＰ１マーカーと置換され、かつ、ｐｄｃ５遺伝子に温度感受性変異を有する酵母ＳＷ０１５株と上記得られたＢ２株とを接合させ２倍体細胞を得た。該２倍体細胞を子嚢形成培地で子嚢形成させた。マイクロマニピュレーターで子嚢を解剖し、それぞれの一倍体細胞を取得し、それぞれ一倍体細胞の栄養要求性を調べた。取得した一倍体細胞の中から、ｐｄｃ１遺伝子座にゼノプス・レービス由来のｌｄｈ遺伝子が挿入され、かつ、ｐｄｃ５遺伝子に温度感受性変異を有する（３４℃で生育不能）株を選択した。得られた酵母株をＳＵ０１４株とした。

また、ＳＵ０１４株が乳酸生産能力を持つかどうかは、ＳＣ培地（ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＹＥＡＳＴ ＧＥＮＥＴＩＣＳ ２０００ ＥＤＩＴＩＯＮ、 ＣＳＨＬ ＰＲＥＳＳ）で形質転換細胞を培養した培養上清に乳酸が含まれていることを下記に示す条件でＨＰＬＣ法により測定することで確認した。
カラム：Ｓｈｉｍ−Ｐａｃｋ ＳＰＲ−Ｈ（島津社製）
移動相：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸、２０ｍＭ ビストリス、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：電気伝導度
温度：４５℃。

また、Ｌ−乳酸の光学純度測定は、以下の条件でＨＰＬＣ法により測定した。
カラム：ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｅｎａｎｔｉｏ ＬI（東ソー社製）
移動相：１ｍＭ 硫酸銅水溶液
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出方法：ＵＶ２５４ｎｍ
温度：３０℃。

なお、Ｌ−乳酸の光学純度は次式で計算される。
光学純度（％）＝１００×（Ｌ−Ｄ）／（Ｌ＋Ｄ）
ここで、ＬはＬ−乳酸の濃度、ＤはＤ−乳酸の濃度を表す。

ＨＰＬＣ分析の結果、Ｌ−乳酸が検出され、Ｄ−乳酸は検出限界以下であった。以上の検討により、このＳＵ０１４株がＬ−乳酸生産能力を持つことを確認した。

（参考例２）多孔性平膜の作製
樹脂としてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）樹脂を、また溶媒としてＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）をそれぞれ用い、これらを９０℃の温度下に十分に攪拌し、次の組成の原液を得た。
・ＰＶＤＦ：１３．０重量％
・ＤＭＡｃ：８７．０重量％。

次に、上記原液を２５℃の温度に冷却した後、あらかじめガラス板上に貼り付けておいた、密度が０．４８ｇ／ｃｍ³で、厚みが２２０μｍのポリエステル繊維製不織布（多孔質基材）に塗布し、直ちに次の組成を有する２５℃の温度の凝固浴中に５分間浸漬して、多孔質基材に多孔質樹脂層が形成された多孔質性膜を得た。
・水：３０．０重量％
・ＤＭＡｃ：７０．０重量％。

この多孔質性膜をガラス板から剥がした後、８０℃の温度の熱水に３回浸漬してＤＭＡｃを洗い出し、分離膜（多孔性膜）を得た。多孔質樹脂層表面の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内を、倍率１０，０００倍で走査型電子顕微鏡観察を行ったところ、観察できる細孔すべての直径の平均は０．１μｍであった。次に、上記の分離膜について純水透過係数を評価したところ、５０×１０^-9ｍ³／ｍ²・ｓ・Ｐａであった。純水透水量の測定は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。また、細孔径の標準偏差 は０．０３５μｍで、膜表面粗さは０．０６μｍであった。

（実施例１）
参考例１で作製したＳＵ０１４株を用い、図２に示す連続培養装置により連続培養を行い、Ｌ−乳酸を製造した。なお、培地には原料糖培地（６０ｇ／Ｌ 優糖精（ムソー株式会社製）、１．５ｇ／Ｌ 硫酸アンモニウム）を用いた。この原料糖培地を１２１℃の温度で１５分間、高圧（２気圧）蒸気滅菌処理して用いた。分離膜エレメント部材としては、ステンレス、及びポリサルホン樹脂の成型品を用い、分離膜としては参考例２で作製した多孔性平膜を用いた。送液ライン１７内のポンプ５にはダイヤフラム式ポンプ“APLS-20”（タクミナ社）を使用し、膜分離槽から透過液を抜き出すためのポンプ４にはペリスタポンプを使用した。さらに、実施例における運転条件は、下記のとおりとした。

培養槽容量：２０（Ｌ）
使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜（参考例２で作製）
膜分離槽容量：５（Ｌ）
膜分離エレメント有効濾過面積：４０００ｃｍ^２
温度調整：３２（℃）
培養槽通気量：空気１（Ｌ／ｍｉｎ）
培養槽攪拌速度：１００（ｒｐｍ） ｐＨ調整：８Ｎ 水酸化カルシウムによりｐＨ５に調整
培地供給速度：培養槽内のレベルセンサ１２にて可変制御
滅菌：膜分離槽、培養槽および使用培地は総て１２１℃、０．２ＭＰａ、２０ｍｉｎの加圧蒸気滅菌
ポンプ４の流量：３Ｌ／ｈｒ
送液ライン１５、１７の最大内径：５０ｍｍ
ポンプ５の出力：５Ｌ／ｍｉｎ
送液ライン１５，１７の線流速：４．２ｃｍ／ｓｅｃ
濾過フラックス：０．１８０ｍ／ｄａｙ
回収率：非制御（１％以下）。

そして、前培養としては、ＳＵ０１４株を試験管で５ｍｌの原料糖培地で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を新鮮な原料糖培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃で振とう培養した（前々培養）。得られた培養液を新鮮な原料糖培地１０００ｍｌに植菌し、３０００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃で振とう培養した（前培養）。

この前培養液を、培養槽１および膜分離槽内の合計２０Ｌの原料糖培地に植菌し、培養槽内を付属の攪拌機によって攪拌し、通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、５０時間培養を行った後に、ポンプ４を稼働させ、Ｌ−乳酸を含む透過液を抜き出した。このとき、膜分離槽２へ流入する培養液の圧力を１日１回測定し、ゲージ圧が０．１ＭＰａになるようにバイパスライン２６に設けた流量制御手段２５（バタフライバルブ）を調整した。

２５０時間培養を行い、培養槽における酵母濁度、透過液中の生産物質である乳酸濃度、糖濃度を測定し、乳酸の対糖収率も算出した。その結果を図１０、表１に示す。なお、乳酸濃度は参考例１に示す方法で測定した。酵母濁度は、光度計により６００ｎｍの吸光にて測定した。また、乳酸の対糖収率とは、消費された糖重量に対する生産された乳酸重量の割合であり、下記の（式７）により算出する。

糖濃度の測定は、以下の条件でＨＰＬＣ法により測定した。
カラム：Ｌｕｎａ ＮＨ２ ２５０ｘ４．６ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）
移動相：水：アセトニトリル＝２５：７５
流速：０．６ｍｌ／ｍｉｎ
検出方法：ＲＩ（示差屈折計）
レスポンス：４
ポラリティー：＋
温度：３０℃。

（比較例１）
図９に示す連続培養装置を用いたこと以外は実施例１と同様にして連続培養を行い、酵母濁度、生産物質である乳酸濃度を測定した。なお、図９に示す装置は、バイパスライン２６、流量制御手段２５および膜分離槽バルブ開閉２７、２８が設けられていない点以外、図２に示す装置と同じ構成であった。

結果を図１１、表１に示す。また、連続培養中の膜分離槽へ供給する培養液の圧力を測定した結果を図１２に示す。

比較例１では膜分離槽へ供給する培養液の圧力を制御していなかったため、図１２に示すように、連続培養中に変動し培養開始から２５０時間で１ＭＰａ以上になった。また、酵母濁度および生産した乳酸濃度共に、実施例１より低く、乳酸の対糖収率は２５０時間の連続培養後で６３％であった。

以上のことから、バイパスライン２６およびそれに設けた流量制御手段２５により培養液の膜分離槽への流入を調整することによって、酵母の高密度培養、乳酸（化学品）濃度向上また乳酸の対糖収率の向上といった、予想し得ない効果を確認できた。

（実施例２）
実施例１で培養が終了した連続培養装置および培養液を使用し、循環ライン内の線流速が０．５、１．５、２．５ｃｍ／ｓｅｃになるようにそれぞれ２時間送液し配管内に沈殿し積層した菌体の量を測定した。その結果を図６に示す。ここから循環ライン内の培養液線速度を２．５ｃｍ／ｓｅｃ以上とすることで配管内に菌体が沈殿することなく培養液を循環することが可能であるといえる。

（実施例３）
ポンプ５の出力を１０Ｌ／ｍｉｎに変更した以外は実施例１と同様にして連続培養を行った。１００時間培養を行った後および２５０時間培養を行った後の培養槽における酵母濁度、透過液中の生産物質である乳酸濃度、糖濃度を測定し、乳酸の対糖収率も算出した。結果を表１に示す。

実施例３は実施例１に対して、若干、乳酸濃度、乳酸の対糖収率が低下した。これは循環流量（ポンプ５）を増加させることで、恐らく培養槽の液混合状態が変化したためと考えられる。

（比較例２）
図９に示す連続培養装置を用いたこと以外は実施例３と同様にして連続培養を行った。

比較例２では膜分離槽へ供給する培養液の圧力を制御していなかったため、連続培養中に膜分離槽内の圧力が増加して培養開始から７０時間で１ＭＰａ以上になり、更に運転を続けると膜分離槽から培養液が漏洩し始め、連続培養を実施可能とは言えない状態となった。

実施例３と比較例２からは、バイパスライン２６が無いと連続培養が実施可能ではなくなることがわかり、バイパスライン２６に設けた流量制御手段２５により培養液の膜分離槽への流入を調整することによって、連続培養を安定して実施できるといった効果があったといえる。

（実施例４）
図７に示す連続培養装置を用い、ポンプ５の出力を５Ｌ／ｍｉｎと、ポンプ１６の出力を１０Ｌ／ｍｉｎとした以外は実施例３と同様にして連続培養を行った。

１００時間培養を行った後および２５０時間培養を行った後の培養槽における酵母濁度、透過液中の生産物質である乳酸濃度、糖濃度を測定し、乳酸の対糖収率も算出した。結果を表１に示す。

その結果、実施例１に対して、ポンプ１６により循環流量を実施例３と同様に増加しても、培養槽への液の戻り流量をポンプ１６により制御することで、乳酸濃度、酵母濁度および乳酸の対糖収率ともに循環流量変更前の実施例１と同等の成績とすることができた。

（比較例３）
図１３に示す連続培養装置を用いたこと以外は実施例４と同様にして連続培養を行った。なお、図１３に示す装置は、バイパスライン２６、流量制御手段２５および膜分離槽バルブ２７、２８が設けられていない点以外、図７に示す装置と同じ構成であった。

比較例３では膜分離槽へ供給する培養液の圧力を制御していなかったため、連続培養中に増加し培養開始から７０時間で１ＭＰａ以上になり、更に運転を続けると膜分離槽から培養液が漏洩し始め、連続培養を実施可能とは言えない状態となった。

（実施例５）
図１４に示す連続培養装置を用いること以外は実施例３と同様にして連続培養を行った。なお、図１４に示す装置は、送液ライン１５を、培養槽１に貯留される培養液に浸漬する位置に開口した以外は図２に示す装置と同じ構成であった。

１００時間培養を行った後および２５０時間培養を行った後の培養槽における酵母濁度、透過液中の生産物質である乳酸濃度、糖濃度を測定し、乳酸の対糖収率も算出した。結果を表１に示す。

その結果、実施例１に対して、ポンプ５による循環流量を実施例３と同様に増加しても、培養槽への液の戻り位置を培養液に浸漬する位置に設置することで、乳酸濃度、酵母濁度および乳酸の対糖収率ともに循環流量変更前の実施例１と同等の成績とすることができた。

（比較例４）
図１５に示す連続培養装置を用いたこと以外は実施例５と同様にして連続培養を行った。なお、図１５に示す装置は、バイパスライン２６、流量制御手段２５および膜分離槽開閉バルブ２７、２８が設けられていない点以外は、図１４に示す装置と同じ構成であった。

比較例４では膜分離槽へ供給する培養液の圧力を制御していなかったため、連続培養中に増加し培養開始から７０時間で１ＭＰａ以上になり、更に運転を続けると膜分離槽から培養液が漏洩し始め、連続培養を実施可能とは言えない状態となった。

（実施例６）
図１６に示す連続培養装置を用い、流量計３０の値から回収率を算出して１.５％の回収率になるようにポンプ４による透過液取出流量を調節しながら連続培養を行い、かつ、２５０時間経過後も連続培養を継続した以外は、実施例１と同様にして連続培養を行った。なお、図１６に示す装置は、流量計３０を設置した以外は図２に示す装置と同じ構成であった。同時に、分離膜３に作用する膜間差圧を経時的に測定し、急激な膜間差圧の上昇から膜の閉塞時間を評価した。

図１７に測定した膜間差圧の推移を示す。運転開始から１０００時間に渡って膜間差圧が安定し、回収率１．５％での運転によって、長時間安定してＬ−乳酸を連続培養により製造することが可能であった。また、連続培養終了時に測定・算出した、培養槽における酵母濁度、透過液中の生産物質である乳酸濃度、糖濃度、乳酸の対糖収率の結果を、表２に示す。

（実施例７）
回収率を３．０％とした以外は実施例６と同様に連続培養をおこなった。

図１７に測定した膜間差圧の推移を示す。運転開始から８００時間に渡って膜間差圧が安定し、回収率３．０％での運転でも、長時間安定してＬ−乳酸を連続培養により製造することが可能であった。また、連続培養終了時に測定・算出した、培養槽における酵母濁度、透過液中の生産物質である乳酸濃度、糖濃度、乳酸の対糖収率の結果を、表２に示す。

（実施例８）
回収率を９．９％に変更した以外は実施例６と同様に連続培養を行った。

図１７に測定した膜間差圧の推移を示す。運転開始から５５０時間に渡って膜間差圧が安定し、回収率９．９％においても、安定してＬ−乳酸を連続培養により製造することが可能であった。また、連続培養終了時に測定・算出した、培養槽における酵母濁度、透過液中の生産物質である乳酸濃度、糖濃度、乳酸の対糖収率の結果を、表２に示す。

（実施例９）
回収率を１２．０％に変更した以外は実施例６と同様に連続培養を行った。

図１７に測定した膜間差圧の推移を示す。運転開始から１００時間で膜間差圧が急上昇し膜の細孔が閉塞した。また、連続培養終了時に測定・算出した、培養槽における酵母濁度、透過液中の生産物質である乳酸濃度、糖濃度、乳酸の対糖収率の結果を、表２に示す。１００時間連続培養を行った後の培養槽における乳酸濃度は４５ｇ／Ｌであった。また、酵母濁度は、ＯＤ６００が１００まで増加し、乳酸の対糖収率は８０％であった。

しかしながら、ろ過が困難な状態となり、１００時間を超えてＬ−乳酸の連続培養による製造を継続することは困難であった。

以上、実施例６〜９の結果から、回収率を１０％以下になるように調節し連続培養運転を行うことで、長時間（５００時間以上）の連続培養運転を行うことができるといった予想できない顕著な効果を確認できた。

（実施例１０）
特開２００４−２２２５６９号公報に記載のコリネバクテリウム・グルタミカムＴＲ−ＣＡＤ１株を用い、図２に示す連続培養装置により連続培養を行い、カダベリンを製造した。なお、培地には表３に示す組成のカダベリン生産培地を用いた。このカダベリン生産培地を１２１℃の温度で１５分間、高圧（２気圧）蒸気滅菌処理して用いた。分離膜エレメント部材としては、ステンレス、及びポリサルホン樹脂の成型品を用い、分離膜としては参考例２で作製した多孔性平膜を用いた。また、送液ライン１７内のポンプ５にはダイヤフラム式ポンプ“APLS-20”（タクミナ社）を使用し、膜分離槽から透過液を抜き出すためのポンプ４にはペリスタポンプを使用した。

さらに実施例における条件は下記のとおりとした。

培養槽容量：２０（Ｌ）
使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜（参考例２で作製）
膜分離槽容量：５（Ｌ）
膜分離エレメント有効濾過面積：４０００ｃｍ^２
温度調整：３０（℃）
培養槽通気量：空気３（Ｌ／ｍｉｎ）
培養槽攪拌速度：１００（ｒｐｍ）ｐＨ調整：３Ｍ ＨＣｌおよび３Ｍ アンモニア水によりｐＨ７．０に調整
培地供給速度：培養装置内の液面レベルセンサにて可変制御
滅菌：膜分離槽、培養槽および使用培地は総て１２１℃、０．２ＭＰａ、２０ｍｉｎの加圧蒸気滅菌
ポンプ４の流量：３Ｌ／ｈｒ
送液ライン１５、１７の最大内径：５０ｍｍ
ポンプ５の出力：５Ｌ／ｍｉｎ
送液ライン１５，１７の線流速：４．２ｃｍ／ｓｅｃ
濾過フラックス：０．１８０ｍ／ｄａｙ
回収率：非制御（１％以下）。

そして、前培養としては、ＴＲ−ＣＡＤ１株を、試験管で、５ｍｌのカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を添加したカダベリン生産培地で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を、新鮮なカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を添加したカダベリン生産培地５０ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃の温度で、振幅３０ｃｍで、１８０ｒｐｍの条件下で培養を行った（前々培養）。得られた培養液を新鮮なカダベリン生産培地１０００ｍｌに植菌し、３０００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃で振とう培養した（前培養）。この前培養液を、培養槽１および膜分離槽２内の合計２０Ｌのカダベリン生産培地に植菌し、培養槽内を付属の攪拌機によって攪拌し、通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、５０時間培養を行った後に、ポンプ４を稼働させ、カダベリンを含む透過液を抜き出した。

このとき、膜分離槽２へ流入する培養液の圧力を１日１回測定し、ゲージ圧が０．１ＭＰａになるようにバイパスライン２６に設けた流量制御手段２５（バタフライバルブ）を調整した。

２５０時間培養を行い、培養槽における酵母濁度、透過液中の生産物質であるカダベリン濃度、糖濃度を測定し、カダベリンの対糖収率も算出した。その結果を図１８、表４に示す。カダベリン濃度は３．５ｇ／Ｌであった。また、コリネバクテリウム濁度は、光度計により６００ｎｍの吸光にて測定した。カダベリンの対糖収率は３％であった。

なお、カダベリン濃度は、以下の方法で測定した。
[カダベリン濃度のＨＰＬＣによる分析方法]
・使用カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８（資生堂）
・移動相：０．１％（ｗ／ｗ）リン酸水溶液：アセトニトリル＝４．５：５．５
・検出：ＵＶ３６０ｎｍ
・サンプル前処理：分析サンプル２５μｌに内標として、１，４−ジアミノブタン（０．０３Ｍ）を２５μｌ、炭酸水素ナトリウム（０．０７５Ｍ）を１５０μｌおよび２，４−ジニトロフルオロベンゼン（０．２Ｍ）のエタノール溶液を添加混合し、３７℃の温度で１時間保温する。

上記の反応溶液５０μｌを１ｍｌアセトニトリルに溶解後、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心した後の上清１０μｌをＨＰＬＣ分析した。

（比較例５）
図９に示す装置を用いたこと以外は実施例１０と同様にして連続培養を行い、コリネバクテリウム濁度、生産物質であるカダベリン濃度を測定した。なお、図９に示す装置は、バイパスライン２６、流量制御手段２５および膜分離槽バルブ開閉２７、２８が設けられていない点以外、図２に示す装置と同じ構成であった。

結果を図１９、表４に示す。また、連続培養中の膜分離槽へ供給する培養液の圧力を測定した結果を図２０に示す。

比較例５では膜分離槽へ供給する培養液の圧力を制御していなかったため、図２０に示すように、連続培養中に変動し培養開始から２２５時間で１ＭＰａ以上になった。また、コリネバクテリウム濁度、カダベリン濃度共に実施例１０より低くなった。また、カダベリンの対糖収率は１．０％であった。

以上のことからバイパスライン２６およびそれに設けた流量制御手段２５により培養液の膜分離槽への流入を調整することによって、コリネバクテリウムの高密度培養、カダベリン（化学品）濃度向上またカダベリンの対糖収率の向上といった、予想し得ない効果を確認できた。

（実施例１１）
特開２００８−２１２１３８号公報に記載のコリネバクテリウム・グルタミカム ｄｅｌｔａ−ＨＯＭ株を用い、図２に示す連続培養装置により連続培養を行い、Ｌ−リジンを製造した。なお、培地には表５に示す組成のＬ−リジン生産培地を用いた。このＬ−リジン生産培地を１２１℃の温度で１５分間、高圧（２気圧）蒸気滅菌処理して用いた。分離膜エレメント部材としては、ステンレス、及びポリサルホン樹脂の成型品を用い、分離膜としては参考例２で作製した多孔性平膜を用いた。また、送液ライン１７内のポンプ５にはダイヤフラム式ポンプ“APLS-20”（タクミナ社）を使用し、膜分離槽から透過液を抜き出すためのポンプ４にはペリスタポンプを使用した。

さらに実施例における条件は下記のとおりとした。

培養槽容量：２０（Ｌ）
使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜（参考例２で作製）
膜分離装置液量：５（Ｌ）
膜分離エレメント有効濾過面積：４０００ｃｍ^２
温度調整：３０（℃）
培養槽通気量：空気５（Ｌ／ｍｉｎ）
培養槽攪拌速度：３００（ｒｐｍ）ｐＨ調整：３Ｍ ＨＣｌおよび３Ｍ アンモニア水によりｐＨ７．３に調整
培地供給速度：培養装置内の液面レベルセンサにて可変制御
滅菌：膜分離槽、培養槽および使用培地は総て１２１℃、０．２ＭＰａ、２０ｍｉｎの加圧蒸気滅菌
ポンプ４の流量：３Ｌ／ｈｒ
送液ライン１５、１７の最大内径：５０ｍｍ
ポンプ５の出力：５Ｌ／ｍｉｎ
送液ライン１５，１７の線流速：４．２ｃｍ／ｓｅｃ
濾過フラックス：０．１８０ｍ／ｄａｙ
回収率：非制御（１％以下）。

そして、前培養としては、ｄｅｌｔａ−ＨＯＭ株を、試験管で、５ｍｌのＢＹ培地（０．５％イーストエキストラクト、０．７％ミートエキストラクト、１％ペプトン、０．３％塩化ナトリウム）で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を、Ｌ−リジン生産培地５０ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃の温度で、振幅３０ｃｍで、１８０ｒｐｍの条件下で培養を行った（前々培養）。得られた培養液を新鮮なＬ−リジン生産培地１０００ｍｌに植菌し、３０００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃で振とう培養した（前培養）。この前培養液を、培養槽１および膜分離槽内の２０ＬのＬ−リジン生産培地に植菌し、培養槽内を付属の攪拌機によって攪拌し、通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、５０時間培養を行った後に、ポンプ４を稼働させ、Ｌ−リジンを含む透過液を抜き出した。

このとき、膜分離槽２へ流入する培養液の圧力を１日１回測定し、ゲージ圧が０．１ＭＰａになるようにバイパスライン２６に設けた流量制御手段２５（バタフライバルブ）を調整した。

２５０時間培養を行い、培養槽におけるコリネバクテリウム濁度、透過液中の生産物質であるＬ−リジン濃度、糖濃度を測定し、Ｌ−リジン濃度の対糖収率も算出した。その結果を図２１、表６に示す。Ｌ−リジン濃度は６．０ｇ／Ｌであった。また、コリネバクテリウム濁度は、光度計により６００ｎｍの吸光にて測定した。Ｌ−リジンの対糖収率は５.５％であった。なお、Ｌ−リジン濃度は、カダベリン濃度の測定法と同じ方法で測定した。

（比較例６）
図９に示す装置を用いたこと以外は実施例１１と同様にして連続培養を行い、コリネバクテリウム濁度、生産物質であるＬ−リジン濃度を測定した。なお、図９に示す装置は、バイパスライン２６、流量制御手段２５および膜分離槽バルブ開閉２７、２８が設けられていない点以外、図２に示す装置と同じ構成であった。

結果を図２２、表６に示す。また、連続培養中の膜分離槽へ供給する培養液の圧力を測定した結果を図２３に示す。

比較例６では膜分離槽へ供給する培養液の圧力を制御していなかったため、図２３に示すように、連続培養中に変動し培養開始から２２５時間で１ＭＰａ以上になった。また、コリネバクテリウム濁度、Ｌ−リジン濃度共に実施例１１より低くなった。また、Ｌ−リジンの対糖収率は１．１％であった。

以上のことからバイパスライン２６およびそれに設けた流量制御手段２５により培養液の膜分離槽への流入を調整することによって、コリネバクテリウムの高密度培養、Ｌ−リジン（化学品）濃度向上またＬ−リジンの対糖収率の向上といった、予想し得ない効果を確認できた。

本発明は、アルコール、有機酸、アミノ酸、核酸、酵素、抗生物質、組換えタンパク質など、微生物の培養によって得られる様々な化学品の生産に好適に適用することが可能である。

１．培養槽
２、２’．膜分離槽
３、３’．分離膜
４．ろ過ポンプ
５．ポンプ
６．培地供給ポンプ
７．攪拌軸
８．ガス供給ライン
９．ｐＨセンサ
１０．中和剤ポンプ
１１．温度調節器
１２．レベルセンサ
１３．大気圧開放部
１４Ａ．合流点
１４Ｂ．分岐点
１５．送液ライン（未濾過培養液の培養槽への戻し）
１６．ポンプ
１７．送液ライン
１８．支持板
１９．流路材
２０．分離膜
２１．凹部
２２．集液パイプ
２３．上部樹脂封止層
２４．下部樹脂封止層
２５．流量制御手段
２６．バイパスライン
２７、２７’．膜分離槽開閉バルブ（培地供給側）
２８、２８’．膜分離槽開閉バルブ（培地排出側）
２９．圧力計
３０．流量計

Claims (12)

1. 培養槽において微生物もしくは培養細胞を培養し、培養液を培養槽から膜分離槽へ送液して分離膜で濾過し、透過液から発酵生産物を化学品として回収するとともに、濾過されなかった未濾過培養液を、培養槽へ還流する化学品の製造方法であって、
   培養槽から送液される培養液の一部を、膜分離槽の培養液流入側圧力に応じて、膜分離槽を迂回させて培養槽、膜分離槽に送液される培養液または膜分離槽から培養槽へ還流される未濾過培養液に合流させ、
   培養槽から膜分離槽へ送液される培養液、膜分離槽から培養槽へ還流される未濾過培養液、ならびに膜分離槽を迂回して培養槽、膜分離槽に送液される培養液または膜分離槽から培養槽へ還流される未濾過培養液に合流する培養液の線流速が、いずれも２．５ｃｍ／ｓｅｃ以上である、化学品の製造方法。
2. 膜分離槽の培養液流入側のゲージ圧が１ＭＰａ以下となるように、膜分離槽を迂回させる培養液の流量を制御する、請求項１に記載の化学品の製造方法。
3. 未濾過培養液の一部を、培養槽内の培養液へ合流させるように還流するとともに、未濾過培養液の残部を、培養槽から膜分離槽までの間の培養液へ合流させるように還流する、請求項１または２に記載の化学品の製造方法。
4. 培養槽から膜分離槽までの間の培養液へ合流させるように還流する未濾過培養液の流量と、培養槽内の培養液へ合流させるように還流する未濾過培養液の流量とを、互いに独立して制御する、請求項３に記載の化学品の製造方法。
5. 培養槽から膜分離槽までの間の培養液へ合流させるように還流する未濾過培養液の流量に対する、培養槽内の培養液へ合流させるように還流する未濾過培養液の流量の比が１以下である、請求項３または４に記載の化学品の製造方法。
6. 膜分離槽へ流入する培養液量に対する分離膜からの透過液量の回収率が１０．０％以下になるように、膜分離槽へ流入する培養液量および／または分離膜からの透過液量を調節する、請求項１〜５のいずれかに記載の化学品の製造方法。
7. 膜分離槽における培養液体積に対する培養槽における培養液体積の比を４以上１００以下とする、請求項１〜６のいずれかに記載の化学品の製造方法。
8. 微生物もしくは培養細胞を培養するための培養槽と、培養槽から培養液中に生産された発酵生産物を回収するための分離膜を備えた膜分離槽と、培養槽と膜分離槽とを接続し、培養液を前記膜分離槽へ送液するとともに分離膜で濾過されなかった未濾過培養液を培養槽に還流する循環ラインと、循環ラインに設けられた培養液送液手段とを備えた連続培養装置であって、
   培養液が膜分離槽を迂回して培養槽または循環ラインに合流するためのバイパスラインと、膜分離槽の培養液流入側圧力の検知手段と、バイパスラインに設けられた流量制御手段とを有し、
   循環ラインが培養槽に貯留される培養液に浸漬する位置に開口してなる、連続培養装置。
9. 流量制御手段が、検知手段の結果に連動して作動するものである、請求項８に記載の連続培養装置。
10. 循環ラインの線流速検知手段を備え、流量制御手段および／または記培養液送液手段が該線流速検知手段の結果に応じて作動するものである、請求項８または９に記載の連続培養装置。
11. 膜分離槽が、前記培養液送液手段とは別の送液手段を有する、培養槽とは独立している循環回路内に備えられている、請求項８〜１０のいずれかに記載の連続培養装置。
12. 膜分離槽体積に対する培養槽体積の比が４以上１００以下である、請求項８〜１１のいずれかに記載の連続培養装置。

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