DE3005605A1

DE3005605A1 - Verfahren und vorrichtung zur abtrennung von wirkstoffen aus einer zellsuspension

Info

Publication number: DE3005605A1
Application number: DE19803005605
Authority: DE
Inventors: Helge Dr. 3400 Göttingen Böhnel; Horst S.H. Prof. Dr. 3406 Bovenden Seifert
Original assignee: Sartorius AG
Current assignee: Seifert Horst Prof Dr Boehnel Helge Dr 340
Priority date: 1980-02-15
Filing date: 1980-02-15
Publication date: 1981-10-01
Also published as: DE3005605C2

Description

Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Abtrennung von Wirkstoffen aus einer Zellsuspension.
Pathogene Clostridia sind die Ursache für den Gasoedem- und Enterotoxaemiekomplex bei Rindern, Schafen und Ziegen, insbesondere in d-en Tropen und Subtropen. Die Seuchen, verursacht von einer Gruppe pathogener Erreger, sind der Grund für erhebliche Verluste hauptsächlich unter abgesetzten Jungtieren, aber auch bei Tieren, die zur Mast intensiv gehalten werden.
Das Seuchengeschehen wird bestimmt durch ein komplexes System von Endo- und Exotoxinen, die die Erreger entweder im Darmkanal oder in der Muskulatur der erkrankten Tiere produzieren. Das Molekulargewicht dieser Toxine kann grob zwischen.
20 und 100 000 eingruppiert werden.
Die Bekämpfung der von Clostridia hervorgerufenen Bodenseucnen ist im Prinzip seit langer Zeit technisch gelöst. Als Antigen für Schutzimpfungen fand bisher ein Gemisch aus mit Formalin abgetöteten Erregern und ausgefällten Anatoxinen der Erreger Verwendung. Die gebräuchlichen Impfstoffe hatten bzw. haben nur eine relativ beschränkte Wirksamkeit, deshalb müssen Impfungen der gefährdeten Tiere in jährlichen Intervallen erfolgen, da sonst der von dem offenbar schwachen Antigen produzierte aktive Immunschutz keine ausreichende Protektion gewährt. Insbesondere auf dem Höhepunkt der Trockenzeit, wenn die Infektion für die Tiere in den Tropen besonders groß und ihr Abwehrsystem aufgrund des Futtermangels geschwächt ist, läßt die Schutzwirkung gebräuchlicher Vakzinen zu wünschen übrig.
Die Ursache dafür kann gesucht werden in - ungenügender Spezifität - ungenügender Antigenität.
Da die Erreger über ihre Toxine pathogen wirken und erst - so beim C.perfringens-Komplex - unter besonderen Lebensbedingungen im Organismus Toxine produzieren, ist es nicht die Infektion, sondern die Toxinwirkung, gegen die der Organismus geschützt werden muß. D. h. über ein Anatoxin möglichst hoher Wirksamkeit muß versucht werden, den Organismus zur Bildung eines möglichst lang persistierenden Titers von Antitoxinen d-nzuregen.
Über die Natur der von der Gruppe pathogener Clostridia gebildeten Toxine und ihre das Immunsystem stimulierenden Anatoxine ist relativ wenig.
bekannt. Man weiß, welches Toxin welche pathogene Wirkung auslöst, so z. B. Histolyse oder Haemolyse, welche Toxine bzw. Toxiinfraktionen am besten immunisieren ist Spekulation. Es konnte jedoch festgestellt werden, daß bei der üblichen Toxinproduktion es rasch zu einem Abbau, zumindestens -der im Tierversuch nachweisbaren Letal-Toxine kommt, wenn der Nährboden länger ats bis zum Zeitpunkt der maximalen- Toxinproduktion bebrütet wird.
Unter den relativ bescheidenen Arbeitsbedingungen von Vakzine-Labors in Entwicklungsländern ist das der Regelfall. Sowohl Temperatur als auch pH scheinen die Toxinaktivität zu beeinträchtigen.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, mit einfachen Mitteln ein Verfahren und eine dazugehörige Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens zu schaffen, welches bzw. die es ermöglicht aus einer Zellsuspension z. B. aus einer Bakteriensuspension eines für einen im gefährdeten Seuchengebiet speziellen Krankheitserreger einen sofort verwendbares Antigen zur Vakzineherstellung abzutrennen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die Wirkstoffe aus der Zellsuspension kontinuierlich unmittelbar durch Membranfiltration abgetrennt und die als Filtrat gewonnene Wirkstoffsuspension in einer Ultrafiltrations-Stufe kontinuierlich durch Abtrennen der Trägerflüssigkeit bis zum gewünschten Konzentrationsgrad aufkonzentriert und die wirkstofffreie Trägerflüssigkeit wieder der Zellsuspension zurückgeführt wird.
Vorteilhafterweise wird das in der Membranfiltrations-Stufe kontinuierlich anfallende Zell konzentrat zur weiteren Vermehrung in die Zellsuspension zurückgeführt.
Durch Weiterbehandlung des Wirkstoffkonzentrates in weiteren Filtrationsstufen können die verschiedenen Wirkstoffe des Wirkstoffkonzentrats entsprechend ihrem Molekulargewicht fraktioniert und damit isoliert werden.
Die Vorrichtung zur Herstellung von Vakzinen durch Abtrennen der Wirkstoffe aus einer Zellsuspension ist gebildet durch einen die Zellsuspension aufnehmenden Fermenter, dess-en Auslaßseite mittels eines Zwangsumlaufes an ein Membranfiltrationsgerät angeschlossen ist, dessen Membranfilter eine die Wirkstoff: unmittelbar durchlassende und abtrennende Porengröße aufweist, wobei die Auslaßseite'für das Zellkonzentrat zu dessen Rückführung an den Einlaß des Fermenter angeschlossen ist. Die Filtratauslaßseite des Membranfiltrationsgerätes ist an die Einlaßseite mindestens eines, die Trägerflüssigkeit dessWirkstofffiltrats der ersten Filtrationsstüfe durchlassenden Ultrafilters angeschlossen, wobei die AuslaB-seite des Ultrafilters zur Abgabe des aufkonzentrierten Wirkstoffes an ein Auffang- und Sammelgerät und die Filtratseite des Ultrafilters on den Fermentereinlaß angeschlossen ist.
Für im kontinuierlichen Betrieb über einen längeren Zeitraum sind das Membranfiltrationsgerät und der Ultrafilter in einem geschlossenen Kreislauf an den Fermenter angeschlossen. Zur Steuerung des Konzentrationsgrades ist in die von der Konzentratauslaßseite des Ultrafilters zum Auffang- und Sammelgefäß führende Leitung ein Drossel- und Absperrventil ein.geschaltet und um im kontinuierlichen Betrieb den Aufbau eines Filterkuchens im Membranfiltrationsgerät und auch im Ultrafilter zu beseitigen, ist vorzugsweise die Konzentratauslaßseite des jeweiligen Filters durch eine absperrbare Bypassleituns oder direkt an die Rücklaufleitung zum Fermenter angeschlossen, so daß sich auf diese Weise die Filtermembranen des Membranfiltrationsgerätes und des Ultrafilters im freien Durchlauf freispülen lass-en.
Die Vorteile dieses Verfahrens und der Vorrichtung sind darin zu sehen, daß - kontinuierlich tage- oder sogar wochenlang kontaminationsfrei im geschlossenen System Vakzine produziert wird, - alle Toxinfraktionen in statu nascendi als mittlere Fraktion der Ultrafiltrationskaskade sofort abgezogen, kühl gelagert und dann verarbeitet werden können, - eine Aufkonzentration der relevanten Toxinfraktion um mindestens das Hundertfache erreicht wird, - der Gesamttoxinkomplex ggf. durch Zwischenschaltung einer weiteren Ultrafiltrationskaskade in -Fraktionen unterschledlichen Molekulargewichts weiter getrennt werden kann.
Damit gelingt es, mit einem minimalen Aufwand an Nährboden eine maximale Menge der als Antigen relevanten Toxine zu gewin-nen und diese sofort zu stabilisieren. Der daraus gewonnene Impfstoff würde im Volumen in jedem Falle unter 1 ccm Dosis/ Tier liegen, dabei an Wirksamkeit die bisherigen Vakzine weit übertreffen und den Vorteil besitzen, fast frei von Abbauprodukten des Nährbodens zu sein, die, wie -die Erfahrung zeigt, nicht nur zu Allergien, sondern zu seuchenhaften anaphylaktischem Schock mit tödlichem Ausgang führen können.
Die Herstellung einer solchen Vakzine verursacht für das Lang in dem sie produziert wird, geringe Kosten,braucht geringe Lager- und Transportkapazität und gibt die Möglichkeit, die Impffrequenz bei den Tieren von einmal Jährlich auf eine doppelt Bessterimpfung bei Absatzkälbern zu reduzieren, die den Tieren einen lebenslangen Schutz verleiht.
Der Erfindungsgedenke, der verschiedene Ausführungsmöglichkeiten zuläßt ist schmelzisch in einer Schaltungszeichnung für die Vorrithtung erläutert. l Die Vorrichtung weist einen einfachen Fermenter 1 bestehend aus einem Behälter 2 mit einem auf Bebrötungstemperatur aufheizbaren Wasserbad 3 auf, in welches das Reaktionsgefäß 4 zur Aufnahme der Zellsuspension 5 eintaucht. Der Einlaß 7 des Reaktionsgefäßes 4 ist dadurch einen Deckel steril verschlossen der von den verschiedenen Leitungen durchstoßen wird. Zur Vermeidung einer Kritischen Abdichtung. im Bereich der Rührwelle it vorzugsweise ein Magnetrührer vorgesehen, dessen Antrieb außerhalb und deseen angetriebenes Rührwerk innerhalb des Reaktionsgefäßes 4 angeordnet ist. Außerdem ist das Reaktionsgefäß 4 mit einer sterilen Entlüftung 8 über ein Sicherheitsgefäß 41 versehen, die den Druckausgleich zwischen innen und außen ermöglicht. Über eine Nährlösungsleitung 9 ist das Reaktiongefäß 4 unter Zwischenschaltung eines Dosierventiles V4 mit einem Vorratsbehälter 10 für die Nährlösung 12 verbunden. Dieser ist ebenfalls verschlossen und mit einer sterilen Belüftung 11 versehen.
Der im Bodenbereich des Reaktionsgefäßes 4 endende Auslaß 13 des Fermenter 1 führt über eine Pumpe 14 mit der Leitung 15 in die Filtereinlaßkammer 19 des Membranfiltrationsgerätes 16, dessen Membran 17 eine die Wirkstoffe mit Trägerflüssigkeit unmittelbar durchlasse-nde und abtrennende Porengröße aufweist. Die Wirkstoffe und Trägerflüssigkeit passieren also die Membranen 17 in Richtung der Filtratkammer 20.
Das in der Filtereinlaßkammer 19 aufkonzentrierte Zell konzentrat verläßt diese durch den Auslaß 18 über die Leitung 21 unter Zwischenschaltung eines Druckregulierventils V1 in Richtung auf den Einlaß 7 des Reaktionsgefäßes 4 und wird in die Zellsuspension 5 wieder einbezogen.
Die Filtratkammer 20 ist über die Filtratleitung 22 an d)e Einlaßkammer 24 des Ultrafilters 23 angeschlossen. Die Ultrafiltrationsmembrane 25 des Ultrafilters 23 hat eine die Wirkstoffe zurü.ckhaltende Porengröße, so daß lediglich die Trägerflüssigkeit die Ultrafiltrationsmembrane 25 passiert und das Wirkstoffiltrat des Membranfilrationsgerätes 16 in der Einlaßkammer 24 des Ultrafilters 23 bis zum gewünschten Konzentrationsgrad aufkonzentriert wird, so daß der Wirkstoff durch den Auslaß 26, über die Leitung 27 und das Drosselventil V2 und die Leitung 28 direkt in ein gekühltes Auffang- und Sammelgefäß 29- geführt wird, in welchem es als Wirkstoffkonzentrat 30 zur weiteren Verwendung zur Verfügung steht. Das Auffang- und Sammelgefäß 29 ist ebenfalls steril verschlossen und mit einer Sterilbelüftung versehen. Mit dsm Drosselventil V2 läßt sich der für die gewünschte Konzentration notwendige Druck in der Einlaßkammer 24 aufbauen.
Die die Ultrafiltrationsmembrane 25 passierende Trägerflüssigkeit des Wirkstoffiltrats wird aus der Kammer 32 über die Leitung 33 und 34 in den Einlaß 7 des Reaktionsgefäßes 4 zurückgeführt und steht ebenfalls der Zellsuspension 5 erneut zur Verfügung.
Während der kontinuierlichen Filtration baut sich in den Einlaßkammern 19 und 24 auf den Membranen 17 und 25 eine Art Filterkuchen auf, der die Wirksamkeit der Filter beeinträchtigt. Durch eine Bypassleitung 27 35 läßt sich jedoch, wie für den Ultrafilter 23 beispielhaft gezeigt, die Ultrafiltrationsmembrane 25 durch das Wirkstofffiltrat aus der Filtrationskammer 20 freispülen.
Zu diesem Zweck wird das Drosselventil V2 gesperrt und die Leitung 35 über das Ventil V3 mit der Leitung 34 verbunden, so daß der Filterkuchen auf einfache Weise von der Ultrafiltrationsmembrane 25 entfernt und deren Poren dadurch wieder.freigespült werden. Eine entsprechend wirksame Leitung ist für das Membranfiltrationsgerät 16 durch die Rücklaufleitung 21 und das einstellbare Druckregulierventil V1 vorhanden. Die vereinfacht dargestellte Filtrationseinheiten 16 und 23 sind mehrschichtig aufgebaut bzw. mehrere Filter können in Reihe geschaltet sein.
Weiterhin ist es möglich, daß das im Auffang- und Sammelgefäß 29 enthaltene Wirkstoffkonzentrat in weiteren Stufen aufgetrennt und zwar nach bestimmten Wirkstoffkomponenten fraktioniert wird. Dies ist durch die Wahl entsprechender Filter mit entsprechend abgestufter Porengröße möglich.
Des weiteren ist das Reaktionsgefäß 4 zur Erzeugung geeigneter atmosphärischer Bedingingen bei Bedarf mit einer regulierbaren GasQuelle 36 mit Sterilfilter 39 verbindbar.
Das Reaktionsgefäß 4 ist mittels in die Zellsuspension 5 eintauchender Meßsonden 40 über ein pH-Meter 37 und eine automa,tische Niveauregelung 42 mit Grenzwertschaltern elektronisch verbunden und strömungsmäßig an Behälter 38 und 10 mit Puffer- -und Nährlösung über elektronisch gesteuerte Magnetventile V4, V5 angeschlossen, wobei der Reaktionsraum eine Gaszuführung aus dem'Behälter 36 und eine Gasabführung in den Sicherheitsbehälter 41 mit Sterilbelüftung 8 aufweist.
Für C.chauvoei und ihm nahestehende, von der Abteilung für Tierhygiene in den Tropen und Subtropen der Universität Göttingen in Madagaskar und Peru isolierte Clostridien der Gasoedemgruppe, die bisher taxonomisch nicht erfaßt sind, wird folgende Filterkombination gewählt: Für das Membranfiltrationsgerät 16 ein Membranfilter mit einer Porengröße von etwa 0,2 um und für den Ultrafilter 23 eine asymmetrische Ultrafiltrationsmembrane, die eine nominelle Trenngrenze, angegeben in Molekulargewicht, von etwa 20 000 hat.
Die im Fermenter 1 angesetzte 8akteriensuspension wird über ca. 4 Stunden bei 370C vorbebrütet.
Im darauffolgenden Filtrationsverfahren erfolgt im Membranfiltrationsgerät 16 die Abtrennung der Mikroorganismen und deren Rückführung als Konzentrat über die Leitung 21 in das Reaktionsgefäß 4. Das sterile und bakterienfreie Filtrat gelangt in den Ultrafilter, in welchem es-eine Aufkonzentrierung von 50 - 80 : 1 erhält und im gekühlten Auffang- und Sammelgefäß 29 als Toxinkonzentrat zur Verfügung steht.
Der Gegenstand der Erfindung kann durch Wahl entsprechender Filter auch zur Produktion von Toxinen tAnatoxinen) zur Impfstoffherstellung gegen andere anaerobe Infektionen der Haustiere sowie gegen Tetanus, Gasbrand und gegebenenfalls wagen die Botulismus-Vergiftungen des Menschen Verwendung finden.
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Claims

Verfahren und Vorrichtung zur Abtrennung von Wirkstoffen aus einer Zellsuspension Patentansprüche: 1. Verfahren zur Abtrennung von Wirkstoffen aus einer Zellsuspension, dadurch gekennzeichnet, daß - die Wirkstoffe aus der Zellsuspension kontinuierlich unmittelbar durch Membranfiltration abgetrennt und - die als Filtrat gewonnene Wirkstoffsuspension in einer Ultrafiltrations-Stufe kontinuierlich durch Abtrennen der Trägerflüssigkeit bis zum gewünschten Konzentrationsgrad aufkonzentriert und - die wirkstofffreie Trägerflüssigkeit wieder der Zellsuspension zugeführt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das in der Membranfiltrati-onsstufe kontinuierlich anfallende Zellkonzentrat in die Zellsuspension zurückgefuhrt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Wirkstoffkonzentrat in einer weiteres Behandlungsstufe nach Molekulargewicht fraktioniert wird.
4. Vorrichtung zum Abtrennen von Wirkstoffen aus einer Zellsuspension, dadurch gekennzeichnet, daß - ein die Zellsuspension (5) aufnehmender Fermenter t4) vorgesehen ist, dessen Auslaßseite (13) mittels eines Zwangsumlaufes (14) an ein Membranfiltrationsgerät (16) angeschlossen ist, dessen Membranfilter (17) eine die Wirkstoffe mit Trägerflüssigkeit unmittelbar durchlassende und abtrennende Porengröße aufweist, - die Auslaßseite (18) für das Zellkonzentrat zu dessen Rückführung an den Einlaß (7) des Fermenters (1) mittels einer absperrbaren Leitung (21, V1) angeschlossen ist, - die Filtratauslaßseite (22) des .Membranfiltrationsgerätes t16) an die Einlaßseite (24) mindestens eines, die Trägerflüssigkeit des Wirkstofffiltrats der ersten Filtrationsstufe (16) durchlassenden Ultrafilters (23) angeschlossen ist, - die Auslaßseite t26) des Ultrafilters (23) zur Abgabe des aufkonzentrierten Wirkstoffes an ein Auffang- und Sammelgefäß (29) angeschlossen, und die Filtratseite (32) des Ultrafilters (23) an den Fermentereinlaß t7) angeschlossen ist.
5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Membranfiltrationsvorrichtung und der Ultrafilter (16 und 23) in einem geschlossenen Kreislauf an den Fermenter [1) angeschlossen sind 6.
Vorrichtung nach Anspruch 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß in die von der Konzentratauslaßseite (26) des Ultrafilters (23) zum Auffang- und Sammelgefäß (29) führende Leitung (27) ein Drossel- und Absperrventil (V 2) eingeschaltet ist.
.7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentratauslaßseite (26) des Ultrafilters (23) durch eine absperrbare Bypassleitung (27, 35) zwecks einer Reinigungsspülung an die Rücklaufleitung (34) zum Fermenter (1) angeschlossen ist.
8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsgefäß (4) mit einer regulierbaren Gasquelle (36) zur Erzeugung geeigneter atmosphärischer Bedingungen verbunden ist.
9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 4 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsgefäß (4) mittels in die Zellsuspen;ion (5) eintauchender Meßsonden (40) über ein pH-Meter (37) und eine automatische Niveauregelung (42) mit Grenzwertschaltern elektronisch verbunden und strömungsmäßig an Behälter (38 und 10) mit Puffer- und Nährlösung über elektronisch gesteuerte Magnetventile (V4, V5) angeschlossen ist, wobei der Reaktionsraum eine Gaszu- (3E, 39) und Abführung (14, 8) aufweist.